KR20070084069A - Ｔｎｆｒ1에 대한 단일 도메인 항체 및 이의 사용 방법 - Google Patents

Ｔｎｆｒ1에 대한 단일 도메인 항체 및 이의 사용 방법 Download PDF

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스티브 홀메스
이안 엠. 톰린슨
제니퍼 리
카롤린 에네버
암리크 바스란
케이트 존스
루드 데 윌트
스태니슬라스 찰스 블레인
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Abstract

본 발명은 종양 괴사 인자 수용체 1을 투여하는 것을 포함하여 염증 질병 (예를들어, 만성 염증 질병)을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 종양 괴사 인자 수용체 1에 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인 (도메인 항체, dAb) 단량체를 함유하는 리간드, 및 이러한 리간드를 이용하는 방법을 제공한다. 또한, 상기 리간드를 엔코딩하는 핵산, 재조합 숙주세포 및 상기 리간드를 제조하기 위한 방법이 제공된다.

Description

ＴＮＦＲ1에 대한 단일 도메인 항체 및 이의 사용 방법 {SINGLE DOMAIN ANTIBODIES AGAINST TNFR1 AND METHODS OF USE THEREFOR}
발명의 배경
항체의 항원 결합 도메인은 2개의 별개의 영역인 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL: 이는 Vκ 또는 Vλ일 수 있음)을 포함한다. 항원 결합 부위 자체는 VH 도메인으로부터의 3개 (H1, H2 및 H3) 및 VL 도메인으로부터의 3개 (L1, L2 및 L3)의 6개의 폴리펩티드 루프로 형성된다. VH 및 VL 도메인을 엔코딩하는 V 유전자의 다양한 주요 레퍼토리가 유전자 분절의 조합적 재배열에 의해 생성된다. VH 유전자는 3개의 유전자 분절인 VH, D 및 JH의 조합에 의해 생성된다. 인간에서는 일배체형에 따른 약 51개의 기능적 VH 분절 (Cook and Tomlinson (1995) Immunol Today, 16: 237), 25개의 기능적 D 분절 (Corbett et al (1997) J. Mol. Biol, 268: 69) 및 6개의 기능적 JH 분절 (Ravetch et al. (1981) Cell, 27: 583)이 존재한다. VH 분절은 VH 도메인의 제 1 및 제 2 항원 결합 루프 (H1 및 H2)를 형성하는 폴리펩티드 사슬의 영역을 엔코딩하고, VH, D 및 JH 분절이 조합되어 VH 도메인의 제 3 항원 결합 루프 (H3)를 형성한다. VL 유전자는 단지 두개의 유전자 분절인 VL 및 JL의 재조합에 의해 생성된다. 인간에서는 일배체형에 따른 약 40개의 기능적 Vκ 분절 (Schaeble and Zachau (1993) Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 374: 1001), 31개의 기능적 Vλ 분절 (Williams et al. (1996) J. Mol. Biol., 264: 220; Kawasaki et al. (1997) Genome Res., 7: 250), 5개의 기능적 JK 분절 (Hieter et al. (1982) J. Biol. Chem., 257: 1516) 및 4개의 기능적 Jλ 분절 (Vasicek and Leder (1990) J. Exp. Med., 172: 609)이 존재한다. VL 분절은 VL 도메인의 제 1 및 제 2 항원 결합 루프 (L1 및 L2)를 형성하는 폴리펩티드 사슬의 영역을 엔코딩하고, VL 및 JL 분절은 조합되어 VL 도메인의 제 3 항원 결합 루프 (L3)를 형성한다. 이러한 주요 레퍼토리로부터 선택된 항체는 최소한 적당한 친화성으로 거의 모든 항원에 결합할 만큼 충분히 다양한 것으로 생각된다. 고 친화성 항체는 점 돌연변이가 생성되고, 개선된 결합을 기초로 하는 면역계에 의해 선택되는 재배열된 유전자의 "친화성 성숙"에 의해 생성된다.
항체의 구조 및 서열의 분석은 6개의 항원 결합 루프중 5개 (H1, H2, L1, L2, L3)가 제한된 수의 주쇄 형태 또는 정준 구조를 지니는 것을 나타내었다 (Chothia and Lesk (1987) J. MoI. Biol., 196: 901; Chothia et al. (1989) Nature, 342: 877). 주쇄 형태는 (i) 항원 결합 루프의 길이, 및 (ii) 항원 결합 루프 및 항체 프레임워크 내의 특정 중요 위치에서의 특정 잔기, 또는 잔기의 유형에 의해 결정된다. 루프 길이 및 중요 잔기의 분석은 대다수의 인간 항체 서열에 의해 엔코딩된 H1, H2, L1, L2 및 L3의 주쇄 형태를 예측가능하게 한다 (Chothia et al (1992) J. Mol Biol, 227: 799; Tomlinson et al. (1995) EMBO J., 14: 4628; Williams et al (1996) J. Mol Biol., 264: 220). H3 영역이 서열, 길이 및 구조에 대해서 보다 더욱 다양하지만 (D 분절의 사용에 기인함), 이는 또한 루프 및 항체 프레임워크 내의 중요 위치에서의 특정 잔기의 길이 및 존재, 또는 잔기 유형에 따른 짧은 루프 길이에 대해 제한된 수의 주쇄 형태를 형성한다 (Martin et al. (1996) J. Mol Biol., 263: 800; Shirai et al. (1996) FEBS Letters, 399: 1).
VH 및 VL 영역의 상보적인 쌍을 포함하는 이중특이적 항체가 당 분야에 공지되어 있다. 이러한 이중특이적 항체는 VH 및 VL의 2개의 쌍을 포함해야 하고, 각각의 VH/VL 쌍은 단일 항원 또는 에피토프에 결합한다. 기술된 방법은 하이브리드 하이브리도마 (Milstein & Cuello AC, Nature 305:537-40), 미니바디(minibody) (Hu et al., (1996) Cancer Res 56:3055-3061;), 디아바디(diabody) (Holliger et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448; WO 94/13804), 킬레이트 재조합 항체 (CRAbs; (Neri et al., (1995) J. MoI. Biol. 246, 367-373), biscFv (e.g. Atwell et al., (1996) Mol. Immunol. 33, 1301-1312), "놉 인 홀(knobs in holes)" 안정화 항체 (Carter et al., (1997) Protein Sci. 6, 781-788)를 포함한다. 각각의 경우에서, 각각의 항체종은 2개의 항원 결합 부위를 포함하고, 이들 각각은 VH 및 VL 도메인의 상보적 쌍에 의해 형성된다. 따라서, 각각의 항체는 동시에 두개의 상이한 항원 또는 에피토프에 결합할 수 있고, VH 및 이의 상보적 VL 도메인에 의해 매개된 EACH 항원 또는 에피토프에 결합할 수 있다. 이러한 기술 각각은 각각의 특정 장점을 나타낸다; 예를들어 하이브리드 하이브리도마의 경우에 비활성 VH/VL 쌍은 이중특이적 IgG의 분획을 크게 감소시킬 수 있다. 또한, 대부분의 이중특이적 방법은 2개의 상이한 VH/VL 결합 부위를 개조시키기 위해 상이한 VH/VL 쌍의 회합 또는 VH 및 VL 사슬의 회합에 의존한다. 따라서, 어셈블리된 분자에서 각각의 항원 또는 에피토프에 대한 결합 부위의 비를 조절하는 것은 불가능하고, 따라서 다수의 어셈블리된 분자는 하나의 항원 또는 에피토프에 결합하지만 다른 것에는 결합하지 않을 것이다. 몇몇 경우에, 둘 모두의 항원 또는 에피토프에 대한 결합 부위를 지니는 분자의 수를 개선시키기 위한 서브-유닛 인터페이스에서의 중쇄 또는 경쇄를 고안하는 것 (Carter et al., 1997)이 가능하지만, 이는 모든 분자가 둘 모두의 항원 또는 에피토프에 결합하도록 하지는 않는다.
2개의 상이한 항체 결합 특이성이 동일한 결합 부위로 포함될 수 있으나, 이는 일반적으로 광범위하게 교차-반응성인 구조적으로 관련된 항원 또는 에피토프 또는 항체에 해당하는 2개 이상의 특이성임을 나타내는 몇몇 증거가 존재한다. 예를들어, 교차-반응성 항체는, 예를들어 계란 흰자 라이소자임 및 칠면조 라이소자임 (McCafferty et al., WO 92/01047)과 같이 보통 2개의 항원이 서열 및 구조에서 관련되는 경우, 또는 자유 합텐 및 담체에 컨쥬게이션된 합텐 (Griffiths AD et al. EMBO J 1994 13:14 3245-60)에 대해 기술되어 있다. 추가예로, WO 02/02773 (Abbott Laboratories)에는 "이중 특이성"을 지니는 항체 분자가 기술되어 있다. 언급된 항체 분자는 다중 항원에 대해 발생하거나 선택된 항체로, 이들의 특이성은 단일 항원보다 더욱 확대되어 있다. WO 02/02773의 항원의 각각의 상보적 VH/VL 쌍은 2개 이상의 구조적으로 관련된 항원에 대한 단일 결합 특이성을 지정하고; 이러한 상보적 쌍의 VH 및 VL 도메인은 각각이 별개의 특이성을 지니지 않는다. 따라서, 항체는 구조적으로 관련된 2개의 항원을 포함하는 광범위한 단일 특이성을 지닌다. 또한, 천연 자가항체는 구조적으로 관련되지 않은 2개 이상 (보통 이 이상)의 상이한 항원 또는 에피토프와 반응하는 다중반응성인 것으로 기술되어 있다 (Casali & Notkins, Ann. Rev. Immunol. 7, 515-531). 이는 또한 모노클로날 항체에 대한 파지 전시 기술을 이용하는 무작위 펩티드 레포토리의 선택이 항원 결합 부위에 적합한 다양한 펩티드 서열을 확인하는 것을 나타낸다. 서열의 일부는 공통 서열에 어울리는 매우 관련된 서열인 반면, 나머지는 매우 상이하며 이는 미모토프 (mimotope)로 언급된다 (Lane & Stephen, Current Opinion in Immunology, 1993, 5, 268-271). 따라서, 회합되고 상보적인 VH 및 VL 도메인을 포함하는 천연의 4개 사슬 항체가 매우 다량의 공지된 항원으로부터의 다수의 상이한 항원에 잠재적으로 결합할 수 있는 것이 명백하다. 동일한 항체에서 두개의 주어진 항원, 특히 반드시 구조적으로 관련되지 않는 항원에 대해 결합 부위를 생성시키는 방법은 덜 명백하다.
상기 사실을 포함할 수 있는 단백질 고안 방법이 제안되어 왔다. 예를들어, 촉매 항체가 하나의 가변 도메인을 통한 금속 이온, 및 이러한 금속 이온 및 상보성 가변 도메인과의 접촉을 통한 합텐 (기질)에 대해 결합 활성을 지니도록 생성될 수 있는 것이 제안되어 왔다 (Barbas et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci USA 90, 6385-6389). 그러나, 이 경우, 기질 (제 1 항원)의 결합 및 촉매 반응이 금속 이온 (제 2 항원)의 결합을 필요로 하는 것을 제안된다. 따라서, VH/VL 쌍에 대한 결합은 단일하지만 다중 성분인 항체에 관한 것이다.
하나의 항원에 대한 결합 접촉이 하나의 가변 도메인에서 생성되고, 제 2의 항원에 대한 결합 접촉이 제 2의 가변 도메인에서 생성되는, 낙타 항체 중쇄 단일 도메인으로부터의 이중특이적 항체의 생성을 위한 방법이 기술되어 있다. 그러나, 가변 도메인은 상보성이 아니었다. 따라서, 제 1 중쇄 가변 도메인은 제 1 항원에 대해 선택되고, 제 2 중쇄 가변 도메인은 제 2 항원에 대해 선택된 후, 둘 모두의 도메인은 동일한 사슬에 함께 연결되어 이중특이적 항체 단편이 생성된다 (Conrath et al., J. Biol. Chem. 270, 27589-27594). 그러나, 낙타 중쇄 단일 도메인은 이들이 경쇄를 지니지 않는 천연 낙타 항체로부터 유래되고, 또한 중쇄 단일 도메인이 낙타 경쇄와 회합되어 상보적 VH 및 VL 쌍을 형성할 수 없으므로 일반적이지 않다.
일반적으로 경쇄와 회합되는 천연 항체로부터 유래된 단일 중쇄 가변 도메인이 또한 기재되어 있다 (모노클로날 항체 또는 도메인의 레퍼토리로부터 유래됨; 참조 EP-A-0368684). 이들 중쇄 가변 도메인은 특이적으로 하나 이상의 관련 항체와 상호작용하지만, 기타 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인과 조합되어 2개 이상의 상이한 항원에 대한 특이성을 지니는 리간들를 생성시키지 않는 것으로 나타났다. 또한, 이들 단일 도메인은 매우 짧은 생체내 반감기를 지니는 것으로 나타났다. 따라서, 이러한 도메인은 체한된 치료 가치를 지닌다.
상이한 특이성의 중쇄 가변 도메인을 함께 (상기 기술된 바와 같이) 연결함으로써 이중특이성 항체 단편을 제조하는 것이 제안되었다. 이러한 방법이 지니는 불이익은 분리된 항체 가변 도메인이 일반적으로 경쇄와 상호작용하는 소수성 인터페이스를 지녀, 용매에 노출되어 "점착성"이 되어 단일 도메인이 소수성 표면에 결합 할 수 있다는 점이다. 또한, 파트너 경쇄의 부재하에서, 소수성 인터페이스를 통해 가능할 수 있는 2개 이상의 상이한 중쇄 가변 도메인 및 이들의 회합의 조합물이 이들을 둘 모두의 리간드가 아닌 하나에 대한 결합으로부터 방해하여 분리된 상태로 결합할 수 있다. 또한, 이러한 경우, 중쇄 가변 도메인은 상보적 경쇄 가변 도메인과 회합되지 않아서, 덜 안정적이 되어 용이하게 언폴딩될 수 있다 (Worn & Pluckthun, 1998 Biochemistry 37, 13120-7).
발명의 개요
본 발명은 종양 괴사 인자 1 (TNFR1, p55, CD120a, P60, TNF 수용체 상과 일원1A, TNFRSF1A)의 길항제 및 이러한 길항제를 이용하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 길항제는 만성 염증 질병을 치료하거나, 억제하거나, 예방하는데 효과적이고, 종양 괴사 인자 2 (TNFR2, P75, P80, CD120b, TNF 수용체 상과 일원 1B, TNFRSF1B)를 실질적으로 길항시키지 않는다. 몇몇 구체예에서, 길항제는 1가이다.
기타 구체예에서, 길항제는 TNFR1에 대해 결합 특이성을 지니는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예를들어 1가 항원 결합 단편 (예를들어, scFv, Fab, Fab', dAb)이다.
기타 바람직한 길항제는 TNFR1에 결합하는 본원에 기술된 리간드이다. 리간드는 TNFR1에 대한 결합 특이성을 지니는 적합한 포맷의 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 도메인 항체 (dAb), 또는 상기 dAb의 상보성 결정 영역을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 리간드는 TNFR1에 대한 결합 특이성을 지니는 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 dAb를 필수 성분으로 포함하거나 이로 구성된 dAb 단량체이다. 기타 구체예에서, 리간드는 적합한 포맷, 예를들어 항체 포맷의 dAb (또는 dAb의 CDR)을 포함하는 폴리펩티드이다.
특정 구체예에서, 리간드는 TNFR1에 결합하는 제 1 dAb 및 제 1 dAb와 상이한 결합 특이성을 지니는 제 2 dAb를 포함하는 이중특이적 리간드이다. 한 예에서, 이중특이성 리간드는 TNFR1의 제 1 에피토프에 결합하는 제 1 dAb 및 상이한 표적의 에피토프에 결합하는 제 2 dAb를 포함한다. 또 다른 예에서, 제 2 dAb는 혈청 알부민의 에피토프에 결합한다.
기타 구체예에서, 리간드는 TNFR1에 대해 결합 특이성을 지니는 제 1 에피토프 결합 도메인 및 제 1 에피토프 결합 도메인과 상이한 결합 특이성을 지니는 하나 이상의 기타 에피토프 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 리간드이다. 예를들어, 제 1 에피토프 결합 도메인은 TNFR1에 결합하는 dAb일 수 있거나, TNFR1에 결합하는 dAb의 CDR (예를들어, CDR은 적합한 단백질 스캐폴드 (scaffold) 또는 골격, 예를들어 어피바디(affibody), SpA 스캐폴드, LDL 수용체 부류 A 도메인 또는 EGF 도메인으로 이식됨)을 포함하는 도메인일 수 있거나, 애피바디, SpA 도메인, LDL 수용체 부류 A 도메인 또는 EGF 도메인으로부터 선택된 TNFR1에 결합하는 도메인 일 수 있다.
특정 구체예에서, 리간드 또는 dAb 단량체는 하기중 하나 이상을 특징으로 한다: 1) 50 nM 내지 20 pM의 해리 상수(Kd), 및 5x10-1 내지 1x10-7 s-1의 Koff 속도 상수로 인간 TNFR1으로부터 해리됨; 2) 500 nM 내지 50 pM의 IC50으로 TNFR1에 대한 종양 괴사 인자 알파 (TNFα)의 결합을 억제함; 3) 표준 L929 세포 분석에서 500 nM 내지 50 pM의 ND50으로 인간 TNFR1을 중화시킴; 4) 표준 세포 분석에서 ≤100 nM의 ND50으로 TNFR1의 활성을 길항시키고, 세포 분석에서 ≤10μM의 농도에서 dAb가 ≤5%로 TNFR1의 활성을 효능화시킴; 5) 마우스의 LPS/D-갈락토사민에 의해 유발된 패혈 쇼크 모델에서 치사성을 억제함; 6) 응집에 내성임; 7) 대장균 (E. coli) 또는 피키아 (Pichia) 종(예를들어, P. 파스토리스)에서 발현시 약 0.5 mg/L 이상의 양으로 분비됨; 8) 가역적으로 언폴딩됨; 9) 마우스의 콜라겐에 의해 유발된 관절염 모델, 마우스의 관절염의 ΔARE 모델, 마우스의 ΔARE 모델의 염증성 장질병, 마우스의 덱스트란 설페이트 나트륨에 의해 유발된 모델의 염증성 장질병, 마우스의 담배 연기 모델의 만성 폐쇄폐병, 및 적합한 영장류 모델 (예를들어, 영장류의 콜라겐에 의해 유발된 관절염 모델)로 구성된 군으로부터 선택된 만성 염증 질병 모델에 효과적임; 및/또는 10) 만성 염증 질병의 치료, 억제 또는 예방에 효과적임.
특정 구체예에서, 리간드 또는 dAb 단량체는 50 nM 내지 20 pM의 해리 상수 (Kd), 및 5x10-1 내지 1x 10-7 s-1의 Koff 속도 상수로 인간 TNFR1으로부터 해리되고; 500 nM 내지 50 pM의 IC50으로 TNFR1에 대한 종양 괴사 인자 알파(TNFα)의 결합을 억제하고; 표준 L929 세포 분석에서 500 nM 내지 50 pM의 ND50으로 인간 TNFR1을 중화시킨다. 다른 특정 구체예에서, 리간드 또는 dAb 단량체는 50 nM 내지 20 pM의 해리 상수 (Kd), 및 5x10-1 내지 1x 10-7 s-1의 Koff 속도 상수로 인간 TNFR1으로부터 해리되고; 500 nM 내지 50 pM의 IC50으로 TNFR1에 대한 종양 괴사 인자 알파(TNFα)의 결합을 억제하고; 마우스의 콜라겐에 의해 유발된 관절염 모델, 마우스의 ΔARE 모델의 관절염, 마우스의 ΔARE 모델의 염증성 장질병, 마우스의 덱스트란 설페이트 나트륨에 의해 유발된 모델의 염증성 장질병, 마우스의 담배 연기 모델의 만성 폐쇄폐병, 및 적합한 영장류 모델 (예를들어, 영장류의 콜라겐에 의해 유발된 관절염 모델)로 구성된 군으로부터 선택된 만성 염증 질병 모델에 효과적이다. 다른 특정 구체예에서, 리간드 또는 dAb 단량체는 50 nM 내지 20 pM의 해리 상수(Kd), 및 5x10-1 내지 1x1O-7 s-1의 Koff 속도 상수로 인간 TNFR1으로부터 해리되고; 표준 L929 세포 분석에서 500 nM 내지 50 pM의 ND50으로 인간 TNFR1을 중화시키고; 표준 세포 분석에서 ≤100 nM의 ND50으로 TNFR1의 활성을 길항시키고, 표준 세포 분석에서 ≤10μM의 농도에서 dAb는 ≤5%로 TNFR1의 활성을 효능화시킨다.
더욱 특정한 구체예에서, 리간드 또는 dAb 단량체는 TAR2h-12 (SEQ ID NO:32), TAR2h-13 (SEQ ID NO:33), TAR2h-14 (SEQ ID NO:34), TAR2h-16 (SEQ ID NO:35), TAR2h-17 (SEQ ID NO:36), TAR2h-18 (SEQ ID NO:37), TAR2h-19 (SEQ ID NO:38), TAR2h-20 (SEQ ID NO:39), TAR2h-21 (SEQ ID NO:40), TAR2h-22 (SEQ ID NO:41), TAR2h-23 (SEQ ID NO:42), TAR2h-24 (SEQ ID NO:43), TAR2h-25 (SEQ ID NO:44), TAR2h-26 (SEQ ID NO:45), TAR2h-27 (SEQ ID NO:46), TAR2h-29 (SEQ ID NO:47), TAR2h-30 (SEQ ID NO:48), TAR2h-32 (SEQ ID NO:49), TAR2h-33 (SEQ ID NO:50), TAR2h-10-1 (SEQ ID NO:51), TAR2h-10-2 (SEQ ID NO:52), TAR2h-10-3 (SEQ ID NO:53), TAR2h-10-4 (SEQ ID NO:54), TAR2h-10-5 (SEQ ID NO:55), TAR2h-10-6 (SEQ ID NO:56), TAR2h-10-7 (SEQ ID NO:57), TAR2h-10-8 (SEQ ID NO:58), TAR2h-10-9 (SEQ ID NO:59), TAR2h-10-10 (SEQ ID NO:60), TAR2h-10-11 (SEQ ID NO:61), TAR2h-10-12 (SEQ ID NO:62), TAR2h-10-13 (SEQ ID NO:63), TAR2h-10-14 (SEQ ID NO:64), TAR2h-10-15 (SEQ ID NO:65), TAR2h-10-16 (SEQ ID NO:66), TAR2h-10-17 (SEQ ID NO:67), TAR2h-10-18 (SEQ ID NO:68), TAR2h-10-19 (SEQ ID NO:69), TAR2h-10-20 (SEQ ID NO:70), TAR2h-10-21 (SEQ ID NO:71), TAR2h-10-22 (SEQ ID NO:72), TAR2h-10-27 (SEQ ID NO:73), TAR2h-10-29 (SEQ ID NO:74), TAR2h-10-31 (SEQ ID NO:75), TAR2h-10-35 (SEQ ID NO:76), TAR2h-10-36 (SEQ ID NO:77), TAR2h-10-37 (SEQ ID NO:78), TAR2h-10-38 (SEQ ID NO:79), TAR2h-10-45 (SEQ ID NO:80), TAR2h-10-47 (SEQ ID NO:81), TAR2h-10-48 (SEQ ID NO:82), TAR2h-10-57 (SEQ ID NO:83), TAR2h-10-56 (SEQ ID NO:84), TAR2h-10-58 (SEQ ID NO:85), TAR2h-10-66 (SEQ ID NO:86), TAR2h-10-64 (SEQ ID NO:87), TAR2h-10-65 (SEQ ID NO:88), TAR2h-10-68 (SEQ ID NO:89), TAR2h-10-69 (SEQ ID NO:90), TAR2h-10-67 (SEQ ID NO:91), TAR2h-10-61 (SEQ ID NO:92), TAR2h-10-62 (SEQ ID NO:93), TAR2h-10-63 (SEQ ID NO:94), TAR2h-10-60 (SEQ ID NO:95), TAR2h-10-55 (SEQ ID NO:96), TAR2h-10-59 (SEQ ID NO:97), TAR2h-10-70 (SEQ ID NO:98), TAR2h-34 (SEQ ID NO:373), TAR2h-35 (SEQ ID NO:374), TAR2h-36 (SEQ ID NO:375), TAR2h-37 (SEQ ID NO:376), TAR2h-38 (SEQ ID NO:377), TAR2h-39 (SEQ ID NO:378), TAR2h-40 (SEQ ID NO:379), TAR2h-41 (SEQ ID NO:380), TAR2h-42 (SEQ ID NO:381), TAR2h-43 (SEQ ID NO:382), TAR2h-44 (SEQ ID NO:383), TAR2h-45 (SEQ ID NO:384), TAR2h-47 (SEQ ID NO:385), TAR2h-48 (SEQ ID NO:386), TAR2h-50 (SEQ ID NO:387), TAR2h-51 (SEQ ID NO:388), TAR2h-66 (SEQ ID NO:389), TAR2h-67 (SEQ ID NO:390), TAR2h-68 (SEQ ID NO:391), TAR2h-70 (SEQ ID NO:392), TAR2h-71 (SEQ ID NO:393), TAR2h-72 (SEQ ID NO:394), TAR2h-73 (SEQ ID NO:395), TAR2h-74 (SEQ ID NO:396), TAR2h-75 (SEQ ID NO:397), TAR2h-76 (SEQ ID NO:398), TAR2h-77 (SEQ ID NO:399), TAR2h-78 (SEQ ID NO:400), TAR2h-79 (SEQ ID NO:401) 및 TAR2h-15 (SEQ ID NO:431)로 구성된 군으로부터 선택된 dAb의 아미노산 서열과 약 90% 이상이 상동성인 아미노산 서열을 포함한다.
추가 구체예에서, 리간드 또는 dAb 단량체는 TAR2h-131-8 (SEQ ID NO:433), TAR2h-131-24 (SEQ ID NO:434), TAR2h-15-8 (SEQ ID NO:435), TAR2h-15-8-1 (SEQ ID NO:436), TAR2h-15-8-2 (SEQ ID NO:437), TAR2h-185-23 (SEQ ID NO:438), TAR2h-154-10-5 (SEQ ID NO:439), TAR2h-14-2 (SEQ ID NO:440), TAR2h-151-8 (SEQ ID NO:441), TAR2h-152-7 (SEQ ID NO:442), TAR2h-35-4 (SEQ ID NO:443), TAR2h-154-7 (SEQ ID NO:444), TAR2h-80 (SEQ ID NO:445), TAR2h-81 (SEQ ID NO:446), TAR2h-82 (SEQ ID NO:447), TAR2h-83 (SEQ ID NO:448), TAR2h-84 (SEQ ID NO:449), TAR2h-85 (SEQ ID NO:450), TAR2h-86 (SEQ ID NO:451), TAR2h-87 (SEQ ID NO:452), TAR2h-88 (SEQ ID NO:453), TAR2h-89 (SEQ ID NO:454), TAR2h-90 (SEQ ID NO:455), TAR2h-91 (SEQ ID NO:456), TAR2h-92 (SEQ ID NO:457), TAR2h-93 (SEQ ID NO:458), TAR2h-94 (SEQ ID NO:459), TAR2h-95 (SEQ ID NO:460), TAR2h-96 (SEQ ID NO:461), TAR2h-97 (SEQ ID NO:462), TAR2h-99 (SEQ ID NO:463), TAR2h-100 (SEQ ID NO:464), TAR2h-101 (SEQ ID NO:465), TAR2h-102 (SEQ ID NO:466), TAR2h-103 (SEQ ID NO:467), TAR2h-104 (SEQ ID NO:468), TAR2h-105 (SEQ ID NO:469), TAR2h-106 (SEQ ID NO:470), TAR2h-107 (SEQ ID NO:471), TAR2h-108 (SEQ ID NO:472), TAR2h-109 (SEQ ID NO:473), TAR2h-110 (SEQ ID NO:474), TAR2h-111 (SEQ ID NO:475), TAR2h-112 (SEQ ID NO:476), TAR2h-113 (SEQ ID NO:477), TAR2h-114 (SEQ ID NO:478), TAR2h-115 (SEQ ID NO:479), TAR2h-116 (SEQ ID NO:480), TAR2h-117 (SEQ ID NO:481), TAR2h-118 (SEQ ID NO:482), TAR2h-119 (SEQ ID NO:483), TAR2h-120 (SEQ ID NO:484), TAR2h-121 (SEQ ID NO:485), TAR2h-122 (SEQ ID NO:486), TAR2h-123 (SEQ ID NO:487), TAR2h-124 (SEQ ID NO:488), TAR2h-125 (SEQ ID NO:489), TAR2h-126 (SEQ ID NO:490), TAR2h-127 (SEQ ID NO:490), TAR2h-128 (SEQ ID NO:492), TAR2h-129 (SEQ ID NO:493), TAR2h-130 (SEQ ID NO:494), TAR2h-131 (SEQ ID NO:495), TAR2h-132 (SEQ ID NO:496), TAR2h-133 (SEQ ID NO:497), TAR2h-151 (SEQ ID NO:498), TAR2h-152 (SEQ ID NO:499), TAR2h-153 (SEQ ID NO:500), TAR2h-154 (SEQ ID NO:501), TAR2h-159 (SEQ ID NO:502), TAR2h-165 (SEQ ID NO:503), TAR2h-166 (SEQ ID NO:504), TAR2h-168 (SEQ ID NO:505), TAR2h-171 (SEQ ID NO:506), TAR2h-172 (SEQ ID NO:507), TAR2h-173 (SEQ ID NO:508), TAR2h-174 (SEQ ID NO:509), TAR2h-176 (SEQ ID NO:510), TAR2h-178 (SEQ ID NO:511), TAR2h-201 (SEQ ID NO:512), TAR2h-202 (SEQ ID NO:513), TAR2h-203 (SEQ ID NO:514), TAR2h-204 (SEQ ID NO:515), TAR2h-185-25 (SEQ ID NO:516), TAR2h-154-10 (SEQ ID NO:517) 및 TAR2h-205 (SEQ ID NO:627)으로 구성된 군으로부터 선택된 dAb의 아미노산 서열과 약 90% 이상이 상동성인 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 종양 괴사 인자 1 (TNFR1) 결합하고, TNFR1을 통한 신호전달을 억제하는 종양 괴사 인자 I (TNFR1)의 길항제에 관한 것으로, 상기 길항제는 TNFR1에 대한 TNFα의 결합을 억제하지 않는다. 몇몇 구체예에서, 길항제는 제 1 도메인 항체 (dAb) 단량체 및 제 2 dAb 단량체를 포함하고, 상기 제 1 dAb 단량체는 도메인 1, 도메인 2, 도메인 3 및 도메인 4로 구성된 군으로부터 선택된 TNFR1의 도메인에 결합하고, 상기 제 2 dAb 단량체는 도메인 1, 도메인 2, 도메인 3 및 도메인 4로 구성된 군으로부터 선택된 TNFR1의 도메인에 결합하고, 상기 길항제는 표준 L929 세포독성 분석 또는 표준 HeLa IL-8 분석에서 약 1 μM의 농도로 존재하는 경우 TNFR1을 효능화시키지 않는다.
몇몇 구체예에서, 본 발명은 종양 괴사 인자 1 (TNFR1)에 결합하고 TNFR1을 통한 신호전달을 억제하는 dAb를 포함하는 도메인 항체 (dAb) 단량체 또는 리간드에 관한 것으로, 상기 dAb 단량체는 TNFR1에 대한 TNFα의 결합을 억제하지 않는다.
몇몇 구체예에서, 본 발명은 종양 괴사 인자 I (TNFR1)에 결합하는 dAb를 포함하는 도메인 항체 (dAb) 단량체 또는 리간드에 관한 것으로, 상기 dAb는 TNFR1의 도메인 1에 결합하고, 마우스 TNFR1에 대한 결합에서 TAR2m-21-23과 경쟁하거나 인간 TNFR1에 대한 결합에서 TAR2h-205와 경쟁한다.
몇몇 구체예에서, 본 발명은 종양 괴사 인자 I (TNFR1)에 결합하는 dAb를 포함하는 도메인 항체 (dAb) 단량체 또는 리간드에 관한 것으로, 상기 dAb는 TNFR1의 도메인 3에 결합하고, 인간 TNFR1에 대한 결합에서 TAR2h-131-8, TAR2h-15-8, TAR2h-35-4, TAR2h-154-7, TAR2h-154-10 또는 TAR2h-185-25와 경쟁한다.
본 발명은 또한 TNFR1에 대한 결합 특이성을 지니고, 만성 염증 질병의 치료, 억제 또는 예방에 효과적인 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 몇몇 구체예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 1가 항원 결합 단편이다.
본 발명은 또한 TNFR1에 대한 결합 특이성을 지니고, TNFR1에 의해 매개된 신호전달을 억제하지만, TNFR1에 대한 TNFα의 결합을 실질적으로 억제하지 않는, dAb 단량체 및 dAb 단량체를 포함하는 리간드를 제공한다. 몇몇 구체예에서, dAb 단량체는 세포 표면에서 TNFα에 의해 유발된 TNFR1의 가교 또는 클러스터링(clustering)을 억제한다.
본 발명은 또한 본 발명의 리간드를 엔코딩하는 분리된 핵산 분자 및/또는 재조합 핵산 분자, 재조합 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 또한, 본 발명의 제조합 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포 및 리간드를 생성하는 방법이 제공된다.
본 발명은 또한 본 발명의 길항제 또는 리간드, 및 약리학적으로 또는 생리학적으로 또는 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 치료적 유효량의 본 발명의 길항제 또는 리간드를 이를 필요로 하는 포유동물에 투여하는 것을 포함하여, 질병 또는 장애 (예를들어, 만성 염증 질병, 자가면역 질병, 염증 질병, 관절염, 다발성 경화증, 염증성 장질병, 만성 폐쇄폐병, 폐렴, 패혈 쇼크)를 치료하거나, 억제하거나, 예방하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 치료 또는 진단에 사용하기 위한 본 발명의 길항제 또는 리간드, 및 본원에 기술된 질병 또는 장애 (예를들어, 만성 염증 질병, 자가면역 질병, 염증성 질병, 관절염, 다발성 경화증, 염증성 장질병, 만성 폐쇄폐병, 폐렴 또는 패혈 쇼크. 다른 구체예에서, 질병은 낭성섬유증 또는 중증 스테로이드 내성 천식일 수 있음)를 치료하거나, 억제하거나, 예방하기 위한 약제의 제조에 있어서, 본 발명의 길항제 또는 리간드의 용도에 관한 것이다..
본 발명은 추가로 활성 성분으로서 본원의 길항제 또는 리간드를 포함하는, 본원에 기술된 질병 또는 장애 (예를들어, 만성 염증 질병, 자가면역 질병, 염증 질병, 관절염, 다발성 경화증, 염증성 장질병, 만성 폐쇄폐병, 폐렴 또는 패혈 쇼크. 다른 구체예에서, 질병은 낭성섬유증 또는 중증 스테로이드 내성 천식일 수 있음)를 치료하거나, 억제하거나, 예방하기 위한 약제 조성물에 관한 것이다.
TNFR1에 대한 결합 특이성을 지니는 단일 가변 도메인 또는 도메인 항체 (dAb), 및 이러한 단일 가변 도메인 또는 dAb를 포함하는 리간드는 여러 장점을 지닌다. 예를들어, 본원에 기술된 TNFR1에 대한 결합 특이성을 지니는 단일 가변 도메인 또는 dAb은 TNFR1을 길항시킨다. 따라서, 본 발명의 항-TNFR1 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 dAb를 포함하는 치료제가 TNFR2에 결합하고/하거나 길항시킴으로써 야기되는 부작용 (예를들어, 면역억제)의 위험이 크게 감소되도록 투여 (예를들어, 치료, 진단 또는 예방 목적임)될 수 있다. TNF 알파를 표적으로 하는 치료제, 예를들어 ENBREL® (entarecept; Immunex Corporation)은 TNFR1 및 TNFR2를 길항시키고, 이러한 제제의 투여는 면역억제 및 관련 부작용 (예를들어, 심각한 감염)을 생성시킬 수 있다. 이들 부작용은 장기간에 걸쳐 투여되는 상기 제제, 특히 만성 질병용 제제의 사용을 제한한다 (Kollias G. and Kontoyiannis D., Cytokine Growth Factor Rev., 13(4-5):315-321 (2002). 대조적으로, 본 발명의 리간드는 TNFR1을 특이적으로 길항시키므로, 이들은 부작용의 위험이 감소되어, 만성 기준에 따라 장기간에 걸쳐 투여될 수 있고, 염증성 질병 및 만성 염증 질병 (활성 염증, 예를들어 염증성 장질병 및 관절염의 휴면 기간 및 활성 기간으로 특징되는 장기간 질병을 포함함) 치료에 이점을 제공한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 VH HSA의 항원 결합 부위 내에 존재하는 위치 H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H96, H97 및 H98 (각각 DVT 또는 NNK를 엔코딩함)에서의 VH/HSA의 다양성을 도시한다 (SEQ ID NO:1, 누클레오티드 서열; SEQ ID NO:2, 아미노산 서열). VK의 서열은 위치 L50 및 L53에서 다양하다.
도 2는 단일 사슬 Fv (scFv) 라이브러리를 제조하는데 사용되는 플라스미드 pIT1/pIT2의 구조를 나타내는 개략도로, 발현 조절 및 클로닝 영역을 가로지르는 플라스미드의 누클레오티드 서열 (SEQ ID NO:3) 및 엔코딩된 아미노산 서열 (SEQ ID NO:4)을 도시한다. 플라스미드는 파지 전시/ScFv 포맷에서 라이브러리 1 : 점라인(Germline) VK/DVT VH, 라이브러리 2: 점라인 VK/NNK VH, 라이브러리 3: 점라인 VH/DVT VK, 및 라이브러리 4: 점라인 VH/NNK VK를 제조하기 위해 사용된다. 이들 라이브러리는 일단 리간드 단백질 A 및 단백질 L에 대한 결합에 대해 미리 선택되어, 클론 및 선택된 라이브러리의 대부분은 기능적이다. 라이브러리는 HSA (제 1 라운드)와 β-gal (제 2 라운드)의 HSA β-gal 선택으로 선택되거나, β-gal (제 1 라운드)와 HSA (제 2 라운드)의 β-gal HSA 선택으로 선택된다. PCR의 이들 클론으로부터의 가용성 scFv가 서열 내에서 증폭된다. 이중특이성 항체 K8을 엔코딩하는 하나의 클론을 추가 실험을 위해 선택하였다.
도 3은 VH 사슬 (VH 더미(dummy) (SEQ ID NO:5), K8 (SEQ ID NO:6), VH2 (SEQ ID NO:7), VH4 (SEQ ID NO:8), VHC11 (SEQ ID NO:9), VHA1Osd (SEQ ID NO:10), VHA1sd (SEQ ID NO:11), VHA5sd (SEQ ID NO:12), VHC5sd (SEQ ID NO:13), VHC11sd (SEQ ID NO:14), VHC11sd (SEQ ID NO:15)) 및 Vκ 사슬 (VK 더미 (SEQ ID NO:16), K8 (SEQ ID NO:17), E5sc (SEQ ID NO:18), C3 (SEQ ID NO:19))의 배열을 도시한다.
도 4는 K8 항체의 결합 특성의 특성화, 및 모노클로날 파지 ELISA에 의해 특성화된 K8 항체의 결합 특성을 도시한 것으로, 이중특이성 K8 항체는 HSA 및 β-gal에 결합하는 것으로 밝혀졌고, 1.0을 초과하는 흡수 신호로 파지의 표면에 전시된다. 기타 단백질에서 교차 반응성은 검출되지 않았다.
도 5는 공지된 농도의 K8 항체 단편을 이용하여 수행된 가용성 scFv ELISA를 도시한다. 96-웰 플레이트는 1 ㎍/㎖의 농도에서 10 ㎍/㎖ 및 100 ㎍/㎖의 단백질 A로 100 ㎍의 HSA, BSA 및 β-gal로 코팅된다. K8 scFv의 50 ㎍의 연속 희석이 적용되었고, 결합된 항체 단편이 단백질 L-HRP로 검출되었다. ELISA 결과는 K8 항체의 이중특이적 특성을 확증하였다.
도 6은 가용성 scFv ELISA를 이용하여 분석된 클론 K8Vκ/더미 VH의 결합 특성을 도시한다. 가용성 scFv 단편의 생성이 문헌[Harrison et al., Methods Enzymol. 1996;267:83-109]에 기술된 바와 같이 IPTG에 의해 유도되었고, scFv를 함유하는 상층액을 직접 분석하였다. 가용성 scFv ELISA는 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행되었고, 결합된 scFv는 단백질 L-HRP로 검출되었다. ELISA 결과는 상기 클론이 β-gal에 여전히 결합될 수 있으나, 결합 BSA가 제거되었음을 나타내었다.
도 7은 가변성 도메인 벡터 1 및 2의 서열 (SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:3)을 도시한다.
도 8은 VH1/VH2 다중특이적 리간드를 작제하는데 사용된 CH 벡터의 맵이다.
도 9는 VK1/VK2 다중특이적 리간드를 작제하는데 사용된 Cκ 벡터의 맵이다.
도 10은 TAR1-5 이합체 4, TAR1-5-19 이합체 4 및 TAR1-5-19 단량체를 비교하는 TNF 수용체 분석을 도시한다.
도 11은 TAR1-5 이합체 1-6을 비교하는 TNF 수용체 분석을 도시한다. 모든 이합체는 정제된 FPLC를 지니고, 최적 이합체 종에 대한 결과가 도시되어 있다.
도 12는 다양한 포맷의 TAR1-5 19 동종이합체의 TNF 수용체 분석을 도시한다: 3U, 5U 또는 7U 링커를 지닌 dAb-링커-dAb 포맷, Fab 포맷 및 시스테인 힌지(hinge) 링커 포맷.
도 13은 라이브러리 1에 대한 더미 VH 서열을 도시한다 (아미노산 서열 (SEQ ID NO:5); 누클레오티드 서열: 코딩 가닥 (SEQ ID NO:20), 논코딩 가닥 (SEQ ID NO:21)). VH 프레임워크의 서열은 점라인 서열 DP47-JH4b를 기초로 한다. NNK 무작위화 (N=A 또는 T 또는 C 또는 G 누클레오티드; K=G 또는 T 누클레오티드)가 라이브러리 1로 통합된 위치를 굵은 글씨의 밑줄친 글씨로 나타내었다.
도 14는 라이브러리 2에 대한 더미 VH 서열을 도시한다 (아미노산 서열 (SEQ ID NO:22); 누클레오티드 서열: 코딩 가닥 (SEQ ID NO:23), 논코딩 가닥 (SEQ ID NO:24)). VH 프레임워크의 서열은 점라인 서열 DP47-JH4b를 기초로 한다. NNK 무작위화 (N=A 또는 T 또는 C 또는 G 누클레오티드; K=G 또는 T 누클레오티드)가 라이브러리 2로 통합된 위치를 굵은 글씨의 밑줄친 글씨로 나타내었다.
도 15는 라이브러리 3에 대한 더미 Vκ 서열을 도시한다 (아미노산 서열 (SEQ ID NO:16); 누클레오티드 서열: 코딩 가닥 (SEQ ID NO:25), 논코딩 가닥 (SEQ ID NO:26)). Vκ 프레임워크의 서열은 점라인 서열 DPK9-JK1를 기초로 한다. NNK 무작위화 (N=A 또는 T 또는 C 또는 G 누클레오티드; K=G 또는 T 누클레오티드)가 라이브러리 3으로 통합된 위치를 굵은 글씨의 밑줄친 글씨로 나타내었다.
도 16은 항 MSA dAb MSA 16의 누클레오티드 및 아미노산 서열 (누클레오티드 서열 (SEQ ID NO:27), 아미노산 서열 (SEQ ID NO:28)), 및 MSA 26의 누클레오티드 서열 및 아미노산 서열 (누클레오티드 서열 (SEQ ID NO:29), 아미노산 서열 (SEQ ID NO:30))을 도시한다.
도 17은 MSA 16 및 26의 억제 비아코어(biacore)를 도시한다. 정제된 dAb MSA16 및 MSA26은 Kd를 결정하기 위해 억제 비아코어에 의해 분석된다. 간단히, dAb는 고밀도의 MSA로 코팅된 비아코어 CM5 칩에서의 200RU의 반응을 달성하기 위해 필요한 dAb 농도를 결정하기 위해 시험된다. dAb의 필요 농도가 결정되면, 예상 Kd 근처의 농도 범위의 MSA 항원이 dAb와 사전 혼합되어, 밤새 인큐베이션된다. 이후, 각각의 사전 혼합물 내의 dAb의 MSA 코팅된 비아코어 칩에 대한 결합이 30 ㎕/분의 높은 유속에서 측정된다.
도 18은 주사후 MSA 16의 혈청 수준을 도시한다. dAb MSA16의 혈청 반감기가 마우스에서 결정된다. MSA16은 CD1 마우스로 약 1.5㎎/㎏의 단일 정맥내 주사로서 투여된다. 2개의 구획 모델을 이용한 모델링은 MSA16이 0.98시간의 t1/2α, 36.5시간의 t1/2β 및 913시간.㎎/㎖의 AUC를 지니는 것을 나타내었다. MSA16은 0.06시간의 t1/2α 및 0.34시간의 t1/2β를 지니는 HEL4 (항-계란 흰자 라이소자임 dAb)에 비해 현저하게 연장된 반감기를 지녔다.
도 19a 내지 19c는 MSA26Ck 및 TAR1-5-19CH를 포함하는 Fab-유사 단편을 이용한 TNF 결합의 억제를 나타내는 ELISA (도 19a) 및 TNF 수용체 분석 (도 19b, 19c)을 도시한다. MSA와 Fab-유사 단편의 첨가는 억제 수준을 감소시킨다. 1㎍/㎖의 TNFα로 코팅된 ELISA 플레이트를 이중특이적 VK CH 및 VK CK Fab 유사 단편으로 프로빙(probing)시키고, 또한 ELISA 상에서 유사한 신호를 생성시키도록 계산된 농도로 대조 TNFα 결합 dAb로 프로빙시켰다. 이중 특이적 dAb 및 대조군 dAb 둘 모두를 2㎎/㎖의 MSA의 존재 및 부재하에서 ELISA 플레이트를 프로빙시키기 위해 사용하였다. 이중특이적 웰 내의 신호는 50% 초과로 감소하였으나, dAb 웰 내의 신호는 전혀 감소되지 않았다 (참조 도 19a). 동일한 이중특이적 단백질을 또한 MSA를 지니거나 지니지 않는 수용체 분석에 넣고, MSA에 의한 경쟁이 또한 나타났다 (참조 도 19c). 이는 이중특이적 단편에 대한 MSA의 결합이 TNFα에 대한 결합과 경쟁하는 것을 입증한다.
도 20은 TAR1-5-19 dAb 및 MSA16 dAb의 이황화 결합된 이종이합체를 이용한 TNF 결합의 억제를 나타내는 TNF 수용체 분석을 도시한다. MSA와 이합체의 첨가는 용량 의존 방식으로 억제 수준을 감소시킨다. TNF 수용체 분석 (도 19 (b))을 일정한 농도의 이종이합체 (18nM) 및 MSA 및 HSA의 일련의 희석액의 존재하에서 수행하였다. 다양한 농도 (2 mg/ml 이하)의 HSA의 존재는 TNFα를 억제하는 이합체의 능력을 감소시키지 않았다. 그러나, MSA의 첨가는 TNFα를 억제하는 이합체의 능력을 용량 의존적으로 감소시켰다 (도 19a). 이는 MSA 및 TNFα가 cys 결합된 TAR1-5-19, MSA16 이합체에 대한 결합에서 경쟁함을 입증한다. MSA 및 HSA 단독은 상기 분석에서 TNF 결합 수준에 영향을 미치지 않는다.
도 21A 내지 21M은 인간 TNFR1에 대해 결합 특이성을 지니는 여러 인간 면역글로불린 가변 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NOS:31-98 및 SEQ ID NOS:373-401 내지 431)을 도시한다. 제시된 아미노산 서열은 갭이 없이 연속적이고; 기호 ~가 상보성 결정 영역 (CDR)의 위치를 나타내기 위해 서열 내에 삽입되었다. CDR1은 ~에 의해 플랭킹되고, CDR2는 ~~에 의해 플랭킹되고, CDR3는 ~~~에 의해 플랭킹된다.
도 22A 내지 22T는 도 21A 내지 21M에 제시된 인간 면역글로불린 가변 도메인을 엔코딩하는 여러 핵산의 누클레오티드 서열 (SEQ ID NOS:99-166 및 SEQ ID NOS:402-430 및 432)을 도시한다. 제시된 누클레오티드 서열은 갭이 없이 연속적이고; 기호 ~는 CDR을 엔코딩하는 서열의 위치를 나타내기 위해 서열 내에 삽입되었다. CDR1을 엔코딩하는 서열은 ~로 플랭킹되고, CDR2를 엔코딩하는 서열은 ~~로 플랭킹되고, CDR3를 엔코딩하는 서열은 ~~~로 플랭킹된다.
도 23A 내지 23B는 마우스 TNFR1에 대한 결합 특이성을 지니는 여러 인간 면역글로불린 가변 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NOS:167-179)을 도시한다. 제시된 아미노산 서열은 갭이 없이 연속적이다. 몇몇 서열에서, 기호 ~가 상보성 결정 영역 (CDR)의 위치를 나타내기 위해 삽입되었다. CDR1은 ~에 의해 플랭킹되고, CDR2는 ~~에 의해 플랭킹되고, CDR3는 ~~~에 의해 플랭킹된다.
도 24A 내지 24C는 도 23A 내지 23B에 제시된 인간 면역글로불린 가변 도메인을 엔코딩하는 여러 핵산의 누클레오티드 서열 (SEQ ID NOS:180-192 및 626)을 도시한다. SEQ ID NO:186 및 SEQ ID NO:626 둘 모두는 SEQ ID NO:173의 아미노산 서열을 엔코딩한다. CDR1을 엔코딩하는 SEQ ID NO:626의 서열은 ~에 의해 플랭킹되고, CDR2를 엔코딩하는 서열은 ~~에 의해 플랭킹되고, CDR3를 엔코딩하는 서열은 ~~~에 의해 플랭킹된다.
도 25A 내지 25L은 여러 인간 면역글로불린 가변 도메인을 엔코딩하는 누클레오티드 서열 및 엔코딩된 인간 면역글로불린 가변 도메인의 아미노산 서열을 도시한다 (SEQ ID NOS:193-198 및 200-295).
도 26은 항-TNFR1 dAb 포맷이 L929 분석에서 TNFR1을 실질적으로 효능화시키지 않음을 나타내는 그래프이다. L929 세포는 다양한 농도의 항-TNFR1 dAb 단량체 (TAR2m-21-23), 시판되는 항-myc 항체 (9E10)에 의해 가교된 TAR2m-21-23 단량체, 이중특이적 항-TNFR1 dAb/항-SA dAb (TAR2m-21-23 3U TAR7m-16), 또는 페길화된 항-TNFR1 dAb 단량체 (TAR2m-21-23 4OK PEG)를 함유하는 배지에서 배양된다. 항-myc 항체에 의해 가교된 TAR2m-21-23 단량체의 경우, dAb 및 항체는 2:1의 비율로 혼합되고, 실온에서 1시간 동안 예비 인큐베이션되어 배양 전에 생체내 면역 가교의 효과를 자극시킨다. TAR2m-21-23 단량체는 myc 에피토프를 포함한다. TAR2m-21-23 단량체는 3,000 nM의 농도로 L929 세포와 함께 인큐베이션된다. TAR2m-21-23 단량체 및 항-myc 항체는 3,000 nM의 dAb 농도로 인큐베이션된다. TAR2m-21-23 3U TAR7m-16은 25 nM, 83.3 nM, 250 nM, 833 nM 및 2,500 nM의 농도로 세포와 함께 인큐베이션된다. TAR2m-21-23 40K PEG는 158.25 nM, 527.5 nM, 1582.5 nM, 5,275 nM 및 15,825 nM의 농도로 세포와 함께 인큐베이션된다. 밤새 인큐베이션 후, 세포 생존도를 측정하였다. 결과는 L929 세포와 TNFR1을 가교시키고 효능화시키는 10 nM, 1 nM 또는 0.1 nM의 시판되는 항-TNFR1 IgG 항체의 인큐베이션이 비-생존 세포의 용량 의존 증가를 야기시키는 것을 나타내었고, 따라서 이는 이들 세포의 TNFR1의 효능제에 대한 민감성을 입증한다. 대조적으로, 다양한 양의 항-TNFR1 포맷을 이용한 인큐베이션은 시판되는 항-TNFR1 IgG 항체의 농도보다 1000배 이상으로 사용하는 경우에도 TNFR1을 길항시키지 않고, 배양에서 비-생존 세포의 수를 증가시키지 않는다.
도 27A 내지 27I는 인간 TNFR1에 대해 결합 특이성을 지니는 여러 인간 면역글로불린 가변 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NOS:433-517 및 627)을 도시한다. 제시된 아미노산 서열은 갭이 없이 연속적이고; 기호 ~는 상보성 결정 영역 (CDR)의 위치를 나타내기 위해 서열 내로 삽입되었다. CDR1은 ~에 의해 플랭킹되고, CDR2는 ~~에 의해 플랭킹되고, CDR3는 ~~~에 의해 플랭킹된다.
도 28A 내지 28O는 도 27A 내지 27H에 제시된 인간 면역글로불린 가변 도메인을 엔코딩하는 여러 핵산의 누클레오티드 서열 (SEQ ID NOS:518-602 및 628)을 도시한다. 제시된 누클레오티드 서열은 갭이 없이 연속적이고; 기호 ~는 CDR을 엔코딩하는 서열의 위치를 나타내기 위해 서열 내로 삽입되었다. CDR1 엔코딩 서열은 ~에 의해 플랭킹되고, CDR2를 엔코딩하는 서열은 ~~에 의해 플랭킹되고, CDR3를 엔코딩하는 서열은 ~~~에 의해 플랭킹된다.
발명의 상세한 설명
본 명세서 내에서, 구체예는 명세서가 명백하고 간결하게 작성가능하게 하는 방식으로 기술되었으나, 상기 구체예는 본 발명에 벗어남이 없이 다양하게 조합되거나 분리될 수 있고, 이러한 사실이 인식될 것이다.
정의
"상보적" : 두개의 면역글로불린 도메인은 이들이 동족쌍 또는 그룹을 형성하는 구조의 과에 속하고, 이러한 과로부터 유래되고, 이러한 특징을 보유하는 경우에 "상보적"이다. 예를들어, 항체의 VH 도메인 및 VL 도메인은 상보적이고; 두개의 VH 도메인은 상보적이지 않고, 두개의 VL 도메인은 상보적이지 않다. 상보적 도메인은 다른 일원의 면역글로불린 상과, 예를들어 T 세포 수용체의 Vα 및 Vβ (또는 γ 및 δ) 도메인에서 발견될 수 있다. 본 발명의 이차 배열에서, 비-상보적 도메인은 표적 분자와 협동적으로 결합하지 않지만, 동일하거나 상이한 분자일 수 있는 상이한 표적 에피토프에 대해서는 독립적으로 작용한다. 인공적인 도메인, 예를들어 에피토프에 결합하도록 고안되지 않는 한 에피토프에 결합하지 않는 단백질 스캐폴드에 기초한 도메인은 비-상보적이다. 마찬가지로, (예를들어) 면역글로불린 도메인 및 피브로넥틴 도메인에 기초한 두개의 도메인은 상보적이 아니다.
"면역글로불린" : 이는 두개의 β 시트 및 보통 보존된 이황화 결합을 보유하는, 항체 분자의 면역글로불린 폴드 특성을 포유하는 폴리펩티드 과를 의미한다. 면역글로불린 상과의 일원은 면역계에서의 광범위한 역할(예를들어, 항체, T 세포 수용체 분자 등)을 포함하는 세포 및 비세포 상호작용의 다양한 양태, 및 세포 부착 (예를들어, ICAM 분자) 및 세포내 신호전달 (예를들어, 수용체 분자, 예를들어 PDGF 수용체)에 수반된다. 본 발명은 결합 도메인을 지니는 모든 면역글로불린 상과 분자에 적용가능하다. 바람직하게는, 본 발명은 항체를 의미한다.
"조합하는" : 본 발명에 따른 가변 도메인은 조합되어 일련의 그룹의 도메인을 형성한다; 예를들어, 상보성 도메인은 VH 도메인과 조합되는 VL 도메인과 같이 조합될 수 있다. 비-상보성 도메인이 또한 조합될 수 있다. 도메인은 공유 또는 비공유 수단에 의한 도메인의 결합을 포함하는 다양한 방식으로 조합될 수 있다.
"도메인" : 도메인은 단백질의 나머지와는 독립적인 삼차 구조를 보유하는 폴딩된 단백질 구조이다. 일반적으로, 도메인은 단백질의 분비 기능 특성을 담당하고, 많은 경우에서 단백질 및/또는 도메인의 나머지의 기능의 손실 없이 기타 단백질로 첨가되거나, 제거되거나 이동될 수 있다. 단일 항체 가변 도메인은 항체 가변 도메인의 서열 특성을 포함하는 폴딩된 폴리펩티드 도메인을 의미한다. 따라서, 이는 완전한 항체 가변 도메인 및, 예를들어 하나 이상의 루프가 항체 가변 도메인의 특성이 아닌 서열로 대체된 변형된 가변 도메인, 또는 N-말단 또는 C-말단이 트렁케이션되거나 N-말단 또는 C-말단 신장을 포함하는 항체 가변 도메인, 뿐만 아니라 전장 도메인의 적어도 일부의 결합 활성 및 특이성을 보유하는 가변 도메인의 폴딩된 단편을 포함한다.
"레퍼토리" : 다양한 변이체, 예를들어 1차 서열이 다른 폴리펩티드 변이체의 집합. 본 발명에 사용된 라이브러리는 1000개 이상의 일원을 포함하는 폴리펩티드의 레퍼토리를 포함한다.
"라이브러리" : 용어 라이브러리는 이종 폴리펩티드 또는 핵산의 혼합물을 의미한다. 라이브러리는 각각이 단일 폴리펩티드 또는 핵산 서열을 지니는 일원으로 구성된다. 이러한 맥락에서, 라이브러리는 레퍼토리와 유의하다. 라이브러리 일원 사이의 서열 차이는 라이브러리에 존재하는 다양성을 책임진다. 라이브러리는 폴리펩티드 또는 핵산의 단순한 혼합물의 형태를 취하거나, 유기체 또는 세포, 예를들어 박테리아, 바이러스, 동물 또는 식물 세포 등의 형태일 수 있다. 바람직하게는, 각각의 개별적 유기체 또는 세포는 단지 하나 또는 제한된 수의 라이브러리 일원을 함유한다. 유리하게는, 핵산이 발현 벡터로 통합되어, 핵산에 의해 엔코딩된 폴리펩티드의 발현을 가능케 한다. 따라서, 한 바람직한 양태에서, 라이브러리는 각각의 유기체가 상응하는 폴리펩티드 일원을 생성시키기 위해 발현될 수 있는 핵산의 라이브러리의 단일 일원을 함유하는 하나 이상의 카피의 발현 벡터를 함유하는, 숙주 유기체의 집단의 형태를 취할 수 있다. 따라서, 숙주 유기체의 집단은 유전적으로 다양한 폴리펩티드 변이체의 광범위한 레퍼토리를 엔코딩하는 잠재성을 지닌다.
"폐쇄 형태의 다중특이적 리간드"는 본원에 정의된 2개 이상의 에피토프 결합 도메인을 포함하는, 본원에 정의된 다중특이적 리간드를 기술한다. 용어 '폐쇄 형태' (다중특이적 리간드)은 리간드의 에피토프 결합 도메인이, 하나의 에피토프 결합 도메인에 의한 에피토프 결합이 또 다른 에피토프 결합 도메인에 의한 에피토프 결합과 경쟁하도록 배열된 것을 의미한다. 즉, 동족의 에피토프는 각각의 에피토프 결합 도메인에 의해 개별적으로 결합될 수 있으나, 동시에 결합되지 않는다. 리간드의 폐쇄 형태는 본원에 기술된 방법을 이용하여 달성될 수 있다.
"항체" : 천연적으로 항체를 생성하는 임의의 종으로부터 유래되거나, 재조합 DNA 기술에 의해 생성되고; 혈청, B 세포, 하이브리도마, 트랜스펙토마(transfectoma), 효모 또는 박테리아로부터 분리된, 항체 (예를들어, IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE) 또는 단편 (예를들어, Fab, F(ab')2, Fv, 이황화 결합된 Fv, scFv, 폐쇄 형태의 다중특이적 항체, 이황화 결합된 scFv, 디아바디(diabody).
"이중특이적 리간드" : 본원에 정의된 제 1 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 제 2 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 리간드로서, 상기 가변 영역은 단일특이적 면역글로불린에 의해 일반적으로 결합되지 않는 두개의 상이한 항원 또는 동일한 항원의 두개의 에피토프에 결합될 수 있다. 예를들어, 두개의 에피토프는 동일한 합텐일 수 있으나, 동일한 에피토프가 아니거나 단일특이적 리간드에 의해 결합되기에 충분히 인접하지 않는다. 본 발명에 따른 이중특이적 리간드는 상이한 특이성을 지니는 가변 도메인으로 구성되고, 동일한 특이성을 지니는 서로 상보성인 가변 도메인쌍을 함유하지 않는다.
"항원" : 본 발명에 따른 리간드에 의해 결합되는 분자. 통상적으로, 항원은 항체 리간드에 의해 결합되고, 생체내에서 항체 반응을 일으킬 수 있다. 이는 폴리펩티드, 단백질, 핵산 또는 기타 분자일 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 따른 이중특이적 리간드는 특정 항원에 대한 특이성을 표적으로 하기 위해 선택된다. 통상적인 항체 및 이의 단편의 경우, 가변 루프 (L1, L2, L3 및 H1, H2, H3)로 규정된 항체 결합 부위가 항원에 결합될 수 있다.
"에피토프" : 면역글로불린 VH/VL 쌍에 의해 통상적으로 결합된 구조의 단위. 에피토프는 항체에 대한 최소 결합 부위를 규정하고, 따라서 항체의 특이성 표적을 의미한다. 단일 도메인 항체의 경우, 에피토프는 분리시 가변 도메인에 의해 결합된 구조의 단위를 의미한다.
"일반 리간드" : 모든 일원의 레퍼토리에 결합하는 리간드. 일반적으로, 상기 정의된 바와 같은 항원 결합 부위를 통해 결합하지 않는다. 비제한적인 예는 단백질 A, 단백질 L 및 단백질 G를 포함한다.
"선택" : 결합 상호작용이 도메인과 항원 또는 에피토프 사이 또는 항체와 항원 또는 에피토프 사이에 이루어지는, 스크리닝에 의해 유래되거나, 다윈 선택 방법에 의해 유래되는 것을 의미한다. 따라서, 제 1 가변 도메인이 상보적 가변 도메인의 존재 또는 부재하에서 항원 또는 에피토프에 대한 결합을 위해 선택될 수 있다.
"유니버셜 프레임워크(universal framework)" : 케이뱃(Kabat)의 문헌["Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services]에 의해 정의된 서열에 보존된 항체의 영역 또는 문헌[Chothia and Lesk, (1987) J. MoI. Biol. 196:910- 917]에 정의된 인간 점라인 면역글로불린 레퍼토리 또는 구조에 상응하는 단일 항체 프레임워크 서열. 본 발명은 고변이 영역 단독에서의 변이를 통한 실질적으로 임의의 결합 특이성의 유도를 허용하는 것으로 밝혀진, 단일 프레임워크, 또는 상기 프레임워크의 세트의 용도를 제공한다.
"반감기" : 예를들어 천연 메커니즘에 의해 리간드의 분해 및/또는 리간드의 제거 또는 분리로 인해 생체내에서 리간드의 혈청 농도가 50%로 감소되는데 걸리는 시간. 본 발명의 리간드는 생체내에서 안정적이고, 이들의 반감기는 분해 및/또는 제거 또는 분리에 내성인 분자로의 결합에 의해 증가된다. 통상적으로, 이러한 분자는 스스로 생체내에서 긴 반감기를 지니는 천연 발생 단백질이다. 리간드의 반감기는 기능 활성이 반감기 증가 분자에 대해 특이적이지 않은 유사한 분자보다 긴 기간 동안 생체내에서 지속되는 경우에 증가된다. 따라서, HSA에 특이적인 리간드 및 표적 분자는 HSA에는 결합하지 않지만 다른 분자에는 결합하는 HSA에 대한 특이성이 존재하지 않는 동일한 리간드와 비교된다. 예를들어, 이는 표적 분자의 제 2의 에피토프에 결합할 수 있다. 통상적으로, 반감기는 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 이 이상 증가된다. 2x, 3x, 4x, 5x, 10x, 2Ox, 30x, 4Ox, 50x 또는 이 이상의 범위의 반감기의 증가가 가능하다. 또한 대안적으로 30x, 40x, 50x, 6Ox, 7Ox, 80x, 9Ox, 10Ox, 150x 이하의 범위의 반감기의 증가가 가능하다.
"동종 면역분석" : 분석물이 결합 및 비결합 시약을 분리시키는 단계를 필요로 하지 않고 검출되는 면역분석.
"실질적으로 동일 (또는 "실질적으로 상동")" : 제 1 아미노산 또는 누클레오티드 서열이 제 2 아미노산 또는 누클레오티드 서열에 대해 충분한 수의 동일하거나 동등한 (예를들어, 유사한 측쇄, 예를들어 보존된 아미노산 치환을 지님) 아미노산 잔기 또는 누클레오티드를 함유하여, 제 1 및 제 2 아미노산 또는 누클레오티드 서열이 동일한 활성을 지니는 것을 의미한다. 이러한 항체의 경우, 제 2 항체는 동일한 결합 특이성을 지니고, 50% 이상의 동일한 친화성을 지닌다.
본원에서 사용되는 용어 "낮은 엄격한 조건", "중간의 엄격한 조건", "높은 엄격한 조건" 또는 "매우 높은 엄격한 조건"은 핵산 하이브리드화 및 세척을 위한 조건을 기술한다. 하이브리드화 반응을 수행하기 위한 지침은 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 문헌[Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6]의 최신 프로토콜에서 발견될 수 있다. 수성 및 비수성 방법이 상기 참조에 기술되어 있고, 둘 모두 사용될 수 있다. 본원에 언급된 특정 하이브리드화 조건은 하기와 같다: (1) 약 45℃의 6X 염화나트륨/시트르산 나트륨(SSC)중의 낮은 엄격한 하이브리드화 조건 후, 50℃ 이상 (세척 온도는 낮은 엄격한 조건에 대해 55℃로 증가될 수있음)에서 0.2X SSC, 0.1% SDS에서 2회 세척; (2) 약 45℃의 6X SSC 중의 중간의 엄격한 하이브리드화 조건 후, 60℃에서 0.2X SSC, 0.1% SDS로 1회 이상 세척; (3) 약 45℃에서 6X SSC 중의 높은 엄격한 하이브리드화 조건 후, 65℃에서 0.2X SSC, 0.1% SDS로 1회 이상 세척; 바람직하게는 (4) 65℃에서 0.5M 염화나트륨, 7% SDS 중의 매우 높은 엄격한 하이브리드화 조건 후, 65℃에서 0.2X SSC, 1% SDS로 1회 이상 세척. 매우 높은 엄격한 조건 (4)가 바람직한 조건이고, 나머지 조건들은 달리 상술되지 않는 경우에 사용됨.
본원에 기술된 용어 "폐쇄 형태" (다중특이적 리간드)은 리간드의 에피토프 결합 도메인이, 임의로 단백질 골격에 의해 서로 결합되거나 회합되어, 하나의 에피토프 결합 도메인에 의한 에피토프 결합이 또 다른 에피토프 결합 도메인에 의한 에피토프 결합과 경쟁하는 것을 의미한다. 즉, 동족 에피토프는 각각의 에피토프 결합 도메인에 개별적으로 결합할 수 있으나, 동시에 결합하지는 않는다. 리간드의 폐쇄 형태는 본원에 기술된 방법을 이용하여 달성될 수 있다.
"개방 형태"는 리간드의 에피토프 결합 도메인이, 임의로 단백질 골격에 의해 서로 결합되거나 회합되어, 하나의 에피토프 결합 도메인에 의한 에피토프 결합이 또 다른 에피토프 결합 도메인에 의한 에피토프 결합과 경쟁하지 않는 것을 의미한다.
본원에 언급된 용어 "경쟁하다"는 제 2 에피토프가 제 2 에피토프의 동족 에피토프 결합 도메인에 대해 결합되는 경우에 제 1 에피토프의 동족 에피토프 결합 도메인에 대한 제 1 에피토프의 결합이 방해되는 것을 의미한다. 예를들어, 결합은, 예를들어 결합 도메인의 물리적 장벽에 의하거나, 결합 도메인의 구조 또는 환경의 변화에 의해 입체적으로 억제되어, 이의 활성 또는 에피토프에 대한 결합성이 감소될 수 있다.
관용구 "면역글로불린 단일 가변 도메인"은 기타 V 영역 또는 도메인과는 독립적으로 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 가변 영역 (VH, VHH, VL)을 의미하나; 상기 용어가 본원에 사용되는 바에 따르면, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 다른 영역 또는 도메인이 단일 면역글로불린 가변 도메인에 의한 항원 결합에 필요하지 않는 경우(즉, 면역글로불린 가변 도메인이 추가의 가변 도메인과는 독립적으로 항원에 결합하는 경우)에 다른 가변 영역 또는 가변 도메인을 지닌 포맷 (예를들어, 동종이합체 또는 이종이합체)으로 존재할 수 있다. "면역글로불린 가변 도메인"은 분리된 항체 단일 가변 도메인 폴리펩티드를 포함할 뿐만 아니라, 항체 단일 가변 도메인 폴리펩티드 서열의 하나 이상의 단량체를 포함하는 보다 큰 폴리펩티드도 포함한다. "도메인 항체" 또는 "dAb"는 본원에서 사용되는 용어에 따르면 "면역글로불린 단일 가변 도메인" 폴리펩티드와 동일하다. 본원에서 사용되는 면역글로불린 단일 가변 도메인 폴리펩티드는 포유동물, 바람직하게는 인간 면역글로불린 단일 가변 도메인 폴리펩티드를 의미하지만, 설치류의 면역글로불린 단일 가변 도메인 폴리펩티드 (참조: 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 WO 00/29004) 및 카멜리드(camelid) VHH dAb도 포함한다. 카멜리드 dAb는 낙타, 라마, 알파카, 단봉낙타 및 과나코를 포함하는 종으로부터 유래되는 면역글로불린 단일 가변 도메인 폴리펩티드이고, 천연적으로 경쇄가 결여된 중쇄 항체를 포함한다: VHH·VHH 분자는 IgG 분자보다 약 10배 작고, 단일 폴리펩티드와 같이 이들은 극도의 pH 및 온도 조건에 내성으로 매우 안정하다.
본원에서 사용되는 용어 "종양 괴사 인자 수용체 1 (TNFR1)"은 TNFR1에 결합하고, TNFR1의 기능 (예를들어, 하나 이상의 기능)을 억제할 수 있는 작용제 (예를들어, 분자, 화합물)를 의미한다. 예를들어, TNFR1의 길항제는 TNFR1에 대한 TNFα 의 결합을 억제하고/하거나 TNFR1를 통해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있다. 따라서, TNFR1에 의해 매개된 과정 및 세포 반응 (예를들어, 표준 L929 세포독성 분석에서의 TNFα에 유발된 세포 사멸)이 TNFR1의 길항제로 억제될 수 있다. TNFR1의 길항제는, 예를들어 작은 유기 분자, 천연 생성물, 단백질, 펩티드 또는 펩티도미메틱(peptidomimetic)일 수 있다. TNFR1의 길항제는, 예를들어 본원에 기술된 미국국립암센터의 케미컬 레포지토리(Chemical Repository)와 같은 라이브러리 또는 분자의 집합체를 스크리닝하거나 기타 적합한 방법을 이용하여 확인될 수 있다. TNFR1의 바람직한 길항제는 본원에 기술된 항체, 항체의 항원 결합 단편, 리간드 및 TNFR1 단량체이다.
본원에 기술된 서열과 유사하거나 상동성인 서열 (예를들어, 약 70% 이상의 서열 동일성)이 또한 본 발명의 일부를 이룬다. 몇몇 구체예에서, 아미노산 수준에서의 서열 동일성은 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 이 이상일 수 있다. 핵산 수준에서, 서열 동일성은 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 이 이상일 수 있다. 대안적으로, 핵산 분절이 선택적 하이브리드화 조건 (예를들어, 매우 높은 엄격한 하이브리드화 조건)하에서 상보적인 가닥에 하이브리드화되는 경우에 충분한 동일성이 존재한다. 핵산은 전체 세포 또는 세포 용해질에 존재하거나 부분적으로 정제되거나 충분히 순수한 형태로 존재할 수 있다.
두개의 서열 사이의 "상동성" 또는 "서열 동일성" 또는 "유사성" (이러한 용어들은 본원에서 상호 교환하여 사용됨)의 계산은 하기와 같이 수행된다. 서열은 최적 비교 목적을 위해 정렬된다 (예를들어, 최적 정렬을 위해 제 1 및 제 2 아미노산 서열중 하나 또는 둘 모두에 갭이 도입될 수 있거나, 비상동성 서열이 비교 목적을 위해 무시될 수 있음). 한 바람직한 구체예에서, 비교 목적을 위해 정렬된 참조 서열의 길이는 30% 이상, 바람직하게는 40% 이상, 더욱 바람직하게는 50% 이상, 더욱 더 바람직하게는 60% 이상, 더욱 더 바람직하게는 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 및 100% 길이의 참조 서열이다. 이후, 상응하는 아미노산 위치 또는 누클레오티드 위치에서의 아미노산 잔기 또는 누클레오티드가 비교된다. 제 1 서열의 위치가 제 2 서열 내의 상응하는 위치와 같은 아미노산 잔기 또는 누클레오티드에 의해 차지되는 경우, 분자들은 상기 위치에서 동일하다 (본원에서 사용되는 아미노산 또는 핵산 "상동성"은 아미노산 또는 핵산 "동일성"과 동일하다). 두개의 서열 사이의 동일성 %는 두개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입되는 것이 필요한, 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려하는, 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다.
유리하게는, 디폴트 값에 대해 설정된 파라미터를 지닌 BLAST 알고리듬 (버전 2.0)이 서열 정렬을 위해 사용된다. BLAST 알고리듬은 미연방정부(".gov")의 국립보건원("nih")의 국립 생물학 기술정보센터(".ncbi")의 월드 와이드 웹 사이트("www")에 "/Blast/" 디렉토리에 "blast_help.html" 파일로 상세하게 기술되어 있다. 검색 파라미터는 하기와 같이 정의되고, 규정된 디폴트 파라미터에 대해 유리하게 설정된다.
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)는 프로그램 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx로 사용되는 학습 검색 알고리듬이다; 이들 프로그램은 몇가지 기능 강화와 함께 문헌[Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(6):2264-8] (상기 기술된 "blast_help.html" 파일 참조)의 통계 방법을 이용한 이들의 발견에 의의를 둔다. BLAST 프로그램은 서열 유사성 검색을 위해, 예를들어 질의 서열에 대한 상동성을 확인하기 위해 맞추어진다. 상기 프로그램은 일반적으로 모티프-양식 검색에는 유용하지 않다. 서열 데이터베이스의 유사성 검색에서의 기본적인 문제를 검토하려면, 문헌[Altschul et al. (1994)]를 참조하라.
국립 생물학 기술정보센터 웹 사이트에서 이용가능한 5개의 BLAST 프로그램은 하기의 작업을 수행한다:
"blastp"은 단백질 서열 데이터베이스에 대해 아미노산 질의 서열을 비교한다;
"blastn"은 누클레오티드 서열 데이터베이스에 대해 누클레오티드 질의 서열을 비교한다;
"blastx"는 단백질 서열 데이터베이스에 대해 누클레오티드 질의 서열(둘 모두의 가닥)의 6개 프레임의 개념적 번역 생성물을 비교한다;
"tblastn"은 모든 6개의 판독 프레임에서 동적으로 번역된 누클레오티드 서열 데이터베이스에 대해 단백질 질의 서열을 비교한다 (둘 모두의 가닥);
"tblastx"는 누크레오티드 서열 데이터베이스의 6개 프레임 번역에 대해 누클레오티드 질의 서열의 6개 프레임 번역을 비교한다.
BLAST는 하기의 검색 파라미터를 사용한다:
HISTOGRAM은 각각의 검색에 대한 스코어의 막대그래프를 나타낸다; 디폴트는 '예'이다 (참조: BLAST 매뉴얼 내의 파라미터 H).
DESCRIPTIONS은 특정된 수로 보고되는 매칭 (matching) 서열의 짧은 디스크립션 (description)의 수를 제한한다; 디폴트 한계는 100개의 디스크립션이다 (매뉴얼 페이지의 파라미터 V 참조). 또한, EXPECT 및 CUTOFF를 참조하라.
ALIGNMENTS는 높은 스코어 분절쌍 (HSP)이 보고되는 특정된 수로 데이터베이스 서열을 제한한다; 디폴트 한계는 50이다. 이보다 더 많은 데이터베이스 서열이 보고를 위한 통계적 유의 분계점을 만족시키는 경우 (하기 EXPECT 및 CUTOFF 참조), 가장 높은 통계 유의성에 기인된 매치만이 보고된다 (BLAST 매뉴얼의 파라미터 B 참조).
EXPECT는 데이터베이스 서열에 대한 매치를 보고하기 위한 통계적 유의 분계점이다; 디폴트 값은 10이고, 이로써 10 매치는 문헌[Karlin and Altschul (1990)]의 추계학 모델에 따라 단지 우연에 의해 발견되는 것으로 예상된다. 매치에 기인한 통계적 유의성이 EXPECT 분계점보다 높은 경우, 매치는 보고되지 않을 것이다. 보다 낮은 EXPECT 분계점은 더욱 엄격해지고, 이는 보고되는 우연적인 매치수를 보다 적게 만든다. 분수값도 허용된다 (BLAST 매뉴얼의 파라미터 E 참조).
CUTOFF는 높은 스코어의 분절쌍을 보고하기 위한 컷오프 스코어이다. 디폴트 값은 EXPECT 값(상기 참조)로부터 계산된다. HSP는 이들에 기인된 통계 유의성이 최소한 CUTOFF 값과 동일한 스코어를 지니는 단독 HSP에 기인되는 것과 같이 높은 경우에만 데이터베이스 서열에 대해 보고된다. 보다 높은 CUTOFF 값은 더욱 엄격해지고, 이는 보고되는 우연적인 매치수를 보다 적게 만든다 (BLAST 매뉴얼의 파라미터 S 참조). 통상적으로, 유의 분계점은 EXPECT를 이용하여 더욱 직관적으로 다루어질 수 있다.
MATRIX는 BLASTP, BLASTX, TBLASTN 및 TBLASTX에 대한 교대 스코어 매트릭스를 특정한다. 디폴트 매트릭스는 BLOSUM62이다 (Henikoff & Henikoff, 1992, Proc. Natl. Aacad. Sci. USA 89(22): 10915-9). 유효한 교대 선택은 PAM40, PAM120, PAM250 및 IDENTITY를 포함한다. BLASTN에 대해서는 교대 스코어 매트릭스를 이용할수 없다; BLASTN 요청에서의 MATRIX 지시어를 특정하는 것은 오류 반응을 일으킨다.
STRAND는 TBLASTN 검색을 바로 데이터베이스 서열의 상단 또는 하단 가닥으로 제한하거나; BLASTN, BLASTX 또는 TBLASTX 검색을 바로 질의 서열의 상단 또는 하단 가닥상의 리딩 프레임으로 제한한다.
FILTER는 문헌[Wootton & Federhen (1993) Computers and Chemistry 17:149-163]의 SEG 프로그램에 의해 결정되는 낮은 구성적 복잡성, 또는 문헌[Claverie & States, 1993, Computers and Chemistry 17:191-201]의 XNU 프로그램에 의해 결정되거나, BLASTN에 대해서는 타투소프(Tatusov) 및 리프만(Lipman)의 DUST 프로그램 (NCBI의 월드 와이드 웹 사이트 참조)에 의해 결정되는 짧은 주기의 내부 반복으로 구성된 분절을 지니는 질의 서열의 분절을 마스킹(masking)한다. 필터링은 blast 산출로부터 통계적으로는 유의하나 생물학적으로는 괌심을 끌지 않는 보고를 배제하여 (예를들어, 통상적인 산성, 염기성 또는 프롤린 풍부 영역에 대한 적중), 데이터베이스 서열에 대한 특이적 매칭에 이용가능한 질의 서열의 생물학적으로 보다 관심을 끄는 영역을 남길 수 있다.
필터 프로그램에 의해 발견된 낮은 복잡성 서열은 누클레오티드 서열 내에서 문자 "N" (예를들어, "N"이 13회 반복됨)을 이용하여 대체되고, 단백질 서열에서 문자 "X" (예를들어, "X"가 9회 반복됨)를 이용하여 대체된다.
필터링은 질의 서열 (또는 이의 번역 생성물)에만 적용되고, 데이터베이스 서열에는 적용되지 않는다. 디폴트 필터링은 BLASTN에 대해서는 DUST이고, 기타 프로그램에 대해서는 SEG이다.
SWISS-PROT 내의 서열에 적용되는 경우 SEG, XNU 또는 둘 모두에 의해 마스킹되어 아무것도 나타나지 않는 것은 특별한 것이 아니므로, 필터링은 항상 결과를 산출하는 것으로 예상되어선 안된다. 더욱이, 몇몇 경우에, 서열은 이의 전체에서 마스킹되는데, 이는 필터링되지 않은 질의 서열에 대해 보고된 임의의 매치의 통계적 유의성이 의심되는 것을 나타낸다. NCBI-gi는 NCBI gi 인식자 뿐만 아니라 수탁정보 및/또는 유전자좌 명칭이 산출물에 나타나게 한다.
가장 바람직하게는, 서열 비교는 상기 기술된 NCBI 월드 와이드 웹 사이트에서 "/BLAST" 디렉토리 내에 제공된 간단한 BLAST 검색 알고리듬을 이용하여 수행된다.
달리 정의되지 않는 경우, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학용어 (예를들어, 세포 배양, 분자유전학, 핵산 화학, 하이브리드화 기술 및 생화학)는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 지닌다. 표준 기술이 분자, 유전학 및 생화학 방법 (참조: 전체 내용이 본원에 참조로서 포함된 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual., 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. and Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th Ed, John Wiley & Sons, Inc.) 및 화학적 방법에 대해 사용된다.
TNFR1은 리간드, 및 내재성 신호전달 활성이 결핍되어 있으나 신호전달 물질과 회합될 수 있는 세포내 도메인과 결합하는 세포외 영역을 함유하는 막횡단 수용체이다. TNF와 결합된 TNFR1의 복합체는 3개의 TNFR1 사슬 및 3개의 TNF 사슬을 함유한다 (Banner et al., Cell, 73(3) 431-445 (1993). TNF 리간드는 3개의 TNFR1 사슬에 의해 결합된 삼합체로 존재한다. 3개의 TNFR1 사슬은 수용체-리간드 복합체에서 함께 밀접하게 클러스터링되어 있고, 이러한 클러스터링은 TNFR1에 의해 매개된 신호전달에 대해 필수적이다. 사실, TNFR1에 결합하는 다가 작용제, 예를들어 항-TNFR1 항체는 TNF의 부재하에서 TNFR1 클러스터링 및 신호전달을 유도할 수 있고, 통상적으로 TNFR1 효능제로 사용된다 (참조: Belka et al., EMBO, 14(6):1 156-1165 (1995); Mandik-Nayak et al., J. Immunol, 167:1920-1928 (2001). 따라서, TNFR1에 결합하는 다가 작용제는 일반적으로 이들이 TNFR1에 대한 TNFα의 결합을 차단하더라도 TNFR1의 효과적인 길항제는 아니다.
TNFR1의 세포외 영역은 막-근위 영역 (SEQ ID NO:603의 아미노산 168-182 (인간); SEQ ID NO:604의 아미노산 168-183 (마우스))에 후속하는 13개 아미노산의 아미노 말단 분절 (SEQ ID NO: 603의 아미노산 1-13 (인간); SEQ ID NO:604의 아미노산 1-13 (마우스)), 도메인 1 (SEQ ID NO:603의 아미노산 14-53 (인간); SEQ ID NO:604의 아미노산 14-53 (마우스)), 도메인 2 (SEQ ID NO:603의 아미노산 54-97 (인간); SEQ ID NO:604의 아미노산 54-97 (마우스)), 도메인 3 (SEQ ID NO: 603의 아미노산 98-138 (인간); SEQ ID NO:604의 아미노산 98-138 (마우스)), 및 도메인 4 (SEQ ID NO:603의 아미노산 139-167 (인간); SEQ ID NO:604의 아미노산 139-167 (마우스))을 포함한다 (참조: Banner et al., Cell 73(3) 431-445 (1993) and Loetscher et al., Cell 61(2) 351-359 (1990)). 도메인 2 및 3은 결합 리간드 (TNFβ, TNFα)와 접촉한다 (Banner et al., Cell, 73(3) 431-445 (1993)). TNFR1의 세포외 영역은 또한 예비-리간드 결합 어셈블리 도메인 또는 PLAD 도메인으로 언급되는 영역 (SEQ ID NO:603의 아미노산 1-53 (인간); SEQ ID NO:604의 아미노산 1-53 (마우스))을 함유한다 (The Government of the USA, WO 01/58953; Deng et al., Nature Medicine, doi: 10.1038/nm1304 (2005)).
TNFR1은 도메인 4 및 막-근위 영역 (SEQ ID NO:603의 아미노산 168-182; SEQ ID NO:604의 아미노산 168-183)에서 TNFR1이 단백질 분해되어 TNFR1의 가용성 형태를 생성하는 단계를 통해 생체내에서 세포의 표면으로부터 쉐딩(shedding)된다. 가용성 TNFR1은 TNFα에 결합하는 능력을 지니고, 이에의해 TNFα의 활성의 내인성 억제제로서 작용한다.
본 발명은 TNFR1에 결합하지만 TNFR1에 대한 결합에서 TNF와 경쟁하지 않는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 (예를들어, dAb) 또는 리간드에 관한 것이다. 예를들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편 (예를들어, dAb) 또는 리간드는 TNFR1의 도메인 1 또는 TNFR1의 도메인 4에 결합할 수 있다. 이러한 항체 또는 이의 항원 결합 단편 (예를들어, dAb) 또는 리간드는 진단제로서의 이점을 제공하고, 샘플에서 TNFR1에 결합하고, 이를 검출하거나 정량화하고 측정하기 위해 사용될 수 있으나, 이는 TNFR1에 대한 결합에서 샘플 내의 TNF와 경쟁하지 않을 것이다. 따라서, TNFR1이 샘플에 존재하는지의 여부 또는 샘플내에 TNFR1이 얼마나 많이 존재하는 지의 여부의 정확한 결정이 이루어질 수 있다. 몇몇 구체예에서, TNFR1에 결합하지만 TNFR1에 대한 결합에서 TNF와 경쟁하지 않는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 (예를들어, dAb) 또는 리간드는 본원에 기술된 바와 같이 TNFR1의 길항제이다.
본 발명은 또한 TNFR1에 결합하지만 TNFR1에 대한 결합에서 TNF와 경쟁하지 않는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 (예를들어, dAb) 또는 리간드 및 사용지침서 (예를들어, 샘플내의 TNFR1의 존재 및/또는 양을 결정하기 위한 사용지침서)를 포함하는, TNFR1이 샘플에 존재하는지의 여부 또는 샘플에 얼마나 많이 존재하는지의 여부를 결정하기 위한 진단 키트에 관한 것이다. 몇몇 구체예에서, 키트는 하나 이상의 보조 시약, 예를들어 적합한 완충용액 또는 적합한 검출 시약 (예를들어, TNFR1에 결합하지만 TNFR1에 대한 결합에서 TNF와 경쟁하지 않는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 (예를들어, dAb) 또는 리간드에 결합하는 검출가능하게 라벨링된 항체 또는 이의 항원 결합 단편)을 추가로 포함한다 .
본 발명은 또한 TNFR1에 결합하지만 TNFR1에 대한 결합에서 TNF와 경쟁하지 않는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 (예를들어, dAb) 또는 리간드가 고정되는 고형 표면을 포함하는 장치에 관한 것으로, 상기 고정된 항체 또는 이의 항원 결합 단편 (예를들어, dAb) 또는 리간드는 TNFR1와 결합한다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편 (예를들어, dAb) 또는 리간드가 고정될 수 있는 임의의 적합한 고형 표면, 예를들어 유리, 플라스틱, 탄수화물 (예를들어, 아가로오스 비드)가 사용될 수 있다. 요망되는 경우, 지지대는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 (예를들어, dAb) 또는 리간드를 고정시키는 것을 돕는 요망되는 작용기를 함유하거나, 이를 함유하도록 변형될 수 있다. 상기 장치 및/또는 지지대는, 예를들어 시트, 막대기, 스트립, 플레이트, 슬라이드, 비드, 펠렛, 디스크, 젤, 튜브, 구, 칩, 플레이트, 접시 등과 같이 임의의 적합한 외형일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 장치는 계량봉이다.
본 발명은 종양 괴사 인자 수용체 1 (TNFR1; p55; CD 120a)에 대해 결합 특이성을 지니는 TNFR1의 길항제 (예를들어, 본원에 기술된 리간드)에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 길항제는 종양 괴사 인자 2 (TNFR2)에 대해 결합 특이성을 지니지 않거나, TNFR2를 실질적으로 길항시키지 않는다. TNFR1의 길항제는 길항제 (1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 μM, 10 μM 또는 100 μM)가 표준 세포 분석에서 TNFα (100 pg/ml)에 의해 유도된 TNFR2 매개 활성의 약 5% 초과의 억제를 일으키지 않는 경우 TNFR2를 실질적으로 길항시키지 않는다. TNFR1의 특히 바람직한 길항제는 만성 염증 질병의 치료에 있어서 효과적인 치료제이다 (효능이 있다, 치료 효능을 지닌다). 예를들어, 몇몇 구체예에서, TNFR1의 길항제는 만성 염증 질병 모델, 예를들어 마우스의 콜라겐에 의해 유발된 관절염 모델, 마우스의 ΔARE 모델의 관절염, 마우스의 덱스트란 설페이트 나트륨에 의해 유발된 모델의 염증성 장질병, 마우스의 ΔARE 모델의 염증성 장질병, 마우스의 담배 연기 모델의 만성 폐쇄폐병 또는 적절한 영장류 모델 (예를들어, 영장류의 콜라겐에 의해 유발된 관절염)에 효과적이다.
TNFR1의 길항제는 1가 또는 다가일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 길항제는 1가이고, TNFR1과 상호작용하는 하나의 결합 부위를 포함한다. 1가 길항제는 하나의 TNFR1과 결합하고, 수용체의 활성화 및 신호전달을 일으킬 수 있는 세포 표면에서의 TNFR1의 가교 또는 클러스터링을 유도하지 않는다. 특정 구체예에서, TNFR1의 1가 길항제는 TNFR1의 도메인 1에 결합한다. 보다 특정 구체예에서, TNFR1의 1가 길항제는 TNFR1의 도메인 1에 결합하고, 마우스 TNFR1에 대한 결합에서 TAR2m-21-23과 경쟁하거나 인간 TNFR1에 대한 결합에서 TAR2h-205와 경쟁한다.
기타 구체예에서, TNFR1의 길항제는 다가이다. TNFR1의 다가 길항제는 TNFR1에 대한 특정 결합 부위의 2개 이상의 카피를 함유할 수 있거나, TNFR1에 결합하는 2개 이상의 상이한 결합 부위를 함유할 수 있다. 예를들어, 본원에 기술된 바와 같이 TNFR1의 길항제는 TNFR1에 결합하는 특정 dAb의 2개 이상의 카피, 또는 TNFR1에 결합하는 2개 이상의 상이한 dAb를 포함하는 이합체, 삼합체 또는 다합체일 수 있다. 바람직하게는, TNFR1의 다가 길항제는 표준 세포 분석에서 TNFR1 (TNFR1의 효능제로 작용하는)을 실질적으로 효능화시키지 않는다 (즉, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 μM, 10 μM, 100 μM, 1000 μM 또는 5,000 μM의 농도로 존재하는 경우, 표준 세포 분석에서 5%를 초과하지 않게 TNFα (100 pg/ml)에 의해 유도되는 TNFR1 매개 활성을 일으킨다).
특정 구체예에서, TNFR1의 다가 길항제는 TNFR1의 요망되는 에피토프 또는 도메인에 대해 2개 이상의 결합 부위를 함유한다. 예를들어, TNFR1의 다가 길항제는 TNFR1의 도메인 1 내의 동일한 에피토프에 결합하는 2개 이상의 결합 부위를 포함할 수 있다.
기타 구체예에서, TNFR1의 다가 길항제는 TNFR1의 상이한 에피토프 또는 도메인에 결합하는 2개 이상의 결합 부위를 함유한다. 한 예에서, TNFR1의 다가 길항제는 TNFR1의 도메인 1 내의 제 1 에피토프에 결합하는 제 1 결합 부위, 및 도메인 1 내의 제 2의 상이한 에피토프에 결합하는 제 2 결합 부위를 포함한다. 기타 예에서, TNFR1의 다가 길항제는 TNFR1의 2개 이상의 요망되는 에피토프 또는 도메인에 결합하는 결합 부위를 포함할 수 있다. 예를들어, TNFR1의 다가 길항제는 TNFR1의 도메인 1 및 2, 도메인 1 및 3, 도메인 1 및 4, 도메인 2 및 3, 도메인 2 및 4, 또는 도메인 3 및 4에 대한 결합 부위를 포함할 수 있다. 예를들어, TNFR1의 다가 길항제는 TNFR1의 도메인 1, 2 및 3에 대한 결합 부위, 도메인 1, 2 및 4에 대한 결합 부위, 또는 도메인 1, 3 및 4에 대한 결합 부위를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, TNFR1의 길항제는 TNFR1의 도메인 1에 결합하는 dAb, 및 TNFR1의 도메인 3에 결합하는 dAb를 포함하는 이중특이적 리간드이다. 바람직하게는, 이러한 다가 길항제는 본원에 기술된 표준 L929 세포독성 분석 또는 표준 HeLa IL-8 분석에서 약 1 nM, 또는 약 10 nM, 또는 약 100 nM, 또는 약 1 μM, 또는 약 10 μM의 농도로 존재하는 경우, TNFR1를 효능화시키지 않는다.
TNFR1의 몇몇 길항제는 TNFR1에 결합하고, TNFR1에 대한 TNFα의 결합을 억제한다. 특정 구체예에서, 이러한 TNFR1의 길항제는 TNFR1의 도메인 2 및/또는 도메인 3에 결합한다. 특정 구체예에서, 길항제는 TNFR1에 대한 결합에서 TAR2h-10-27, TAR2h-131-8, TAR2h-15-8, TAR2h-35-4, TAR2h-154-7, TAR2h-154-10 또는 TAR2h-185-25와 경쟁한다.
기타 리간드 (바람직한 구체예에서, TNFR1의 길항제인 리간드)는 TNFR1에 대한 TNFα의 결합을 억제하지 않는다. 이러한 리간드 (및 길항제)는 진단제로서의 이점을 제공하는데, 이는 이들이 샘플내의 TNFR1에 결합하여, 이를 검출하거나 정량화하거나 측정하는데 사용할 수 있고, TNFR1에 대한 결합에서 샘플 내의 TNF와 경쟁하지 않기 때문이다. 따라서, 샘플 내에 TNFR1이 존재하는지의 여부 또는 TNFR1가 얼마나 많이 존재하는지의 여부의 정확한 결정이 이루어질수 있다.
TNFR1의 몇몇 길항제는 TNFR1에 대한 TNFα의 결합을 억제하지 않지만, TNFR1을 통해 매개되는 신호전달을 억제한다. 예를들어, TNFR1의 길항제는 TNFR1을 통한 신호전달에 선행하는 TNFα에 의해 유발되는 TNFR1의 클러스트링을 억제할 수 있다. 이러한 길항제는 여러 이점을 제공한다. 예를들어, 상기 길항제의 존재하에서, TNFα는 세포 표면에 발현되는 TNFR1에 결합할 수 있고, 세포 환경으로부터 제거될 수 있으나, TNFR1 매개 신호전달은 활성화되지 않을 것이다. 따라서, TNFR1 신호에 의해 유발된 추가의 TNFα 및 염증의 기타 매개자의 생성이 억제될 것이다. 유사하게, TNFR1에 결합하고 TNFR1을 통해 매개된 신호전달을 억제하지만 TNFR1에 대한 TNFα의 결합을 억제하지 않는 TNFR1의 길항제는 내인적으로 생성된 가용성 TNFR1의 TNFα 결합 및 억제 활성을 억제하지 않을 것이다. 따라서, 이러한 길항제를 이를 필요로 하는 포유동물에 투여하는 것은 생체 내에서 TNFα의 활성 및 TNFR1의 활성을 억제하는 내성 조절 경로를 보충할 수 있다. 본 발명은 또한 (i) TNFR1 (예를들어, 도메인 1)에 결합하고, (ii) TNFR1 매개 신호전달의 활성화를 길항시키지 않고, (iii) TNFR1에 대한 TNFα의 결합을 억제하지 않는 리간드에 관한 것이다. 이러한 리간드는 가용성 TNFR1에 결합하고, TNFα로부터의 가용성 수용체 결합을 예방하지 않으므로, 이러한 길항제를 이를 필요로 하는 포유동물에 투여하는 것은 혈청 내의 가용성 수용체의 반감기를 증가시킴으로써 생체내 TNFα의 활성을 억제하는 내생 조절 경로를 보충할 수 있다. 이들 이점은, 예를들어 PEG기, 혈청 알부민, 트랜스페린, 트랜스페린 수용체 또는 최소한 이의 트랜스페린 결합 부분 및 항체 Fc 영역의 부착, 또는 항체 도메인으로의 컨쥬게이션에 의해 보다 큰 유체역학 크기를 지니도록 포맷화된 리간드와 특히 관련된다. 예를들어, (i) TNFR1 (예를들어, 도메인 1)에 결합하고, (ii) TNFR1 매개 신호전달의 활성화를 길항시키지 않고, (iii) TNFR1에 대한 TNFα의 결합을 억제하지 않는 작용제 (예를들어, 폴리펩티드), 예를들어 dAb 단량체는 항체의 보다 큰 항원 결합 단편 및/또는 항체로서 포맷화될 수 있다 (예를들어, Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, IgG, scFv로 포맷화됨). 리간드의 유체역학적 크기 및 이의 혈청 반감기는 또한 본원에 기술된 바와 같이(참조, 부록 1) 생체내 반감기를 증가시키는 항원 또는 에피토프에 결합하는 결합 도메인 (예를들어, 항체 또는 항체 단편)으로 TNFR1 결합 작용제를 컨쥬게이션시키거나 결합시킴으로써 증가될 수 있다. 예를들어, TNFR1 결합 작용제 (예를들어, 폴리펩티드)는 항-혈청 알부민 또는 항-신생아 Fc 수용체 항체 또는 항체 단편, 예를들어 항-SA 또는 항-신생아 Fc 수용체 dAb, Fab, Fab' 또는 scFv, 또는 항-SA 어피바디 또는 항-신생 Fc 수용체 어피바디에 컨쥬게이션되거나 결합될 수 있다.
본 발명에 따른 TNFR1-결합 리간드에 사용하기에 적합한 알부민, 알부민 단편 또는 알부민 변이체의 예는 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 WO 2005/077042A2에 기술되어 있다. 특히, 하기의 알부민, 알부민 단편 또는 알부민 변이체가 본 발명에 사용될 수 있다:
· SEQ ID NO:1 (WO 2005/077042A2에 기술됨, 이 서열은 참조로서 본원에 명백히 포함되어 있음);
· WO 2005/077042A2 내의 SEQ ID NO:1의 아미노산 1-387을 포함하거나 이로 구성된 알부민 단편 또는 변이체;
· 하기의 (a) 내지 (l)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산을 포함하는 알부민 또는 이의 단편 또는 변이체: (a) WO 2005/077042A2의 SEQ ID NO:1의 아미노산 54 내지 61; (b) WO 2005/077042A2의 SEQ ID NO:1의 아미노산 76 내지 89; (c) WO 2005/077042A2의 SEQ ID NO:1의 아미노산 92 내지 100; (d) WO 2005/077042A2의 SEQ ID NO:1의 아미노산 170 내지 176; (e) WO 2005/077042A2의 SEQ ID NO:1의 아미노산 247 내지 252; (f) WO 2005/077042A2의 SEQ ID NO:1의 아미노산 266 내지 277; (g) WO 2005/077042A2의 SEQ ID NO:1의 아미노산 280 내지 288; (h) WO 2005/077042A2의 SEQ ID NO:1의 아미노산 362 내지 368; (i) WO 2005/077042A2의 SEQ ID NO:1의 아미노산 439 내지 447; (j) WO 2005/077042A2의 SEQ ID NO:1의 아미노산 462 내지 475; (k) WO 2005/077042A2의 SEQ ID NO:1의 아미노산 478 내지 486; 및 (l) WO 2005/077042A2의 SEQ ID NO:1의 아미노산 560 내지 566.
본 발명에 따른 TNFR1 결합 리간드에 사용하기에 적합한 알부민, 및 이의 단편 및 유사체의 추가의 예는 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 WO 03/076567 A2에 기술되어 있다. 특히, 하기의 알부민, 또는 이의 단편 또는 변이체가 본 발명에 사용될 수 있다:
· WO 03/076567A2, 예를들어 도 3에 기술된 인간 혈청 알부민 (이 서열 정보는 참조로서 본원에 명백히 포함되어 있음);
· 66,500의 화학식 분자량을 지니는 585개의 아미노산의 단일한 글리코실화되지 않은 폴리펩티드 사슬로 구성된 인간 혈청 알부민 (HA) (참조: Meloun, et al., FEBS Letters 58:136 (1975); Behrens, et al., Fed. Proc. 34:591 (1975); Lawn, et al., Nucleic Acids Research 9:6102-6114 (1981); Minghetti, et al., J. Biol Chem. 261:6747 (1986));
· 문헌[Weitkamp, et al., Ann. Hum. Genet. 37:219 (1973)]에 기술된 알부민의 다형 변이체 또는 유사체 또는 단편;
· EP 322094에 기술된 알부민 단편 또는 변이체, 예를들어 HA(1-373), HA(1-388), HA(1-389), HA(1-369) 및 HA(1-419) 및 1-369와 1-419 사이의 단편;
· EP 399666에 기술된 알부민 단편 또는 변이체, 예를들어 HA(1-177) 및 HA(1-200) 및 HA(1-X) 사이의 단편, 여기서 X는 178 내지 199중 임의의 수임.
(하나 이상의) 반감기 연장 부분 (예를들어, 알부민, 트랜스페린 및 이들의 단편 및 유사체)이 본 발명의 TNFR1 결합 리간드에 사용되는 경우, 이는 임의의 적절한 방법, 예를들어 TNFR1 결합 부분 (예를들어, 항-TNFR1 dAb 또는 항체 단편)으로의 직접 융합, 또는 융합 단백질을 엔코딩하는 단일 누클레오티드 작제물을 이용함으로써 컨쥬게이션될 수 있고, 여기서 융합 단백질은 TNFR1 결합 부분에 N-말단 또는 C-말단으로 위치된 반감기 연장 부분을 지닌 단일 폴리펩티드 사슬로서 엔코딩된다. 대안적으로, 컨쥬게이션은 부분들 사이의 펩티드 링커, 예를들어 WO 03/076567 A2 또는 WO 2004/003019에 기술된 펩티드 링커를 이용함으로써 달성될 수 있다 (상기 링커는 본 발명에 사용하기 위한 예를 제공하기 위해 본원에 참조로서 포함되어 있다).
더욱 특정한 구체예에서, TNFR1에 결합하고 TNFR1을 통해 매개되는 신호전달을 억제하지만, TNFR1에 대한 TNFα의 결합을 억제하지 않는 TNFR1의 길항제는 TNFR1의 도메인 1 또는 TNFR1의 도메인 4에 결합한다. 특정 구체예에서, TNFR1의 이러한 길항제는 TNFR1의 도메인 1 또는 TNFR1의 도메인 4에 결합하는 dAb 단량체 또는 리간드이다.
한 특정 구체예에서, TNFR1의 길항제 (예를들어, dAb 단량체 또는 리간드)는 TNFR1의 도메인 1에 결합하고, TNFα의 결합시 TNFR1을 통해 매개되는 신호전달을 억제한다. 이러한 길항제는 TNFR1을 통한 신호전달을 억제할 수 있으나, TNFR1에 대한 TNFα의 결합 및/또는 가용성 TNFR1을 생성시키기 위한 TNFR1의 쉐딩을 억제하지 않는다. 따라서, 이러한 길항제를 이를 필요로 하는 포유동물에 투여하는 것은 생체내에서 TNFα의 활성 및 TNFR1의 활성을 억제하는 내생 조절 경로를 보충할 수 있다.
TNFR1의 기타 길항제는 TNFR1에 결합하지만, 도메인 4에는 결합하지 않는다. 이러한 길항제는 TNFR1의 기능을 억제하지만, 가용성 TNFR1의 쉐딩을 억제하지 않는다. 따라서, 이러한 길항제를 이를 필요로 하는 포유동물에 투여하는 것은 생체내에서 TNFα의 활성 및 TNFR1의 활성을 억제하는 내생 조절 경로를 보충할 수 있다.
특정 구체예에서, 길항제 (예를들어, 화학적 화합물, 신규한 화학적 존재물, dAb 단량체, 리간드)는 TNFR1의 도메인 1에 결합하고, 마우스 TNFR1에 대한 결합에서 TAR2m-21-23과 경쟁하거나 인간 TNFR1에 대한 결합에서 TAR2h-205와 경쟁한다. 기타 구체예에서, 길항제 (예를들어, 화학적 화합물, 신규한 화학적 존재물, dAb 단량체, 리간드)는 TNFR1의 도메인 2 또는 도메인 4에 결합한다. 기타 구체예에서, 길항제 (예를들어, 화학적 화합물, 신규한 화학적 존재물, dAb 단량체, 리간드)는 TNFR1의 도메인 3에 결합하고, TNFR1 (예를들어, 인간 및/또는 마우스 TNFR1)에 대한 결합에서 TAR2h-131-8, TAR2h-15-8, TAR2h-35-4, TAR2h-154-7, TAR2h-154-10, TAR2h-185-25 또는 TAR2h-27-10과 경쟁한다.
몇몇 리간드 (바람직한 구체예에서, TNFR1의 길항제인 리간드)는 인간 TNFR1 및 마우스 TNFR1에 결합한다. 이러한 리간드 (예를들어, 길항제 dAb 단량체)는 동일한 리간드를 이용한 전임상 및 임상 연구를 가능케 하고, 적합한 대리 리간드를 이용한 전임상 연구를 수행할 필요를 회피하는 이점을 제공한다.
기타 구체예에서, 길항제 또는 리간드는 TNFR1에 대한 결합 특이성을 지니는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예를들어 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편 또는 Fv 단편 (예를들어, scFV)이다. 기타 구체예에서, 길항제 또는 리간드는 1가, 예를들어 dAb 또는 항체의 1가 항원 결합 단편, 예를들어 Fab 단편, Fab' 단편 또는 Fv 단편이다.
본원을 통해 기술된 본원의 기타 구체예에서, 본 발명의 길항제 또는 리간드에서 "dAb"를 사용하는 것 대신, 당업자는 TNFR1에 결합하는 dAb의 CDR을 포함하는 도메인 (예를들어, CDR이 적합한 단백질 스캐폴드 또는 골격, 예를들어 어피바디, SpA 스캐폴드, LDL 수용체 부류 A 도메인 또는 EGF 도메인에 이식된 것)을 사용할 수 있거나, TNFR1에 대한 결합 부위를 포함하는 단백질 도메인을 사용할 수 있다는 것이 고려되고, 여기서 도메인은 어피바디, SpA 도메인, LDL 수용체 부류 A 도메인 또는 EGF 도메인으로부터 선택된다. 따라서, 전체적인 기술은 길항제, 리간드 및 dAb 대신 상기 도메인을 사용하는 방법의 기술을 제공하는 것으로 해석되어진다.
바람직하게는, TNFR1의 길항제는 본원에 기술된 리간드이다. 상기 리간드는 TNFR1에 대한 결합 특이성 또는 적합한 포맷의 상기 dAb의 상보성 결정 영역을 지니는 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 도메인 항체 (dAb)를 포함한다. 리간드는 dAb로 구성되거나, dAb를 필수 성분으로 포함하는 폴리펩티드일 수 있다. 리간드는 또한 적합한 포맷, 예를들어 항체 포맷 (예를들어, IgG-유사 포맷, scFv, Fab, Fab', F(ab')2)의 dAb (또는 dAb의 CDR)을 포함하는 폴리펩티드, TNFR1에 결합하는 dAb 및 또 다른 단백질, 항원 또는 에피토프 (예를들어, 혈청 알부민)에 결합하는 제 2 dAb를 포함하는 이중 특이적 리간드, 또는 본원에 기술된 바와 같은 다중특이적 리간드일 수 있다.
본 발명의 임의의 양태에 따른 리간드를 포함하는 TNFR1의 길항제 뿐만 아니라 상기 리간드를 작제하는데 유용한 dAb 리간드는 유리하게는 표면 플라즈몬 공명을 측정시 300 nM 내지 5 pM (즉, 3 x 10-7 내지 5 x 10-12M), 바람직하게는 50 nM 내지 20 pM, 또는 5 nM 내지 200 pM 또는 1 nM 내지 100 pM, 1 x 10-7 M 이하, 1 x 10-8 M 이하, 1 x 10-9 M 이하, 1 x 10-10 M 이하, 1 x 10-11 M 이하의 Kd; 5 x 10-1 s-1 내지 1 x 10-7 s-1, 바람직하게는 1 x 10-2 s-1 내지 1 x 10-6 s-1, 또는 5 x 10-3 s-1 내지 1 x 10-5 s-1, 또는 5 x 10-1 s-1 이하, 또는 1 x 10-2 s-1 이하, 또는 1 x 10-3 s-1 이하, 또는 1 x 10-4 s-1 이하, 또는 1 x 10-5 s-1 이하, 또는 1 x 10-6 s-1 이하의 Koff 속도 상수로 이의 동족 표적(들)로부터 해리될 수 있다. Kd 속도 상수는 Koff/Kon로 정의된다.
기타 구체예에서, 길항제는 TNFR1에 결합하고, TNFR1의 (하나 이상의) 기능 (예를들어, 수용체 클러스터링, 수용체 신호전달 또는 TNFR1에 대한 TNFα의 결합)을 억제하고, 또한 TNF 수용체 상과의 또 다른 일원에 결합한다. 바람직하게는, 이러한 유형의 길항제는 또한 TNF 수용체 상과의 기타 일원의 기능 (예를들어, 일원 클러스터링, 신호전달 또는 길항제의 동족 리간드에 대한 일원의 결합)을 억제한다. TNF 수용체 상과는 TNFR1 (p55, CD 120a, p60, TNF 수용체 상과 일원 1A, TNFRSF1A), TNFR2 (p75, ρ80, CD120b, TNF 수용체 상과 일원 1B, TNFRSF1B), CD18 (TNFRSF3, LTBR, TNFR2-RP, TNFR-RP, TNFCR, TNF-R-III), OX40 (TNFRSF4, ACT35, TXGP1L), CD40 (TNFRSF5, p50, Bp50), Fas (CD95, TNFRSF6, APO-1, APTI), DcR3 (TNFRSF6B), CD27 (TNFRSF7, Tp55, S152), CD30 (TNFRSF8, Ki-1, D1S166E), CD137 (TNFRSF9, 4-1BB, ILA), TRAILR-I (TNFRSF1OA, DR4, Apo2), TRAIL-R2 (TNFRSF1OB, DR5, KILLER, TRICK2A, TRICKB), TRAILR3 (TNFRSF1OC, DcR1, LIT, TRID), TRAILR4 (TNFRSF1OD, DcR2, TRUNDD), RANK (TNFRSF11A), OPG (TNFRSF11B, OCIF, TR1), DR3 (TNFRSF12, TRAMP, WSL-1, LARD, WSL-LR, DDR3, TR3, APO-3), DR3L (TNFRSF12L), TAC1 (TNFRSF13B), BAFFR (TNFRSF13C), HVEM (TNFRSF14, ATAR, TR2, LIGHTR, HVEA), NGFR (TNFRSF16), BCMA (TNFRSF17, BCM), AITR (TNFRSF18, GITR), TNFRSF19, FLJ14993 (TNFRSF19L, RELT), DR6 (TNFRSF21), SOBa (TNFRSF22, Tnfrh2, 2810028K06Rik), mSOB (THFRSF23, Tnfrh1)을 포함하는 당업계에 인지된 그룹의 단백질이다. 몇몇 구체예에서, 길항제는 TNFR1에 결합하고 TNFR1의 기능을 억제하는 제 1 dAb, 및 TNF 수용체 상과의 또 다른 일원, 예를들어 상기 나열된 TNFR2 (CD 120b), OX40, CD40, Fas (CD95), TRAILR-1, TRAILR-2, TAC1, BCMA 등에 결합하는 제 2 dAb를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 길항제는 TNFR1에 결합하고 TNFR1의 기능 (예를들어, 수용체 클러스터링, 수용체 신호전달 또는 TNFR1에 대한 TNFα의 결합)을 억제하고, 또한 TNF 수용체 상과의 또 다른 일원, 예를들어 상기 나열된 TNFR2 (CD120b), OX40, CD40, Fas (CD95), TRAILR-1, TRAILR-2, TAC1, BCMA 등에 결합하는 dAb 단량체를 포함한다.
TNFR1에 결합하는 리간드 및 dAb 단량체
본 발명은 표면 플라즈몬 공명으로 측정시 300 nM 내지 5 pM (즉, 3 x 10-7 내지 5 x 10-12M), 바람직하게는 50 nM 내지 20 pM, 더욱 바람직하게는 5 nM 내지 200 pM, 가장 바람직하게는 1 nM 내지 100 pM, 예를들어 1 x 10-7 M 이하, 바람직하게는 1 x 10-8 M 이하, 더욱 바람직하게는 1 x 10-9 M 이하, 유리하게는 1 x 10-10 M 이하, 가장 바람직하게는1 x 10-11 M 이하의 Kd; 및/또는 5 x 10-1 s-1 내지 1 x 10-7 s-1, 바람직하게는 1 x 10-2 s-1 내지 1 x 10-6 s-1, 더욱 바람직하게는 5 x 10-3 s-1 내지 1 x 10-5 s-1, 예를들어 5 X lO-1 s-1 이하, 바람직하게는 1 x 10-2 s-1 이하, 유리하게는 1 x 10-3 s-1 이하, 더욱 바람직하게는 1 x 10-4 s-1 이하, 더욱 더 바람직하게는 1 x 10-5 s-1 이하, 가장 바람직하게는 1 x 10-6 s-1 이하의 Koff 속도 상수로 TNF 수용체 Ⅰ에 결합하는 항-TNFR1 dAb 단량체 (예를들어, 상기 dAb를 포함하는 이중특이적 리간드)를 포함하는 리간드를 제공한다.
바람직하게는, 리간드 또는 dAb 단량체는 500 nM 내지 50 pM, 바람직하게는 100 nM 내지 50 pM, 더욱 바람직하게는 10 nM 내지 100 pM, 유리하게는 1 nM 내지 100 pM; 예를들어 50 nM 이하, 바람직하게는 5 nM 이하, 더욱 바람직하게는 500 pM 이하, 유리하게는 200 pM 이하, 가장 바람직하게는 100 pM 이하의 억제 농도 50 (IC50)으로 TNF 알파 수용체 I (p55 수용체)에 대한 TNF의 결합을 억제한다. 바람직하게는, TNF 수용체 I의 표적은 인간 TNFα이다.
바람직하게는, 리간드 또는 dAb는 인간 TNFR1에 결합하고, 인간 TNFR1에 대한 TNF 알파의 결합을 억제하거나, TNF 알파 결합에 대한 반응에서 TNFR1을 통한 신호전달을 억제한다. 예를들어, 특정 구체예에서, 리간드 또는 dAb 단량체는 TNFR1에 결합할 수 있고, TNFR1 매개 신호전달을 억제할 수 있으나, TNFR1에 대한 TNFα의 결합을 실질적으로 억제하지 않는다. 몇몇 구체예에서, 리간드 또는 dAb 단량체는 세포 표면에서 TNFα에 의해 유발된 TNFR1의 가교 또는 클러스터링을 억제한다. 이러한 리간드 또는 dAb (예를들어, 본원에 기술된 TAR2m-21-23)가 유리한데, 이는 이들이 세포 표면 TNFR1을 길항시킬 수 있으나 내인성의 가용성 TNFR1의 억제 활성을 실질적으로 감소시키지 않기 때문이다. 예를들어, 리간드 또는 dAb는 TNFR1에 결합할 수 있으나, 수용체 결합 분석에서 약 10% 이하, 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하, 약 1%이하로 TNFR1에 대한 TNFα의 결합을 억제한다. 또한, 이들 구체예에서, 리간드 또는 dAb는 표준 세포 분석에서 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 99% 이상으로 TNFα에 의해 유발된 TNFR1의 가교 및/또는 TNFR1에 의해 유발된 신호전달을 억제한다.
리간드는 본원에 기술된 바와 같이 1가 (예를들어, dAb 단량체)이거나 다가 (예를들어, 이중특이적, 다중특이적)일 수 있다. 특정 구체예에서, 리간드는 TNFR1의 도메인 1에 결합하는 dAb 단량체이다. TNFR1의 도메인 1에 결합하는 도메인 항체 단량체는 기타 결합 포맷, 예를들어 모노클로날 항체에 비해 작은 풋프린트(footprint)를 지닌다. 따라서, 이러한 dAb 단량체는 도메인 1을 선택적으로 차단하지만, TNFR1의 기타 도메인의 작용을 간섭하지 않는다. 예를들어, TNFR1의 도메인 1에 결합하는 dAb 단량체는 TNFR1을 길항시킬 수 있으나, TNFR1에 대한 TNFα의 결합 또는 TNFR1의 쉐딩을 억제하지 않는다.
더욱 특정한 구체예에서, 리간드는 TNFR1의 도메인 1에 결합하는 dAb 단량체이고, 마우스 TNFR1에 대한 결합에서 TAR2m-21-23과 경쟁하거나 인간 TNFR1에 대한 결합에서 TAR2h-205와 경쟁한다.
기타 구체예에서, 리간드는 다가이고, TNFR1에 결합하는 2개 이상의 dAb 단량체를 포함한다. 다가 리간드는 TNFR1에 결합하는 특정 dAb의 2개 이상의 카피를 함유하거나 TNFR1에 결합하는 2개 이상의 dAb를 함유할 수 있다. 예를들어, 본원에 기술된 바와 같이, 리간드는 TNFR1에 결합하는 특정 dAb의 2개 이상의 카피 또는 TNFR1에 결합하는 2개 이상의 상이한 dAb를 포함하는 이합체, 삼합체 또는 다합체일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 리간드는 각각 TNFR1에 결합하는 특정 dAb의 2개 또는 3개의 카피를 포함하는 동종이합체 또는 동종삼합체이다. 바람직하게는, 다가 리간드는 표준 세포 분석에서 (TNFR1의 효능제로 작용하는) TNFR1을 실질적으로 효능화시키지 않는다 (즉, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 μM, 10 μM, 100 μM, 1000 μM 또는 5,000 μM의 농도로 존재하는 경우, 표준 세포 분석에서 5%를 초과하지 않는 TNFα (100 pg/ml)에 의해 유도된 TNFR1 매개 활성을 일으킨다).
특정 구체예에서, 다가 리간드는 TNFR1의 요망되는 에피토프 또는 도메인에 결합하는 2개 이상의 dAb를 함유한다. 예를들어, 다가 리간드는 TNFR1의 도메인 1 내의 요망되는 에피토프에 결합하는 dAb의 2개 이상의 카피를 포함할 수 있다.
기타 구체예에서, 다가 리간드는 TNFR1의 상이한 에피토프 또는 도메인에 결합하는 2개 이상의 dAb를 함유한다. 한 예에서, 다가 리간드는 TNFR1의 도메인 1 내의 제 1 에피토프에 결합하는 제 1 dAb, 및 TNFR1의 도메인 1 내의 제 2의 상이한 에피토프에 결합하는 제 2 dAb를 포함한다. 기타 예에서, 다가 리간드는 TNFR1의 2개 이상의 요망되는 에피토프 또는 도메인에 결합하는 dAb를 포함한다. 예를들어, 다가 리간드는 TNFR1의 도메인 1 및 2, 도메인 1 및 3, 도메인 1 및 4, 도메인 2 및 3, 도메인 2 및 4, 또는 도메인 3 및 4에 결합하는 dAb를 포함할 수 있다.
특정 구체예에서, 다가 리간드는 TNFR1의 도메인 1에 결합하는 dAb, 및 TNFR1의 도메인 3에 결합하는 dAb를 포함하는 이중특이적 리간드이다. 이러한 유형의 리간드는 높은 결합성으로 TNFR1에 결합할 수 있고, 기타 리간드 포맷, 예를들어 dAb 단량체 보다 높은 밀도로 세포 표면에서 TNFR1을 과발현하거나 TNFR1을 발현하는 세포로의 결합에 대해 보다 선택적이다.
기타 특정 구체예에서, 다가 리간드는 TNFR1의 도메인 1에 결합하는 2개 이상의 dAb, 또는 특정 dAb의 2개 이상의 카피를 포함한다. 이러한 유형의 다가 리간드는 낮은 결합성으로 TNFR1 단량체에 결합할 수 있으나, 높은 결합성으로 수용체 다합체 (예를들어, 수용체 리간드 복합체에서 발견되는 삼합체)에 결합한다. 따라서, 이러한 포맷의 리간드는 서로 클러스터링되거나 회합되는 수용체 및/또는 TNFR1 매개 신호전달에 요구되는 리간드 (예를들어, TNFα)로 효과적으로 투여될 수 있다.
몇몇 리간드 또는 dAb 단량체는 TNFR1에 결합하고, TNFR1에 대한 TNFα의 결합을 억제한다. 특정 구체예에서, 이러한 리간드 또는 dAb 단량체는 TNFR1의 도메인 2 및/또는 도메인 3에 결합한다. 특정 구체예에서, 리간드 또는 dAb 단량체는 TNFR1의 도메인 3에 결합한다. 더욱 특정한 구체예에서, 리간드 또는 dAb 단량체는 TNFR1의 도메인 3에 결합하고, TNFR1에 대한 결합에서 TAR2h-10-27, TAR2h-131-8, TAR2h-15-8, TAR2h-35-4, TAR2h-154-7, TAR2h-154-10 또는 TAR2h-185-25와 경쟁한다.
기타 리간드 또는 dAb 단량체는 TNFR1에 대한 TNFα의 결합을 억제하지 않는다. 이러한 길항제는 진단제로서 이점을 제공하는데, 이는 이들이 샘플 내의 TNFR1에 결합하여, 이를 검출하거나, 정량화하거나 측정하는데 사용될 수 있고, TNFR1에 대한 결합에서 샘플내의 TNF와 경쟁하지 않기 때문이다. 따라서, 샘플 내에 TNFR1이 존재하는지의 여부 또는 TNFR1이 얼마나 많이 존재하는지의 여부의 정확한 결정이 이루어질 수 있다.
몇몇 리간드 및 dAb 단량체는 TNFR1에 대한 TNFα의 결합을 억제하지 않지만, TNFR1을 통해 매개되는 신호전달을 억제한다. 예를들어, 리간드 또는 dAb 단량체는 TNFR1를 통한 신호전달에 선행하는 TNFα에 의해 유발된 TNFR1의 클러스터링을 억제할 수 있다. 이러한 리간드 또는 dAb 단량체는 상기 특성들을 지니는 길항제에 대해 본원에 논의된 바와 같이 여러 장점을 제공한다. 특정 구체예에서, 이러한 유형의 리간드 또는 dAb 단량체는 TNFR1의 도메인 1 또는 TNFR1의 도메인 4에 결합한다. 특정 구체예에서, 리간드는 TNFR1의 도메인 1 또는 TNFR1의 도메인 4에 결합하는 dAb 단량체이다.
특정 구체예에서, 리간드 또는 dAb 단량체는 TNFR1의 도메인 1에 결합하고, TNFα의 결합시 TNFR1을 통해 매개되는 신호전달을 억제한다. 이러한 리간드 또는 dAb 단량제는 TNFR1을 통한 신호전달을 억제할 수 있으나, TNFR1에 대한 TNFα 결합 및/또는 가용성 TNFR1을 생성시키기 위한 TNFR1의 쉐딩을 억제하지 않는다. 따라서, 이러한 리간드 또는 dAb 단량체를 이를 필요로 하는 포유동물에 투여하는 것은 생체내에서 dAb의 활성 및 TNFR1의 활성을 억제하는 내생 조절 경로를 보충할 수 있다.
기타 리간드 또는 dAb 단량체는 TNFR1에 결합하지만, 도메인 4에 결합하지 않는다. 이러한 리간드 또는 dAb 단량체는 TNFR1의 기능을 억제하지만, 가용성 TNFR1의 쉐딩을 억제하지 않는다. 따라서, 이러한 길항제를 이를 필요로 하는 포유동물에 투여하는 것은 생체내에서 TNFα의 활성 및 TNFR1의 활성을 억제하는 내생 조절 경로를 보충할 수 있다.
바람직하게는, 리간드 또는 dAb 단량체는 표준 분석 (예를들어, 본원에 기술된 표준 L929 또는 표준 HeLa IL-8 분석)에서 500 nM 내지 50 pM, 바람직하게는 100 nM 내지 50 pM, 더욱 바람직하게는 10 nM 내지 100 pM, 유리하게는 1 nM 내지 100 pM; 예를들어 50 nM 이하, 바람직하게는 5 nM 이하, 더욱 바람직하게는 500 pM 이하, 유리하게는 200 pM 이하, 가장 바람직하게는 100 pM 이하의 중화 용량 50 (ND50)으로 TNFα 또는 TNFR1을 중화 (이의 활성을 억제)시킨다.
특정 구체예에서, 리간드 또는 dAb 단량체는 인간 종양 괴사 인자 수용체 1 (TNFRI; p55)에 특이적으로 결합하고, 표면 플라즈몬 공명으로 측정시 50 nM 내지 20 pM의 해리 상수(Kd), 및 5XlO-1 s-1 내지 1xIO-7 s-1의 Koff 속도 상수로 인간 TNFR1로부터 해리된다.
기타 구체예에서, 리간드 또는 dAb 단량체는 본원에 기술된 Kd로 TNFR1에 특이적으로 결합하고, 표준 마우스 LPS/D-갈락토사민에 의해 유발된 패혈 쇼크 모델에서 치사성을 억제한다 (즉, 적절한 대조군에 비해 약 10% 이상으로 치사를 예방하거나 치사성을 감소시킴). 바람직하게는, dAb 단량체는 약 5 mg/kg, 더욱 바람직하게는 약 1 mg/kg으로 투여되는 경우 표준 마우스 LPS/D-갈락토사민에 의해 유발된 패혈 쇼크 모델에서 적절한 대조군에 비해 약 25% 이상 또는 약 50% 이상으로 치사를 억제한다.
기타 구체예에서, 리간드 또는 dAb 단량체는 TNFR1에 결합하고, 표준 세포 분석에서 ≤100 nM의 ND50으로 TNFR1의 활성을 길항시키고, 표준 세포 분석에서 ≤10μM의 농도에서 dAb는 TNFR1의 활성을 효능화시킨다.
특정 구체예에서, 리간드 또는 dAb 단량체는 표준 세포 분석에서 TNFR1의 효능제로 작용하는) TNFR1를 실질적으로 효능화시키지 않는다 (즉, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 μM, 10 μM, 100 μM, 1000 μM 또는 5,000 μM의 농도로 존재하는 경우, 표준 세포 분석에서 5%를 초과하지 않게 TNFα (100 pg/ml)에 의해 유도되는 TNFR1 매개 활성을 일으킨다).
특정 구체예에서, 리간드 또는 dAb 단량체는 실질적으로 응집에 대해 내성이다. 예를들어, 몇몇 구체예에서, 약물 제조에 통상적으로 사용되는 용매, 예를들어 염수, 완충 염수, 시트레이트 완충 염수, 물, 에멀젼 및 FDA에 의해 승인된 허용되는 부형제를 지닌 임의의 상기 용매중에 1-5 mg/ml, 5-10 mg/ml, 10-20 mg/ml, 20-50 mg/ml, 50-100 mg/ml, 100-200 mg/ml 또는 200-500 mg/ml의 리간드 또는 dAb의 용액이, 예를들어 10분, 1시간, 8시간, 24 시간, 2일, 3일, 4일, 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 6개월, 1년 또는 2년의 기간 동안 22℃, 22-25℃, 25-30℃ 30-37℃, 37-40℃, 40-50℃, 50-60℃, 60-70℃, 70-80℃, 15-2O℃, 10-15℃, 5-1O℃, 2-5℃, 0-2℃, -1O℃ 내지 O℃, -2O℃ 내지 -1O℃, -4O℃ 내지 -2O℃, -6O℃ 내지 -4O℃ 또는 -8O℃ 내지 -6O℃에서 유지되는 경우에, 약 10% 이하, 약 9% 이하, 약 8% 이하, 약 7% 이하, 약 6% 이하, 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하 또는 약 1% 이하의 리간드 또는 dAb 단량체가 응집된다.
응집은 임의의 적절한 방법, 예를들어 현미경, 시각적 관찰 또는 분광학에 의한 용액의 혼탁도 측정, 또는 임의의 적절한 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 바람직하게는, 응집은 동적광산란법으로 측정된다. 응집에 대해 내성인 리간드 또는 dAb 단량체는 여러 이점을 제공한다. 예를들어, 이러한 리간드 또는 dAb 단량체는 적절한 생물학적 생성 시스템, 예를들어 대장균(E. coli)을 이용한 발현에 의해 가용성 단백질로서 높은 수율로 용이하게 생성될 수 있고, 보다 적은 응집성 및 적은 활성 손실로 통상적인 폴리펩티드 보다 높은 농도로 포뮬레이팅되고/되거나 저장될 수 있다.
또한, 응집에 내성인 리간드 또는 dAb 단량체는 기타 항원 결합 폴리펩티드 또는 에피토프 결합 폴리펩티드 (예를들어, 통상적인 항체) 보다 경제적으로 생성될 수 있다. 예를들어, 일반적으로, 생체내 적용을 위한 항원 결합 폴리펩티드 또는 에피토프 결합 폴리펩티드의 제조는 응집된 폴리펩티드를 제거하는 과정 (예를들어, 젤 여과)을 포함한다. 이러한 응집물 제거의 불이행은 생체내 적용에 적합하지 않은 제조물을 생성시킬 수 있는데, 이는 예를들어 길항제로 작용시키기 위한 항원 결합 폴리펩티드의 응집물이 표적 항원의 가교 또는 클러스터링을 유도시킴으로써 효능제로 작용할 수 있기 때문이다. 단백질 응집물은 또한 이들이 투여되는 피검체에서 면역 반응을 유도함으로써 치료 폴리펩티드의 효능을 감소시킬 수 있다.
대조적으로, 본 발명의 응집 내성 리간드 또는 dAb 단량체는 응집물을 제거하는 공정 단계를 포함하지 않고 생체내 적용을 위해 제조될 수 있고, 폴리펩티드 응집에 의해 야기되는 상술한 불이익 없이 생체내에 적용될 수 있다.
몇몇 구체예에서, 리간드 또는 dAb 단량체는 온도 (Ts)로 가열되고 온도 (Tc)로 냉각되는 경우 가역적으로 언폴딩되고, 여기서 Ts는 dAb의 용융 온도 (Tm)를 초과하는 온도이고, Tc는 dAb의 용융 온도 미만의 온도이다. 예를들어, dAb 단량체는 80℃로 가열되고, 대략 실온으로 냉각되는 경우 가역적으로 언폴딩된다. 가역적으로 언폴딩된 폴리펩티드는 기능을 상실하나, 재폴딩되는 경우 기능을 회복한다. 이러한 폴리펩티드는 언폴딩되거나 부적절하게 재폴딩 (잘못 폴딩된 폴리펩티드)되는 경우 응집되는 폴리펩티드 (즉, 기능을 회복하지 않음)와는 구별된다.
폴리펩티드 언폴딩 및 재폴딩은, 예를들어 임의의 적절한 방법을 이용하여 폴리펩티드 구조를 직접적 또는 간접적으로 검출함으로써 측정될 수 있다. 예를들어, 폴리펩티드 구조는 원형 광이색성 (CD) (예를들어, 파(far)-UV CD, 니어(near)-UV CD), 형광 (예를들어, 트립토판 측쇄의 형광), 단백질 분해에 대한 민감성, 핵자기공명(NMR)에 의하거나, 적당한 폴딩 (예를들어, 표적 리간드에 대한 결합, 일반 리간드에 대한 결합)에 따른 폴리펩티드 기능을 검출하거나 측정함으로써 검출될 수 있다. 한 구체예에서, 폴리펩티드 언폴딩은 결합 기능 (예를들어, 일반 및/또는 표적 리간드 결합, 기질 결합)의 손실이 폴리펩티드가 언폴딩됨을 나타내는 기능 분석을 이용함으로써 측정된다.
리간드 또는 dAb 단량체의 언폴딩 및 재폴딩 범위는 언폴딩 또는 변성 곡선을 이용하여 결정될 수 있다. 언폴딩 곡선은 세로좌표로서 온도 및 가로좌표로서 폴딩된 폴리펩티드의 상대 농도를 작도함으로써 생성될 수 있다. 폴딩된 리간드 또는 dAb 단량체의 상대 농도는 임의의 적합한 방법 (예를들어, CD, 형광, 결합 분석)을 이용하여 직접 또는 간접적으로 결정될 수 있다. 예를들어, 리간드 또는 dAb 단량체 용액이 제조될 수 있고, 상기 용액의 타원율은 CD에 의해 결정된다. 수득된 타원율 값은 100%의 폴딩된 리간드 또는 dAb 단량체의 상대 농도를 나타낸다. 이후, 용액 내의 리간드 또는 dAb 단량체는 용액의 증진적인 온도 상승에 의해 언폴딩되고, 타원율은 적합한 증가량 (예를들어, 각각 1℃의 온도증가 후)에서 결정된다. 이후, 용액 내의 리간드 또는 dAb 단량체는 용액의 증진적인 온도 감소에 의해 재폴딩되고, 타원율은 적합한 증가량에서 결정된다. 데이터는 작도되어 언폴딩 곡선 및 재폴딩 곡선이 생성될 수 있다. 언폴딩 및 재폴딩 곡선은 리간드 또는 dAb 단량체 분자가 폴딩되는 부분, 리간드 또는 dAb 단량체 분자가 다양한 정도로 언폴딩되는 언폴딩/재폴딩 변이, 및 리간드 또는 dAb 단량체 분자가 언폴딩 되는 부분을 포함하는 특징적인 S자 형태를 지닌다. 재폴딩 곡선의 y-축 절편은 회복된 재폴딩된 리간드 또는 dAb 단량체의 상대량이다. 약 50% 이상, 또는 약 60% 이상, 또는 약 70% 이상, 또는 약 75% 이상, 또는 약 80% 이상, 또는 약 85% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상의 회복은 리간드 또는 dAb 단량체가 가역적으로 언폴딩됨을 나타낸다.
한 바람직한 구체예에서, 리간드 또는 dAb 단량체의 언폴딩의 가역성은 리간드 또는 dAb 단량체 용액을 제조하고, 가열 언폴딩 및 재폴딩 곡선을 작도함으로써 결정된다. 리간드 또는 dAb 단량체 용액은 임의의 적합한 용매, 예를들어 리간드 또는 dAb 단량체가 용해되기에 적합한 pH (예를들어, 약 3 유닛 초과 또는 등전점 (pi) 미만인 pH)를 지니는 수성 수성 완충용액에서 제조될 수 있다. 리간드 또는 dAb 단량체 용액은 언폴딩/재폴딩이 검출되기에 충분하도록 농축된다. 예를들어, 리간드 또는 dAb 리간드 용액은 약 0.1 μM 내지 약 100 μM, 또는 바람직하게는 약 1 μM 내지 약 10 μM일 수 있다.
리간드 또는 dAb 단량체의 용융 온도 (Tm)가 공지되어 있는 경우, 용액은 Tm 에서 약 10℃ 이하 (Tm-10)로 가열될 수 있고, 폴딩이 타원율 또는 형광 (예를들어, 235 nm 내지 225 nm에서의 파장 CD로 고정된 200 nm 내지 250 nm의 파-UV CD 스캔; 298 nm에서의 여기와 함께 300 내지 450 nm에서의 트립토판 형광 방출 스펙트럼)에 의해 측정되어 100%의 상대적으로 폴딩된 리간드 또는 dAb 단량체를 제공할 수 있다. 이후, 용액은 소정의 증진 (예를들어, 약 0.1 내지 약 1℃의 증가)으로 Tm 에서 약 10℃ 이상 (Tm+10)으로 가열되고, 타원율 또는 형광이 각각의 증진에서 결정된다. 이후, 리간드 또는 dAb 단량체는 소정의 증진으로 TM-10 이상으로 냉각됨으로써 재폴딩되고, 타원율 또는 형광이 각각의 증진에서 결정된다. 리간드 또는 dAb 단량체의 용융 온도가 공지되어 있지 않은 경우, 용액은 약 25℃ 내지 약 100℃로 점진적으로 가열되어 언폴딩된 후, 약 25℃ 이상으로 점진적으로 냉각됨으로써 재폴딩될 수 있고, 각각의 가열 및 냉각 증가에서의 타원율 또는 형광이 결정된다. 수득된 데이터는 작도되어 언폴딩 곡선 및 재폴딩 곡선의 y-축이 회수된 재폴딩 단백질의 상대량인 재폴딩 곡선이 생성될 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명의 리간드 또는 dAb 단량체는 유효량이 투여되는 경우 만성 염증 질병 모델에 효과적이다. 일반적으로, 유효량은 약 1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg (예를들어, 약 1 mg/kg, 약 2 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 4 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 6 mg/kg, 약 7 mg/kg, 약 8 mg/kg, 약 9 mg/kg 또는 약 10 mg/kg)이다. 본원에 기술된 만성 염증 질병 모델은 인간에게 있어서 예보적인 치료 효능과 같이 당업자에 의해 인지된다. 종래 분야는 이러한 모델에서의 TNFR1의 길항제 (예를들어, 본원에 기술된 1가 길항제, 리간드)를 이용하거나, 이들이 유효할 것이라는 것을 암시하지 않았다.
특정 구체예에서, 리간드 또는 dAb 단량체는 표준 마우스의 콜라겐에 의해 유발된 관절염 모델 (실시예 15A)에 유효하다. 예를들어, 유효량의 리간드를 투여하는 것은 표준 마우스의 콜라겐에 의해 유발된 관절염 모델에서 4개의 사지의 합산의 평균 관절염 스코어를 적절한 대조군에 비해, 예를들어 약 1 내지 약 16, 약 3 내지 약 16, 약 6 내지 약 16, 약 9 내지 약 16 또는 약 12 내지 약 16으로 감소시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 유효량의 리간드를 투여하는 것은 표준 마우스의 콜라겐에 의해 유발된 관절염 모델에서 관절염의 증상의 발병을 적절한 대조군에 비해, 예를들어 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 10일, 약 14일, 약 21일 또는 약 28일 지연시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 유효량의 리간드를 투여하는 것은 표준 마우스의 콜라겐에 의해 유발된 관절염 모델에서 0 내지 약 3, 약 3 내지 약 5, 약 5 내지 약 7, 약 7 내지 약 15, 약 9 내지 약 15, 약 10 내지 약 15, 약 12 내지 약 15 또는 약 14 내지 약 15의 4개의 사지의 합산의 평균 관절염 스코어를 생성시킬 수 있다.
기타 구체예에서, 리간드 또는 dAb 단량체는 마우스의 ΔARE 모델의 관절염 (실시예 15B)에 효과적이다. 예를들어, 유효량의 리간드를 투여하는 것은 마우스의 ΔARE 모델의 관절염에서 평균 관절염 스코어를 적절한 대조군에 비해, 예를들어 약 0.1 내지 약 2.5, 약 0.5 내지 약 2.5, 약 1 내지 약 2.5, 약 1.5 내지 약 2.5, 또는 약 2 내지 약 2.5로 감소시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 유효량의 리간드를 투여하는 것은 마우스 ΔARE 모델의 관절염에서 관절염 증상의 발병을 적절한 대조군에 비해, 예를들어 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 10일, 약 14일, 약 21일 또는 약 28일 지연시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 유효량의 리간드를 투여하는 것은 마우스의 ΔARE 모델의 관절염에서 0 내지 약 0.5, 약 0.5 내지 약 1, 약 1 내지 약 1.5, 약 1.5 내지 약 2, 또는 약 2 내지 약 2.5의 평균 관절염 스코어를 생성시킬 수 있다.
기타 구체예에서, 리간드 또는 dAb 단량체는 마우스의 ΔARE 모델의 염증성 장질병 (IBD) (실시예 15B)에 효과적이다. 예를들어, 유효량의 리간드를 투여하는 것은 마우스의 ΔARE 모델의 IBD에서 평균 급성 및/또는 만성 염증 스코어를 적절한 대조군에 비해, 예를들어 약 0.1 내지 약 2.5, 약 0.5 내지 약 2.5, 약 1 내지 약 2.5, 약 1.5 내지 약 2.5, 또는 약 2 내지 약 2.5 감소시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 유효량의 리간드를 투여하는 것은 마우스의 ΔARE 모델의 IBD에서 IBD 증상의 발병을 적절한 대조군에 비해, 예를들어 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 10일, 약 14일, 약 21일 또는 약 28일 지연시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 유효량의 리간드를 투여하는 것은 마우스의 ΔARE 모델의 IBD에서 0 내지 약 0.5, 약 0.5 내지 약 1, 약 1 내지 약 1.5, 약 1.5 내지 약 2, 또는 약 2 내지 약 2.5의 평균 급성 및/또는 만성 염증 스코어를 생성시킬 수 있다.
기타 구체예에서, 리간드 또는 dAb 단량체는 마우스의 덱스트란 설페이트 나트륨 (DSS)에 의해 유발된 모델의 IBD (실시예 15C)에 효과적이다. 예를들어, 유효량의 리간드를 투여하는 것은 마우스의 DSS 모델의 IBD에서 평균 중증도 스코어를 적절한 대조군에 비해, 예를들어 약 0.1 내지 약 2.5, 약 0.5 내지 약 2.5, 약 1 내지 약 2.5, 약 1.5 내지 약 2.5, 또는 약 2 내지 약 2.5로 감소시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 유효량의 리간드를 투여하는 것은 마우스의 DSS 모델의 IBD에서 IBD 증상의 발병을 적절한 대조군에 비해, 예를들어 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 10일, 약 14일, 약 21 일, 또는 약 28일 지연시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 유효량의 리간드를 투여하는 것은 마우스의 DSS 모델의 IBD에서 0 내지 약 0.5, 약 0.5 내지 약 1, 약 1 내지 약 1.5, 약 1.5 내지 약 2, 또는 약 2 내지 약 2.5의 평균 중증도 스코어를 생성시킬 수 있다.
특정 구체예에서, 리간드 또는 dAb 단량체는 마우스의 담배 연기 모델의 만성 폐쇄폐병 (COPD) (실시예 15D)에 효과적이다. 예를들어, 유효량의 리간드를 투여하는 것은 적절한 대조군에 비해 COPD의 증상의 발병을 지연시킬 수 있다.
특정 구체예에서, 리간드 또는 dAb 단량체는 TNFR1에 특이적으로 결합하고, TAR2-10의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:31) 또는 이와 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상이 상동성인 서열을 포함한다.
특정 구체예에서, 리간드 또는 dAb 단량체는 TNFR1에 특이적으로 결합하고, TAR2-5의 아미노산 (SEQ ID NO:195) 또는 이와 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상이 상동성인 서열을 포함한다.
기타 구체예에서, 리간드는 300 nM 내지 5 pM의 Kd로 종양 괴사 인자 수용체 I (TNFR1, p55, CD120a)에 특이적으로 결합하는 도메인 항체 (dAb) 단량체를 포함하고, TAR2h-12 (SEQ ID NO:32), TAR2h-13 (SEQ ID NO:33), TAR2h-14 (SEQ ID NO:34), TAR2h-16 (SEQ ID NO:35), TAR2h-17 (SEQ ID NO:36), TAR2h-18 (SEQ ID NO:37), TAR2h-19 (SEQ ID NO:38), TAR2h-20 (SEQ ID NO:39), TAR2h-21 (SEQ ID NO:40), TAR2h-22 (SEQ DD NO:41), TAR2h-23 (SEQ ID NO:42), TAR2h-24 (SEQ ID NO:43), TAR2h-25 (SEQ ID NO:44), TAR2h-26 (SEQ ID NO:45), TAR2h-27 (SEQ ID NO:46), TAR2h-29 (SEQ ID NO:47), TAR2h-30 (SEQ ID NO:48), TAR2h-32 (SEQ ID NO:49), TAR2h-33 (SEQ ID NO:50), TAR2h-10-1 (SEQ ID NO:51), TAR2h-1O-2 (SEQ ID NO:52), TAR2h-10-3 (SEQ ID NO:53), TAR2h-10-4 (SEQ ID NO:54), TAR2h-10-5 (SEQ ID NO:55), TAR2h-10-6 (SEQ ID NO:56), TAR2h-10-7 (SEQ ID NO:57), TAR2h-10-8 (SEQ ID NO:58), TAR2h-10-9 (SEQ ID NO:59), TAR2h-10-10 (SEQ ID NO:60), TAR2h-10-11 (SEQ ID NO:61), TAR2h-10-12 (SEQ ID NO:62), TAR2h-10-13 (SEQ ID NO:63), TAR2h-10-14 (SEQ ID NO:64), TAR2h-10-15 (SEQ ID NO:65), TAR2h-10-16 (SEQ ID NO:66), TAR2h-10-17 (SEQ ID NO:67), TAR2h-10-18 (SEQ ID NO:68), TAR2h-10-19 (SEQ ID NO:69), TAR2h-10-20 (SEQ ID NO:70), TAR2h-10-21 (SEQ ID NO:71), TAR2h-10-22 (SEQ ID NO:72), TAR2h-10-27 (SEQ ID NO:73), TAR2h-10-29 (SEQ ID NO:74), TAJR2h-10-31 (SEQ ID NO:75), TAR2h-10-35 (SEQ ID NO:76), TAR2h-10-36 (SEQ ID NO:77), TAR2h-10-37 (SEQ ID NO:78), TAR2h-10-38 (SEQ ID NO:79), TAJR2h-10-45 (SEQ ID NO:80), TAR2h-10-47 (SEQ ID NO:81), TAR2h-10-48 (SEQ ID NO:82), TAR2h-10-57 (SEQ ID NO:83), TAR2h-10-56 (SEQ ID NO:84), TAR2h-10-58 (SEQ ID NO:85), TAR2h-10-66 (SEQ ID NO:86), TAR2h-10-64 (SEQ ID NO:87), TAR2h-10-65 (SEQ ID NO:88), TAR2h-10-68 (SEQ ID NO:89), TAR2h-10-69 (SEQ ID NO:90), TAR2h-10-67 (SEQ ID NO:91), TAR2h-10-61 (SEQ ID NO:92), TAR2h-10-62 (SEQ ID NO:93), TAR2h-10-63 (SEQ ID NO:94), TAR2h-10-60 (SEQ ID NO:95), TAR2h-10-55 (SEQ ID NO:96), TAR2h-10-59 (SEQ ID NO:97), TAR2h-10-70 (SEQ ID NO:98), TAR2h-34 (SEQ ID NO:373), TAR2h-35 (SEQ ID NO:374), TAR2h-36 (SEQ ID NO:375), TAR2h-37 (SEQ ID NO:376), TAR2h-38 (SEQ ID NO:377), TAR2h-39 (SEQ ID NO:378), TAR2h-40 (SEQ ID NO:379), TAR2h-41 (SEQ ID NO:380), TAR2h-42 (SEQ ID NO:381), TAR2h-43 (SEQ ID NO:382), TAR2h-44 (SEQ ID NO:383), TAR2h-45 (SEQ ID NO:384), TAR2h-47 (SEQ ID NO:385), TAR2h-48 (SEQ ID NO:386), TAR2h-50 (SEQ ID NO:387), TAR2h-51 (SEQ ID NO:388), TAR2h-66 (SEQ ID NO:389), TAR2h-67 (SEQ ID N0:39O), TAR2h-68 (SEQ ID NO:391), TAR2h-70 (SEQ ID NO:392), TAR2h-71 (SEQ ID NO:393), TAR2h-72 (SEQ ID NO:394), TAR2h-73 (SEQ ID NO:395), TAR2h-74 (SEQ ID NO:396), TAR2h-75 (SEQ ID NO:397), TAR2h-76 (SEQ ID NO:398), TAR2h-77 (SEQ ID NO:399), TAR2h-78 (SEQ ID NO:400), TAR2h-79 (SEQ ID NO:401) 및 TAR2h-15 (SEQ ID NO:431)로 구성된 군으로부터 선택된 dAb의 아미노산 서열과 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상이 상동성인 아미노산 서열을 포함한다.
추가 구체예에서, 리간드는 300 nM 내지 5 pM의 Kd로 종양 괴사 인자 수용체 I (TNFR1, p55, CD120a)에 특이적으로 결합하는 도메인 항체 (dAb) 단량체를 포함하고, TAR2h-131-8 (SEQ ID NO:433), TAR2h-131-24 (SEQ ID NO:434), TAR2h-15-8 (SEQ ID NO:435), TAR2h-15-8-1 (SEQ ID NO:436), TAR2h-15-8-2 (SEQ ID NO:437), TAR2h-185-23 (SEQ ID NO:438), TAR2h-154-10-5 (SEQ ID NO:439), TAR2h-14-2 (SEQ ID NO:440), TAR2h-151-8 (SEQ ID NO:441), TAR2h-152-7 (SEQ ID NO:442), TAR2h-35-4 (SEQ ID NO:443), TAR2h-154-7 (SEQ ID NO:444), TAR2h-80 (SEQ ID NO:445), TAR2h-81 (SEQ ID NO:446), TAR2h-82 (SEQ ID NO:447), TAR2h-83 (SEQ ID NO:448), TAR2h-84 (SEQ ID NO:449), TAR2h-85 (SEQ ID NO:450), TAR2h-86 (SEQ ID NO:45 1), TAR2h-87 (SEQ ID NO:452), TAR2h-88 (SEQ ID NO:453), TAR2h-89 (SEQ ID NO:454), TAR2h-90 (SEQ ID NO:455), TAR2h-91 (SEQ ID NO:456), TAR2h-92 (SEQ ID NO:457), TAR2h-93 (SEQ ID NO:458), TAR2h-94 (SEQ ID NO:459), TAR2h-95 (SEQ ID NO:460), TAR2h-96 (SEQ ID NO:461), TAR2h-97 (SEQ ID NO:462), TAR2h-99 (SEQ ID NO:463), TAR2h-100 (SEQ ID NO:464), TAR2h-101 (SEQ ID NO:465), TAR2h-102 (SEQ ID NO:466), TAR2h-103 (SEQ ID NO:467), TAR2h-104 (SEQ ID NO:468), TAR2h-105 (SEQ ID NO:469), TAR2h-106 (SEQ ID NO:470), TAR2h-107 (SEQ ID NO:471), TAR2h-108 (SEQ ID NO:472), TAR2h-109 (SEQ ID NO:473), TAR2h-110 (SEQ ID NO:474), TAR2h-111 (SEQ ID NO:475), TAR2h-112 (SEQ ID NO:476), TAR2h-113 (SEQ ID NO:477), TAR2h-114 (SEQ ID NO:478), TAR2h-115 (SEQ ID NO:479), TAR2h-116 (SEQ ID NO:480), TAR2h-117 (SEQ ID NO:481), TAR2h-118 (SEQ ID NO:482), TAR2h-119 (SEQ ID NO:483), TAR2h-120 (SEQ ID NO:484), TAR2h-121 (SEQ ID NO:485), TAR2h-122 (SEQ ID NO:486), TAR2h-123 (SEQ ID NO:487), TAR2h-124 (SEQ ID NO:488), TAR2h-125 (SEQ ID NO:489), TAR2h-126 (SEQ ID NO:490), TAR2h-127 (SEQ ID NO:490), TAR2h-128 (SEQ ID NO:492), TAR2h-129 (SEQ ID NO:493), TAR2h-130 (SEQ ID NO:494), TAR2h-131 (SEQ ID NO:495), TAR2h-132 (SEQ ID NO:496), TAR2h-133 (SEQ ID NO:497), TAR2h-151 (SEQ ID NO:498), TAR2h-152 (SEQ ID NO:499), TAR2h-153 (SEQ ID NO:500), TAR2h-154 (SEQ ID NO:501), TAR2h-159 (SEQ ID NO:502), TAR2h-165 (SEQ ID NO:503), TAR2h-166 (SEQ ID NO:504), TAR2h-168 (SEQ ID NO:505), TAR2h-171 (SEQ ID NO:506), TAR2h-172 (SEQ ID NO:507), TAR2h-173 (SEQ ID NO:508), TAR2h-174 (SEQ ID NO:509), TAR2h-176 (SEQ ID NO:510), TAR2h- 178 (SEQ ID NO:511), TAR2h-201 (SEQ ID NO:512), TAR2h-202 (SEQ ID NO:513), TAR2h-203 (SEQ ID NO:514), TAR2h-204 (SEQ ID NO:515), TAR2h-185-25 (SEQ ID NO:516), TAR2h-154-10 (SEQ ID NO:517) 및 TAR2h-205 (SEQ ID NO:627)로 구성된 군으로부터 선택된 dAb의 아미노산 서열과 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99%이상이 상동성인 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 리간드 또는 dAb는 TAR2h-10-27 (SEQ ID NO:73), TAR2h-10-57 (SEQ ID NO:83), TAR2h-10-56 (SEQ ID NO:84), TAR2h-10-58 (SEQ ID NO:85), TAR2h-10-66 (SEQ ID NO:86), TAR2h-10-64 (SEQ ID NO:87), TAR2h-10-65 (SEQ ID NO:88), TAR2h-10-68 (SEQ ID NO:89), TAR2h-10-69 (SEQ ID NO:90), TAR2h-10-67 (SEQ ID NO:91), TAR2h-10-61 (SEQ ID NO:92), TAR2h-10-62 (SEQ ID NO:93), TAR2h-10-63 (SEQ ID NO:94), TAR2h-10-60 (SEQ ID NO:95), TAR2h-10-55 (SEQ ID NO:96), TAR2h-10-59 (SEQ ID NO:97) 및 TAR2h-10-7O (SEQ ID NO:98)로 구성된 군으로부터 선택된 dAb의 아미노산 서열과 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상이 상동성인 아미노산 서열을 포함한다.
특히 바람직한 리간드 또는 dAb는 SEQ ID NO: 73의 아미노산 서열과 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상이 상동성인 아미노산 서열을 포함한다.
기타 구체예에서, 리간드는 300 nM 내지 5 pM의 Kd로 종양 괴사 인자 수용체 I (TNFR1, p55, CD 120a)에 특이적으로 결합하는 도메인 항체 (dAb) 단량체를 포함하고, TAR2m-14 (SEQ ID NO:167), TAR2m-15 (SEQ ID NO:168), TAR2m-19 (SEQ ID NO:169), TAR2m-20 (SEQ ID NO:170), TAR2m-21 (SEQ ID NO:171), TAR2m-24 (SEQ ID NO:172), TAR2m-21-23 (SEQ ID NQ:173), TAR2m-21-07 (SEQ ID NO:174), TAR2m-21-43 (SEQ ID NO:175), TAR2m-21-48 (SEQ ID NO:176), TAR2m-21-1O (SEQ ID NO:177), TAR2m-21-06 (SEQ ID NO:178) 및 TAR2m-21-17 (SEQ ID NO:179)로 구성된 군으로부터 선택된 dAb의 아미노산 서열과 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상이 상동성인 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 구체예에서, 리간드는 TNFR1에 결합하고, TNFR1 (예를들어, 마우스 및/또는 인간 TNFR1)에 대한 결합에서 본원에 기술된 임의의 dAb와 경쟁하는 dAb 단량체를 포함한다.
바람직하게는, 리간드 또는 dAb 단량체는 대장균(E. coli) 또는 피키아 종 (예를들어, P. 파스토리스)에서 발현되는 경우 약 0.5 mg/L 이상의 양으로 분비된다. 기타 바람직한 구체예에서, dAb 단량체는 대장균(E. coli) 또는 피키아 종 (예를들어, P. 파스토리스)에서 발현되는 경우 약 0.75 mg/L 이상, 약 1 mg/L 이상, 약 4 mg/L 이상, 약 5 mg/L 이상, 약 10 mg/L 이상, 약 15 mg/L 이상, 약 20 mg/L 이상, 약 25 mg/L 이상, 약 30 mg/L 이상, 약 35 mg/L 이상, 약 40 mg/L 이상, 약 45 mg/L 이상, 또는 약 50 mg/L 이상, 또는 약 100 mg/L 이상, 또는 약 200 mg/L 이상, 또는 약 300 mg/L 이상, 또는 약 400 mg/L 이상, 또는 약 500 mg/L 이상, 또는 약 600 mg/L 이상, 또는 약 700 mg/L 이상, 또는 약 800 mg/L 이상, 약 900 mg/L 이상, 또는 약 lg/L 이상의 양으로 분비된다. 기타 바람직한 구체예에서, dAb 단량체는 대장균(E. coli) 또는 피키아 종 (예를들어, P. 파스토리스)에서 발현되는 경우 약 1 mg/L 이상 내지 약 lg/L 이상, 약 1 mg/L 이상 내지 약 750 mg/L 이상, 약 100 mg/L 이상 내지 약 1 g/L 이상, 약 200 mg/L 이상 내지 약 1 g/L 이상, 약 300 mg/L 이상 내지 약 1 g/L 이상, 약 400 mg/L 이상 내지 약 1 g/L 이상, 약 500 mg/L 이상 내지 약 lg/L 이상, 약 600 mg/L 이상 내지 약 1 g/L 이상, 약 700 mg/L 이상 내지 약 1 g/L 이상, 약 800 mg/L 이상 내지 약 lg/L 이상, 또는 약 900 mg/L 이상 내지 약 lg/L 이상의 양으로 분비된다. 비록, 대장균(E. coli) 또는 피키아 종 (예를들어, P. 파스토리스)에서 발현되는 경우 본원에 기술된 리간드 및 dAb 단량체는 분비될 수 있으나, 이들은 대장균(E. coli) 또는 피키아 종을 사용하지 않는 임의의 적절한 방법, 예를들어 합성 화학 방법 또는 생물학적 생성 방법을 이용하여 생성될 수 있다.
dAb 단량체는 임의의 적합한 면역글로불린 가변 도메인을 포함할 수 있고, 바람직하게는 인간 가변 도메인 또는 인간 프레임워크 영역을 포함하는 가변 도메인을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, dAb 단량체는 본원에 기술된 유니버셜 프레임워크를 포함한다.
유니버셜 프레임워크는 VL 프레임워크 (Vλ 또는 Vκ), 예를들어 인간 점라인 DPK1, DPK2, DPK3, DPK4, DPK5, DPK6, DPK7, DPK8, DPK9, DPK1O, DPK12, DPK13, DPK15, DPK16, DPK18, DPK19, DPK20, DPK21, DPK22, DPK23, DPK24, DPK25, DPK26 또는 DPK 28 면역글로불린 유전자 분절에 의해 엔코딩된 프레임워크 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크일 수 있다. 요망되는 경우, VL 프레임워크는 인간 점라인 Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 또는 Jκ5 면역글로불린 유전자 분절에 의해 엔코딩된 프레임워크 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다.
기타 구체예에서, 유니버셜 프레임워크는 VH 프레임워크, 예를들어 인간 점라인 DP4, DP7, DP8, DP9, DP1O, DP31, DP33, DP38, DP45, DP46, DP47, DP49, DP50, DP51, DP53, DP54, DP65, DP66, DP67, DP68 또는 DP69 면역글로불린 유전자 분절에 의해 엔코딩된 프레임워크 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크일 수 있다. 요망되는 경우, VH 프레임워크는 인간 점라인 JH1, JH2, JH3, JH4, JH4b, JH5 및 JH6 면역글로불린 유전자 분절에 의해 엔코딩된 프레임워크 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다.
특정 구체예에서, dAb 단량체 리간드는 DPK9 VL 프레임워크, 또는 DP47, DP45 및 DP38로 구성된 군으로부터 선택된 VH 프레임워크를 포함한다.
dAb 단량체는 일반 리간드, 예를들어 단백질 A, 단백질 L 및 단백질 G에 대한 결합 부위를 포함할 수 있다.
특정 구체예에서, dAb 단량체는 인간 점라인 항체 유전자 분절에 의해 엔코딩된 상응하는 프레임워크 영역의 아미노산 서열, 또는 인간 점라인 항체 유전자 분절에 의해 엔코딩된 상응하는 프레임워크 영역의 아미노산 서열에 비해 5개 이하의 아미노산 서열 차이를 집합적으로 포함하는 하나 이상의 프레임워크 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 프레임워크 영역을 포함한다.
기타 구체예에서, dAb 단량체의 FW1, FW2, FW3 및 FW4의 아미노산 서열은 인간 점라인 항체 유전자 분절에 의해 엔코딩된 상응하는 프레임워크 영역의 아미노산 서열, 또는 인간 점라인 항체 유전자 분절에 의해 엔코딩된 상응하는 프레임워크 영역의 아미노산 서열에 비해 10개 이하의 아미노산 차이를 집합적으로 함유하는 FW1, FW2, FW3 및 FW4의 아미노산 서열과 동일하다.
기타 구체예에서, dAb 단량체는 FW1, FW2 및 FW3 영역을 포함하고, 상기 FW1, FW2 및 FW3 영역의 아미노산 서열은 인간 점라인 항체 유전자 분절에 의해 엔코딩된 상응하는 프레임워크 영역의 아미노산 서열과 동일하다.
몇몇 구체예에서, dAb 단량체는 카멜리드 면역글로불린 가변 도메인, 또는 카멜리드 점라인 항체 유전자 분절에 의해 엔코딩된 면역글로불린 가변 도메인에 대해 유일무이한 하나 이상의 프레임워크 아미노산을 포함하지 않는다.
혈청 알부민에 결합하는 리간드 및 dAb 단량체
본 발명은 1 nM 내지 500 μM (즉, x 10-9 내지 5 x 10-4), 바람직하게는 100 nM 내지 10 μM의 Kd로 혈청 알부민 (SA)에 결합하는 리간드 또는 dAb 단량체 (예를들어, 이러한 dAb를 포함하는 이중특이적 리간드)를 제공한다. 바람직하게는, 제 1 항-SA dAb 및 또 다른 표적에 대한 제 2 dAb를 포함하는 이중특이적 리간드에 대해서, 제 2 dAb의 표적에 대한 이의 친화성 (예를들어, 비아코어(BiaCore)를 이용한, 예를들어 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된 Kd 및/또는 Koff)은 SA에 대한 제 1 dAb의 친화성에 비해 1 내지 100000배 (바람직하게는, 100 내지 100000배, 더욱 바람직하게는 1000 내지 100000배, 또는 10000 내지 100000배)이다. 예를들어, 제 1 dAb는 약 10 μM의 친화성으로 SA에 결합하는 반면, 제 2 dAb는 100 pM의 친화성으로 이의 표적에 결합한다. 바람직하게는, 혈청 알부민은 인간 혈청 알부민 (HSA)이다. 한 구체예에서, 제 1 dAb (또는 dAb 단량체)는 약 50, 바람직하게는 70, 더욱 바람직하게는 100, 150 또는 200 nM의 Kd로 SA (예를들어, HSA)에 결합한다.
특정 구체예에서, SA에 특이적인 dAb 단량체는 MSA-16의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:28) 또는 이와 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상이 상동성인 서열을 포함한다.
또 다른 구체예에서, SA에 특이적인 dAb 단량체는 MSA-26의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:30) 또는 이와 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상이 상동성인 서열을 포함한다.
특정 구체예에서, SA에 결합하는 dAb 단량체는 응집에 내성이고, 가역적으로 언폴딩되고/되거나 TNFR1에 결합하는 dAb 단량체에 대해 상기 기술된 바와 같은 프레임워크 영역을 포함한다.
핵산 분자, 벡터 및 숙주세포
본 발명은 또한 본원에 기술된 리간드 및 dAb 단량체를 엔코딩하는 분리된 핵산 분자 및/또는 재조합 핵산 분자를 제공한다. 특정 구체예에서, 분리된 핵산 분자 및/또는 재조합 핵산 분자는 종양 괴사 인자 수용체 I (TNFR1)에 특이적으로 결합하는 도메인 항체 (dAb) 단량체를 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하고, 여기서, 상기 누클레오티드 서열은 TAR2h-12 (SEQ ID NO:32), TAR2h-13 (SEQ ID NO:33), TAR2h-14 (SEQ ID NO:34), TAR2h-16 (SEQ ID NO:35), TAR2h-17 (SEQ ID NO:36), TAR2h-18 (SEQ ID NO:37), TAR2h-19 (SEQ ID NO:38), TAR2h-20 (SEQ ID NO:39), TAR2h-21 (SEQ ID NO:40), TAR2h-22 (SEQ ID NO:41), TAR2h-23 (SEQ ID NO:42), TAR2h-24 (SEQ ID NO:43), TAR2h-25 (SEQ ID NO:44), TAR2h-26 (SEQ ID NO:45), TAR2h-27 (SEQ ID NO:46), TAR2h-29 (SEQ ID NO:47), TAR2h-30 (SEQ ID NO:48), TAR2h-32 (SEQ ID NO:49), TAR2h-33 (SEQ ID NO:50), TAR2h-10-1 (SEQ ID NO:51), TAR2h-10-2 (SEQ ID NO:52), TAR2h-10-3 (SEQ ID NO:53), TAR2h-10-4 (SEQ ID NO:54), TAR2h-10-5 (SEQ ID NO:55), TAR2h-10-6 (SEQ ID NO:56), TAR2h-10-7 (SEQ ID NO:57), TAR2h-10-8 (SEQ ID NO:58), TAR2h-10-9 (SEQ ID NO:59), TAR2h-10-10 (SEQ ID NO:60), TAR2h-10-11 (SEQ ID NO:61), TAR2h-10-12 (SEQ ID NO:62), TAR2h-10-13 (SEQ ID NO:63), TAR2h-10-14 (SEQ ID NO:64), TAR2h-10-15 (SEQ ID NO:65), TAR2h-10-16 (SEQ ID NO:66), TAR2h-10-17 (SEQ ID NO:67), TAR2h-10-18 (SEQ ID NO:68), TAR2h-10-19 (SEQ ID NO:69), TAR2h-10-20 (SEQ ID NO:70), TAR2h-10-21 (SEQ ID NO:71), TAR2h-10-22 (SEQ ID NO:72), TAR2h-10-27 (SEQ ID NO:73), TAR2h-10-29 (SEQ ID NO:74), TAR2h-10-31 (SEQ ID NO:75), TAR2h-10-35 (SEQ ID NO:76), TAR2h-10-36 (SEQ ID NO:77), TAR2h-10-37 (SEQ ID NO:78), TAR2h-10-38 (SEQ ID NO:79), TAR2h-10-45 (SEQ ID NO:80), TAR2h-10-47 (SEQ ID NO:81), TAR2h-10-48 (SEQ ID NO:82), TAR2h-10-57 (SEQ ID NO:83), TAR2h-10-56 (SEQ ID NO:84), TAR2h-10-58 (SEQ ID NO:85), TAR2h-10-66 (SEQ ID NO:86), TAR2h-10-64 (SEQ ID NO:87), TAR2h-10-65 (SEQ ID NO:88), TAR2h-10-68 (SEQ ID NO:89), TAR2h-10-69 (SEQ ID NO:90), TAR2h-10-67 (SEQ ID NO:91), TAR2h-10-61 (SEQ ID NO:92), TAR2h-10-62 (SEQ ID NO:93), TAR2h-10-63 (SEQ ID NO:94), TAR2h-10-60 (SEQ ID NO:95), TAR2h-10-55 (SEQ ID NO:96), TAR2h-10-59 (SEQ ID NO:97), TAR2h-10-70 (SEQ ID NO:98), TAR2h-34 (SEQ ID NO:402), TAR2h-35 (SEQ ID NO:403), TAR2h-36 (SEQ ID NO:404), TAR2h-37 (SEQ ID NO:405), TAR2h-38 (SEQ ID NO:406), TAR2h-39 (SEQ ID NO:407), TAR2h-40 (SEQ ID NO:408), TAR2h-41 (SEQ ID NO:409), TAR2h-42 (SEQ ID NO:410), TAR2h-43 (SEQ ID NO:411), TAR2h-44 (SEQ ID NO:412), TAR2h-45 (SEQ ID NO:413), TAR2h-47 (SEQ ID NO:414), TAR2h-48 (SEQ ID NO:415), TAR2h-50 (SEQ ID NO:416), TAR2h-51 (SEQ ID NO:417), TAR2h-66 (SEQ ID NO:418), TAR2h-67 (SEQ ID NO:419), TAR2h-68 (SEQ ID NO:420), TAR2h-70 (SEQ ID NO:421), TAR2h-71 (SEQ ID NO:422), TAR2h-72 (SEQ ID NO:423), TAR2h-73 (SEQ ID NO:424), TAR2h-74 (SEQ ID NO:425), TAR2h-75 (SEQ ID NO:426), TAR2h-76 (SEQ ID NO:427), TAR2h-77 (SEQ ID NO:428), TAR2h-78 (SEQ ID NO:429), TAR2h-79 (SEQ ID NO:430) 및 TAR2h-15 (SEQ ID NO:432)으로 구성된 군으로부터 선택된 누클레오티드 서열과 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상이 상동성이다.
기타 구체예에서, 분리된 핵산 및/또는 재조합 핵산은 종양 괴사 인자 수용체 I (TNFR1)에 특이적으로 결합하는 도메인 항체 (dAb) 단량체를 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 상기 누클레오티드 서열은 TAR2h-131-8 (SEQ ID NO:518), TAR2h-131-24 (SEQ ID NO:519), TAR2h-15-8 (SEQ ID NO:520), TAR2h-15-8-1 (SEQ ID NO:521), TAR2h-15-8-2 (SEQ ID NO:522), TAR2h-185-23 (SEQ ID NO:523), TAR2h-154-10-5 (SEQ ID NO:524), TAR2h-14-2 (SEQ ID NO:525), TAR2h-151-8 (SEQ ID NO:526), TAR2h-152-7 (SEQ ID NO:527), TAR2h-35-4 (SEQ ID NO:528), TAR2h-154-7 (SEQ ID NO:529), TAR2h-80 (SEQ ID NO:530), TAR2h-81 (SEQ ID NO:531), TAR2h-82 (SEQ ID NO:532), TAR2h-83 (SEQ ID NO:533), TAR2h-84 (SEQ ID NO:534), TAR2h-85 (SEQ ID NO:535), TAR2h-86 (SEQ ID NO:536), TAR2h-87 (SEQ ID NO:537), TAR2h-88 (SEQ ID NO:538), TAR2h-89 (SEQ ID NO:539), TAR2h-90 (SEQ ID NO:540), TAR2h-91 (SEQ ID NO:541), TAR2h-92 (SEQ ID NO:542), TAR2h-93 (SEQ ID NO:543), TAR2h-94 (SEQ ID NO:544), TAR2h-95 (SEQ ID NO:545), TAR2h-96 (SEQ ID NO:546), TAR2h-97 (SEQ ID NO:547), TAR2h-99 (SEQ ID NO:548), TAR2h-100 (SEQ ID NO:549), TAR2h-101 (SEQ ID NO:550), TAR2h-1O2 (SEQ ID NO:551), TAR2h-103 (SEQ ID NO:552), TAR2h-104 (SEQ ID NO:553), TAR2h-105 (SEQ ID NO:554), TAR2h-106 (SEQ ID NO:555), TAR2h-1O7 (SEQ ID NO:556), TAR2h-108 (SEQ ID NO:557), TAR2h-109 (SEQ ID NO:558), TAR2h-110 (SEQ ID NO:559), TAR2h-111 (SEQ ID NO:560), TAR2h-112 (SEQ ID NO:561), TAR2h-113 (SEQ ID NO:562), TAR2h-114 (SEQ ID NO:563), TAR2h-115 (SEQ ID NO:564), TAR2h-116 (SEQ ID NO:565), TAR2h-117 (SEQ ID NO:566), TAR2h-118 (SEQ ID NO:567), TAR2h-119 (SEQ ID NO:568), TAR2h-120 (SEQ ID NO:569), TAR2h-121 (SEQ ID NO:570), TAR2h-122 (SEQ ID NO:571), TAR2h-123 (SEQ ID NO:572), TAR2h-12 (SEQ ID NO:573), TAR2h-125 (SEQ ID NO:574), TAR2h-126 (SEQ ID NO:575), TAR2h-127 (SEQ ID NO:576), TAR2h-128 (SEQ ID NO:577), TAR2h-129 (SEQ ID NO:578), TAR2h-130 (SEQ ID NO:579), TAR2h-131 (SEQ ID NO:580), TAR2h-132 (SEQ ID NO:581), TAR2h-133 (SEQ ID NO:582), TAR2h-151 (SEQ ID NO:583), TAR2h-152 (SEQ ID NO:584), TAR2h-153 (SEQ ID NO:585), TAR2h-154 (SEQ ID NO:586), TAR2h-159 (SEQ ID NO:587), TAR2h-165 (SEQ ID NO:588), TAR2h-166 (SEQ ID NO:589), TAR2h-168 (SEQ ID NO:590), TAR2h-171 (SEQ ID NO:591), TAR2h-172 (SEQ ID NO:592), TAR2h-173 (SEQ ID NO:593), TAR2h-174 (SEQ ID NO:594), TAR2h-176 (SEQ ID NO:595), TAR2h-178 (SEQ ID NO:596), TAR2h-201 (SEQ ID NO:597), TAR2h-202 (SEQ ID NO:598), TAR2h-203 (SEQ ID NO:599), TAR2h-204 (SEQ ID NO:600), TAR2h-185-25 (SEQ ID NO:601), TAR2h-154-10 (SEQ ID NO:602) 및 TAR2h-205 (SEQ ID NO:628)으로 구성된 군으로부터 선택된 누클레오티드 서열과 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상이 상동성이다.
한 바람직한 구체예에서, 분리된 핵산 및/또는 재조합 핵산은 TAR2h-10-27 (SEQ ID NO:141), TAR2h-10-57 (SEQ ID NO:151), TAR2h-10-56 (SEQ ID NO:152), TAR2h-10-58 (SEQ ID NO:153), TAR2h-10-66 (SEQ ID NO:154), TAR2h-10-64 (SEQ ID NO:155), TAR2h-10-65 (SEQ ID NO:156), TAR2h-10-68 (SEQ ID NO:157), TAR2h-10-69 (SEQ ID NO:158), TAR2h-10-67 (SEQ ID NO:159), TAR2h-10-61 (SEQ ID NO:160), TAR2h-10-62 (SEQ ID NO:161), TAR2h-10-63 (SEQ ID NO:162), TAR2h-10-60 (SEQ ID NO:163), TAR2h-10-55 (SEQ ID NO:164), TAR2h-10-59 (SEQ ID NO:165) 및 TAR2h-10-70 (SEQ ID NO:166)으로 구성된 군으로부터 선택된 누클레오티드 서열과 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상이 상동성인 누클레오티드 서열을 포함한다.
기타 구체예에서, 분리된 핵산 및/또는 재조합 핵산은 종양 괴사 인자 수용체 I (TNFR1)에 특이적으로 결합하는 도메인 항체 (dAb) 단량체를 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 상기 누클레오티드 서열은 TAR2m-14 (SEQ ID NO:180), TAR2m-15 (SEQ ID NO:181), TAR2m-19 (SEQ ID NO:182), TAR2m-20 (SEQ ID NO:183), TAR2m-21 (SEQ ID NO:184), TAR2m-24 (SEQ ID N0:185), TAR2m-21-23 (SEQ ID NO:186), TAR2m-21-07 (SEQ ID NO:187), TAR2m-21-43 (SEQ ID NO:188), TAR2m-21-48 (SEQ ID NO:189), TAR2m-21-10 (SEQ ID NO:190), TAR2m-21-06 (SEQ ID NO:191), TAR2m-21-17 (SEQ ID NO:192) 및 TAR2m-21-23a (SEQ ID NO:626)로 구성된 군으로부터 선택된 누클레오티드 서열과 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상이 상동성이다.
본 발명은 또한 본 발명의 재조합 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 특정 구체예에서, 벡터는 본 발명의 재조합 핵산에 작동적으로 연결된 하나 이상의 발현 조절 성분 또는 서열을 포함하는 발현 벡터이다. 적합한 벡터 (예를들어, 플라스미드, 파지미드) 및 발현 조절 성분이 하기에 추가로 기술된다.
본 발명은 또한 본 발명의 제조합 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 재조합 숙주세포를 제공한다. 적합한 숙주 세포 및 본 발명의 재조합 숙주 세포를 생성하는 방법이 하기에 추가로 기술된다.
본 발명은 또한 재조합 핵산의 발현에 적합한 조건하에서 본 발명의 재조합 핵산을 포함하는 재조합 숙주세포를 유지시킴으로써 재조합 핵산이 발현되고 리간드가 생성되는 것을 포함하는, 본 발명의 리간드 (예를들어, dAb 단량체, 이중특이적 리간드, 다중특이적 리간드)를 생성하는 방법을 제공한다. 몇몇 구체예에서, 상기 방법은 리간드를 분리시키는 것을 추가로 포함한다.
리간드 포맷
본 발명에 따른 리간드는 단일특이적 또는 다중특이적 항체 또는 항체 단편, 또는 단일특이적 또는 다중특이적 비-면역글로불린 구조로 포맷화될 수 있다. 적합한 포맷은, 항체 가변 도메인 또는 이의 CDR이 포함되어 구조상에 항원에 대한 결합 특이성을 수여할 수 있는 임의의 적합한 폴리펩티드 구조를 포함한다. 다양한 적합한 항체 포맷, 예를들어 IgG-유사 포맷, 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 단일 사슬 항체, 이중특이적 항체, 항체 중쇄, 항체 경쇄, 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 동종이합체 및 이종이합체, 상술한 임의의 항체의 항원 결합 단편 (예를들어, Fv 단편 (예를들어, 단일 사슬 Fv (scFv), 이황화결합된 Fv), Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편), 단일 가변 도메인 (예를들어, VH, VL), dAb, 및 상술한 임의의 항체의 변형된 버전 (예를들어, 폴리알킬렌 글리콜 (예를들어, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리부틸렌 글리콜) 또는 기타 적절한 다합체의 공유적 부착)이 당 분야에 공지되어 있다. 페길화된 단일 가변 도메인 및 dAb, 이를 제조하기에 적합한 방법, 증가된 생체내 반감기의 페길화된 단일 가변 도메인 및 dAb 단량체 및 다합체, 적합한 PEG, 바람직한 유체역학적 크기의 PEG, 및 바람직한 유체역학적 크기의 페길화된 단일 가변 도메인 및 dAb 단량체 및 다합체에 관한 미국에서 지정된, 2003년 6월 30일자로 출원된 PCT/GB03/002804 (WO 2004/081026)를 참조하라. 상기에 언급된 부분을 포함하는 PCT/GB03/002804 (WO 2004/081026)의 전체 교시는 본원에 참조로서 포함되어 있다.
특정 구체예에서, 리간드 (예를들어, dAb 단량체, 이합체 또는 다합체, 이중특이적 포맷, 다중특이적 포맷)는 페길화되고, TNFR1의 도메인 1에 결합하고, TNFR1의 기능을 임의로 억제한다. 바람직하게는, 페길화된 리간드는 TNFR1을 통한 신호전달을 억제한다. 바람직하게는, 페길화된 리간드는 페길화되지 않은 동일한 리간드와 실질적으로 동일한 친화성으로 TNFR1의 도메인 1에 결합한다. 예를들어, 한 구체예에서, 리간드는 TNFR1의 도메인 1에 결합하고, TNFR1을 통한 신호전달을 억제하는 페길화된dAb 단량체이고, 여기서 페길화된 dAb 단량체는 약 1000 이하의 인자, 바람직하게는 약 100 이하의 인자, 더욱 바람직하게는 약 10 이하의 인자에 의해 페길화되지 않은 형태의 dAb의 친화성과는 다른 친화성, 또는 페길화되지 않은 형태에 비해 실질적으로 변화하지 않은 친화성으로 TNFR1의 도메인 1에 결합한다.
TNFR1의 막결합 (막횡단) 및 가용성 형태의 도메인 1에 결합하지만 수용체 형태에 대한 TNFα의 결합을 억제하지 않는 본 발명에 따른 리간드는 막결합 수용체에서 도메인 1을 차단 (예를들어, 수용체 클러스터링을 억제하고/하거나 신호전달을 억제)하고, 특히 PEG 또는 상기에 달리 기술된 것에 부착되는 경우 반감기를 향상시키기 위한 가용성 형태로 결합시키기에 유용할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 리간드는 TNFR1의 막결합 (막횡단) 및 가용성 형태의 도메인 2에 결합하지 않는다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 리간드는 TNFR1의 막결합 (막횡단) 및 가용성 형태의 도메인 3에 결합하지 않는다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 리간드는 TNFR1의 막결합 (막횡단) 및 가용성 형태의 도메인 2 또는 도메인 3에 결합하지 않는다.
몇몇 구체예에서, 리간드는 IgG-유사 포맷이다. 이러한 포맷은 하나 이상의 가변 영역 (VH 및/또는 VL)이 요망되는 특이성의 dAb 또는 단일 가변 도메인으로 대체된, 통상적으로 4개 사슬 구조의 IgG 분자 (2개의 중쇄 및 2개의 경쇄)를 지닌다. 바람직하게는, 각각의 가변 영역 (2개의 VH 영역 및 2개의 VL 영역)은 dAb 또는 단일 가변 도메인으로 대체된다. IgG-유사 포맷에 포함된 dAb(들) 또는 단일 가변 도메인(들)은 동일한 특이성 또는 상이한 특이성을 지닐 수 있다. 몇몇 구체예에서, IgG-유사 포맷은 4가이고, 1, 2, 3 또는 4개의 특이성을 지닐 수 있다. 예를들어, IgG-유사 포맷은 단일특이적이며, 동일한 특이성을 지니는 4개의 dAb를 포함하거나; 이중특이적이며, 동일한 특이성을 지니는 3개의 dAb 및 상이한 특이성을 지니는 또 다른 dAb를 포함하거나; 이중특이적이며, 동일한 특이성을 지니는 두개의 dAb 및 동일하지만 상이한 특이성을 지니는 두개의 dAb를 포함하거나; 삼중특이적이며, 동일한 특이성을 지니는 제 1 및 제 2 dAb, 상이한 특이성을 지니는 제 3 dAb, 및 제 1, 제 2 및 제 3 dAb와 다른 특이성을 지니는 제 4 dAb를 포함하거나; 사중특이적이며, 각각 상이한 특이성을 지니는 4개의 dAb를 포함할 수 있다. IgG-유사 포맷의 항원 결합 단편 (예를들어, Fab, F(ab')2, Fab', Fv, scFy)이 제조될 수 있다. 바람직하게는, IgG-유사 포맷 또는 이의 항원 결합 단편은 TNFR1를 가교시키지 않는다.
dAb 단량체, 이합체 및 삼합체를 포함하는 본 발명에 따른 리간드는 CH2 및 CH3 도메인중 하나 또는 둘 모두, 및 임의로 힌지 영역을 포함하는 항체 Fc 영역에 연결될 수 있다. 예를들어, Fc 영역에 대해 단일 누클레오티드 서열로서 연결된 리간드를 엔코딩하는 벡터가 상기 폴리펩티드를 제조하기 위해 사용될 수 있다.
더욱이, 본 발명은 본 발명의 다음 양태에 따라 상기 언급된 dAb 단량체의 이합체, 삼합체 및 다합체를 제공한다.
본 발명에 따른 리간드는 비-면역글로불린 다중-리간드 구조로 조합되고/되거나 포맷화되어 다가 복합체를 형성할 수 있고, 이는 동일한 항원을 지닌 표적 분자에 결합함으로써 우수한 결합성을 제공한다. 몇몇 구체예에서, 하나 이상의 가변 도메인은 항원에 결합하여 다합체의 반감기를 증가시킨다. 예를들어, 천연 박테리아 수용체, 예를들어 SpA는 CDR의 이식을 위한 스캐폴드로서 사용되어 하나 이상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 리간드를 생성시킨다. 이러한 과정의 상세한 설명은 US 5,831,012에 기술되어 있다. 기타 적절한 스캐폴드는 피브로넥틴 및 어피바디에 기초한 것을 포함한다. 적절한 과정의 상세한 설명은 WO 98/58965에 기술되어 있다. 기타 적절한 스캐폴드는 문헌[van den Beuken et al., J. Mol. Biol. (2001) 310, 591-601]에 기술된 바와 같은 리포칼린 및 CTLA4, 예를들어 박테리아 GroEL 또는 기타 샤페론 폴리펩티드의 고리 구조에 기초한 문헌[WO 00/69907 (Medical Research Council)]에 기술된 것과 같은 스캐폴드를 포함한다.
단백질 스캐폴드는 조합될 수 있고; 예를들어, CDR은 CTLA4 스캐폴드에 이식될 수 있고, 면역글로불린 VH 또는 VL 도메인과 함께 사용하여 리간드를 형성할 수있다. 유사하게, 피브로넥틴, 리포칼린 및 기타 스캐폴드가 조합될 수 있다.
이중특이적 및 다중특이적 리간드
본 발명자들은 이들의 공동계류중인 국제 특허 출원 WO 03/002609 및 공동계류중인 공개되지 않은 영국 특허 출원 0230203.2호에서, 각각 상이한 특이성을 지니는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 이중특이적 면역글로불린 리간드를 기재하였다. 상기 도메인들은 표적 분자 상의 항원 또는 에피토프에 대해 서로 경쟁하거나 이에 대해 독립적으로 결합할 수 있다.
본 발명에 따른 이중특이적 리간드는 바람직하게는 중쇄 및 경쇄 도메인의 조합물을 포함한다. 예를들어, 이중특이적 리간드는 scFv의 형태로 서로 연결될 수 있는 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함할 수 있다. 또한, 리간드는 하나 이상의 CH 또는 CL 도메인을 포함할 수 있다. 예를들어, 리간드는 CH1 도메인, CH2 또는 CH3 도메인, 및/또는 CL 도메인, Cμ1, Cμ2, Cμ3 또는 Cμ4 도메인, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다. 힌지 영역 도메인이 또한 포함될 수 있다. 이러한 도메인의 조합물은, 예를들어, 미믹(mimic) 천연 항체, 예를들어 IgG 또는 IgM, 또는 이들의 단편, 예를들어 Fv, scFv, Fab 또는 F(ab')2 분자일 수 있다. 기타 구조, 예를들어 VH, VL, CH1 및 CL 도메인을 포함하는 IgG 분자의 단일 암(arm)이 예견된다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 가변 영역은 단일 도메인 V 유전자 레퍼토리로부터 선택된다. 일반적으로, 단일 항체 도메인의 레퍼토리는 섬유상 박테리오파지의 표면에 전시된다. 한 바람직한 구체예에서, 각각의 단일 항체 도메인은 항원에 대한 파지 레퍼토리의 결합에 의해 선택된다.
본 발명의 한 바람직한 구체예에서, 각각의 단일 가변 도메인은 상보적 가변 영역의 부재하에서 표적 항원 또는 에피토프에 대한 결합에 대해 선택될 수 있다. 대안적 구체예에서, 단일 가변 도메인은 상보적 가변 영역의 존재하에서 표적 항원 또는 에피토프에 대한 결합에 대해 선택될 수 있다. 따라서, 제 1 단일 가변 도메인은 제 3 상보적 가변 도메인의 존재하에서 선택될 수 있고, 제 2 가변 도메인은 제 4 상보적 가변 도메인의 존재하에서 선택될 수 있다. 상보적 제 3 및 제 4 가변 도메인은 시험되는 단일 도메인과 동일한 특이성을 지니는 천연 동족 가변 도메인, 또는 "더미" 가변 도메인과 같은 비-동족 상보적 도메인일 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 이중특이적 리간드는 단지 두개의 가변 도메인을 포함하지만, 이러한 여러 리간드는 동일한 단백질로 함께 포함될 수 있고, 예를들어, 두개의 상기 리간드는 IgG 또는 다합체 면역글로불린, 예를들어 IgM으로 포함될 수 있다. 대안적으로, 또 다른 구체예에서, 다수의 이중특이적 리간드가 조합되어 다합체를 형성할 수 있다. 예를들어, 두개의 상이한 이중특이적 리간드가 조합되어 사중특이적 분자를 생성할 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 생성된 이중특이적 리간드의 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 동일한 폴리펩티드 사슬이거나, 상이한 폴리펩티드 사슬일 수 있음을 당업자는 인지할 것이다. 가변 영역이 상이한 폴리펩티드 사슬인 경우, 이들은 링커, 일반적으로 가요성 링커 (예를들어, 폴리펩티드 사슬), 화학적 결합기, 또는 당 분야에 공지된 임의의 방법을 통해 결합될 수 있다.
제 1 형에서, 본 발명은 리간드의 하나의 특이성이 생물체의 체내에 존재하는 단백질 또는 폴리펩티드에 대해 작용함으로써 리간드의 반감기를 증가시키도록 작용할 수 있는 단백질 또는 폴리펩티드에 특이적인, 본 발명자들에 의해 개발된 이중특이적 리간드를 추가로 개선시켰다.
따라서, 제 1 양태에서, 제 1 항원 또는 에피토프에 대한 결합 특이성을 지니는 제 1 면역글로불린 단일 가변 도메인, 및 제 2 항원 또는 에피토프에 대한 결합 특이성을 지니는 제 2 상보적 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 이중특이적 리간드가 제공되고, 여기서 상기 항원 또는 에피토프중 하나 또는 둘 모두는 생체내에서 리간드의 반감기를 증가시키고, 상기 제 1 및 제 2 도메인은 동일한 특이성을 공유하는 서로 상보적인 도메인이 상호 결핍되어 있으나, 단 상기 이중 특이성 리간드는 항-HSA VH 도메인 및 항-β 갈락토시다아제 Vκ 도메인으로 구성되지 않는다. 바람직하게는, 제 1 또는 제 2 가변 도메인 두 모두는 인간 혈청 알부민 (HSA)에 대해 결합하지 않는다.
본원에 기술된 리간드의 반감기를 증가시키는 항원 또는 에피토프는 유리하게는 생체내 유기체에서 발견되는 단백질 또는 폴리펩티드에 존재한다. 이의 예는 세포외 기질 단백질, 혈액 단백질, 및 유기체의 여러 조직에 존재하는 단백질을 포함한다. 단백질은, 예를들어 충전재로서 작용하거나 요망되는 작용 부위로 리간드를 고정시킴으로써 혈액으로부터의 리간드 제거 속도를 감소시킨다. 생체내 반감기를 증가시키는 항원/에피토프의 예는 하기 부록 1에 주어진다.
증가된 반감기는 면역글로불린, 특히 항체, 더욱 특히 작은 크기의 항체 단편의 생체내 적용에 유용하다. 이러한 단편 (Fvs, 이황화 결합된 Fv, Fab, scFv, dAb)은 신체로부터 신속하게 제거된다; 따라서, 이들은 신체의 대부분의 부분에 신속하게 도달할 수 있고, 신속하게 생성되고 취급하기에 용이한 반면, 이들의 생체내 적용은 단지 이들의 짧은 생체내 지속성에 의해 제한되어 왔다. 본 발명은 생체내 리간드의 증가된 반감기 및 이에따른 리간드의 신체에서의 기능적 활성에서의 보다 긴 지속시간을 제공함으로써 상기 문제를 해결하였다.
약동학 분석 및 리간드 반감기의 결정 방법은 당업자에게 친숙하다. 상세한 설명은 문헌[Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and in Peters et al., Pharmacokinetc analysis: A Practical Approach (1996)]에서 발견될 수 있다. 문헌["Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2nd Rev. ex edition (1982)]이 또한 참조가 되고, 여기에는 t 알파 및 t 베타 반감기 및 곡선하 영역 (AUC)과 같은 약동학 파라미터가 기재되어 있다.
반감기 (t1/2 알파 및 t1/2 베타) 및 AUC는 시간에 대한 리간드의 혈청 농도의 곡선으로부터 결정될 수 있다. 윈놀린 (WinNonlin) 분석 패키지 (파사이트 코프 (Pharsight Corp., Mountain View, CA94040, USA)에서 구입가능)가 예를들어 상기 곡선을 모델링하기 위해 사용될 수 있다. 제 1 단계 (알파 단계)에서, 리간드는 약간의 제거와 함께 환자에서 주로 분포되어 있다. 제 2 단계 (베타 단계)는 리간드가 분포되고, 리간드가 환자로부터 제거됨에 따라 혈청 농도가 감소되는 경우의 말기 단계이다. t 알파 반감기는 제 1 단계의 반감기이고, t 베타 반감기는 제 2 단계의 반감기이다. 따라서, 유리하게는, 본 발명은 15분 이상의 범위의 tα 반감기를 지니는 본 발명에 따른 리간드 또는 이러한 리간드를 포함하는 조성물을 제공한다. 한 구체예에서, 상기 범위의 하위 말단은 30분, 45분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 10시간, 11시간 또는 12시간이다. 또한 또는 대안적으로, 본 발명에 따른 리간드 또는 조성물은 12시간 이하의 범위의 tα 반감기를 지닐 것이다. 한 구체예에서, 상기 범위의 상위 말단은 11, 10, 9, 8, 7, 6 또는 5 시간이다. 적절한 범위의 예는 1 내지 6시간, 2 내지 5시간 또는 3 내지 4시간이다.
유리하게는, 본 발명은 2.5시간 이상의 범위의 tβ 반감기를 지니는 본 발명에 따른 리간드 또는 이러한 리간드를 포함하는 조성물을 제공한다. 한 구체예에서, 상기 범위의 하위 말단은 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 10시간, 11시간 또는 12시간이다. 또한 또는 대안적으로, 본 발명에 따른 리간드 또는 조성물은 21일 이하의 범위의 tβ 반감기를 지닌다. 한 구체예에서, 상기 범위의 상위 말단은 12시간, 24시간, 2일, 3일, 5일, 10일, 15일 또는 20일이다. 유리하게는, 본 발명에 따른 리간드 또는 조성물은 12 내지 60시간의 tβ 반감기를 지닐 것이다. 한 추가 구체예에서, 이는 12 내지 48시간이다. 한 추가 구체예에서, 이는 12 내지 26시간이다.
또한 또는 대안적으로, 상기 기준에 대해, 본 발명은 1 mg.분/ml 이상의 범위의 AUC 값 (곡선하 영역)을 지니는 본 발명에 따른 리간드 또는 이러한 리간드를 포함하는 조성물을 제공한다. 한 구체예에서, 상기 범위의 하위 말단은 5, 10, 15, 20, 30, 100, 200 또는 300 mg.분/ml이다. 또한 또는 대안적으로, 본 발명에 따른 리간드 또는 조성물은 600 mg.분/ml 이하의 범위의 AUC를 지닌다. 한 구체예에서, 상기 범위의 상위 말단은 500, 400, 300, 200, 150, 100, 75 또는 50 mg.분/ml이다. 유리하게는, 본 발명에 따른 리간드는 15 내지 150 mg.분/ml, 15 내지 100 mg.분/ml, 15 내지 75 mg.분/ml, 및 15 내지 50mg.분/ml으로 구성된 군으로부터 선택된 범위의 AUC를 지닌다.
제 1 구체예에서, 이중특이적 리간드는 두개의 상보적 가변 도메인, 즉 본 발명의 문맥에서 이들이 이들의 동족 에피토프에 개별적으로 결합하더라도 이들의 천연 환경에서 동족 쌍 또는 기로서 함께 작용할 수 있는 두개의 가변 도메인을 포함한다. 예를들어, 상보적 가변 도메인은 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 (VH 및 VL)일 수 있다. VH 및 VL 도메인은 유리하게는 scFv 또는 Fab 항체 단편에 의해 제공된다. 가변 도메인은, 예를들어 각각의 V 도메인의 C-말단에서의 힌지 영역 및 이러한 힌지 영역에서 시스테인 사이의 이황화결합의 공급; 또는 상기 도메인의 C-말단에서의 함께 이황화 결합되는 시스테인과 함께 각각의 dAb의 제공; 또는 Fab 포맷을 생성하기 위한 V-CH & V-CL의 생성; 또는 이합체, 삼합체 및 추가의 다합체를 생성하기 위한 펩티드 링커 (예를들어, 하기에 논의되는 Gly4Ser 링커)의 사용에 의해 함께 연결되어 다가 리간드를 형성할 수 있다.
본 발명자들은 상보적 가변 도메인의 사용이 두개의 도메인 표면을 함께 패킹시키고 용매로부터 격리시키는 것을 발견하였다. 더욱이, 상보적 도메인은 서로 안정화시킬 수 있다. 또한, 이는 종래 분야에서 사용되었던 하이브리드 하이브리도마의 불이익 또는 서브유닛 인터페이스에서 중쇄 또는 경쇄를 고안할 필요 없이 이중특이적 IgG 항체의 생성을 가능케 한다. 본 발명의 제 1 양태의 이중특이적 리간드는 하나 이상의 VH/VL 쌍을 지닌다. 따라서, 이러한 발명에 따른 이중특이적 IgG는 Y 형 분자의 각각의 암에 대한 하나의 쌍인 두개의 상기 쌍을 포함한다. 따라서, 사용되는 사슬의 비가 이의 제조의 성공에서 결정적 원인으로, 실용적인 어려움을 발생시키는 통상적인 이중특이적 항체 또는 디아바디와는 달리, 본 발명의 이중특이적 사슬 균형의 문제로부터 자유롭다. 통상적인 이중특이적 항체에서의 사슬 불균형은 VL 사슬 1과 함께 VH 사슬 1이 항원 또는 에피토프 1에 결합할 수 있고, VL 사슬 2와 함께 VH 사슬 2가 항원 또는 에피토프 2에 결합할 수 있고, 두개의 올바른 쌍이 어떤 방식으로든 서로 연결되는 경우, 두개의 상이한 VL 사슬과 두개의 상이한 VH 사슬의 회합으로부터 유래된다. 따라서, 단지 단일 분자에서 VL 사슬 1이 VH 사슬 1과 쌍이 되고, VL 사슬 2가 VH 사슬 2와 쌍이 되는 경우 이중특이성이 생성된다. 이러한 이중특이적 분자는 두개의 상이한 방식으로 생성될 수 있다. 첫재로, 이들은 각각 상이한 항원 또는 에피토프에 결합하는 두개로 존재하는 VH/VL 쌍 (예를들어, 이중특이적 IgG)의 회합에 의해 생성될 수 있다. 이러한 경우, VH/VL 쌍은 이중특이성인 모둔 분자의 집단을 생성시키기 위해 모두 함께 1:1의 비로 생성되어야 한다. 이는 (상보적 CH 도메인이 "놉스 인투 홀스(knobs into holes)" 기술에 의해 향상되더라도) 결코 하나의 항원 또는 에피토프에 결합할 수 있으나 서로 결합하지 않는 이중특이적 분자 및 분자들의 혼합물을 발생시키지 않는다. 이중특이적 항체를 생성하는 두번째 방법은 두개의 상이한 VH 사슬과 두개의 상이한 VL 사슬의 동시적인 회합(예를들어, 이중특이적 디아바디)에 의한 방법이다. 이러한 경우, VH 사슬 1을 지닌 쌍에 대해 VL 사슬 1이, VH 사슬 2를 지닌 쌍에 대해 VL 사슬 2가 선호 (이는 VL 및 VH 도메인의 "놉스 인투 홀스" 기술에 의해 향상될 수 있음)되는 경향이 있지만, 이러한 쌍은 모든 분자에서 달성되지 않으며, 혼합 포뮬레이션을 발생시켜 항원 또는 에피토프에 결합할 수 없는 부정확한 쌍이 발생한다.
본 발명의 제 1 양태에 따른 이중특이적 리간드 방법에 따라 작제된 이중특이적 항체는 항원 또는 에피토프 1에 대한 결합이 VH 또는 VL 도메인 내, 항원 또는 에피토프 2에 대한 결합이 상보적 VL 또는 VH 도메인 내에 각각 존재하므로, 상기 모든 문제점을 극복한다. 1:1 기초의 모든 VH/VL 쌍에서의 VH 및 VL 도메인 쌍은 이중특이적이며, 따라서 이러한 VH/VL 쌍을 이용하여 작제된 모든 포맷 (Fv, scFv, Fab, 미니바디, IgG 등)은 100% 이중특이적 활성을 지닐 것이다.
본 발명의 문맥에서, 제 1 및 제 2 "에피토프"는 동일하지 않고, 단일한 단일특이적 리간드에 의해 결합되지 않는 에피토프로 이해된다. 본 발명의 제 1 형에서, 이들은 유리하게는 상이한 항원에 존재하고, 이중 하나는 생체내 리간드의 반감기를 증가시킨다. 또한, 제 1 및 제 2 항원은 유리하게는 동일하지 않다.
본 발명의 이중특이적 리간드는 WO 02/02773에 기술된 리간드를 포함하지 않는다. 따라서, 본 발명의 리간드는 협동적으로 임의의 하나 이상의 항원 또는 에피토프에 결합하는 상보적 VH/VL 쌍을 포함하지 않는다. 대신, 본 발명의 제 1 양태에 따른 리간드는 VH/VL 상보적 쌍을 포함하고, 여기서 V 도메인은 상이한 특이성을 지닌다. 더욱이, 본 발명의 제 1 양태에 따른 리간드는 구조적으로 관련되지 않은 에피토프 또는 항원에 대해 상이한 특이성을 지니는 VH/VL 상보적 쌍을 포함한다. 구조적으로 관련된 에피토프 또는 항원은 항원 또는 에피토프에 결합하기 위해 협동적인 방식으로 작용하는 통상적인 VH/VL 상보적 쌍에 의해 결합되는 충분한 구조적 유사성을 지니는 에피토프 또는 항원이고; 구조적으로 관련된 에피토프의 경우, 에피토프는 이들이 VH/VL 이합체의 항원 결합 부위에서 형성된 동일한 결합 포켓(pocket) 내로 "피트(fit)"되는 구조와 충분히 유사하다.
제 2 양태에서, 본 발명은 제 1 항원 또는 에피토프 결합 특이성을 지니는 제 1 면역글로불린 가변 도메인 및 제 2 항원 또는 에피토프 결합 특이성을 지니는 제 2 면역글로불린 가변 도메인을 포함하는 리간드를 제공하고, 상기 제 1 및 제 2 가변 도메인중 하나 또는 둘 모두는 생체내에서의 리간드의 반감기를 증가시키는 항원에 결합하고, 가변 도메인은 서로 상보적이지 않다.
한 구체예에서, 하나의 가변 도메인을 통한 결합은 제 2 가변 도메인을 통한 리간드의 결합을 조절한다.
이 구체예에서, 가변 도메인은, 예를들어 VH 도메인의 쌍 또는 VL 도메인의 쌍일 수 있다. 제 1 부위에서의 항원의 결합은 제 2 부위에서의 항원의 결합을 향상하거나 억제하는 것과 같이 조절할 수 있다. 예를들어, 제 1 부위에서의 결합은 제 2 부위에서의 항원의 결합을 적어도 부분적으로 억제한다. 이러한 구체예에서, 리간드는, 예를들어 제 2 표적 항원으로 결합되고 반감기 증가 단백질로부터 해리되는 시간까지 리간드의 반감기를 증가시키는 단백질로의 결합을 통해 생체내에서의 피검체 유기체의 신체에서 유지될 수 있다.
상기 문맥에서의 결합의 조절은 서로에 대한 항원 결합 부위의 구조적 근접의 결과에 따라 달성된다. 이러한 구조적 근접은 항원 결합 부위를 밀접한 근접으로 고정시키는 비교적 단단한 구조를 지닌 리간드의 공급에 의해 두개 이상의 항원 결합 부위를 결합시키는 구조적 성분의 특성에 의해 달성될 수 있다. 유리하게는, 두개 이상의 항원 결합 부위는 서로에 대해 물리적으로 밀접한 근접하여 있어, 면역글로불린 분자 내에서의 입체구조적 간섭 및/또는 형태 변화를 포함하는 과정에 의해 다른 부위에서의 항원의 결합을 조절한다.
제 1 및 제 2 항원 결합 도메인은 공유적으로 또는 비공유적으로 회합될 수 있다. 도메인이 공유적으로 회합되는 경우, 회합은, 예를들어 이황화결합 또는 폴리펩티드 링커, 예를들어 (Gly4Ser)n에 의해 매개될 수 있고, 여기서 n은 1 내지 8, 예를들어 2, 3, 4, 5 또는 7이다.
가변 도메인이, 예를들어 본원에 기술된 파지 전시 기술을 이용하여 선택된 V-유전자 레퍼토리로부터 선택되는 경우, 이들 가변 도메인은 유니버셜 프레임워크 영역을 포함할 수 있어, 이들은 본원에 정의된 특이적 일바 리간드에 의해 인지될 수 있다. 유니버셜 프레임워크 및 일반 리간드 등의 사용은 WO 99/20749에 기술되어 있다. 본 발명에서, 파지 전시에 대한 참조는 파지 및/또는 파지미드 둘 모두의 사용을 포함한다.
V-유전자 레퍼토리가 폴리펩티드에서의 변이에 사용되는 경우, 서열은 바람직하게는 가변 도메인의 구조적 루프 내에 위치된다. 가변 도메인의 폴리펩티드 서열은 각각의 가변 도메인과 이의 상보적 쌍의 상호작용을 향상시키기 위해 DNA 셔플링(shuffling) 또는 돌연변이에 의해 변경될 수 있다. DNA 셔플링은 당 분야에 공지되어 있고, 예를들어 문헌[Stemmer, Nature 370:389-391 (1994)] 및 미국 특허 제 6,297,053호에 교시되어 있으며, 둘 모두는 참조로서 본원에 포함되어 있다. 돌연변이 유발의 기타 방법이 당업자에게 널리 공지되어 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, '이중특이적 리간드'는 단일 사슬 Fv 단편이다. 본 발명의 대안적 구체예에서, 용어 '이중특이적 리간드'는 항체의 Fab 영역으로 구성된다. 용어 "Fab 영역"은 두개의 VH 또는 두개의 VL 도메인이 사용되는 Fab-유사 영역을 포함한다.
가변 영역은 표적 항원 또는 에피토프에 특이적인 항체로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 이들은 섬유상 박테리오파지의 표면에 발현되는 것과 같은 단일 항체 도메인의 레퍼토리로부터 유래될 수 있다. 하기 기술된 바와 같이 선택이 수행될 수 있다.
한 추가 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 이중특이적 리간드를 엔코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 제공한다. 이중특이적 리간드는 단일 핵산 분자에 대해 엔코딩될 수 있고; 대안적으로, 각각의 도메인은 별개의 핵산 분자에 의해 엔코딩될 수 있다. 리간드가 단일 핵산 분자에 의해 엔코딩되는 경우, 도메인은 scFv 분자의 방식으로 융합 폴리펩티드로서 발현될 수 있거나, 별도로 발현되어, 예를들어 화학 결합제를 이용하여 이후 서로 결합될 수 있다. 별개의 핵산으로부터 발현된 리간드는 적절한 수단에 의해 함께 결합될 것이다.
핵산은 발현시 숙주세포로부터의 폴리펩티드의 수출을 위한 신호 서열을 추가로 엔코딩할 수 있고, 발현시 섬유상 박테리오파지 입자의 표면 성분 (또는 선택 전시 시스템의 기타 성분)과 함께 융합될 수 있다.
한 추가 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 이중특이적 리간드를 엔코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
또 다른 한 추가 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 이중특이적 리간드를 엔코딩하는 벡터로 트랜스펙션된 숙주세포를 제공한다.
이러한 벡터로부터의 발현은, 예를들어 박테리오파지 입자의 표면에서의 선택을 위한 가변 도메인을 생성시키도록 형성될 수 있다. 이는 전시된 가변 영역의 선택 및 이에 따른 본 발명의 방법을 이용하여 '이중특이적 리간드'의 선택을 가능케 한다.
본 발명은 본 발명에 따른 하나 이상의 이중특이적 리간드를 포함하는 키트를 추가로 제공한다.
제 3 양태에서, 본 발명은 제 1 결합 특이성을 지니는 제 1 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 제 2 (상이한) 결합 특이성을 지니는 제 2 단일 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 리간드를 생성하는 방법을 제공하고, 상기 결합 특성중 하나 또는 둘 모두는 생체내에서의 리간드의 반감기를 증가시키는 항원에 대해 특이적이고, 상기 방법은 a) 제 1 에피토프에 대한 결합에 대한 제 1 가변 도메인의 능력에 의해 이를 선택하는 단계, b) 제 2 에피토프에 대한 결합에 대한 제 2 가변 영역의 능력에 의해 이를 선택하는 단계, c) 가변 도메인을 조합시키는 단계, 및 d) 제 1 에피토프 및 제 2 에피토프에 대한 결합에 대한 리간드의 능력에 의해 이를 선택하는 단계를 포함한다.
리간드는 동시에 제 1 및 제 2 에피토프에 대해 결합할 수 있거나, 에피토프 결합에 대한 결합 도메인 사이에 경쟁이 존재하는 경우, 하나의 도메인의 결합은 또 다른 도메인의 동족 에피토프에 대한 이의 결합을 방해할 수 있다. 따라서, 한 구체예에서, 상기의 단계 (d)는 제 1 및 제 2 (및 가능하게는 추가의) 에피토프 둘 모두에 대한 동시적 결합을 필요로 하며; 또 다른 구체예에서는, 제 1 및 제 2 에피토프에 대한 결합은 동시적이지 않다.
에피토프는 바람직하게는 별개의 항원에 존재한다.
리간드는 유리하게는 상기 기술된 바와 같이 면역글로불린 가변 도메인의 VH/VL 조합물, 또는 VH/VH 또는 VL/VL 조합물을 포함한다. 더욱이, 리간드는 카멜리드 VHH 도메인을 포함하나, 단 생체내에서의 리간드의 반감기를 증가시키는 항원 대해 특이적인 VHH 도메인은 문헌[Conrath et al., (2001) JBC 276:7346-7350] 및 WO99/23221호에 기술된 바와 같이 계란 흰자 라이소자임 (HEL), 돼지 이자 알파-아밀라아제 또는 NmC-A; hcg, BSA-결합된 RR6 아조 염료 또는 S.뮤탄스(S. mutans) HG982 세포에 결합하지 않고, 상기 두 문헌중 어느 것도 생체내에서의 리간드의 반감기를 증가시키기 위해 반감기를 증가시키는 항원에 대한 특이성의 용도를 기술하지 않는다.
한 구체예에서, 상기 제 1 가변 도메인이 상보적 가변 도메인의 부재하에서 상기 제 1 에피토프로의 결합에 대해 선택된다. 한 추가 구체예에서, 제 1 가변 도메인이 제 2 가변 도메인과는 상이하고, 제 1 도메인에 상보적인 제 3 가변 도메인의 존재하에서 제 1 에피토프/항원에 대한 결합에 대해 선택된다.
유사하게, 제 2 도메인은 상보적 가변 도메인의 부재 또는 존재하에서 선택될 수 있다.
본 발명의 리간드에 의해 표적화된 항원 또는 에피토프, 및 반감기 향상 단백질은 임의의 항원 또는 에피토프일 수 있으나, 유리하게는 치료 이익을 지니도록 표적화되는 항원 또는 에피토프이다. 본 발명은 임의의 표적, 특히 본원에서 추가로 확인된 표적들에 대해 특이적인 개방 형태 및 폐쇄 형태, 및 분리된 dAb 단량체 리간드를 포함하는 리간드를 제공한다. 이러한 표적은 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산, 또는 이들의 일부일 수 있고, 이들은 자연적으로 발생될 수 있거나 합성될 수 있다. 이러한 양태에서, 본 발명의 리간드는 에피토프 또는 항원에 결합할 수 있고, 길항제 또는 효능제 (예를들어, EPO 수용체 효능제)로 작용할 수 있다. 당업자는 선택이 광범위하고 다양하다는 것을 인지할 것이다. 이들은, 예를들어 인간 또는 동물 단백질, 사이토카인, 사이토카인 수용체, 효소, 효소에 대한 보조인자 또는 DNA 결합 단백질일 수 있다. 적절한 사이토카인 및 성장인자는 ApoE, Apo-SAA, BDNF, 카디오트로핀(Cardiotrophin)-1, EGF, EGF 수용체, ENA-78, 에오탁신(Eotaxin), 에오탁신-2, 엑소두스(Exodus)-2, EpoR, FGF-산, FGF-염기, 섬유모세포 성장인자-10, FLT3 리간드, 프랙탈카인(Fractalkine) (CX3C), GDNF, G-CSF, GM-CSF, GF-β1, 인슐린, IFN-γ, IGF-I, IGF-II, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (72 아미노산), IL-8 (77 아미노산), IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 (IGIF), 인히빈α, 인히빈β, IP-1O, 각질세포 성장인자-2 (KGF-2), KGF, 렙틴(Leptin), LIF, 림포택틴(Lymphotactin), 뮐러리안(Mullerian) 억제 물질, 단핵구 콜로니 억제인자, 단핵구 유인 단백질, M-CSF, MDC (67 아미노산), MDC (69 아미노산), MCP-1 (MCAF), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MDC (67 아미노산), MDC (69 아미노산), MIG, MIP-1α, MlP-1β, MIP-3α, MIP-3β, MIP-4, 골수 전구세포 억제인자-1 (MPIF-I), NAP-2, 뉴르투린(Neurturin), 신경성장인자, β-NGF, NT-3, NT-4, 온코스타틴 M, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4, RANTES, SDF1α, SDF1β, SCF, SCGF, 줄기세포 인자(SCF), TARC, TGF-α, TGF-β, TGF-β2, TGF-β3, 종양 괴사인자(TNF), TNF-α, TNF-β, TNF 수용체 I, TNF 수용체 II, TNIL-I, TPO, VEGF, VEGF 수용체 1, VEGF 수용체 2, VEGF 수용체 3, GCP-2, GRO/MGSA, GRO-β, GRO-γ, HCC1, 1-309, HER 1, HER 2, HER 3 및 HER 4를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 사이토카인 수용체는 상술한 사이토카인에 대한 수용체를 포함한다. 상기 리스트는 총망라된 것이 아님이 인지될 것이다.
본 발명의 한 구체예에서, 가변 도메인은 항원 또는 에피토프에 특이적인 각각의 항체로부터 유래된다. 한 바람직한 구체예에서, 가변 도메인은 단일 가변 항체 도메인의 레퍼토리로부터 유래된다.
제 2 형에서, 본 발명은 다중특이적 리간드를 제공한다. 본 발명에 따르면, 용어 "다중특이적 리간드"는 본원에 정의된 하나 이상의 에피토프 결합 특이성을 지니는 리간드를 의미한다. 일반적으로, 다중특이적 리간드는 두개 이상의 에피토프 결합 도메인을 포함한다.
본 발명에 따른 에피토프 결합 도메인은 단백질 스캐폴드 및 에피토프 상호작용 부위 (유리하게는, 단백질 스캐폴드의 표면에 존재함)를 포함한다. 본 발명에 따르면, 유리하게는, 각각의 에피토프 결합 도메인은 상이한 에피토프 결합 특이성을 지닌다.
본 발명의 문맥에서, 제 1 및 제 2 "에피토프"는 동일하지 않고 단일한 단일특이성 리간드에 의해 결합되지 않는 에피토프인 것으로 이해된다. 이들은 상이한 항원 또는 동일한 항원에 대해 존재할 수 있으나, 이들은 통상적인 항체의 단일한 단일특이성 VH/VL 결합쌍에 의해 결합될 수 있는 단일 존재물을 형성하지 않는 충분한 거리로 분리되어 있다. 실험적으로, 단실 사슬 항체 형태 (도메인 항체 또는 dAb) 내의 개별적 가변 도메인 둘 모두가 두개의 에피토프에 대한 단일특이적 VH/VL 리간드에 의해 별개로 경쟁되는 경우, 이들 두 에피토프는 본 발명에 따라 별개의 에피토프로 여겨지는 충분히 멀리 떨어져 있지 않은 것이다.
본 발명에 따르면, 유리하게는, 각각의 에피토프 결합 도메인은 면역글로불린 가변 도메인을 포함한다. 더욱 유리하게는, 각각의 면역글로불린 가변 도메인은 가변 경쇄 도메인 (VL)이거나 가변 중쇄 도메인 VH일 것이다. 본 발명의 제 2 형에서, 본 발명에 따른 리간드에서 발현되는 경우 면역글로불린 도메인은 비상보적이고, 이는 이들이 회합되어 VH/VL 항원 결합 부위를 형성하지 않는다는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명의 제 2 형에 정의된 다중특이적 리간드는 동일한 서브타입의 면역글로불린 도메인을 포함하고, 이는 가변 경쇄 도메인 (VL) 또는 가변 중쇄 도메인 (VH)이다. 더욱이, 본 발명에 따른 리간드가 폐쇄 형태인 경우, 면역글로불린 도메인은 카멜리드 VHH 타입일 것이다.
한 대안적 구체예에서, 본 발명에 따른 리간드(들)은 카멜리드 VHH 도메인을 포함하지 않는다. 더욱 특히, 본 발명의 리간드(들)은 인간 VH 도메인에 비해 카멜리드 VHH 도메인에 특이적인 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하지 않는다.
유리하게는, 단일 가변 도메인은 상이한 항원 또는 에피토프에 대한 결합 활성에 대해 선택된 항체로부터 유래된다. 예를들어, 가변 도메인은 인간 면역화에 의해 적어도 부분적으로 분리될 수 있다. 인간 항체 라이브러리로부터의 분리 및 인공 항체 유전자의 합성을 포함하는 대안적 방법이 당 분야에 공지되어 있다.
가변 도메인은 유리하게는 초항원, 예를들어 단백질 A 또는 단백질 L에 결합한다. 초항원에 대한 결합은 정확하게 폴딩된 항체 가변 도메인의 특성으로, 이는 이러한 도메인이 예를들어 재조합 도메인 또는 돌연변이 도메인의 라이브러리로부터 구별될 수 있도록 한다.
에피토프 결합 도메인은 또한 면역글로불린 도메인이 아닌 단백질 스캐폴드 또는 골격에 기초될 수 있다. 예를들어, 천연 박테리아 수용체, 예를들어 SpA가 하나 이상의 에피토프에 대해 특이적으로 결합하는 리간드를 생성시키기 위해 CDR의 이식을 위한 스캐폴드로서 사용되어 왔다. 이러한 과정의 상세한 설명은 US 5,831,012에 기술되어 있다. 기타 적합한 스캐폴드는 피브로넥틴 및 어피바디에 기초한 것을 포함한다. 적합한 과정에 대한 상세한 설명은 WO 98/58965에 기술되어 있다. 기타 적합한 스캐폴드는 문헌[van den Beuken et al., J. Mol. Biol. (2001) 310, 591-601]에 기술된 리포칼린 및 CTLA4, 및 WO0069907 (Medical Research Council)에 기술된 것과 같은 스캐폴드를 포함하고, 이들은, 예를들어 박테리아 GroEL 또는 기타 샤페론 폴리펩티드의 고리 구조를 기초로 한다.
단백질 스캐폴드는 조합될 수 있고; 예를들어, CDR은 CTLA4 스캐폴드에 이식될 수 있고, 면역글로불린 VH 또는 VL 도메인과 함께 사용되어 다가 리간드를 형성할 수 있다. 유사하게, 피브로넥틴, 리포칼린 및 기타 스캐폴드가 조합될 수 있다.
한 구체예에서, 다중특이적 리간드는 적합한 단백질 스캐폴드 또는 골격에 이식된 본원에 기술된 TNFR1에 결합하는 단일 면역글로불린 도메인 (dAb)의 CDR을 포함하는 에피토프 결합 도메인을 포함한다.
본 발명에 따라 생성된 폐쇄 형태의 다중특이적 리간드의 에피토프 결합 도메인이 동일한 폴리펩티드 사슬에 존재할 수 있거나, 대안적으로 상이한 폴리펩티드 사슬에 존재할 수 있다는 것이 당업자에게 인지될 것이다. 가변 영역이 상이한 폴리펩티드 사슬에 존재하는 경우, 이들은 링커, 유리하게는 가요성 링커 (예를들어, 폴리펩티드 사슬), 화학적 결합기, 또는 당 분야에 공지된 임의의 기타 방법을 통해 연결될 수 있다.
제 1 및 제 2 에피토프 결합 도메인은 공유적으로 또는 비공유적으로 회합될 수 있다. 도메인이 공유적으로 회합되는 경우, 상기 회합은 예를들어 이황화결합에 의해 매개될 수 있다.
본 발명의 제 2 형의 특정 구체예에서, 에피토프는 결합시에 서로 대체될 수 있다. 예를들어, 제 1 에피토프는 동족의 제 1 결합 도메인에 결합시에 제 2 결합 도메인의 입체구조적 간섭을 야기하거나 제 2 결합 도메인에 대한 에피토프 결합을 대체하는 상기에서의 형태 변화를 야기시키는 항원에 존재할 수 있다.
유리하게는, 결합은 25% 이상, 유리하게는 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상, 바람직하게는 100% 이하 또는 이에 근접하게 억제되어, 결합이 완전히 억제된다. 에피토프의 결합은 통상적인 항원 결합 분석, 예를들어 ELISA, 또는 FRET을 포함하는 형광 기재 기술, 또는 분자의 질량을 측정하는 표면 플라즈몬 공명과 같은 기술에 의해 측정될 수 있다.
더욱이, 본 발명은 제 1 에피토프 결합 특이성을 지니는 제 1 에피토프 결합 도메인 및 제 2 에피토프 결합 특이성을 지니는 비상보적 제 2 에피토프 결합 도메인을 포함하는 폐쇄 형태의 다중특이적 리간드를 제공하고, 상기 제 1 및 제 2 결합 특이성은 에피토프 결합에 대해 경쟁하여 상기 폐쇄 형태의 다중특이적 리간드는 둘 모두의 에피토프에 동시에 결합하지 않을 것이다.
본 발명의 폐쇄 형태의 다중특이적 리간드는 WO 02/02773에 기술된 리간드를 포함하지 않는다. 따라서, 본 발명의 리간드는 임의의 하나 이상의 항원 또는 에피토프에 협동적으로 결합하는 상보적 VH/VL 쌍을 포함하지 않는다. 대신, 본 발명에 따른 리간드는 바람직하게는 비상보적 VH-VH 또는 VL-VL 쌍을 포함한다. 유리하게는, 각각의 VH-VH 또는 VL-VL 쌍에서의 각각의 VH 또는 VL 도메인은 상이한 에피토프 결합 특이성을 지니고, 상기 에피토프 결합 부위는 하나의 부위에서의 에피토프의 결합이 또 다른 부위에서의 에피토프의 결합과 경쟁하도록 배열된다.
유리하게는, 폐쇄 형태의 다중특이적 리간드는 표적 분자에 결합할 수 있는 제 1 도메인, 및 리간드의 반감기를 연장시키는 분자 또는 기에 결합할 수 있는 제 2 도메인을 포함할 수 있다. 예를들어, 상기 분자 또는 기는 벌크화제, 예를들어 HSA 또는 세포 기질 단백질일 수 있다. 본원에 기술된 관용구 "리간드의 반감기를 연장시키는 분자 또는 기"는 본원에 기술된 이중특이적 리간드에 의해 결합되는 경우 상기 분자 또는 기에 결합하지 않는 리간드에 비해 동물에 투여시 상기 이중특이적 리간드의 생체내 반감기를 증가시키는 분자 또는 화학기를 의미한다. 리간드의 반감기를 연장시키는 분자 또는 기의 예는 하기에 기술되어 있다. 한 바람직한 구체예에서, 폐쇄 형태의 다중특이적 리간드는 반감기 향상 분자 또는 기의 대체에 의해서만 표적 분자에 결합될 수 있다. 따라서, 예를들어, 폐쇄 형태의 다중특이적 리간드는 HSA와 같은 벌크 분자에 의해 피검체의 혈류에서의 순환으로 유지된다. 표적 분자가 조우되는 경우, 폐쇄 형태의 다중특이적 리간드의 결합 도메인 사이의 경쟁은 HSA의 대체 및 표적의 결합을 야기시킨다.
본 발명의 제 2형의 한 바람직한 구체예에서, 에피토프 결합 도메인은 면역글로불린 가변 영역이고, 단일 도메인 V 유전자 레퍼토피로부터 선택된다. 일반적으로, 단일 항체 도메인의 레퍼토리는 섬유상 박테리오파지의 표면에 전시된다. 한 바람직한 구체예에서, 각각의 단일 항체 도메인은 항원에 대한 파지 레퍼토리의 결합에 의해 선택된다. 본 발명의 제 2형의 한 바람직한 구체예에서, 에피토프 결합 도메인은 면역글로불린 가변 영역이고, 단일 도메인 V 유전자 레퍼토피로부터 선택된다. 일반적으로, 단일 항체 도메인의 레퍼토리는 섬유상 박테리오파지의 표면에 전시된다. 한 바람직한 구체예에서, 각각의 단일 항체 도메인은 항원에 대한 파지 레퍼토리의 결합에 의해 선택된다.
한 양태에서, 다중특이적 리간드는 두개 이상의 비상보적 가변 도메인을 포함한다. 예를들어, 리간드는 VH 도메인의 쌍 또는 VL 도메인의 쌍을 포함할 수 있다. 유리하게는, 도메인은 비-카멜리드 기원이고; 바람직하게는 이들은 인간 도메인이거나, 인간 프레임워크 영역 (FW) 및 하나 이상의 이종유래 CDR을 포함한다. CDR 및 프레임워크 영역은 케이뱃 데이터베이스(the Kabat database of Sequences of Proteins of Immunological Interest)에 정의된 면역글로불린 가변 도메인의 영역들이다.
바람직한 인간 프레임워크 영역은 점라인 유전자 분절 DP47 및 DPK9에 의해 엔코딩된 것들이다. 유리하게는, VH 또는 VL 도메인의 FW1, FW2 및 FW3는 DP47 또는 DPK9로부터의 FW1, FW2 또는 FW3의 서열을 지닌다. 인간 프레임워크는 본 발명의 리간드에 사용되는 인간 프레임워크에서 임의로 돌연변이, 예를들어 약 5개 이하의 아미노산 변형 또는 약 10개 이하의 아미노산 변형을 집합적으로 함유할 수 있다.
본 발명의 제 2 형에 따른 다중특이적 리간드 내의 가변 도메인은 개방 또는 폐쇄 형태로 배열될 수 있고; 즉, 이들은 가변 도메인이 이들의 동족 리간드에 독립적으로 및 동시에 결합될 수 있거나, 단지 하나의 가변 도메인이 임의의 시간에 이의 동족 리간드와 결합할 수 있도록 배열된다.
본 발명자들은 특정 구조 조건하에서, 비상보적 가변 도메인 (예를들어, 두개의 경쇄 가변 도메인 또는 두개의 중쇄 가변 도메인)이 상기 비상보적 도메인이 동족쌍으로서 함께 작동하지 않더라도 제 1 가변 도메인에 대한 제 1 에피토프의 결합이 제 2 가변 도메인에 대한 제 2 에피토프의 결합을 억제하는 리간드로 존재할 수 있다는 것을 발견하였다.
유리하게는, 리간드는 가변 도메인의 두개 이상의 쌍을 포함하고; 즉, 이는 4개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 유리하게는, 4개의 가변 도메인은 인간 기원의 프레임워크를 포함한다.
한 바람직한 구체예에서, 인간 프레임워크는 인간 점라인 서열의 것과 동일하다.
본 발명자들은 상기 항체가 치료 및 기타 용도를 위한 리간드 결합 분석에 특히 사용될 것이라고 생각한다.
본 발명의 제 2 형의 한 구체예에서, 가변 도메인은 제 1 및/또는 제 2 항원 또는 에피토프에 대한 항체로부터 유래된다. 한 바람직한 구체예에서, 가변 도메인은 단일 가변 항체 도메인의 레퍼토리로부터 유래된다. 한 예에서, 레퍼토리는 동물 또는 합성 레퍼토리에서 생성되지 않는 레퍼토리이다. 또 다른 예에서, 단일 가변 도메인은 동물 면역화에 의해 분리 (적어도 일부)되지 않는다. 따라서, 단일 도메인이 천연 라이브러리로부터 분리될 수 있다.
또 다른 양태에서 본 발명의 제 2형은 제 1 에피토프 결합 특이성을 지니는 제 1 에피토프 결합 도메인 및 제 2 에피토프 결합 특이성을 지니는 비상보적 제 2 에피토프 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 리간드를 제공한다. 제 1 및 제 2 결합 특이성은 동일하거나 상이할 수 있다.
한 추가 양태에서, 본 발명은 제 1 에피토프 결합 특이성을 지니는 제 1 에피토프 결합 도메인 및 제 2 에피토프 결합 특이성을 지니는 비상보적 제 2 에피토프 결합 도메인을 포함하는 폐쇄 형태의 다중특이적 리간드를 제공하고, 여기서 제 1 및 제 2 결합 특이성은 에피토프 결합에 대해 경쟁할 수 있어, 폐쇄 형태의 다중특이적 리간드가 둘 모두의 에피토프에 동시에 결합할 수 없다.
또 다른 한 추가 양태에서, 본 발명은 비상보적 결합 도메인을 포함하는 개방 형태의 리간드를 제공하고, 여기서 상기 도메인은 동일한 표적에서 상이한 에피토프에 대해 특이적이다. 이러한 리간드는 증가된 결합성으로 표적에 결합한다. 유사하게는, 본 발명은 동일한 에피토프에 특이적이고, 상기 에피토프의 다중 카피, 예를들어 IL-5, PDGF-AA, PDGF-BB, TGF 베타, TGF 베타2, TGF 베타3 및 TNFα, 예를들어 인간 TNF 수용체 1 및 인간 TNFα를 포함하는 표적에 대해 특이적인 비상보적 결합 도메인을 포함하는 다가 리간드를 제공한다.
한 유사 양태에서, 본 발명에 따른 리간드는 낮은 친화성으로 개별적 에피토프에 결합하여, 개별적 에피토프에 대한 결합이 치료적으로 유의하지 않으나, 두개의 에피토프에 대한 결합으로부터 생성된 증가된 결합성이 치료 이익을 제공하도록 형성될 수 있다. 한 특정 예에서, 에피토프는 정상 세포 유형에 개별적으로 존재하나, 비정상 또는 질병 세포, 예를들어 종양 세포에만 함께 존재하도록 표적화될 수 있다. 이러한 상황에서, 비정상 또는 질병 세포만 본 발명에 따른 이중특이적 리간드에 의해 효과적으로 표적화된다.
동일한 표적에 대한 동일한 에피토프 또는 인접한 에피토프의 다중 카피에 특이적인 리간드 (킬레이트 dAb로 공지됨)가 또한 3개, 4개 이상의 비상보적 결합 도메인을 포함하는 삼합체 또는 다합체 (사합체 이상) 리간드일 수 있다. 예를들어, 리간드는 3개 또는 4개의 VH 도메인 또는 VL 도메인을 포함하도록 작제될 수 있다.
더욱이, 리간드는 다중서브유닛 표적에 결합하도록 제공되고, 여기서 각각의 결합 도메인은 상기 표적의 서브유닛에 대해 특이적이다. 이러한 리간드는 이합체, 삼합체 또는 다합체일 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 상기 양태에 따른 다중특이적 리간드는 본 발명의 제 1 양태의 방법에 의해 수득가능하다.
본 발명의 제 2 형의 상기 양태에 따르면, 유리하게는 제 1 에피토프 결합 도메인 및 제 2 에피토프 결합 도메인은 본원에 정의된 비상보적 면역글로불린 가변 도메인이다. 이는 VH-VH 또는 VL-VL 가변 도메인이다.
특히, 킬레이트 dAb가 본 발명의 바람직한 양태에 따라 제조될 수 있고, 즉 링커의 다른편에 삽입되는 제 2, 제 3 및 추가 dAb의 레퍼토리와 함께, 이합체, 삼합체 또는 다합체 dAb의 라이브러리가 링커 서열의 일정한 dAb 업스트림 또는 다운스트림을 포함하는 벡터를 이용하여 작제되는 앵커 dAb의 사용에 의해 제조될 수 있다. 예를들어, 앵커 또는 가이딩 dAb는 TAR1-5 (VK), TAR1-27(VK), TAR2h-5(VH) 또는 TAR2h-6(VK)일 수 있다.
대안적 방법에서, 링커의 사용은, 예를들어 결합 도메인, 예를들어 VH 및 Vκ 사이의 비공유 결합 또는 천연 친화성의 사용에 의해 회피될 수 있다. 따라서, 본 발명은 (a) 표적 상의 제 1 에피토프에 특이적인 단일 결합 도메인을 엔코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제공하는 단계; (b) 상기 표적 상의 제 2 에피토프에 특이적인 제 2 결합 도메인을 포함하는 레퍼토리를 엔코딩하는 벡터를 제공하는 단계로서, 상기 에피토프가 제 1 에피토프에 대해 동일하거나 상이할 수 있고, 상기 제 2 에피토프가 상기 제 1 에피토프에 인접한 단계; (c) 상기 제 1 및 제 2 결합 도메인을 발현시키는 단계; 및 (d) 표적 결합 이합체를 생성시키기 위해 서로 조합된 제 1 및 제 2 결합 도메인의 조합물을 분리시키는 단계를 포함하여, 킬레이트 다합체 리간드를 제조하는 방법을 제공한다.
제 1 및 제 2 에피토프는 다합체 리간드가 둘 모두의 에피토프에 동시에 결합할 수 있도록 인접되어 있다. 이는 결합시 증가된 결합성의 이점을 지닌 리간드를 제공한다. 에피토프가 동일한 경우, 표적 상의 에피토프의 다중 카피의 존재에 의해 증가된 결합성이 수득되고, 이는 두개 이상의 카피가 동시에 결합되어 증가된 결합성 효과를 수득하게 한다.
결합 도메인은 링커의 사용과 같은 여러 방법에 의해 회합될 수 있다. 예를들어, 결합 도메인은 cys 잔기, 아비딘 및 스트렙타비딘기 또는 합성후 비공유 부착을 위한 기타 수단을 포함할 수 있고; 표적에 효과적으로 결합하는 이들 조합물들이 분리될 것이다. 대안적으로, 링커는 예를들어 본원에 기술된 제 1 결합 도메인, 링커 및 제 2 결합 도메인의 레퍼토리를 포함하는 단일 벡터로부터 단일 폴리펩티드로서 발현되는 제 1 및 제 2 결합 도메인 사이에 존재할 수 있다.
한 바람직한 양태에서, 제 1 및 제 2 결합 도메인은 항원에 결합시 자연적으로 회합되고; 예를들어, 인접한 에피토프에 결합되는 경우 VH 및 Vκ 도메인은 3개 방식의 상호작용으로 자연적으로 회합되어 안정한 이합체를 형성한다. 이러한 회합된 단백질은 표적 결합 분석에서 분리될 수 있다. 상기 과정의 이점은 정확한 배열로 밀접하게 인접한 에피토프에 결합하는 결합 도메인만이 회합되고, 표적에 대한 이들의 증가된 결합성의 결과로서 분리된다는 점이다.
본 발명의 제 2 형의 상기 양태의 한 대안적 구체예에서, 하나 이상의 에피토프 결합 도메인은 본원에 정의된 비-면역글로불린 "단백질 스캐폴드" 또는 "단백질 골격"을 포함한다. 적합한 비-면역글로불린 단백질 스캐폴드는 상기에 나열된 SpA, 피브로넥틴, GroEL 및 기타 샤페론, 리포칼린, CCTLA4 및 어피바디로 구성된 군으로부터 선택된 임의의 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 제 2 형의 상기 양태에 따르면, 유리하게는, 에피토프 결합 도메인은 단백질 골격에 부착된다. 유리하게는, 본 발명에 따른 단백질 골격은 면역글로불린 골격이다.
본 발명에 따르면, 용어 "면역글로불린 골격"은 하나 이상의 면역글로불린 폴드를 포함하고 본원에 정의된 하나 이상의 에피토프 결합 도메인에 대한 핵으로 작용하는 단백질을 의미한다.
본원에 정의된 바람직한 면역글로불린 골격은 (i) 항체의 CL (카파 또는 람다 서브클래스) 도메인, 또는 (ii) 항체 중쇄의 CH1 도메인; 항체 중쇄의 CH1 및 CH2 도메인을 포함하는 면역글로불린 분자; 항체 중쇄의 CH1, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 면역글로불린 분자; 또는 항체의 CL (카파 또는 람다 서브클래스) 도메인과 연결된 상기 서브셋 (ii)중 임의의 것으로부터 선택된 임의의 하나 이상의 면역글로불린 분자를 포함한다. 힌지 영역 도메인이 또한 포함될 수 있다. 이러한 도메인의 조합물은, 예를들어 미믹 천연 항체, 예를들어 IgG 또는 IgM 또는 이들의 단편, 예를들어 Fv, scFv, Fab 또는 F(ab')2 분자일 수 있다. 당업자는 상기 목록이 총망라된 것이 아님을 인식할 것이다.
본원에 정의된 에피토프 결합 도메인에 대한 골격의 결합은 골격 및/또는 에피토프 결합 도메인을 엔코딩하는 핵산의 발현 후인 폴리펩티드 수준에서 달성될 수 있다. 대안적으로, 상기 결합 단계는 핵산 수준에서 수행될 수 있다. 본 발명에 따른 단백질 골격을 하나 이상의 에피토프 결합 도메인에 결합하는 방법은 당업자에게 친숙하고 본원에 기술된 단백질 화학 및/또는 분자생물학 기술의 사용을 포함한다.
유리하게는, 폐쇄 형태의 다중특이적 리간드는 표적 분자에 결합할 수 있는 제 1 도메인, 및 리간드의 반감기를 연장시키는 분자 또는 기에 결합할 수 있는 제 2 도메인을 포함할 수 있다. 예를들어, 상기 분자 또는 기는 벌크화제, 예를들어 HSA 또는 세포 기질 단백질일 수 있다. 본원에서 사용되는 관용구 "리간드의 반감기를 연장시키는 분자 또는 기"는 본원에 기술된 이중특이적 리간드에 의해 결합되는 경우 상기 분자 또는 기에 결합하지 않는 리간드에 비해 동물에 투여되는 경우 상기 이중특이적 리간드의 생체내 반감기를 증가시키는 분자 또는 화학기를 의미한다. 리간드의 반감기를 연장시키는 분자 또는 기의 예는 하기에 기술된다. 한 바람직한 구체예에서, 폐쇄 형태의 다중특이적 리간드는 반감기 향상 분자 또는 기의 대체시에만 표적 분자에 결합할 수 있다. 따라서, 예를들어, 폐쇄 형태의 다중특이적 리간드는 벌크 분자, 예르들어 HSA에 의해 피검체의 혈류에서 순환상태로 유지된다. 표적 분자와 조우되는 경우, 폐쇄 형태의 다중특이적 리간드의 도메인 사이의 경쟁은 HSA의 대체 및 표적의 결합을 야기한다.
본 발명의 제 2형의 한 추가 양태에서, 본 발명은 본원에 정의된 하나 이상의 다중특이적 리간드를 엔코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 제공한다. 한 구체예에서, 리간드는 폐쇄 형태의 리간드이다. 또 다른 구체예에서, 이는 개방 형태의 리간드이다. 다중특이적 리간드는 하나의 단일 핵산 분자에서 엔코딩될 수 있고; 대안적으로, 각각의 에피토프 결합 도메인은 별개의 핵산 분자에 의해 엔코딩될 수 있다. 리간드가 단일 핵산 분자에 의해 엔코딩되는 경우, 도메인은 융합 폴리펩티드로서 발현될 수 있거나, 별도로 발현되어, 예를들어 화학적 결합제를 이용하여 이후에 서로 연결될 수 있다. 별개의 핵산으로부터 발현된 리간드는 적절한 수단에 의해 함께 연결될 것이다.
핵산은 발현시 숙주세포로부터의 폴리펩티드 수출을 위한 신호서열을 추가로 엔코딩할 수 있고, 발현시 섬유상 박테리오파지 입자 (또는 선택 전시 시스템의 기타 성분)의 표면 성분과 함께 융합될 수 있다. 박테리아 발현 및/또는 파지 또는 파지미드 전시에 사용될 수 있는 선도 서열은 pelB, stⅡ, ompA, phoA, bla 및 pelA를 포함한다.
본 발명의 제 2형의 한 추가 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
또 다른 한 추가 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 벡터로 트랜스펙션된 숙주세포를 제공한다.
이러한 벡터로부터의 발현은, 예를들어 선택을 위한 에포토프 결합 도메인인 박테리오파지 입자가 표면에서 생성되도록 형성될 수 있다. 이는 전시된 도메인의 선택 및 이에따른 본 발명의 방법을 이용하는 '다중특이적 리간드'의 선택을 가능케 한다.
본 발명은 본 발명에 따른 하나 이상의 다중특이적 리간드를 포함하는 키트를 추가로 제공하고, 상기 다중특이적 리간드는 개방 형태 또는 폐쇄 형태의 리간드일 수 있다. 본 발명에 따른 키트는, 예를들어 진단 키트, 치료 키트, 화학적 또는 생물학적 종의 검출을 위한 키트 등일 수 있다.
본 발명은, a) 제 1 에피토프에 결합하는 능력에 의해 제 1 에프토프 결합 도메인을 선택하는 단계; b) 제 2 에피토프에 결합하는 능력에 의해 제 2 에피토프 결합 도메인을 선택하는 단계; c) 에피토프 결합 도메인을 조합시키는 단계; 및 d) 상기 제 1 에피토프 및 제 2 에피토프에 결합하는 능력에 의해 폐쇄 형태의 다중특이적 리간드를 선택하는 단계를 포함하여, 다중특이적 리간드를 생성하는 방법을 제공한다.
제 2형의 한 추가 양태에서, 본 발명은 제 1 에피토프 결합 특이성을 지니는 제 1 에피토프 결합 도메인 및 제 2 에피토프 결합 특이성을 지니는 비상보적 제 2 에피토프 결합 도메인을 포함하는 폐쇄 형태의 다중특이적 리간드를 제조하는 방법을 제공하고, 여기서 제 1 및 제 2 결합 특이성은 에피토프 결합에 대해 경쟁하여, 폐쇄 형태의 다중특이적 리간드는 둘 모두의 에피토프에 동시에 결합하지 않을 수 있고, 상기 방법은, a) 제 1 에피토프에 결합하는 능력에 의해 제 1 에피토프 결합 도메인을 선택하는 단계; b) 제 2 에피토프에 결합하는 능력에 의해 제 2 에피토프 결합 도메인을 선택하는 단계; c) 상기 에피토프 결합 도메인을 조합시켜 상기 도메인이 폐쇄 형태로 되도록 하는 단계; 및 d) 상기 제 1 에피토프 및 제 2 에피토프에 결합하지만, 상기 제 1 에피토프 및 제 2 에피토프 둘 모두에 대해 동시에 결합하지 않는 능력에 의해 폐쇄 형태의 다중특이적 리간드를 선택하는 단계를 포함한다.
본 발명의 제 2형의 상기 양태의 한 대안적 구체예는 제 3 또는 추가의 에피토프 결합 도메인을 선택하는 것을 포함하는 추가의 단계 b1)을 임의로 포함한다. 이러한 식으로, 개방형 또는 폐쇄형이건 간에 두개 이상의 에피토프 결합 특이성을 포함하는 다중특이적 리간드가 생성된다. 본 발명의 제 2 형의 한 바람직한 양태에서, 다중특이적 리간드가 두개 이상의 에피토프 결합 도메인을 포함하는 경우, 상기 도메인중 두개 이상은 폐쇄 형태이고, 결합에 대해 경쟁하고; 나머지 도메인은 결합에 대해 경쟁할 수 있거나, 이들의 동족 에피토프(들)과 독립적으로 자유롭게 회합될 수 있다.
본 발명의 제 2형에서, 제 1 및 제 2 에피토프는 바람직하게는 상이하다. 이들은 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산 또는 이들의 일부일 수 있고, 천연적으로 발생하거나 합성될 수 있다. 이러한 점에서, 본 발명의 리간드는 에피토프 또는 항원에 결합할 수 있고, 길항제 또는 효능제 (예를들어, EPO 수용체 효능제)로 작용할 수 있다. 한 구체예에서 리간드의 에피토프 결합 도메인은 동일한 에피토프 특이성을 지니고, 예를들어 에피토프의 다중 카피가 동일한 항원에 존재하는 경우 이들의 에피토프에 동시에 결합할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 이들 에피토프는 상이한 항원에서 제공되어, 상기 리간드는 에피토프에 결합하여, 항원을 연계시킬 수 있다. 당업자는 에피토프 및 항원의 선택이 광범위하고 다양하다는 것을 인식할 것이다. 이들은, 예를들어 인간 또는 동물 단백질, 사이토카인, 사이토카인 수용체, 효소, 효소에 대한 보조인자 또는 DNA 결합 단백질일 수 있다. 적합한 사이토카인 및 성장인자는 ApoE, Apo-SAA, BDNF, 카디오트로핀-1, EGF, EGF 수용체, ENA-78, 에오탁신, 에오탁신-2, 엑소두스-2, EpoR, FGF-산, FGF-염기, 섬유모세포 성장인자-10, FLT3 리간드, 프랙탈카인 (CX3C), GDNF, G-CSF, GM-CSF, GF-β1, 인슐린, IFN-γ, IGF-I, IGF-II, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (72 아미노산), IL-8 (77 아미노산), IL-9, IL-1O, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 (IGIF), 인히빈α, 인히빈β, EP-10, 각질세포 성장인자-2 (KGF-2), KGF, 렙틴, LIF, 림포탁틴, 뮐러리안 억제 물질, 단핵구 콜로니 억제인자, 단핵구 유인 단백질, M-CSF, MDC (67 아미노산), MDC (69 아미노산), MCP-1 (MCAF), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MDC (67 아미노산), MDC (69 아미노산), MIG, MIP-1α, MIP-1β, MIP-3α, MBP-3β, MIP-4, 골수 전구세포 억제인자-1 (MPIF-1), NAP-2, 뉴르투린, 신경 성장인자, β-NGF, NT-3, NT-4, 온코스타틴 M, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4, RANTES, SDF1α, SDF1β, SCF, SCGF, 줄기세포 인자 (SCF), TARC, TGF-α, TGF-β, TGF-β2, TGF-β3, 종양 괴사 인자 (TNF), TNF-α, TNF-β, TNF 수용체 I, TNF 수용체 II, TNIL-1 , TPO, VEGF, VEGF 수용체 1, VEGF 수용체 2, VEGF 수용체 3, GCP-2, GRO/MGSA, GRO-β, GRO-γ, HCC1, 1-309, HER 1, HER 2, HER 3, HER 4, TACE 인지 부위, TNF BP-I 및 TNF BP-II, 뿐만 아니라 본원에 조합물로 나열되었는지 아닌지 간에 본원의 부록 2 또는 부록 3에 기술된 임의의 표적을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 사이토카인 수용체는 상기의 사이토카인에 대한 수용체, 예를들어 IL-1 R1; IL-6R; IL-1OR; IL-18R, 뿐만 아니라 부록 2 또는 부록 3에 나열된 사이토카인에 대한 수용체, 및 부록 2 및 3에 기술된 수용체들을 포함한다. 이러한 목록이 총망라된 것이 아님이 인지될 것이다. 다중특이적 리간드가 두개의 에피토프 (동일하거나 상이한 항원에 대한 에피토프)에 결합하는 경우, 항원(들)은 상기 목록으로부터 선택될 수 있다. 특정 구체예에서, 리간드는 TNFR1에 결합하는 dAb, 및 상기 항원들중 임의의 하나에 결합하는 제 2 dAb 또는 에피토프 결합 도메인을 포함한다. 이러한 구체예에서, 다중특이적 리간드는 면역글로불린 가변 도메인의 임의의 조합물 (예를들어, VHVH, VHVL, VLVL)을 포함할 수 있다.
다중특이적 리간드에 기초한 면역글로불린 제조
본 발명의 요망되는 형에 따른 개방형이거나 폐쇄형이건 간에 본 발명에 따른 이중특이적 리간드는 scFv, "파지" 항체 및 기타 고안된 항체 분자를 제조하기 위해 항체 공학 분야에서 사용되는 기존에 확립된 기술에 따라 제조될 수 있다. 항체, 특히 이중특이적 항체를 제조하기 위한 기술은, 예를들어 하기의 리뷰 및 본원에 인용된 참고문헌에 기술되어 있다: [Winter & Milstein, (1991) Nature 349:293-299; Pluckthun (1992) Immunological Reviews 130:151-188; Wright et al., (1992) Crti. Rev. Immunol.l2:125-168; Holliger, P. & Winter, G. (1993) Curr. Op. Biotechn. 4, 446-449; Carter, et al. (1995) J. Hernatother. 4, 463-470; Chester, K.A. & Hawkins, R.E. (1995) Trends Biotechn. 13, 294-300; Hoogenboom, H.R. (1997) Nature Biotechnol. 15, 125-126; Fearon, D . (1997) Nature Biotechnol. 15, 618-619; Pluckthun, A. & Pack, P. (1997) Inumunotechnology 3, 83-105; Carter, P. & Merchant, A.M. (1997) Curr. Opin. Biotechnol. 8, 449-454; Holliger, P. & Winter, G. (1997) Cancer Immunol. Immuaother. 45,128-130].
본 발명은 두개의 상이한 항원 또는 에피토프에 대한 가변 도메인의 선택, 및 이후 가변 도메인의 조합을 제공한다. 가변 도메인의 선택에 사용되는 기술은 당 분야에 공지된 라이브러리 및 선택 과정을 이용한다. 인간 B 세포로부터 수거된 재배열된 V 유전자를 사용하는 천연 라이브러리 (Marks et al (1991) J. MoI. Biol, 222: 581; Vaughan et al (1996) Mature Biotech., 14: 309)가 당 분야에 널리 공지되어 있다. 합성 라이브러리 (Hoogenbooxn & Winter (1992) J. MoI. Biol, 227: 381; Barbas et al. (1992) Proc. Natl Acad. ScL USA, 89: 4457; Nissim et al (1994) EMBO J., 13: 692; Griffiths et al. (1994) EMBO J, 13: 3245; De Kruif et al. (1995) J. MoI Biol, 248: 97)가 보통 PCR을 이용하는 면역글로불린 V 유전자의 클로닝에 의해 제조된다. PCR 과정에서의 오류는 높은 정도의 무작위화를 발생시킬 수 있다. VH 및/또는 VL 라이브러리는 표적 항원 또는 에피토프에 대해 별도로 선택될 수 있고, 이러한 경우 단일 도메인 결합이 직접적으로 선택되거나, 함께 선택된다.
본 발명에 따른 이중특이적 리간드를 제조하기 위한 바람직한 방법은 가변 도메인의 레퍼토피가 제 1 항원 또는 에피토프에 대한 결합에 대해 선택되고, 가변 도메인의 레퍼토리가 제 2 항원 또는 에피토프에 대한 결합에 대해 선택되는 선택 시스템을 이용하는 것을 포함한다. 이후, 선택된 제 1 및 제 2 가변 도메인이 조합되고, 제 1 및 제 2 항원 또는 에피토프 둘 모두에 대한 결합에 대한 결합에 대해 선택된다. 폐쇄 형태의 리간드는 제 1 및 제 2 항원 또는 에피토프에 대한 동시가 아닌 독립적 결합에 대해 선택된다.
A. 라이브러리 벡터 시스템
본 발명에 사용하기에 적합한 다양한 선택 시스템이 당 분야에 공지되어 있다. 이러한 시스템의 예는 하기에 기술되어 있다.
박테리오파지 람다 발현 시스템이 기존에 기술된 바와 같이 박테리오파지 플라크 또는 용해소원의 콜로니, 또는 둘 모두로서 직접적으로 스크리닝될 수 있고 (Huse et al. (1989J Science, 246: 1275; Caton and Koprowski (1990) Proc. Natl. Acad. Sd. U.S.A., 87; Mullinax et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sd. U.S.A., 87: 8095; Persson et al. (1991) Proc. Natl Acad. Sd. U.S.A., 88: 2432), 본 발명에 사용된다. 이러한 발현 시스템이 106개 이하의 상이한 일원의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 사용될 수 있으나, 이들은 보다 많은 수(106개 일원 초과)의 스크리닝에는 적합하지 않다.
라이브러리의 작제하는데 특히 사용되는 것은 핵산이 이의 발현물인 폴리펩티드로 연결될 수 있는 선택 전시 시스템이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 선택 전시 시스템은 적절한 전시 수단에 의해 일반 및/또는 표적 리간드에 의해 라이브러리의 개별적 일원의 선택을 가능케 하는 시스템이다.
요망되는 수의 다수의 라이브러리를 분리시키기 위한 선택 프로토콜은 당 분야에 공지되어 있고, 이는 파지 전시 기술로 대표된다. 다양한 펩티드 서열이 섬유상 박테리오파지의 표면에 전시되는 이러한 시스템 (Scott and Smith (1990) Science, 249: 386)은 시험관내 선택을 위한 항체 단편 (및 이를 엔코딩하는 누클레오티드 서열)의 라이브러리 및 표적 항원에 결합하는 특이적 항체 단편의 증폭 (McCafferty et al., WO 92/01047)을 생성시키기에 유용한 것으로 증명되었다. VH 및 VL 영역을 엔코딩하는 누클레오티드 서열은, 이들을 대장균(E. coli)의 원형질막 주위공간으로 향하게 하여, 결과로서 생성된 항체 단편이 통상적으로 박테리오파지 코트 단백질 (예를들어, pⅢ 또는 pVIII)로의 융합으로 박테리오파지의 표면에 전시되도록 하는 선도 신호를 엔코딩하는 유전자 단편에 연결된다. 대안적으로, 항체 단편은 람다 파지 캡시드 (파지바디(phagebodi))에서 외부적으로 전시된다. 파지 기재 전시 시스템의 이점은 이들이 생물학적 시스템이므로, 선택된 라이브러리 일원이 박테리아 세포에서 선택된 라이브러리 일원을 함유하는 파지를 성장시킴으로써 간단하게 증폭될 수 있다는 점이다. 더욱이, 폴리펩티드 라이브러리 일원을 엔코딩하는 누클레오티드 서열이 파지 또는 파지미드 벡터에 함유되므로, 서열분석, 발현 및 이후의 유전적 조작이 비교적 간단하다.
박테리오파지 항체 전시 라이브러리 및 람다 파지 발현 라이브러리의 작제를 위한 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다 (McCafferty et al. (1990) Nature, 348: 552; Kang et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88: 4363; Clackson et al. (1991) Nature, 352: 624; Lowman et al. (1991) Biochemistry, 30: 10832; Burton et al (1991) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 88: 10134; Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res., 19: 4133; Chang et al. (1991) J Immunol., 147: 3610; Breitling et al. (1991) Gene, 104: 147; Marks et al. (1991) supra; Baxbas et al. (1992) supra; Hawkins and Winter (1992) J. Immunol, 22: 867; Marks et al., 1992, J. Biol. Chem., 267: 16007; Lerner et al. (1992) Science, 258: 1313, 본원에 참조로서 포함되어 있음).
특히 유리한 한 방법은 scFv 파지-라이브러리를 사용하는 것이다 (Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 85: 5879-5883; Chaudlxary et al (1990) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 87: 1066-1070; McCafferty et al (1990) supra; Clackson et al (1991) Nature, 352: 624; Marks et al (1991) J MoI. Biol, 222: 581; Chiswell et al (1992) Trends Biotech., 10: 80; Marks et al (1992) J Biol. Chem., 267). 박테리오파지 코트 단백질에 전시되는 scFv 라이브러리의 다양한 구체예가 기술되어 있다. 파지 전시 방법의 정련이 본원에 참조로서 포함된 WO96/06213 및 WO92/01047 (Medical Research Council et al.) 및 WO97/08320 (Morphosys)에 기술된 바와 같이 공지되어 있다.
폴리펩티드의 라이브러리를 생성하기 위한 기타 시스템은 라이브러리 일원의 시험관내 합성을 위한 세포 결핍 효소 기구의 사용을 포함한다. 한 방법에서, RNA 분자는 표적 리간드에 대한 대안적 범위의 선택 및 PCR 증폭에 의해 선택된다 (Tuerk and Gold (1990) Science, 249: 505; Ellington and Szostak (1990) Nature, 346: 818). 유사한 기술이 소정의 인간 전사 인자에 결합하는 DNA 서열을 확인하기 위해 사용될 수 있다 (Thiesen and Bach (1990) Nucleic Acids Res., 18: 3203; Beaudry and Joyce (1992) Science, 257: 635; WO92/05258 and WO92/14843). 유사한 방식에서, 다수의 라이브러리를 생성시키기 위한 방법으로서 폴리펩티드를 합성하기 위해 시험관내 번역이 사용될 수 있다. 일반적으로 안정화된 폴리솜(polysome) 복합체를 포함하는 이러한 방법이 WO88/08453, WO90/05785, WO90/07003, WO91/02076, WO91/05058 및 WO92/02536에 추가로 기술되어 있다. 파지 기재가 아닌 대안적 전시 시스템, 예를들어 WO95/22625 및 WO95/11922 (Affymax)에 기술된 것은 선택을 위한 폴리펩티드를 전시하기 위해 폴리솜을 이용한다.
또 다른 추가 범주의 기술은 유전자와 이의 유전 생성물의 결합을 가능케 하는 인공 구획내에서의 레퍼토리의 선택을 포함한다. 예를들어, 요망되는 유전자 생성물을 엔코딩하는 핵산 서열이 유중수 에멀젼에 의해 형성된 마이크로캡슐에서 선택될 수 있는 선택 시스템이 WO99/02671, WO00/40712 및 문헌[Tawfik & Griffiths (1998) Nature Biotechnol 16(7), 652-6]에 기술되어 있다. 요망되는 활성을 지니는 유전자 생성물을 엔코딩하는 유전 성분이 마이크로캡슐 내로 구획으로 나누어진 후, 마이크로캡슐 내에서 이들의 각각의 유전자 생성물 (RNA 또는 단백질)을 생성시키기 위해 전사되고/되거나 번역된다. 요망되는 활성을 지니는 유전자 생성물을 생성하는 유전 성분은 이후 분류된다. 이러한 방법은 다양한 방법에 의해 요망되는 활성을 검출함으로써 관심 유전자 생성물을 선택한다.
B. 라이브러리 작제
선택을 위한 라이브러리는 당 분야에 널리 공지된 기술, 예를들어 상기 나열된 기술을 이용하여 작제될 수 있거나, 상업적 공급원으로부터 구입될 수 있다. 본 발명에 유용한 라이브러리는, 예를들어 WO99/20749에 기술되어 있다. 일단 벡터 시스템이 선택되고, 관심 폴리펩티드를 엔코딩하는 하나 이상의 핵산 서열이 라이브러리 벡터 내로 클로닝되면, 이는 발현 전에 돌연변이 유발을 수행함으로서 클로닝된 분자 내에서 다양성을 생성시킬 수 있고; 대안적으로, 엔코딩된 단백질은 돌연변이 유발 및 추가 범위의 선택이 수행되기 전에 상기 기술된 바와 같이 발현되고 선택될 수 있다. 구조적으로 최적화된 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산 서열의 돌연변이 유발은 표준 분자 방법에 의해 수행된다. 물론, 중합효소 연쇄반응, 또는 PCR(Mullis and Faloona (1987) Methods Enzymol, 155: 335, 본원에 참조로서 포함됨)이 사용된다. 관심 표적 서열을 증폭시키기 위한 열안정적인 DNA 의존성 DNA 중합효소에 의해 다중 사이클의 DNA 복제를 이용하는 PCR은 당 분야에 널리 공지되어 있다. 다양한 항체 라이브러리의 작제는 본원에 참조로서 인용된 문헌[Winter et al. (1994) Ann. Rev. Immunology 12, 433-55]에 논의되어 있다.
PCR은 주형 DNA (1 fg 이상; 보다 유용하게는 1-1000 ng) 및 25 pmol 이상의 올리고누클레오티드 프라이머를 이용하여 수행되고; 프라이머 풀이 각각의 서열이 상기 풀의 분자의 소량의 분획만에 의해 나타내어지는 바와 같이 매우 이종이고, 양이 이후의 증폭 사이클에서 제한이 되는 경우에 보다 많은 양의 프라이머를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 통상적인 반응 혼합물은 2μl의 DNA, 25 pmol의 올리고누클레오티드 프라이머, 2.5 μl의 1OX PCR 완충용액 1 (Perkin-Elmer, Foster City, CA), 0.4 μl의 1.25 μM dNTP, 0.15 μl (또는 2.5 유닛)의 Taq DNA 중합효소 (Perkin Elmer, Foster City, CA) 및 전체 부피가 25μl가 되게 하는 탈이온화된 물을 포함한다. 미네랄 오일이 입혀지고, 프로그램화된 열 사이클러를 이용하여 PCR이 수행된다. PCR 사이클의 각각의 단계의 길이 및 온도, 뿐만 아니라 사이클의 수는 효과에 대한 엄격한 요구조건에 따라 조정된다. 어닐링 온도 및 시간은 주형에 대해 어닐링되는 것으로 예상되는 프라이머의 효능 및 용인되는 미스매치의 정도 둘 모두에 의해 결정되고; 명백하게는, 핵산 분자가 동시에 증폭되고 돌연변이 유발되는 경우 최소한 첫번째 순환의 합성에서 미스매치가 요구된다. 프라이머 어닐링 조건의 엄격함을 최적화시키기 위한 능력은 당업자의 지식 범위 내에 해당된다. 30℃ 내지 72℃ 사이의 어닐링 온도가 사용된다. 주형 분자의 최초 변성은 일반적으로 4분 동안 92℃ 내지 99℃에서 발생한 후, 변성 (15초 내지 1분 동안 94-99℃), 어닐링 (상기 논의된 바와 같은 온도; 1-2분) 및 신장 (증폭되는 생성물의 길이에 따라 1-5분 동안 72℃)으로 구성된 20-40회의 사이클로 발생한다. 최종 신장은 일반적으로 72℃에서 4분이고, 4℃에서 한계가 없는 (0 내지 24시간) 단계가 후속될 수 있다.
C. 단일 가변 도메인의 조합
일단 선택되면, 본 발명에 유용한 도메인은 공유 및 비공유 방법을 포함하는 당 업계에 공지된 다양한 방법에 의해 조합될 수 있다.
바람직한 방법은, 예를들어 scFv 분자와 관련하여 기술된 바와 같은 폴리펩티드 링커의 사용을 포함한다 (Bird et al., (1988) Science 242:423-426). 적절한 링커의 논의는 문헌[Bird et al. Science 242, 423-426; Hudson et al., Journal Immunol Methods 231 (1999) 177-189; Hudson et al., Proc Nat Acad Sci USA 85, 5879-5883]에 제공되어 있다. 링커는 바람직하게는 가요성으로, 이는 두개의 단일 도메인이 상호작용할 수 있도록 한다. 하나의 예시적 링커는 (Gly4 Ser)n 링커로, 여기서 n=1 내지 8, 예를들어 2, 3, 4, 5 또는 7이다. 덜 가요성인 디아바디에 사용되는 링커가 또한 사용될 수 있다 (Holliger et al , (1993) PNAS (USA) 90:6444-6448).
한 구체예에서, 사용되는 링커는 면역글로불린 힌지 영역이 아니다.
가변 도메인은 링커가 아닌 방법을 이용하여 조합될 수 있다. 예를들어, 천연 발생되거나 고안된 시스테인 잔기를 통해 제공되는 이황화결합(Reiter et al., (1994) Protein Eng. 7:697-704)을 사용하거나 "피트(fit)"하여 이에 따라 상호작용의 안정성을 개선시키기 위해 가변 도메인 사이의 인터페이스를 개조 (Ridgeway et al., (1996) Protein Eng. 7:617-621; Zhu et al., (1997) Protein Science 6:781-788)시킴으로써 VH-VH, VL-VL 또는 VH-VL 이합체를 안정화시킬 수 있다.
면역글로불린의 가변 도메인, 특히 항체 VH 도메인을 결합시키거나 안정화시키기 위한 기타 기술이 적절하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 이중 특이적 리간드는 용액 내에서 "폐쇄된" 형태로 존재할 수 있다. "폐쇄된" 형태는 두개의 도메인 (예를들어, VH 및 VL)이 회합된 형태, 예를들어 항체 결합 부위를 형성하는 회합된 VH-VL 쌍의 형태로 존재하는 형태이다. 예를들어, scFv는 VH 및 VL 도메인을 연결시키기 위해 사용되는 링커의 재배열에 의존되는 폐쇄 형태로 존재할 수 있다. 이러한 형태가 도메인이 회합되거나, 이들을 회합된 위치에 견고하게 고정시키기에 충분히 가요성인 경우, 도메인은 폐쇄 형태를 채용할 것이다.
유사하게, VH 도메인쌍 및 VL 도메인쌍은 폐쇄 형태로 존재할 수 있다. 일반적으로, 이는, 예를들어 리간드 분자 내에서 견고한 링커에 의해 도메인의 밀접한 회합의 기능을 할 것이다. 폐쇄 형태 내의 리간드는 리간드의 반감기를 증가시키는 분자 및 제 2 표적 분자 둘 모두에 결합할 수없을 것이다. 따라서, 리간드는 통상적으로 리간드의 반감기를 증가시키는 분자로부터 해리시에만 제 2 표적 분자에 결합할 것이다.
더욱이, 링커 없는 VH/VH, VL/VL 또는 VH/VL 이합체의 작제는 도메인 사이에 경쟁을 일으킨다.
본 발명에 따른 리간드는 더욱이 개방 형태일 수 있다. 이러한 형태에서, 리간드는 리간드의 반감기를 증가시키는 분자 및 제 2 표적 분자 둘 모두에 동시에 결합할 수 있을 것이다. 통상적으로, 개방 형태의 가변 도메인은 (VH-VL 쌍의 경우), 상호작용하지 않고, 항체 결합 부위를 형성하나, 이들의 각각의 에피토프에 대한 결합에서 경쟁하지 않도록 도메인으로부터 충분히 멀리 떨어지도록 고정된다. VH/VH 또는 VL/VL 이합체의 경우, 도메인은 견고한 링커에 의해 서로 포싱(forcing)되지 않는다. 자연적으로, 이러한 도메인 쌍은 항원 결합에 대해 경쟁하지 않고, 항체 결합 부위를 형성할 것이다.
Fab 단편 및 전체 항체는 우선적으로 폐쇄 형태로 존재할 것이나, 개방형 및 폐쇄형의 특이적 리간드가 다양한 환경하에서 다양한 평형상태로 존재할 수 있음이 인지될 것이다. 표적에 대한 리간드의 결합은 개방 형태로의 평형의 균형을 전환시킬 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 특정 리간드는 용액 중에서 두개의 형태로 존재할 수 있고, 이중 하나 (개방 형태)는 두개의 항원 또는 에피토프에 독립적으로 결합할 수 있는 반면, 대안적 형태 (폐쇄 형태)는 하나의 항원 또는 에피토프에만 결합할 수 있고; 따라서 항원 또는 에피토프는 상기 형태로 리간드에 대한 결합에서 경쟁한다.
이중특이적 리간드의 개방 형태는 이와 같이 용액 중에서 폐쇄 형태로 평형상태로 존재할 수 있으나, 상기 평형은 폐쇄 형태를 선호할 것이 예상되고; 더욱이, 개방 형태는 표적 결합에 의해 폐쇄 형태로 격리될 수 있다. 따라서, 바람직하게는 본 발명의 특정 이중특이적 리간드는 두개 (개방 및 폐쇄) 형태 사이에서 평형 상태로 존재한다.
본 발명에 따른 이중특이적 리간드는 개방 또는 폐쇄 형태를 선호하기 위해 변형될 수 있다. 예를들어, 이황화결합을 이용한 VH-VL 상호작용의 안정화는 폐쇄 형태를 안정화시킨다. 더욱이, VH 도메인 및 VL 도메인쌍을 포함하는 도메인을 결합시키기 위해 사용되는 링커가 작제되어 개방 형태가 선호되고, 예를들어 링커는,예를들어 적절한 위치의 다수의 아미노산 잔기를 통합시키거나, 도메인을 물리적으로 간격을 유지시키는 적합한 견고한 구조의 고안에 의해 도메인의 회합을 입체구조적으로 간섭시킬 수 있다
D. 이중특이적 리간드의 특성화
이중특이적 리간드의 이의 특정 항원 또는 에피토프에 대한 결합은 당업자에게 친숙한 방법에 의해 시험될 수 있고, 이는 ELISA를 포함한다. 본 발명의 한 바람직한 구체예에서, 결합은 모노클로날 파지 ELISA를 이용하여 시험된다.
파지 ELISA는 임의의 적절한 과정에 따라 수행될 수 있고; 한 예시적 프로토콜이 하기 기술된다.
각각의 라운드의 선택에서 생성된 파지의 집단은 "폴리클로날" 파지 항체를 확인하기 위해, 선택된 항원 또는 에피토프에 대한 결합이 ELISA에 의해 스크리닝될 수 있다. 이후, 상기 집단으로부터의 단일한 감염된 박테리아 콜로니로부터의 파지가 "모노클로날" 파지 항체임을 확인하기 위해 ELISA에 의해 스크리닝될 수 있다. 항원 또는 에피토프에 대한 결합에서 가용성 항체 단편을 스크리닝하는 것이 또한 요망되고, 이는 또한 예를들어 C- 또는 N-말단 태그에 대한 시약을 이용하는 ELISA에 의해 수행될 수 있다 (참조: Winter et al. (1994) Ann. Rev. Immunology 12, 433-55, 참조로서 본원에 인용되어 있음).
선택된 모노클로날 항체의 다양성은 또한 PCR 생성물의 젤 전기영동 (Marks et al. 1991, supra; Nissim et al. 1994 supra), 프로빙 (Tomlinson et al., 1992) J. MoI. Biol. 227, 776) 또는 벡터 DNA의 서열분석에 의해 측정될 수 있다
E. 이중특이적 리간드의 구조
상기 기술된 바와 같이, 항체는 본원에서 항체 (예를들어, IgG, IgM, IgA, IgA, IgE) 또는 하나 이상의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인, 두개 이상의 중쇄 가변 도메인 또는 두개 이상의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 단편 (Fab, Fv, 이황화 결합된 Fv, scFv, 디아바디)으로 정의된다. 이는 적어도 부분적으로 항체를 자연적으로 생성하는 임의의 종으로부터 유래되거나 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 수 있고; 이는 혈청, B 세포, 하이브리도마, 트랜스펙토마, 효모 또는 박테리아로부터 분리된다.
본 발명의 한 바람직한 구체예에서, 이중특이적 리간드는 항체의 하나 이상의 단일 중쇄 가변 도메인 및 항체의 하나의 단일 경쇄 가변 도메인, 또 VH는 두개의 단일한 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 예를들어, 리간드는 /VL 쌍, VH 도메인의 쌍 또는 VL 도메인의 쌍을 포함할 수 있다.
상기 리간드의 제 1 및 제 2 가변 도메인은 동일한 폴리펩티드 사슬에 존재할 수 있다. 대안적으로, 이들은 별도의 폴리펩티드 사슬에 존재할 수 있다. 이들이 동일한 폴리펩티드 사슬에 존재하는 경우, 이들은 링커에 의해 연결될 수 있고, 이는 상기 기술된 펩티드 서열이다.
제 1 및 제 2 가변 도메인은 공유적 또는 비공유적으로 회합될 수 있다. 이들이 공유적으로 회합되는 경우, 공유 결합은 이황화 결합일 수 있다.
가변 도메인이 예를들어 본원에 기술된 파지 전시 기술을 이용하여 선택된 V 유전자 레퍼토리로부터 선택되는 경우, 이들 가변 도메인은 유니버셜 프레임워크 영역을 포함하여, 본원에 정의된 특정 일반 리간드에 의해 인식될 수 있다. 유니버셜 프레임워크 및 일반 리간드 등의 사용은 WO99/20749에 기술되어 있다. V 유전자 레퍼토리가 사용되는 경우, 폴리펩티드 서열 내의 변이는 바람직하게는 가변 도메인의 구조적 루프 내에 위치된다. 가변 도메인의 폴리펩티드 서열은 각각의 가변 도메인과 이의 상보적 쌍의 상호작용을 향상시키기 위해 DNA 셔플링 또는 돌연변이에 의해 변경될 수 있다. DNA 셔플링은 당 분야에 공지되어 있고, 예를들어 문헌[Stemmer, 1994, Nature 370: 389-391] 및 미국 특허 제 6,297,053호에 교시되어 있고, 상기 두 문헌은 참조로서 본원에 포함되어 있다. 돌연변이 유발의 기타 방법이 당 분야에 널리 공지되어 있다.
본 발명의 한 바람직한 구체예에서, '이중특이적 리간드'는 단일 사슬 Fv 단편이다. 본 발명의 한 대안적 구체예에서, '이중특이적 리간드'는 Fab 포맷으로 구성된다.
한 추가 양태에서, 본 발명은 본원에 정의된 하나 이상의 '이중특이적 리간드'를 엔코딩하는 핵산을 제공한다.
당업자는 본 발명의 양태에 따라, 둘 모두의 항원 또는 에피토프가 동일한 항체 분자에 동시에 결합할 수 있음을 인식할 것이다. 대안적으로, 이들은 동일한 항체 분자에 대한 결합에서 경쟁할 수 있다. 예를들어, 둘 모두의 에피토프가 동시에 결합하는 경우, 이중특이적 리간드의 둘 모두의 가변 도메인은 이들의 표적 에피토프에 독립적으로 결합할 수 있다. 도메인이 경쟁하는 경우, 하나의 가변 도메인은 이의 표적에 결합할 수 있으나, 동시에 나머지 가변 도메인은 이의 동족 표적에 결합하지 않거나; 제 1 가변 도메인이 이의 표적에 결합할 수 있으나, 동시에 제 2 가변 도메인은 이의 동족 표적에 결합하지 않는다.
가변 영역은 표적 항원 또는 에피토프에 대해 특이적인 항체로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 이들은 단일 항체 도메인의 레퍼토리, 예를들어 섬유상 박테리오파지의 표면에서 발현된 것들로부터 유래될 수 있다. 선택은 하기에 기술되는 바와 같이 수행될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 수행에 요구되는 핵산 분자 및 벡터 작제물은 표준 실험실 매뉴얼, 예를들어 문헌[Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, USA]에 기술된 바와 같이 작제되고 조작될 수 있다.
본 발명에 유용한 핵산의 조작은 통상적으로 재조합 벡터로 수행된다.
따라서, 한 추가 양태에서, 본 발명은 본원에 정의된 하나 이상의 '이중특이적 리간드'를 엔코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 벡터는 이종유래의 DNA를 이의 발현 및/또는 복제를 위해 세포로 도입시키기 위해 사용되는 별개의 성분을 의미한다. 상기 벡터를 선택하고, 작제하고, 이후에 사용하는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 박테리아 플라스미드, 박테리오파지, 인공 염색체 및 에피솜 벡터를 포함하는 다양한 벡터가 공적으로 이용가능하다. 이러한 벡터는 간단한 클로닝 및 돌연변이 유발에 사용될 수 있고; 대안적으로, 유전자 발현 벡터가 사용된다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 벡터는 요망되는 크기, 통상적으로 0.25 킬로베이스 (kb) 내지 40 kb 또는 이 이상의 길이의 폴리펩티드 코딩 서열을 수용하도록 선택될 수 있다. 적절한 숙주 세포가 시험관내 클로닝 조작 이후에 벡터로 형질전환된다. 각각의 벡터는 일반적으로 클로닝 (또는 "폴리링커") 부위, 복제 기점 및 하나 이상의 선택 마커 유전자를 포함하는 다양한 기능 성분을 함유한다. 주어진 벡터가 발현 벡터인 경우, 이는 추가로 클로닝 부위에 근접하여 위치되는 인핸서 성분, 프로모터, 전사 종결 및 신호 서열중 하나 이상을 포함하고, 이들은 본 발명에 따른 리간드를 엔코딩하는 유전자에 작동적으로 연결된다.
클로닝 및 발현 벡터 둘 모두는 일반적으로 하나 이상의 선택된 숙주세포에서 벡터가 복제할 수 있는 핵산 서열을 함유한다. 통상적으로, 클로닝 벡터에서, 상기 서열은 벡터가 숙주 유전체 DNA와 독립적으로 복제가능한 서열이고, 복제 기점 또는 독립적 복제 서열을 포함한다. 이러한 서열은 다양한 박테리아, 효모 및 바이러스에 대해 널리 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322의 복제 기점이 대부분의 그람-네거티브 박테리아에 적합하고, 2 미크론의 플라스미드 기점이 효모에 적합하고, 다양한 바이러스 기점 (예를들어, SV 40, 아데노바이러스)이 표유동물 세포에서의 벡터의 클로닝에 적합하다. 일반적으로, 복제 기점은 이들이 높은 수준의 DNA를 복제할 수 있는 포유동물 세포, 예를들어 COS 세포에 사용되지 않는 경우 포유동물 발현 세포에 필요하지 않다.
유리하게는, 클로닝 또는 발현 벡터는 선택 마커로도 언급되는 선택 유전자를 함유할 수 있다. 이들 유전자는 선택 배양 배지에서 성장하는 형질전환된 숙주 세포의 생존 또는 성장에 필요한 단백질을 엔코딩한다. 따라서, 선택 유전자를 함유하는 벡터로 형질전환되지 않은 숙주세포는 상기 배지에서 생존하지 않는다. 통상적인 선택 유전자는 항생제 및 기타 독소, 예를들어 앰피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대한 내성 또는 상보적 영양요구 결핍에 대한 내성을 수여하거나, 성장 배지에서 이용가능하지 않은 필수 영양소를 공급하는 단백질을 엔코딩한다.
본 발명에 따른 리간드를 엔코딩하는 벡터의 복제는 대장균에서 가장 편리하게 수행되므로, 대장균 선택 마커, 예를들어 항생제인 앰피실렌에 대한 내성을 수여하는 β-락타마아제 유전자가 사용된다. 이들은 대장균 플라스미드, 예를들어 pBR322 또는 pUC 플라스미드, 예를들어 pUC18 또는 pUC19로부터 수득될 수 있다.
발현 벡터는 보통 숙주 유지체에 의해 인지되고, 관심 코딩 서열에 작동적으로 연결되는 는 프로모터를 함유한다. 이러한 프로모터는 유도되거나 구성될 수 있다. 용어 "작동적으로 연결"은 기술된 성분이 이들이 이들의 의도되는 방식으로 기능하도록 하는 관계에 있는 근접부위를 의미한다. 코딩 서열에 "작동적으로 연결된" 조절 서열은 코딩 서열의 발현이 조절 서열과 양립가능한 조건하에서 달성되는 방식으로 라이게이션된다.
원핵생물 숙주에 이용하기에 적합한 프로모터는, 예를들어 β-락타마아제 및 락토오스 프로모터 시스템, 알칼라인 포스파타아제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 및 하이브리드 프로모터, 예를들어 tac 프로모터를 포함한다. 박테리아 시스템에 사용하기 위한 프로모터는 또한 일반적으로 코딩 서열에 작동적으로 연결된 샤인-델가르노 (Shine-Delgarno) 서열을 함유할 것이다.
바람직한 벡터는 폴리펩티드 라이브러리 일원에 상응하는 누클레오티드 서열의 발현을 가능하게 하는 발현 벡터이다. 따라서, 제 1 및/또는 제 2 항원 또는 에피토프를 이용한 선택은 폴리펩티드 라이브러리 일원을 발현하는 단일한 클론의 별도의 증식 및 발현에 의하거나, 임의의 선택 전시 시스템의 사용에 의해 수행될 수 있다. 상기 기술된 바와 같이, 바람직한 선택 전시 시스템은 박테리오파지 전시이다. 따라서, 파지 또는 파지미드 벡터, 옐를들어 pIT1 또는 pIT2가 사용될 수 있다. 본 발명에 유용한 선도 서열은 pelB, stll, ompA, phoA, bla 및 pelA를 포함한다. 한 예는 대장균 복제 기점 (이중 가닥 복제를 위한 것임) 및 파지 복제 기점 (단일 가닥의 DNA의 생성을 위한 것임)을 지니는 파지미드 벡터이다. 상기 벡터의 조작 및 발현은 당 분야에 널리 공지되어 있다 (Hoogenboom and Winter (1992) supra; Nissim et al. (1994) supra). 요컨대, 벡터는 파지미드의 선택성을 수여하기 위한 β-락타마아제 유전자 및 pelB 선도 서열 (발현된 폴리펩티드를 원형질막 주위공간으로 향하게 함), 다중 클로닝 부위 (라이브러리 일원의 누클레오티드 버젼을 클로닝시키기 위한 것임), 임의로 하나 이상의 펩티드 태그 (검출을 위한 것임), 임의로 하나 이상의 TAG 정지 코돈 및 파지 단백질 pⅢ로 구성 (N에서 C 말단)되는 발현 카세트의 lac 프로모터 업스트림을 함유한다. 따라서, 대장균의 다양한 억제인자 및 비억제인자 균주 및 글루코오스, 이소-프로필 티오-β-D-갈락토시드 (IPTG) 또는 조력 파지, 예를들어 VCS M13을 이용함으로써, 상기 벡터는 발현이 없는 플라스미드로서 복제되거나, 다량의 폴리펩티드 라이브러리 일원만을 생성하거나, 일부가 이들의 표면에서 하나 이상의 카피의 폴리펩티드-pIII 융합을 함유하는 파지를 생성시킬 수 있다.
본 발명에 따른 리간드를 엔코딩하는 벡터의 작제물은 통상적인 라이게이션 기술을 사용한다. 분리된 벡터 또는 DNA 단편이 분해되고, 손질되고, 필요한 벡터를 생성하기에 요망되는 형태로 다시 라이게이션된다. 요망되는 경우, 정확한 서열이 작제된 벡터에 존재하는지를 확인하기 위한 분석이 공지된 방식으로 수행될 수 있다. 발현 벡터를 작제하고, 시험관내 전사체를 제조하고, DNA를 숙주 세포로 도입시키고, 발현 및 기능을 측정하기 위한 분석을 수행하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 서던 또는 노던 분석, 웨스턴 블로팅, DNA, RNA 또는 단백질의 도트 블로팅, 인시츄 하이브리드화, 면역세포화학 또는 핵산 또는 단백질 분자의 서열 분석에 의해 샘플 내의 유전자 서열의 존재가 검출되거나, 이의 증폭 및/또는 발현이 정량화된다. 당업자는 요망시 이들 방법이 변형될 수 있음을 용이하게 인식할 것이다.
폐쇄 형태의 다중특이적 리간드의 구조
본 발명의 제 2 형의 한 양태에 따르면, 두개 이상의 비-상보적 에피토프 결합 도메인은 연결되어, 본원에 기술된 폐쇄 형태로 존재한다. 유리하게는, 이들은, 대안으로서 본원에 기술된 링커로의 첨가시에, 상호간에 대해 에피토프 결합 부위의 폐쇄 형태의 형성 및/또는 유지를 촉진하는 골격에 추가로 부착될 수 있다.
(I) 골격
골격은 면역글로불린 분자에 기초될 수 있거나, 상기 기술된 기원의 비-면역글로불린일 수 있다. 본원에 정의된 바람직한 면역글로불린 골격은 하기로부터 선택된 것중 하나 이상을 포함한다: 최소한 (i) 항체의 CL (카파 또는 람다 서브클래스) 도메인; 또는 (ii) 항체 중쇄의 CH1 도메인을 포함하는 면역글로불린 분자; 항체 중쇄의 CH1 및 CH2 도메인을 포함하는 면역글로불린 분자; 항체 중쇄의 CH1, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 면역글로불린 분자; 또는 항체의 CL (카파 또는 람다 서브클래스) 도메인과 연결된 상기 서브셋 (ii)중 임의의 것. 힌지 영역 도메인이 또한 포함될 수 있다. 도메인의 이러한 조합물은, 예를들어 미믹 천연 항체, 예를들어 IgG 또는 IgM, 또는 이들의 단편, 예를들어 Fv, scFv, Fab 또는 F(ab')2 분자일 수 있다. 당업자는 상기 목록이 총망라된 것이 아님을 인식할 것이다.
(II) 단백질 스캐폴드
각각의 에피토프 결합 도메인은 단백질 스캐폴드 및 하나 이상의 에피토프를 지닌 도메인의 특정 상호작용에 수반되는 하나 이상의 CDR을 포함한다. 유리하게는, 본 발명에 따른 에피토프 결합 도메인은 세개의 CDR을 포함한다. 적절한 단백질 스캐폴드는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 임의의 것을 포함한다: 면역글로불린 도메인에 기초한 것, 피브로넥틴에 기초한 것, 어피바디에 기초한 것, CTLA4에 기초한 것, 샤페론, 예를들어 GroEL에 기초한 것, 리포칼린에 기초한 것, 및 박테리아 수용체 SpA 및 SpD에 기초한 것. 당업자는 상기 목록이 총망라된 것이 아님을 인식할 것이다.
F: 이중특이적 리간드 작제에 사용하기 위한 스캐폴드
i. 주쇄 형태의 선택
면역글로불린 상과의 일원은 모두 이들의 폴리펩티드 사슬에 대한 유사한 폴드를 공유한다. 예를들어, 항체가 이들의 주요 서열과 관련하여 매우 다양하지만, 서열 및 결정학적 구조의 비교는 예상과는 반대로 제한된 수의 주쇄 형태, 또는 정준 구조를 채택한 항체의 6개의 항원 결합 루프중 5개 (H1, H2, L1, L2, L3)를 나타낸다 (Chothia and Lesk (1987) J. MoI. 3iol, 196: 901; Chothia et al (1989) Nature, 342: 877). 따라서, 루프 길이 및 중요 잔기의 분석은 인간 항체의 대부분에서 발견되는 H1, H2, L1, L2 및 L3의 주쇄 형태의 예상을 가능케 한다 (Chothia et al. (1992) J MoI. Biol, 227: 799; Tomlinson et al. (1995) EMBOJ., 14: 4628; Williams et al. (1996) J. MoI. Biol, 264: 220). H3 영역이 서열, 길이 및 구조와 관련하여 보다 다양하지만 (D 분절의 사용에 기인함), 이는 또한 루프 및 항체 프레임워크 내의 중요 위치에서 특정 잔기 또는 잔기의 유형의 길이 및 존재에 따른 짧은 루프 길이에 대해 제한된 수의 주쇄 형태를 형성한다 (Martin et al (1996) J. MoI Biol, 263: 800; Shirai et al. (1996) FEBS Letters, 399: 1).
본 발명의 이중특이적 리간드는 유리하게는 도메인의 라이브러리, 예를들어 VH 도메인의 라이브러리 및/또는 VL 도메인의 라이브러리로부터 어셈블리된다. 더욱이, 본 발명의 이중특이적 리간드는 이들 스스로 라이브러리의 형태로 제공될 수 있다. 본 발명의 한 양태에서, 이중특이적 리간드 및/또는 도메인의 라이브러리는 특정 루프 길이 및 중요 잔기가 일원의 주쇄 형태가 공지되는 것이 보장되게 선택되도록 고안된다. 유리하게는, 이들은 상기 논의된 바와 같이 비기능적인 우연을 최소화하기 위한 천연에서 발견되는 면역글로불린 상과 분자의 실제 형태이다. 점라인 V 유전자 분절은 항체 또는 T 세포 수용체 라이브러리에 적절한 기본 프레임워크로 작용하며; 기타 서열이 또한 사용될 수 있다. 기능에 영향을 미치지 않는 적은 수의 기능적 일원이 변경된 주쇄 형태를 지닐 수 있도록 매우 낮은 빈도로 변이가 발생할 수 있다.
리간드에 의해 엔코딩된 상이한 주쇄 형태의 수를 측정하고, 리간드 서열에 기초한 주쇄 형태를 예측하고, 정준 구조에 영향을 미치지 않는 다양성을 위한 잔기를 선택하기 위해 정준 구조 이론이 또한 사용된다. 인간 Vκ 도메인에서, L1 루크가 4개의 정준 구조중 하나를 채택할 수 있고, L2 루프가 단일 정준 구조를 지닐 수 있고, 인간 Vκ 도메인의 90%가 L3 루프에 대해 4개 또는 5개의 정준 구조중 하나를 채택한다는 것이 공지되어 있으므로 (Tomlinson et al. (1995) supra); Vκ 도메인 단독에서, 상이한 정준 구조가 매우 다양한 주쇄 형태를 생성시키기 위해 조합될 수 있다. Vλ 도메인이 L1, L2 및 L3 루프에 대해 다양한 범위의 정준 구조를 엔코딩하고, Vκ 및 Vλ 도메인이 H1 및 H2 루프에 대해 여러 정준 구조를 엔코딩할 수 있는 임의의 VH 도메인과 함께 쌍을 이룰 수 있고, 이들 5개의 루프에 대해 관찰된 정준 구조 조합의 수가 매우 크다는 것이 제공되어 있다. 이는 주쇄 형태에서의 다양성의 생성이 광범위한 결합 특이성의 생성에 필수적일 수 있음을 의미한다. 그러나, 단일한 공지된 주쇄 형태에 기초하여 항체 라이브러리를 작제하는 경우, 예상과는 반대로 주쇄 형태의 다양성이 모든 항원을 실질적으로 표적으로 하는 충분한 다양성을 생성시키는데 필요하지 않음이 발견되었다. 더욱 놀랍게는, 단일 주쇄 형태는 공통 구조를 필요로 하지 않으며, 단일한 천연 발생 형태가 전체 라이브러리에 대한 기초로 사용될 수 있다. 따라서, 한 바람직한 양태에서, 본 발명의 이중특이적 리간드는 단일한 공지된 주쇄 형태를 지닌다.
선택되는 단일한 주쇄 형태는 바람직하게는 당해 면역글로불린 상과 유형의 분자중 평범한 것이다. 형태는 현저한 수의 천연 발생 분자가 이를 채택하는 것으로 관찰되는 경우에 평범한 것이다. 따라서, 본 발명의 한 바람직한 양태에서, 면역글로불린 도메인의 각각의 결합 루프에 대한 다양한 주쇄 형태의 천연 발생은 별개인 것을 간주되고, 천연 발생 가변 도메인은 상이한 루프에 대한 주쇄 형태의 요망되는 조합을 지니도록 선택된다. 어떠한 것도 가능하지 않은 경우, 가장 근접한 동등물이 선택될 수 있다. 상이한 루프에 대한 주쇄 형태의 요망되는 조합은 요망되는 주쇄 형태를 엔코딩하는 점라인 유전자 분절을 선택함으로써 생성되는 것이 바람직하다. 선택된 점라인 유전자 분절이 종종 천연으로 발현되는 것이 더욱 바람직하고, 매우 빈번히 모든 천연 점라인 유전자 분절이 발현되는 것이 가장 바람직하다.
이중특이적 리간드 또는 이의 라이브러리의 고안에서, 6개의 항원 결합 루프의 각각에 대한 상이한 주쇄 형태의 발생은 별개적인 것으로 간주될 수 있다. H1, H2, L1, L2 및 L3에 대해, 천연 발생 분자의 항원 결합 루프중 20% 내지 100%에 의해 채택되는 소정의 형태가 선택된다. 통상적으로, 이의 관찰된 발생률은 35% 초과 (즉, 35% 내지 100%)이고, 이상적으로는 50% 초과 또는 65% 초과이다. 방대한 대부분의 H3 루프는 정준 구조를 지니지 않으므로, 정준 구조를 나타내지 않는 루프들중에서 평범한 것의 주쇄 형태를 선택하는 것이 바람직하다. 따라서, 각각의 루프에 대해, 천연 레퍼토리에서 가장 빈번히 관찰되는 형태가 선택된다. 인간 항체에서, 각각의 루프에 대해 가장 인기있는 정준 구조 (CS)는 하기와 같다: H1-CS1 (발현된 레퍼토리의 79%), H2-CS3 (46%), VK의 L1-CS 2 (39%), L2-CS1 (100%), Vκ의 L3-CS1 (36%) (계산은 70:30의 κ:λ 비로 추정, Hood et al. (1967) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol, 48: 133). 정준 구조를 지니는 H3 루프에 대해, 잔기 94에서 잔기 101의 염교(salt bridge)를 지니는 7개의 잔기의 CDR3 길이 (Kabat et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest, U.S. Department of Health and Human Services)가 가장 통상적인 듯 하다. 상기 배열을 형성하기 위해 필요한 H3 길이 및 중요 잔기를 지니는 EMBL 데이터 라이브러리 내에 16개 이상의 인간 항체 서열 및 항체 모델링에 대한 기초로 사용될 수 있는 단백질 데이터 뱅크에서의 두개 이상의 결정학적 구조(2cgr 및 ltet)가 존재한다. 상기 형태의 정준 구조에서 가장 빈번하게 발현되는 점라인 유전자 분절은 VH 분절 3-23 (DP-47), JH 분절 JH4b, Vκ 분절 02/012 (DPK9) 및 Jκ 분절 Jκ1이다. VH 분절 DP45 및 DP38이 또한 적합하다. 따라서, 이들 분절은 작제물에 기초하여 요망되는 단일 주쇄 형태를 지닌 라이브러리와 조합하여 사용될 수 있다.
대안적으로, 분리시 결합 루프의 각각에 대해 상이한 주쇄 형태의 천연 발생에 기초한 단일 주쇄 형태를 선택하는 것 대신에, 주쇄 형태의 조합물의 천연 발생이 단일 주쇄 형태를 선택하기 위한 기초로 사용될 수 있다. 항체의 경우, 예를들어, 임의의 2개, 3개, 4개, 5개 또는 모든 6개의 항원 결합 루프에 대한 정준 구조 조합물의 천연 발생이 결정될 수 있다. 여기서, 선택된 형태는 천연 발생 항체에서 평범한 것이 바람직하고, 천연 레퍼토르에서 가장 빈번하게 관찰되는 것이 가장 바람직하다. 따라서, 인간 항체에서, 예를들어, 5개 항원 결합 루프인 H1, H2, L1, L2 및 L3의 천연 조합이 고려되는 경우, 정준 구조의 가장 빈번한 조합이 결정되고, 단일 주쇄 형태를 선택하기 위한 기초로서 H3 루프에 대한 가장 인기있는 형태와 조합된다.
ii. 정준 서열의 다양성
선택된 여러 공지된 주쇄 형태 또는 바람직하게는 바람직하게는 단일의 공지된 주쇄 형태를 지니는, 본 발명에 따른 이중특이적 리간드 또는 본 발명에 사용하기 위한 라이브러리는 구조 및/또는 기능적 다양성일 지니는 레퍼토리를 생성시키기 위해 분자의 결합 부위를 다양화시킴으로써 작제될 수 있다. 이는 변이체가 광범위한 활성을 제공할 수 있도록 이들의 구조 및/또는 기능에서 충분한 다양성을 지니도록 생성된다는 것을 의미한다.
요망되는 다양성은 통상적으로 하나 이상의 위치에서 선택된 분자를 다양화시킴으로써 생성된다. 변형되는 위치는 무작위적으로 선택될 수 있고, 바람직하게는 선택된다. 이후, 변이는 존재하는 아미노산이 천연 또는 합성의 임의의 아미노산 또는 이의 유사체에 의해 대체되는 동안 무작위화에 의해 매우 다양한 수의 변이체를 생성시키거나, 존재하는 아미노산을 하나 이상의 정의된 서브셋의 아미노산으로 대체하여 보다 제한된 수의 변이체를 생성시킴으로써 달성될 수 있다.
상기 다양성을 도입시키기 위해 다양한 방법이 보고되어 있다. 오류 빈발(Error-prone) PCR (Hawkins et al. (1992) J. MoI. Biol, 226: 889), 화학적 돌연벼이 유발 (Deng et al. (1994) J. Biol. Chem., 269: 9533) 또는 박테리아 돌연변이 균주 (Low et al (1996) J. MoI. Biol, 260: 359)가 상기 분자를 엔코딩하는 유전자로 무작위적 돌연변이를 도입시키기 위해 사용될 수 있다. 선택된 위치를 돌연변이화시키기 위한 방법은 또한 당 분야에 널리 공지되어 있고, PCR을 사용하거나 사용하지 않고 미스매칭된 올리고누클레오티드 또는 축퇴된 올리고누클레오티드를 사용하는 것을 포함한다. 예를들어, 여러 합성 항체 라이브러리가 항원 결합 루프에 대해 돌연변이를 표적화시킴으로써 생성되었다. 인간 톡소이드 결합 Fab의 H3 영역이 다양한 신규한 결합 특이성을 생성시키기 위해 무작위화되었다 (Barbas et al (1992) Proc. Natl. Acad. ScL USA, 89: 4457). 무작위 또는 반-무작위 H3 및 L3 영역이 돌연변이화되지 않은 프레임워크 영역을 지니는 다수의 라이브러리를 생성시키기 위해 점라인 V 유전자 분절에 첨부되었다 (Hoogenboom & Winter (1992) J. MoI Biol, 227: 381; Barbas et al (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457; Nissim et al (1994) EMBO J, 13: 692; Griffiths et al. (1994) EMBOJ., 13: 3245; De Kruif et al (1995) J MoI Biol, 248: 97). 이러한 다양성이 기타 항원 결합 루프중 일부 또는 전부를 포함하도록 확장되었다 (Crameri et al. (1996) Nature Med., 2: 100; Riechmann et al. (1995) Bio/Technology, 13: 475; Morphosys, WO97/08320, supra).
루프 무작위화는 H3 단독에 대해 잠재적으로 약 1015개 이상의 구조 및 기타 5개 루프에 대해 유사하게 많은 변이를 생성시킬 수 있으므로, 이는 현재의 형질전환 기술을 이용하거나 모든 가능한 조합을 나타내는 라이브러리를 생성시키는 세포 결핍 시스템을 이용하여 실행 불가능하다. 예를들어, 지금까지 작제된 가장 큰 라이브러리중 하나로, 상기 고안의 라이브러리에 대한 잠재적 다양성중 단지 소량인 6 x 1010개의 상이한 항체가 생성되었다 (Griffiths et al. (1994) supra).
한 바람직한 구체예에서, 분자의 요망되는 기능을 생성시키거나 변형시키는데 직접적으로 관련된 잔기들만이 다양화된다. 많은 분자에 대해, 상기 기능은 표적으로의 결합이 될 것이며, 따라서 다양성은 표적 결합 부위에 집중되어야 하는 반면, 분자의 전체 패킹에 중요한 분자를 변화시키거나 선택된 주쇄 형태를 유지시키는 것은 피해야 한다.
항체 도메인에 적용됨에 따른 정준 서열의 다양화
항체 이중특이적 리간드의 경우, 표적에 대한 결합 부위는 가장 빈번하게는 항원 결합 부위이다. 따라서, 매우 바람직한 양태에서, 본 발명은 단지 항원 결합 부위 내의 잔기만이 변형되는 항체 이중특이적 리간드의 어셈블리의 라이브러리 또는 상기 어셈블리를 제공한다. 이들 잔기는 인간 항체 레퍼토리에서 극도록 다양하고, 고-분해 항체/항원 복합체 내에서 접촉을 이루는 것으로 공지되어 있다. 예를들어, L2는 천연 발생 항체에서 위치 50 및 53이 다양한 것으로 공지되어 있고, 항원과 접촉을 이루는 것으로 관찰된다. 대조적으로, 통상적인 방법은 문헌[Kabat et al. (1991, supra)]에 정의된 바와 같이 상응하는 상보성 결정 영역 (CDR1) 내의 모든 잔기를 다양화시켰고, 약 7개의 잔기를 본 발명에 따라 사용하기 위한 라이브러리에서 다양화된 2개와 비교하였다. 이는 다양한 항원 결합 특이성을 생성시키기 위해 필요한 기능적 다양성에 대한 현저한 개선을 나타낸다.
사실상, 항체 다양성은 나이브(naive) 1차 레퍼토리를 생성하기 위한 점라인 V, D 및 J 유전자의 체세포성 재조합 (점라인 및 접합부 다양성으로도 언급됨) 및 생성된 재배열된 V 유전자의 체세포성 과변이의 두개의 과정의 결과이다. 인간 항체 서열의 분석은 1차 레퍼토리에서의 다양성이 항원 결합 부위의 중심에 초점이 되는 반면, 체세포성 과변이는 1차 레퍼토리에서 고도로 보존된 항원 결합 부위의 주위의 영역에 대해 다양하게 분포된 것으로 나타난다 (참조: Tomlinson et al. (1996) J. MoI. Biol, 256: 813). 이러한 상보성은 비록 항체에서만 명백하게 독특히지만 서열 공간을 검색하기 위한 효과적인 방법으로 발달될 수 있고, 이는 기타 폴리펩티드 레퍼토리에도 용이하게 적용될 수 있다. 다양화된 잔기들은 표적에 대한 결합 부위를 형성하는 것의 서브셋이다. 표적 결합 부위 내의 다양한 (오버래핑되는 것을 포함함) 잔기의 서브셋은 요망시 선택 동안 여러 단계에서 다양화된다.
항체 레퍼토리의 경우, 최초 '나이브' 레퍼토리는 항원 결합 부위 내의 전체가 아닌 몇몇 잔기가 다양화되는 경우 생성된다. 본원에서 사용되는 맥락과 같이, 용어 "나이브"는 미리 결정된 표적을 지니지 않는 항체 분자를 의미한다. 이러한 분자는 면역계가 아직 광범위한 항원 자극에 의해 공격되지 않은 태아 및 신생아 개체의 경우와 같이 면역 다양성을 경험하지 않은 개체의 면역글로불린 유전자에 의해 엔코딩된 것과 유사하다. 이후, 이러한 레퍼토리는 광범위한 항원 또는 에피토프에 대해 선택된다. 요망되는 경우, 추가의 다양성이 최초 레퍼토리에서 다양화된 영역 외부에 도입될 수 있다. 이러한 성숙한 레퍼토리는 변형된 기능, 특이성 또는친화성에 대해 선택될 수 있다.
본 발명은 항원 결합 부위 내의 몇몇 또는 모든 잔기가 변형된 이중 특이적 리간드 또는 이중특이적 리간드의 나이브 라이브러리의 작제를 위해 결합 도메인의 두개의 상이한 나이브 레퍼토리를 제공한다. "1차" 라이브러리는 점라인 V 유전자 분절 내에서 다양하거나 (점라인 다양성) 재조합 과정 동안 다양화 (접합 다양성)된 항원 결합 부위의 중심의 잔기에 제한된 다양성을 지니는 천연 1차 레퍼토리를 모방한다. 다양화된 잔기들은 H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H96, H97, H98, L50, L53, L91, L92, L93, L94 및 L96을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. "체세포성" 라이브러리에서, 다양성은 재조합 과정 동안 다양화(접합 다양성)되거나 매우 체세포적으로 돌연변이화된 잔기에 제한된다. 다양화된 잔기는 H31, H33, H35, H95, H96, H97, H98, L30, L31, L32, L34 및 L96을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 라이브러리에서의 다양화에 적합한 상기 기술된 모든 잔기는 하나 이상의 항체-항원 복합체에서 접촉을 이루는 것으로 공지되어 있다. 둘 모두의 라이브러리에서, 항원 결합 부위 내의 모든 잔기가 변화되는 것은 아니므로, 요망되는 경우 잔여 잔기를 변화시킴으로서 선택 동안 추가의 다양성이 통합된다. 임의의 상기 잔기 (또는 항원 결합 부위를 포함하는 추가 잔기)의 임의의 서브셋이 항원 결합 부위의 최초 및/또는 이후의 다양화에 사용될 수 있음이 당업자에게 명백해야 한다.
본 발명에 사용하기 위한 라이브러리의 작제에서, 선택된 위치의 다양화는 통상적으로 다수의 가능한 아미노산 (모든 20 또는 이의 서브셋)이 상기 위치에 포함될 수 있도록 폴리펩티드의 서열을 특성화하는 코딩 서열을 변환시킴으로써 핵산 수준에서 달성된다. IUPAC 명명법을 이용하여, 가장 다능한 코돈은 모든 아미노산 뿐만 아니라 TAG 정지 코돈을 엔코딩하는 NNK이다. NNK 코돈은 바람직하게는 필요한 다양성을 도입시키기 위해 사용된다. 추가의 정지 코돈 TGA 및 TAA의 생성을 야기시키는 NNN 코돈을 포함하는 동일한 목적을 달성하는 기타 코돈이 또한 사용된다.
인간 항체의 항원 결합 부위에서의 측쇄 다양성의 특징은 특정 아미노산 잔기를 선호하는 현저한 경향이다. 각각의 VH, VK 및 Vχ 영역에서의 10개의 가장 다양한 위치의 아미노산 조성이 합계되는 경우, 측쇄 다양성의 76% 이상이 세린 (24%), 티로신 (14%), 아스파라긴 (11%), 글리신 (9%), 알라닌 (7%), 아스파테이트 (6%) 및 트레오닌 (6%)의 7개의 상이한 잔기만으로부터 발생한다. 이러한 주쇄 가요성을 제공할 수 있는 친수성 잔기 및 작은 잔기로의 경향은 광범위한 항원 또는 에피토프에 결합하는 경향이 있는 표면의 진화를 반영하는 듯 하며, 1차 레퍼토리 내의 항체에서 요구되는 복잡성을 설명하는데 도움이 될 수 있다.
아미노산의 상기 분포를 모방하는 것이 바람직하므로, 다양화되는 위치에서의 아미노산의 분포는 바람직하게는 항체의 항원 결합 부위에서 관찰되는 것을 모방한다. 다양한 표적 항원에 대한 특정 폴리펩티드 (반드시 항체 폴리펩티드는 아님)의 선택을 허용하는 아미노산의 분포에서의 상기 경향은 임의의 폴리펩티드 레퍼토리에 대해 용이하게 적용된다. 다양화되는 위치에서의 아미노산 분포를 경향화시키는 다양한 방법 (트리-누클레오티드 돌연변이 유발의 사용을 포함함, 참조 WO97/08320)이 존재하고, 이중 바람직한 방법은 합성의 용이함으로 인해 통상적인 축퇴성 코돈의 사용이다. 천연 아미노산 용도를 이용한 축퇴성 코돈 (각각의 위치에서 동일한 비의 단일, 이중, 삼중 및 사중 축퇴를 지님)의 모든 조합에 의해 엔코딩된 아미노산 프로파일을 비교함으로써, 대부분의 표시 코돈을 계산하는 것이 가능하다. IUPAC 명명법을 이용한 코돈 (AGT)(AGC)T, (AGT)(AGC)C 및 (AGT)(AGC)(CT) - 즉, DVT, DVC 및 DVY 각각이 요망되는 아미노산 프로파일에 가장 근접한 것들이다: 이들은 22% 세린 및 11% 티로신, 아라파라긴, 글리신, 알라닌, 아스파테이트, 트레오닌 및 시스테인을 엔코딩한다. 따라서, 바람직하게는 라이브러리는 각각의 다양화된 위치에서 DVT, DVC 또는 DVY 코돈을 이용하여 작제된다.
G: 리간드 반감기를 증가시킬 수 있는 항원
본 발명에 따른 이중특이적 리간드는 이의 한 형태에서 생체내에서의 리간드의 반감기를 증가시킬 수 있는 하나 이상의 분자에 대해 결합할 수 있다. 통상적으로, 이러한 분자는 생체내에서 천연적으로 발생하고, 유기체로부터의 원치않는 물질을 제거하는 내생 메커니즘에 의한 분해 또는 제거에 내성인 폴리펩티드이다. 예를들어, 유기체의 반감기를 증가시키는 분자는 하기로부터 선택될 수 있다:
세포외 기질로부터의 단백질; 예를들어, 콜라겐, 라미닌, 인테그린 및 피브로넥틴. 콜라겐은 세포외 기질의 주요 단백질이다. 신체의 여러 부분에서 발견된 약 15 타입의 콜라겐 분자가 공지되어 있고, 예를들어 타입 I 콜라겐 (신체 콜라겐의 90%를 차지)는 골, 피부, 힘줄, 인대, 각막, 내부 장기에서 발견되고, 타입 II 콜라겐은 연골, 축추 디스크, 척삭, 안구의 유리성 체액에서 발견된다.
하기를 포함하는 혈액에서 발견되는 단백질:
혈장 단백질, 예를들어 피브린, α-2 마크로글로불린, 혈청 알부민, 피브리노겐 A, 피브리노겐 B, 혈청 아밀로이드 단백질 A, 헵타글로빈, 프로필린, 유비퀴틴, 우테로글로불린 및 β-2-마이크로글로불린;
효소 및 억제인자, 예를들어 플라스미노겐, 라이소자임, 시스타틴 C, 알파-1-안티트립신 및 췌장 트립신 억제인자. 플라스미노겐은 트립신 유사 세린 프로테아제 플라스민의 비활성 전구물질이다. 이는 일반적으로 혈류를 통해 순환하는 상태로 발견된다. 플라스미노겐이 활성화되고, 플라스민으로 전환되는 경우, 이는 혈병에서 혈액 세포를 엉클어지게 하는 피브리노겐 섬유를 용해시키는 효능있는 효소 도메인을 언폴딩시킨다. 이를 섬유소용해라 한다.
면역계 단백질, 예를들어 IgE, IgG, IgM.
운반 단백질, 예를들어 레티놀 결합 단백질, α-1 마이크로글로불린.
디펜신, 예를들어 베타-디펜신 1, 호중구 디펜신 1, 2 및 3.
혈액뇌장벽 또는 중성 조직에서 발견되는 단백질, 예를들어 멜라노코르틴 수용체, 수초, 아스코르베이트 운반체.
트랜스페린 수용체 특이적 리간드-신경약제 융합 단백질 (참조: US5977307);
뇌 모세혈관 내피세포 수용체, 트랜스페린, 트랜스페린 수용체, 인슐린, 인슐린 유사 성장 인자 1 (IGF 1) 수용체, 인슐린 유사 성장 인자 2 (IGF 2) 수용체, 인슐린 수용체. 신장에 국소화된 단백질, 예를들어 폴리시스틴, 타입 IV 콜라겐, 유기 음이온 운반체 K1, 헤이만 항원(Heymann's antigen).
간에 국소화된 단백질, 예를들어 알코올 탈수소효소, G250.
혈액 응고 인자 X
α1 항트립신
HNF 1α
폐에 국소화된 단백질, 예를들어 분비 성분 (IgA에 결합함).
심장에 국소화된 단백질, 예를들어 HSP 27. 이는 확장심근병증과 관련된다.
피부에 국소화된 단백질, 예를들어 케라틴.
골 특이적 단백질, 예를들어 골형성 활성을 나타내는 형질전환 성장 인자 β 상과의 서브셋인 골 형성 단백질 (BMP). 예로서 BMP-2, -4, -5, -6, -7 (골형성 단백질 (OP-1)으로도 언급됨) 및 -8 (OP-2)를 포함한다.
인간 영양막 항원, 헤르셉틴 (herceptin) 수용체, 에스트로겐 수용체, 카텝신, 예를들어 카텝신 B (간 및 비장에서 발견됨)을 포함하는 종양 특이적 단백질.
하기를 포함하는 질병 특이적 단백질, 예를들어 활성화된 T 세포에서만 발현되는 항원:
LAG-3 (림프구 활성화 유전자), 오스테오프로테게린(osteoprotegerin) 리간드 (OPGL)(참조: Nature 402, 304-309; 1999), OX40 (활성화된 T 세포에서 발현된 TNF 수용체 과의 일원 및 인간 T 세포 백혈병 바이러스 타입-I (HTLV-I)-생성 세포에서 특이적으로 상향조절되는 것으로 공지된 공동자극성 T 세포 분자) 참조: J Immunol. 2000 Jul 1;165(1):263-70; 드로소필라 (Drosophila) CG6512, 인간 파라플레긴 (paraplegin), 인간 FtsH, 인간 AFG3L2, 뮤린 ftsH을 포함하는 메탈로프로페아제 (관절염/암과 관련됨); 산성 섬유모세포 성장 인자 (FGF-1), 염기성 섬유모세포 성장 인자 (FGF-2), 맥관 내피세포 성장 인자/맥관 투과 인자 (VE-GF/VPF), 형질전환 성장 인자-a (TGFa), 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α), 안지오텐신, 인터루킨-3 (IL-3), 인터루킨-8 (IL-8), 혈소판 유래 내피세포 성장 인자 (PD-ECGF), 태반 성장 인자 (P1GF), 미드카인 (midkine) 혈소판 유래 성장 인자-BB (PDGF), 프랙탈카인을 포함하는 혈관형성 성장 인자.
스트레스 단백질 (열 충격 단백질)
HSP는 보통 세포내에서 발견된다. 이들이 세포외에서 발견되는 경우, 이는 세포가 사멸되고, 이의 내용물이 흘러나온 것의 지시자이다. 이러한 프로그램화되지 않은 세포 사멸 (괴사)는 외상, 질병 또는 상체의 결과로서만 발생하고, 따라서 생체내에서 세포외 HSP는 감염 및 질병에 대항하는 면역계로부터의 반응을 유발시킨다. 세포외 HSP에 결합하는 이중특이성은 질병 부위에 국소화될 수 있다.
Fc 운반체에 포함되는 단백질
브람벨 (Brambell) 수용체 (FcRB로도 공지됨).
이러한 Fc 수용체는 두개의 기능을 지니고, 이러한 둘 모두의 기능은 전달에 잠재적으로 유용함
상기 기능은, 태반을 통한 어머니로부터의 아이로의 IgG의 운반, IgG의 분해로부터의 보호에 의한 IgG의 혈청 반감기 연장이다. 이는 수용체가 엔도솜으로부터 IgG를 재생하는 것으로 생각된다.
참조: Holliger et al., Nat Biotechnol 1997 Jul;15(7):632-6.
본 발명에 따른 리간드는 생체내 반감기의 임의의 증가 또는 이를 증가시키는 것을 필요로 하지 않고 표적에 특이적이 되도록 고안될 수 있다. 예를들어, 본 발명에 따른 리간드는 조직 특이적인 전술한 표적으로부터 선택된 표적에 특이적이 될 수 있고, 이에 의해 반감기에서의 임의의 증가를 고려하지 않으나 이러한 증가가 발생할 수 있는, 이중특이적 리간드, 또는 조직 특이적인 치료적으로 관련된 표적에 결합하는 dAb 단량체의 조직 특이적인 표적화를 가능하게 한다. 더욱이, 리간드 또는 dAb 단량체가 신장 또는 간을 표적으로 하는 경우, 이는 생체내에서의 대안적인 청소 경로에 대한 리간드 또는 dAb 단량체로 대상을 변경시킬 수 있다 (예를들어, 상기 리간드는 간 청소로부터 신장 청소로 대상 변경될 수 있다).
H: 본 발명의 제 2 형에 따른 다중특이적 리간드의 용도.
본 발명의 제 2 형의 방법에 따른 다중특이적 리간드는 생체내 치료 및 예방 적용, 시험관내 및 생체내 진단 적용, 시험관내 분석 및 시약 적용 등에 사용될 수 있다. 예를들어, 항체 분자는 당업자에게 공지된 방법에 따라 항체 기재 분석 기술, 예를들어 ELISA 기술에 사용될 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명에 따른 다중특이적 리간드는 진단, 예방 및 치료 과정에 사용된다. 본 발명에 따른 다중특이적 리간드는 표준 면역조직화학 과정에 의해 웨스턴 분석 및 인 시츄 단백질 검출에 진단적으로 사용된다; 예를들어, 상기 적용에 사용하기 위해, 리간드는 당 분야에 공지된 기술에 따라 라벨링될 수 있다. 또한, 상기 항체 폴리펩티드는 크로마토그래피 지지체, 예를들어 수지에 부착되는 경우 친화성 크로마토그래피 과정에서 예비적으로 사용될 수 있다. 상기 모든 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
본 발명에 따른 폐쇄 형태의 다중특이적 리간드의 진단 용도는 두개의 표적에 경쟁적으로 결합하고 두개의 표적이 동시에 결합하지 못하는 폐쇄 형태의 다중특이적 리간드의 능력, 또는 두개의 표적에 동시에 결합하는 다중특이적 리간드의 능력 (개방 형태)을 개발하는 분석물에 대한 동종 분석을 포함한다.
본 발명의 제 2 형의 한 추가 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 리간드를 이용하는 동종 면역분석을 제공한다.
실제의 동종 면역분석 포맷은 약물 발견 및 개발에 사용되는 진단학 및 검색 분석 시스템의 제조자에 의해 매우 고려되어 왔다. 주요 진단학 시장은 병원, 의원 및 클리닉, 상업적 위탁 실험실, 혈액 은행, 및 가정, 비-인간 진단학 (예를들어, 식품 검사, 수질 검사, 환경 검사, 생물방어, 및 수의학 검사), 및 최종 연구 (약물 개발; 기초 연구 및 학술 연구를 포함함)를 포함한다.
현재, 이러한 모든 시장은 화학발광, ELISA, 형광 또는 드물게는 방사성-면역분석 기술로 이루어진 면역분석 시스템을 이용한다. 이러한 분석 포맷 각각은 분리 단계 (결합되지 않은 시약으로부터 결합물을 분리시키는 단계)를 필요로 한다. 몇몇 경우에, 여러 분리 단계가 요구된다. 이러한 추가 단계를 추가하는 것은 시간을 요하고, 분석의 최종 결과에 영향을 미치는 시약 및 자동화를 추가로 한다. 인간 진단학에서, 분리 단계는 자동화될 수 있고, 이는 문제점을 감추어 버리고, 이를 제고하지 않는다. 로봇 공학, 추가 시약, 추가 인큐베이션 시간 등은 현저한 비용증가 및 복잡성을 부가한다. 약물 개발에서, 고속 처리 스크리닝과 같이, 매우 낮은 수준의 시험 분자로 사실상 수백만개의 샘플이 한번에 분석되는 경우, 추가 분리 단계를 추가하는 것은 스크리닝을 수행하는 능력을 제거할 수 있다. 그러나, 상기 분리 단계를 회피하는 것은 판독시 너무 많은 노이즈를 발생시킨다. 따라서, 현재 분석 포맷으로부터 수득가능한 범위에서 민감성을 제공하는 진정한 동족 포맷이 요구된다. 유리하게는, 분석은 높은 민감성 및 큰 동적 구역을 지닌 완전히 정량적인 정보판독을 포함한다. 민감성은 요구되는 샘플의 양을 감소시키므로 중요한 요구사항이다. 이러한 둘 모두의 특성은 동족 시스템이 제공하는 특성이다. 이는 샘플이 귀중한 경우 현장검사 및 약물 개발에서 매우 중요하다. 현재 당 분야에서 이용가능한 이종 시스템은 많은 양의 샘플 및 고비용의 시약을 필요로 한다.
동족 분석에 대한 적용은 암 검사를 포함하고, 가장 중요한 분석은 남성의 전립선 암에 대한 스크리닝에 사용되는 전립선 특이적 항원에 대한 분석이다. 기타 적용은 임신에 대한 베타-hcg를 포함하여 여성이 임신에 대해 시도하는 일련의 검사를 제공하는 임신 검사를 포함한다. 간염, HIV, 풍진, 및 기타 바이러스 및 미생물을 포함하는 감염성 질병 및 성적으로 전염되는 질병에 대한 검사. 시험, 특히 HIV, A, B, C형 간염, 비A, 비B형 간염에 대한 시험이 혈액 은행에 의해 사용된다. 치료 약물 모니터링 시험은 효능적이고 독성을 회피하기 위한 환자의 처방된 약물, 예를들어 부정맥에 대한 디곡신의 수준, 정신병의 경우 페노바르비탈 수준, 및 천식에 대한 테오필린 수준의 모니터링을 포함한다. 더욱이, 진단 시험은 약물 남용 시험, 예를들어 코카인, 마리화나 등에 대한 시험에 유용하다. 대사시험이 갑상선 기능, 빈혈 및 기타 생리학적 장애 및 기능을 측정하기 위해 사용된다.
더욱이, 동족 면역분석 포맷은 표준 임상 화학 분석의 제조에 유용하다. 동일한 기계에 대한 면역분석 및 화학 분석의 포함은 진단 시험에서 매우 유용하다. 적합한 화학 분석은 글루코오스, 콜레스테롤, 칼륨 등에 대한 시험을 포함한다.
동족 면역분석에 대한 추가의 주요 적용은 약물 발견 및 개발이다; 고속 처리 스크리닝은 극히 높은 부피의 표적에 대한 복합 화학 라이브러리의 시험을 포함한다. 신호가 검출된 후, 포지티브 그룹이 보다 작은 그룹으로 분리되고, 결국에서 세포 및 이후 동물에서 시험된다. 동족 분석은 상기 모든 유형의 시험에 사용될 수 있다. 약물 개발, 특히 동물 연구 및 임상 시험에서, 면역분석이 비중있게 사용된다. 동족 분석은 상기 과정을 매우 가속화시키고, 단순화시킨다. 기타 적용은 식품 및 음료 시험; 대장균 (E. coli), 살모넬라 등에 대한 육류 및 기타 식품 검사; 대장균을 포함하는 모든 유형의 오염에 대한 수생 식물에서의 검사를 포함하는 수질 검사; 및 수의학 검사를 포함한다.
한 광범위한 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폐쇄 형태의 다중특이적 리간드에 결합되는 검출가능한 작용제를 포함하고, 이의 검출가능한 특성이 상기 폐쇄 형태의 다중특이적 리간드에 대한 분석물의 결합에 의해 변화되는 결합 분석을 제공한다. 이러한 분석은 여러 다양한 방식으로 형성될 수 있고, 각각은 폐쇄 형태의 다중특이적 리간드의 상기 특성을 활용한다.
상기 분석은 분석물에 의해 작용제의 직접 또는 간접 대체에 의존하고, 이에 의해 작용제의 검출가능한 특성에서 변화가 발생한다. 예를들어, 상기 작용제가 검출가능한 결과를 편향되게 하는 반응을 촉매할 수 있는 효소인 경우, 상기 효소는 상기 리간드에 의해 결합되어 이의 활성 부위를 방해할 수 있고, 이에의해 상기 효소를 불활성화시킬 수 있다. 폐쇄 형태의 다중특이적 리간드에 의해 또한 결합되는 분석물은 효소를 대체하고, 활성 부위의 자유로움을 통해 이를 활성이 되도록 한다. 이후, 상기 효소는 기질과 반응하여 검출가능한 결과를 발생시킬 수 있다. 한 대안적 구체예에서, 상기 리간드는 활성 부위의 외부에서 효소에 결합할 수 있고, 이는 효소의 형태에 영향을 주어 이의 활성을 변화시킨다. 예를들어, 활성 부위의 구조는 리간드의 결합에 의해 구속될 수 있거나, 활성에 필요한 보조인자의 결합이 예방될 수 있다.
상기 분석의 물리적 이행은 당 분야에 공지된 임의의 형태를 취할 수 있다. 예를들어, 폐쇄 형태의 다중특이적 리간드/효소 복합체는 시험 스트립 상에 제공될 수 있고; 기질은 상기 시험 스트립의 상이한 영역에 제공될 수 있고, 분석물을 함유하는 용매는 리간드/효소 복합체를 통해 이동되도록 하고, 상기 효소를 제거하고, 이를 기질 영역으로 이동시켜 신호를 생성시킬 수 있다. 대안적으로, 리간드/효소 복합체는 시험 막대 또는 기타 고형상에 제공될 수 있고, 분석물/기질 용액으로 담궈져, 분석물의 존재에 대한 반응으로 용액으로 효소를 방출시킨다.
분석물의 각각의 분자는 잠재적으로 하나의 효소 분자를 방출시키므로, 상기 분석은 정량적이고, 용액 내의 분석물의 농도에 의존하여 주어진 시간에 생성되는 신호의 강도를 지닌다.
폐쇄 형태에서 상기 분석물을 이용하는 추가의 형태가 가능하다. 예를들어, 폐쇄 형태의 다중특이적 리간드는 알로스테릭 (allosteric) 부위에서 효소와 결합하도록 형성되어, 효소를 활성화시킬 수 있다. 이러한 한 구체예에서, 상기 효소는 분석물의 분재하에서 활성이다. 분석물의 첨가는 효소를 대체하고, 알로스테릭 활성화를 제거하여, 효소를 불활성화시킨다.
분석물 농도의 측정으로서 효소 활성을 이용하는 상기 구체예의 맥락에서, 상기 효소의 활성화 또는 비활성화는 신호 생성 반응을 촉매하는 효소의 활성으로 측정된, 효소의 활성의 감소 또는 증가를 의미한다. 예를들어, 상기 효소는 검출가능하지 않는 기질의 이의 검출가능한 형태로의 전환을 촉매할 수 있다. 예를들어, 호스라디쉬(horseradish) 과산화효소가 시판되는 색소 또는 화학발광 기질과 함께 당 분야에서 널리 사용된다. 상기 효소의 활성의 증가 또는 감소 수준은 10% 내지 100%, 예를들어 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%일 수 있고; 활성 증가의 경우, 이러한 증가는 100% 초과, 즉 200%, 300%, 500% 또는 이 이상일 수 있거나, 억제된 효소의 기저 활성이 검출가능하지 않은 경우 백분율로 측정될 수 없다.
한 추가 형태에서, 폐쇄 형태의 다중특이적 리간드는 효소가 아닌 효소/기질 쌍의 기질에 결합할 수 있다. 따라서, 기질은 분석물의 결합을 통해 폐쇄 형태의 다중특이적 리간드로부터 방출될 때까지 효소에 대해 이용가능하지 않다. 이러한 형태를 위한 이행은 효소에 결합하는 형태와 같다.
더우이, 분석은 형광이 리간드에 대한 결합시에 켄칭되는 형태로 형광 분자, 예를들어 형광물질 또는 또 다른 형광단에 결합하도록 형성될 수 있다. 이러한 경우, 리간드에 대한 분석물질의 결합은 형광 분자를 대체하여, 신호를 생성시킬 수 있다. 본 발명에 유용한 형광 분자에 대한 대안은 발광 작용제, 예를들어 루시페린/루시퍼라아제, 및 HRP와 같은 면역검정에 통상적으로 사용되는 작용제를 포함하는 색소 작용제를 포함한다.
치료 및 진단 조성물 및 이들의 용도
본 발명은 본 발명의 TNFR1의 길항제 (예를들어, 리간드) (예를들어, 이중특이적 리간드, 다중특이적 리간드, dAb 단량체) 및 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형체를 포함하는 조성물, 및 본 발명의 리간드 또는 조성물을 사용하는 치료 및 진단 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 따른 길항제 및 리간드 (예를들어, 이중특이적 리간드, 다중특이적 리간드, dAb 단량체)는 생체내 치료 및 예방 적용, 생체내 진단 적용 등에 사용될 수 있다.
본 발명의 길항제 및 리간드 (예를들어, 다중특이적 리간드, 이중특이적 리간드, dAb 단량체)의 치료 및 예방 용도는 본 발명에 따른 길항제 및/또는 리간드를 수용체 포유동물, 예를들어 인간에게 투여하는 것을 포함한다. 이중특이적 및 다중특이적 리간드 (예를들어, 이중특이적 항체 포맷)는 높은 결합성으로 다합체 항원에 결합한다. 이중특이적 또는 다중특이적 리간드는 예를들어 종양 세포주의 사멸을 매개하는 세포독성 T 세포를 보충하는데 있어서 두개의 항원이 가교를 가능케 한다.
90 내지 95% 이상의 동종성의 실질적으로 순수한 리간드 또는 이의 결합 단백질, 예를들어 dAb 단량체가 포유동물에 투여하기에 바람직하고, 98 내지 99% 이상의 동종성이 약학적 용도, 특히 포유동물이 인간인 경우에 가장 바람직하다. 부분적으로 또는 요망되는 동종성으로 정제된 후, 리간드는 진단적 또는 치료적 (체외 포함)으로 사용될 수 있거나, 분석 과정, 형광 염색 등을 개발하고 수행하는데 사용될 수 있다 (Lefkovite and Pernis, (1979 and 1981) Immunological Methods, Volumes I and II, Academic Press, NY).
예를들어, 본 발명의 리간드 또는 이의 결합 단백질, 예를들어 dAb 단량체는 통상적으로 급성 및 만성 염증 질병을 포함하는 염증 상태를 예방하거나, 억제하거나, 치료하는데 사용될 것이다. 예를들어, 길항제 및/또는 리간드는 만성 염증 질병, 알레르기 과민성, 암, 박테리아 또는 바이러스 감염, 자가면역 질병 (타입 I 당뇨병, 천식, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 유년기 류마티스 관절염, 건선성 관절염, 척추관절병증 (예를들어, 강직성 척추염), 전신홍반루푸스, 염증성 장질병 (예를들어, 크론병, 궤양성 대장염), 중증근무력증 및 베케트 증후군을 포함하나, 이에 제한되지는 않음), 건선, 자궁내막증, 및 복부 유착 (예를들어, 복부 수술 후)을 치료하거나, 억제하거나 예방하기 위해 투여될 수 있다.
세포내 이입과 관련된 세포외 표적 (예를들어, 클라트린)에 결합할 수 있는 본 발명에 따른 길항제 (예를들어, 리간드) (예를들어, 이중특이적 리간드, 다중특이적 리간드, dAb 단량체)가 세포내 이입되어, 세포내 표적에 접근될 수 있다. 또한, 이중특이적 또는 다중특이적 리간드는 세포내 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 도메인 (예를들어, dAb 단량체)가 세포내 환경으로 전달될 수 있는 수단을 제공한다. 이러한 방법은, 예를들어 세포 내에서 기능적으로 지속될 수 있도록 하는 물리적 특성을 지닌 이중특이적 리간드를 필요로 한다. 대안적으로, 최종 목적의 세포내 구획이 산화되는 경우, 잘 폴딩된 리간드는 디설피드 결핍을 필요로 하지 않을 수 있다.
즉각적인 적용에서, 용어 "예방"은 질병의 도입 전에 보호적 조성물을 투여하는 것을 포함한다. "억제"는 유도 결과 후이지만, 질병의 임상 외간 전에 조성물의 투여를 의미한다. "치료"는 질병 증상이 명백해진 후의 보호적 조성물의 투여를 포함한다.
유리하게는, 이중특이적 또는 다중특이적 리간드는 유기체의 신체에서 치료 상황에서 상승작용적으로 협동하는 표적 사이토카인 및 기타 분자에 대해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 두개 이상의 분자 (예를들어, 사이토카인)에 결합할 수 있는 이중특이적 또는 다중특이적 리간드를 투여하는 것을 포함하여, 사이토카인 또는 기타 분자에 결합하는 두개 이상의 결합 도메인 (예를들어, dAb)의 활성을 상승작용시키기 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 이러한 양태에서, 이중특이적 또는 다중특이적 리간드는 상보적 및/또는 비-상보적 도메인으로 구성된 리간드, 개방 형태 및 폐쇄 형태의 리간드를 포함하는 임의의 이중특이적 또는 다중특이적 리간드일 수 있다. 예를들어, 본 발명의 이러한 양태는 VH 도메인 및 VL 도메인, VH 도메인 단독 및 VL 도메인 단독의 조합물에 관한 것이다.
치료 맥락에서의 상승작용은 다수의 방법으로 달성될 수 있다. 예를들어, 표적 조합물은 둘 모두의 표적이 리간드에 의해 표적화되는 경우에만 치료적으로 활성일 수 있는 반면, 하나의 단독 표적을 표적화하는 것은 치료적으로 효과적이지 않다. 또 다른 구체예에서, 하나의 단독 표적은 다소 낮거나 최소 치료 효과를 제공할 수 있으나, 제 2 표적과 함께에서는 상기 조합물은 치료 효과의 상승적 증가를 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 상기 양태의 이중특이적 또는 다중특이적 리간드에 의해 결합된 사이토가인은 부록 2에 나타낸 목록으로부터 선택된다.
더욱이, 이중특이적 또는 다중특이적 리간드는 종양학 적용에 사용될 수 있고, 하나의 특이성은 세포독성 세포에서 발현되는 CD89를 표적으로 하고, 나머지 하나는 종양 특이적이다. 표적화될 수 있는 종양 항원의 예는 부록 3에 주어진다.
상기 질병에 대한 보호 또는 치료에서 TNFR1의 길항제 (예를들어, 리간드, 항체 또는 이의 결합 단백질)의 유효성을 스크리닝하기 위해 사용될 수 있는 동물 모델 시스템이 이용가능하다. 민감한 마우스에서의 전신홍반루푸스 (SLE)의 치료를 위한 방법은 당 분야에 공지되어 있다 (Knight et al. (1978) J. Exp. Med., 147: 1653; Reinersten et al. (1978) New Eng. J. Med., 299: 515). 중증근무력증 (MG)은 또 다른 종으로부터의 가용성 AchR 단백질을 이용하여 상기 질병을 유도시킴으로써 SJL/J 암컷 마우스에서 시험된다 (Lindstrom et al. (1988) Adv. Immunol., 42: 233). 관절염은 타입 II 콜라겐의 주사에 의해 민감한 종의 마우스에서 유도된다 (Stuart et al. (1984) Ann. Rev. Immunol, 42: 233). 미코박테리아 열충격 단백질의 주사에 의해 민감한 래트로 유년기 관절염을 도입시킨 모델이 기술되어 있다 (Van Eden et al. (1988) Nature, 331: 171). 갑상선글로불린의 투여에 의해 마우스에서 갑상샘염이 유도된다 (Maron et al. (1980) J. Exp. Med., 152: 1115). 인슐린 의존성 당뇨병 (IDDM)은 자연적으로 발생하거나, 특정 종의 마우스, 예를들어 문헌[Kanasawa et al. (1984) Diabetologia, 27: 113]에 기술된 마우스에서 유도될 수 있다. 마우스 및 래트에서의 EAE는 인간에서의 MS에 대한 모델로 작용한다. 이러한 모델에서, 탈수초 질병이 수초 기초 단백질의 투여에 의해 유도된다 (참조: Paterson (1986) Textbook oflmmunopathology, Mischer et al., eds., Grune and Stratton, New York, pp. 179-213; McFarlin et al (1973) Science, 179: 478: and Satoh et al (1987) J. Immunol, 138: 179).
일반적으로, 본 발명의 길항제 (예를들어, 리간드)는 약리학적으로 적절한 담체와 함께 정제된 형태로 이용될 것이다. 통상적으로, 이러한 담체는 수용액 또는 알코올/수용액, 에멀젼 또는 현탁액, 염수 및/또는 완충 배지를 포함한다. 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 링거의 덱스트로오스, 덱스트로오스 및 염화나트륨 및 락테이트화된 링거를 포함한다. 현탁액 내에 폴리펩티드 복합체를 지속시키는 것이 필요한 경우, 적절한 생리학적으로 허용되는 애쥬번트가 증점제, 예를들어 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴 및 알기네이트로부터 선택될 수 있다.
정맥내 비히클은 유체 및 영양소 보충물 및 전해질 보충물, 예를들어 링커 덱스트로오스에 기초한 것을 포함한다. 보존제 및 기타 첨가제, 예를들어 항균제, 항산화제, 킬레이트제 및 비활성 가스가 또한 존재할 수 있다 (Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition). 연장된 방출 포뮬레이션을 포함하는 다양한 적절한 포뮬레이션이 사용될 수 있다.
본 발명의 길항제 (예를들어, 리간드)가 별도로 투여되는 조성물 또는 기타 작용제와 함께 투여되는 조성물로 사용될 수 있다. 이들은 다양한 면역치료 약물, 예를들어 시클로스포린, 메토트렉세이트, 아드리아마이신 또는 시스플라티늄, 및 면역독소를 포함할 수 있다. 약제 조성물은 본 발명의 길항제 (예를들어, 리간드)와 함께 다양한 세포독소 또는 기타 작용제의 "칵테일(cocktail)", 또는 다양한 특이성을 지니는 본 발명에 따른 리간드, 예를들어 투여전에 풀링되건 안되건 간에 다양한 표적 항원 또는 에피토프를 이용하여 선택된 리간드의 조합물을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약제 조성물의 투여 경로는 당업자에게 통상적으로 공지된 것중 임의의 것일 수 있다. 면역 요법을 제한하지 않는 것을 포함하는 치료를 위해, 본 발명의 선택된 리간드는 표준 기술에 따라 임의의 환자에 투여될 수 있다. 투여는 비경구, 정맥내, 근내, 복막내, 경피, 폐경로를 통해, 또는 적절하게는 카테터를 이용한 직접 주입을 포함하는 임의의 적절한 방식일 수 있다. 투여량 및 빈도는 임상의에 의해 고려되는 환자의 연령, 성별 및 상태, 기타 약물의 동반 투여, 카운터인디케이션(counterindication) 및 기타 파라미터에 의존될 것이다. 투여는 나타낸 바와 같이 국소적 (예를들어, 폐 투여에 의한 폐로의 국소 전달, 예를들어 비내 투여)이거나 전신적일 수 있다.
본 발명의 리간드는 보관을 위해 동결건조될 수 있고, 사용전에 적절한 담체에 재구성될 수 있다. 이러한 기술은 통상적인 면역글로불린을 이용하여 효과적인 것으로 밝혀졌고, 당 분야에 공지된 동결건조법 및 재구성 기술이 사용될 수 있다. 당업자는 동결건조법 및 재구성이 항체 활성 손실의 다양한 정도를 야기할 수 있으며 (예를들어, 통상적인 면역글로불린인 IgM 항체는 IgG 항체보다 더 큰 활성 손실을 지니는 경향이 있음), 이를 보충하기 위해 사용 수준이 상향 조절될 수 있음을 인지할 것이다.
본 발명의 길항체 (예를들어, 리간드) 또는 이의 칵테일을 함유하는 조성물은 예방적 및/또는 치료적 처리를 위해 투여될 수 있다. 특정 치료 적용에서, 선택된 세포의 집단의 적어도 부분적인 억제, 서프레션, 조절, 사멸, 또는 기타 측정가능한 파라미터를 달성하기에 적절한 양은 "치료적 유효량"으로 정의된다. 이러한 용량을 달성하기에 요구되는 양은 질병의 중중도 및 환자의 면역계의 일반 상태에 좌우될 것이나, 일반적으로 체중 ㎏ 당 0.005 내지 5.0 mg의 리간드, 예를들어 항체, 수용체 (예를들어, T 세포 수용체) 또는 이의 결합 단백질의 범위이고, 0.05 내지 2.0 mg/kg/용량의 용량이 더욱 일반적으로 사용된다. 예방 적용을 위해, 본 발명의 리간드 또는 이의 칵테일을 함유하는 조성물은 또한 질병의 발명을 예방하거나, 억제하거나, 지연시키기 위해 (예를들어, 완화 또는 정지를 지속시키거나 급성 단계를 방지하기 위해) 유사하거나 약간 낮은 용량으로 투여될 수 있다. 숙력된 임상의는 질병을 치료하거나, 억제하거나, 예방하기 위한 적절한 투여 간격을 결정할 수 있을 것이다. TNFR1의 길항제 (예를들어, 리간드)가 만성 염증 질병을 치료하거나, 억제하거나, 예방하기 위해 투여되는 경우, 이는 , 예를들어 약 10 μg/kg 내지 약 80 mg/kg, 약 100 μg/kg 내지 약 80 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 80 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 70 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 60 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 40 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 10 μg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 10 μg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 10 μg/kg 내지 약 2.5 mg/kg, 약 1 mg/kg, 약 2 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 4 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 6 mg/kg, 약 7 mg/kg, 약 8 mg/kg, 약 9 mg/kg 또는 약 10 mg/kg의 용량으로 하루당 4회 이하, 1주일에 2회, 1주일에 1회, 2주 간격으로 1회, 1개월에 1회 또는 2개월 간격으로 1회로 투여될 수 있다. 특정 구체예에서, TNFR1의 길항제 (예를들어, 리간드)는
약 10 μg/kg 내지 약 10 mg/kg (예를들어, 약 10 μg/kg, 약 100 μg/kg, 약 1 mg/kg, 약 2 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 4 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 6 mg/kg, 약 7 mg/kg, 약 8 mg/kg, 약 9 mg/kg 또는 약 10 mg/kg)의 용량으로 2주에 1회 또는 1개월에 1회로, 만성 염증 질병을 치료하거나, 억제하거나, 예방하기 위해 투여될 수 있다.
본원에 기술된 조성물을 이용하여 수행되는 치료 또는 요법은 치료 전에 존재하는 증상, 또는 상기 조성물로 치료되지 않은 개체 (인간 또는 모델 동물) 또는 기타 적절한 대조군에서의 증상에 비해, 하나 이상의 증상이 감소 (예를들어, 10% 이상 또는 임상 평가 스케일에서 하나 이상의 포인트에 의함)된 경우 "효과적인" 것으로 간주된다. 증상은 치료되는 질병 또는 장애에 따라 다양할 것이나, 숙련된 임상의 또는 기술자에 의해 측정될 수 있다. 이러한 증상은, 예를들어 질병 또는 장애의 하나 이상의 생화학적 지시자 (예를들어, 질병과 관련된 효소 또는 대사물질의 수준, 감염된 세포수 등)의 수준을 모니터링하거나, 물리적 표현 (예를들어, 염증, 종양 크기 등)을 모니터링하거나, 인정된 임상적 평가 척도, 예를들어 확장 장애 상태 척도 (다발성 경화증에 대해서임), 어빈(Irvine) 염증성 장질병 질문표 (장 기능, 전신 증상, 사회적 기능 및 감정 상태의 질을 평가하는 32 포인트의 평가 - 스코어는 32 내지 224의 범위이며, 보다 높은 스코어는 보다 나은 삶의 질을 나타냄), 류마티스 관절염 척도의 삶의 질, 또는 당 분야에 공지된 기타 인정된 임상적 평가 척도에 의해 측정될 수 있다. 주어진 임상 척도에 대해 10% 이상 또는 하나 이상의 포인트에 의한 질병 또는 장애 증상에서의 지속적 (예를들어, 하루 이상, 바람직하게는 더 이상) 감소는 "효과적인 치료를 나타낸다. 유사하게, 본원에 기술된 조성물을 이용하여 수행된 예방은 하나 이상의 증상의 발병 또는 중증도가 상기 조성물로 치료되지 않은 유사한 개체 (인간 또는 동물 모델)에서의 증상에 비해 지연되거나, 감소되거나, 제거된 경우 "효과적"이다.
본 발명에 따른 길항제 (예를들어, 리간드) 또는 이의 칵테일을 함유하는 조성물은 포유동물의 선택 표적 세포 집단의 변화, 비활성화, 사멸 또는 제거를 돕기 위한 예방적 및 치료 환경에 이용될 수 있다. 또한, 본원에 기술된 선택된 레퍼토리의 폴리펩티드는 세포의 이종 집합물로부터 표적 세포 집단을 사멸시키거나, 고갈시키거나, 달리 효과적으로 제거하기 위해 체외에서 또는 시험관내에서 선택적으로 사용될 수 있다. 포유동물의 혈액이 리간드, 예를들어 항체, 세포 표면 수용체 또는 이의 결합 단백질과 체외에서 조합될 수 있고, 이에의해 표준 기술에 따라 포유동물로 복귀시키기 위해 요망되지 않는 세포가 혈액으로부터 사멸되거나 달리 제거된다.
본 발명에 따른 길항제 (예를들어, 리간드)를 함유하는 조성물은 포유동물 내의 선택 표적 세포 집단의 변화, 비활성화, 사멸 또는 제거를 돕기 위해 예방적 및 치료 환경에서 사용될 수 있다.
TNFR1의 길항제 (예를들어, 리간드, dAb 단량체)는 하나 이상의 추가 치료제 또는 활성제와 함께 투여되고 포뮬레이팅될 수 있다. TNFR1의 길항제 (예를들어, 리간드, dAb 단량체)가 추가 치료제와 함께 투여되는 경우, TNFR1의 길항제는 추가의 작용제의 투여 전, 작용제와 동시에, 또는 작용제의 투여 후에 투여될 수 있다. 일반적으로, TNFR1의 길항제 (예를들어, 리간드, dAb 단량체) 및 추가의 작용제는 치료 효과의 중복을 제공하는 방식으로 투여된다.
한 구체예에서, 본 발명은 치료적 유효량의 TNFR1의 길항제 (예를들어, TNFR1에 결합하는 dAb 단량체를 포함하는 리간드)를 이를 필요로 하는 포유동물에 투여하는 것을 포함하여, 만성 염증 질병을 치료하거나, 억제하거나, 예방하는 방법에 관한 것이다.
한 구체예에서, 본 발명은 치료적 유효량의 TNFR1의 길항제 (예를들어, TNFR1에 결합하는 dAb 단량체를 포함하는 리간드)를 이를 필요로 하는 포유동물에 투여하는 것을 포함하여, 관절염 (예를들어, 류마티스 관절염, 유년기 류마티스 관절염, 강직성 척추염, 건선성 관절염)을 치료하거나, 억제하거나, 예방하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 치료적 유효량의 TNFR1의 길항제 (예를들어, TNFR1에 결합하는 dAb 단량체를 포함하는 리간드)를 이를 필요로 하는 포유동물에 투여하는 것을 포함하여, 건선을 치료하거나, 억제하거나, 예방하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 치료적 유효량의 TNFR1의 길항제 (예를들어, TNFR1에 결합하는 dAb 단량체를 포함하는 리간드)를 이를 필요로 하는 포유동물에 투여하는 것을 포함하여, 염증성 장질병 (예를들어, 크론병, 궤양성 대장염)을 치료하거나, 억제하거나, 예방하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 치료적 유효량의 TNFR1의 길항제 (예를들어, TNFR1에 결합하는 dAb 단량체를 포함하는 리간드)를 이를 필요로 하는 포유동물에 투여하는 것을 포함하여, 만성 폐쇄폐병 (예를들어, 만성 기관지염, 만성 폐쇄 기관지염, 폐기종)을 치료하거나, 억제하거나, 예방하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 치료적 유효량의 TNFR1의 길항제 (예를들어, TNFR1에 결합하는 dAb 단량체를 포함하는 리간드)를 이를 필요로 하는 포유동물에 투여하는 것을 포함하여, 폐렴 (예를들어, 박테리아성 폐렴, 예를들어 포도상구균 폐렴)을 치료하거나, 억제하거나, 예방하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 만성 폐쇄폐병, 및 폐렴 외의 기타 폐병을 치료하거나, 억제하거나, 예방하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따라 치료되거나, 억제되거나, 예방될 수 있는 기타 폐병은, 예를들어 낭성섬유증 및 천식 (예를들어, 스테로이드 내성 천식)을 포함한다. 따라서, 또 다른 구체예에서, 본 발명은 치료적 유효량의 TNFR1의 길항제 (예를들어, TNFR1에 결합하는 dAb 단량체를 포함하는 리간드)를 이를 필요로 하는 포유동물에 투여하는 것을 포함하여, 페병 (예를들어, 낭성섬유증, 천식)을 치료하거나, 억제하거나, 예방하는 방법에 관한 것이다.
특정 구체예에서, TNFR1의 길항제는 폐 경로, 예를들어 흡입 (예를들어, 기관지내, 비내 또는 경구 흡입, 비내 점적제)을 통하거나, 전신 경로 (예를들어, 경구, 정맥내, 근내, 복막내, 피하)에 의해 투여된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 치료적 유효량의 TNFR1의 길항제 (예를들어, TNFR1에 결합하는 dAb 단량체를 포함하는 리간드)를 이를 필요로 하는 포유동물에 투여하는 것을 포함하여, 패혈 쇼크를 치료하거나, 억제하거나, 예방하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제 2 형의 한 추가 양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 폐쇄 형태의 다중특이적 리간드, 및 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 조성물을 제공한다.
더욱이, 본 발명은 "폐쇄 형태의 다중특이적 리간드" 또는 본 발명에 따른 조성물을 이용하여 질병을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 한 바람직한 구체예에서, 질병은 암 또는 염증 질병, 예를들어 류마티스 관절염, 천식 또는 크론병이다.
본 발명의 제 2 형의 한 추가 양태에서, 본 발명은 폐쇄 형태의 다중특이적 리간드, 또는 본 발명에 따른 조성물을 이용하여 질병을 진단하는 것을 포함하는, 진단을 위한 방법을 제공한다. 따라서, 일반적으로 폐쇄 형태의 다중특이적 리간드에 대한 분석물질의 결합은 대체 시의 신호의 생성을 일으키는 작용제를 대체하기 위해 활용될 수 있다. 예를들어, 분석물질 (제 2 항원)의 결합은, 특히 상기 효소가 이의 활성 부위를 통해 항체를 고정시키는 경우 항체에 결합하는 효소 (제 1 항원)를 대체할 수 있고, 이는 면역분석을 위한 기초를 제공한다.
따라서, 본 발명은 표적 분자의 존재를 검출하는 방법으로서,
(a) 작용제에 대해 표적 분자 및 작용제에 대해 특이적인 폐쇄 형태의 다중특이적 리간드의 결합을 제공하고 (여기서, 상기 리간드에 의해 결합되는 작용제는 리간드로부터 대체 시에 검출가능한 신호를 생성시킴);
(b) 표적 분자에 폐쇄 형태의 다중특이적 리간드를 노출시키고;
(c) 상기 작용제의 대체의 결과로 생성된 신호를 검출하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 제 2 형의 상기 양태에 따르면, 유리하게는, 상기 작용제는 폐쇄 형태의 다중특이적 리간드에 의해 결합되는 경우 비활성인 효소이다. 대안적으로, 상기 작용제는 효소에 대한 기질, 및 리간드에 의해 결합시 비활성화되거나 켄칭되는 형광, 발광 및 색소 분자로 구성된 군으로부터 선택된 임의의 하나 이상의 것일 수 있다.
또한, 본원에 기술된 폴리펩티드의 선택된 레퍼토리는 세포의 이종 집합물로부터의 표적 세포 집단을 사멸시키거나, 고갈시키거나 달리 효과적으로 제거하기 위해 체외에서 또는 시험관에서 선택적으로 사용될 수 있다. 포유동물의 혈액은 상기 리간드, 예를들어 항체, 세포 표면 수용체 또는 이의 결합 단백질과 체외에서 조합되어, 표준 기술에 따라 포유동물에 복귀시키기 위해 요망되지 않는 세포가 혈액으로부터 사멸되거나 달리 제거된다.
실시예
본 발명은 단지 예시적인 목적의 하기 실시예에서 추가로 기술된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, dAb 명명법을 위해, 인간 TNFα는 TAR1으로 언급되고, 인간 TNFα 수용체 1 (p55 수용체)는 TAR2로 언급된다.
실시예 1. 인간 혈청 알부민 (HSA) 및 β-갈락토시다아제 (β-gal)에 대한 이중특이적 scFv 항체 (K8)의 선택.
본 실시예는 점라인 (더미) VH 도메인에 연결된 Vκ 가변 도메인의 레퍼토리가 β-gal에 대한 결합에 대해 선택되고, 점라인 (더미) Vκ 도메인에 연결된 VH 가변 도메인의 레퍼토리가 HSA에 대한 결합에 대해 선택되는, β-gal 및 HSA에 대한 이중특이적 항체를 제조하는 방법을 설명한다. 선택된 가변 VH HSA 및 Vκ β-gal 도메인은 이후 조합되고, 상기 항체는 β-gal 및 HSA에 대한 결합에 대해 선택된다. HSA는 인간 혈액에서 발견되는 반감기 증가 단백질이다.
네개의 인간 파지 항체 라이브러리를 본 실험에 사용하였다.
라이브러리 1 점라인 Vκ/DVT VH 8.46 x 107
라이브러리 2 점라인 VK/NNK VH 9.64 x 107
라이브러리 3 점라인 VH/DVT Vκ 1.47 x 108
라이브러리 4 점라인 VH/NNK Vκ 1.45 x 108
모든 라이브러리는 상보성 결정 영역 (CDR2 및 CDR3) 내에 포함된 측쇄 다양성을 지니는 VH (V3-23/DP47 및 JH4b) 및 Vκ (O12/O2/DPK9 및 Jκ1)에 대한 단일한 인간 프레임워크에 기초한다.
라이브러리 1 및 라이브러리 2는 더미 Vκ 서열을 지니는 반면, VH의 서열은 위치 H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H96, H97 및 H98 (각각 DVT 또는 NNK를 엔코딩함)에서 다양화되어 있다 (도 1). 라이브러리 3 및 라이브러리 4는 더미 VH 서열을 함유하는 반면, Vκ의 서열은 위치 L50, L53, L91, L92, L93, L94 및 L96 (각각 DVT 또는 NNK를 엔코딩함)에서 다양화되어 있다 (도 1). 라이브러리는 파지미드 pIT2/ScFv 포맷으로 존재하고 (도 2), 일반 리간드, 단백질 A 및 단백질 L에 대한 결합에 대해 사전 선택되어서, 선택되지 않은 라이브러리 내의 대부분의 클론은 기능적이다. 상기 나타낸 라이브러리의 크기는 사전 선택 후의 크기에 해당한다. 라이브러리 1 및 라이브러리 2는 항원에 대한 선택 전에 혼합되어, 단일한 VH/더미 Vκ 라이브러리를 생성하고, 라이브러리 3 및 라이브러리 4는 혼합되어 단일한 Vκ/더미 VH 라이브러리를 형성한다.
3 라운드의 선택을 Vκ/더미 VH 라이브러리를 이용하여 β-gal에 대해 수행하고, 3 라운드의 선택을 VH/더미 Vκ 라이브러리를 이용하여 HSA에 대해 수행하였다. β-gal의 경우, 파지 역가는 첫번째 라운드의 1.1 x 106에서 세번째 라운드의 2.0 x 108로 증가하였다. HSA의 경우, 파지 역가는 첫번째 라운드의 2 x 104에서 세번째 라운드의 1.4 x 109로 증가하였다. KM13 보조 파지 (D2 및 D3 도메인 사이에 프로테아제 분해 부위를 지니는 pⅢ 단백질을 함유함)를 사용하고, 파지를 1 mg/ml의 PBS중 트립신으로 용리시키는 것을 제외하고, 문헌[Griffith et al., (1993)]에 기술된 바와 같이 선택을 수행하였다. 트립신을 첨가하여 보조 파지로부터 유래된 pⅢ 단백질을 분해 (파지미드로부터의 pⅢ 단백질은 분해되지 않음)시키고, c-myc 태그 내에서의 분해에 의해 결합된 scFv-파지 융합체를 용리시킴으로써 (도 2), 기능적 scFv를 발현하는 파지를 추가로 풍부하게 만들고, 백그라운드를 감소시켰다 (Kristensen & Winter, Folding & Design 3: 321-328, Jul 9, 1998). lOOμg/ml의 농도로 HSA 또는 β-gal로 코팅된 면역 튜브를 이용하여 선택을 수행하였다.
결합을 확인하기 위해, 세번째 라운드의 각각의 선택으로부터 24개의 콜로니를 모노클로날 파지 ELISA로 스크리닝하였다. 파지 입자를 문헌[Harrison et al., Methods Enzymol. 1996;267:83-109]에 기술된 바와 같이 생성시켰다. 96-웰 ELISA 플레이트를 4℃에서 밤새 PBS 중 1Oμg/ml의 농도의 lOOμl의 HSA 또는 β-gal로 코팅시켰다. 항-M13-HRP 컨쥬게이트 (conjugate)를 지니는 파지의 검출을 이용하는 표준 ELISA 프로토콜을 따랐다 (Hoogenboom et al., 1991). 클론의 선택은 50μl의 상층액으로 1.0 초과의 ELISA 신호를 생성시켰다.
다음으로, 키아프렙 스핀 미니프렙 키트 (QIAprep Spin Miniprep kit, Qiagen)를 이용하여, HSA에 대해 선택된 VH/더미 Vκ 라이브러리 및 β-gal에 대해 선택된 Vκ/더미 VH 라이브러리로부터 DNA 프렙(prep)을 제조하였다. 대부분의 다양성을 측정하기 위해, DNA 프렙을 세개의 라운드의 선택의 각각으로부터 제조한 후, 항원 각각에 대해 함께 모았다. 이후, DNA 프렙을 37℃에서 밤새 SalⅠ/NotⅠ으로 분해시켰다. 단편들의 젤 정제 후, β-gal에 대해 선택된 Vκ/더미 VH 라이브러리로부터의 Vκ 사슬을 HSA에 대해 선택된 VH/더미 Vκ 라이브러리의 더미 Vκ 사슬의 위치에 라이게이션시켜 3.3 x 109개의 클론의 라이브러리를 발생시켰다.
이후, 이러한 라이브러리를 HSA (첫번째 라운드) 및 β-gal (두번째 라운드)에 대해 선택 (HSA/β-gal 선택)하거나, β-gal (첫번째 라운드) 및 HSA (두번째 라운드)에 대해 선택 (β-gal/HSA 선택)하였다. 상기 기술된 바와 같이 선택을 수행하였다. 각각의 경우에서, 두번째 라운드 후, 48개의 클론을 모노클로날 파지 ELISA (상기 기술된 바와 같음) 및 가용성 scFv 단편의 ELISA에 의해 HSA 및 β-gal에 대한 결합에 대해 시험하였다. 가용성 항체 단편을 문헌[Harrison et al., (1996)]에 기술된 바와 같이 생성시키고, 2% Tween/PBS를 블로킹 완충용액으로 사용하고 결합된 scFv를 단백질 L-HRP로 검출하는 것을 제외한 표준 ELISA 프로토콜을 문헌[Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res., 19: 4133]에 따랐다. HSA/β-gal 선택으로부터의 세개의 클론 (E4, E5 및 E8) 및 β-gal/HSA 선택으로부터의 두개의 클론 (K8 및 K1O)은 둘 모두의 항원에 결합할 수 있다. 이들 클론으로부터의 scFv를 PCR 증폭시키고, 프라이머 LMB3 및 pHENseq을 이용하여 문헌[Ignatovich et al., (1999) J Mol Biol 1999 Nov 26;294(2):457-65]에 기술된 바와 같이 서열분석하였다. 서열 분석은 모든 클론이 동일함을 나타내었다. 따라서, 이중특이적 항체를 엔코딩하는 단지 하나의 클론 (K8)을 추가 실험을 위해 선택하였다 (도 3).
실시예 2. K8 항체의 결합 특성의 특성분석
우선, K8 항체의 결합 특성을 모노클로날 파지 ELISA에 의해 특성분석하였다. 96-웰 플레이트를 4℃에서 밤새 PBS 중에서 lOμg/ml의 농도로 알칼라인 포스파타아제 (APS), 우혈청 알부민 (BSA), 땅콩 아글루티닌, 라이소자임 및 시토크롬 c (교차 반응성을 확인하기 위한 것임)를 지니는 1OOμl의 HSA 및 β-gal로 코팅시켰다. K8 클론으로부터의 파지미드를 문헌[Harrison et al., (1996)]에 기술된 바와 같이 KM13으로 보호시키고, 파지를 함유하는 상층액 (50μl)을 직접 분석하였다. 문헌[Hoogenboom et al., 1991]에 따른 표준 ELISA 프로토콜을 항-M13-HRP 컨쥬게이트를 지닌 결합된 파지의 검출에 이용하였다. 1.0 이상의 흡수 신호로 파지의 표면에 전시되는 경우 이중특이적 K8 항체가 HSA 및 β-gal에 결합되는 것을 발견하였다 (도 4). BSA에 대한 강한 결합이 또한 관찰되었다 (도 4). HSA 및 BSA는 아미노산 수준에서 76% 상동적이므로, K8 항체가 이들 구조적으로 관련된 둘 모두의 단백질을 인식하는 것은 놀라운 것이 아니다. 기타 단백질을 이용하여 교차 반응성이 검출되지 않았다 (도 4).
두번째로, K8 항체의 결합 특성을 가용성 scFv ELISA에서 시험하였다. 가용성 scFv 단편의 생성을 문헌[Harrison et al., (1996)]에 기술된 바와 같이 IPTG에 의해 유도시켰다. K8 scFv의 발현 수준을 결정하기 위해, 가용성 항체 단편을 문헌[Harlow and Lane, Antibodies: a Laboratory Manual, (1988) Cold Spring Harbor]에 기술된 바와 같이 단백질 A-세파로오스 컬럼을 이용하여 50 ml의 유도물질의 상층액으로부터 정제하였다. 이후, OD280을 측정하고, 단백질 농도를 문헌[Sambrook et al., (1989)]에 기술된 바와 같이 계산하였다. K8 scFv를 19mg/l로 상층액에 생성시켰다.
이후, 가용성 scFv ELISA를 공지된 농도의 K8 항체 단편을 이용하여 수행하였다. 96-웰 플레이트를 lOμg/ml의 농도의 lOOμl의 HSA, BSA 및 β-gal과 lμg/ml의 농도의 lOOμl의 단백질 A로 코팅시켰다. 50μl의 K8 scFv의 연속 희석을 적용시키고, 결합된 항체 단편을 단백질 L-HRP로 검출하였다. ELISA 결과는 K8 항체의 이중특이적 특성을 확증하였다 (도 5).
β-gal에 대한 결합이 Vκ 도메인에 의해 결정되고, HSA/BSA에 대한 결합이 K8 scFv 항체의 VH 도메인에 의해 결정되는 것을 확인하기 위해, Vκ 도메인을 SalⅠ/NotⅠ 분해에 의해 K8 scFv으로부터 절단시키고, 더미 VH 사슬을 함유하는 SalⅠ/NotⅠ으로 분해된 pIT2 벡터로 라이게이션시켰다 (도 1 및 2). 생성된 클론 K8Vκ/더미 VH의 결합 특성을 가용성 scFv ELISA에 의해 분석하였다. 가용성 scFv 단편의 생성을 문헌[Harrison et al., (1996)]에 기술된 바와 같이 IPTG에 의해 유도시키고, scFv를 함유하는 상층액 (50μ)을 직접 분석하였다. 가용성 scFv ELISA를 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행하고, 결합된 scFv를 단백질 L-HRP로 검출하였다. ELISA는 상기 클론이 β-gal에 결합될 수 있는 반면, BSA에 대한 결합이 제거되었음을 나타내었다 (도 6).
실시예 3. 항원 A 및 B에 특이적인 단일 VH 도메인 항체 및 항원 C 및 D에 특이적인 단일 Vκ 도메인 항체의 선택.
본 실시예는 상보성 가변 도메인의 부재하에서 항원 A, B, C 및 D로의 결합에 대해 처녀 단일 항체 가변 도메인의 레퍼토리를 선택함으로써, 항원 A 및 B에 특이적인 단일 VH 도메인 항체 및 항원 C 및 D에 특이적인 단일 Vκ 도메인 항체를 제조하는 방법을 기술한다.
결합 클론의 선택 및 특성분석은 기존에 기술된 바와 같이 수행한다 (참조: PCT/GB02/003014의 실시예 5). 4개의 클론을 추가 실험을 위해 선택하였다:
VH1 - 항 A VH
VH2 - 항 B VH
VK1 - 항 C VK
VK2 - 항 D VK
VH 도메인의 조합물 (즉, VH-VH 리간드) 및 VL 도메인의 조합물 (VL-VL 리간드)을 포함하는 이합체 분자를 생성시키기 위해, 상기에 기술된 것과 유사한 방식으로 상기 실시예 1-3에 기술된 방법이 사용될 수 있다.
실시예 4. 이중특이적 ScFv 항체의 생성 및 특성분석 (항원 A 및 B에 특이적인 VH1/VH2 및 항원 C 및 D에 특이적인 VK1/VK2)
본 실시예는 이중특이적 ScFv 벡터 내의 각각의 항원에 대해 선택된 Vκ 및 VH 단일 도메인을 조합시킴으로써 ScFv 항체 (항원 A 및 B에 특이적인 VH1/VH2 및 항원 C 및 D에 특이적인 VK1/VK2)가 생성될 수 있음을 입증한다.
이중특이적 항체 VH1/VH2를 생성시키기 위해, VH1 단일 도메인을 NcoⅠ/XhoⅠ 분해에 의해 가변 도메인 벡터 1 (도 7)로부터 절제하고, NcoⅠ/XhoⅠ 분해된 가변 도메인 벡터 2 (도 7)로 라이게이션시켜, VH1/가변 도메인 벡터 2를 생성시켰다. VH2 단일 도메인을 프라이머를 이용하여 가변 도메인 벡터 1으로부터 PCR 증폭시켜 5' 말단에 SalⅠ 제한 부위를 도입시키고 3' 말단에 NotⅠ 제한 부위를 도입시켰다. 이후, PCR 생성물을 SalⅠ/NotⅠ으로 분해시키고, SalⅠ/NotⅠ으로 분해된 VH1/가변 도메인 벡터 2로 라이게이션시켜, VH1/VH2/가변 도메인 벡터 2를 생성시켰다.
VK1/VK2/가변 도메인 벡터 2를 유사한 방식으로 생성시켰다. 생성된 VH1/VH2 ScFv 및 VK1/VK2 ScFv의 이중특이적 특성을 기존에 기술된 바와 같이 가용성 ScFv ELISA에서 시험하였다 (참조: PCT/GB02/003014의 실시예 6). 경쟁 ELISA를 기존에 기술된 바와 같이 수행하였다 (참조: PCT/GB02/003014의 실시예 8).
가능한 결과:
-VH1/VH2 ScFv는 항원 A 및 B에 동시에 결합할 수 있음
-VK1/VK2 ScFv는 항원 C 및 D에 동시에 결합할 수 있음
-VH1/VH2 ScFv 결합은 경쟁적임 (항원 A에 결합하는 경우, VH1/VH2 ScFv는 항원 B에 결합할 수 없음)
-VK1/VK2 ScFv 결합은 경쟁적임 (항원 C에 결합하는 경우, VK1/VK2 ScFv는 항원 D에 결합할 수 없음)
실시예 5. 이중특이적 VH1/VH2 Fab 및 VK1/VK2 Fab의 작제 및 이들의 결합 특성의 분석.
VH1/VH2 Fab를 생성시키기 위해, VH1 단일 도메인을 NcoⅠ/XhoⅠ 분해된 CH 벡터 (도 8)에 라이게이션시켜 VH1/CH를 생성시키고, VH2 단일 도메인을 SalⅠ/NotⅠ 분해된 CK 벡터 (도 9)에 라이게이션시켜 VH2/CK를 생성시켰다. VH1/CH 및 VH2/CK로부터의 플라스미드 DNA를 기존에 기술된 바와 같이 적격 대장균 세포로 공동 형질전환시키기 위해 사용하였다 (참조: PCT/GB02/003014의 실시예 8).
이후, VH1/CH 및 VH2/CK 플라스미드를 함유하는 클론을 기존에 기술된 바와 같이 IPTG에 의해 유도시켜 가용성 VH1/VH2 Fab를 생성시켰다 (참조: PCT/GB02/003014의 실시예 8).
VK1/VK2 Fab를 유사한 방식으로 생성시켰다.
생성된 Fab의 결합 특성을 기존에 기술된 바와 같이 경쟁 ELISA로 시험하였다 (참조: PCT/GB02/003014의 실시예 8).
가능한 결과:
-VH1/VH2 Fab는 항원 A 및 B에 동시에 결합할 수 있음
-VK1/VK2 Fab는 항원 C 및 d에 동시에 결합할 수 있음
-VH1/VH2 Fab 결합은 경쟁적임 (항원 A에 결합하는 경우, VH1/VH2 Fab는 항원 B에 결합할 수 없음)
-VK1/VK2 Fab 결합은 경쟁적임 (항원 C에 결합하는 경우, VK1/VK2 Fab는 항원 D에 결합할 수 없음)
실시예 6. 킬레이트 dAb 이합체
개요
VH 및 VK 동종이합체를 가요성 폴리펩티드 링커를 이용하여 dAb-링커-dAb 포맷으로 생성시켰다. 벡터를 상이한 길이의 3U:(Gly4Ser)3 (SEQ ID NO:199), 5U:(Gly4Ser)5 (SEQ ID NO:629) 및 7U:(Gly4Ser)7 (SEQ TD NO:630)의 글리신-세린 링커를 함유하는 dAb 링커-dAb 포맷으로 생성시켰다. 이합체 라이브러리를 링커의 가이딩(guiding) dAb 업스트립: TAR1-5 (VK), TAR1-27(VK), TAR2-5(VH) 또는 TAR2-6(VK) 및 링커 뒤의 상응하는 제 2 dAb의 라이브러리를 이용하여 생성시켰다. 이러한 방법을 이용하여, 신규한 이합체 dAb를 선택하였다. 항원 결합에 대한 이합체화의 효과를 ELISA 및 비아코어 연구로 결정하고, 세포 중화 및 수용체 결합 분석에서 결정하였다. TAR1-5 및 TAR1-27 둘 모두의 이합체화는 결합 친화성 및 중화 수준을 현저히 개선시켰다.
1.0 방법
1.1 라이브러리 생성
1.1.1 벡터
pEDA3U, pEDA5U 및 pEDA7U 벡터를 dAb-링커-dAb 포맷과 양립가능한 상이한 길이의 링커를 도입시키기 위해 고안하였다. pEDA3U에 대해, 센스 및 안티센스의 73-염기쌍의 올리고 링커를 0.1M NaCl, 1OmM 트리스-HCl(pH7.4)를 함유하는 완충용액에서 저속 어닐링 프로그램 (95℃-5분, 80℃-10분, 70℃-15분, 56℃-15분, 사용때까지 42℃)을 이용하여 어닐링시키고, XhoⅠ 및 NotⅠ 제한 부위를 이용하여 클로닝시켰다. 링커는 3개의 (Gly4Ser) 유닛을 포함하였고, 스터퍼(stuffer) 영역이 SalⅠ 및 NotⅠ 클로닝 부위 사이에 위치하였다 (도해 1). 단일 dAb가 파지 전시에 의해 선택되는 가능성을 감소시키기 위해, 스터퍼 영역을 3개의 정지 코돈, SacⅠ 제한 부위 및 제 2 dAb가 존재하지 않는 경우 프레임 외부의 영역을 배치시키기 위한 프레임 시프트 돌연변이를 포함하도록 고안하였다. pEDA5U 및 7U에 대해, 링커의 길이로 인해, 중첩된 올리고-링커가 각각의 벡터에 대해 고안되고, 클레노우(Klenow)를 이용하여 어닐링시키고, 신장시키는 것이 요구된다. 이후, 상기 단편을 정제시키고, XhoⅠ 및 NotⅠ 제한 부위를 이용하는 클로닝 전에 적절한 효소를 이용하여 분해시켰다.
Figure 112007034140104-PCT00001
도해 1
1. 1.2 라이브러리 제조
가이딩 dAb에 상응하는 N-말단 V 유전자를 NcoⅠ 및 XhoⅠ 제한 부위를 이용하여 링커의 업스트림에 클로닝시켰다. VH 유전자는 양립가능한 부위가 존재하지만, 클로닝 VK 유전자는 적절한 제한 부위의 도입을 필요로 한다. 이는 2:1 혼합물의 수퍼택 (SuperTaq, HTBiotechnology Ltd) 및 pfu 터보 (pfu turbo, Stratagene)를 이용하는 30주기의 PCR 증폭에서, 변형된 PCR 프라이머 (VK-DLIBF: 5' cggccatggcgtcaacggacat (SEQ ID NO:377); VKXholR: 5' atgtgcgctcgagcgtttgattt 3' (SEQ ID NO:378))를 이용함으로써 달성하였다. 이는 5' 말단에 NcoⅠ 부위를 유지시키는 반면, 인접한 SalⅠ 부위를 파괴하고, 3' 말단에 XhoⅠ 부위를 도입시켰다. 5개의 가이딩 dAb인 TAR1-5 (VK), TAR1-27(VK), TAR2-5(VH), TAR2-6(VK) 및 TAR2-7(VK)를 3개의 이합체 벡터 각각에 클로닝시켰다. 모든 작제물을 서열 분석에 의해 확인하였다.
상기의 각각의 벡터 (pEDA3U, 5U 및 7U) 내의 링커의 업스트림에 가이딩 dAb TAR1-5 (VK), TAR1-27(VK), TAR2-5(VH) 또는 TAR2-6(VK)를 클로닝시키고, 상응하는 제 2 dAb의 라이브러리를 링커 뒤에 클로닝시켰다. 이를 달성하기 위해, TAR1-5 또는 TAR1-27이 가이딩 dAb인 경우 인간 TNFα에 대한 VK 라이브러리 (라운드 1 후 약 1 x 106의 다양성), 또는 TAR2-5 또는 TAR2-6 각각이 가이딩 dAb인 경우 인간 p55 TNF 수용체에 대한 VH 또는 VK 라이브러리 (둘 모두 라운드 1 후 약 1 x 105의 다양성)의 라운드 1 선택으로부터 회수된 파지로부터 상보적 dAb 라이브러리를 PCR 증폭시켰다. VK 라이브러리에 대해, 2:1 혼합물의 수퍼택 및 pfu 터보를 이용하는 30주기의 PCR 증폭으로 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 수행하였다. 상기 유전자의 5' 말단에 SalⅠ 제한 부위를 도입시키기 위한 프라이머를 이용하여 VH 라이브러리를 PCR 증폭시켰다. dAb 라이브러리 PCR 산물을 적절한 제한 효소로 분해시키고, SalⅠ/NotⅠ 제한 부위를 이용하여 상응하는 벡터의 링커의 다운스트림에 라이게이션시키고, 새로이 제작된 적격 TG1 세포에 전기천공시켰다.
각각의 라이브러리에 대해 수득된 역가는 하기와 같다:
TAR1-5: pEDA3U = 4 x 1O8, pEDA5U = 8 x 1O7, pEDA7U = 1 x 1O8
TAR1-27: pEDA3U = 6.2 x 1O8, pEDA5U = 1 x 1O8, pEDA7U = 1 x 1O9
TAR2h-5: pEDA3U = 4 x 1O7, pEDA5U = 2 x 108, pEDA7U = 8 x 1O7
TAR2h-6: pEDA3U = 7.4 x 1O8, pEDA5U = 1.2 x 108, pEDA7U = 2.2 x 1O8
1.2 선택
1.2.1 TNFα
면역튜브에 피동적으로 코팅된 인간 TNFα를 이용하여 선택을 수행하였다. 간단히, 면역튜브를 1-4ml의 요망되는 항원으로 밤새 코팅하였다. 이후, 면역튜브를 PBS로 3회 세척하고, 1-2시간 동안 2%의 PBS중 분유로 블로킹시키고, PBS로 3회 추가로 세척하였다. 파지 용액을 2%의 PBS중 분유로 희석시키고, 2시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 이후, 튜브를 PBS로 세척하고, 파지를 1mg/ml의 트립신-PBS로 용리시켰다. TAR1-5 이합체 라이브러리에 대해 3개의 선택 방법으로 연구하였다. 첫번째 라운드 선택을 lμg/ml 또는 20μg/ml에서 코팅된 인간 TNFα를 이용하여 면역튜브에서 수행하고, PBS 0.1% Tween에서 20회 세척하였다. TG1 세포를 용리된 파지로 감염시키고, 역가를 결정하였다 (참조: Marks et al J Mol Biol. 1991 Dec 5;222(3):581-97, Richmann et al Biochemistry. 1993 Aug 31;32(34):8848-55).
회수된 역가는 하기와 같았다:
pEDA3U = 2.8 x 107 (1μg/ml TNF), 1.5 x 1O8 (20μg/ml TNF),
pEDA5U = 1.8 x 107 (1μg/ml TNF), 1.6 x 108 (20μg/ml TNF),
pEDA7U = 8 x 106 (1μg/ml TNF), 7 x 107 (20μg/ml TNF).
두번째 라운드 선택을 3개의 상이한 방법을 이용하여 수행하였다.
1. 면역튜브에서, 밤새의 배양물로 20회 세척 후, 10회 추가 세척.
2. 면역튜브에서, 20회 세척후, (lμg/ml TNFα)을 지닌 세척 완충용액 중에서 실온에서 1시간 인큐베이션 후, 10회 추가 세척.
3. 33 pmole의 비오티닐화된 인간 TNFα를 이용하는 스트렙타비딘 비드에서의 선택 (Henderikx et al., 2002, Selection of antibodies against biotinylated antigens. Antibody Phage Display : Methods and protocols, Ed. O'Brien and Atkin, Humana Press). 라운드 2 선택으로부터의 단일 클론을 채집하여 96 웰 플레이트로 넣고, 미정제 상층액 프렙을 2ml의 96웰 플레이트 포맷으로 제작하였다.
표 1.
Figure 112007034140104-PCT00002
TAR1-27에 대해, 선택을 하기의 변형을 지니는 기존에 기술된 방법으로 수행하였다. 첫번째 라운드 선택을 1μg/ml 또는 2Oμg/ml에서 코팅된 인간 TNFα를 이용하여 면역튜브에서 수행하고, PBS 0.1%Tween으로 20회 세척하였다. 두번째 라운드 선택을 밤새의 배양물로 20회 세척하여 면역튜브에서 수행한 후, 추가로 20회 세척하였다. 라운드 2 선택으로부터의 단일 클론을 채집하여 96웰 플레이트에 넣고, 미정제 상층액 프렙을 2ml의 96웰 플레이트 포맷으로 제조하였다.
TAR1-27 역가는 하기와 같다:
표 2.
Figure 112007034140104-PCT00003
1.2.2 TNF 수용체 1 (p55 수용체;TAR2)
TAR2h-5 라이브러리만에 대해 기존에 기술된 바와 같이 선택을 수행하였다. 3 라운드의 선택을 1 μg/ml의 인간 p55 TNF 수용체 또는 lOμg/ml의 인간 p55 TNF 수용체를 이용하여 면역튜브에서 수행하고, 밤새 배양물을 지닌 PBS 0.1% Tween에서 20회 세척하고, 20회 추가로 세척하였다. 라운드 2 및 3 선택으로부터 단일 클론을 채집하여 96웰 플레이트에 넣고, 미정제 상층액 프렙을 2ml의 96웰 플레이트 포맷으로 제조하였다.
TAR2h-5 역가는 하기와 같다:
표 3.
Figure 112007034140104-PCT00004
1.3 스크리닝
라운드 2 또는 3 선택으로부터의 단일 클론을 적절한 경우 상이한 선택 방법으로 3U, 5U 및 7U 라이브러리로 각각으로부터 채집하였다. 클론을 37℃에서 밤새 1OOμg/ml의 앰피실린 및 1% 글루코오스를 지닌 2xTY에서 성장시켰다. 이러한 배양물의 1/100 희석액을 2ml의 96웰 플레이트 포맷으로 1OOμg/ml의 앰피실린 및 0.1%의 글루코오스를 지닌 2ml의 2xTY로 접종시키고, OD600이 약 0.9가 될때까지 37℃에서 진탕시켜 성장시켰다. 이후, 30℃에서 밤새 1mM의 IPTG로 배양을 유도시켰다. 상층액을 소발(sorval) 플레이트 원심분리기에서 15분 동안 40O0rpm으로 원심분리하여 투명하게 만들었다. 상층액 프렙을 최초 스크리닝에 사용하였다.
1.3.1 ELISA
단백질 A/L ELISA 또는 항원 ELISA에 의해 이합체 재조합 단백질의 결합 활성을 단량체와 비교하였다. 간단히, 96웰 플레이트를 4℃에서 밤새 항원 또는 단백질 A/L로 코팅시켰다. 플레이트를 0.05% Tween-PBS로 세척하고, 2% Tween-PBS로 2시간 동안 블로킹시켰다. 샘플을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션된 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 세척하고, 실온에서 1시간 동안 제 2 시약으로 인큐베이션시켰다. 플레이트를 세척하고, TMB 기질을 이용하여 발달시켰다. 단백질 A/L-HRP 또는 India-HRP를 제 2 시약으로 사용하였다. 항원 ELISA에 대해, 사용된 항원 농도는 인간 TNFα 및 인간 THF 수용체 1에 대해 PBS 중 1 μg/ml이었다. 가이딩 dAb의 존재로 인해, 대부분의 경우 이합체는 포지티프 ELISA 신호를 발생시켰고, 따라서 분리 속도(off rate) 결정을 비아코어로 시험하였다.
1.3.2 비아코어 (BIAcore)
TAR1-5 및 TAR2h-5 클론에 대해 비아코어 분석을 수행하였다. 스크리닝을 위해, 인간 TNFα를 높은 밀도 (약 10000 RU)로 CM5 칩에 커플링시켰다. 50μl의 인간 TNFα (50μg/ml)를 아세테이트 완충용액 (pH 5.5)에서 5μl/분으로 칩에 커플링시켰다. 표준 방법을 이용하는 분석후 칩의 재생은 인간 TNFα의 불안정성으로 인해 가능하지 않아서, 각각의 샘플이 분석된 후 칩을 완충용액으로 10분 동안 세척하였다. TAR1-5에 대해, 라운드 2 선택으로부터의 클론 상층액을 비아코어로 스크리닝하였다. 48개의 클론을 하기의 선택 방법을 이용하여 수득된 3U, 5U 및 7U 라이브러리 각각으로부터 스크리닝하였다:
R1: 1μg/ml 인간 TNFα 면역튜브, R2: 1μg/ml 인간 TNFα 면역튜브, 밤새 세척.
R1: 20μg/ml 인간 TNFα 면역튜브, R2: 20㎍/ml 인간 TNFα 면역튜브, 밤새 세척.
R1: lμg/ml 인간 TNFα 면역튜브, R2: 33 pmole의 비드 상에 비오티닐화된 인간 TNFα.
R1 : 20μg/ml 인간 TNFα 면역튜브, R2: 33 pmole의 비드 상에 비오티닐화된 인간 TNFα.
스크리닝을 위해, 인간 p55 TNF 수용체를 고밀도 (약 4000 RU)로 CM5 칩에 커플링시켰다. 100μl의 인간 p55 TNF 수용체 (10 μg/ml)를 아세테이트 완충용액 (pH5.5)에서 5μl/분으로 칩에 커플링시켰다. 표준 재생 조건을 시험하였으나 (글리신 pH2 또는 pH3), 각각의 경우 항원이 칩의 표면으로부터 TNFα와 같이 제거되므로, 각각의 샘플이 분석된 후 칩을 완충용액으로 10분 동안 세척하였다. TAR2-5에 대해, 라운드 2 선택으로부터의 클론 상층액을 스크리닝하였다. 하기의 선택 방법을 이용하여 3U, 5U 및 7U 라이브러리 각각으로부터 48개의 클론을 스크리닝하였다:
R1: lμg/ml 인간 p55 TNF 수용체 면역튜브, R2: 1μg/ml 인간 p55 TNF 수용체 면역튜브, 밤새 세척.
R1: lOμg/ml 인간 p55 TNF 수용체 면역튜브, R2: 1Oμg/ml 인간 p55 TNF 수용체 면역튜브, 밤새 세척.
1.3.3 수용체 및 세포 분석
수용체 분석에서의 중화시키는 이합체의 능력을 하기와 같이 수행하였다:
수용체 결합
항-TNF dAb를 재조합 TNF 수용체 1 (p55)에 대한 TNF의 결합을 억제하는 능력에 대해 시험하였다. 간단히, 맥시소프(Maxisorp) 플레이트를 30mg/ml의 항-인간 Fc 마우스 모노클로날 항체 (Zymed, San Francisco, USA)로 밤새 인큐베이션시켰다. 웰을 0.05% Tween-20을 함유하는 인산염 완충 식염수 (PBS)로 세척하고, 1%의 PBS중 BSA로 블로킹시키고, 100ng/ml의 TNF 수용체 1 Fc 융합 단백질 (R&D Systems, Minneapolis, USA)로 인큐베이션시켰다. 항-TNF dAb를 10ng/ml의 최종 농도로 세척된 웰에 첨가되는 TNF와 혼합시켰다. TNF 결합을 0.2mg/ml의 비오티닐화된 항-TNF 항체 (HyCult biotechnology, Uben, Netherlands), 이후 스트렙타비딘으로 라벨링된 1/500 희석의 호스라디쉬 과산화효소 (Amersham Biosciences, UK)으로 검출한 후, TMB 기질 (KPL, Gaithersburg, USA)과 함께 인큐베이션시켰다. 상기 반응을 HCl을 첨가하여 정지시키고, 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 항-TNF dAb 활성은 TNF 결합을 감소시켰고, 따라서 TNF 단독 대조군에 비해 흡광도가 감소하였다.
L929 세포독성 분석
항-TNF dAb를 또한 마우스 L929 섬유모세포에서 TNF의 세포독성 활성을 중화시키는 능력에 대해 시험하였다 (Evans, T. (2000) Molecular Biotechnology 15, 243-248). 간단히, 미세역가 플레이트에 플레이팅된 L929 세포를 항-TNF dAb, 100pg/ml의 TNF 및 1mg/ml의 액티노마이신 D (Sigma, Poole, UK)과 함께 밤새 인큐베이션시켰다. [3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸리움 (Promega, Madison, USA)과의 인큐베이션 후, 세포 생존률을 490nm에서 흡광도를 판독하여 측정하였다. 항-TNF dAb 활성은 TNF 세포독성을 감소시켰고, 따라서 TNF 단독 대조군에 비해 흡광도를 증가시켰다.
최초 스크리닝에서, 상기 기술된 비아코어 분석으로부터 제조된 상층액을 또한 수용체 분석에 사용하였다. 선택된 이합체의 추가 분석을 또한 정제된 단백질을 이용하는 수용체 및 세포 분석으로 수행하였다.
HeLa IL-8 분석
항-TNFR1 또는 항-TNF 알파 dAb를 HeLa 세포에서 TNF에 의한 IL-8 분비 유도를 중화시키는 능력에 대해 시험하였다 (HUVEC에서 IL-1에 의한 IL-8의 유도를 기술하는 문헌[Akeson, L. et al (1996) Journal of Biological Chemistry 271, 30517-30523]의 방법으로부터 적합화된 방법; 본 발명자들은 인간 TNF 알파에 의한 유도를 주목하였고, HUVEC 세포주 대신 HeLa 세포를 사용하였다). 간단히, 미세역가 플레이트에 플레이팅된 HeLa 세포를 dAb 및 300pg/ml의 TNF와 함께 밤새 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 상층액을 세포로부터 흡출시켜 제거하고, 샌드위치 ELISA (R&D Systems)를 통해 IL-8 농도를 측정하였다. 항-TNFR1 dAb 활성은 TNF 단독 대조군에 비해 상층액으로의 IL-8 분비를 감소시켰다.
L929 분석을 하기 실험을 통해 수행하였으나; 항-TNF 수용체 1 (p55) 리간드를 측정하기 위해 HeLa IL-8 분석의 사용이 바람직하고; L929 분석에서의 마우스 p55의 존재는 이의 용도에서 특정한 제한을 지닌다.
1.4 서열 분석
비아코어 및 수용체 분석 스크리닝에서 흥미로운 특성을 지니는 것으로 증명된 이합체를 서열분석하였다. 서열은 서열 목록에 상세히 제시되어 있다.
1.5 포맷화
1.5.1 TAR1-5-19 이합체
우수한 중화 특성을 지니는 것으로 나타난 TAR1-5 이합체를 다시 포맷화시키고, 세포 및 수용체 분석에서 분석하였다. TAR1-5 가이딩 dAb를 친화성 성숙된 클론 TAR1-5-19으로 치환시켰다. 이를 달성하기 위해, TAR1-5를 개별적 이합체쌍을 클로닝 아웃 (cloning out)시키고, PCR에 의해 증폭된 TAR1-5-19로 치환시켰다. 또한, TAR1-5-19 동종이합체를 또한 3U, 5U 및 TU 벡터에서 작제하였다. 상기 유전자의 N 말단 카피를 PCR로 증폭시키고, 상기 기술된 바와 같이 클로닝시키고, C-말단 유전자 단편을 존재하는 SalⅠ 및 NotⅠ 제한 부위를 이용하여 클로닝시켰다.
1.5.2 돌연변이 유발
앰버(amber) 정지 코돈이 dAb에 존재하고, TAR1-5 이합체쌍 내의 C-말단 dAb중 하나를 부위 특이적 돌연변이 유발에 의해 글루타민으로 돌연변이시켰다.
1.5.3 Fab
TAR1-5 또는 TAR1-5-19를 함유하는 이합체를 Fab 발현 벡터로 다시 포맷화시켰다. dAb를 SfiⅠ 및 NotⅠ 제한 부위를 이용하여 CK 또는 CH 유전자를 함유하는 발현 벡터로 클로닝시키고, 서열 분석으로 확인하였다. CK 벡터를 pUC 기재 앰피실린 내성 벡터로부터 유도시키고, CH 벡터를 pACYC 클로람페니콜 내성 벡터로부터 유도시켰다. Fab 발현에 대해, dAb-CH 및 dAb-CK 작제물을 HB2151 세포로 공동 형질전환시키고, 0.1%의 글루코오스, lOOμg/ml의 앰피실린 및 10μg/ml의 클로람페니콜을 함유하는 2xTY에서 성장시켰다.
1.5.3 힌지 이합체화
시스테인 결합 형성을 통한 dAb의 이합체화를 시험하였다. 인간 IgGC1 힌지의 변형된 형태인 짧은 서열의 아미노산 EPKSGDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:379)를 dAb의 C 말단 영역에서 고안하였다. 기존에 기술된 바와 같이, 이러한 서열을 엔코딩하는 올리고 링커를 합성하고, 어닐링시켰다. 링커를 XhoⅠ 및 NotⅠ 제한 부위를 이용하여 TAR1-5-19를 함유하는 pEDA 벡터로 클로닝시켰다. 이합체화는 원형질막 공간에서 제자리에서 발생한다.
1.6 발현 및 정제
1.6.1 발현
기존에 기술된 바와 같이 최초 스크리닝을 위해 2ml의 96-웰 포맷으로 상층액을 제조하였다. 최초 스크리닝 과정 후, 선택된 이합체를 추가로 분석하였다. 이합체 작제물을 상층액으로서 TOP1OF' 또는 HB2151 세포에서 발현시켰다. 간단히, 새로이 스트리킹된 플레이트로부터의 개별적 콜로니를 1OOμg/ml의 앰피실린 및 1%의 글루코오스를 지니는 2xTY에서 37℃에서 밤새 성장시켰다. 이러한 배양물의 1/100 희석액을 1OOμg/ml의 앰피실린 및 0.1%의 글루코오스를 지니는 2xTY로 접종시키고, OD600이 약 0.9가 될때까지 37℃에서 진탕시켜 성장시켰다. 이후, 30℃에서 밤새 1mM의 IPTG로 배양을 유도시켰다. 원심분리에 의해 세포를 제거하고, 단백질 A 또는 L 아가로오스로 상층액을 정제시켰다.
Fab 및 시스테인 힌지 이합체를 HB2152 세포에서 원형질막 공간 단백질로 발현시켰다. 밤새의 배양물의 1/100 희석액을 0.1%의 글루코오스 및 적절한 항생제를 지니는 2xTY로 접종시키고, OD600이 약 0.9가 될때까지 30℃에서 진탕시켜 성장시켰다. 이후, 25℃에서 3-4시간 동안 1mM IPTG로 배양을 유도시켰다. 세포를 원심분리로 수거하고, 펠렛을 원형질막 공간 제조 완충용액 (3OmM 트리스-HCl pH8.0, 1mM EDTA, 20% 수크로오스)에 재현탁시켰다. 원심분리 후, 상층액을 유지시키고, 펠렛을 5mM의 MgSO4에 재현탁시켰다. 상층액을 원심분리로 다시 수거하고, 풀링시키고, 정제시켰다.
1.6.2 단백질 A/L 정제
단백질 L 아가로오스 (Affitech, Norway) 또는 단백질 A 아가로오스 (Sigma, UK)로부터의 이합체 단백질의 정제의 최적화를 시험하였다. 단백질을 배치(batch) 또는 연동 펌프를 이용하는 컬럼 용리에 의해 용리시켰다. 세개의 완충용액 0.1M 포스페이트-시트레이트 완충용액 (pH2.6), 0.2M 글리신 (pH2.5) 및 0.1M 글리신 (pH2.5)으로 시험하였다. 10 컬럼 부피를 초과하는 0.1M 글리신 (pH2.5)을 이용하는 연동 펌프 조건 하에서 최적 조건을 결정하였다. 단백질 A로부터의 정제를 0.1M 글리신 (pH2.5)을 이용하는 연동 펌프 조건으로 수행하였다.
1.6.3 FPLC 정제
AKTA 익스플로러 (Explorer) 100 시스템 (Amersham Biosciences Ltd)에서의 FPLC 분석으로 추가 정제를 수행하였다. TAR1-5 및 TAR1-5-19 이합체를 5OmM 아세테이트 완충용액중 0-1M NaCl (pH4) 구배로 용리된 양이온 교환 크로마토그래피 (1ml Resource S-Amersham Biosciences Ltd)로 분획화시켰다. 힌지 이합체를 25mM 트리스 HCl 중의 0-1M NaCl(pH8.0) 구배로 용리된 이온 교환 (1ml Resource Q Amersham Biosciences Ltd)으로 정제시켰다. Fab를 0.05% tween을 지닌 PBS 중에서 0.5ml/분의 유속에서 진행되는 수퍼로오스(superose) 12 (Amersham Biosciences Ltd) 컬럼을 이용하는 크기 배제 크로마토그래피로 정제하였다. 정제후, 샘플을 비바스핀 (vivaspin) 5K 컷오프 농축기 (Vivascience Ltd)를 이용하여 농축시켰다.
2.0 결과
2.1 TAR1-5 이합체
6 x 96 클론을 모든 라이브러리 및 선택 조건을 포함하는 라운드 2 선택으로부터 채집하였다. 상층액 프렙을 제조하고, 항원 및 단백질 L ELISA 및 비아코어로 분석하고, 수용체 분석에서 분석하였다. ELISA에서, 포지티브 결합 클론을 각각의 선택 방법으로부터 확인하고, 3U, 5U 및 7U 라이브러리 사이로 분배시켰다. 그러나, 가이딩 dAb가 항상 존재하여, 상기 방법에 의해 높은 친화성 및 낮은 친화성 사이를 구별하는 것이 불가능하므로, 비아코어 분석을 수행하였다.
2ml의 상층액을 이용하여 비아코어 분석을 수행하였다. 비아코어 분석은 이합체의 Koff 속도가 단일 TAR1-5에 비해 매우 개선되었음을 나타내었다. 단량체 Koff 속도는 10-3 내지 10-4M의 범위인 이합체 Koff 속도에 비해 10-1M의 범위로 존재하였다. 매우 느린 분리 속도를 지니는 듯한 16개의 클론을 선택하였고, 이들은 3U, 5U 및 7U 라이브러리로부터 유래하였고, 서열분석하였다. 또한, 상층액을 수용체 분석에서 인간 TNFα를 중화시키는 능력에 대해 분석하였다.
상기 분석에서 중화된 6개의 선도 클론 (하기의 d1-d6)을 서열분석하였다. 결과는 수득된 6개 클론에서 단지 3개의 상이한 제 2 dAb (dAb1, dAb2 및 dAb3)가 존재하였으나, 제 2 dAb가 하나 이상으로 발견되는 경우 이들은 상이한 길이의 링커로 연결되는 것을 나타내었다.
TAR1-5d1: 3U 링커 2nd dAb=dAb1 - 1μg/ml Ag 면역튜브 밤새 세척
TAR1-5d2: 3U 링커 2nd dAb=dAb2 - 1μg/ml Ag 면역튜브 밤새 세척
TAR1-5d3: 5U 링커 2nd dAb=dAb2 - 1μg/ml Ag 면역튜브 밤새 세척
TAR1-5d4: 5U 링커 2nd dAb=dAb3 - 20μg/ml Ag 면역튜브 밤새 세척
TAR1-5d5: 5U 링커 2nd dAb=dAb1 - 20μg/ml Ag 면역튜브 밤새 세척
TAR1-5d6: 7U 링커 2nd dAb=dAb1 - R1: 1μg/ml Ag 면역튜브 밤새 세척, R2:비드.
6개의 선도 클론을 추가로 시험하였다. 단백질을 원형질막 공간 및 상층액으로부터 생성시키고, 단백질 L 아가로오스로 정제시키고, 세포 및 수용체 분석으로 시험하였다. 중화 수준은 다양하였다 (표 1). 단백질 제조를 위한 최적 조건을 결정하였다. 상층액으로서 HB2151 세포로부터 생성되는 단백질을 가장 높은 수율로 생성시켰다 (약 10㎎/L의 배양물). 상층액을 실온에서 2시간 또는 4℃에서 밤새 단백질 L 아가로오스과 인큐베이션시켰다. 비드를 PBS/NaCl로 세척하고, 연동 펌프를 이용하여 FPLC 컬럼에 패킹시켰다. 비드를 10 컬럼 부피의 PBS/NaCl로 세척하고, 0.1M 글리신 (pH2.5)으로 용리시켰다. 일반적으로, 이합체 단백질을 단량체 후에 용리시켰다.
TAR1-5d1-6 이합체를 FPLC로 정제시켰다. FPLC 정제로 세개의 종을 수득하고, SDS PAGE로 확인하였다. 하나의 종은 단량체에 해당하고, 나머지 두 종은 상이한 크기의 이합체에 해당하였다. C 말단 태그의 존재로 인해 두개의 종중 보다 큰 것이 가능하다. 이들 단백질을 수용체 분석에서 시험하였다. 표 1에 제시된 데이터는 두개의 이합체 종으로부터 수득된 최적 결과를 나타낸다 (도 11).
상기 이합체 쌍으로부터의 세개의 제 2 dAb (즉, dAb1, dAb2 및 dAb3)을 단량체로서 클로닝하고, ELISA로 시험하고, 세포 및 수용체 분석으로 시험하였다. 모든 세개의 dAb는 항원 ELISA에 의해 TNF에 특이적으로 결합하고, 플라스틱 또는 BSA와 교차 반응하지 않는다. 단량체로서, dAb중 어느 것도 세포 또는 수용체 분석에서 중화시키지 않았다.
2.1.2 TAR1-5-19 이합체
6개의 선도 클론에서 TAR1-5를 TAR1-5-19로 치환시켰다. 세포 및 수용체 분석에서의 모든 TAR1-5-19 이합체의 분석을 달리 언급되지 않는 경우 전체 단백질 (단백질 L에 의해서만 정제)을 이용하여 수행하였다 (표 2). TAR1-5-19d4 및 TAR1-5-19d3는 세포 분석에서 최고의 ND50 (~5nM)을 지니고, 이는 수용체 분석 결과와 일치하고, TAR1-5-19 단량체 (ND50~30nM)에 비해 개선된 것이다. 정제된 TAR1-5 이합체가 수용체 및 세포 분석에서 다양한 결과를 발생시켰으나, TAR1-5- 19 이합체가 보다 일정하였다. 단백질 정제 동안 다양한 용리 완충용액을 이용하는 경우 다양성이 관찰되었다. 0.1M 포스페이트-시트레이트 완충용액 (pH2.6) 또는 0.2M 글리신 (pH2.5)을 이용하는 용리로 대부분의 경우 단백질 L 아가로오스로부터 모든 단백질이 제거되었으나, 이를 덜 기능적으로 만들었다.
TAR1-5-19d4를 발효기에서 발현시키고, 양이온 교환 FPLC에서 정제하여, 완전하게 순수한 이합체를 생성시켰다. TAR1-5d4와 같이 FPLC 정제에 의해 단량체 및 두개의 이합체 종에 해당하는 세개의 종을 수득하였다. 이러한 이합체를 아미노산 서열분석하였다. 이후, TAR1-5-19 단량체 및 TAR1-5-19d4를 수용체 분석에서 시험하고, 단량체에 대해 생성된 IC50은 3OnM이었고, 이합체에 대해서는 8nM이었다. TAR1-5-19 단량체, TAR1-5-19d4 및 TAR1-5d4를 비교하는 수용체 분석의 결과를 도 10에 도시하였다.
TAR1-5-19 동종이합체를 3U, 5U 및 7U 벡터에서 제조하고, 발현시키고, 단백질 L에서 정제시켰다. 단백질을 세포 및 수용체 분석에서 시험하고, 생성되는 IC50 (수용체 분석) 및 ND50 (세포 분석)을 결정하였다 (표 3, 도 12).
2.2 Fab
TAR1-5 및 TAR1-5-19 이합체를 또한 Fab 포맷으로 클로닝시키고, 발현시키고, 단백질 L 아가로오스에서 정제시켰다. Fab를 수용체 분석에서 평가하였다 (표 4). 결과는 TAR1-5-19 및 TAR1-5 이합체 둘 모두에 대해 중화 수준이 이들이 유래되는 본래의 Gly4Ser 링커 이합체와 유사함을 나타내었다. TAR1-5-19가 CH 및 CK 둘 모두에서 전시되는 경우 이를 발현시키고, 단백질 L 정제시키고, 수용체 분석에서 평가하였다. 생성된 IC50은 약 1nM이었다.
2.3 TAR1-27 이합체
3 x 96 클론을 모든 라이브러리 및 선택 조건을 포함하는 라운드 2 선택으로부터 채집하였다. ELISA 분석 및 생물학적 검정을 위해 2ml의 상층액 프렙을 제조하였다. 항원 ELISA는 71개의 포지티브 클론을 생성시켰다. 미정제 상층액의 수용체 분석은 억제 특성 (TNF 결합 0-60%)을 지니는 42개의 클론을 생성시켰다. 대부분의 경우, 억제 특성은 강한 ELISA 신호와 관련된다. 42개의 클론을 서열분석하였고, 이들중 39개는 유일무이한 제 2 dAb 서열을 지녔다. 최고의 억제 특성을 생성시키는 12개의 이합체를 추가로 분석하였다.
12개의 중화 클론을 200ml의 상층액 프렙으로 발현시키고, 단백질 L에서 정제시켰다. 이들을 단백질 L 및 항원 ELISA, 비아코어 및 수용체 분석에 의해 평가하였다. 강한 포지티프 ELISA 신호가 모든 경우에 수득되었다. 비아코어 분석은 모든 클론이 신속한 결합 및 분리 속도를 지니는 것을 나타내었다. 분리 속도는 단일 TAR1-27에 비해 개선되었으나, TAR1-27 이합체의 분리 속도는 기존에 시험된 TAR1-5 이합체 (Koff가 약 10-3 - 10-4M의 범위임) 보다 더욱 신속하였다 (Koff가 약 10-1 내지 10-2M의 범위임). 정제된 이합체의 안정성이 문제시되었고, 따라서 안정성을 개선시키기 위해, 2개의 TAR1-27 이합체 (d2 및 d16)의 정제에서 5%의 글리세롤, 0.5%의 트리톤 XlOO 또는 0.5%의 NP40 (Sigma)을 첨가하였다. NP40 또는 트리톤 X100™의 첨가는 정제된 생성물의 수율을 약 2배 개선시켰다. 둘 모두의 이합체를 수용체 분석에서 평가하였다. TAR1-27d2는 모든 정제 조건하에서 ~30nM의 IC50을 생성시켰다. TAR1-27d16은 안정화제의 사용 없이 정제되는 경우 중화 효과를 나타내지 않았으나, 안정화 조건하에서 정제되는 경우 ~50nM의 IC50을 생성시켰다. 추가 분석을 수행하지 않았다.
2.4 TAR2-5 이합체
3 x 96 클론을 모든 라이브러리 및 선택 조건을 포함하는 두번째 라운드 선택으로부터 채집하였다. 분석을 위해 2ml의 상층액 프렙을 제조하였다. 단백질 A 및 항원 ELISA를 각각의 플레이트에 대해 수행하였다. 비아코어에 의해 우수한 분리 속도 (10-2 - 10-3M의 Koff 범위)를 지니는 30개의 관심 클론을 확인하였다. 상기 클론을 서열분석하고, 서열 분석에 의해 13개의 유일무이한 이합체를 확인하였다.
표 4: TAR1-5 이합체.
이합체 세포 유형 정제 단백질 분획 용리 조건 수용체/세포 분석
TAR1-5d1 HB2151 단백질 L + FPLC 작은 이합체 종 0.1M 글리신 pH2.5 RA~30nM
TAR1-5d2 HB2151 단백질 L + FPLC 작은 이합체 종 0.1M 글리신 pH2.5 RA~50nM
TAR1-5d3 HB2151 단백질 L + FPLC 큰 이합체 종 0.1M 글리신 pH2.5 RA~300nM
TAR1-5d4 HB2151 단백질 L + FPLC 작은 이합체 종 0.1M 글리신 pH2.5 RA~3nM
TAR1-5d5 HB2151 단백질 L + FPLC 큰 이합체 종 0.1M 글리신 pH2.5 RA~200nM
TAR1-5d6 HB2151 단백질 L + FPLC 큰 이합체 종 0.1M 글리신 pH2.5 RA~100nM
* 주: 이합체 2 및 이합체 3은 동일한 제 2 dAb (dAb2라 언급됨)을 지니지만, 상이한 링커 길이를 지닌다 (d2 = (Gly4Ser)3, d3 = (Gly4Ser)3). dAb1은 이합체 1, 5 및 6에 대한 파트너 dAb이다. dAb3은 이합체 4에 대한 파트너 dAb이다. 모든 파트너 dAb는 단독으로 중화시키지 않는다. FPLC 정제는 달리 언급되지 않는 경우 양이온 교환에 의해 수행된다. FPLC에 의해 수득된 각각의 이합체에 대한 최적 이합체 종은 상기 분석으로 결정되었다.
표 5: TAR1-5-19 이합체
이합체 세포 유형 정제 단백질 분획 용리 조건 수용체/세포 분석
TAR1-5-19 d1 TOP10F' 단백질 L 전체 단백질 0.1M 글리신 pH 2.0 RA~15nM
TAR1-5-19 d2 (정지 코돈이 없음) TOP10F' 단백질 L 전체 단백질 0.1M 글리신 pH 2.0 + 0.05% NP40 RA~2nM
TAR1-5-19 d3 (정지 코돈이 없음) TOP10F' 단백질 L 전체 단백질 0.1M 글리신 pH 2.5 + 0.05% NP40 RA~8nM
TAR1-5-19 d4 TOP10F' 단백질 L + FPLC FPLC 정제된 분획 0.1M 글리신 pH 2.0 RA~2-5nM CA~12nM
TAR1-5-19 d5 TOP10F' 단백질 L 전체 단백질 0.1M 글리신 pH 2.0 + NP40 RA~8nM CA~10nM
TAR1-5-19 d6 TOP10F' 단백질 L 전체 단백질 0.1M 글리신 pH 2.0 RA~10nM
표 6: TAR1-5-19 동종이합체
이합체 세포 유형 정제 단백질 분획 용리 조건 수용체/세포 분석
TAR1-5-19 3U 동종이합체 HB2151 단백질 L 전체 단백질 0.1M 글리신 pH2.5 RA~20nM CA~30nM
TAR1-5-19 5U 동종이합체 HB2151 단백질 L 전체 단백질 0.1M 글리신 pH2.5 RA~2nM CA~3nM
TAR1-5-19 7U 동종이합체 HB2151 단백질 L 전체 단백질 0.1M 글리신 pH2.5 RA~10nM CA~15nM
TAR1-5-19 cys 힌지 HB2151 단백질 L + FPLC FPLC 정제된 이합체 분획 0.1M 글리신 pH2.5 RA~2nM
TAR1-5-19 CH/TAR1-5-19 CK HB2151 단백질 전체 단백질 0.1M 글리신 pH2.5 RA~1nM
표 7: TAR1-5/TAR1-5-19 Fab
이합체 세포 유형 정제 단백질 분획 용리 조건 수용체/세포 분석
TAR1-5CH/dAb1 CK HB2151 단백질 L 전체 단백질 0.1M 시트레이트 pH2.6 RA~90nM
TAR1-5CH/dAb2 CK HB2151 단백질 L 전체 단백질 0.1M 글리신 pH2.5 RA~30nM CA~60nM
TAR3CH/ TAR1-5CK HB2151 단백질 L 전체 단백질 0.1M 시트레이트 pH2.6 RA~100nM
TAR1-5-19CH/dAb1 CK HB2151 단백질 L 전체 단백질 0.1M 글리신 pH2.0 RA~6nM
dAb1 CH/ TAR1-5-19CK HB2151 단백질 L 0.1M 글리신 pH2.0 Myc/flag RA~6nM
TAR1-5-19CH/dAb2 CK HB2151 단백질 L 전체 단백질 0.1M 글리신 pH2.0 RA~8nM CA~12nM
TAR1-5-19CH/dAb3CK HB2151 단백질 L 전체 단백질 0.1M 글리신 pH2.0 RA~3nM
실시예 7. 말단 시스테인 결합에 의한 dAb 이합체화
개요
dAb 이합체화를 위해, 자유 시스테인을 단백질의 C-말단에서 고안하였다. 발현시, 상기 단백질은 두 단계의 정제 방법에 의해 정제될 수 있는 이합체를 형성한다.
TAR1-5-19CYS 이합체의 PCR 작제물
참조: dAb 삼합체를 기술하는 실시예 8. 삼합체 프로토콜은 단량체, 이합체 및 삼합체의 혼합물을 발생시킨다.
TAR1-5-19CYS 이합체의 발현 및 정제
실시예 8에 기술된 바와 같이 단백질 L 아가로오스에서의 포획에 의해 배양물의 상층액으로부터 이합체를 정제시켰다.
TAR1-5-19CYS 이합체로부터 TAR1-5-19CYS 단량체의 분리
양이온 교환 분리 전에, 혼합된 단량체/이합체 샘플을 제조업체의 지침서에 따라 PD-10 컬럼 (Amersham Pharmacia)을 이용하여 50 mM의 아세트산 나트륨 완충용액 (pH 4.0)으로 완충용액 교환시켰다. 이후, 샘플을 50 mM의 아세트산 나트륨 (pH4.0)로 미리 평형화된 1mL의 리소스(Resource) S 양이온 교환 컬럼 (Amersham Pharmacia)에 적용시켰다. 단량체 및 이합체를 50 mM의 아세트산 나트륨 (pH 4.0)에서 하기의 염 구배를 이용하여 분리시켰다:
15 컬럼 부피를 초과하는 150 내지 200 mM 염화나트륨
10 컬럼 부피를 초과하는 200 내지 450 mM 염화나트륨
15 컬럼 부피를 초과하는 450 내지 1000 mM 염화나트륨.
이합체만을 함유하는 분획을 SDS-PAGE를 이용하여 확인한 후, 풀링시키고, 1/5 부피의 1M 트리스 (pH8.0)의 첨가에 의해 pH를 8로 증가시켰다.
시험관내 작용 결합 분석: TNF 수용체 분석 및 세포 분석
인간 TNFα에 대한 이합체의 친화성을 TNF 수용체 및 세포 분석을 이용하여 결정하였다. 수용체 분석에서의 IC50은 약 0.3-0.8 nM이었고; 세포 분석에서의 ND50은 약 3-8 nM이었다.
기타 가능한 TAR1-5-19CYS 이합체 포맷
PEG 이합체 및 통상적 합성 말레이미드 이합체
넥타 (Nektar, Shearwater)는 단량체를, dAb를 분리시키는 작은 링커를 지니고, 5 내지 40kDa의 크기의 PEG에 열결되는 이량체로 포맷화되도록 하는 다양한 비-말레이미드 PEG [mPEG2-(MAL)2 또는 mPEG-(MAL)2]를 제공한다. 5kDa의 mPEG-(MAL)2 (즉, [TAR1-5-19]-Cys-말레이미드-PEG x 2, 여기서 말레이미드는 이합체에서 서로 연결됨)가 TNF 수용체 분석에서 ~ 1-3 nM의 친화성을 지니는 것으로 나타났다. 또한, 이합체는 TMEA (트리스[2-말레이미도에틸]아민)(Pierce Biotechnology) 또는 기타 이작용성 링커를 이용하여 생성될 수도 있다.
2,2'-디티오디피리딘 (Sigma Aldrich) 및 환원된 단량체를 이용하는 화학적 커플링 방법을 이용하여 이황화물 이합체를 생성시키는 것도 가능한다.
dAb의 C-말단으로의 폴리펩티드 링커 또는 힌지의 첨가
작은 링커인 (Gly4Ser)n (여기서, n은 1 내지 10, 예를들어 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7임, 면역글로불린 (예를들어, IgG 힌지 영역) 또는 무작위 펩티드 서열 (예를들어, 무작위 펩티드 서열의 라이브러리로부터 선택된 것))이 dAb와 말단 시스테인 잔기 사이에서 고안될 수 있다. 이후, 이는 상기 기술된 이합체를 제조하기 위해 사용될 수 있다.
실시예 8. dAb 삼합체화
개요
dAb 삼합체화를 위해, 자유 시스테인이 단백질의 C-말단에 요구된다. 일단 환원되어 자유 티올을 생성시키는 상기 시스테인 잔기는 이후 단백질을 삼합체 말레이미드 분자, 예를들어 TMEA (트리스[2-말레이미도에틸]아민)로 특이적으로 커플링시키기 위해 사용될 수 있다.
TAR1-5-19CYS의 PCR 작제물
하기 올리고누클레오티드를 클로닝을 위한 SalⅠ 및 BamΗⅠ 부위를 지니는 TAR1-5-19를 특이적으로 PCR시키고, C-말단 시스테인 잔기를 도입시키기 위해 사용하였다:
Figure 112007034140104-PCT00005
(*TAR1-5-19CYS 서열의 시작; TAR1-5-19CYS 아미노산 서열 (SEQ ID NO:293); TAR1-5-19CYS 누클레오티드 서열 (SEQ ID NO:294, 코딩 가닥; SEQ ID NO:295, 논코딩 가닥))
정방향 프라이머
Figure 112007034140104-PCT00006
역방향 프라이머
Figure 112007034140104-PCT00007
PCR 반응 (50μL 부피)을 하기와 같이 설정하였다: 200μM의 dNTP, 0.4μM의 각각의 프라이머, 5μL의 10x PfuTurbo 완충용액 (Stratagene), 100ng의 주형 플라스미드 (TAR1-5-19를 엔코딩함), 1μL의 PfuTurbo 효소 (Stratagene) 및 부피를 50μL로 조정하는 멸균수. 하기의 PCR 조건을 사용하였다: 최초 변성 단계 2분 동안 94℃, 이후 25 주기의 30초 동안 94℃, 30초 동안 64℃ 및 30초 동안 72℃. 또한, 5분 동안 72℃의 최종 신장 단계를 포함시켰다. PCR 생성물을 정제시키고, SalⅠ 및 BamHⅠ으로 분해시키고, 동일한 제한 효소로 절단된 벡터로 라이게이션시켰다. 정확한 클론을 DNA 서열분석으로 확인하였다.
TAR1-5-19CYS의 발현 및 정제
TAR1-5-19CYS 벡터를 제조업체의 프로토콜에 따라 BL21 (DE3) pLysS 화학적 적격 세포 (Novagen)로 형질전환시켰다. dAb 플라스미드를 지니는 세포를 lOOμg/mL의 카르베니실린 및 37μg/mL의 클로람페니콜을 이용하여 선택하였다. 배양물을 500mL의 테리픽 브로쓰 (terrific broth) (Sigma-Aldrich), lOOμg/mL의 카르베니실린 및 37μg/mL의 클로람페니콜을 함유하는 2L 배플드 플라스크(baffled flask)로 옮겼다. 배양물을 200rpm에서 30℃에서 1-1.5의 O.D.600으로 성장시키고, 1mM IPTG (이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노시드)(Melford Laboratories)로 유도시켰다. dAb의 발현을 30℃에서 12-16시간 동안 지속시켰다. 대부분의 dAb가 배지에 존재하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 세포를 원심분리 (30분 동안 8,000 x g)에 의해 배지로부터 분리시키고, dAb를 정제시키기 위해 상층액을 사용하였다. 상층액의 리터 당, 30 mL의 단백질 L 아가로오스 (Affitech)를 첨가하고, 2시간 동안 교반하여 dAb가 배치 결합되도록 하였다. 이후, 수지를 추가 시간 동안 중력하에서 가라앉도록 두고, 상층액을 사이폰으로 제거하였다. 이후, 아가로오스를 XK 50 컬럼 (Amersham Phamacia)으로 패킹시키고, 10 컬럼 부피의 PBS로 세척하였다. 결합된 dAb를 100mM 글리신 (pH2.0)으로 용리시킨 후, 분획을 함유하는 단백질을 1/5 부피의 1M 트리스 (pH8.0)를 첨가하여 중화시켰다. 배양 상층액의 리터당 20mg의 순수한 단백질을 분리시키고, 이는 50:50의 비로 단량체 대 다합체를 함유하였다.
TAR1-5-19CYS의 삼합체화
2.5ml의 100μM TAR1-5-19CYS를 5mM 디티오트레이톨로 환원시키고, 20분 동안 실온에 두었다. 이후, 샘플을 PD-10 컬럼 (Amersham Pharmacia)을 이용하여 완충용액 교환하였다. 컬럼을 5mM EDTA, 50mM 인산나트륨 (pH6.5)으로 미리 평형화시키고, 샘플을 제조업체의 지침서에 따라 적용시키고 용리시켰다. 샘플을 필요시까지 얼음에 두었다. TMEA (트리스[2-말레이미도에틸]아민)를 피어스 바이오테크놀로지 (Pierce Biotechnology)사에서 구입하였다. TMEA의 20mM 스톡 용액을 100% DMSO (디메틸 설폭시드)에서 제조하였다. 3:1 (dAb:TMEA의 몰비)를 초과하는 TMEA의 농도가 단백질의 신속한 침전 및 가교를 야기시키는 것이 밝혀졌다. 또한, 침전 및 가교의 속도는 pH 증가보다 컸다. 따라서, 100μM의 환원된 TAR1-5-19CYS를 이용하여, 단백질을 삼합체화시키기 위해 25μM TMEA를 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 반응이 진행되도록 하였다. 첨가물, 예를들어 글리세롤 또는 에틸렌 글리콜을 20% (v/v)로 첨가하는 것이 커플링 반응이 진행됨에 따라 삼합체의 침전을 현저하게 감소시키는 것을 발견하였다. 커플링 후, SDS-PAGE 분석은 용액 내의 단량체, 이합체 및 삼합체의 존재를 나타내었다.
삼합체 TAR1-5-19CYS의 정제
pH를 ~4로 감소시키기 위해 TMEA-TAR1-5-19cys 반응물의 mL 당 40μL의 40% 빙초산을 첨가하였다. 이후, 샘플을 50 mM 아세트산 나트륨 (pH 4.0)으로 미리 평형화된 1mL의 리소스 S 양이온 교환 컬럼 (Amersham Pharmacia)에 적용시켰다. 이합체 및 삼합체를 30 컬럼 부피를 초과하는 340 내지 450mM 염화나트륨, 50mM 아세트산 나트륨 (pH4.0)의 염 구배를 이용하여 부분적으로 분리시켰다. 삼합체만을 함유하는 분획을 SDS-PAGE를 이용하여 확인한 후, 풀링시키고, 1/5 부피의 1M 트리스 (pH 8.0)를 첨가하여 pH를 8로 증가시켰다. 농축 단계 (5K 컷오프 비바스핀 농축기를 이용함; Vivascience) 동안의 삼함체의 침전을 예방하기 위해, 10% 글리세롤을 샘플에 첨가하였다.
시험관내 작용 결합 분석: TNF 수용체 분석 및 세포 분석
인간 TNFα에 대한 삼합체의 친화성을 TNF 수용체 및 세포 분석을 이용하여 결정하였다. 수용체 분석에서 IC50은 0.3nM이었고; 세포 분석에서 ND50은 3 내지 1OnM의 범위 (예를들어, 3nM)였다.
기타 가능한 TAR1-5-19CYS 삼합체 포맷
TAR1-5-19CYS는 또한 하기 시약을 이용하여 삼합체로 포맷화될 수 있다:
PEG 삼합체 및 통상의 합성 말레이미드 삼합체
넥타 (Shearwater)는 다양한 다중 암 (arm)의 PEG를 제공하고, 이는 PEG의 말단에서 화학적으로 변형될 수 있다. 따라서, 각각의 암의 말단에 말레이미드 작용기를 지니는 PEG 삼합체를 이용하여 TMEA를 이용하는 상기 기술된 것과 유사한 방식으로 dAb의 삼합체화시켰다. PEG는 또한 삼합체의 가용성을 증가시키는 이점을 지니고, 따라서 응집의 문제를 예방한다. 따라서, 각각의 dAb가 말레이미드 작용기에 연결되는 C-말단 시스테인을 지니는 dAb 삼합체를 생성할 수 있고, 상기 말레이미드 작용기는 PEG 삼합체에 연결된다.
dAb의 C-말단에 대한 폴리펩티드 링커 또는 힌지의 첨가
작은 링커인 (Gly4Ser)n (여기서, n은 1 내지 10, 예를들어 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7임, 면역글로불린 (예를들어, IgG 힌지 영역) 또는 무작위 펩티드 서열 (예를들어, 무작위 펩티드 서열의 라이브러리로부터 선택된 것))이 dAb와 말단 시스테인 잔기 사이에서 고안될 수 있다. 다합체 (예를들어, 이합체 또는 삼합체)를 제조하는데 사용되는 경우, 이는 다시 보다 큰 정도의 가요성 및 개별적 단량체 사이의 거리로 도입되어, 표적, 예를들어 다중유닛 표적, 예를들어 인간 TNFα에 대한 결합 특성을 개선시킬 수 있다.
실시예 9. 인간 혈청 알부민 (HSA) 및 마우스 혈청 알부민 (MSA)에 특이적인 단일 도메인 항체 (dAb)의 수집물의 선택.
본 실시예는 혈청 알부민에 특이적인 단일 도메인 항체 (dAb)를 제조하는 방법을 설명한다. 마우스 혈청 알부민 (MSA) 및 인간 혈청 알부민 (HSA) 둘 모두에 대한 dAb의 선택이 기술된다. 3개의 인간 파지 전시 항체 라이브러리를 본 실험에 사용하였고, 이들 각각은 상보성 결정 영역 (CDR1, CDR2 및 CDR3)에 포함된 NNK 코돈에 의해 엔코딩되는 측쇄 다양성을 지니는 VH (도 13 참조: V3-23/DP47 및 JH4b에 기초한 더미 VH의 서열) 또는 Vκ (도 15 참조: o12/o2/DPK9 및 JK1에 기초한 더미 VK의 서열)에 대한 단일 인간 프레임워크를 기초로 한다.
라이브러리 1 (VH):
위치 H30, H31, H33, H35, H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H97 및 H98에서 다양성.
라이브러리 크기: 6.2 x 109
라이브러리 2 (VH):
위치 H30, H31, H33, H35, H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H97, H98, H99, H1OO, H1OOa 및 H1OOb에서 다양성.
라이브러리 크기: 4.3 x 109
라이브러리 3 (Vκ):
위치 L30, L31, L32, L34, L50, L53, L91, L92, L93, L94 및 L96에서 다양성.
라이브러리 크기: 2 x 109
VH 및 VK 라이브러리를 일반 리간드 단백질 A 및 단백질 L 각각에 대한 결합에 대해 사전선택하여, 선택되지 않은 라이브러리 내의 대부분의 클론은 기능적이다. 상기 나타낸 라이브러리의 크기는 사전선택 후의 크기에 해당한다.
두번째 라운드의 선택을 각각의 라이브러리를 단독으로 이용하여 혈청 알부민에 대해 수행하였다. 각각의 선택을 위해, 항원을 4ml의 PBS중 1OOμg/ml의 농도로 면역튜브 (nunc)에 코팅시켰다. 첫번째 라운드의 선택에서, 세개의 라이브러리 각각을 HSA (Sigma) 및 MSA (Sigma)에 대해 단독으로 패닝(panning)시켰다. 두번째 라운드의 선택에서, 6개의 첫번째 라운드 선택의 각각으로부터의 파지를 (i) 동일한 항원 (예를들어, 첫번째 라운드 MSA, 두번째 라운드 MSA) 및 (ii) 상호적 항원 (예를들어, 첫번째 라운드 MSA, 두번째 라운드 HSA)에 대해 패닝시켜, 전체 12개의 두번째 라운드 선택을 생성시켰다. 각각의 경우, 두번째 라운드의 선택후, 48개의 클론을 HSA 및 MSA에 대한 결합에 대해 시험하였다. 가용성 dAb 단편을 문헌[Harrison et al., Methods Enzymol. 1996;267:83-109]에 scFv 단편에 대해 기술된 바와 같이 생성시키고, 2% tween PBS를 블로킹 완충용액으로 사용하고 결합된 dAb를 단백질 L-HRP (Sigma) (Vκ에 대해) 및 단백질 A-HRP (Amersham Pharmacia Biotech) (VH에 대해)로 검출한 것을 제외하고 표준 ELISA 프로토콜을 따랐다 (Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res., 19: 4133).
MSA, HSA 또는 둘 모두에 대한 결합을 나타내는 백그라운드를 초과하는 신호를 발생시킨 dAb를 플라스틱 단독에 대한 결합에 대해 ELISA 불용성 형태로 시험하였으나, 모두 혈청 알부민에 대해 특이적이었다. 이후, 클론을 서열분석하였고 (참조: 하기 표), 이는 21개의 유일무이한 dAb 서열이 확인되었음을 나타낸다. 선택된 VK dAb 클론 사이의 최소 유사성 (아미노산 수준)은 86.25% ((69/8O)xlOO); 모든 다양화된 잔기가 상이한 경우의 결과임, 예를들어 클론 24 및 34)이었다. 선택된 VH dAb 클론 사이의 최소 유사성은 94% ((127/136)xl00)이었다.
다음으로, 혈청 알부민 결합 dAb를 용액으로부터의 비오티닐화된 항원을 포획하는 이들의 능력에 대해 시험하였다. ELISA 플레이트를 1μg/ml의 단백질 L (VK 클론에 대해) 및 lμg/ml의 단백질 A (VH 클론에 대해)로 코팅한 것을 제외하고 ELISA 프로토콜 (상기와 같음)을 따랐다. 가용성 dAb를 상기 프로토콜로 용액으로부터 포획하고, 비오티닐화된 MSA 또는 HSA 및 스트렙타비딘 HRP로 검출하였다. 혈청 알부민 분자당 평균 2개의 비오틴이 달성되도록, 제조업체의 설명서에 따라 비오티닐화된 MSA 및 HSA를 제조하였다. 24개의 클론이 ELISA에서 용액으로부터 비오티닐화된 MSA를 포획하였음을 확인하였다. 이들중 두개 (하기의 클론 2 및 38)는 또한 비오티닐화된 HSA를 포획하였다. 다음으로, dAb를 CM5 비아코어 칩에 코팅된 MSA에 결합하는 이들의 능력에 대해 시험하였다. 8개의 클론이 비아코어 상의 MSA에 결합하였음을 확인하였다.
표 8.
Figure 112007034140104-PCT00008
Figure 112007034140104-PCT00009
모든 경우에서, 프레임워크는 상응하는 더미 서열 내의 프레임워크와 동일하고, 상기 표에 나타낸 바와 같이 CDR에 다양성을 지닌다.
비아코어에서 MSA에 결합하는 8개의 클론 중, 대장균에서 고도로 발현되는 두개의 클론 (클론 MSA16 및 MSA26)을 추가 연구를 위해 선택하였다 (실시예 10). MSA16 및 MSA26에 대한 전체 누클레오티드 및 아미노산 서열은 도 16에 제시되어 있다.
실시예 10. MSA 결합 dAb인 MSA16 및 MSA26의 마우스에서의 친화성 및 혈청 반감기 결정.
dAb MSA16 및 MSA26을 대장균의 원형질막 공간에서 발현시키고, 단백질 L-아가로오스 친화성 수지 (Affitech, Norway)에 대한 배치 흡착을 이용하여 정제시킨 후, pH2.2에서 글리신으로 용리시켰다. 이후, 정제된 dAb를 억제 비아코어로 분석하여 Kd를 결정하였다. 간단히, 정제된 MSA16 및 MSA26을 시험하여 고밀도의 MSA로 코팅된 비아코어 CM5 칩에 대해 200RU의 반응을 달성하는데 필요한 dAb의 농도를 결정하였다. 일단, dAb의 요구되는 농도를 결정하고, 예상 Kd 근처의 농도 범위로 MSA 항원을 dAb와 사전 혼합시키고, 밤새 인큐베이션시켰다. 각각의 사전 혼합물에서의 dAb의 MSA 코팅된 비아코어 칩으로의 결합을 30μl/분의 높은 유속으로 측정하였다. 생성된 곡선을 클로츠 (Klotz) 플롯을 생성하기 위해 사용하였고, 이는 MSA16에 대해 20OnM 및 MSA26에 대해 7OnM의 예측 Kd를 생성시켰다 (도 17A & B).
다음으로, 클론 MSA16 및 MSA26을 HA 태그 (핵산 서열: TATCCTTATGATGTTCCTGATTATGCA (SEQ ID NO:373) 및 아미노산 서열: YPYDVPDYA (SEQ ID NO:374))를 이용하여 발현 벡터에 클로닝시키고, 2-10 mg의 양을 대장균에서 발현시키고, 단백질 L-아가로오스 친화성 수지 (Affitech, Norway)로 상층액으로부터 정제시키고, pH2.2에서 글리신으로 용리시켰다. dAb의 혈청 반감기를 마우스에서 결정하였다. MSA26 및 MSA16을 약 1.5mg/kg으로 CD1 마우스에 단일 정맥내 주사로 투여하였다. 혈청 수준의 분석을 염소 항-HA (Abcam, UK) 포획 및 4% 마벨 (Marvel)로 블로킹된 단백질 L-HRP (invitrogen) 검출 ELISA로 수행하였다. 0.05% tween PBS로 세척하였다. dAb의 공지된 농도의 표준 곡선을 시험 샘플과의 비교가능성을 보장하기 위해 1x 마우스 혈청의 존재하에서 작성하였다. 2개의 구획 모델을 이용한 모델링은 MSA-26이 0.16시간의 t1/2α, 14.5시간의 t1/2β 및 465시간.mg/ml의 곡선하 영역 (AUC)을 지니고 (데이터는 나타내지 않음), MSA-16이 0.98시간의 t1/2α, 36.5시간의 t1/2β 및 913시간.mg/ml의 AUC를 지님을 나타내었다 (도 18). 둘 모두의 항-MSA 클론은 0.06시간의 t1/2α 및 0.34시간의 t1/2β를 지니는 HEL4 (항-계란 흰자 라이소자임 dAb)와 비교하여 현저하게 연장된 반감기를 지녔다.
실시예 11. VH-VH 및 VK-VK 이중특이적 Fab 유사 단편의 생성.
본 실시예는 Fab 유사 단편으로서 VH-VH 및 VK-VK 이중특이적 단편을 제조하는 방법을 기술한다. 기재된 각각의 Fab 유사 단편을 작제하기 전에, 선택 표적에 결합하는 dAb를 우선 실시예 9에 기술된 것과 유사한 dAb 라이브러리로부터 선택하였다. 계란 라이소자임 (Sigma)에 결합하는 VH dAb인 HEL4를 분리시키고, TNFα 수용체에 결합하는 제 2 VH dAb (TAR2h-5) (R 및 D 시스템)를 또한 분리시켰다. 이들 서열은 서열 목록에 제시되어 있다. TNFα에 결합하는 VK dAb (TAR1-5-19)를 선택 및 친화성 성숙에 의해 분리시켰고, 상기 서열 또한 서열 목록에 제시되어 있다. 서열이 도 17B에 있는 실시예 9에 기술된 제 2 VK dAb (MSA26)이 또한 본 실험에 사용되었다.
상기 기술된 4개의 dAb를 함유하는 발현 벡터로부터의 DNA를 dAb를 코딩하는 DNA를 절제하기 위해 효소 SalⅠ 및 NotⅠ으로 분해시켰다. 예상 크기 (300-400bp)의 밴드를 아가로오스 겔 상에서 영동시키고, 상기 밴드를 절제한 후 키아젠 (Qiagen) 젤 정제 키트 (Qiagen, UK)를 이용하는 젤 정제에 의해 정제시켰다. 이후, 상기 dAb를 코딩하는 DNA를 하기 표에 나타낸 바와 같이 CH 또는 CK 벡터 (도 8 및 9)로 삽입시켰다.
표 9.
dAb 표적 항원 dAb VH 또는 dAb Vκ 삽입된 벡터 태그 (C 말단) 항생제 내성
HEL4 계란 라이소자임 VH CH Myc 클로람페니콜
TAR2-5 TNF 수용체 VH Cκ Flag 앰피실린
TAR1-5-19 TNFα Vκ CH Myc 클로람페니콜
MSA26 마우스 혈청 알부민 Vκ Cκ Flag 앰피실린
VH CH 및 VH CK 작제물을 HB2151 세포에 공동형질전환시켰다. 별도로, VK CH 및 VK CK 작제물을 HB2151 세포로 공동형질전환시켰다. 공동형질전환된 세포주 각각의 배양물을 밤새 성장시켰다 (CH 및 Cκ 플라스미드 둘 모두에 대한 항생제 선택을 유지시키기 위해 5%의 글루코오스, 1Oμg/ml의 클로람페니콜 및 100μg/ml의 앰피실린을 함유하는 2xTy에서 배양). 밤새의 배양물을 신선한 배지 (2xTy, 1Oμg/ml의 클로람페니콜 및 100μg/ml의 앰피실린)에 접종시키고, OD 0.7-0.9로 성장시키고, IPTG를 첨가에 의해 유도시켜, 이들의 CH 및 CK 작제물을 발현시켰다. 발현된 이후, Fab 유사 단편을 단백질 A 정제 (공동형질전환된 VH CH 및 VH CK에 대해) 및 MSA 친화성 수지 정제 (공동형질전환된 VK CH 및 VK CK에 대해)에 의해 원형질막 공간으로부터 정제시켰다.
VH-VH 이중특이적 단편
VH CH 및 VH CK 이중특이적 단편의 발현을 젤에서 단백질을 영동시켜 시험하였다. 젤을 블로팅시키고, Fab 단편에 대한 예상 크기의 밴드를 myc 태그 및 flag 태그 둘 모두를 통해 웨스턴 블롯상에서 검출하였고, 이는 Fab 유사 단편의 VH CH 및 VH CK 부분 둘 모두가 존재함을 나타낸다. 다음으로, 이중특이적 단편의 2개의 반쪽이 동일한 Fab 유사 단편으로 존재하는지의 여부를 결정하기 위해, ELISA 플레이트를 중탄산나트륨 완충용액중 3 mg/ml의 웰당 100㎕의 계란 라이소자임 (HEL)으로 밤새 코팅시켰다. 이후, 플레이트를 2% tween PBS로 블로킹 (실시예 1에 기술된 바와 같음)시키고, VH CH /VH CK 이중특이적 Fab 유사 단편과 함께 인큐베이션하였다. HEL에 대한 이중특이적 단편의 결합의 검출을 9e1O (myc tag에 결합하는 모노클로날 항체, Roche) 및 항 마우스 IgG-HRP (Amersham Pharmacia Biotech)을 이용하여 비동족 사슬을 통해 수행하였다. VH CH /VH CK 이중특이적 Fab 유사 단편에 대한 신호는 단독 발현된 VH CK 사슬에 대한 0.069의 백그라운드 신호에 비해 0.154였다. 이는 Fab 유사 단편이 표적 항원에 대해 결합 특이성을 지님을 증명한다.
Vκ-Vκ 이중특이적 단편
MSA 친화성 수지에서 공동형질전환된 Vκ CH 및 Vκ CK 이중특이적 Fab 유사 단편의 정제 후, 생성된 단백질을 1μg/ml의 TNFα로 코팅된 ELISA 플레이트 및 lOμg/ml의 MSA로 코팅된 ELISA 플레이트를 프로빙하기 위해 사용하였다. 예상되는 바와 같이, 둘 모두의 ELISA 플레이트에서 단백질 L-HRP를 이용하여 검출하는 경우 백그라운드를 초과하는 신호가 존재하였다 (데이터는 나타내지 않음). 이는 MSA에 결합할 수 있는 단백질의 분획 (MSA 친화성 컬럼에서 정제됨)이 또한 이후의 ELISA에서 TNFα에 결합할 수 있음을 나타내고, 이는 상기 항체 단편의 이중특이성을 확증한다. 이후, 이러한 단백질의 분획을 두개의 이후의 실험에 사용하였다. 첫째로, 1μg/ml의 TNFα로 코팅된 ELISA 플레이트를 이중특이적 VK CH 및 Vκ Cκ Fab 유사 단편, 및 대조군 TNFα 결합 dAb로 ELISA 상에서 유사한 신호를 생성시키는 것으로 계산되는 농도로 프로빙시켰다. 이중특이적 및 대조군 dAb 둘 모두를 2mg/ml의 MSA의 존재 및 부재하에서 ELISA 플레이트를 프로빙시키기 위해 사용하였다. 이중특이적 웰에서의 신호는 50% 이상 감소하였으나, dAb 웰에서의 신호는 전혀 감소하지 않았다 (도 19a). 동일한 단백질을 또한 MSA를 지니거나, 지니지 않는 수용체 분석에 적용시켰고, MSA에 의한 경쟁을 또한 나타내었다 (참조: 도 19c). 이는 이중특이적 단편에 대한 MSA의 결합이 TNFα로의 결합과 경쟁적임을 증명한다.
실시예 12. 마우스 혈청 알부민 및 TNFα에 대해 특이성을 지니는 이중특이적 단편에 결합된 Vκ-Vκ 이중특이적 cys의 생성
본 실시예는 이황화 결합을 통한 화학적 커플링에 의해 마우스 혈청 알부민 및 TNFα 둘 모두에 대해 특이적인 이중특이적 항체 단편을 제조하는 방법을 기술한다. MSA16 (실시예 1) 및 TAR1-5-19 dAb 둘 모두를 C 말단 시스테인을 지니고 tag를 지니지 않는 pET 기재 벡터로 다시 클로닝시켰다. 두개의 dAb를 4-10 mg 수준으로 발현시키고, 단백질 L-아가로오스 친화성 수지 (Affitiech, Norway)를 이용하여 상층액으로부터 정제시켰다. 이후, 시스테인 태깅된 dAb를 디티오트레이톨로 환원시켰다. 이후, TAR1-5-19 dAb를 디티오디피리딘 커플링시켜 PEP1-5-19 동종이합체의 형성을 발생시키는 이황화 결합의 재형성을 블로킹시켰다. 이후, 두개의 상이한 dAb를 pH 6.5에서 혼합시켜 이황화 결합 및 TAR1-5-19, MSA16 cys 결합된 이종이합체의 형성을 촉진시켰다. 두개의 유사하지 않은 단백질의 컨쥬게이트를 생성시키는 이러한 방법은 본래 문헌[King et al. (King TP, Li Y Kochoumian L Biochemistry. 1978 vol17:1499-506 Preparation of protein conjugates via intermolecular disulfide bond formation.)]에 기술되어 있다. 이종이합체를 양이온 교환에 의해 단일종으로부터 분리시켰다. SDS 젤에서의 예상 크기의 밴드의 존재로 분리를 확인하였다. 생성된 이종이합체 종을 TNF 수용체 분석에서 시험하고, 약 18nM의 TNF를 중화시키기 위한 IC50를 지니는 것을 확인하였다. 다음으로, 수용체 분석을 동일한 농도의 이종이합체 (18nM) 및 MSA 및 HSA의 일련의 희석액으로 반복하였다. 다양한 농도 (2 mg/ml 이하)에서의 HSA의 존재는 TNFα를 억제하는 이합체의 능력을 감소시키지 않았다. 그러나, MSA의 첨가는 TNFα를 억제하는 이합체의 능력을 용량 의존적으로 감소시켰다 (도 20). 이는 MSA 및 TNFα가 cys 결합된 TAR1-5-19, MSA16 이합체에 대한 결합에 대해 경쟁함을 입증한다.
데이터 요약
상기 언급한 실시예에 기술된 실험에서 수득한 데이터의 요약을 부록 4에 기술하였다.
실시예 13
항-마우스 TNFR1 dAb 및 항-인간 TNFR1 dAb의 활성
표 10 항-마우스 TNFR1 dAb의 활성
Figure 112007034140104-PCT00010
n/d, 측정되지 않음
표 11 항-인간 TNFR1 dAb의 활성
Figure 112007034140104-PCT00011
n/d, 측정되지 않음
MRC-5 IL-8 방출 분석
인간 TNFR1에 결합하는 특정 dAb의 활성을 하기의 MRC-5 세포 분석에서 평가하였다. 이 분석은 MRC-5 세포에서의 TNF에 의한 IL-8 분비의 유도를 기초로 하고, HUVEC에서의 IL-1에 의한 IL-8의 유도를 기술하는 문헌[Alceson, L. et al. Journal of Biological Chemistry 271:30517-30523 (1996)]에 기술된 방법으로부터 적합화된 것이다. HUVEC 세포주 대신에 MRC-5 세포를 이용하여 인간 TNFα에 의한 IL-8 유도를 측정함으로써 dAb의 활성을 분석하였다. 간단히, MRC-5 세포를 미세역가 플레이트에 플레이팅시키고, 플레이트를 dAb 및 인간 TNFα (300 pg/ml)와 함께 밤새 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 배양 상층액을 흡출시키고, 상층액 내의 IL-8의 농도를 샌드위치 ELISA (R&D Systems)를 통해 측정하였다. 항-TNFR1 dAb 활성은 TNFα로만 인큐베이션된 대조군 웰에 비해 상층액으로의 IL-8 분비를 감소시켰다.
실시예 14. 마우스 패혈 쇼크 모델
항-TNFR1 dAb의 생체내 효능을 패혈 쇼크 증후군에 대해 잘 확립된 실험 모델에서 평가하였다 (Rothe et al., Circulatory Shock 44:51-56, (1995)). 이러한 모델에서의 LPS에 의해 유발된 사멸은 TNFR-1 (p55) 활성화에 의존적이다. 이 모델에서, 마우스는 D-갈락토사민 (D-GaIN)을 이용한 LPS의 독성에 민감하였다. 이 연구에서 야생형 동물에 대한 치사 LPS 양은 약 10 ng이었다.
LPS (살모넬라 엔테리티디스, Sigma, USA) 및 D-갈락토사민 (D-GaIN, Sigma, USA)을 복막내 주사하였다. D-GalN-민감화된 (10 mg/마우스) 대조군 마우스는 LPS 투여 (10 ng) 후 18시간 내에 사망하였다. 비-민감화된 마우스의 사망률을 투여후 1일 동안에 걸쳐 기록하였다.
마우스에 마우스 TNFR1 및 마우스 혈청 알부민에 결합하는 이중특이적 리간드 (TAR2m-21-23 3U TAR7m-16; TAR7m-16는 본원에서 MSA16으로도 언급됨) 또는 ENBREL® (entarecept; Immunex Corporation)를 LPS의 투여 4시간 전에 복막내 주사하여 투여하였다 (참조: 표 12). 48시간에 걸쳐 4-6시간의 간격으로 생존을 모니터하였다. 항-마우스 TNFR1 dAb의 효능이 생존에 의해 입증되었다.
표 12.
처리 그룹 작용제 및 용량 마우스당 LPS 용량 (ng) 동물수 24시간에서의 생존수
1 염수 10 8 0/8
2 10 mg/kg의 ENBREL® (entarecept; Immunex Corporation) 10 8 8/8
3 5.4 mg/kg의 TAR2m-21-23 3U TAR7m-16 10 8 4/8
4 1 mg/kg의 TAR2m-21-23 3U TAR7m-16 10 8 2/8
5 5.4 mg/kg의 TAR2m-21-23 3U TAR7m-16 0 2 2/2
TAR2m-21-23 3U TAR7m-16은 펩티드 링커를 통해 마우스 혈청 알부민에 결합하는 dAb에 연결되는 마우스 TNFR1에 결합하는 dAb를 함유하는 이중특이적 리간드이다. TAR2m-21-23 3U TAR7m-16을 엔코딩하는 누클레오티드 서열 및 이중특이적 리간드의 아미노산 서열이 하기에 SEQ ID NO:375 및 SEQ ID NO:376로 각각 제시되어 있다:
Figure 112007034140104-PCT00012
Figure 112007034140104-PCT00013
TAR2m-21-23 3U TAR7m-16 처리 그룹에서의 생존자의 존재는 항-TNFR1 dAb가 생체내에서 수용체의 활성을 억제하는데 효과적임을 입증하고, 이러한 결과는 효과가 용량 의존적임을 입증한다. 더욱이, TAR2m-21-23 3U TAR7m-16 처리의 효능은 ENBREL® (entarecept; Immunex Corporation)의 효능에 비해 바람직하다. TAR2m-21-23 3U TAR7m-16 단독 (그룹 5, LPS 투여 없음)으로 처리된 동물의 생존은 또한 TAR2m-21-23 3U TAR7m-16이 비독성이고, 수용체 가교에 의해 생체내에서 수용체를 효능화시키지 않음을 입증한다.
추가의 연구는 항-TNFR1 dAb가 TNFα의 부재하에서 TNFR1 (TNFR1 효능제로 작용함)을 효능화시키지 않음을 입증한다. L929 세포를 다양한 농도의 TAR2m-21-23 단량체, 시판되는 항-myc 항체 (9E10)에 가교된 TAR2m-21-23 단량체, TAR2m-21-23 3U TAR7m-16 또는 TAR2m-21-23 4OK PEG를 함유하는 배지에서 배양시켰다. 항-myc 항체로 가교된 TAR2m-21-23 단량체의 경우, dAb 및 항체를 2:1의 비로 혼합시키고, 실온에서 1시간 동안 미리 인큐베이션시켜, 배양 전에 생체내 면역 가교의 효과를 자극시켰다. TAR2m-21-23 단량체를 3000 nM의 농도로 L929 세포와 함께 인큐베이션시켰다. TAR2m-21-23 단량체 및 항-Myc 항체를 3000 nM의 dAb 농도로 인큐베이션시켰다. TAR2m-21-23 3U TAR7m-16을 25 nM, 83.3 nM, 250 nM, 833 nM 및 2500 nM의 농도로 상기 세포와 함께 인큐베이션시켰다. TAR2m-21-23 4OK PEG를 158.25 nM, 527.5 nM, 1582.5 nM, 5275 nM 및 15825 nM의 농도로 상기 세포와 함께 인큐베이션시켰다. 밤새 인큐베이션시킨 후, L929 세포 세포독성 분석에 대해 기술된 바와 같이 세포 생존률을 측정하였다. 결과는 다양한 양의 dAb를 이용한 인큐베이션이 배양에서 비-생존 세포의 수를 증가시키지 않았음을 나타내었다. 10 nM, 1 nM 및 0.1 nM의 시판되는 항-TNFR1 IgG 항체를 이용한 L929 세포의 인큐베이션은 비-생존 세포를 용량 의존적으로 증가시켰고, 이는 TNFR1 매개 효능화에 대한 이들 세포의 민감성을 입증한다 (도 26).
실시예 15. 만성 염증 질병의 모델
A. 마우스의 콜라겐에 의해 유발된 관절염 모델
DBA/1 마우스에 아르트로겐(Arthrogen)-CIA 애쥬번트 및 아르트로겐-CIA 콜라겐의 에멀젼 (MD-biosciences)을 1회 주사하였다. 21일째에, 높은 관절염 스코어를 지니는 동물을 연구로부터 배제시키고, 나머지 동물을 동일한 수의 수컷 및 암컷 동물로 10개의 그룹으로 나누었다. 21일째에, 염수, ENBREL® (entarecept; Immunex Corporation) 또는 TAR2m-21-23 40k PEG를 복막내 주사하여 치료를 시작하고, 28일까지 지속시켰다. 0 내지 4의 스케일의 임상 관절염 스코어를 동물의 4개의 사지의 각각에 대해 평가하고, 0의 스코어를 정상적인 사지로 지정하고, 4의 스코어를 다관절을 포함하는 최대로 염증이 발생된 사지로 지정하였다.
16 내지 (a) 14-15, (b) 12-15, (c) 10-15, (d) 9-15, (e) 7-15, (f) 5-15, (g) 3-15 또는 (h) 1-15의 최대치로부터의 4개의 사지의 관절염 스코어의 합산의 감소가 본 모델에서 이로운 효과이다. 발생될 수 있는 이로운 효과는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15의 4개의 사지의 관절염 스코어의 합산이다. 치료되지 않은 대조군과 비교하여 관절염 발병의 지연이 또한 본 모델에서 이로운 효과이다.
임상 스코어는 TAR2m-21-23 40k PEG를 이용한 치료가 염수 대조군과 비교하는 경우 관절염 발달의 억제의 매우 바람직한 효과를 지니고, 더욱이 TAR2m-21-23 40k PEG 처리가 ENBREL® (entarecept; Immunex Corporation)과 비교하여 바람직함을 명백히 입증한다. 이는 만성 염증 질병 모델의 치료에 효과적인 TNFR1의 억제의 최초의 입증이다.
B. 마우스 ΔARE 모델의 IBD 및 관절염
TNF mRNA의 3' AU-풍부 엘리먼트 (ARE) 내에서의 표적화된 결실을 지니는 마우스 (TnfΔARE 마우스로 언급됨)는 TNF를 과생성하고, 크론병과 조직병리학적으로 유사한 염증성 장질병을 발달시킨다 (Kontoyiannis et al., J Exp Med 196:1563-14 (2002)). 이러한 마우스에서, 크론 유사 질병은 4 내지 8주령 사이에 발달하고, 이러한 동물은 또한 류마티스 관절염의 임상 증상을 발달시킨다.
마우스 TNFR1에 결합하는 dAb를 TnfΔARE 마우스에서의 크론 유사 병리 및 관절염을 억제하는 효능에 대해 평가하였다. ENBREL® (entarecept; Immunex Corporation)을 포지티브 대조군으로 사용하였다. 상기 작용제를 표 13에 제시된 투여 및 투여량 방법에 따라 복막내 주사로 투여하였다.
연구된 dAbs는 하기를 포함한다:
1) 하나의 40 kD PEG 부분으로 페길화된 TAR2m-21-23;
2) 마우스 TNFR1 및 마우스 혈청 알부민에 결합하는 이중특이적 TAR2m-21-23 3U TAR7m-16.
표 13.
그룹 처리 용량 투여수 동물수
6 ENBREL® (entarecept; Immunex Corporation) (주당 3회 투여) 10 mg/kg 8 10
5 TAR2m-21-23 40 kD PEG (주당 2회 투여) 1 mg/kg 8 10
4 TAR2m-21-23 40 kD PEG (주당 2회 투여) 10 mg/kg 8 10
3 TAR2m-21-23 3U TAR7m-16 (주당 2회 투여) 1 mg/kg 8 10
2 TAR2m-21-23 3U TAR7m-16 (주당 2회 투여) 10 mg/kg 8 10
1 염수 NA 8 10
투여 기간 마지막에 임하여, 마우스를 희생시키고, 말단 회장 및 근위 결장을 분석을 위해 분리시켰다.
조직학적 분석을 위해, 조직 샘플을 절제하고, 헤마톡실린 및 에오신으로 염색시키고, 급성 및 만성 염증이 반-정량적 스코어 시스템을 이용하여 스코어링될 것이다. 스코어는 다음과 같이 지정될 것이다: 급성 염증 스코어 0 = 0-1개의 고전압장 당 다형핵 (PMN) 세포 (PMN/hpf); 1 = 점막 내의 2-10개의 PMN/hpf; 2 = 점막 내의 11-20개의 PMN/hpf; 3 = 점막 내의 21-30개의 PMN/hpf 또는 점막내근육 아래에 확장된 11-20개의 PMN/hpf; 4 = 점막 내의 >30개의 PMN/hpf 또는 점막내근육 아래에 확장된 >20개의 PMN/hpf; 만성 염증 스코어 0 = 점막 내의 0-10개의 hpf 당 단핵백혈구 (ML) (ML/hpf); 1 = 점막 내의 11-20개의 ML/hpf; 2 = 점막 내의 21-30개의 ML/hpf 또는 점막내근육 아래에 확장된 11-20개의 ML/hpf; 3 = 점막 내의 31-40개의 ML/hpf 또는 모낭 증식; 및 4 = 점막 내의 >40개의 ML/hpf 또는 점막내근육 아래에 확장된 >30개의 ML/hpf 또는 모낭 증식.
관절염의 대량표현형(macrophenotypic) 신호를 하기 시스템에 따라 매주 스코어링하였다: 0 = 관절염이 없음 (정상적인 외관 및 굴곡); 1 = 약한 관절염 (관절 염좌); 2 = 중등증의 관절염 (종창, 관절 변형); 3 = 중증 관절염 (심각하게 손상된 운동).
TAR2m-21-23 dAb는 40kD의 페길화된 단량체 (TAR2m21-23 40 KD PEG) 및 이중특이적 항-TNFR1/항-SA 포맷 (TAR2m-21-23 3U TAR7m-16) 둘 모두로서 델타 ARE 마우스 모델의 관절염에서 우수한 생체내 효능을 입증하였다. 9주째에, TAR2m-21-23 및 TAR2m-21-23 3U TAR7m-16 처리 그룹 둘 모두의 평균 관절염 스코어는 0.4 미만이었다. 대조적으로, 염수 대조군 그룹은 >1.0의 평균 관절염 스코어를 지니는 중등증 내지 중증 관절염을 나타내었다. 주당 2회 투여되는 TAR2m-21-23 및 TAR2m-21-23 3U TAR7m-16에 비해 주당 3회 투여되는 ENBREL® (entarecept; Immunex Corporation)로 치료된 그룹은 0.5 내지 1.0의 평균 스코어를 나타냈다. 이러한 결과는 TNFR1에 결합하는 dAb 포맷을 이용한 치료가 매우 효능적인 항-관절염 치료이고, 연구되는 페길화된 dAb 포맷 및 이중특이적 dAb 포맷 둘 모두가 만성 염증 질병에 대해 매우 효과적인 약물임을 나타낸다. 더욱이, 이들 결과는 TNFR1에 결합하는 dAb가 길항적인 방식으로만 수용체를 구속시키는 것을 추가로 입증한다.
C. IBD의 마우스 DSS 모델.
IBD는 음용수 내에 덱스트란 설페이트 나트륨 (DSS)을 투여함으로써 마우스에 도입될 것이다 (참조: Okayasu I. et al., Gastroenterology 98:694-702 (1990); Podolsky K., J Gasteroenterol. 38 suppl XV:63-66 (2003)). H.파이로리가 없는 성체 BDF1 마우스가 이들의 하루주기 리듬을 안정화시키기 위해 2주 동안 사육될 것이다. 모든 마우스는 12시간의 명암 주기로 특정무균 (SPF) 장벽 단위으로 개별적으로 환기되는 우리에 유지될 것이다. 동물은 음식 및 물에 자유롭게 접근가능할 것이다.
본 연구는 7일 동안 지속될 것이다. 음용수는 연구 기간 동안 5% DSS를 함유할 것이다. 모든 동물은 아침 (0900-1000) 및 저녁 (1600-1700)에 1-7일째에 치료될 것이다 (참조: 표 14). 1일은 단일 예방 용량에 상당한다. 모든 동물은 매일 칭량되고, 임의의 설사는 기록될 것이다. 모든 동물은 마지막 치료 후 24시간 째에 희생될 것이고, 희생 40분 전에 브로모데옥시우리딘의 적용량이 투여될 것이다. 원위의 대장이 동물로부터 분리될 것이다. 원위의 대장의 작은 샘플이 "알앤에이레이터(RNAlater)"에 놓여질 것이고, 나머지는 카노이 고정액 (Carnoy's fixative)에 고정되고, 파라핀에 엠베딩(embedding)되고, 절단되고 (슬라이드당 비연속적 절단), 헤마톡실린 및 에오신으로 염색될 것이다. 절단물은 IBD 중증도 및 지정된 중증도 스코어에 대해 시작적으로 평가될 것이다. 조직학적 분석이 수행될 것이고, 평균 병변 영역 (궤양 영역), 평균 상피 영역, 및 평균 벽내 염증 영역이 결정될 것이다.
영역의 정확한 정량화를 가능하게 하는 제이스 액시오홈 (Zeiss Axiohome) 현미경을 이용하여 일련의 조직 치수를 기록하기 위해 대장의 H&E 교차 절단을 이용하였다. 각각의 교차 절단을 위해, 내피 및 고유판의 영역 및 결합조직의 영역이 측정될 것이다. 이후, 내피 영역이 각각 측정될 것이고, 이는 고유판의 영역과 차이를 나타낼 것이다. 정상 조직에서, 상기 영역에 대한 상기 조직의 상대 분포는 약 10%이나, 이는 염증이 증가함에 따라 증가한다. 따라서, 상피:고유판의 상대비는 변화한다.
중증도가 증가하면, 상기 영역의 깊이가 좁아지고 (궤양화에 기여함), 결장의 길이가 짧아진다. 이러한 현상과 함께, 관강의 교차 절단 영역이 증가한다. 따라서, 이러한 파라미터는 또한 질병 중증도에 있어서 유용한 측정법이 될 것이다.
조직 샘플은 현미경적으로 관찰될 수 있고, 다음과 같이 중증도 스코어로 지정될 수 있다: 0 = 염증이 없음; 1 = 크립트 베이스(crypt base) 주위의 약한 염증; 2 = 대량의 염증 침윤, 및 분열된 점막 구조; 3 = 대량의 염증 침윤, 및 분열된 점막 구조 및 궤양화.
효능은 본 모델에서 치료가 염수 대조 그룹의 중증도 스코어에 비해 중증도 스코어를 감소시키는 경우를 나타낸다. 예를들어, 치료 그룹의 중증도 스코어는 0.1 내지 약 1, 1 내지 약 2, 또는 2 내지 약 3으로 감소될 수 있다. 효능은 약 2 이하, 1 내지 약 2, 또는 1 이하의 스코어로 나타낼 수 있다.
9개 그룹의 6 마리의 동물이 하기와 같이 치료될 것이다:
표 14.
그룹
1 음용수중 DSS
2 음용수중 DSS + 복막내 PEG TAR2m-21-23, 10 mg/kg 1x/d
3 음용수중 DSS + 복막내 PEG TAR2m-21-23, 1 mg/kg 1x/d
4 음용수중 DSS + 복막내 염수
5 음용수중 DSS + 경구 위관영양 PEG TAR2m-21-23, 0.25 mg/동물 2x/d
6 음용수중 DSS + 경구 위관영양 염수
7 음용수중 DSS + 복막내 투여 포지티브 대조군, 예를들어 스테로이드
8 음용수중 DSS + 경구 위관영양 포지티브 대조군, 예를들어 5'아미노살리실산 또는 유사물질
9 미치료 동물
경구 위관영양은 ZANTAC® (라니티딘 히드로클로라이드; GlaxoSmithKline)와 함께 제공될 것이다.
D. 만성 폐쇄폐병 (COPD)의 마우스 모델
마우스의 아만성 담배 연기 (TS) 모델에서의 질병의 진행에서의 항-TNFR1 dAb의 효능이 평가될 것이다 (참조: Wright JL and Churg A., Chest 122:306S-3O9S (2002)). 항-마우스 TNFR1 dAb은 48시간 마다 복막내 주사에 의해 투여될 것이고 (TS에 대한 최초 노출 24시간 전에 시작), 연장된 혈청 반감기 포맷 (예를들어, 항-SA dAb를 포함하는 페길화된 이중특이적 리간드)으로 제공될 것이다.
대안적으로, 항-TNFR1 dAb는 24시간 마다 비내 전달에 의해 투여될 것이고 (TS에 대한 최초 노출 4시간 전에 시작), 단량체 dAb로 제공될 것이다. ENBREL® (entarecept; Immunex Corporation)이 포지티브 대조군으로 사용될 것이다. TS 노출은 매일 수행될 것이고, 상기 연구는 1-2주 동안 지속될 것이다 (참조: Vitalis et al., Eur. Respir. J, 77:664-669 (1998)). 지속적인 TS 노출 후, 기관지 폐포 세척물이 호중구, 호산구, 대식구 및 T 림프구 서브셋을 포함하는 전체 및 미분적 세포 계수에 대해 분석될 것이다. 폐엽이 10% 완충 포르말린에 고정될 것이고, 조직 절단물이 폐포 및 폐포관의 확장, 소기도벽의 굵어짐 및 호중구, 호산구, 대식구 및 T 림프구 서브셋을 포함하는 세포 계수에 대해 분석될 것이다. TS 노출에 의해 상승되는 호중구, 호산구, 대식구 및 T 림프구 서브셋의 수의 감소, 및 TS에 의해 유발된 폐포 및 폐포관의 확장 및 소기도벽의 굵어짐의 감소에 의해 효과가 명백해질 것이다.
실시예 16. 재조합 키메라 TNFR1 분자의 작제 및 발현
본 실시예는 상이한 뮤린 TNFR1 도메인 인간 TNFR1 도메인으로 구성된 분자를 생성시키는 방법 (Banner DW, et al. Cell, 75(3):431-45 (1993)을 설명하고, 상기 분자는 TNFR1의 네개의 정의된 세포외 도메인을 함유하나, 이들은 마우스 및 인간 TNFR1 단백질 사이의 유래에서 다양하다. 생성된 키메라 수용체는 상이한 도메인 역할 및 기능에 따라 인간 TNFR1 및 마우스 TNFR1 둘 모두의 특성을 공유한다. 상기 분자는 인간 또는 마우스 TNFR1에 결합하는 dAb, 항체 및 이의 항원 결합 단편 및 기타 분자 (예를들어, 유기 화학 화합물, NCE; 또는 단백질 도메인, 예를들어 어피바디, LDL 수용체 도메인 또는 EGF 도메인)의 도메인 특이성의 평가를 위한 수단을 제공한다.
방법
인간 및 마우스 TNFR1 서열을 EcoRⅠ 및 NotⅠ 제한 엔도누클레아제 부위를 통해 피키아 (Pichia) 발현 벡터 pPicZalpha Invitrogen)로 미리 클로닝시켰다. 주형 마우스 TNFR1 DNA (및 이에따른 뮤린 도메인 4를 엔코딩하는 키메라 수용체 작제물)은 3' 6x 히스티딘 태그를 함유하였다. 인간 TNFR1 (및 이에따른 인간 도메인 4를 엔코딩하는 키메라 수용체 작제물)은 3 말단의 서열 내에 Myc 및 6x 히스티딘 태그 둘 모두를 함유하였다.
RubyTaq DNA 중합효소 (USB Corporation, Cleveland, Ohio), 100 ng의 주형 DNA (전장의 mTNFR1 또는 hTNFR1 DNA의 관련 DNA 미니프렙 주형을 포함함)를 이용하여 표준 PCR 조건에 따라 최초 PCR을 수행하였다.
통상적인 PCR 반응을 하기와 같이 설정하였다: 중합효소를 함유하는 25μl의 1OX RubyTaq PCR 완충용액; 2μl의 제 1 프라이머 (10μM 스톡으로부터); 2μl의 제 2 프라이머 (10μM 스톡으로부터); 1μl (100 ng) 전장의 TNFR1 주형 DNA; 20μl의 dH2O (50μl의 최종 부피로). 반응물을 얇은 벽의 튜브에 두고, 하기의 파라미터에 따라 반응이 수행되는 열순환기에 두었다.
최초 변성 3분 94℃
변성 어닐링 (25 주기) 신장 30초 94℃
30초 55℃
1분 72℃
최종 신장 10분 72℃
키메라 작제물의 생성에 사용되는 최초 PCR 반응의 개요
작제물* PCR 수 - 사용된 프라이머 주형
MHHH PCR 1- 1 및 12 마우스
PCR 2 - 2 및 3 인간
HMHH PCR 1 - 1 및 9 인간
PCR 2 - 6 및 13 마우스
PCR 3 - 2 및 4 인간
HHMH PCR 1 - 1 및 10 인간
PCR 2 - 7 및 14 마우스
PCR 3 - 2 및 5 인간
HHHM PCR 1 - 1 및 11 인간
PCR 2 - 2 및 8 마우스
HMMM PCR 1 -1 및 9 인간
PCR 2 - 2 및 6 마우스
* 기호: H = 인간 도메인; M = 마우스 도메인; 예를들어, MHHH = 마우스 도메인 1, 인간 도메인 2-4.
이러한 최초 PCR에서 생성된 PCR 생성물을 1% 아가로오스 젤로부터 절단하여, 젤 정제 키트 (Qiagen)를 이용하여 정제하고, 50μl의 dH20로 용리시켰다.
키메라 TNFR1 작제물 생성에 사용된 프라이머
Figure 112007034140104-PCT00014
SOE PCR
어셈블리 PCR ('풀-스루(pull-through)' 또는 중첩 신장에 의한 스플라이싱 (SOE)로도 공지되어 있음, 참조: Gene, 15:77(1):61-8 (1989))은 제 1 PCR 생성물의 상보성 말단을 사용하여, 분해 또는 라이게이션 없이 제 1 PCR 생성물이 함께 생성되는 것을 가능케 한다. 이러한 과정 동안, 제 1 생성물이 함께 생성되고, 이들의 상보성 말단이 Taq DNA 중합효소 및 dNTP의 존재하에서 함께 어닐링되기 전에 변성된다. 여러 주기의 재어닐링 및 신장은 상보성 가닥의 필-인(fill-in) 및 전장 주형의 생성을 야기시킨다. 전장의 작제물 카세트를 플랭킹시키는 프라이머를 첨가하고, 통상적인 PCR을 수행하여 어셈블리된 생성물을 증폭시켰다. 상기 기술된 최초 PCR 생성물로부터 유래된 다양한 TNFR1 도메인을 함께 어닐링시키고 증폭시키기 위해 SOE PCR을 수행하였다. 어셈블리 SOE PCR을 하기와 같이 설정하였다: MgCl2를 함유하는 40μl의 10 x PCR 완충용액; ~2μl (100 ng)의 최초 PCR 1의 정제된 생성물; ~2μl (1OO ng)의 최초 PCR 2의 정제된 생성물; 36μl의 dH2O (80μl의 최종 부피). SOE 프라이머 혼합물을 어셈블리 단계 후 하기와 같이 첨가하였다: 2 μl의 5' 플랭킹 프라이머 (프라이머 1); 2μl의 3' 플랭킹 프라이머 (프라이머 2); 10μl의 1Ox PCR 완충용액; 6μl의 dH2O (20μl의 최종 부피).
하기 기술된 프로그램을 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. 최초 어셈블리 주기는 열순환기가 94℃에서 정지되도록 설정된 후 약 45분의 시간을 필요로 한다. 20μl의 프라이머 혼합물을 각각의 반응물에 첨가하고, 혼합하였다.
단계 1. 어셈블리
최초 변성 5분 94℃
변성 어닐링 (15 주기) 신장 1분 94℃
1분 55℃
1분 72℃
단계 2. 증폭 (94℃에서 정지, 프라이머 혼합물 첨가)
변성 어닐링 (25 주기) 신장 1분 94℃
1분 55℃
1분 72℃
PCR 생성물을 각각의 반응물의 3-5μl를 1% 아가로오스 젤에 영동시켜 확인하였다.
3) 피키아 발현 벡터로의 어셈블리된 TNFR1의 클로닝
pPicZalpha 벡터 (Invitrogen)를 EcoRI 및 NotI 효소로 순차적으로 분해하고, 크로마스핀 (Chromaspin) TE-1000 젤 여과 컬럼 (Clontech, Mountain View, CA)으로 정제시켰다.
4) 대장균으로의 TNFR1 키메라 작제물의 형질전환
라이게이션된 키메라 작제물을 HB2151 전기적격 대장균 세포로 형질전환시키고, 저염 LB 배지에서 1시간 동안 회수하고, 37℃에서 24시간 동안 0.25μg/ml의 ZEOCIN, 플레오마이신 D (Cayla, Toulouse, France)를 함유하는 항생물질 포뮬레이션을 지니는 저염 LB 아가 상에 플레이팅시켰다. 이후, 개별적 콜로니를 발현 벡터 내의 키메라 작제물의 정확한 서열을 확인하고, 각각의 키메라 작제물 벡터의 대규모 맥시프렙 (Maxiprep) 플라스미드 제조물을 제조하였다.
제조된 키메라 작제물의 누클레오티드 서열을 하기에 나타내었다. 키메라 작제물을 이들의 도메인의 기원에 따라 작명하였다 (좌측의 도메인 1로부터 우측의 도메인 4으로). 예를들어, HMMM은 인간 도메인 1 및 마우스 도메인 2-4를 함유한다. 마우스 도메인 4를 함유하는 키메라 단백질은 His 태그만을 지니며, 막횡단 영역과 도메인 4 사이의 스페이서 (spacer) 영역이 결핍되어 있다.
Figure 112007034140104-PCT00015
Figure 112007034140104-PCT00016
Figure 112007034140104-PCT00017
Figure 112007034140104-PCT00018
Figure 112007034140104-PCT00019
5) TNFR1 키메라 작제물의 제조 및 피키아 파스토리스로의 형질전환.
각각의 맥시프렘에 의해 생성된 플라스미드 DNA를 희귀한 절단 제한 엔도누클레아제 PmeⅠ으로 분해시켜, 피키아 형질전환 전에 선형화시켰다. 선형화된 DNA를 이후 페놀/클로로포름 추출에 의해 정제시키고, 에탄올 침전시키고, 30μl의 dH2O에 재현탁시켰다. 10μl의 선형화된 DNA 용액을 80μl의 전기적격 KM71H 피키아 세포와 5분 동안 혼합시키고, 1.5kV, 200Ω, 25μF에서 전기 천공시켰다. 세포를 YPDS를 이용하여 즉시 회수하고, 30℃에서 2시간 동안 인큐베이션시키고, 2일 동안 1OOμg/ml의 ZEOCIN, 플레오마이신 D (Cayla, Toulouse, France)를 함유하는 YPDS 아가 플레이트에 플레이팅시켰다.
6) 피키아에서의 작제물의 발현
각각의 작제물에 대한 개별적 형질전환체 콜로니를 시작 배양으로 5ml의 BMGY로 채집하여 넣고, 30℃에서 24시간 동안 성장시켰다. 이러한 배양물을 500 ml의 BMGY 배지에 접종시키고, 이를 30℃에서 24시간 동안 성장시키고, 실온에서 5분 동안 1500-3000g에서의 원심분리로 세포를 수거하였다. 이후, 세포를 100ml의 BMMY에 재현탁시키고, 메탄올 농도차를 증가시켜 4일 동안 성장시켰다 (1일에 0.5%, 2일에 1%, 3일에 1.5% 및 4일에 2%). 발현후, 15분 동안 330Og에서 배양물을 원심분리하여 상층액을 수거하였다.
7) 니켈 수지를 이용한 TNFR1 키메라 작제물의 정제
배양 상층액을 처음 10 mM의 최종 농도의 이미다졸 및 2x PBS를 첨가하여 완충처리하였다. His-태깅된 단백질을 니켈-NTA 수지를 첨가하여 실온에서 4시간 (진탕) 동안 배치 흡수시켰다. 이후, 상층액/수지 혼합물을 폴리-프렙 컬럼 (Biorad)으로 유동시켰다. 이후, 수지를 10 컬럼 부피의 2 x PBS로 세척하고, 250mM의 이미다졸 1x PBS를 이용하여 용리시켰다. 완충용액 교환 후, 키메라 작제물 발현을 EndoH 데글리코실라아제를 이용하여 데글리코실화시키고, SDS-PAGE로 확인하였다.
PCR 동안 사용된 주형 DNA 서열
인간 (호모 사피엔스) TNFR1 (세포외 영역 유전자은행 (Genbank) 등록번호 33991418)
Figure 112007034140104-PCT00020
인간 TNFR1의 엔코딩된 세포외 영역은 하기의 아미노산 서열을 지닌다.
Figure 112007034140104-PCT00021
뮤린 (무스 무스쿨루스) TNFR1 (세포외 영역 유전자은행 등록번호 31560798)
Figure 112007034140104-PCT00022
뮤린 (무스 무스쿨루스) TNFR1의 엔코딩된 세포외 영역은 하기의 아미노산 서열을 지닌다.
Figure 112007034140104-PCT00023
실시예 17. 항-TNFRl dAb의 도메인 특이성
본 실시예는 TNFR1에 결합하는 dAb의 도메인 특이성을 결정하기 위해 사용되는 방법을 기술한다. 상기 방법은 항체가 실시예 16에 기술된 과량의 키메라 분자로 인큐베이션되고 평형화된 후, 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 칩 표면 상에 고정된 완전한 인간 또는 마우스의 비오티닐화된 TNFR1에 결합하는 항체의 능력을 결정하는 SPR ('Detection of immuno-complex formation via surface plasmon resonance on gold-coated diffraction gratings.' Biosensors. 1987-88;3(4):211-25)을 이용한다. 이러한 분석에서, TNFR1 표면 상의 항-TNFR1 dAb의 유동은 SPR 신호를 발생시키고, 이는 SPR 칩 상에 고정된 TNFR1에 결합하는 dAb의 양을 나타낸다. dAb가 특정 dAb와 결합하는 TNFR1의 도메인(들)을 포함하는 키메라 분자로 미리 인큐베이션되고 평형화되는 경우, TNFR1 표면 상의 상기 혼합물의 유동은 dAb 단독에 비해 작은 SPR 신호를 발생시킬 것이다. 그러나, dAb가 특정 dAb와 결합하는 TNFR1의 도메인(들)을 포함하지 않는 키메라 분자로 미리 인큐베이션되고 평형화되는 경우, TNFR1 표면 상의 상기 혼합물은 dAb 단독을 이용하여 수득된 신호와 대략 비슷하다.
방법
1) SPR 칩 TNFR1 표면의 생성.
TNFR1 표면의 선택은 시험되는 항-TNFR1 dAb의 종 특이성에 의해 결정된다. 따라서, 항-인간 TNFR1 dAb를 인간 TNFR1로 코팅된 표면을 이용하여 평가하고, 항-마우스 TNFR1 dAb를 마우스 TNFR1로 코팅된 칩을 이용하여 평가하였다.
비오티닐화된 TNFR1를 적절한 SPR 완충용액에 희석시키고, 비아코어 3000 SPR 기계 (Biacore International AB, Uppsala, Sweden) 내의 스트렙타비딘 (SA) 센서 칩을 가로질러 작동시켰다. 비오티닐화된 TNFR1과 스트렙타비딘 표면 사이의 접촉 시간을 최대화하기 위해 낮은 유속 (5-10μl/분)을 이용하였다. 스트렙타비딘 표면이 비오티닐화된 물질로 포화될때까지 유동을 지속시켜, 최대 TNFR1 표면을 지닌 칩을 생성시켰다. 칩은 통상적으로 비오티닐화된 물질의 수백 내지 수천의 SPR 반응 유닛에 결합하였다.
2) SPR 칩에서의 항-TNFR1 반응의 적정
성공적인 경쟁 실험은 dAb의 최소량이 현저한 SPR 신호를 발생시키는 표면 위로 유동되도록 하는 항-TNFR1 dAb 농도의 최초 최적화를 필요로 한다. 특정 농도 범위 내에서, dAb는 dAb 결합의 RU의 수가 칩 표면을 가로질러 유동된 dAb의 농도를 반영하는 용량 의존 반식으로 표면에 결합할 것이다.
이러한 용량 의존물의 농도를 확인하기 위해, 항-TNFR1 dAb를 1/10 희석 내지 1/1,000,000 희석의 범위의 비아코어 완충용액의 일련의 10배의 연속적 희석으로 적정하였다. 이후, 희석액을 대부분의 희석 샘플로 시작하여, TNFR1 칩 표면을 가로질러 개별적으로 및 연속적으로 주입시켰다. 각각의 희석액에서 수득된 RU의 최대수를 측정하였다. 각각의 주입후, 필요시 적절한 SPR 재생 완충용액을 이용하여 결합된 항-TNFR1 dAb를 제거하기 위해 TNFR1 표면을 재생시켰다. 이러한 방법을 이용하여, 약 100RU를 나타내는 신호를 생성하는데 필요한 항-TNFR1 dAb의 최소 농도를 결정하였다.
3) 항-TNFR1 dAb/키메라의 예비 평형화
일단 최적 항-TNFR1 dAb 농도가 결정된 후, 항-TNFR1 dAb/키메라 TNFR1 혼합물을 제조하였다. 항-TNFR1 dAb의 최종 농도가 이전에 결정된 최적 농도와 동일하도록 혼합물을 구성시켰다. 통상적으로, 반응물을 50 마이크로리터의 2x 농도의 항-TNFR1 dAb, 40 마이크로리터의 비아코어 완충용액 및 10 마이크로리터의 순수한 정제된 키메라 단백질을 함유하는 100μl 부피로 제조하였다. 최종 혼합물에 대한 통상적 농도는 약 10-100μM의 키메라 단백질 및 약 10-100nM의 항-TNFR1 dAb이었다. 혼합물을 실온에 30분 동안 평형화되도록 두었다.
4) 경쟁 비아코어 실험
평형화 후, 각각의 항-TNFR1 dAb/키메라 TNFR1 혼합물을 TNFR1 SPR 표면상에서 연속적으로 작동시키고, 반응 유닛의 반응수를 측정하였다. 각각의 혼합물을 주입시키고, 다음 혼합물이 주입되기 전에 결합된 항-TNFR1 dAb를 제거하기 위해 표면을 재생시켰다. 상이한 키메라를 이용하여 생성된 상이한 반응은 특정 dAb에 의해 결합된 TNFR1 도메인의 결정을 가능하게 하였다.
이들 연구는 TAR2m-21-23이 마우스 TNFR1의 도메인 1에 결합하고, TAR2h-205가 인간 TNFR1의 도메인 1에 결합하고, TAR2h-10-27, TAR2h-131-8, TAR2h-15-8, TAR2h-35-4, TAR2h-154-7, TAR2h-154-10 및 TAR2h-185-25가 인간 TNFR1의 도메인 3에 결합하는 것을 나타내었다.
실시예 18. 스크리닝 방법
실시예 16에 기술된 이들 키메라 수용체 단백질은 TNFR1 내에서 특정 도메인에 결합하는 작용제 (예를들어, 항체, dAb, 화학적 화합물)을 분리시키기 위한 분석 또는 스크리닝에 사용될 수 있다. 간단히, 이들 방법은 ELISA 또는 표면 플라즈몬 공명에 의해 TNFR1 결합을 스크리닝하기 전에 미정제 항체 제조물에 키메라 항체를 첨가하는 것을 기술한다. 추가로, 이들은 표면 (예를들어, ELISA 플레이트 또는 SPR 칩) 상에 코팅된 키메라 단백질의 사용 및 상기 표면 상의 키메라 단백질로의 결합의 시험을 통한 항체의 스크리닝을 기술한다.
1) 가용성 ELISA 스크리닝
본 방법은 공지되지 않은 특이성의 항체 또는 항체 단편의 방대한 레퍼토리로부터 TNFR1의 특정 도메인에 결합하는 항체 또는 항체 단편 (예를들어, dAb)을 신속하게 분리시키기 위해 사용될 수 있다.
96 웰 분석 플레이트는 웰당 lOOμl의 키메라 TNFR1로 4℃에서 밤새 코팅될 것이다. 웰은 0.1% TPBS (0.1%의 농도로 Tween-20을 함유하는 인산염 완충 식염수)로 3회 세척될 것이다. 웰당 200μl의 1% TPBS가 플레이트를 블로킹하기 위해 첨가될 것이고, 플레이트는 실온에서 1-2시간 동안 인큐베이션될 것이다. 이후, 웰은 PBS로 3회 세척되고, 50μl의 0.2% TPBS 중에 가용성 항체 또는 항체 단편 (c-Myc 에피토프 태그 함유)를 함유하는 50μl의 박테리아 상층액 또는 페리프렙이 첨가될 것이다. 이후, 플레이트는 실온에서 1시간 동안 인큐베이션될 것이다. 이후, 플레이트는 0.1% TPBS (PBS중 0.1% Tween-20)로 5회 세척될 것이다. 이후, lOOμl의 제 1 항-c-Myc 마우스 모노클로날이 각각의 웰에 0.1% TPBS로 첨가될 것이고, 상기 플레이트는 실온에서 1시간 동안 인큐베이션될 것이다. 상기 제 1 항체 용액은 폐기될 것이고, 이후 플레이트는 0.1% TPBS로 5회 세척될 것이다. 이후, 염소로부터의 lOOμl의 미리희석된 항-마우스 IgG (Fc 특이적) HRP 컨쥬게이트 (Sigma Cat No: AOl 68)가 첨가되고, 플레이트가 실온에서 1시간 동인 인큐베이션될 것이다. 이후, 제 2 항체가 폐기되고, 플레이트가 0.1% TPBS로 6회 세척된 후, PBS로 2회 세척될 것이다. 이후, 50μl의 TMB 과산화효소 용액이 각각의 웰에 첨가되고, 플레이트가 2-60분 동안 실온에 방치될 것이다. 50μl의 1M 염산이 첨가되어 반응이 정지될 것이다. 플레이트의 450nm에서의 OD가 산 첨가후 30분 이내에 96-웰 플레이트 판독기에서 판독될 것이다. 키메라 단백질 내에 존재하는 TNFR1의 도메인에 결합하는, 미정제 박테리아 상층액 또는 페리프렙으로 존재하는 상기 항체들은 그렇지 않은 항체 보다 강한 ELISA 신호를 발생시킬 것이다.
2) 경쟁적 ELISA 스크리닝
본 방법은 도메인 결합 특이성을 결정하기 위해 다양한 세트의 TNFR1에 결합하는 미정제 항체 또는 항체 단편 제조물을 신속하게 스크리닝하는데 사용될 수 있다.
96웰 분석 플레이트는 웰당 lOOμl의 뮤린 또는 인간 TNFR1 (인간 또는 마우스)로 4℃에서 밤새 코팅될 것이다. 웰은 0.1% TPBS (0.1%의 농도로 Tween-20을 함유하는 인산염 완충 식염수)로 3회 세척될 것이다. 웰당 200μl의 1% TPBS (PBS중 1% Tween-20)가 플레이트를 블로킹하기 위해 첨가될 것이고, 플레이트는 실온에서 1-2시간 동안 인큐베이션될 것이다. 이후, 웰은 PBS로 3회 세척될 것이다. 동시에, 박테리아 상층액 또는 페리프렙이 미리 최적화된 농도의 용액 중의 키메라 TNFR1 단백질로 미리 평형화될 것이다. 이후, 가용성 항체 또는 항체 단편을 함유하는 50μl의 이러한 미정제 박테리아/키메라 단백질 혼합물이 ELISA 플레이트에 첨가될 것이다. 플레이트는 실온에서 1시간 동안 인큐베이션될 것이다. 이후, 플레이트는 0.1% TPBS (PBS중 0.1% Tween-20)로 5회 세척되고, lOOμl의 제 1 검출 항체 (또는 단백질 A-HRP 또는 단백질 L HRP)이 각각의 웰에 0.1% TPBS로 첨가되고, 플레이트는 실온에서 1시간 동안 인큐베이션될 것이다. 이러한 제 1 항체 용액은 폐기되고, 플레이트는 0.1% TPBS로 5회 세척될 것이다. 요망되는 경우, 염소로부터의 1OOμl의 미리 희석된 제 2 항체/HRP 컨쥬게이트가 첨가될 것이고, 플레이트는 실온에서 1시간 동안 인큐베이션될 것이다. 이후, 제 2 항체는 폐기되고, 플레이트는 0.1% TPBS로 6회 세척된 후, PBS로 2회 세척될 것이다. 50μl의 TMB 과산화효소 용액이 각각의 웰에 첨가될 것이고, 플레이트가 2-60분 동안 실온에 방치될 것이다. 50μl의 1M 염산이 첨가되어 반응이 중지될 것이다. 플레이트의 450 nm에서의 OD가 산 첨가후 30분 이내에 96-웰 플레이트 판독기에서 판독될 것이다. ELISA 신호의 감소는 플레이트 상에 코팅된 완전한 TNFR1이 아닌 키메라 TNFR1 도메인에 대한 항체 결합을 나타내는 것으로, 키메라 항체 내의 도메인중 하나에 결합하는 것을 나타낸다.
3) TNFR1에 대한 결합에서 참조 항체 또는 항체 단편과의 경쟁하는 항체 및 항체 단편에 대한 경쟁적 ELISA 스크리닝
본 방법은 TNFR1에 대한 결합에서 참조 항체 또는 항체 단편 (예를들어, TAR2m-21-23)과 경쟁하는 항체 또는 항체 단편에 대해 TNFR1에 결합하거나 TNFR1의 요망되는 도메인 (예를들어, 도메인 1)에 결합하는 다양한 세트의 미정제 항체 또는 항체 단편 제조물을 신속하게 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다. 상기 방법은 상이한 검출가능한 태그 (에피토프 태그)를 함유하는 참조 항체 또는 항체 단편 및 시험 항체 또는 항체 단편 (예를들어, 스크리닝되는 항체의 집단)을 사용한다.
96웰 분석 플레이트는 웰당 lOOμl의 뮤린 또는 인간 TNFR1로 4℃에서 밤새 코팅될 것이다. 웰은 0.1% TPBS (0.1%의 농도로 Tween-20을 함유하는 인산염 완충 식염수)로 3회 세척될 것이다. 웰당 200μl의 1% TPBS (PBS중 1% Tween-20)가 플레이트를 블로킹하기 위해 첨가될 것이고, 플레이트는 실온에서 1-2시간 동안 인큐베이션될 것이다. 이후, 웰은 PBS로 3회 세척될 것이다. 동시에, 시험되는 미정제 항체 제조물이 용액 중의 미리 최적화된 농도의 참조 항체 또는 항체 단편 (예를들어, 도메인 1-결합 항체; TAR2m-21-23)과 함께 혼합될 것이다. 이미 언급한 바와 같이, 이러한 항체는 도메인 결합 특이성에 대해 스크리닝되는 항체 내에 존재하는 바와 같은 동일한 검출 태그를 포함하지 않는 것이 중요하다. 50μl의 이러한 미정제 항체/참조 항체 혼합물이 ELISA 플레이트에 첨가될 것이다. 이후, 플레이트는 실온에서 1시간 동안 인큐베이션될 것이다. 이후, 플레이트는 0.1% TPBS로 5회 세척될 것이고, lOOμl의 제 1 검출 항체 (스크리닝되는 항체 집단 내에서만 존재하는 태그에 결합함)가 각각의 웰에 0.1% TPBS로 첨가될 것이고, 플레이트는 실온에서 1시간 동안 인큐베이션될 것이다. 이러한 제 1 항체 용액은 폐기될 것이고, 플레이트는 0.1% TPBS로 5회 세척될 것이다. 제 1 검출 항체를 인식하는 10Oμl의 미리 희석된 제 2 항체-HRP 컨쥬게이트가 첨가될 것이고, 플레이트는 실온에서 1시간 동안 인큐베이션될 것이다. 이후, 제 2 항체 용액은 폐기될 것이고, 플레이트는 0.1% TPBS로 6회 세척된 후 PBS로 2회 세척될 것이다. 이후, 50μl의 TMB 과산화효소 용액이 각각의 웰에 첨가될 것이고, 플레이트는 2-60분 동안 실온에 방치될 것이다. 50μl의 1M 염산을 첨가하여 반응이 중지될 것이다. 플레이트의 450 nm에서의 OD가 산 첨가후 30분 이내에 96-웰 플레이트 판독기에서 판독될 것이다. 상기 방법을 이용하나 참조 항체 또는 항체 단편을 첨가하지 않는 별도의 병행 ELISA가 동시에 수행되어야 한다. 참조 항체 또는 항체 단편과 경쟁하지 않는 동일한 항체 제조물에 대한 ELISA 신호와 비교한 참조 항체 또는 항체 단편의 존재하에서의 ELISA 신호의 감소는 특정 항체 또는 항체 단편이 TNFR1에 대한 결합에서 참조 항체 또는 항체 단편과 경쟁하고, 참조 항체 또는 항체 단편과 동일한 TNFR1의 도메인에 결합함을 나타낸다.
4) SPR 스크리닝
상기 기술된 ELISA 방법은, 예를들어 비아코어 3000 SPR 기계 (Biacore International AB, Uppsala, Sweden)를 이용하여 표면 플라즈몬 공명을 이용하는 포맷에 용이하게 적합화될 수 있다. 일반적으로, 키메라 항체는 SPR 칩에 고정되거나, 키메라 항체는 항-TNFR1 항체 또는 항체 단편을 함유하는 미정제 박테리아 상층액을 이용하여 평형화될 것이고, 생성된 혼합물은 전장의 인간 TNFR1 또는 뮤린 TNFR1로 코팅된 SPR 칩 상에 유동될 것이다.
실시예 19. TAR2m21-23 이합체는 높은 결합성의 TNFR1 길항제이다.
실시예 8에 기술된 방법을 이용하여 카르복시 말단에서 cys 잔기를 함유하는 TAR2m21-23의 형태를 생성시킴으로써 TAR2m21-23 이합체를 제조하였다. 단백질 (TAR2m21-23 CYS)을 피키아에서 발현시키고, 스트림라인 (Streamline) 단백질 A를 이용하여 정제하였다. 비-환원 SDS-PAGE 분석은 ~40-50%의 단백질이 이합체로서 용액에 존재함을 나타내었다. 이합체를 젤 여과 크로마토그래피로 추가로 정제시켰다.
2mg의 단백질을 약 250μl 이하로 농축시키고, PBS로 미리 평형화된 수퍼덱스 (Superdex) 75 HR 젤 여과 컬럼 (Amersham Bioscience)에 적용시켰다. 컬럼을 0.5 ml/분의 유속으로 작동시키고, 0.5 ml의 분획을 수거하였다. 컬럼으로부터의 단백질의 용리를 280 nm에서 모니터하고, 이합체 함유 분획을 비-환원 SDS-PAGE로 확인하였다. 이합체를 함유하나, 단일 TAR2m-21-23 CYS를 함유하지 않는 분획을 조합시켰다. 조합된 분획을 농축시키고, 이합체 dAb의 효능을 L929 TNF 세포 세포독성 분석에서 결정하였다 (실시예 6).
TAR2m21-23 이합체의 생물학적 효능을 L929 세포독성 분석에서 단일 TAR2m-21-23에 대해 비교하였다. 이 분석에서, TAR2m21-23 단량체 및 TAR2m21-23 이합체에 의한 마우스 L929 세포의 TNF에 의해 유발된 세포독성의 억제를 평가하였고, 결과는 상기 분석에서 50%로 세포독성을 억제 (중화 용량 50, ND50)하는 dAb 단량체 또는 이합체의 농도로 발현되었다.
단량체 dAb는 상기 분석에서 약 600 pM의 ND50을 지녔다. 이합체화된 dAb (TAR2m21-23 이합체)의 ND50은 상기 분석에서 약 10배 낮았다 (약 60-70 pM의 ND50). 이러한 결과는 TAR2m21-23 이합체가 dAb 단량체에 비해 세포 표면 TNFR1에 대한 현저히 개선된 친화성을 지님을 나타낸다. 상기 결과는 TAR2m21-23 이합체가 세포 표면에서 두개의 별도의 TNFR1 분자에 동시에 결합하고, 다합체화에 대해 생성된 결합성에 영향을 주어 TNFR1의 억제를 개선시키는 것을 나타낸다.
이후, TNFR1 효능의 임의의 징후를 나타내는지, 즉 TNFR1의 가교를 야기시키고 세포내 신호전달 및 세포 사멸을 개시하는 능력을 나타내는지 확인하기 위해 이합체 포맷 (TAR2m21-23 이합체)을 시험하였다. 이는 TNF-α가 첨가되지 않는 변형된 L929 세포 세포독성 분석을 이용하여 달성되지만, 항-TNFR1 항체 또는 dAb 포맷을 이들이 dTNFR1을 효능화시키고 세포 사멸을 유도하는지 확인하기 위해 시험하였다. TNFR1의 효능제로 공지된 항-TNFR1 항체 AF-425-PB (R&D Systems), TNFR1의 보고된 길항제인 항-TNFR 1 항체 MAB430 (R&D Systems), 및 TAR2m-21-23 및 TAR2m21-23 이합체를 상기 분석에서 시험하였다.
항체 AF-425-PB는 TNFR1를 활성화시키고, 상기 분석에서 약 100pM의 ND50으로 세포독성을 유도하였다. 또한, 보고된 길항제인 항체 MAB430은 상기 분석에서 약 1OnM의 ND50으로 수용체 가교 및 세포 사멸을 야기하였다. 대조적으로, TAR2m-21-23 이합체는 매우 높은 농도 (>1 μM)로 존재하는 경우에도 상기 분석에서 임의의 세포 사멸을 야기시키지 않았다. 이들 결과는 TAR2m21-23 이합체가 TNFR1 효능제가 아님을 나타낸다.
상기 결과는 TNFR1에 결합하는 dAb의 이합체, 삼합체 또는 기타 다합체가 세포의 표면에서 발현된 TNFR1에 대해 매우 높은 결합성을 지니며 효과적인 TNFR1 길항제임을 나타낸다. 더욱이, 이러한 연구의 결과는 TNFR1의 도메인 1에 결합하는 dAb의 다합체, 예를들어 TAR2m21-23 이합체가 두개의 TNFR1 분자 (상기 분석에서 효능제로 작용하는 항체일 수 있음)에 결합할 수 있고, TNFR1 상의 도메인 또는 에피토프 표적 (도메인 1)으로의 결합이 TNFR1 신호전달의 개시에 요구되는 수용체 사슬의 밀접한 회합을 방지하는 것을 나타낸다. 이러한 특성은 세포 표면 상에서 TNFR1을 가교시킬 수 있고, TNFR1 신호전달 및 세포 사멸을 야기시키지 않는 2가 분자에 대해 유일무이하다.
실시예 20. 인간 TNFR1 및 마우스 TNFR1에 결합하는 dAb의 분리
공지된 서열의 dAb를 대장균에서 발현시키고, 단백질 A 스트림라인 수지로 정제시켰다. 트리스-글리신으로의 용리후, dAb를 비오티닐화된 인간 TNFR1이 고정 (유동 세포 2)되고 비오티닐화된 뮤린 TNFR1이 고정 (유동 세포 4)된 SPR 칩 상에 유동시켰다 (SPR 칩은 유사한 밀도로 인간 TNFR1 및 뮤린 TNFR1으로 코팅되었음). 유동 세포 1 및 3을 공백으로 두었고, 이는 비-특이적 결합의 검출 및 공제를 위한 항원 참조 표면으로 작용하지 않는다.
dAb를 측정된 유동 세포 2 및 1 사이의 반응 차이를 지니는 일련의 4개의 유동 세포 상 (유동 세포 1, 이후 2, 3, 최종적으로 4)에 유동시키고, 유동 세포 4와 3 사이의 반응 차이를 또한 측정하였다. 전자는 인간 TNFR1에 대한 결합의 측정이고, 후자는 뮤린 TNFR1에 대한 결합의 측정이다. 인간 TNFR1 및 뮤린 TNFR1 둘 모두에 대한 결합에 대한 특이적 결합 곡선을 기록하고, 결합 속도가 뮤린 TNFR1 보다 인간 TNFR1에 대해 보다 빠른 곡선의 특성을 기록하였다. 분리 속도는 대체로 유사하였다. 각각의 결합에 의해 최대로 달성된 반응 단위 (RU)의 수에 의해 가교성의 평가가 제공된다. 이러한 샘플에서, 인간의 비오티닐화된 TNFR1 표면은 유동 세포 2에서 약 900 RU의 TNFR1을 포함하는 반면, 유동 세포 4는 약 1400RU의 뮤린 TNFR1을 포함하였다. 대조군으로서 2 마이크로몰의 농도에서 385RU의 최대 반응으로 인간 표면에 결합하는 인간 특이적 dAb인 TAR2h-154-7는 단지 4.5R의 마우스 표면에 대한 반응을 발생시켰다. 2 마이크로몰의 TAR2h-205은 435RU의 인간 표면에 대한 반응 및 266RU의 마우스 표면에 대한 반응을 발생시켰다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 및 상기 간행물에 인용된 참조는 본원에 참조로서 포함되어 있다. 본 발명의 상기 기술된 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변화는 본 발명의 범위 및 사상을 벗어남이 없이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명은 특정한 바람직한 구체예로 기술되어 있으나, 청구되는 발명은 이러한 특정 구체예에 의해 과도학 제한되는 것이 아님을 이해해야 한다. 또한, 분자생물학 또는 관련 분야의 당업자에게 명백한 본 발명을 수행하기 위해 기술된 방법의 다양한변형은 하기의 청구항의 범위 내에 속한다.
부록 1: 생체내에서 반감기를 향상시키는 폴리펩티드
알파-1 당단백질 (오로소무코이드) (AAG)
알파-1 안티키로모트립신 (ACT)
알파-1 안티트립신 (AAT)
알파-1 마이크로글로불린 (단백질 HC) (AIM)
알파-2 마크로 글로불린 (A2M)
안티트롬빈 III (AT III)
아포지질단백질 A-1 (Apo A-1)
아포지질단백질 B (Apo B)
베타-2-마이크로글로불린 (B2M)
세룰로플라스민 (Cp)
보체 성분 (C3)
보체 성분 (C4)
C1 에스테라아제 억제제 (C1 INH)
C-반응성 단백질 (CRP)
시스타틴 C (Cys C)
페리틴 (FER)
피브리노겐 (FEB)
피브로넥틴 (FN)
햅토글로빈 (Hp)
헤모펙신 (HPX)
면역글로불린 A (IgA)
면역글로불린 D (IgD)
면역글로불린 E (IgE)
면역글로불린 G (IgG)
면역글로불린 M (IgM)
면역글로불린 광 사슬 (kapallambda)
리포단백질(a) [Lp(a)]
만노즈-결합 단백질 (MBP)
미오글로빈 (Myo)
플라스미노겐 (PSM)
프레알부민 (트랜스티레틴) (PAL)
레티놀-결합 단백질 (RBP)
레오마토이드 인자 (RIP)
혈청 아밀로이드 A (SAA)
용융성 트랜페린 수용체 (sTfR)
트랜스페린 (Tf)
부록 2
Figure 112007034140104-PCT00024
Figure 112007034140104-PCT00025
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부록 3: 종양학 조합
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Figure 112007034140104-PCT00035
부록 4:
데이타 요약
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Figure 112007034140104-PCT00037
Figure 112007034140104-PCT00038
SEQUENCE LISTING <110> Domantis Limited Brewis, Neil D. Woolven, Benjamin P. Holmes, Steve Tomlinson, Ian M. <120> ANTAGONISTS AND METHODS OF USE THEREFOR <130> P59533L-WO <140> PCT/GB2005/003873 <141> 2005-10-07 <150> 10/985,847 <151> 2004-11-10 <150> PCT/GB2004/004253 <151> 2003-10-08 <150> PCT/GB2003/005646 <151> 2003-12-24 <150> GB 0230202.4 <151> 2002-12-27 <150> GB 0327706.8 <151> 2003-11-28 <150> PCT/GB2003/002804 <151> 2003-06-30 <150> PCT/GB02/03014 <151> 2002-06-28 <160> 639 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 720 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaagttat 300 ggtgcttttg actactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcgagcgg tggaggcggt 360 tcaggcggag gtggcagcgg cggtggcggg tcgacggaca tccagatgac ccagtctcca 420 tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga gtcaccatca cttgccgggc aagtcagagc 480 attagcagct atttaaattg gtatcagcag aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc 540 tatgctgcat ccagtttgca aagtggggtc ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg 600 acagatttca ctctcaccat cagcagtctg caacctgaag attttgcaac ttactactgt 660 caacagagtt acagtacccc taatacgttc ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaacgg 720 <210> 2 <211> 240 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ser Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Thr Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 130 135 140 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser 145 150 155 160 Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 165 170 175 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser 180 185 190 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 195 200 205 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr 210 215 220 Ser Thr Pro Asn Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 225 230 235 240 <210> 3 <211> 359 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Phagemide pIP1/pIT2 <400> 3 caggaaacag ctatgaccat gattacgcca agcttgcatg caaattctat ttcaaggaga 60 cagtcataat gaaataccta ttgcctacgg cagccgctgg attgttatta ctcgcggccc 120 agccggccat ggccgaggtg tttgactact ggggccaggg aaccctggtc accgtctcga 180 gcggtggagg cggttcaggc ggaggtggca gcggcggtgg cgggtcgacg gacatccaga 240 tgacccaggc ggccgcagaa caaaaactcc atcatcatca ccatcacggg gccgcaatct 300 cagaagagga tctgaatggg gccgcataga ctgttgaaag ttgtttagca aaacctcat 359 <210> 4 <211> 96 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> phagemide pIP1/pIT2 <400> 4 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Gln Pro Ala Met Ala Glu Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 20 25 30 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 45 Gly Gly Gly Gly Ser Thr Asp Ile Gln Met Thr Gln Ala Ala Ala Glu 50 55 60 Gln Lys Leu His His His His His His Gly Ala Ala Ile Ser Glu Glu 65 70 75 80 Asp Leu Asn Gly Ala Ala Thr Val Glu Ser Cys Leu Ala Lys Pro His 85 90 95 <210> 5 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 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<400> 9 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Pro Ala Ser Gly Leu His Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Gly Leu Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 10 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Asp Ile Glu Arg Thr Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala 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Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Leu Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Trp Trp Leu Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 19 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ser Leu Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Val Tyr Asp Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 20 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgtgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaagttat 300 ggtgcttttg actactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 21 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 gctcgagacg gtgaccaggg ttccctggcc ccagtagtca aaagcaccat aacttttcgc 60 acagtaatat accgcggtgt cctcggcacg caggctgttc atttgcagat acagcgtgtt 120 cttggaattg tcacgggaga tggtgaaccg gcccttcacg gagtctgcgt agtatgtgct 180 accaccacta ccactaatag ctgagaccca ctctagaccc ttccctggag cctggcggac 240 ccagctcatg gcatagctgc taaaggtgaa tccggaggct gcacaggaga gacgcaggga 300 ccccccaggc tgtaccaagc ctcccccaga ctccaacagc tgcacctc 348 <210> 22 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> 103, 104, 105, 106 <223> Xaa = Any Amino Acid <400> 22 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ser Tyr Gly Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 23 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> 309, 312, 315, 318 <223> K = G or T <221> misc_feature <222> 307, 308, 310, 311, 313, 314, 316, 317 <223> n = A,T,C or G <400> 23 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgtgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaagttat 300 ggtgctnnkn nknnknnktt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcgagc 360 <210> 24 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> 43, 46, 49, 52 <223> K = G or T <221> misc_feature <222> 44, 45, 47, 48, 50, 51, 53, 54 <223> n = A,T,C or G <400> 24 gctcgagacg gtgaccaggg ttccctggcc ccagtagtca aaknnknnkn nknnagcacc 60 ataacttttc gcacagtaat ataccgcggt gtcctcggca cgcaggctgt tcatttgcag 120 atacagcgtg ttcttggaat tgtcacggga gatggtgaac cggcccttca cggagtctgc 180 gtagtatgtg ctaccaccac taccactaat agctgagacc cactctagac ccttccctgg 240 agcctggcgg acccagctca tggcatagct gctaaaggtg aatccggagg ctgcacagga 300 gagacgcagg gaccccccag gctgtaccaa gcctccccca gactccaaca gctgcacctc 360 <210> 25 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag agttacagta cccctaatac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 26 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 ccgtttgatt tccaccttgg tcccttggcc gaacgtatta ggggtactgt aactctgttg 60 acagtagtac gtagcaaaat cttcaggttg cagactgctg atggtgagag tgaaatctgt 120 cccagatcca ctgccactga aacgtgatgg gaccccactt tgcaaactgg atgcagcata 180 gatcaggagc ttaggggctt tccctggttt ctgctggtac caatttaaat agctgctaat 240 gctctgactt gcccggcaag tgatggtgac acggtctcct acagatgcag acagggagga 300 tggagactgg gtcatctgga tgtc 324 <210> 27 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattatt aagcatttaa agtggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatggt gcatcccggt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag ggggctcggt ggcctcagac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 28 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ile Lys His 20 25 30 Leu Lys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ala Arg Trp Pro Gln 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 29 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcatttat tatcatttaa agtggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctataag gcatccacgt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag gttcggaagg tgcctcggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 30 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Tyr His 20 25 30 Leu Lys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Arg Lys Val Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 31 <211> 120 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 31 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Trp Tyr 20 25 30 Trp Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe 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ccctggtcac cgtctcgagc 360 <210> 100 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 100 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt gcttataata tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcattt attgatatgt atggtgctaa gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcagatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaactttgt 300 ttgatggatt gttctgggga tatttttgac tactggggtc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcgagc 366 <210> 101 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 101 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttcct gctgatgaga tgtattgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaagt attggttggc cgggtggtgc tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaatatggt 300 cgtaattttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 102 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 102 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgat cagtatgata tgtcgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcactg attgatccga gcggtggtca tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcaaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaccggtt 300 ttttctgatt ggcctgcggt ggagtttgac tactggggtc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcgagc 366 <210> 103 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 103 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttggg aattatgata tgcagtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatct attgatggga ctggtggtac tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gcaagagact 300 aatgcgtttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 104 <211> 372 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 104 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttggt ggttatcaga tgggttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtcttgagtg ggtctcattt attgatttta ctggtgcgca tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaattgagt 300 gatgatctta ctttgcctga gcggtttccg tttgactact ggggtcaggg aaccctggtc 360 accgtctcga gc 372 <210> 105 <211> 369 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 105 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgct gattataata tgacttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatgg attgatcagg agggtgtttt tacatactac 180 gcagattccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaagatttt 300 tcggcggctg ttatgcttag gactagtttt gactactggg gtcagggaac cctggtcacc 360 gtctcgagc 369 <210> 106 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 106 gaggtgcagc 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tcctgtgcag cctccggatt cacctttact gagtataata tgggttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcattt attgggcatt ctggtcagca tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga atagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc ggaactgaat 300 aatttgatgt ttgactactg gggtcaggga accctggtca ccgtctcgag c 351 <210> 109 <211> 363 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 109 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttggt gagtataata tggcgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtcaagagtg ggtctcattt atttctacgg gtggtcatgt tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaattttcg 300 gtgcgtttta ggtcgagtat ttttgactac tggggtcagg gaaccctggt caccgtctcg 360 agc 363 <210> 110 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 110 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggata cacctttact gagtatacga 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gcctggaatg ggtgagccgt attgatagct atggccgtgg cacctattat 180 gcggatagcg tgaaaggccg ttttaccatt agccgtgata acagcaaaaa caccctgtat 240 ctgcagatga acagcctgcg tgcggaagat accgcggtgt attattgcgc gaaaattagc 300 cagtttggca gcaacgcgtt tgattattgg ggccagggca ccctggtgac cgtgagcagc 360 <210> 191 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 191 gaagtgcagc tgctggaaag cggcggcggc ctggtgcagc cgggcggcag cctgcgtctg 60 agctgcgcgg cgagcggctt tacctttacc cgttatagca tgggctggat tcgtcaggcg 120 ccgggcaaag gcctggaatg ggtgagccgt attgatagct atggccgtgg cacctattat 180 gcggatagcg tgaaaggccg ttttaccatt agccgtgata acagcaaaaa caccctgtat 240 ctgcagatga acagcctgcg tgcggaagat accgcggtgt attattgcgc gaaaattagc 300 cagtttggca gcaacgcgtt tgattattgg ggccagggca ccctggtgac cgtgagcagc 360 <210> 192 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 192 gaagtgcagc tgctggaaag cggcggcggc ctggtgcagc cgggcggcag cctgcgtctg 60 agctgcgcgg cgagcggctt tacctttacc cgttatagca tgggctgggt gcgtcaggcg 120 ccgggcaaag gcctggaatg ggtgagccgt attgatagct atggccgtgg cacctattat 180 gcggatagcg tgaaaggccg ttttaccatt agccgtgata acagcaaaaa caccctgtat 240 ctgcagatga acagcctgcg tgcggaagat accgcggtgt attattgcgc gaaaattagc 300 cagtttggca gcaacgcgtt tgattattgg ggccagggca ccgtggtgac cgtgagcagc 360 <210> 193 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 193 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Arg Ile Ser Asp Glu 20 25 30 Asp Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Tyr Gly Pro Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Ala Leu Glu Pro Leu Ser Glu Pro Leu Gly Phe Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 194 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 194 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt 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cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag attcagcata ttcctgtgac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 220 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 220 ccgtttgatt tccaccttgg tcccttggcc gaacgtcaca ggaatatgct gaatctgttg 60 acagtagtac gtagcaaaat cttcaggttg cagactgctg atggtgagag tgaaatctgt 120 cccagatcca ctgccactga aacgtgatgg gaccccactt tgcaaactgg atgcagcata 180 gatcaggagc ttaggggctt tccctggttt ctgctggtac caacataaaa tcggctaaat 240 gctctgactt gcccggcaag tgatggtgac acggtctcct acagatgcag acagggagga 300 tggagactgg gtcatctgga tgtc 324 <210> 221 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 221 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asp Leu 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Thr Ala Ser Leu Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 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gcccggcaag tgatggtgac acggtctcct acagatgcag acagggagga 300 tggagactgg gtcatctgga tgtc 324 <210> 245 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 245 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Met Asp Lys 20 25 30 Leu Lys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ser Ile Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Ser Gly Gly Pro Asn Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 246 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 246 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattatg gataagttaa agtggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctattag gcatccattt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag gatagtgggg gtcctaatac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 247 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 247 ccgtttgatt tccaccttgg tcccttggcc gaacgtatta ggacccccac tatcctgttg 60 acagtagtac gtagcaaaat cttcaggttg cagactgctg atggtgagag tgaaatctgt 120 cccagatcca ctgccactga aacgtgatgg gaccccactt tgcaaaatgg atgcctaata 180 gatcaggagc ttaggggctt tccctggttt ctgctggtac cactttaact tatccataat 240 gctctgactt gcccggcaag tgatggtgac acggtctcct acagatgcag acagggagga 300 tggagactgg gtcatctgga tgtc 324 <210> 248 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 248 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Arg Asn 20 25 30 Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser His Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser 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ctaatagctg agacccactc tagacccttc cctggagcct ggcggaccca 240 aaacatctta tacccctaaa aggtgaatcc ggaggctgca caggagagac gcagggaccc 300 cccaggctgt accaagcctc ccccagactc caacagctgc acctc 345 <210> 275 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 275 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asp Tyr 20 25 30 Ala Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Ser Ser Asn Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Arg Val Arg Lys Arg Thr Pro Glu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 <210> 276 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 276 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttggg gattatgcta tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagtg attagttcga atggtgggag tacattttac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacgtgtt 300 cgtaagagga ctcctgagtt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcg 357 <210> 277 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 277 cgagacggtg accagggttc cctggcccca gtagtcaaac tcaggagtcc tcttacgaac 60 acgtttcgca cagtaatata ccgcggtgtc ctcggcacgc aggctgttca tttgcagata 120 cagcgtgttc ttggaattgt cgcgggagat ggtgaaccgg cccttcacgg agtctgcgta 180 aaatgtactc ccaccattcg aactaatcac tgagacccac tctagaccct tccctggagc 240 ctggcggacc caccacatag cataatcccc aaaggtgaat ccggaggctg cacaggagag 300 acgcagggac cccccaggct gtaccaagcc tcccccagac tccaacagct gcacctc 357 <210> 278 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 278 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Arg Tyr 20 25 30 Lys Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 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Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val 85 90 95 Val Trp Arg Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Cys Gly Ser Gly 115 <210> 634 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 634 tggagcgcgt cgacggacat ccagatgacc cagtctccat cctctctgtc tgcatctgta 60 ggagaccgtg tcaccatcac ttgccgggca agtcagagca ttgatagtta tttacattgg 120 taccagcaga aaccagggaa agcccctaag ctcctgatct atagtgcatc cgagttgcaa 180 agtggggtcc catcacgttt cagtggcagt ggatctggga cagatttcac tctcaccatc 240 agcagtctgc aacctgaaga ttttgctacg tactactgtc aacaggttgt gtggcgtcct 300 tttacgttcg gccaagggac caaggtggaa atcaaacggt gctaataagg atccggc 357 <210> 635 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 635 gccggatcct tattagcacc gtttgatttc caccttggtc ccttggccga acgtaaaagg 60 acgccacaca acctgttgac agtagtacgt agcaaaatct tcaggttgca gactgctgat 120 ggtgagagtg aaatctgtcc cagatccact gccactgaaa cgtgatggga ccccactttg 180 caactcggat gcactataga tcaggagctt aggggctttc cctggtttct gctggtacca 240 atgtaaataa ctatcaatgc tctgacttgc ccggcaagtg atggtgacac ggtctcctac 300 agatgcagac agagaggatg gagactgggt catctggatg tccgtcgacg cgctcca 357 <210> 636 <211> 774 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 636 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttaat aggtatagta tggggtggct ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacgg attgattctt atggtcgtgg tacatactac 180 gaagaccccg tgaagggccg gttcagcatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgccgtat attactgtgc gaaaatttct 300 cagtttgggt caaatgcgtt tgactactgg ggtcagggaa cccaggtcac cgtctcgagc 360 ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggcagc ggcggtggcg ggtcgacgga catccagatg 420 acccagtctc catcctccct gtctgcatct gtaggagacc gtgtcaccat cacttgccgg 480 gcaagtcaga gcattattaa gcatttaaag tggtaccagc agaaaccagg gaaagcccct 540 aagctcctga tctatggtgc atcccggttg caaagtgggg tcccatcacg tttcagtggc 600 agtggatctg ggacagattt cactctcacc atcagcagtc tgcaacctga agattttgct 660 acgtactact gtcaacaggg ggctcggtgg cctcagacgt tcggccaagg gaccaaggtg 720 gaaatcaaac gggcggccgc agaacaaaaa ctcatctcag aagaggatct gaat 774 <210> 637 <211> 258 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 637 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Arg Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Asp Ser Tyr Gly Arg Gly Thr Tyr Tyr Glu Asp Pro Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ile Ser Gln Phe Gly Ser Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro 130 135 140 Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg 145 150 155 160 Ala Ser Gln Ser Ile Ile Lys His Leu Lys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 165 170 175 Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Arg Leu Gln Ser 180 185 190 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 195 200 205 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 210 215 220 Gln Gln Gly Ala Arg Trp Pro Gln Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val 225 230 235 240 Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp 245 250 255 Leu Asn <210> 638 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VK-DLIBF primer <400> 638 cggccatggc gtcaacggac at 22 <210> 639 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VKXhO1R primer <400> 639 atgtgcgctc gagcgtttga ttt 23

Claims (241)

  1. 표면 플라즈몬 공명으로 측정시 50 nM 내지 20 pM의 해리 상수(Kd) 및 5x10-1 내지 1x10-7 s-1의 Koff 속도 상수로 인간 TNFR1으로부터 해리되는, 종양 괴사 인자 수용체 1 (TNFR1; p55)에 특이적인 dAb 단량체 리간드.
  2. 제 1항에 있어서, dAb 단량체가 500 nM 내지 50 pM의 IC50으로 TNFR1에 대한 종양 괴사 인자 알파 (TNFα)의 결합을 억제함을 특징으로 하는 dAb 단량체 리간드.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 단량체가 500 nM 내지 50 pM의 ND50으로 표준 L929 세포 분석에서 인간 TNFR1을 중화시킴을 특징으로 하는 dAb 단량체 리간드.
  4. 제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 있어서, dAb가 표준 세포 분석에서 ≤10μM의 농도에서 ≤100 nM의 ND50으로 TNFR1의 활성을 길항시키고, dAb가 표준 세포 분석에서 ≤5%로 TNFR1의 활성을 효능화(agonize)시킴을 특징으로 하는 dAb 단량체 리간드.
  5. 제 1항 내지 제 4항중 어느 한 항에 있어서, 유니버셜(universal) 프레임워크를 포함함을 특징으로 하는 dAb 단량체 리간드.
  6. 제 5항에 있어서, 유니버셜 프레임워크가 DPK9 VL 프레임워크, 또는 DP47, DP45 및 DP38로 구성된 군으로부터 선택된 VH 프레임워크를 포함함을 특징으로 하는 dAb 단량체 리간드.
  7. 제 1항 내지 제 7항중 어느 한 항에 있어서, 일반 리간드에 대한 결합 부위를 포함함을 특징으로 하는 dAb 단량체 리간드.
  8. 제 7항에 있어서, 일반 리간드가 단백질 A, 단백질 L 및 단백질 G로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 dAb 단량체 리간드.
  9. 제 1항 내지 제 8항중 어느 한 항에 있어서, dAb 단량체 리간드가 인간 점라인(germline) 항체 유전자 분절에 의해 엔코딩된 상응하는 프레임워크 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산을 포함하는 하나 이상의 프레임워크 영역을 지니는 항체 가변 도메인을 포함하거나, 하나 이상의 상기 프레임워크 영역의 아미노산 서열이 인간 점라인 항체 유전자 분절에 의해 엔코딩된 상응하는 프레임워크 영역의 아미노산 서열에 비해 5개 이하의 아미노산의 차이를 집합적으로 포함하는 하나 이 상의 프레임워크 영역의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 dAb 단량체 리간드.
  10. 제 1항 내지 제 8항중 어느 한 항에 있어서, 항체 가변 도메인을 포함하고, FW1, FW2, FW3 및 FW4의 아미노산 서열이 인간 점라인 항체 유전자 분절에 의해 엔코딩된 상응하는 프레임워크 영역의 아미노산 서열과 동일하거나, FW1, FW2, FW3 및 FW4의 아미노산 서열이 인간 점라인 항체 유전자 분절에 의해 엔코딩된 상응하는 프레임워크 영역의 아미노산 서열에 비해 10개 미만의 아미노산 차이를 집합적으로 포함함을 특징으로 하는 dAb 단량체 리간드.
  11. 제 1항 내지 제 8항중 어느 한 항에 있어서, FW1, FW2 및 FW3 영역을 포함하는 항체 가변 도메인을 포함하고, FW1, FW2 및 FW3 영역의 아미노산 서열이 인간 점라인 항체 유전자 분절에 의해 엔코딩된 상응하는 프레임워크 영역의 아미노산 서열과 동일함을 특징으로 하는 dAb 단량체 리간드.
  12. 제 9항 내지 제 11항중 어느 한 항에 있어서, 인간 점라인 항체 유전자 분절이 DP47, DP45, DP48 및 DPK9로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 dAb 단량체 리간드.
  13. 제 1항 내지 제 8항중 어느 한 항에 있어서, 카멜리드(Camelid) 면역글로불 린 가변 도메인이 아닌 VH 도메인을 포함함을 특징으로 하는 dAb 단량체 리간드.
  14. 제 1항 내지 제 8항중 어느 한 항에 있어서, 인간 VH 도메인과 비교하여 카멜리드 면역글로불린 가변 도메인에 특이적인 하나 이상의 아미노산을 함유하지 않는 VH 도메인을 포함함을 특징으로 하는 dAb 단량체 리간드.
  15. 제 1항 내지 제 14항중 어느 한 항에 있어서, 말단 Cys 잔기를 포함함을 특징으로 하는 dAb 단량체 리간드.
  16. 하나 이상의 제 1항 내지 제 15항중 어느 한 항에 따른 dAb 단량체 리간드를 포함하는 이중 특이적 리간드.
  17. 제 16항에 있어서, 다이머임을 특징으로 하는 이중 특이적 리간드.
  18. TAR2-10의 아미노산 서열 또는 이와 80% 이상이 상동성인 서열을 포함하는, 종양 괴사 인자 수용체 1 (TNFR1; p55)에 특이적인 dAb 단량체 리간드.
  19. 제 18항에 있어서, dAb가 TAR2-10의 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상이 상동성인 서열을 포함함을 특징으로 하는 dAb 단량체 리간드.
  20. TAR2-5의 아미노산 서열 또는 이와 80% 이상이 상동성인 서열을 포함하는, 종양 괴사 인자 수용체 1 (TNFR1; p55)에 특이적인 dAb 단량체 리간드.
  21. 제 20항에 있어서, dAb가 TAR2-5의 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상이 상동성인 서열을 포함함을 특징으로 하는 dAb 단량체 리간드.
  22. 표면 플라즈몬 공명으로 측정시 50 nM 내지 20 pM의 해리 상수(Kd) 및 5x10-1 내지 1x10-7 s-1의 Koff 속도 상수로 인간 TNFR1으로부터 해리되는, 종양 괴사 인자 수용체 1 (TNFR1; p55)에 특이적인 dAb 단량체 리간드를 엔코딩하는 분리된 핵산.
  23. 제 22항에 있어서, dAb 단량체 리간드 dAb가 TAR2-10의 아미노산 서열 또는 이와 80% 이상이 상동성인 서열을 포함함을 특징으로 하는 분리된 핵산.
  24. 제 22항에 있어서, dAb 단량체 리간드 dAb가 TAR2-5의 아미노산 서열 또는 이와 80% 이상이 상동성인 서열을 포함함을 특징으로 하는 분리된 핵산.
  25. 제 16항의 이중 특이적 리간드를 엔코딩하는 분리된 핵산.
  26. 표면 플라즈몬 공명으로 측정시 50 nM 내지 20 pM의 해리 상수(Kd) 및 5x10-1 내지 1x10-7 s-1의 Koff 속도 상수로 인간 TNFR1으로부터 해리되는, 종양 괴사 인자 수용체 1 (TNFR1; p55)에 특이적인 dAb 단량체 리간드를 엔코딩하는 재조합 핵산.
  27. 제 26항에 있어서, dAb 단량체 리간드 dAb가 TAR2-10의 아미노산 서열 또는 이와 80% 이상이 상동성인 서열을 포함함을 특징으로 하는 재조합 핵산.
  28. 제 26항에 있어서, dAb 단량체 리간드 dAb가 TAR2-5의 아미노산 서열 또는 이와 80% 이상이 상동성인 서열을 포함함을 특징으로 하는 재조합 핵산.
  29. 제 16항의 이중 특이적 리간드를 엔코딩하는 재조합 핵산.
  30. 제 26항 내지 제 28항중 어느 한 항의 재조합 핵산을 포함하는 벡터.
  31. 제 30항에 있어서, 재조합 핵산에 작동적으로 연결된 발현 조절 서열을 추가로 포함함을 특징으로 하는 벡터.
  32. 제 30항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  33. 재조합 핵산의 발현에 적합한 조건하에서 제 32항의 숙주 세포를 유지시킴으로써 dAb 단량체 리간드를 생성시키는 것을 포함하여, dAb 단량체 리간드를 생성시키는 방법.
  34. 제 33항에 있어서, dAb 단량체 리간드를 분리시키는 것을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 29항의 재조합 핵산을 포함하는 벡터.
  36. 제 35항에 있어서, 재조합 핵산에 작동적으로 연결된 발현 조절 서열을 추가로 포함함을 특징으로 하는 벡터.
  37. 제 36항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  38. 재조합 핵산의 발현에 적합한 조건하에서 제 37항의 숙주 세포를 유지시킴으로써 이중 특이적 리간드를 생성시키는 것을 포함하여, 이중 특이적 리간드를 생성시키는 방법.
  39. 제 33항에 있어서, 이중 특이적 리간드를 분리시킴을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  40. 표면 플라즈몬 공명으로 측정시 50 nM 내지 20 pM의 해리 상수(Kd) 및 5x10-1 내지 1x10-7 s-1의 Koff 속도 상수로 인간 TNFR1으로부터 해리되는, 종양 괴사 인자 수용체 1 (TNFR1; p55)에 특이적인 치료적 유효량의 dAb 단량체 리간드를 이를 필요로 하는 포유동물에 투여하는 것을 포함하여, 자가면역 질병을 치료하는 방법.
  41. 표면 플라즈몬 공명으로 측정시 50 nM 내지 20 pM의 해리 상수(Kd) 및 5x10-1 내지 1x10-7 s-1의 Koff 속도 상수로 인간 TNFR1으로부터 해리되는, 종양 괴사 인자 수용체 1 (TNFR1; p55)에 특이적인 치료적 유효량의 dAb 단량체 리간드를 포함하는 이중 특이적 리간드를 이를 필요로 하는 포유동물에 투여하는 것을 포함하여, 자가면역 질병을 치료하는 방법.
  42. 제 35항 또는 제 36항에 있어서, 자가면역 질병이 타입 Ⅰ 당뇨병, 천식, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 전신성홍반루푸스, 크론병 및 중증근무력증으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  43. 제 1항 내지 제 15항중 어느 한 항에 따른 dAb 단량체 및 약리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  44. 제 16항에 따른 이중 특이적 리간드 및 약리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  45. 종양 괴사 인자 2 (TNFR2)를 실질적으로 길항시키지 않고, 피검체의 만성 염증 질병 치료에 효과적인 종양 괴사 인자 1 (TNFR1)의 길항제.
  46. 제 45항에 있어서, 마우스의 콜라겐에 의해 유발된 관절염 모델, 마우스의 관절염의 ΔARE 모델, 마우스의 염증성 장질병의 ΔARE 모델, 마우스의 덱스트란 설페이트 나트륨에 의해 유발된 염증성 장질병 모델, 및 마우스의 만성 폐쇄폐병의 담배 연기 모델로 구성된 군으로부터 선택된 만성 염증 질병 모델에 효과적임을 특징으로 하는 길항제.
  47. 제 45항 또는 제 46항에 있어서, 길항제가 1가임을 특징으로 하는 길항제.
  48. 제 45항 내지 제 47항중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편임을 특징으로 하는 길항제.
  49. 제 48항에 있어서, 항체의 1가 항원 결합 단편임을 특징으로 하는 길항제.
  50. 제 45항 내지 제 47항중 어느 한 항에 있어서, 도메인 항체 단량체임을 특징으로 하는 길항제.
  51. 제 45항 내지 제 50항중 어느 한 항에 있어서, 300 nM 내지 5 pM의 Kd로 TNFR1에 결합함을 특징으로 하는 길항제.
  52. 종양 괴사 인자 수용체Ⅰ (TNFR1)에 특이적으로 결합하는 도메인 항체 (dAb) 단량체로서, 상기 dAb 단량체가 300 nM 내지 5 pM의 Kd로 TNFR1에 결합하고, 피검체의 만성 염증 질병 치료에 효과적인 도메인 항체 (dAb) 단량체.
  53. 제 52항에 있어서, dAb가 마우스의 콜라겐에 의해 유발된 관절염 모델, 마우스의 관절염의 ΔARE 모델, 마우스의 염증성 장질병의 ΔARE 모델, 마우스의 덱스트란 설페이트 나트륨에 의해 유발된 염증성 장질병 모델, 및 마우스의 만성 폐쇄폐병의 담배 연기 모델로 구성된 군으로부터 선택된 만성 염증 질병 모델에 효과적임을 특징으로 하는 dAb 단량체.
  54. 제 52항 또는 제 53항에 있어서, 종양 괴사 인자 2 (TNFR2)를 실질적으로 길항시키지 않음을 특징으로 하는 dAb 단량체.
  55. 제 52항 내지 제 54항중 어느 한 항에 있어서, 10 μM 이하의 농도로 존재하는 경우 표준 L929 세포 분석에서 TNFR1을 실질적으로 효능화시키지 않음을 특징으로 하는 dAb 단량체.
  56. 제 52항 내지 제 55항중 어느 한 항에 있어서, 500 nM 내지 50 pM의 IC50으로 TNFR1에 대한 종양 괴사 인자 알파 (TNFα)의 결합을 억제함을 특징으로 하는 dAb 단량체.
  57. 제 52항 내지 제 56항중 어느 한 항에 있어서, 대장균 (E. coli)에서 발현되는 경우 약 0.5 mg/L 이상의 양으로 분비됨을 특징으로 하는 dAb 단량체.
  58. 제 52항 내지 제 57항중 어느 한 항에 있어서, 온도 (Ts)로 가열하거나 온도 (Tc)로 냉각하는 경우 가역적으로 언폴딩(unfolding)되고, 여기서 Ts는 dAb 단량체의 용융 온도 (Tm)를 초과하는 온도이고, Tc는 dAb 단량체의 용융 온도 미만의 온도임을 특징으로 하는 dAb 단량체.
  59. 제 58항에 있어서, Ts가 약 80℃이고, Tc가 대략 실온임을 특징으로 하는 dAb 단량체.
  60. 제 52항 내지 제 59항중 어느 한 항에 있어서, TNFR1이 인간 TNFR1임을 특징으로 하는 dAb 단량체.
  61. 제 56항에 있어서, TNFα가 인간 TNFα이고, TNFR1이 인간 TNFR1임을 특징으로 하는 dAb 단량체.
  62. 제 52항 내지 제 61항중 어느 한 항에 있어서, dAb 단량체가 인간 VH 또는 인간 VL을 포함함을 특징으로 하는 dAb 단량체.
  63. 제 52항 내지 제 62항중 어느 한 항에 있어서, dAb 단량체의 프레임워크 영역 FWl, FW2, FW3 및 FW4중 하나 이상의 아미노산 서열이 인간 점라인 항체 유전자 분절에 의해 엔코딩된 상응하는 프레임워크 영역의 아미노산 서열과 동일하거나, 프레임워크 영역중 하나 이상의 아미노산 서열이 인간 점라인 항체 유전자 분절에 의해 엔코딩된 상응하는 프레임워크 영역의 아미노산에 비해 5개 이하의 아미노산의 차이를 집합적으로 포함함을 특징으로 하는 dAb 단량체.
  64. 제 52항 내지 제 62항중 어느 한 항에 있어서, dAb 단량체의 프레임워크 영 역 FWl, FW2, FW3 및 FW4의 아미노산 서열이 인간 점라인 항체 유전자 분절에 의해 엔코딩된 상응하는 프레임워크 영역의 아미노산 서열과 동일하거나, FWl, FW2, FW3 및 FW4의 아미노산 서열이 인간 점라인 항체 유전자 분절에 의해 엔코딩된 상응하는 프레임워크 영역의 아미노산에 비해 10개 이하의 아미노산의 차이를 집합적으로 포함함을 특징으로 하는 dAb 단량체.
  65. 제 52항 내지 제 62항중 어느 한 항에 있어서, FWl, FW2 및 FW3 영역을 포함하고, 상기 FWl, FW2 및 FW3 영역의 아미노산 서열이 인간 점라인 항체 유전자 분절에 의해 엔코딩된 상응하는 프레임워크 영역의 아미노산 서열과 동일함을 특징으로 하는 dAb 단량체.
  66. 제 63항 내지 제 65항중 어느 한 항에 있어서, 인간 점라인 항체 유전자 분절이 DP47, DP45, DP48 및 DPK9로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 dAb 단량체.
  67. 제 52항 내지 제 61항중 어느 한 항에 있어서, 카멜리드 면역글로불린 가변 도메인을 포함하지 않음을 특징으로 하는 dAb 단량체.
  68. 제 52항 내지 제 61항중 어느 한 항에 있어서, 카멜리드 점라인 항체 유전자 분절에 의해 엔코딩된 면역글로불린 가변 도메인에 대해 독특한 하나 이상의 프레 임워크 아미노산을 함유하지 않음을 특징으로 하는 dAb 단량체.
  69. 제 52항 내지 제 68항중 어느 한 항에 있어서, 말단 시스테인 잔기를 포함함을 특징으로 하는 dAb 단량체.
  70. 제 52항 내지 제 69항중 어느 한 항에 있어서, 폴리알킬렌 글리콜 부분을 추가로 포함함을 특징으로 하는 dAb 단량체.
  71. 제 70항에 있어서, 폴리알킬렌 글리콜 부분이 폴리에틸렌 글리콜 부분임을 특징으로 하는 dAb 단량체.
  72. 하나 이상의 제 52항 내지 제 71항중 어느 한 항의 dAb 단량체를 포함하는 다중특이적 리간드.
  73. 제 72항에 있어서, TNFR1에 결합하지 않는 하나 이상의 dAb 단량체를 포함함을 특징으로 하는 다중특이적 리간드.
  74. 제 72항에 있어서, 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 dAb 단량체를 포함함을 특징으로 하는 다중특이적 리간드.
  75. 하나 이상의 제 52항 내지 제 71항중 어느 한 항의 dAb 단량체를 포함하는 항체 포맷.
  76. 종양 괴사 인자 수용체 Ⅰ (TNFR1)에 특이적으로 결합하는 도메인 항체 (dAb) 단량체를 엔코딩하는 분리된 핵산으로서, 상기 dAb 단량체가 300 nM 내지 5 pM의 Kd로 TNFR1에 결합하고, 피검체의 만성 염증 질병을 치료하는데 효과적인 분리된 핵산.
  77. 제 76항에 있어서, dAb 단량체가 마우스의 콜라겐에 의해 유발된 관절염 모델, 마우스의 관절염의 ΔARE 모델, 마우스의 염증성 장질병의 ΔARE 모델, 마우스의 덱스트란 설페이트 나트륨에 의해 유발된 염증성 장질병 모델, 및 마우스의 만성 폐쇄폐병의 담배 연기 모델로 구성된 군으로부터 선택된 만성 염증 질병 모델에 효과적임을 특징으로 하는 분리된 핵산.
  78. 제 72항의 다중특이적 리간드를 엔코딩하는 분리된 핵산.
  79. 제 75항의 항체 포맷을 엔코딩하는 분리된 핵산.
  80. 종양 괴사 인자 수용체 Ⅰ (TNFR1)에 특이적으로 결합하는 도메인 항체 (dAb) 단량체를 엔코딩하는 재조합 핵산으로서, 상기 dAb 단량체가 300 nM 내지 5 pM의 Kd로 TNFR1에 결합하고, 피검체의 만성 염증 질병 치료에 효과적인 재조합 핵산.
  81. 제 80항에 있어서, dAb 단량체가 마우스의 콜라겐에 의해 유발된 관절염 모델, 마우스의 관절염의 ΔARE 모델, 마우스의 염증성 장질병의 ΔARE 모델, 마우스의 덱스트란 설페이트 나트륨에 의해 유발된 염증성 장질병 모델, 및 마우스의 만성 폐쇄폐병의 담배 연기 모델로 구성된 군으로부터 선택된 만성 염증 질병 모델에 효과적임을 특징으로 하는 재조합 핵산.
  82. 제 72항의 다중특이적 리간드를 엔코딩하는 재조합 핵산.
  83. 제 75항의 항체 포맷을 엔코딩하는 재조합 핵산.
  84. 제 80항의 재조합 핵산을 포함하는 벡터.
  85. 제 84항에 있어서, 재조합 핵산에 작동적으로 연결된 발현 조절 서열을 추가로 포함함을 특징으로 하는 벡터.
  86. 제 85항의 벡터 또는 제 80항의 재조합 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  87. 재조합 핵산의 발현에 적합한 조건하에서 제 86항의 숙주 세포를 유지시킴으로써 dAb 단량체를 생성시키는 것을 포함하여, dAb 단량체 리간드를 생성시키는 방법.
  88. 제 87항에 있어서, dAb 단량체 리간드를 분리시키는 것을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  89. 제 82항의 재조합 핵산을 포함하는 벡터.
  90. 제 89항에 있어서, 재조합 핵산에 작동적으로 연결된 발현 조절 서열을 추가로 포함함을 특징으로 하는 벡터.
  91. 제 90항의 벡터 또는 제 82항의 재조합 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  92. 재조합 핵산의 발현에 적합한 조건하에서 제 91항의 숙주 세포를 유지시킴으로써 다중특이적 리간드를 생성시키는 것을 포함하여, 다중특이적 리간드를 생성시키는 방법.
  93. 제 92항에 있어서, 다중특이적 리간드를 분리시키는 것을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  94. 제 83항의 재조합 핵산을 포함하는 벡터.
  95. 제 94항에 있어서, 재조합 핵산에 작동적으로 연결된 발현 조절 서열을 추가로 포함함을 특징으로 하는 벡터.
  96. 제 95항의 벡터 또는 제 83항의 재조합 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  97. 재조합 핵산의 발현에 적합한 조건하에서 제 96항의 숙주 세포를 유지시킴으로써 항체 포맷을 생성시키는 것을 포함하여, 항체 포맷을 생성시키는 방법.
  98. 제 97항에 있어서, 항체 포맷을 분리시키는 것을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  99. 제 52항 내지 제 71항중 어느 한 항의 dAb 단량체 및 약리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  100. 제 72항에 따른 다중특이적 리간드 및 약리학적으로 허용되는 담체를 포함하 는 조성물.
  101. 제 75항에 따른 항체 포맷 및 약리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  102. 종양 괴사 인자 수용체 I (TNFR1)에 특이적으로 결합하는 도메인 항체 (dAb) 단량체로서, 상기 dAb 단량체가 300 nM 내지 5 pM의 Kd로 TNFR1에 결합하고, TAR2h-12 (SEQ ID NO:32), TAR2h-13 (SEQ ID NO:33), TAR2h-14 (SEQ ID NO:34), TAR2h-16 (SEQ ID NO:35), TAR2h-17 (SEQ ID NO:36), TAR2h-18 (SEQ ID NO:37), TAR2h-19 (SEQ ID NO:38), TAR2h-20 (SEQ ID NO:39), TAR2h-21 (SEQ ID NO:40), TAR2h-22 (SEQ ID NO:41), TAR2h-23 (SEQ ID NO:42), TAR2h-24 (SEQ ID NO:43), TAR2h-25 (SEQ ID NO:44), TAR2h-26 (SEQ ID NO:45), TAR2h-27 (SEQ ID NO:46), TAR2h-29 (SEQ ID NO:47), TAR2h-30 (SEQ ID NO:48), TAR2h-32 (SEQ ID NO:49), TAR2h-33 (SEQ ID NO:50), TAR2h-10-1 (SEQ ID NO:51), TAR2h-10-2 (SEQ ID NO:52), TAR2h-10-3 (SEQ ID NO:53), TAR2h-10-4 (SEQ ID NO:54), TAR2h-10-5 (SEQ ID NO:55), TAR2h-10-6 (SEQ ID NO:56), TAR2h-10-7 (SEQ ID NO:57), TAR2h-10-8 (SEQ ID NO:58), TAR2h-10-9 (SEQ ID NO:59), TAR2h-10-10 (SEQ ID NO:60), TAR2h-10-11 (SEQ ID NO:61), TAR2h-10-12 (SEQ ID NO:62), TAR2h-10-13 (SEQ ID NO:63), TAR2h-10-14 (SEQ ID NO:64), TAR2h-10-15 (SEQ ID NO:65), TAR2h-10-16 (SEQ ID NO:66), TAR2h-10-17 (SEQ ID NO:67), TAR2h-10-18 (SEQ ID NO:68), TAR2h-10-19 (SEQ ID NO:69), TAR2h-10-20 (SEQ ID NO:70), TAR2h-10-21 (SEQ ID NO:71), TAR2h-10-22 (SEQ ID NO:72), TAR2h-10-27 (SEQ ID NO:73), TAR2h-10-29 (SEQ ID NO:74), TAR2h-10-31 (SEQ ID NO:75), TAR2h-10-35 (SEQ ID NO:76), TAR2h-10-36 (SEQ ID NO:77), TAR2h-10-37 (SEQ ID NO:78), TAR2h-10-38 (SEQ ID NO:79), TAR2h-10-45 (SEQ ID NO:80), TAR2h-10-47 (SEQ ID NO:81), TAR2h-10-48 (SEQ ID NO:82), TAR2h-10-57 (SEQ ID NO:83), TAR2h-10-56 (SEQ ID NO.84), TAR2h-10-58 (SEQ ID NO:85), TAR2h-10-66 (SEQ ID NO:86), TAR2h-10-64 (SEQ ID NO:87), TAR2h-10-65 (SEQ ID NO:88), TAR2h-10-68 (SEQ ID NO:89), TAR2h-10-69 (SEQ ID NO:90), TAR2h-10-67 (SEQ ID NO:91), TAR2h-10-61 (SEQ ID NO:92), TAR2h-10-62 (SEQ ID NO:93), TAR2h-10-63 (SEQ ID NO:94), TAR2h-10-60 (SEQ ID NO:95), TAR2h- 10-55 (SEQ ID NO:96), TAR2h-10-59 (SEQ ID NO:97), TAR2h-10-70 (SEQ ID NO:98), TAR2h-34 (SEQ ID NO:373), TAR2h-35 (SEQ ID NO:374), TAR2h-36 (SEQ ID NO:375), TAR2h-37 (SEQ ID NO:376), TAR2h-38 (SEQ ID NO:377), TAR2h-39 (SEQ ID NO:378), TAR2h-40 (SEQ ID NO:379), TAR2h-41 (SEQ ID NO:380), TAR2h-42 (SEQ ID NO:381), TAR2h-43 (SEQ ID NO:382), TAR2h-44 (SEQ ID NO:383), TAR2h-45 (SEQ ID NO:384), TAR2h-47 (SEQ ID NO:385), TAR2h-48 (SEQ ID NO:386), TAR2h-50 (SEQ ID NO:387), TAR2h-51 (SEQ ID NO:388), TAR2h-66 (SEQ ID NO:389), TAR2h-67 (SEQ ID NO:390), TAR2h-68 (SEQ ID NO:391), TAR2h-70 (SEQ ID NO:392), TAR2h-71 (SEQ ID NO:393), TAR2h-72 (SEQ ID NO:394), TAR2h-73 (SEQ ID NO:395), TAR2h-74 (SEQ ID NO:396), TAR2h-75 (SEQ ID NO:397), TAR2h-76 (SEQ ID NO:398), TAR2h-77 (SEQ ID NO:399), TAR2h-78 (SEQ ID NO:400), TAR2h-79 (SEQ ID NO:401) 및 TAR2h-15 (SEQ ID NO:431)로 구성된 군으로부터 선택된 dAb의 아미노산 서열과 약 90% 이상이 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 도메인 항체 (dAb) 단량체.
  103. TAR2m-14 (SEQ ID NO: 167), TAR2M-15 (SEQ ID NO: 168), TAR2m-19 (SEQ ID NO:169), TAR2m-20 (SEQ ID NO: 170), TAR2m-21 (SEQ ID NO:171), TAR2m-24 (SEQ ID NO:172), TAR2m-21-23 (SEQ ID NO:173), TAR2m-21-07 (SEQ ID NO:174), TAR2m-21-43 (SEQ ID NO:175), TAR2m-21-48 (SEQ ID NO:176), TAR2m-21-10 (SEQ ID NO: 177), TAR2m-21-06 (SEQ ID NO: 178), TAR2m-21-17 (SEQ ID NO:179)로 구성된 군으로부터 선택된 dAb의 아미노산 서열과 약 90% 이상이 상동성인 아미노산 서열을 포함하는, 종양 괴사 인자 수용체 I (TNFR1, p55, CD120a)에 특이적으로 결합하는 도메인 항체 (dAb) 단량체.
  104. 제 102항에 있어서, 리간드가 폴리알킬렌 글리콜 부분을 추가로 포함함을 특징으로 하는 dAb 단량체.
  105. 제 104항에 있어서, 폴리알킬렌 글리콜 부분이 폴리에틸렌 글리콜 부분임을 특징으로 하는 dAb 단량체.
  106. 하나 이상의 제 102항의 dAb 단량체를 포함하는 다중특이적 리간드.
  107. 제 106항에 있어서, TNFR1에 결합하지 않는 하나 이상의 dAb 단량체를 포함함을 특징으로 하는 다중특이적 리간드.
  108. 제 106항에 있어서, 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 dAb 단량체를 포함하는 다중특이적 리간드.
  109. 하나 이상의 제 102항의 dAb 단량체를 포함하는 항체 포맷.
  110. 종양 괴사 인자 수용체 I (TNFR1)에 특이적으로 결합하는 도메인 항체 (dAb) 단량체를 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 재조합 핵산으로서, 상기 누클레오티드 서열이 TAR2h-12 (SEQ ID NO:32), TAR2h-13 (SEQ ID NO:33), TAR2h-14 (SEQ ID NO:34), TAR2h-16 (SEQ ID NO:35), TAR2h-17 (SEQ ID NO:36), TAR2h-18 (SEQ ID NO:37), TAR2h-19 (SEQ ID NO:38), TAR2h-20 (SEQ ID NO:39), TAR2h-21 (SEQ ID NO:40), TAR2h-22 (SEQ ID NO:41), TAR2h-23 (SEQ ID NO:42), TAR2h-24 (SEQ ID NO:43), TAR2h-25 (SEQ ID NO:44), TAR2h-26 (SEQ ID NO:45), TAR2h-27 (SEQ ID NO:46), TAR2h-29 (SEQ ID NO:47), TAR2h-30 (SEQ ID NO:48), TAR2h-32 (SEQ ID NO:49), TAR2h-33 (SEQ ID NO:50), TAR2h-10-1 (SEQ ID NO:51), TAR2h-10-2 (SEQ ID NO:52), TAR2h-10-3 (SEQ ID NO:53), TAR2h-10-4 (SEQ ID NO:54), TAR2h-10-5 (SEQ ID NO:55), TAR2h-10-6 (SEQ ID NO:56), TAR2h-10-7 (SEQ ID NO:57), TAR2h-10-8 (SEQ ID NO:58), TAR2h-10-9 (SEQ ID NO:59), TAR2h-10-10 (SEQ ID NO:60), TAR2h-10-11 (SEQ ID NO:61), TAR2h-10-12 (SEQ ID NO:62), TAR2h-10-13 (SEQ ID NO:63), TAR2h-10-14 (SEQ ID NO:64), TAR2h- 10-15 (SEQ ID NO:65), TAR2h-10-16 (SEQ ID NO:66), TAR2h-10-17 (SEQ ID NO:67), TAR2h-10-18 (SEQ ID NO:68), TAR2h-10-19 (SEQ ID NO:69), TAR2h-10-20 (SEQ ID NO:70), TAR2h-10-21 (SEQ ID NO:71), TAR2h-10-22 (SEQ ID NO:72), TAR2h-10-27 (SEQ ID NO:73), TAR2h- 10-29 (SEQ ID NO:74), TAR2h-10-31 (SEQ ID NO:75), TAR2h-10-35 (SEQ ID NO:76), TAR2h-10-36 (SEQ ID NO:77), TAR2h-10-37 (SEQ ID NO:78), TAR2h-10-38 (SEQ ID NO:79), TAR2h-10-45 (SEQ ID NO:80), TAR2h-10-47 (SEQ ID NO:81), TAR2h-10-48 (SEQ ID NO:82), TAR2h- 10-57 (SEQ ID NO:83), TAR2h-10-56 (SEQ ID NO:84), TAR2h-10-58 (SEQ ID NO:85), TAR2h-10-66 (SEQ ID NO:86), TAR2h-10-64 (SEQ ID NO:87), TAR2h-10-65 (SEQ ID NO:88), TAR2h-10-68 (SEQ ID NO:89), TAR2h-10-69 (SEQ ID NO:90), TAR2h-10-67 (SEQ ID NO:91), TAR2h-10-61 (SEQ ID NO:92), TAR2h-10-62 (SEQ ID NO:93), TAR2h-10-63 (SEQ ID NO:94), TAR2h-10-60 (SEQ ID NO:95), TAR2h-10-55 (SEQ ID NO:96), TAR2h-10-59 (SEQ ID NO:97), TAR2h-10-70 (SEQ ID NO:98), TAR2h-34 (SEQ ID NO:402), TAR2h-35 (SEQ ID NO:403), TAR2h-36 (SEQ ID NO:404), TAR2h-37 (SEQ ID NO:405), TAR2h-38 (SEQ ID NO:406), TAR2h-39 (SEQ ID NO:407), TAR2h-40 (SEQ ID NO:408), TAR2h-41 (SEQ ID NO:409), TAR2h-42 (SEQ ID NO:410), TAR2h-43 (SEQ ID NO:411), TAR2h-44 (SEQ ID NO:412), TAR2h-45 (SEQ ID NO:413), TAR2h-47 (SEQ ID NO:414), TAR2h-48 (SEQ ID NO:415), TAR2h-50 (SEQ ID NO:416), TAR2h-51 (SEQ ID NO:417), TAR2h-66 (SEQ ID NO:418), TAR2h-67 (SEQ ID NO:419), TAR2h-68 (SEQ ID NO:420), TAR2h-70 (SEQ ID NO:421), TAR2h-71 (SEQ ID NO:422), TAR2h-72 (SEQ ID NO:423), TAR2h-73 (SEQ ID NO:424), TAR2h-74 (SEQ ID NO:425), TAR2h-75 (SEQ ID NO:426), TAR2h-76 (SEQ ID NO:427), TAR2h-77 (SEQ ID NO:428), TAR2h-78 (SEQ ID NO:429), TAR2h-79 (SEQ ID NO:430) 및 TAR2h-15 (SEQ ID NO:432)로 구성된 군으로부터 선택된 핵산과 약 90% 이상의 동일성을 지니는 재조합 핵산.
  111. 종양 괴사 인자 수용체 I (TNFR1)에 특이적으로 결합하는 도메인 항체 (dAb) 단량체를 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 재조합 핵산으로서, 상기 핵산 서열이 TAR2m-14 (SEQ ID NO:180), TAR2m-15 (SEQ ID NO:181), TAR2m-19 (SEQ ID NO:182), TAR2m-20 (SEQ ID NO:183), TAR2m-21 (SEQ ID NO:184), TAR2m-24 (SEQ ID NO:185), TAR2m-21-23 (SEQ ID NO: 186), TAR2m-21-07 (SEQ ID NO: 187), TAR2m-21-43 (SEQ ID NO:188), TAR2m-21-48 (SEQ ID NO:189), TAR2m-21-10 (SEQ ID NO:190), TAR2m-21-06 (SEQ ID NO:191), and TAR2m-21-17 (SEQ ID NO: 192)로 구성된 군으로부터 선택된 누클레오티드 서열과 약 90% 이상의 상동성을 지니는 재조합 핵산.
  112. 제 110항의 재조합 핵산 서열을 포함하는 벡터.
  113. 제 112항에 있어서, 재조합 핵산에 작동적으로 연결된 발현 조절 서열을 추가로 포함함을 특징으로 하는 벡터.
  114. 제 113항의 벡터 또는 제 110항의 재조합 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  115. 재조합 핵산의 발현에 적합한 조건하에서 제 114항의 숙주 세포를 유지시킴으로써 dAb 단량체를 생성시키는 것을 포함하여, dAb 단량체를 생성시키는 방법.
  116. 종양 괴사 인자 2 (TNFR2)를 실질적으로 길항시키지 않는 치료적 유효량의 종양 괴사 인자 1 (TNFR1)의 길항제를 이를 필요로 하는 피검체에 투여하는 것을 포함하여, 만성 염증 질병을 치료하거나, 억제하거나 예방하는 방법.
  117. 제 116항에 있어서, 길항제가 1가임을 특징으로 하는 방법.
  118. 제 116항 또는 제 117항에 있어서, 길항제가 항체 또는 이의 항원 결합 단편임을 특징으로 하는 방법.
  119. 제 118항에 있어서, 길항제가 항체의 1가 항원 결합 단편임을 특징으로 하는 방법.
  120. 제 116항 내지 제 119항중 어느 한 항에 있어서, 길항제가 도메인 항체 단량체임을 특징으로 하는 방법.
  121. 제 116항 내지 제 120항중 어느 한 항에 있어서, 길항제가 300 nM 내지 5 pM의 Kd로 TNFR1에 결합함을 특징으로 하는 방법.
  122. 제 116항 내지 제 121항중 어느 한 항에 있어서, 만성 염증 질병이 관절염, 다발성 경화증, 염증성 장질병 및 만성 폐쇄폐병으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  123. 제 1항 내지 제 15항 또는 제 18항 내지 제 21항 또는 제 52항 내지 제 71항 또는 제 102항 내지 제 105항중 어느 한 항의 dAb 단량체를 포함하는 치료적 유효량의 리간드를 이를 필요로 하는 피검체에 투여하는 것을 포함하여 염증 질병을 치료하는 방법.
  124. 제 1항 내지 제 15항 또는 제 18항 내지 제 21항 또는 제 52항 내지 제 71항 또는 제 102항 내지 제 105항중 어느 한 항의 dAb 단량체를 포함하는 치료적 유효량의 리간드를 이를 필요로 하는 피검체에 투여하는 것을 포함하여 관절염을 치료 하는 방법.
  125. 제 124항에 있어서, 관절염이 류마티스 관절염 또는 유년기 류마티스 관절염임을 특징으로 하는 방법.
  126. 제 1항 내지 제 15항 또는 제 18항 내지 제 21항 또는 제 52항 내지 제 71항 또는 제 102항 내지 제 105항중 어느 한 항의 dAb 단량체를 포함하는 치료적 유효량의 리간드를 이를 필요로 하는 피검체에 투여하는 것을 포함하여 다발성 경화증을 치료하는 방법.
  127. 제 1항 내지 제 15항 또는 제 18항 내지 제 21항 또는 제 52항 내지 제 71항 또는 제 102항 내지 제 105항중 어느 한 항의 dAb 단량체를 포함하는 치료적 유효량의 리간드를 이를 필요로 하는 피검체에 투여하는 것을 포함하여 염증성 장질병을 치료하는 방법.
  128. 제 127항에 있어서, 염증성 장질병이 크론병 및 궤양성 대장염으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  129. 제 1항 내지 제 15항 또는 제 18항 내지 제 21항 또는 제 52항 내지 제 71항 또는 제 102항 내지 제 105항중 어느 한 항의 dAb 단량체를 포함하는 치료적 유효 량의 리간드를 이를 필요로 하는 피검체에 투여하는 것을 포함하여 만성 폐쇄폐병을 치료하는 방법.
  130. 제 129항에 있어서, 만성 폐쇄폐병이 만성 기관지염, 만성 폐쇄 기관지염 및 폐기종으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  131. 제 1항 내지 제 15항 또는 제 18항 내지 제 21항 또는 제 52항 또는 제 71항 또는 제 102항 내지 제 105항중 어느 한 항의 dAb 단량체를 포함하는 치료적 유효량의 리간드를 이를 필요로 하는 피검체에 투여하는 것을 포함하여 폐렴을 치료하는 방법.
  132. 제 131항에 있어서, 폐렴이 박테리아성 폐렴임을 특징으로 하는 방법.
  133. 제 132항에 있어서, 박테리아성 폐렴이 포도상구균 폐렴임을 특징으로 하는 방법.
  134. 제 1항 내지 제 15항 또는 제 18항 내지 제 21항 또는 제 52항 내지 제 71항 또는 제 102항 내지 제 105항중 어느 한 항의 dAb 단량체를 포함하는 치료적 유효량의 리간드를 이를 필요로 하는 피검체에 투여하는 것을 포함하여 패혈 쇼크를 치료하는 방법.
  135. 종양 괴사 인자 수용체 I (TNFR1)에 특이적으로 결합하는 도메인 항체 (dAb) 단량체를 포함하는 폴리펩티드로서, 300 nM 내지 5 pM의 Kd로 TNFR1에 결합하고, 피검체의 만성 염증 질병을 치료하는데 효과적인 폴리펩티드.
  136. 제 135항에 있어서, 마우스의 콜라겐에 의해 유발된 관절염 모델, 마우스의 관절염의 ΔARE 모델, 마우스의 염증성 장질병의 ΔARE 모델, 마우스의 덱스트란 설페이트 나트륨에 의해 유발된 염증성 장질병 모델, 및 마우스의 만성 폐쇄폐병의 담배 연기 모델로 구성된 군으로부터 선택된 만성 염증 질병 모델에 효과적임을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  137. 종양 괴사 인자 수용체 I (TNFR1)에 특이적으로 결합하는 도메인 항체 (dAb) 단량체로서, 상기 dAb 단량체가 300 nM to 5 pM의 Kd로 TNFR1에 결합하고, 마우스의 LPS/D-갈락토사민에 의해 유발된 패혈 쇼크 모델에서 치사성을 억제하는 도메인 항체 (dAb) 단량체.
  138. 종양 괴사 인자 수용체 I (TNFR1)에 특이적으로 결합하는 도메인 항체 (dAb) 단량체를 엔코딩하는 분리된 핵산으로서, 상기 dAb 단량체가 300 nM 내지 5 pM의 Kd로 TNFR1에 결합하고, 마우스의 LPS/D-갈락토사민에 의해 유발된 패혈 쇼크 모델에 서 치사성을 억제하는 분리된 핵산.
  139. 종양 괴사 인자 수용체 I (TNFR1)에 특이적으로 결합하는 도메인 항체 (dAb) 단량체를 엔코딩하는 재조합 핵산으로서, 상기 dAb 단량체가 300 nM 내지 5 pM의 Kd로 TNFR1에 결합하고, 마우스의 LPS/D-갈락토사민에 의해 유발된 패혈 쇼크 모델에서 치사성을 억제하는 재조합 핵산.
  140. 제 139항의 재조합 핵산을 포함하는 벡터.
  141. 제 140항에 있어서, 재조합 핵산에 작동적으로 연결된 발현 조절 서열을 추가로 포함함을 특징으로 하는 벡터.
  142. 제 141항의 벡터 또는 제 139항의 재조합 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  143. 재조합 핵산의 발현에 적합한 조건하에서 제 142항의 숙주 세포를 유지시킴으로써 dAb 단량체를 생성시키는 것을 포함하여, dAb 단량체를 생성시키는 방법.
  144. 제 143항에 있어서, dAb 단량체를 분리시키는 것을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  145. 종양 괴사 인자 수용체 I (TNFR1)에 특이적으로 결합하는 도메인 항체 (dAb) 단량체로서, 상기 dAb 단량체가 300 nM 내지 5 pM의 Kd로 TNFR1에 결합하고, TNFR1에 의해 매개된 신호전달을 억제하고, TNFR1에 대한 TNFα의 결합을 실질적으로 억제하지 않는 도메인 항체 (dAb) 단량체.
  146. 제 145항에 있어서, TNFα에 의해 유발된 TNFR1의 가교를 억제함을 특징으로 하는 dAb 단량체.
  147. 300 nM 내지 5 pM의 Kd로 TNFR1에 결합하고, 피검체의 만성 염증 질병을 치료하는데 효과적인, 종양 괴사 인자 수용체 I (TNFR1)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  148. 제 147항에 있어서, 1가 항원 결합 단편임을 특징으로 하는 항원 또는 이의 항원 결합 단편.
  149. 제 148항에 있어서, 1가 항원 결합 단편이 dAb 단량체임을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  150. 제 147항에 있어서, 마우스의 콜라겐에 의해 유발된 관절염 모델 및 마우스의 관절염의 ΔARE 모델로 구성된 군으로부터 선택된 만성 염증 질병 모델에 효과적임을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  151. 제 147항에 있어서, 만성 염증 질병이 류마티스 관절염, 염증성 장질병, 만성 폐쇄폐병, 강직성 척추염, 건선 및 건선성 관절염으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  152. TNFR1에 대한 TNFα의 결합을 억제하지 않는, 종양 괴사 인자 1 (TNFR1)에 결합하고, TNFR1을 통한 신호 전달을 억제하는 종양 괴사 인자 I (TNFR1)의 길항제.
  153. 제 152항에 있어서, 표준 L929 세포독성 분석에서 TNFα에 의해 유발된 세포 사멸을 억제하거나 표준 HeLa IL-8 분석에서 TNFα에 의해 유발된 IL-8의 분비를 억제함을 특징으로 하는 TNFR1의 길항제.
  154. 제 152항 또는 제 153항에 있어서, TNFR1의 도메인 1에 결합함을 특징으로 하는 TNFR1의 길항제.
  155. 제 154항에 있어서, 마우스 TNFR1에 대한 결합에서 TAR2m-21-23과 경쟁함을 특징으로 하는 TNFR1의 길항제.
  156. 제 154항에 있어서, 인간 TNFR1에 대한 결합에서 TAR2h-205와 경쟁함을 특징으로 하는 TNFR1의 길항제.
  157. 제 152항 또는 제 153항에 있어서, TNFR1의 도메인 2 또는 3에 결합함을 특징으로 하는 TNFR1의 길항제.
  158. 제 152항 또는 제 153항에 있어서, TNFR1의 도메인 4에 결합함을 특징으로 하는 길항제.
  159. 제 1 도메인 항체 (dAb) 단량체 및 제 2 dAb 단량체를 포함하는 종양 괴사 인자 1 (TNFRl)의 길항제로서, 상기 제 1 dAb 단량체가 도메인 1, 도메인 2, 도메인 3 및 도메인 4로 구성된 군으로부터 선택된 TNFR1의 도메인에 결합하고, 상기 제 2 dAb 단량체가 도메인 1, 도메인 2, 도메인 3 및 도메인 4로 구성된 군으로부터 선택된 TNFR1의 도메인에 결합하고, 상기 길항제가 표준 L929 세포독성 분석 또는 표준 HeLa IL-8 분석에서 약 1 μM의 농도로 존재하는 경우 TNFR1을 효능화시키지 않는 종양 괴사 인자 1 (TNFRl)의 길항제.
  160. 제 159 항에 있어서, 제 1 dAb가 TNFR1의 도메인 1에 결합하고, 제 2 dAb가 TNFR1의 도메인 1에 결합하거나; 제 1 dAb가 TNFR1의 도메인 1에 결합하고, 제 2 dAb가 TNFR1의 도메인 2에 결합하거나; 제 1 dAb가 TNFR1의 도메인 1에 결합하고, 제 2 dAb가 TNFR1의 도메인 3에 결합하거나; 제 1 dAb가 TNFR1의 도메인 1에 결합하고, 제 2 dAb가 TNFR1의 도메인 4에 결합하거나; 제 1 dAb가 TNFR1의 도메인 2에 결합하고, 제 2 dAb가 TNFR1의 도메인 2에 결합하거나; 제 1 dAb가 TNFR1의 도메인 2에 결합하고, 제 2 dAb가 TNFR1의 도메인 3에 결합하거나; 제 1 dAb가 TNFR1의 도메인 2에 결합하고, 제 2 dAb가 TNFR1의 도메인 4에 결합하거나; 제 1 dAb가 TNFR1의 도메인 3에 결합하고, 제 2 dAb가 TNFR1의 도메인 3에 결합하거나; 제 1 dAb가 TNFR1의 도메인 3에 결합하고, 제 2 dAb가 TNFR1의 도메인 4에 결합하거나; 제 1 dAb가 TNFR1의 도메인 4에 결합하고, 제 2 dAb가 TNFR1의 도메인 4에 결합함을 특징으로 하는 TNFR1의 길항제.
  161. 제 159항 또는 제 160항에 있어서, 제 1 dAb 및 제 2 dAb를 포함함을 특징으로 하는 길항제.
  162. TNFR1에 대한 TNFα의 결합을 억제하지 않는, 종양 괴사 인자 1 (TNFR1)에 결합하고, TNFR1을 통한 신호 전달을 억제하는 도메인 항체 (dAb) 단량체.
  163. 제 162항에 있어서, 표준 L929 세포독성 분석에서 TNFα에 의해 유발된 세포 사멸을 억제하거나, 표준 HeLa IL-8 분석에서 TNFα에 의해 유발된 IL-8의 분비를 억제함을 특징으로 하는 dAb 단량체.
  164. 제 162항 또는 제 163항에 있어서, TNFR1의 도메인 1에 결합함을 특징으로 하는 dAb 단량체.
  165. 제 164항에 있어서, 마우스의 TNFR1에 대한 결합에서 TAR2m21-23과 경쟁함을 특징으로 하는 dAb 단량체.
  166. 제 164항에 있어서, 인간 TNFR1에 대한 결합에서 TAR2h-205와 경쟁함을 특징으로 하는 dAb 단량체.
  167. 제 162항 또는 제 163항에 있어서, TNFR1의 도메인 2 또는 3과 결합함을 특징으로 하는 dAb 단량체.
  168. 제 162항 또는 제 163항에 있어서, TNFR1의 도메인 4와 결합함을 특징으로 하는 dAb 단량체.
  169. 제 162항 내지 제 168항중 어느 한 항에 있어서, 말단 Cys 잔기를 포함함을 특징으로 하는 dAb 단량체.
  170. 하나 이상의 제 162항 내지 제 169항중 어느 한 항에 따른 dAb 단량체를 포함하는 리간드.
  171. 제 170항에 있어서, 제 162항에 따른 dAb 단량체인 두개의 dAb 단량체를 포함하는 동종이합체(homodimer)임을 특징으로 하는 리간드.
  172. 제 170항에 있어서, 두개의 상이한 dAb 단량체를 포함하는 동종이합체임ㅇ르 특징으로 하는 리간드.
  173. 제 170항 내지 제 172항중 어느 한 항에 있어서, 표준 L929 세포독성 분석 또는 표준 HeLa IL-8 분석에서 약 1 μM의 농도로 존재하는 경우 TNFR1을 효능화하지 않음을 특징으로 하는 리간드.
  174. 종양 괴사 인자 I (TNFR1)에 결합하는 도메인 항체 (dAb) 단량체로서, 상기 dAb가 TNFR1의 도메인 1과 결합하고, 마우스 TNFR1에 대한 결합에서 TAR2m-21-23과 경쟁하는 도메인 항체 (dAb) 단량체.
  175. 종양 괴사 인자 I (TNFR1)에 결합하는 도메인 항체 (dAb) 단량체로서, 상기 dAb가 TNFR1의 도메인 1과 결합하고, 인간 TNFR1에 대한 결합에서 TAR2h-205와 경쟁하는 도메인 항체 (dAb) 단량체.
  176. 제 174항 또는 제 175항에서, dAb가 인간 TNFR1의 도메인 1에 결합함을 특징으로 하는 dAb 단량체.
  177. 제 174항 내지 제 176항중 어느 한 항에 있어서, 표준 L929 세포독성 분석에서 TNFα에 의해 유발된 세포 사멸을 억제하거나, 표준 HeLa IL-8 분석에서 TNFα에 의해 유발된 IL-8의 분비를 억제함을 특징으로 하는 dAb 단량체.
  178. 제 174항 내지 제 177항중 어느 한 항에 있어서, 말단 Cys 잔기를 포함함을 특징으로 하는 dAb 단량체.
  179. 제 174항 내지 제 178항중 어느 한 항에 있어서, TNFR1에 대한 TNFα의 결합을 억제하지 않음을 특징으로 하는 dAb 단량체.
  180. 제 174항 내지 제 179항중 어느 한 항의 dAb 단량체를 포함하는 리간드.
  181. 제 180항에 있어서, 두개 이상의 dAb 단량체를 포함함을 특징으로 하는 리간드.
  182. 제 180항 또는 제 181항에 있어서, 두개의 dAb 단량체를 포함하는 동종이합 체이고, 여기서 각각의 dAb 단량체가 제 174항에 따른 dAb 단량체임을 특징으로 하는 리간드.
  183. 하나 이상의 제 174항 내지 제 179항중 어느 한 항에 따른 dAb 단량체를 포함하는 이중 특이적 리간드.
  184. 제 183항에 있어서, 제 174항 내지 제 179항중 어느 한 항에 따른 제 1 dAb 단량체 및 TNFR1의 도메인 1, 도메인 2, 도메인 3 또는 도메인 4에 결합하는 제 2 dAb 단량체를 포함함을 특징으로 하는 이중 특이적 리간드.
  185. 제 184항에 있어서, 제 1 dAb 및 제 2 dAb를 포함하는 이종이합체임을 특징으로 하는 이중 특이적 리간드.
  186. 제 184항 또는 제 185항에 있어서, 제 2 dAb가 TNFR1의 도메인 1에 결합함을 특징으로 하는 이중 특이적 리간드.
  187. 제 184항 또는 제 185항에 있어서, 제 2 dAb가 TNFR1의 도메인 3에 결합함을 특징으로 하는 이중 특이적 리간드.
  188. 제 187항에 있어서, 제 2 dAb가 인간 TNFR1에 대한 결합에서 TAR2h-10-27, TAR2h-131-8, TAR2h-15-8, TAR2h-35-4, TAR2h-l 54- 7, TAR2h-154-10 또는 TAR2h-185-25와 경쟁함을 특징으로 하는 이중 특이적 리간드.
  189. 제 181항 내지 제 188항중 어느 한 항에 있어서, 표준 L929 세포독성 분석 또는 표준 HeLa IL-8 분석에서 약 1 μM의 농도로 존재하는 경우 TNFR1을 효능화하지 않음을 특징으로 하는 리간드 또는 이중 특이적 리간드.
  190. 종양 괴사 인자 I (TNFR1)에 결합하는 도메인 항체 (dAb) 단량체로서, 상기 dAb가 TNFR1의 도메인 3에 결합하고, 인간 TNFR1에 대한 결합에서 TAR2h-131-8, TAR2h-15-8, TAR2h-35-4, TAR2h-154-7, TAR2h-154-1O 또는 TAR2h-185-25와 경쟁함을 특징으로 하는 도메인 항체 (dAb) 단량체.
  191. 제 190항에 있어서, dAb가 인간 TNFR1의 도메인 3에 결합함을 특징으로 하는 dAb 단량체.
  192. 제 190항 또는 제 191항에 있어서, 표준 L929 세포독성 분석에서 TNFα에 의해 유발된 세포 사멸을 억제하거나, 표준 HeLa IL-8 분석에서 TNFα에 의해 유발된 IL-8의 분비를 억제함을 특징으로 하는 dAb 단량체.
  193. 제 190항 내지 제 192항중 어느 한 항에 있어서, 말단 Cys 잔기를 포함함을 특징으로 하는 dAb 단량체.
  194. 제 190항 내지 제 193항중 어느 한 항의 dAb 단량체를 포함하는 리간드.
  195. 제 194항에 있어서, 두개 이상의 dAb 단량체를 포함함을 특징으로 하는 리간드.
  196. 제 194항 또는 제 195항에 있어서, 두개의 dAb 단량체를 포함하고, 여기서 각각의 dAb 단량체가 제 190항에 따른 dAb 단량체임을 특징으로 하는 리간드.
  197. 하나 이상의 제 190항 내지 제 193항중 어느 한 항에 따른 dAb 단량체를 포함하는 이중 특이적 리간드.
  198. 제 197항에 있어서, 제 190항 내지 제 193항중 어느 한 항에 따른 제 1 dAb 단량체, 및 TNFR1의 도메인 1, 도메인 2, 도메인 3 또는 도메인 4에 결합하는 제 2 dAb 단량체를 포함함을 특징으로 하는 이중 특이적 리간드.
  199. 제 198항에 있어서, 제 1 dAb 및 제 2 dAb를 포함하는 이종이합체임을 특징으로 하는 이중 특이적 리간드.
  200. 제 198항 또는 제 199항에 있어서, 제 2 dAb가 TNFR1의 도메인 1에 결합함을 특징으로 하는 이중 특이적 리간드.
  201. 제 198항 또는 제 199항에 있어서, 제 2 dAb가 TNFR1의 도메인 3에 결합함을 특징으로 하는 이중 특이적 리간드.
  202. 제 194항 내지 제 201항중 어느 한 항에 있어서, 표준 L929 세포독성 분석 또는 표준 HeLa IL-8 분석에서 약 1 μM의 농도로 존재하는 경우 TNFR1을 효능화시키지 않는 리간드 또는 이중 특이적 리간드.
  203. 종양 괴사 인자 수용체 I (TNFR1)에 특이적으로 결합하는 도메인 항체 (dAb) 단량체로서, 상기 dAb 단량체가 300 nM 내지 5 pM의 Kd로 TNFR1에 결합하고, TAR2h-131-8 (SEQ ID NO:433), TAR2h-131-24 (SEQ ID NO:434), TAR2h-15-8 (SEQ ID NO:435), TAR2h-15-8-1 SEQ ID NO:436), TAR2h-15-8-2 (SEQ ID NO:437), TAR2h-185-23 (SEQ ID NO:438), TAR2h-154-10-5 (SEQ ID NO:439), TAR2h-14-2 (SEQ ID NO:440), TAR2h-151-8 (SEQ ID NO:441), TAR2h-152-7 (SEQ ID NO:442), TAR2h-35-4 (SEQ ID NO:443), TAR2h-154-7 (SEQ ID NO:444), TAR2h-80 (SEQ ID NO:445), TAR2h-81 (SEQ ID NO:446), TAR2h-82 (SEQ ID NO:447), TAR2h-83 (SEQ ID NO:448), TAR2h-84 (SEQ ID NO:449), TAR2h-85 (SEQ ID NO:450), TAR2h-86 (SEQ ID NO:451), TAR2h-87 (SEQ ID NO:452), TAR2h-88 (SEQ ID NO:453), TAR2h-89 (SEQ ID NO:454), TAR2h-90 (SEQ ID NO:455), TAR2h-91 (SEQ ID NO:456), TAR2h-92 (SEQ ID NO:457), TAR2h-93 (SEQ ID NO:458), TAR2h-94 (SEQ ID NO:459), TAR2h-95 (SEQ ID NO:460), TAR2h-96 (SEQ ID NO:461), TAR2h-97 (SEQ ID NO:462), TAR2h-99 (SEQ ID NO:463), TAR2h-100 (SEQ ID NO:464), TAR2h-101 (SEQ ID NO:465), TAR2h-102 (SEQ ID NO:466), TAR2h-103 (SEQ ID NO:467), TAR2h-104 (SEQ ID NO:468), TAR2h-105 (SEQ ID NO:469), TAR2h-106 (SEQ ID NO:470), TAR2h-107 (SEQ ID NO:471), TAR2h-108 (SEQ ID NO:472), TAR2h-109 (SEQ ID NO:473), TAR2h-110 (SEQ ID NO:474), TAR2h-111 (SEQ ID NO:475), TAR2h-112 (SEQ ID NO:476), TAR2h-113 (SEQ ID NO:477), TAR2h-114 (SEQ ID NO:478), TAR2h-115 (SEQ ID NO:479), TAR2h-116 (SEQ ID NO:480), TAR2h-117 (SEQ ID NO:481), TAR2h-118 (SEQ ID NO:482), TAR2h-119 (SEQ ID NO:483), TAR2h-120 (SEQ ID NO:484), TAR2h-121 (SEQ ID NO:485), TAR2h-122 (SEQ ID NO:486), TAR2h-123 (SEQ ID NO:487), TAR2h-124 (SEQ ID NO:488), TAR2h-125 (SEQ ID NO:489), TAR2h-126 (SEQ ID NO:490), TAR2h-127 (SEQ ID NO:490), TAR2h-128 (SEQ ID NO:492), TAR2h-129 (SEQ ID NO:493), TAR2h-130 (SEQ ID NO:494), TAR2h-131 (SEQ ID NO:495), TAR2h-132 (SEQ ID NO:496), TAR2h-133 (SEQ ID NO:497), TAR2h-151 (SEQ ID NO:498), TAR2h-152 (SEQ ID NO:499), TAR2h-153 (SEQ ID NO:500), TAR2h-154 (SEQ ID NO:501), TAR2h-159 (SEQ ID NO:502), TAR2h-165 (SEQ ID NO:503), TAR2h-166 (SEQ ID NO:504), TAR2h-168 (SEQ ID NO:505), TAR2h-171 (SEQ ID NO:506), TAR2h-172 (SEQ ID NO:507), TAR2h-173 (SEQ ID NO:508), TAR2h-174 (SEQ ID NO:509), TAR2h-176 (SEQ ID NO:510), TAR2h-178 (SEQ ID NO:511), TAR2h-201 (SEQ ID NO:512), TAR2h-202 (SEQ ID NO:513), TAR2h-203 (SEQ ID NO:514), TAR2h-204 (SEQ ID NO:515), TAR2h-185-25 (SEQ ID NO:516), TAR2h- 154-10 (SEQ ID NO:517) 및 TAR2h-205 (SEQ ID NO:627)로 구성된 군으로부터선택된 dAb의 아미노산 서열과 약 90% 이상의 상동성을 지니는 아미노산 서열을 포함하는 도메인 항체 (dAb) 단량체.
  204. 제 203항에 있어서, 폴리알킬렌 글리콜 부분을 추가로 포함함을 특징으로 하는 dAb 단량체.
  205. 제 204항에 있어서, 폴리알킬렌 글리콜 부분이 폴리에틸렌 글리콜 부분임을 특징으로 하는 dAb 단량체.
  206. 하나 이상의 제 203항 내지 제 205항중 어느 한 항에 따른 dAb 단량체를 포함하는 리간드.
  207. 제 206항에 있어서, 이중 특이적 리간드 또는 다중특이적 리간드임을 특징으로 하는 리간드.
  208. 하나 이상의 제 203항 내지 제 205항중 어느 한 항의 dAb 단량체를 포함하는 항체 포맷.
  209. 종양 괴사 인자 수용체 I (TNFR1)에 특이적으로 결합하는 도메인 항체 (dAb) 단량체를 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 재조합 핵산으로서, 상기 누클레오티드 서열이 TAR2h-131-8 (SEQ ID NO:518), TAR2h-131-24 (SEQ ID NO:519), TAR2h-15-8 (SEQ ID NO:520), TAR2h-15-8-1 (SEQ ID NO:521), TAR2h-15-8-2 (SEQ ID NO:522), TAR2h-185-23 (SEQ ID NO:523), TAR2h- 154-10-5 (SEQ ID NO:524), TAR2h-14-2 (SEQ ID NO:525), TAR2h-151-8 (SEQ ID NO: 526), TAR2h- 152-7 (SEQ ID NO:527), TAR2h-35-4 (SEQ ID NO:528), TAR2h-154-7 (SEQ ID NO:529), TAR2h-80 (SEQ ID NO:530), TAR2h-81 (SEQ ID NO:531), TAR2h-82 (SEQ ID NO:532), TAR2h-83 (SEQ ID NO:533), TAR2h-84 (SEQ ID NO:534), TAR2h-85 (SEQ ID NO:535), TAR2h-86 (SEQ ID NO:536), TAR2h-87 (SEQ ID NO:537), TAR2h-88 (SEQ ID NO:538), TAR2h-89 (SEQ ID NO:539), TAR2h-90 (SEQ ID NO:540), TAR2h-91 (SEQ ID NO:541), TAR2h-92 (SEQ ID NO:542), TAR2h-93 (SEQ ID NO:543), TAR2h-94 (SEQ ID NO:544), TAR2h-95 (SEQ ID NO:545), TAR2h-96 (SEQ ID NO: 546), TAR2h-97 (SEQ ID NO: 547), TAR2h-99 (SEQ ID NO:548), TAR2h-100 (SEQ ID NO:549), TAR2h-101 (SEQ ID NO:550), TAR2h-102 (SEQ ID NO:551), TAR2h-103 (SEQ ID NO:552), TAR2h-104 (SEQ ID NO:553), TAR2h-105 (SEQ ID NO:554), TAR2h-106 (SEQ ID NO:555), TAR2h-107 (SEQ ID NO:556), TAR2h-108 (SEQ BD NO:557), TAR2h-109 (SEQ ID NO:558), TAR2h-110 (SEQ ID NO:559), TAR2h-111 (SEQ ID NO:560), TAR2h-112 (SEQ ID NO:561), TAR2h- 113 (SEQ ID NO:562), TAR2h-114 (SEQ ID NO:563), TAR2h-115 (SEQ ID NO:564), TAR2h-116 (SEQ ID NO:565), TAR2h-117 (SEQ ID NO:566), TAR2h-118 (SEQ ID NO:567), TAR2h-119 (SEQ ID NO:568), TAR2h-120 (SEQ ID NO:569), TAR2h-121 (SEQ ID NO:570), TAR2h-122 (SEQ ID NO:571), TAR2h-123 (SEQ ID NO:572), TAR2h-12 (SEQ ID NO:573), TAR2h-125 (SEQ ID NO:574), TAR2h-126 (SEQ ID NO:575), TAR2h-127 (SEQ ID NO:576), TAR2h-128 (SEQ ID NO:577), TAR2h-129 (SEQ ID NO:578), TAR2h-130 (SEQ ID NO:579), TAR2h-131 (SEQ ID NO:580), TAR2h-132 (SEQ ID NO:581), TAR2h-133 (SEQ ID NO:582), TAR2h-151 (SEQ ID NO:583), TAR2h-152 (SEQ ID NO:584), TAR2h-153 (SEQ ID NO:585), TAR2h-154 (SEQ ID NO:586), TAR2h-159 (SEQ ID NO:587), TAR2h-165 (SEQ ID NO:588), TAR2h-166 (SEQ ID NO.589), TAR2h-168 (SEQ ID NO:590), TAR2h-171 (SEQ ID NO:591), TAR2h-172 (SEQ ID NO:592), TAR2h-173 (SEQ ID NO:593), TAR2h-174 (SEQ ID NO:594), TAR2h-176 (SEQ ID NO:595), TAR2h-178 (SEQ ID NO:596), TAR2h-201 (SEQ ID NO:597), TAR2h-202 (SEQ ID NO:598), TAR2h-203 (SEQ ID NO:599), TAR2h-204 (SEQ ID NO:600), TAR2h-185-25 (SEQ ID NO:601), TAR2h- 154-10 (SEQ ID NO:602) 및 TAR2h-205 (SEQ ID NO:628)로 구성된 군으로부터 선택된 누클레오티드 서열과 약 90% 이상의 상동성을 지니는 재조합 핵산.
  210. 제 209항의 재조합 핵산을 포함하는 벡터.
  211. 제 210항에 있어서, 재조합 핵산에 작동적으로 연결된 발현 조절 서열을 추가로 포함함을 특징으로 하는 벡터.
  212. 제 211항의 벡터 또는 제 209항의 재조합 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  213. 재조합 핵산의 발현에 적합한 조건하에서 제 212항의 숙주 세포를 유지시킴으로써 dAb 단량체를 생성시키는 것을 포함하여, dAb 단량체를 생성시키는 방법.
  214. 가용성 TNFR1 및 막횡단 TNFR1에 결합하지만, 가용성 TNFR1 또는 막횡단 TNFR1에 대한 TNFα의 결합을 억제하지 않는 리간드.
  215. 제 214항에 있어서, TNFR1의 길항제임을 특징으로 하는 리간드.
  216. 제 214항 또는 제 215항에 있어서, 마우스 TNFR1에 대한 결합에서 TAR2m-21-23과 경쟁함을 특징으로 하는 리간드.
  217. 제 214항 또는 제 215항에 있어서, 인간 TNFR1에 대한 결합에서 TAR2h-205와 경쟁함을 특징으로 하는 리간드.
  218. 제 214항 내지 제 217항중 어느 한 항에 있어서, TNFR1 결합 부분 및 반감기 연장 부분(half-life extending moiety)을 포함함을 특징으로 하는 리간드.
  219. 제 218항에 있어서, 반감기 연장 부분이 폴리에틸렌 글리콜 부분, 혈청 알부민 또는 이의 단편, 트랜스페린 수용체 또는 이의 트랜스페린 결합 부분, 또는 생체내 반감기를 향상시키는 폴리펩티드에 대한 결합 부위를 포함하는 항체 또는 항체 단편임을 특징으로 하는 리간드.
  220. 제 219항에 있어서, 반감기 연장 부분이 혈청 알부민 또는 신생아 Fc 수용체에 대한 결합 부위를 포함하는 항체 또는 항체 단편임을 특징으로 하는 리간드.
  221. 제 220항에 있어서, 반감기 연장 부분이 dAb임을 특징으로 하는 리간드.
  222. 인간 TNFR1 및 마우스 TNFR1에 결합하는 리간드.
  223. 제 222항에 있어서, 인간 TNFR1 및 마우스 TNFR1의 도메인 1에 결합하는 TNFR1 결합 부분을 포함함을 특징으로 하는 리간드.
  224. 제 223항에 있어서, 결합 부분이 항체 또는 항체 단편임을 특징으로 하는 리간드.
  225. 제 224항에 있어서, 결합 부분이 dAb임을 특징으로 하는 리간드.
  226. 치료적 유효량의 제 152항 내지 제 161항중 어느 한 항의 길항제, 제 162항 내지 제 169항 또는 제 174항 내지 제 179항 또는 제 190항 내지 제 193항 또는 제 203항 내지 제 205항중 어느 한 항의 dAb 단량체, 제 170항 내지 제 173항 또는 제 180항 내지 제 189항 또는 제 194항 내지 제 202항 또는 제 202항 또는 제 206항 또는 제 207항 또는 제 214항 내지 제 225항중 어느 한 항의 dAb 단량체, 및 제 208항의 항체 포맷을 이를 필요로 하는 피검체에 투여하는 것을 포함하여 염증 질병을 치료하거나 억제하거나 예방하는 방법.
  227. 제 226항에 있어서, 염증 질병이 만성 염증 질병임을 특징으로 하는 방법.
  228. 치료적 유효량의 제 152항 내지 제 161항중 어느 한 항의 길항제, 제 162항 내지 제 169항 또는 제 174항 내지 제 179항 또는 제 190 내지 제 193항 또는 제 203항 내지 제 205항중 어느 한 항의 dAb 단량체, 제 170항 내지 제 173항 또는 제 180항 내지 제 189항 또는 제 194항 내지 제 202항 또는 제 206항 또는 제 207항 또는 제 214항 내지 제 225항중 어느 한 항의 리간드 또는 이중 특이적 리간드, 및 제 208항의 항체 포맷을 이를 필요로 하는 피검체에 투여하는 것을 포함하여 관절염을 치료하는 방법.
  229. 제 228항에 있어서, 관절염이 류마티스 관절염 또는 유년기 류마티스 관절염임을 특징으로 하는 방법.
  230. 치료적 유효량의 제 152항 내지 제 161항중 어느 한 항의 길항제, 제 162항 내지 제 169항 또는 제 174항 내지 제 179항 또는 제 190 내지 제 193항 또는 제 203항 내지 제 205항중 어느 한 항의 dAb 단량체, 제 170항 내지 제 173항 또는 제 180항 내지 제 189항 또는 제 194항 내지 제 202항 또는 제 206항 또는 제 207항 또는 제 214항 내지 제 225항중 어느 한 항의 리간드 또는 이중 특이적 리간드, 및 제 208항의 항체 포맷을 이를 필요로 하는 피검체에 투여하는 것을 포함하여 다발성 경화증을 치료하는 방법.
  231. 치료적 유효량의 제 152항 내지 제 161항중 어느 한 항의 길항제, 제 162항 내지 제 169항 또는 제 174항 내지 제 179항 또는 제 190 내지 제 193항 또는 제 203항 내지 제 205항중 어느 한 항의 dAb 단량체, 제 170항 내지 제 173항 또는 제 180항 내지 제 189항 또는 제 194항 내지 제 202항 또는 제 206항 또는 제 207항 또는 제 214항 내지 제 225항중 어느 한 항의 리간드 또는 이중 특이적 리간드, 및 제 208항의 항체 포맷을 이를 필요로 하는 피검체에 투여하는 것을 포함하여 염증성 장질병을 치료하는 방법.
  232. 제 231항에 있어서, 염증성 장질병이 크론병 및 궤양성 대장염으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  233. 치료적 유효량의 제 152항 내지 제 161항중 어느 한 항의 길항제, 제 162항 내지 제 169항 또는 제 174항 내지 제 179항 또는 제 190 내지 제 193항 또는 제 203항 내지 제 205항중 어느 한 항의 dAb 단량체, 제 170항 내지 제 173항 또는 제 180항 내지 제 189항 또는 제 194항 내지 제 202항 또는 제 206항 또는 제 207항 또는 제 214항 내지 제 225항중 어느 한 항의 리간드 또는 이중 특이적 리간드, 및 제 208항의 항체 포맷을 이를 필요로 하는 피검체에 투여하는 것을 포함하여 만성 폐쇄폐병을 치료하는 방법.
  234. 치료적 유효량의 제 152항 내지 제 161항중 어느 한 항의 길항제, 제 162항 내지 제 169항 또는 제 174항 내지 제 179항 또는 제 190 내지 제 193항 또는 제 203항 내지 제 205항중 어느 한 항의 dAb 단량체, 제 170항 내지 제 173항 또는 제 180항 내지 제 189항 또는 제 194항 내지 제 202항 또는 제 206항 또는 제 207항 또는 제 214항 내지 제 225항중 어느 한 항의 리간드 또는 이중 특이적 리간드, 및 제 208항의 항체 포맷을 이를 필요로 하는 피검체에 투여하는 것을 포함하여 폐렴을 치료하는 방법.
  235. 제 234항에 있어서, 폐렴이 박테리아성 폐렴임을 특징으로 하는 방법.
  236. 제 235항에 있어서, 박테리아성 폐렴이 포도상구균 폐렴임을 특징으로 하는 방법.
  237. 치료적 유효량의 제 152항 내지 제 161항중 어느 한 항의 길항제, 제 162항 내지 제 169항 또는 제 174항 내지 제 179항 또는 제 190 내지 제 193항 또는 제 203항 내지 제 205항중 어느 한 항의 dAb 단량체, 제 170항 내지 제 173항 또는 제 180항 내지 제 189항 또는 제 194항 내지 제 202항 또는 제 206항 또는 제 207항 또는 제 214항 내지 제 225항중 어느 한 항의 리간드 또는 이중 특이적 리간드, 및 제 208항의 항체 포맷을 이를 필요로 하는 피검체에 투여하는 것을 포함하여 패혈 쇼크를 치료하는 방법.
  238. TNFR1에 대한 TNFα의 결합을 차단하기 위한 약제의 제조에서의 TNFR1의 도메인 3에 결합하는 길항제의 용도로서, 상기 길항제가 인간 TNFR1에 대한 결합에서 TAR2h-10-27, TAR.2h-131-8, TAR2h-15-8, TAR2h-35-4, TAR2h-154-7, TAR2h-154-10 및 TAR2h-185-25로 구성된 군으로부터 선택된 dAb 단량체와 경쟁하는 용도.
  239. 환자의 TNFR1에 대한 TNFα의 결합에 의해 매개되는 질병을 치료하고/하거나 예방하는 방법으로서, TNFR1의 도메인 3에 결합하는 길항제를 환자에게 투여하는 것을 포함하고, 길항제가 인간 TNFR1에 대한 결합에서 TAR2h-10-27, TAR.2h-131-8, TAR2h-15-8, TAR2h-35-4, TAR2h-154-7, TAR2h-154-10 및 TAR2h-185-25로 구성된 군 으로부터 선택된 dAb 단량체와 시험관내에서 경쟁하는 방법.
  240. 제 40항 내지 제 42항 또는 제 116항 내지 제 134항 또는 제 226항 내지 제 237항 또는 제 239항중 어느 한 항에 있어서, 길항제, dAb, 리간드 또는 이중 특이적 리간드, 또는 항체 포맷이 폐 투여를 통해 투여됨을 특징으로 하는 방법.
  241. 제 40항 내지 제 42항 또는 제 116항 내지 제 134항 또는 제 226항 내지 제 237항 또는 제 239항중 어느 한 항에 있어서, 길항제, dAb, 리간드 또는 이중 특이적 리간드, 또는 이중 특이적 리간드, 또는 항체 포맷이 전신 투여를 통해 투여됨을 특징으로 하는 방법.
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