KR101205643B1 - 염증 질환을 치료하기 위한 조성물과 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 염증성 질환을 치료하기 위한 조성물과 방법에 관계한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 항체 조성물 및 염증성 질환의 치료에서 이의 용도에 관계한다.

Description

염증 질환을 치료하기 위한 조성물과 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING INFLAMMATORY DISORDERS}
본 발명은 단일 도메인 항체 리간드와 이중특이적 리간드를 보유하는 항체 폴리펩티드 구조체, 이들 리간드의 조성물, 이들 리간드를 제조하고 활용하는 방법을 이용하여 류머티스성 관절염을 비롯한 질병의 치료 방법에 관계한다. 특히, 본 발명은 TNF-α와 VEGF를 비롯한 염증성 사이토킨에 결합하는 단일 도메인 항체의 제조 방법을 제시한다. 또한, 첫 번째 항원이나 에피토프에 결합하는 첫 번째 단일 면역글로불린 가변 도메인 및 두 번째 항원이나 에피토프에 결합하는 두 번째 단일 면역글로불린 가변 도메인을 포함하는 이중특이적 리간드를 제시한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 이중특이적 리간드에 관계하는데, 여기서 첫 번째와 두 번째 항원이나 에피토프 중에서 적어도 하나에 결합은 생체내에서 상기 리간드의 반감기(half-life)를 증가시키는 역할을 한다. 한가지이상의 결합 특이성(binding specificity)을 보유하는 열린 형태 리간드(open conformation ligand)와 닫힌 형태 리간드(closed conformation ligand)가 제시된다. 예로써, TNF-α, VEGF, HSA의 임의의 조합을 포함할 수 있는 첫 번째와 두 번째 항원에 결합하는 단일 도메인 항체 구조체와 이중특이적 리간드를 이용하여 류머티스성 관절염을 치료하는 방법이 제시된다.
TNF -α:
이름에서 암시하는 바와 같이, 종양 괴사 인자-α(TNF-α)는 항-종양 특성을 갖는 분자로서 초기에 기술되었지만, 이후 염증과 자가면역 질환을 매개하는 핵심적인 역할을 비롯한 다른 과정에서 핵심적인 역할을 수행하는 것으로 밝혀졌다. TNF-α는 예로써 류머티스성 관절염(RA), 크론병, 궤양성 대장염과 다른 장 질환, 건선, 독소 쇼크, 이식편 대 숙주 질환, 다발성 경화증을 비롯한 염증성 질환에서 핵심적인 친염증성 사이토킨이다.
TNF-α의 친-염증성 작용은 조직 손상, 예를 들면, 혈관내피세포에서 전구응고 활성(procoagulant activity) 유도(Pober, et al., J. Immunol. 136:1680(1986)), 호중구와 림프구의 유착 증가(Pober, et al., J. Immunol. 138:3319(1987)), 대식세포, 호중구, 혈관내피세포로부터 혈소판 활성 인자(platelet activating factor)의 방출 촉진(Camussi, et al., J. Exp. Med. 166:1390(1987))을 유도한다.
TNF-α는 TNF-α-전환 메탈로프로테이나아제 효소(converting metalloproteinase enzyme)에 의해 절단되고 17 kD 용해성 단백질로서 분비되는 세포내 꼬리(intracellular tail)를 보유하는 26 kD 막통과 전구 단백질(transmembrane precursor protein)로서 합성된다. 활성 형태는 2가지 상이한 세포 표면 수용체, p55 TNFR1과 p75 TNFR2와 상호작용하는 17 kD 단량체의 동종삼량체(homotrimer)로 구성된다. 또한, TNF-α의 세포 표면 결합된 전구체 형태는 상기 인자의 일부 생물학적 효과를 매개할 수 있는 것으로 확인되고 있다. 대부분의 세포는 상기 리간드의 상이한 생물학적 기능을 매개하는 p55와 p75 수용체를 모두 발현한다. p75 수용체는 림프구 증식을 유인하는데 관여하는 반면, p55 수용체는 TNF-매개된 세포독성(cytotoxicity), 아폽토시스(apoptosis), 항바이러스 활성(antiviral activity), 섬유아세포 증식(fibroblast proliferation), NF-κB 활성화에 관여한다(참조: Locksley et al., 2001, Cell 104: 487-501).
TNF 수용체는 NGF 수용체, Fas 항원, CD27, CD30, CD40, Ox40, 림포톡신(lymphotoxin) α/β 이형이량체(heterodimer)에 대한 수용체를 비롯한 일군의 막 단백질의 구성원이다. 상기 동종삼량체에 의한 수용체의 결합은 p55 또는 p75의 2개 또는 3개 분자의 소형 클러스터로 수용체의 응집을 유도한다. TNF-α는 활성화된 대식세포와 T 림프구에 의해 주로 생산되지만, 급성 염증 반응(acute inflammatory reaction) 동안 호중구, 내피세포, 각화세포, 섬유아세포에 의해 생산된다.
TNF-α는 친-염증성 사이토킨의 캐스케이드의 정점이다(Feldmann & Maini, 2001, Ann. Rev. Immunol. 19: 163). 상기 사이토킨은 추가의 친염증성 사이토킨, 특히, IL-1과 IL-6의 발현이나 방출을 유도한다(참조: Rutgeerts et al., 2004, Gastroenterology 126: 1593-1610). TNF-α의 저해는 IL-1, IL-6, IL-8, GM-CSF를 비롯한 염증성 사이토킨의 생산을 저해한다(Brennan et al., 1989, Lancet 2: 244).
염증에서 역할로 인하여, TNF-α는 염증성 질환의 증상을 감소시키는 시도에서 중요한 저해 표적으로 부상했다. TNF-α에 특이적인 용해성 TNF-α 수용체와 항체의 이용을 비롯하여 질병의 임상적 치료를 위한 TNF-α의 저해에 다양한 접근이 모색되고 있다. 임상 용도로 승인된 제품은 예로써, 항체 제품 RemicadeTM(Infliximab; Centocor, Malvern, PA; 인간 IgG4 불변 영역과 생쥐 가변 영역을 보유하는 키메라 단클론 IgG 항체), HumiraTM(adalimumab 또는 D2E7; Abbott Laboratories, U.S. 특허 No. 6,090,382), 용해성 수용체 제품 EnbrelTM(etanercept, 용해성 p75 TNFR2 Fc 융합 단백질; Immunex) 등이다.
염증성 관절염에서 TNF-α의 역할은 예로써 Li & Schwartz, 2003, Sringer Semin. Immunopathol. 25: 19-33에서 검토되었다. RA에서, TNF-α는 염증 활액막, 특히, 연골-파누스 접점(cartilage-pannus junction)에서 고도로 발현된다(DiGiovine et al., 1988, Ann. Rheum. Dis. 47: 768; Firestein et al., 1990, J. Immunol. 144: 3347; Saxne et al., 1988, Atrbritis Rheum. 31: 1041). TNF-α가 염증성 사이토킨 IL-1, IL-6, IL-8, GM-CSF의 수준을 증가시킨다는 증거 이외에, TNF-α는 단독으로, 포식윤활세포(fibroblast-like synoviocyte)의 관절 염증과 증식을 유인하고(Gitter et al., 1989, Immunology 66: 196), 콜라게나아제를 유도하여 연골 파괴를 유인하고(sayer et al., 1985, J. Exp. Med. 162: 2163; Dayer et al., 1986, J. Clin. Invest. 77. 645), 관절 연골세포(articular chondrocyte)에 의한 프로테오글리칸 합성(proteoglycan synthesis)을 저해하고(Saklatvala, 1986, Nature 322: 547; Saklatvala et al., 1985, J. Exp. Med. 162: 1208), 파골세포형성(osteoclastogenesis)과 골 재흡수(bone resorption)를 촉진할 수 있다(Abu-Amer et al., 2000, J. Biol. Chem. 275: 27307; Bertolini et al., 1986, Nature 319: 516). TNF-α는 골수에 의한 CD14+ 단핵구의 증가된 방출을 유도한다. 이들 단핵구는 관절에 침투하고 RANK(수용체 활성인자 또는 NF-κB)-RANKL 신호전달 경로를 통하여 염증 반응을 증폭하여 관절 염증 동안 파골세포 형성을 유도할 수 있다(Anandarajah & Richlin, 2004, Curr. Opin. Rheumatol. 16: 338-343).
TNF-α는 IL-8의 유도를 통하여 혈관 침투성(vascular permeability)을 증가시켜 대식세포와 호중구를 감염 부위로 동원하는 급성 단계 단백질(acute phase protein)이다. 일단 존재하는 활성화된 대식세포는 지속적으로 TNF-α를 생산하여 염증 반응을 유지하고 증폭한다.
용해성 수용체 구조체 Etanercept에 의한 TNF-α의 적정(titration)은 RA의 치료에 유효하지만, 크론병의 치료에는 유효하지 않다. 대조적으로, 항체 TNF-α 길항제 Infliximab은 RA와 크론병을 치료하는데 모두 유효하다. 따라서, 용해성 TNF-α의 단순한 중화는 항-TNF-기초된 치료 효능에 관여하는 유일한 기전이 아니다. 오히려, TNF-α에 의해 유도되는 다른 친-염증성 신호 또는 분자의 차단 역시 일정한 역할을 한다(Rutgeelts et al., supra). 가령, Infliximab의 투여는 유착 분자(adhesion molecule)의 발현을 명백하게 감소시켜 호중구의 염증 부위로의 감소된 침윤을 유도한다. 또한, Infliximab 치료는 크론병에서 이미 염증이 발생된 내장 점막으로부터 염증 세포의 소멸을 유도한다. 고유 판상(lamina propria)에서 활성화된 T 세포의 소멸은 Fas 의존성 방식으로 카스파제 8, 9, 3의 순차적인 활성화이후 막-결합된 TNF-α를 보유하는 세포의 아폽토시스에 의해 매개된다(참조: Lugering et al., 2001, Gaskoenterology 121: 1145-1157). 따라서, 막- 또는 수용체-결합된 TNF-α는 항-TNF-α 치료 접근을 위한 중요한 표적이다. 더 나아가, Infliximab은 활성화된 말초혈 세포와 고유 판상 세포에 결합하여 카스파제 3의 활성화를 통한 아폽토시스를 유도하는 것으로 밝혀졌다(참조: Van den Brande et al., 2003, Gastroenterology 124: 1774-1785).
세포내에서, 삼량체 TNF-α의 수용체 결합은 저해 분자, 예를 들면, SODD(사멸 도메인(death domain)의 침묵인자(silencer))와 같은 저해분자의 이동(displacement) 및 어댑터 인자(adaptor factor) FADD, TRADD, TRAF2, c-IAP, RAIDD, TRIP + 키나아제 RIP1과 특정 카스파제의 결합을 비롯한 신호전달 현상의 캐스케이드를 유인한다(Chen & Goeddel, 2002, Science 296: 1634-1635; Muzio & Saccani in :Methods in Molecular Medicine: Tumor Necrosis Factor, Methods and Protocols," Corti and Ghezzi, eds.(Humane Press, New Jersey), pp. 81-99). 조립된 신호전달 복합체는 NF-κB 활성화와 후속의 하류 유전자 활성화(downstream gene activation)를 통한 세포 생존 경로(cell survival pathway), 또는 카스파제 활성화(caspase activation)를 통한 아폽토시스 경로(apoptotic pathway)를 활성화시킬 수 있다.
유사한 세포외 하류 사이토킨 캐스케이드와 세포내 신호 도입 경로가 다른 질환에서 TNF-α에 의해 유도될 수 있다. 따라서, TNF-α 분자가 병리의 원인이 되는 다른 질환이나 질병에서, TNF-α의 저해는 한가지 치료법을 제공한다.
VEGF:
혈관신생(angiogenesis)은 염증성 활액 조직(inflammatory synovial tissue)의 능동적 증식에서 중요한 역할을 수행한다. 고도로 혈관화(vascularization)되는 RA 활액 조직은 관절주위 연골(periarticular cartilage)과 골조직(bone tissue)에 침투하고 관절 파괴를 유발한다.
혈관 내피세포 성장 인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF)는 공지된 가장 강력한 혈관생성 사이토킨(angiogenic cytokine)이다. VEGF는 최초 전사체의 대안 절단접합(alternative splicing)에 기인한 여러 대안 형태로 존재하는 분비된, 헤파린-결합, 동종이량체 당단백질이다(Leung et al., 1989, Science 246: 1306). VEGF는 또한, 염증에서 중요한 과정인 혈관 누출(vascular leakage)을 유도하는 능력으로 인하여, 혈관 침투성 인자(vascular permeability factor, VPF)로 알려져 있다. RA 환자의 활액 조직에서 VEGF의 확인은 RA의 병리에서 VEGF의 잠재적 역할을 뒷받침한다(Fava et al., 1994, J. Exp. Med. 180: 341: 346; Nagashima et al., 1995, J. Rheumatol. 22: 1624-1630). RA의 병리에서 VEGF의 역할은 항-VEGF 항체가 뮤린 콜라겐-유도된 관절염(CIA) 모형에 투여되는 연구이후 확립되었다. 이들 연구에서, 상기 질환의 유도이후 관절에서 VEGF 발현이 증가하였고, 항-VEGF 항혈청의 투여는 관절염 질환의 발생을 차단하고 확립된 질환을 완화시켰다(Sone et al., 2001, Biochem. Biophys. Res. Comm. 281: 562-568; Lu et al., 2000, J. Immunol. 164: 5922-5927).
항체 폴리펩티드:
항체는 그들의 결합 표적에 고도로 특이적이고, 자연의 자기 방어 기전으로부터 유래되지만 인간 환자에서 질병의 치료에 적용되는 경우에 여러 어려움에 직면한다. 통상적인 항체는 적어도 4개의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 대형 다중-아단위 단백질 분자이다. 가령, 인간 IgG는 이황화 결합되어 기능적 항체를 형성하는 2개의 중쇄와 2개의 경쇄를 보유한다. 통상적인 IgG의 크기는 대략 150 kD이다. 상대적으로 큰 크기로 인하여, 완전 항체(가령, IgG, IgA, IgM 등)는 예로써, 조직 침투에서 문제로 인하여 치료 효용이 제한된다. 항원 결합 기능과 용해성을 유지하는 더욱 작은 항체 단편을 확인하고 생산하는데 상당한 노력이 집중되고 있다.
항체의 중쇄와 경쇄 폴리펩티드는 항원 상호작용에 직접 참여하는 가변(V) 영역 및 구조적 지지(structural support)를 제공하고 면역 효과기(immune effecter)와의 비-항원-특이적 상호작용에서 기능하는 불변(C) 영역을 포함한다. 통상적인 항체의 항원 결합 도메인(antigen binding domain)은 2개의 별개의 도메인: 중쇄 가변 도메인(VH)과 경쇄 가변 도메인(VL: 이는 Vκ 또는 Vλ이다)으로 구성된다. 항원 결합 부위 자체는 6개의 폴리펩티드 루프(loop): VH 도메인으로부터 3개(H1, H2, H3) 및 VL 도메인으로부터 3개(L1, L2, L3)로 구성된다. 생체내에서, VH와 VL 도메인을 인코딩하는 V 유전자의 다양한 일차 레퍼토리는 유전자 분절의 조합 재정렬(combinatorial rearrangement)에 의해 생산된다. C 영역은 경쇄 C 영역(CL 영역으로 명명됨)과 중쇄 C 영역(CH1, CH2, CH3 영역으로 명명됨)을 보유한다.
자연 발생 항체의 다수의 더욱 작은 항원 결합 단편이 프로테아제 절단(protease digestion)이후 확인되었다. 여기에는 예로써, “Fab 단편”(VL-CL-CH1-VH), “Fab' 단편”(중쇄 힌지 영역을 보유하는 Fab), “F(ab')2 단편”(중쇄 힌지 영역에 의해 연결된 Fab' 단편의 이량체) 등이 포함된다. 재조합 방법을 이용하여 합성 펩티드 링커에 의해 연결된 VL과 VH로 구성되는 더욱 작은 항원-결합 단편(“단일 사슬 Fv”(가변 단편) 또는 “scFv”)이 산출되었다.
단일 도메인 항체:
자연 발생 항체(가령, 인간과 다른 대부분의 포유동물에서)의 항원 결합 단위는 일반적으로, V 영역의 일부(VL/VH)로 구성되는 것으로 알려져 있긴 하지만, 카멜리드(camelid) 종은 경쇄 서열이 부재하는 완전 기능성의 매우 특이적인 항체를 다량으로 발현한다. 카멜리드 중쇄 항체는 그들의 불변 영역을 통하여 이량체화된 단이 중쇄의 동종이량체로서 발견된다. 이들 카멜리드 중쇄 항체의 가변 도메인은 VHH 도메인으로 명명되고, VH 사슬의 단편으로서 분리되는 경우에 높은 특이성으로 항원에 결합하는 능력을 유지한다(Hamers-Casterman et al., 1993, Nature 363: 446-448; Gahroudi et al., 1997, FEBS Lett. 414: 521-526). 또한, 항원 결합 단일 VH 도메인은 예로써, 면역화된 생쥐의 비장으로부터 유래된 게놈 DNA로부터 증폭되고 대장균(E. coli)에서 발현된 뮤린 VH 유전자의 라이브러리로부터 확인되었다(Ward et al., 1989, Nature 341: 544-546). Ward 등은 분리된 단일 VH 도메인을 “도메인 항체”를 의미하는 “dAb”로 명명하였다. 본 명세서에서 “dAb”는 항원에 특이적으로 결합하는 단일 면역글로불린 가변 도메인(VH, VHH 또는 VL) 폴리펩티드를 의미한다. “dAb”는 다른 V 도메인에 독립적으로 항원에 결합한다; 하지만, “dAb”는 다른 도메인이 dAb에 의한 항원 결합에 필요하지 않은 경우, 다시 말하면, dAb가 추가의 VH, VHH 또는 VL 도메인에 독립적으로 항원에 결합하는 경우에, 다른 VH 또는 VL 도메인과 동종- 또는 이형이량체로 존재할 수 있다.
단일 면역글로불린 가변 도메인, 예를 들면, VHH는 현재까지 알려진 가장 작은 항원-결합 항체이다. 치료 이용에서, 인간 항체가 선호되는데, 그 이유는 이들이 환자에 투여될 때 면역 반응을 유발할 가능성이 낮기 때문이다. 전술한 바와 같이, 분리된 비-카멜리드 VH 도메인은 상대적으로 불용성이고, 빈번하게 발현이 불량하다. 카멜리드 VHH와 인간 항체의 VH 도메인의 비교에서, 인간 VH 도메인 VH/VL 인터페이스에 상응하는 카멜리드 VHH 도메인의 프레임워크(framework) 영역에서 여러 핵심적인 차이가 확인된다. 항원 결합 활성(Davies & Riechmann, 1994, FEBS Lett.339: 285-290)을 유지하면서도 향상된 발현과 용해성을 갖는 “카멜화(camelization)된”인간 VH 도메인을 생산하기 위하여, VHH 서열에 더욱 유사하도록 인간 VH3의 잔기의 돌연변이(구체적으로, Gly 44 Glu, Lou 45 Arg, Trp 47 Gly)가 수행되었다. 본 발명에 이용된 가변 도메인 아미노산 넘버링(amino acid numbering)은 Kabat 번호 체계(numbering convention)와 일치한다(Kabat et al., 1991, Sequences of Immunological Interest, 5th ed. U.S. Dept. Health & Human Services, Washington, D.C.)). WO 03/035694(Muyldermans)에서는 Trp 103 Arg 돌연변이가 비-카멜리드 VH 도메인의 용해성을 개선한다고 보고한다. 또한, Davies & Riechmann(1995, Biotechnology N.Y. 13: 475-479)에서는 카멜화된 인간 VH 도메인의 파지-전시된 레퍼토리의 생성 및 100-400nM 범위의 친화력으로 합텐에 결합하는 클론의 선별을 보고하지만, 단백질 항원에 대한 결합에 대하여 선별된 클론은 더욱 약한 친화력을 보였다.
항체의 항원 결합 도메인은 2개의 별개의 영역: 중쇄 가변 도메인(VH)과 경쇄 가변 도메인(VL: 이는 Vκ 또는 Vλ이다)으로 구성된다. 항원 결합 부위 자체는 6개의 폴리펩티드 루프: VH 도메인으로부터 3개(H1, H2, H3) 및 VL 도메인으로부터 3개(L1, L2, L3)로 구성된다. VH와 VL 도메인을 인코딩하는 V 유전자의 다양한 일차 레퍼토리는 유전자 분절의 조합 재정렬에 의해 생산된다. VH 유전자는 3가지 유전자 분절, VH, D, JH의 조합으로 생성된다. 인간의 경우에, 일배체형(haplotype)에 따라, 대략 51개의 기능성 VH 분절(Cook and Tomlinson(1995) Immunol Today, 16: 237), 25개의 기능성 D 분절(Corbett et al.(1997) J. Mol. Biol., 268: 69), 6개의 기능성 JH 분절(Ravetch et al.(1981) Cell, 27: 583)이 존재한다. VH 분절은 VH 도메인의 첫 번째와 두 번째 항원 결합 루프(H1과 H2)를 형성하는 폴리펩티드 사슬의 영역을 인코딩하고, VH, D, JH 분절은 결합하여 VH 도메인의 세 번째 항원 결합 루프(H3)를 형성한다. VL 유전자는 단지 2개의 유전자 분절, VL과 JL의 조합으로 생성된다. 인간의 경우에, 일배체형에 따라, 대략 40개의 기능성 Vκ 분절(Schable and Zachau(1993) Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 374: 1001), 31개의 기능성 Vλ 분절(Williams et al.(1996) J. Mol. Biol., 264: 220; Kawasaki et al.(1997) Genome Res., 7: 250), 5개의 기능성 Jκ 분절(Hieter et al.(1982) J. Biol. Chem. 257: 1516), 4개의 기능성 Jλ 분절(Vasicek and Leder(1990) J. Exp. Med., 172: 609)이 존재한다. VL 분절은 VL 도메인의 첫 번째와 두 번째 항원 결합 루프(L1과 L2)를 형성하는 폴리펩티드 사슬의 영역을 인코딩하고, VL과 JL 분절은 결합하여 VL 도메인의 세 번째 항원 결합 루프(L3)를 형성한다. 이런 일차 레퍼토리로부터 선별된 항체는 적어도 중간 정도의 친화력으로 거의 모든 항원에 결합할 수 있을 만큼 충분히 다양하다. 높은 친화력 항체는 재정렬된 유전자의 “친화력 성숙(affinity maturation)”에 의해 생체내에서 생산되는데, 여기서 향상된 결합의 기초에서 면역계에 의해 점 돌연변이(point mutation)가 생성되고 선별된다.
항체의 구조와 서열 분석에서, 6개의 항원 결합 루프 중에서 5개(H1, H2, L1, L2, L3)가 제한된 수의 주요-사슬 형태(main-chain conformation) 또는 정준 구조(canonical structure)를 보유하는 것으로 밝혀졌다(Chothia and Lesk(1987) J. Mol. Biol., 196: 901; Chothia et al.(1989) Nature, 342: 877). 주요 사슬 형태는 (i) 항원 결합 루프의 길이 및 (ii) 항원 결합 루프와 항체 프레임워크에서 특정 핵심 위치에 특정 잔기, 또는 잔기의 유형에 의해 결정된다. 루프 길이와 핵심 잔기의 분석으로, 대부분의 인간 항체 서열에 의해 인코딩되는 H1, H2, L1, L2, L3의 주요-사슬 형태를 예측할 수 있다(Chothia et al.(1992) J. Mol. Biol., 227: 799; Tomlinson et al.(1995) EMBO J., 14: 4628; Williams et al.(1996) J. Mol. Biol., 264: 220). 비록, H3 영역이 서열, 길이, 구조의 관점에서 더욱 다양하긴 하지만(D 분절의 이용에 기인함), 이는 항원 결합 루프와 항체 프레임워크 내에 핵심 위치에서 특정 잔기의 길이와 존재, 또는 잔기의 유형에 좌우되는 짧은 루프 길이를 위한 제한된 수의 주요-사슬 형태를 형성한다(Martin et al.(1996) J. Mol. Biol., 263: 800; Shirai et al.(1996) FEDS Letters, 399: 1).
이중특이적 항체:
VH와 VL 영역의 상보적인 쌍을 포함하는 이중특이적 항체는 당분야에 공지되어 있다. 이들 이중특이적 항체는 두 쌍의 VH와 VLS를 포함해야 하는데, 각 VH/VL 쌍은 단일 항원이나 에피토프에 결합한다. 보고된 방법에는 하이브리드 하이브리도마(hybrid hybridoma)(Milstein & Cuello, Nature 305:537-40), 미니바디(minibody)(Hu et al.,(1996) Cancer Res 30 56:3055-3061;), 디아바디(diabody)(Holliger et al.,(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9O, 6444 6448; WO 94/13804), 킬레이트화 재조합 항체(CRAbs; (Nerd et i al.,(1995) J. Mol. Biol. 246, 367-373), biscFv(가령, Atwell et al.,(1996) Mol. Immunol. 33, 1301 1312), “구멍 내에 손잡이(knobs in holes)” 안정화된 항체(Carter et al.,(1997) Protein Sci. 6, 781 788) 등이 포함된다. 각 경우에, 각 항체 종은 2개의 항원-결합 부위를 포함하는데, 각각은 VH와 VL 도메인의 상보적인 쌍에 의해 적합된다. 따라서, 각 항체는 동시에 2개의 상이한 항원이나 에피토프에 결합할 수 있는데, EACH 항원이나 에피토프에 대한 결합은 VH와 이의 상보적 VL 도메인에 의해 매개된다. 이들 각 기술은 특유의 단점이 있다; 가령, 하이브리드 하이브리도마의 경우에, 불활성 VH/VL 쌍이 이중특이적 IgG의 세분(fraction)을 상당히 감소시킬 수 있다.
더 나아가, 대부분의 이중특이적 접근법은 2개의 상이한 VH/VL 결합 부위를 재현하기 위하여 상이한 VH/VL 쌍의 결합, 또는 VH와 VL 사슬의 결합에 의존한다. 이런 이유로, 조립된 분자에서 각 항원이나 에피토프에 대한 결합 부위의 비율을 조절하는 것이 불가능하기 때문에, 많은 조립된 분자들이 하나의 항원이나 에피토프에만 결합하고 다른 항원이나 에피토프에는 결합하지 않는다. 일부 경우에, 양쪽 항원이나 에피토프에 결합 부위를 보유하는 분자의 수를 증가시키기 위하여 아단위 인터페이스에서 중쇄와 경쇄를 조작하는 것이 가능하긴 하지만(Carter et al., 1997), 그럼에도 불구하고 모든 분자가 양쪽 항원이나 에피토프에 결합하는 것은 아니다.
일부 경우에, 2가지 상이한 항체 결합 특이성이 동일 결합 부위에 통합될 수 있긴 하지만, 전체적으로, 이들은 구조적으로 관련된 항원이나 에피토프 또는 광범위하게 교차-반응하는 항체에 상응하는 2가지 이상의 특이성을 대표한다. 가령, 교차-반응 항체가 보고되었는데, 여기서 두 항원, 예를 들면, 암탉 난백 라이소자임(hen egg white lysozyme)과 칠면조 라이소자임(turkey lysozyme)(McCafferty et al., WO 92/01047), 또는 유리 합텐과 담체에 공액된 합텐(Griffiths AD et al. EMBO J 1994 13:14 3245-60)이 서열과 구조에서 밀접하게 관련된다. 다른 실례에서, WO 02/02773(Abbott Laboratories)에서는 “이중 특이성(dual specificity)”을 갖는 항체 분자를 기술한다. 인용된 이들 항체 분자는 복수 항원에 대하여 발생되거나 선별되는 항체이기 때문에, 이들의 특이성은 단일 항원을 초과한다. WO 02/02773의 항체에서 각 상보성 VH/VL 쌍은 2개 이상의 구조적으로 관련된 항원에 단일 결합 특이성을 지정한다; 이런 상보성 쌍에서 VH와 VL 도메인은 각각, 별개의 특이성을 보유하지 않는다.
따라서, 이들 항체는 구조적으로 관련된 2가지 항원을 포괄하는 넓은 범위의 단일 특이성을 갖는다. 더 나아가, 구조적으로 무관한 적어도 2개(일반적으로, 그 이상)의 상이한 항원이나 에피토프와 반응하는 다중반응성의 자연 자기항체가 보고되었다(Casali & Notkins, Ann. Rev. Immunol. 7, 515-531). 또한, 단클론 항체에서 파지 전시 기술을 이용한 무작위 펩티드 레퍼토리의 선별이 항원 결합 부위에 합치되는 펩티드 서열의 범위를 결정하는 것으로 밝혀졌다. 이들 서열 중에서 일부는 고도로 관련되고 공통 서열로서 적합하며, 다른 서열은 매우 상이하고 미모토프(mimotope)로 불린다(Lane & Stephen, Current Opinion in Immunology, 1993, 5, 268-271). 이런 이유로, 연관되고 상보적인 VH와 VL 도메인을 포함하는 자연의 4-사슬 항체가 광범위한 공지된 항원으로부터 여러 상이한 항원에 결합할 수 있는 잠재력을 보유함은 명확하다. 하지만, 동일한 항체에서 2개의 일정한 항원, 특히, 반드시 구조적으로 관련되지는 않는 항원에 대한 단일 결합 부위를 어떻게 발생시킬 지는 다소 불명확하다.
이와 관련하여, 단백질 가공 방법이 제안되었다. 가령, 하나의 가변 도메인을 통하여 금속 이온에, 금속 이온 및 상보성 가변 도메인과의 접촉을 통하여 합텐(기질)에 결합 활성을 갖는 촉매 항체가 제안되었다(Barbas et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci USA 90, 6385-6389). 하지만, 이 경우에, 기질(첫 번째 항원)의 결합과 촉매 반응이 금속 이온(두 번째 항원)의 결합을 요구하는 것으로 제안되었다. 따라서, VH/VL 쌍에 결합은 단일하지만 복수 성분의 항원에 관계한다.
한 항원에 대한 결합 접촉이 첫 번째 가변 도메인에서 일어나고, 두 번째 항원에 대한 결합 접촉이 두 번째 가변 도메인에서 일어나는 낙타 항체 중쇄 단일 도메인으로부터 이중특이적 항체를 생산하는 방법이 보고되었다. 하지만, 이들 가변 도메인은 비-상보적이었다. 따라서, 첫 번째 중쇄 가변 도메인은 첫 번째 항원에 대하여 선택되고, 두 번째 중쇄 가변 도메인은 두 번째 항원에 대하여 선택되고, 이후 이들 양쪽 도메인은 동일 사슬에서 서로 연결되어 이중특이적 항체 단편을 제공한다(Conrath et al., J. Biol. Chem. 270, 27589-27594). 하지만, 낙타 중쇄 단일 도메인은 이들 도메인이 경쇄가 없는 자연 낙타 항체로부터 유래된다는 점에서 독특한데, 실제로 중쇄 단일 도메인은 상보성 VH와 VL 쌍을 형성하기 위하여 낙타 경쇄와 결합할 수 없다.
경쇄와 정상적으로 결합된 자연 항체(단클론 항체로부터 또는 도메인의 레퍼토리로부터; 참조: EP-A-0368684)로부터 유래된 단일 중쇄 가변 도메인 역시 보고되었다. 이들 중쇄 가변 도메인은 하나이상의 관련된 항원과 특이적으로 상호작용하지만 다른 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인과 합체되지 않아 2개 이상의 상이한 항원에 대한 특이성을 갖는 리간드를 갖는 리간드를 만들 수 있는 것으로 밝혀졌다. 더 나아가, 이들 단일 도메인은 매우 짧은 생체내 반감기를 갖는 것으로 밝혀졌다. 이런 이유로, 이들 도메인은 치료 가치가 제한적이다.
상이한 특이성의 중쇄 가변 도메인을 서로 연결함으로써(앞서 기술된 바와 같이) 이중특이적 항체 단편을 제조하는 방법이 제안되었다. 이런 방법의 단점은 분리된 항체 가변 도메인이 정상적으로 경쇄와 상호작용하고 용매에 노출되는 소수성 표면을 보유하고, 단일 도메인이 소수성 표면에 결합할 수 있도록 “점착성”이어야 한다는 점이다. 더 나아가, 상대 경쇄의 부재에서, 2개 이상의 상이한 중쇄 가변 도메인의 조합 및 소수성 인터페이스를 통한 이들의 결합은 이들이 분리 결합할 수 있는 리간드의 한쪽 또는 양쪽에 결합하는 것을 차단할 수 있다. 게다가, 이 경우에, 중쇄 가변 도메인은 상보성 경쇄 가변 도메인과 결합하지 않기 때문에, 안정성이 덜하고 쉽게 풀어진다(Worn & Pluckthun, 1998 Biochemistry37, 13120-7).
본 발명의 요약
본 발명자들은 국제 특허 출원 WO 03/002609 및 UK 특허 출원 0230203.2에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 이중특이적 면역글로불린 리간드를 기술하였는데, 여기서 각 가변 도메인은 상이한 특이성(specificity)을 보유할 수 있다. 이들 도메인은 서로 경쟁적으로 또는 독립적으로 기능하여 표적 분자에서 항원이나 에피토프에 결합할 수 있다.
본 발명은 TNF-α 관련된 염증성 질환으로 고생하는 개체에서 이를 치료하는 방법에 관계한다. 상기 방법은 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체, 바람직하게는, 인간 단일 도메인 항체 구조체의 치료 효과량을 병든 개체에 투여하여 TNF-α 관련된 염증성 질환을 치료하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 인간 TNF-α에 결합한다.
한 측면에서, 염증성 질환은 류머티스성 관절염이고, 상기 방법은 하나이상의 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체의 이용을 포함하는데, 여기서 하나이상의 이들 구조체는 수용체에 대한 수용체에 대한 인간 TNFα 결합을 길항한다. 본 발명은 수용체에 대한 인간 TNFα 결합을 길항하는 하나이상의 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체를 함유하는 조성물 및 리간드의 한 특이성이 TNFα를 지향하고 두 번째 특이성이 VEGF 또는 HSA를 지향하는 이중특이적 리간드(dual specific ligand)에 관계한다. 본 발명은 또한, 리간드의 한 특이성이 VEGF를 지향하고 두 번째 특이성이 HSA를 지향하는 이중특이적 리간드에 관계한다.
또한, 본 발명은 질병 치료를 위한 약물의 제조, 특히, 류머티스성 관절염의 치료를 위한 약물의 제조에서 본 명세서에 기술된 폴리펩티드 구조체의 용도에 관계한다.
한 측면에서, 본 발명은 류머티스성 관절염을 치료하는 방법에 관계하는데, 상기 방법은 수용체에 대한 인간 TNFα 결합을 길항하는 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체를 함유하는 조성물의 치료 효과량을 병든 개체에 투여하여 류머티스성 관절염을 치료하는 단계를 포함한다.
한 구체예에서, 조성물은 관절염의 Tgl97 유전자도입 생쥐 모형(transgenic mouse model)의 생쥐에 투여되는 경우에 관절염 스코어의 증가를 예방한다.
다른 구체예에서, Tgl97 유전자도입 생쥐에 조성물의 투여는 아래의 단계를 포함한다: a) 이형접합성 Tgl97 유전자도입 생쥐에 상기 조성물의 주1회 복강내 주사를 투여하고, b) 단계 a)의 생쥐를 주1회 칭량하고, c) 상기 생쥐에서 아래의 체계: 0 = 관절염 없음(정상 외관과 굴곡), 1 = 경등도 관절염(관절 염좌), 2 = 중등도 관절염(부종, 관절 변형), 3 = 중증도 관절염(심각하게 손상된 움직임)에 따라 관절염의 거대표현형적 증상에 대한 스코어를 기록한다.
다른 구체예에서, 조성물은 관절염 증상의 발병이 나타나기 이전에 생쥐에 투여된다. 다른 구체예에서, 조성물은 생쥐가 3주령일 때 처음 투여된다. 다른 구체예에서, 조성물은 생쥐가 6주령일 때 처음 투여된다.
다른 구체예에서, 조성물은 Tgl97 유전자도입 생쥐 관절염 검사에서, Etanercept, Infliximab, D2E7에서 선택되는 당량(㎎/㎏ 기초)의 약제의 효능과 동등하거나 이를 초과하는 효능을 갖는다.
다른 구체예에서, 조성물은 Tgl97 유전자도입 생쥐 관절염 검사에서, 치료에 의해 O 내지 0.5의 관절염 스코어가 유도되는 효능을 갖는다. 다른 구체예에서, 조성물은 Tgl97 유전자도입 생쥐 관절염 검사에서, 치료에 의해 O 내지 1.0의 관절염 스코어가 유도되는 효능을 갖는다. 다른 구체예에서, 조성물은 Tgl97 유전자도입 생쥐 관절염 검사에서, 치료에 의해 O 내지 1.5의 관절염 스코어가 유도되는 효능을 갖는다. 다른 구체예에서, 조성물은 Tgl97 유전자도입 생쥐 관절염 검사에서, 치료에 의해 O 내지 2.0의 관절염 스코어가 유도되는 효능을 갖는다.
다른 구체예에서, 치료는 류머티스성 관절염의 진행의 저해를 포함한다. 다른 구체예에서, 치료는 류머티스성 관절염의 발병의 예방이나 지연을 포함한다.
다른 구체예에서, 투여는 RA의 하나이상의 징후에서 통계학적으로 유의한 변화를 유도한다. 다른 구체예에서, RA의 하나이상의 징후는 적혈구 침강 속도(erythrocyte sedimentation rate, ESR), 리치 관절 지수(Ritchie articular index)와 조조 강직(morning stiffness)의 지속 시간, 관절 가동력(joint mobility), 관절 부종(joint swelling), 하나이상의 관절의 x 레이 영상, 하나이상의 관절의 고정된 절편의 조직병리학적 분석결과 중에서 하나이상이다.
다른 구체예에서, RA의 하나이상의 징후는 조성물이 Tgl97 유전자도입 생쥐에 투여되는 경우에 상기 Tgl97 유전자도입 생쥐에서 관절염의 거대표현형적 증상(macrophenotypic sign)의 감소이고, 여기서 상기 Tgl97 유전자도입 생쥐는 관절염의 거대표현형적 증상에 대한 스코어가 기록되고, 관절염의 거대표현형적 증상은 아래의 체계: 0 = 관절염 없음(정상 외관과 굴곡), 1 = 경등도 관절염(관절 염좌), 2 = 중등도 관절염(부종, 관절 변형), 3 = 중증도 관절염(심각하게 손상된 움직임)에 따라 스코어가 기록된다.
다른 구체예에서, RA의 하나이상의 징후는 조성물이 Tgl97 유전자도입 생쥐에 투여되는 경우에 상기 Tgl97 유전자도입 생쥐에서 관절염의 조직병리학적 증상(histopathological sign)의 감소이고, 여기서 상기 Tgl97 유전자도입 생쥐는 관절염의 조직병리학적 증상에 대한 스코어가 기록되고, 관절염의 조직병리학적 검사는 관절에서 수행되고 아래의 체계: 0 = 검출되는 병리 없음, 1 = 활액막(synovial membrane)의 과형성(hyperplasia)과 다형핵 침윤물(polymorphonuclear infiltrate)의 존재, 2 = 파누스(pannus)와 섬유상 조직 형성 및 병소 연골하골 골 침식(focal subchondral bone erosion), 3 = 관절 연골 파괴와 골 침식, 4 = 광범위한 관절 연골 파괴와 골 침식에 따라 스코어가 기록된다.
다른 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 인간 단일 도메인 항체 폴리펩티드를 포함한다. 다른 구체예에서, 인간 단일 도메인 항체 폴리펩티드는 TNFα에 결합한다. 다른 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 <100 nM의 Kd로 인간 TNFα에 결합한다. 다른 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 100 nM 내지 50 pM 범위의 Kd로 인간 TNFα에 결합한다. 다른 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 30 nM 내지 50 pM 범위의 Kd로 인간 TNFα에 결합한다. 다른 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 10 nM 내지 50 pM 범위의 Kd로 인간 TNFα에 결합한다. 다른 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 1 nM 내지 50 pM 범위의 Kd로 인간 TNFα에 결합한다.
다른 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 표준 L929 세포 검사에 의한 측정에서, 인간 TNFα를 길항한다.
본 발명은 또한, 류머티스성 관절염을 치료하는 방법에 관계하는데, 상기 방법은 수용체에 대한 인간 TNFα 결합을 길항하는 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체를 함유하는 조성물의 치료 효과량을 병든 개체에 투여하여 류머티스성 관절염을 치료하는 단계를 포함하고, 상기 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 TNFα 수용체에 대한 인간 TNFα의 결합을 저해한다.
한 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 세포 표면 수용체에 결합된 인간 TNF-α에 특이적으로 결합한다.
다른 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 15분 내지 12시간 범위의 생체내 tα-반감기(in vivo tα-half life)를 갖는다. 다른 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 1시간 내지 6시간 범위의 생체내 tα-반감기를 갖는다. 다른 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 2시간 내지 5시간 범위의 생체내 tα-반감기를 갖는다. 다른 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 3시간 내지 4시간 범위의 생체내 tα-반감기를 갖는다. 다른 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 12시간 내지 60시간 범위의 생체내 tβ-반감기(in vivo tβ-half life)를 갖는다. 다른 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 12시간 내지 48시간 범위의 생체내 tβ-반감기를 갖는다. 다른 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 12시간 내지 26시간 범위의 생체내 tβ-반감기를 갖는다.
다른 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 15 ㎎.min/㎖ 내지 150 ㎎.min/㎖ 범위의 생체내 AUC 반감기(in vivo AUC half life) 수치를 갖는다. 다른 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 15 ㎎.min/㎖ 내지 100 ㎎.min/㎖ 범위의 생체내 AUC 반감기 수치를 갖는다. 다른 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 15 ㎎.min/㎖ 내지 75 ㎎.min/㎖ 범위의 생체내 AUC 반감기 수치를 갖는다. 다른 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 15 ㎎.min/㎖ 내지 50 ㎎.min/㎖ 범위의 생체내 AUC 반감기 수치를 갖는다.
다른 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 PEG 분자에 연결된다. 다른 구체예에서, PEG-연결된 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 적어도 24 kDa의 유체역학적 크기(hydrodynamic size)를 갖고, 전체 PEG 크기는 20 내지 60 kDa이다. 다른 구체예에서, PEG-연결된 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 적어도 200 kDa의 유체역학적 크기(hydrodynamic size)를 갖고, 전체 PEG 크기는 20 내지 60 kDa이다. 다른 구체예에서, 본 발명의 PEG화된 단백질은 평균적으로, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 17, 20, 또는 그 이상의 폴리에틸렌 글리콜 분자에 연결된다.
다른 구체예에서, 항체 구조체는 인간 TNFα에 결합하는 2개 이상의 단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드를 포함한다. 다른 구체예에서, 항체 구조체는 인간 TNFα에 결합하는 단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드의 동종이량체(homodimer)를 포함한다. 다른 구체예에서, 항체 구조체는 인간 TNFα에 결합하는 단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드의 동종삼량체(homotrimer)를 포함한다. 다른 구체예에서, 항체 구조체는 인간 TNFα에 결합하는 단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드의 동종사량체(homotetramer)를 포함한다.
다른 구체예에서, 항체 구조체는 TNFα 이외의 항원에 특이적인 항체 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, TNFα 이외의 항원에 특이적인 항체 폴리펩티드는 단일 도메인 항체 폴리펩티드를 포함한다. 다른 구체예에서, TNFα 이외의 항원에 특이적인 항체 폴리펩티드에 의한 TNFα 이외의 항원의 결합은 항체 폴리펩티드 구조체의 생체내 반감기(in vivo half-life)를 증가시킨다, 다른 구체예에서, TNFα 이외의 항원은 혈청 단백질을 포함한다. 다른 구체예에서, 혈청 단백질은 피브린(fibrin), α-2 마크로글로불린(macroglobulin), 혈청 알부민(serum albumin), 피브리노겐(fibrinogen) A, 피브리노겐, 혈청 아밀로이드 단백질 A, 헵타글로빈(heptaglobin), 프로필린, 유비퀴틴(ubiquitin), 유테로글로불린(uteroglobulin), β-2 마크로글로불린(microglobulin)에서 선택된다. 다른 구체예에서, TNFα 이외의 항원은 HSA를 포함한다.
다른 구체예에서, 치료는 적어도 한가지 추가의 치료제의 투여를 더욱 포함한다.
다른 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 클론 TAR1-2m-9, TAR1-2m-30, TAR1-2m-l, TAR1-2m-2, TAR1-5, TAR1-27, TAR1-261, TAR1-398, TAR1-701, TAR1-5-2, TAR1-5-3, TAR1-5-4, TAR1-5-7, TAR1-5-8, TAR1-5-10, TAR1-5-11, TAR1-5-12, TAR1-5-13, TAR1-5-19, TAR1-5-20, TAR1-5-21, TAR1-5-22, TAR1-5-23, TAR1-5-24, TAR1-5-25, TAR1-5-26, TAR1-5-27, TAR1-5-28, TAR1-5-29, TAR1-5-34, TAR1-5-35, TAR1-5-36, TAR1-5-464, TAR1-5-463, TAR1-5-460, TAR1-5-461, TAR1-5-479, TAR1-5-477, TAR1-5-478, TAR1-5-476, TAR1-5-490, TAR1h-l, TAR1h-2, TAR1h-3, TAR1-100-29, TAR1-100-35, TAR1-100-43, TAR1-100-47, TAR1-100-52, TAR1-109, TAR1-100, TAR1-100-34, TAR1-100-36, TAR1-100-38, TAR1-100-39, TAR1-100-40, TAR1-100-41, TAR1-100-45, TAR1-100-60, TAR1-100-62, TAR1-100-64, TAR1-100-65, TAR1-100-75, TAR1-100-76, TAR1-100-77, TAR1-100-78, TAR1-100-80, TAR1-100-82, TAR1-100-83, TAR1-100-84, TAR1-100-89, TAR1-100-90, TAR1-100-91, TAR1-100-92, TAR1-100-93, TAR1-100-94, TAR1-100-95, TAR1-100-96, TAR1-100-97, TAR1-100-98, TAR1-100-99, TAR1-100-100, TAR1-100-101, TAR1-100-102, TAR1-100-103, TAR1-100-105, TAR1-100-106, TAR1-100-107, TAR1-100-108, TAR1-100-109, TAR1-100-110, TAR1-100-111, TAR1-100-112, TAR1-100-113, TAR1-5-19에서 선택되는 항체 폴리펩티드의 CDR3의 아미노산 서열을 포함한다.
다른 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 클론 TAR1-2m-9, TAR1-2m-30, TAR1-2m-l, TAR1-2m-2, TAR1-5, TAR1-27, TAR1-261, TAR1-398, TAR1-701, TAR1-5-2, TAR1-5-3, TAR1-5-4, TAR1-5-7, TAR1-5-8, TAR1-5-10, TAR1-5-11, TAR1-5-12, TAR1-5-13, TAR1-5-19, TAR1-5-20, TAR1-5-21, TAR1-5-22, TAR1-5-23, TAR1-5-24, TAR1-5-25, TAR1-5-26, TAR1-5-27, TAR1-5-28, TAR1-5-29, TAR1-5-34, TAR1-5-35, TAR1-5-36, TAR1-5-464, TAR1-5-463, TAR1-5-460, TAR1-5-461, TAR1-5-479, TAR1-5-477, TAR1-5-478, TAR1-5-476, TAR1-5-490, TAR1h-l, TAR1h-2, TAR1h-3, TAR1-100-29, TAR1-100-35, TAR1-100-43, TAR1-100-47, TAR1-100-52, TAR1-109, TAR1-100, TAR1-100-34, TAR1-100-36, TAR1-100-38, TAR1-100-39, TAR1-100-40, TAR1-100-41, TAR1-100-45, TAR1-100-60, TAR1-100-62, TAR1-100-64, TAR1-100-65, TAR1-100-75, TAR1-100-76, TAR1-100-77, TAR1-100-78, TAR1-100-80, TAR1-100-82, TAR1-100-83, TAR1-100-84, TAR1-100-89, TAR1-100-90, TAR1-100-91, TAR1-100-92, TAR1-100-93, TAR1-100-94, TAR1-100-95, TAR1-100-96, TAR1-100-97, TAR1-100-98, TAR1-100-99, TAR1-100-100, TAR1-100-101, TAR1-100-102, TAR1-100-103, TAR1-100-105, TAR1-100-106, TAR1-100-107, TAR1-100-108, TAR1-100-109, TAR1-100-110, TAR1-100-111, TAR1-100-112, TAR1-100-113, TAR1-5-19, 또는 이들과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열에서 선택되는 항체 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함한다.
다른 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 클론 TAR1-2m-9, TAR1-2m-30, TAR1-2m-l, TAR1-2m-2, TAR1-5, TAR1-27, TAR1-261, TAR1-398, TAR1-701, TAR1-5-2, TAR1-5-3, TAR1-5-4, TAR1-5-7, TAR1-5-8, TAR1-5-10, TAR1-5-11, TAR1-5-12, TAR1-5-13, TAR1-5-19, TAR1-5-20, TAR1-5-21, TAR1-5-22, TAR1-5-23, TAR1-5-24, TAR1-5-25, TAR1-5-26, TAR1-5-27, TAR1-5-28, TAR1-5-29, TAR1-5-34, TAR1-5-35, TAR1-5-36, TAR1-5-464, TAR1-5-463, TAR1-5-460, TAR1-5-461, TAR1-5-479, TAR1-5-477, TAR1-5-478, TAR1-5-476, TAR1-5-490, TAR1h-l, TAR1h-2, TAR1h-3, TAR1-100-29, TAR1-100-35, TAR1-100-43, TAR1-100-47, TAR1-100-52, TAR1-109, TAR1-100, TAR1-100-34, TAR1-100-36, TAR1-100-38, TAR1-100-39, TAR1-100-40, TAR1-100-41, TAR1-100-45, TAR1-100-60, TAR1-100-62, TAR1-100-64, TAR1-100-65, TAR1-100-75, TAR1-100-76, TAR1-100-77, TAR1-100-78, TAR1-100-80, TAR1-100-82, TAR1-100-83, TAR1-100-84, TAR1-100-89, TAR1-100-90, TAR1-100-91, TAR1-100-92, TAR1-100-93, TAR1-100-94, TAR1-100-95, TAR1-100-96, TAR1-100-97, TAR1-100-98, TAR1-100-99, TAR1-100-100, TAR1-100-101, TAR1-100-102, TAR1-100-103, TAR1-100-105, TAR1-100-106, TAR1-100-107, TAR1-100-108, TAR1-100-109, TAR1-100-110, TAR1-100-111, TAR1-100-112, TAR1-100-113, TAR1-5-19, 또는 이들과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열에서 선택되는 항체 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함한다.
다른 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 클론 TAR1-2m-9, TAR1-2m-30, TAR1-2m-l, TAR1-2m-2, TAR1-5, TAR1-27, TAR1-261, TAR1-398, TAR1-701, TAR1-5-2, TAR1-5-3, TAR1-5-4, TAR1-5-7, TAR1-5-8, TAR1-5-10, TAR1-5-11, TAR1-5-12, TAR1-5-13, TAR1-5-19, TAR1-5-20, TAR1-5-21, TAR1-5-22, TAR1-5-23, TAR1-5-24, TAR1-5-25, TAR1-5-26, TAR1-5-27, TAR1-5-28, TAR1-5-29, TAR1-5-34, TAR1-5-35, TAR1-5-36, TAR1-5-464, TAR1-5-463, TAR1-5-460, TAR1-5-461, TAR1-5-479, TAR1-5-477, TAR1-5-478, TAR1-5-476, TAR1-5-490, TAR1h-l, TAR1h-2, TAR1h-3, TAR1-100-29, TAR1-100-35, TAR1-100-43, TAR1-100-47, TAR1-100-52, TAR1-109, TAR1-100, TAR1-100-34, TAR1-100-36, TAR1-100-38, TAR1-100-39, TAR1-100-40, TAR1-100-41, TAR1-100-45, TAR1-100-60, TAR1-100-62, TAR1-100-64, TAR1-100-65, TAR1-100-75, TAR1-100-76, TAR1-100-77, TAR1-100-78, TAR1-100-80, TAR1-100-82, TAR1-100-83, TAR1-100-84, TAR1-100-89, TAR1-100-90, TAR1-100-91, TAR1-100-92, TAR1-100-93, TAR1-100-94, TAR1-100-95, TAR1-100-96, TAR1-100-97, TAR1-100-98, TAR1-100-99, TAR1-100-100, TAR1-100-101, TAR1-100-102, TAR1-100-103, TAR1-100-105, TAR1-100-106, TAR1-100-107, TAR1-100-108, TAR1-100-109, TAR1-100-110, TAR1-100-111, TAR1-100-112, TAR1-100-113, TAR1-5-19, 또는 이들과 적어도 92% 동일한 아미노산 서열에서 선택되는 항체 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함한다.
다른 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 클론 TAR1-2m-9, TAR1-2m-30, TAR1-2m-l, TAR1-2m-2, TAR1-5, TAR1-27, TAR1-261, TAR1-398, TAR1-701, TAR1-5-2, TAR1-5-3, TAR1-5-4, TAR1-5-7, TAR1-5-8, TAR1-5-10, TAR1-5-11, TAR1-5-12, TAR1-5-13, TAR1-5-19, TAR1-5-20, TAR1-5-21, TAR1-5-22, TAR1-5-23, TAR1-5-24, TAR1-5-25, TAR1-5-26, TAR1-5-27, TAR1-5-28, TAR1-5-29, TAR1-5-34, TAR1-5-35, TAR1-5-36, TAR1-5-464, TAR1-5-463, TAR1-5-460, TAR1-5-461, TAR1-5-479, TAR1-5-477, TAR1-5-478, TAR1-5-476, TAR1-5-490, TAR1h-l, TAR1h-2, TAR1h-3, TAR1-100-29, TAR1-100-35, TAR1-100-43, TAR1-100-47, TAR1-100-52, TAR1-109, TAR1-100, TAR1-100-34, TAR1-100-36, TAR1-100-38, TAR1-100-39, TAR1-100-40, TAR1-100-41, TAR1-100-45, TAR1-100-60, TAR1-100-62, TAR1-100-64, TAR1-100-65, TAR1-100-75, TAR1-100-76, TAR1-100-77, TAR1-100-78, TAR1-100-80, TAR1-100-82, TAR1-100-83, TAR1-100-84, TAR1-100-89, TAR1-100-90, TAR1-100-91, TAR1-100-92, TAR1-100-93, TAR1-100-94, TAR1-100-95, TAR1-100-96, TAR1-100-97, TAR1-100-98, TAR1-100-99, TAR1-100-100, TAR1-100-101, TAR1-100-102, TAR1-100-103, TAR1-100-105, TAR1-100-106, TAR1-100-107, TAR1-100-108, TAR1-100-109, TAR1-100-110, TAR1-100-111, TAR1-100-112, TAR1-100-113, TAR1-5-19, 또는 이들과 적어도 94% 동일한 아미노산 서열에서 선택되는 항체 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함한다.
다른 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 클론 TAR1-2m-9, TAR1-2m-30, TAR1-2m-l, TAR1-2m-2, TAR1-5, TAR1-27, TAR1-261, TAR1-398, TAR1-701, TAR1-5-2, TAR1-5-3, TAR1-5-4, TAR1-5-7, TAR1-5-8, TAR1-5-10, TAR1-5-11, TAR1-5-12, TAR1-5-13, TAR1-5-19, TAR1-5-20, TAR1-5-21, TAR1-5-22, TAR1-5-23, TAR1-5-24, TAR1-5-25, TAR1-5-26, TAR1-5-27, TAR1-5-28, TAR1-5-29, TAR1-5-34, TAR1-5-35, TAR1-5-36, TAR1-5-464, TAR1-5-463, TAR1-5-460, TAR1-5-461, TAR1-5-479, TAR1-5-477, TAR1-5-478, TAR1-5-476, TAR1-5-490, TAR1h-l, TAR1h-2, TAR1h-3, TAR1-100-29, TAR1-100-35, TAR1-100-43, TAR1-100-47, TAR1-100-52, TAR1-109, TAR1-100, TAR1-100-34, TAR1-100-36, TAR1-100-38, TAR1-100-39, TAR1-100-40, TAR1-100-41, TAR1-100-45, TAR1-100-60, TAR1-100-62, TAR1-100-64, TAR1-100-65, TAR1-100-75, TAR1-100-76, TAR1-100-77, TAR1-100-78, TAR1-100-80, TAR1-100-82, TAR1-100-83, TAR1-100-84, TAR1-100-89, TAR1-100-90, TAR1-100-91, TAR1-100-92, TAR1-100-93, TAR1-100-94, TAR1-100-95, TAR1-100-96, TAR1-100-97, TAR1-100-98, TAR1-100-99, TAR1-100-100, TAR1-100-101, TAR1-100-102, TAR1-100-103, TAR1-100-105, TAR1-100-106, TAR1-100-107, TAR1-100-108, TAR1-100-109, TAR1-100-110, TAR1-100-111, TAR1-100-112, TAR1-100-113, TAR1-5-19, 또는 이들과 적어도 96% 동일한 아미노산 서열에서 선택되는 항체 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함한다.
다른 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 클론 TAR1-2m-9, TAR1-2m-30, TAR1-2m-l, TAR1-2m-2, TAR1-5, TAR1-27, TAR1-261, TAR1-398, TAR1-701, TAR1-5-2, TAR1-5-3, TAR1-5-4, TAR1-5-7, TAR1-5-8, TAR1-5-10, TAR1-5-11, TAR1-5-12, TAR1-5-13, TAR1-5-19, TAR1-5-20, TAR1-5-21, TAR1-5-22, TAR1-5-23, TAR1-5-24, TAR1-5-25, TAR1-5-26, TAR1-5-27, TAR1-5-28, TAR1-5-29, TAR1-5-34, TAR1-5-35, TAR1-5-36, TAR1-5-464, TAR1-5-463, TAR1-5-460, TAR1-5-461, TAR1-5-479, TAR1-5-477, TAR1-5-478, TAR1-5-476, TAR1-5-490, TAR1h-l, TAR1h-2, TAR1h-3, TAR1-100-29, TAR1-100-35, TAR1-100-43, TAR1-100-47, TAR1-100-52, TAR1-109, TAR1-100, TAR1-100-34, TAR1-100-36, TAR1-100-38, TAR1-100-39, TAR1-100-40, TAR1-100-41, TAR1-100-45, TAR1-100-60, TAR1-100-62, TAR1-100-64, TAR1-100-65, TAR1-100-75, TAR1-100-76, TAR1-100-77, TAR1-100-78, TAR1-100-80, TAR1-100-82, TAR1-100-83, TAR1-100-84, TAR1-100-89, TAR1-100-90, TAR1-100-91, TAR1-100-92, TAR1-100-93, TAR1-100-94, TAR1-100-95, TAR1-100-96, TAR1-100-97, TAR1-100-98, TAR1-100-99, TAR1-100-100, TAR1-100-101, TAR1-100-102, TAR1-100-103, TAR1-100-105, TAR1-100-106, TAR1-100-107, TAR1-100-108, TAR1-100-109, TAR1-100-110, TAR1-100-111, TAR1-100-112, TAR1-100-113, TAR1-5-19, 또는 이들과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열에서 선택되는 항체 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함한다.
다른 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 클론 TAR1-2m-9, TAR1-2m-30, TAR1-2m-l, TAR1-2m-2, TAR1-5, TAR1-27, TAR1-261, TAR1-398, TAR1-701, TAR1-5-2, TAR1-5-3, TAR1-5-4, TAR1-5-7, TAR1-5-8, TAR1-5-10, TAR1-5-11, TAR1-5-12, TAR1-5-13, TAR1-5-19, TAR1-5-20, TAR1-5-21, TAR1-5-22, TAR1-5-23, TAR1-5-24, TAR1-5-25, TAR1-5-26, TAR1-5-27, TAR1-5-28, TAR1-5-29, TAR1-5-34, TAR1-5-35, TAR1-5-36, TAR1-5-464, TAR1-5-463, TAR1-5-460, TAR1-5-461, TAR1-5-479, TAR1-5-477, TAR1-5-478, TAR1-5-476, TAR1-5-490, TAR1h-l, TAR1h-2, TAR1h-3, TAR1-100-29, TAR1-100-35, TAR1-100-43, TAR1-100-47, TAR1-100-52, TAR1-109, TAR1-100, TAR1-100-34, TAR1-100-36, TAR1-100-38, TAR1-100-39, TAR1-100-40, TAR1-100-41, TAR1-100-45, TAR1-100-60, TAR1-100-62, TAR1-100-64, TAR1-100-65, TAR1-100-75, TAR1-100-76, TAR1-100-77, TAR1-100-78, TAR1-100-80, TAR1-100-82, TAR1-100-83, TAR1-100-84, TAR1-100-89, TAR1-100-90, TAR1-100-91, TAR1-100-92, TAR1-100-93, TAR1-100-94, TAR1-100-95, TAR1-100-96, TAR1-100-97, TAR1-100-98, TAR1-100-99, TAR1-100-100, TAR1-100-101, TAR1-100-102, TAR1-100-103, TAR1-100-105, TAR1-100-106, TAR1-100-107, TAR1-100-108, TAR1-100-109, TAR1-100-110, TAR1-100-111, TAR1-100-112, TAR1-100-113, TAR1-5-19, 또는 이들과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열에서 선택되는 항체 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함한다.
더 나아가, 본 발명은 류머티스성 관절염을 치료하는 방법에 관계하는데, 상기 방법은 수용체에 대한 인간 TNFα 결합을 길항하는 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체를 함유하는 조성물의 치료 효과량을 병든 개체에 투여하여 류머티스성 관절염을 치료하는 단계를 포함하고, 상기 조성물은 관절염의 Tgl97 유전자도입 생쥐 모형의 생쥐에 투여되는 경우에 관절염 스코어의 증가를 예방하고, 상기 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 <100 nM의 Kd로 인간 TNFα에 결합하고; 상기 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 표준 L929 세포 검사에 의한 측정에서, 인간 TNFα를 중화시킨다.
더 나아가, 본 발명은 수용체에 대한 인간 TNFα 결합을 길항하고 관절염의 Tgl97 유전자도입 생쥐 모형의 생쥐에 투여되는 경우에 관절염 스코어의 증가를 예방하는 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체를 함유하는 조성물에 관계하는데, 상기 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 표준 L929 세포 검사에 의한 측정에서, 인간 TNFα를 중화시킨다.
더 나아가, 본 발명은 수용체에 대한 인간 TNFα 결합을 길항하고 관절염의 Tgl97 유전자도입 생쥐 모형의 생쥐에 투여되는 경우에 관절염 스코어의 증가를 예방하는 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체를 함유하는 조성물에 관계하는데, 상기 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 류머티스성 관절염의 진행을 저해한다.
더 나아가, 본 발명은 수용체에 대한 인간 TNFα 결합을 길항하고 관절염의 Tgl97 유전자도입 생쥐 모형의 생쥐에 투여되는 경우에 관절염 스코어의 증가를 예방하는 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체를 함유하는 조성물에 관계하는데, 상기 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 <100 nM의 Kd로 인간 TNFα에 결합한다.
더 나아가, 본 발명은 수용체에 대한 인간 TNFα 결합을 길항하고 관절염의 Tgl97 유전자도입 생쥐 모형의 생쥐에 투여되는 경우에 관절염 스코어의 증가를 예방하는 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체를 함유하는 조성물에 관계하는데, 상기 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 표준 L929 세포 검사에 의한 측정에서, 인간 TNFα를 중화시키고, 상기 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 류머티스성 관절염의 진행을 저해하고, 상기 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 <100 nM의 Kd로 인간 TNFα에 결합한다.
상기한 구체예의 추가 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 클론 TAR1-2m-9, TAR1-2m-30, TAR1-2m-l, TAR1-2m-2, TAR1-5, TAR1-27, TAR1-261, TAR1-398, TAR1-701, TAR1-5-2, TAR1-5-3, TAR1-5-4, TAR1-5-7, TAR1-5-8, TAR1-5-10, TAR1-5-11, TAR1-5-12, TAR1-5-13, TAR1-5-19, TAR1-5-20, TAR1-5-21, TAR1-5-22, TAR1-5-23, TAR1-5-24, TAR1-5-25, TAR1-5-26, TAR1-5-27, TAR1-5-28, TAR1-5-29, TAR1-5-34, TAR1-5-35, TAR1-5-36, TAR1-5-464, TAR1-5-463, TAR1-5-460, TAR1-5-461, TAR1-5-479, TAR1-5-477, TAR1-5-478, TAR1-5-476, TAR1-5-490, TAR1h-l, TAR1h-2, TAR1h-3, TAR1-100-29, TAR1-100-35, TAR1-100-43, TAR1-100-47, TAR1-100-52, TAR1-109, TAR1-100, TAR1-100-34, TAR1-100-36, TAR1-100-38, TAR1-100-39, TAR1-100-40, TAR1-100-41, TAR1-100-45, TAR1-100-60, TAR1-100-62, TAR1-100-64, TAR1-100-65, TAR1-100-75, TAR1-100-76, TAR1-100-77, TAR1-100-78, TAR1-100-80, TAR1-100-82, TAR1-100-83, TAR1-100-84, TAR1-100-89, TAR1-100-90, TAR1-100-91, TAR1-100-92, TAR1-100-93, TAR1-100-94, TAR1-100-95, TAR1-100-96, TAR1-100-97, TAR1-100-98, TAR1-100-99, TAR1-100-100, TAR1-100-101, TAR1-100-102, TAR1-100-103, TAR1-100-105, TAR1-100-106, TAR1-100-107, TAR1-100-108, TAR1-100-109, TAR1-100-110, TAR1-100-111, TAR1-100-112, TAR1-100-113, TAR1-5-19에서 선택되는 항체 폴리펩티드의 CDR3의 아미노산 서열을 포함한다.
다른 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 클론 TAR1-2m-9, TAR1-2m-30, TAR1-2m-l, TAR1-2m-2, TAR1-5, TAR1-27, TAR1-261, TAR1-398, TAR1-701, TAR1-5-2, TAR1-5-3, TAR1-5-4, TAR1-5-7, TAR1-5-8, TAR1-5-10, TAR1-5-11, TAR1-5-12, TAR1-5-13, TAR1-5-19, TAR1-5-20, TAR1-5-21, TAR1-5-22, TAR1-5-23, TAR1-5-24, TAR1-5-25, TAR1-5-26, TAR1-5-27, TAR1-5-28, TAR1-5-29, TAR1-5-34, TAR1-5-35, TAR1-5-36, TAR1-5-464, TAR1-5-463, TAR1-5-460, TAR1-5-461, TAR1-5-479, TAR1-5-477, TAR1-5-478, TAR1-5-476, TAR1-5-490, TAR1h-l, TAR1h-2, TAR1h-3, TAR1-100-29, TAR1-100-35, TAR1-100-43, TAR1-100-47, TAR1-100-52, TAR1-109, TAR1-100, TAR1-100-34, TAR1-100-36, TAR1-100-38, TAR1-100-39, TAR1-100-40, TAR1-100-41, TAR1-100-45, TAR1-100-60, TAR1-100-62, TAR1-100-64, TAR1-100-65, TAR1-100-75, TAR1-100-76, TAR1-100-77, TAR1-100-78, TAR1-100-80, TAR1-100-82, TAR1-100-83, TAR1-100-84, TAR1-100-89, TAR1-100-90, TAR1-100-91, TAR1-100-92, TAR1-100-93, TAR1-100-94, TAR1-100-95, TAR1-100-96, TAR1-100-97, TAR1-100-98, TAR1-100-99, TAR1-100-100, TAR1-100-101, TAR1-100-102, TAR1-100-103, TAR1-100-105, TAR1-100-106, TAR1-100-107, TAR1-100-108, TAR1-100-109, TAR1-100-110, TAR1-100-111, TAR1-100-112, TAR1-100-113, TAR1-5-19, 또는 이들과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열에서 선택되는 항체 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함한다.
다른 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 클론 TAR1-2m-9, TAR1-2m-30, TAR1-2m-l, TAR1-2m-2, TAR1-5, TAR1-27, TAR1-261, TAR1-398, TAR1-701, TAR1-5-2, TAR1-5-3, TAR1-5-4, TAR1-5-7, TAR1-5-8, TAR1-5-10, TAR1-5-11, TAR1-5-12, TAR1-5-13, TAR1-5-19, TAR1-5-20, TAR1-5-21, TAR1-5-22, TAR1-5-23, TAR1-5-24, TAR1-5-25, TAR1-5-26, TAR1-5-27, TAR1-5-28, TAR1-5-29, TAR1-5-34, TAR1-5-35, TAR1-5-36, TAR1-5-464, TAR1-5-463, TAR1-5-460, TAR1-5-461, TAR1-5-479, TAR1-5-477, TAR1-5-478, TAR1-5-476, TAR1-5-490, TAR1h-l, TAR1h-2, TAR1h-3, TAR1-100-29, TAR1-100-35, TAR1-100-43, TAR1-100-47, TAR1-100-52, TAR1-109, TAR1-100, TAR1-100-34, TAR1-100-36, TAR1-100-38, TAR1-100-39, TAR1-100-40, TAR1-100-41, TAR1-100-45, TAR1-100-60, TAR1-100-62, TAR1-100-64, TAR1-100-65, TAR1-100-75, TAR1-100-76, TAR1-100-77, TAR1-100-78, TAR1-100-80, TAR1-100-82, TAR1-100-83, TAR1-100-84, TAR1-100-89, TAR1-100-90, TAR1-100-91, TAR1-100-92, TAR1-100-93, TAR1-100-94, TAR1-100-95, TAR1-100-96, TAR1-100-97, TAR1-100-98, TAR1-100-99, TAR1-100-100, TAR1-100-101, TAR1-100-102, TAR1-100-103, TAR1-100-105, TAR1-100-106, TAR1-100-107, TAR1-100-108, TAR1-100-109, TAR1-100-110, TAR1-100-111, TAR1-100-112, TAR1-100-113, TAR1-5-19, 또는 이들과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열에서 선택되는 항체 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함한다.
다른 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 클론 TAR1-2m-9, TAR1-2m-30, TAR1-2m-l, TAR1-2m-2, TAR1-5, TAR1-27, TAR1-261, TAR1-398, TAR1-701, TAR1-5-2, TAR1-5-3, TAR1-5-4, TAR1-5-7, TAR1-5-8, TAR1-5-10, TAR1-5-11, TAR1-5-12, TAR1-5-13, TAR1-5-19, TAR1-5-20, TAR1-5-21, TAR1-5-22, TAR1-5-23, TAR1-5-24, TAR1-5-25, TAR1-5-26, TAR1-5-27, TAR1-5-28, TAR1-5-29, TAR1-5-34, TAR1-5-35, TAR1-5-36, TAR1-5-464, TAR1-5-463, TAR1-5-460, TAR1-5-461, TAR1-5-479, TAR1-5-477, TAR1-5-478, TAR1-5-476, TAR1-5-490, TAR1h-l, TAR1h-2, TAR1h-3, TAR1-100-29, TAR1-100-35, TAR1-100-43, TAR1-100-47, TAR1-100-52, TAR1-109, TAR1-100, TAR1-100-34, TAR1-100-36, TAR1-100-38, TAR1-100-39, TAR1-100-40, TAR1-100-41, TAR1-100-45, TAR1-100-60, TAR1-100-62, TAR1-100-64, TAR1-100-65, TAR1-100-75, TAR1-100-76, TAR1-100-77, TAR1-100-78, TAR1-100-80, TAR1-100-82, TAR1-100-83, TAR1-100-84, TAR1-100-89, TAR1-100-90, TAR1-100-91, TAR1-100-92, TAR1-100-93, TAR1-100-94, TAR1-100-95, TAR1-100-96, TAR1-100-97, TAR1-100-98, TAR1-100-99, TAR1-100-100, TAR1-100-101, TAR1-100-102, TAR1-100-103, TAR1-100-105, TAR1-100-106, TAR1-100-107, TAR1-100-108, TAR1-100-109, TAR1-100-110, TAR1-100-111, TAR1-100-112, TAR1-100-113, TAR1-5-19, 또는 이들과 적어도 92% 동일한 아미노산 서열에서 선택되는 항체 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함한다.
다른 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 클론 TAR1-2m-9, TAR1-2m-30, TAR1-2m-l, TAR1-2m-2, TAR1-5, TAR1-27, TAR1-261, TAR1-398, TAR1-701, TAR1-5-2, TAR1-5-3, TAR1-5-4, TAR1-5-7, TAR1-5-8, TAR1-5-10, TAR1-5-11, TAR1-5-12, TAR1-5-13, TAR1-5-19, TAR1-5-20, TAR1-5-21, TAR1-5-22, TAR1-5-23, TAR1-5-24, TAR1-5-25, TAR1-5-26, TAR1-5-27, TAR1-5-28, TAR1-5-29, TAR1-5-34, TAR1-5-35, TAR1-5-36, TAR1-5-464, TAR1-5-463, TAR1-5-460, TAR1-5-461, TAR1-5-479, TAR1-5-477, TAR1-5-478, TAR1-5-476, TAR1-5-490, TAR1h-l, TAR1h-2, TAR1h-3, TAR1-100-29, TAR1-100-35, TAR1-100-43, TAR1-100-47, TAR1-100-52, TAR1-109, TAR1-100, TAR1-100-34, TAR1-100-36, TAR1-100-38, TAR1-100-39, TAR1-100-40, TAR1-100-41, TAR1-100-45, TAR1-100-60, TAR1-100-62, TAR1-100-64, TAR1-100-65, TAR1-100-75, TAR1-100-76, TAR1-100-77, TAR1-100-78, TAR1-100-80, TAR1-100-82, TAR1-100-83, TAR1-100-84, TAR1-100-89, TAR1-100-90, TAR1-100-91, TAR1-100-92, TAR1-100-93, TAR1-100-94, TAR1-100-95, TAR1-100-96, TAR1-100-97, TAR1-100-98, TAR1-100-99, TAR1-100-100, TAR1-100-101, TAR1-100-102, TAR1-100-103, TAR1-100-105, TAR1-100-106, TAR1-100-107, TAR1-100-108, TAR1-100-109, TAR1-100-110, TAR1-100-111, TAR1-100-112, TAR1-100-113, TAR1-5-19, 또는 이들과 적어도 94% 동일한 아미노산 서열에서 선택되는 항체 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함한다.
다른 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 클론 TAR1-2m-9, TAR1-2m-30, TAR1-2m-l, TAR1-2m-2, TAR1-5, TAR1-27, TAR1-261, TAR1-398, TAR1-701, TAR1-5-2, TAR1-5-3, TAR1-5-4, TAR1-5-7, TAR1-5-8, TAR1-5-10, TAR1-5-11, TAR1-5-12, TAR1-5-13, TAR1-5-19, TAR1-5-20, TAR1-5-21, TAR1-5-22, TAR1-5-23, TAR1-5-24, TAR1-5-25, TAR1-5-26, TAR1-5-27, TAR1-5-28, TAR1-5-29, TAR1-5-34, TAR1-5-35, TAR1-5-36, TAR1-5-464, TAR1-5-463, TAR1-5-460, TAR1-5-461, TAR1-5-479, TAR1-5-477, TAR1-5-478, TAR1-5-476, TAR1-5-490, TAR1h-l, TAR1h-2, TAR1h-3, TAR1-100-29, TAR1-100-35, TAR1-100-43, TAR1-100-47, TAR1-100-52, TAR1-109, TAR1-100, TAR1-100-34, TAR1-100-36, TAR1-100-38, TAR1-100-39, TAR1-100-40, TAR1-100-41, TAR1-100-45, TAR1-100-60, TAR1-100-62, TAR1-100-64, TAR1-100-65, TAR1-100-75, TAR1-100-76, TAR1-100-77, TAR1-100-78, TAR1-100-80, TAR1-100-82, TAR1-100-83, TAR1-100-84, TAR1-100-89, TAR1-100-90, TAR1-100-91, TAR1-100-92, TAR1-100-93, TAR1-100-94, TAR1-100-95, TAR1-100-96, TAR1-100-97, TAR1-100-98, TAR1-100-99, TAR1-100-100, TAR1-100-101, TAR1-100-102, TAR1-100-103, TAR1-100-105, TAR1-100-106, TAR1-100-107, TAR1-100-108, TAR1-100-109, TAR1-100-110, TAR1-100-111, TAR1-100-112, TAR1-100-113, TAR1-5-19, 또는 이들과 적어도 96% 동일한 아미노산 서열에서 선택되는 항체 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함한다.
다른 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 클론 TAR1-2m-9, TAR1-2m-30, TAR1-2m-l, TAR1-2m-2, TAR1-5, TAR1-27, TAR1-261, TAR1-398, TAR1-701, TAR1-5-2, TAR1-5-3, TAR1-5-4, TAR1-5-7, TAR1-5-8, TAR1-5-10, TAR1-5-11, TAR1-5-12, TAR1-5-13, TAR1-5-19, TAR1-5-20, TAR1-5-21, TAR1-5-22, TAR1-5-23, TAR1-5-24, TAR1-5-25, TAR1-5-26, TAR1-5-27, TAR1-5-28, TAR1-5-29, TAR1-5-34, TAR1-5-35, TAR1-5-36, TAR1-5-464, TAR1-5-463, TAR1-5-460, TAR1-5-461, TAR1-5-479, TAR1-5-477, TAR1-5-478, TAR1-5-476, TAR1-5-490, TAR1h-l, TAR1h-2, TAR1h-3, TAR1-100-29, TAR1-100-35, TAR1-100-43, TAR1-100-47, TAR1-100-52, TAR1-109, TAR1-100, TAR1-100-34, TAR1-100-36, TAR1-100-38, TAR1-100-39, TAR1-100-40, TAR1-100-41, TAR1-100-45, TAR1-100-60, TAR1-100-62, TAR1-100-64, TAR1-100-65, TAR1-100-75, TAR1-100-76, TAR1-100-77, TAR1-100-78, TAR1-100-80, TAR1-100-82, TAR1-100-83, TAR1-100-84, TAR1-100-89, TAR1-100-90, TAR1-100-91, TAR1-100-92, TAR1-100-93, TAR1-100-94, TAR1-100-95, TAR1-100-96, TAR1-100-97, TAR1-100-98, TAR1-100-99, TAR1-100-100, TAR1-100-101, TAR1-100-102, TAR1-100-103, TAR1-100-105, TAR1-100-106, TAR1-100-107, TAR1-100-108, TAR1-100-109, TAR1-100-110, TAR1-100-111, TAR1-100-112, TAR1-100-113, TAR1-5-19, 또는 이들과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열에서 선택되는 항체 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함한다.
다른 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 클론 TAR1-2m-9, TAR1-2m-30, TAR1-2m-l, TAR1-2m-2, TAR1-5, TAR1-27, TAR1-261, TAR1-398, TAR1-701, TAR1-5-2, TAR1-5-3, TAR1-5-4, TAR1-5-7, TAR1-5-8, TAR1-5-10, TAR1-5-11, TAR1-5-12, TAR1-5-13, TAR1-5-19, TAR1-5-20, TAR1-5-21, TAR1-5-22, TAR1-5-23, TAR1-5-24, TAR1-5-25, TAR1-5-26, TAR1-5-27, TAR1-5-28, TAR1-5-29, TAR1-5-34, TAR1-5-35, TAR1-5-36, TAR1-5-464, TAR1-5-463, TAR1-5-460, TAR1-5-461, TAR1-5-479, TAR1-5-477, TAR1-5-478, TAR1-5-476, TAR1-5-490, TAR1h-l, TAR1h-2, TAR1h-3, TAR1-100-29, TAR1-100-35, TAR1-100-43, TAR1-100-47, TAR1-100-52, TAR1-109, TAR1-100, TAR1-100-34, TAR1-100-36, TAR1-100-38, TAR1-100-39, TAR1-100-40, TAR1-100-41, TAR1-100-45, TAR1-100-60, TAR1-100-62, TAR1-100-64, TAR1-100-65, TAR1-100-75, TAR1-100-76, TAR1-100-77, TAR1-100-78, TAR1-100-80, TAR1-100-82, TAR1-100-83, TAR1-100-84, TAR1-100-89, TAR1-100-90, TAR1-100-91, TAR1-100-92, TAR1-100-93, TAR1-100-94, TAR1-100-95, TAR1-100-96, TAR1-100-97, TAR1-100-98, TAR1-100-99, TAR1-100-100, TAR1-100-101, TAR1-100-102, TAR1-100-103, TAR1-100-105, TAR1-100-106, TAR1-100-107, TAR1-100-108, TAR1-100-109, TAR1-100-110, TAR1-100-111, TAR1-100-112, TAR1-100-113, TAR1-5-19, 또는 이들과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열에서 선택되는 항체 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함한다.
더 나아가, 본 발명은 류머티스성 관절염을 치료하는 방법에 관계하는데, 상기 방법은 수용체에 대한 인간 VEGF 결합을 길항하는 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체를 함유하는 조성물의 치료 효과량을 병든 개체에 투여하여 류머티스성 관절염을 치료하는 단계를 포함한다.
한 구체예에서, 조성물은 콜라겐 유도된 관절염(CIA) 생쥐 모형으로부터 생쥐에 투여되는 경우에 관절염 스코어의 증가를 예방한다.
뮤린 II형 콜라겐으로 DBA/1 생쥐의 면역화(immunization)는 인간 자가면역 관절염에 대한 강한 모형을 제공하는 만성 재발성 다발성 관절염(chronic relapsing polyarthritis)을 유도한다. 상기 모형은 예로써, Courtenay et al., 1980, Nature 282:666-668, Kato et al., 1996, Ann. Rheum. Dis. 55:535-539 및 Myers et al., 1997, Life Sci. 61: 1861-1878에서 기술된다.
한 구체예에서, 생쥐에 조성물의 투여는 아래의 단계를 포함한다: a) CIA 모형 생쥐에 상기 조성물의 주1회 복강내 주사를 투여하고, b) 단계 a)의 생쥐를 주1회 칭량하고, c) 상기 생쥐에서 아래의 체계: 0 = 관절염 없음(정상 외관과 굴곡), 1 = 경등도 관절염(관절 염좌), 2 = 중등도 관절염(부종, 관절 변형), 3 = 중증도 관절염(심각하게 손상된 움직임)에 따라 관절염의 거대표현형적 증상에 대한 스코어를 기록한다.
한 구체예에서, 치료는 류머티스성 관절염의 진행을 저해한다.
한 구체예에서, 치료는 류머티스성 관절염의 발병을 예방 또는 지연한다.
한 구체예에서, 투여는 RA의 하나이상의 징후에서 통계학적으로 유의한 변화를 유도한다. 적절하게는, 변화는 적어도 10% 또는 그 이상이다.
한 구체예에서, RA의 하나이상의 징후는 적혈구 침강 속도(erythrocyte sedimentation rate, ESR), 리치 관절 지수(Ritchie articular index; Ritchie et al., 1968, Q. J. Med. 37: 393-406)와 조조 강직(morning stiffness)의 지속 시간, 관절 가동력(joint mobility), 관절 부종(joint swelling), 하나이상의 관절의 x 레이 영상에 의한 분석결과, 하나이상의 관절의 고정된 절편의 조직병리학적 분석에 의한 징후 중에서 하나이상이다. 치료로 달성되는 질병 활성과 변화는 질병 활성 스코어(disease activity score, DAS) 및/또는 만성 관절염 전신 지수(chronic arthritis systemic index, CASI)로 평가할 수 있다(Carotti et al., 2002, Ann. Rheum. Dis. 61:877-882, and Salaff1 et al., 2000, Rheumatology 39: 90-96).
한 구체예에서, RA의 하나이상의 징후는 조성물이 콜라겐 유도된 관절염(CIA) 생쥐 모형으로부터 생쥐에 투여되는 경우에 상기 생쥐에서 관절염의 거대표현형적 증상(macrophenotypic sign)의 감소이고, 여기서 상기 생쥐는 관절염의 거대표현형적 증상에 대한 스코어가 기록되고, 관절염의 거대표현형적 증상은 아래의 체계: 0 = 관절염 없음(정상 외관과 굴곡), 1 = 경등도 관절염(관절 염좌), 2 = 중등도 관절염(부종, 관절 변형), 3 = 중증도 관절염(심각하게 손상된 움직임)에 따라 스코어가 기록된다.
한 구체예에서, RA의 하나이상의 징후는 조성물이 콜라겐 유도된 관절염(CIA) 생쥐 모형으로부터 생쥐에 투여되는 경우에 상기 생쥐에서 관절염의 조직병리학적 증상(histopathological sign)의 감소이고, 여기서 상기 생쥐는 관절염의 조직병리학적 증상에 대한 스코어가 기록되고, 관절염의 조직병리학적 검사는 관절에서 수행되고 아래의 체계: 0 = 검출되는 병리 없음, 1 = 활액막(synovial membrane)의 과형성(hyperplasia)과 다형핵 침윤물(polymorphonuclear infiltrate)의 존재, 2 = 파누스(pannus)와 섬유상 조직 형성 및 병소 연골하골 골 침식(focal subchondral bone erosion), 3 = 관절 연골 파괴와 골 침식, 4 = 광범위한 관절 연골 파괴와 골 침식에 따라 스코어가 기록된다.
한 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 인간 단일 도메인 항체 폴리펩티드를 포함한다.
한 구체예에서, 인간 단일 도메인 항체 폴리펩티드는 VEGF에 결합한다.
한 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 <100 nM의 Kd로 인간 VEGF에 결합한다.
한 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 100 nM 내지 50 pM 범위의 Kd로 인간 VEGF에 결합한다.
한 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 30 nM 내지 50 pM 범위의 Kd로 인간 VEGF에 결합한다.
한 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 10 nM 내지 50 pM 범위의 Kd로 인간 VEGF에 결합한다.
한 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 1 nM 내지 50 pM 범위의 Kd로 인간 VEGF에 결합한다.
한 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 VEGF 수용체 1 검사 또는 VEGF 수용체 2 검사에 의한 측정에서, 인간 VEGF를 중화시킨다.
더 나아가, 본 발명은 류머티스성 관절염을 치료하는 방법에 관계하는데, 상기 방법은 수용체에 대한 인간 VEGF 결합을 길항하는 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체를 함유하는 조성물의 치료 효과량을 병든 개체에 투여하여 류머티스성 관절염을 치료하는 단계를 포함하고, 상기 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 VEGF 수용체에 대한 인간 VEGF의 결합을 저해한다.
한 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 세포 표면 수용체에 결합된 인간 VEGF에 특이적으로 결합한다.
한 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 PEG 분자에 연결된다.
한 구체예에서, PEG-연결된 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 적어도 24 kDa의 유체역학적 크기(hydrodynamic size)를 갖고, 전체 PEG 크기는 20 내지 60 kDa이다.
한 구체예에서, PEG-연결된 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 적어도 200 kDa의 유체역학적 크기(hydrodynamic size)를 갖고, 전체 PEG 크기는 20 내지 60 kDa이다.
한 구체예에서, 본 발명의 PEG화된 단백질은 평균적으로, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 17, 20, 또는 그 이상의 폴리에틸렌 글리콜 분자에 연결된다.
한 구체예에서, 항체 구조체는 인간 VEGF에 결합하는 2개 이상의 단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드를 포함한다.
한 구체예에서, 항체 구조체는 인간 VEGF에 결합하는 단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드의 동종이량체를 포함한다.
한 구체예에서, 항체 구조체는 인간 VEGF에 결합하는 단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드의 동종삼량체를 포함한다.
한 구체예에서, 항체 구조체는 인간 VEGF에 결합하는 단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드의 동종사량체를 포함한다.
한 구체예에서, 항체 구조체는 VEGF 이외의 항원에 특이적인 항체 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
한 구체예에서, VEGF 이외의 항원에 특이적인 항체 폴리펩티드는 단일 도메인 항체 폴리펩티드를 포함한다.
한 구체예에서, VEGF 이외의 항원에 특이적인 항체 폴리펩티드에 의한 VEGF 이외의 항원의 결합은 항체 폴리펩티드 구조체의 생체내 반감기(in vivo half-life)를 증가시킨다.
한 구체예에서, VEGF 이외의 항원은 혈청 단백질을 포함한다.
한 구체예에서, 혈청 단백질은 피브린(fibrin), α-2 마크로글로불린(macroglobulin), 혈청 알부민(serum albumin), 피브리노겐(fibrinogen) A, 피브리노겐, 혈청 아밀로이드 단백질 A, 헵타글로빈(heptaglobin), 프로필린, 유비퀴틴(ubiquitin), 유테로글로불린(uteroglobulin), β-2 마크로글로불린(microglobulin)에서 선택된다.
한 구체예에서, VEGF 이외의 항원은 HSA를 포함한다.
한 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 15분 내지 12시간 범위의 생체내 tα-반감기(in vivo tα-half life)를 갖는다. 다른 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 1시간 내지 6시간 범위의 생체내 tα-반감기를 갖는다.
다른 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 2시간 내지 5시간 범위의 생체내 tα-반감기를 갖는다. 다른 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 3시간 내지 4시간 범위의 생체내 tα-반감기를 갖는다.
다른 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 12시간 내지 60시간 범위의 생체내 tβ-반감기(in vivo tβ-half life)를 갖는다. 다른 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 12시간 내지 48시간 범위의 생체내 tβ-반감기를 갖는다.
다른 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 12시간 내지 26시간 범위의 생체내 tβ-반감기를 갖는다. 다른 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 15 ㎎.min/㎖ 내지 150 ㎎.min/㎖ 범위의 생체내 AUC 반감기(in vivo AUC half life) 수치를 갖는다. 다른 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 15 ㎎.min/㎖ 내지 100 ㎎.min/㎖ 범위의 생체내 AUC 반감기 수치를 갖는다. 다른 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 15 ㎎.min/㎖ 내지 75 ㎎.min/㎖ 범위의 생체내 AUC 반감기 수치를 갖는다. 다른 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 15 ㎎.min/㎖ 내지 50 ㎎.min/㎖ 범위의 생체내 AUC 반감기 수치를 갖는다.
한 구체예에서, 치료는 적어도 한가지 추가의 치료제의 투여를 더욱 포함한다.
한 구체예에서, 치료제는 Etanercept, Inflixmab, D2E7에서 선택된다.
한 구체예에서, 치료제는 코르티코스테로이드(corticosteroid), 비-스테로이드성 소염제(NSAIDS), 아세틸살리실산(acetylsalicylic acid), 피라졸론(pyrazolone), 페나메이트(fenamate), 디플루니살(diflunisal), 아세트산 유도체(acetic acid derivative), 프로피온산 유도체(propionic acid derivative), 옥시캄(oxicam), 메페남산(mefenamic acid), 폰스텔(Ponstel), 메클로페나메이트(meclofenamate), 메클로멘(Meclomen), 페닐부타존(phenylbutazone), 부타졸리딘(Butazolidin), 디플루니살(diflunisal), 돌로비드(Dolobid), 디클로페낙(diclofenac), 볼타렌(Voltaren), 인도메타신(indomethacin), 인도신(Indocin), 술린닥(sulindac), 클리노릴(Clinoril), 에토돌락(etodolac), 로딘(Lodine), 케토롤락(ketorolac), 토라돌(Toradol), 나부메톤(nabumetone), 렐라펜(Relafen), 톨메틴(tolmetin), 톨렉틴(Tolectin), 이부프로펜(ibuprofen), 모트린(Motrin), 페노프로펜(fenoprofen), 날폰(Nalfon), 플루르비프로펜(flurbiprofen), 안사이드(Ansaid), 카르프로펜(carprofen), 리마딜(Rimadyl), 케토프로펜(ketoprofen), 오루디스(Orudis), 나프록센(naproxen), 아나프록스(Anaprox), 나프로신(Naprosyn), 피록시캄(piroxicam), 펠덴(Feldene)에서 선택된다.
한 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 클론 TAR15-1, TAR15-3, TAR15-4, TAR15-9, TAR15-10, TAR15-11, TAR15-12, TAR15-13, TAR15-14, TAR15-15, TAR15-16, TAR15-17, TAR15-18, TAR15-19, TAR15-20, TAR15-22, TAR15-5, TAR15-6, TAR15-7, TAR15-8, TAR15-23, TAR15-24, TAR15-25, TAR15-26, TAR15-27, TAR15-29, TAR15-30에서 선택되는 항체 폴리펩티드의 CDR3의 아미노산 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 클론 TAR15-1, TAR15-3, TAR15-4, TAR15-9, TAR15-10, TAR15-11, TAR15-12, TAR15-13, TAR15-14, TAR15-15, TAR15-16, TAR15-17, TAR15-18, TAR15-19, TAR15-20, TAR15-22, TAR15-5, TAR15-6, TAR15-7, TAR15-8, TAR15-23, TAR15-24, TAR15-25, TAR15-26, TAR15-27, TAR15-29, TAR15-30, 또는 이들과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열에서 선택되는 항체 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 클론 TAR15-1, TAR15-3, TAR15-4, TAR15-9, TAR15-10, TAR15-11, TAR15-12, TAR15-13, TAR15-14, TAR15-15, TAR15-16, TAR15-17, TAR15-18, TAR15-19, TAR15-20, TAR15-22, TAR15-5, TAR15-6, TAR15-7, TAR15-8, TAR15-23, TAR15-24, TAR15-25, TAR15-26, TAR15-27, TAR15-29, TAR15-30, 또는 이들과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열에서 선택되는 항체 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 클론 TAR15-1, TAR15-3, TAR15-4, TAR15-9, TAR15-10, TAR15-11, TAR15-12, TAR15-13, TAR15-14, TAR15-15, TAR15-16, TAR15-17, TAR15-18, TAR15-19, TAR15-20, TAR15-22, TAR15-5, TAR15-6, TAR15-7, TAR15-8, TAR15-23, TAR15-24, TAR15-25, TAR15-26, TAR15-27, TAR15-29, TAR15-30, 또는 이들과 적어도 92% 동일한 아미노산 서열에서 선택되는 항체 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 클론 TAR15-1, TAR15-3, TAR15-4, TAR15-9, TAR15-10, TAR15-11, TAR15-12, TAR15-13, TAR15-14, TAR15-15, TAR15-16, TAR15-17, TAR15-18, TAR15-19, TAR15-20, TAR15-22, TAR15-5, TAR15-6, TAR15-7, TAR15-8, TAR15-23, TAR15-24, TAR15-25, TAR15-26, TAR15-27, TAR15-29, TAR15-30, 또는 이들과 적어도 94% 동일한 아미노산 서열에서 선택되는 항체 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 클론 TAR15-1, TAR15-3, TAR15-4, TAR15-9, TAR15-10, TAR15-11, TAR15-12, TAR15-13, TAR15-14, TAR15-15, TAR15-16, TAR15-17, TAR15-18, TAR15-19, TAR15-20, TAR15-22, TAR15-5, TAR15-6, TAR15-7, TAR15-8, TAR15-23, TAR15-24, TAR15-25, TAR15-26, TAR15-27, TAR15-29, TAR15-30, 또는 이들과 적어도 96% 동일한 아미노산 서열에서 선택되는 항체 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 클론 TAR15-1, TAR15-3, TAR15-4, TAR15-9, TAR15-10, TAR15-11, TAR15-12, TAR15-13, TAR15-14, TAR15-15, TAR15-16, TAR15-17, TAR15-18, TAR15-19, TAR15-20, TAR15-22, TAR15-5, TAR15-6, TAR15-7, TAR15-8, TAR15-23, TAR15-24, TAR15-25, TAR15-26, TAR15-27, TAR15-29, TAR15-30, 또는 이들과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열에서 선택되는 항체 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 클론 TAR15-1, TAR15-3, TAR15-4, TAR15-9, TAR15-10, TAR15-11, TAR15-12, TAR15-13, TAR15-14, TAR15-15, TAR15-16, TAR15-17, TAR15-18, TAR15-19, TAR15-20, TAR15-22, TAR15-5, TAR15-6, TAR15-7, TAR15-8, TAR15-23, TAR15-24, TAR15-25, TAR15-26, TAR15-27, TAR15-29, TAR15-30, 또는 이들과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열에서 선택되는 항체 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함한다.
더 나아가, 본 발명은 수용체에 대한 인간 VEGF 결합을 길항하는 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체를 함유하는 조성물에 관계하는데, 상기 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 클론 TAR15-1, TAR15-3, TAR15-4, TAR15-9, TAR15-10, TAR15-11, TAR15-12, TAR15-13, TAR15-14, TAR15-15, TAR15-16, TAR15-17, TAR15-18, TAR15-19, TAR15-20, TAR15-22, TAR15-5, TAR15-6, TAR15-7, TAR15-8, TAR15-23, TAR15-24, TAR15-25, TAR15-26, TAR15-27, TAR15-29, TAR15-30에서 선택되는 CDR3 서열을 포함한다.
더 나아가, 본 발명은 수용체에 대한 인간 VEGF 결합을 길항하는 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체를 함유하는 조성물에 관계하는데, 상기 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 클론 TAR15-1, TAR15-3, TAR15-4, TAR15-9, TAR15-10, TAR15-11, TAR15-12, TAR15-13, TAR15-14, TAR15-15, TAR15-16, TAR15-17, TAR15-18, TAR15-19, TAR15-20, TAR15-22, TAR15-5, TAR15-6, TAR15-7, TAR15-8, TAR15-23, TAR15-24, TAR15-25, TAR15-26, TAR15-27, TAR15-29, TAR15-30, 또는 이들과 적어도 85% 동일한 서열에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
더 나아가, 본 발명은 수용체에 대한 인간 VEGF 결합을 길항하는 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체를 함유하는 조성물에 관계하는데, 상기 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 클론 TAR15-1, TAR15-3, TAR15-4, TAR15-9, TAR15-10, TAR15-11, TAR15-12, TAR15-13, TAR15-14, TAR15-15, TAR15-16, TAR15-17, TAR15-18, TAR15-19, TAR15-20, TAR15-22, TAR15-5, TAR15-6, TAR15-7, TAR15-8, TAR15-23, TAR15-24, TAR15-25, TAR15-26, TAR15-27, TAR15-29, TAR15-30, 또는 이들과 적어도 90% 동일한 서열에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
더 나아가, 본 발명은 수용체에 대한 인간 VEGF 결합을 길항하는 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체를 함유하는 조성물에 관계하는데, 상기 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 클론 TAR15-1, TAR15-3, TAR15-4, TAR15-9, TAR15-10, TAR15-11, TAR15-12, TAR15-13, TAR15-14, TAR15-15, TAR15-16, TAR15-17, TAR15-18, TAR15-19, TAR15-20, TAR15-22, TAR15-5, TAR15-6, TAR15-7, TAR15-8, TAR15-23, TAR15-24, TAR15-25, TAR15-26, TAR15-27, TAR15-29, TAR15-30, 또는 이들과 적어도 92% 동일한 서열에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
더 나아가, 본 발명은 수용체에 대한 인간 VEGF 결합을 길항하는 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체를 함유하는 조성물에 관계하는데, 상기 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 클론 TAR15-1, TAR15-3, TAR15-4, TAR15-9, TAR15-10, TAR15-11, TAR15-12, TAR15-13, TAR15-14, TAR15-15, TAR15-16, TAR15-17, TAR15-18, TAR15-19, TAR15-20, TAR15-22, TAR15-5, TAR15-6, TAR15-7, TAR15-8, TAR15-23, TAR15-24, TAR15-25, TAR15-26, TAR15-27, TAR15-29, TAR15-30, 또는 이들과 적어도 94% 동일한 서열에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
더 나아가, 본 발명은 수용체에 대한 인간 VEGF 결합을 길항하는 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체를 함유하는 조성물에 관계하는데, 상기 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 클론 TAR15-1, TAR15-3, TAR15-4, TAR15-9, TAR15-10, TAR15-11, TAR15-12, TAR15-13, TAR15-14, TAR15-15, TAR15-16, TAR15-17, TAR15-18, TAR15-19, TAR15-20, TAR15-22, TAR15-5, TAR15-6, TAR15-7, TAR15-8, TAR15-23, TAR15-24, TAR15-25, TAR15-26, TAR15-27, TAR15-29, TAR15-30, 또는 이들과 적어도 96% 동일한 서열에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
더 나아가, 본 발명은 수용체에 대한 인간 VEGF 결합을 길항하는 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체를 함유하는 조성물에 관계하는데, 상기 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 클론 TAR15-1, TAR15-3, TAR15-4, TAR15-9, TAR15-10, TAR15-11, TAR15-12, TAR15-13, TAR15-14, TAR15-15, TAR15-16, TAR15-17, TAR15-18, TAR15-19, TAR15-20, TAR15-22, TAR15-5, TAR15-6, TAR15-7, TAR15-8, TAR15-23, TAR15-24, TAR15-25, TAR15-26, TAR15-27, TAR15-29, TAR15-30, 또는 이들과 적어도 98% 동일한 서열에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
더 나아가, 본 발명은 수용체에 대한 인간 VEGF 결합을 길항하는 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체를 함유하는 조성물에 관계하는데, 상기 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 클론 TAR15-1, TAR15-3, TAR15-4, TAR15-9, TAR15-10, TAR15-11, TAR15-12, TAR15-13, TAR15-14, TAR15-15, TAR15-16, TAR15-17, TAR15-18, TAR15-19, TAR15-20, TAR15-22, TAR15-5, TAR15-6, TAR15-7, TAR15-8, TAR15-23, TAR15-24, TAR15-25, TAR15-26, TAR15-27, TAR15-29, TAR15-30, 또는 이들과 적어도 99% 동일한 서열에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 또한, 류머티스성 관절염을 치료하는 방법에 관계하는데, 상기 방법은 수용체에 대한 인간 TNFα 결합을 길항하고 수용체에 대한 인간 VEGF 결합을 길항하는 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체를 함유하는 조성물의 치료 효과량을 병든 개체에 투여하여 류머티스성 관절염을 치료하는 단계를 포함한다.
한 구체예에서, 조성물은 관절염의 Tgl97 유전자도입 생쥐 모형(transgenic mouse model)의 생쥐에 투여되는 경우에 관절염 스코어의 증가를 예방한다.
다른 구체예에서, Tgl97 유전자도입 생쥐에 조성물의 투여는 아래의 단계를 포함한다: a) 이형접합성 Tgl97 유전자도입 생쥐에 상기 조성물의 주1회 복강내 주사를 투여하고, b) 단계 a)의 생쥐를 주1회 칭량하고, c) 상기 생쥐에서 아래의 체계: 0 = 관절염 없음(정상 외관과 굴곡), 1 = 경등도 관절염(관절 염좌), 2 = 중등도 관절염(부종, 관절 변형), 3 = 중증도 관절염(심각하게 손상된 움직임)에 따라 관절염의 거대표현형적 증상에 대한 스코어를 기록한다.
다른 구체예에서, 조성물은 Tgl97 유전자도입 생쥐 관절염 검사에서, Etanercept, Infliximab, D2E7에서 선택되는 약제의 효능과 통계학적 유의성의 범위 내에서 동등하거나 이를 초과하는 효능을 갖는다.
다른 구체예에서, 치료는 류머티스성 관절염의 진행의 저해를 포함한다.
다른 구체예에서, 치료는 류머티스성 관절염의 발병의 예방이나 지연을 포함한다.
다른 구체예에서, 투여는 RA의 하나이상의 징후에서 통계학적으로 유의한 변화를 유도한다.
다른 구체예에서, RA의 하나이상의 징후는 적혈구 침강 속도(erythrocyte sedimentation rate, ESR), 리치 관절 지수(Ritchie articular index)와 조조 강직(morning stiffness)의 지속 시간, 관절 가동력(joint mobility), 관절 부종(joint swelling), 하나이상의 관절의 x 레이 영상, 하나이상의 관절의 고정된 절편의 조직병리학적 분석결과 중에서 하나이상이다.
다른 구체예에서, RA의 하나이상의 징후는 조성물이 Tgl97 유전자도입 생쥐에 투여되는 경우에 상기 Tgl97 유전자도입 생쥐에서 관절염의 거대표현형적 증상(macrophenotypic sign)의 감소이고, 여기서 상기 Tgl97 유전자도입 생쥐는 관절염의 거대표현형적 증상에 대한 스코어가 기록되고, 관절염의 거대표현형적 증상은 아래의 체계: 0 = 관절염 없음(정상 외관과 굴곡), 1 = 경등도 관절염(관절 염좌), 2 = 중등도 관절염(부종, 관절 변형), 3 = 중증도 관절염(심각하게 손상된 움직임)에 따라 스코어가 기록된다.
다른 구체예에서, RA의 하나이상의 징후는 조성물이 Tgl97 유전자도입 생쥐에 투여되는 경우에 상기 Tgl97 유전자도입 생쥐에서 관절염의 조직병리학적 증상(histopathological sign)의 감소이고, 여기서 상기 Tgl97 유전자도입 생쥐는 관절염의 조직병리학적 증상에 대한 스코어가 기록되고, 관절염의 조직병리학적 검사는 관절에서 수행되고 아래의 체계: 0 = 검출되는 병리 없음, 1 = 활액막(synovial membrane)의 과형성(hyperplasia)과 다형핵 침윤물(polymorphonuclear infiltrate)의 존재, 2 = 파누스(pannus)와 섬유상 조직 형성 및 병소 연골하골 골 침식(focal subchondral bone erosion), 3 = 관절 연골 파괴와 골 침식, 4 = 광범위한 관절 연골 파괴와 골 침식에 따라 스코어가 기록된다.
다른 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 인간 단일 도메인 항체 폴리펩티드를 포함한다.
다른 구체예에서, 인간 단일 도메인 항체 폴리펩티드는 TNFα와 VEGF에 결합한다.
다른 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 표준 L929 세포 검사에 의한 측정에서, 인간 TNFα를 중화시킨다.
다른 구체예에서, 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 PEG 분자에 연결된다.
다른 구체예에서, PEG-연결된 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 적어도 24 kDa의 유체역학적 크기(hydrodynamic size)를 갖고, 전체 PEG 크기는 20 내지 60 kDa이다.
다른 구체예에서, PEG-연결된 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 적어도 200 kDa의 유체역학적 크기(hydrodynamic size)를 갖고, 전체 PEG 크기는 20 내지 60 kDa이다.
다른 구체예에서, 항체 폴리펩티드 구조체는 평균적으로, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 17, 20, 또는 그 이상의 폴리에틸렌 글리콜 분자에 연결된다.
다른 구체예에서, 항체 구조체는 인간 TNFα에 결합하는 2개 이상의 단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드 및/또는 인간 VEGF에 결합하는 2개 이상의 단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드를 포함한다.
다른 구체예에서, 항체 구조체는 인간 TNFα에 결합하는 단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드의 동종이량체 및/또는 인간 VEGF에 결합하는 단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드의 동종이량체를 포함한다.
다른 구체예에서, 항체 구조체는 인간 TNFα에 결합하는 단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드의 동종삼량체 및/또는 인간 VEGF에 결합하는 단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드의 동종삼량체를 포함한다.
다른 구체예에서, 항체 구조체는 인간 TNFα에 결합하는 단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드의 동종사량체 및/또는 인간 VEGF에 결합하는 단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드의 동종사량체를 포함한다.
다른 구체예에서, 항체 구조체는 TNFα 또는 VEGF 이외의 항원에 특이적인 항체 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
다른 구체예에서, TNFα 또는 VEGF 이외의 항원에 특이적인 항체 폴리펩티드는 단일 도메인 항체 폴리펩티드를 포함한다.
다른 구체예에서, TNFα 또는 VEGF 이외의 항원에 특이적인 항체 폴리펩티드에 의한 TNFα 또는 VEGF 이외의 항원의 결합은 항체 폴리펩티드 구조체의 생체내 반감기(in vivo half-life)를 증가시킨다,
다른 구체예에서, TNFα 또는 VEGF 이외의 항원은 혈청 단백질을 포함한다.
다른 구체예에서, 혈청 단백질은 피브린(fibrin), α-2 마크로글로불린(macroglobulin), 혈청 알부민(serum albumin), 피브리노겐(fibrinogen) A, 피브리노겐, 혈청 아밀로이드 단백질 A, 헵타글로빈(heptaglobin), 프로필린, 유비퀴틴(ubiquitin), 유테로글로불린(uteroglobulin), β-2 마크로글로불린(microglobulin)에서 선택된다.
다른 구체예에서, TNFα 이외의 항원은 HSA를 포함한다.
다른 구체예에서, 치료는 적어도 한가지 추가의 치료제의 투여를 더욱 포함한다.
더 나아가, 본 발명은 수용체에 대한 인간 TNFα 결합을 길항하고 수용체에 대한 인간 VEGF 결합을 길항하며 관절염의 Tgl97 유전자도입 생쥐 모형의 생쥐에 투여되는 경우에 관절염 스코어의 증가를 예방하는 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체를 함유하는 조성물에 관계하는데, 상기 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 류머티스성 관절염의 진행을 저해한다.
더 나아가, 본 발명은 수용체에 대한 인간 TNFα 결합을 길항하고 수용체에 대한 인간 VEGF 결합을 길항하며 관절염의 Tgl97 유전자도입 생쥐 모형의 생쥐에 투여되는 경우에 관절염 스코어의 증가를 예방하는 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체를 함유하는 조성물에 관계하는데, 상기 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 <100 nM의 Kd로 인간 TNFα에 결합한다.
더 나아가, 본 발명은 수용체에 대한 인간 TNFα 결합을 길항하고 수용체에 대한 인간 VEGF 결합을 길항하며 관절염의 Tgl97 유전자도입 생쥐 모형의 생쥐에 투여되는 경우에 관절염 스코어의 증가를 예방하는 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체를 함유하는 조성물에 관계하는데, 상기 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 표준 L929 세포 검사에 의한 측정에서, 인간 TNFα를 중화시키고, 상기 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 류머티스성 관절염의 진행을 저해하고, 상기 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 <100 nM의 Kd로 인간 TNFα에 결합한다.
다른 측면은 수용체에 대한 인간 TNFα 결합을 길항하고 관절염의 Tgl97 유전자도입 생쥐 모형의 생쥐에 투여되는 경우에 관절염 스코어의 증가를 예방하는 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체를 선별하는 방법인데, 여기서 상기 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 표준 L929 세포 검사에 의한 측정에서, 인간 TNFα를 중화시키고, 상기 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 류머티스성 관절염의 진행을 저해하고, 상기 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 <100 nM의 Kd로 인간 TNFα에 결합하고, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다: (1) 각 부위에서 모든 가능한 아미노 치환이 발생할 수 있도록 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체의 여러 초가변 영역(hypervariable region) 부위를 인코딩하는 핵산을 돌연변이시키고; (2) 단계 (1)에서 발생된 돌연변이된 초가변 영역 부위를 인코딩하는 핵산을 파지미드(phagemid) 전시 벡터(display vector)에 도입하여 파지미드 표면 전시 단백질(surface display protein)에 전시된 상기 돌연변이된 초가변 영역 부위 중에서 하나를 발현할 수 있는 대량의 전시 벡터를 형성하고; (3) 이렇게 발생된 돌연변이된 초가변 영역 부위가 융합체로서 섬유상 파지 입자로부터 각 입자 내에 패킹된 M13의 유전자 III 산물로 일가 방식(monovalent fashion)으로 전시되도록 섬유상 파지 입자의 표면에 돌연변이된 초가변 영역 부위를 발현시키고; (4) TNFα에 결합하는 능력에 대하여 표면-발현된 파지 입자를 선별하고; (5) TNFα에 결합할 수 있는 표면-발현된 파지 입자를 분리하고; (6) TNFα에 결합할 수 있고, 또한 관절염의 Tgl97 유전자도입 생쥐 모형의 생쥐에 투여되는 경우에 관절염 스코어의 증가를 예방하고, 표준 L929 세포 검사에 의한 측정에서 인간 TNFα를 중화시키고, 류머티스성 관절염의 진행을 저해하고, <100 nM의 Kd로 인간 TNFα에 결합할 수 있는, 단계 (5)로부터 표면-발현된 파지 입자를 선별하고, 이로써 수용체에 대한 인간 TNFα 결합을 길항하는 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체를 보유하는 전시 단백질을 포함하는 한가지이상 종류의 파지미드를 선별한다.
다른 측면은 류머티스성 관절염을 치료하는 방법인데, 상기 방법은 수용체에 대한 인간 VEGF 결합을 길항하는 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체를 함유하는 조성물의 치료 효과량을 병든 개체에 투여하여 류머티스성 관절염을 치료하는 단계를 포함하고, 상기 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 15분 내지 12시간, 1시간 내지 6시간, 2시간 내지 5시간, 또는 3시간 내지 4시간 범위의 생체내 tα-반감기를 갖는다.
다른 구체예는 류머티스성 관절염을 치료하는 방법인데, 상기 방법은 수용체에 대한 인간 VEGF 결합을 길항하는 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체를 함유하는 조성물의 치료 효과량을 병든 개체에 투여하는 단계를 포함하고, 상기 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 12시간 내지 60시간, 12시간 내지 48시간, 또는 12시간 내지 26시간 범위의 생체내 tβ-반감기를 갖는다.
다른 구체예는 류머티스성 관절염을 치료하는 방법인데, 상기 방법은 수용체에 대한 인간 VEGF 결합을 길항하는 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체를 함유하는 조성물의 치료 효과량을 병든 개체에 투여하는 단계를 포함하고, 상기 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 15 ㎎.min/㎖ 내지 150 ㎎.min/㎖, 15 ㎎.min/㎖ 내지 100 ㎎.min/㎖, 15 ㎎.min/㎖ 내지 75 ㎎.min/㎖, 또는 15 ㎎.min/㎖ 내지 50 ㎎.min/㎖ 범위의 생체내 AUC 반감기 수치를 갖는다.
다른 구체예는 류머티스성 관절염을 치료하는 방법인데, 상기 방법은 수용체에 대한 인간 TNFα 결합을 길항하고 수용체에 대한 인간 VEGF 결합을 길항하는 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체를 함유하는 조성물의 치료 효과량을 병든 개체에 투여하여 류머티스성 관절염을 치료하는 단계를 포함하고, 상기 조성물은 관절염의 Tgl97 유전자도입 생쥐 모형의 생쥐에 투여되는 경우에 관절염 스코어의 증가를 예방하고, 상기 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 각각, <100 nM의 Kd로 인간 TNFα와 VEGF에 결합하거나, 상기 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 각각, 100 nM 내지 50 pM 범위의 Kd로 인간 TNFα와 VEGF에 결합하거나, 상기 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 각각, 30 nM 내지 50 pM 범위의 Kd로 인간 TNFα와 VEGF에 결합하거나, 상기 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 각각, 10 nM 내지 50 pM 범위의 Kd로 인간 TNFα와 VEGF에 결합하거나, 또는 상기 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 각각, 1 nM 내지 50 pM 범위의 Kd로 인간 TNFα와 VEGF에 결합한다.
다른 구체예는 류머티스성 관절염을 치료하는 방법인데, 상기 방법은 수용체에 대한 인간 TNFα 결합을 길항하고 수용체에 대한 인간 VEGF 결합을 길항하는 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체를 함유하는 조성물의 치료 효과량을 병든 개체에 투여하여 류머티스성 관절염을 치료하는 단계를 포함하고, 상기 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 TNFα 수용체에 인간 TNFα의 결합 및 VEGF 수용체에 인간 VEGF의 결합을 저해한다.
다른 구체예는 류머티스성 관절염을 치료하는 방법인데, 상기 방법은 수용체에 대한 인간 TNFα 결합을 길항하고 수용체에 대한 인간 VEGF 결합을 길항하는 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체를 함유하는 조성물의 치료 효과량을 병든 개체에 투여하여 류머티스성 관절염을 치료하는 단계를 포함하고, 상기 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 TNFα 수용체에 인간 TNFα의 결합 및 VEGF 수용체에 인간 VEGF의 결합을 저해하고, 상기 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 세포 표면 수용체에 결합된 인간 TNFα에 특이적으로 결합한다.
다른 구체예는 류머티스성 관절염을 치료하는 방법인데, 상기 방법은 수용체에 대한 인간 TNFα 결합을 길항하고 수용체에 대한 인간 VEGF 결합을 길항하는 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체를 함유하는 조성물의 치료 효과량을 병든 개체에 투여하여 류머티스성 관절염을 치료하는 단계를 포함하고, 상기 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 세포 표면 수용체에 결합된 인간 TNFα에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 다른 구체예는 TNFα에 특이적인 항체 구조체의 투여를 포함하는 류머티스성 관절염을 치료하는 방법인데, 여기서 상기 항체 구조체의 서열은 본 명세서에 언급된 항-TNFα 클론 중에서 임의의 하나의 서열과 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 이상의 동일성 비율(percent identity)을 갖는 서열을 포함하거나, 또는 이러한 서열로 구성된다.
본 발명의 다른 구체예는 TNFα에 특이적인 항체 구조체를 함유하는 조성물인데, 여기서 상기 항체 구조체의 서열은 본 명세서에 언급된 항-TNFα 클론 중에서 임의의 하나의 서열과 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 이상의 동일성 비율을 갖는 서열을 포함하거나, 또는 이러한 서열로 구성된다.
본 발명의 다른 구체예는 VEGF에 특이적인 항체 구조체의 투여를 포함하는 류머티스성 관절염을 치료하는 방법인데, 여기서 상기 항체 구조체의 서열은 본 명세서에 언급된 항-VEGF 클론 중에서 임의의 하나의 서열과 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 이상의 동일성 비율을 갖는 서열을 포함하거나, 또는 이러한 서열로 구성된다.
본 발명의 다른 구체예는 VEGF에 특이적인 항체 구조체를 함유하는 조성물인데, 여기서 상기 항체 구조체의 서열은 본 명세서에 언급된 항-VEGF 클론 중에서 임의의 하나의 서열과 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 이상의 동일성 비율을 갖는 서열을 포함하거나, 또는 이러한 서열로 구성된다.
다른 구체예에서, 첫 번째 항원이나 에피토프에 결합하는 VH 또는 VL 단일 도메인 항체의 2개 사본 및 두 번째 항원이나 에피토프에 결합하는 VH 또는 VL 단일 도메인 항체의 2개 사본을 포함하는 4가(tetravalent), 이중특이적(dual-specific) 항원-결합 폴리펩티드 구조체를 제시한다. 이들 첫 번째와 두 번째 에피토프는 동일한 항원에, 또는 상이한 항원에 존재할 수 있다. 첫 번째 항원이나 에피토프에 결합하는 단일 도메인 항체의 2개 사본 각각은 개별 IgG 중쇄 불변 도메인에 융합되고, 두 번째 항원이나 에피토프에 결합하는 단일 도메인 항체의 2개 사본 각각은 개별 경쇄 불변 도메인에 융합된다. 이들 4가, 이중특이적 폴리펩티드 구조체는 2개의 항원-결합 팔(arm)이 중쇄와 경쇄 불변 도메인에 의해 연결된다는 점에서 IgG-유사하다. 이들은 각 팔에 2개의 상이한 항원-특이적 단일 도메인 항체 폴리펩티드가 존재하고, 각 팔이 2개의 상이한 항원이나 에피토프에 결합하여 상기 구조체가 4가와 이중특이적이 되도록 만든다는 점에서 자연-발생 IgG와 구별된다. 한 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 에피토프는 동일하고, 따라서 상기 에피토프에 대한 4개의 특이적인 결합 부위가 폴리펩티드 구조체 상에 존재한다. 다른 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 에피토프는 상이하고, 동일하거나 상이한 항원에 존재한다.
본 명세서에 기술된 이중특이적, 4가 폴리펩티드 구조체는 임의의 2가지 항원이나 에피토프에 특이적인 단일 도메인 항체 서열을 포함할 수 있긴 하지만, 바람직하게는 인간 TNF-α와 VEGF에 특이적인 서열, 더욱 바람직하게는 본 명세서에 기술된 단일 도메인 항체 서열 중에서 하나를 포함한다. 다른 구체예에서, Cκ 또는 Cλ 경쇄 불변 도메인이 이용될 수 있고, IgG1 이외의 IgG 중쇄 불변 도메인이 또한 이용될 수 있다.
또한, 관절염의 Tgl97 유전자도입 생쥐 모형의 생쥐에 단량체로서 투여되는 경우에 관절염 스코어의 증가를 예방하는 단일 도메인 항-TNFα 항체 클론 및 콜라겐-유도된 관절염 생쥐 모형의 생쥐에 단량체로서 투여되는 경우에 관절염 스코어의 증가를 예방하는 단일 도메인 항-VEGF 항체 클론을 포함하는 이런 종류의 구조체가 제시된다. 다른 구체예에서, 이용된 단일 도메인 항-TNFα 항체 클론은 단량체로서 이용되는 경우에 본 명세서에 기술된 표준 L929 세포독성 검사에서 인간 TNFα를 중화시키고, 이용된 단일 도메인 항-VEGF 항체 클론은 단량체로서 이용되는 경우에 본 명세서에 기술된 VEGF 수용체 2 결합 검사에서 VEGF 수용체 결합을 길항한다. 다른 구체예에서, 이용된 단일 도메인 항-TNFα 항체 클론은 <100 nM의 Kd로 개별 항원이나 에피토프에 결합한다. 다른 구체예에서, 이중특이적, 2가 구조체는 <100 nM의 Kd로 개별 항원이나 에피토프에 결합하고, 본 명세서에 기술된 관절염의 Tgl97과 CIA 모형 중에서 한쪽 또는 양쪽에서 관절염 스코어의 증가를 예방한다.
이들 4가, 이중특이적 구조체는 투여, 용량, 효능의 모니터링의 관점에서, 본 명세서에 기술된 다른 구조체와 유사한 방식으로, 류머티스성 관절염의 치료에 사용될 수 있다. 구조체의 반감기는 앞서 기술된 바와 같이, 예를 들면, PEG 부분의 추가에 의해, 또는 순환 반감기(circulating half-life)를 증가시키는 단백질, 예를 들면, HSA와 같은 혈청 단백질에 특이적인 결합 부분(가령, 추가의 단일 도메인 항체)의 추가적인 융합에 의해 변경될 수 있다.
한 측면에서, TNF-α에 결합하는 첫 번째 항체 단일 도메인 폴리펩티드 및 VEGF에 결합하는 두 번째 항체 단일 도메인 폴리펩티드를 포함하는 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드를 제시한다. 이들 폴리펩티드는 예로써, 류머티스성 관절염의 치료에 사용될 수 있다.
다른 측면에서, a) 첫 번째 에피토프에 결합하고 IgG 중쇄 불변 도메인에 융합된 단일 도메인 항체 폴리펩티드를 포함하는 첫 번째 융합 단백질의 첫 번째 사본; b) 첫 번째 융합 단백질의 두 번째 사본; c) 두 번째 에피토프에 결합하고 경쇄 불변 도메인에 융합된 단일 도메인 항체 폴리펩티드를 포함하는 두 번째 융합 단백질의 첫 번째 사본; d) 두 번째 융합 단백질의 두 번째 사본을 포함하는 4가, 이중특이적(dual-specific) 항체 폴리펩티드 구조체를 제시하는데, 첫 번째 융합 단백질의 첫 번째와 두 번째 사본은 그들의 개별 IgG 중쇄 불변 도메인을 통하여 서로 이황화 결합되고, 두 번째 융합 단백질의 첫 번째 사본의 경쇄 불변 도메인은 첫 번째 융합 단백질의 첫 번째 사본의 IgG 중쇄 불변 도메인에 이황화 결합되고, 두 번째 융합 단백질의 두 번째 사본의 경쇄 불변 도메인은 첫 번째 융합 단백질의 두 번째 사본의 IgG 중쇄 불변 도메인에 이황화 결합되고, 상기 폴리펩티드 구조체는 상기 첫 번째와 두 번째 에피토프에 결합한다.
이러한 4가, 이중특이적 항원 결합 폴리펩티드 구조체의 한 구체예에서, 첫 번째 에피토프에 결합하는 단일 도메인 항체는 VH와 VL에서 선택되는 V 도메인이다.
다른 구체예에서, 두 번째 에피토프에 결합하는 단일 도메인 항체는 VH와 VL에서 선택되는 V 도메인이다.
다른 구체예에서, IgG 중쇄 불변 도메인은 IgG1 중쇄 불변 도메인이다.
다른 구체예에서, 경쇄 불변 도메인은 Cκ 또는 Cλ 경쇄 불변 도메인이다. 다른 구체예에서, 경쇄 불변 도메인은 Cκ 경쇄 불변 도메인이다.
다른 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 에피토프는 동일한 항원 상에 존재한다.
다른 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 에피토프는 상이한 첫 번째와 두 번째 항원 상에 존재한다.
다른 구체예에서, 첫 번째 에피토프에 결합하는 단일 도메인 항체 및 두 번째 에피토프에 결합하는 단일 도메인 항체 중에서 하나 또는 둘 모두 인간 단일 도메인 항체이다.
다른 구체예에서, 첫 번째 에피토프에 결합하는 단일 도메인 항체 폴리펩티드 및/또는 두 번째 에피토프에 결합하는 단일 도메인 항체 폴리펩티드는 인간 생식세포계 VH 유전자 서열에 의해 인코딩된 FW1, 인간 생식세포계 VH 유전자 서열에 의해 인코딩된 FW2, 인간 생식세포계 VH 유전자 서열에 의해 인코딩된 FW3, 인간 생식세포계 VH 유전자 서열에 의해 인코딩된 FW4 중에서 하나이상을 포함한다.
다른 구체예에서, 첫 번째 에피토프에 결합하는 단일 도메인 항체 폴리펩티드 및 두 번째 에피토프에 결합하는 단일 도메인 항체는 인간 단일 도메인 항체이다.
다른 구체예에서, IgG 중쇄 불변 도메인은 인간 IgG 중쇄 불변 도메인이다.
다른 구체예에서, IgG 중쇄 불변 도메인은 CH1 도메인을 포함한다.
다른 구체예에서, 경쇄 불변 도메인은 인간 Cκ 경쇄 불변 도메인이다.
다른 구체예에서, 상기 구조체는 TNF-α와 VEGF에 결합한다. 다른 구체예에서, VEGF에 결합하는 단일 도메인 항체는 IgG1 중쇄 불변 도메인에 융합되고, TNF-α에 결합하는 단일 도메인 항체는 Cκ 경쇄 불변 도메인에 융합된다.
다른 구체예에서, VEGF에 결합하는 단일 도메인 항체는 콜라겐-유도된 관절염 생쥐 모형의 생쥐에 투여되는 경우에 관절염 스코어의 증가를 예방한다.
다른 구체예에서, 인간 VEGF의 활성을 길항하는 단일 도메인 항체 폴리펩티드 부분은 <100 nM의 Kd로 인간 VEGF에 결합한다.
다른 구체예에서, 인간 VEGF의 활성을 길항하는 단일 도메인 항체 폴리펩티드 부분은 VEGF 수용체 1 검사 또는 VEGF 수용체 2 검사에 의한 측정에서, 인간 VEGF를 중화시킨다.
다른 구체예에서, 인간 VEGF의 활성을 길항하는 단일 도메인 항체 폴리펩티드 부분은 세포 표면 수용체에 결합된 인간 VEGF에 특이적으로 결합한다.
이런 측면의 다른 구체예에서, TNFα 결합하거나 인간 TNFα의 활성을 길항하는 단일 도메인 항체는 관절염의 Tgl97 유전자도입 생쥐 모형의 생쥐에 투여되는 경우에 관절염 스코어의 증가를 예방한다. 다른 구체예에서, 단일 도메인 항체는 표준 L929 세포독성 검사에 의한 측정에서 인간 TNFα의 활성을 길항한다. 다른 구체예에서, 단일 도메인 항체는 <100 nM의 Kd로 인간 TNFα에 결합한다.
이런 측면의 한 구체예에서, 인간 TNFα의 활성을 길항하는 단일 도메인 항체 폴리펩티드 부분은 예로써, 클론 TAR1-2m-9, TAR1-2m-30, TAR1-2m-l, TAR1-2m-2, TAR1-5, TAR1-27, TAR1-261, TAR1-398, TAR1-701, TAR1-5-2, TAR1-5-3, TAR1-5-4, TAR1-5-7, TAR1-5-8, TAR1-5-10, TAR1-5-11, TAR1-5-12, TAR1-5-13, TAR1-5-19, TAR1-5-20, TAR1-5-21, TAR1-5-22, TAR1-5-23, TAR1-5-24, TAR1-5-25, TAR1-5-26, TAR1-5-27, TAR1-5-28, TAR1-5-29, TAR1-5-34, TAR1-5-35, TAR1-5-36, TAR1-5-464, TAR1-5-463, TAR1-5-460, TAR1-5-461, TAR1-5-479, TAR1-5-477, TAR1-5-478, TAR1-5-476, TAR1-5-490, TAR1h-l, TAR1h-2, TAR1h-3, TAR1-100-29, TAR1-100-35, TAR1-100-43, TAR1-100-47, TAR1-100-52, TAR1-109, TAR1-100, TAR1-100-34, TAR1-100-36, TAR1-100-38, TAR1-100-39, TAR1-100-40, TAR1-100-41, TAR1-100-45, TAR1-100-60, TAR1-100-62, TAR1-100-64, TAR1-100-65, TAR1-100-75, TAR1-100-76, TAR1-100-77, TAR1-100-78, TAR1-100-80, TAR1-100-82, TAR1-100-83, TAR1-100-84, TAR1-100-89, TAR1-100-90, TAR1-100-91, TAR1-100-92, TAR1-100-93, TAR1-100-94, TAR1-100-95, TAR1-100-96, TAR1-100-97, TAR1-100-98, TAR1-100-99, TAR1-100-100, TAR1-100-101, TAR1-100-102, TAR1-100-103, TAR1-100-105, TAR1-100-106, TAR1-100-107, TAR1-100-108, TAR1-100-109, TAR1-100-110, TAR1-100-111, TAR1-100-112, TAR1-100-113, TAR1-5-19, 또는 상기 서열과 적어도 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열에서 선택되는 항체 폴리펩티드의 CDR3의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
이런 측면의 다른 구체예에서, 인간 TNFα의 활성을 길항하는 단일 도메인 항체 폴리펩티드 부분은 예로써, 클론 TAR1-2m-9, TAR1-2m-30, TAR1-2m-l, TAR1-2m-2, TAR1-5, TAR1-27, TAR1-261, TAR1-398, TAR1-701, TAR1-5-2, TAR1-5-3, TAR1-5-4, TAR1-5-7, TAR1-5-8, TAR1-5-10, TAR1-5-11, TAR1-5-12, TAR1-5-13, TAR1-5-19, TAR1-5-20, TAR1-5-21, TAR1-5-22, TAR1-5-23, TAR1-5-24, TAR1-5-25, TAR1-5-26, TAR1-5-27, TAR1-5-28, TAR1-5-29, TAR1-5-34, TAR1-5-35, TAR1-5-36, TAR1-5-464, TAR1-5-463, TAR1-5-460, TAR1-5-461, TAR1-5-479, TAR1-5-477, TAR1-5-478, TAR1-5-476, TAR1-5-490, TAR1h-l, TAR1h-2, TAR1h-3, TAR1-100-29, TAR1-100-35, TAR1-100-43, TAR1-100-47, TAR1-100-52, TAR1-109, TAR1-100, TAR1-100-34, TAR1-100-36, TAR1-100-38, TAR1-100-39, TAR1-100-40, TAR1-100-41, TAR1-100-45, TAR1-100-60, TAR1-100-62, TAR1-100-64, TAR1-100-65, TAR1-100-75, TAR1-100-76, TAR1-100-77, TAR1-100-78, TAR1-100-80, TAR1-100-82, TAR1-100-83, TAR1-100-84, TAR1-100-89, TAR1-100-90, TAR1-100-91, TAR1-100-92, TAR1-100-93, TAR1-100-94, TAR1-100-95, TAR1-100-96, TAR1-100-97, TAR1-100-98, TAR1-100-99, TAR1-100-100, TAR1-100-101, TAR1-100-102, TAR1-100-103, TAR1-100-105, TAR1-100-106, TAR1-100-107, TAR1-100-108, TAR1-100-109, TAR1-100-110, TAR1-100-111, TAR1-100-112, TAR1-100-113, TAR1-5-19, 또는 상기 서열과 적어도 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열에서 선택되는 항체 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
이런 측면의 한 구체예에서, VEGF 수용체에 대한 인간 VEGF의 결합을 길항하는 단일 도메인 항체 폴리펩티드 부분은 예로써, 클론 TAR15-1, TAR15-3, TAR15-4, TAR15-9, TAR15-10, TAR15-11, TAR15-12, TAR15-13, TAR15-14, TAR15-15, TAR15-16, TAR15-17, TAR15-18, TAR15-19, TAR15-20, TAR15-22, TAR15-5, TAR15-6, TAR15-7, TAR15-8, TAR15-23, TAR15-24, TAR15-25, TAR15-26, TAR15-27, TAR15-29, TAR15-30, 또는 상기 서열과 적어도 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열에서 선택되는 항체 폴리펩티드의 CDR3의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
이런 측면의 다른 구체예에서, VEGF 수용체에 대한 인간 VEGF의 결합을 길항하는 단일 도메인 항체 폴리펩티드 부분은 예로써, 클론 TAR15-1, TAR15-3, TAR15-4, TAR15-9, TAR15-10, TAR15-11, TAR15-12, TAR15-13, TAR15-14, TAR15-15, TAR15-16, TAR15-17, TAR15-18, TAR15-19, TAR15-20, TAR15-22, TAR15-5, TAR15-6, TAR15-7, TAR15-8, TAR15-23, TAR15-24, TAR15-25, TAR15-26, TAR15-27, TAR15-29, TAR15-30, 또는 상기 서열과 적어도 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열에서 선택되는 항체 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
정의
달리 정의하지 않은 경우에, 본 명세서에 이용된 모든 기술 용어와 과학 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 동일한 의미를 지닌다(가령, 세포 배양, 분자 유전학, 핵산 화학, 혼성화 기술, 생화학에서). 표준 기술은 분자적, 유전적, 생화학적 방법(참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Ausuble et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th ed. John Wiley & Sons, Inc.) 및 화학적 방법에 이용된다.
본 명세서에서, “도메인”은 단백질의 나머지 부분과 독립적으로 4차 구조를 유지하는 접힘된 단백질 구조를 의미한다. 일반적으로, 도메인은 단백질의 구별된 기능적 특성을 주도하고, 많은 경우에 단백질 및/또는 도메인의 나머지 부분의 기능 상실 없이 부가되거나, 제거되거나, 또는 다른 단백질로 이동될 수 있다.
“단일 면역글로불린 가변 도메인” 또는 “단일 도메인 항체 폴리펩티드”는 면역글로불린 가변 도메인의 특징적인 서열을 포함하고 항원에 특이적으로 결합(즉, 500 nM 이하의 분리 상수(dissociation constant))하는 접힘된 폴리펩티드 도메인을 의미한다. 따라서, “단일 도메인 항체 폴리펩티드”에는 완전 항체 가변 도메인과 변형된 가변 도메인, 예를 들면, 하나이상의 루프가 항체 가변 도메인에 특징적이지 않은 서열로 치환된 가변 도메인, 또는 절두되거나 N- 또는 C-말단 신장을 포함하는 항체 가변 도메인과 500 nM 이하의 분리 상수(가령, 450 nM 이하, 400 nM 이하, 350 nM 이하, 300 nM 이하, 250 nM 이하, 200 nM 이하, nM 이하, 100 nM 이하)와 전장 도메인의 표적 항원 특이성을 유지하는 가변 도메인의 접힘된 단편이 포함된다. 적절하게는, 항체 단일 가변 도메인은 Vκ(kappa)와 Vλ( lambda )를 비롯하여 VH와 VL에서 선택된다.
“단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체”는 분리된 단일 도메인 항체 폴리펩티드뿐만 아니라, 단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드 서열의 하나이상 단량체를 포함하는 더욱 큰 폴리펩티드 구조체를 포괄한다. 더욱 큰 구조체의 일부로서 단일 도메인 항체 폴리펩티드는 자체로써, 표적 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 따라서, 하나이상의 단일 도메인 항체 폴리펩티드를 포함하는 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 예로써, 단일 항원 분자에 특이적으로 결합하는데 필요한 결합 부위를 형성하기 위하여 VH와 VL 도메인이 협력적으로 요구되는 구조체를 포괄하지 않는다. 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체에서 단일 도메인 항체 폴리펩티드 사이의 연쇄(linkage)는 펩티드 또는 폴리펩티드 링커이거나, 또는 대안으로 다른 화학적 연쇄, 예를 들면, 다가 PEG에 폴리펩티드 단량체의 연쇄일 수 있다. 연결된 단일 도메인 항체 폴리펩티드는 동일하거나 상이할 수 있고, 구성 폴리펩티드의 표적 특이성은 유사하게 동일하거나 상이할 수 있다.
상보성: 2개의 면역글로불린 도메인은 이들이 동족 쌍이나 군을 형성하는 구조의 일족에 속하거나, 또는 이들 일족으로부터 유래되고 상기 특징으로 유지하는 경우에 “상보적”이다. 가령, 항체의 VH 도메인 및 VL 도메인은 상보적이다; 2개의 VH 도메인은 상보적이지 않고, 2개의 VL 도메인은 상보적이지 않다. 상보적 도메인은 T-세포 수용체의 Vα와 Vβ(또는 γ 및 δ) 도메인과 같이 면역글로불린 대과의 다른 구성원에서 발견될 수도 있다. 본 발명의 두 번째 구성의 배경에서, 비-상보성 도메인은 표적 분자에 협력적으로 결합하지 않지만, 동일하거나 상이한 분자일 수 있는 상이한 표적 에피토프 상에 독립적으로 작용한다. 인공적인 도메인, 예를 들면, 달리 조작되면 에피토프에 결합하지 않는 단백질 뼈대에 기반한 도메인은 비-상보성이다. 유사하게는, (예로써) 면역글로불린 도메인과 피브로넥틴 도메인에 기초한 2개의 도메인은 상보적이지 않다.
면역글로불린: 이는 항체 분자의 특징적인 면역글로불린 접힘을 보유하는 폴리펩티드 일족을 의미하는데, 이는 2개의 β 시트 및 일반적으로, 보존된 이황화 결합을 보유한다. 면역글로불린 대과의 구성원은 면역계에서 광범위한 역할(가령, 항체, T-세포 수용체 분자 등), 세포 부착에 관여(가령, ICAM 분자) 및 세포내 신호전달(가령, PDGF 수용체와 같은 수용체 분자)을 비롯한 다양한 생체내 세포성과 비-세포성 상호작용에 관여한다.
본 발명은 결합 도메인을 보유하는 모든 면역글로불린 대과에 적용가능하다. 적절하게는, 본 발명은 항체에 관계한다.
결합: 본 발명에 따른 가변 도메인은 결합하여 일군의 도메인을 형성한다; 가령, 상보성 도메인, 예를 들면, VL 도메인과 VH 도메인이 결합된다. 비-상보성 도메인 역시 결합될 수 있다. 도메인은 공유결합 또는 비-공유결합 수단에 의한 도메인의 연쇄를 비롯한 다수의 방법으로 결합될 수 있다.
닫힌 형태 다중특이적 리간드: 상기 용어는 본 명세서에 기술된 적어도 2 이상의 에피토프 결합 도메인을 포함하는 본 명세서에 정의된 다중특이적 리간드를 나타낸다. '닫힌 형태'(다중특이적 리간드)는 하나의 에피토프 결합 도메인에 의한 에피토프 결합이 다른 에피토프 결합 도메인에 의한 에피토프 결합과 경쟁하도록 리간드의 에피토프 결합 도메인이 배열됨을 의미한다. 다시 말하면, 동족 에피토프는 개별적이지만 동시에 각 에피토프 결합 도메인에 의해 결합될 수 있다. 리간드의 닫힌 형태는 본 명세서에 기술된 방법을 이용하여 달성될 수 있다.
항체: 항체를 자연적으로 생산하는 임의의 종으로부터 유래되거나 재조합 DNA 기술에 의해 생성되거나, 또는 혈청, B-세포, 하이브리도마, 트랜스펙토마스(transfectomas), 효모 또는 박테리아로부터 분리되는 지에 상관없이, 항체(가령, IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE) 또는 단편(Fab, F(ab')2, Fv, 이황화 결합된 Fv, scFv, 닫힌 형태 다중특이적 항체, 이황화-결합된 scFv, 디아바디(diabody)).
이중특이적 리간드: 본 명세서에 정의된 바와 같은 첫 번째 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 두 번째 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 리간드, 여기서 가변 영역은 단일특이적 면역글로불린에 의해 정상적으로 결합되지 않는 2개의 상이한 항원 또는 동일한 항원 상에 2개의 에피토프에 결합할 수 있다. 가령, 이들 2개의 에피토프는 동일한 합텐(hapten) 상에 존재할 수 있지만 동일한 에피토프가 아니거나 단일특이적 리간드에 의해 결합될 만큼 충분히 인접하지 않는다. 본 발명에 따른 이중특이적 리간드는 다른 특이성을 갖는 가변 도메인으로 구성되고, 동일한 특이성을 갖는 상호 상보성 가변 도메인 쌍을 포함하지 않는다.
항원: 본 발명에 따른 리간드에 의해 결합되는 분자. 전형적으로, 항원은 항체 리간드에 의해 결합되고 생체내에서 항원 반응을 유도할 수 있다. 이는 폴리펩티드, 단백질, 핵산 또는 다른 분자이다. 일반적으로, 본 발명에 따른 이중특이적 리간드는 특정 항원에 대한 표적 특이성에 대해 선별된다. 통상의 항체 및 이의 단편의 경우에, 가변 루프(L1, L2, L3 및 H1, H2, H3)에 의해 한정된 항체 결합 부위는 항원에 결합할 수 있다.
에피토프: 면역글로불린 VH/VL 쌍에 의해 통상적으로 결합되는 구조의 단위. 에피토프는 항체에 대한 최소한의 결합 부위를 정의하고, 따라서 항체의 특이성의 표적을 대표한다. 단일 도메인 항체의 경우에, 에피토프는 가변 도메인에 의해 분리 결합되는 구조의 단위를 나타낸다.
총괄적 리간드: 레퍼토리의 모든 구성원에 결합하는 리간드. 일반적으로, 앞서 정의된 항원 결합 부위를 통하여 결합되지 않음. 무-제한적 예는 단백질 A, 단백질 L, 단백질 G 등이다.
선별: 스크리닝(screening)에 의해 유도되거나, 또는 도메인과 항원이나 에피토프 사이에 또는 항체와 항원이나 에피토프 사이에 결합 상호작용이 이루어지는 다윈 선별 과정에 의해 유도됨. 따라서, 첫 번째 가변 도메인은 상보성 가변 도메인의 존재 또는 부재에서 항원이나 에피토프로의 결합에 대해 선별된다.
보편적 프레임워크: Kabat("Sequence of Protein of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services)에 의해 정의된 바와 같이 서열 내에 보존된 항체 영역에 상응하거나, 또는 Chothia and Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196:910-917에 의해 정의된 바와 같이 인간 생식세포계 면역글로불린 레퍼토리 또는 구조에 상응하는 단일 항체 프레임워크 서열. 본 발명은 단일 프레임워크 또는 일단의 프레임워크의 세트의 이용을 제시하는데, 이는 초가변 영역 단독에서 변이를 통하여 거의 모든 결합 특이성의 유도를 가능하게 하는 것으로 밝혀졌다.
상동성 면역검사: 결합되고 결합되지 않은 반응물을 분리하는 단계의 필요 없이 분석물을 검출하는 면역검사.
실질적으로 동일한(또는 “실질적으로 상동한”): 첫 번째와 두 번째 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이 유사한 활성을 보유하도록, 두 번째 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열에 대해 충분한 숫자의 동일하거나 동등한(가령, 유사한 측쇄, 예를 들면, 보존된 아미노산 치환) 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 보유하는 첫 번째 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열. 항체의 경우에, 두 번째 항체는 동일한 결합 특이성을 갖고 적어도 50%의 동일한 친화력을 갖는다.
“도메인 항체” 또는 “dAb"는 본 명세서에서 “단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드” 또는 “단일 도메인 항체 폴리펩티드”와 동의어다.
본 명세서에서, “특이적인 결합”은 예로써, BIAcoreTM 표면 플라스몬 공명 시스템(surface plasmon resonance system) 및 BIAcoreTM 동역학적 평가 소프트웨어(kinetic evaluation software)(e.g., version 2.1)을 이용한 표면 플라스몬 공명 분석(surface plasmon resonance analysis)에 의한 측정에서, 1 μM 이하의 분리 상수(Kd)로 면역글로불린 가변 도메인에 의한 항원의 결합을 의미한다. 특이적인 결합 상호작용에 대한 친화력 또는 Kd는 바람직하게는, 대략 500 nM 이하, 더욱 바람직하게는 대략 300 nM 이하이다.
본 명세서에서, “높은 친화력 결합”은 100 nM 이하의 Kd로 결합을 의미한다.
본 명세서에서, “인간 단일 도메인 항체 폴리펩티드”는 인간 생식세포계 면역글로불린 V 영역으로부터 유래된 서열을 보유하는 폴리펩티드를 의미한다. 서열이 인간 개체로부터 분리되거나, 클론된 인간 항체 유전자 서열의 라이브러리(또는, 인간 항체 V 영역 유전자 서열의 라이브러리)로부터 분리되거나, 또는 원하는 표적 항원에 결합에 대한 결합으로 선별된 하나이상의 다양화된 서열(무작위 또는 표적된 돌연변이유발에 의해)을 산출하는데 클론된 인간 생식세포계 V 영역 서열이 이용되는 경우에, 상기 서열은 “인간 생식세포계 V 영역으로부터 유래된다.” 최소한, 인간 면역글로불린 가변 도메인은 자연 발생 인간 면역글로불린 가변 도메인 서열에 적어도 85% 아미노산 유사성(가령, 87%, 90%, 93%, 95%, 97%, 99% 또는 그 이상의 유사성)을 갖는다.
대안으로, 또는 이에 더하여, “인간 면역글로불린 가변 도메인”은 4개의 인간 면역글로불린 가변 도메인 프레임워크 영역(FW1-FW4)을 포함하는 가변 도메인인데, 프레임워크 영역은 Kabat et al.(1991, supra)에서 기술된다. “인간 면역글로불린 가변 도메인 프레임워크 영역”은 a) 인간 프레임워크 영역의 아미노산 서열 및 b) 인간 프레임워크 영역의 아미노산 서열의 적어도 8개 연속 아미노산을 포함하는 프레임워크 영역을 포괄한다. 인간 면역글로불린 가변 도메인은 인간 생식세포계 항체 유전자 분절에 의해 인코딩되는 상응하는 프레임워크 영역의 아미노산 서열과 동일한 FW1-FW4의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 FW1-FW4 서열이 전체적으로, 인간 생식세포계 항체 유전자 분절에 의해 인코딩되는 상응하는 프레임워크 영역의 아미노산 서열과 비교하여 최대 10개의 아미노산 서열 차이, 최대 9개의 아미노산 서열 차이, 최대 8개의 아미노산 서열 차이, 최대 7개의 아미노산 서열 차이, 최대 6개의 아미노산 서열 차이, 최대 6개의 아미노산 서열 차이, 최대 5개의 아미노산 서열 차이, 최대 4개의 아미노산 서열 차이, 최대 3개의 아미노산 서열 차이, 최대 2개의 아미노산 서열 차이, 또는 최대 1개의 아미노산 서열 차이를 보유하는 가변 도메인을 포함할 수 있다.
본 명세서에 정의된 “인간 면역글로불린 가변 도메인”은 가변 도메인이 단일 면역글로불린 가변 도메인 단독으로서, 또는 하나이상의 다른 폴리펩티드 서열과 결합된 단일 면역글로불린 가변 도메인으로서 존재하는 지에 상관없이, 자체로써 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는다. 본 명세서에서 “인간 면역글로불린 가변 도메인”은 “인간화된” 면역글로불린 폴리펩티드, 다시 말하면, 인간에서 면역원성을 감소시키기 위하여 불변 영역에서 변형된 비-인간(가령, 생쥐, 카멜리드 등) 면역글로불린을 포괄하지 않는다.
본 명세서에서, “면역글로불린 가변 도메인의 특징적인 서열”은 면역글로불린 가변 도메인 서열에 의해 포함되는 서열에 20개 이상, 25개 이상, 30개 이상, 35개 이상, 40개 이상, 45개 이상, 또는 50개 이상의 연속 아미노산에서 상동한 아미노산 서열을 의미한다.
본 명세서에서, “2가(bivalent)”는 항원-결합 항체 폴리펩티드가 2개의 항원-특이적 결합 부위를 보유한다는 것을 의미한다. 항원-결합 부위에 의해 인식되는 에피토프는 동일하거나 상이할 수 있다. 항체 폴리펩티드가 개별적인 2개의 항원-특이적 결합 부위를 통하여 2개의 상이한 에피토프(상이한 항원 상에, 또는 동일한 항원 상에 존재하는)에 결합하는 경우에, 상기 항체 폴리펩티드는 “이중특이적”이라고 한다.
본 명세서에서, “4가(tetravalent)”는 항원-결합 폴리펩티드가 4개의 항원-특이적 결합 부위를 보유한다는 것을 의미한다. 항원-결합 부위에 의해 인식되는 에피토프는 동일하거나 상이할 수 있다. “이중특이적” 4가 항체 폴리펩티드는 하나의 에피토프 또는 항원에 대한 2개의 결합 부위 및 상이한 에피토프 또는 항원에 대한 2개의 결합 부위를 보유한다.
본 명세서에서, “4가, 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체”는 2개의 항원-결합 팔이 중쇄와 경쇄 불변 도메인에 의해 연결된다는 점에서, 자연 발생 IgG에 유사한 구조를 보유한다. 하지만, 자연-발생 IgG와 달리, 각 팔은 2개의 하원-결합 도메인: 첫 번째 항원에 특이적인 한 도메인 및 두 번째 항원에 특이적인 한 도메인을 보유한다. 본 명세서에 기술된 4가, 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체에 있어서, 각 항원-결합 도메인은 단일 도메인 항체이다, 다시 말하면, 이들 항원-결합 도메인은 예로써, scFv에서처럼 서로 쌍을 이뤄 단일 결합 부위를 형성하지 않는다.
본 명세서에서, “IgG 포맷”은 상기 구조체에서 2개의 항원-결합 팔이 서로 결합하는 중쇄와 경쇄 불변 도메인에 의해 연결된다는 점에서, 자연 발생 IgG에 유사한 구조를 보유하는 인공 항원-결합 폴리펩티드이다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, IgG 포맷에서 항원-결합 폴리펩티드는 4개의 폴리펩티드 사슬: 첫 번째 항원이나 에피토프에 결합하고 IgG 중쇄 불변 도메인(가령, CH1-CH2-CH3)에 융합되는 단일-도메인 항체 폴리펩티드를 포함하는 첫 번째 융합 단백질을 포함하는 융합 단백질)의 2개 사본 및 두 번째 항원에 결합하고 경쇄 불변 도메인(가령, Cλ 또는 Cκ)에 융합되는 단일-도메인 항체 폴리펩티드를 포함하는 두 번째 융합 단백질의 2개 사본으로 구성된다. 상기 포맷에서, 세포에서 동시-발현될 때 중쇄 불변 도메인은 서로 이황화 결합하고, 각 중쇄 불변 도메인은 경쇄 불변 도메인에 또한 이황화 결합한다. IgG 포맷에서 항원-결합 폴리펩티드는 4가이다; 불변 도메인에 융합된 단일 도메인 항체는 상이한 항원(가령, 중쇄 불변 도메인에 융합된 dAb1이 한 항원에 결합하고, 경쇄 불변 도메인에 융합된 dAb2가 다른 항원에 결합한다) 또는 동일한 항원 상에서 상이한 에피토프(가령, 중쇄 불변 도메인에 융합된 dAbl이 한 항원 상에서 한 에피토프에 결합하고, 경쇄 불변 도메인에 융합된 dAb2가 동일한 항원 상에서 다른 에피토프에 결합한다)에 결합하도록 선별되거나, 또는 대안으로, 4개 모두 동일한 항원 상에 동일한 에피토프에 결합할 수 있다(dAb1과 dAb2가 동일한 항원 상에서 동일한 에피토프에 결합한다).
본 명세서에서, “Fab 포맷”은 하나의 단일-도메인 항체가 경쇄 불변 도메인 CL(가령, Cλ 또는 Cκ)에 융합되고, 다른 단일 도메인 항체가 중쇄 CH1 불변 도메인에 융합되고, 개별 CH1과 CL 구조체 도메인이 서로 이황화 결합하는 이가 항체 폴리펩티드 구조체를 의미한다. 단일 도메인 항체는 상이한 항원(이중특이적 Fab 포맷을 산출), 동일한 항원 상에서 상이한 에피토프(이중특이적), 또는 동일한 항원 상에 동일한 에피토프에 결합하도록 선별될 수 있다. Fab 포맷 이중특이적 항체 폴리펩티드의 실례는 예로써, Cλ 경쇄에 융합되는 본 명세서에 기술된 항-TNF-α 단일 도메인 항체 및 인간 중쇄 CH1 불변 도메인에 융합되는 본 명세서에 기술된 항-VEGF 단일 도메인 항체인데, 여기서 두 융합 단백질은 개별 불변 도메인을 통하여 서로 이황화 결합한다. 이런 포맷의 항체 폴리펩티드 구조체에서, 항원-결합 도메인은 예로써, scFv에서처럼 서로 쌍을 이뤄 단일 결합 부위를 형성하지 않는다; 오히려, 각 단일 도메인 항체는 자체로써 항원에 결합하여 구조체를 이가로 만들 수 있다.
“류머티스성 관절염”(RA)은 관절 및/또는 다른 내부 장기의 내막(lining)에서 염증을 수반하는 질병을 의미한다. 전형적으로, RA는 여러 관절에 영향을 준다. 이는 전형적으로 만성이고, 급성(flare-up)의 질병일 수 있다. RA는 전신에 영향을 주는 전신 질환이고, 관절염의 가장 일반적인 형태 중의 하나이다. 이는 관절 내막의 염증으로 특성화되고, 통증, 경직, 발열, 홍적, 부종을 유발한다. 염증이 발생된 관절 내막, 활액막은 뼈와 연골에 침투하고 이를 손상시킬 수 있다. 염증 세포는 뼈와 연골을 분해하는 효소를 방출한다. 연루된 관절은 형상과 정렬을 상실하고 통증과 움직임 상실을 유발할 수 있다. 증상에는 관절 염증, 부종, 이동의 어려움, 통증 등이 포함된다. 다른 증상에는 식용 상실, 열병, 기력 상실, 빈혈 등이 포함된다. 다른 특징은 압력을 받는 부위(가령, 팔꿈치 뒷부분) 아래 종기(류머티스성 결절(rheumatoid nodule))이다. 류머티스성 관절염은 U.S. 5,698,195에 기술된 바와 같은 여러 임상적으로 인정되는 등급에 기초하여 임상적 스코어가 기록된다. 간단히 말하면, 임상적 반응 연구는 아래의 파라미터를 평가할 수 있다.
1. 압통성 관절(tender joint)의 숫자 및 통증/압통의 평가
아래의 스코어링(scoring)이 이용된다:
0 = 관절에서 통증/압통 없음
1 = 경등도 통증. 환자는 질문을 받은 이후에 관절에서 압통을 진술한다.
2 = 중등도 통증. 환자는 관절에서 압통과 움츠림을 진술한다.
3 = 중증도 통증. 환자는 관절에서 압통과 움츠림을 진술하고 관절을 뒤로 뺀다.
2. 부종이 발생된 관절의 총수
각 관절에서 압통과 부종을 개별적으로 평가한다.
3. 조조 강직의 지속 시간(minute)
4. 악력(grip strength)
5. 시각 연속 통증 척도(Visual analog pain scale)(0-10 cm)
6. 환자 및 맹검 평가자에게 약물에 대한 임상 반응을 평가하도록 요청한다. 임상 반응은 아래와 같은 주관적 스코어링 체계를 이용하여 평가한다.
5 = 탁월한 반응(최대 가능한 예상 반응)
4 = 우수한 반응(최대보다 덜한 가능한 예상 반응)
3 = 상당한 반응(명확한 개선, 하지만 보다 우수할 있었음)
2 = 반응 없음(효과 없음)
1 = 악화(질병 악화)
류머티스성 관절염의 원인은 아직 확인되지 않고 있다. 하지만, RA는 자가면역질환이며, 면역계가 건강한 관절 조직을 공격하도록 유도함으로써 염증과 관절 손상을 유발하는 것으로 알려져 있다. 많은 RA 환자가 HLA-DR4라고 하는 유전자 마커(genetic marker)를 나타낸다.
본 명세서에서, “TNF-α 관련된 질환”은 단독으로, 또는 이런 질환을 치료하는 한가지이상의 다른 약제 또는 치료제와 공동으로, TNF-α의 기능을 중화 또는 길항하는 약제의 투여가 유효한 질병이나 질환을 의미한다.
본 명세서에서, “치료”는 질병이나 질병 증상의 발병 예방, 질병이나 질병 증상의 진행 저해, 또는 질병이나 질병 증상의 반전을 의미한다.
본 명세서에서, “질병의 발병 예방”은 소정의 질환, 예를 들면, 류머티스성 관절염의 하나이상의 증상이나 측정가능 파라미터가 이런 질환에 소인이 있는 개체에서 발생하지 않는다는 것을 의미한다.
본 명세서에서, “질병 진행의 저해”는 약제 치료가 치료 부재시에 진행에 비하여, 치료되는 개체에서 이미 명백해진 질병의 증상의 심각도에서 증가를 정지 또는 지연시키는 것을 의미한다.
본 명세서에서, “질병의 반전”은 질병의 하나이상의 증상이나 측정가능 파라미터가 약제의 투여 이전의 증상이나 파라미터에 비하여, 약제의 투여이후 개선된다는 것을 의미한다. 증상이나 측정가능 파라미터에서 “개선”은 이런 측정가능 파라미터에서, 통계학적으로 유의한, 바람직하게는 적어도 10%의 긍정적인 차이에 의해 확인된다.
측적가능 파라미터에는 예로써, 직접적으로 측정가능한 것들 및 간접적으로 측정가능한 것들이 포함된다. 직접적으로 측정가능한 파라미터의 무-제한적 실례는 관절 크기, 관절 이동성, 관절염과 조직병리학적 스코어 또는 징후, 지시자, 예를 들면, 사이토킨의 혈청 수준이다. 간접적으로 측정가능한 파라미터는 예로써, 불쾌감이나 움직임 부족의 환자 지각, 또는 질병 심각도를 평가하는 임상적으로 인정되는 척도이다.
본 명세서에서, 파라미터, 예를 들면, 관절염 스코어 또는 다른 측정가능 파라미터에서 “증가”는 상기 파라미터에서 통계학적으로 유의한 증가를 의미한다. 대안으로, “증가”는 적어도 10% 증가를 의미한다. 이와 유사하게, 이러한 파라미터에서 “감소”는 상기 파라미터에서 통계학적으로 유의한 감소, 또는 적어도 10% 감소를 의미한다.
본 명세서에서, “길항”은 약제가 활성을 간섭한다는 것을 의미한다. 활성이 예로써, TNF-α, VEGF 또는 다른 생물학적으로 활성 분자 또는 사이토킨의 활성인 경우에, 상기 용어는 무-제한적 실례로서, 수용체와의 결합이나 상호작용(시험관내에서, 배양 중인 세포 표면에서, 또는 생체내에서), 세포내 신호전달, 세포독성, 내피세포분열(mitogenesis), 또는 상기 분자 또는 사이토킨에 의해 매개되는 다른 하류 효과 또는 과정(가령, 유전자 활성화)을 비롯한 상기 분자 또는 사이토킨의 활성의 저해(적어도 10%)를 포괄한다. 길항은 TNF, VEGF 등과 같은 인자에 의한 수용체 결합의 간섭 및 상기 인자가 세포-표면 수용체에 결합하는 경우에 상기 인자의 활성 간섭을 포괄한다.
본 명세서에서, “이상(greater than or equal to)”은 수치가 다른 수치에 동등하거나, 또는 통계학적으로 유의한 방식(p<0.1, 바람직하게는 p<O.05, 더욱 바람직하게는 p<0.0l)으로 다른 수치보다 크다는 것을 의미한다. 예로써, 질병 치료 또는 수용체 결합의 길항에서 한 조성물의 효능과 다른 조성물의 효능을 비교하는 경우에, 이러한 비교는 동몰에 기초하여 수행되어야 한다.
본 명세서에서, “연결된”은 PEG와 같은 중합체 부분의 항체 폴리펩티드, 예를 들면, 본 명세서에 기술된 단일 도메인 항체의 아미노산 잔기로의 부착을 의미한다. PEG 중합체의 항체 폴리펩티드, 예를 들면, 단일 도메인 항체의 아미노산 잔기로의 부착은 “PEG화(PEGylation)”라고 하는데, 이는 N-하이드록시숙신이미드(NHS) 활성 에스테르, 숙신이미딜 프로피오네이트(succinimidyl propionate, SPA), 말레이미드(MAL), 비닐 술폰(VS), 또는 티올을 비롯한 여러 PEG 부착 부분을 이용하여 달성할 수 있다. PEG 중합체, 또는 다른 중합체는 미리 결정된 위치에서 항체 폴리펩티드에 연결되거나, 또는 무작위로 항체 분자에 연결될 수 있다. 하지만, PEG 중합체는 미리 결정된 위치에서 항체 폴리펩티드에 연결하는 것이 바람직하다. PEG 중합체는 항체 폴리펩티드에서 임의의 잔기에 연결될 수 있지만, 상기 중합체는 가급적, 항체 폴리펩티드에서 자연 발생하거나, 또는 예로써 항체 폴리펩티드에서 자연 발생 잔기의 시스테인이나 리신으로의 돌연변이유발에 의해 항체 폴리펩티드에 조작된 리신이나 시스테인에 연결된다. 본 명세서에서, “연결된”은 또한, 이량체, 삼량체, 사량체, 또는 다른 다량체를 형성하는 2개 이상의 항체 단일 가변 도메인 단량체의 결합을 의미할 수 있다. dAb 단량체는 융합 단백질로서 dAb 단량체의 발현; 단량체 사이에 펩티드 링커를 통한 2개 이상의 단량체의 연쇄; 번역이후 서로 직접적으로 또는 링커를 통한 이황화 결합으로 단량체의 화학적 연결, 또는 이가, 삼가 또는 다가 연결 부분으로의 연쇄를 비롯한 당분야에 공지된 여러 방법으로 다량체를 형성하도록 연결될 수 있다.
본 명세서에서, 항체 폴리펩티드, 예를 들면, 단일 가변 도메인 폴리펩티드에 “직접 연결된” 중합체와 관련하여 “직접 연결된”은 상기 중합체가 가변 도메인의 자연적인 일부인 잔기, 예를 들면, 불변 영역, 힌지 영역, 또는 링커 펩티드 내에 내포되지 않는 잔기에 부착되는 상황을 의미한다. 반대로, 본 명세서에서, 항체 폴리펩티드에 “간접적으로 연결된”은 상기 중합체가 자연 발생 가변 영역에 일부인 아미노산 잔기에 부착되지 않는(가령, 힌지 영역에 부착될 수 있는), 중합체 분자의 항체 단일 가변 도메인으로의 연쇄를 의미한다. 중합체는 연결 펩티드(linking peptide)를 통하여 항체 폴리펩티드에 연결되는 경우에, 다시 말하면, 중합체가 항체 자체의 일부인 아미노산 잔기에 부착되지 않는 경우에, “간접적으로 연결된다.” 대안으로, 중합체는 폴리펩티드의 C-말단 힌지 영역에 연결되거나, 또는 항체 폴리펩티드의 일부로서 존재하는 불변 영역의 임의의 잔기에 부착되는 경우에, “간접적으로 연결된다.”
본 명세서에서, “상동성(homology)” 또는 “유사성(similarity)”은 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열이 서로 구조적으로 닮은 정도를 의미한다. 본 명세서에서, 서열 “유사성”은 서열의 정렬 내에 상응하는 위치에서 아미노산 서열이 유사한 아미노산 잔기를 공유하는 정도의 크기이다. 아미노산은 그들의 측쇄가 유사한 경우에 서로 유사하다. 구체적으로, “유사성”은 서로에 대한 보존성 치환사슬 아미노산을 포괄한다. “보존성” 치환은 blosum62 치환 매트릭스(substitution matrix)에서 양성 스코어를 갖는 임의의 치환이다(Hentikoff and Hentikoff, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919). “서열 A가 서열 B에 n% 유사하다”는 서술은 서열 A와 B 사이에 최적 전체 정렬(optimal global alignment)의 위치에서 n%가 동일한 아미노산 또는 보존성 치환으로 구성되어 있음을 의미한다. 최적 전체 정렬은 Needleman-Wunsch 정렬 알고리즘에서 아래의 파라미터를 이용하여 수행할 수 있다:
폴리펩티드의 경우:
치환 매트릭스: blosum62
공백 스코어링 함수(gap scoring function): -A -B*LG, 여기서 A = 11(공백 벌점(gap penalty)), B = 1(공백 길이 벌점(gap length penalty)), LG = 공백 길이.
뉴클레오티드의 경우:
치환 매트릭스: 정합(match)의 경우 10, 부정합(mismatch)의 경우 0
공백 스코어링 함수(gap scoring function): -A -B*LG, 여기서 A = 50(공백 벌점(gap penalty)), B = 3(공백 길이 벌점(gap length penalty)), LG = 공백 길이.
전형적인 보존성 치환은 Met, Val, Lou, lie 사이의 치환이다; Ser과 Thr 사이의 치환; 잔기 Asp, Glu, Asn 사이의 치환; 잔기 Gin, Lys, Arg 사이의 치환; 또는 방향족 잔기 Phe와 Tyr 사이의 치환.
본 명세서에서, 두 서열이 Needleman-Wunsch 알고리즘, 또는 Tatusova & Madden, 1999, FEMS Microbiol Lett. 174:247-250에 기술된 “BLAST 2 서열” 알고리즘을 이용하여 정렬될 때 서로 간에 적어도 85% 서열 유사성을 갖는 경우에 서로 “상동하다” 또는 “유사하다.” 아미노산 서열을 “BLAST 2 서열 알고리즘”을 이용하여 정렬하는 경우에, Blosum62 매트릭스는 디폴트 매트릭스(default matrix)이다.
당분야에 공지된 바와 같이 “동일성(identity)”은 2개 이상의 폴리펩티드 서열 또는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 비교함으로써 결정되는, 이들 서열 사이의 상관관계이다. 당분야에서, “동일성”은 또한, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 가닥 사이의 정합에 의해 결정되는, 이들 서열 사이의 서열 관련도를 의미한다. 동일성 비율(percentage identity)은 Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ea., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ea., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; and Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073(198S)에 기술된 방법을 비롯한 공지된 방법으로 용의하게 결정될 수 있다. 동일성을 결정하는데 선호되는 방법은 검사되는 서열 사이의 최대 정합을 제공하도록 설계된다. 동일성을 결정하는 방법은 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 프로그램으로 체계화된다. 두 서열 사이의 동일성 비율을 결정하는데 선호되는 컴퓨터 프로그램 방법에는 GCG 프로그램 패키지(Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(1): 387(1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA(Atschul, S. F. et al., J. Molec. Biol. 215: 403 410(1990) 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. BLAST X 프로그램은 NCBI 및 다른 출처로부터 공개적으로 입수가능하다(BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410(1990)). 예시로써, “SEQ 1D NO: A”의 참고 뉴클레오티드 서열에 예로써, 적어도 95% “동일성”을 갖는 뉴클레오티드 서열을 보유하는 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 “SEQ 1D NO: A”의 참고 뉴클레오티드 서열의 각 100개의 뉴클레오티드당 최대 5개의 점 돌연변이(point mutation)를 보유하는 점을 제외하고, 상기 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 참고 서열과 동일하다는 것을 의미한다. 다시 말하면, 참고 뉴클레오티드 서열에 적어도 95% 동일한 뉴클레오티드 서열을 보유하는 폴리뉴클레오티드를 수득하기 위하여, 참고 서열에서 최대 5%의 뉴클레오티드가 결실되거나 다른 뉴클레오티드로 치환되고, 또는 참고 서열에서 전체 뉴클레오티드의 최대 5%까지 뉴클레오티드가 참고 서열에 삽입될 수 있다. 참고 서열의 이들 돌연변이는 참고 뉴클레오티드 서열의 5 또는 3 말단 위치에서 또는 이들 두 말단 위치 사이에 임의의 위치에서 발생하고, 참고 서열에서 뉴클레오티드 사이에 개별적으로 또는 참고 서열 내에 하나이상의 연속 군으로 산재된다. 이와 유사하게, “SEQ 1D NO: B”의 참고 아미노산 서열에 예로써, 적어도 95% “동일성”을 갖는 아미노산 서열을 보유하는 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열이 “SEQ 1D NO: B”의 참고 아미노산 서열의 각 100개의 아미노산당 최대 5개의 아미노산 변형을 보유하는 점을 제외하고, 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열이 참고 서열과 동일하다는 것을 의미한다. 다시 말하면, 참고 아미노산 서열에 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 보유하는 폴리펩티드를 수득하기 위하여, 참고 서열에서 최대 5%의 아미노산 잔기가 결실되거나 다른 아미노산으로 치환되고, 또는 참고 서열에서 전체 아미노산 잔기의 최대 5%까지 아미노산이 참고 서열에 삽입될 수 있다. 참고 서열의 이들 변형은 참고 아미노산 서열의 아미노 또는 카르복시 말단 위치에서 또는 이들 두 말단 위치 사이에 임의의 위치에서 발생하고, 참고 서열에서 잔기 사이에 개별적으로 또는 참고 서열 내에 하나이상의 연속 군으로 산재된다.
본 명세서에서, “낮은 엄밀도”, “중간 엄밀도”, “높은 엄밀도” 또는 “매우 높은 엄밀도” 조건은 핵산 혼성화 및 세척에 대한 조건을 나타낸다. 혼성화 반응을 수행하기 위한 지침은 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6에서 발견할 수 있다. 수성과 비수성 방법이 참고문헌에 기술되어 있고 양쪽 모두 이용될 수 있다. 본 명세서에서 언급된 특이적 혼성화 조건은 아래와 같다: (1) 대략 45℃, 6X 염화나트륨/구연산나트륨(SSC)에서 낮은 엄밀도 혼성화 조건, 이후 적어도 50℃, 0.2X SSC, 0.1% SDS에서 2회 세척(세척액 온도는 낮은 엄밀도 조건의 경우에 55℃로 증가될 수 있다); (2) 대략 45℃, 6X SSC에서 중간 엄밀도 혼성화 조건, 이후 60℃, 0.2X SSC, 0.1% SDS에서 1회 이상 세척; (3) 대략 45℃, 6X SSC에서 높은 엄밀도 혼성화 조건, 이후 65℃, 0.2X SSC, 0.1% SDS에서 1회 이상 세척; (4) 65℃, 0.5 M 인산나트륨, 7% SDS에서 매우 높은 엄밀도 혼성화 조건, 이후 65℃, 0.2X SSC, 1% SDS에서 1회 이상 세척.
본 명세서에서, “농도에서”는 소정의 폴리펩티드가 단위 부피(unit volume)당 명시된 질량이나 몰량으로 용액(바람직하게는, 수용액)에 용해된다는 것을 의미한다. 이런 이유로, “X의 농도” 또는 “적어도 X의 농도”로 존재하는 폴리펩티드는 폴리펩티드의 건조된 제조물과 냉동 건조된 제조물을 배제한다.
본 명세서에서, “레퍼토리”는 예로써, 다양한 변이체, 예를 들면, 최초 서열과 상이한 폴리펩티드 변이체의 집합을 의미한다. 본 발명에 이용된 라이브러리는 적어도 1000개의 구성원을 포함하는 폴리펩티드의 레퍼토리를 포괄할 것이다.
본 명세서에서, “라이브러리”는 이질성 폴리펩티드 또는 핵산의 혼합물을 의미한다. 라이브러리는 단일 폴리펩티드 또는 핵산 서열을 각각 보유하는 구성원으로 구성된다. 이러한 관점에서, 라이브러리는 레퍼토리와 동의어이다. 라이브러리 구성원 사이의 서열 차이는 라이브러리 내에 존재하는 다양성을 설명한다. 라이브러리는 폴리펩티드 또는 핵산의 단순 혼합물의 형태를 취하거나, 또는 핵산의 라이브러리로 형질전환된 생물체 또는 세포, 예를 들면, 박테리아, 바이러스, 동물 또는 식물 세포 등의 형태이다. 적절하게는, 각 개별 생물체 또는 세포는 단지 하나 또는 제한된 수의 라이브러리 구성원을 포함한다. 유리하게는, 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 발현이 가능하도록 하기 위하여, 핵산이 발현 벡터 내로 도입된다. 이런 이유로, 바람직한 관점에서, 라이브러리는 숙주 생물체의 집단 형태를 취하고, 각 생물체는 상응하는 폴리펩티드 구성원을 생성하도록 발현될 수 있는 핵산 형태 내에 라이브러리의 단일 구성원을 포함하는 발현 벡터의 하나이상의 사본을 포함한다. 따라서, 숙주 생물체 집단은 유전적으로 다양한 폴리펩티드 변이체의 대형 레퍼토리를 인코딩할 수 있는 잠재력을 갖는다.
본 명세서에서, “중합체”는 반복 단량체 단위로 구성되는 거대분자를 의미하고, 또한 합성이나 자연 발생 중합체, 예를 들면, 선택적으로 치환된 선형이나 분지형 사슬 폴리알킬렌, 폴리알케닐렌 또는 폴리옥시알킬렌 중합체, 또는 분지되거나 분지되지 않은 다당류를 의미할 수 있다. 본 명세서에서, “중합체”는 구체적으로, 선택적으로 치환되거나 분지된 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(프로필렌 글리콜), 또는 폴리(비닐 알코올)과 이의 유도체를 의미한다.
본 명세서에서, “PEG” 또는 “PEG 중합체”는 폴리에틸렌 글리콜을 의미하고, 더욱 구체적으로 숙신이미딜 프로피오네이트(succinimidyl propionate), 베조트리아졸 활성 에스테르(benzotriazole active ester), 말레이미드로 유도체화된 PEG, 비닐 술폰(vinyl sulfone), 또는 티올 기와 같은 PEG의 N-하이드록시숙신이미드(NHS) 활성 에스테르를 비롯한 PEG의 유도체화된 형태를 의미할 수 있다. 특정 PEG 제제에는 PEG-O-CH2CH2CH2-CO2-NHS; PEG-O-CH2-NHS; PEG-O-CH2CH2-CO2-NHS; PEG-S-CH2CH2-CO-NHS; PEG-O2CNH-CH(R)-CO2-NHS; PEG-NHCO-CH2CH2-CO-NHS; PEG-O-CH2-CO2-NHS가 포함될 수 있다; 여기서, R은 (CH2)4)NHCO2(mPEG)이다. 본 발명에 유용한 PEG 중합체는 선형 분자이거나, 또는 복수 PEG 부분이 단일 중합체에 존재하는 경우에 분지형일 수 있다. 본 발명에 유용한 특히 선호되는 PEG 형태는 아래와 같다:
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본 명세서에서, “설피드릴-선택성 시약(Sulfhydryl-selective reagent)”은 PEG 중합체의 티올-포함 아미노산으로의 부착에 유용한 시약이다. 아미노산 잔기 시스테인 상에서 티올 기는 설피드릴-선택성 시약과의 상호작용에 특히 유용하다. 본 발명에 유용한 설피드릴-선택성 시약에는 말레이미드, 비닐 술폰, 티올 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 시스테인 잔기에 결합을 위한 설피드릴-선택성 시약의 유용성은 당분야에 공지되어 있고, 필요에 따라 본 발명에 적합하도록 조정될 수 있다(참조: Eg., Zalipsky, 1995, Bioconjug Chem. 6:150; Greenwald et al., 2000, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 17:101; Herman et al., 1994, Macromol. Chem. Phys. 195:203).
본 명세서에서, “항원”은 항체 또는 항체의 결합 영역(가령, 가변 도메인)에 의해 결합되는 분자를 의미한다. 전형적으로, 항원은 생체내에서 항체 반응(antibody response)을 유도할 수 있다. 항원은 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 핵신, 지질, 탄수화물, 또는 다른 분자일 수 있다. 일반적으로, 면역글로불린 가변 도메인은 특정 항원에 대한 표적 특이성(target specificity)에 적합하게 선별된다.
본 명세서에서, “에피토프”는 면역글로불린 VH/VL 쌍에 의해 공통적으로 결합되는 구조 단위를 의미한다. 에피토프는 항체에 대한 최소 결합 부위를 정의하고, 따라서 항체의 특이적 표적을 나타낸다. 단일 도메인 항체의 경우에, 에피토프는 가변 도메인에 의해 분리 결합되는 구조 단위를 나타낸다.
본 명세서에서, 본 명세서에 기술된 단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드와 관련하여 “중화”는 상기 폴리펩티드가 표적 항원의 측정가능 활성이나 기능을 간섭한다는 것을 의미한다. 펩티드는 표적 항원의 측정가능 활성이나 기능을 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상, 최대 100%(표적 항원의 효과 또는 기능이 검출되지 않음) 감소시키는 경우에 “중화” 폴리펩티드이다. 표적 항원의 측정가능 활성이나 기능의 감소는 이런 활성이나 기능의 하나이상의 지시자를 측정하는 표준 방법을 이용하여 당업자에 의해 평가될 수 있다. 예시로써, 표적이 TNF-α인 경우에, 중화 활성은 표준 L929 세포 사멸 검사(cell killing assay)를 이용하거나, 또는 TNF-α 유도된 세포 활성화를 측정하는 HUVEC에서 ELAM-1의 TNF-α 유도된 발현을 저해하는 단일 면역글로불린 가변 도메인의 능력을 측정함으로써 평가될 수 있다. 본 명세서에서, “중화”와 유사한 의미의 “세포독성의 저해”는 예로써, 표준 L929 세포 사멸 검사를 이용한 측정에서 세포 사멸의 감소를 의미하는데, 여기서 세포독성은 세포 사멸이 적어도 10% 또는 그 이상 감소하는 경우에 저해된다.
본 명세서에서, “표적 항원의 측정가능 활성이나 기능”에는 예로써, 세포 신호전달, 효소 활성, 결합 활성, 리간드-의존성 내재화(internalization), 세포 사멸, 세포 활성화, 세포 생존의 증진, 유전자 발현 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 당업자는 소정의 표적 항원에 대한 활성을 측정하는 검사를 수행할 수 있다. 적절하게는, 본 명세서에서, “활성”은 (1) 세포-기초된 검사에서 ND50; (2) 표적 리간드에 대한 친화력; (3) ELISA 결합, 또는 (4) 수용체 결합 검사에 의해 정의된다. 이들 검사를 수행하는 방법은 당업자에게 알려져 있고, 하기에 더욱 상세하게 기술된다.
본 명세서에서, “활성 유지”는 PEG-연결된 항체 폴리펩티드, 예를 들면, 단일 가변 도메인의 활성 수준을 의미하는데, 상기 활성 수준은 본 명세서에 기술된 바와 같이 활성이 결정되는 동일 서열의 비-PEG-연결된 항체 폴리펩티드의 활성 수준의 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 최대 100%이다. 더욱 구체적으로, 비-PEG-연결된 항체 폴리펩티드의 활성 수준과 비교되는 PEG-연결된 항체 폴리펩티드의 활성 수준은 항체 몰 기초에서 결정되어야 한다; 다시 말하면, 각 시험에서, 동등한 몰 수치의 PEG-연결된 항체 폴리펩티드와 비-PEG-연결된 항체 폴리펩티드가 각각 사용되어야 한다. 특정한 PEG-연결된 항체 폴리펩티드가 “활성을 유지하는” 지를 결정하는 경우에, PEG-연결된 항체 폴리펩티드의 활성은 PEG의 부재시에 동일한 항체 폴리펩티드의 활성과 비교하는 것이 바람직하다.
본 명세서에서, “동종이량체(homodimer)”, “동종삼량체(homotrimer)”, “동종사량체(homotetramer)”, “동종다량체(homomultimer)” 등은 각각, 소정의 단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드 서열의 2개, 3개 또는 그 이상(가령, 4개, 5개 등)의 단량체를 포함하는 분자를 의미한다. 가령, 동종이량체는 동일한 VH 서열의 2개 사본을 보유한다. 단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드의 “단량체”는 항원에 특이적으로 결합하는 단일 VH 또는 VL 서열이다. 동종이량체, 동종삼량체, 동종사량체, 또는 동종다량체에서 이들 단량체는 예로써, 단량체 사이에 펩티드 링커를 통한 융합 폴리펩티드로서 발현; 번역이후 서로 직접적으로 또는 링커를 통한 이황화 결합으로 단량체의 화학적 연결, 또는 이가, 삼가 또는 다가 연결 부분으로의 연쇄에 의해 연결될 수 있다. 한 구체예에서, 동종이량체, 삼량체, 사량체, 또는 다량체에서 이들 단량체는 복수-팔 PEG 중합체에 의해 연결될 수 있는데, 여기서 이량체, 삼량체, 사량체, 또는 다량체의 각 단량체는 앞서 기술된 바와 같이, 복수-팔 PEG의 PEG 부분에 연결된다.
본 명세서에서, “이형이량체(heterodimer)”, “이형삼량체(heterotrimer)”, “이형사량체(heterotetramer)”, “이형다량체(heteromultimer)” 등은 각각, 2개 이상의 상이한 단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드 서열의 2개, 3개 또는 그 이상(가령, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 최대 8개 또는 그 이상)의 단량체를 포함하는 분자를 의미한다. 가령, 이형이량체는 2개의 VH 서열, 예를 들면, VH1과 VH2를 보유하거나, 또는 VH와 VL의 조합을 보유할 수 있다. 동종이량체, 삼량체, 또는 사량체에서와 유사하게, 이형이량체, 이형삼량체, 이형사량체, 또는 이형다량체에서 이들 단량체는 예로써, 단량체 사이에 펩티드 링커를 통한 융합 폴리펩티드로서 발현; 번역이후 서로 직접적으로 또는 링커를 통한 이황화 결합으로 단량체의 화학적 연결, 또는 이가, 삼가 또는 다가 연결 부분으로의 연쇄에 의해 연결될 수 있다. 한 구체예에서, 이형이량체, 이형삼량체, 이형사량체, 또는 이형다량체에서 이들 단량체는 복수-팔 PEG 중합체에 의해 연결될 수 있는데, 여기서 이량체, 삼량체, 사량체, 또는 다량체의 각 단량체는 앞서 기술된 바와 같이, 복수-팔 PEG의 PEG 부분에 연결된다.
본 명세서에서, “반감기”는 예로써, 리간드 분해 및/또는 자연 기전에 의한 리간드의 제거 또는 격리로 인하여, 리간드(가령, 항체 폴리펩티드, 예를 들면, 단일 면역글로불린 가변 도메인)의 혈청 농도를 생체내에서 50%까지 감소시키는데 소요되는 시간을 의미한다. 이들 항체 폴리펩티드는 분해 및/또는 제거 또는 격리에 저항하는 분자, 예를 들면, PEG에 결합함으로서, 생체내에서 안정화되고 반감기가 증가된다. 일반적으로, 항체 폴리펩티드(가령, dAb)의 반감기는 이의 기능적 활성이 PEG 중합체에 연결되지 않은 유사한 dAb보다 더욱 오랜 기간 동안 생체내에서 존속하는 경우에, 증가한다. 전형적으로, PEG화된 dAb의 반감기는 비-PEG화된 dAb에 비하여, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 그 이상까지 증가한다. 반감기의 2x, 3x, 4x, 5x, 10x, 20x, 30x, 40x, 50x 또는 그 이상의 범위에서 증가가 가능하다. 대안으로, 또는 이에 더하여, 반감기의 최대 30x, 40x, 50x, 60x, 70x, 80x, 90x, 100x, 150x 범위에서 증가가 가능하다. 본 발명에 따라, PEG-연결된 항체 단일 가변 도메인은 0.25 내지 170 시간, 바람직하게는 1 내지 100 시간, 더욱 바람직하게는 30 내지 100 시간, 이보다 더욱 바람직하게는 50 내지 100 시간, 최대 170, 180, 190, 200 시간 또는 그 이상의 반감기를 갖는다.
본 명세서에서, PEG- 또는 다른 중합체-연결된 dAb 단량체 또는 다량체와 관련하여 “분해에 저항성” 또는 “분해 저항”은 상기 PEG- 또는 다른 중합체-연결된 dAb 단량체 또는 다량체가 pH 2.0에서 펩신(pepsin)에 30분간 노출되는 경우에 10% 이하로 분해되고, 바람직하게는 전혀 분해되지 않는다는 것을 의미한다. 특히, PEG- 또는 다른 중합체-연결된 dAb 다량체(가령, 헤테로- 또는 동종이량체, 삼량체, 사량체 등)와 관련하여, 분해에 저항성 분자는 pH 2.0에서 30분간 펩신(pepsin)의 존재하에 5% 이하로 분해되고, 바람직하게는 전혀 분해되지 않는다.
본 명세서에서, “유체역학적 크기(hydrodynamic size)”는 전체 수용액에서 분자의 확산(diffusion)에 기초한 분자(가령, 단백질 분자)의 겉보기 크기(apparent size)를 의미한다. 용액을 통한 단백질의 확산 또는 이동을 처리하여 단백질의 겉보기 크기를 유추할 수 있는데, 여기서 겉보기 크기는 단백질 입자의 “스토크스 반경(Stokes radius)” 또는 “유체역학적 반경(hydrodynamic radius)”에 의해 제공된다. 단백질의 “유체역학적 크기”는 질량과 형상(형태)에 좌우되기 때문에, 동일한 분자량을 갖는 두 단백질이 단백질의 전체 형태에 기초하여 상이한 유체역학적 크기를 가질 수도 있다. PEG-연결된 항체 폴리펩티드, 예를 들면, 단일 가변 도메인(본 명세서에 기술된 항체 가변 도메인 다량체)의 유체역학적 크기의 범위는 24 kDa 내지 500 kDa; 30 내지 500 kDa; 40 내지 500 kDa; 50 내지 500 kDa; 100 내지 500 kDa; 150 내지 500 kDa; 200 내지 500 kDa, 250 내지 500 kDa; 300 내지 500 kDa; 350 내지 500 kDa; 400 내지 500 kDa; 450 내지 500 kDa일 수 있다. 적절하게는, 본 발명의 PEG화된 dAb의 유체역학적 크기는 30 내지 40 kDa; 70 내지 80 kDa 또는 200 내지 300 kDa이다. 항체 가변 도메인 다량체가 조영(imaging) 목적으로 사용되는 경우에, 다량체는 50 내지 100 kDa의 유체역학적 크기를 갖는다. 대안으로, 항체 단일 도메인 다량체가 치료 목적으로 사용되는 경우에, 다량체는 200 kDa 초과의 유체역학적 크기를 갖는다.
이중특이적 항체 폴리펩티드:
본 발명자들은 국제 특허 출원 WO 2004/003019에서, 더욱 개선된 이중특이적 리간드를 제시하였는데, 여기서 상기 리간드의 하나의 특이성은 생물체의 생체내에 존재하는 단백질 또는 폴리펩티드를 지향하고, 이는 상기 리간드에 결합함으로써 이의 반감기를 증가시키는 작용을 할 수 있다. WO 2004/003019에서는 첫 번째 항원이나 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 첫 번째 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 두 번째 항원이나 에피토프에 대한 결합 활성을 갖는 두 번째 상보적 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 이중특이적 리간드를 제시하는데, 여기서 상기 항원이나 에피토프의 한쪽 또는 양쪽 모두 생체내에서 리간드의 반감기를 증가시키는 작용을 하고, 상기 이중특이적 리간드가 항-HSA VH 도메인 및 항-β-갈락토시다아제 VK 도메인으로 구성되지 않은 경우에, 상기 첫 번째와 두 번째 도메인은 동일한 특이성을 공유하는 상호 상보적 도메인이 부재한다.
유리하게는, 본 명세서에 기술된 바와 같이 리간드의 반감기를 증가시키는 항원이나 에피토프는 생물체의 생체내에서 발견되는 단백질 또는 폴리펩티드 상에 존재한다.
실례는 세포외 매트릭스 단백질, 혈액 단백질 및 생물체의 다양한 조직 내에 존재하는 단백질 등이다. 이들 단백질은 예로써, 부피형성제(bulking agent)로서 작용함으로서, 또는 리간드를 작용 목적 부위에 고착시킴으로서 혈액으로부터 리간드 제거(clearance) 속도를 감소시키는 작용을 한다. 생체내 반감기를 증가시키는 항원/에피토프의 실례는 하기 부록 1에 제시된다.
증가된 반감기는 면역글로불린, 바람직하게는 항체, 가장 바람직하게는 작은 크기의 항체 단편의 생체내 적용에 유용하다. 이들 단편(Fv, 이황화 결합된 Fv, Fab, scFv, dAb)은 신체로부터의 제거가 급속하게 진행된다; 따라서, 이들은 대부분의 신체 부위에 빠르게 도달하고 신속하게 제조되며 조작이 용이하긴 하지만, 이들의 생체내 적용은 생체내에서 짧은 지속 시간에 의해 제한된다. 본 발명은 생체내에서 리간드의 증가된 반감기 및 결과로써, 신체 내에서 리간드의 기능적 활성의 더욱 긴 지속 시간을 제공함으로서 이러한 문제점을 해결한다.
리간드 반감기의 약물동력학적 분석과 결정을 위한 방법은 당업자에게 널리 알려져 있다. 상세한 설명은 Kenneth A et al.: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists 및 Peters et al, Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach (1996)에 확인할 수 있다. 또한, t 알파와 t 베타 반감기 및 곡선 아래 면적(area under curve, AUC)과 같은 약물동력학적 파라미터를 기술하는 "Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, published Marcel Dekker, 2nd Rev. ex eddition(1982)을 참조한다.
반감기(t1/2 알파와 t1/2 베타) 및 AUC는 시간에 대한 리간드의 혈청 농도 곡선으로부터 결정될 수 있다. 가령, WinNonlin 분석 패키지(Pharsight Corp., Mountain View, CA94040, USA)가 곡선을 모델링하는데 이용될 수 있다. 첫 번째 단계(phase)(알파 단계)에서, 리간드는 주로 환자에 분포되고 일부 배출된다. 두 번째 단계(베타 단계)는 리간드가 분산되는 종점 단계이고, 혈청 농도는 리간드가 환자로부터 제거됨에 따라 감소한다. t 알파 반감기는 첫 번째 단계의 반감기이고, t 베타 반감기는 두 번째 단계의 반감기이다. 따라서, 유리하게는, 본 발명은 15 분 이상의 범위에서 tα반감기를 갖는 본 발명에 따른 리간드 또는 상기 리간드를 함유하는 조성물을 제시한다. 한 구체예에서, 상기 범위의 하위 종점은 30분, 45분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 10시간, 11시간 또는 12시간이다. 이에 더하여, 또는 대안으로, 본 발명에 따른 리간드 또는 조성물은 최대 12시간 범위의 tα반감기를 갖는다. 한 구체예에서, 범위의 상위 종점은 11, 10, 9, 8, 7, 6 또는 5시간이다. 적절한 범위의 실례는 1 내지 6시간, 2 내지 5시간 또는 3 내지 4시간이다. 유리하게는, 본 발명은 2.5시간 이상의 범위에서 tβ반감기를 갖는 본 발명에 따른 리간드 또는 상기 리간드를 함유하는 조성물을 제시한다.
한 구체예에서, 범위의 하위 종점은 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 10시간, 11시간 또는 12시간이다. 이에 더하여, 또는 대안으로, 본 발명에 따른 리간드 또는 조성물은 최대 21일 범위의 tβ반감기를 갖는다. 한 구체예에서, 범위의 상위 종점은 12시간, 24시간, 2일, 3일, 5일, 10일, 15일 또는 20일이다. 유리하게는, 본 발명에 따른 리간드 또는 조성물은 12-60시간 범위의 tβ반감기를 갖는다.
다른 구체예에서, 이는 12 내지 48시간 범위이다. 또 다른 구체예에서, 이는 12 내지 26시간 범위이다.
상기 기준에 더하여, 또는 대안으로, 본 발명은 1 ㎎.min/㎖ 또는 그 이상의 범위에서 AUC(area under curve) 수치를 갖는 본 발명에 따른 리간드 또는 상기 리간드를 함유하는 조성물을 제시한다. 한 구체예에서, 범위의 하위 종점은 5, 10, 15, 20, 30, 100, 200 또는 300 ㎎.min/㎖이다. 이에 더하여, 또는 대안으로, 본 발명에 따른 리간드 또는 조성물은 최대 600 ㎎.min/㎖ 범위의 AUC를 지닌다.
한 구체예에서, 범위의 상위 종점은 500, 400, 300, 200, 150, 100, 75 또는 50 ㎎.min/㎖이다. 유리하게는, 본 발명에 따른 리간드는 아래에서 선택되는 범위의 AUC를 갖는다: 15 내지 150 ㎎.min/㎖, 15 내지 100 ㎎.min/㎖, 15 내지 75 ㎎.min/㎖, 15 내지 50 ㎎.min/㎖.
첫 번째 구체예에서, 이중특이적 리간드는 2개의 상보적 가변 도메인, 다시 말하면, 본 발명의 배경에서 동족(congate) 에피토프에 개별적으로 결합하더라도 자연적인 환경에서 동족 쌍이나 군으로서 함께 작용할 수 있는 2개의 가변 도메인은 을 포함한다. 가령, 상보적 가변 도메인은 면역글로불린 중쇄와 경쇄 가변 도메인(VH 및 VL)이다. 유리하게는, VH과 VL 도메인은 scFv 또는 Fab 항체 단편에 의해 제공된다. 가변 도메인은 함께 연결되어 예로써, 각 V 도메인의 C-말단에서 힌지(hinge) 영역의 제공 및 힌지 영역 내에서 시스테인 사이의 이황화 결합; 또는 도메인의 C-말단에서 시스테인으로 각 dAb의 공급, 이들 시스테인은 함께 이황화 결합됨; 또는 Fab 포맷을 산출하는 V-CH & V-CL의 생성; 또는 이량체, 삼량체, 다량체를 생성하는 펩티드 링커(가령, 아래에 기술된 Gly4Ser 링커)의 이용에 의해 다가 리간드를 형성한다. 본 발명자들은 상보적 가변 도메인의 이용이 2개의 도메인 표면이 함께 패킹되고 용매로부터 격리될 수 있도록 한다는 것을 발견하였다. 더 나아가, 상보적 도메인은 서로 안정화시킬 수 있다. 이에 더하여, 이는 선행기술에서 이용되는 하이브리드 하이브리도마의 단점 없이, 또는 아단위 인터페이스에서 중쇄 또는 경쇄를 조작할 필요 없이, 이중특이적 IgG 항체의 생성을 가능하게 한다.
본 발명의 첫 번째 측면의 이중특이적 리간드는 적어도 하나의 VH/VL 쌍을 보유한다. 따라서, 본 발명에 따른 이중특이적 IgG는 Y-형태 분자의 각 팔(arm)에 한 쌍씩 2개의 쌍을 포함한다. 이런 이유로, 이용되는 사슬의 비율이 제조의 성공에서 결정적이고 실질적인 어려움을 유발하는 통상의 이중특이적 항체 또는 디아바디(diabody)와 달리, 본 발명의 이중특이적 리간드는 사슬 균형의 문제로부터 자유롭다. 통상의 이중특이적 항체에서 사슬 불균형은 2개의 상이한 VL 사슬과 2개의 상이한 VH 사슬의 결합에 기인하는데, VH 사슬 1과 함께 VL 사슬 1은 항원이나 에피토프 1에 결합할 수 있고, VH 사슬 2와 함께 VL 사슬 2는 항원이나 에피토프 2에 결합할 수 있고, 2개의 정확한 쌍 형성은 다소간 서로 연관된다. 따라서, 단일 분자 내에서 VL 사슬 1이 VH 사슬 1과 쌍을 이루고, VL 사슬 2가 VH 사슬 2와 쌍을 이룰 때에만 이중특이성이 형성된다. 이들 이중특이적 분자는 2가지 다른 방식으로 생성될 수 있다. 먼저, 이들은 상이한 항원이나 에피토프에 각각 결합하는 2개의 기존 VH/VL 쌍의 결합에 의해 생성될 수 있다(가령, 이중특이적 IgG 내에서). 이 경우에, VH/VL 쌍 형성은 모두 이중특이적인 분자의 집단을 생성하기 위하여 1 : 1의 비율로 이루어져야 한다. 이는 결코 발생하지 않고(상보적 CH 도메인이 “구멍 내에 손잡이(knobs into holes)” 조작에 의해 강화되더라도), 이중특이적 분자 및 하나의 항원이나 에피토프에만 결합하고 다른 항원이나 에피토프에는 결합할 수 없는 분자의 혼합물을 유발한다. 이중특이적 항체를 생성하는 두 번째 방법은 2개의 상이한 VH 사슬과 2개의 상이한 VL 사슬의 동시 결합에 의한다(가령, 이중특이적 디아바디(diabody)에서). 이 경우에, VL 사슬 1이 VH 사슬 1과 쌍을 이루고 VL 사슬 2가 VH 사슬 2와 쌍을 이루는 선호(VL과 VH 도메인의 “구멍 내에 손잡이” 조작에 의해 강화될 수 있음)의 경향이 존재하긴 하지만, 이러한 쌍 형성은 모든 분자에서 달성되는 것이 아니고, 항원이나 에피토프에 결합할 수 없는 부정확한 쌍 형성이 발생하는 혼합물을 유발한다.
본 발명의 첫 번째 측면에 따른 이중특이적 리간드 접근법에 따라 작제된 이중특이적 항체는 항원이나 에피토프 1에 대한 결합이 VH 또는 VL 도메인 내에 존재하고, 항원이나 에피토프 2에 대한 결합이 상보적인 VH 또는 VL 도메인 내에 존재하기 때문에, 이들 문제점을 모두 극복한다. VH와 VL 도메인이 1 : 1 기초로 쌍을 이루기 때문에, 모든 VH/VL 쌍 형성은 이중특이적이고, 따라서 이들 VH/VL 쌍 형성을 이용하여 작제된 모든 포맷(Fv, scFv, Fab, 미니바디(minibody), IgG 등)은 100% 이중특이적 활성을 갖는다.
본 발명의 배경에서, 첫 번째와 두 번째 “에피토프”는 동일하지 않고 단일 단일특이적 리간드에 의해 결합되지 않은 에피토프인 것으로 이해된다. 본 발명의 첫 번째 배치에서, 이들은 상이한 항원이고, 이들 중에서 하나는 생체내에서 리간드 반감기를 증가시키는 역할을 한다. 이와 유사하게, 첫 번째와 두 번째 항원은 동일하지 않다.
본 발명의 이중특이적 리간드는 WO 02/02773에 기술된 리간드를 포함하지 않는다. 따라서, 본 발명의 리간드는 임의의 하나이상의 항원이나 에피토프에 동시-작업으로 결합하는 상보적 VH/VL 쌍을 포함하지 않는다. 대신에, 본 발명의 첫 번째 측면에 따른 리간드는 V 도메인이 상이한 특이성을 갖는 VH/VL 상보적 쌍을 포함한다.
게다가, 본 발명의 첫 번째 측면에 따른 리간드는 비-구조적으로 관련된 에피토프 또는 항원에 대해 상이한 특이성을 갖는 VH/VL 상보적 쌍을 포함한다. 구조적으로 관련된 에피토프 또는 항원은 항원이나 에피토프에 결합하도록 동시-작업 방식으로 작용하는 통상의 VH/VL 상보적 쌍에 의해 결합될 만큼 충분한 구조적 유사성을 갖는 에피토프 또는 항원인데, 구조적으로 관련된 에피토프의 경우에, 이들 에피토프는 VH/VL 이량체의 항원 결합 부위에서 형성된 동일한 결합 포켓 내에 “합치”될 만큼 구조적으로 충분히 유사하다.
두 번째 측면에서, 본 발명은 첫 번째 항원이나 에피토프 결합 특이성을 갖는 첫 번째 면역글로불린 가변 도메인 및 두 번째 항원이나 에피토프 결합 특이성을 갖는 두 번째 면역글로불린 가변 도메인을 포함하는 리간드를 제시하는데, 상기 첫 번째와 두 번째 가변 도메인의 한쪽 또는 양쪽 모두 생체내에서 리간드의 반감기를 증가시키는 항원에 결합하고, 이들 가변 도메인은 서로 상보적이지 않다.
한 구체예에서, 하나의 가변 도메인에 대한 결합은 두 번째 가변 도메인에 대한 리간드의 결합을 조절한다.
이러한 구체예에서, 가변 도메인은 예로써, VH 도메인 쌍 또는 VL 도메인 쌍이다. 첫 번째 부위에서 항원의 결합은 두 번째 부위에서 항원의 결합을 조절, 예를 들면, 강화 또는 저해한다. 가령, 첫 번째 부위에서 결합은 두 번째 부위에서 항원 결합을 적어도 부분적으로 저해한다. 상기 구체예에서, 리간드는 예로써, 두 번째 표적 항원에 결합하게 되고 반감기 증가 단백질로부터 분리되는 시점까지, 리간드의 반감기를 증가시키는 단백질에 대한 결합을 통하여 생체내에서 개체 생물체의 신체 내에 유지된다.
이러한 배경에서 결합 조절은 서로에 대한 항원 결합 부위의 구조적 근접성(structural proximity)의 결과로써 달성된다. 이러한 구조적 근접성은 2개 이상의 항원 결합 부위를 연결하는 구조 성분의 특성에 의해, 예를 들면, 항원 결합 부위를 근접되게 보유하는 상대적으로 견고한 구조를 갖는 리간드의 제공으로 달성될 수 있다. 유리하게는, 2개 이상의 항원 결합 부위는 서로 물리적으로 매우 근접되게 위치하고, 따라서 한 부위는 면역글로불린 분자 내에 입체적 방해 및/또는 형태적 변화를 수반하는 과정으로 다른 부위에서 항원의 결합을 조절하게 된다.
첫 번째와 두 번째 결합 도메인은 공유결합으로 또는 비-공유결합으로 결합된다. 도메인이 공유결합으로 결합되는 경우에, 결합은 예로써, 이황화 결합에 의해 또는 (Gly4Ser)n(n= 1 내지 8, 예를 들면, 2, 3, 4, 5 또는 7)과 같은 폴리펩티드 링커에 의해 매개된다.
본 발명의 이러한 측면에 따른 리간드는 비-면역글로불린 다중-리간드 구조에 통합되어 다가 복합체를 형성하는데, 이는 동일한 항원을 갖는 표적 분자에 결합하여 우수한 친화력(avidity)을 제공하고, 적어도 하나의 가변 도메인이 다량체의 반감기를 증가시키는 항원에 결합한다. 가령, SpA와 같은 자연 박테리아 수용체는 하나이상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 리간드를 산출하기 위하여 CDR의 이식을 위한 뼈대로서 이용되고 있다. 이러한 절차의 상세한 설명은 미국 특허 제5,831,012호에서 기술된다. 다른 적합한 뼈대는 피브로넥틴(fibronectin) 및 어피바디(affibody)에 기초한 뼈대이다. 적합한 절차의 상세한 설명은 WO 98/58965에서 기술된다. 다른 적합한 뼈대는 van den Beuken et al., J Mol. Biol. (2001) 310:591-601에 기술된 리포칼린(lipocallin)과 CTLA4 및 예로써 박테리아 GroEL 또는 다른 샤페론(chaperone) 폴리펩티드의 고리 구조에 기초하고 WO0069907(Medical Research Council)에 기술된 뼈대이다.
단백질 뼈대는 통합된다, 예를 들면, CDR은 CTLA4 뼈대 상에 이식되고 면역글로불린 VH 또는 VL 도메인과 함께 사용되어 다가 리간드를 형성한다.
이와 유사하게, 피브로넥틴, 리포칼린 및 다른 뼈대가 통합될 수 있다.
가변 도메인이 예로써, 본 명세서에 기술된 바와 같이 파지 전시 기술을 이용하여 선별된 V-유전자 레퍼토리로부터 선택되는 경우에, 이들 가변 도메인은 보편적 프레임워크 영역을 포함할 수 있고, 따라서 이들은 본 명세서에 정의된 특이적인 총괄적 리간드에 의해 인식될 수 있다. 보편적 프레임워크, 총괄적 리간드 등의 이용은 WO 99/20749에서 기술된다. 본 발명에서, 파지 전시에 대한 참조는 파지 및/또는 파지미드(phagemid)의 이용을 포함한다.
V-유전자 레퍼토리가 이용되는 경우에, 폴리펩티드 서열 내에서 변이는 가급적, 가변 도메인의 구조적 루프 내에 위치한다. 가변 도메인의 폴리펩티드 서열은 각 가변 도메인 및 이의 상보적 쌍의 상호작용을 강화시키기 위하여 DNA 셔플링(shuffling) 또는 돌연변이에 의해 변화된다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, “이중특이적 리간드”는 단일 사슬 Fv 단편이다. 본 발명의 대안적 구체예에서, “이중특이적 리간드”는 항체의 Fab 영역으로 구성된다. “Fab 영역”은 2개의 VH 또는 2개의 VL 도메인이 이용된 Fab-유사 영역을 포함한다.
가변 영역은 표적 항원이나 에피토프를 지향하는 항체로부터 유래될 수 있다. 대안으로, 이들은 섬유상 박테리오파지 표면 상에 발현된 것들과 같은 단일 항체 도메인의 레퍼토리로부터 유래된다. 선별은 아래에 기술된 바와 같이 수행된다.
dAb의 제조:
본 발명의 한 측면은 전체적으로 이중특이적 리간드에 관계하고, 또한 이중특이적 포맷으로 TNF-α 단독, TNF-α, HSA 또는 다른 반감기-연장 폴리펩티드에 결합하는 리간드와 이중특이적 포맷으로 TNF-α와 VEGF에 결합하는 리간드의 다양한 구조체에 관계한다. VEGF와 HSA 또는 다른 반감기-연장 폴리펩티드에 결합하는 리간드 역시 제조될 수 있다. 이중특이적 TNF-α/VEGF 구조체는 부가적으로, HSA 또는 다른 반감기-연장 분자에 대한 결합제(binder)를 포함할 수 있다. 이들 각 구체예에서, 개별 리간드, 다시 말하면, TNF-α, HSA 또는 VEGF에 결합하는 리간드는 가급적, dAb이다. 이들 dAb의 생산은 아래에 기술된다.
다양한 측면에서, 본 명세서에 기술된 dAb는 단량체 형태, 이량체 형태, 삼량체 형태, 사량체 형태, 또는 그 이상의 다량체 형태로 존재할 수 있다. 이들 이중특이적 구조체와 같은 이형이량체 형태에 더하여, 다량체 구조체는 동종다량체, 다시 말하면, 동종이량체, 동종삼량체, 동종사량체 등일 수 있다. 이형삼량체, 이형사량체 및 그 이상의 이형다량체 역시 고려된다. 다양한 dAb 형태 각각은 폴리펩티드 구조체의 혈청 반감기를 더욱 연장하기 위하여 부가적으로, 추가의 부분, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 복합될 수 있다. PEG화(PEGylation)는 당분야에 공지되어 있고 본 명세서에서 기술된다.
dAb의 단일 면역글로불린 가변 도메인은 다양한 방식으로 생성된다. 바람직한 측면에서, 이들 dAb는 인간 단일 면역글로불린 가변 도메인이다. 이들 각 접근법에서, 핵산 서열을 생성(가령, 증폭, 돌연변이 등)하고 조직하는 널리 공지된 방법이 적용될 수 있다.
dAb를 제조하는 한가지 수단은 원하는 항원에 결합하는 것으로 공지된 클론된 항체에 대한 중쇄와 경쇄 유전자의 VH 또는 VL 영역을 증폭하고 발현하는 것이다. VH와 VL 도메인의 경계는 Kabat et al.(1991, supra)에서 기술된다. 중쇄와 경쇄 유전자의 VH와 VL 도메인의 경계와 관련된 정보를 이용하여, 소정의 항원에 결합하는 것으로 공지된 항체를 인코딩하는 클론된 중쇄와 경쇄 코딩 서열로부터 V 도메인을 증폭하는 PCR 프라이머를 설계한다. 증폭된 V 도메인은 적합한 발현 벡터, 예를 들면, pHEN-1(Hoogenboom et al., 1991, Nucleic Acids Res. 19: 4133-4137)에 삽입하고, 단독으로 또는 다른 폴리펩티드 서열과의 융합체로서 발현시킨다. 이후, 발현된 VH 또는 VL 도메인은 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드의 나머지 부분으로부터 분리하여, 원하는 항원으로의 높은 친화력 결합에 대해 스크리닝한다. 본 발명의 모든 측면에서, 결합에 대한 스크리닝은 당분야에 공지되거나 아래에 기술된 바와 같이 수행된다.
VH 또는 VL 도메인의 레퍼토리는 예로써, 원하는 항원을 팬닝(panning)하는 파지 전시에 의해 스크리닝된다. 박테리오파지 전시 라이브러리와 람다 파지 발현 라이브러리의 작제 방법은 당분야에 널리 공지되어 있고, 예로써 McCafferty et al., 1990, Nature 348: 552; Kang et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88: 4363; Clackson et al., 1991, Nature 352: 624; Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832; Burton et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 88: 10134; Hoogenboom et al., 1991, Nucleic Acids Res. 19: 4133; Chang et al.,1991, J. Immunol. 147: 3610; Breitling et al., 1991, Gene 104: 147; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581; Barbas et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 4457; Hawkins and Winter(1992) J. Immunol., 22: 867; Marks et al.(1992) J. Biol. Chem., 267: 16007; Lerner et al.(1992) Science, 258: 1313에서 교시된다. scFv 파지 라이브러리는 예로써, Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci U. S.A. 85: 5879-5883; Chaudhary et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 87: 1066-1070; McCafferty et al., 1990, supra; Clackson et al., 1991, supra; Marks et al., 1991, supra; Chiswell et al., 1992, Trends Biotech. 10: 80; Marks et al., 1992, supra에서 교시된다. 박테리오파지 외피 단백질에 전시된 scFv 라이브러리의 다양한 구체예가 기술되었다. 파지 전시 접근법의 교화 역시 공지되어 있고, 예로써 WO96/06213와 W092/01047(Medical Research Council et al.) 및 W097/08320(Morphosys, supra)에서 기술된다.
VH 또는 VL 도메인의 레퍼토리는 면역글로불린 서열의 자연-발생 레퍼토리 또는 합성 레퍼토리일 수 있다. 자연-발생 레퍼토리는 예로써, 1명 이상의 개체로부터 수확된 면역글로불린-발현 세포로부터 생성된다. 이들 레퍼토리는 고유하다, 다시 말하면, 인간 태아 또는 신생아 면역글로불린-발현 세포로부터 생성된다, 또는 재정렬된다, 다시 말하면, 성체 인간 B 세로부터 생성된다. 자연 레퍼토리는 예로써, Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581 및 Vaughan et al., 1996, Nature Biotech에서 기술된다. 원하는 경우에, 자연 레퍼토리, 또는 표적 항원에 결합하는 임의의 레퍼토리로부터 확인된 클론은 향상된 결합 특성을 갖는 변이체를 생성하고 선별하기 위하여, 돌연변이 및 추가의 스크리닝이 수행된다.
단일 면역글로불린 가변 도메인의 합성 레퍼토리는 다양성(diversity)을 클론된 V 도메인에 인공적으로 도입함으로써 생성된다. 합성 레퍼토리는 예로써, Hoogenboom & Winter, 1992, J. Mol. Biol. 227: 381; Barbas et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 4457; Nissim et al., 1994, EMBO J. 13: 692; Griffiths et al., 1994, EMBO J. 13: 3245; DeKriuf et al., 1995, J. Mol. Biol. 248: 97; WO 99/20749에서 기술된다.
통상적인 항체의 항원 결합 도메인은 2개의 독립된 영역: 중쇄 가변 도메인(VH)과 경쇄 가변 도메인(VL: 이는 Vκ 또는 Vλ이다)을 포함한다. 이런 항체의 항원 결합 부위는 6개의 폴리펩티드 루프: VH 도메인으로부터 3개(H1, H2, H3) 및 VL 도메인으로부터 3개(L1, L2, L3)로 구성된다. 이들 루프의 경계는 예로써, Kabat et al.(1991, supra)에서 기술된다. VH와 VL 도메인을 인코딩하는 V 유전자의 다양한 일차 레퍼토리는 생체내에서, 유전자 분절의 조합 재정렬(combinatorial rearrangement)에 의해 생성된다. VH 유전자는 3개의 유전자 분절, VH, D, JH의 재조합으로 생성된다. 인간의 경우에, 일배체형(haplotype)에 따라, 대략 51개의 기능성 VH 분절(Cook and Tomlinson(1995) Immunol Today, 16: 237), 25개의 기능성 D 분절(Corbett et al.(1997) J. Mol. Biol., 268: 69), 6개의 기능성 JH 분절(Ravetch et al.(1981) Cell, 27: 583)이 존재한다. VH 분절은 VH 도메인의 첫 번째와 두 번째 항원 결합 루프(H1과 H2)를 형성하는 폴리펩티드 사슬의 영역을 인코딩하고, VH, D, JH 분절은 결합하여 VH 도메인의 세 번째 항원 결합 루프(H3)를 형성한다.
VL 유전자는 단지 2개의 유전자 분절, VL과 JL의 조합으로 생성된다. 인간의 경우에, 일배체형에 따라, 대략 40개의 기능성 Vκ 분절(Schable and Zachau(1993) Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 374: 1001), 31개의 기능성 Vλ 분절(Williams et al.(1996) J. Mol. Biol., 264: 220; Kawasaki et al.(1997) Genome Res., 7: 250), 5개의 기능성 Jκ 분절(Hieter et al.(1982) J. Biol. Chem. 257: 1516), 4개의 기능성 Jλ 분절(Vasicek and Leder(1990) J. Exp. Med., 172: 609)이 존재한다. VL 분절은 VL 도메인의 첫 번째와 두 번째 항원 결합 루프(L1과 L2)를 형성하는 폴리펩티드 사슬의 영역을 인코딩하고, VL과 JL 분절은 결합하여 VL 도메인의 세 번째 항원 결합 루프(L3)를 형성한다. 이런 일차 레퍼토리로부터 선택된 항체는 적어도 중간 정도의 친화력으로 거의 모든 항원에 결합할 수 있을 만큼 충분히 다양하다. 높은 친화력 항체는 재정렬된 유전자의 “친화력 성숙(affinity maturation)”에 의해 생체내에서 생산되는데, 여기서 향상된 결합의 기초에서 면역계에 의해 점 돌연변이(point mutation)가 생성되고 선택된다.
항체의 구조와 서열 분석에서, 6개의 항원 결합 루프 중에서 5개(H1, H2, L1, L2, L3)가 제한된 수의 주요-사슬 형태(main-chain conformation) 또는 정준 구조(canonical structure)를 보유하는 것으로 밝혀졌다(Chothia and Lesk(1987) J. Mol. Biol., 196: 901; Chothia et al.(1989) Nature, 342: 877). 주요 사슬 형태는 (i) 항원 결합 루프의 길이 및 (ii) 항원 결합 루프와 항체 프레임워크에서 특정 핵심 위치에 특정 잔기, 또는 잔기의 유형에 의해 결정된다. 루프 길이와 핵심 잔기의 분석으로, 대부분의 인간 항체 서열에 의해 인코딩되는 H1, H2, L1, L2, L3의 주요-사슬 형태를 예측할 수 있다(Chothia et al.(1992) J. Mol. Biol., 227: 799; Tomlinson et al.(1995) EMBO J., 14: 4628; Williams et al.(1996) J. Mol. Biol., 264: 220). 비록, H3 영역이 서열, 길이, 구조의 관점에서 더욱 다양하긴 하지만(D 분절의 이용에 기인함), 이는 항원 결합 루프와 항체 프레임워크 내에 핵심 위치에서 특정 잔기의 길이와 존재, 또는 잔기의 유형에 좌우되는 짧은 루프 길이를 위한 제한된 수의 주요-사슬 형태를 형성한다(Martin et al.(1996) J. Mol. Biol., 263: 800; Shirai et al.(1996) FEBS Letters, 399: 1)
본 발명의 한 구체예에 따라, 다양성이 다양한 항원-결합 루프의 CDR 내에 임의의 부위에서 합성 레퍼토리에 부가될 수 있긴 하지만, 이런 접근법은 적절하게 접히지 않고, 항원에 결합할 수 있는 잠재력을 갖는 분자의 더욱 낮아진 비율의 원인이 되는 더욱 높은 비율의 V 도메인을 유발한다. 항원-결합 루프의 주요 사슬 형태에 기여하는 잔기에 대한 이해는 VH 또는 VL 도메인의 합성 레퍼토리에서 다양화되는 특정 잔기를 확인하는데 도움이 된다. 다시 말하면, 다양성은 주요 사슬 형태를 유지하는데 필수적이지 않은 잔기에 최적으로 도입된다. 예시로써, 루프 L2의 다양화의 경우에, 통상적인 접근법은 Kabat et al.(1991, supra)에 정의된 바와 같이, 상응하는 CDR(CDR2)에서 모든 잔기(대략 7개의 잔기)를 다양화하는 것이다. 하지만, L2의 경우, 위치 50과 53은 자연 발생 항체에서 다양한 것으로 알려져 있고, 항원과의 접촉을 유도하는 것으로 관찰되었다. 선호되는 접근법은 상기 루프에서 이들 두 잔기만을 다양화하는 것이다. 이는 일련의 항원 결합 특이성을 산출하는데 요구되는 기능적 다양성의 관점에서 현저하게 개선된 것이다.
한 측면에서, 합성 가변 도메인 레퍼토리는 인위적으로 다양화된 생식세포계 VH 또는 Vκ 서열에 기초하여, VH 또는 Vκ 배경에서 생성된다. 가령, VH 도메인 레퍼토리는 클론된 생식세포계 VH 유전자 분절 V3-23/DP47(Tomlinson et al., 1992, J. Mol. Biol. 227: 7768)과 JH4b(도 1과 2 참조)에 기초한다. Vκ 도메인 레퍼토리는 예로써, 생식세포계 Vκ 유전자 분절 02/012/DPK9(Cox et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24: 827) 및 Jκ1(도 3 참조)에 기초한다. 다양성은 예로써, PCR 돌연변이유발에 의해 이와 같은 유전자 분절에 도입된다. 다양성은 예로써, 실수 유발(error prone) PCR(Hawkins, et al., 1992, J. Mol. Biol. 226: 889) 또는 화학적 돌연변이유발에 의해 무작위로 도입될 있다. 하지만, 앞서 기술된 바와 같이, 다양성의 도입은 특정 잔기를 표적하는 것이 바람직하다. 또한, 원하는 잔기는 모든 아미노산과 TAG 종결 코돈을 인코딩하는 돌연변이유발 프라이머를 이용한 코돈 NNK(IUPAC 명칭 이용; N = G, A, T 또는 C, K= G 또는 T)의 도입으로 표적하는 것이 바람직하다. 유사한 결과를 달성하는 다른 코돈, 예를 들면, NNN 코돈(이는 추가적인 종결 코돈 TGA와 TAA의 생성을 유도한다), DVT 코돈((A/G/T)(A/G/C)T), DVC 코돈((A/G/T)(A/G/C)C), DVY 코돈((A/G/T)(A/G/C)(C/T) 역시 이용된다. DVT 코돈은 22% 세린 및 11% 티로신, 아스파라긴, 글리신, 알라닌, 아스파라긴산염, 트레오닌, 시스테인을 인코딩하는데, 이는 자연 인간 항체의 항원 결합 부위에 대한 아미노산 잔기의 분포를 가장 가깝게 모방한다. 레퍼토리는 다양화되는 각 부위에 선택된 축퇴 코돈을 보유하는 PCR 프라이머를 이용하여 생성된다. PCR 돌연변이유발은 당분야에 공지되어 있다; 하지만, 본 발명의 방법에 유용한 프라이머 설계와 PCR 돌연변이유발을 위한 고려는 하기 “PCR 돌연변이유발” 섹션에서 기술된다.
한 측면에서, 다양성은 도 1에 도시된 바와 같이, CDR 1, 2, 3에서 다양성에 상응하는 부위 H30, H31, H33, H35, H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H97, H98에서 NNK 코돈을 이용하여 인간 생식세포계 VH 유전자 분절 V3-23/DP47(Tomlinson et al., 1992, J. Mol. Biol. 227: 7768)과 JH4b의 서열에 도입된다.
다른 측면에서, 다양성은 도 2에 도시된 바와 같이, 예로써, CDR 1, 2, 3에서 다양성에 상응하는 H30, H31, H33, H35, H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H97, H98, H99, H100, H100a, H100b에서 NNK 코돈을 이용하여 인간 생식세포계 VH 유전자 분절 V3-23/DP47과 JH4b의 서열에 도입된다.
다른 측면에서, 다양성은 도 3에 도시된 바와 같이, 예로써, CDR 1, 2, 3에서 다양성에 상응하는 부위 L30, L31, L32, L34, L50, L53, L91, L92, L93, L94, L96에서 NNK 코돈을 이용하여 인간 생식세포계 Vκ 유전자 분절에 도입된다.
다양화된 레퍼토리는 당분야에 공지되고 예로써 WO 99/20749에 기술된 바와 같이 파지 전시 벡터 내로 클론된다. 전반적으로, 본 발명의 수행에 요구되는 핵산 분자와 벡터 구조체는 당분야에서 구입가능하고, Sambrook et al.(1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, USA와 같은 표준 실험실 매뉴얼에 기술된 바와 같이 작제되고 조작된다.
본 발명에서 핵산의 조작은 전형적으로, 재조합 벡터에서 수행된다. 본 명세서에서, “벡터”는 이질성 DNA를 이의 발현이나 복제를 위하여 세포 내로 도입하는데 이용되는 별개의 요소를 의미한다. 이와 같은 벡터를 선택하거나 작제하고 이용하는 방법은 당업자에게 널리 알려져 있다. 박테리아 플라스미드, 박테리오파지, 인공 크로모좀, 에피솜 벡터를 비롯한 다수의 벡터가 공개적으로 입수가능하다. 이들 벡터는 단순한 클로닝과 돌연변이유발에 이용될 수 있다; 대안으로, 본 발명의 레퍼토리(또는 전-레퍼토리) 구성원이 운반되는 벡터인 경우에 전형적인 유전자 발현 벡터가 이용된다. 본 발명에 따라 이용되는 벡터는 전형적으로 0.25 킬로베이스(kb) 내지 40 kb 또는 그 이상의 길이에서 원하는 크기의 폴리펩티드 코딩 서열을 수용하도록 선택된다. 적당한 숙주 세포는 시험관내 클로닝 조작이후 상기 벡터로 형질전환된다. 각 벡터는 다양한 기능적 구성요소를 보유하는데, 여기에는 일반적으로, 클로닝(또는 “폴리링커(polylinker)”) 부위, 복제 기점, 적어도 하나의 선별가능 마커 유전자가 포함된다. 소정의 벡터가 발현 벡터이면, 이는 클로닝 부위의 주변에 각각 위치하는 아래의 구성요소: 인핸서 요소, 프로모터, 전사 종결인자, 신호 서열 중에서 하나이상을 부가적으로 보유하는데, 이들은 본 발명에 따른 폴리펩티드 레퍼토리 구성원을 인코딩하는 유전자에 작동가능하게 연결된다.
클로닝과 발현 벡터 모두 일반적으로, 벡터가 하나이상의 선택된 숙주 세포에서 복제할 수 있도록 하는 핵산 서열을 보유한다. 전형적으로, 클로닝 벡터에서, 이러한 서열은 벡터가 숙주 크로모좀 DNA와 독립적으로 복제할 수 있도록 하는 서열인데, 여기에는 복제 기점 또는 자체적으로 복제하는 서열이 포함된다. 이들 서열은 다양한 박테리아, 효모, 바이러스에서 널리 알려져 있다. 플라스미드 pBR322로부터 복제 기점은 대부분의 그람-음성 박테리아에 적합하고, 2 마이크론 플라스미드 기점은 효모에 적합하고, 다양한 바이러스 기점(가령, SV 40, 아데노바이러스)은 포유동물 세포에서 클로닝 벡터에 유용하다. 일반적으로, 복제 기점은 높은 수준의 DNA를 복제할 수 있는 포유동물 세포, 예를 들면, COS 세포에 이용되는 경우가 아니라면, 포유동물 발현 벡터에 불필요하다.
유리하게는, 클로닝 또는 발현 벡터는 선별가능 마커라고 하는 선별 유전자(selection gene)를 또한, 보유한다. 상기 유전자는 선별적 배양 배지에서 배양되는 형질전환된 숙주 세포의 생존이나 성장에 필요한 단백질을 인코딩한다. 이런 이유로, 선별 유전자를 보유하는 벡터로 형질전환되지 않은 숙주 세포는 상기 배양 배지에서 생존하지 못한다. 전형적인 선별 유전자는 항생제 및 다른 독소, 예를 들면, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 저항성을 공여하거나, 영양요구성 결핍(auxotrophic deficiency)을 보충하거나, 또는 성장 배지에서 가용하지 않은 중요한 영양소를 공급하는 단백질을 인코딩한다.
본 발명에 따른 벡터의 복제가 통상적으로, 대장균(E. coli)에서 수행되기 때문에, 대장균(E. coli)-선별가능 마커, 예를 들면, 항생제 암피실린에 저항성을 공여하는 β-락타마제 유전자가 유용하다. 이들은 대장균(E. coli) 플라스미드, 예를 들면, pBR322, 또는 pUC 플라스미드, 예를 들면, pUC18 또는 pUCl9로부터 획득될 수 있다.
발현 벡터는 통상적으로, 숙주 생물체에 의해 인식되고 목적하는 코딩 서열에 작동가능하게 연결되는 프로모터를 포함한다. 이러한 프로모터는 유도성 또는 구조성이다. “작동가능하게 연결되는”은 앞서 기술된 구성요소가 의도된 방식으로 기능할 수 있도록 하는 관계로 이들 구성요소의 병렬을 의미한다. 코딩 서열에 “작동가능하게 연결되는” 조절 서열은 코딩 서열의 발현이 조절 서열과 조화되는 조건하에 달성되도록 하는 방식으로 결찰된다.
원핵 숙주에 적합한 프로모터는 예로써, β-락타마제와 락토오스 프로모터 시스템, 알칼린 포스파타제, 트립토판(trp) 프로모터 시스템, 하이브리드 프로모터, 예를 들면, tac 프로모터 등이다. 박테리아 체계에 적합한 프로모터는 일반적으로, 코딩 서열에 작동가능하게 연결되는 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 서열을 또한, 포함한다.
본 명세서에 기술된 라이브러리 또는 레퍼토리에서, 선호되는 벡터는 폴리펩티드 라이브러리 구성원에 상응하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 가능하게 하는 발현 벡터이다. 따라서, 선별은 폴리펩티드 라이브러리 구성원을 발현하는 단일 클론의 독립된 증식과 발현에 의해, 또는 임의의 선별 전시 시스템의 이용에 의해 수행된다. 따라서, 파지 또는 파지미드 벡터가 이용될 수 있다. 선호되는 벡터는 대장균(E. coli) 복제 기점(이중 가닥 복제의 경우) 및 파지 복제 기점(단일 가닥 DNA의 생산의 경우)을 포함하는 파지미드 벡터이다. 이들 벡터의 조작과 발현은 당분야에 널리 공지되어 있다(Hoogenboom and Winter(1992) supra; Nissim et al.(1994) supra). 간단히 말하면, 벡터는 파지미드에 선별성(selectivity)을 공여하는 β-락타마제 또는 다른 선별가능 마커 및 pelB 리더 서열(이는 발현된 폴리펩티드를 주변세포질 공간으로 지향시킨다), 복수 클로닝 부위(라이브러리 구성원의 뉴클레오티드 이형을 클로닝하기 위하여), 선택적으로, 하나이상의 펩티드 태그(tag)(검출을 위하여), 선택적으로, 하나이상의 TAG 종결 코돈, 파지 단백질 pIII으로 구성되는(N에서 C 말단으로) 발현 카세트의 상류에 lac 프로모터를 포함한다. 대장균(E. coli)의 다양한 억제자와 비-억제자 균주를 이용하고 글루코오스, 이소프로필 티오-β-D-갈락토시드(IPTG) 또는 헬퍼 파지(helper phage), 예를 들면, VCS M13을 추가하여, 상기 벡터는 발현 없는 플라스미드로서 복제하거나, 폴리펩티드 라이브러리 구성원만을 대량으로 생산하거나, 또는 파지를 생산할 수 있는데, 이들 파지 중에서 일부는 그들의 표면에 폴리펩티드-pIII 융합의 적어도 하나의 사본을 보유한다.
선호되는 벡터의 실례는 pHEN1 파지미드 벡터(Hoogenboom et al., 1991, Nucl. Acids Res. 19: 4133-4137, 서열은 예로써, WO 03/031611에서 SEQ ID NO: 7로서 입수가능하다)인데, 여기서 pIII 융합 단백질의 생산은 LacZ 프로모터의 조절하에 수행되고, 상기 프로모터는 글루코오스의 존재에서 저해되고 IPTG에 의해 유도된다. 대장균(E. coli)의 억제자 균주, 예를 들면, TG1에서 성장되는 경우에, 유전자 III 융합 단백질이 생산되고 파지에 패킹되는 반면, 비-억제제 균주, 예를 들면, HB2151에서 성장되는 경우에, 박테리아 주변세포질과 배양 배지로 용해성 융합 단백질이 분비된다. 유전자 III의 발현이 헬퍼 파지에 의한 후기 감염(later infection)을 예방하기 때문에, 파지미드 벡터를 보유하는 박테리아는 파지 구출(phage rescue)을 위한 VCSM13 헬퍼 파지로 감염에 앞서, 글루코오스의 존재에서 증식시킨다.
본 발명에 따른 벡터의 작제는 통상적인 결찰 기술을 이용한다. 분리된 벡터 또는 DNA 단편은 절단되고, 재단되고, 필요한 벡터를 산출하는데 바람직한 형태로 재-결찰된다. 원하는 경우에, 표준 방법을 이용하여, 정확한 서열이 작제된 벡터에 존재하는 지를 확증하는 서열 분석을 수행한다. 발현 벡터를 작제하고, 시험관내 전사체를 생성하고, DNA를 숙주 세포 내로 도입하고, 발현과 기능을 평가하기 위한 분석을 수행하는데 적합한 방법은 당업자에게 널리 알려져 있다. 샘플 내에 유전자 서열은 통상적인 방법, 예를 들면, 서던 분석(Southern analysis)이나 노던 분석(Northern analysis), 웨스턴 블랏팅(Western blotting), DNA, RNA 또는 단백질의 다트 블랏팅(dot blotting), in situ 혼성화(hybridization), 면역세포화학(immunocytochemistry) 또는 핵산이나 단백질 분자의 서열 분석에 의해 존재가 검출되고, 이의 증폭 및/또는 발현이 정량된다. 당업자는 원하는 경우에, 이들 방법을 편의하게 수정될 수 있다.
PCR 돌연변이유발:
프라이머는 폴리펩티드 레퍼토리 구성원을 인코딩하는 일단의 핵산 레퍼토리 구성원의 생성에 이용되는 핵산 분자의 풀에 존재하는 표적 분자의 일부분에 상보적이다. 상당 부분, 프라이머는 화학적 또는 효소적 합성 방법에 의해 생성된다. 돌연변이유발 올리고뉴클레오티드 프라이머는 일반적으로, 15개 내지 100개, 이상적으로는 20개 내지 40개의 뉴클레오티드 길이를 갖지만, 상이한 길이의 올리고뉴클레오티드가 이용될 수도 있다.
전형적으로, 선별적 혼성화는 2개의 핵산 서열이 실질적으로 상보적인(적어도 14개 내지 25개의 뉴클레오티드의 가닥에 적어도 65%, 바람직하게는 적어도 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 85% 또는 90% 상보적인) 경우에 나타난다(참조: Kanehisa, 1984, Nucleic Acids Res. 12: 203). 결과로써, 프라이밍 부위(priming site)에서 일정한 정도의 부정합은 관용될 것으로 예상된다. 이런 부정합은 예로써, 단일-, 이중-, 또는 삼중-뉴클레오티드이다. 대안으로, 이는 뉴클레오티드 루프를 포함할 수 있는데, 상기 루프는 본 명세서에서, 부정합이 연속된 4개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 영역으로 정의된다.
전체적으로, 5가지 인자가 두 번째 핵산 분자에 대한 프라이머의 혼성화의 효율과 선택성에 영향을 준다. 이들 인자: (i) 프라이머 길이, (ii) 뉴클레오티드 서열 및/또는 조성, (iii) 혼성화 온도, (iv) 완충제 화학반응(buffer chemistry), (v) 혼성화를 위하여 프라이머가 요구되는 영역 내에 입체 방해(steric hindrance)에 대한 잠재가 비-무작위 프라이밍 서열을 설계할 때 고려되는 중요한 사항이다.
프라이머 길이 및 프라이머가 표적 서열에 어닐링하는 효율과 정확성 사이에 양의 상관관계가 존재한다; 더욱 긴 서열은 짧은 서열보다 더욱 높은 융점(TM)을 보유하고 소정의 표적 서열 내에 반복될 가능성이 더욱 낮기 때문에, 무차별한 혼성화를 최소화시킨다. 높은 G-C 함량을 보유하거나 회문 서열을 포함하는 프라이머 서열은 이들의 의도된 표적 부위에서처럼 자기-혼성화되는 경향이 있는데, 그 이유는 이중분자보다는 단일분자 혼성화 동태가 일반적으로, 용액에서 선호되기 때문이다; 이와 동시에, 표적 서열에 강하게 결합할 만큼 충분한 숫자의 G-C 뉴클레오티드 쌍을 보유하는 프라이머를 설계하는 것이 중요한데, 그 이유는 이와 같은 각 쌍이 A와 T 염기쌍에서 관찰되는 2개의 수소 결합이 아닌 3개의 수소 결합에 의해 결합되기 때문이다. 혼성화 온도는 혼성화 혼합물에 내포될 수 있는 유기 용매, 예를 들면, 포름아마이드의 농도처럼 프라이머 어닐링 효율과 역비례하여 변하는 반면, 염 농도의 증가는 결합을 조장한다. 엄밀도 혼성화 조건하에, 더욱 긴 프로브는 더욱 허용가능한 조건하에서는 충분한 짧은 프로브보다 더욱 효율적으로 혼성화된다. 프라이머에 대한 엄밀도 혼성화 조건은 전형적으로, 대략 1M 이하, 대략 500 mM 이하, 바람직하게는 대략 200 mM 이하의 염 농도를 포함한다. 혼성화 온도 범위는 최저 0℃에서 22℃ 이상, 대략 30℃ 이상, 거의 대부분, 대략 37℃ 초과이다. 더욱 긴 단편은 특이적인 혼성화를 위하여 더욱 높은 혼성화 온도를 요한다. 여러 인자가 혼성화의 엄밀도에 영향을 주기 때문에, 파라미터의 조합이 개별 파라미터의 절대 수치보다 중요하다.
프라이머는 이들 고려사항을 염두에 두고 설계된다. 다양한 서열의 상대적 장점이 당업자에 의해 지능적으로 평가될 수 있긴 하지만, 이들 여러 파라미터의 평가 및 프라이머 서열의 최적화를 보조하는 컴퓨터 프로그램이 설계되었다. 이들 프로그램의 실례는 DNAStarTM 소프트웨어 패키지의 "PrimerSelect"(DNAStar, Inc.; Madison, WI) 및 OLIGO 4.0(National Biosciences, Inc.)이다. 일단 설계된 적당한 올리고뉴클레오티드는 적절한 방법, 예를 들면, Beaucage and Carruthers, 1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859에 기술된 포스포라미디트(phosphoramidite) 방법, 또는 Matteucci and Caruthers, 1981, J. Am. Chem. Soc. 103: 3185에 따른 트리에스테르(triester) 방법, 또는 자동화된 상업적 올리고뉴클레오티드 합성장치 또는 예로써 VLSIPSTM 기술을 이용하는 다른 화학적 방법에 의해 생성된다.
PCR은 주형 DNA(적어도 1fg; 더욱 유용하게는, 1-1000 ng) 및 적어도 25 pmol의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 수행된다; 각 서열이 프라이머 풀의 분자 중에서 극히 일부이고 양이 후기 증폭 사이클에서 제한되기 때문에, 프라이머 풀이 현저하게 이질적인 경우에는 더욱 많은 양의 프라이머를 사용하는 것이 유리하다. 전형적인 반응 혼합물은 2 ㎕의 DNA, 25 pmol의 올리고뉴클레오티드 프라이머, 2.5 ㎕의 10X PCR 완충액 1(Perkin-Elmer), 0.4 ㎕의 1.25 μM dNTP, 0.15 ㎕(또는 2.5 단위)의 Taq DNA 중합효소(Perkin Elmer), 전체 25 ㎕까지 탈이온수(deionized water)를 함유한다. 미네랄 기름이 위에 깔려지고, PCR은 프로그램가능 서열 증폭기(programmable thermal cycler)에 의해 수행된다.
PCR 사이클의 각 단계의 길이와 온도 및 사이클의 횟수는 실효중인 엄밀도 요건에 따라 조정된다. 어닐링(annealing) 온도와 시간은 프라이머가 주형에 어닐링할 것으로 예상되는 효율 및 관용되는 부정합의 정도에 의해 결정된다; 명백하게, 핵산 분자가 동시에 증폭되고 돌연변이되는 경우에, 적어도 1차 라운드의 합성에서 부정합이 요구된다. 돌연변이유발 프라이머의 혼합 풀을 이용하여 분자 집단을 증폭하는 시도에서, 엄밀도(높은 온도) 어닐링 조건하에, 낮은 융점에서만 생성되는 잠재적 변이 산물의 손실은 표적 부위 이외의 서열에 대한 프라이머의 무차별한 어닐링에 비교 고량된다. 프라이머 어닐링 조건의 엄밀도를 최적화하는 능력은 당업자의 능력 범위에 속한다. 30℃ 내지 72℃ 사이의 어닐링 온도가 이용된다. 주형 분자의 최초 변성은 통상적으로, 92℃ 내지 99℃에서 4분, 이후 변성(94-99℃에서 15초 내지 1분), 어닐링(앞서 기술된 바와 같이 결정된 온도; 1-2분), 신장(증폭되는 산물의 길이에 따라, 72℃에서 1-5분)의 20 내지 40회 사이클로 수행된다. 최종 신장은 일반적으로, 72℃에서 4분, 이후 4℃에서 부정(不定)(0-24시간) 단계로 수행된다.
항원 결합을 위한 dAb 스크리닝:
파지 표면에서 dAb의 레퍼토리의 발현이후, 선별은 파지 레퍼토리를 고정된 표적 항원과 접촉시키고, 세척하여 결합하지 않은 파지를 제거하고, 결합된 파지를 증폭함으로써 수행되는데, 이런 전체 과정은 “팬닝(panning)”이라고 한다. 대안으로, 파지는 접힘된 구성원에 의해서만 결합되는 고정된 총괄적 리간드(가령, 단백질 A 또는 단백질 L)를 팬닝함으로써 적절하게 접힘된 구성원 변이체의 발현에 대해 미리-선별된다. 이는 비-기능성 구성원의 비율을 감소시켜 표적 항원에 결합할 가능성이 높은 구성원의 비율을 증가시키는 이점이 있다. 총괄적 리간드로 미리-선별은 WO 99/20749에 교시된다. 파지 항체 라이브러리의 스크리닝은 예로써, Harrison et al., 1996, Moth. Enzymol. 267: 83-109에서 전반적으로 기술된다.
스크리닝은 통상적으로, 고체 서프트, 예를 들면, 플라스틱 튜브 또는 웰, 또는 크로마토그래피 매트릭스, 예를 들면, SepharoseTM(Pharmacia) 상에 고정되는 정제된 항원을 이용하여 수행된다. 스크리닝 또는 선별은 복합 항원, 예를 들면, 세포 표면에서 수행될 수도 있다(Marks et al., 1993, BioTechnology 11: 1145; de Kruif et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92: 3938). 다른 대안은 용액에서 비오틴화된 항원 결합, 이후 스트렙타비딘-코팅된 비드 상에서 포획에 의한 선별을 수반한다.
바람직한 측면에서, 팬닝은 평판, 예를 들면, Nunc MAXISORPTM 면역튜브 8 웰 스트립 내에 튜브 또는 웰 상에 항원(총괄적 또는 특이적)을 고정시킴으로써 수행된다. 웰은 150 ㎕의 항원(PBS에서 100 ㎍/㎖)으로 코팅하고 하룻밤동안 배양한다. 이들 웰은 이후, PBS로 3회 세척하고 37℃에서 2시간동안 400 ㎕ PBS-2% 탈지유(skim milk)(2%MPBS)로 차단한다. 이들 웰은 PBS로 3회 세척하고 파지를 2%MPBS에 첨가한다. 혼합물은 실온에서 90분간 배양하고, 결합하지 않은 파지를 포함하는 액체는 제거한다. 웰은 PBS-0.1% Tween 20으로 10회 및 PBS로 10회 씻어내어 세정제를 제거한다. 결합된 파지는 200 ㎕의 새로 제조된 100 mM 트리에틸아민을 첨가하고, 충분히 혼합하고, 실온에서 10분간 배양함으로써 용리한다. 용리된 파지는 100 ㎕의 1M Tris-HCl, pH 7.4를 포함하는 튜브로 이전하고 와동시켜 트리에틸아민을 중화시킨다. 기하급수적으로 성장하는 대장균 숙주 세포(가령, TG1)는 37℃에서 30분간 배양함으로써 150 ㎖의 용리된 파지로 감염시킨다. 감염된 세포는 스핀다운(spin down)시키고, 새로운 배지에서 재부유시키고, 상위 아가로즈에 도말한다. 파지 플라크는 숙주 세포의 새로운 배양액 내로 용리하거나 채집하여 분석 또는 추가 라운드의 선별을 위하여 증식한다. 필요한 경우에 1회 이상의 플라크 정제를 수행하여 선별된 파지의 순수 집단을 확보한다. 다른 스크리닝 접근법은 Harrison et al., 1996, supra에서 기술된다.
pHEN1과 같은 파지미드 벡터가 이용되는 경우에, 원하는 표적에 결합하는 단일 면역글로불린 가변 도메인을 발현하는 파지의 확인이후, 가변 도메인 융합 단백질은 박테리아의 비-억제자 균주, 예를 들면, 용해성 유전자 III 융합 단백질의 분비가 가능한 HB2151를 감염시킴으로써 용해성 형태로 용이하게 생산된다. 대안으로, 당분야에 공지된 방법에 따라 용해성 단백질을 생산하기 위하여 V 도메인 서열이 적절한 발현 벡터 내로 서브-클론될 수 있다.
dAb의 정제와 농축:
주변세포질 공간 또는 박테리아의 배지로 분비된 dAb 폴리펩티드는 공지된 방법에 따라 수확되고 정제된다(Harrison et al., 1996, supra). Skerra & Pluckthun 1988, Science 240: 1038 및 Breitling et al., 1991, Gene 104: 147)에서는 주변세포질로부터 항체 폴리펩티드의 수확을 기술하고, Better et al., 1988, Science 240: 1041에서는 배양 상층액으로부터 수확을 기술한다. 정제 역시 총괄적 리간드, 예를 들면, 단백질 A 또는 단백질 L에 대한 결합으로 달성될 수 있다. 대안으로, 이들 가변 도메인은 친화력 크로마토그래피에 의한 정제를 조장하는 펩티드 태그, 예를 들면, Myc, HA 또는 6X-His 태그와 함께 발현될 수 있다.
폴리펩티드는 예로써, 한외여과(ultrafiltration), 정용여과(diafiltration), 접선 흐름 여과(tangential flow filtration)를 비롯한 당분야에 널리 공지된 여러 방법으로 농축된다. 한외여과 과정은 반-투과성 막과 압력을 이용하여 크기와 형상의 기초에서 분자 종류를 분리한다. 압력은 가스압 또는 원심분리에 의해 제공된다. 상업적 한외여과 산물은 예로써 Millipore(Bedford, MA; CentriconTM과 MicroconTM 농축기) 및 Vivascience(Hannover, Germany; VivaspinTM 농축기)로부터 구입가능하다. 표적보다 작은 분자량 컷오프(molecular weight cutoff)(통상적으로, 표적 폴리펩티드의 분자량의 1/3 내지 1/6, 하지만 10 kD 정도의 차이가 성공적으로 이용될 수 있다)의 선별에 의해, 상기 폴리펩티드는 용매와 더욱 작은 용질이 막을 통과할 때 여전히 유지된다. 따라서, 대략 5 kD의 분자량 컷오프가 본 명세서에 기술된 dAb 폴리펩티드의 농축에 유용하다.
“세척” 과정과 함께 한외여과 막을 이용하는 정용여과는 폴리펩티드 제조물에서 염이나 완충액을 제거 또는 교환하려는 경우에 이용된다. 폴리펩티드는 막을 통한 용매와 작은 용질의 통과에 의해 농축되고, 남아있는 염이나 완충액은 새로운 완충액이나 염 용액이나 물을 이용한 유지된 폴리펩티드의 희석으로 제거되고, 원하는 경우에 연속 한외여과가 동반된다. 연속 정용여과에서, 여과액이 막을 통과하는 동일한 속도로 새로운 완충액이 첨가된다. 정용여과 부피는 정용여과의 시작에 앞서 폴리펩티드 용액의 부피이다 - 연속 정용여과를 이용하여, 완전 투과성 용질의 99.5% 이상이 새로운 완충액으로 6 정용여과 부피를 통한 세척으로 제거될 수 있다. 대안으로, 상기 과정은 불연속 방식으로 수행될 수 있는데, 여기서 샘플은 반복적으로 희석되고, 이후 최초 부피로 역여과되어 염이나 완충액이 제거 또는 교환되고, 궁극적으로 폴리펩티드가 농축된다. 정용여과 장치 및 이의 상세한 이용 방법은 예로써, Pall Life Sciences(Ann Arbor, MI) 및 Sartorius AG/Vivascience(Hannover, Germany)로부터 입수가능하다.
접선 흐름 여과(TFF)(또는, “교차 흐름 여과(cross-flow filtration)”) 역시 한외여과 막을 이용한다. 표적 폴리펩티드를 포함하는 유체는 막을 표면을 따라 접선으로 주입된다. 압력은 유체의 일부가 막을 통과하도록 유도하지만, 표적 폴리펩티드 상기 필터 위에 유지된다. 하지만, 표준 한외여과와 대조적으로, 유지된 분자가 막의 표면에 축적되지 않고 접선 흐름에 실려 이동된다. 필터를 통과하지 않는 용액(표적 폴리펩티드 포함)은 원하는 수준의 농도를 달성하기 위하여 막을 가로질러 반복적으로 순환될 수 있다. TFF 장치 및 이의 상세한 이용 방법은 예로써, Millipore(가령, ProFlux M12TM Benchtop TFF 시스템과 PelliconTM 시스템), Pall Life Sciences(가령, Minim_ Tangential Flow Filtration system)로부터 입수가능하다.
단백질 농도는 당분야에 널리 공지된 다양한 방법으로 측정된다. 여기에는 예로써, 아미노산 분석, 280 nm에서 흡광도, “브래포드(Bradford)”와 “로우리(Lowry)” 방법, SDS-PAGE 등이 포함된다. 가장 정확한 방법은 전체 가수분해, HPLC에 의한 아미노산 분석, 이후 dAb 폴리펩티드의 공지된 서열과의 비교를 통한 농도 결정이다. 상기 방법이 가장 정확하긴 하지만, 비용과 시간이 많이 소요된다. 280 nm에서 UV 흡광도의 측정에 의한 단백질 결정은 더욱 신속하고 훨씬 저렴하면서도 상대적으로 정확하기 때문에, 아미노산 분석에 비하여 절충안으로서 선호된다.
280 nm에서 흡광도는 본 명세서에 기술된 실시예에서 보고된 단백질 농도를 결정하는데 이용되었다.
“브래포드(Bradford)”와 “로우리(Lowry)” 단백질 검사(Bradford, 1976, Anal. Biochem. 72: 248-254; Lowry et al.,l951, J. Biol. Chem. 193: 265-275)는 소 혈청 알부민(BSA)에 거의 기초한 표준 곡선과 샘플 단백질 농도를 비교한다. 이들 방법은 정확성이 떨어지고, 단일 면역글로불린 가변 도메인의 농도를 실제보다 낮게 평가하는 경향이 있다. 하지만, VH 또는 Vκ 단일 도메인 폴리펩티드를 표준(standard)으로 이용함으로써 이들의 정확도가 개선될 수 있다.
다른 단백질 검사 방법은 U.S. 특허 제 4,839,295호에 기술되고, Pierce Biotechnology(Rockford, IL)에 의해 “BCA 단백질 검사”(가령, Pierce Catalog No. 23227)로서 시판되고 있는 BCA(bicinchoninic acid) 검사이다.
SDS-PAGE 방법은 공지된 농도 표준, 예를 들면, 공지된 양의 단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드와의 비교에서, 겔 전기영동과 쿠마시 블루 염색(Coomassie blue staining)을 이용한다. 정량은 나안으로 또는 농도계(densitometry)에 의해 수행될 수 있다.
세 번째 측면에서, 본 발명은 첫 번째 결합 특이성을 갖는 첫 번째 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 두 번째(상이한) 결합 특이성을 갖는 두 번째 단일 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 리간드를 제조하는 방법을 제시하는데, 상기 결합 특이성 중에서 하나 또는 둘 모두 생체내에서 리간드의 반감기를 증가시키는 항원에 특이적이고, 상기 방법은 (a) 첫 번째 에피토프에 대한 결합 능력으로 첫 번째 가변 도메인을 선별하는 단계; (b) 두 번째 에피토프에 대한 결합 능력으로 두 번째 가변 영역을 선별하는 단계; (c) 가변 도메인을 통합하는 단계; (d) 상기 첫 번째 에피토프 및 두 번째 에피토프에 대한 결합 능력으로 리간드를 선별하는 단계를 포함한다.
상기 리간드는 첫 번째와 두 번째 에피토프에 동시에 결합할 수 있거나, 또는 에피토프 결합에 대한 결합 도메인 사이의 경쟁이 존재하는 경우에, 한 도메인의 결합이 동족 에피토프에 대한 다른 도메인의 결합을 방해한다. 따라서, 한 구체예에서, 단계 (d)는 첫 번째와 두 번째(및 가능한 추가의) 에피토프에 대한 동시 결합을 필요로 한다; 다른 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 에피토프에 대한 결합은 동시에 발생하지 않는다.
이들 에피토프는 가급적, 별개의 항원 상에 있다.
리간드는 유리하게는, 앞서 기술된 바와 같이 면역글로불린 가변 도메인의 VH/VL 조합, 또는 VH/VH 또는 VL/VL 조합을 포함한다. 게다가, Conrath et al., 2001) JBC 276:7346-7350 및 WO99/23221에 기술된 바와 같이, 생체내에서 리간드 반감기를 증가시키는 항원에 특이적인 VHH 도메인이 암탉 난백 리소자임(HEL), 돼지 췌장 알파-아밀라아제 또는 NmC-A; hog, BSA-연결된 RR6 ado 5 염료 또는 뮤탄스 균(S. mutans) HG982 세포와 결합하지 않는다면, 리간드는 카멜리드(camelid) VHH 도메인을 포함하는데, 이들 문헌에서는 생체내에서 리간드 반감기를 증가시키는 항원에 대한 특이성의 효용을 기술하지 않는다.
한 구체예에서, 상기 첫 번째 가변 도메인은 상보적 가변 도메인의 부재에서 상기 첫 번째 에피토프로의 결합에 대해 선별된다(즉, 이는 앞서 기술된 바와 같이 dAb로서 선별된다). 다른 구체예에서, 상기 첫 번째 가변 도메인은 세 번째 가변 도메인이 두 번째 가변 도메인과 상이하고 첫 번째 도메인에 상보적인 경우에, 세 번째 가변 도메인의 존재에서 상기 첫 번째 에피토프/항원으로의 결합에 대해 선별된다. 유사하게는, 두 번째 도메인은 상보적인 가변 도메인의 존재 또는 부재에서, 선별된다.
반감기 증가 단백질 이외에, 본 발명의 리간드에 의해 표적되는 항원이나 에피토프는 임의의 항원이나 에피토프일 수 있지만, 유리하게는 치료적 가치로 표적된 항원이나 에피토프이다. 본 발명은 이와 같은 표적, 특히 본 발명에서 더욱 확인된 표적에 특이적인 열린 형태, 닫힌 형태, 분리된 dAb 단량체 리간드를 비롯한 리간드를 제시한다. 이들 표적은 자연 발생하거나 합성된 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산, 또는 이들의 일부이다. 이러한 관점에서, 본 발명의 리간드는 에피토프 또는 항원에 결합하고 길항제(antagonist) 또는 작용제(agonist)(가령, EPO 수용체 작용제)로서 기능한다. 당업자는 선택이 넓고 다양함을 인식할 것이다.
이들은 예로써, 인간이나 동물 단백질, 사이토킨, 사이토킨 수용체, 효소에 대한 효소 보조-인자 또는 DNA 결합 단백질일 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같이 단일- 또는 이중-특이적 결합 폴리펩티드에 의해 표적될 수 있는 적절한 사이토킨과 성장 인자에는 ApoE, Apo-SAA, BDNF, 카디오트로핀-1, EGF, EGF 수용체, ENA-78, 에오탁신, 에오탁신-2, 엑소더스-2, EpoR, FGF-산성, FGF-염기성, 섬유아세포 성장 인자-10, FLT3 리간드, 프랙탈카인(CX3C), GDNF, G-CSF, GM-CSF, GF-β1, 인슐린, IFN-γ, IGF-I, IGF-II, IL-1α, IL-β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8(72 a.a.), IL-8(77 a.a.), IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18(IGIF), 인히빈 α, 인히빈 β, IP-10, 각화세포 성장 인자-2(KGF-2), KGF, 렙틴, LIF, 림포탁틴, 뮬레리안 저해 물질, 단핵구 콜로니 저해 인자, 단핵구 유인 단백질, M-CSF, MDC(67 a.a.), MDC(69 a.a.), MCP-1(MCAF), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MIG, MIP-1α, MIP-1β, MIP-3α, MIP-3β, MIP-4, 골수 전구체 저해 인자-1(MPIF-1), NAP-2, Neurturin, 신경 성장 인자, β-NGF, NT-3, NT-4, 온코스탄틴 M, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4, RANTES, SDF1α, SDF1β, SCF, SCGF, 줄기 세포 인자(SCF), TARC, TGF-α, TGF-β, TGF-β2, TGF-β3, 종양 괴사 인자(TNF), TNF-α, TNF-β, TNF 수용체 I, TNF 수용체 II, TLIL-1, TPO, VEGF, VEGF 수용체 1, VEGF 수용체 2, VEGF 수용체 3, GCP-2, GRO/MGSA, GRO-β, GRO-γ, HCC1, 1-309, HER 1, HER 2, HER 3, HER 4, TACE 인식부위, TNF BP-I, TNF BP-II 및 부록 2와 3에 기술된 임의의 표적(이들 부록에서 언급된 바와 같은 조합으로, 상이한 조합으로, 또는 개별적으로)를 포함되지만 이들에 한정되지 않는다.
특히, 선호되는 리간드는 단독으로, 조합으로 및/또는 항-HSA 결합 활성을 갖는 TNF-α와 VEGF이다.
사이토킨 수용체는 전술된 사이토킨에 대한 수용체를 포함한다. 상기 목록은 결코 한정적으로 의도되지 않는다.
본 발명의 한 구체예에서, 가변 도메인은 항원이나 에피토프를 지향하는 개별 항체로부터 유래된다. 바람직한 구체예에서, 가변 도메인은 단일 가변 항체 도메인의 레퍼토리로부터 유래된다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 이중특이적인 리간드를 인코딩하는 하나이상의 핵산 분자를 제시한다.
이중특이적 리간드는 단일 핵산 분자 상에서 인코딩된다; 대안으로, 각 도메인은 개별 핵산 분자에 의해 인코딩된다. 리간드가 단일 핵산 분자에 의해 인코딩되는 경우에, 도메인은 scFv 분자의 방식으로 융합 폴리펩티드로서 발현되거나, 또는 개별적으로 발현되고, 이후 예로써 화학 결합제를 이용하여 서로 연결된다. 개별 핵산으로부터 발현된 리간드는 적절한 방법에 의해 서로 연결된다.
핵산은 발현이후 숙주 세포로부터의 폴리펩티드 유출을 위한 신호 서열을 추가로 인코딩하고, 발현이후 섬유상 박테리오파지 입자의 표면 성분(또는 선별 전시 시스템의 다른 성분)과 융합된다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 이중특이적 리간드를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제시한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 이중특이적 리간드를 인코딩하는 벡터로 형질감염된 숙주 세포를 제시한다.
이러한 벡터로부터의 발현은 예로써, 박테리오파지 입자의 표면 상에서 선별을 위한 가변 도메인을 생성하도록 형성된다. 이는 전시된 가변 영역의 선별을 가능하게 하고, 따라서 본 발명의 방법을 이용한 '이중특이적 리간드'의 선별을 가능하게 한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 적어도 하나의 이중특이적 리간드를 포함하는 키트를 제공한다.
적절하게는, 본 발명에 따른 이중특이적 리간드는 중쇄와 경쇄 도메인의 조합을 포함한다. 가령, 이중특이적 리간드는 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는데, 이들 도메인은 scFv의 형태로 서로 연결된다. 게다가, 리간드는 하나 이상의 CH 또는 CL 도메인을 포함한다. 가령, 리간드는 CH1 도메인 C H2 또는 CH3 도메인 및/또는 CL 도메인, Cμ1, Cμ2, Cμ3 또는 Cμ 4 도메인, 또는 이들의 조합을 포함한다. 힌지 영역 도메인 역시 포함될 수 있다. 이러한 도메인 조합은 예로써, IgG 또는 IgM과 같은 자연 항체, 또는 Fv, scFv, Fab 또는 F(ab')2 분자와 같은 이의 단편을 모의한다. VH, VL, CH1, CL 도메인을 포함하는IgG 분자의 단일 팔(arm)과 같은 다른 구조가 고려된다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 가변 영역은 단일 도메인 V 유전자 레퍼토리로부터 선별된다. 일반적으로, 단일 항체 도메인의 레퍼토리는 섬유상 박테리오파지의 표면 상에 전시된다. 바람직한 구체예에서, 각 단일 항체 도메인은 항원에 대한 파지 레퍼토리의 결합에 의해 선별된다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 각각의 단일 가변 도메인은 상보적 가변 영역의 부재에서 표적 항원이나 에피토프로의 결합에 대해 선별된다. 대안적 구체예에서, 단일 가변 도메인은 상보적 가변 영역의 존재에서 표적 항원이나 에피토프로의 결합에 대해 선별된다. 따라서, 첫 번째 단일 가변 도메인은 세 번째 상보적 가변 도메인의 존재에서 선별되고, 두 번째 가변 도메인은 네 번째 상보적 가변 도메인의 존재에서 선별된다. 상보적인 세 번째 또는 네 번째 가변 도메인은 검사되는 단일 도메인과 동일한 특이성을 갖는 자연적인 동족 가변 도메인이거나, 또는 “견본(dummy)” 가변 도메인과 같은 비-동족 상보성 도메인이다.
적절하게는, 본 발명의 이중특이적 리간드는 이와 같은 여러 리간드가 동일한 단백질 내로 함께 통합될 수 있긴 하지만 단지 2개의 가변 도메인만을 포함한다, 예를 들면, 이들 2개의 리간드는 IgG 또는 IgM과 같은 다량체 면역글로불린 내로 통합될 수 있다. 대안으로, 다른 구체예에서, 복수의 이중특이적 리간드가 통합되어 다량체를 형성한다. 가령, 2개의 상이한 이중특이적 리간드가 통합되어 사중-특이적 분자를 생성한다.
본 발명의 방법에 따라 생성된 이중특이적 리간드 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 동일한 폴리펩티드 사슬 상에 존재하거나, 또는 대안으로 상이한 폴리펩티드 사슬 상에 존재할 수 있음은 당업자에 의해 인식될 것이다. 가변 영역이 상이한 폴리펩티드 사슬 상에 존재하는 경우에, 이들은 링커(linker), 일반적으로 유연성 링커(가령, 폴리펩티드 사슬), 화학적 결합기 또는 당분야에 공지된 다른 방법에 의해 연결된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 수득되는 이중특이적 리간드 및 제약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 함유하는 조성물을 제시한다.
게다가, 본 발명은 본 발명에 따른 '이중특이적 리간드' 또는 조성물을 이용한 질병의 치료 및/또는 예방 방법을 제시한다.
두 번째 배치에서, 본 발명은 적어도 2개의 비-상보성 가변 도메인을 포함하는 다중특이적 리간드를 제시한다. 가령, 리간드는 한 쌍의 VH 도메인 또는 한 쌍의 VL 도메인을 포함한다. 유리하게는, 도메인은 비-카멜리드 기원이다; 바람직하게는, 이들은 인간 도메인이거나, 또는 인간 프레임워크 영역(FW) 및 하나이상의 이형성 CDR을 포함한다. CDR 및 프레임워크 영역은 Kabat database of Sequence of Proteins of Immunological Interest에서 정의된 면역글로불린 가변 도메인의 영역이다.
선호되는 인간 프레임워크 영역은 생식세포계 유전자 분절 DP47과 DPK9에 의해 인코딩되는 영역이다. 유리하게는, VH 또는 VL 도메인의 FW1, FW2, FW3은 DP47 또는 DPK9로부터의 FW1, FW2 또는 FW3의 서열을 갖는다. 이들 인간 프레임워크는 선택적으로, 본 발명의 리간드에 이용된 인간 프레임워크 내에서 돌연변이, 예를 들면, 최대 5개의 아미노산 또는 최대 10개의 아미노산 변화를 포함한다.
본 발명의 두 번째 배치에 따른 다중특이적 리간드에서 가변 도메인은 열린 또는 닫힌 형태로 배열된다; 다시 말하면, 이들은 가변 도메인이 독립적으로 및 동시에 동족 리간드에 결합할 수 있도록 배열되거나, 또는 가변 도메인 중에서 한 번에 하나만 동족 리간드에 결합하도록 배열된다.
본 발명자들은 특정한 구조적 조건 하에서, 비-상보성 도메인이 동족 쌍으로서 함께 작용하지 않더라도 첫 번째 가변 도메인에 대한 첫 번째 에피토프의 결합이 두 번째 가변 도메인에 대한 두 번째 에피토프의 결합을 저해하도록 비-상보성 가변 도메인(가령, 2개의 경쇄 가변 도메인 또는 2개의 중쇄 가변 도메인)이 리간드 내에 존재한다는 것을 인식하였다.
유리하게는, 리간드는 2쌍 이상의 가변 도메인을 포함한다; 다시 말하면, 적어도 4개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 유리하게는, 4개의 가변 도메인은 인간 기원의 프레임워크를 포함한다.
바람직한 구체예에서, 인간 프레임워크는 인간 생식세포계 서열의 프레임워크와 동일하다.
본 발명자들은 이들 항체가 치료 및 다른 용도에 대한 리간드 결합 검사에서 특히 유용할 것으로 생각한다.
따라서, 두 번째 배치의 첫 번째 측면에서, 본 발명은 a) 첫 번째 에피토프에 대한 결합 능력으로 첫 번째 에피토프 결합 도메인을 선별하는 단계; b) 두 번째 에피토프에 대한 결합 능력으로 두 번째 에피토프 결합 도메인을 선별하는 단계; c) 에피토프 결합 도메인을 통합하는 단계; d) 상기 첫 번째 에피토프 및 상기 두 번째 에피토프에 대한 결합 능력으로 닫힌 형태 다중특이적 리간드를 선별하는 단계를 포함하는, 다중특이적 리간드를 생성하는 방법을 제시한다.
두 번째 배치의 다른 관점에서, 본 발명은 첫 번째 에피토프 결합 특이성을 갖는 첫 번째 에피토프 결합 도메인 및 두 번째 에피토프 결합 특이성을 갖는 비-상보성 두 번째 에피토프 결합 도메인을 포함하는 닫힌 형태 다중특이적 리간드를 생성하는 방법을 제시하는데, 상기 첫 번째와 두 번째 결합 특이성은 닫힌 형태 다중특이적 리간드가 양쪽 에피토프에 동시에 결합하지 않도록 에피토프 결합에 대해 경쟁하고, 상기 방법은 a) 첫 번째 에피토프에 대한 결합 능력으로 첫 번째 에피토프 결합 도메인을 선별하는 단계; b) 두 번째 에피토프에 대한 결합 능력으로 두 번째 에피토프 결합 도메인을 선별하는 단계; c) 도메인이 닫힌 형태가 되도록 에피토프 결합 도메인을 통합하는 단계; d) 상기 첫 번째 에피토프 및 상기 두 번째 에피토프에 결합하지만 상기 첫 번째와 두 번째 에피토프 둘 모두에 동시에 결합하지 않는 능력으로 닫힌 형태 다중특이적 리간드를 선별하는 단계를 포함한다.
게다가, 본 발명은 첫 번째 에피토프 결합 특이성을 갖는 첫 번째 에피토프 결합 도메인 및 두 번째 에피토프 결합 특이성을 갖는 비-상보성 두 번째 에피토프 결합 도메인을 포함하는 닫힌 형태 다중특이적 리간드를 제시하는데, 상기 첫 번째와 두 번째 결합 특이성은 닫힌 형태 다중특이적 리간드가 양쪽 에피토프에 동시에 결합하지 않도록 에피토프 결합에 대해 경쟁한다.
본 발명의 두 번째 배치의 상기 측면의 대안적 구체예는 선택적으로, 세 번째 또는 추가의 에피토프 결합 도메인을 선별하는 추가 단계 (b1)를 포함한다. 이러한 방법에서, 열린 또는 닫힌 형태인 지에 상관없이, 생성된 다중특이적 리간드는 2개 이상의 에피토프 결합 특이성을 포함한다. 본 발명의 두 번째 배치의 바람직한 측면에서, 다중특이적 리간드가 2 이상의 에피토프 결합 도메인을 포함하는 경우에, 적어도 2개의 상기 도메인이 닫힌 형태이고 결합에 대해 경쟁한다; 다른 도메인이 결합에 대해 경쟁하거나 그들의 동족 에피토프와 독립적으로 자유롭게 결합할 수도 있다.
본 발명에 따라, '다중특이적 리간드'는 본 명세서에 정의된 바와 같이 하나이상의 에피토프 결합 특이성을 보유한 리간드를 의미한다.
본 명세서에서 정의된 바와 같이, '닫힌 형태'(다중특이적 리간드)는 한 에피토프 결합 도메인에 의한 에피토프 결합이 다른 에피토프 결합 도메인에 의한 에피토프 결합과 경쟁하도록 리간드의 에피토프 결합 도메인이 선택적으로, 단백질 골격에 의해 서로 부착되거나 결합된다는 것을 의미한다. 다시 말하면, 동족 에피토프는 각각의 에피토프 결합 도메인에 의해 개별적으로 결합되지만 동시에 결합되지는 않는다. 리간드의 닫힌 형태는 본 명세서에 기술된 방법에 의해 달성될 수 있다.
“열린 형태”는 한 에피토프 결합 도메인에 의한 에피토프 결합이 다른 에피토프 결합 도메인에 의한 에피토프 결합과 경쟁하지 않도록 리간드의 에피토프 결합 도메인이 선택적으로, 단백질 골격에 의해 서로 부착되거나 결합된다는 것을 의미한다.
본 명세서에서, '경쟁'은 두 번째 에피토프가 그의 동족 에피토프 결합 도메인에 결합될 때 첫 번째 에피토프의 그의 동족 에피토프 결합 도메인으로의 결합이 저해된다는 것을 의미한다. 가령, 결합은 예로써, 에피토프에 대한 친화력 또는 화합력이 감소되도록 하는 결합 도메인의 물리적 차단, 또는 결합 도메인의 구조 또는 환경의 변화에 의해 입체적으로 저해된다.
본 발명의 두 번째 배치의 또 다른 구체예에서, 에피토프는 결합시에 서로를 배제한다. 가령, 첫 번째 에피토프는 그의 동족 첫 번째 결합 도메인에 대한 결합시에, 두 번째 결합 도메인의 입체 방해 또는 형태적 변화를 유발하여 두 번째 결합 도메인에 결합된 에피토프가 배제되도록 항원 상에 제공된다.
유리하게는, 결합은 25% 이상, 바람직하게는 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상 및 더욱 바람직하게는 최대 100%까지 감소되어 결합이 완전하게 저해된다. 에피토프의 결합은 ELISA와 같은 통상의 항원 결합 검사, FRET를 비롯한 형광 기초된 기술, 또는 분자량을 측정하는 표면 플라스몬 공명과 같은 기술에 의해 측정될 수 있다.
유리하게는, 본 발명의 방법에 따라, 각 에피토프 결합 도메인은 상이한 에피토프 결합 특이성을 갖는다.
본 발명의 배경에서, 첫 번째와 두 번째 “에피토프”는 동일하지 않고 단일 단일특이적 리간드에 의해 결합되지 않는 에피토프로 이해된다. 이들은 상이한 항원 상에 또는 동일한 항원 상에 존재하지만, 통상적인 항체의 단독 단일-특이적 VH/VL 결합 쌍에 의해 결합될 수 있는 단일 실체를 형성하지 않을 만큼 충분한 거리로 분리된다. 실험적으로, 단일 사슬 항체 형태(도메인 항체 또는 dAb)에서 개별 가변 도메인 둘 모두가 2개의 에피토프에 대해 단일특이적 VH/VL 리간드에 의해 개별적으로 경쟁되면, 이들 2개의 에피토프는 본 발명에 따른 독립된 에피토프로 간주될 만큼 멀리 떨어지지 않는다.
본 발명의 닫힌 형태 다중특이적 리간드는 WO 02/02773에 기술된 바와 같은 리간드를 포함하지 않는다. 따라서, 본 발명의 리간드는 임의의 하나이상의 항원이나 에피토프에 동시-작업으로 결합하는 상보적 VH/VL 쌍을 포함하지 않는다. 대신에, 본 발명에 따른 리간드는 가급적, 비-상보성 VH 또는 VL 쌍을 포함한다. 유리하게는, 각 VH 또는 VL 쌍에서 각각의 VH 또는 VL 도메인은 상이한 에피토프 결합 특이성을 갖고, 에피토프 결합 부위는 한 부위에서 에피토프 결합이 다른 부위에서 에피토프 결합과 경쟁하도록 배열된다.
본 발명에 따라, 유리하게는, 각 에피토프 결합 도메인은 면역글로불린 가변 도메인을 포함한다. 더욱 유리하게는, 각 면역글로불린 가변 도메인은 가변 경쇄 도메인(VL) 또는 가변 중쇄 도메인(VH)일 것이다. 본 발명의 두 번째 배치에서, 면역글로불린 도메인은 본 발명에 따른 리간드 상에 존재할 때 비-상보성이다, 다시 말하면, 이들 도메인은 VH/VL 항원 결합 부위를 형성하도록 결합하지 않는다. 따라서, 본 발명의 두 번째 배치에서 다중특이적 리간드는 동일한 아형의 면역글로불린 도메인, 다시 말하면, 가변 경쇄 도메인(VL) 또는 가변 중쇄 도메인(VH)을 포함한다. 게다가, 본 발명에 따른 리간드가 닫힌 형태인 경우에, 면역글로불린 도메인은 카멜리드 VHH 타입이다.
대안적 구체예에서, 본 발명에 따른 리간드는 카멜리드 VHH 도메인을 포함하지 않는다. 더욱 구체적으로, 본 발명의 리간드는 인간 VH 도메인과 비교하여 카멜리드 VHH 도메인에 특이적인 하나이상의 아미노산 잔기를 포함하지 않는다.
유리하게는, 단일 가변 도메인은 상이한 항원이나 에피토프로의 결합 능력에 대해 선별된 항체로부터 유래된다. 가령, 가변 도메인은 인간 면역화(human immunisation)에 의해 적어도 부분적으로 분리된다. 인간 항체 라이브러리로부터 분리 및 인공 항체 유전자의 합성을 비롯한 대안적 방법이 당분야에 공지되어 있다.
가변 도메인은 유리하게는, 단백질 A 또는 단백질 L과 같은 초항원(superantigen)에 결합한다. 초항원에 대한 결합은 정확하게 접힘된 항체 가변 도메인의 특성이며, 이들 도메인이 예로써, 재조합이나 돌연변이 도메인의 라이브러리로부터 분리될 수 있도록 한다. 본 발명에 따른 에피토프 결합 도메인은 단백질 뼈대 및 에피토프 상호작용 부위(이들은 유리하게는, 단백질 뼈대의 표면 상에 위치한다)를 포함한다. 또한, 에피토프 결합 도메인은 면역글로불린 도메인 이외의 단백질 뼈대 또는 골격 상에 기초한다. 가령, SpA와 같은 자연 박테리아 수용체가 하나이상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 리간드를 생성하는 CDR의 이식을 위한 뼈대로서 사용되었다. 이러한 절차의 상세한 설명은 미국 특허 제5,831,012호에서 기술된다. 다른 적합한 뼈대는 피브로넥틴(fibronectin) 및 어피바디(affibody)에 기초한 뼈대이다. 적합한 절차의 상세한 설명은 WO 98/58965에서 기술된다. 다른 적합한 뼈대는 van den Beuken et al., J Mol. Biol. (2001) 310:591-601에 기술된 리포칼린(lipocallin)과 CTLA4 및 예로써 박테리아 GroEL 또는 다른 샤페론(chaperone) 폴리펩티드의 고리 구조에 기초하고 WO0069907(Medical Research Council)에 기술된 뼈대이다. 단백질 뼈대는 통합된다, 예를 들면, CDR은 CTLA4 뼈대 상에 이식되고 면역글로불린 VH 또는 VL 도메인과 함께 사용되어 다가 리간드를 형성한다. 이와 유사하게, 피브로넥틴, 리포칼린 및 다른 뼈대가 통합될 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 생성된 닫힌 형태 다중특이적 리간드의 에피토프 결합 도메인이 동일한 폴리펩티드 사슬 상에 존재하거나, 또는 대안으로, 다른 폴리펩티드 상에 존재할 수 있음은 당업자에 의해 인식될 것이다. 가변 영역이 상이한 폴리펩티드 사슬 상에 존재하는 경우에, 이들은 링커, 유리하게는 유연성 링커(가령, 폴리펩티드 사슬), 화학적 결합기, 또는 당분야에 공지된 다른 방법에 의해 연결된다.
첫 번째와 두 번째 에피토프 결합 도메인은 공유결합으로 또는 비-공유결합으로 결합된다. 도메인이 공유결합으로 결합되는 경우에, 결합은 예로써 이황화 결합에 의해 매개된다.
본 발명의 두 번째 배치에서, 첫 번째와 두 번째 에피토프는 가급적, 상이하다. 이들은 자연 발생하거나 합성된 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산, 또는 이들의 일부이다. 이러한 관점에서, 본 발명의 리간드는 에피토프 또는 항원에 결합하고 길항제(antagonist) 또는 작용제(agonist)(가령, EPO 수용체 작용제)로서 기능한다. 한 구체예에서, 리간드의 에피토프 결합 도메인은 동일한 에피토프 특이성을 갖고, 동일한 항원 상에 에피토프의 복수 사본이 존재하는 경우에 그들의 에피토프에 동시에 결합한다. 다른 구체예에서, 이들 에피토프는 리간드가 에피토프에 결합하여 항원을 가교할 수 있도록 상이한 항원 상에 제공된다. 당업자는 에피토프와 항원의 선택이 넓고 다양함을 인식할 것이다. 이들은 예로써, 인간이나 동물 단백질, 사이토킨, 사이토킨 수용체, 효소에 대한 효소 보조-인자 또는 DNA 결합 단백질일 수 있다.
본 명세서에 기술된 바와 같이 단일- 또는 이중-특이적 결합 폴리펩티드에 의해 표적될 수 있는 적절한 사이토킨과 성장 인자에는 ApoE, Apo-SAA, BDNF, BLyS, 카디오트로핀-1, EGF, EGF 수용체, ENA-78, 에오탁신, 에오탁신-2, 엑소더스-2, EpoR, FGF-산성, FGF-염기성, 섬유아세포 성장 인자-10, FLT3 리간드, 프랙탈카인(CX3C), GDNF, G-CSF, GM-CSF, GF-β1, 인슐린, IFN-γ, IGF-I, IGF-II, IL-1α, IL-β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8(72 a.a.), IL-8(77 a.a.), IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18(IGIF), 인히빈 α, 인히빈 β, IP-10, 각화세포 성장 인자-2(KGF-2), KGF, 렙틴, LIF, 림포탁틴, 뮬레리안 저해 물질, 단핵구 콜로니 저해 인자, 단핵구 유인 단백질, M-CSF, MDC(67 a.a.), MDC(69 a.a.), MCP-1(MCAF), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MIG, MIP-1α, MIP-1β, MIP-3α, MIP-3β, MIP-4, 골수 전구체 저해 인자-1(MPIF-1), NAP-2, Neurturin, 신경 성장 인자, β-NGF, NT-3, NT-4, 온코스탄틴 M, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4, RANTES, SDF1α, SDF1β, SCF, SCGF, 줄기 세포 인자(SCF), TARC, TGF-α, TGF-β, TGF-β2, TGF-β3, 종양 괴사 인자(TNF), TNF-α, TNF-β, TNF 수용체 I, TNF 수용체 II, TLIL-1, TPO, VEGF, VEGF 수용체 1, VEGF 수용체 2, VEGF 수용체 3, GCP-2, GRO/MGSA, GRO-β, GRO-γ, HCC1, 1-309, HER 1, HER 2, HER 3, HER 4, TACE 인식부위, TNF BP-I, TNF BP-II 및 부록 2와 3에 기술된 임의의 표적(이들 부록에서 언급된 바와 같은 조합으로, 상이한 조합으로, 또는 개별적으로)를 포함되지만 이들에 한정되지 않는다.
사이토킨 수용체는 전술된 사이토킨, 다시 말하면, IL-1 R1, IL-6R, IL-10R, IL-18R, 부록 2 또는 부록 3에 기술된 사이토킨에 대한 수용체 및 부록 2와 3에 기술된 수용체를 포함한다.
상기 목록은 결코 한정적으로 의도되지 않는다. 다중특이적 리간드가 2개의 에피토프(동일하거나 상이한 항원 상에서)에 결합하는 경우에, 항원은 상기 목록으로부터 선택된다.
유리하게는, 이중특이적 리간드는 사이토킨 및 생물체의 신체 내에 치료적 상황에서 상승적으로 협력하는 다른 분자를 표적하는데 이용된다. 이런 이유로, 본 발명은 2개 이상의 사이토킨의 활성을 상승시키는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 상기 2개 이상의 사이토킨에 결합할 수 있는 이중특이적 리간드를 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 이러한 측면에서, 이중특이적 리간드는 상보성 및/또는 비-상보성 도메인으로 구성되는 리간드, 열린 형태의 리간드, 닫힌 형태의 리간드를 비롯한 임의의 이중특이적 리간드이다. 가령, 본 발명의 이러한 측면은 VH 도메인 및 VL 도메인의 조합, VH 도메인 단독, VL 도메인 단독에 관계한다.
치료적 배경에서 상승작용은 다양한 방법으로 달성된다. 가령, 표적 조합(target combination)은 양쪽 표적이 리간드에 의해 표적되는 경우에만 치료적으로 활성인 반면, 하나의 표적 단독을 표적하는 것은 치료적으로 무효하다. 다른 구체예에서, 하나의 표적 단독은 낮거나 최소한의 치료적 효과를 제공하지만, 두 번째 표적과의 조합은 치료 효과에서 상승적 증가를 제공한다.
적절하게는, 본 발명의 이러한 측면의 이중특이적 리간드에 의해 결합된 사이토킨은 부록 2에 도시된 목록으로부터 선택된다.
게다가, 이중특이적 리간드는 종양 분야에 사용될 수 있는데, 여기서 하나의 특이성은 세포독성 세포에 의해 발현되는 CD89를 표적하고, 다른 특이성은 종양 특이적이다. 표적되는 종양 항원의 실례는 부록 3에 제공된다.
본 발명의 두 번째 배치의 한 구체예에서, 가변 도메인은 첫 번째 및/또는 두 번째 항원이나 에피토프를 지향하는 항체로부터 유래된다. 바람직한 구체예에서, 가변 도메인은 단일 가변 항체 도메인의 레퍼토리로부터 유래된다. 한 실례에서, 레퍼토리는 동물에서 생성되지 않은 레퍼토리 또는 합성 레퍼토리이다. 다른 실례에서, 단일 가변 도메인은 동물 면역화에 의해 분리되지 않는다(적어도 부분적으로). 따라서, 단일 도메인은 고유의 라이브러리로부터 분리될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명의 두 번째 배치는 첫 번째 에피토프 결합 특이성을 갖는 첫 번째 에피토프 결합 도메인 및 두 번째 에피토프 결합 특이성을 갖는 비-상보성 두 번째 에피토프 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 리간드를 제시한다. 첫 번째와 두 번째 결합 특이성은 동일하거나 상이하다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 첫 번째 에피토프 결합 특이성을 갖는 첫 번째 에피토프 결합 도메인 및 두 번째 에피토프 결합 특이성을 갖는 비-상보성 두 번째 에피토프 결합 도메인을 포함하는 닫힌 형태 다중특이적 리간드를 제시하는데, 상기 첫 번째와 두 번째 결합 특이성은 닫힌 형태 다중특이적 리간드가 양쪽 에피토프에 동시에 결합할 수 없도록 에피토프 결합에 대해 경쟁할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 비-상보성 결합 도메인을 포함하는 열린 형태를 제시하는데, 상기 도메인은 동일한 표적 상에서 상이한 에피토프에 대해 특이적이다. 이러한 리간드는 증가된 화합력으로 표적에 결합한다.
이와 유사하게, 본 발명은 동일한 에피토프에 특이적인 비-상보성 결합 도메인을 포함하고 IL-5, PDGF-AA, PDGF-BB, TGFβ, TGFβ2, TGFβ3 및 TNFα, 예를 들면, 인간 TNF 수용체 1과 인간 TNFα와 같은 상기 에피토프의 복수 사본을 포함하는 표적을 지향하는 다가 리간드를 제시한다.
유사한 측면에서, 본 발명에 따른 리간드는 낮은 친화력으로 개별 에피토프에 결합하도록 배치될 수 있어서 개별 에피토프에 대한 결합은 치료적으로 유의성이 없지만, 2개의 에피토프로의 결합으로부터 유발된 증가된 화합력은 치료적 이익을 제공한다. 특정한 실례에서, 정상 세포 유형에서는 개별적으로 존재하지만 비정상적이거나 병든 세포, 예를 들면, 종양 세포에서만 함께 존재하는 에피토프가 표적된다. 이러한 상황에서, 비정상적인 또는 병든 세포만 본 발명에 따른 이중특이적 리간드에 의해 효과적으로 표적된다. 또한, 동일한 표적 상에서 동일한 에피토프 또는 인접 에피토프의 복수 사본에 특이적인 리간드(킬레이트화 dAb)는 3개, 4개 또는 그 이상의 비-상보성 결합 도메인을 포함하는 삼량체 또는 다량체(사량체 이상)이다. 가령, 3개 또는 4개의 VH 도메인이나 VL 도메인을 포함하는 리간드가 작제된다.
게다가, 각각의 결합 도메인이 표적의 아단위에 특이적인 다중특이적 표적에 결합하는 리간드가 제시된다. 리간드는 이량체, 삼량체 또는 다량체이다. 적절하게는, 본 발명의 상기 측면에 따른 다중특이적 리간드는 본 발명의 첫 번째 측면의 방법에 의해 수득될 수 있다.
유리하게는, 본 발명의 두 번째 배치의 상기 측면에 따라, 첫 번째 에피토프 결합 도메인 및 두 번째 에피토프 결합 도메인은 본 명세서에 정의된 바와 같이 비-상보성 면역글로불린 가변 도메인이다. 다시 말하면, VH-VH 또는 VL-VL 가변 도메인이다.
특히, 킬레이트화 dAb는 본 발명의 바람직한 측면, 다시 말하면, 앵커 dAb의 이용으로 생성되는데, 여기서 이량체, 삼량체 또는 다량체 dAb의 라이브러리가 링커 서열의 상류 또는 하류에 일정한 dAb를 포함하는 벡터를 이용하여 작제되고, 두 번째, 세 번째 및 추가의 dAb의 레퍼토리가 링커의 다른 면에 삽입된다. 가령, 앵커 또는 안내 dAb는 TAR1-5(Vκ), TAR1-27(Vκ), TAR2h-5(VH) 또는 TAR2h-6(Vκ)이다.
대안적 방법론에서, 링커의 이용은 예로써, VH 및 Vκ와 같은 결합 도메인 사이의 비-공유결합 또는 자연적 친화력의 이용에 의해 회피된다. 따라서, 본 발명은
(a) 표적 상에서 첫 번째 에피토프에 특이적인 단일 결합 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제공하는 단계;
(b) 상기 표적 상에서 두 번째 에피토프에 특이적인 두 번째 결합 도메인을 포함하는 에피토프를 인코딩하는 벡터를 제공하는 단계, 상기 에피토프는 첫 번째 에피토프와 동일하거나 상이하고, 상기 두 번째 에피토프는 상기 첫 번째 에피토프에 인접하고;
(c) 상기 첫 번째와 두 번째 결합 도메인을 발현하는 단계; 및
(d) 함께 통합되어 표적-결합 이량체를 생성하는 첫 번째와 두 번째 결합 도메인의 조합을 분리하는 단계를 포함하는, 킬레이트화 다량체 리간드를 생성하는 방법을 제시한다.
첫 번째와 두 번째 에피토프가 인접하여 다량체 리간드가 양쪽 에피토프에 동시에 결합할 수 있다. 이는 결합의 증가된 화합력의 장점을 리간드에 제공한다. 에피토프가 동일한 경우에, 증가된 화합력은 표적 상에서 에피토프의 복수 사본의 존재에 의해 달성되고, 증가된 화합력 효과를 달성하기 위하여 적어도 2개의 사본이 동시에 결합될 수 있도록 한다.
결합 도메인은 여러 방법뿐만 아니라 링커의 이용에 의해 결합될 수 있다. 가령, 결합 도메인은 cys 잔기, 아비딘, 스트렙타비딘 기, 또는 합성이후 비-공유결합성 부착을 위한 다른 수단을 포함한다; 표적에 효과적으로 결합하는 이들 조합은 분리될 것이다. 대안으로, 링커는 첫 번째와 두 번째 결합 도메인 사이에 존재하고, 이들 도메인은 단일 벡터로부터 단일 폴리펩티드로서 발현되고, 상기 벡터는 예로써, 앞서 기술된 바와 같이 첫 번째 결합 도메인, 링커 및 두 번째 결합 도메인의 레퍼토리를 포함한다.
바람직한 측면에서, 첫 번째와 두 번째 결합 도메인은 항원에 결합시에 자연적으로 결합한다; 가령, VH와 VK 도메인은 인접 에피토프에 결합시에 3-원 상호작용으로 자연적으로 결합하여 안정적인 이량체를 형성한다. 이들 결합된 단백질은 표적 결합 검사에서 분리될 수 있다. 이러한 절차의 장점은 정확한 형태에서, 매우 인접한 에피토프에 결합하는 결합 도메인만 결합하고, 따라서 표적에 대해 증가된 화합력의 결과로서 분리된다는 점이다.
본 발명의 두 번째 배치의 상기 측면의 대안적 구체예에서, 적어도 하나의 에피토프 결합 도메인은 본 명세서에 정의된 바와 같이 비-면역글로불린 '단백질 뼈대' 또는 '단백질 골격'을 포함한다. 적절한 비-면역글로불린 단백질 뼈대는 앞서 기술된 바와 같이 SpA, 피브로넥틴, GroEL과 다른 샤페론, 리포칼린, CCTLA4 및 어피바디에서 선택되지만 이들에 한정되지 않는다.
유리하게는, 본 발명의 두 번째 배치의 상기 측면에 따라, 에피토프 결합 도메인은 '단백질 골격'에 부착된다.
유리하게는, 본 발명에 따른 단백질 골격은 면역글로불린 골격이다. 본 발명에 따라, '면역글로불린 골격'은 본 명세서에 정의된 바와 같이 적어도 하나의 면역글로불린 폴드를 포함하고 하나이상의 에피토프 결합 도메인에 대한 핵으로서 작용하는 단백질을 의미한다.
본 명세서에 정의된 선호되는 “면역글로불린 골격”은 아래에서 선택되는 것들 중에서 하나이상을 포함한다: 적어도 (ⅰ) 항체의 CL(카파 또는 람다 하위집합) 도메인; 또는 (ⅱ) 항체 중쇄의 CH1 도메인; 항체 중쇄의 CH1과 CH2 도메인을 포함하는 면역글로불린 분자; 항체 중쇄의 CH1, CH2, CH3 도메인을 포함하는 면역글로불린 분자; 또는 항체의 CL(카파 또는 람다 하위집합) 도메인과 공동으로 임의의 부분집합 (ⅱ). 힌지 영역 도메인 역시 포함될 수 있다. 도메인의 이러한 조합은 예로써, IgG 또는 IgM와 같은 자연 항체, 또는 Fv, scFv, Fab 또는 F(ab')2 분자와 같은 이의 단편을 모방한다.
당업자가 인지하는 바와 같이, 상기 목록은 결코 한정적으로 의도되지 않는다.
본 명세서에 정의된 바와 같이 에피토프 결합 도메인에 대한 골격의 결합은 폴리펩티드 수준에서, 다시 말하면, 골격 및/또는 에피토프 결합 도메인을 인코딩하는 핵산의 발현이후 달성된다. 대안으로, 결합 단계는 핵산 수준에서 수행된다. 본 발명에 따른 단백질 골격을 하나이상의 에피토프 결합 도메인에 연결하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있고 본 명세서에 기술된 단백질 화학 및/또는 분자생물학적 기술의 이용을 수반한다.
유리하게는, 닫힌 형태 다중특이적 리간드는 표적 분자에 결합할 수 있는 첫 번째 도메인 및 리간드의 반감기를 연장시키는 분자 또는 작용기에 결합할 수 있는 두 번째 도메인을 포함한다. 가령, 분자 또는 작용기는 HSA 또는 세포 매트릭스 단백질과 같은 부피형성제이다. 본 명세서에서, “리간드의 반감기를 연장시키는 분자 또는 작용기”는 본 명세서에 기술된 바와 같이 이중특이적 리간드에 의해 결합되는 경우에 동물에 투여될 때 상기 분자 또는 작용기에 결합하지 않은 리간드에 비하여, 이러한 이중특이적 리간드의 생체내 반감기를 증가시키는 분자 또는 화학 작용기를 의미한다. 리간드의 반감기를 연장시키는 분자 또는 작용기의 실례는 하기에 기술된다. 바람직한 구체예에서, 닫힌 형태 다중특이적 리간드는 반감기 증가 분자 또는 작용기의 이동시에만 표적 분사에 결합할 수 있다. 따라서, 가령, 닫힌 형태 다중특이적 리간드는 HSA와 같은 거대 분자에 의해 피험자의 혈액 내에 순환 유지된다. 표적 분자와 마주치면, 닫힌 형태 다중특이적 리간드의 결합 도메인 사이의 경쟁은 HSA의 이동 및 표적의 결합을 유도한다.
유리하게는, 본 발명의 한 측면에 따른 리간드 및 이러한 리간드를 작제하는데 유용한 dAb 단량체는 표면 플라스몬 공명에 의한 측정에서, 300 nM 내지 5 pM(즉, 3x 10-7 내지 5x 10-12 M), 바람직하게는 50 nM 내지 20 pM, 또는 5 nM 내지 200 pM, 또는 1 nM 내지 100 pM, 1x 10-7 M 이하, 1x 10-8 M 이하, 1x 10-9 M 이하, 1x 10-10 이하, 1x 10-11 이하의 Kd 및/또는 5x 10-1 내지 1x 10-7 S-1, 바람직하게는 1x 10-2 내지 1x 10-6 S-1 또는 5x10-3 내지 1x 10-5 S-1, 또는 5x 10-1 S-1 이하, 또는 1x 10-2 S-1 이하, 또는 1x 10-3 S-1 이하, 또는 1x 10-4 S-1 이하 또는 1x 10-5 S-1 이하, 또는 1x 10-6 S-1 이하의 Koff 속도 상수로 동족 표적으로부터 분리된다. Kd 속도 상수는 Koff/Kon으로 정의된다.
특히, 본 발명은 각 dAb가 TNFα에 결합하는 항-TNFαdAb 단량체(또는 dAb와 같은 이중특이적 리간드), 동종이량체, 이형이량체 또는 상동삼량체 리간드를 제시한다. 리간드는 표면 플라스몬 공명에 의한 측정에서, 300 nM 내지 5 pM(즉, 3x 10-7 내지 5× 10-12 M), 바람직하게는 50 nM 내지 20 pM, 더욱 바람직하게는 5 nM 내지 200 pM, 가장 바람직하게는 1 nM 내지 100 pM의 Kd; 대안적 방식으로, Kd는 1x 10-7 M 이하, 바람직하게는 1x 10-8 M 이하, 더욱 바람직하게는 1x 10-9 M 이하, 유리하게는 1x 10-10 이하, 가장 바람직하게는 1x 10-11 이하이다; 및/또는 5x 10-1 내지 1x 10-7 S-1, 바람직하게는 1x 10-2 내지 1x 10-6 S-1, 더욱 바람직하게는 5x 10-3 내지 1x 10-5 S-1, 예를 들어 5x 10-1 S-1 이하, 바람직하게는 1x 10-2 S-1 이하, 더욱 바람직하게는 1x 10-3 S-1 이하, 유리하게는 1x 10-4 S-1 이하, 더욱 유리하게는 1x 10-5 S-1 이하, 가장 바람직하게는 1x 10-6 S-1 이하의 Koff 속도 상수로 TNFα에 결합한다.
적절하게는, 리간드는 표준 L929 검사에서, 500 nM 내지 50 pM, 바람직하게는 100 nM 내지 50 pM, 유리하게는 10 nM 내지 100 pM, 더욱 바람직하게는 1 nM 내지 100 pM; 예를 들면, 50 nM 이하, 바람직하게는 5 nM 이하, 유리하게는 500 pM 이하, 더욱 바람직하게는 200 pM 이하, 가장 바람직하게는 100 pM 이하의 ND50으로 TNFα를 중화시킨다.
적절하게는, 리간드는 500 nM 내지 50 pM, 바람직하게는 100 nM 내지 50 pM, 더욱 바람직하게는 10 nM 내지 100 pM, 유리하게는 1 nM 내지 100 pM; 예를 들면, 50 nM 이하, 바람직하게는 5 nM 이하, 더욱 바람직하게는 500pM 이하, 유리하게는 200 pM 이하, 가장 바람직하게는 100 pM 이하의 IC50으로 TNFα 수용체 I(p55 수용체)에 대한 TNFα의 결합을 저해한다. 적절하게는, TNFα는 인간 TNFα이다.
더 나아가, 본 발명은 표면 플라스몬 공명에 의한 측정에서, 300 nM 내지 5 pM(즉, 3x 10-7 내지 5x 10-12 M), 바람직하게는 50 nM 내지 20 pM, 더욱 바람직하게는 5 nM 내지 200 pM, 가장 바람직하게는 1 nM 내지 100 pM, 예를 들면, 1x 10-7 M 이하, 바람직하게는 1x 10-8 M 이하, 더욱 바람직하게는 1x 10-9 M 이하, 유리하게는 1x 10-10 이하, 가장 바람직하게는 1x 10-11 이하의 Kd; 및/또는 5x 10-1 내지 1x 10-7 S-1, 바람직하게는 1x 10-2 내지 1x 10-6 S-1, 더욱 바람직하게는 5x 10-3 내지 1x 10-5 S-1, 예를 들면, 5x 10-1 S-1 이하, 바람직하게는 1x 10-2 S-1 이하, 더욱 바람직하게는 1x 10-3 S-1 이하, 유리하게는 1x 10-4 S-1 이하, 더욱 유리하게는 1x 10-5 S-1 이하, 가장 바람직하게는 1x 10-6 S-1 이하의 Koff 속도 상수로 TNF 수용체 I에 결합하는 항-TNF 수용체 I dAb 단량체, 또는 이러한 aAb를 포함하는 이중특이적 리간드를 제시한다.
적절하게는, dAb 단량체 또는 리간드는 표준 검사(가령, 본 명세서에 기술된 L929 또는 HeLa 검사)에서, 500 nM 내지 50 pM, 바람직하게는 100 nM 내지 50 pM, 더욱 바람직하게는 10 nM 내지 100 pM, 유리하게는 1 nM 내지 100 pM; 예를 들면, 50 nM 이하, 바람직하게는 5 nM 이하, 더욱 바람직하게는 500 pM 이하, 유리하게는 200 pM 이하, 가장 바람직하게는 100 pM 이하의 ND50으로 TNFα를 중화시킨다.
적절하게는, dAb 단량체 또는 리간드는 500 nM 내지 50 pM, 바람직하게는 100 nM 내지 50 pM, 더욱 바람직하게는 10 nM 내지 100 pM, 유리하게는 1 nM 내지 100 pM; 예를 들면, 50 nM 이하, 바람직하게는 5 nM 이하, 더욱 바람직하게는 500 pM 이하, 유리하게는 200 pM 이하, 가장 바람직하게는 100 pM 이하의 IC50으로 TNFα 수용체 I(p55 수용체)에 대한 TNFα의 결합을 저해한다. 적절하게는, TNF 수용체 I 표적은 인간 TNFα이다.
더 나아가, 본 발명은 1 nM 내지 500 μM(즉, 1x 10-9 내지 5x 10-4), 바람직하게는 100 nM 내지 10 μM의 Kd로 혈청 알부민(SA)에 결합하는 dAb 단량체(또는 이러한 dAb를 포함하는 이중특이적 리간드)를 제시한다. 적절하게는, 첫 번째 항-SA dAb 및 다른 표적에 대한 두 번째 dAb를 포함하는 이중특이적 리간드에서, 표적에 대한 두 번째 dAb의 친화력(가령, BiaCore를 이용한 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 Kd 및/또는 Koff)은 SA에 대한 첫 번째 dAb의 친화력의 1-100000배(바람직하게는, 100-100000배, 더욱 바람직하게는 1000-100000배, 또는 10000-100000배)이다. 가령, 첫 번째 dAb가 대략 10 μM의 친화력으로 SA에 결합하는 반면, 두 번째 dAb는 100 pM의 친화력으로 표적에 결합한다. 적절하게는, 혈청 알부민은 인간 혈청 알부민(HSA)이다.
한 구체예에서, 첫 번째 dAb(또는 dAb 단량체)는 대략 50, 바람직하게는 70, 더욱 바람직하게는 100, 150 또는 200 nM의 Kd로 SA(가령, HSA)에 결합한다.
게다가, 본 발명은 본 발명의 상기한 측면에 따라, 전술된 dAb 단량체의 이량체, 삼량체 및 중합체를 제시한다.
dAb 단량체, 이량체 및 삼량체를 비롯한 본 발명에 따른 리간드는 CH2와 CH3 도메인의 하나 또는 둘 모두 및 선택적으로 힌지 영역을 포함하는 항체 Fc 영역에 연결될 수 있다. 가령, 단일 뉴클레오티드 서열로서 Fc 영역에 연결된 리간드를 인코딩하는 벡터가 이들 폴리펩티드를 제조하는데 이용된다.
본 발명의 두 번째 배치의 다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 바와 같이 적어도 하나의 다중특이적인 리간드를 인코딩하는 하나이상의 핵산 분자를 제시한다. 한 구체예에서, 리간드는 닫힌 형태 리간드이다. 다른 구체예에서, 이는 열린 형태 리간드이다. 다중특이적 리간드는 단일 핵산 분자 상에 인코딩된다; 대안으로, 각 에피토프 결합 도메인은 개별 핵산 분자에 의해 인코딩된다. 리간드가 단일 핵산 분자에 의해 인코딩되면, 도메인은 융합 폴리펩티드로서 발현되거나, 또는 개별적으로 발현되고 후속으로 예로써 화학 결합제를 이용하여 서로 연결된다. 개별 핵산으로부터 발현된 리간드는 적당한 수단으로 서로 연결될 것이다.
핵산은 발현이후 숙주 세포로부터의 폴리펩티드 유출을 위한 신호 서열을 추가로 인코딩하고, 발현이후 섬유상 박테리오파지 입자의 표면 성분(또는 선별 전시 시스템의 다른 성분)과 융합된다. 박테리아 발현 및/또는 파지 또는 파지미드 전시에 이용되는 리더 서열은 pelB, stII, ompA, phoA, bla 및 pelA를 포함한다.
본 발명의 두 번째 배치의 또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 벡터를 제시한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 벡터로 형질감염된 숙주 세포를 제시한다.
이러한 벡터로부터의 발현은 예로써, 박테리오파지 입자의 표면 상에서 선별을 위한 에피토프 결합 도메인을 생성하도록 형성된다. 이는 전시된 도메인의 선별을 가능하게 하고, 따라서 본 발명의 방법을 이용한 '다중특이적 리간드'의 선별을 가능하게 한다.
본 발명의 두 번째 배치의 바람직한 구체예에서, 에피토프 결합 도메인은 면역글로불린 가변 영역이고 단일 도메인 V 유전자 레퍼토리로부터 선택된다. 일반적으로, 단일 항체 도메인의 레퍼토리는 섬유상 박테리오파지의 표면 상에 전시된다. 바람직한 구체예에서, 각 단일 항체 도메인은 항원에 대한 파지 레퍼토리의 결합에 의해 선택된다.
또한, 본 발명은 열린 형태 또는 닫힌 형태 리간드인, 본 발명에 따른 적어도 하나의 다중특이적 리간드를 포함한 키트를 제시한다. 본 발명에 따른 키트는 예로써, 진단 키트, 치료 키트, 화학 종류 또는 생물 종류의 검출용 키트 등이다.
본 발명의 두 번째 배치의 또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 리간드를 이용한 상동적 면역검사를 제시한다.
본 발명의 두 번째 배치의 또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 수득되는 닫힌 형태 다중특이적 리간드 및 제약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 함유하는 조성물을 제시한다. 게다가, 본 발명은 본 발명에 따른 '닫힌 형태 다중특이적 리간드' 또는 조성물을 이용한 질병 치료 방법을 제시한다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 질병은 암 또는 염증성 질환, 예를 들면, 류머티스성 관절염, 천식 또는 크론병이다.
본 발명의 두 번째 배치의 또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 닫힌 형태 다중특이적 리간드 또는 조성물을 이용한 질병의 진단을 비롯한 진단 방법을 제시한다.
따라서, 일반적으로, 닫힌 형태 다중특이적 리간드에 대한 분석물의 결합은 약제를 치환하는데 이용되고, 상기 약제는 치환시에 신호의 발생을 유도한다. 가령, 효소가 활성 부위를 통하여 항체에 유지되는 경우에, 분석물(두 번째 항원)의 결합은 면역검사에 대한 기초를 제공하는 항체에 결합된 효소(첫 번째 항원)를 치환할 수 있다.
따라서, 두 번째 배치의 마지막 측면에서, 본 발명은 (a) 약제에 결합된 닫힌 형태 다중특이적 리간드를 제공하는 단계, 상기 리간드는 표적 분자 및 약제에 특이적이고, 상기 리간드에 의해 결합된 약제는 리간드로부터의 치환시에 검출가능한 신호의 발생을 유도하고; (b) 닫힌 형태 다중특이적 리간드를 표적 분자에 노출시키는 단계; (c) 약제의 치환의 결과로서 발생된 신호를 검출하는 단계를 포함하는, 표적 분자의 존재를 검출하는 방법을 제시한다.
유리하게는, 본 발명의 두 번째 배치의 상기 측면에 따라, 약제는 효소이고, 상기 효소는 닫힌 형태 다중특이적 리간드에 의해 결합될 때 불활성이다. 대안으로, 약제는 효소에 대한 기질 및 리간드에 의한 결합시에 불활성 또는 소멸되는 형광성, 발광성 또는 색원성 분자로부터 선택된다.
본 명세서에 기술된 서열과 유사하거나 상동한(가령, 적어도 70% 이상의 서열 동일성) 서열 역시 본 발명의 일부이다. 일부 구체예에서, 아미노산 수준에서 서열 동일성은 대략 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 될 수 있다. 핵산 수준에서 서열 동일성은 대략 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 될 수 있다. 대안으로, 실질적 동일성은 핵산 분절이 선별적 혼성화 조건(가령, 매우 높은 엄밀도 혼성화 조건) 하에서 상기 가닥의 보체에 혼성화되는 경우에 존재한다. 핵산은 전체 세포 내에, 세포 용해질 내에, 또는 부분적으로 정제되거나 실질적으로 순수한 형태로 존재한다.
두 서열 사이의 “상동성(homology)”또는 “서열 동일성(sequence identity)” 또는 “유사성”(이들 용어는 상호 호환된다)의 산정은 아래와 같이 수행된다. 서열은 최적 비교 목적으로 정렬된다(가령, 비교 목적으로, 최적 정렬을 위하여 첫 번째와 두 번째 아미노산 또는 핵산의 한쪽 또는 양쪽 모두에 공백이 도입될 수 있고, 비-상동성 서열이 무시될 수 있다).
바람직한 구체예에서, 비교 목적으로 정렬된 참조 서열의 길이는 참조 서열 길이의 적어도 30% 이상, 바람직하게는 적어도 40% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 50% 이상, 이보다 더욱 더 바람직하게는 적어도 60%, 이보다 더욱 더욱 바람직하게는 적어도 70%, 80%, 90%, 100%이다. 이후, 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에 상응하는 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드가 비교된다. 첫 번째 서열에서 한 위치가 두 번째 서열에서 상응하는 위치에서와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 점유될 때, 이들 분자는 상기 위치에서 동일하다(본 명세서에서, 아미노산 또는 핵산 “상동성”은 아미노산 또는 핵산 “동일성”과 동일한 의미를 갖는다). 2개의 서열 사이의 백분율 동일성 비율은 이들 두 서열 사이의 최적 정렬을 위하여 도입되는 공백의 총수 및 각 공백의 길이를 고려한, 이들 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 총수의 함수이다.
유리하게는, 파라미터가 디폴트 수치로 설정된 BLAAST 알고리즘(버전 2.0)이 서열 정렬에 이용된다. BLAST 알고리즘은 "blst_help.html" 파일 내에 "/Blast/" 디렉토리에서 미국정부("gov")의 국립보건원("nih")의 생명공학 정보 국립 센터("ncbi")의 월드 와이드 웹 부위("www")에 상세하게 기술되어 있다. 검색 파라미터는 아래와 같이 정의되고, 유리하게는 정의된 디폴트 파라미터로 설정된다.
BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)는 프로그램 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx에 의해 이용되는 귀납적(heuristic) 검색 알고리즘이다; 이들 프로그램은 다소 개선된 Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(6):2264-8(상기 기술된 "blast_help.html" 파일 참고)의 통계적 방법을 이용하여 그들의 발견에 유의성을 부여한다. BLAST 프로그램은 예로써, 질문 서열에 대한 상동체를 확인하는 서열 유사성 검색에 맞춤되었다. 서열 데이터베이스의 유사성 검색에서 기본 이슈(issue)와 관련하여, Altschul et al.(1994)를 참조한다.
생명공학 정보 국립 센터 웹 사이트에서 입수가능한 5개의 BLAST 프로그램은 아래의 작업를 수행한다: "blastp"는 단백질 서열 데이터베이스에 대한 아미노산 질문 서열을 비교한다; "blastn"은 뉴클레오티드 서열 데이터베이스에 대한 뉴클레오티드 질문 서열을 비교한다; "blastx"는 단백질 서열 데이터베이스에 대한 뉴클레오티드 질문 서열(양쪽 가닥 모두)의 6-프레임 개념적 번역 산물을 비교한다; "tblastn: 모두 6개의 리딩(reading) 프레임(양쪽 가닥 모두)에서 동적으로 번역된 뉴클레오티드 데이터베이스에 대한 단백질 질문 서열을 비교한다; "tblastx"는 뉴클레오티드 서열 데이터베이스의 6-프레임 번역에 대한 뉴클레오티드 질문 서열의 6-프레임 번역을 비교한다.
BLAST는 하기의 검색 파라미터를 이용한다:
HISTOGRAM(히스토그램)은 각 검색에 대한 스코어의 히스토그램을 표시한다; 디폴트는 yes이다(BLAST 매뉴얼에서 파라미터 H를 참조한다).
DESCRIPTIONS(설명)은 특성화된 번호로 보고되는 정합 서열(matching sequence)의 간단한 설명(description)의 수를 제한한다; 디폴트 한계는 100개의 설명이다(상기 매뉴얼에서 파라미터 V를 참조한다). 또한, EXPECT(예상) 및 CUTOFF(컷오프)를 참조한다.
ALIGNMENTS(정렬)은 높은-스코어링 분절 쌍(HSP)이 보고되는 특정화된 번호에 데이터베이스 서열을 제한한다; 디폴트 한계는 50이다. 이 보다 많은 데이터베이스 서열이 리포팅을 위한 통계적 유의성 역치를 만족시키는 경우에(하기의 EXPECT 및 CUTOFF를 참조한다), 최대 통계학적 유의성이 부여된 매치만이 보고된다(BLAST 매뉴얼에서 파라미터 B를 참조한다).
EXPECT(예상)은 데이터베이스 서열에 대한 정합을 보고하기 위한 통계학적 유의성 역치를 예상한다; 디폴트 값은 10인데, Karlin and Altschul(1990)의 추계학적 모델에 따라, 10개의 정합이 단지 우연히 발견될 것으로 예상된다. 정합에 부여된 통계학적 유의성이 EXPECT 역치보다 큰 경우에, 정합은 보고되지 않을 것이다. 더욱 낮은 EXPECT 역치는 더욱 엄격하고, 정합이 보고되는 기회를 더욱 적게 한다. 분수 값이 허용된다(BLAST 매뉴얼에서 파라미터 E를 참조한다).
CUTOFF(컷오프)는 높은-스코어링 분절(segment) 쌍을 보고하기 위한 점수를 컷오프한다. 디폴트 값은 EXPECT 값(상기 참조)으로부터 산정된다. HSP는 이들에 부여된 통계적 유의성이 적어도, CUTOFF 값과 동등한 스코어를 갖는 고립 HSP에 부여된 통계학적 유의성만큼 높은 경우에만 데이터베이스 서열에 대해 보고된다. 더욱 높은 CUTOFF 값은 더욱 엄격하고, 정합이 보고되는 기회를 더욱 적게 한다(BLAST 매뉴얼에서 파라미터 S를 참조한다). 전형적으로, 유의성 역치는 EXPECT를 이용하여 더욱 직관적으로 관리될 수 있다.
MATRIX(매트릭스)는 BLASTP, BLASTX, TBLASTN 및 TBLASTX에 대한 교대적 스코어링 매트릭스를 지정한다. 디폴트 매트릭스는 BLOSUM62(Henikoff & Henikoff, 1992)이다. 유효한 다른 선택은 PAM40, PAM120, PAM250, IDENTITY 등이다. BLASTN에 유용한 교대적 스코어링 매트릭스는 없다; BLASTN 리퀘스트(request)에서 MATRIX 지령의 지정은 오류 반응(error response)으로 되돌아온다.
STRAND(가닥)은 TBLASTN 검색을 상기 데이터베이스 서열의 상부 또는 하부 가닥으로만 한정한다; 또는 BLASTP, BLASTX 또는 TBLASTX 검색을 질문 서열의 상부 또는 하부 상에 리딩 프레임으로만 한정한다.
FILTER(필터)는 Wootton & Federhen(1993) Computers and Chemistry 17:149-163의 SEG 프로그램에 의한 측정에서 낮은 구성 복합성을 갖는 질문 서열의 분절, 또는 Claverie & States(1993) Computers and Chemistry 17:191-201의 XNU 프로그램 또는 BLASTN의 경우, Tatusov and Lipman(NCBI의 월드 와이드 웹 사이트 참조)의 DUST 프로그램에 의한 측정에서 짧은-주기성 간격 반복(short-periodicity internal repeat)으로 구성되는 분절을 마스크 오프(mask off)한다. 필터링(filtering)은 blast 출력(가령, 공통의 산성-, 염기성- 또는 프롤린-풍부 영역에 대한 적중(hit))으로부터 통계적으로는 유의하지만 생물학적으로 무의미한 리포트를 제거함으로써, 질문 서열의 생물학적으로 더욱 유의미한 영역이 데이터베이스 서열에 대한 특정 매칭에 이용되도록 한다. 필터 프로그램에 의해 발견된 낮은 복합성 서열은 뉴클레오티드 서열에서 문자 "N"로 대체되고(가령, 13번 반복된 "N"), 단백질 서열에서 문자 "X"로 대체된다(가령, 9번 반복된 "X").
필터링은 데이터베이스 서열이 아닌 질문 서열(또는 그의 번역 생성물)에만 적용된다. 디폴트 필터링은 BLASTN의 경우 DUST, 다른 프로그램의 경우는 SEG이다. SWISS-PROT 내의 서열에 적용되는 경우에, 어떤 것도 SEG, XNU 또는 둘 모두에 의해 마스킹되지 않는 사례가 빈번하기 때문에, 필터링이 항상 효과를 나타내지는 않는다. 더 나아가, 일부 사례에서, 서열이 완전히 마스킹되는데, 이는 여과되지 않은 질문 서열에 대해 보고된 임의의 정합의 통계학적 유의성이 의심받고 있음을 암시한다.
NCBI-gi는 NCBI-gi 확인자가 접근 및/또는 로커스(locus) 명칭에 부가하여, 출력 내에 나타나도록 유도한다.
가장 적절하게는, 서열 비교는 "/BLAST" 디렉토리 내에서, 앞서 기술된 NCBI 월드 와이드 웹 사이트에 제공된 간단한 BLAST 검색 알고리즘을 사용하여 수행된다.
면역글로불린 기초된 다중특이적 리간드의 제조
본 발명에 따른 이중특이적 리간드는 본 발명의 바람직한 배치에 따른 열린 또는 닫힌 형태인 지에 상관없이, 기존에 확립된 기술에 따라 생성되고 항체 공학 분야에서 scFv, "파지" 항체 및 다른 설계된 항체 분자의 제조에 이용된다. 항체, 특히 이중특이적 항체의 제조 기술은 예로써, 아래의 리뷰 및 여기에 언급된 참고문헌에서 기술된다: Winter & Milstein (1991) Nature 349:293-299; Plueckthun (1992) Immunological Reviews 130:151-188; Wright et al., (1992) Crti. Rev. Immunol. 12:125-168; Holliger, P. & Winter, G. (1993) Curr. Op. Biotechn. 4:446-449; Carter et al., (1995) J. Hematother. 4:463-470; Chester, K.A. & Hawkins, R.E. (1995) Trends Biotechn. 13:294-300; Hoogenboom, H.R. (1997) Nature Biotechnol. 15:125-126; Fearon, D. (1997) Nature Biotechnol. 15:618-619; Pluckthun, A. & Pack, P.(1997) Immunotechnology 3:83-105; Carter, P. & Merchant, A.M. (1997) Curr. Opin. Biotechnol. 8:449-454; Holliger P. & Winter, G. (1997) Cancer Immunol. Immunother. 45:128-130.
본 발명은 2개의 상이한 항원이나 에피토프에 대한 가변 도메인의 선별 및 가변 도메인의 후속적 조합을 제시한다. 가변 도메인의 선별에 사용되는 기술은 당분야에 공지된 라이브러리와 선별 기술을 이용한다. 인간 B 세포로부터 획득된 재배열된 V 유전자를 이용한 자연 라이브러리(Marks et al. (1991) J. Mol. Biol., 222:581; Vaughan et al., (1996) Nature Biotech., 14:309)는 당업자에게 널리 알려져 있다. 합성 라이브러리(Hoogenboom & Winter (1992) J. Mol. Biol. 227:381; Barbas et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4457; Nissim et al. (1994) EMBO J., 13:692; Griffiths et al. 91994) EMBO J., 13:3245; De Kruif et al. (1995) J. Mol. Biol., 248:97)는 일반적으로 PCR을 이용하여, 면역글로불린 V 유전자를 클로닝함으로서 제조된다. PCR 과정에서 오류는 높은 정도의 무작위화를 초래한다. VH 및/또는 VL 라이브러리는 개별적으로 표적 항원이나 에피토프에 대해 선별될 수 있는데, 이 경우에 단일 도메인 결합은 직접적으로 또는 함께 선별된다.
본 발명에 따른 이중특이적 리간드를 제조하는 바람직한 방법은 가변 도메인의 레퍼토리가 첫 번째 항원이나 에피토프로의 결합에 대해 선별되고 가변 도메인의 레퍼토리가 두 번째 항원이나 에피토프로의 결합에 대해 선별되는 선별 시스템을 이용하는 단계를 포함한다. 이후, 선별된 첫 번째와 두 번째 가변 도메인은 통합되고, 첫 번째와 두 번째 항원이나 에피토프 모두로의 결합에 대해 이중특이적 리간드가 선별된다. 닫힌 형태 리간드는 첫 번째와 두 번째 항원이나 에피토프 모두에 동시가 아닌 분리된 결합에 대해 선별된다.
A. 라이브러리 벡터 시스템
본 발명에 이용하기 적합한 다양한 선택 시스템이 당분야에 공지되어 있다. 이러한 시스템의 실례는 하기에 기술된다.
박테리오파지 람다 발현 시스템은 기존 문헌(Huse et al. (1989) Science, 246:1275; Caton and Koprowski (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87; Mullinax et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:8095; Persson et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:2432)에서 기술된 바와 같이, 박테리오파지 플라크로서 또는 용원균(lysogen)의 콜로니로서 직접 스크리닝되고 본 발명에 이용된다. 이러한 발현 시스템은 라이브러리의 최대 106개의 상이한 구성원을 스크리닝하는데 이용될 수 있긴 하지만, 더욱 큰 수(106개 이상의 구성원)의 스크리닝에는 실제로 적합하지 않다.
특히, 라이브러리의 작제에 선별 전시 시스템이 이용되는데, 이는 핵산이 그가 발현하는 폴리펩티드에 연결될 수 있도록 한다. 본 명세서에서, 선별 전시 시스템은 총괄적 및/또는 표적 리간드에 결합함으로서 적당한 전시 수단에 의한, 라이브러리의 개별 구성원의 선별을 가능하게 하는 시스템이다.
파지 전시 기술에 의해 예시되는, 대형 라이브러리의 원하는 구성원을 분리하기 위한 선별 프로토콜은 당분야에 공지되어 있다. 다양한 펩티드 서열이 섬유상 박테리오파지의 표면 상에 전시되는 이들 시스템(Scott and Smith (1990) Science 249:386)은 표적 항원에 결합하는 특이적인 항체 단편의 시험관내 선별과 증폭을 위한 항체 단편(및 이들을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열)의 라이브러리를 생성하는데 유용한 것으로 입증되었다(McCafferty et al., WO 92/01047). VH 및 VL 영역을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 이들을 대장균(E. coli)의 주변세포질 공간으로 지향시키는 리더 신호를 인코딩하는 유전자 단편에 연결되고, 그 결과로써, 수득된 항체 단편은 전형적으로 박테리오파지 외피 단백질(가령, pIII 또는 pVIII)에 대한 융합체로서 박테리오파지의 표면 상에 전시된다.
대안으로, 항체 단편은 람다 파지 캡시드(파지바디) 상에 외부적으로 전시된다. 파지-기초된 전시 시스템의 장점은 이들이 생물학적 시스템이기 때문에, 박테리아 세포에서 선별된 라이브러리 구성원을 포함하는 파지를 단순히 생장시킴으로서 선별된 라이브러리 구성원이 증폭될 수 있다는 점이다. 게다가, 폴리펩티드 라이브러리 구성원을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 파지 또는 파지미드 벡터 상에 포함되기 때문에, 염기서열분석, 발현 및 후속의 유전적 조작이 상대적으로 용이하다.
박테리오파지 항체 전시 라이브러리 및 람다 파지 발현 라이브러리의 작제 방법은 당분야에 널리 공지되어 있다(McCafferty et al. (1990) Nature, 348:552; Kang et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4363; Clackson et al., (1991) Nature 352:624; Lowman et al. (1991) Biochemistry 30:10832; Burton et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10134; Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4133; Chang et al. (1991) J. Immunol. 147:3610; Breitling et al. (1991) Gene, 104:147; Marks et al. (1991) supra; Barbas et al. (1992) supra; Hawkins and Winter (1992) Science, 258:1313).
특히 유리한 접근법중의 하나는 scFv 파지-라이브러리를 이용하는 것이다(Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Chaudhary et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1066-1070; McCafferty et al. (1990) supra; Clackson et al. (1992) Nature 352:624; Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. Chem. 267). 박테리오파지 외피 단백질 상에 전시된 scFv 라이브러리의 다양한 구체예가 보고되었다. 파지 전시 접근법의 교화 역시 예로써, WO 96/06213과 WO 92/01047(Medicla Research Counci8l et al.) 및 WO 97/08320에서 기술된다.
폴리펩티드의 라이브러리를 생성하는 다른 시스템은 라이브러리 구성원의 시험관내 합성을 위한 무-세포 효소 기구의 이용을 수반한다. 한가지 방법에서, RNA 분자는 표적 리간드에 대한 대안적 선별 라운드 및 PCR 증폭에 의해 선별된다(Tuerk and Gold (1990) Science 249:505; Ellington and Szostak (1990) Nature 346:818). 미리결정된 인간 전사 인자에 결합하는 DNA 서열을 확인하는데 유사한 기술이 이용된다(Thiesen and Bach (1990) Nucleic Acids Res. 18:3203; Beaudry and Joyce (1992) Science 257:635; WO 92/05258 및 WO 92/14843). 유사한 방식으로, 대형 라이브러리를 생성하는 방법으로서 폴리펩티드를 합성하는데 시험관내 번역이 이용될 수 있다. 일반적으로 안정화된 폴리솜 복합체를 포함하는 이들 방법은 WO 88/08453, WO 90/05785, WO 90/07003, WO 91/02076, WO 91/05058, WO 92/02536에서 더욱 기술된다. WO 95/22625 및 WO 95/11922(Affymax)에 기술된 것들과 같은 파지-기초하지 않은 대안적 전시 시스템은 선별을 위한 폴리펩티드를 전시하기 위하여 폴리솜을 이용한다.
또 다른 카테고리의 기술은 유전자와 유전자 생성물의 연쇄를 가능하게 하는 인공적 구획 내에서 레퍼토리의 선별을 수반한다. 가령, 원하는 유전자 생성물을 인코딩하는 핵산이 유중수 에멀젼에 의해 형성된 마이크로캡슐에서 선별되는 선별 시스템이 WO 99/02671, WO 00/40712 및 Tawfik & Griffiths (1998) Nature Biotechnol 16(7):652-6에서 기술된다. 원하는 활성을 갖는 유전자 생성물을 인코딩하는 유전자 요소는 마이크로캡슐 내에 구획되고, 이후 전사되고/또는 번역되어 마이크로캡슐 내에서 개별 유전자 생성물(RNA 또는 단백질)을 생성한다. 원하는 활성을 갖는 유전자 생성물을 생성하는 유전자 요소는 후속으로 분류된다. 이러한 접근법은 다양한 수단으로 원하는 활성을 검출함으로서 목적하는 유전자 생성물을 선별한다.
B. 라이브러리 작제
선별되는 라이브러리는 예로써, 앞서 기술된 바와 같이 당분야에 공지된 기술에 의해 작제되거나 상업적 출처로부터 구입된다. 본 발명에 유용한 라이브러리는 예로써, WO 99/20749에서 기술된다. 벡터 시스템이 선택되고 목적 폴리펩티드를 인코딩하는 하나이상의 핵산 서열이 라이브러리 벡터 내로 클론되면, 발현에 앞서 돌연변이유발을 수행함으로써 클론된 분자 내에서 다양성을 생성할 수 있다; 대안으로, 인코딩된 단백질은 앞서 기술된 바와 같이 돌연변이유발 및 추가적인 선별 라운드를 수행하기에 앞서, 발현되고 선별된다. 구조적으로 최적화된 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열의 돌연변이유발은 표준 분자 방법에 의해 수행된다. 특히, 중합효소 연쇄 반응(또는 PCR)이 이용된다(Mullins and Faloona (1987) Methods Enzymol., 155:335). 목적하는 표적 서열을 증폭하는 열안정적인 DNA-의존성 DNA 중합효소에 의해 촉매된 DNA 복제의 복수 사이클을 이용하는 PCR은 당분야에 널리 공지되어 있다. 다양한 항체 라이브러리의 작제는 Winter et al. (1994) Ann. Rev. Immunology 12:433-55 및 여기에 인용된 참고문헌에서 기술된다.
PCR은 주형 DNA(적어도 1fg; 더욱 유용하게는, 1-1000 ng) 및 적어도 25 pmol의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 수행된다; 각 서열이 프라이머 풀의 분자 중에서 극히 일부이고 양이 후기 증폭 사이클에서 제한되기 때문에, 프라이머 풀이 현저하게 이질적인 경우에는 더욱 많은 양의 프라이머를 사용하는 것이 유리하다. 전형적인 반응 혼합물은 2 ㎕의 DNA, 25 pmol의 올리고뉴클레오티드 프라이머, 2.5 ㎕의 10X PCR 완충액 1(Perkin-Elmer, Foster City, CA), 0.4 ㎕의 1.25 μM dNTP, 0.15 ㎕(또는 2.5 단위)의 Taq DNA 중합효소(Perkin Elmer, Foster City, CA), 전체 25 ㎕까지 탈이온수(deionized water)를 함유한다. 미네랄 기름이 위에 깔려지고, PCR은 프로그램가능 서열 증폭기(programmable thermal cycler)에 의해 수행된다. PCR 사이클의 각 단계의 길이와 온도 및 사이클의 횟수는 실효중인 엄밀도 요건에 따라 조정된다. 어닐링(annealing) 온도와 시간은 프라이머가 주형에 어닐링할 것으로 예상되는 효율 및 관용되는 부정합의 정도에 의해 결정된다; 명백하게, 핵산 분자가 동시에 증폭되고 돌연변이되는 경우에, 적어도 1차 라운드의 합성에서 부정합이 요구된다. 프라이머 어닐링 조건의 엄밀도를 최적화하는 능력은 당업자의 능력 범위에 속한다. 30℃ 내지 72℃ 사이의 어닐링 온도가 이용된다. 주형 분자의 최초 변성은 통상적으로, 92℃ 내지 99℃에서 4분, 이후 변성(94-99℃에서 15초 내지 1분), 어닐링(앞서 기술된 바와 같이 결정된 온도; 1-2분), 신장(증폭되는 산물의 길이에 따라, 72℃에서 1-5분)의 20 내지 40회 사이클로 수행된다. 최종 신장은 일반적으로, 72℃에서 4분, 이후 4℃에서 부정(不定)(0-24시간) 단계로 수행된다.
C. 단일 가변 도메인의 통합
일단 선별된 본 발명에 유용한 도메인은 공유결합과 비-공유결합 방법을 포함하는 다양한 방법에 의해 통합된다.
바람직한 방법은 기술된 바와 같이, scFv 분자에 연결된 폴리펩티드 링커의 이용을 수반한다(Bird et al., (1988) Science 242:423-426). 적합한 링커의 논의는 Bird et al., (1988) Science 242:423-426; Hudson et al., Journal Immunol Methods 231 (1999) 177-189; Hudson et al., Proc. Nat. Acad. Scid. USA 85:5879-5883에서 제공된다. 적절하게는, 링커는 유연하고, 2개의 단일 도메인이 상호작용할 수 있도록 한다. 링커의 한가지 예는 (Gly4Ser)n 링커(n = 1 내지 8, 예를 들면, 2, 3, 4, 5 또는 7)이다. 덜 유연한, 디아바디에 이용된 링커 역시 사용될 수 있다(Holliger et al. (1993) PNAS (USA) 90:6444-6448).
한 구체예에서, 이용된 링커는 면역글로불린 힌지 영역이 아니다.
가변 도메인은 링커 이외의 방법을 이용하여 통합된다. 가령, 자연-발생되거나 조작된 시스테인 잔기를 통하여 제공되는 이황화 가교의 이용은 VH-VH, VL-VL 또는 VH-VL 이량체를 안정화하는데 이용되거나(Reiter et al., (1994) Protein Eng. 7:697-704), 또는 가변 도메인 사이의 인터페이스를 리모델링함으로써 “적합성(fit)”을 증가시켜 상호작용의 안정성을 증가시킨다(Ridgeway et al., (1996) Protein Eng. 7:617-621; Zhu et al., (1997) Protein Science 6:781-788).
적절한 경우에, 면역글로불린, 특히 항체 VH 도메인의 가변 도메인을 연결시키거나 안정화시키는 다른 기술이 이용될 수 있다.
본 발명에 따라, 이중특이적 리간드는 용액 내에서 “닫힌” 형태일 수 있다. “닫힌” 형태는 항체 결합 부위를 형성하는 결합된 VL 쌍에서와 같이 2개의 도메인(가령, VH와 VL)이 결합된 형태로 존재한다는 것을 나타낸다. 가령, scFv는 VH와 VL 도메인을 연결하는데 이용된 링커의 배열에 따라, 닫힌 형태로 존재한다. 이것이 도메인이 결합할 만큼 충분히 유연하거나, 또는 이들을 결합된 위치로 견고하게 유지시키는 경우에, 이들 도메인은 닫힌 형태를 채택할 가능성이 높다.
이와 유사하게, VH 도메인 쌍 및 VL 도메인 쌍은 닫힌 형태로 존재한다. 일반적으로, 이는 리간드 분자 내에서 예로써, 견고한 링커에 의한 이들 도메인의 밀접한 결합의 기능이 될 것이다. 닫힌 형태의 리간드는 리간드의 반감기를 증가시키는 분자 및 두 번째 표적 분자 모두에 결합할 수 없을 것이다. 따라서, 리간드는 전형적으로, 리간드의 반감기를 증가시키는 분자로부터 분리이후에만 두 번째 표적 분자에 결합할 것이다.
게다가, 링커가 없는 VH/VH, VL/VL 또는 VH/VL 이량체의 작제는 도메인 사이에서 경쟁을 제공한다.
이에 더하여, 본 발명에 따른 리간드는 열린 형태이다. 이러한 형태에서, 리간드는 리간드의 반감기를 증가시키는 분자 및 두 번째 표적 분자 모두에 동시에 결합할 것이다. 전형적으로, 열린 형태의 가변 도메인은 이들 도메인이 상호작용하지 않고 항체 결합 부위를 형성하며 개별 에피토프로의 결합에 대해 경쟁하지 않을 만큼 충분히 떨어져 유지된다(VH-VL 쌍의 경우). VH/VH 또는 VL/VL 이량체의 경우에, 도메인은 견고한 링커에 의해 서로 합쳐지도록 강제되지 않는다. 자연적으로, 이들 도메인 쌍은 항원 결합에 대해 경쟁하지 않거나, 또는 항체 결합 부위를 형성할 것이다.
열린 이중특이적 리간드 및 닫힌 이중특이적 리간드가 상이한 환경 하에서 다양한 평형 상태로 존재할 가능성이 높긴 하지만, Fab 단편 및 전체 항체는 일차적으로, 닫힌 형태로 존재할 것이다. 표적에 대한 리간드의 결합은 열린 형태 방향으로 평형의 균형을 이동시킬 가능성이 높다. 따라서, 본 발명에 따른 특정 리간드는 용액 내에서 2가지 형태로 존재할 수 있는데, 이중 하나(열린 형태)는 2개의 항원이나 에피토프에 독립적으로 결합할 수 있는 반면, 대안적 형태(닫힌 형태)는 하나의 항원 또는 에피토프에만 결합할 수 있다; 따라서, 항원이나 에피토프는 이의 형태에서, 리간드로의 결합에 대해 경쟁한다.
따라서, 이중특이적 리간드의 열린 형태가 용액 내에서 닫힌 형태와 평형으로 존재할 수 있긴 하지만, 이러한 평형은 닫힌 형태를 선호할 것으로 생각된다; 게다가, 열린 형태는 표적 결합에 의해 닫힌 형태로 격리될 수 있다. 이런 이유로, 본 발명의 특정 이중특이적 리간드는 가급적, 2가지(열린 및 닫힌) 형태 사이에서 평형으로 존재한다.
본 발명에 따른 이중특이적 리간드는 열린 또는 닫힌 형태를 선호하도록 변형된다. 가령, 이황화 결합으로 VH-VL 상호작용의 안정화는 닫힌 형태를 안정화시킨다. 게다가, VH 도메인 및 VL 도메인 쌍을 포함하는 도메인을 연결하는데 이용되는 링커는 열린 형태가 선호되도록 작제된다; 가령, 링커는 예로써, 적절한 위치에서 대형 아미노산 잔기의 통합, 또는 도메인을 물리적으로 이격시켜 유지시키는 적절한 견고한 구조물의 설계에 의해, 이들 도메인의 결합을 입체적으로 방해한다.
D. 이중특이적 리간드의 특성
특이적 항원이나 에피토프에 대한 이중특이적 리간드의 결합은 ELISA를 비롯한 당업자에게 널리 알려져 있는 방법에 의해 검사될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 결합은 단클론 파지 ELISA를 이용하여 검사된다.
파지 ELISA는 임의의 적절한 절차에 따라 수행된다; 예시적인 프로토콜은 하기에 기술된다.
각 선별 라운드에서 생산된 파지 집단은 “다클론” 파지 항체를 확인하기 위한 ELISA로, 선별된 항원이나 에피토프로의 결합에 대해 스크리닝될 수 있다. 이후, 이들 집단의 단일 감염된 박테리아 콜로니로부터 파지는 “단클론” 파지 항체를 확인하기 위한 ELISA에 의해 스크리닝될 수 있다. 또한, 항원이나 에피토프로의 결합에 대해 용해성 항체 단편을 스크리닝하는 것이 바람직한데, 이는 예로써, C- 또는 N-말단 tag에 대한 반응물을 이용한 ELISA에 의해 수행될 수 있다(참조: Winter et al. (1994) Ann. Rev. Immunology 12:433-55 및 여기에 언급된 참고문헌).
또한, 선별된 파지 단클론 항체의 다양성은 PCR 생성물의 겔 전기영동(Marks et al., 1991, 상동; Nissim et al., 1994 supra), 탐침(Tomlinson et al., 1992, J. Mol. Biol. 227:776) 또는 벡터 DNA의 염기서열분석에 의해 검사된다.
E. '이중특이적 리간드'의 구조
앞서 기술된 바와 같이, 항체는 적어도 하나의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인, 적어도 2개의 중쇄 가변 도메인 또는 적어도 2개의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체(가령, IgG, IgM, IgA, IgE) 또는 단편(Fab, Fv, 이황화 결합된 Fv, scFv, 디아바디)으로 정의된다(상기 용어는 dAb를 포괄한다). 이는 항체를 자연적으로 생산하는 임의의 종으로부터 유래되거나, 또는 재조합 DNA 기술에 의해 생성된다; 혈청, B-세포, 하이브리도마, 트랜스펙토마스(transfectomas), 효모 또는 박테리아로부터 분리되는 지에 상관없이.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 이중특이적 리간드는 항체의 적어도 하나의 단일 중쇄 가변 도메인 및 항체의 하나의 단일 경쇄 가변 도메인, 또는 2개의 단일 중쇄 또는 경쇄 가변도메인을 포함한다. 가령, 리간드는 VH/VL 쌍, VH 도메인 한 쌍 또는 VL 도메인 한 쌍을 포함한다.
이러한 리간드의 첫 번째와 두 번째 가변 도메인은 동일한 폴리펩티드 사슬 상에 존재한다. 대안으로, 이들은 별개의 폴리펩티드 사슬 상에 존재한다. 동일한 폴리펩티드 사슬 상에 존재하는 경우에, 이들은 앞서 기술된 바와 같이 우선적으로, 펩티드 서열인 링커에 의해 연결된다.
첫 번째와 두 번째 가변 도메인은 공유결합 또는 비-공유결합으로 결합된다. 이들이 공유결합된 경우에, 공유결합은 이황화 결합이다.
가변 도메인이 본 명세서에 기술된 파지 전시 기술을 이용하여 선별된 V-유전자 레퍼토리로부터 선택되는 경우에, 이들 가변 도메인은 보편적 프레임워크 영역을 포함하고 본 명세서에 정의된 특이적인 총괄적 리간드에 의해 인식되게 된다. 보편적 프레임워크, 총괄적 리간드 등의 이용은 WO 99/20749에서 기술된다.
V-유전자 레퍼토리가 이용되는 경우에, 폴리펩티드 서열 내에서 변이는 가급적, 가변 도메인의 구조적 루프 내에 위치한다. 가변 도메인의 폴리펩티드 서열은 각 가변 도메인 및 이의 상보적 쌍의 상호작용을 강화시키기 위하여 DNA 셔플링(shuffling) 또는 돌연변이에 의해 변화된다. DNA 셔플링은 당분야에 공지되어 있고, 예로써 Stemmer, 1994 Nature 370:389-391 및 미국 특허 제6,297,053호에서 교시된다. 돌연변이유발의 다른 방법은 당업자에게 널리 알려져 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, “이중특이적 리간드”는 단일 사슬 Fv 단편이다. 본 발명의 대안적 구체예에서, “이중특이적 리간드”는 항체의 Fab 포맷으로 구성된다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 바와 같이 적어도 하나의 ‘이중특이적 리간드’를 인코딩하는 핵산을 제시한다.
당업자는 본 발명의 이러한 측면에 따라, 항원이나 에피토프 모두 동일한 항체 분자에 동시에 결합할 수 있음 인식할 것이다. 대안으로, 이들은 동일한 항체 분자로의 결합에 대해 경쟁한다. 가령, 양쪽 에피토프가 동시에 결합되는 경우에, 이중특이적 리간드의 양쪽 가변 도메인은 그들의 표적 에피토프에 독립적으로 결합할 수 있다. 도메인이 경쟁하는 경우에, 하나의 가변 도메인이 표적에 결합할 수 있지만, 다른 가변 도메인이 동족 표적에 결합할 때와 동시에 결합할 수는 없다; 또는, 첫 번째 가변 도메인은 표적에 결합할 수 있지만, 두 번째 가변 도메인이 동족 표적에 결합할 때와 동시에 결합할 수는 없다.
가변 영역은 표적 항원이나 에피토프를 지향하는 항체로부터 유래될 수 있다. 대안으로, 이들은 섬유상 박테리오파지 표면 상에 발현된 것들과 같은 단일 항체 도메인의 레퍼토리로부터 유래된다. 선별은 아래에 기술된 바와 같이 수행된다.
전반적으로, 본 발명의 수행에 요구되는 핵산 분자와 벡터 구조체는 Sambrook et al.(1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, USA와 같은 표준 실험실 매뉴얼에 기술된 바와 같이 작제되고 조작된다.
본 발명에 유용한 핵산의 조작은 전형적으로, 재조합 벡터에서 수행된다.
따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에서 정의된 적어도 하나의 ‘이중특이적 리간드’를 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 제시한다.
본 명세서에서, 벡터는 이질성 DNA를 이의 발현이나 복제를 위하여 세포 내로 도입하는데 이용되는 별개의 요소를 의미한다. 이와 같은 벡터를 선택하거나 작제하고 이용하는 방법은 당업자에게 널리 알려져 있다. 박테리아 플라스미드, 박테리오파지, 인공 크로모좀, 에피솜 벡터를 비롯한 다수의 벡터가 공개적으로 입수가능하다. 이들 벡터는 단순한 클로닝과 돌연변이유발에 이용될 수 있다; 대안으로, 유전자 발현 벡터가 이용된다. 본 발명에 따라 이용되는 벡터는 전형적으로 0.25 킬로베이스(kb) 내지 40 kb 또는 그 이상의 길이에서 원하는 크기의 폴리펩티드 코딩 서열을 수용하도록 선택된다. 적당한 숙주 세포는 시험관내 클로닝 조작이후 상기 벡터로 형질전환된다. 각 벡터는 다양한 기능적 구성요소를 보유하는데, 여기에는 일반적으로, 클로닝(또는 “폴리링커(polylinker)”) 부위, 복제 기점, 적어도 하나의 선별가능 마커 유전자가 포함된다. 소정의 벡터가 발현 벡터이면, 이는 클로닝 부위의 주변에 각각 위치하는 아래의 구성요소: 인핸서 요소, 프로모터, 전사 종결인자, 신호 서열 중에서 하나이상을 부가적으로 보유하는데, 이들은 본 발명에 따른 폴리펩티드 레퍼토리 구성원을 인코딩하는 유전자에 작동가능하게 연결된다.
클로닝과 발현 벡터 모두 일반적으로, 벡터가 하나이상의 선택된 숙주 세포에서 복제할 수 있도록 하는 핵산 서열을 보유한다. 전형적으로, 클로닝 벡터에서, 이러한 서열은 벡터가 숙주 크로모좀 DNA와 독립적으로 복제할 수 있도록 하는 서열인데, 여기에는 복제 기점 또는 자체적으로 복제하는 서열이 포함된다. 이들 서열은 다양한 박테리아, 효모, 바이러스에서 널리 알려져 있다. 플라스미드 pBR322로부터 복제 기점은 대부분의 그람-음성 박테리아에 적합하고, 2 마이크론 플라스미드 기점은 효모에 적합하고, 다양한 바이러스 기점(가령, SV 40, 아데노바이러스)은 포유동물 세포에서 클로닝 벡터에 유용하다. 일반적으로, 복제 기점은 높은 수준의 DNA를 복제할 수 있는 포유동물 세포, 예를 들면, COS 세포에 이용되는 경우가 아니라면, 포유동물 발현 벡터에 불필요하다.
유리하게는, 클로닝 또는 발현 벡터는 선별가능 마커라고 하는 선별 유전자(selection gene)를 또한, 보유한다. 상기 유전자는 선별적 배양 배지에서 배양되는 형질전환된 숙주 세포의 생존이나 성장에 필요한 단백질을 인코딩한다. 이런 이유로, 선별 유전자를 보유하는 벡터로 형질전환되지 않은 숙주 세포는 상기 배양 배지에서 생존하지 못한다. 전형적인 선별 유전자는 항생제 및 다른 독소, 예를 들면, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 저항성을 공여하거나, 영양요구성 결핍(auxotrophic deficiency)을 보충하거나, 또는 성장 배지에서 가용하지 않은 중요한 영양소를 공급하는 단백질을 인코딩한다. 본 발명에 따른 리간드를 인코딩하는 벡터의 복제가 통상적으로, 대장균(E. coli)에서 수행되기 때문에, 대장균(E. coli)-선별가능 마커, 예를 들면, 항생제 암피실린에 저항성을 공여하는 β-락타마제 유전자가 유용하다. 이들은 대장균(E. coli) 플라스미드, 예를 들면, pBR322, 또는 pUC 플라스미드, 예를 들면, pUC18 또는 pUCl9로부터 획득될 수 있다.
발현 벡터는 통상적으로, 숙주 생물체에 의해 인식되고 목적하는 코딩 서열에 작동가능하게 연결되는 프로모터를 포함한다. 이러한 프로모터는 유도성 또는 구조성이다. “작동가능하게 연결되는”은 앞서 기술된 구성요소가 의도된 방식으로 기능할 수 있도록 하는 관계로 이들 구성요소의 병렬을 의미한다. 코딩 서열에 “작동가능하게 연결되는” 조절 서열은 코딩 서열의 발현이 조절 서열과 조화되는 조건하에 달성되도록 하는 방식으로 결찰된다.
원핵 숙주에 적합한 프로모터는 예로써, β-락타마제와 락토오스 프로모터 시스템, 알칼린 포스파타제, 트립토판(trp) 프로모터 시스템, 하이브리드 프로모터, 예를 들면, tac 프로모터 등이다. 박테리아 체계에 적합한 프로모터는 일반적으로, 코딩 서열에 작동가능하게 연결되는 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 서열을 또한, 포함한다. 선호되는 벡터는 폴리펩티드 라이브러리 구성원에 상응하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 가능하게 하는 발현 벡터이다. 따라서, 첫 번째 및/또는 두 번째 항원이나 에피토프로 선별은 폴리펩티드 라이브러리 구성원을 발현하는 단일 클론의 독립된 증식과 발현에 의해, 또는 임의의 선별 전시 시스템의 이용에 의해 수행될 수 있다. 상기한 바와 같이, 선호되는 선별 전시 시스템은 박테리오파지 전시이다. 따라서, 파지 또는 파지미드 벡터, 예를 들면, pIT1 또는 pIT2가 이용될 수 있다. 본 발명에 유용한 리더 서열은 pelB, stII, ompA, phoA, bla, pelA 등이다. 한가지 실례는 대장균(E. coli) 복제 기점(이중 가닥 복제의 경우) 및 파지 복제 기점(단일 가닥 DNA의 생산의 경우)을 포함하는 파지미드 벡터이다. 이들 벡터의 조작과 발현은 당분야에 널리 공지되어 있다(Hoogenboom and Winter(1992) supra; Nissim et al.(1994) supra). 간단히 말하면, 벡터는 파지미드에 선별성(selectivity)을 공여하는 β-락타마제 및 pelB 리더 서열(이는 발현된 폴리펩티드를 주변세포질 공간으로 지향시킨다), 복수 클로닝 부위(라이브러리 구성원의 뉴클레오티드 이형을 클로닝하기 위하여), 선택적으로, 하나이상의 펩티드 태그(tag)(검출을 위하여), 선택적으로, 하나이상의 TAG 종결 코돈, 파지 단백질 pIII으로 구성되는(N에서 C 말단으로) 발현 카세트의 상류에 lac 프로모터를 포함한다. 따라서, 대장균(E. coli)의 다양한 억제자와 비-억제자 균주를 이용하고 글루코오스, 이소프로필 티오-β-D-갈락토시드(IPTG) 또는 헬퍼 파지(helper phage), 예를 들면, VCS M13을 추가하여, 상기 벡터는 발현 없는 플라스미드로서 복제하거나, 폴리펩티드 라이브러리 구성원만을 대량으로 생산하거나, 또는 파지를 생산할 수 있는데, 이들 파지 중에서 일부는 그들의 표면에 폴리펩티드-pIII 융합의 적어도 하나의 사본을 보유한다.
본 발명에 따른 벡터의 작제는 통상적인 결찰 기술을 이용한다. 분리된 벡터 또는 DNA 단편은 절단되고, 재단되고, 필요한 벡터를 산출하는데 바람직한 형태로 재-결찰된다. 원하는 경우에, 공지된 방식으로, 정확한 서열이 작제된 벡터에 존재하는 지를 확증하는 서열 분석을 수행할 수 있다. 발현 벡터를 작제하고, 시험관내 전사체를 생성하고, DNA를 숙주 세포 내로 도입하고, 발현과 기능을 평가하기 위한 분석을 수행하는데 적합한 방법은 당업자에게 널리 알려져 있다. 샘플 내에 유전자 서열은 통상적인 방법, 예를 들면, 서던 분석(Southern analysis)이나 노던 분석(Northern analysis), 웨스턴 블랏팅(Western blotting), DNA, RNA 또는 단백질의 다트 블랏팅(dot blotting), in situ 혼성화(hybridization), 면역세포화학(immunocytochemistry) 또는 핵산이나 단백질 분자의 서열 분석에 의해 존재가 검출되고, 이의 증폭 및/또는 발현이 정량된다. 당업자는 원하는 경우에, 이들 방법을 편의하게 수정될 수 있다.
*닫힌 형태 다중특이적 리간드의 구조
본 발명의 두 번째 배치의 한 측면에 따라, 2개 이상의 비-상보성 에피토프 결합 도메인은 본 명세서에 정의된 닫힌 형태가 되도록 연결된다. 대안으로, 이들은 본 명세서에 정의된 링커의 대안으로, 또는 이러한 링커에 부가하여, 서로 간에 에피토프 결합 부위의 닫힌 형태의 형성 및/또는 유지를 조장하는 골격에 더욱 부착된다.
(Ⅰ) 골격
골격은 면역글로불린 분자 상에 기초하거나, 또는 앞서 기술된 기원의 비-면역글로불린이다. 본 명세서에 정의된 바람직한 면역글로불린 골격은 아래에서 선택되는 것들 중에서 하나이상을 포함한다: 적어도 (ⅰ) 항체의 CL(카파 또는 람다 하위집합) 도메인; 또는 (ⅱ) 항체 중쇄의 CH1 도메인; 항체 중쇄의 CH1과 CH2 도메인을 포함하는 면역글로불린 분자; 항체 중쇄의 CH1, CH2, CH3 도메인을 포함하는 면역글로불린 분자; 또는 항체의 CL(카파 또는 람다 하위집합) 도메인과 공동으로 임의의 부분집합 (ⅱ). 힌지 영역 도메인 역시 포함될 수 있다. 도메인의 이러한 조합은 예로써, IgG 또는 IgM와 같은 자연 항체, 또는 Fv, scFv, Fab 또는 F(ab')2 분자와 같은 이의 단편을 모방한다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 상기 목록은 결코 한정적으로 의도되지 않는다.
(Ⅱ) 단백질 뼈대
각 에피토프 결합 도메인은 단백질 뼈대 및 하나이상의 에피토프와 도메인의 특이적 상호작용에 관여하는 하나이상의 CDR을 포함한다. 대안으로, 본 발명에 따른 에피토프 결합 도메인은 3개의 CDR을 포함한다. 적절한 단백질 뼈대는 아래와 같이 구성된 군으로부터 선택된다: 면역글로불린 도메인에 기초한 뼈대, 피브로넥틴에 기초한 뼈대, 어피바디(affibody)에 기초한 뼈대, CTLA4에 기초한 뼈대, GroEL과 같은 샤페론에 기초한 뼈대, 리포칼린에 기초한 뼈대, 박테리아 Fc 수용체 SpA와 SpD에 기초한 뼈대. 당업자는 상기 목록이 결코 한정적으로 의도되지 않음을 인식할 것이다.
F: 이중특이적 리간드를 작제하는데 유용한 뼈대
주요-사슬 형태의 선별
면역글로불린 대과의 구성원 모두 폴리펩티드 사슬에 대한 유사한 폴드를 공유한다. 가령, 항체가 그들의 1차 서열의 관점에서 매우 다양하긴 하지만, 서열 비교 및 결정학적 구조에서, 예측과는 대조적으로, 항체의 6개 항원 루프 중에서 5개(H1, H2, L1, L2, L3)가 제한된 수의 주요-사슬 형태(main-chain conformation) 또는 정준 구조(canonical structure)를 보유하는 것으로 밝혀졌다(Chothia and Lesk(1987) J. Mol. Biol., 196: 901; Chothia et al.(1989) Nature, 342: 877). 이런 이유로, 루프 길이와 핵심 잔기의 분석으로, 대부분의 인간 항체에서 발견되는 H1, H2, L1, L2, L3의 주요-사슬 형태를 예측할 수 있다(Chothia et al.(1992) J. Mol. Biol., 227: 799; Tomlinson et al.(1995) EMBO J., 14: 4628; Williams et al.(1996) J. Mol. Biol., 264: 220). 비록, H3 영역이 서열, 길이, 구조의 관점에서 더욱 다양하긴 하지만(D 분절의 이용에 기인함), 이는 항원 결합 루프와 항체 프레임워크 내에 핵심 위치에서 특정 잔기의 길이와 존재, 또는 잔기의 유형에 좌우되는 짧은 루프 길이를 위한 제한된 수의 주요-사슬 형태를 형성한다(Martin et al.(1996) J. Mol. Biol., 263: 800; Shirai et al.(1996) FEBS Letters, 399: 1).
유리하게는, 본 발명의 이중특이적 리간드는 VH 도메인 라이브러리 및/또는 VL 도메인 라이브러리와 같은 도메인 라이브러리로부터 집합된다. 게다가, 본 발명의 이중특이적 리간드는 자체로써, 라이브러리 형태로 제공된다. 본 발명의 한 측면에서, 이중특이적 리간드 및/또는 도메인의 라이브러리는 구성원의 주요-사슬 형태가 확인되도록 담보하는 특정 루프 길이 및 중요 잔기가 선별되도록 설계된다. 유리하게는, 이들은 앞서 기술된 바와 같이 비-기능성 기회를 최소화하기 위하여 자연에서 발견되는 면역글로불린 대과 분자의 실제 형태이다. 생식세포계 V 유전자 분절은 항체 또는 T-세포 수용체를 작제하기 위한 적절한 기본 프레임워크로서 기능한다; 다른 서열 역시 이용된다. 변이는 낮은 빈도로 발생하고, 따라서 적은 수의 기능적 구성원이 기능에 영향을 주지 않는 변화된 주요-사슬 형태를 보유한다.
정준 구조 이론은 리간드 서열에 기초한 주요-사슬 형태를 예측하고 정준 구조에 영향을 주지 않는 다양화를 위한 잔기를 선택하기 위하여, 리간드에 의해 인코딩된 많은 상이한 주요-사슬 형태를 평가하는 데에도 이용된다. 인간 VK 도메인 내에서, L1 루프는 4개의 정준 구조 중에서 하나를 채택하고, L2 루프는 단일 정준 구조를 보유하고, 인간 VK 도메인의 90%는 L3 루프에 대한 4개 또는 5개의 정준 구조 중에서 하나를 채택하는 것으로 알려져 있다(Tomlinson et al. (1995) supra); 따라서, 단독의 VK 도메인 내에서, 상이한 정준 구조를 통합하여 일련의 상이한 주요-사슬 형태를 생성할 수 있다. Vλ 도메인이 L1, L2, L3 루프에 대한 상이한 범위의 정준 구조를 인코딩하고 VK와 Vλ 도메인이 H1과 H2 루프에 대한 여러 정준 구조를 인코딩할 수 있는 VH 도메인과 쌍을 이룰 수 있다는 점에서, 이들 5개 루프에서 관찰된 많은 정준 구조 조합의 수는 매우 크다. 이는 주요-사슬 형태에서 다양성의 생성이 광범위한 결합 특이성의 생성에 필수적임을 의미한다. 하지만, 공지된 단일 주요-사슬 형태에 기초한 항체 라이브러리를 작제함으로서, 예측과 대조적으로, 주요-사슬 형태에서 다양성이 모든 항원을 실질적으로 표적할 만큼 충분한 다양성을 생성하는데 필요하지 않은 것으로 밝혀졌다. 더욱 놀랍게는, 단일 주요-사슬 형태는 컨센서스 구조일 필요가 없다 - 단일 자연 발생적 형태는 전체 라이브러리에 대한 기초로서 이용될 수 있다. 따라서, 바람직한 측면에서, 본 발명의 이중특이적 리간드는 공지된 단일 주요-사슬 형태를 보유한다.
적절하게는, 선택된 단일 주요-사슬 형태는 문제되는 면역글로불린 대과 유형의 분자에서 공통적이다. 유의한 수의 자연 발생적 분자가 이를 채택한 것으로 관찰되면 형태는 공통적이다. 따라서, 본 발명의 바람직한 측면에서, 면역글로불린 도메인의 각 결합 루프에 대한 상이한 주요-사슬 형태의 자연적 발생은 별개로 간주되고, 이후 상이한 루프에 대한 주요-사슬 형태의 원하는 조합을 보유하는 자연 발생 가변 도메인이 선택된다. 어떤 것도 가능하지 않으면, 가장 가까운 등가물이 선택된다. 상이한 루프에 대한 주요-사슬 형태의 원하는 조합은 원하는 주요-사슬 형태를 인코딩하는 생식세포계 유전자 분절을 선별함으로서 생성되는 것이 바람직하다. 선별된 생식세포계 유전자 분절이 자연적으로 빈번하게 발현되는 것이 더욱 바람직하고, 이들이 모든 자연 생식세포계 유전자 분절 중에서 가장 빈번하게 발현되는 것이 가장 바람직하다.
이중특이적 리간드 또는 이들의 라이브러리를 설계할 때, 6개의 항원 결합 루프 각각에 대한 상이한 주요-사슬 형태의 발생률은 개별적으로 고려된다. H1, H2, L1, L2, L3의 경우에, 자연 발생적 분자의 항원 결합 루프의 20% 내지 100%가 선택되는 소정의 형태가 채택된다.
전형적으로, 관찰된 발생률은 35% 이상(즉, 35% 내지 100%)이고, 이상적으로는 50% 이상 또는 65% 이상이다. 상당수의 H3 루프가 정준 구조를 갖지 않기 때문에, 정준 구조를 전시하는 루프 중에서 공통적인 주요-사슬 형태를 선별하는 것이 바람직하다. 따라서, 각 루프에서, 자연적 레퍼토리 내에서 가장 빈번하게 관찰되는 형태가 선별된다. 인간 항체에서, 각 루프에 대한 가장 일반적인 정준 구조(CS)는 아래와같다: H1 - CS 1(발현된 레퍼토리의 79%), H2 - CS 3(46%), VK의 L1 - CS 2(39%), VK의 L2 - CS 1(100%), VK의 L3 - CS 1(36%)(계산은 70 : 30의 κ: λ 비율을 가정한다)(Hood et al. (1967) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 48:133). 정준 구조를 갖는 H3 루프의 경우에, 잔기 94 내지 잔기 101의 염-가교(salt-bridge)를 갖는 7개 잔기의 CDR3 길이(Kabat et al. (1991) Sequences of proteins of immuological interest U.S. Department of Health and Human Services)가 가장 일반적인 것으로 보인다. 이런 형태를 형성하기 위한 필요한 H3 길이 및 중요 잔기를 갖는 EMBL 데이터 라이브러리 내에 적어도 16개의 인간 항체 서열 및 항체 모델링을 위한 기초로서 이용될 수 있는 단백질 데이터은행 내에 적어도 2개의 결정학적 구조가 존재한다(2cgr 및 1tet). 가장 빈번하게 발현되는 생식세포계 유전자 분절에서, 정준 구조의 이러한 조합은 VH 분절 3-23(DP-47), JH 분절 JH4b, VK 분절 O2/O12(DPK9) 및 JK 분절 JK1이다. VH 분절 DP-47과 DP38 역시 적합하다. 이런 이유로, 이들 분절은 원하는 단일 주요-사슬 형태를 갖는 라이브러리를 작제하는 기초로서 조합적으로 이용될 수 있다.
대안으로, 분리된 각 결합 루프에 대한 상이한 주요-사슬 형태의 자연적 발생에 기초하여 단일 주요-사슬 형태를 선택하는 대신에, 주요-사슬 형태 조합의 자연적 발생은 단일 주요-사슬 형태를 선택하기 위한 기초로서 이용된다. 항체의 경우에, 예로써 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 모두의 항원 결합 루프에 대한 정준 구조 조합의 자연적 발생이 결정될 수 있다. 이 시점에서, 선택된 형태가 자연 발생적 항체에서 공통적인 것이 바람직하고, 자연적 레퍼토리 내에서 가장 빈번하게 관찰되는 것이 가장 바람직하다. 따라서, 인간 항체에서, 예로써 5개 항원 결합 루프, H1, H2, L1, L2, L3의 자연적 조합이 고려되면, 정준 구조의 가장 빈번한 결합이 결정되고, 이후 단일 주요-사슬 형태를 선택하는 기초로서, H3 루프에 대한 가장 일반적인 형태와 통합된다.
ⅱ. 정준 서열의 다양화
여러 공지된 주요-사슬 형태 또는 바람직하게는, 공지된 단일 주요-사슬 형태를 선별할 때, 구조적 및/또는 기능적 다양성을 갖는 레퍼토리를 생성하기 위하여 본 발명에 따른 이중특이적 리간드 또는 본 발명에 이용되는 라이브러리는 분자의 결합 부위를 변화시킴으로서 작제될 수 있다. 이는 변이체가 일련의 활성을 제공할 수 있고 구조 및/또는 기능에서 충분한 다양성을 보유하도록 변이체가 생성됨을 의미한다.
원하는 다양성은 전형적으로, 하나이상의 위치에서 선별된 분자를 변이시킴으로서 생성된다. 변화되는 위치는 무작위로 선별될 수 있거나, 또는 바람직하게는, 선별된다. 이후, 변이는 거주 아미노산을 임의의 자연이나 합성 아미노산 또는 이의 유사체로 대체하여 많은 변이체를 생성하는 무작위화에 의해, 또는 거주 아미노산을 아미노산의 하나이상의 정의된 부분집합으로 대체하여 더욱 제한된 수의 변이체를 생성함으로서 달성될 수 있다.
이러한 다양성을 도입하는 다양한 방법이 보고되었다. 실수 유발 PCR(Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226:889), 화학적 돌연변이유발(Deng et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9533) 또는 박테리아 돌연변이유발 균주(Low et al. (1996) J. Mol. Biol. 260:359)를 이용하여 분자를 인코딩하는 유전자 내로 무작위 돌연변이를 도입할 수 있다. 또한, 선별된 위치를 돌연변이시키는 방법은 당분야에 널리 공지되어 있고, PCR을 이용하여 또는 PCR의 이용 없이 부정합된 올리고뉴클레오티드 또는 축퇴성 올리고뉴클레오티드의 이용을 포함한다. 가령, 항원 결합 루프에 돌연변이를 표적함으로서 여러 합성 항체 라이브러리가 산출되었다. 인간 파상풍 톡소이드-결합 Fab의 H3 영역은 무작위화되어 일련의 새로운 결합 특이성을 산출한다(Barbas et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4457). 무작위 또는 반-무작위 H3과 L3 영역은 생식세포계 V 유전자 분절에 부가되어 돌연변이화되지 않은 프레임워크 영역을 갖는 대형 라이브러리를 산출한다(Hoogenboom & Winter (1992) J. Mol. Biol. 227:381; Barbas et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4457; Nissim et al. (1994) EMBO J. 13:692; Griffiths et al. (1994) AEMBO J 13:3245; De Kruif et al. (1995) J. Mol. Biol. 248:97). 이러한 다양화는 다른 항원 결합 루프의 일부 또는 전체를 포함하도록 확대된다(Crameri et al. (1996) Nature Med. 2:100; Riechmann et al. (1995) Bio/Technology 13:475; Morphosys, WO 97/08320, supra). 루프 무작위화가 H3 단독에 대한 대략 1015개 이상의 구조물 및 다른 5개 루프에 대한 유사하게 많은 변이체를 생성하는 잠재력을 갖고 있기 때문에, 현재의 형질전환 기술을 이용하거나 세포 없는 시스템을 이용함으로써 모든 가능한 조합을 나타내는 라이브러리를 생성하는 것은 불가능하다. 가령, 현재까지 작제된 최대 라이브러리중의 하나에서, 이러한 설계의 라이브러리에 대한 잠재력 다양성의 극히 일부인 6x1010개의 상이한 항체가 생성되었다(Griffiths et al. (1994) supra).
바람직한 구체예에서, 분자의 원하는 기능을 생성하거나 변형시키는데 직접적으로 관여하는 잔기만이 다양화된다. 많은 분자에서, 기능이 표적에 결합되기 때문에, 다양성은 표적 결합 부위 내에 집중되고, 분자의 전체 패킹에 중요한 잔기를 변화시키는 것을 피하거나 선택된 주요-사슬 형태를 유지시킨다.
항체 도메인에 적용시 정준 서열의 다양화
항체 이중특이적 리간드의 경우에, 표적에 대한 결합 부위는 가장 빈번한 항원 결합 부위이다. 따라서, 매우 바람직한 측면에서, 본 발명은 항원 결합 부위 내에 이들 잔기만 변화된 항체 이중특이적 리간드의 라이브러리 또는 집합을 제공한다. 이들 잔기는 인간 항체 레퍼토리 내에서 매우 다양하고, 높은-분해 항체/항원 복합체 내에서 접촉을 유도하는 것으로 알려져 있다. 가령, L2 내에서, 위치 50과 53은 자연 발생 항체에서 다양한 것으로 알려져 있고, 항원과의 접촉을 유도하는 것으로 관찰되었다.
대조적으로, 통상의 접근법은 Kabat et al. (1991, supra)에 의해 정의된 바와 같이 상응하는 상보성 결정 부위(Complementarity Determining Region, CDR1)에서 전체 잔기를 다양화시키는데, 대략 7개 잔기는 본 발명에 따라 이용되는 라이브러리 내에서 2개 잔기가 다양화되는 것과 비교된다. 이는 일련의 항원 결합 특이성을 생성하는데 필요한 기능적 다양성의 관점에서 유의적인 개선을 나타낸다.
자연 상태에서, 항체 다양성은 2가지 과정의 결과이다: 고유의 1차 레퍼토리(소위, 생식세포계 및 접합적 다양성)를 생성하는 생식세포계 V, D, J 유전자 분절의 체세포성 재조합 및 결과의 재배열된 V 유전자의 체세포성 과돌연변이(hypermutation). 인간 항체 서열의 분석에서, 1차 레퍼토리 내의 다양성은 항원 결합 부위의 중심에 집중되는 반면 체세포성 과돌연변이는 1차 레퍼토리 내에서 고도로 보존된 항원 결합 부위의 주변에서 영역으로 다양성을 확산시킨다(참조: Tomlinson et al. (1996) J. Mol. Biol. 256:813). 이러한 상보성은 서열 공간을 검색하기 위한 효과적인 전략으로서 발달되었는데, 이는 항체에 명백하게 독특하지만, 다른 폴리펩티드 레퍼토리에 용이하게 적용될 수 있다. 변화되는 잔기는 표적에 대한 결합 부위를 형성하는 것들의 부분집합이다. 표적 결합 부위 내에 잔기의 상이한(중복 포함) 부분집합은 원하는 경우에, 선별 동안 상이한 단계에서 다양화된다.
항체 레퍼토리의 경우에, 항원 결합 부위 내에 전체가 아닌 일부 잔기가 다양화된 초기 “고유” 레퍼토리가 생성된다. 본 명세서에서, “고유”는 미리-결정된 표적을 갖지 않는 항체 분자를 의미한다. 이들 분자는 태아와 신생아 개체에서처럼 면역 다양화(immune diversification)를 겪지 않고, 면역계이 다양한 항원 자극에 의해 공격되지 않은 개체의 면역글로불린 유전자에 의해 인코딩되는 것들과 유사하다. 이후, 이러한 레퍼토리는 일련의 항원이나 에피토프에 대해 선별된다. 필요한 경우에, 추가의 다양성이 초기 레퍼토리 내에서 다양화된 영역 외부에 도입될 수 있다. 이러한 성숙된 레퍼토리는 변형된 기능, 특이성 또는 친화력에 대해 선별될 수 있다.
본 발명은 항원 결합 부위 내에 일부 또는 전체 잔기가 변이된 이중특이적 리간드, 또는 이중특이적 리간드의 고유 레퍼토리의 작제를 위한 결합 도메인의 2가지 상이한 고유 레퍼토리를 제공한다. 이러한 “1차” 라이브러리는 생식세포계 V 유전자 분절 내에서 다양한(생식세포계 다양성) 또는 재조합 과정 동안 다양화된(접합성 다양성) 항원 결합 부위의 중심에서 잔기에 국한된 다양성으로, 자연적 1차 레퍼토리를 모방한다. 다양화되는 잔기는 H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H96, H97, H98, L50, L53, L91, L92, L93, L94 및 L96을 포함하나 이들에 한정되지 않는다. “체세포성” 라이브러리에서, 다양성은 재조합 과정 동안 다양화된(접합성 다양성) 또는 매우 체세포성으로 돌연변이된 잔기에 국한된다. 다양화되는 잔기는 H31, H33, H35, H95, H96, H97, H98, L30, L31, L32, L34 및 L96을 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 이들 라이브러리 내에서 다양화에 적합한 앞서 언급된 모든 잔기는 하나이상의 항체-항원 복합체에서 접촉을 유도하는 것으로 알려져 있다. 둘 모두의 라이브러리에서 항원 결합 부위 내의 모든 잔기가 변하는 것은 아니기 때문에, 바람직한 경우에 잔여 잔기를 변화시킴으로써 추가의 다양성이 선별 동안 통합된다. 이들 잔기의 임의의 부분집합(또는 항원 결합 부위를 포함하는 추가 잔기)이 항원 결합 부위의 초기 및/또는 후속 다양화에 이용될 수 있음은 당업자에게 명확하다.
본 발명에 이용되는 라이브러리의 작제에서, 선별된 위치의 다양화는 전형적으로, 다수의 상이한 아미노산(총 20개 또는 이의 부분집합)이 상기 위치에 통합될 수 있도록 폴리펩티드의 서열을 지정하는 코딩 서열을 변경함으로써, 핵산 수준에서 달성된다. IUPAC 명명법을 이용하여, 가장 다목적인 코돈은 NNK인데, 이는 전체 아미노산뿐만 아니라 TAG 종결 코돈을 인코딩한다. 적절하게는, NNK 코돈은 필요한 다양성을 도입하기 위하여 이용된다. NNK 코돈을 비롯하여 동일한 결과를 달성하는 다른 코돈 역시 추가의 종결 코돈 TGA와 TAA의 생성을 유도하는데 이용된다.
인간 항체의 항원 결합 부위에서 측쇄 다양성의 특징은 특정 아미노산 잔기를 선호하는 뚜렷한 성향이다. 각각의 VH, Vκ, Vλ 영역에서 최대 10개의 다양한 위치의 아미노산 조성물이 합계되면, 76% 이상의 측쇄 다양성은 단지 7개의 다른 잔기로부터 유래하고, 이들은 세린(24%), 티로신(14%), 아스파라긴(11%), 글리신(9%), 알라닌(7%), 아스파르트산염(6%), 트레오닌(6%)이다. 주요-사슬 유연성을 제공할 수 있는 친수성 잔기와 작은 잔기를 향한 이러한 성향은 광범위한 항원이나 에피토프에 쉽게 결합하는 표면의 진화를 반영하고, 1차 레퍼토리에서 항체의 필요한 무차별성을 설명하는데 도움이 된다.
이러한 아미노산 분포를 모방하는 것이 바람직하기 때문에, 변이되는 위치에서의 아미노산 분포는 가급적, 항체의 항원 결합 부위에서 나타난 것을 모방한다. 일련의 표적 항원에 대한 특정 폴리펩티드(항체 폴리펩티드만이 아닌)의 선별을 가능하게 하는 아미노산의 치환의 이러한 성향은 임의의 폴리펩티드 레퍼토리에 용이하게 적용된다. 변이되는 위치에서 아미노산 분포를 한쪽으로 치우치게 하는 다양한 방법이 존재하는데(트리-뉴클레오티드 돌연변이유발을 포함, WO 97/08320 참조), 이중에서 선호되는 방법은 합성의 용이성으로 인해, 통상의 축퇴성 코돈을 이용하는 것이다. 축퇴된 코돈의 모든 조합(각 위치에서의 동등한 비율의 단일, 이중, 삼중, 사중 축퇴성)에 의해 인코딩된 아미노산 프로필을 자연 아미노산 이용과 비교함으로서, 가장 대표적인 코돈을 계산하는 것이 가능하다. 코돈 (AGT)(AGC)T, (AGT)(AGC)C, (AGT)(AGC)(CT) - 다시 말하면, IUPAC 명명법을 이용하여 각각 DVT, DVC, DVY - 는 원하는 아미노산 프로필에 가장 근접한 것이다; 이들은 22% 세린 및 11% 티로신, 아스파라긴, 글리신, 알라닌, 아스파라긴산염, 트레오닌 및 시스테인을 인코딩한다. 적절하게는, 라이브러리는 각각의 다양화된 위치에서 DVT, DVC 또는 DVY 코돈을 이용하여 작제된다.
G. 리간드 반감기를 증가시킬 수 있는 항원
본 발명의 한 배치에서, 본 발명에 따른 이중특이적 리간드는 생체내에서 리간드의 반감기를 증가시킬 수 있는 하나이상의 분자에 결합할 수 있다. 전형적으로, 이들 분자는 생체내에서 자연적으로 발생하고, 생물체로부터 원치 않는 물질을 제거하는 내생적 기전에 의한 분해 또는 제거에 저항하는 폴리펩티드이다. 가령, 생물체의 반감기를 증가시키는 분자는 아래에서 선택된다:
세포외 매트릭스로부터 단백질: 예를 들면, 콜라겐, 라미닌, 인테그린, 피브로넥틴. 콜라겐은 세포외 매트릭스의 중요 단백질이다. 대략 15가지 유형의 콜라겐 분자가 현재 알려져 있고 신체의 상이한 부위에서 발견되는데, 예를 들면, I형 콜라겐(신체 콜라겐의 90%)은 뼈, 피부, 건, 인대, 각막, 내부 기관 내에서 발견되고, II형 콜라겐은 연골, 무척추동물 디스크, 척삭, 눈 유리액에서 발견된다.
혈액 내에서 발견되는 단백질: 예를 들면, 피브린, α-2 마크로글로불린, 혈청 알부민, 피브리노겐 A, 피브리노겐 B, 혈청 아밀로이드 단백질 A, 헵타글로빈, 프로필린, 유비퀴틴, 우테로글로불린, β-2-마이크로글로불린과 같은 플라스마 단백질; 플라스미노겐, 리소자임, 시스타틴 C, 알파-1-안티티로신, 췌장 트립신 저해제와 같은 효소 및 저해제. 플라스미노겐은 트립신-유사 세린 프로테아제 플라스민의 불활성 전구체이다. 이는 통상적으로, 혈류를 통한 순환하는 것으로 발견된다. 플라스미노겐은 활성화되고 플라스민으로 전환되면 혈전 내에 혈액 세포를 얽히게 하는 피브리노겐 섬유를 분해시키는 강력한 효소 도메인을 전개한다. 이는 섬유소 용해(fibrinolysis)로 불린다.
IgE, IgG, IgM과 같은 면역계 단백질.
레티놀 결합 단백질, α-1 마이크로글로불린과 같은 운반 단백질.
베타-디펜신(defensin) 1, 호중구 디펜신 1, 2, 3과 같은 디펜신.
*멜라노콜틴(melanocortin) 수용체, 미엘린, 아스코르베이트 운반체와 같은 뇌 혈관 장벽 또는 신경 조직에서 발견되는 단백질.
트랜스페린(transferrin) 수용체 특이적 리간드-신경약제 융합 단백질(미국 특허 제5,977,307호 참조): 뇌 모세혈관 내피세포 수용체, 트랜스페린, 트랜스페린 수용체, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자 1(IGF 1) 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 2(IGF 2) 수용체, 인슐린 수용체.
폴리시스틴, Ⅳ형 콜라겐, 유기 음이온 운반체 K1, 헤이만(Heymann) 항원과 같은 신장에 집중되는 단백질.
알코올 탈수소효소, G250과 같은 간에 집중되는 단백질.
혈액 응고 인자 X
α1 안티트립신
HNF 1α
분비 성분(IgA에 결합)과 같은 폐에 집중되는 단백질.
예로써 HSP 27과 같은 심장에 집중되는 단백질. 이는 팽창된 심근증에 관련된다.
케라틴과 같은 피부에 집중되는 단백질.
골형성(osteogenic) 활성을 나타내는 형질전환 성장 인자 β 대과의 부분집합인 뼈 형태발생 단백질(BMP)과 같은 뼈 특이적 단백질.
실례는 BMP-2, -4, -5, -6, -7(골형성 단백질(OP-1)), -8(OP-2) 등이다.
인간 영양배엽(trophoblast) 항원, 헤르셉틴(herceptin) 수용체, 오에스트로젠(oestrogen) 수용체, 카텝신(cathepsin), 예를 들면, 카텝신 B(간과 비장에서 발견됨)를 비롯한 종양 특이적 단백질.
활성화된 T-세포 상에서만 발현되는 항원과 같은 질병-특이적 단백질; LAG-3(림프구 활성 유전자), 오스테오프로테게린(osteoprotegerin) 리간드(OPGL)(참조: Nature 402:304-309; 1999), OX40(활성화된 T 세포 및 인간 T-세포 백혈병 바이러스 Ⅰ형(HTLV-Ⅰ)-생성 세포 내에서 특이적으로 상향-조절되는 것으로 알려진 동시자극성 T 세포 분자 상에서만 발현되는 TNF 수용체 계통의 구성원)(참조: J. Immunol. 2000 Jul 1;165(1):263-70); CG6512 초파리, 인간 파라플레긴, 인간 FtsH, 인간 AFG3L2, 쥐 ftsH를 비롯한 메탈로프로테아제(metalloprotease)(관절염/암과 연관됨); 산성 섬유아세포 성장 인자(FGF-1), 염기성 섬유아세포 성장 인자(FGF-2), 혈관 내피 성장 인자/혈관 투과성 인자(VEGF/VPF), 형질전환 성장 인자-α(TGF-α), 종양 괴사 인자-알파(TNF-α), 안지오제닌, 인터루킨-3(IL-3), 인터루킨-8(IL-8), 혈소판-유도된 내피 성장 인자(PD-ECGF), 태반 성장 인자(PlGF), 미드킨 혈소판-유도된 성장 인자-BB(PDGF), 프랙탈킨을 비롯한 혈관생성 성장 인자.
스트레스 단백질(열 충격 단백질)
HSP는 통상적으로, 세포내에서 발견된다. 이들이 세포외에서 발견되면, 이는 세포가 사멸하고 내용물이 유출되었다는 지표이다. 이러한 예정되지 않은 세포 사멸(괴사)은 외상, 질병 또는 손상의 결과로서만 발생하고, 따라서 생체내에서 세포외 HSP는 감염 및 질병에 저항하는 면역계로부터의 반응을 유인한다. 세포외 HSP에 결합하는 이중특이체는 질병 부위에 집중될 수 있다.
Fc 운반에 관여하는 단백질.
브람벨(brambell) 수용체(FcRB로 알려짐)
이러한 Fc 수용체는 2가지 기능을 갖는데, 양쪽 모두는 운반에 잠재적으로 유용하다. 이들 기능은 (1) 태반을 가로질러 모친으로부터 자식으로 IgG의 운반 및 (2) 분해로부터 IgG를 보호하여 IgG의 혈청 반감기 증가이다. 상기 수용체는 엔도솜으로부터 IgG를 재활용하는 것으로 생각된다(참조: Holliger et al., Nat Biotechnol 1997 Jul;15(7):632-6).
본 발명에 따른 리간드는 생체내 반감기의 증가를 필요로 하지 않거나 이를 증가시키지 않으면서 상기 표적에 특이적이도록 설계된다. 가령, 본 발명에 따른 리간드는 조직-특이적인 앞서 기술된 것들로부터 선별되는 표적에 특이적일 수 있고, 따라서 반감기 증가의 유무에 상관없이, 이중특이적 리간드, 또는 치료적으로 적절한 조직-특이적 표적에 결합하는 dAb 단량체의 조직-특이적 표적화(targeting)를 가능하게 한다. 게다가, 리간드 또는 dAb 단량체가 신장 또는 간을 표적하는 경우에, 이는 리간드 또는 dAb 단량체를 대안적인 생체내 제거(clearance) 경로로 재지향시킨다(가령, 리간드는 간 제거로부터 신장 제거로 지향된다).
생체내 반감기를 증가시키는 다른 접근법:
한 특이성이 항체 폴리펩티드 구조체의 혈청 반감기를 증가시키는 표적 단백질을 지향하는 이중특이적 리간드의 설계에 더하여, 본 명세서에 기술된 항체 폴리펩티드는 혈청 반감기를 증가시키는 화학적 부분(chemical moiety)에 연쇄에 의해 더욱 안정화될 수 있다. 항체 분자의 약동학에서 개선을 제공하기 위하여, 본 발명은 증가된 안정성과 반감기를 제공하는 중합체에 연결된 단일 도메인 가변 영역 폴리펩티드를 제시한다. 중합체 분자(가령, 폴리에틸렌 글리콜; PEG)의 단백질로의 부착은 충분히 확립되어 있고, 변형된 단백질의 약동학적 특성을 조절하는 것으로 밝혀졌다. 가령, 단백질의 PEG 변형은 생체내 순환 반감기, 항원성, 용해성, 단백질의 단백분해에 대한 저항성을 변화시키는 것으로 밝혀졌다(Abuchowski et al., J. Biol. Chem. 1977, 252:3578; Nucci et al., Adv. Drug Delivery Reviews 1991, 6:133; Francis et al., Pharmaccutical Biotechnology Vol.3(Borchardt, R. T. ed.); Stability of Protein Pharmaceuticals: in vivo Pathways of Degradation and Strategies for Protein Stabilization 1991 pp235-263, Plenum, NY).
단백질 분자의 부위-특이적 PEG화와 무작위 PEG화는 당분야에 공지되어 있다(참조: Zalipsky and Lee, Poly(ethYlene glycol) Chemiskv: Biotechnical and Biomedical Applications 1992, pp 347-370, Plenum, NY; Goodson and Katre, 1990, Bio/Technology, 8:343; Hershfield et al., 1991, PANS 88:7185). 더욱 구체적으로, 항체 분자의 무작위 PEG화는 리신 잔기와 티올화된 유도체에서 기술되었다(Ling and Mattiasson, 1983, Immunol. Methods 59: 327; Wilkinson et al., 1987, Immunol. Letters, 15: 17; Kitamura et al., 1991, Cancer Res. 51:4310; Delgado et al., 1996 Br.J. Cancer, 73: 175; Pedley et al., 1994, Br.J. Cancer,70:1126).
PEG화 방법은 아래에 기술된다. 항체 폴리펩티드, 특히 dAb의 PEG화의 구체적인 실례 역시 2004년 6월 30일자로 제출된 동시 출원 PCT/GB2004/002829 및 2004년 1월 8일자로 제출된 미국 가출원 60/535,076에서 제시된다.
친화력/활성 결정:
본 명세서에 기술된 분리된 단일 도메인 항체(가령, dAb) 폴리펩티드는 적어도 300 nM 이하, 바람직하게는 적어도 300 nM - 50 pM, 200 nM - 50 pM, 더욱 바람직하게는 적어도 100 nM - 50 pM, 75 nM - 50 pM, 50 nM - 50 pM, 25 nM - 50 pM, 10 nM - 50 pM, 5 nM - 50 pM, 1 nM - 50 pM, 950 pM - 50 pM, 900 pM - 50 pM, 850 pM - 50 pM, 800 pM - 50 pM, 750 pM - 50 pM, 700 pM - 50 pM, 650 pM - 50 pM, 600 pM - 50 pM, 550 pM - 50 pM, 500 pM - 50 pM, 450 pM - 50 pM, 400 pM - 50 pM, 350 pM - 50 pM, 300 pM - 50 pM, 250 pM - 50 pM, 200 pM - 50 pM, 150 pM - 50 pM, 100 pM - 50 pM, 90 pM - 50 pM, 80 pM - 50 pM, 70 pM - 50 pM, 60 pM - 50 pM, 또는 대략 50 pM의 친화력(분리 상수, Kd, = Koff/Kon,)을 갖는다.
가변 도메인 폴리펩티드의 항원-결합 친화력은 BIAcore 시스템(Pharmacia Biosensor, Piscataway, N.J.)을 이용한 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance, SPR))으로 통상적으로 측정할 수 있다. 상기 방법에서, 항원은 공지된 농도에서 BIAcore 칩에 결합되고, 가변 도메인 폴리펩티드가 도입된다. 가변 도메인 폴리펩티드와 고정된 항원 사이의 특이적인 결합은 칩 매트릭스에서 증가된 단백질 농도 및 SPR 신호에서 변화를 유도한다. SPR 신호에서 변화는 공명 단위(RU)로서 기록되고, 센서그램(sensorgram)의 Y축을 따라 시간에 관해서 전시된다. 기준 신호(baseline signal)는 칩을 통과하는 용매(가령, PBS) 단독에서 획득된다. 기준 신호와 가변 도메인 폴리펩티드 주입의 완결이후 신호사이의 순수한 차이는 소정의 샘플의 결합 수치를 나타낸다. 오프 속도(off rate, Koff), 온 속도(on rate, Kon), 분리 속도(Kd) 상수를 결정하기 위하여, BIAcore 동적 평가 소프트웨어(가령, version 2.1)가 이용된다.
높은 친화력은 항원의 표면 및 항체 또는 항체 단편의 CDR 사이의 상보성(complementarity)에 좌우된다. 상보성은 표적의 일부분과 CDR 사이의 가능한 분자 상호작용, 예를 들면, 잠재적 이온 상호작용, 판 데르 발스 상호작용, 수소 결합, 또는 나타날 수 있는 다른 상호작용의 유형과 강도에 의해 결정된다. CDR3은 아마도, 긍정적인 표면 상호작용을 위한 더욱 많은 기회를 제공하는 전반적으로 더욱 큰 크기로 인하여, CDR 1과 2 보다 항원 결합 상호작용에 더욱 기여한다(참조: Padlan et al., 1994, Mol. Immunol. 31: 169-217; Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 904-917; Chothia et al., 1985, J. Mol. Biol. 186: 651-663). 높은 친화성은 가변 도메인과 표적의 구조에 직접적으로 관련되는 높은 수준의 상보성을 갖는 단일 면역글로불린 가변 도메인/항원 쌍을 지시한다.
소정의 항원에 대한 단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드의 높은 친화성을 공여하는 구조는 폴리펩티드 구조를 갖는 항원의 도킹(docking)을 가능하게 하는 분자 모델링 소프트웨어를 이용하여 밝힐 수 있다. 일반적으로, 공지된 친화력의 단일 면역글로불린 가변 도메인의 컴퓨터 모델은 상호작용 표면을 결정하기 위하여 공지된 구조의 폴리펩티드 또는 다른 표적 항원의 컴퓨터 모델과 도킹될 수 있다. 이러한 공지된 상호작용을 위한 상호작용 표면의 구조를 고려하여, 상호작용의 강도에 대한 가변 도메인 서열에서 보존성 또는 덜-보존성 치환의 긍정적 또는 부정적 영향을 예측하고 개선된 결합 분자의 합리적 설계를 가능하게 할 수 있다.
항체 단일 가변 도메인의 다형체 형태
한 측면에서, 본 명세서에 기술된 항체 폴리펩티드 구조체(가령, dAb)는 예로써 이형- 또는 동종이량체, 이형- 또는 동종삼량체, 이형- 또는 동종사량체, 또는 그 이상의 이형- 또는 동종다량체(가령, 이형- 또는 동종오량체 및 그 이상의 다량체)로서 다량체화(multimerization)된다. 다량체화는 화합력 효과를 통하여 항원 결합의 강도를 증가시킬 수 있는데, 결합의 강도는 복수 결합 부위의 결합 친화성의 합에 관련된다.
이형-과 동종다량체는 예로써, 펩티드 링커를 통하여 융합된 단일 도메인 항체의 발현으로 제조되고, dAb-링커-dAb 형태 또는 이런 정렬의 더욱 높은 다량체를 생성한다. 이들 다량체는 추가의 부분, 예를 들면, 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드 서열, 또는 다른 효과기 부분(effecter moiety), 예를 들면, 독소 또는 표적 부분, 예를 들면, PEGd에 연결될 수도 있다. 이형- 또는 동종다량체를 생성하기 위하여 임의의 링커 펩티드 서열, 예를 들면, scFv를 생성하기 위하여 당분야에 이용되는 링커 서열이 이용될 수 있다. 한가지 통상적으로 유용한 링커는 펩티드 서열(Gly4Ser)n(SEQ ID NO: 7)의 반복을 포함하는데, 여기서 n = 1 내지 대략 10(가령, n=1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)이다. 가령, 링커는 (Gly4Ser)3(SEQ ID NO: 8), (Gly4Ser)5(SEQ ID NO: 9), (Gly4Ser)7(SEQ ID NO: 10) 또는 (Gly4Ser)(SEQ ID NO: 7) 서열의 다른 다량체일 수 있다.
단량체가 펩티드 서열에 의해 연결된 다량체의 발현에 대한 대안은 예로써, 이황화 결합 또는 다른 화학적 연쇄를 통하여 번역이후 단량체 면역글로불린 가변 도메인의 연쇄이다. 가령, 유리 시스테인이 단량체 폴리펩티드의 C-말단에서 조작되어 단량체 사이의 이황화 결합을 가능하게 한다. 이런 측면 또는 유리 시스테인을 요하는 다른 측면에서, 시스테인은 dAb 서열의 마지막 코돈에 인접하여(C-말단 시스테인의 경우, 프라이머에서 상기 서열은 역 보체, 다시 말하면, ACA 또는 GCA인데, 그 이유는 상기 서열이 하류 PCR 프라이머에 통합되기 때문이다), 그리고 하나이상의 종결 코돈의 바로 앞에 PCR 프라이머 내로 시스테인 코돈(TGT, TGC)을 포함시킴으로써 도입된다. 원하는 경우에, 링커 펩티드 서열, 예를 들면, (Gly4Ser)n(SEQ ID NO: 7)는 dAb 서열과 유리 시스테인 사이에 위치한다. 유리 시스테인 잔기를 보유하는 단량체의 발현은 대략 1:1 혼합물로 단량체와 복합체 형태의 혼합물을 유도한다. 이량체는 염 기울기 용출(salt gradient elusion)과 함께 겔 크로마토그래피, 예를 들면, 이온-교환 크로마토그래피를 이용함으로써 단량체로부터 분리된다.
대안으로, 조작된 유리 시스테인은 티올 연쇄를 통하여 다가 화학적 링커, 예를 들면, 삼량체 말레이미드 분자(가령, Tris[2-말레이미도에틸]아민, TMEA) 또는 이중-말레이미드 PEG 분자(예로써 Nektar(Shearwater)로부터 구입가능)에 티올 연쇄(thiol linkage)를 통하여 단량체에 결합하는데 이용된다.
한 구체예에서, 본 발명의 동종이량체 또는 이형이량체는 C-말단 아미노산에서 각각, 면역글로불린 CH1 도메인 또는 Cκ 도메인에 공유 부착된 VH 또는 VL 도메인을 보유한다. 따라서, 이형- 또는 동종이량체는 Fab-유사 분자인데, 여기서 항원 결합 도메인은 C-말단에서 각각, CH1과 Cκ 도메인에 공유 연결된 결합된 VH 및/또는 VL 도메인을 보유한다. 이에 더하여, 또는 대안으로, 본 발명의 dAb 다량체는 경쇄 서열이 없는 완전한 기능성의 고도 특이적 항체를 대량으로 발현하는 카멜리드 종에서 설계될 수 있다. 카멜리드 중쇄 항체는 그들의 불변 영역을 이량체화된 단일 중쇄의 동종이량체로서 발견된다. 이들 카멜리드 중쇄 항체의 가변 도메인은 VHH 도메인이라 하는데, VH 사슬의 단편으로 분리되는 경우에 높은 특이성으로 항원에 결합하는 능력을 유지한다(Hamers-Casterman et al., 1993, Nature 363: 446-448; Gahroudi et al., 1997, FEBS Lett. 414: 521-526). 따라서, 본 발명의 항체 단일 가변 도메인 다량체는 당분야에 공지된 방법을 이용하여 작제되고, 상기한 바와 같이, 카멜리드 종 중쇄 항체의 VHH 형태를 보유한다.
항체 폴리펩티드의 PEG화
본 발명은 비-PEG화된 항체 폴리펩티드에 비하여, 활성(가령, 결합 친화력) 감소 없이 증가된 반감기와 분해에 대한 저항성을 제공하는 PEG화된 항체 폴리펩티드(가령, dAb) 단량체와 다량체를 제시한다.
본 명세서에 기술된 바와 같은 항체 폴리펩티드 분자는 당분야에 공지된 방법을 이용하여, 증가된 반감기와 분해 저항성을 달성하는데 유용한 중합체 분자(바람직하게는, PEG)에 결합될 수 있다. 본 발명에 이용될 수 있는 중합체 부분은 합성되거나 자연적으로 생성될 수 있는데, 여기에는 선형이나 분지형 사슬 폴리알킬렌, 폴리알케닐렌 또는 폴리옥시알킬렌, 또는 분지되거나 분지되지 않은 폴리사카라이드, 예를 들면, 동종- 또는 이형폴리사카라이드가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 본 발명에 이용될 수 있는 합성 중합체의 선호되는 실례는 선형이나 분지형 사슬 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG), 폴리(프로필렌 글리콜), 또는 폴리(비닐 알코올), 이의 유도체 또는 치환된 형태 등이다. 본 명세서에 기술된 항체 폴리펩티드에 연쇄를 위한 특히 선호되는 치화된 중합체는 메톡시(폴리에틸렌 글리콜)을 비롯한 치환된 PEG이다. PEG에 부가적으로 또는 이를 대신하여 이용될 수 있는 자연 발생 중합체 부분은 락토오스, 아밀로오스, 덱스트란 또는 글리코겐 및 당업자에 의해 인식되는 이들의 유도체이다. 중합체의 유도체화된 형태는 예로써, 본 명세서에 기술된 항체 폴리펩티드의 아미노산 잔기와 상호작용을 가능하게 하는 현재하는 추가의 부분 또는 반응기를 보유하는 유도체이다. 이들 유도체에는 N-하이드록시숙신이미드(NHS) 활성 에스테르, 숙신이미딜 프로피오네이트 중합체 및 설피드릴-선택적 반응제, 예를 들면, 말레이미드, 비닐 술폰, 티올 등이 포함된다. 특히 선호되는 유도체화된 중합체는 아래의 화학식을 갖는 PEG 중합체이지만 이에 국한되지 않는다: PEG-O-CH2CH2CH2-CO2-NHS; PEG-O-CH2-NHS; PEG-O-CH2CH2-CO2-NHS; PEG-S-CH2CH2-CO-NHS; PEG-02CNH-CH(R)-CO2-NHS; PEG-NHCO-CH2CH2-CO-NHS; PEG-O-CH2-CO2-NHS; 여기서, R은 (CH2)4)NHCO2(mPEG)이다. PEG 중합체는 선형 분자이거나, 또는 분지형일 수 있는데, 여기서 복수 PEG 부분이 단일 중합체 내에 존재한다. 본 발명에 유용한 다른 특히 선호되는 PEG 유도체는 아래와 같다:
Figure 112010026521157-pat00003
Figure 112010026521157-pat00004
반응기(가령, MAL, NHS, SPA, VS, 또는 티올)는 PEG 중합체에 직접 부착되거나, 또는 링커 분자를 통하여 PEG에 부착된다.
본 발명에 유용한 중합체의 크기는 500 Da 내지 60 kDa, 예를 들면, 1000 Da 내지 60 kDa, 10 kDa 내지 60 kDa, 20 kDa 내지 60 kDa, 30 kDa 내지 60 kDa, 40 kDa 내지 60 kDa, 최대 50 kDa 내지 60 kDa 범위에 존재할 수 있다. 본 발명에 이용되는 중합체, 특히 PEG는 선형 사슬 중합체이거나, 또는 분지형 형태를 갖는다. 분자량과 형태의 조합에 따라, 항체 구조체(가령, dAb) 단량체 또는 다량체에 부착된 중합체 분자는 24 내지 500 kDa의 평균 유체역학적 크기를 갖는 분자를 산출한다. 본 명세서에 이용된 중합체 분자의 유체역학적 크기는 수용액을 통한 분자의 확산에 기초한 분자(가령, 단백질 분자)의 겉보기 크기(apparent size)를 의미한다. 용액을 통한 단백질의 확산 또는 움직임은 단백질의 겉보기 크기를 유도하도록 처리될 수 있는데, 여기서 겉보기 크기는 단백질 입자의 스토크스 반경(Stokes radius) 또는 유체역학적 반경(hydrodynamic radius)에 의해 제공된다. 단백질의 유체역학적 크기는 질량과 형상(형태)에 좌우되기 때문에, 동일한 분자량을 갖는 두 단백질이 단백질의 전체 형태에 기초하여 상이한 유체역학적 크기를 가질 수도 있다. PEG-연결된 항체 단일 가변 도메인(본 명세서에 기술된 단일 도메인 항체 다량체)의 유체역학적 크기의 범위는 24 kDa 내지 500 kDa; 30 내지 500 kDa; 40 내지 500 kDa; 50 내지 500 kDa; 100 내지 500 kDa; 150 내지 500 kDa; 200 내지 500 kDa, 250 내지 500 kDa; 300 내지 500 kDa; 350 내지 500 kDa; 400 내지 500 kDa; 450 내지 500 kDa일 수 있다. 적절하게는, PEG화된 dAb의 유체역학적 크기는 30 내지 40 kDa; 70 내지 80 kDa 또는 200 내지 300 kDa이다. 따라서, 항체 폴리펩티드, 예를 들면, dAb 또는 dAb 다량체에 부착된 중합체 분자의 크기는 원하는 목적에 따라 달라질 수 있다. 가령, PEG화된 dAb가 순환계를 떠나 말초 조직으로 들어가는 경우에, 혈류로부터 혈관외유출(extravasation)을 용이하게 하기 위하여 부착된 중합체의 크기를 낮게 유지하는 것이 바람직하다. 대안으로, PEG화된 dAb가 더욱 오랜 기간 동안 순환계에 남아있도록 하는 것이 바람직한 경우에, 더욱 높은 분자량 중합체(가령, 30 내지 60 kDa 중합체)가 이용될 수 있다.
본 발명에 유용한 중합체(PEG) 분자는 당분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 항체 폴리펩티드 구조체에 부착될 수 있다. 본 발명의 항체 폴리펩티드 단량체 또는 다량체에 PEG 또는 다른 중합체 부분의 부착에서 첫 번째 단계는 친전자체-포함 기능기에 의한 PEG 중합체의 하이드록실 말단기의 치환이다. 특히, PEG 중합체는 항체 폴리펩티드 단량체 또는 다량체에 존재하는 시스테인 또는 리신 잔기에 부착된다. 시스테인과 리신 잔기는 자연적으로 발생하거나, 또는 항체 폴리펩티드 분자 내로 조작될 수 있다. 가령, 시스테인 잔기가 dAb 폴리펩티드의 C-말단에서 재조합 방식으로 조작되거나, 또는 dAb 또는 다른 항체 폴리펩티드 내에 특정 용매 접근가능 위치에서 잔기가 시스테인이나 리신으로 치환될 수 있다. 바람직한 구체예에서, PEG 부분은 본 명세서에 기술된 바와 같이 dAb 단량체 또는 다량체의 C-말단에서 힌지 영역에 존재하는 시스테인 잔기에 부착된다.
한 구체예에서, PEG 중합체는 한 프레임워크 영역(FW)에 존재하는 하나이상의 시스테인이나 리신 잔기 및 한 dAb의 하나이상의 이질성 CDR에 부착된다. CDR과 프레임워크 영역은 Sequences of Proteins of Immunological Interest(Kabat et al.(1991) Sequences of proteins of immunological interest, U.S. Department of Health and Human Services)의 Kabat 데이터베이스에 정의된 바와 같은 면역글로불린 가변 도메인의 영역이다. 바람직한 구체예에서, PEG 중합체는 VH 프레임워크 분절 DP47, 또는 Vk 프레임워크 분절 DPK9에서 시스테인이나 리신 잔기에 연결된다. PEG에 연결될 수 있는 DP47의 시스테인 및/또는 리신 잔기는 SEQ ID NO: 1에서, 위치 22 또는 96의 시스테인 잔기 및 위치 43, 65, 76 또는 98의 리신 잔기이다(도 21). 본 발명에 따른 PEG에 연결될 수 있는 DPK9의 시스테인 및/또는 리신 잔기는 SEQ ID NO: 2에서, 위치 23 또는 88의 시스테인 잔기 및 위치 39, 42, 45, 103 또는 107의 리신 잔기이다(도 21). 이에 더하여, 특정 시스테인이나 리신 잔기가 VH 정준 프레임워크 영역 DP38, 또는 DP45에서 PEG에 연결될 수 있다.
이에 더하여, 자연적으로 발생하는 시스테인이나 리신 잔기가 아닌 dAb 내에 특정 용매 접근가능 부위는 PEG 중합체의 부착을 위한 시스테인이나 리신으로 돌연변이될 수 있다. 소정의 dAb 단량체 또는 다량체에서 용매 접근가능 잔기는 소정의 dAb의 결정 구조의 분석과 같은 당분야에 공지된 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 가령, VH dAb HEL4(암탉 난 리소자임에 결합한다; 아래 참조)의 분석된 결정 구조를 이용하여, 잔기 Gln-12, Pro-41, Asp-62, Glu-89, Gln-112, Leu-115, Thr-117, Ser-119, Ser-120은 용매 접근가능한 것으로 확인되었고, 따라서 PEG 중합체의 부착을 위한 시스테인이나 리신 잔기로의 돌연변이를 위한 매력적인 후보이다. 이에 더하여, Vk 견본 dAb(아래 참조)의 분석된 결정 구조를 이용하여, 잔기 Val-15, Pro-40, Gly-41, Ser-56, Gly-57, Ser-60, Pro-80, Gly-71, Gln-100, Lys-107, Arg-108은 용매 접근가능한 것으로 확인되었고, 따라서 PEG 중합체의 부착을 위한 시스테인이나 리신 잔기로의 돌연변이를 위한 매력적인 후보이다.
HEL4의 일차 아미노산 서열(SEQ ID NO: 5).
Figure 112010026521157-pat00005
Vk 견본의 일차 아미노산 서열(SEQ ID NO: 6)
Figure 112010026521157-pat00006
한 구체예에서, PEG 중합체는 복수의 용매 접근가능 시스테인이나 리신 잔기, 또는 시스테인이나 리신 잔기로 돌연변이된 용매 접근가능 부위에 연결된다. 대안으로, 특정 항체 폴리펩티드 구조체가 하나의 용매 접근가능 시스테인이나 잔기(또는 시스테인이나 리신으로 변형되는 잔기)를 보유하는 경우에, 또는 하나의 특정 용매 접근가능 잔기가 PEG화를 위한 이들 여러 잔기에서 선택되는 경우에, 단 하나의 용매 접근가능 잔기만 PEG에 연결된다.
본 발명에 유용한 여러 부착 전략은 Nektar(SanCarlos, CA)에 의해 제공된다. 가령, 리신 잔기에 PEG 또는 다른 중합체의 부착이 필요한 경우에, N-하이드록시숙신이미드, 예를 들면, 숙신이미딜 프로피오네이트로 유도체화된 PEG 중합체의 활성 에스테르가 이용된다. 시스테인 잔기에 부착이 의도되는 경우에, 설피드릴-선택성 반응물, 예를 들면, 말레이미드, 비닐 술폰, 또는 티올로 유도체화된 PEG 중합체가 이용된다. PEG화된 dAb를 생성하기 위하여 본 발명에 따라 이용될 수 있는 PEG 유도체의 특정 구체예의 다른 실례는 Nektar 카탈로그(nektar.com의 월드 와이드 웹에서 입수가능)에서 찾을 수 있다. 이에 더하여, 본 발명의 dAb 단량체 또는 다량체에 PEG 중합체의 부착을 용이하게 하기 위하여, PEG의 여러 유도체화된 형태가 본 발명에 이용될 수 있다. 본 발명에 유용한 PEG 유도체에는 PEG-숙신이미딜 숙시네이트, 우레탄 연결된 PEG, PEG 페닐카보네이트, PEG 숙신이미딜 카보네이트, PEG-카르복시메틸 아지드, 디메틸말레산 무수물 PEG, PEG 디티오카보네이트 유도체, PEG-트레실레이트(2,2,2-트리플루오르에탄설포네이트), mPEG 이미도에스테르 및 Zalipsky and Lee,(1992)("Use of functionalized poly(ethylene glycol)s for modification of peptides" in Poly(Ethylene Glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. Milton Harris, Ed., Plenum Press, NY)에 기술된 다른 유도체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
상기한 각 구체예에서, PEG 중합체는 항체 폴리펩티드 구조체 펩티드에 존재하는 임의의 적절한 잔기에 부착되거나, 또는 바람직하게는, 구조체의 하나이상의 잔기가 PEG 중합체에 대한 부착점(attachment point)으로서 이용될 수 있는 시스테인이나 리신 잔기로 변형되거나 돌연변이될 수 있다. 적절하게는, 이런 방식으로 변형되는 잔기는 용매 접근가능 잔기; 다시 말하면, 항체 폴리펩티드 구조체가 자연적인 접힌 형태 상태로 존재할 때 수성 환경과 유도체화된 PEG 중합체에 접근가능한 잔기이다. 이들 잔기 중에서 하나이상이 본 발명에 따라 시스테인 잔기로 돌연변이되면, 선형이나 분지형 MAL 유도체화된 PEG(MAL-PEG)를 이용한 PEG 부착이 가능하다.
한 구체예에서, 항체 단일 가변 도메인과 PEG 중합체를 포함하는 항체 구조체가 제시되는데, 여기서 PEG 중합체 대 항체 단일 가변 도메인의 비율은 적어도 0.25:1의 몰 비율이다. 다른 구체예에서, PEG 중합체 대 항체 단일 가변 도메인의 몰 비율은 0.33:1 또는 그 이상이다. 또 다른 구체예에서, PEG 중합체 대 항체 단일 가변 도메인의 몰 비율은 0.5:1 또는 그 이상이다.
H: 본 명세서에 기술된 리간드의 용도
1) 본 발명의 두 번째 배치에 따른 다중특이적 리간드의 용도
본 발명의 두 번째 배치의 방법에 따른 다중특이적 리간드는 생체내 치료적 적용 및 예방적 적용, 시험관내 및 생체내 진단적 적용, 시험관내 검사 및 반응물 적용 등에 이용된다. 가령, 항체 분자는 당업자에게 널리 알려진 기술에 따라, ELISA 기술과 같은 항체 기초된 검사 기술에 사용된다.
상기 논의된 바와 같이, 본 발명에 따른 다중특이적 리간드는 진단, 예방 및 치료 절차에 사용된다. 본 발명에 따른 다중특이적 항체는 표준 면역조직화학적 절차에 의해 웨스턴 분석 및 in situ 단백질 검출에 진단적으로 사용된다; 이들 적용에서의 이용을 위하여, 리간드는 당분야에 공지된 기술에 따라 표지된다. 게다가, 이러한 항체 폴리펩티드는 수지와 같은 크로마토그래프 서포트에 복합될 때 친화력 크로마토그래피 절차에 예비적으로 사용된다. 이러한 모든 기술은 당업자에게 널리 알려져 있다.
본 발명에 따른 닫힌 형태 다중특이적 리간드의 진단적 이용은 경쟁중인 2개의 표적에 결합하는 닫힌 형태 다중특이적 리간드의 능력을 활용하는 분석물에 대한 상동성 검사를 포함하는데, 이들 2개의 표적은 동시에 결합할 수 없거나(닫힌 형상), 또는 대안으로, 2개의 표적에 동시에 결합할 수 있다(열린 형태).
진정한 상동성 면역검사 포맷이 약물 발견 및 개발에 이용되는 진단 및 연구 검사 시스템의 제조자들에 의해 활발하게 연구되고 있다. 주요 진단 시장는 병원, 의원과 클리닉, 상업적 참고 실험실, 혈액은행 및 집, 비-인간 진단(가령, 식품 검사, 수질 검사, 환경 검사, 생물-방어 및 수의학 검사) 및 최종적으로 연구(약물 개발; 기본 연구 및 학문적 연구 포함)를 포함한다.
현재, 이들 모든 시장은 화학발광, ELISA, 형광 또는 드문 경우에 방사성-면역검사 기술에 기초한 면역검사 시스템을 이용한다. 이들 검사 포맷 각각은 분리 단계(비-결합된 반응물로부터 결합된 것을 분리)를 요한다. 일부 경우에, 여러 분리 단계가 요구된다. 이들 부가적 단계의 추가는 반응물, 자동화 및 수행 시간을 추가시키고, 검사의 절대 결과에 영향을 미친다. 인간 진단에서, 분리 단계는 자동화되는데, 이는 문제점을 감출뿐 해결하지 못한다. 로봇, 추가의 반응물, 추가의 배양 시간 등은 상당한 비용 및 복잡성을 부가한다. 문자 그대로, 매우 낮은 수준의 검사 분자로 수백만개의 샘플이 한 번에 처리되는 초고속 스크리닝과 같은 약물 개발에서, 부가적 분리 단계를 추가하는 것은 스크린을 수행살 수 있는 능력을 소멸시킬 수 있다. 하지만, 분리의 회피는 판독시에 너무 많은 잡음을 발생시킨다. 따라서, 현재 검사 포맷으로부터 획득가능한 범위에서 민감도를 제공하는 진정한 상동성 포맷이 필요하다. 유리하게는, 검사는 높은 민감도로 충분히 정량적인 판독 및 큰 동태 범위를 보유한다. 민감도는 필요한 샘플의 양을 감소시키는데 있어 중요한 필요조건이다. 이들 특징은 상동성 시스템이 제공하는 특징이다. 이는 샘플이 고가일 때 관리 검사(care testing)의 포인트 및 약물 개발에서 매우 중요하다. 당분야에 현재 이용되는 이질성 시스템은 많은 양의 샘플 및 값비싼 반응물을 요구한다.
상동성 검사에 대한 적용에는 암 검사가 포함되는데, 여기서 최대 검사는 남성에서 전립선암을 스크리닝하는데 이용되는 전립선 특이적 항원에 대한 검사이다. 다른 적용은 임신 검사인데, 이는 임신에 대한 베타-hcg를 비롯하여 임신을 시도하는 여성에 대한 일련의 검사를 제공한다. 간염, HIV, 풍진, 다른 바이러스 및 미생물과 성적으로 전달된 질병을 비롯한 전염성 질환에 대한 검사. 검사는 혈액 은행에 의한 검사, 특히 HIV, 간염 A, B, C, 비-A, 비-B에 대한 검사가 이용된다. 치료 약물 모니터링 검사는 환자에서 효율적이고 독성을 회피하기 위하여 처방된 약물, 예를 들면, 부정맥용 디곡신(digoxin) 수준; 정신병의 경우 페노바르비탈 수준; 천식용 티오필린의 모니터링을 포함한다. 게다가, 진단 시험은 코카인, 마리화나 등의 검사와 같은 남용된 약물 검사에 유용하다. 대사 검사는 갑상선 기능, 빈혈증 및 다른 생리적 장애와 기능을 측정하는데 이용된다.
게다가, 상동성 면역검사 포맷은 표준 임상 화학 검사의 제조에 유용하다. 동일한 기구 내에 면역검사와 화학 검사의 포함은 진단 검사에 매우 유리하다. 적당한 화학 검사는 글루코오스, 콜레스테롤, 칼륨 등에 대한 검사를 포함한다.
상동성 면역검사에 대한 다른 주요 적용은 약물 발견과 개발이다: 초고속 스크리닝은 극도로 높은 부피 내에서 조합 화학 라이브러리 vs. 표적의 검사를 포함한다. 신호가 검출되면, 양성 그룹이 더욱 작은 그룹으로 분할되고, 최종적으로 세포 및 동물 내에서 검사된다. 상동성 검사는 이들 모든 유형의 검사에 이용된다. 약물 개발, 특히 동물 연구와 임상 시험에서, 면역검사의 집중적인 이용이 이루어진다. 다른 적용은 식품과 음료 검사: 대장균(E. coli), 살모넬라 등에 대한 육류와 다른 식품 검사; 대장균(E. coli)을 비롯한 모든 유형의 오염물에 대한 식수 공장에서의 수질 검사; 수의학 검사를 포함한다.
광범위한 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 닫힌 형태 다중특이적 리간드에 결합된 검출가능한 약제를 포함하는 결합 검사를 제시하는데, 이의 검출가능 성질은 상기 닫힌 형태 다중특이적 리간드에 대한 반응물의 결합에 의해 변화된다. 이러한 여러 검사는 여러 상이한 방식으로 구성되고, 각각은 닫힌 형태 다중특이적 리간드의 상기 성질을 이용한다.
이러한 검사는 반응물에 의한 약제의 직접적 또는 간접적 이동에 따라 좌우되고, 이는 약제의 검출가능 특성에서 변화를 야기한다. 가령, 약제가 검출가능한 종점(둥-point)을 갖는 반응을 촉매할 수 있는 효소인 경우에, 상기 효소는 활성 부위를 차단하여 효소를 불활성화시키는 리간드에 의해 결합될 수 있다. 닫힌 형태 다중특이적 리간드에 의해 결합되는 반응물은 효소를 이동시키고, 활성 부위의 해방을 통해 이를 활성화시킨다. 이후, 효소는 기질과 반응하여 검출가능한 현상을 유발할 수 있다. 대안적 구체예에서, 리간드는 효소에서 활성 부위 외부에 결합하여 효소의 형태에 영향에 영향을 주고 그의 활성을 변화시킨다. 가령, 활성 부위의 구조는 리간드의 결합에 의해 저해되거나, 또는 활성에 필요한 보조인자의 결합이 예방된다.
검사의 물리적 수행은 당분야에 공지된 임의의 형태를 취한다. 가령, 닫힌 형태 다중특이적 리간드/효소 복합체는 검사 스트립에 제공된다; 기질은 검사 스트립의 다른 영역 내에 제공되고, 반응물을 함유하는 용매는 리간드/효소 복합체를 통해 이동하고, 효소를 이동시키고 신호를 생성하는 기질 영역 내로 이를 운반할 수 있다. 대안으로, 리간드/효소 복합체는 검사 스틱 또는 다른 고형상 상에 제공되고, 반응물/기질 용액 내에 넣어지고, 반응물의 존재에 반응하여 효소를 용액 내로 방출한다.
반응물의 각 분자가 잠재적으로 하나의 효소 분자를 방출하기 때문에, 검사는 용액에서 반응물의 농도에 따라 달라지는 일정한 시간 내에 생성된 신호의 강도로 정량된다.
닫힌 형태의 반응물을 이용한 또 다른 배치가 가능하다. 가령, 닫힌 형태 다중특이적 리간드는 알로스테릭 부위(allosteric site) 내에서 효소에 결합하도록 구성되어 효소를 활성화시킨다. 이러한 구체예에서, 효소는 반응물의 부재시 활성을 나타낸다. 반응물의 첨가는 효소를 이동시키고 알로스테릭 활성화(allosteric activation)를 제거하여 효소를 불활성화시킨다.
반응물 농도의 척도로서 효소 활성을 이용하는 상기 구체예의 배경에서, 효소의 활성화 또는 불활성화는 신호-생성 반응을 촉매하는 효소의 능력에 의한 측정에서, 효소 활성의 증가 또는 감소를 나타낸다. 가령, 효소는 비-검출가능 기질의 검출가능 형태로의 전환을 촉매한다. 가령, 양고추냉이 과산화효소는 상업적으로 구입가능한 색원성 또는 화학발광성 기질과 함께 당분야에 널리 사용된다. 효소 활성의 증가 또는 감소 수준은 10% 내지 100%, 예를 들면, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%이다; 활성 증가의 경우에, 증가는 100% 이상, 다시 말하면, 200%, 300%, 500% 또는 이상이고, 또는 저해된 효소의 기준 활성이 검출되지 않는 경우에 백분율로서 측정가능하지 않다.
또 다른 배치에서, 닫힌 형태 다중특이적 리간드는 효소보다는 효소/기질 쌍 기질에 결합한다. 이런 이유로, 기질은 분석물의 결합을 통해 닫힌 형태 다중특이적 리간드로부터의 방출될 때까지 효소에 사용될 수 없다. 이러한 배치의 수행은 효소에 결합하는 배치에서와 동일하다.
게다가, 검사는 리간드에 결합이후 형광이 제거되는 형태로, 형광 분자, 예를 들면, 플루오레신 또는 다른 형광단에 결합하도록 배치된다. 이러한 경우에, 리간드에 대한 분석물의 결합은 형광 분자를 이동시켜 신호를 생성한다. 본 발명에 유용한 형광 분자의 대안은 HRP와 같은 면역검사에 통상적으로 사용되는 약제를 비롯한 루시페린/루시페라제와 같은 발광제 및 색원성 약물을 포함한다.
본 발명에 따라 제조된 다중특이적 리간드의 치료적 및 예방적 이용은 인간과 같은 수용자 포유동물에 본 발명에 따른 리간드의 투여를 포함한다. 다중-특이성은 항체가 큰 화합력으로 다중 항원에 결합하게 할 수 있다. 다중특이적 리간드는 예로써, 종양 세포주의 사멸을 중개하는 세포파괴성 T-세포를 동원하는데 있어 2개 항원의 교차-결합을 가능하게 할 수 있다.
적어도 90-95% 상동성의 실질적으로 순수한 리간드 또는 이의 결합 단백질, 예를 들면, dAb 단량체는 포유동물 투여에 바람직하고, 특히 포유동물이 인간인 제약학적 용도에서는 98-99% 이상의 상동성이 가장 바람직하다. 부분적으로 또는 원하는 상동성으로 정제된 리간드는 진단적으로 또는 치료적으로(체외 포함) 사용되거나, 또는 검사 절차, 면역형광 염색 등을 개발하고 수행하는데 사용된다(Lefkovite and Pernis (1979 and 1981) Immunological Methods, Volumes I and II, Academic Press, NY).
본 발명의 리간드 또는 이의 결합 단백질, 예를 들면, dAb 단량체는 전형적으로, 염증 상태, 알레르기성 과민증, 암, 박테리아 또는 바이러스 감염 및 자가면역 장애(I형 당뇨병, 천식, 다발성경화증, 류머티스성 관절염, 전신성 홍반성 낭창, 크론병 및 중증근무력증을 포함하지만 이들에 국한되지 않음)를 예방하거나 저해하거나 치료하는데 사용될 것이다.
류머티스성 관절염 이외에, 항-TNF-알파 폴리펩티드는 에디슨병(Addison's disease)(부신); 귀의 자가면역 질환(귀); 눈의 자가면역 질환(눈); 자가면역 간염(간); 자가면역 이하선염(이하선); 크론병과 염증성 장 질환(내장); I형 당뇨병(췌장); 부고환염(부고환), 사구체신염(신장); 그레이브스병(Graves' disease)(갑상선); 귈레인-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome)(신경 세포); 하시모토병(Hashimoto's disease)(갑상선); 조혈성 빈혈(hemolytic anemia)(적혈구); 전신성 홍반성 낭창(systemic lupus erythematosus)(다발성 조직); 남성 불임(정액); 다발성 경화증(신경 세포); 중증근무력증(신경근연접(neuromuscular junction)); 천포창(pemphigus)(주로 피부); 건선(피부); 류머티스열(rheumatic fever)(심장과 관절); 유육종증(sarcoidosis)(다발성 조직과 기관); 경피증(scleroderma)(피부와 연결 조직); 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome)(외분비선과 다른 조직); 척추관절병증(spondyloarthropathies)(중축(axial skeleton)과 다른 조직); 갑상선염(갑상선); 궤양성 대장염(내장); 맥관염(혈관)을 포함하지만 이들에 국한되지 않는 자가면역 질환(괄호 안은 피해를 받는 기관을 지시한다)의 치료에 적용된다.
류머티스성 관절염 및 다른 만성 염증성 질환(가령, 크론병, 건선 등) 이외에, 본 명세서에 기술된 바와 같이 항-VEGF 폴리펩티드는 당뇨병, 급성 골수성 백혈병, 백혈병 및 황반변성(macular degeneration)과 당뇨성 망막병증(diabetic retinopathy)을 비롯한 안구 질환을 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명에서, “예방”은 질병의 유도에 앞서 보호성 조성물의 투여에 관련한다. “저해”는 유도성 현상이후, 질병의 임상적 출현에 앞서 조성물의 투여를 나타낸다.
질병에 대해 보호 또는 이에 대한 치료시 항체 또는 이의 결합 단백질의 효능을 스크리닝하는데 이용될 수 있는 동물 모형 시스템이 가용하다. 민감성 생쥐에서 전신성 홍반성 낭창(SLE)의 검사 방법은 당분야에 공지되어 있다(Knight et al. (1987) J. Exp. Med. 147:1653; Reinersten et al. (1978) New Eng. J. Med. 299:515). 중증근무력증(MG)은 다른 종으로부터의 용해성 AchR 단백질로 상기 질병을 유도함으로서 SJL/J 암컷 생쥐에서 검사된다(Lindstrom et al. (1988) Adv. Immunol. 42:233). 관절염은 II형 콜라겐의 주입에 의해 민감성 생쥐 계통에서 유도된다(Stuart et al. (1984) Ann, Rev. Immunol. 42:233). 보조 관절염이 마이코박테리아 열 충격 단백질의 주입에 의해 민감성 쥐에서 유도되는 모형이 기술되었다(Van Eden et al. (1988) Nature 331:171). 갑상선염은 기존 문헌에 기술된 바와 같이 티로글루불린(thyroglobulin)의 투여에 의해 생쥐에서 유도된다(Maron et al. (1980) J. Exp. Med. 152:1115). 인슐린 의존형 당뇨병(IDDM)은 자연적으로 발생할 수 있거나, 또는 Kanasawa et al. (1984) Diabetologia 27:113에 기술된 바와 같이 생쥐의 특정 계통에서 유도될 수 있다. 생쥐와 쥐에서 EAE는 인간에서 MS에 대한 모형으로서 기능한다. 이러한 모형에서, 탈수초화 질환은 미엘린 기초 단백질의 투여에 의해 유도된다(참조: Paterson (1986) Textbook of Immunology, Mischer et al., eds, Grune and Stratton, New York, pp. 179-213; MaFarlin et al. (1973) Science, 179:478; Satoh et al. (1987) J. Immunol. 138:179).
일반적으로, 본 리간드는 제약학적으로 적당한 담체와 함께 정제된 형태로 사용된다. 전형적으로, 이들 담체는 수성 또는 알코올성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액, 식염수 및/또는 완충된 매체를 포함한다. 비경구 부형약은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 텍스트로스와 염화나트륨 및 락테이트화된 링거를 포함한다. 폴리펩티드 복합체를 현탁액 내에 유지시킬 필요가 있는 경우에, 적합한 생리적으로-허용되는 보조제는 카르복실메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴 및 알기네이트와 같은 농축제로부터 선택된다.
정맥내 부형약은 링거 덱스트로스에 기초한 것들과 같은 유체와 영양 공급제 및 전해질 공급제를 포함한다. 또한, 방부제 및 향균제, 항산화제, 킬레이트화제, 불활성 기체와 같은 다른 첨가제 역시 존재할 수 있다(Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Science, 16th Edition).
본 발명의 리간드는 개별적으로, 또는 다른 약제와 공동으로 투여되는 조성물로서 사용된다. 이들은 시클로스포린, 메토트렉세이트, 아드리아마이신 또는 시스플라티늄과 같은 다양한 면역치료제 및 면역독소를 포함할 수 있다. 제약학적 조성물은 투여 이전에 함께 집합되는 지에 상관없이, 본 발명의 리간드, 또는 상이한 표적 항원이나 에피토프를 이용하여 선별된 리간드와 같은 다른 특이성을 갖는 본 발명에 따른 리간드의 조합과 공동으로 다양한 세포독성 또는 다른 약제의 “칵테일”을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 제약학적 조성물의 투여 경로는 당업자에게 통상적으로 알려진 것들 중에서 하나이다. 면역치료를 포함하지만 이에 국한되지 않는 치료를 위하여, 본 발명의 선별된 리간드는 표준 기술에 따라 환자에게 투여될 수 있다. 투여는 비경구적, 정맥내, 근육내, 복강내, 경피, 폐 경로를 통해, 또는 적절하게는 카테터로 직접 주입을 비롯한 임의의 적절한 경로로 달성될 수 있다. 투여의 용량과 빈도는 환자의 연령, 성별, 상태, 다른 약물의 동시 투여, 금기 및 임상의에 의해 고려되는 다른 파라미터에 따라 달라질 것이다.
당업자가 인지하는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 양식은 원하는 결과에 따라 달라질 것이다. 특정 구체예에서, 활성 화합물은 급속한 방출로부터 화합물을 보호하는 담체로, 이식물, 경피 패치, 마이크로피포된 전달 시스템과 같은 조절 방출 제제의 형태로 제조될 수 있다. 단일 도메인 항체 구조체는 부분적으로, 작은 크기에 의해 연장된 방출 제조물로서 제제화에 매우 적합하다 - 투약당 몰 수가 예로써 전체 크기 항체의 용량보다 현저하게 높아질 수 있다. 생물분해성, 생체적합성 중합체, 예를 들면, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 폴리락트산이 사용될 수 있다. 주사가능 조성물의 연장된 흡수는 조성물 내에 흡수를 지연시키는 약물, 예를 들면, 모노스테아레이트 염과 젤라틴을 포함시킴으로써 달성될 수 있다. 이들 제제의 제조 방법은 특허되었거나, 당업자에게 전반적으로 알려져 있다(참조: Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978). 본 명세서에 기술된 단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드와 같은 폴리펩티드의 조절되거나 연장된 방출에 적용되는 다른 방법은 예로써, U.S. 특허 6,306,406과 6,346,274 및 U.S. 특허 출원 Nos. US20020182254와 US20020051808에서 기술된다.
본 발명의 리간드는 보관을 위하여 동결건조될 수 있고, 사용에 앞서 적당한 담체 내에서 재구성될 수 있다. 이러한 기술은 통상의 면역글로불린에 유효한 것으로 밝혀졌고, 당분야에 공지된 동결건조 및 재구성 기술이 이용될 수 있다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 동결건조 및 재구성은 항체 활성 손실의 정도를 변화시킬 수 있고(가령, 통상의 면역글로불린으로, IgM 항체는 IgG 항체보다 더욱 많은 활성 손실을 유도하는 경향이 있다), 사용 수준은 보상을 위하여 상향 조정되어야 한다.
본 발명의 리간드 또는 이의 칵테일을 포함하는 조성물은 예방적 및/또는 치료적 처리를 위하여 투여될 수 있다. 특정 치료 적용에서, 선별된 세포 집단의 적어도 부분적 저해, 억제, 조절, 사멸 또는 일부 다른 측정가능한 파라미터를 달성하는데 적합한 양은 “치료 효과량”으로 정의된다. 이러한 투여량을 달성하는데 필요한 양은 질병의 심각도 및 환자 자신의 면역계의 전반적 상태에 따라 달라지긴 하지만, 일반적으로 체중의 킬로그램 당 0.005-5.0 ㎎의 리간드, 예를 들면, 항체, 수용체(가령, T-세포 수용체) 또는 이의 결합 단백질의 범위이고, 0.05-2.0 ㎎/㎏/투약의 용량이 더욱 통상적으로 사용된다. 또한 예방적 적용의 경우에. 본 발명의 리간드 또는 이의 칵테일을 포함하는 조성물은 유사하거나 다소 낮은 용량으로 투여된다.
본 명세서에 기술된 조성물을 이용하여 수행된 치료는 치료이전에 나타난 증상에 비하여 또는 이러한 조성물로 치료되지 않은 개체(인간 또는 모형 동물)에서 이러한 증상에 비하여 하나이상의 증상이 감소되면(가령, 적어도 10% 이상, 또는 임상적 평가 규모에서 적어도 하나의 포인트 이상으로) “효과적인”것으로 고려된다. 증상은 명백하게, 표적된 질병이나 장애에 따라 매우 달라지긴 하지만 임상학자 또는 기술자에 의해 편의하게 결정될 수 있다. 이러한 증상은 예로써, 질병 또는 질환의 하나이상의 생화학적 지표 수준(가령, 질병에 연관된 효소 또는 대사물질의 수준, 병든 세포 수 등)을 모니터함으로서, 물리적 징후(가령, 염증, 종양 크기 등)를 모니터함으로서, 또는 수용된 임상 평가 스케일, 예를 들면, Expanded Disability Status Scale(다발성 경화증의 경우), Irvine Inflammatory Bowel Disease Questionnarie(32 포인트 평가는 장 기능, 전신 증상, 사회적 기능 및 감정적 상태와 관련하여 삶의 질을 평가한다 - 스코어는 32-224의 범위이고 더욱 높은 점수는 더욱 좋은 삶의 질을 지시한다), Quality of Life Rheumatoid Arthritis Scale 또는 당분야에 공지된 다른 수용된 임상 평가 스케일에 의해 측정될 수 있다. 일정한 임상적 스케일에서 적어도 10% 또는 하나이상의 포인트로 질병 또는 질환 증상에서 지속적인(가령, 1일 이상, 바람직하게는 그 이상) 감소는 “효과적인” 치료의 지표이다. 이와 유사하게, 하나이상의 증상의 발병 또는 심각도가 조성물로 처리되지 않은 유사한 개체(인간 또는 동물 모형)에서 이들 증상에 비하여 지연되거나 감소되거나 제거되면, 여기에 기술된 조성물을 사용하여 수행된 예방은 “효과적”이다.
본 발명에 따른 리간드 또는 이의 칵테일을 함유하는 조성물은 포유동물에서 선별 표적 세포 집단의 변화, 불활화, 사멸 또는 제거를 돕는 예방적 및 치료적 설정에 사용된다. 게다가, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드의 선별된 레퍼토리는 세포의 이질성 집합으로부터의 표적 세포 집단을 사멸시키거나 고갈시키거나, 또는 효과적으로 제거하기 위하여 체외에서 또는 시험관내에서 선택적으로 사용된다. 포유동물로부터의 혈액은 리간드, 예를 들면, 항체, 세포-표면 수용체 또는 이의 결합 단백질과 체외에서 결합되는데, 여기서 원치 않는 세포는 표준 기술에 따라 포유동물로 환원되는 혈액으로부터 사멸되거나 또는 그렇지 않은 경우 제거된다.
2: 본 발명에 따른 반감기가 증가된 이중특이적 리간드의 이용
본 발명의 방법에 따른 이중특이적 리간드는 생체내 치료적 및 예방적 적용, 생체내 진단적 적용 등으로 사용된다.
본 발명에 따라 제조된 이중특이적 리간드의 치료적 및 예방적 이용은 인간과 같은 수용자 포유동물에 본 발명에 따른 리간드의 투여를 수반한다. 본 발명에 따른 이중특이적 리간드는 반감기 증가 분자에 대한 적어도 하나의 특이성을 포함한다; 하나이상의 다른 특이성은 표적 분자를 지향한다. 가령, 이중특이적 IgG는 4개의 에피토프에 대해 특이적인데, 이들 중에서 하나는 반감기 증가 분자 상에 존재한다. 이중특이성은 항체가 큰 화합력으로 다중 항원에 결합하게 할 수 있다. 다중특이적 리간드는 예로써, 종양 세포주의 사멸을 중개하는 세포파괴성 T-세포를 동원하는데 있어 2개 항원의 교차-결합을 가능하게 할 수 있다.
적어도 90-95% 상동성의 실질적으로 순수한 리간드 또는 이의 결합 단백질, 예를 들면, dAb 단량체는 포유동물 투여에 바람직하고, 특히 포유동물이 인간인 제약학적 용도에서는 98-99% 이상의 상동성이 가장 바람직하다. 부분적으로 또는 원하는 상동성으로 정제된 리간드는 진단적으로 또는 치료적으로(체외 포함) 사용되거나, 또는 검사 절차, 면역형광 염색 등을 개발하고 수행하는데 사용된다(Lefkovite and Pernis (1979 and 1981) Immunological Methods, Volumes I and II, Academic Press, NY).
본 발명의 리간드는 전형적으로, 염증 상태, 알레르기성 과민증, 암, 박테리아 또는 바이러스 감염 및 자가면역 장애(I형 당뇨병, 다발성경화증, 류머티스성 관절염, 전신성 홍반성 낭창, 크론병 및 중증근무력증을 포함하지만 이들에 국한되지 않음)를 예방하거나 저해하거나 치료하는데 사용될 것이다.
질병에 대해 보호 또는 이에 대한 치료시 이중특이적 리간드의 효능을 스크리닝하는데 이용될 수 있는 동물 모형 시스템이 가용하다. 민감성 생쥐에서 전신성 홍반성 낭창(SLE)의 검사 방법은 당분야에 공지되어 있다(Knight et al. (1987) J. Exp. Med. 147:1653; Reinersten et al. (1978) New Eng. J. Med. 299:515). 중증근무력증(MG)은 다른 종으로부터의 용해성 AchR 단백질로 상기 질병을 유도함으로서 SJL/J 암컷 생쥐에서 검사된다(Lindstrom et al. (1988) Adv. Immunol. 42:233). 관절염은 II형 콜라겐의 주입에 의해 민감성 생쥐 계통에서 유도된다(Stuart et al. (1984) Ann, Rev. Immunol. 42:233). 보조 관절염이 마이코박테리아 열 충격 단백질의 주입에 의해 민감성 쥐에서 유도되는 모형이 기술되었다(Van Eden et al. (1988) Nature 331:171). 갑상선염은 기존 문헌에 기술된 바와 같이 티로글루불린(thyroglobulin)의 투여에 의해 생쥐에서 유도된다(Maron et al. (1980) J. Exp. Med. 152:1115). 인슐린 의존형 당뇨병(IDDM)은 자연적으로 발생할 수 있거나, 또는 Kanasawa et al. (1984) Diabetologia 27:113에 기술된 바와 같이 생쥐의 특정 계통에서 유도될 수 있다. 생쥐와 쥐에서 EAE는 인간에서 MS에 대한 모형으로서 기능한다. 이러한 모형에서, 탈수초화 질환은 미엘린 기초 단백질의 투여에 의해 유도된다(참조: Paterson (1986) Textbook of Immunology, Mischer et al., eds, Grune and Stratton, New York, pp. 179-213; MaFarlin et al. (1973) Science, 179:478; Satoh et al. (1987) J. Immunol. 138:179).
본 발명에 따른 이중특이적 리간드 및 세포내 함입(endocytosis)에 관여하는 세포외 표적(즉, 클라트린)에 결합할 수 있는 dAb 단량체는 이중특이적 리간드가 세포내 함입될 수 있도록 하고, 세포내 표적에 결합할 수 있는 다른 특이성이 세포내 환경으로 전달될 수 있도록 한다. 이러한 전략은 세포 내에서 기능성이 유지될 수 있도록 하는 물리적 성질을 갖는 이중특이적 리간드를 필요로 한다. 대안으로, 최종 목적지 세포내 구획이 산화되면, 충분히 접힘된 리간드는 이황화 결합이 존재하여도 무방하다.
일반적으로, 본 이중특이적 리간드는 제약학적으로 적당한 담체와 함께 정제된 형태로 사용된다. 전형적으로, 이들 담체는 수성 또는 알코올성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액, 식염수 및/또는 완충된 매체를 포함한다. 비경구 부형약은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 텍스트로스와 염화나트륨 및 락테이트화된 링거를 포함한다. 폴리펩티드 복합체를 현탁액 내에 유지시킬 필요가 있는 경우에, 적합한 생리적으로-허용되는 보조제는 카르복실메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴 및 알기네이트와 같은 농축제로부터 선택된다.
정맥내 부형약은 링거 덱스트로스에 기초한 것들과 같은 유체와 영양 공급제 및 전해질 공급제를 포함한다. 또한, 방부제 및 향균제, 항산화제, 킬레이트화제, 불활성 기체와 같은 다른 첨가제 역시 존재할 수 있다(Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Science, 16th Edition).
본 발명의 리간드는 개별적으로, 또는 다른 약제와 공동으로 투여되는 조성물로서 사용된다. 이들은 시클로스포린, 메토트렉세이트, 아드리아마이신 또는 시스플라티늄과 같은 다양한 면역치료제 및 면역독소를 포함할 수 있다. 제약학적 조성물은 본 발명의 리간드와 공동으로 다양한 세포독성 또는 다른 약제의 “칵테일”을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 제약학적 조성물의 투여 경로는 당업자에게 통상적으로 알려진 것들 중에서 하나이다. 면역치료를 포함하지만 이에 국한되지 않는 치료를 위하여, 본 발명의 리간드는 표준 기술에 따라 환자에게 투여될 수 있다. 투여는 비경구적, 정맥내, 근육내, 복강내, 경피, 폐 경로를 통해, 또는 적절하게는 카테터로 직접 주입을 비롯한 임의의 적절한 경로로 달성될 수 있다. 투여의 용량과 빈도는 환자의 연령, 성별, 상태, 다른 약물의 동시 투여, 금기 및 임상의에 의해 고려되는 다른 파라미터에 따라 달라질 것이다.
본 발명의 리간드는 보관을 위하여 동결건조될 수 있고, 사용에 앞서 적당한 담체 내에서 재구성될 수 있다. 이러한 기술은 통상의 면역글로불린에 유효한 것으로 밝혀졌고, 당분야에 공지된 동결건조 및 재구성 기술이 이용될 수 있다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 동결건조 및 재구성은 항체 활성 손실의 정도를 변화시킬 수 있고(가령, 통상의 면역글로불린으로, IgM 항체는 IgG 항체보다 더욱 많은 활성 손실을 유도하는 경향이 있다), 사용 수준은 보상을 위하여 상향 조정되어야 한다.
본 발명의 리간드 또는 이의 칵테일을 포함하는 조성물은 예방적 및/또는 치료적 처리를 위하여 투여될 수 있다. 특정 치료 적용에서, 선별된 세포 집단의 적어도 부분적 저해, 억제, 조절, 사멸 또는 일부 다른 측정가능한 파라미터를 달성하는데 적합한 양은 “치료 효과량”으로 정의된다. 이러한 투여량을 달성하는데 필요한 양은 질병의 심각도 및 환자 자신의 면역계의 전반적 상태에 따라 달라지긴 하지만, 일반적으로 체중의 킬로그램 당 0.005-5.0 ㎎의 리간드의 범위이고, 0.05-2.0 ㎎/㎏/투약의 용량이 더욱 통상적으로 사용된다. 또한 예방적 적용의 경우에. 본 발명의 리간드 또는 이의 칵테일을 포함하는 조성물은 유사하거나 다소 낮은 용량으로 투여된다.
본 발명에 따른 리간드 또는 이의 칵테일을 함유하는 조성물은 포유동물에서 선별 표적 세포 집단의 변화, 불활화, 사멸 또는 제거를 돕는 예방적 및 치료적 설정에 사용된다.
게다가, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드의 선별된 레퍼토리는 세포의 이질성 집합으로부터의 표적 세포 집단을 사멸시키거나 고갈시키거나, 또는 효과적으로 제거하기 위하여 체외에서 또는 시험관내에서 선택적으로 사용된다. 포유동물로부터의 혈액은 리간드, 예를 들면, 항체, 세포-표면 수용체 또는 이의 결합 단백질과 체외에서 결합되는데, 여기서 원치 않는 세포는 표준 기술에 따라 포유동물로 환원되는 혈액으로부터 사멸되거나 또는 그렇지 않은 경우 제거된다. 본 발명은 아래의 실시예에서 예시의 목적으로만 기술된다. 본 명세에서, dAb 명명의 목적으로, 인간 TNFα는 TAR1로 표기되고, 인간 TNFα 수용체 I(p55 수용체)는 TAR2로 표기된다.
3. 류머티스성 관절염의 치료
바람직한 구체예에서, 본 명세서에 기술된 리간드는 류머티스성 관절염을 치료하는데 사용될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 류머티스성 관절염을 치료하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 하나이상의 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체의 사용을 포함하고, 여기서 하나이상의 이들 구조체는 수용체에 대한 인간 TNFα의 결합을 길항한다. 본 발명은 수용체에 대한 인간 TNFα의 결합을 길항하는 하나이상의 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체 및 리간드의 첫 번째 특이성이 TNFα를 지향하는 단일 도메인 항체이고 두 번째 특이성이 VEGF 또는 HSA를 지향하는 단일 도메인 항체인 이중특이적 리간드를 포함하는 조성물을 포괄한다. 더 나아가, 본 발명은 리간드의 첫 번째 특이성이 VEGF를 지향하고 두 번째 특이성이 HSA를 지향하는 이중특이적 리간드를 포괄한다.
한 구체예에서, 본 발명은 류머티스성 관절염의 치료 방법을 제시하는데, 상기 방법은 하나이상의 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체를 함유하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 하나이상의 이들 구조체는 수용체에 대한 인간 TNFα의 결합을 길항하거고 및/또는 관절염의 Tgl97 유전자도입 생쥐 모형의 생쥐에 생쥐에 투여되는 경우에 관절염 스코어의 증가를 예방하고 및/또는 L929 세포독성 검사에서 TNF-α를 중화시킨다. 특히, 관절염의 치료 방법은 하나이상의 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체를 함유하는 조성물의 투여를 포함하는데, 여기서 하나이상의 이들 구조체는 수용체에 대한 인간 TNFα의 결합을 길항하고, Tgl97 유전자도입 생쥐에 조성물의 투여는 관절염 스코어의 증가를 예방한다.
a) 수용체 결합 검사
류머티스성 관절염의 치료를 위한 리간드는 TNF-α 수용체에 대한 TNF-α의 결합을 간섭할 수 있다. 상기 수용체는 분리된(통상적으로, 막-결합된) 수용체이거나, 또는 시험관내 또는 생체내에서 세포 상에 존재하는 수용체일 수 있다.
TNF-α 수용체 결합 및 본 명세서에 기술된 리간드에 의한 이러한 결합의 간섭을 측정하는 검사는 하기 실시예 6에서 기술된다. 여기에는 ELISA(실시예 6, 섹션 1.3.1), BlAcore 검사(실시예 6, 섹션 1.3.2), 분리된(또는 막-결합된) 수용체(실시예 6, 섹션 1.3.3)와 배양된 세포의 표면 상에 발현된 수용체(실시예 6, 섹션 1.3.3) 둘 모두를 이용한 생화학적 수용체 결합 검사 등이 포함된다.
본 명세서에서, 수용체의 “결합을 길항하는”은 동족 수용체에 대한 TNF-α(또는, VEGF 또는 다른 인자)의 결합을 간섭하는 소정의 항체 폴리펩티드 구조체의 능력이나 효과를 나타낸다. 길항은 본 명세서에 기술된 하나이상의 시험관내 세포-기초된 검사 또는 생체내 검사를 이용하여 측정된다. 따라서, 수용체는 분리되거나, 막 결합되거나, 또는 세포 표면 상에 존재할 수 있다. 구조체의 부재시에 비하여 구조체의 존재시에 검출된 결합의 통계학적으로 유의한 감소가 나타나면, 구조체는 동족 수용체(가령, TNFR1, TNFR2, VEGFR1, VEGF112)에 대한 결합을 간섭하거나 길항한다. 대안으로, 구조체는 구조체의 부재시에 비하여 구조체의 존재시에 측정된 결합에서 적어도 10% 감소가 나타나면, 구조체는 결합을 간섭한다.
b) L929 세포독성 검사
류머티스성 관절염의 치료를 위한 리간드는 L929 세포독성 검사에서 TNF-α의 세포독성 효과를 간섭할 수 있다. Evans et al., 2000, Molecular Biotechnology 15: 243-248에 기술된 검사에 기초한 상기 검사는 실시예 6, 섹션 1.3.3에서 기술된다. 류머티스성 관절염의 치료에 유용한 항-TNF-α 리간드는 이러한 세포 검사에서 TNF-α의 활성을 중화시킬 수 있다.
본 명세서에서, 본 명세서에 기술된 항체 또는 dAb 폴리펩티드와 관련하여 “중화”는 상기 폴리펩티드가 표적 항원의 측정가능 활성이나 기능을 간섭한다는 것을 의미한다. 폴리펩티드는 표적 항원의 측정가능 활성이나 기능을 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상, 최대 100%(즉, 표적 항원의 효과 또는 기능이 검출되지 않음) 감소시키는 경우에 “중화” 폴리펩티드이다. 따라서, 표적이 TNF-α인 경우에, 중화 활성은 본 명세서에 기술된 표준 L929 세포 사멸 검사를 이용하거나, 또는 TNF-α 유도된 세포 활성화를 측정하는 HUVEC에서 ELAM-1의 TNF-α 유도된 발현을 저해하는 항-TNF-α-폴리펩티드 구조체의 능력을 측정함으로써 평가될 수 있다.
TNF-α의 수용체 결합 활성의 항체 폴리펩티드 간섭에 대한 추가적인 검사에는 실시예 6, 섹션 1.3.3에 기술된 HeLa IL-8 검사가 포함된다.
c) 생체내 검사.
본 명세서에 기술된 항-TNF-α 리간드의 효능은 Tgl97 유전자도입 생쥐 관절염 모형을 이용하여 평가할 수 있다. Tgl97 생쥐는 인간 TNF-글로빈 하이브리드 유전자가 외부로부터 도입되고, 이형접합체(heterozygote)는 4-7주령에서, 류머티스성 관절염과 공통의 조직학적 특징을 보이는 만성 진행성 다발성 관절염이 발병한다(Keffer, et al., 1991. EMBO J., Vol. 10, pp. 4025-4031). 관절염 표현형은 관절 이동성과 관절 부종을 평가함으로써 스코어를 기록할 수 있다. 관절의 관절염 표현형은 관절의 X-레이 조영 및 무릎과 발목/발 관절의 고정된 부분의 조직병리학적 분석으로 스코어를 기록할 수 있다.
소정의 항체 폴리펩티드 구조체의 효능을 평가하는 실험적 처리는 아래와 같이 수행된다.
1) 항체 폴리펩티드 구조체로 관절염의 예방을 검사하기 위하여, 동물은 아래와 같이 처리한다:
a) 이형접합성 Tgl97 생쥐는 수컷과 암컷을 동수로 하여 각 10마리의 동물군으로 분할한다. 치료는 3주령에, PBS에 담긴 항체 폴리펩티드, 또는 대조 동물에서 PBS 단독의 주1회 복강내 주입으로 시작한다.
b) 생쥐를 매주 칭량하고;
c) 이들 생쥐에서 아래의 체계: 0 = 관절염 없음(정상 외관과 굴곡), 1 = 경등도 관절염(관절 염좌), 2 = 중등도 관절염(부종, 관절 변형), 3 = 중증도 관절염(심각하게 손상된 움직임)에 따라 관절염의 거대표현형적 증상에 대한 스코어를 기록한다.
이들 연구는 개별 스코어링이 검사 군에 맹검(blind)인 경우에 최적으로 수행된다. 이러한 검사를 위한 항체 전달의 최적 메커니즘은 IP 주입이다. 하지만, 상기 검사는 피하 주입, IV 주입(가령, 꼬리 정맥을 통하여), 근육내 주입, 또는 구강, 흡입 또는 국소 투여가 이용되도록 조정될 수 있다.
치료는 평균 관절염 스코어가 운반제 단독 대조군에서보다 치료된 군에서 더욱 낮은 경우에(통계학적으로 유의한 양으로) Tg197 모형 시스템에서 유효하다. 치료는 또한, 평균 관절염 스코어가 운반제-단독 대조군에 비하여, 적어도 0.5 단위, 적어도 1.0 단위, 적어도 1.5 단위 또는 적어도 2.0 단위 낮은 경우에 유효한 것으로 간주된다. 대안으로, 치료는 평균 관절염 스코어가 치료 섭생의 전체 과정 동안 O 내지 0.25로 유지되거나 이들 수치로 낮아지는 경우에 유효하다.
치료는 평균 관절염 스코어가 실험 과정동안 증가하지만 이런 증가의 시작이 운반제 단독 대조군에 비하여 치료된 군에서 지연되는 경우에 Tg197 모형 시스템에서 유효하다. 치료는 또한, 평균 관절염 스코어의 증가가 운반제-단독 대조군에 비하여, 치료된 군에서 적어도 0.5 주, 적어도 1 주, 적어도 1.5 주 또는 적어도 2 주 또는 3주 이상 지연되는 경우에 유효한 것으로 간주된다.
거대표현형적 스코어링의 대안으로, 치료동안 다양한 간격으로, 발목/발 관절은 고정되고 아래의 체계: 0 = 검출되는 병리 없음, 1 = 활액막(synovial membrane)의 과형성(hyperplasia)과 다형핵 침윤물(polymorphonuclear infiltrate)의 존재, 2 = 파누스(pannus)와 섬유상 조직 형성 및 병소 연골하골 골 침식(focal subchondral bone erosion), 3 = 관절 연골 파괴와 골 침식, 4 = 광범위한 관절 연골 파괴와 골 침식에 따라 조직병리학적으로 분석될 수 있다. 치료는 평균 조직병리학적 스코어가 운반제 대조군에서보다 치료된 군에서 더욱 낮은 경우에(통계학적으로 유의한 양으로) 유효한 것으로 간주된다. 치료는 또한, 평균 조직병리학적 스코어가 운반제-단독 대조군에 비하여, 적어도 0.5 단위, 적어도 1.0 단위, 적어도 1.5 단위, 적어도 2.0 단위, 적어도 2.5 단위, 적어도 3.0 단위, 또는 적어도 3.5 단위 낮은 경우에 유효한 것으로 간주된다. 대안으로, 치료는 평균 조직병리학적 스코어가 치료 섭생의 전체 과정 동안 O 내지 0.5로 유지되거나 이들 수치로 낮아지는 경우에 유효하다.
2) 확립된 관절염에 대한 항체 폴리펩티드 구조체(항-TNF-α, 항-VEGF 등)의 효과를 검사하기 위하여, 상기 검사는 현저한 관절염 표현형을 보이는 6주령부터 치료가 시작된 Tgl97 동물에서 앞서 기술된 바와 같이 수행할 수 있다. 스코어링과 효능 분석 역시 앞서 기술된 바와 동일하게 수행된다. 본 명세서에서 기술된 항-TNF-α dAb 구조체는 앞서 기술된 하나이상의 모형 시스템에서, 확립된 관절염의 진행을 중지 또는 반전시킬 수 있다.
양쪽 포맷에서, 치료 접근은 단량체, 이량체 또는 다른 다량체 형태의 항-TNF-α(가령, 본 명세서에 기술된 항-TNF-α dAb), 단량체, 이량체 또는 다른 다량체 형태의 항-VEGF(가령, 카멜리드 항-VEGF dAb를 비롯한 본 명세서에 기술된 항-VEGF dAb), 항-TNF/항-VEGF의 이중특이적 포맷 및 항-HSA, PEG 또는 다른 반감기 변화 부분을 보유하는 개별이나 이중특이적 구조체를 포함한다. 부가적으로, 본 명세서에 기술된 항-VEGF 조성물이 다른 항-TNF 조성물, 예를 들면, Etanercept(Enbrel), D2E7(Humira), Infliximab(Remicade)와의 조합으로 투여될 수 있다. 이러한 조합 요법의 효능은 예로써, 세포 배양액 및 본 명세서에 기술된 생체내 모형 시스템을 이용하여 평가될 수 있다.
관절염의 추가적으로 수용되는 동물 모형은 예로써, Horsfall et al., 1997, J. of Immunol. 159:5687에서 기술된 콜라겐 유도된 관절염(CIA) 및 예로써, Stasluk et al., 1997, Immunol. 90:81에 기술된 프리스탄(pristane)-유도된 관절염이다.
항-VEGF 폴리펩티드 구조체 효능에 대한 검사:
a) VEGF 수용체 2 결합 검사
상기 방법은 VEGF 수용체 2에 대한 VEGF165 결합을 예방하는 용해성 도메인 항체(dAb)의 능력을 측정하기 위한 VEGF 수용체 결합 검사를 기술한다.
VEGF는 시험관내에서 내피세포에 대한 특이적인 미토겐(mitogen) 및 생체내에서 강력한 혈관신생 인자인데, 다양한 유형의 종양에서 상기 단백질이 높은 수준으로 발현된다. 이는 동종이량체로서 활성을 나타내는 45kDa 당단백질이다. 현재까지, 택일적 mRNA 스플라이싱(splicing)을 통하여 생성되는 5개의 상이한 동등형(isoform)이 보고되었다. 이들 동등형 중에서, VEGF121과 VEGF165가 가장 많이 존재한다.
내피세포에 대한 VEGF의 특이적인 작용은 2가지 유형의 수용체 티로신 키나아제(RTK), VEGF R1(Flt-l)과 VEGF R2(KDR/Flk-1)에 의해 거의 조절된다. 하지만, 유사분열성(mitogenicity), 화학주성(chemotaxis), 형태적 변화의 유도와 같은 VEGF 활성은 이들 두 수용체가 VEGF의 결합이후 인산화를 겪긴 하지만, VEGF R2에 의해 매개되는 것으로 보인다.
인간 IgG1의 Fc 영역에 융합된 인간 VEGF R2의 세포외 도메인을 포함하는 재조합 인간 VEGF R2/Fc 키메라가 상기 검사에 사용된다. 간단히 말하면, 수용체는 ELISA 평판에 포획하고, 상기 평판은 비-특이적 결합을 예방하기 위하여 차단한다. 이후, VEGF165와 dAb 단백질의 혼합물을 첨가하고, 평판을 세척하고, 비오틴화된 항-VEGF 항체와 HRP 공액된 항-비오틴 항체를 이용하여 수용체 결합된 VEGF165를 검출한다. 평판은 비색 기질(colorimetric substrate)을 이용하여 현색시키고, 450nm에서 OD를 판독한다. dAb가 수용체에 대한 VEGF 결합을 차단하면, 색채는 전혀 관찰되지 않는다.
상기 검사는 아래와 같이 수행된다. 96 웰 Nunc Maxisorp 검사 평판은 탄산염 완충액 내에 0.5 ㎍/㎖에서 웰당 100 ㎕의 재조합 인간 VEGF R2/Fc(R&D Systems, Cat. No: 357-KD-050)로 4℃에서 하룻밤동안 코팅한다. 웰은 0.05% Tween/PBS로 3회 및 PBS로 3회 세척한다. PBS에 담긴 웰당 200 ㎕의 2% BSA를 평판에 첨가하여 이를 차단하고, 실온에서 최소 1시간동안 평판을 배양한다.
웰은 세척하고(상기한 바와 같이), 이후 웰당 50 ㎕의 정제된 dAb 단백질을 각 웰에 첨가한다. 그 다음, 희석액 내에 6 ng/㎖(3 ng/㎖의 최종 농도)에서 50 ㎕의 VEGF를 각 웰에 첨가하고, 실온에서 2시간동안 평판을 배양한다(상층액 분석의 경우에, 각 웰에 80 ㎕의 상층액을 첨가하고, 이후 15 ng/㎖에서 20 ㎕의 VEGF를 첨가한다.
아래의 대조가 포함된다: O ng/㎖ VEGF(희석액 단독); 3 ng/㎖ VEGF(R&D Systems, Cat No: 293-VE-050); 3 ng/㎖ VEGF + O.1 ㎍/㎖ 항-VEGF 중화 항체(R&D Systems cat#MAB293).
평판은 세척하고(상기한 바와 같이), 이후 희석액 내에 0.5 ㎍/㎖에서 100 ㎕ 비오틴화된 항-VEGF 항체(R&D Systems, Cat No: BAF293)를 첨가하고 실온에서 2시간동안 배양한다.
웰은 세척하고(상기한 바와 같이), 이후 100 ㎕ HRP 공액된 항-비오틴 항체(희석액에서 1:5000 희석; Stratech, Cat No: 200-032-096)를 첨가한다. 그 다음, 실온에서 1시간동안 평판을 배양한다.
평판은 세척하여(상기한 바와 같이) Tween-20의 잔류물을 제거함으로써, 후속의 과산화효소 검사에서 배경을 제한하고 부정확한 CD 판독을 유발하는 검사 평판 웰에서 기포의 예방을 보조한다.
100 ㎕의 SureBlue 1-Component TMB MicroWell 과산화효소 용액을 각 웰에 첨가하고, 실온에서 최대 20분간 평판을 방치한다. 결합된 HRP 표지된 공액체가 기질과 반응함에 따라 짙은 푸른색 가용성 산물이 생성된다. 반응은 100 ㎕ 1M 염화수소산의 첨가(푸른색이 황색으로 변한다)로 중단시킨다. 450nm에서 평판의 OD는 산 첨가이후 30분 이내에 96-웰 평판 판독기에서 판독한다. OD450nm은 결합된 스트렙타비딘-HRP 공액체의 양에 비례한다.
대조로부터 예상되는 결과는 아래와 같다: O ng/㎖ VEGF는 <0.15 OD의 낮은 신호를 제공한다; 3 ng/㎖ VEGF는 >0.5 OD의 신호를 제공한다; 0.1 ㎍/㎖ 중화 항체와 함께 사전-배양된 3 ng/㎖ VEGF는 <0.2 OD의 신호를 제공한다.
b) VEGF 수용체 1 결합 검사
상기 검사는 VEGF R1에 대한 VEGF165의 결합 및 이러한 상호작용을 차단하는 dAb의 능력을 측정한다.
인간 IgG1의 Fc 영역에 융합된 인간 VEGF R1의 세포외 도메인을 포함하는 재조합 인간 VEGF R1/Fc 키메라가 상기 검사에 사용된다. 간단히 말하면, 수용체는 ELISA 평판에 포획하고, 상기 평판은 비-특이적 결합을 예방하기 위하여 차단한다. 이후, VEGF165와 dAb 단백질의 혼합물을 첨가하고, 평판을 세척하고, 비오틴화된 항-VEGF 항체와 HRP 공액된 항-비오틴 항체를 이용하여 수용체 결합된 VEGF165를 검출한다. 평판은 비색 기질(colorimetric substrate)을 이용하여 현색시키고, 450nm에서 OD를 판독한다. dAb가 수용체에 대한 VEGF 결합을 차단하면, 색채는 전혀 관찰되지 않는다.
상기 검사는 아래와 같이 수행된다. 96 웰 Nunc Maxisorp 검사 평판은 탄산염 완충액 내에 0.1 ㎍/㎖에서 웰당 100 ㎕의 재조합 인간 VEGF R1/Fc(R&D Systems, Cat. No: 321-FL-050)로 4℃에서 하룻밤동안 코팅한다. 웰은 0.05% Tween/PBS로 3회 및 PBS로 3회 세척한다.
PBS에 담긴 웰당 200 ㎕의 2% BSA를 평판에 첨가하여 이를 차단하고, 실온에서 최소 1시간동안 평판을 배양한다.
웰은 세척하고(상기한 바와 같이), 이후 웰당 50 ㎕의 정제된 dAb 단백질을 각 웰에 첨가한다. 그 다음, 희석액 내에 1 ng/㎖(500 pg/㎖의 최종 농도)에서 50 ㎕의 VEGF를 각 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간동안 평판을 배양한다(상층액 분석의 경우에, 각 웰에 80 ㎕의 상층액을 첨가하고, 이후 2.5 ng/㎖에서 20 ㎕의 VEGF를 첨가한다.
아래의 대조가 포함된다: O ng/㎖ VEGF(희석액 단독); 500 pg/㎖ VEGF; 500 pg/㎖ VEGF + 1 ㎍/㎖ 항-VEGF 항체(R&D Systems cat#MAB293).
평판은 세척하고(상기한 바와 같이), 이후 희석액 내에 50 ng/㎖에서 100 ㎕ 비오틴화된 항-VEGF 항체를 첨가하고 실온에서 1시간동안 배양한다.
웰은 세척하고(상기한 바와 같이), 이후 100 ㎕ HRP 공액된 항-비오틴 항체(희석액에서 1:5000 희석)를 첨가한다. 그 다음, 실온에서 1시간동안 평판을 배양한다.
평판은 세척하여(상기한 바와 같이) Tween-20의 잔류물을 제거함으로써, 후속의 과산화효소 검사에서 배경을 제한하고 부정확한 CD 판독을 유발하는 검사 평판 웰에서 기포의 예방을 보조한다.
100 ㎕의 SureBlue 1-Component TMB MicroWell 과산화효소 용액을 각 웰에 첨가하고, 실온에서 최대 20분간 평판을 방치한다. 결합된 HRP 표지된 공액체가 기질과 반응함에 따라 짙은 푸른색 가용성 산물이 생성된다. 반응은 100 ㎕ 1M 염화수소산의 첨가(푸른색이 황색으로 변한다)로 중단시킨다. 450nm에서 평판의 OD는 산 첨가이후 30분 이내에 96-웰 평판 판독기에서 판독한다. OD450nm은 결합된 스트렙타비딘-HRP 공액체의 양에 비례한다.
대조로부터 예상되는 결과는 아래와 같다: O ng/㎖ VEGF는 <0.15 OD의 낮은 신호를 제공한다; 500 pg/㎖ VEGF는 >0.8 OD의 신호를 제공한다; 1 ㎍/㎖ 중화 항체와 함께 사전-배양된 500 pg/㎖ VEGF는 <0.3 OD의 신호를 제공한다.
c) VEGF 활성에 대한 세포-기초된 검사:
상기 생물검사는 HUVE 세포의 VEGF 유도된 증식을 중화시키는 항체 폴리펩티드(가령, dAb)와 다른 저해물질의 능력을 측정한다. 96웰 평판에 도말된 HUVE 세포는 미리-평형화된 VEGF와 dAb 단백질과 함께 72시간동안 배양된다. 이후, 세포 생존능 염료(cell viability dye)를 이용하여 세포 총수를 측정한다.
상기 검사는 아래와 같이 수행된다. HUVE 세포는 합류이하 175㎠ 플라스크로부터 트립신처리한다. 배지는 흡출하고, 세포는 5 ㎖ 트립신으로 세척하고 실온에서 5분간 2 ㎖ 트립신과 함께 배양한다. 이들 세포는 손바닥에 부딪힘으로써 플라스크의 바닥으로부터 부드럽게 떼어낸다. 이후, 8 ㎖의 유도 배지를 플라스크에 첨가하고, 이들 세포를 피펫으로 옮겨 덩어리를 분산시킨다. 생존 세포는 트리판 블루 염료를 이용하여 산정한다.
세포는 스핀 다운시키고 유도 배지에서 2X 세척하며, 세포를 스핀 다운시키고 각 세척이후 배지를 흡출한다. 최종 흡출이후, 이들 세포는 105 세포/㎖(유도 배지에서)로 희석하고 웰당 100 ㎕로 96 웰 평판 내에 도말한다(10,000개 세포/웰). 평판은 37℃에서 >2시간동안 배양하여 세포가 부착되도록 한다.
60 ㎕ dAb 단백질 및 40 ng/㎖ VEGF165(10 ng/㎖의 최종 농도)를 포함하는 60㎕ 유도 배지를 v 바닥 96 웰 평판에 첨가하고 필름으로 밀봉한다. 이후, dAb/VEGF 혼합물은 37℃에서 0.5-1시간동안 배양한다.
dAb/VEGF 평판은 배양기로부터 떼어내고, 100 ㎕의 용액을 HUVEC 포함 평판의 각 웰에 첨가한다(200 ㎕의 최종 부피). 이후, 상기 평판은 적어도 72시간동안 37℃ 배양기로 환원시킨다.
대조 웰은 아래와 같다: 세포를 포함하지만 VEGF를 포함하지 않는 웰; 세포, 양성 대조 중화 항-VEGF 항체, VEGF를 포함하는 웰; 세포와 VEGF 단독만을 포함하는 대조 웰.
세포 생존능(cell viability)은 웰당 20 ㎕의 Celltiter96 반응물을 첨가함으로써 평가하고, 평판은 갈색이 나타날 때까지 37℃에서 2-4시간동안 배양한다. 반응은 웰당 20 ㎕의 10%(w/v) SDS를 첨가함으로써 중단시킨다. 이후, 490nm에서 Wallac 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 흡광도를 판독한다.
VEGF 없음 대조의 흡광도는 모든 다른 수치로부터 삭감한다. 흡광도는 세포 총수에 비례한다. 대조 항-VEGF 항체를 포함하는 대조 웰 역시 최소의 세포 증식을 보인다. VEGF 단독을 포함하는 웰은 최대 세포 증식을 보인다.
d) VEGF 활성에 대한 생체내 검사
항-VEGF 폴리펩티드 구조체(단량체, 다량체 또는 이중특이체)의 효능은 관절염 질환의 Tgl97 유전자도입 생쥐 모형에서도 검사될 수 있다. 투약 섭생(dosing regimen)과 스코어링(scoring)은 항-TNF-α 폴리펩티드 구조체에 대하여 기술된 바와 실질적으로 동일하다.
4. 크론병의 치료
본 명세서에 기술된 항-TNF-α 폴리펩티드는 인간에서 크론병을 치료하는데 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명은 TNF-α가 관여하는 크론병 또는 다른 염증성 장 질환(IBD)의 치료 방법을 제시한다. 상기 방법은 하나이상의 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는데, 여기서 하나이상의 이들 구조체는 수용체에 대한 인간 TNFα의 결합을 길항하고 및/또는 IBD의 Tnf△ ARE 유전자도입 생쥐 모형의 생쥐에 투여되는 경우에 급성이나 만성 염증성 장 스코어의 증가를 예방하고 및/또는 L929 세포독성 검사에서 TNF-α를 중화시킨다. 특히, 크론병 또는 다른 염증성 장 질환의 치료 방법은 하나이상의 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체를 함유하는 조성물의 투여를 포함하는데, 여기서 하나이상의 이들 구조체는 수용체에 대한 인간 TNFα의 결합을 길항하고, Tnf△ ARE 유전자도입 생쥐에 상기 조성물의 투여는 급성이나 만성 염증성 장 스코어의 증가를 예방하거나 감소를 유도한다.
크론병의 Tnf△ ARE 유전자도입 생쥐 모형은 Kontoyiannis et al., 1999, Immunity 10: 387-398; Kontoyiannis et al., 2002, J. Exp. Med. 196: 1563-1574에서 처음 기술되었다. 이들 생쥐는 TNF-α mRNA의 3' AU-풍부한 요소(ARE)에서 표적된 결실 돌연변이를 보유한다. AU-풍부한 요소는 낮은 mRNA 안정성을 유지하는데 관여하고, 이들의 파괴는 이들 동물에서 뮤린 TNF-α의 과다발현을 유발한다. 이들 동물은 4주령 내지 8주령부터 크론병과 유사한 IBD 표현형이 나타난다. 기본 조직병리학적 특징은 융모 블런팅(villus blunting) 및 PMN/대식세포와 림프구성 삼출액(lymphocytic exudate)이 우세한 점막하 염증(submucosal inflammation)를 포함하고, 산재된 경점막 염증(patchy transmural inflammation) 및 림프성 군체(lymphoid aggregate)와 미발달 육아종(rudimentary granulomata)의 출현으로 진행된다(Kontoyiannis et al., 2002, supra.). 이들 동물은 관절염 표현형 역시 나타나고, 따라서 RA에서 항-TNF-α 치료의 효능을 별도로 평가하는 데에도 이용될 수 있다.
IBD를 예방하는데 있어 치료 효능을 평가하는 경우에, 치료는 예로써, 3주령에 소정의 항체 폴리펩티드 구조체의 최초 주1회 IP 투약으로 시작된다. 최초 연구의 결과에 따라, 더욱 높거나 더욱 낮은 빈도의 투약 간격이 당업자에 의해 선택될 수 있다. 이후, 동물은 Kontoyiannis et al., 2002, supra에 기술된 바와 같이 표준 스케일에 따라 장 질환을 모니터할 수 있다. 회장의 파라핀-포매된 장 조직 절편은 아래의 스케일에 따라 맹검 방식으로 조직학적으로 평가된다: 급성과 만성 염증은 아래와 같이 최소 8 고배율시야(high power field, hpf)에서 독립적으로 평가된다 - 급성 염증 스코어 0 = hpf당 0-1 다핵형(PMN) 세포(PMN/hpf); 1 = 점막 내에 2-10 PMN/hpf; 2 = 점막 내에 11-20 PMN/hpf; 3 = 점막 내에 21-30 PMN/hpf, 또는 점막근판(muscularis mucosae) 아래 확장과 함께 11-20 PMN/hpf; 4 = 점막 내에 >30 PMN/hpf, 또는 점막근판 아래 확장과 함께 >20 PMN/hpf. 만성 염증 스코어 0 = 점막 내에 hpf당 0-10 단핵 백혈구(ML)(ML/hpf); 1 = 점막 내에 11-20 ML/hpf; 2 = 점막 내에 21-30 ML/hpf, 또는 점막근판 아래 확장과 함께 11-20 ML/hpf; 3 = 점막 내에 31-40 ML/hpf, 또는 점막근판 아래 확장 또는 여포 과형성(follicular hyperplasia)과 함께 21-30 ML/hpf; 4 = 점막 내에 >40 ML/hpf, 또는 점막근판 아래 확장 또는 여포 과형성(follicular hyperplasia)과 함께 >30 ML/hpf. 생쥐당 전체 질환 스코어는 각 생쥐에 대한 급성 염증이나 만성 염증 스코어의 합계로 계산된다.
확립된 질환에 치료의 효과를 평가하기 위하여, 치료는 6-8주령에 시작하고 스코어링은 동일한 방식으로 수행하였다.
치료는 평균 조직병리학적 질병 스코어가 운반제 대조군에서보다 치료된 군에서 더욱 낮은 경우에(통계학적으로 유의한 양으로) 유효한 것으로 간주된다. 치료는 또한, 평균 조직병리학적 스코어가 운반제-단독 대조군에 비하여, 적어도 0.5 단위, 적어도 1.0 단위, 적어도 1.5 단위, 적어도 2.0 단위, 적어도 2.5 단위, 적어도 3.0 단위, 또는 적어도 3.5 단위 낮은 경우에 유효한 것으로 간주된다. 대안으로, 치료는 평균 조직병리학적 스코어가 치료 섭생의 전체 과정 동안 O 내지 0.5로 유지되거나 이들 수치로 낮아지는 경우에 유효하다.
IBD의 다른 모형에는 예로써, BALB/c 생쥐에서 만성 대장염의 DSS(덱스트란 황산나트륨) 모형이 포함된다. DSS 모형은 Okayasu et al., 1990, Gastroenterology 98: 694-702에서 최초로 기술되었고, Kojonharoff et al., 1997, Clin Exp. Immunol. 107: 353-358에서 변형되었다(참조: WO 2004/041862). 21-22 g 중량의 BALB/c 생쥐는 7일의 치료 및 DSS 없는 12일의 회복 휴지기의 사이클에서 음용수 내에 5% w/v로 DSS의 투여에 의해 만성 대장염을 유도하도록 처리된다. 4차 회복 기간은 더욱 짧은 회복으로 모형되는 급성 상태보다는 만성 염증 상태를 나타내기 위하여 12에서 21일로 연장될 수 있다. 마지막 회복 기간이후, 본 명세서에 기술된 항체 폴리펩티드, 예를 들면, 항-TNF-α 폴리펩티드가 치료적으로 투여된다. 주1회 투여는 초기에 권장되지만, 필요에 따라(특히, 예로써, 상이한 반감기 변화 부분을 포함하는 투약 형태를 평가하기 위하여) 당업자에 의해 조정될 수 있다. 치료 동안 휴지기에, 동물은 희생시키고, 장을 절개하고, 본 명세서에 기술된 바와 같이 또는 Kojouharoff et al., 1997, supra에 기술된 바와 같이 조직병리학적 스코어를 평가한다.
염증성 장 질환의 다른 동물 모형은 2,4,6-트리니트로벤젠 술폰산(TNBS)의 직장 주입에 의해 유도된 만성 장 염증이다(Neurath et al., 1995, J. Exp. Med. 182: 1281; U.S. 6,764,838), 조직병리학적 스코어링은 앞서 기술된 동일한 표준을 이용하여 수행될 수 있다.
다른 항-TNF-α 약제와의 비교
본 발명에서는 RA, 크론병 및 다른 TNF-α 매개된 질환의 치료에 유효한 항-TNF-dAb 구조체를 개시한다. 한 측면에서, 항-TNF-α dAb 구조체의 효능은 Etanercept(ENBREL), Infliximab(REMICADE), D2E7(HUMIRA; U.S. patent No. 6,090,382 참조)에서 선택되는 약제의 효능보다 뛰어나거나 이에 필적하다.
인간 IgG1의 Fc 영역에 연결된 용해성 인간 TNFR(p75)의 재조합 이형(sTNFR(p75):Fc, ENBREL, Immunex)의 임상 시험은 이의 투여가 RA 질병 활성(disease activity)에서 현저하고 급속한 감소를 유도한다는 것을 증명한다(Moreland et al., 1997, N. Eng. J. Med., 337:141-147). 이에 더하여, sTNFR(p75):Fc에 대한 소아 임상 시험으로부터 예비 안정성 데이터는 상기 약물이 연소기 류머티스성 관절염(JRA)을 앓는 환자에 의해 전반적으로 관용된다는 것을 지시한다(Garrison et al, 1998, Am. College of Rheumatology meeting, Nov. 9, 1998, abstract 584).
상기한 바와 같이, ENBREL은 인간 IgGl의 Fc 영역에 연결된 인간 75 킬로달톤(p75) TNFR(GenBank Accession No. P20333)의 세포외 리간드-결합 부분으로 구성되는 이량체 융합 단백질이다. ENBREL의 Fc 성분은 IgGl의 CH2 도메인, CH3 도메인, 힌지 영역을 보유하지만 CH1 도메인을 보유하지 않는다. ENBREL은 중국 햄스터 난소(CHO) 포유동물 세포 발현 시스템에서 생산된다. 이는 934개의 아미노산으로 구성되고 대략 150 킬로달톤의 겉보기 분자량(apparent molecular weight)를 갖는다(Smith et al., 1990, Science 248:1019-1023; Mohler et al., 1993, J. Immunol. 151:1548-1561; U.S. Pat. No. 5,395,760(Immunex Corporation, Seaffle, Wash.); U.S. Pat. No. 5,605,690(Immunex Corporation, Seattle, Wash.).
메토트렉세이트와 함께 또는 메토트렉세이트 없이 투여되는 TNF-α.에 대한 단클론 항체(Infliximab, REMICADE, Centocor)는 RA의 치료에서 임상적 효능을 보였다(Elliott et al., 1993, Arthritis Rheum. 36: 1681-1690; Elliott et al., 1994, Lancet 344:1105-1110). 이들 데이터는 4주, 12주, 26주에 파울루스(Paulus)에서 20% 내지 50% 범위의 현저한 감소를 입증한다. 이러한 치료제는 정맥내 투여되고, 항-TNF 단클론 항체는 2개월 내에 순환계로부터 소멸된다. 효능의 지속 기간은 투약이 반복됨에 따라 감소하는 것으로 생각된다. 환자는 항-TNF 항체에 대한 항체가 생성할 수 있는데, 이는 이러한 요법의 효능과 지속 기간을 제한한다(Kavanaugh et al., 1998, Rheum. Dis. Clin. North Am. 24:593-614). Infliximab과의 조합으로 메토트렉세이트의 투여는 항-Infliximab 항체의 발생을 예방하는데 도움이 된다(Maini et al., 1998, Arthritis Rheum. 41:1552-1563). Infliximab은 또한, 염증성 장 질환 크론병의 치료에도 임상적 효능을 보였다(Baert et al., 1999, Gastroenterology 116:22-28).
배경 단락에서 논의한 바와 같이, Infliximab은 인간 IgG4 불변 영역과 생쥐 가변 영역을 보유하는 키메라 단클론 IgG 항체이다. Infliximab 폴리펩티드는 U.S. 특허 5,698,195와 5,656,272에서 기술된다.
이들 항-TNF-α 조성물과의 효능을 비교하기 위하여, 기존의 조성물과 병행으로 항-TNF-α dAb 구조체를 이용하여 앞서 기술된 수용체 결합 검사, 세포-기초된 검사 또는 생체내 검사 중에서 하나이상을 수행해야 한다. 따라서, 이러한 접근법은 이들 항-TNF-α dAb 구조체가 하나이상의 이들 검사에서, 비교 조성물의 효능에 필적하거나 이보다 뛰어난 효능(통계학적으로 유의한 방식으로)을 보인다는 것을 확인한다. 이들 구조체의 실례 및 동등하거나 뛰어난 효능을 입증하는 분석은 하기 실시예에서 제공된다.
도 1은 VH HSA의 항원 결합 부위 내에서 H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H96, H97, H98(각각, DVT 또는 NNK 인코딩됨) 위치에서 VH/HSA의 다양화를 나타낸다.
도 2는 파지 전시/ScFv 포맷에서, 라이브러리 1: 생식세포계 VK/DVT VH; 라이브러리 2: 생식세포계 VK/NNK VH; 라이브러리 3: 생식세포계 VH/DVT VK; 라이브러리 4: 생식세포계 VH/NNK VK를 나타낸다. 이들 라이브러리는 대부분의 클론 및 선별된 라이브러리가 기능하도록, 총괄적 리간드 단백질 A와 단백질 L로의 결합에 대해 미리-선별되었다. 라이브러리는 HSA(1차 라운드)와 β-gal(2차 라운드), 또는 HSA β-gal 선별 또는 β-gal(1차 라운드) 및 HSA(2차 라운드)β-gal HSA 선별에서 선별하였다. 이들 PCR 클론으로부터의 용해성 scFv는 서열 내에서 증폭된다. 이중특이적 항체 K8을 인코딩하는 하나의 클론이 추가 작업을 위하여 선택되었다. 뉴클레오티드 서열: SEQ ID NO: 221; 아미노산 서열: SEQ ID NO: 222.
도 3은 VH 사슬 및 VK 사슬의 정렬을 나타낸다. VH 견본, SEQ ID NO: 1; K8, SEQ ID No 223(VH)과 232(VK); VH2, SEQ ID NO: 224; VH4, SEQ ID NO: 225; VHC11, SEQ ID NO: 226; VHA10sd, SEQ ID NO: 227; VHAlsd, SEQ ID NO: 228; VHA5sd, SEQ ID NO: 229; VHC5sd, SEQ ID NO: 230; VHC11sd, SEQ ID NO: 231; Vκ 견본, SEQ ID NO: 3; E5sd, SEQ ID NO: 233; C3, SEQ ID NO: 234
도 4는 K8 항체의 결합 성질의 특성화를 나타낸다. K8 항체의 결합 성질은 단클론 파지 ELISA에 의해 특성화되는데, 이중특이적 K8 항체는 HSA와 β-gal에 결합하는 것으로 밝혀졌고 1.0 이상의 흡광 신호로 파지 표면 상에 전시되었다. 다른 단백질과의 교차 반응성(cross reactivity)은 검출되지 않았다.
도 5는 공지된 농도의 K8 항체 단편을 이용하여 수행된 용해성 scFv ELISA를 나타낸다. 96-웰 평판은 10 ㎍/㎖ 농도로 100 ㎍의 HSA, BSA, β-gal 및 1 ㎍/㎖ 농도로 100 ㎍/㎖의 단백질 A로 코팅하였다. K8 scFv의 연속적 희석액 50 ㎍을 도포하고 단백질 L-HRP로 결합된 항체 단편을 검출하였다. ELISA 결과는 K8 항체의 이중특이성을 확증한다.
도 6은 용해성 scFv ELISA를 이용하여 분석된 클론 K8 Vκ/견본 VH의 결합 특성을 나타낸다. 용해성 scFv 단편의 생성은 Harrison et al, Methods Enzymol 1996; 267:83-109에 기술된 IPTG로 유도하고, scFv를 포함하는 상층액은 직접 분석하였다. 용해성 scFv ELISA는 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행하고, 결합된 scFv는 단백질 L-HRP로 검출하였다. ELISA 결과는 이러한 클론이 여전히 β-gal에 결합할 수 있는 반면, BSA 결합은 제거되었음을 증명하였다.
도 7은 가변 도메인 벡터 1과 2의 서열을 나타낸다. 뉴클레오티드 서열: SEQ ID NO: 221; 아미노산 서열: SEQ ID NO: 222.
도 8은 VH1/VH2 다중특이적 리간드를 작제하는데 이용된 CH 벡터의 유전자지도이다.
도 9는 VK1/VK2 다중특이적 리간드를 작제하는데 이용된 VK 벡터의 유전자지도이다.
도 10은 TAR1-5 이량체 4, TAR1-5-19 이량체 4, TAR1-5-19 단량체를 비교하는 TNF 수용체 검사를 나타낸다.
도 11은 TAR1-5 이량체 1-6을 비교하는 TNF 수용체 검사를 나타낸다. 모든 이량체는 FPLC 정제되었고, 최적 이량체 종류에 대한 결과가 도시된다.
도 12는 상이한 포맷의 TAR1-5-19 동종이량체의 TNF 수용체 검사를 나타낸다: 3U, 5U 또는 7U 링커를 갖는 dAb-링커-dAb 포맷, Fab 포맷, 시스테인 힌지 링커 포맷.
도 13은 라이브러리 1에 대한 견본 VH 서열을 나타낸다. 생식세포계 서열 DP47 - JH4b에 기초한 VH 프레임워크의 서열. NNK 무작위화(N = A 또는 T 또는 C 또는 G 뉴클레오티드; K = G 또는 T 뉴클레오티드)가 라이브러리 1에 통합된 위치는 굵은 밑줄로 표시된다.
도 14는 라이브러리 2에 대한 견본 VH 서열을 나타낸다. 생식세포계 서열 DP47 - JH4b에 기초한 VH 프레임워크의 서열을 나타낸다. NNK 무작위화(N = A 또는 T 또는 C 또는 G 뉴클레오티드; K = G 또는 T 뉴클레오티드)가 라이브러리 2에 통합된 위치는 굵은 밑줄로 표시된다. 아미노산 서열: SEQ ID NO: 235; 뉴클레오티드 서열, 위쪽 가닥: SEQ ID NO: 236.
도 15는 라이브러리 3에 대한 견본 VK 서열을 나타낸다. 생식세포계 서열 DPK9 - JK1에 기초한 VK 프레임워크의 서열. NNK 무작위화(N = A 또는 T 또는 C 또는 G 뉴클레오티드; K = G 또는 T 뉴클레오티드)가 라이브러리 3에 통합된 위치는 굵은 밑줄로 표시된다. 아미노산 서열: SEQ ID NO: 3; 뉴클레오티드 서열, SEQ ID NO: 4.
도 16은 항 MSA dAb MSA 16과 MSA 26의 뉴클레오티드와 아미노산 서열을 나타낸다. MSA 16: 아미노산 서열, SEQ ID NO: 237; 뉴클레오티드 서열, SEQ ID NO: 238. MSA 26: 아미노산 서열, SEQ ID NO: 239; 뉴클레오티드 서열, SEQ ID NO: 240.
도 17은 MSA 16과 26의 저해 비아코어(biacore)를 나타낸다. 정제된 dAb MSA16과 MSA26은 Kd를 결정하기 위한 저해 비아코어로 분석하였다. 간단히 말하면, dAb는 높은 밀도의 MSA로 코팅된 비아코어 CM5 칩 상에서 200RUs의 반응을 달성하는데 요구되는 dAb의 농도를 결정하기 위하여 검사하였다. dAb의 요구 농도가 결정되면, 예측된 Kd 주변의 농도 범위에서 MSA 항원은 dAb와 미리 혼합하고 하룻밤동안 배양하였다. 각 예비 혼합물에서 dAb의 MSA 코팅된 비아코어 칩으로의 결합은 30 ㎕/분의 높은 유속에서 측정하였다.
도 18은 주입이후 MSA16의 혈청 수준을 나타낸다. dAb MSA16의 혈청 반감기는 생쥐에서 측정하였다. MSA16은 대략 1.5 ㎎/㎏으로 CD1 생쥐에 단일 i.v. 주입으로 투여하였다. 2 구획 모형으로 모델링에서, MSA-16은 0.98시간의 t1/2α, 36.5시간의 t1/2β, 913 hr.㎎/㎖의 AUC를 갖는 것으로 나타났다. MSA-16은 0.06시간의 t1/2α 및 0.34시간의 t1/2β를 갖는 HEL4(항-암탉 난백 리소자임 dAb)에 비하여 상당히 연장된 반감기를 보였다.
도 19는 MSA26Ck와 TAR1-5-19CH를 포함하는 Fab-유사 단편과 TNF 결합의 저해를 보여주는 LISA(a) 및 TNF 수용체 검사(b)를 나타낸다. Fab-유사 단편으로 MSA의 첨가는 저해 수준을 감소시킨다. 1 ㎍/㎖의 TNFα로 코팅된 ELISA 평판은 ELISA 상에 유사한 신호를 제공하도록 계산된 농도에서 이중특이적 VK CH와 VK CK Fab 유사 단편 및 대조 TNFα결합 dAb로 탐침하였다. 이중특이적 dAb와 대조군 dAb 모두 2 ㎎/㎖ MSA의 존재와 부재시에 ELISA 평판을 탐침하는데 사용하였다. 이중특이적 웰에서 신호는 50% 이상 감소되었으나 dAb에서 신호는 전혀 감소되지 않았다(도 19a 참조). 동일한 이중특이적 단백질은 MSA와 함께 또는 MSA 없이 수용체 검사에 적용하고, MSA에 의한 경쟁 역시 관찰하였다(도 19c 참조). 이는 MSA의 상기 이중특이체로의 결합이 TNFα로의 결합과 경쟁함을 증명한다.
도 20은 TAR1-5-19 dAb 및 MSA16 dAb의 이황화 결합된 이형이량체와 TNF 결합의 저해를 보여주는 TNF 수용체 검사를 나타낸다. 이량체로 MSA의 첨가는 용량 의존성 방식(dose dependent manner)으로 저해 수준을 감소시킨다. TNF 수용체 검사는 일정한 농도(18 nM)의 이형이량체 및 MSA와 HSA의 일련의 희석물의 존재에서 수행하였다. 농도 범위(2 ㎎/㎖까지)에서 HSA의 존재는 TNFα를 저해하는 이량체의 능력을 감소시키지 않았다. 하지만, MSA의 첨가는 TNFα를 저해하는 이량체의 능력에서 용량 의존성 감소를 유발하였다. 이는 MSA와 TNFα가 cys 결합된 TAR1-5-19, MSA16 이량체에 대한 결합에 대해 경쟁함을 증명한다. MSA와 HSA 단독은 상기 검사에서 TNF 결합 수준에 어떠한 영향도 주지 않았다.
도 21은 인간 생식세포계 프레임워크 분절 DP47의 폴리뉴클레오티드와 아미노산 서열을 나타낸다(도 1 참조). 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1이다; 위쪽 가닥의 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 2이다.
도 22는 인간 생식세포계 프레임워크 분절 DPK9의 폴리뉴클레오티드와 아미노산 서열을 나타낸다. 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 3이다; 위쪽 가닥의 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 4이다.
도 23은 본 명세서에 기술된 TART 클론에 대한 아미노산 서열을 나타낸다(참조: 실시예 13). TART-5, SEQ ID NO: 241; TAR1-27, SEQ ID NO: 242; TAR1-261, SEQ ID NO: 243; TAR1-398, SEQ ID NO: 244; TAR1-701, SEQ ID NO: 245; TAR1-5-2, SEQ ID NO: 246; TAR1-5-3, SEQ ID NO: 247; TAR1-5-4, SEQ ID NO: 248; TAR1-5-7, SEQ ID NO: 249; TAR1-5-8, SEQ ID NO: 250; TAR1-5-10, SEQ ID NO: 251; TAR1-5-11, SEQ ID NO: 252; TAR1-5-12, SEQ ID NO: 253; TAR1-5-13, SEQ ID NO: 254; TAR1-5-19, SEQ ID NO: 191; TAR1-5-20, SEQ ID NO: 255; TAR1-5-21, SEQ ID NO: 256; TAR1-5-22, SEQ ID NO: 257; TAR1-5-23, SEQ ID NO: 258; TAR1-5-24, SEQ ID NO: 259; TAR1-5-25, SEQ ID NO: 260; TAR1-5-26, SEQ ID NO: 261; TAR1-5-27, SEQ ID NO: 262; TAR1-5-28, SEQ ID NO: 263; TAR1-5-29, SEQ ID NO: 264; TAR1-5-34, SEQ ID NO: 265; TAR1-5-35, SEQ ID NO: 266; TAR1-5-36, SEQ ID NO: 267; TAR1-5-464, SEQ ID NO: 268; TAR1-5-463, SEQ ID NO: 269; TAR1-5-460, SEQ ID NO: 270; TAR1-5-461, SEQ ID NO: 271; TAR1-5-479, SEQ ID NO: 272; TAR1-5-477, SEQ ID NO: 273; TAR1-5-478, SEQ ID NO: 274; TAR1-5-476, SEQ ID NO: 275; TAR1-5-490, SEQ ID NO: 276; TAR1h-l, SEQ ID NO: 277; TAR1h-2, SEQ ID NO: 278; TAR1h-3, SEQ ID NO: 279.
도 24는 단일 정맥내 주입이후 dAb 단량체 포맷 또는 Fc 융합 포맷에서 TAR1-5-19의 혈청 반감기의 비교를 나타낸다.
도 25는 TAR1-5-19를 이용한 일련의 Tgl97 모형 시험에서, 투여되는 dAb 구조체의 용량과 시기를 요약한다.
도 26은 Tgl97 생쥐 RA 모형에서 수행된 연구에 사용되는 상이한 포맷(Fc 융합, PEG화된, 항-TNF/항-SA 이중특이적)의 TAR1-5-19 dAb의 주1회 투약을 요약한다.
도 27은 항-TNF dAb 구조체의 효능을 기존의 항-TNF 산물의 효능에 비교하는 Tgl97 생쥐 RA 모형에서, 투여되는 항-TNF dAb 구조체의 상기 포맷(Fc 융합, PEG화된, PEG 사량체, 항-TNF/항-SA 이중특이적), 전달 양식, 용량을 요약한다.
도 28은 Tgl97 생쥐 RA 모형에서 확립된 질병 증상에 대한 항-TNF dAb의 효능을 검사하는 연구를 위한 투약과 스코어링 섭생을 나타낸다.
도 29는 인간 IgG1 불변 도메인에 융합된 인간 VEGF에 특이적인 Vκ 가변 도메인 및 인간 Cκ 불변 도메인에 융합된 인간 TNF-α에 특이적인 Vκ 가변 도메인을 포함하는 IgG-유사 이중특이적 항체에 대한 SDS PAGE 겔 분석을 나타낸다. 레인 1: InVitrogen Multimark MW 마커. 레인 2: 1X 비-환원 적하 완충액(non-reducing loading buffer)에서 항-TNF x 항-VEGF 이중특이적 항체. 레인 3: 10 mM β-멀캡토에탄올을 포함하는 1X 적하 완충액에서 항-TNF x 항-VEGF 이중특이적 항체.
도 30A와 B는 TNF-α 활성과 VEGF 수용체 결합의 검사에서 항-TNF x 항-VEGF 이중특이적 항체의 저해 효과를 조사하는 검사의 결과를 나타낸다. A. L929 TNF-α 세포독성 중화 검사의 결과. 사각형의 데이터 점으로 표시된 곡선, 대조 항-TNF-α 항체. 사면체 모서리가 위에 위치하는 삼각형의 데이터 점으로 표시된 곡선, 항-TNF x 항-VEGF 이중특이적 항체. 사면체 모서리가 아래에 위치하는 삼각형의 데이터 점으로 표시된 곡선, 항-TNF-α 단량체. B. 인간 VEGF 수용체 2 결합 검사의 결과. 사각형의 데이터 점으로 표시된 곡선, 항-TNF x 항-VEGF 이중특이적 항체. 사면체 모서리가 위에 위치하는 삼각형의 데이터 점으로 표시된 곡선, 항-VEGF 대조. 사면체 모서리가 아래에 위치하는 삼각형의 데이터 점으로 표시된 곡선, 음성 대조(negative control).
실시예 1. 인간 혈청 알부민( HSA )과 β- 갈락토시다아제(β-gal)에 대한 이중특이적 scFv 항체(K8)의 선별.
본 실시예에서는 β-gal과 HSA에 대한 이중특이적 항체를 제조하는 방법을 설명하는데, 여기서 생식세포계(견본) VH 도메인에 연결된 Vκ 가변 도메인의 레퍼토리는 β-gal에 대한 결합으로 선별하고, 생식세포계(견본) Vκ 도메인에 연결된 VH 가변 도메인의 레퍼토리는 HSA에 대한 결합으로 선별한다. 선별된 가변 VH HSA와 VκB-gal 도메인은 합치고, β-gal과 HSA에 대한 결합으로 항체를 선별한다. HSA는 인간 혈액에서 발견되는 반감기 증가 단백질(half-life increasing protein)이다.
4가지 인간 파지 항체 라이브러리가 본 실험에 이용되었다.
라이브러리 1 생식세포계 Vκ/DVT VH 8.46 x 107
라이브러리 2 생식세포계 Vκ/NNK VH 9.64 x 107
라이브러리 3 생식세포계 VH/DVT Vκ 1.47 x 108
라이브러리 4 생식세포계 VH/NNK Vκ 1.45 x 108
모든 라이브러리는 상보성 결정 영역(complementarily determining region)(CDR2와 CDR3)에서 통합된 측쇄 다양성(side chain diversity)을 갖는 VH(V3-23/DP47과 JH4b)와 Vκ(012/02/DPK9와 JK1)에 대한 단일 인간 골격에 기초한다.
라이브러리 1과 2는 견본 Vκ 서열을 보유하는 반면, VH의 서열은 위치 H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H96, H97, H98(각각, DVT 또는 NNK 인코딩됨)에서 다양화된다(도 1). 라이브러리 3과 4는 견본 VH 서열을 보유하는 반면, Vκ의 서열은 위치 L50, L53, L91, L92, L93, L94, L96(각각, DVT 또는 NNK 인코딩됨)에서 다양화된다(도 1). 이들 라이브러리는 파지미드(phagemid) pIT2/ScFv 포맷이고(도 2), 선별되지 않은 라이브러리에서 대부분의 클론이 기능성을 갖도록 총괄적 리간드, 단백질 A, 단백질 L에 대한 결합으로 사전 선별하였다. 앞서 도시된 라이브러리의 크기는 사전 선별(preselection)이후 크기에 상응한다. 라이브러리 1과 2는 항원에서 선별에 앞서 혼합하여 단일 VH/견본 Vκ 라이브러리를 생성하고, 라이브러리 3과 4는 혼합하여 단일 Vκ/견본 VH 라이브러리를 산출하였다.
β-gal에서 Vκ/견본 VH 라이브러리를 이용하여 3회 선별하고, HSA에서 VH/견본 Vκ 라이브러리를 이용하여 3회 선별하였다. β-gal의 경우에, 파지 역가(phage titre)는 1차 선별에서 1.1 x 106에서 3차 선별에서 2.0 x 108로 증가하였다. HSA의 경우에, 파지 역가는 1차 선별에서 2 x 104에서 3차 선별에서 1.4 x 109로 증가하였다. 이들 선별은 KM13 헬퍼 파지(D2와 D3 도메인 사이에 프로테아제 절단 부위를 보유하는 pIII 단백질을 포함한다)가 이용되고 파지가 PBS에 녹인 1 ㎎/㎖ 트립신으로 용리된 점을 제외하고, Griffith et al.,(1993)에 기술된 바와 동일하게 수행되었다. 첨가된 트립신은 헬퍼 파지로부터 유래된 pIII 단백질(파지미드로부터 유래된 pIII 단백질은 해당하지 않음)을 절단하고, 결합된 scFv-파지 융합을 c-myc 태그에서 절단으로 용리하여(도 2) 기능성 scFv를 발현하는 파지의 추가적인 농축 및 배경에서 상응하는 감소를 제공한다(Kristensen & Winter, Folding & Design 3: 321-328, Jul 9, 1998). 선별은 100 ㎍/㎖ 농도의 HSA 또는 β-gal로 코팅된 면역튜브(immunotube)를 이용하여 수행하였다.
결합을 조사하기 위하여, 3차례의 선별 각각으로부터 콜로니를 단클론 파지 ELISA로 스크리닝하였다. 파지 입자는 Harrison et al., Methods Enzymol. 1996;267:83-109에 기술된 바와 동일하게 생산하였다. 96-웰 ELISA 평판은 PBS에 담긴 10 ㎍/㎖ 농도로 100 ㎕의 HSA 또는 β-gal로 4℃에서 하룻밤동안 코팅하였다. 항-M13-HRP 공액체로 결합된 파지의 검출을 이용한 표준 ELISA 프로토콜을 따랐다(Hoogenboom et al., 1991). 클론의 선별은 50㎕ 상층액으로 1.0 이상의 ELISA 신호를 제공하였다.
이후, HSA에서 선별된 VH/견본 Vκ 라이브러리 및 β-gal에서 선별된 Vκ/견본 VH 라이브러리로부터, QIAprep Spin Miniprep 키트(Qiagen)를 이용하여 DNA prep를 만들었다.
*최대의 다양성에 근접하기 위하여, DNA prep는 3차례의 선별 각각으로부터 만들고, 이후 각 항원에 대하여 통합하였다. DNA prep는 37℃에서 하룻밤동안 SalI/NotI으로 절단하였다. 이들 단편의 겔 정제이후, HSA에서 선별된 VH/견본 Vκ 라이브러리의 견본 Vκ 사슬 대신에, β-gal에서 선별된 Vκ/견본 VH 라이브러리로부터 Vκ 사슬을 결찰시켜 3.3 x 109개의 클론 라이브러리를 산출하였다.
이후, 상기 라이브러리는 HSA(1차 선별)와 β-gal(2차 선별)에서, HSA/β-gal 선별로, 또는 β-gal(1차 선별)과 HSA(2차 선별)에서, β-gal/HSA 선별로 선별하였다. 선별은 앞서 기술된 바와 같이 수행하였다. 2차 선별이후 각 경우에, 48개의 클론에서 단클론 파지 ELISA(앞서 기술된 바와 동일함) 및 용해성 scFv 단편의 ELISA로 HSA와 β-gal에 대한 결합을 검사하였다. 용해성 항체 단편은 Harrison et al.,(1996)에 기술된 바와 같이 생산하고, 2% Tween/PBS를 차단 완충액(blocking buffer)으로 사용하고 결합된 scFv를 단백질 L-HRP로 검출한 점을 제외하고 표준 ELISA 프로토콜을 따랐다(Hoogenboom et al.(1991) Nucleic Acids Res., 19: 4133). HSA/β-gal 선별로부터 3개의 클론(E4, E5, E8) 및 β-gal/HSA 선별로부터의 2개의 클론(K8, K10)은 양쪽 항원에 결합할 수 있었다. 이들 클론으로부터의 scFv는 프라이머 LMB3과 pHENseq를 이용하여 Ignatovich et al., J. Mol. Biol. 1999 Nov 26;294(2):457-65에 기술된 바와 같이 PCR 증폭하고 염기서열분석하였다. 서열 분석에서, 모든 클론이 동일함이 확인되었다. 이런 이유로, 이중특이적 항체를 인코딩하는 하나의 클론(K8)만이 추가의 작업을 위하여 선별되었다(도 3).
실시예 2. K8 항체의 결합 특성의 특성화
첫째, K8 항체의 결합 특성은 단클론 파지 ELISA로 특성화하였다. 96-웰 플레이트는 4℃에서 하룻밤동안, PBS에 담긴 10 ㎍/㎖ 농도에서 알칼리성 포스파타제(APS), 소 혈청 알부민(BSA), 땅콩 아글루티닌, 리소자임, 사이토크롬 c(교차-반응성을 조사하기 위해)와 함께, 100 ㎕의 HSA 또는 β-gal로 코팅하였다. K8 클론으로부터 파지미드는 Harrison et al. (1996)에 기술된 바와 같이 KM13으로 구출하고, 파지를 포함하는 상층액(50 ㎕)은 직접 분석하였다. 항-M13-HRP 공액체로 결합 파지의 검출을 이용한 표준 ELISA 프로토콜을 따랐다(Hoogenboon et al. 1991). 이중특이적 K8 항체는 1.0 이상의 흡광 신호(absorbance signal)로 파지 표면상에 전시될 때 HSA와 β-gal에 결합하는 것으로 밝혀졌다(도 4). BSA에 대한 강한 결합 역시 관찰되었다(도 4).
HSA와 BSA가 아미노산 수준에서 76% 상동하기 때문에, K8 항체가 이들 구조적으로 관련된 단백질 둘 모두를 인식한다는 것은 놀라운 일이 아니다. 다른 단백질과의 교차-반응성은 검출되지 않았다(도 4).
둘째, K8 항체의 결합 특성은 용해성 scFv ELISA에서 검사하였다. 용해성 scFv 단편의 제조는 Harrison et al. (1996)에 기술된 바와 같이, IPTG로 유도하였다. K8 scFv의 발현 수준을 측정하기 위하여, 용해성 항체 단편은 Harlow and Lane, Antibodies: a Laboratory Manual (1988) Cold Spring Harbor에 기술된 바와 같이, 단백질 A 세파로스 칼럼을 이용하여 50 ㎖ 유도 상층액으로부터 정제하였다. 이후, OD280을 측정하고, Sambrook et al., (1989)에 기술된 바와 같이, 단백질 농도를 계산하였다. K8 scFv는 상층액에서 19 ㎎/㎖로 생산하였다.
이후, 용해성 scFv ELISA는 알려진 농도의 K8 항체 단편을 이용하여 수행하였다. 96-웰 플레이트는 10 ㎍/㎖ 농도에서 100 ㎕의 HSA, BSA, β-gal 및 1 ㎍/㎖ 농도에서 100 ㎕의 단백질 A로 코팅하였다. K8 scFv의 연속 희석액 50 ㎕를 도포하고, 결합된 항체 단편을 단백질 L-HRP로 검출하였다. ELISA 결과는 K8 항체의 이중특이적 성질을 확증하였다(도 5).
β-gal에 대한 결합이 K8 scFv 항체의 Vκ 도메인에 의해 결정되고, HSA/BSA에 대한 결합이 K8 scFv 항체의 VH 도메인에 의해 결정됨을 확증하기 위하여, Vκ 도메인을 SalI/NotI 분해로 K8 scFv DNA로부터 절단하고 견본 VH 사슬을 포함하는 SalI/NotI 절단된 pIT2 벡터로 결찰하였다(도 1과 2). 수득된 클론 K8Vκ/견본 VH의 결합 특성은 용해성 scFv ELISA로 분석하였다. 용해성 scFv 단편의 생산은 Harrison et al. (1996)에 기술된 바와 같이 IPTG로 유도하고, scFv를 포함하는 상층액(50 ㎕)은 직접 검사하였다. 용해성 scFv ELISA는 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행하고, 결합된 scFv는 단백질 L-HRP로 검출하였다. ELISA 결과는 상기 클론이 β-gal에 여전히 결합할 수 있는 반면, BSA에 대한 결합이 제거되었음을 나타냈다(도 6).
실시예 3: 항원 A와 B에 대한 단일 V H 도메인 항체 및 항원 C와 D에 대한 단일 Vκ 도메인 항체의 선별
본 실시예에서는 항원 A와 B에 대한 단일 VH 도메인 항체 및 항원 C와 D에 대한 단일 Vκ 도메인 항체를 상보성 가변 도메인의 부재에서 이들 항원에 대한 결합에 대하여 버진(virgin) 단일 항체 가변 도메인의 레퍼토리를 선별함으로서 제조하는 방법을 기술한다.
결합 클론의 선별 및 특성화는 앞서 기술된 바와 같이 수행한다(실시예 5, PCT/GB02/003014 참조). 추가 작업을 위하여 4개의 클론이 선별되었다:
VH1 - 항 A VH
VH2 - 항 B VH
VK1 - 항 C Vκ
VK2 - 항 D Vκ
실시예 1-3에서 앞서 기술된 절차를 유사한 방식으로 이용하여, VH 도메인의 조합(즉, VH-VH 리간드) 및 VL 도메인의 조합(즉, VL-VL 리간드)을 포함하는 이량체 분자를 생성한다.
실시예 4: 이중특이적 ScFv 항체의 생성과 특성화(항원 A와 B에 대한 VH1/VH2 및 항원 C와 D에 대한 VK1/VK2)
본 실시예에서는 이중특이적 ScFv 항체(항원 A와 B에 대한 VH1/VH2 항체 및 항원 C와 D에 대한 VK1/VK2)가 ScFv 벡터에서 개별 항원에 대해 선별된 Vκ와 VH 단일 도메인을 결합시킴으로서 생성될 수 있다. 이중특이적 항체 VH1/VH2를 생성하기 위하여, VH1 단일 도메인은 NcoI/XhoI 절단으로 가변 도메인 벡터 1(도 7)로부터 절제하고, NcoI/XhoI 절단된 가변 도메인 벡터 2(도 7)로 결찰하여 VH1/가변 도메인 벡터 2를 생성한다. VH2 단일 도메인은 SalI 제한 부위를 5' 말단에 도입하고 NotI 제한 부위를 3' 말단에 도입하는 프라이머를 이용하여 가변 도메인 벡터 1로부터 PCR 증폭한다. 이후, PCR 생성물은 SalI/NotI로 절단하고, SalI/NotI 절단된 VH1/가변 도메인 벡터 2 로 결찰하여 VH1/VH2 가변 도메인 벡터 2를 생성한다.
VK1/VK2 가변 도메인 벡터 2는 유사한 방법으로 생성된다. 생성된 VH1/VH2 ScFv 및 VK1/VK2 ScFv의 이중특이적 성질은 앞서 기술된 바와 같이, 용해성 ScFv ELISA에서 검사한다(실시예 6, PCT/GB02/003014 참조). 경쟁 ELISA는 앞서 기술된 바와 같이 수행한다(실시예 8, PCT/GB02/003014 참조).
가능한 결과:
- VH1/VH2 ScFv는 항원 A와 B에 동시에 결합할 수 있다.
- VK1/VK2 ScFv는 항원 C와 D에 동시에 결합할 수 있다.
- VH1/VH2 ScFv 결합은 경쟁적이다(항원 A에 결합되면, VH1/VH2 ScFv는 항원 B에 결합할 수 없다).
- VK1/VK2 ScFv 결합은 경쟁적이다(항원 C에 결합되면, VK1/VK2 ScFv는 항원 D에 결합할 수 없다).
실시예 5: 이중특이적 VH1 / VH2 Fab 및 VK1 / VK2 Fab 의 작제 및 이들의 결합 특성의 분석
VH1/VH2 Fab을 생성하기 위하여, VH1 단일 도메인은 NcoI/XhoI 절단된 CH 벡터(도 8)로 결찰하여 VH1/CH를 생성하고, VH2 단일 도메인은 SalI/NotI 분해된 CK 벡터(도 9)로 결찰하여 VH2/CK를 생성한다. VH1/CH 및 VH2/CK로부터 플라스미드 DNA는 앞서 기술된 바와 같이, 적격 대장균(E. coil) 세포를 동시-형질전환시키는데 이용된다(실시예 8, PCT/GB02/003014 참조).
이후, 앞서 기술된 바와 같이, VH1/CH 및 VH2/CK 플라스미드를 포함하는 클론을 IPTG로 유도하여 용해성 VH1/VH2 Fab를 생성한다(실시예 8, PCT/GB02/003014 참조).
VK1/VK2 Fab은 유사한 방법으로 생성된다.
생성된 Fab의 결합 특성은 앞서 기술된 바와 같이, 경쟁 ELISA로 검사한다(실시예 8, PCT/GB02/003014 참조).
가능한 결과:
- VH1/VH2 Fab는 항원 A와 B에 동시에 결합할 수 있다.
- VK1/VK2 Fab는 항원 C와 D에 동시에 결합할 수 있다.
- VH1/VH2 Fab 결합은 경쟁적이다(항원 A에 결합되면, VH1/VH2 Fab는 항원 B에 결합할 수 없다).
- VK1/VK2 Fab 결합은 경쟁적이다(항원 C에 결합되면, VK1/VK2 Fab는 항원 D에 결합할 수 없다).
실시예 6. 킬레이팅 dAb 이량체
*요약
VH와 VK 동종이량체는 유연한 폴리펩티드 링커를 이용하여 dAb-링커-dAb 포맷으로 생성한다. 벡터는 상이한 길이 3U:(Gly4Ser)3, 5U:(Gly4Ser)5, 7U:(Gly4Ser)7의 글리신-세린 링커를 포함하는 dAb-링커-dAb 포맷으로 생성하였다. 이량체 라이브러리는 링커 상류에 안내 dAb: TAR-5(VK), TAR1-27(VK), TAR2-5(VH) 또는 TAR2-6(VK) 및 링커이후 상응하는 두 번째 dAb의 라이브러리를 이용하여 생성하였다. 이런 방법을 이용하여 신규한 이량체 dAb를 선별하였다. 항원 결합에 대한 이량체화의 효과는 ELISA와 BIAcore 연구 및 세포 중화와 수용체 결합 검사로 결정하였다. TAR1-5 및 TAR1-27 모두의 이량체화는 결합 친화력 및 중화 수준에서 유의적인 증가를 유도하였다.
1.0 방법
1.1 라이브러리 생성
1.1.1 벡터
pEDA3U, pEDA5U, pEDA7U 벡터는 dAb-링커-dAb 포맷과 양립가능한 상이한 링커 길이를 도입하도록 설계되었다. pEDA3U의 경우에, 센스와 안티센스 73개-염기쌍 올리고 링커는 0.1 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7.4를 함유하는 완충액에서 완만한 어닐링 프로그램(95℃-5분, 80℃-10분, 70℃-15분, 사용 때까지 42℃)을 이용하여 어닐링하고, XhoI와 NotI 제한 부위를 이용하여 클론하였다.
링커는 SalI과 NotI 클로닝 부위 사이에 위치하는 3개의 (Gly4Ser)(SEQ ID NO: 7) 단위 및 안내자(stuffer) 영역을 포함하였다(도표 1). 파지 전시(phage display)에 의해 단량체 dAb가 선별되는 가능성을 감소시키기 위하여, 안내자 영역은 3개 종결 코돈, SacI 제한 부위 및 두 번째 dAb가 존재하지 않는 경우에 프레임으로부터 상기 영역을 치환시키는 프레인 쉬프트 돌연변이(frame shift mutation)를 보유하도록 설계되었다. pEDA5U와 pEDA7U의 경우에, 필요한 링커의 길이로 인하여, 각 벡터에 대해 중복 올리고-링커를 설계하고 어닐링하며 Klenow를 이용하여 신장시켰다. 이후, 단편은 정제하고 XhoI와 NotI 제한 부위를 이용한 클로닝에 앞서, 적당한 효소를 이용하여 절단하였다.
Figure 112010026521157-pat00007
도표 1
1.1.2 라이브러리 제조
안내 dAb에 상응하는 N-말단 V 유전자는 NcoI와 XhoI 제한 부위를 이용하여 링커의 상류에 클론하였다. VH 유전자는 현존하는 양립성 부위를 보유하는 반면, 클로닝 VK 유전자는 적당한 제한 효소의 도입을 필요로 하였다. 이는 SuperTaq(HTBiotechnology Ltd)와 pfu 터보(Stratagene)의 2:1 혼합물을 이용한 30회 사이클의 PCR 증폭에서 변형 PCR 프라이머(VK-DLIBF: 5'-cggccatggcgtcaacggacat-3'; VKXhoIR: 5'-atgtgcgctcgagcgtttgattt-3')를 이용함으로서 달성하였다. 이는 인접한 SalI 부위를 파괴하는 동안 5' 말단에서 NcoI 부위를 유지시키고 3' 말단에 XhoI 부위를 도입하였다. 5개의 안내 dAb: TAR1-5(VK), TAR1-27(VK), TAR2-5(VH), TAR2-6(VK), TAR2-7(VK)은 3개의 이량체 벡터 각각에 클론하였다. 모든 구조체는 서열 분석으로 확인하였다.
각 벡터(pEDA3U, 5U, 7U)에서 링커의 상류에 안내 dAb: TAR1-5(VK), TAR1-27(VK), TAR2-5(VH) 또는 TAR2-6(VK)을 클론한 이후, 상응하는 두 번째 dAb의 라이브러리를 링커 뒤에 클론하였다. 이를 달성하기 위하여, 상보성 dAb 라이브러리는 TAR1-5 또는 TAR1-27이 안내 dAb인 경우에 인간 TNFα에 대한 VK 라이브러리(1차 라운드이후 대략 1 x 106 다양성), 또는 TAR2-5 또는 TAR2-6이 각각, 안내 dAb인 경우에 인간 p55 TNF 수용체에 대한 VH 또는 VK 라이브러리(둘 모두, 1차 라운드이후 대략 1 x 105 다양성)의 1차 라운드 선별로부터 회수된 파지로부터 PCR 증폭하였다. VK 라이브러리의 경우에 PCR 증폭은 SuperTaq와 pfu 터보의 2:1 혼합물을 이용한 30회 사이클의 PCR 증폭에서 프라이머를 이용하여 수행하였다. VH 라이브러리는 상기 유전자의 5' 말단에서 SalI 제한 부위를 도입하기 위한 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하였다. dAb 라이브러리 PCR은 적당한 제한 효소로 절단하고, SalI/NotI 제한 부위를 이용하여 링커의 하류에 상응하는 벡터 내로 결찰하고, 새로 준비된 적격 TG1 세포 내로 전기천공(electroporation)하였다.
각 라이브러리에서 달성된 역가는 아래와 같다:
TAR1-5: pEDA3U = 4 x 108, pEDA5U = 8 x 107, pEDA7U = 1 x 108
TAR1-27: pEDA3U = 6.2 x 108, pEDA5U = 1 x 108, pEDA7U = 1 x 109
TAR2h-5: pEDA3U = 4 x 107, pEDA5U = 2 x 108, pEDA7U = 8 x 107
TAR2h-6: pEDA3U = 7.4 x 108, pEDA5U = 1.2 x 108, pEDA7U = 2.2 x 108
1.2 선별
1.2.1 TNFα
선별은 면역튜브에 수동으로 코팅된 인간 TNFα를 이용하여 수행하였다. 간단히 말하면, 면역튜브는 1-4 ㎖의 필요한 항원과 함께 하룻밤동안 코팅하였다. 이후, 면역튜브는 PBS로 3회 세척하고 PBS에 담긴 2% 우유 분말로 1-2시간 동안 차단하고 PBS로 3회 추가로 세척하였다. 파지 용액은 PBS에 담긴 2% 우유 분말에 희석하고 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 이들 튜브는 PBS로 세척하고, 파지는 1 ㎎/㎖의 트립신-PBS로 용리하였다. TAR1-5 이량체 라이브러리에서 3가지 선별 전략을 조사하였다. 1차 라운드 선별은 1 ㎍/㎖ 또는 20 ㎍/㎖로 코팅되고 PBS 0.1% Tween에서 20회 세척된 인간 TNFα를 이용하여 면역튜브에서 수행하였다. TG1 세포는 용출된 파지로 감염시키고 역가를 결정한다(가령, Marks et al. J. Mol. Biol. 1991, Dec 5;222(3)581-97, Richmann et al. Biotchemistry. 1993 Aug 31;32(34)8848-55).
회수된 역가는 아래와 같다:
pEDA3U = 2.8 x 107(1 ㎍/㎖ TNF), 1.5 x 108(20 ㎍/㎖ TNF),
pEDA5U = 1.8 x 107(1 ㎍/㎖ TNF), 1.6 x 108(20 ㎍/㎖ TNF),
pEDA7U = 8 x 106(1 ㎍/㎖ TNF), 7 x 107(20 ㎍/㎖ TNF).
2차 라운드 선별은 3가지 상이한 방법을 이용하여 수행하였다.
1. 면역튜브에서, 하룻밤동안 배양하면서 20회 세척, 이후 10회 추가 세척.
2. 면역튜브에서, 20회 세척, 이후 실온에서 세척 완충액(1 ㎍/㎖ TNFα 포함)에서 1시간 배양과 10회 추가 세척.
3. 33 pmole 비오틴화 인간 TNFα를 이용한 스트렙타비딘 비드 상에서 선별(Henderikx et al. 2002, Selection of antibodies against biotinylated antigens. Antibody Phage Display: Methods and protocols, Ed. O'Brien and Atkin, Humana Press). 2차 라운드 선별로부터 단일 클론은 96 웰 플레이트로 채집하고, 2 ㎖의 96 웰 평판 포맷에서 정제되지 않은 상층액 prep을 만들었다.
Figure 112010026521157-pat00008
TAR1-27의 경우에, 선별은 아래의 변형을 제외하고, 앞서 기술된 바와 동일하게 수행하였다. 1차 라운드 선별은 1 ㎍/㎖ 또는 20 ㎍/㎖로 코팅하고 PBS 0.1% Tween에서 20회 세척된 인간 TNFα를 이용하여 면역튜브에서 수행하였다. 2차 라운드 선별은 하룻밤동안 배양하면서 20회 세척, 이후 20회 추가 세척을 이용하여 면역튜브에서 수행하였다. 2차 라운드 선별로부터 단일 클론은 96 웰 평판 내로 채집하고 2 ㎖의 96 웰 평판 포맷에서 정제되지 않은 상층액 prep을 만들었다.
TAR1-27 역가는 아래와 같다:
Figure 112010026521157-pat00009
1.2.2 TNF 수용체 1(p55 수용체; TAR2)
선별은 TAR2h-5 라이브러리에 대해서만 앞서 기술된 바와 같이 수행하였다. 3차 라운드 선별은 하룻밤동안 배양하면서 PBS 0.1% Tween에서 20회 세척, 이후 20회 추가 세척된 1 ㎍/㎖ 인간 p55 TNF 수용체 또는 10 ㎍/㎖ 인간 p55 TNF 수용체를 이용하여 면역튜브에서 수행하였다. 2차와 3차 라운드 선별로부터 단일 클론은 96 웰 평판 내로 채집하고 2 ㎖의 96 웰 평판 포맷에서 정제되지 않은 상층액 prep을 만들었다.
TAR2h-5 역가는 아래와 같다:
Figure 112010026521157-pat00010
1.3 스크리닝
2차 또는 2차 라운드 선별로부터 단일 클론은 적절한 다른 선별 방법으로부터 3U, 5U, 7U 라이브러리 각각으로부터 채집하였다. 클론은 100 ㎍/㎖의 암피실린과 1% 글루코오스를 포함하는 2xTY에서, 37℃에서 하룻밤동안 성장시켰다. 이러한 배양액의 1/100 희석액은 2 ㎖, 96 웰 평판 포맷에서 100 ㎍/㎖의 암피실린과 1% 글루코오스를 포함하는 2 ㎖의 2xTY 내로 접종하고, OD600이 대략 0.9가 될 때까지 37℃에서 진탕하면서 성장시켰다. 이후, 배양액은 30℃에서 하룻밤동안 1 mM IPTG로 유도하였다.
상층액은 Sorval 평판 원심분리기에서 15분간 4000 rmp에서 원심분리로 정화하였다. 상층액 prep은 초기 스크리닝에 사용하였다.
1.3.1 ELISA
이량체 재조합 단백질의 결합 활성은 단백질 A/L ELISA 또는 항원 ELISA에 의해 단량체와 비교하였다. 간단히 말하면, 96 웰 평판은 4℃에서 하룻밤동안 항원 또는 단백질 A/L로 코팅하였다. 평판은 0.05% Tween-PBS로 세척하고, 2% Tween-PBS로 2시간 동안 차단하였다. 샘플을 평판에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 평판은 세척하고 2차 시약과 함께 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 평판은 세척하고 TMB 기질로 현색하였다. 단백질 A/L-HRP 또는 India-HRP는 2차 시약으로 사용하였다. 항원 ELISA의 경우에, 이용된 항원 농도는 인간 TNFα와 인간 THF 수용체 1에 대하여 PBS에서 1 ㎍/㎖이었다. 대부분의 경우에, 안내 dAb의 존재로 인하여, 이량체는 양성의 ELISA 신호를 제공하고, 따라서 오프 속도(off rate) 측정은 BIAcore로 조사하였다.
1.3.2 BIAcore
BIAcore 분석은 TAR1-5와 TAR2h-5 클론에 대해 수행하였다. 스크리닝을 위하여, 인간 TNFα는 높은 밀도(대략 10,000 RUs)로 CM5 칩에 결합시켰다.
50 ㎕의 인간 TNFα(50 ㎍/㎖)는 아세트산 완충액 - pH 5.5에서 5 ㎕/분으로 상기 칩에 결합시켰다. 표준 방법을 이용한 분석이후 칩 재생은 인간 TNF-α의 불안정성으로 인하여 불가능하다. 이런 이유로, 각 샘플을 분석한 이후, 칩은 완충액으로 10분간 세척하였다.
TAR1-5의 경우에, 2차 라운드 선별로부터의 클론 상층액은 BIAcore로 스크리닝하였다. 아래의 선별 방법을 이용하여 수득된 3U, 5U, 7U 라이브러리 각각으로부터 48개의 클론이 스크리닝되었다:
R1: 1 ㎍/㎖ 인간 TNFα 면역튜브, R2 1 ㎍/㎖ 인간 TNFα 면역튜브, 하룻밤동안 세척.
R1: 20 ㎍/㎖ 인간 TNFα 면역튜브, R2 20 ㎍/㎖ 인간 TNFα 면역튜브, 하룻밤동안 세척.
R1: 1 ㎍/㎖ 인간 TNFα 면역튜브, R2 비드 상에서 33 pmole 비오틴화된 인간 TNFα.
R1: 20 ㎍/㎖ 인간 TNFα 면역튜브, R2 비드 상에서 33 pmole 비오틴화된 인간 TNFα.
스크리닝을 위하여, 인간 p55 TNF 수용체는 높은 밀도(대략 4000 RUs)로 CM5 칩에 결합시켰다. 100 ㎕의 인간 p55 TNF 수용체(10 ㎍/㎖)를 아세트산 완충액 - pH 5.5에서 5 ㎕/분으로 상기 칩에 결합시켰다. 표준 재생 조건이 조사되긴 했지만(글리신 pH2 또는 pH3), 각 경우에 항원은 칩의 표면으로부터 제거되었다 - 이런 이유로, TNF-α에서처럼, 각 샘플을 분석한 이후, 칩은 완충액으로 10분간 세척하였다.
TAR2-5의 경우에, 2차 라운드 선별로부터의 클론 상층액을 스크리닝하였다.
아래의 선별 방법을 이용하여 수득된 3U, 5U, 7U 라이브러리 각각으로부터 48개의 클론이 스크리닝되었다:
R1: 1 ㎍/㎖ 인간 pp55 TNF 수용체 면역튜브, R2 1 ㎍/㎖ 인간 p55 TNF 수용체 면역튜브, 하룻밤동안 세척.
R1: 10 ㎍/㎖ 인간 pp55 TNF 수용체 면역튜브, R2 10 ㎍/㎖ 인간 p55 TNF 수용체 면역튜브, 하룻밤동안 세척.
1.3.3 수용체 및 세포 검사
수용체에서 이량체의 중화 능력 검사는 아래와 같이 수행하였다:
수용체 결합
항-TNF dAb는 재조합 TNF 수용체 1(p55)에 TNF의 결합을 저해하는 능력을 조사하였다. 간단히 말하면, Maxisorp 평판은 30 ㎎/㎖의 항-인간 Fc 생쥐 단클론 항체(Zymed, San Francisco, USA)와 함께 하룻밤동안 배양하였다. 웰은 0.05% Tween-20을 함유하는 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척하고, 이후 100 ng/㎖의 TNF 수용체 1 Fc 융합 단백질(R&D Systems, Minneapolis, USA)과 함께 배양하기에 앞서, PBS에 담긴 1% BSA로 차단하였다. 항-TNF dAb는 10 ng/㎖의 최종 농도로 세척된 웰에 첨가된 TNF와 혼합하였다. TNF 결합은 0.2 ㎎/㎖의 비오틴화된 항-TNF 항체(HyCult biotechnology, Uben, Netherlands) 및 양고추냉이 과산화효소 표지된 스트렙타비딘(Amersham Biosciences, UK)의 1/500 희석액으로 순차적으로 검출하고, 이후 TMB 기질(KPL, Gaithersburg, USA)와 함께 배양하였다. 반응은 HC의 첨가로 중단시키고, 흡광도는 450 nm에서 판독하였다. 항-TNF dAb 활성은 TNF 결합의 감소를 유도하고, 따라서 TNF 단독 대조와 비교하여 흡광도의 감소를 유도하였다.
L929 세포독성 검사
항-TNF dAb는 또한, 생쥐 L929 섬유아세포 상에서 TNF의 세포독성 활성을 중화하는 능력을 조사하였다(Evans, T. (2000) Molecular Biotechnology 15:243-248). 간단히 말하면, 마이크로역가 평판에 도말된 L929 세포는 항-TNF dAb, 100 pg/㎖의 TNF, 1 ㎎/㎖의 악티노마이신 D(Sigma, Poole, UK)와 함께 하룻밤동안 배양하였다. 세포 생존력(cell viability)은 [3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-술포페닐)-2H-테트라졸리움(Promega, Madison, USA)과 함께 배양한 이후, 490 nm에서 흡광도를 판독함으로써 측정하였다. 항-TNF dAb 활성은 TNF 세포독성의 감소를 유도하고, 따라서 TNF 단독 대조와 비교하여 흡광도의 증가를 유도하였다.
최초 스크린에서, 앞서 기술된 BIAcore 분석용으로 제조된 상층액은 수용체 검사에도 사용되었다. 또한, 정제된 단백질을 이용한 수용체 및 세포 검사에서, 선별된 이량체의 추가적 분석을 수행하였다.
HeLa IL -8 검사
항-TNFR1 또는 항-TNF 알파 dAb는 HeLa 세포에서 TNF에 의한 IL-8 분비의 유도를 중화시키는 능력을 조사하였다(HUVEC에서 IL-1에 의한 IL-8의 유도 감소를 기술하는 Akeson, L. et al. (1996) Journal of Biological Chemistry 271:30517-30523의 방법으로부터 개조된 방법; 여기서, 인간 TNF 알파에 의한 유도에 주목하고 HUVEC 세포주 대신에 HeLa 세포를 이용한다). 간단히 말하면, 마이크로역가 평판에 도말된 HeLa 세포는 dAb 및 300 pg/㎖의 TNF와 함께 하룻밤동안 배양하였다. 배양이후, 상층액은 세포로부터 흡입하고 IL-8 농도는 샌드위치 ELISA(R&D Systems)를 통해 측정하였다. 항-TNFR1 dAb 활성은 TNF 단독 대조와 비교하여, 상층액으로 IL-8 분비의 감소를 유도한다.
L929 검사는 아래의 실험 전체에 이용된다; 하지만, HeLa IL-8 검사의 이용은 항-TNF 수용체 1(p55) 리간드를 측정하는데 선호된다; L929 검사에서 생쥐 p55 존재는 이의 활용에 특정한 제한을 가한다.
1.4 서열 분석
BIAcore와 수용체 검사 스크린에서 흥미로운 특성을 갖는 것으로 판명된 이량체가 염기서열분석하였다. 서열은 서열목록, 도면, 아래에 실시예에서 상술된다.
1.5 포맷팅(Formatting)
우수한 중화 성질을 갖는 것으로 밝혀진 TAR1-5 이량체는 세포와 수용체 검사에서 포맷하고 분석하였다. TAR1-5 안내 dAb는 친화력 성숙된 클론 TAR1-5-19로 치환하였다. 이를 달성하기 위하여 TAR1-5는 개별 이량체 쌍으로부터 클론하고 PCR 에 의해 증폭된 TAR1-5-19로 치환하였다. 이에 더하여, TAR1-5-19 동종이량체 역시 3U, 5U, 7U 벡터에서 작제하였다. 상기 유전자의 N 말단 사본은 PCR로 증폭하고 앞서 기술된 바와 같이 클론하며, C-말단 유전자 단편은 기존의 SalI와 NotI 제한 부위를 이용하여 클론하였다.
1.5.2 돌연변이유발
TAR1-5 이량체 쌍에서 C-말단 dAb 중의 하나인 dAb2에 존재하는 호박 종결 코돈(amber stop codon)은 특정부위 돌연변이유발(site-directed mutagenesis)에 의해 글루타민으로 돌연변이시켰다.
1.5.3 Fab
*TAR1-5 또는 TAR1-5-19를 포함하는 이량체는 FAb 발현 벡터 내로 재-포맷하였다. dAb는 SfiI와 NotI 제한 부위를 이용하여 CK 또는 CH 유전자를 포함하는 발현 벡터 내로 클론하고 염기서열분석으로 확인하였다. CK 벡터는 pUC 기초된 암피실린 저항성 벡터로부터 유도되고, CH 벡터는 pACYC 클로람페니콜(chlroamphenicol) 저항성 벡터로부터 유도된다. Fab 발현을 위하여, dAb-CH와 dAb-CK 구조체는 HB2151 내로 동시-형질전환시키고 0.1% 글루코오스, 100 ㎍/㎖ 암피실린, 10 ㎍/㎖ 클로람페니콜을 포함하는 2xTY에서 생장시켰다.
1.5.3 힌지 이량체화(hinge dimerisation)
시스테인 결합 형성을 통한 dAb의 이량체화를 조사하였다. 인간 IgGC1 힌지로부터의 변형 형태인 짧은 아미노산 서열 EPKSGDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:11)를 dAb 상의 C 말단 영역에서 조작하였다. 이러한 서열을 인코딩하는 올리고 링커는 앞서 기술된 바와 같이 합성하고 어닐링하였다. 상기 링커는 XhoI와 NotI 제한 부위를 이용하여 TAR1-5-19를 포함하는 pEDA 벡터 내로 클론하였다. 이량체화는 주변세포질(periplasm)에서 in situ로 진행된다.
1.6 발현 및 정제
1.6.1 발현
상층액은 앞서 기술된 바와 같이 초기 스크리닝을 위한 2 ㎖, 96-웰 평판 포맷에서 제조하였다. 초기 스크리닝 과정이후, 선별된 이량체를 더욱 분석하였다. 이량체 구조체는 상층액으로서 TOP10F' 또는 HB2151 세포에서 발현시켰다. 간단히 말하면, 새로 스트리킹(streaking)된 평판으로부터 개별 콜로니는 100 ㎍/㎖ 암피실린 및 1% 글루코오스를 포함하는 2xTY에서 37℃에서 하룻밤동안 성장시켰다. 이러한 배양액의 1/100 희석액은 100 ㎍/㎖ 암피실린 및 1% 글루코오스를 포함하는 2xTY 내로 접종하고 OD600이 대략 0.9가 될 때까지 37℃에서 진탕하면서 성장시켰다. 이후, 배양액은 30℃에서 하룻밤동안 1 mM IPTG로 유도하였다. 세포는 원심분리로 제거하고, 상층액은 단백질 A 또는 L 아가로스로 정제하였다.
Fab와 시스테인 힌지 이량체는 HB2152 세포에서 주변세포질 단백질로서 발현되었다. 하룻밤 배양액의 1/100 희석액은 0.1% 글루코오스를 포함하는 2xTY 내로 접종하고 OD600이 대략 0.9가 될 때까지 37℃에서 진탕하면서 성장시켰다. 이후, 배양액은 30℃에서 3-4시간 동안 1 mM IPTG로 유도하였다. 세포는 원심분리로 수집하고, 펠릿은 주변세포질 제조 완충액(30 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA, 20% 수크로오스)에 재현탁하였다. 원심분리이후, 상층액은 존속시키고 펠릿은 5 mM MgSO4 에 재현탁하였다. 상층액은 원심분리로 다시 수집하고, 집합시키고 정제하였다.
1.6.2 단백질 A/L 정제
단백질 L 아가로스(Affitech, Norway) 또는 단백질 A 아가로스(Sigma, UK)로부터 이량체 단백질의 정제 최적화를 조사하였다. 단백질은 배치(batch)에 의해 또는 튜브연동성 펌프(peristaltic pump)를 이용한 칼럼 용출에 의해 용리하였다. 0.1 M 인산염-구연산염 완충액 pH 2.6; 0.2 M 글리신, pH 2.5; 0.1 M 글리신 pH 2.5의 3가지 완충액을 조사하였다. 최적 조건은 10 칼럼 부피(column volume) 이상으로 0.1 M 글리신 pH 2.5를 이용한 튜브연동성 펌프 조건인 것으로 결정되었다. 단백질 A로부터 정제는 0.1 M 글리신 pH 2.5를 이용한 튜브연동성 펌프 조건 하에 수행되었다.
1.6.3 FPLC 정제
추가의 정제는 AKTA Explorer 100 시스템(Amersham Biosciences Ltd) 상에서 FPLC 분석으로 수행하였다. TAR1-5와 TAR1-5-19 이량체는 50 mM 아세트산 완충액 pH 4에서 0-1 M NaCl 기울기로 용리되는 양이온 교환 크로마토그래피(1 ml Resource S - Amersham Biosciences Ltd)로 분별하였다. 힌지 이량체는 25 mM Tris-HCl pH 8.0에서 0-1 M NaCl 기울기로 용리되는 이온 교환(1㎖ Resource Q Amersham Biosciences Ltd)으로 정제하였다. Fab는 0.05% Tween을 포함하는 PBS에서 0.5 ㎖/분의 유속으로 작동하는 superose 12(Amersham Biosciences Ltd) 칼럼을 이용한 크기 배제 크로마토그래피로 정제하였다. 정제이후, 샘플은 Vivaspin 5K 컷 오프 농축기(Vivascience Ltd)를 이용하여 농축하였다.
2.0 결과
2.1 TAR1-5 이량체4
모든 라이브러리 및 선별 조건을 포괄하는 2차 라운드 선별로부터 6 x 96개의 클론이 채집되었다. 상층액 prep을 제조하고 항원과 단백질 L ELISA, BIAcore, 수용체 검사로 검사하였다. ELISA에서, 양성 결합 클론은 각 선별 방법으로부터 확인하고 3U, 5U, 7U 라이브러리 사이에 분포시켰다. 하지만, 안내 dAb가 항상 존재하기 때문에, 이러한 방법으로 높은 친화력 결합물과 낮은 친화력 결합물을 구별하는 것이 불가능하고, 이런 이유로 BIAcore 분석을 수행하였다.
BIAcore 분석은 2 ㎖ 상층액을 이용하여 수행하였다. BIAcore 분석에서, 이량체 Koff 속도는 단량체 TAR1-5에 비하여 현저하게 증가하는 것으로 밝혀졌다. 단량체 Koff 속도는 10-3-10-4 M 범위인 이량체 Koff 속도와 비교하여 10-1 M의 범위에 존재하였다. 매우 느린 off 속도를 갖는 것으로 보이는 16개 클론을 선별하였는데, 이들은 3U, 5U, 7U 라이브러리로부터 획득하고 염기서열분석하였다. 이에 더하여, 상층액은 수용체 검사에서 인간 TNFα를 중화시키는 능력을 분석하였다.
6개 리드 클론(하기 d1-d6)이 이들 분석에서 중화되고 염기서열분석되었다. 이들 결과는 수득된 6개 클론 중에서 단지 3개의 상이한 두 번째 dAb(dAb1, dAb2, dAb3)가 존재하지만, 두 번째 dAb가 상이한 길이 링커와 결합되는 경우에 더욱 빈번하게 발견된다는 것을 증명한다.
TAR1-5d1: 3U 링커 2nd dAb = dAb1 - 1 ㎍/㎖ Ag 면역튜브 하룻밤동안 세척
TAR1-5d2: 3U 링커 2nd dAb = dAb2 - 1 ㎍/㎖ Ag 면역튜브 하룻밤동안 세척
TAR1-5d3: 5U 링커 2nd dAb = dAb2 - 1 ㎍/㎖ Ag 면역튜브 하룻밤동안 세척
TAR1-5d4: 5U 링커 2nd dAb = dAb3 - 20 ㎍/㎖ Ag 면역튜브 하룻밤동안 세척
TAR1-5d5: 5U 링커 2nd dAb = dAb1 - 20 ㎍/㎖ Ag 면역튜브 하룻밤동안 세척
TAR1-5d6: 7U 링커 2nd dAb = dAb1 - R1:1 ㎍/㎖ Ag 면역튜브 하룻밤동안 세척, R2: 비드
이들 6개 리드 클론은 더욱 조사하였다. 단백질은 주변세포질 및 상층액으로부터 생산하고 단백질 L 아가로스로 정제하며 세포와 수용체 검사에서 조사하였다. 중화 수준은 변화하였다(표 1). 단백질 제조를 위한 최적 조건을 결정하였다. 상층액으로서 HB2151 세포로부터 생산된 단백질이 최대 수율(배양액 ℓ당 대략 10 ㎎)을 제공하였다. 상층액은 실온에서 2시간 동안 또는 4℃에서 하룻밤동안 단백질 L 아가로스와 함께 배양하였다. 비드는 PBS/NaCl로 세척하고 튜브연동성 펌프를 이용하여 FPLC 칼럼 상에 패킹하였다. 이들 비드는 PBS/NaCl의 100 칼럼 부피로 세척하고 0.1 M 글리신 pH 2.5로 용리하였다. 전반적으로, 이량체 단백질은 단량체이후에 용리된다.
TAR1-5d1-6 이량체는 FPLC로 정제하였다. FPLC 정제로 수득된 3가지 종류는 SDS PAGE로 확인하였다. 한 종류는 단량체에 상응하고, 다른 두 종류는 상이한 크기의 이량체에 상응한다. 이들 두 종류 중에서 더욱 큰 종류는 아마도, C 말단 tag의 존재에 기인한다. 이들 단백질은 수용체 검사에서 조사하였다. 표 1에 제시된 데이터는 2가지 이량체 종류로부터 획득된 최적 결과를 나타낸다(도 11). 이량체 쌍으로부터의 3개의 두 번째 dAb(즉, dAb1, dAb2, dAb3)는 단량체로서 클론하고 세포와 수용체 검사에서 ELISA로 분석하였다. 3개의 dAb 모두 항원 ELISA에 의해 TNF에 특이적으로 결합하고 플리스틱 또는 BSA와 교차 반응하지 않는다. 단량체로서 dAb는 세포 또는 수용체 검사에서 중화하지 않는다.
2.1.2 TAR1-5-19 이량체
TAR1-5-19는 6개의 리드 클론에서 TAR1-5를 대체하였다. 세포와 수용체 검사에서 모든 TAR1-5-19 이량체의 분석은 달리 명시하지 않는 경우에, 총 단백질(정제된 단백질 L)을 이용하여 수행하였다(표 2). TAR1-5-19d4 및 TAR1-5-19d3은 세포 검사에서 최고 ND50(～5 nM)을 보이는데, 이는 수용체 검사 결과와 일치하고 TAR1-5-19 단량체(ND50 ～30 nM)보다 우월하다. 정제된 TAR1-5 이량체는 수용체와 세포 검사에서 변화되는 결과를 제공하는 반면, TAR1-5-19 이량체는 더욱 일정하였다. 변이성은 단백질 정제 동안 상이한 용리 완충액(elution buffer)을 이용할 때 나타났다. 0.1 M 인산염-구연산염 완충액 pH 2.6 또는 0.2 M 글리신 pH 2.5를 이용한 용리가 대부분의 경우에 단백질 L 아가로스로부터 모든 단백질을 제거하긴 하지만, 이의 기능성을 다소 감소시켰다.
TAR1-5-19d4는 발효조에서 발현시키고 양이온 교환 FPLC 상에서 정제하여 완전하게 순수한 이량체를 산출하였다. TAR1-5d4에서처럼, FPLC 정제에 의해, 하나의 단량체와 2개의 이량체 종류에 상응하는 3가지 종류를 수득하였다. 이러한 이량체는 아미노산 서열분석하였다. 이후, TAR1-5-19 단량체 및 TAR1-5-19d4는 수용체 검사에서 조사하였는데, 단량체에 대한 IC50은 30 nM이고, 이량체에 대한 IC50은 5 nM이었다.
TAR1-5-19 단량체, TAR1-5-19d4, TAR1-5d4를 비교하는 수용체 검사의 결과는 도 10에 도시한다.
TAR1-5-19 동종이량체는 3U, 5U, 7U 벡터에서 제조하고, 발현시키고, 단백질 L 상에서 정제하였다. 단백질은 세포와 수용체 검사에서 조사하고, IC50(수용체 검사의 경우) 및 ND50(세포 검사의 경우)을 측정하였다(표 3, 도 12).
2.2 Fab
TAR1-5와 TAR1-5-19 이량체는 또한, Fab 포맷 내로 클론하고, 발현시키고, 단백질 L 아가로스 상에서 정제하였다. Fab는 수용체 검사로 평가하였다(표 4). 결과는 TAR1-5와 TAR1-5-19 이량체 모두에서 중화 수준이 이들이 유래되는 본래의 Gly4Ser 링커 이량체에서와 유사하다는 것을 증명하였다. TAR1-5-19가 CH와 CK 모두에서 전시되는 TAR1-5-19 Fab는 발현시키고, 단백질 L 정제하고, 수용체 검사에서 평가하였다. 획득된 IC50은 대략 1 nM이었다.
2.3 TAR1-27 이량체
모든 라이브러리 및 선별 조건을 포괄하는 2차 라운드 선별로부터 3 x 96개의 클론을 채집하였다. ELISA 및 생물검사에서 분석을 위하여 2 ㎖의 상층액 prep을 제조하였다. 항원 ELISA는 71개의 양성 클론을 제공하였다. 정제되지 않은 상층액의 수용체 검사는 저해 특성을 갖는 42개의 클론을 산출하였다(TNF 결합 0-60%). 대부분의 경우에, 저해 특성은 강한 ELISA 신호와 상관하였다. 42개 클론은 염기서열분석하였는데, 이들 중에서 39개가 독특한 두 번째 dAb 서열을 보유한다. 최고 저해 특성을 제공하는 12개 이량체는 더욱 분석하였다.
12개의 중화 클론은 200 ㎖ 상층액 prep에서 발현시키고, 단백질 L 상에서 정제하였다. 이들은 단백질 L과 항원 ELISA, BIAcore, 수용체 검사로 평가하였다. 모든 경우에서, 강한 양성 ELISA 신호가 획득되었다. BIAcore 분석에서, 모든 클론이 빠른 온-오프 속도(on-off rate)를 갖는 것으로 밝혀졌다. 오프 속도(off rate)는 단량체 TAR1-27에 비하여 증가되긴 했지만, TAR1-27 이량체의 오프 속도(Koff 범위는 대략 10-1 내지 10-2 M이다)는 앞서 조사된 TAR1-5 이량체의 오프 속도(Koff 범위는 대략 10-3 내지 10-4 M이다)보다 빨랐다. 정제된 이량체의 안정성이 의심스럽기 때문에, 안정성을 증가시키기 위하여 5% 글리세롤, 0.5% Triton X100 또는 0.5% NP40(Sigma)의 첨가가 2가지 TAR1-27 이량체(d2 및 d16)의 정제에 포함되었다. NP40 또는 Triton X100의 첨가는 정제된 생성물의 수율을 2배 정도 증가시켰다. 이들 두 이량체는 수용체 검사에서 평가하였다. TAR1-27d2는 모든 정제 조건 하에 ～30 nM의 IC50을 제공하였다. TAR1-27d16은 안정화제의 이용 없이 정제되는 경우에 중화 효과를 나타내지 않은 반면, 안정화 조건 하에 정제되는 경우에 ～50 nM의 IC50을 제공하였다. 추가의 분석은 수행되지 않았다.
2.4 TAR2-5 이량체
모든 라이브러리 및 선별 조건을 포괄하는 2차 라운드 선별로부터 3 x 96개의 클론을 채집하였다. 분석을 위하여 2 ㎖의 상층액 prep를 제조하였다. 단백질 A와 항원 ELISA는 각 평판에 대해 수행하였다. BIAcore에 의해, 30개 목적 클론이 우수한 오프-속도를 갖는 것으로 확인되었다(Koff 범위는 10-2 - 10-3 M이다). 이들 클론은 염기서열분석하였는데, 염기서열분석에 의해 13개의 독특한 이량체가 확인되었다.
TAR1-5 이량체
이량체 세포 유형 정제 단백질
분획		 용리 조건 수용체/세포 검사
TAR1-5d1 HB2151 단백질 L + FPLC 소형 이량체 종류 0.1 M 글리신 pH 2.5 RA ～30 nM
TAR1-5d2 HB2151 단백질 L + FPLC 소형 이량체 종류 0.1 M 글리신 pH 2.5 RA ～50 nM
TAR1-5d3 HB2151 단백질 L + FPLC 대형 이량체 종류 0.1 M 글리신 pH 2.5 RA ～300 nM
TAR1-5d4 HB2151 단백질 L + FPLC 소형 이량체 종류 0.1 M 글리신 pH 2.5 RA ～3 nM
TAR1-5d5 HB2151 단백질 L + FPLC 대형 이량체 종류 0.1 M 글리신 pH 2.5 RA ～200 nM
TAR1-5d6 HB2151 단백질 L + FPLC 대형 이량체 종류 0.1 M 글리신 pH 2.5 RA ～100 nM
이량체 2 및 이량체 3은 동일한 두 번째 dAb(dAb2로 명명)을 보유하지만 상이한 링커 길이를 갖는다(d2 = (Gly4Ser)3, d3 = (Gly4Ser)3). dAb1은 이량체 1, 5, 6에 대한 파트너 dAb이다. dAb3은 이량체 4에 대한 파트너 dAb이다. 파트너 dAb단독은 중화하지 않는다. FPLC 정제는 달리 명시하지 않는 경우에 양이온 교환에 의한다. FPLC에 의해 수득된 각 이량체에 대한 최적 이량체 종류가 이들 검사에서 결정되었다.
TAR1-5-19 이량체
이량체 세포 유형 정제 단백질 분획 용리 조건 수용체/세포 검사
TAR1-5-19d1 TOP10F' 단백질 L 총 단백질 0.1 M 글리신
pH 2.0		 RA ～15 nM
TAR1-5-19d2
(종결 코돈 없음)		 TOP10F' 단백질 L 총 단백질 0.1 M 글리신
pH 2.0 + 0.05% NP40		 RA ～2 nM
TAR1-5-19d3
(종결 코돈 없음)		 TOP10F' 단백질 L 총 단백질 0.1 M 글리신
pH 2.5 + 0.05% NP40		 RA ～8 nM
TAR1-5-19d4 TOP10F' 단백질 L +
FPLC		 FPLC 정제된 분획 0.1 M 글리신
pH 2.0		 RA ～2-5 nM
CA ~12 nM
TAR1-5-19d5 TOP10F' 단백질 L 총 단백질 0.1 M 글리신
pH 2.0 + NP40		 RA ～8 nM
CA ~10 nM
TAR1-5-19d6 TOP10F' 단백질 L 총 단백질 0.1 M 글리신
pH 2.0		 RA ～10 nM
TAR1-5-19 동종이량체
이량체 세포 유형 정제 단백질 분획 용리 조건 수용체/세포 검사
동종이량체 nM
CA ～30 nM
TAR1-5-19 5U
동종이량체		 HB2151 단백질 L 총 단백질 0.1 M 글리신
pH 2.5		 RA ～2 nM
CA ～3 nM
TAR1-5-19 7U
동종이량체		 HB2151 단백질 L +
FPLC		 FPLC 정제된
이량체 분획		 0.1 M 글리신
pH 2.5 		RA ～10 nM
CA ～15 nM
TAR1-5-19
cys 힌지		 HB2151 단백질 총 단백질 0.1 M 글리신
pH 2.5		 RA ～2 nM
TAR1-5-19CH/TAR1-5-19CK HB2151 단백질 총 단백질 0.1 M 글리신
pH 2.5 		RA～1 nM
TAR1-5/TAR1-5-19 Fab
이량체 세포 유형 정제 단백질 분획 용리 조건 수용체/세포 검사
TAR1-5CH/
dAb1 CK		 HB2151 단백질 L 총 단백질 0.1 M 구연산염
pH 2.6		 RA ～90 nM
TAR1-5CH/
dAb2 CK		 HB2151 단백질 L 총 단백질 0.1 M 구연산염
pH 2.5		 RA ～30 nM
CA ～60 nM
dAb3CH/
TAR1-5CK		 HB2151 단백질 L 총 단백질 0.1 M 구연산염
pH 2.6		 RA ～10 nM
TAR1-5-19CH/
dAb1 CK		 HB2151 단백질 L 총 단백질 0.1 M 구연산염
pH 2.0		 RA ～6 nM
dAb1 CH/
TAR1-5-19CK		 HB2151 단백질 L 0.1M 글리신
pH 2.0		 Myc/flag RA ～6 nM
TAR1-5-19CH/
dAb2 CK		 HB2151 단백질 L 총 단백질 0.1 M 글리신
pH 2.0		 RA ～8 nM
CA ～12 nM
TAR1-5-19CH/
dAb3CK		 HB2151 단백질 L 총 단백질 0.1 M 글리신
pH 2.0		 RA ～3 nM
TAR1-5-19CYS 이량체의 PCR 작제
dAb 삼량체를 기술하는 실시예 8을 참조한다. 삼량체 프로토콜은 단량체, 이량체, 삼량체의 혼합물을 제공한다.
TAR1-5-19CYS 이량체의 발현과 정제
이량체는 실시예 8에 개설된 바와 같이, 단백질 L 아가로스 상에서 포획으로 배양액의 상층액으로부터 정제하였다.
TAR1-5-19CYS 이량체로부터 TAR1-5-19CYS 단량체의 분리
양이온 교환 분리에 앞서, 혼합된 단량체/이량체 샘플은 제조업체의 지침에 따라 PD-10 칼럼(Amersham Pharmacia)을 이용하여 50 mM 아세트산나트륨 완충액 pH 4.0으로 완충액 교환하였다. 이후, 상기 샘플은 1 ㎖ Resource S 양이온 교환 칼럼(Amersham Pharmacia)에 적용하였는데, 이는 50 mM 아세트산나트륨 pH 4.0으로 미리 평형화시켰다. 단량체 및 이량체는 50 mM 아세트산나트륨 pH 4.0에서 아래의 염 기울기를 이용하여 분리하였다.
15 칼럼 부피 이상으로 150 내지 200 mM 염화나트륨
10 칼럼 부피 이상으로 200 내지 450 mM 염화나트륨
15 칼럼 부피 이상으로 450 내지 1000 mM 염화나트륨
이량체만을 포함하는 분획은 SDS-PAGE를 이용하여 확인하고, 집합시키고, 1/5 부피의 1 M Tris pH 8.0의 첨가로 pH를 8까지 증가시켰다.
시험관내 기능성 결합 검사: TNF 수용체 검사 및 세포 검사
인간 TNFα에 대한 이량체 친화력은 TNF 수용체와 세포 검사를 이용하여 측정하였다. 수용체 검사에서 IC50은 대략 0.3 - 0.8 nM이었다; 세포 검사에서 ND50은 대략 3-8 nM이었다.
다른 가능한 TAR1-5-19CYS 이량체 포맷
PEG 이량체 및 맞춤 합성 말레이미드 이량체
Nektar(Shearwater)는 단량체가 dAb를 분리하는 작은 링커에 의해 이량체로서 포맷되고, 양자가 5-40 kDa의 크기 범위의 PEG에 연결될 수 있도록 하는 바이-말레이미드(bi-maleimide) PEG[m-PEG2-(MAL)2 또는 mPEG(MAL)2]를 제공한다. 5 kDa mPEG-(MAL)2(즉, [TAR1-5-19]-Cys-말레이미드-PEG x 2, 말레이미드, 여기서 상기 말레이미드는 이량체 형태로 서로 결합됨)는 TNF 수용체 검사에서 ～1-3 nM 초과의 친화력을 갖는 것으로 밝혀졌다. 또한, 이량체는 TMEA(Tris[2-말레이미도에틸]아민)(Pierce Biotechnology) 또는 다른 이중-기능성 링커를 이용하여 생산될 수도 있다.
또한, 2,2'-디티오디피리딘(Sigma Aldrich) 및 환원된 단량체를 이용한 화학 결합 절차(chemical coupling monomer)를 이용하여 이황화물 이량체를 생산하는 것도 가능하다.
dAb 의 C-말단으로의 폴리펩티드 링커 또는 힌지의 부가
작은 링커, (Gly4Ser)n, n = 1 내지 10, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7, 면역글로불린(가령, IgG 힌지 영역) 또는 무작위 펩티드 서열(예로써, 무작위 펩티드 서열의 라이브러리로부터 선별됨)은 dAb와 말단 시스테인 잔기 사이에 조작될 수 있다. 이는 이량체를 앞서 기술된 바와 같이 제조하는데 이용될 수 있다.
실시예 8: dAb 삼량체화( trimerisation )
요약
dAb 삼량체화를 위하여, 유리 시스테인이 단백질의 C-말단에서 요구된다. 환원되면 유리 티올을 제공하는 시스테인 잔기를 이용하여 상기 단백질을 삼량체 말레이미드 분자, 예를 들면, TMEA(Tris[2-말레이미도에틸]아민)에 특이적으로 결합시킬 수 있다.
TAR1-5-19CYS의 PCR 작제
아래의 올리고뉴클레오티드는 클로닝을 위한 SalI와 BamHI 부위로 특이적으로 사용되었고 C-말단 시스테인 잔기를 도입하는데 이용하였다:
Figure 112010026521157-pat00011
Figure 112010026521157-pat00012
(* TAR1-5-19CYS 서열의 개시; 아미노산 서열 = SEQ ID NO: 12; 뉴클레오티드 서열 = SEQ ID NO: 13)
전방 프라이머
5'-TGGAGCGCGTCGACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCA-3'(SEQ ID NO: 14)
후방 프라이머
5'-TTAGCAGCCGGATCCTTATTAGCACCGTTTGATTTCCAC-3'(SEQ ID NO: 15)
PCR 반응(50 ㎕ 부피)은 아래와 같이 설정되었다: 200 μM dNTP, 0.4 μM의 각 프라이머, 5 ㎕의 10x PfuTurbo 완충액(Stratagene), 100 ng의 주형 플라스미드(TAR1-5-10을 인코딩), 1 ㎕의 PfuTurbo 효소(Stratagene) 및 무균수를 이용하여 50 ㎕로 조정된 부피. 아래의 PCR 조건이 이용되었다: 초기 변성 단계 94℃에서 2분, 이후 94℃에서 30초, 64℃에서 30초, 72℃에서 30초의 25회 사이클. 72℃에서 5분의 최종 신장 단계 역시 포함되었다. PCR 생성물은 정제하고, SalI과 BamHI로 절단하고, 동일한 제한 효소로 절단된 벡터 내로 결찰하였다. 정확한 클론은 DNA 염기서열분석으로 확인하였다.
TAR1-5-19CYS의 발현과 정제
TAR1-5-19CYS 벡터는 제조업체의 프로토콜에 따라, BL21(DE3)pLysS 화학적으로 적격한 세포(Novagen) 내로 형질전환시켰다. dAb 플라스미드를 보유하는 세포는 100 ㎍/㎖ 카르베니실린 및 37 ㎍/㎖의 클로람페니콜을 이용하여 선별하였다. 배양액은 500 ㎖의 강한 액체배지(terrific broth)(Sigma Aldrich), 100 ㎍/㎖ 카르베니실린, 37 ㎍/㎖ 클로람페니콜을 포함하는 2 ℓ 방해 플라스크(baffled flask)에 설정하였다. 배양액은 30℃에서 200 rmp으로 1-1.5의 OD600까지 성장시키고, 이후 1 mM IPTG(이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노시드, Melford Laboratories)로 유도하였다. dAb의 발현은 30℃에서 12-16시간 동안 지속하였다. 대부분의 dAb는 배양액 배지 내에 존재하는 것으로 밝혀졌다. 이런 이유로, 이들 세포는 원심분리(30분간 8,000xg)로 배지로부터 분리하고, 상층액은 dAb를 정제하는데 사용하였다. 상층액 리터당 30 ㎖의 단백질 L 아가로스(Affitech)가 첨가되었고, dAb는 2시간 동안 교반하면서 배치(batch) 결합하도록 하였다. 이후, 수지는 상층액이 흡수되기에 앞서, 추가로 1시간 동안 중력 하에 안정시켰다. 그 다음, 아가로스를 XK 50 칼럼(Amersham Phamacia) 내로 패킹하고 10 칼럼 부피의 PBS로 세척하였다. 결합된 dAb는 100 mM 글리신 pH 2.0으로 용리하고, 단백질 함유 분획은 1/5 부피의 1 M Tris pH 8.0의 첨가로 중화시켰다. 배양 상층액의 리터당 20 ㎎의 순수한 단백질이 분리되었는데, 이는 50 : 50의 이량체 : 단량체 비율을 보유하였다.
TAR1-5-19CYS의 삼량체화
2.5 ㎖의 100 μM TAR1-5-19CYS는 5 mM 디티오트레이톨로 환원시키고 실온에 20분간 방치하였다. 이후, 상기 샘플은 PD-10 칼럼(Amersham Pharmacia)을 이용하여 완충액 교환하였다. 칼럼은 5 mM EDTA, 50 mM 인산나트륨 pH 6.5로 미리-평형화시키고, 샘플은 제조업체 지침에 따라 적용하고 용리하였다. 샘플은 필요시까지 얼음 위에 위치시켰다. TMEA(Tris[2-말레이미도에틸]아민)는 Pierce Biotechnology로부터 구입하였다. TMEA의 20 mM 저장 용액(stock solution)은 100% DMSO(디메틸술폭사이드)에서 제조하였다. 3 : 1(dAb : TMEA의 몰 비율) 이상의 TMEA 농도는 단백질의 급속한 침전과 교차-결합을 유발하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 침전 속도와 교차-결합은 pH가 증가함에 따라 더욱 커졌다. 이런 이유로, 100 μM 환원된 TAR1-5-19CYS를 이용하여, 25 μM의 TMEA를 첨가하여 상기 단백질을 삼량체화시키고 반응은 2시간 동안 실온에서 진행시켰다. 20%(v/v)까지 글리세롤 또는 에틸렌글리콜과 같은 첨가제의 첨가는 결합 반응이 진행됨에 따라, 삼량체의 침전을 현저하게 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 결합이후, SDA-PAGE 분석은 용액에서 단량체, 이량체, 삼량체의 존재를 증명하였다.
삼량체 TAR1-5-19CYS의 정제
pH를 4로 감소시키기 위하여 TMEA-TAR1-5-19cys 반응의 리터당 40㎕의 40% 빙초산을 첨가하였다. 이후, 상기 샘플은 50 mM의 아세트산나트륨 pH 4.0으로 미리-평형화된 1 ㎖의 Resource S 양이온 교환 칼럼(Amersham Pharmacia)에 적용하였다. 이량체 및 삼량체는 30 칼럼 부피 이상으로 340 내지 450 mM 염화나트륨, 50 mM 아세트산나트륨 pH 4.0의 염 기울기(salt gradient)를 이용하여 부분적으로 분리하였다. 삼량체만을 포함하는 분획은 SDS-PAGE를 이용하여 확인하고, 이후 집합시키고 1/5 부피의 1 M Tris pH 8.0의 첨가로 pH를 8까지 증가시켰다. 농축 단계 동안 삼량체의 침전을 방지하기 위하여(5K 컷 오프 Viva spin 농축기(Vivascience)를 이용), 10% 글리세롤을 상기 샘플에 첨가하였다.
시험관내 기능성 결합 검사: TNF 수용체 검사 및 세포 검사
인간 TNFα에 대한 삼량체 친화력은 TNF 수용체와 세포 검사를 이용하여 측정하였다. 수용체 검사에서 IC50은 대략 0.3 nM이었다; 세포 검사에서 ND50은 3 내지 10 nM 범위(가령, 3 nM)에 존재하였다.
다른 가능한 TAR1-5-19CYS 삼량체 포맷
TAR1-5-19CYS은 아래의 반응물을 이용하여 삼량체로 포맷될 수도 있다
PEG 삼량체 및 맞춤 합성 말레이미드 이량체
Nektar(Shearwater)는 PEG의 말단에서 화학적으로 변형될 수 있는 복수의 팔(arm) PEG를 제공한다. 이런 이유로, 각 팔의 말단에 말레이미드 기능기를 보유하는 PEG 삼량체를 이용하여, TMEA를 이용한 앞서 개설된 방식과 유사한 방식으로 dAb의 삼량체화를 달성할 수 있다. PEG는 또한, 삼량체의 용해성을 증가시켜 응집의 문제점을 예방하는 장점이 있다. 따라서, 각 dAb가 말레이미드 기능기에 결합되는 C-말단 시스테인을 보유하고, 상기 말레이미드 기능기가 PEG 삼량체에 결합되는 dAb 삼량체를 생산할 수 있다.
dAb 의 C-말단으로의 폴리펩티드 링커 또는 힌지의 부가
작은 링커, (Gly4Ser)n, n = 1 내지 10, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7, 면역글로불린(가령, IgG 힌지 영역) 또는 무작위 펩티드 서열(예로써, 무작위 펩티드 서열의 라이브러리로부터 선별됨)은 dAb와 말단 시스테인 잔기 사이에 조작될 수 있다. 다량체(가령, 이량체 또는 삼량체)를 제조하는데 이용되는 경우에, 이는 다시, 개별적 단량체 사이에 더욱 큰 정도의 유연성과 거리를 도입함으로써 표적, 예를 들면, 인간 TNFα와 같은 복수아단위 표적에 결합 특성을 증가시킨다.
실시예 9: 인간 혈청 알부민( HSA ) 및 생쥐 혈청 알부민( MSA )에 대한 단일 도메인 항체(dAb) 수집의 선별
본 실시예에서는 혈청 알부민에 대한 단일 도메인 항체(dAb)를 제조하는 방법을 설명한다. 생쥐 혈청 알부민(MSA) 및 인간 혈청 알부민(HSA) 모두에 대한 dAb의 선별이 기술된다. 3개의 인간 파지 전시 항체 라이브러리가 본 실험에 이용되었는데, 이들 각각은 상보성 결정 영역(complementarity determining region)(CDR1, CDR2, CDR3)에 통합된 NNK 코돈에 의해 인코딩되는 측쇄 다양성(side chain diversity)을 갖는 VH(도 13: V3-23/DP47과 JH4b에 기초한 견본 VH의 서열) 또는 Vκ(도 15: O12/02/DPK9와 Jk1에 기초한 견본 Vκ의 서열)에 대한 단일 인간 프레임워크에 기초하였다.
라이브러리 1(VH):
위치에서 다양성: H30, H31, H33, H35, H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H97, H98.
라이브러리 크기: 6.2 x 109
라이브러리 2(VH)
위치에서 다양성: H30, H31, H33, H35, H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H97, H98, H99, H100, H100a, H100b.
라이브러리 크기: 4.3 x 109
라이브러리 3(Vκ):
위치에서 다양성: L30, L31, L32, L34, L50, L53, L91, L92, L93, L94, L96.
라이브러리 크기: 2 x 109
VH와 Vκ 라이브러리는 총괄적 리간드 단백질 A와 단백질 L 각각에 결합에 대하여 미리 선별되고, 따라서 선별되지 않은 라이브러리에서 대부분의 클론은 기능적이다. 앞서 도시된 라이브러리의 크기는 사전선별이후 크기에 상응한다. 각 라이브러리를 개별적으로 이용하여 혈처 알부민 상에서 2차례의 선별을 수행하였다. 각 선별을 위하여, 항원은 100 ㎍/㎖ 농도로 4 ㎖의 PBS에서 면역튜브(nunc) 상에서 코팅하였다. 1차 라운드 선별에서, 3개의 라이브러리 각각은 HSA(Sigma) 및 MSA(Sigma)에 대해 개별적으로 적용하였다. 2차 라운드 선별에서, 6개의 1차 라운드 선별 각각으로부터 파지는 (ⅰ) 동일한 항원(즉, 1차 라운드 MSA, 2차 라운드 MSA) 및 (ⅱ) 상반된 항원(즉, 1차 라운드 MSA, 2차 라운드 HSA)에 대해 적용하여 총 12개의 2차 라운드 선별을 수득하였다. 각 경우에, 2차 라운드 선별이후 48개의 클론은 HSA 및 MSA로의 결합에 대해 검사하였다. 용해성 dAb 단편은 Harrison et al., Methods Enzymol. 1996, 267:83-109에 의해 scFv 단편에 대해 기술된 바와 같이 생산하고, 2% Tween PBS를 차단 완충액으로 사용하고 결합된 dAb를 단백질 L-HRP(Sigma)(Vκ의 경우) 또는 단백질 A-HRP(Amersham Pharmacia Biotech)(VH의 경우)로 검출한 점을 제외하고, 표준 ELISA 프로토콜을 따랐다(Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4133).
MSA, HSA 또는 둘 모두에 결합을 암시하는 배경 이상의 신호를 제공하는 dAb는 ELISA 불용성 형태로, 플라스틱 단독에 대한 결합을 검사하였지만, 이들 모두 혈청 알부민에 대해 특이적이었다. 이후, 클론은 염기서열분석하였는데(하기 표 참조), 여기에서 21개의 독특한 dAb 서열이 확인되었다. 선별된 VK dAb 클론 사이의 최소 유사성(아미노산 수준에서)은 86.25%((69/80) x 100; 모든 다양화된 잔기가 상이한 경우, 예를 들면, 클론 24 및 34의 결과)이었다. VH dAb 클론 사이에서의 최소 유사성은 94%((127/136) x 100)이었다.
그 다음, 혈청 알부민 결합 항체는 용액으로부터 비오틴화된 항원을 포획하는 능력에 대해 검사하였다. ELISA 평판을 1 ㎍/㎖ 단백질 L(Vκ 클론의 경우) 및 1 ㎍/㎖의 단백질 A(VH 클론의 경우)로 코팅한 점을 제외하고, ELISA 프로토콜(앞서 기술된 바와 같이)을 수행하였다. 용해성 dAb는 상기 프로토콜에서처럼 용액으로부터 포획하고, 검출은 비오틴화된 MSA 또는 HSA 및 스트렙타비딘 HRP로 수행하였다. 비오틴화된 MSA 및 HSA는 혈청 알부민 분자당 평균 2개의 비오틴을 달성하는 목적으로, 제조업체의 사용설명서에 따라 제조하였다. ELISA에서 용액으로부터 비오틴화된 MSA를 포획하는 24개의 클론이 확인하였다. 이들 중에서 2개(클론 2와 38)는 비오틴화된 HSA 역시 포획하였다. 이후, dAb는 CM5 biacore 칩 상에 코팅된 MSA에 결합하는 능력에 대해 검사하였다. 8개 클론이 biacore 상에서 MSA에 결합하는 것으로 밝혀졌다.
Figure 112010026521157-pat00013
Figure 112010026521157-pat00014
모든 경우에, 프레임워크는 상기 표에 지시된 바와 같이, 상응하는 견본 서열에서 프레임워크와 동일하고 CDR에서 구별되었다.
bicore 상에서 MSA에 결합하는 8개의 클론 중에서, 대장균(E. coli)에서 높게 발현되는 2개 클론(클론 MSA16와 MSA26)은 추가 연구를 위하여 선별하였다(실시예 10 참조).
MSA16과 26에 대한 전체 뉴클레오티드 서열과 아미노산 서열은 도 16에 제시된다.
실시예 10: dAb MSA16 과 MSA26 에 결합하는 MSA 의 생쥐에서 친화력 및 혈청 반감기의 측정
dAb MSA16과 MSA26은 대장균(E. coli)의 주변세포질에서 발현시키고, 단백질 L-아가로스 친화력 수지(Affitech, Norwary)로의 배치 흡수(batch absorption)를 이용하여 정제하고, pH 2.2에서 글리신으로 용리하였다. 이후, 정제된 dAb는 저해 biacore로 분석하여 Kd를 결정하였다. 간단히 말하면, 정제된 MSA16과 MSA26은 고밀도의 MSA로 코팅된 biacore CM5 칩 상에서 200RU의 반응을 달성하는데 필요한 dAb 농도를 결정하기 위하여 검사하였다. dAb의 필요 농도가 결정되면, 예측된 kd 주변의 농도 범위에서 MSA 항원을 dAb와 사전 혼합하고 하룻밤동안 배양하였다. 이후, 각 예비혼합물(premix)에서 dAb의 MSA 코팅된 biacore 칩으로의 결합은 30 ㎕/분의 높은 유속에서 측정하였다. 획득된 곡선을 이용하여 Klotz 플롯을 산출하였는데, 이는 MSA16의 경우 200 nM 및 MSA26의 경우 70 nM의 추정된 Kd를 제공하였다(도 17A와 B).
그 다음, 클론 MSA16과 MSA26은 HA tag(핵산 서열: TATCCTTATGATGTTCCTGATTATGCA(SEQ ID NO: 91) 및 아미노산 서열: YPYDVPDYA((SEQ ID NO: 92))를 포함하는 발현 벡터 내로 클론하고, 2-10 ㎎ 양을 대장균(E. coli) 에서 발현시키고, 단백질 L-아가로스 친화력 수지(Affitech, Norwary)로 상층액으로부터 정제하고, pH 2.2에서 글리신으로 용리하였다. dAb의 혈청 반감기(serum half-life)를 생쥐에서 측정하였다. MSA26과 MSA16은 대략 1.5 ㎎/㎏으로 CD1 생쥐에 단일 i.v. 주입으로 투여하였다.
혈청 수준 분석은 염소 항-HA(Abcam, UK) 포획 및 4% Marvel로 차단된 단백질 L-HRP(invitrogen) 검출 ELISA로 수행하였다. 세척은 0.05% Tween PBS로 수행하였다. 검사 샘플과의 동등성(comparability)을 확보하기 위하여, 1x생쥐 혈청의 존재에서 공지된 농도의 dAb의 표준 곡선을 설정하였다. 2 구획 모형으로 모델링에서, MSA-26은 0.16시간의 t1/2α, 14.5시간의 t1/2β, 465 hr.㎎/㎖의 곡선 아래 면적(area under the curve, AUC)을 갖고(데이터 제시되지 않음), MSA-16은 0.98시간의 t1/2α, 36.5시간의 t1/2β, 913 hr.㎎/㎖의 AUC를 갖는 것으로 나타났다(도 18). 이들 두 항-MSA 클론은 0.06시간의 t1/2α 및 0.34시간의 t1/2β를 갖는 HEL4(항-암탉 난백 리소자임 dAb)에 비하여 상당히 연장된 반감기를 보였다.
실시예 11: V H - V H 및 Vκ-Vκ 이중특이적 Fab 유사 단편의 생성
본 실시예에서는 VH와 Vκ 이중특이적 Fab 유사 단편을 제조하는 방법을 기술한다. 기술된 각 Fab 유사 단편의 작제에 앞서, 선별 표적에 결합하는 dAb는 먼저, 실시예 9에 기술된 것들과 유사한 dAb 라이브러리로부터 선별하였다. 또한, 암탉 난 리소자임(Sigma)에 결합하는 VH dAb, HEL4를 분리하고, TNFα수용체(R and D Systems)에 결합하는 두 번째 VH dAb(TAR2h-5)를 분리하였다. 이들의 서열은 서열목록에 제시된다. TNFα에 결합하는 Vκ dAb(TAR1-5-19)는 선별 및 친화력 성숙으로 분리하였고, 이의 서열은 서열목록에 제시된다. 서열이 도 17B에 제시된, 실시예 9에 기술된 두 번째 Vκ dAb(MSA 26) 역시 이들 실험에 사용하였다.
앞서 기술된 4개의 dAb를 포함하는 발현 벡터로부터의 DNA는 dAb를 코딩하는 DNA를 절제하기 위하여 효소 SalI과 NotI로 절단하였다. 예측된 크기(300-400 bp)의 밴드는 절단물을 아가로스 겔 상에서 이동시키고 상기 밴드를 절제하며, 이후 Qiqgen 겔 정제 키트(Qiagen, UK)를 이용한 겔 정제를 수행함으로서 정제하였다. 이후, 이들 dAb를 코딩하는 DNA는 하기 표에 지시된 바와 같이, CH 또는 Cκ 벡터(도 8과 9) 내로 삽입하였다.
Figure 112010026521157-pat00015
VH CH와 VH Cκ 구조체는 HB2151 세포 내로 동시-형질전환시켰다. 별도로, Vκ CH와 Vκ Cκ 구조체는 HB2151 세포 내로 동시-형질전환시켰다. 동시-형질전환된 각 세포주의 배양액은 하룻밤동안 성장시켰다(5% 글루코오스, 10 ㎍/㎖ 클로람페니콜 및 CH와 Cκ 플라스미드 모두에 대한 항생제 선별을 유지하기 위한 100 ㎍/㎖ 암피실린을 함유하는 2xTY에서). 하룻밤 배양액은 새로운 배지(2xTY, 10 ㎍/㎖ 클로람페니콜 및 100 ㎍/㎖ 암피실린)를 접종하는데 사용하고, CH와 Cκ 구조체를 발현하기 위한 IPTG 첨가에 의한 유도에 앞서 OD 0.7-0.9로 성장시켰다.
이후, 발현된 Fab 유사 단편은 단백질 A 정제(동시-형질전환된 VH CH와 VH Cκ의 경우) 및 MSA 친화력 수지 정제(동시-형질전환된 Vκ CH와 Vκ Cκ의 경우)로 주변세포질로부터 정제하였다.
VH-VH 이중특이체
VH CH와 VH Cκ 이중특이적 Fab 유사 단편의 발현은 겔 상에서 단백질을 이동시킴으로서 검사하였다. 겔은 블랏(blot)하고, Fab 단편에 대한 기대 크기의 밴드는 myc tag 및 flag tag 모두를 통한 웨스턴 블랏 상에서 검출할 수 있었는데, 이는 Fab 유사 단편의 VH CH와 VH Cκ 부분이 모두 존재함을 암시하였다. 그 다음, 이중특이적 Fab 유사 단편의 이들 두 절반이 동일한 Fab-유사 단편 내에 존재하는지 여부를 결정하기 위하여, ELISA 평판은 중탄산나트륨 완충액에서 3 ㎎/㎖로, 웰 당 100 ㎕의 암탉 난 리소자임(HEL)으로 4℃에서 하룻밤동안 코팅하였다. 평판은 2% Tween PBS로 차단하고(실시예 1에 기술된 바와 같이), 이후 VH CH/VH Cκ 이중특이적 Fab 유사 단편과 함께 배양하였다. HEL로의 이중특이적 Fab 유사 단편의 결합 검출은 9e10(myc tag에 결합하는 단클론 항체, Roche) 및 항 생쥐 IgG-HARP(Amersham Pharmacia Biotech)를 이용한 비-동족 사슬(non-cognate chain)을 통해 수행하였다. VH CH/VH Cκ 이중특이적 Fab 유사 단편에 대한 신호는 단독으로 발현된 VH Cκ 사슬에 대한 0.069의 배경 신호와 비교하여 0.154이었다. 이는 상기 Fab 유사 단편이 표적 항원에 대한 결합 특이성을 갖는다는 것을 증명한다.
Vκ-Vκ 이중특이체
MSA 친화력 수지 상에서 동시-형질전환된 VκCH와 VκCκ 이중특이적 Fab 유사 단편을 정제한 이후, 수득된 단백질은 1 ㎍/㎖ TNFα로 코팅된 ELISA 평판 및 10 ㎍/㎖ MSA로 코팅된 ELISA 평판을 탐침하는데 사용하였다. 예측된 바와 같이, 이들 두 ELISA 평판 상에서 단백질 L-HRP로 검출시에 배경 이상의 신호가 존재하였다(데이터 제시되지 않음). 이는 MSA에 결합할 수 있는(따라서, MSA 친화력 칼럼 상에서 정제될 수 있는) 단백질 분획이 후속 ELISA에서 TNFα에도 결합할 수 있음을 암시하는데, 이는 상기 항체 단편의 이중특이성을 확증한다. 단백질의 이러한 분획은 2가지 후속 실험에 사용하였다. 먼저, 1 ㎍/㎖ TNFα로 코팅된 ELISA 평판은 ELISA 상에서 유사한 신호를 제공하는 것으로 계산된 농도로 이중특이적 VκCH와 VκCκ Fab 유사 단편 및 대조군 TNFα 결합 dAb로 탐침하였다. 이중특이적 dAb와 대조군 dAb 모두 2 ㎎/㎖ MSA의 존재와 부재시에 ELISA 평판을 탐침하는데 사용하였다. 이중특이적 웰에서 신호는 50% 이상 감소되었으나 dAb에서 신호는 전혀 감소되지 않았다(도 19a 참조). 동일한 이중특이적 단백질은 MSA와 함께 또는 MSA 없이 수용체 검사에 적용하고, MSA에 의한 경쟁 역시 관찰하였다(도 19c 참조). 이는 MSA의 상기 이중특이체로의 결합이 TNFα로의 결합과 경쟁함을 증명한다.
실시예 12: 생쥐 혈청 알부민 및 TNF α에 대한 특이성을 갖는 Vκ-Vκ 이중특이적 cys 결합된 이중특이체의 생성
본 실시예에서는 이황화 결합을 통한 화학적 결합(chemical coupling)에 의해 생쥐 혈청 알부민 및 TNFα 모두에 특이적인 이중특이적 항체 단편을 제조하는 방법을 기술한다. MSA16(실시예 1) 및 TAR1-5-19 dAb 모두 C 말단 시스테인을 포함하고 tag가 없는 pET 기초된 벡터 내로 재클론하였다. 이들 두 dAb는 4-10 ㎎ 수준으로 발현시키고 단백질 L-아가로스 친화력 수지(Affitech, Norway)를 이용하여 상층액으로부터 정제하였다. 이후, 시스테인 태그된 dAb는 디티오트레이톨로 환원시켰다. TAR1-5-19 dAb는 PEP 1-5-19 동종이량체의 형성을 유도하는 이황화 결합의 재형성을 차단하기 위하여 디티오디피리딘과 결합시켰다. 이들 2개의 상이한 dAb는 pH 6.5에서 혼합하여 이황화 결합 형성 및 TAR1-5-19, MSA16 cys 결합된 이형이량체의 생성을 촉진하였다. 2개의 다른 단백질의 공액체를 제조하는 방법은 King 등(King TP, Li Y Kochoumian L Biochemistry. 1978 17:1499-506 Preparation of protein conjugates via intermolecular disulfide bond formation)에 의해 처음으로 기술되었다. 이형이량체는 양이온 교환으로 단량체 종류로부터 분리하였다. 분리는 SDS 겔 상에서 예측된 크기의 밴드의 존재로 확증하였다. 수득된 이형이량체 종류는 TNF 수용체 검사에서 검사하였는데, 대략 18 nM의 TNF를 중화하는 IC50을 갖는 밝혀졌다. 그 다음, 일정 농도(18 nM)의 이형이량체 및 MSA와 HSA의 일련의 희석물로 수용체 검사를 반복하였다. 일정한 농도 범위(최대 2㎎/㎖)에서 HSA의 존재는 TNFα를 저해하는 이량체의 능력에서 감소를 유발하지 않았다.
하지만, MSA의 첨가는 TNFα를 저해하는 이량체의 능력에서 용량 의존성 감소(dose dependent reduction)를 유발하였다(도 20). 이는 MSA와 TNFα가 cys 결합된 TAR1-5-19, MSA16 이량체로의 결합에 대하여 경쟁함을 증명한다.
데이터 요약
상기한 실시예에 기술된 실험에서 획득된 데이터의 요약은 부록 4에 제시된다.
실시예 13: 항- TNF -α dAb 에 대한 핵산과 폴리펩티드 서열의 요약.
본 명세서에 기술된 항-TNF-α dAb에 관한 연구의 전체 과정 동안, 인간 및/또는 생쥐 TNF-α에 결합하는 다수의 상이한 dAb가 확인되었다. 서열 및 추가의 정보는 아래에 제공된다.
생쥐 TNF -α에 결합하는 클론: 4가지 항-생쥐 TNF-α dAb에 대한 뉴클레오티드와 아미노산 서열은 아래에 제공된다. 이들 중에서 2가지(TAR1-2m-9와 TAR1-2m-30)는 생쥐 TNF-α의 활성을 저해하고, 나머지 2개(TAR1-2m-1과 TART-2m-2)는 결합하지만 이를 저해하지 않는다.
TAR1 -2m-9:
TAR-2m-9는 6 μM의 IC50 및 5 μM의 ND50을 보유하는 Vκ 클론이다. IC50과 ND50은 단백질 L 가교-결합이후 개선되지 않는다. 상기 클론은 인간 TNF-α에 대한 어떤 효과를 나타내지 않지만(2가지 농도에서 세포 검사로 종 교차-반응성(species cross-reactivity)을 평가하였다), 쥐 TNF-α에 대하여 유사한 중화 활성을 보인다.
아미노산 서열(CDR3은 굵게 표시된다)(SEQ ID NO: 93):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGSFLWWYQQKPGKAPKLLIYYSSYLQSGVP
SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYRWHPNTFGQGTKVEIKR
뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 94):
Figure 112010026521157-pat00016
Figure 112010026521157-pat00017
TART -2m-30:
TAR1-2m-30은 10 μM의 ND50을 보유하는 Vκ 클론이다. ND50은 단백질 L 가교-결합이후 개선되지 않는다. 상기 클론은 인간 TNF-α에 대한 어떤 효과를 나타내지 않지만(2가지 농도에서 세포 검사로 종 교차-반응성을 평가하였다), 생쥐에 비하여 쥐 TNF-α에 대하여 효과가 약간 덜하다.
아미노산 서열(CDR3은 굵게 표시된다)(SEQ ID NO: 95):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIYSWLNWYQQKPGKAPKLLIYRASHLQSGV
PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQIWNMPFTFGQGTKVEIKR
뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 96):
Figure 112010026521157-pat00018
TAR1 -2m-1: 상기 클론은 생쥐 TNF-α에 결합하지만 수용체 결합 활성을 저해하지 않는다.
아미노산 서열(SEQ ID NO: 97):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGYDLFWYQQKPGKAPKLLIYRGSVLQSGVP
SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRWRWPFTFGQGTKVEIKR
뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 98):
Figure 112010026521157-pat00019
Figure 112010026521157-pat00020
TAR1 -2m-2: 상기 클론은 생쥐 TNF-α에 결합하지만 수용체 결합 활성을 저해하지 않는다.
아미노산 서열(SEQ ID NO: 99):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASLPIGRDLWWYQQKPGKAPKLLIYRGSFLQSGVP
SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRWYYPHTFGQGTKVEIKR
뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 100):
Figure 112010026521157-pat00021
인간 TNF-α에 결합하는 dAb 클론
아래는 인간 TNF-α에 결합하는 것으로 확인된 dAb의 뉴클레오티드 서열의 목록이다. 상응하는 아미노산 서열은 도 23에 제공한다.
Figure 112010026521157-pat00022
Figure 112010026521157-pat00023
Figure 112010026521157-pat00024
Figure 112010026521157-pat00025
Figure 112010026521157-pat00026
Figure 112010026521157-pat00027
Figure 112010026521157-pat00028
추가의 항-인간 TNF-α dAb 클론은 아래와 같다:
여러 클론에서 친화력 성숙(affinity maturation)을 수행하였다. 클론 TAR1-100-47은 L929 세포 검사에서 30-50 nM 및 단백질 L과 가교-결합되는 경우에 3-5 nM의 ND50을 갖는 친화력-성숙된 클론이다. TAR1-100-47은 붉은털원숭이 TNF와 교차-반응한다. 이의 아미노산 서열 및 다수의 다른 클론의 아미노산 서열은 아래에 제공된다. TAR1-2-100과 TAR1-2-109는 라이브러리 작제에 이용되는 부모 클론이다. 상기 군에서 우수한 TART 클론은 아래의 공통 서열: TAR1-100-47에서 굵게 표시된 D/E3O, W32, R94, F96을 보유한다.
Figure 112010026521157-pat00029
Figure 112010026521157-pat00030
Figure 112010026521157-pat00031
Figure 112010026521157-pat00032
Figure 112010026521157-pat00033
이들 실시예에서 다양한 포맷으로 개조된 TAR1-5-19 항-인간 TNF-α dAb의 서열은 아래와 같다:
TAR1-5-19
아미노산(SEQ ID NO: 191)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVKEFLWWYQQKPGKAPKLLIYMASNLQSGVPS
RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKFKLPRTFGQGTKVEIKR
뉴클레오티드(SEQ ID NO: 115)
Figure 112010026521157-pat00034
실시예 14: 관절염의 예방 모형에서 PEG화된 TAR1 -5-19의 효능 연구.
Tgl97 생쥐는 인간 TNF-글로빈 하이브리드 유전자가 외부로부터 도입되고, 이형접합체(heterozygote)는 4-7주령에서, 류머티스성 관절염과 공통의 조직학적 특징을 보이는 만성 진행성 다발성 관절염이 발병한다[Keffer, J., Probert, L.,Cazlaris, H., Georgopoulos, S., Kaslaris, E., Kioussis, D., Kollias, G.(1991). Transgenic mice expressing human tumor necrosis factor: a predictive genetic model of arthritis. EMBO J., Vol. 10, pp. 4025-4031.]
Tgl97 모형에서 관절염의 예방에서 PEG화된 dAb(dAb에 대한 2개의 부착 부위를 보유하는 2x20k 분지화된 PEG 포맷[즉, 40K mPEG2 MAL2], 상기 dAb는 TAR1-5-l9cys이다)의 효능을 검사하기 위하여, 이형접합성 유전자도입 생쥐는 수컷과 암컷을 동수로 하여 각 10마리의 동물군으로 분할하였다. 치료는 3주령에, 검사 물품의 주1회 복강내 주입으로 시작하였다. TAR1-5-19cys 단량체의 발현과 PEG화(PEGylation)는 실시예 1, 섹션 1.3.3에서 개설한다. 모든 단백질 제조물은 인산염 완충액에 집어넣고 내독소의 허용가능 수준을 검사하였다.
상기 연구는 맹검(blind)으로 수행하였다. 매주, 동물은 칭량하고 아래의 체계: 0 = 관절염 없음(정상 외관과 굴곡), 1 = 경등도 관절염(관절 염좌), 2 = 중등도 관절염(부종, 관절 변형), 3 = 중증도 관절염(심각하게 손상된 움직임)에 따라 관절염의 거대표현형적 증상에 대한 스코어를 기록하였다.
본 연구의 결과는 염수 대조와 치료된 군의 관절염 스코어간의 현저한 차이로, 1O ㎎/㎏ PEG화된 TAR1-5-19가 관절염의 발생을 저해한다는 것을 분명하게 증명하였다. 1 ㎎/㎏ 용량의 PEG화된 TAR1-5-19 역시, 염수 대조군에 비하여 통계학적으로 유의하게 낮은 평균 관절염 스코어를 유도하였다(P<0.05%, 윌콕슨 검증(Wilcoxon Test)에 정규 근사(normal approximation)를 이용).
실시예 15: 관절염의 치료 모델에서 PEG화된 TAR1 -5-19의 효능 연구.
Tgl97 모형에서 관절염의 치료에서 PEG화된 dAb의 효능을 검사하기 위하여, 이형접합성 유전자도입 생쥐는 수컷과 암컷을 동수로 하여 각 10마리의 동물군으로 분할하였다. 치료는 이들 동물이 현저한 관절염 표현형을 보이는 6주령에 시작하였다. 치료는 검사 물품의 주2회 4.6 ㎎/㎏ 복강내 주입으로 수행하였다. 샘플 제조와 질병 스코어링(disease scoring)은 실시예 14에서 앞서 기술된 바와 동일하다.
관절염 스코어는 PEG화된 TAR1-5-19가 치료 모형에서 관절염의 진행을 저해한다는 것을 분명하게 증명하였다. 4.6 ㎎/㎏ 용량의 PEG화된 TAR1-5-19는 9주 시점에, 염수 대조군에 비하여 통계학적으로 유의하게 낮은 평균 관절염 스코어를 유도하였다(P<0.01%, 윌콕슨 검증(Wilcoxon Test)에 정규 근사(normal approximation)를 이용)
실시예 16: 완만한 방출 포맷에서 dAb 효능
완만한 방출 포맷으로부터 dAb의 효능을 검사하기 위하여, 소형 PEG 분자를 보유하는 dAb(상기 PEG는 C-말단 Cys 잔기와 함께 4개의 dAb 부착 부위로 4x5k이고, 상기 dAb는 TAR1-5-l9[즉, 20K PEG4 arm MAL]이다)을 0.2 ㎖ 삼투압 펌프에 적하하였다. 4주간 0.2 ㎖의 방출 속도를 갖는 상기 펌프는 앞서 기술된 바와 같이, 6주 시점에, 치료 Tgl97 모형의 생쥐에 피하 이식하였다. 이들 동물의 관절염 스코어는 염수가 적하된 펌프가 이식된 동물에 비하여 명백하게 더욱 완만한 속도로 증가하였다. 이는 dAb가 완만한 방출 포맷으로부터 전달되는 경우에 유효하다는 것을 증명한다.
실시예 17: 반감기 안정화된 항-인간 TNF -α dAb 는 Tgl97 생쥐 모델에서 RA의 발병을 예방한다.
본 명세서에 기술된 dAb 단량체 TAR1-5-19는 수동으로 코팅된 TNF-α을 이용하여 초기에 선별된 dAb로부터 유래되는 친화력 성숙된 dAb 단량체이다. 최초 클론은 L929 TNF-세포독성 중화 검사에서, 5 μM 이상의 ND50을 나타냈다. TAR1-5-19는 30 nM 이하의 ND50을 보인다. 본 명세서에 기술된 바와 같이 Fc 융합체로서 만들어지는 경우에, TAR1-5-19 클론은 L929 검사에서, 5 nM 이하의 ND50을 보인다.
TAR1-5-19 dAb Fc-융합체의 혈청 반감기는 생쥐로의 주입이후 검사하였다. 결과는 도 24에 도시된다. TAR1-5-19 dAb 단량체는 대략 20분의 t1/2β를 보유하는 반면, 동일한 dAb의 Fc-융합체 형태는 24시간 이상의 t1/2β를 보유하는데, 이는 혈청 반감기에서 70배 이상의 증가를 나타낸다.
TAR1-5-19 dAb Fc 융합 구조체는 앞서 기술된 RA의 Tgl97 생쥐 모형에서 검사하였다. 생쥐는 수컷과 암컷을 동수로 하여 군당 10마리씩 5 군으로 분할하였다. TAR1-5-l9 dAb Fc 융합체, ENBREL 또는 염수의 주2회 IP 주입으로 치료는 RA 증상이 아직 분명하지 않은 3주령에 시작하였다. 상기 연구는 7주간 수행하였다. 도 25에 도시된 바와 같이, 2가지 용량, l ㎎/㎏과 10 ㎎/㎏의 TAR1-5-l9 dAb Fc 융합체를 투여하였다. 음성 대조 동물에는 10 ㎎/㎏의 음성 대조 항-β-gal Fc 융합체를 주2회 주입하고, 한 군은 염수 주입으로 주2회 치료하였다. 비교를 위하여, 한 군에는 10 ㎎/㎏의 ENBREL를 주2회 주입하였다.
동물은 본 명세서에 기술된 바와 같이, 맹검 방식으로 관절염 스코어를 평가하였다. 7주 치료 과정의 종결 시점에서, 10 ㎎/㎏의 TAR1-5-l9 dAb Fc 융합체가 주2회 주입된 동물은 10 ㎎/㎏의 ENBREL이 주입된 동물보다 낮은 관절염 스코어를 보였고, 치료되지 않은 동물 또는 음성 대조 dAb Fc 융합체가 주입된 동물에 비하여 관절염 질병의 실질적으로 완전한 예방을 경험하였다.
TNF-α는 악액질(cachexia)과 연관한다. 동물은 항-TNF-α dAb 치료의 전체 과정 동안 칭량하였다. TAR1-5-l9 dAb Fc 융합체가 주입된 동물의 체중은 음성 대조 dAb Fc 융합체가 주입된 동물의 체중보다 현저하게 크고, ENBREL이 주입된 동물의 체중과 유사하였다.
요약하면, 10 ㎎/㎏ TAR1-5-l9는 Tgl97 모형에서 관절염의 발병을 완전히 예방하였다. 이런 반응은 용량-의존성으로, 부분적인 효과가 l ㎎/㎏ 용량에 기인하고, 또한, 상기 반응은 유사한 용량의 기존 항-TNF-α 약제 ENBREL에서 관찰되는 반응보다 우수하였다. 본 연구는 인간 질환의 임상적으로 확립된 모형에서 치료제로서 dAb의 효능을 증명한다.
이들 동물의 관절로부터 고정된 절편의 조직학적 분석 결과는 이들 데이터와 일치한다.
실시예 18: 상이한 연장된 반감기 포맷에서 생체내 연구.
일련의 연구에서, 3가지 상이한 연장된 반감기 항-TNF-α dAb 포맷은 관절염 스코어에 대한 효과를 검사하였다. 이들 포맷은 항-TNF-α dAb Fc 융합체(인간 IgG CH2/CH3 영역에 융합에 의해 동종이량체화된 2개의 항-인간 TNF-α dAb), 2가지 상이한 PEG-연결된 항-TNF-α dAb 구조체(2개의 동일한 dAb의 시스-말레이미드 연쇄(cys-maleimide linkage)에 의해 2x20K 분지화된 PEG로 형성된 동종이량체 및 4개의 동일한 dAb의 시스-말레이미드 연쇄에 의해 4x10K 분지화된 PEG로 형성된 동종사량체), 2개의 동일한 항-TNF-α dAb와 항-생쥐 혈청 알부민 dAb를 순차적으로 포함하는 이중특이적 항-TNF-α/Anti SA dAb이었다.
별도의 연구에서, 약제 조성물을 3주령에서부터 시작하여 7주간, 도 26에 도시된 바와 같이 10 ㎎/㎏ 또는 1 ㎎/㎏으로 주1회, 또는 가변 용량으로 주2회 투여하였다.
PEG화된 항-TNF dAb 동종이량체는 관절염 스코어에 기초한 관절염의 완전한 예방을 위한 주1회 주입 프로토콜에서 10 ㎎/㎏에서 유효하였다. 비교 목적으로 사용된 기존 항-TNF-α 약제는 치료되지 않은 동물에 비하여 감소된 관절염 스코어를 유도하긴 하지만, 상기 스코어는 PEG화된 dAb 구조체로 달성되는 스코어보다 통계학적으로 유의하게 높았다. 항-TNF-α/항-SA 이중특이적 구조체와 Fc 융합체는 치료 없음에 비하여 유효하였다.
주1회 1 ㎎/㎏ 주입 섭생(injection regimen)에서, 어떤 치료도 발병을 예방하는데 100% 유효하지는 않지만, PEG화된 항-TNF-α dAb 구조체는 치료 없음과 기존 항-TNF-α 약제에 비하여 질병 증상의 진행을 예방하는데 훨씬 유효하였다. 이런 투약 섭생(dosing regimen)에서, 항-TNF-α dAb Fc 융합체와 이중특이적 구조체 역시 기존의 약제보다 더욱 유효하였다.
요약하면, 반감기-연장된 dAb의 3가지 상이한 포맷을 이용한 주1회 투약 섭생 연구는 인간 질환의 임상적으로 확립된 모형에서 치료의 효능을 더욱 뒷받침한다.
실시예 19: Tgl97 생쥐 RA 모형에서 확립된 질환에 대한 기존 항- TNF -α 치료제에 비하여 항-인간 TNF-α dAb의 효능.
본 연구에서, 확립된 질환에 대한 항-TNF-α dAb 구조체의 다양한 포맷과 투약 섭생의 효능은 Tgl97 RA 모형에서, 동등 몰량의 기존 항-TNF-α 치료제 ENBREL, HUMIRA, REMICADE의 효능과 비교하였다. 동물은 3주 대신에, 관절염 증상이 분명해지는 6주 시점에 이들 치료제를 투여하였다. 증상은 맹검 방식으로, 조직 구조(9주) 및 관절염 스코어링(매주)으로 모니터하였다.
주2회 투여를 위한 다양한 포맷과 용량은 도 27에 도시된다. 포맷에는 Fc 융합체(인간 IgG1 CH2/CH3 영역에 융합으로 동종이량체화된 TAR1-5-19 dAb의 2개 사본), TAR1-5-19 dAb PEG 이량체(2개의 동일한 dAb의 시스-말레이미드 연쇄(cys-maleimide linkage)에 의해 2x20K 분지화된 PEG로 형성된 동종이량체), TAR1-5-19 dAb PEG 사량체(4개의 동일한 dAb의 시스-말레이미드 연쇄에 의해 4x10K 분지화된 PEG로 형성된 동종사량체), TAR1-5-19 dAb/항-생쥐 SA 이중특이적 구조체(2개의 동일한 항-TNF-α dAb와 1개의 항-생쥐 혈청 알부민 dAb의 순차적인 선형 융합체)가 포함되었다. 이런 투약 섭생은 도 28에 도시된다. 이식된 삼투압 펌프를 통한 4x5k PEG화된 TAR1-5-19 구조체의 연속 투여 역시 평가하였다.
본 연구의 결과는 기존 치료제 중에서 어느 것도 9주 시점까지 관절염 스코어를 눈에 띄게 반전시키지 못한다는 것을 증명하였다. TAR 포맷은 염수 대조에 비하여, 관절염 스코어를 다소간 안정시키는데, 이는 통계학적으로 유의하였다. 게다가, 6주 스코어와 비교하여, 질병 반전의 징후가 관찰되었다.
조직병리학적 질환에 대한 검사에서 9주 시점에 관절염 관절은 6주 시점에 관절과 비교하여, TAR 포맷으로 치료이후 질병 심각도(disease severity)에서 감소를 보였다. 이는 TAR 포맷이 상기 확립된 질환의 관절염 표현형의 반전을 유도할 수 있음을 확증한다.
이들 연구 결과는 이러한 질병 과정을 적어도 부분적으로 반전시키는 TNF-α dAb의 능력을 비롯하여 확립된 관절염 질환에 대한 검사된 항-TNF-α dAb 구조체의 효능을 증명한다.
실시예 20: 혈청 알부민 dAb 와의 융합체로서 항- TNF dAb 의 효능
A 관절염의 예방 모형에서 TAR1 -5-19/항-혈청 알부민 dAb 융합체의 효능 연구
Tg197 생쥐는 인간 TNF-글로빈 하이브리드 유전자가 외부로부터 도입되고, 이형접합체(heterozygote)는 4-7주령에서, 류머티스성 관절염과 공통의 조직학적 특징을 보이는 만성 진행성 다발성 관절염이 발병한다[Keffer, J., Probert, L.,Cazlaris, H., Georgopoulos, S., Kaslaris, E., Kioussis, D., Kollias, G.(1991). Transgenic mice expressing human tumor necrosis factor: a predictive genetic model of arthritis. EMBO J., Vol. 10, pp. 4025-4031.]
Tgl97 모형에서 관절염의 예방에서 TAR1-5-19/항-혈청 알부민 dAb 융합체(3가지 dAb: TAR1-5-19, TAR1-5-19, 항-생쥐 혈청 알부민 dAb의 인라인 삼량체(inline trimer))의 효능을 검사하기 위하여, 이형접합성 유전자도입 생쥐는 수컷과 암컷을 동수로 하여 각 10마리의 동물군으로 분할하였다. 치료는 3주령에, 검사 물품의 주1회 복강내 주입으로 시작하였다. TAR1-5-19/항-혈청 알부민 dAb 융합체는 C-말단 헥사 히스티딘 태그(C-terminal hexa histidine tag)와 함께 대장균(E. coli)에서 발현시키고 Ni 친화력 크로마토그래피(affinity chromatography), IEX, 겔 여과(gel filtration)로 정제하였다. 모든 단백질 제조물은 인산염 완충액에 집어넣고 내독소의 허용가능 수준을 검사하였다.
상기 연구는 맹검(blind)으로 수행하였다. 매주, 동물은 칭량하고 아래의 체계: 0 = 관절염 없음(정상 외관과 굴곡), 1 = 경등도 관절염(관절 염좌), 2 = 중등도 관절염(부종, 관절 변형), 3 = 중증도 관절염(심각하게 손상된 움직임)에 따라 관절염의 거대표현형적 증상에 대한 스코어를 기록하였다.
본 연구의 결과는 염수 대조와 치료된 군의 관절염 스코어간의 현저한 차이로, 1O ㎎/㎏ TAR1-5-19/항-혈청 알부민 dAb 융합체가 관절염의 발생을 저해한다는 것을 분명하게 증명하였다. 1 ㎎/㎏ 용량의 TAR1-5-19/항-혈청 알부민 dAb 융합체 역시, 염수 대조군에 비하여 통계학적으로 유의하게 낮은 평균 관절염 스코어를 유도하였다(P<2%, 윌콕슨 검증(Wilcoxon Test)에 정규 근사(normal approximation)를 이용).
B 관절염의 치료 모형에서 TAR1 -5-19/항-혈청 알부민 dAb 융합체의 효능 연구
Tgl97 모형에서 관절염의 치료에서 TAR1-5-19/항-혈청 알부민 dAb 융합체의 효능을 검사하기 위하여, 이형접합성 유전자도입 생쥐는 수컷과 암컷을 동수로 하여 각 10마리의 동물군으로 분할하였다. 치료는 이들 동물이 현저한 관절염 표현형을 보이는 6주령에 시작하였다. 치료는 검사 물품의 주2회 2.7 ㎎/㎏ 복강내 주입으로 수행하였다. 샘플 제조와 질병 스코어링(disease scoring)은 앞서 기술된 바와 동일하다.
관절염 스코어는 TAR1-5-19/항-혈청 알부민 dAb 융합체가 치료 모형에서 관절염의 진행을 저해한다는 것을 분명하게 증명하였다. 2.7 ㎎/㎏ 용량의 TAR1-5-19/항-혈청 알부민 dAb 융합체는 9주 시점에, 염수 대조군에 비하여 통계학적으로 유의하게 낮은 평균 관절염 스코어를 유도하였다(P<0.05%, 윌콕슨 검증(Wilcoxon Test)에 정규 근사(normal approximation)를 이용).
이는 항-TNF dAb가 항-SA dAb의 포맷으로 유효할 수 있고, 항-SA dAb가 항-TNF dAb 단독에서 예상되는, 항-TNF dAb의 혈청 반감기를 연장시킨다는 것을 분명하게 증명한다.
실시예 21: RA 의 Tgl97 생쥐 모형에서, 본 명세서에 기술된 항- TNF -α dAb의 관절염 스코어와 조직병리학적 스코어에 대한 효과의 조사.
RA의 Tgl97 모형에서, 관절염 스코어와 조직병리학적 스코어에 대한 항-TNF-α dAb의 효과를 조사하기 위하여, 2가지 연구를 추가로 수행하였다.
첫 번째 연구에서, 앞서 기술된 TAR1-5-19 dAb Fc 융합체는 RA 증상의 발병 이전인 3주령부터 10 ㎎/㎏으로 주2회 투여하였다. 결과는 동일한 일정에서 염수, ENBREL, 대조 Fc 융합 dAb 주입과 비교하여 판단하였다.
TAR1-5-19 dAb Fc 융합체는 관절염 스코어에 의한 판단 및 조직 구조 슬라이드의 분석으로부터, 생쥐에서 RA 증상의 발병을 예방함에 있어 ENBREL보다 더욱 유효하였다.
두 번째 연구에서, 3주령부터 10 또는 1 ㎎/㎏으로 항-TNF-α dAb Fc 융합체, PEG 이량체, 이중특이적 항-TNF/antiSA의 주1회 주입의 효과. 결과는 ENBREL과 HUMIRA의 결과와 비교한다.
1 ㎎/㎏ 또는 10 ㎎/㎏ 용량으로 제공된 모든 TAR 포맷에 대한 관절염 스코어는 염수 대조에 비하여 감소하였다. 게다가, 상기 질병의 발병에서 지연이 관찰되었다. PEG화된 포맷과 항-SA 이중특이적 포맷은 Humira와 Enbrel에 비하여, 관절염의 심각도를 더욱 유효하게 감소시켰다. 이에 더하여, 10주 시점에 관절의 조직 구조의 분석에서, 이들 TAR 포맷은 염수 대조에 비하여 여전히 유효하고 질병 심각도를 감소시켰다.
요약하면, Fc 융합체 포맷, PEG화된 포맷, 항-SA 이중특이적 포맷의 TAR1-5-19 항-TNF-dAb 모두 관절염 증상의 발병 전후에 투여되는 지에 상관없이, Tgl97 모형 체계에서 RA 증상에 유효하다. 가장 유효한 항-TNF dAb 포맷은 HUMIRA와 동등하거나 이보다 더욱 유효하고, 가장 유효한 항-TNF dAb 포맷은 모든 연구에서 ENBREL보다 훨씬 유효하다.
실시예 22: 항-인간 VEGF dAb
TARI5 (항-인간 VEGF )
인간 VEGF에 결합하는 Vκ dAb를 아래에 기술한다. RBA는 본 명세서에 기술된 VEGF 수용체 2 결합 검사를 의미한다.
Figure 112010026521157-pat00035
TAR15-1 클론은 저밀도 BIAcore 칩에서 다양한 농도로 검사되는 경우에 50-80 nM의 Kd를 갖는다. 다른 Vκ 클론은 한가지 농도(50nM)에서 저밀도 칩에 통과시켰다. 상이한 클론은 상이한 동력학 프로필(kinetic profile)을 보인다.
아미노산 서열:
공통 서열: W28, G30, E32, S34, H50, Y93.
추가의 TAR15 항-인간 VEGF dAb 클론은 아래 TAR15-10에 도시된 바와 같이, 공통 서열: W28, G30, E32, S34, H50, Y93을 보유한다.
Figure 112010026521157-pat00036
Figure 112010026521157-pat00037
인간 VEGF에 결합하는 VH dAb를 아래에 기술한다. 이들 클론은 상층액 RBA(R2)에서 감소(50% 이상)를 제공한다.
Figure 112010026521157-pat00038
VH 클론은 한가지 농도(50nM)에서 저밀도 VEGF 칩의 BIAcore에 통과시켰다. 상이한 클론은 상이한 동력학 프로필(kinetic profile)을 보인다.
아미노산 서열:
Figure 112010026521157-pat00039
Figure 112010026521157-pat00040
실시예 23: 항- VEGF dAb 로 추가 연구
본 명세서에 기술된 항-VEGF dAb는 예로써, Fc 융합체, Fab, PEG화된 형태, 이량체, 사량체, 항-SA 이중특이적 형태를 비롯한 항-TNF-α dAb에 대한 앞서 기술된 다양한 포맷으로 효능을 검사할 수 있다. 항-VEGF dAb는 본 명세서에 기술된 항-TNF-α dAb 뿐만 아니라 다른 항-TNF-α 제조물, 예를 들면, HUMIRA, ENBREL 및/또는 REMICADE로 평가될 수 있다.
예로써, RA의 Tgl97 모형에서 관절염 스코어와 조직병리학적 스코어에 대한 항-VEGF dAb의 효과를 검사하기 위한 추가의 연구를 수행할 수 있다.
가령, 앞서 기술된 TAR1-5-19 Fc 융합체와 유사한 TAR15 dAb Fc 융합체를 3주령(RA 증상의 발병 이전), 또는 6주령(증상의 발병 이후)에서부터 최대 7주 또는 그 이상 동안 주1회 또는 주2회, 1 ㎎/㎏ 또는 10 ㎎/㎏으로 IP 투여한다. 결과는 가급적, 동등 몰량의 염수, 대조 Fc 융합체(항-β-gal), TAR1-5-19 단독, ENBREL, REMICADE 및/또는 HUMIRA와 비교하여 판단한다.
동물은 앞서 기술된 바와 같이, 거대표현형적 증상(가령, 관절염 스코어)와 조직병리학적 증상에 대한 스코어를 기록한다. 효능은
i) 3주령부터 동물에 투여되는 경우에, 질병 증상(관절염 스코어 또는 조직병리학적 스코어로 확인됨)의 발생 없음,
ii) 3주령부터 동물에 투여되는 경우에, 대조 동물에 비하여 나타나는 질병 증상의 심각도 감소,
iii) 6주령부터 동물에 투여되는 경우에, 대조 동물에 비하여 더욱 심각한 질병으로의 진행 없음 또는 더욱 느린 속도로 진행, 또는
iv) 6주령부터 동물에 투여되는 경우에, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 14주에 증상의 반전(관절염 스코어 또는 조직병리학적 스코어로 확인됨)에 의해 입증된다.
앞서 기술된 상이한 포맷, 예를 들면, Fab, PEG화된 형태, 이량체, 사량체, 항-SA 이중특이적 형태 각각으로 유사한 연구를 수행할 수 있다.
TAR15 dAb와 같은 항-VEGF dAb는 HUMIRA, ENBREL 및/또는 REMICADE와의 조합으로, Tgl97 동물 모형에 투여될 수도 있다. 이들 연구는 VEGF dAb 단독의 검사에서 앞서 기술된 바와 동일한 방식으로 수행되고, 효능 역시 동일한 방식으로 결정된다.
실시예 24: 크론병 모형에서 항- TNF -α dAb 의 평가
크론병에서 항-TNF-α dAb(및/또는 항-VEGF dAb)의 효능을 평가하기 위하여, Kontoyiannis et al., 1999, Immunity 10: 387-398에 최초로 기술된, 크론병의 TNF△ ARE 유전자도입 생쥐 모형을 이용한다(상기 DSS 모형은 유사한 방식으로 이용될 수도 있다). 이들 동물은 4주령 내지 8주령부터 크론병과 유사한 IBD 표현형이 나타난다. 이런 이유로, 다양한 포맷(Fc 융합체, Fab, PEG화된(이량체, 사량체 등), VEGF와 이중특이적, 항-SA와 이중특이적 등)으로 항-TNF-α dAb, 예를 들면, TAR1-5-19를 3주령(질병의 예방을 검사하기 위하여) 또는 6주령(질병 증상의 안정화, 진행의 예방 또는 반전을 검사하기 위하여)에 투여하고, 앞서 기술된 바와 같이 체중과 조직 구조로 동물에 대한 스코어를 기록한다. 최초 연구에 1 ㎎/㎏과 10 ㎎/㎏의 IP 투약이 이용되고, 이들 최초 연구의 결과에 따라 조정이 이루어진다. 검사 조성물은 주1회 또는 주2회 투여되거나, 또는 예로써 삼투압 펌프를 이용하여 연속적으로 투여될 수 있다. 대안으로, 경구 전달 제제, 예를 들면, Zantac으로 경구 위관영양(oral gavage) 또는 장용피(enteric coating) 제제가 적용될 수도 있다. 이들 연구는 일단 시작되면, 최대 7주 또는 그 이상 동안 지속된다.
크론병의 TNF△ ARE 모형에서 효능은
i) 3주령부터 동물에 투여되는 경우에, 질병 증상의 발생 없음,
ii) 3주령부터 동물에 투여되는 경우에, 대조 동물에 비하여 나타나는 질병 증상의 심각도 감소,
iii) 6주령부터 동물에 투여되는 경우에, 대조 동물에 비하여 더욱 심각한 질병으로의 진행 없음 또는 더욱 느린 속도로 진행, 또는
iv) 6주령부터 동물에 투여되는 경우에, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 14주에 증상의 반전에 의해 입증된다.
특히, 치료는 평균 조직병리학적 질병 스코어가 운반제 대조군에서보다 치료된 군에서 더욱 낮은 경우에(통계학적으로 유의한 양으로) 유효한 것으로 간주된다. 치료는 또한, 평균 조직병리학적 스코어가 운반제-단독 대조군에 비하여, 적어도 0.5 단위, 적어도 1.0 단위, 적어도 1.5 단위, 적어도 2.0 단위, 적어도 2.5 단위, 적어도 3.0 단위, 또는 적어도 3.5 단위 낮은 경우에 유효한 것으로 간주된다. 대안으로, 치료는 평균 조직병리학적 스코어가 치료 섭생의 전체 과정 동안 O 내지 0.5로 유지되거나 이들 수치로 낮아지는 경우에 유효하다.
RA 모형에서처럼, VEGF에 특이적인 dAb, 또는 다른 항-TNF-α 조성물(가령, ENBREL, REMICADE 및/또는 HUMIRA)과 병용 치료의 효과 역시 상기 모델에서 평가한다.
실시예 25: 인간 TNF -알파와 인간 VEGF 에 대한 이중특이적 IgG.
아래에 기술된 가공된 IgG-유사 이중특이적 포맷에서, 2가지 상이한 특이성의 dAb는 중쇄와 경쇄 불변 도메인에 개별적으로 융합한다. 세포에서 동시-발현이후, 2개의 팔을 갖는 IgG-유사 분자가 생성되는데, 여기서 2개의 치료 표적(가령, TNF-α에 특이적인 치료 표적 및 VEGF에 특이적인 치료 표적)에 결합할 수 있는 2개의 가변 도메인이 이중 표적화(dual targeting) IgG의 각 팔에 존재한다.
DNA 구조체. 이용되는 포유동물 발현 벡터는 Invibrogen pcDNA3.1 골격에 기초하는데, 이는 CMV 극초기 프로모터(immediate early promoter)를 통하여 포유동물 세포에서 유전자 발현을 조장한다. 중쇄 발현을 위하여, 인간 CD33 신호 펩티드와 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인으로 구성되는 카세트는 벡터 pcDNA3.1(+)의 NheI와 XbaI 제한 부위로 삽입하고, VEGF에 특이적이고 중쇄 폴리펩티드의 일부로서 발현되는 가변 도메인은 HindIII와 NotI 제한 부위를 이용하여 상기 카세트에서, CD33 신호 펩티드와 IgG1 중쇄 불변 도메인 사이에 클론하였다. 경쇄 발현을 위하여, CD33 신호 펩티드와 인간 C 카파 불변 도메인으로 구성되는 카세트는 벡터 pcDNA3.lzeo(+)의 NheI과 XhoI 제한 부위에 삽입하고, TNF-알파에 특이적이고 경쇄 폴리펩티드의 일부로서 발현되는 가변 도메인은 HindIII과 NotI 제한 부위를 이용하여 상기 카세트에서, CD33 신호 펩티드와 C 카파 불변 도메인 사이에 클론하였다.
단백질 발현과 정제. 중쇄와 경쇄 발현 벡터의 DNA는 제조업체의 사용설명서에 따라 Qiagen EndoFree 플라스미드 Mega 키트를 이용하여 제조하고, 제조업체의 사용설명서에 따라 Roche 형질감염(transfection) 시약 Fugene6으로 HEK293(European Collection of Cell Cultures로부터 입수됨) 또는 Cos-7 세포(American Type Culture Collection으로부터 입수됨)를 형질감염시키는데 이용하였다. 5일후, 배양 상층액은 원심분리로 수확하고, 분비된 이중특이적 항체는 2-단계 친화력 정제를 이용하여 정제하였다. 먼저, 배양 상층액은 1.5x PBS의 최종 농도로 인산염 완충액(PBS)으로 보충하고, 항체는 Amersham Streamline 단백질 A 수지에서 포획하였다. 수지는 2x PBS, 이후 10 mM Tris pH8로 세척하고, 결합된 항체는 0.1M 글리신 pH2를 이용하여 용리하였다. 용출액(eluate)은 25% 부피의 1M Tris pH8을 첨가하여 중화시키고, 재조합 항체는 Affitech 단백질 L 아가로즈 수지에서 포획하였다. 수지는 2x PBS, 이후 10 mM Tris pH8을 이용하여 다시 세척하고, 결합된 재조합 항체는 0.1M 글리신 pH2를 이용하여 용리하고, 용출액은 25% 부피의 1M Tris pH8을 첨가함으로써 중화시켰다.
재조합 항체의 분석. 정제된 재조합 항체는 280nm에서 흡광도 판독(absorbance reading)을 이용하여 분광광도계에서 정량하고, 제조업체의 사용설명서에 따라 Invitrogen NuPAGE 4-12% Bis-Tris 겔과 SilverQuest 염색을 이용한 SDS-PAGE로 분석하였다. 도 29에서는 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인에 융합된 인간 VEGF에 특이적인 kappa 가변 도메인 및 인간 C 카파 불변 도메인에 융합된 인간 TNF-알파에 특이적인 카파 가변 도메인을 포함하는 이중특이적 항체의 SDS-PAGE 분석의 결과를 도시한다. 레인 1은 Invitrogen MultiMark 분자량 마커로 적하되고, 레인 2는 1x Invitrogen NuPAGE LDS 샘플 완충액에 담긴 이중특이적 항체로 적하되고, 레인 3은 10 mM 베타멀캡토에탄올(betamercaptoethanol)로 보충된 1x Invitrogen NuPAGE LDS 샘플 완충액에 담긴 이중특이적 항체로 적하된다. 레인 3에서, 중쇄는 50kDa 밴드로 나타나고, 경쇄는 25kDa 밴드로 나타난다.
이중특이성의 검사. 이들 발현된 항체의 이중특이성은 인간 TNF-세포 검사와 인간 VEGF 수용체 결합 검사 모두에서 항체의 각 정제된 배치의 효능을 측정함으로써 증명하였다.
이용된 인간 TNF 세포-기초된 검사는 Evans(2000, Molecular Biotechnology 15, 243-248)에 의해 기술된 L929 세포독성 검사이었다. 간단히 말하면, 마이크로역가 평판에 도말된 L929 세포는 이중특이적 항체, 100 pg/㎖ TNF, 1 ㎎/㎖ 악티노마이신 D(Sigma, Poole, UK)와 함께 하룻밤동안 배양하였다. 세포 생존능(cell viability)은 [3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-술포페닐)-2H-테타라졸리움(Promega, Madison, USA)과의 배양이후 490nm에서 흡광도를 판독함으로써 측정하였다. 항-TNF 활성은 TNF 세포독성에서 감소를 유도하고, 따라서 TNF 단독 대조에 비하여 흡광도 증가를 유도한다.
VEGF 활성은 “면역글로불린 기초된 다중특이적 리간드의 제조” 섹션에서 앞서 기술된 바와 같이 VEGFR2 결합 검사를 이용하여 측정하였다. 간단히 말하면, 96 웰 Nunc Maxisorp 검사 평판은 탄산염에서 0.5 ㎍/㎖의 재조합 인간 VEGF R2/Fc(R&D Systems, Cat. No: 357-KD-050)로 하룻밤동안 코팅하였다. 웰은 0.05% Tween/PBS, 이후 PBS로 반복적으로 세척하였다. PBS에 녹인 2% BSA를 첨가하여 평판을 차단하였다. 웰은 상기한 바와 같이 세척하고, 이후 정제된 이중특이적 항체를 각 웰에 첨가하였다. 그 다음, 희석액(3 ng/㎖의 최종 농도)에서 6 ng/㎖의 VEGF를 각 웰에 첨가하고, 실온에서 2시간동안 평판을 배양하였다. 웰은 상기한 바와 같이 세척하고, 희석액에서 0.5 ㎍/㎖의 비오틴화된 항-VEGF 항체(R&D Systems, Cat No: BAF293)를 첨가하고 실온에서 2시간동안 배양하였다. 웰은 상기한 바와 같이 세척하고, 이후 HRP 공액된 항-비오틴 항체(희석액에서 1:5000 희석; Stratech, Cat No: 200-032-096)를 첨가하였다. 그 다음, 평판은 실온에서 1시간동안 배양하였다. 평판은 상기한 바와 같이 세척하고, Tween-20의 잔류물질을 완전히 제거하였다. 검출을 위하여, 100 ㎕의 SureBlue 1-Component TMB MicroWell 과산화효소 용액을 각 웰에 첨가하였다. 1M 염화수소산을 첨가하여 반응을 중단시키고, 이후 평판 판독기(plate reader)를 이용하여 OD450을 판독하였다.
도 30에서는 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인에 융합된 인간 VEGF에 특이적인 kappa 가변 도메인 및 인간 C 카파 불변 도메인에 융합된 인간 TNF-알파에 특이적인 카파 가변 도메인을 포함하는 이중특이적 항체의 결과를 도시한다. 상기 이중특이적 항체(항-TNF-알파 x 항-VEGF)는 인간 TNF-알파와 인간 VEGF에 모두 결합한다. 상기 항체는 양쪽 표적에 대하여 이가(bivalent)이다: TNF-알파에 대한 ND50(24 nM)은 이중특이적 분자에서 C 카파에 가변 도메인으로서 융합된 항-TNF-알파 단량체의 ND50(200 nM)에 비하여 현저하게 낮다. VEGF에 대한 EC50(75 pM)은 이중특이적 분자에서 중쇄 불변 도메인에 가변 도메인으로 융합된 항-VEGF 단량체에 대한 EC50(12 nM)보다 훨씬 낮고, 또한 단백질 L 가교-결합에 의해 올리고머화(oligomerization)된 항-VEGF 단량체에 대한 EC50(사각형의 데이터 점으로 표시된 선, 990 pM)보다 훨씬 낮다.
이런 구체예의 구조체들은 첫 번째 에피토프에 결합하는 VH 또는 VL 단일 도메인 항체의 2개 사본 및 두 번째 에피토프에 결합하는 VH 또는 VL 단일 도메인 항체의 2개 사본을 포함하는 4가, 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체이다. 첫 번째 에피토프에 결합하는 단일 도메인 항체의 2개 사본 각각은 IgG 중쇄 불변 도메인에 융합되고, 두 번째 에피토프에 결합하는 단일 도메인 항체의 2개 사본 각각은 경쇄 불변 도메인에 융합된다.
본 실시예에서 기술된 것들과 유사한 추가의 이중특이적, 4가 폴리펩티드 구조체는 예로써, 다른 항-TNF-α와 항-VEGF 항체 서열, 예를 들면, 본 명세서에 기술된 것들을 이용하여 당업자에 의해 생성될 수 있다. 다른 구체예에서, Cκ 또는 Cλ 경쇄 불변 도메인이 이용될 수 있고, IgG1 이외의 IgG 중쇄 불변 도메인 역시 이용될 수 있다. 이런 종류의 구조체의 개발에서, dAb 단량체로서 관절염의 Tgl97 유전자도입 생쥐 모형의 생쥐에 투여되는 경우에 관절염 스코어의 증가를 예방하는 단일 도메인 항-TNF-α 항체 클론 및 dAb 단량체로서 콜라겐-유도된 관절염 생쥐 모형의 생쥐에 투여되는 경우에 관절염 스코어의 증가를 예방하는 단일 도메인 항-VEGF 항체 클론이 특히 주목된다. 또한, 단일 도메인 항-TNF-α 항체 클론의 단량체는 본 명세서에 기술된 L929 세포 세포독성 검사에서 인간 TNF-α를 중화시키고, 단일 도메인 항-VEGF 항체 클론의 단량체는 본 명세서에 기술된 VEGF 수용체 2 결합의 검사에서 VEGF 수용체를 길항하는 것이 바람직하다. 이용된 단일 도메인 항체 클론은 <100 nM의 Kd로 개별 에피토프에 결합하는 것이 바람직하다. 또한, 이들 이중특이적, 4가 구조체는 <100 nM의 Kd로 개별 에피토프에 결합하고, 본 명세서에 기술된 관절염의 Tgl97과 CIA 모형 중에서 한쪽 또는 양쪽에서 관절염 스코어의 증가를 예방한다.
이들 구조체는 투여, 용량, 효능의 모니터링의 관점에서, 본 명세서에 기술된 다른 구조체와 유사한 방식으로 류머티스성 관절염의 치료에 이용될 수 있다. 구조체의 반감기는 앞서 기술된 바와 같이, 예를 들면, PEG 부분의 추가에 의해, 및/또는 순환 반감기(circulating half-life)를 증가시키는 단백질, 예를 들면, HSA와 같은 혈청 단백질에 특이적인 결합 부분(가령, 추가의 단일 도메인 항체)의 추가적인 융합에 의해 변경될 수 있다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허, 공개된 특허 출원 및 이들 간행물에 인용된 문헌은 참고문헌으로서 포함된다. 본 발명의 기술된 방법과 시스템의 다양한 개변은 본 발명의 범위 및 기술적 사상에서 벗어남 없이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명이 특정의 바람직한 구체예와 연관하여 기술되긴 했지만, 청구된 본 발명은 이들 특정 구체예에 부당하게 한정되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 실제로, 분자생물학 또는 관련 분야의 당업자에게 명백한, 본 발명을 수행하기 위한 기술된 양식의 다양한 변형은 아래의 청구항의 범위 내에 존재한다.
부록 1: 생체내에서 반감기를 증가시키는 폴리펩티드
알파-1 당단백질(오로뮤코이드)(AAG)
알파-1 안티키로모티로신(ACT)
알파-1 안티티로신(AAT)
알파-1 마이크로글로불린(단백질 HC)(AIM)
알파-2 마크로글로불린(A2M)
안티트롬빈 Ⅲ(AT Ⅲ)
아폴리포프로테인A-1(Apo A-1)
아폴리프로테인 B(Apo B)
베타-2-마이크로글로불린(β2M)
*세룰로플라스민(Cp)
보충 성분(Complement Component)(C3)
보충 성분(C4)
C1 에스테라아제 저해제(C1 INH)
C-반응성 단백질(CRP)
시스타틴 C(Cys C)
페리틴(FER)
피브리노겐(FIB)
피브로텍틴(FN)
합토글로빈(Hp)
*헤모펙신(HPX)
면역글로불린 A(IgA)
면역글로불린 D(IgD)
면역글로불린 E(IgE)
면역글로불린 G(IgG)
면역글로불린 M(IgM)
면역글로불린 경쇄(카파/람다)
리포프로테인(a)[Lp(a)]
만노스-결합 단백질(MBP)
미오글로빈(Myo)
플라스미노겐(PSM)
프리알부민(트랜스티레틴)(PAL)
레티놀-결합 단백질(RBP)
레노마토이드 인자(RF)
혈청 아밀로이드 A(SAA)
용해성 트랜스페린 수용체(sTfR)
트랜스페린(Tf)
부록 2
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부록 3: 종양학 조합
Figure 112010026521157-pat00051
Figure 112010026521157-pat00052
부록 4: 데이터 요약
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서열목록 전자파일 첨부

Claims (3)

  1. 하기 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체:
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAP
    KLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLGPEDFATYYCQ
    QVVWRPFTFGQGTKVEIKR
  2. 삭제
  3. 인간을 제외한 개체에서 류머티스성 관절염을 치료하는 방법에 있어서, 수용체에 대한 인간 TNFα 결합을 길항하는 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체를 함유하는 조성물의 치료 효과량을 병든 개체에 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 단일 도메인 항체 폴리펩티드 구조체는 하기 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 류머티스성 관절염의 치료 방법:
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAP
    KLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLGPEDFATYYCQ
    QVVWRPFTFGQGTKVEIKR
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Families Citing this family (284)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9321832B2 (en) 2002-06-28 2016-04-26 Domantis Limited Ligand
US7696320B2 (en) * 2004-08-24 2010-04-13 Domantis Limited Ligands that have binding specificity for VEGF and/or EGFR and methods of use therefor
WO2007066106A1 (en) * 2005-12-06 2007-06-14 Domantis Limited Ligands that have binding specificity for egfr and/or vegf and methods of use therefor
AU2003256299A1 (en) 2002-07-01 2004-01-19 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that specifically bind to reg iv
PT1639011E (pt) * 2003-06-30 2009-01-20 Domantis Ltd Anticorpos (dab) de domínio único peguilados
EP2322554A1 (en) 2004-06-30 2011-05-18 Domantis Limited Composition comprising an anti-TNF-alpha domain antibody for the treatment of rheumatoid arthritis
GB0521621D0 (en) 2005-10-24 2005-11-30 Domantis Ltd Tumor necrosis factor receptor 1 antagonists for treating respiratory diseases
JP2009504685A (ja) * 2005-08-15 2009-02-05 アラーナ・テラピューティクス・リミテッド 新世界霊長類フレームワーク領域を用いる設計された抗体
CA2634083A1 (en) * 2005-12-20 2007-06-28 Arana Therapeutics Limited Chimeric antibodies with part new world primate binding regions
EP1987064A4 (en) * 2006-02-01 2010-04-07 Arana Therapeutics Ltd DOMAIN ANTIBODY CONSTRUCT
US9101670B2 (en) 2006-04-07 2015-08-11 Nektar Therapeutics Conjugates of an anti-TNF-α antibody
US20110076279A1 (en) * 2006-10-20 2011-03-31 Schering Corporation Fully human anti-vegf antibodies and methods of using
US20080139790A1 (en) * 2006-12-08 2008-06-12 Jennings Philip A Chimeric antibodies
CA2673331A1 (en) 2006-12-19 2008-06-26 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against gpcrs and polypeptides comprising the same for the treatment of gpcr-related diseases and disorders
EP2102244A2 (en) 2006-12-19 2009-09-23 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against a metalloproteinase from the adam family and polypeptides comprising the same for the treatment of adam-related diseases and disorders
US9512236B2 (en) 2006-12-19 2016-12-06 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against GPCRS and polypeptides comprising the same for the treatment of GPCR-related diseases and disorders
JP2010518839A (ja) * 2007-02-21 2010-06-03 アブリンクス エン．ヴェー． 血管内皮増殖因子に指向性を有するアミノ酸配列、及び過度の及び／もしくは病的な血管形成又は血管新生を特徴とする症状及び疾患を治療するためにこれを含むポリペプチド
GB0724331D0 (en) * 2007-12-13 2008-01-23 Domantis Ltd Compositions for pulmonary delivery
NZ580530A (en) * 2007-06-06 2012-04-27 Domantis Ltd Anti vegf polypeptides, antibody variable domains and antagonists
CA2688434A1 (en) * 2007-06-06 2008-12-11 Domantis Limited Polypeptides, antibody variable domains and antagonists
EP2173772A2 (en) 2007-07-03 2010-04-14 Ablynx N.V. Providing improved immunoglobulin sequences by mutating cdr and/or fr positions
CA2698419C (en) * 2007-09-07 2019-11-12 Edward Dolk Binding molecules with multiple binding sites, compositions comprising the same and uses thereof
EP2215123A1 (en) 2007-11-27 2010-08-11 Ablynx N.V. Immunoglobulin constructs
EP2247616A2 (en) 2008-03-05 2010-11-10 Ablynx N.V. Novel antigen binding dimer-complexes, methods of making and uses thereof
AU2009235467A1 (en) 2008-04-07 2009-10-15 Ablynx Nv Single variable domains against the Notch pathways
BRPI0911984A2 (pt) 2008-05-16 2016-09-20 Ablynx Nv sequências de aminoácidos direncionadas contra cxcr4 e outros compostos gpcrs compreendendo os mesmos
DK2285408T3 (en) 2008-06-05 2019-02-04 Ablynx Nv AMINO ACID SEQUENCES AGAINST COATING PROTEINS IN A VIRUS AND POLYPEPTIDES INCLUDING THESE FOR TREATMENT OF VIRUSAL DISEASES
NZ590668A (en) * 2008-07-02 2012-12-21 Emergent Product Dev Seattle TNF-alpha ANTAGONIST MULTI-TARGET BINDING PROTEINS
US9005963B2 (en) 2008-10-14 2015-04-14 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against cellular receptors for viruses and bacteria
CA2739352C (en) 2008-10-29 2021-07-13 Wyeth Llc Methods for purification of single domain antigen binding molecules
MX345226B (es) 2008-10-29 2017-01-20 Ablynx Nv Formulaciones de moleculas de union a antigeno de dominio sencillo.
AU2009319175A1 (en) * 2008-11-26 2010-06-03 Glaxo Group Limited Polypeptides, antibody variable domains & antagonists
CN102307902B (zh) 2008-12-10 2016-02-24 埃博灵克斯股份有限公司 用于治疗与血管发生相关的疾病和病症的针对血管生成素/Tie系统的氨基酸序列和包括其的多肽
US10005830B2 (en) 2009-03-05 2018-06-26 Ablynx N.V. Antigen binding dimer-complexes, methods of making/avoiding and uses thereof
EP3461844A3 (en) 2009-04-10 2019-05-15 Ablynx N.V. Improved amino acid sequences directed against il-6r and polypeptides comprising the same for the treatment of il-6r related diseases and disorders
DK2424889T3 (en) 2009-04-30 2015-11-02 Ablynx Nv Process for the preparation of domain antibodies
EA201190273A1 (ru) * 2009-05-28 2012-12-28 Глаксо Груп Лимитед Комбинация антагониста tnf-альфа и антагониста vegf для применения в лечении или предупреждении заболеваний глаз
EP2438087B1 (en) 2009-06-05 2017-05-10 Ablynx N.V. Trivalent anti human respiratory syncytial virus (hrsv) nanobody constructs for the prevention and/or treatment of respiratory tract infections
ES2804450T3 (es) * 2009-07-10 2021-02-08 Ablynx Nv Método para la producción de dominios variables
CN102741288B (zh) 2009-08-29 2015-08-19 Abbvie公司 治疗用dll4结合蛋白
PL2473528T3 (pl) 2009-09-03 2015-05-29 Ablynx Nv Stabilne formulacje polipeptydów i ich zastosowanie
EP2507262A1 (en) 2009-11-30 2012-10-10 Ablynx N.V. Improved amino acid sequences directed against human respiratory syncytial virus (hrsv) and polypeptides comprising the same for the prevention and/or treatment of respiratory tract infections
EP3309176A1 (en) 2009-12-14 2018-04-18 Ablynx N.V. Immunoglobulin single variable domain antibodies against ox40l, constructs and therapeutic use
WO2011083140A1 (en) 2010-01-08 2011-07-14 Ablynx Nv Immunoglobulin single variable domain directed against human cxcr4
US9120855B2 (en) 2010-02-10 2015-09-01 Novartis Ag Biologic compounds directed against death receptor 5
SI2533761T1 (sl) 2010-02-11 2019-08-30 Ablynx N.V. Postopki in sestavki za pripravo aerosolov
RU2016146198A (ru) 2010-03-02 2018-12-19 Эббви Инк. Терапевтические dll4-связывающие белки
US8937164B2 (en) 2010-03-26 2015-01-20 Ablynx N.V. Biological materials related to CXCR7
JP6120767B2 (ja) 2010-05-20 2017-04-26 アブリンクス ナームローゼ・フェノーツハップＡｂｌｙｎｘ ＮＶ Ｈｅｒ３に関連する生物学的材料
WO2011161263A1 (en) 2010-06-25 2011-12-29 Ablynx Nv Pharmaceutical compositions for cutaneous administration
CN103119062A (zh) 2010-07-16 2013-05-22 埃博灵克斯股份有限公司 修饰的单结构域抗原结合分子及其应用
NZ607480A (en) 2010-08-03 2014-10-31 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
JP6173911B2 (ja) 2010-09-10 2017-08-09 メディミューン リミテド 抗体誘導体
WO2012042026A1 (en) 2010-09-30 2012-04-05 Ablynx Nv Biological materials related to c-met
PL2632946T3 (pl) 2010-10-29 2018-06-29 Ablynx N.V. Sposób wytwarzania pojedynczych domen zmiennych immunoglobulin
DK2635607T3 (da) 2010-11-05 2019-11-18 Zymeworks Inc Stabilt heterodimert antistofdesign med mutationer i fc-domænet
ES2723775T3 (es) 2010-11-08 2019-09-02 Ablynx Nv Polipéptidos que se unen a CXCR2
EA201390611A1 (ru) * 2010-11-24 2014-01-30 Глаксо Груп Лимитед Мультиспецифические антигенсвязывающие белки, направленные на hgf
EP2691415B1 (en) 2011-03-28 2018-07-11 Ablynx N.V. Method for producing solid formulations comprising immunoglobulin single variable domains
US20150158948A9 (en) 2011-03-28 2015-06-11 Francis Descamps Bispecific anti-cxcr7 immunoglobulin single variable domains
AU2012237287B2 (en) 2011-03-30 2016-09-08 Ablynx Nv Methods of treating immune disorders with single domain antibodies against TNF-alpha
UA117218C2 (uk) 2011-05-05 2018-07-10 Мерк Патент Гмбх Поліпептид, спрямований проти il-17a, il-17f та/або il17-a/f
WO2012152823A1 (en) 2011-05-09 2012-11-15 Ablynx Nv Method for the production of immunoglobulin single variable domains
CA2835340A1 (en) 2011-05-27 2012-12-06 Ablynx Nv Inhibition of bone resorption with rankl binding peptides
CN104271598A (zh) 2011-06-23 2015-01-07 埃博灵克斯股份有限公司 针对IgE的免疫球蛋白单可变结构域
EA028886B1 (ru) 2011-07-27 2018-01-31 Глаксо Груп Лимитед ОТДЕЛЬНЫЕ ВАРИАБЕЛЬНЫЕ ДОМЕНЫ ПРОТИВ VEGF, СЛИТЫЕ С Fc-ДОМЕНАМИ
US9605083B2 (en) 2011-08-16 2017-03-28 Emory University JAML specific binding agents, antibodies, and uses related thereto
US10465005B2 (en) 2011-08-16 2019-11-05 Emory Patent Group JAML specific binding agents, antibodies, and uses related thereto
KR102162413B1 (ko) * 2011-08-17 2020-10-07 글락소 그룹 리미티드 변형된 단백질 및 펩티드
EP2747782B1 (en) 2011-09-23 2018-01-17 Ablynx NV Prolonged inhibition of interleukin-6 mediated signaling
CN106046161B (zh) 2011-09-30 2019-09-13 埃博灵克斯股份有限公司 与C-Met相关的生物物质
ES2899956T3 (es) 2011-11-04 2022-03-15 Zymeworks Inc Diseño de anticuerpo heterodimérico estable con mutaciones en el dominio Fc
EP2827882B1 (en) 2012-02-21 2020-04-08 Cytonics Corporation Systems, compositions, and methods for transplantation
AU2013258834B2 (en) 2012-05-10 2017-09-07 Zymeworks Bc Inc. Heteromultimer constructs of immunoglobulin heavy chains with mutations in the Fc domain
US11339208B1 (en) 2012-05-31 2022-05-24 United States Of America As Represented By The Secretary Of The Air Force Camelidae single-domain antibodies against Yersinia pestis and methods of use
US9499634B2 (en) 2012-06-25 2016-11-22 Zymeworks Inc. Process and methods for efficient manufacturing of highly pure asymmetric antibodies in mammalian cells
SG11201503412RA (en) 2012-11-01 2015-05-28 Abbvie Inc Anti-vegf/dll4 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US9914785B2 (en) 2012-11-28 2018-03-13 Zymeworks Inc. Engineered immunoglobulin heavy chain-light chain pairs and uses thereof
HUE047580T2 (hu) 2013-04-29 2020-05-28 Agrosavfe Nv Szfingolipidekhez kötõdõ ellenanyagokat tartalmazó agrokémiai készítmények
US9352021B2 (en) 2013-08-28 2016-05-31 Cytonics Corporation Systems, compositions, and methods for transplantation and treating conditions
EP2883883A1 (en) 2013-12-16 2015-06-17 Cardio3 Biosciences S.A. Therapeutic targets and agents useful in treating ischemia reperfusion injury
NL2013007B1 (en) 2014-06-16 2016-07-05 Ablynx Nv Methods of treating TTP with immunoglobulin single variable domains and uses thereof.
NL2013661B1 (en) 2014-10-21 2016-10-05 Ablynx Nv KV1.3 Binding immunoglobulins.
RU2700650C2 (ru) 2014-10-10 2019-09-18 Аблинкс Н.В. Игаляционное устройство для использования в аэрозольной терапии респираторных заболеваний
RU2017115670A (ru) 2014-10-10 2018-11-15 Аблинкс Н.В. Лечение инфекции рсв
BR112017009330A2 (pt) 2014-11-05 2017-12-19 Agrosavfe N V planta transgênica que compreende um polinucleotídeo que codifica um domínio variável de anticorpo de cadeia pesada
WO2016094881A2 (en) 2014-12-11 2016-06-16 Abbvie Inc. Lrp-8 binding proteins
CA2971278C (en) 2014-12-19 2023-09-19 Ablynx N.V. Cysteine linked nanobody dimers
CN107531780B (zh) 2015-02-03 2021-11-02 国家健康与医学研究院 抗-Rho GTPase的构象单域抗体及其用途
WO2016130451A1 (en) * 2015-02-09 2016-08-18 Dnx Biotech, Llc Increasing the half-life of a full-length or a functional fragment of variant anti-human tnf-alpha antibody
WO2016135041A1 (en) 2015-02-26 2016-09-01 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Fusion proteins and antibodies comprising thereof for promoting apoptosis
WO2016180969A1 (en) 2015-05-13 2016-11-17 Ablynx N.V. T cell recruiting polypeptides based on tcr alpha/beta reactivity
CA2985700C (en) 2015-05-13 2022-06-28 Ablynx N.V. T cell recruiting polypeptides based on cd3 reactivity
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
CN105384825B (zh) 2015-08-11 2018-06-01 南京传奇生物科技有限公司 一种基于单域抗体的双特异性嵌合抗原受体及其应用
US11078251B2 (en) 2015-09-18 2021-08-03 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) T cell receptors (TCR) and uses thereof for the diagnosis and treatment of diabetes
US10947598B2 (en) 2015-09-29 2021-03-16 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Methods for determining the metabolic status of lymphomas
US10556953B2 (en) 2015-10-12 2020-02-11 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Agent capable of depleting CD8 T cells for the treatment of myocardial infarction or acute myocardial infarction
EP3374389A1 (en) 2015-11-13 2018-09-19 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Anti- nkg2d single domain antibodies and uses thereof
CA3006398A1 (en) 2015-11-27 2017-06-01 Ablynx Nv Polypeptides inhibiting cd40l
WO2017118634A1 (en) 2016-01-04 2017-07-13 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of pd-1 and tim-3 as a measure for cd8+ cells in predicting and treating renal cell carcinoma
WO2017129558A1 (en) 2016-01-25 2017-08-03 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for predicting or treating myelopoiesis-driven cardiometabolic diseases and sepsis
WO2017129763A1 (en) 2016-01-28 2017-08-03 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of signet ring cell gastric cancer
US10822415B2 (en) 2016-01-28 2020-11-03 Inserm (Institut National De La Santéet De La Recherche Médicale) Methods for enhancing the potency of the immune checkpoint inhibitors
ES2924775T3 (es) 2016-01-28 2022-10-10 Inst Nat Sante Rech Med Métodos y composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer
EP3439659A1 (en) 2016-04-06 2019-02-13 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of age-related cardiometabolic diseases
WO2017182609A1 (en) 2016-04-22 2017-10-26 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical composition for the treatment of inflammatory skin diseases associated with desmoglein-1 deficiency
CN109311968A (zh) 2016-05-02 2019-02-05 埃博灵克斯股份有限公司 治疗rsv感染
US11098124B2 (en) 2016-05-03 2021-08-24 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) CD31 shed as a molecular target for imaging of inflammation
EP3744348B1 (en) 2016-05-06 2022-03-23 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Pharmaceutical compositions for the treatment of chemoresistant acute myeloid leukemia (aml)
WO2017194554A1 (en) 2016-05-10 2017-11-16 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Combinations therapies for the treatment of cancer
WO2017202962A1 (en) 2016-05-24 2017-11-30 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of non small cell lung cancer (nsclc) that coexists with chronic obstructive pulmonary disease (copd)
WO2017202890A1 (en) 2016-05-27 2017-11-30 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for predicting and treating myeloma
RU2745748C2 (ru) 2016-06-02 2021-03-31 Эббви Инк. Агонист глюкокортикоидного рецептора и его иммуноконъюгаты
WO2018007442A1 (en) 2016-07-06 2018-01-11 Ablynx N.V. Treatment of il-6r related diseases
WO2018014260A1 (en) 2016-07-20 2018-01-25 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Multispecific antigen binding proteins and methods of use thereof
WO2018029182A1 (en) 2016-08-08 2018-02-15 Ablynx N.V. Il-6r single variable domain antibodies for treatment of il-6r related diseases
WO2018041989A1 (en) 2016-09-02 2018-03-08 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for diagnosing and treating refractory celiac disease type 2
EP3510407A1 (en) 2016-09-08 2019-07-17 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for diagnosing and treating nephrotic syndrome
EP3512880A1 (en) 2016-09-15 2019-07-24 Ablynx NV Immunoglobulin single variable domains directed against macrophage migration inhibitory factor
WO2018068201A1 (en) 2016-10-11 2018-04-19 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Single-domain antibodies and variants thereof against ctla-4
EP3538140A1 (en) 2016-11-14 2019-09-18 Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale (INSERM) Methods and pharmaceutical compositions for modulating stem cells proliferation or differentiation
CN110177809B (zh) 2016-11-16 2023-11-03 埃博灵克斯股份有限公司 能够结合CD123和TCRα/β的T细胞募集多肽
WO2018091621A1 (en) 2016-11-17 2018-05-24 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for increasing endogenous protein level
WO2018099968A1 (en) 2016-11-29 2018-06-07 Ablynx N.V. Treatment of infection by respiratory syncytial virus (rsv)
WO2018100190A1 (en) 2016-12-02 2018-06-07 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for diagnosing renal cell carcinoma
WO2018134389A1 (en) 2017-01-23 2018-07-26 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating infections
JP7341060B2 (ja) 2017-02-10 2023-09-08 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル Ｍａｐｋ経路の活性化に関連付けられる癌の処置のための方法及び医薬組成物
CN110573604A (zh) 2017-02-28 2019-12-13 非营利性组织佛兰芒综合大学生物技术研究所 用于口服蛋白质递送的工具和方法
EP3600427A1 (en) 2017-03-24 2020-02-05 INSERM - Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods and compositions for treating melanoma
WO2018178029A1 (en) 2017-03-27 2018-10-04 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating degenerative muscular and/or neurological conditions or diseases
WO2018178030A1 (en) 2017-03-27 2018-10-04 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating degenerative muscular and/or neurological conditions or diseases
WO2018178078A1 (en) 2017-03-28 2018-10-04 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) New tau species
JP2020515588A (ja) 2017-03-30 2020-05-28 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル ミトコンドリア遺伝子疾患の処置方法
JP2020519261A (ja) 2017-05-11 2020-07-02 ブイアイビー ブイゼットダブリュＶｉｂ Ｖｚｗ 可変免疫グロブリンドメインのグリコシル化
US20200171022A1 (en) 2017-05-17 2020-06-04 Inserm (Institut National De La Santé Et Da La Recherche Médicale) Flt3 inhibitors for improving pain treatments by opioids
WO2018220225A1 (en) 2017-06-02 2018-12-06 Ablynx Nv Aggrecan binding immunoglobulins
AU2018278275A1 (en) 2017-06-02 2019-12-19 Ablynx N.V. MMP13 binding immunoglobulins
MX2019014397A (es) 2017-06-02 2020-02-10 Merck Patent Gmbh Polipeptidos que enlazan adamts5, mmp13 y agrecano.
BR112019024333A2 (pt) 2017-06-02 2020-07-28 Merck Patent Gmbh imunoglobulinas de ligação adamts
EP3634582A1 (en) 2017-06-08 2020-04-15 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating hyperpigmentation disorders
US20200096507A1 (en) 2017-06-08 2020-03-26 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Chimeric receptor for use in whole-cell sensors for detecting analytes of interest
US20210403573A1 (en) 2017-06-22 2021-12-30 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of fibrosis with agents capable of inhibiting the activation of mucosal-associated invariant t (mait) cells
WO2019000223A1 (en) 2017-06-27 2019-01-03 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. ENABLERS OF IMMUNE EFFECTOR CELLS OF CHIMERIC ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF
WO2019002548A1 (en) 2017-06-29 2019-01-03 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) TREATMENT OF MIGRAINE WITH TREK1, TREK2 AGONIZATION OR HETEROMERS COMPRISING SAME
KR102625929B1 (ko) 2017-07-19 2024-01-16 브이아이비 브이지더블유 혈청 알부민 결합제
WO2019016310A1 (en) 2017-07-20 2019-01-24 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING CANCERS
WO2019020480A1 (en) 2017-07-24 2019-01-31 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) ANTIBODIES AND PEPTIDES FOR TREATING HCMV RELATED DISEASES
WO2019020593A1 (en) 2017-07-25 2019-01-31 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) METHODS AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS FOR MODULATION OF MONOCYTOPOISIS
US20200197547A1 (en) 2017-08-30 2020-06-25 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Anti-mesothelin radiolabelled single domain antibodies suitable for the imaging and treatment of cancers
EP3457139A1 (en) 2017-09-19 2019-03-20 Promise Advanced Proteomics Antibody-like peptides for quantifying therapeutic antibodies
WO2019057742A1 (en) 2017-09-20 2019-03-28 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) METHODS AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS FOR MODULATION OF AUTOPHAGIA
EP3704160A1 (en) 2017-10-31 2020-09-09 VIB vzw Novel antigen-binding chimeric proteins and methods and uses thereof
EP3710486A1 (en) 2017-11-15 2020-09-23 Novo Nordisk A/S Factor x binders enhancing fx activation
WO2019101995A1 (en) 2017-11-27 2019-05-31 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for cardiac regeneration
PT3658192T (pt) 2017-12-01 2021-06-25 Abbvie Inc Agonista recetor de glucocorticóide e imunoconjugados do mesmo
KR20200104333A (ko) 2017-12-28 2020-09-03 난징 레전드 바이오테크 씨오., 엘티디. Tigit에 대한 단일-도메인 항체 및 이의 변이체
WO2019134946A1 (en) 2018-01-04 2019-07-11 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating melanoma resistant
EP3740507A4 (en) 2018-01-15 2022-08-24 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. SINGLE DOMAIN ANTIBODIES AND VARIANTS THEREOF AGAINST PD-1
US20210054064A1 (en) 2018-01-24 2021-02-25 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Antagonists of il-33 for use in methods for preventing ischemia reperfusion injusry in an organ
US20210221912A1 (en) 2018-02-06 2021-07-22 Ablynx N.V. Methods of treating initial episode of ttp with immunoglobulin single variable domains
JP7384811B2 (ja) 2018-02-16 2023-11-21 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル 白斑を処置するための方法及び組成物
JP2021514649A (ja) 2018-03-01 2021-06-17 ブレイエ・ユニバージテイト・ブリュッセルＶｒｉｊｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ Ｂｒｕｓｓｅｌ ヒトｐｄ−ｌ１結合免疫グロブリン
PL3768701T3 (pl) 2018-03-23 2024-02-19 Université Libre de Bruxelles Cząsteczki agonistów sygnalizacji WNT
CA3093034A1 (en) 2018-03-30 2019-10-03 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Single-domain antibodies against lag-3 and uses thereof
WO2019193375A1 (en) 2018-04-04 2019-10-10 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of fzd7 inhibitors for the treatment of retinal neovascularization
WO2019207030A1 (en) 2018-04-26 2019-10-31 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for predicting a response with an immune checkpoint inhibitor in a patient suffering from a lung cancer
CN112654397A (zh) 2018-09-05 2021-04-13 国家医疗保健研究所 用于治疗哮喘和过敏性疾病的方法和组合物
EP3849545A1 (en) 2018-09-10 2021-07-21 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Methods for the treatment of neurofibromatosis
EP3850008A1 (en) 2018-09-10 2021-07-21 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of an inhibitor of ntsr1 activation or expression for preventing weight loss, muscle loss, and protein blood level decrease in subjects in need thereof
WO2020058201A1 (en) 2018-09-17 2020-03-26 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of inhibitors of phosphatase activity of soluble epoxide for the treatment of cardiometabolic diseases
WO2020058372A1 (en) 2018-09-19 2020-03-26 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical composition for the treatment of cancers resistant to immune checkpoint therapy
WO2020064702A1 (en) 2018-09-25 2020-04-02 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of antagonists of th17 cytokines for the treatment of bronchial remodeling in patients suffering from allergic asthma
WO2020070062A1 (en) 2018-10-01 2020-04-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of tim-3 inhibitors for the treatment of exacerbations in patients suffering from severe asthma
JP2022512626A (ja) 2018-10-04 2022-02-07 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル 粘膜炎症性疾患の処置のための方法及び医薬組成物
EP3860653A1 (en) 2018-10-05 2021-08-11 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and systems for controlling the agonistic properties of antibody variable domains by light
EP3636657A1 (en) 2018-10-08 2020-04-15 Ablynx N.V. Chromatography-free antibody purification method
JP2022512648A (ja) 2018-10-09 2022-02-07 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル 心筋線維化の処置のためのαＶ－インテグリン（ＣＤ５１）阻害剤の使用
WO2020079162A1 (en) 2018-10-18 2020-04-23 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for inducing full ablation of hematopoiesis
GB201818460D0 (en) * 2018-11-13 2018-12-26 Crescendo Biologics Ltd Single domain antibodies that bind human serum albumin
WO2020104479A1 (en) 2018-11-20 2020-05-28 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating cancers and resistant cancers with anti transferrin receptor 1 antibodies
WO2020115261A1 (en) 2018-12-07 2020-06-11 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating melanoma
WO2020120592A1 (en) 2018-12-12 2020-06-18 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for predicting and treating melanoma
EP3894438A1 (en) 2018-12-13 2021-10-20 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) New anti tau svqivykpv epitope single domain antibody
WO2020127885A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Compositions for treating cancers and resistant cancers
CN113574386A (zh) 2019-01-03 2021-10-29 国家医疗保健研究所 用于增强癌症患者的cd8+t细胞依赖性免疫应答的方法和药物组合物
EP3921031A1 (en) 2019-02-04 2021-12-15 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Methods and compositions for modulating blood-brain barrier
WO2020169707A1 (en) 2019-02-21 2020-08-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Foxo1 inhibitor for use in the treatment of latent virus infection
EP3935391B1 (en) 2019-03-05 2024-04-24 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Biomarkers for renal cell carcinoma
JP2022524768A (ja) 2019-03-08 2022-05-10 リンクシス ベスローテン フェンノートシャップ 細胞増殖又は細胞分化に関与する受容体を標的にする内在化結合分子
EP3947446A1 (en) 2019-03-25 2022-02-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Treatment of taupathy disorders by targeting new tau species
EP3946330A1 (en) 2019-03-29 2022-02-09 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Methods for the treatment of keloid, hypertrophic scars and/or hyperpigmentation disorders
US20220177978A1 (en) 2019-04-02 2022-06-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods of predicting and preventing cancer in patients having premalignant lesions
US20220175815A1 (en) 2019-04-03 2022-06-09 Orega Biotech Combination therapies based on pd1 and il-17b inhibitors
WO2020221796A1 (en) 2019-04-30 2020-11-05 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating melanoma
US20220228116A1 (en) 2019-05-28 2022-07-21 Vib Vzw Cd8+ t-cells lacking plexins and their application in cancer treatment
EP3976650A1 (en) 2019-05-28 2022-04-06 Vib Vzw Cancer treatment by targeting plexins in the immune compartment
EP3986453A1 (en) 2019-06-20 2022-04-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Anti- protease nexin-1 conformational single domain antibodies and uses thereof
CN114401743A (zh) 2019-08-02 2022-04-26 法国国家健康和医学研究院 中和颗粒酶b用于向经历过心肌梗塞的受试者提供心脏保护
WO2021048292A1 (en) 2019-09-11 2021-03-18 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating melanoma
WO2021063968A1 (en) 2019-09-30 2021-04-08 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method and composition for diagnosing chronic obstructive pulmonary disease
WO2021064180A1 (en) 2019-10-03 2021-04-08 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for modulating macrophages polarization
US20220363776A1 (en) 2019-10-04 2022-11-17 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical composition for the treatment of ovarian cancer, breast cancer or pancreatic cancer
WO2021078359A1 (en) 2019-10-21 2021-04-29 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of inhibitors of cubilin for the treatment of chronic kidney diseases
JP2023500954A (ja) 2019-11-12 2023-01-11 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル 潜伏形態のトキソプラズマ症についての新たな血清マーカー
GB201918279D0 (en) 2019-12-12 2020-01-29 Vib Vzw Glycosylated single chain immunoglobulin domains
WO2021144426A1 (en) 2020-01-17 2021-07-22 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating melanoma
JP2023514957A (ja) 2020-02-28 2023-04-12 オレガ・バイオテック Ｃｔｌａ４阻害剤及びｉｌ－１７ｂ阻害剤に基づく複合療法
CN115915939A (zh) 2020-03-31 2023-04-04 生物催化公司 抗真菌多肽
WO2021198511A1 (en) 2020-04-03 2021-10-07 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treatment of sars-cov-2 infection
EP4144758A1 (en) 2020-04-22 2023-03-08 Mabwell (Shanghai) Bioscience Co., Ltd. Single variable domain antibody targeting human programmed death ligand 1 (pd-l1) and derivative thereof
WO2021224401A1 (en) 2020-05-07 2021-11-11 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for determining a reference range of β-galactose exposure platelet
CA3180683A1 (en) 2020-05-12 2021-11-18 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) New method to treat cutaneous t-cell lymphomas and tfh derived lymphomas
WO2021229104A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Université de Liège Anti-cd38 single-domain antibodies in disease monitoring and treatment
JP2023528293A (ja) 2020-05-20 2023-07-04 アンスティテュ・クリー 単一ドメイン抗体及びがん治療におけるその使用
JP2023526477A (ja) 2020-05-20 2023-06-21 アンスティテュ・クリー 合成単一ドメインライブラリー
JP2023527578A (ja) 2020-06-05 2023-06-29 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル 眼疾患を処置するための方法及び医薬組成物
CN115884986A (zh) 2020-06-29 2023-03-31 Inserm(法国国家健康医学研究院) 抗蛋白s单域抗体和包含其的多肽
WO2022008597A1 (en) 2020-07-08 2022-01-13 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical composition for the treatment of infectious diseases
WO2022023379A1 (en) 2020-07-28 2022-02-03 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for preventing and treating a cancer
WO2022029080A1 (en) 2020-08-03 2022-02-10 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Population of treg cells functionally committed to exert a regulatory activity and their use for adoptive therapy
JP2023541934A (ja) 2020-09-16 2023-10-04 リンクシス ベスローテン フェンノートシャップ 内在化結合分子
WO2022063957A1 (en) 2020-09-24 2022-03-31 Vib Vzw Biomarker for anti-tumor therapy
US20230364049A1 (en) 2020-09-24 2023-11-16 Vib Vzw Combination of p2y6 inhibitors and immune checkpoint inhibitors
WO2022064049A1 (en) 2020-09-28 2022-03-31 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method for diagnosing brucella infection
EP4229090A1 (en) 2020-10-16 2023-08-23 Université d'Aix-Marseille Anti-gpc4 single domain antibodies
WO2022084300A1 (en) 2020-10-20 2022-04-28 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for diagnosis and monitoring form of coronavirus infection
WO2022084531A1 (en) 2020-10-23 2022-04-28 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating glioma
WO2022096547A1 (en) 2020-11-05 2022-05-12 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of il-6 inhibitors for the treatment of acute chest syndrome in patients suffering from sickle cell disease
WO2022101481A1 (en) 2020-11-16 2022-05-19 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for predicting and treating uveal melanoma
CA3201219A1 (en) 2020-12-04 2022-06-09 Mir Ali Ionizable cationic lipids and lipid nanoparticles, and methods of synthesis and use thereof
TW202222840A (zh) 2020-12-11 2022-06-16 大陸商上海華奧泰生物藥業股份有限公司 Ｃｄ７３的抗原結合蛋白及其應用
EP4286409A1 (en) 2021-01-11 2023-12-06 Starmab Biologics (Suzhou) Co., Ltd Antigen-binding protein targeting staphylococcus aureus ?-hemolysis and application thereof
CN116568811A (zh) 2021-01-13 2023-08-08 上海华奥泰生物药业股份有限公司 结合cd73的蛋白及其应用
JP2024505428A (ja) 2021-01-14 2024-02-06 アンスティテュ キュリー Ｈｅｒ２単一ドメイン抗体バリアントおよびそのｃａｒ
WO2022156727A1 (zh) 2021-01-21 2022-07-28 浙江养生堂天然药物研究所有限公司 治疗肿瘤的组合物及方法
CN117241804A (zh) 2021-02-17 2023-12-15 非营利性组织佛兰芒综合大学生物技术研究所 在癌症治疗中slc4a4的抑制
EP4296282A1 (en) 2021-02-19 2023-12-27 SHAPERON Inc. Single domain antibody against cd47 and use thereof
CN117321076A (zh) 2021-02-19 2023-12-29 美国卫生及公众服务部代表 中和SARS-CoV-2的单结构域抗体
EP4296284A1 (en) 2021-02-19 2023-12-27 SHAPERON Inc. Bispecific single domain antibody to pd-l1 and cd47 and use thereof
AU2022222423A1 (en) 2021-02-19 2023-09-28 Seoul National University R&Db Foundation Single domain antibody against pd-l1 and use thereof
EP4308118A1 (en) 2021-03-17 2024-01-24 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Methods and compositions for treating melanoma
JP2024513746A (ja) 2021-03-22 2024-03-27 星濟生物（蘇州）有限公司 ニューモリシンを標的とした抗原結合たんぱく質およびその応用
WO2022200303A1 (en) 2021-03-23 2022-09-29 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for the diagnosis and treatment of t cell-lymphomas
EP4299593A1 (en) 2021-04-02 2024-01-03 Oricell Therapeutics Co., Ltd. Cldn18.2 antigen-binding protein and use thereof
EP4320153A1 (en) 2021-04-09 2024-02-14 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for the treatment of anaplastic large cell lymphoma
EP4326871A1 (en) 2021-04-19 2024-02-28 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of splice switching oligonucleotides for exon skipping-mediated knockdown of pim2
WO2022223791A1 (en) 2021-04-23 2022-10-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating cell senescence accumulation related disease
WO2022242892A1 (en) 2021-05-17 2022-11-24 Université de Liège Anti-cd38 single-domain antibodies in disease monitoring and treatment
WO2022269473A1 (en) 2021-06-23 2022-12-29 Janssen Biotech, Inc. Materials and methods for hinge regions in functional exogenous receptors
IL309559A (en) 2021-07-09 2024-02-01 Luxembourg Inst Of Health Lih Dimeric protein complexes and their uses
WO2023285362A1 (en) 2021-07-12 2023-01-19 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of il-36 inhibitors for the treatment of netherton syndrome
WO2023006975A2 (en) 2021-07-30 2023-02-02 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Chimeric proteins and methods of immunotherapy
WO2023057601A1 (en) 2021-10-06 2023-04-13 Biotalys NV Anti-fungal polypeptides
WO2023078900A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating triple negative breast cancer (tnbc)
WO2023110937A1 (en) 2021-12-14 2023-06-22 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Depletion of nk cells for the treatment of adverse post-ischemic cardiac remodeling
WO2023118165A1 (en) 2021-12-21 2023-06-29 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating melanoma
EP4209508A1 (en) 2022-01-11 2023-07-12 Centre national de la recherche scientifique Nanobodies for the deneddylating enzyme nedp1
WO2023144235A1 (en) 2022-01-27 2023-08-03 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for monitoring and treating warburg effect in patients with pi3k-related disorders
WO2023144303A1 (en) 2022-01-31 2023-08-03 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Cd38 as a biomarker and biotarget in t-cell lymphomas
EP4231017A1 (en) 2022-02-17 2023-08-23 Promise Proteomics Detection and quantification of anti-drug antibodies and anti-self antibodies
EP4257609A1 (en) 2022-04-08 2023-10-11 iOmx Therapeutics AG Combination therapies based on pd-1 inhibitors and sik3 inhibitors
WO2023198648A1 (en) 2022-04-11 2023-10-19 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for the diagnosis and treatment of t-cell malignancies
WO2023198851A1 (en) 2022-04-14 2023-10-19 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for controlling the tumor cell killing by light
WO2023198874A1 (en) 2022-04-15 2023-10-19 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for the diagnosis and treatment of t cell-lymphomas
WO2023217904A1 (en) 2022-05-10 2023-11-16 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Syncitin-1 fusion proteins and uses thereof for cargo delivery into target cells
WO2023240156A1 (en) 2022-06-08 2023-12-14 Tidal Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipids and lipid nanoparticles, and methods of synthesis and use thereof
WO2023237661A1 (en) 2022-06-09 2023-12-14 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Use of endothelin receptor type b agonists for the treatment of aortic valve stenosis
WO2024003310A1 (en) 2022-06-30 2024-01-04 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for the diagnosis and treatment of acute lymphoblastic leukemia
EP4299124A1 (en) 2022-06-30 2024-01-03 Universite De Montpellier Anti-mglur2 nanobodies for use as biomolecule transporter
WO2024008755A1 (en) 2022-07-04 2024-01-11 Vib Vzw Blood-cerebrospinal fluid barrier crossing antibodies
WO2024008274A1 (en) 2022-07-04 2024-01-11 Universiteit Antwerpen T regulatory cell modification
WO2024008799A1 (en) 2022-07-06 2024-01-11 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for the treatment of proliferative glomerulonephritis
WO2024013234A1 (en) 2022-07-13 2024-01-18 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for diagnosis, prognosis, stratification and treating of myocarditis
WO2024018003A1 (en) 2022-07-21 2024-01-25 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Extracellular vesicles functionalized with an erv syncitin and uses thereof for cargo delivery
WO2024018046A1 (en) 2022-07-22 2024-01-25 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Garp as a biomarker and biotarget in t-cell malignancies
WO2024018426A1 (en) 2022-07-22 2024-01-25 Janssen Biotech, Inc. Enhanced transfer of genetic instructions to effector immune cells
WO2024023283A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Lrrc33 as a biomarker and biotarget in cutaneous t-cell lymphomas
WO2024028433A1 (en) 2022-08-04 2024-02-08 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for the treatment of lymphoproliferative disorders
WO2024033400A1 (en) 2022-08-10 2024-02-15 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Sk2 inhibitor for the treatment of pancreatic cancer
WO2024033399A1 (en) 2022-08-10 2024-02-15 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Sigmar1 ligand for the treatment of pancreatic cancer
WO2024038112A1 (en) 2022-08-17 2024-02-22 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Improved anti-albumin nanobodies and their uses
WO2024047110A1 (en) 2022-08-31 2024-03-07 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Method to generate more efficient car-t cells
WO2024074713A1 (en) 2022-10-07 2024-04-11 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Method to generate improving car-t cells

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5712374A (en) * 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates

Family Cites Families (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US539037A (en) * 1895-05-14 Magazine fieeaem
US5700466A (en) * 1981-09-08 1997-12-23 The Rockefeller University Method of ameliorating or preventing septic shock using a monoclonal antibody specific to cachectin/tumor necrosis factor
US5672347A (en) * 1984-07-05 1997-09-30 Genentech, Inc. Tumor necrosis factor antagonists and their use
US4677063A (en) * 1985-05-02 1987-06-30 Cetus Corporation Human tumor necrosis factor
IL73883A (en) * 1984-12-20 1990-12-23 Yeda Res & Dev Monoclonal antibodies against tnf-alpha,hybridomas producing them and method for the purification of tnf-alpha
US5183657A (en) * 1988-03-11 1993-02-02 Celltech Limited Antibodies for use in antilymphocyte antibody therapy
US5360716A (en) * 1988-10-24 1994-11-01 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Human tumor necrosis factor αspecific monoclonal antibody and method for detecting human tumor necrosis factor α
EP0368684B2 (en) * 1988-11-11 2004-09-29 Medical Research Council Cloning immunoglobulin variable domain sequences.
US5223395A (en) * 1988-12-01 1993-06-29 Centocor, Inc. Immunometric assays for tumor necrosis factor-alpha and methods for preventing the loss of biological activity of tumor necrosis factor-alpha in biological samples
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5116964A (en) * 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US6232446B1 (en) * 1989-05-18 2001-05-15 Yeda Research And Development Co. Ltd. TNF ligands
US6262239B1 (en) * 1989-05-18 2001-07-17 Yeda Research And Development Co., Ltd. TNF receptor-specific antibodies
US5959087A (en) * 1989-08-07 1999-09-28 Peptide Technology, Ltd. Tumour necrosis factor binding ligands
US6448380B2 (en) * 1989-08-07 2002-09-10 Peptech Limited Tumor necrosis factor antibodies
US5644034A (en) * 1989-08-07 1997-07-01 Peptide Technology Ltd. Tumour necrosis factor binding ligands
US6315999B1 (en) * 1989-08-10 2001-11-13 Solvay, S.A. Pharmaceutical product for the treatment of sepsis
DE69033457T2 (de) * 1989-08-16 2000-09-14 Chiron Corp Prohormonspaltungsplatzblockierungsantikörper
NZ235148A (en) * 1989-09-05 1991-12-23 Immunex Corp Tumour necrosis factor receptor protein and dna sequences
EP0939121B2 (de) * 1989-09-12 2007-12-26 AHP Manufacturing B.V. TFN-bindende Proteine
US20040010810A1 (en) * 1990-01-12 2004-01-15 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US7253264B1 (en) * 1990-06-28 2007-08-07 Sanofi-Arentideutschland GmbH Immunoglobulin fusion proteins, their production and use
US6916605B1 (en) * 1990-07-10 2005-07-12 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
US5843440A (en) * 1990-10-03 1998-12-01 Redcell Canada, Inc. Cellular and serum protein anchors for modulating pharmacokinetics
GB9109645D0 (en) * 1991-05-03 1991-06-26 Celltech Ltd Recombinant antibodies
US6277969B1 (en) * 1991-03-18 2001-08-21 New York University Anti-TNF antibodies and peptides of human tumor necrosis factor
US6284471B1 (en) * 1991-03-18 2001-09-04 New York University Medical Center Anti-TNFa antibodies and assays employing anti-TNFa antibodies
US5582998A (en) * 1991-06-19 1996-12-10 Boehringer Ingelheim International Gmbh Monoclonal antibodies against human TNF-binding protein I (TNF-BP I) and immunoassays therefor
GB9225448D0 (en) * 1992-12-04 1993-01-27 Erba Carlo Spa Improved synthesis of polymer bioactive conjugates
US5888511A (en) * 1993-02-26 1999-03-30 Advanced Biotherapy Concepts, Inc. Treatment of autoimmune diseases, including AIDS
ATE204299T1 (de) * 1993-03-05 2001-09-15 Bayer Ag Humane monoklonale anti-tnf alpha antikörper
CA2139385C (en) * 1994-02-04 2001-12-25 Gottfried Alber Products containing g-csf and tnf binding protein
US6579697B1 (en) * 1995-05-11 2003-06-17 Yeda Research And Development Co. Ltd. Modulator of TNF/NGF superfamily receptors and soluble oligomeric TNF/NGF superfamily receptors
DE4446471C2 (de) * 1994-12-23 1997-05-22 Fraunhofer Ges Forschung Verfahren zur Montage eines Chips auf einem flexiblen Schaltungsträger
US5747532A (en) * 1995-11-21 1998-05-05 Medinox, Inc. Combinational therapeutic methods employing nitric oxide scavengers and compositions useful therefor
US6090382A (en) * 1996-02-09 2000-07-18 Basf Aktiengesellschaft Human antibodies that bind human TNFα
US5942385A (en) * 1996-03-21 1999-08-24 Sugen, Inc. Method for molecular diagnosis of tumor angiogenesis and metastasis
US20030207346A1 (en) * 1997-05-02 2003-11-06 William R. Arathoon Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US6172213B1 (en) * 1997-07-02 2001-01-09 Genentech, Inc. Anti-IgE antibodies and method of improving polypeptides
US6670453B2 (en) * 1997-10-27 2003-12-30 Unilever Patent Holdings B.V. Multivalent antigen-binding proteins
US6136599A (en) * 1998-12-10 2000-10-24 Bayer Corporation Human hybrid host cell for mammalian gene expression
EP1022027A1 (en) * 1999-01-22 2000-07-26 Applied Research Systems ARS Holding N.V. Tumor necrosis factor antagonists and their use in endometriosis
US6897044B1 (en) * 1999-01-28 2005-05-24 Biogen Idec, Inc. Production of tetravalent antibodies
US6379666B1 (en) * 1999-02-24 2002-04-30 Edward L. Tobinick TNF inhibitors for the treatment of neurological, retinal and muscular disorders
KR100816572B1 (ko) * 1999-04-28 2008-03-24 보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 항-ｖｅｇｆ 항체 및 이를 포함하는 약제학적 조성물
DE60031419T2 (de) * 1999-08-25 2007-09-27 Immunex Corp., Thousand Oaks Zusammensetzungen und verfahren für verbesserte zellkultur
JP2004511430A (ja) * 2000-05-24 2004-04-15 イムクローン　システムズ　インコーポレイティド 二重特異性免疫グロブリン様抗原結合蛋白および製造方法
GB0013810D0 (en) * 2000-06-06 2000-07-26 Celltech Chiroscience Ltd Biological products
EP1361891A2 (en) * 2001-02-19 2003-11-19 MERCK PATENT GmbH Artificial fusion proteins with reduced immunogenicity
WO2004003019A2 (en) * 2002-06-28 2004-01-08 Domantis Limited Immunoglobin single variant antigen-binding domains and dual-specific constructs
WO2004058821A2 (en) * 2002-12-27 2004-07-15 Domantis Limited Dual specific single domain antibodies specific for a ligand and for the receptor of the ligand
US20030226155A1 (en) * 2001-08-30 2003-12-04 Biorexis Pharmaceutical Corporation Modified transferrin-antibody fusion proteins
US6818613B2 (en) * 2001-11-07 2004-11-16 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Aqueous sustained-release formulations of proteins
EP1585477A4 (en) * 2001-11-30 2007-06-27 Centocor Inc ANTI-TNF ANTIBODIES, COMPOSITIONS, METHODS AND USES
US20040082533A1 (en) * 2002-08-09 2004-04-29 Kim Jong-Mook Electro-gene therapy of arthritis by using an expression plasmid encoding the soluble p75 tumor necrosis factor receptor-Fc fusion protein
JP2006520584A (ja) * 2002-11-08 2006-09-14 アブリンクス エン．ヴェー． 安定化単一ドメイン抗体
PT1639011E (pt) * 2003-06-30 2009-01-20 Domantis Ltd Anticorpos (dab) de domínio único peguilados
WO2005044853A2 (en) * 2003-11-01 2005-05-19 Genentech, Inc. Anti-vegf antibodies

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5712374A (en) * 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates

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