CN110128536A - 抗肿瘤干细胞标志蛋白cd133的单域抗体及其应用 - Google Patents

抗肿瘤干细胞标志蛋白cd133的单域抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种抗肿瘤干细胞标志蛋白CD133的单域抗体及其应用。本发明从人源单域抗体文库，利用噬菌体展示技术筛选与CD133胞外段结合的抗体，最终筛选出2个单域抗体，分别命名为HW‑145和HW‑314。将这2个单域抗体基因扩增，测序，并克隆至表达载体，进行单域抗体原核系统表达纯化，随后进行ELISA检测、MTT、细胞凋亡、Transwell侵袭实验，结果显示2个单域抗体与抗原结合能力较强，能有效的抑制肿瘤细胞增殖、侵袭，并能够诱导肿瘤细胞凋亡。本发明所提供的抗体为全人源化单域抗体，应用在人体内不会产生免疫原性，且在体外具有抑制肿瘤细胞的作用。这2个单域抗体为后期开发肿瘤抗体药物奠定基础。

Description

抗肿瘤干细胞标志蛋白CD133的单域抗体及其应用
技术领域
本发明涉及抗体领域，特别涉及一种抗肿瘤干细胞标志蛋白CD133的单域抗体及其应用。
背景技术
肿瘤细胞具有的不死性、迁移性和失去接触抑制的特点，使得肿瘤成为人类极难治愈的疾病之一。目前肿瘤治疗手段主要有手术切除，放疗或者化疗，但在肿瘤中的存在一群具有类似干细胞特性的肿瘤干细胞导致治疗后肿瘤复发率极高。2006年，美国癌症研究协会将肿瘤干细胞定义为：肿瘤中具有自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞的细胞。这种细胞在体内可以长期处于休眠状态，并具有多种耐药分子而对杀伤肿瘤细胞的外界理化因素不敏感，导致在常规肿瘤治疗方法消灭大部分普通肿瘤细胞后，肿瘤再次复发。基于肿瘤干细胞的特性，通过基因工程技术开发靶向肿瘤干细胞表面特异性标记分子的抗体，或许将成为治疗癌症的新曙光。
作为干细胞及肿瘤干细胞表面特异性标记蛋白之一，CD133最早是Yin等从CD34造血干细胞中通过人工AC133单克隆抗体分离而来。CDl33属于Prominin家族成员之一，基因定于位于人的4号染色体，大小约152kb，包含至少37个外显子。CD133蛋白由865个氨基酸组成，分子量约120kDa，包含：细胞外NH2-端，5次跨膜结构域，2个胞外环状结构，2个富含半胱氨酸的胞内环状结构，胞内-COOH结构。已有研究表明，CD133是一种造血干细胞和神经干细胞的表面标志物；在脑胶质瘤、结肠癌、恶性黑色素瘤等肿瘤的肿瘤干细胞中CD133均有表达，并且在脑肿瘤、乳腺癌和结肠癌中，CD133+细胞比CD133-细胞成瘤性强；通过基因芯片和临床分析发现，CDl33+肿瘤细胞表现出更强的增殖能力，并且预后较差。以上研究结果均表明，CDl33在肿瘤干细胞中的表达对癌症的发展具有重要意义。因此，可将CD133作为开发抗肿瘤药物的新靶点。
与传统的单克隆抗体相比，仅由一个重链可变区组成的单域抗体具有分子量小，易于穿过血脑屏障，免疫原性低，特异性强等优点。已有相关研究结果表明，单域抗体可有效的靶向抗原，且在体内外均具有抗肿瘤效果。目前，还没有关于抗肿瘤干细胞标记蛋白CD133单域抗体的研究。
发明内容
本发明的主要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种抗肿瘤干细胞标记蛋白CD133的单域抗体。
本发明的另一目的在于提供所述抗肿瘤干细胞标记蛋白CD133的单域抗体的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种抗肿瘤干细胞标记蛋白CD133的单域抗体，由1个重链可变区组成，为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的命名为HW-145的抗体或氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的命名为HW-314的抗体。
HW-145抗体：
QVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGDTVSNHDMAWVRQAPGKGLEWVSSINSKDGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWSKSQHSEMSYWGQGTLVTVSS；
HW-314抗体：
QVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFRISPEVMAWVRQAPGKGLEWVSTIKTADGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASVKHQVPEHFNFWGQGTLVTVSS。
编码所述的抗肿瘤干细胞标记蛋白CD133的单域抗体的核苷酸序列如下：编码命名为HW-145的抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；编码命名为HW-314的抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
编码HW-145抗体的核苷酸序列：
CAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGAGACACCGTTTCCAATCACGACATGGCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTATCAATGATTAATATGAAGGACGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGTGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTATTGCGCGCGCTGGTCCAAGTCCCAGCACTCCGAGATGTCCTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC；
编码HW-314抗体的核苷酸序列：
CAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTTCGTATTTCCCCTGAGGTTATGGCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTATCAACCATTAAGACGGCAGACGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGTGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTATTGCGCGAGTGTTAAGCACCAGGTGCCTGAGCACTTTAATTTTTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC。
编码HW-145抗体和HW-314抗体的核苷酸序列均由360个碱基组成，编码120个氨基酸。含有3个CDR(互补决定簇)区：CDR1含有9个氨基酸；CDR2含有6个氨基酸；CDR3含有12个氨基酸。
所述的抗肿瘤干细胞标记蛋白CD133的单域抗体可通过将编码所述的抗肿瘤干细胞标记蛋白CD133的单域抗体的核苷酸序列克隆至表达载体中，构建重组表达质粒，再将重组表达质粒转入宿主细胞进行抗体蛋白表达、纯化，即可得到所述抗CD133单域抗体。
所述的抗肿瘤干细胞标记蛋白CD133的单域抗体在制备抗肿瘤抗体药物中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明以噬菌体展示技术为基础，从人源单域抗体噬菌体文库筛选出2个与CD133胞外段结合的抗CD133单域抗体，仅通过原核系统就可进行抗体表达，可大幅度简化生产工艺，降低抗体生产成本，且本抗体无需使用抗原免疫人体就可获得。
(2)本发明所提供的抗CD133单域抗体仅由一个重链可变区结构域组成，具有分子量小，组织渗透性强，结构稳定等优点。
(3)本发明所提供的人源性单域抗体应用于人体内不会产生免疫原性，可用于将来开发肿瘤抗体药物。
附图说明
图1是通过ELISA检测2个纯化的抗CD133单域抗体与CD133胞外段结合的结果图；其中，BSA为空白对照，HER2和EGFR为无关抗原对照，CD133为相关抗原，以2个单域抗体分别作为一抗，以HRP-protein A作为二抗，进行ELISA检测。
图2是通过MTT方法检测单域抗体对肿瘤细胞增殖能力影响的结果图；其中，使用2个抗体(HW-145和HW-314)在不同的浓度(0，25，50，100μg/mL)下培养肿瘤细胞DU145(图A)、MCF-7(图B)，72h后每孔加入30μL的MTT孵育4h，再加入200μL的DMSO使甲瓒充分溶解，之后用酶标仪检测OD570吸光值。*p<0.05vs 0μg/mL(n＝3)。
图3是通过流式细胞分析仪和Annexin V/PI双染试剂盒检测单域抗体对肿瘤细胞凋亡影响的结果图；其中，2个抗体(HW-145和HW-134)在50μg/mL浓度下共同培养肿瘤细胞DU145和MCF-7，同时设置一个无抗体对照(No antibody control)组；培养48h后，利用Annexin V/PI双染试剂盒和流式细胞分析仪检测细胞凋亡；图A,B数据分别代表抗体诱导肿瘤细胞DU-145和MCF-7凋亡的比例；*p<0.05，相对于无抗体对照组，(n＝3)。
图4是通过Transwell侵袭方法检测单域抗体对肿瘤细胞侵袭影响的结果图；其中，2个抗体(HW-145和HW-134和IgG)在不同的浓度(0、25、50、100μg/mL)下培养肿瘤细胞DU145和MCF-7，再用含20％血清培养基诱导细胞侵袭24h，之后用0.5％结晶紫对细胞染色并在显微镜下拍照，33％的乙酸将结合在细胞上的结晶紫洗脱，收集洗脱液，酶标仪检测OD570吸光值；图A,B数据分别代表抗体对肿瘤细胞DU-145和MCF-7侵袭的影响；*p<0.05vs0μg/mL，(n＝3)。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作详细描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1制备辅助噬菌体
(1)在一个含有TYE固体培养基的培养皿中，将从碧云天购买的TG1甘油菌以三区划线法涂布，之后将培养皿置于37℃恒温培养箱培养12～16小时；
(2)挑取TYE固体培养基上长出的TG1单菌落，接种于5mL的2×TY液体培养基，置于37℃恒温摇床，250rpm培养12～16小时；
(3)将步骤(2)中细菌培养液按1:100比例转接至另一管5mL的2×TY液体培养基，置于37℃恒温摇床，250rpm培养至菌液OD600约0.5；
(4)用PBS将辅助噬菌体KM13稀释(从1012/mL～104/mL)；
(5)取200μL步骤(3)中菌液，向其中加入10μL稀释好的辅助噬菌体KM13，混匀后置于37℃水浴锅水浴30分钟；
(6)取3mL已熔解的琼脂培养基，铺到提前预热的含有TYE固体培养基上，室温静置使其凝固。
(7)使用之前，顶层琼脂先加热至完全熔解，然后在水中孵育冷却到42℃，再与步骤(5)得到的菌液混合。室温静置至培养基完全凝固，将培养皿置于37℃恒温培养箱培养12～16小时；
(8)用无菌吸头挑取步骤(7)中培养基上一个小的菌斑，接种于5mL步骤(3)中菌液(OD600＝0.5，按步骤(3)中方法制备),37℃恒温摇床，250rpm条件下培养2～3个小时；
(9)将步骤(8)得到的菌液按体积比1:100比例转接至另一含有500mL的2×TY液体培养基的锥形瓶中，37℃恒温摇床，250rpm培养2～3个小时；
(10)向步骤(9)得到的培养液中加入卡那霉素至终浓度50μg/mL，30℃恒温摇床，250rpm培养12～16小时；
(11)将步骤(10)培养好的培养液于12000g离心，取上清液过滤，再加入20％的PEG，4℃静止数小时，纯化噬菌体；
(12)检测制备的辅助噬菌体对胰酶的敏感性：在1mL胰酶溶液中加入1010个辅助噬菌体KM13，室温孵育30分钟。然后用PBS进行梯度稀释辅助噬菌体KM13(从1010到102个噬菌体)，分别取10μL的KM13梯度稀释物感染200μL TG1细菌(OD600＝0.5，制备及侵染方法如前述)，涂布于TYE固体培养基上(包含终浓度50μg/mL的卡那霉素)，37℃恒温培养箱培养过夜。经胰酶处理的噬菌体侵染细菌后，获得的克隆数应该至少比未处理组的克隆数少106倍。否则丢弃该辅助噬菌体制备物，挑取另一个空斑重新制备。
实施例2表达噬菌体单域抗体文库
(1)取适量噬菌体文库(Source Bioscience,货号：6001_hDAb)，加入500mL 2×TY液体培养基(培养基额外含100μg/mL氨苄青霉素，4％葡萄糖)，37℃恒温摇床，250rpm培养至细菌OD600＝0.5；
(2)加入2×1012个辅助噬菌体KM13到步骤(1)得到的菌液，混匀后置于37℃水浴30分钟。将这500mL培养物分装成50mL每管，3200g离心10分钟，弃上清，将沉淀重悬，转接于含有500mL的2×TY液体培养基的锥形瓶中(培养基额外含0.1％葡萄糖，100μg/ml氨苄青霉素，50μg/ml卡那霉素)。置于25℃恒温摇床，250rpm震荡培养16～20小时。
实施例3纯化噬菌体单域抗体文库
(1)将实施例2中的过夜培养分装成50mL每管，室温3200g离心20分钟；
(2)取离心后上清液转入另一干净的50mL离心管，每管按体积比1:4的比例加入20％聚乙二醇溶液，冰上孵育1个小时；
(3)将步骤(2)中离心管置于4℃、3200g离心30分钟，弃上清，用5mL PBS重悬沉淀，再向其中加入1mL 20％PEG溶液，冰上孵育10分钟；
(4)将步骤(3)置于4℃、3200g离心30分钟，弃上清，再用1mL PBS重悬沉淀，然后4℃、3200g离心5分钟，上清用0.45μM滤器过滤除菌；
(5)通过测量260nm处吸光值，估算噬菌体文库滴度：将上述纯化好的噬菌体文库用PBS稀释100倍，根据以下的经验公式估计噬菌体文库滴度：噬菌体/mL＝OD260×100×22.14×1010，制备好的噬菌体文库可以在4℃保存2周，也可长期冻存于-80℃。
实施例4从噬菌体单域抗体文库中筛选抗CD133胞外段单域抗体
(1)在上海波泰生物科技有限公司合成的CD133胞外段蛋白(序列见GenBANK编号:NP_006008.1)，在NUNC免疫管中加入4mL终浓度为100μg/mL的CD133胞外段蛋白稀释液，置于4℃过夜；
(2)弃步骤(1)中过夜包被液，用PBS缓冲液轻柔冲洗免疫管内壁3次，然后加入4mL2％BSA-PBS封闭液，置于室温2小时；
(3)弃步骤(2)中封闭液，再用PBS缓冲液轻柔冲洗免疫管内壁3次，加入4mL 2％BSA-PBS封闭液(其中包含5×1012个噬菌体)，置于室温1小时；
(4)弃步骤(3)中封闭液，用PBST缓冲液轻柔冲洗免疫管内壁10次，再加入4mL的1％胰酶溶液，置于室温1小时，使噬菌体彻底从免疫管消化下来；
(5)从TG1菌株甘油储存物中挑取TG1菌液，按三区划线法划线于TYE固体培养基上，置于37℃恒温培养箱，培养14～16小时；
(6)挑取步骤(5)中培养基上TG1单菌落接种于5mL 2×TY液体培养基，37℃恒温摇床，250rpm培养过夜；
(7)将步骤(6)中菌液按体积比1：100比例接种至另一含有5mL 2×TY液体培养基的试管中，37℃恒温摇床，250rpm培养至菌液OD600＝0.5。
(8)取步骤(7)得到的菌液加入步骤(4)制备的消化液中，37℃恒温水浴1小时，然后3200g离心5分钟；
(9)弃上清，沉淀用1mL 2×TY液体培养基重悬；取6个含有TYE固体培养基的培养皿(含100ug/ml氨苄青霉素，4％的葡萄糖)，每个板取166μL重悬液进行涂布，涂好的培养皿置于37℃恒温培养箱培养过夜；
(10)取步骤(9)培养过夜的培养皿，每块皿加入2mL 2×TY液体培养基，利用涂布棒将板上细菌刮下；
(11)将刮下的菌液转入含有500mL 2×TY液体培养基的锥形瓶(培养基含4％葡萄糖，100μg/mL氨苄青霉素)，置于37℃恒温摇床，250rpm培养至菌液OD600＝0.5，再加入辅助噬菌体KM13感染菌液，置于30℃恒温摇床，250rpm震荡培养过夜；
(12)取步骤(11)得到的过夜培养物，加入适量的20％PEG进行噬菌体纯化(参考前文步骤进行)，再通过梯度稀释涂板来测定筛选所得的噬菌体文库滴度；
(13)参考前面的方法进行后续4轮的噬菌体文库淘选。
实施例5从文库中挑取单克隆进行ELISA验证
(1)完成5轮噬菌体文库淘选后，取一无菌96孔板，每孔加入200mL的2×TY液体培养基(培养基含100μg/mL氨苄青霉素，4％葡萄糖)，用无菌吸头从第5筛选得到的过夜培养皿上挑取单克隆，接种至含有培养液的96孔板中，37℃恒温摇床，250rpm震荡培养过夜；
(2)取另一无菌96孔板，每孔加入200μL的2×TY液体培养基(培养基含100μg/mL氨苄青霉素，4％的葡萄糖)，吸取5μL步骤(1)得到的过夜培养物，接种至96孔板，之后将板置于37℃恒温摇床，250rpm震荡培养3小时；在步骤(1)中剩余的过夜培养物每孔加入终浓度为20％甘油，制成甘油菌液储存物，长期冻存于-80℃；
(3)将步骤(2)中培养3小时之后的板中的每孔培养物，分别转至无菌1.5mL EP管，管中有50μL包含4×108个辅助噬菌体KM13的2×TY液体培养基，轻柔混匀，将EP管置于37℃恒温孵育1小时；
(4)孵育好之后，将1.5mL EP管3200g离心10分钟，弃上清；沉淀用200μL 2×TY液体培养基重悬(培养基含100μg/mL氨苄青霉素，50μg/mL卡那霉素，0.1％葡萄糖)，25℃恒温摇床，250rpm震荡培养过夜；
(5)将步骤(4)得到的过夜培养物转至另一新的1.5mL EP管，3200g离心10分钟，取上清液再转移到另一个新的96孔板，置于冰箱4℃保存；
(6)每孔加入100μL含有0.2μg CD133胞外段蛋白的PBS缓冲液包被96孔ELISA板，置于4℃过夜；
(7)包被好的ELISA板用PBS洗板3次，再向每孔加入250μL 2％BSA-PBS，室温封闭ELISA板2小时，之后用PBS洗板3次备用；
(8)吸取步骤(5)制备的上清液25μL至新的1.5mL EP管，再加入75μL 2％BSA-PBS中制备噬菌体稀释液，将噬菌体稀释液到步骤(7)中洗好的ELISA板中，室温孵育1小时；
(9)用PBST洗板5次，每孔加入100μL按体积比1:10000稀释的HRP标记抗M13偶联物(2％BSA-PBS稀释)，室温孵育1个小时；
(10)再次用PBST洗板5次，每孔加入100μL TMB溶液，待孔中液体变蓝，每孔加入50μL 1M浓硫酸终止反应，450nm处读取吸光值，并记录实验结果。
实施例6制备DH5α，BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞
(1)取少量大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)菌液以三区划线法分别划线于含有LB固体培养基的培养皿上，之后将培养皿置于37℃恒温培养箱培养14～16小时；
(2)分别从含有LB固体培养基的培养皿上挑取大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)单菌落，分别接种于含有5mL LB液体培养基的试管中，37℃恒温摇床，220rpm震荡培养约12小时；
(3)将两种细菌培养液按1:100的体积比分别接种至含有50mL LB液体培养基的锥形瓶中，37℃恒温摇床，220rpm振荡培养2～3小时至菌液OD 600＝0.5左右；
(4)将步骤(3)培养好的菌液分别转入另外2只无菌50mL离心管，置于冰水混合液中静置10分钟；
(5)将步骤(4)中的离心管置于冷冻离心机4℃，3000g离心5分钟；
(6)弃上清，取10mL预冷的0.1mol/L CaCl2溶液轻柔重悬菌体沉淀，之后将离心管置于冰水混合液中静置30分钟；
(7)离心管置于冷冻离心机4℃、3000g离心5分钟；
(8)弃上清，取3mL预冷的0.1mol/L CaCl2溶液轻柔重悬沉淀；
(9)取3mL预冷的30％的无菌甘油加入步骤(8)，轻柔混匀后，将混合液分装成每管100μL，-80℃长期冻存。
实施例7将表达抗CD133单域抗体的重组质粒转化至DH5α感受态细胞
(一)构建抗CD133单域抗体的重组质粒
(1)将实施例5中的阳性单克隆按体积比1：1000比例接种转接到5mL的2×TY液体培养基(培养基含100μg/mL氨苄青霉素，4％葡萄糖)培养过夜；
(2)以CD133单域抗体的正向及反向引物(正向引物：5’-ATGGCCCAGGTGCAGCTGT-3’；反向引物：5’-TCTGCGGCCGCGCTCGAGAC-3’)，配制25μL的PCR扩增体系，向其中加入1μL步骤(1)得到的过夜培养物，将CD133抗体的核苷酸序列扩增；
(3)将得到的CD133抗体核苷酸序列PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，之后切取凝胶上的目的片段进行胶回收，胶回收产物保存于-20℃备用；
(4)取适量CD133抗体核苷酸序列胶回收产物，向其中加入限制性内切酶NotI与NocI进行酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，之后切取凝胶上的目的片段进行胶回收，胶回收产物保存于-20℃备用
(5)取适量表达载体pET28a，向其中加入限制性内切酶NotI与NocI进行酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，之后切取凝胶上的目的片段进行胶回收，胶回收产物保存于-20℃备用
(6)取适量CD133抗体核苷酸序列酶切后胶回收产物，表达载体pET28a酶切后胶回收产物，加入连接酶，置于37℃连接过夜，得到连接产物。
(二)将抗CD133重组质粒转化至DH5α感受态细胞
(1)从-80℃冰箱中取出一管DH5α感受态细胞，冰上解冻；
(2)取10μL连接产物加入100μL感受态细胞，轻柔混匀，冰上静置30分钟；
(3)将步骤(2)制备的混合物置于42℃恒温水浴锅中水浴90s，之后迅速转移至冰上静置冷却2～3分钟；
(4)取900μL LB液体培养基加入步骤(3)制备的混合液，37℃恒温摇床，200rpm震荡培养1小时；
(5)将培养好的混合液置于离心机，3000g离心1分钟收集混合液沉淀；
(6)弃900μL上清，用剩下的100μL培养液重悬菌体沉淀；
(7)将混匀的菌悬液涂布于预先准备好的含有LB固体培养基的培养皿上(培养基含100μg/mL氨苄青霉素，1％葡萄糖)；
(8)培养皿置于37℃恒温培养箱培养12～16小时，
(9)随机挑取培养皿上数个单克隆，分别接种至5mL LB液体培养基(培养基含100μg/mL氨苄青霉素)，37℃恒温摇床，220rpm震荡培养过夜。
(10)以CD133单域抗体的正向及反向引物(正向引物：5’-ATGGCCCAGGTGCAGCTGT-3’；反向引物：5’-TCTGCGGCCGCGCTCGAGAC-3’)，配制25μL的PCR扩增体系，向其中加入1μL步骤(9)得到的过夜培养物，对单克隆进行菌液PCR验证。
(11)PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，出现目的片段的则为阳性克隆。
(12)对阳性克隆进行质粒抽提，即可得到抗CD133单域抗体的重组质粒。
(13)将得到的阳性克隆进行测序，结果显示，获得两个抗体，命名为HW-145抗体和HW-314抗体，其编码核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
实施例8单域抗体的原核表达，抗体纯化，SDS-PAGE凝胶电泳和考马斯亮蓝染色
(一)单域抗体原核表达
(1)将抗CD133单域抗体的重组质粒转化至BL21感受态细胞(具体步骤参考实施例7)；
(2)从步骤(1)转化后涂布的平板上挑取单菌落，接种至含有5mL LB液体培养基的试管中(培养基含100μg/mL氨苄青霉素，1％葡萄糖)，37℃恒温摇床，220rpm震荡培养12小时；
(3)取步骤(2)培养好的菌液，按1：100体积比接种至含有100mL LB液体培养基的锥形瓶中(培养基含100μg/mL氨苄青霉素)，37℃恒温摇床，220rpm震荡培养2～3小时；
(4)待菌液OD600为0.6～1.0，取1mL菌液用于制备未诱导大肠杆菌全蛋白样品，剩余菌液进行后续实验；
(5)向步骤(4)剩余菌液内加入终浓度为0.25mM IPTG，25℃恒温摇床，220rpm诱导表达6h；
(6)取步骤(5)培养好的菌液1mL用于制备诱导后的大肠杆菌全蛋白样品，剩余菌液置于4℃、5000g离心5min收集菌体沉淀；
(7)弃上清，用20mL预冷的破菌缓冲液重悬步骤(6)得到的菌体沉淀；
(8)菌悬液转移至50mL烧杯，将烧杯置于冰盒中超声破碎菌悬液，超声粉碎机工作功率：40％，工作4秒，停8秒，破碎40分钟；
(9)将破碎好的菌悬液转移到一干净的50mL离心管，4℃，15000g离心40分钟；
(10)收集步骤(9)离心后得到的上清，从中取20μL上清用于制备菌体破碎后上清样品，再取部分沉淀用于制备菌体破碎后沉淀(沉淀用20μl破菌缓冲液重悬)，剩余上清转入另一个干净的50mL离心管中，4℃保存，等待过柱纯化。
(二)单域抗体过柱纯化
(1)取一根Ni-NTA His·Bind Resin纯化柱，用10～15倍柱体积的上样缓冲液冲洗纯化柱；
(2)将步骤(一)得到的上清液加入纯化柱，让上清液以自然流速流过纯化柱，期间取20μL过柱液用于制备过柱液样品；
(4)待上清液全部流过纯化柱，加入10倍柱体积的上样缓冲液冲洗纯化柱；
(5)待步骤(4)中液体流尽，加入20倍柱体积的洗杂缓冲液洗净纯化柱上杂蛋白，期间取20μL洗杂液用于制备洗杂液样品；
(6)待步骤(5)中液体流尽，加入5倍柱体积的洗脱缓冲液将目的蛋白从纯化柱上洗脱，期间用1.5mL EP管收集洗脱液，每管收集洗脱液1mL，共收集5管，再从每管洗脱液中分别取20μL用于制备洗脱液1～5样品；
(7)完成目的蛋白收集后，加入5倍柱体积的6M尿素将纯化柱上剩余的蛋白洗脱，再加入30倍柱体积的蒸馏水清洗纯化柱。
(8)待蒸馏水流尽，取5mL 20％乙醇加入纯化柱，再封闭纯化管上下两端，将纯化柱长期保存于4℃。
(三)SDS-PAGE凝胶电泳和考马斯亮蓝染色
(1)按说明书配制12％的分离胶5mL，加入灌胶模具，使液面距离模具顶部2cm左右，然后加入1.5mL无水乙醇，室温静置30min待分离胶凝固；
(2)将模具内无水乙醇除尽，按说明书配制5％的浓缩胶2mL，加入到灌胶模具至顶部，插入模具配套梳子，室温静置30min待浓缩胶凝固；
(3)将配制好的胶板放入电泳槽内，加入适量电泳液，拔掉梳子，准备上样；
(4)将上述单链抗体表达纯化步骤中收集到的样品分别加入5μL 5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，混匀，置于100℃加热5～10min；
(5)取(4)中制备好的样品5μL加入SDS-PAGE凝胶梳孔，80V电压电泳，待样品跑过浓缩胶，将电压调至110V，电泳至样品蓝色指示带跑至凝胶底部；
(6)向染胶盒中加入适量考马斯亮蓝染色液，取出SDS-PAGE凝胶置于染胶盒，室温染色30min；
(7)弃染色液，使用清水洗净胶上染色液，再加入适量脱色液进行脱色；
(8)待SDS-PAGE胶上目的条带清晰可见，凝胶脱色至透明状，白光下拍照记录。
实验结果表明，获得纯化的HW-145抗体和HW-314抗体。
实施例9采用ELISA检测纯化的抗CD133单域抗体与抗原的结合
(1)取一新的96孔免疫板，每孔加入100μL终浓度为2μg/mL的抗原HER2、EGFR，抗原CD133胞外段混合液，同时包被100μL 2％BSA-PBS缓冲液作为空白对照，板置于37℃恒温培养箱静置2小时；
(2)取出包被好的免疫板，PBS缓冲液洗板3次，除尽板内剩余液体，每孔加入250μL2％BSA-PBS缓冲液，37℃恒温培养箱静置2小时；
(3)取出封闭好的免疫板，PBS缓冲液洗板3次，除尽板内剩余液体，每孔加入100μL稀释了50倍的CD133单域抗体-PBS混合液，将免疫板置于室温孵育1小时；
(4)取出免疫板，PBST缓冲液洗板3次，除尽板内剩余液体，将二抗HRP-protein A用2％BSA-PBS缓冲液按1：5000比例进行稀释，免疫板每孔加入100μL二抗稀释液，室温孵育1小时；
(5)取出免疫板，PBST缓冲液洗板5次，除尽板内剩余液体，每孔加入100μL TMB底物显色液，室温避光孵育10分钟，之后将免疫板置于酶标仪检测OD 450nm吸光值，记录实验数据。
实验结果如图1所示，其中，BSA为空白对照，HER2和EGFR为无关抗原对照，可见，HW-145抗体和HW-314抗体均能与CD133胞外段特异性结合。
实施例10采用MTT方法检测纯化后的单域抗体对肿瘤细胞增殖能力的影响
(1)取一块96孔细胞培养板，每孔加入100μL全培养基(含10％小牛血清的RPMI1640)，其中含有处于对数生长期的肿瘤(DU145或MCF-7)细胞5000个，将培养板置于细胞培养箱37℃，5％CO2培养过夜；
(2)待细胞完全贴壁后，将孔内全培养基换成无血清培养基，培养板置于细胞培养箱饥饿处理4小时；
(3)将步骤(2)饥饿处理后的无血清培养基吸除，每孔分别加入含有不同浓度抗体(0、25、50和100μg/mL)的100μL 1％血清培养基，培养板置于细胞培养箱37℃，5％CO2培养72小时；抗体分别为HW-145、HW-314。
(4)将处理好的培养板内液体吸除，每孔加入含有100μL无血清培养基和20μL MTT溶液的混合液，置于细胞培养箱37℃，5％CO2孵育4小时；
(5)吸除培养板内混合液，每孔加入200μL DMSO，之后将培养板置于摇床快速震荡10min使甲瓒充分溶解；
(6)将培养板置于酶标仪检测570nm处吸光值，记录检测结果。
结果如图2所示，可见，HW-145和HW-314抗体在50μL/mL浓度时即可显著的抑制DU145细胞增殖；抗体HW-145在50μL/mL、抗体HW-314在25μL/mL浓度时即可显著的抑制MCF-7细胞增殖。
实施例11采用流式细胞分析仪检测单域抗体诱导肿瘤细胞凋亡
(1)取一块6孔细胞培养板，每孔加入1mL全培养基，其中含有处于对数生长期肿瘤细胞5×106个，将培养板置于细胞培养箱37℃，5％CO2培养过夜；
(2)待细胞完全贴壁后，将孔内全培养基换成无血清培养基，培养板置于细胞培养箱饥饿处理4小时；
(3)将(2)中孔内培养基吸除，每孔加入无血清培养基1mL，其中含有50μg/mL抗体，培养板置于细胞培养箱37℃，5％CO2培养48小时；
(4)用胰酶将培养板内细胞消化，收集于1.5mL EP管，细胞用PBS缓冲液清洗2次；
(5)取出Annexin V-FITC凋亡试剂盒中的4×结合缓冲液，用ddH2O其稀释成1×，取195μL 1×结合缓冲液将细胞密度调整为5×106个/mL；
(6)取试剂盒中的Annexin V-FITC 5μL，加入步骤(5)制备的细胞混合液，室温避光孵育10～15min；
(7)取200μL 1×结合缓冲液加入到1.5mL EP管中，加入步骤(6)制备的细胞混合液，轻柔混匀；
(8)将步骤(7)中1.5mL EP管置于离心机1000g离心5min，弃上清，取190μL 1×结合缓冲液重悬细胞，再加入10μL PI染色液，轻柔混匀。
(9)流式细胞分析仪检测发生凋亡的肿瘤细胞，记录实验结果。
结果如图3所示，HW-145和HW-314抗体在50μL/mL浓度时可显著的诱导DU145细胞和MCF-7细胞凋亡。
实施例12Transwell侵袭实验检测单域抗体对肿瘤细胞侵袭能力的影响
(1)将无菌Transwell小室(8μm孔径，24孔板)放入24孔细胞培养板，吸取50μLMatrigel基质加入小室内，将板置于细胞培养箱静置数小时，待Matrigel胶完全凝固；
(2)将处于对数生长期的肿瘤细胞用无血清培养基饥饿处理4小时，之后将肿瘤细胞消化并收集备用；
(3)每个Transwell小室的上室分别加入无血清培养基200μL，其中含有5×104个步骤(2)处理好的肿瘤细胞和不同浓度抗体(0、25、50和100μg/mL)，下室加入500μL的含有20％FBS的细胞培养基，将处理好的板置于细胞培养箱37℃，5％CO2培养24小时；
(4)取出培养好的培养板内小室，吸除小室内培养基，并用棉签轻轻擦除小室内Matrigel基质胶上未侵袭的细胞；
(5)向培养板内加入4％多聚甲醇固定小室内细胞10min；
(6)吸除固定液，向培养板内加入500μL 0.5％结晶紫染液对细胞室温染色30min；
(7)将小室取出，用蒸馏水清洗3遍，再将小室正放置于载玻片上，显微镜下拍照记录；
(8)将拍好照的小室放入另一干净24孔细胞培养板，向板中加入100μL 33％乙酸溶液，将结合于细胞上的结晶紫洗脱下来，收集洗脱液，置于酶标仪检测570nm处吸光值，并记录实验结果。
结果如图4所示，HW-145和HW-314抗体在25μL/mL浓度时即可显著的抑制DU145细胞侵袭；HW-145和HW-314抗体在50μL/mL浓度时即可显著的抑制MCF-7细胞侵袭。
实施例中使用到的试剂配制方法如下：
(1)TYE固体培养基
注：将上述试剂溶解于800mL去离子水中，121℃高压蒸汽灭菌30min。待培养基冷却至60℃左右，每19mL培养基加入20μL的100μg/mL氨苄青霉素和1mL 20％葡萄糖，混匀后倒板，4℃保存备用。
(2)2×TY培养基
注：将上述试剂溶解于1L去离子水，121℃高压蒸汽灭菌20min，室温长期保存。
(3)50×TAE DNA电泳缓冲液
注：将上述试剂，溶液溶解于800mL去离子水，再定容成1L，使用时稀释成1×TAE电泳缓冲液，室温保存。
(4)PBS缓冲液(pH＝7.4)
注：将上述试剂溶解于800mL去离子水中，pH值调节至7.4，再定容成1L，121℃高压蒸汽灭菌20min，室温长期保存。在1L PBS缓冲液中加入1mL吐温-20，充分混匀后可配制成PBST溶液。
(5)PEG溶液
注：将上述试剂溶解于500mL去离子水，使用0.2μM过滤器细菌后，4℃保存备用。
(6)LB液体培养基
注：将上述试剂溶解于200mL去离子水，121℃高压蒸汽灭菌20min，4℃保存备用。
(7)LB固体培养基
注：将上述试剂溶解于200mL去离子水，121℃高压蒸汽灭菌30min。待培养基冷却至约60℃，每19mL培养基加入20μL的100μg/mL氨苄青霉素和1mL 20％葡萄糖，混匀后倒板，4℃保存备用。
(8)5×SDS-PAGE电泳缓冲液
注：将上述试剂溶解于400mL去离子水，之后定容成500mL，使用时稀释成1×SDS-PAGE电泳缓冲液，室温长期保存。
(9)5×SDS-PAGE Loading Buffer
注：将上述试剂及溶液混匀，定容成5mL，分装成500μL/份，使用前每小份加入25μLβ-巯基乙醇，室温长期保存。
(10)考马斯亮蓝R-250染色液
注：将上述试剂，溶剂混匀并充分溶解，室温长期保存备用。
(11)考马斯亮蓝染色脱色液
注：将上述溶剂混匀，室温保存。
(12)破菌缓冲液
注：用1L水将上述试剂混匀并充分溶解，-4℃保存，使用时加入100×PMSF储液，PMSF储液的终浓度为1×PMSF储液。上样缓冲液：同破菌缓冲液；洗杂缓冲液：现配现用，量取9.9mL破菌缓冲液，加入100μL 2M咪唑，充分混匀；洗脱缓冲液：现配现用，量取9mL破菌缓冲液，加入2M咪唑1mL，充分混匀。
(13)卡那霉素溶液(50mg/mL)
称取1g卡那霉素粉末充分溶解于20mL去离子水，混合液用0.2μM的滤器过滤除菌，分装成每管1mL，-20℃保存备用。
(14)氨苄青霉素溶液(100mg/mL)
称取1g氨苄青霉素粉末充分溶解于10mL去离子水，混合液用0.2μM的滤器过滤除菌，分装成每管1mL，-20℃保存备用。
(15)2％BSA-PBS缓冲液
称取1g牛血清白蛋白粉末充分溶解于50mL PBS缓冲液，混合液用0.2μM的滤器过滤除菌，现配现用或-20℃长期保存。
(16)1mg/mL胰蛋白酶溶液
称取10mg胰蛋白酶粉末充分溶解于10mL PBS缓冲液，-20℃长期保存。
(17)20％葡萄糖溶液
称取200g葡萄糖粉末充分溶解于1L去离子水，混合液用0.2μM滤器过滤除菌，-4℃保存备用。
(18)1M硫酸溶液
量筒量取9.8mL浓硫酸，缓慢加入187mL去离子水中，充分混匀，室温保存备用。
(19)10％过硫酸铵(APS)
称取0.1g过硫酸铵粉末溶解于1mL去离子水中，分装成200μL每管，-20℃保存。
(20)IPTG溶液(500mM)
称取IPTG粉末11.915g充分溶解于100mL去离子水，混合液用0.2μM滤器过滤除菌，分装成每管1mL，-20℃长期保存。
(21)30％甘油溶液
量筒量取15mL甘油加入35mL去离子水中，充分混匀后用0.22μM滤器过滤除菌，-4℃保存备用。
(22)100×PMSF储液
称取1.74g PMSF粉末充分溶解于100mL异丙醇，充分混匀，-20℃长期保存。
(23)2M咪唑
称取1.14g咪唑粉末充分溶解于10mL破菌缓冲液，-4℃保存备用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 暨南大学
<120> 抗肿瘤干细胞标志蛋白CD133的单域抗体及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HW-145抗体的氨基酸序列
<400> 1
Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Thr Val Ser Asn His
20 25 30
Asp Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Asn Ser Lys Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Ser Lys Ser Gln His Ser Glu Met Ser Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HW-314抗体的氨基酸序列
<400> 2
Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Arg Ile Ser Pro Glu
20 25 30
Val Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Lys Thr Ala Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Val Lys His Gln Val Pro Glu His Phe Asn Phe Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 3
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码HW-145抗体的核苷酸序列
<400> 3
caggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60
tcctgtgcag cctccggaga caccgtttcc aatcacgaca tggcctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gtctagagtg ggtatcaatg attaatatga aggacggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgtgaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attattgcgc gcgctggtcc 300
aagtcccagc actccgagat gtcctactgg ggtcagggaa ccctggtcac cgtctcgagc 360
<210> 4
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码HW-314抗体的核苷酸序列
<400> 4
caggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60
tcctgtgcag cctccggatt tcgtatttcc cctgaggtta tggcctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gtctagagtg ggtatcaacc attaagacgg cagacggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgtgaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attattgcgc gagtgttaag 300
caccaggtgc ctgagcactt taatttttgg ggtcagggaa ccctggtcac cgtctcgagc 360
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 正向引物
<400> 5
atggcccagg tgcagctgt 19
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反向引物
<400> 6
tctgcggccg cgctcgagac 20

Claims (4)

1.一种抗肿瘤干细胞标记蛋白CD133的单域抗体，其特征在于：由1个重链可变区组成，为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的命名为HW-145的抗体或氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的命名为HW-314的抗体。
2.编码权利要求1所述的抗肿瘤干细胞标记蛋白CD133的单域抗体的核苷酸序列，其特征在于：编码所述的命名为HW-145的抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；编码所述的命名为HW-314的抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.权利要求1所述的抗肿瘤干细胞标记蛋白CD133的单域抗体的制备方法，其特征在于：所述的单域抗体通过化学合成方法制备得到；或是通过将编码所述的抗肿瘤干细胞标记蛋白CD133的单域抗体的核苷酸序列克隆至表达载体中，构建重组表达质粒，再将重组表达质粒转入宿主细胞进行抗体蛋白表达、纯化，得到抗肿瘤干细胞标记蛋白CD133的单域抗体。
4.权利要求1所述的抗肿瘤干细胞标记蛋白CD133的单域抗体在制备抗肿瘤抗体药物中的应用。
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