CN102746382A

CN102746382A - 心脏型脂肪酸结合蛋白b细胞表位肽及其抗体和应用

Info

Publication number: CN102746382A
Application number: CN2012102631409A
Authority: CN
Inventors: 黄洪涛; 石延宾; 姚静; 张宪; 胡伟; 魏勇
Original assignee: CHONGQING NOVEAGENE BIOTECH Co Ltd
Current assignee: Chongqing Novegent Biotech Co ltd
Priority date: 2012-07-27
Filing date: 2012-07-27
Publication date: 2012-10-24
Anticipated expiration: 2032-07-27
Also published as: CN102746382B

Abstract

本发明属于医学中的免疫学领域，特别涉及心脏型脂肪酸结合蛋白B细胞表位肽及其单克隆抗体的应用，所述表位肽段如SEQIDNO.5所示，其可用于制备杂交瘤细胞株并分泌相应的单克隆抗体；该单克隆抗体可用于制备检测心脏型脂肪酸结合蛋白的诊断试剂；本单克隆抗体纯度高大于96%，纯化的抗体用间接ELISA法检测效价达1：256000，且特异性好、可大批量制备等优点；通过本发明制备的单克隆抗体、多克隆抗体可用于病人血液心脏型脂肪酸结合蛋白的检测，为急性心肌梗死的早期诊断奠定了基础。

Description

心脏型脂肪酸结合蛋白B细胞表位肽及其抗体和应用

技术领域

本发明涉及医学检测领域，特别涉及心脏型脂肪酸结合蛋白B细胞表位肽，还涉及由该表位肽的制备的单克隆抗体及其应用。

背景技术

心血管疾病是严重威胁人类生命和健康的重要疾病，已成为21世纪人类健康的头号杀手。全球每年有1750万人死于心脏病和其他心血管疾病，约占全球死亡人数的1/3，预计到2020年这个数字将突破2500万，届时心血管疾病将成为人类死亡和致残的首要原因。急性心肌梗死(Acute myocardial infarction，AMI)是心血管疾病的主要类型，发病突然，急性期死亡率约为30%。在我国，急性心肌梗死的发病率呈明显上升趋势，正成为我国心血管领域的重要公共卫生问题。因此，AMI的早期诊断和治疗监测非常重要。

寻找AMI的高特异性、高灵敏度的早期诊断标志物是临床亟待解决的热点问题。对AMI早期正确诊断，以便进行及时有效的治疗，是改善预后、降低AMI急性期病死率提高患者生存率的关键。临床上虽然可以通过患者的临床表现、心电图对典型AMI病例进行有效诊断及预后判断，但是对一些非典型病例仍然需要通过心肌损伤标志物的检测进行早期诊断。目前，用于诊断AMI的指标主要有肌酸激酶同工酶MB (creatine kinase isoenzyme MB，CK-MB)、心肌肌钙蛋白T ( cardiac troponin T，cTnT)、心肌肌钙蛋白I ( cardiac troponin I，cTn I)和肌红蛋白（Myoglobin，Mb）等，但它们对于早期诊断AMI均不够理想，主要原因是CK-MB、肌钙蛋白I、肌钙蛋白T缺乏足够的敏感性(胸痛后4~8小时后浓度才上升)。而肌红蛋白早期敏感性虽高(胸痛后2~3小时浓度上升)，但特异性较差，不能区分骨骼肌损伤和心肌损伤，也不是一个理想的早期诊断指标。

心脏型脂肪酸结合蛋白（heart type fatty acid-binding protein，H-FABP）是存在于心肌细胞胞质内的小分子可溶性蛋白质，分子质量约为15KD，其作用是与细胞内长链脂肪酸结合，促进细胞内长链脂肪酸转运，将其转运至线粒体，进入线粒体后参加β氧化，并最终生成ATP，后者是心肌收缩的主要能量来源。经研究发现H-FABP对于AMI的早期诊断更具有特异性和敏感性，有望成为理想的早期诊断AMI的生化指标。新近发现，H-FABP可弥补CK -MB、cTnI和Mb检测的不足，对于AMI的早期诊断更具有特异性和敏感性，有望成为理想的AMI的早期诊断生化指标。主要是由于H-FABP具备以下特点：①心肌特异性高：大量地存在于心肌组织中，在心肌中比骨骼肌高10倍，在肾脏、肝脏、小肠中水平很低；②敏感性高：由于H-FABP的相对分子质量小，当心肌细胞缺血时，H-FABP可快速从心肌细胞释放，并迅速进入到血液中，在心肌损伤发生20分钟内可被检测到，3～4 小时内可检测到其峰值，20-24小时后回到正常值。而且，H-FABP在AMI发生3 小时内的敏感度显著高于肌红蛋白(72. 3 % Vs 57. 4 %)。上述特点表明，H-FABP对早期诊断和排除AM I是一个有用的生化标志物，是早期检测心肌损伤的理想指标。目前，对于H-FABP的B细胞表位肽未见相关报道。

发明内容

本发明的目的之一在于提供心脏型脂肪酸结合蛋白B细胞表位肽，与载体蛋白交联后能够刺激免疫体统产生免疫反应，制备成杂交瘤细胞株后能产生单克隆抗体。

为实现上述发明目的，技术方案为：

心脏型脂肪酸结合蛋白B细胞表位肽，所述心脏型脂肪酸结合蛋白B细胞表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明的目的之二在于提供心脏型脂肪酸结合蛋白B细胞表位肽的衍生物，技术方案为：

含有权利要求1所述心脏型脂肪酸结合蛋白B细胞表位肽的衍生物，所述心脏型脂肪酸结合蛋白B细胞表位肽的衍生物为N端引入半胱氨酸的心脏型脂肪酸结合蛋白B细胞表位肽与载体蛋白的交联体。

优选的，所述载体蛋白为血蓝蛋白、牛血清白蛋白或鸡卵白蛋白。

本发明的目的之三在于提供由心脏型脂肪酸结合蛋白B细胞表位肽的衍生物制备的杂交瘤细胞株，技术方案为：

所述心脏型脂肪酸结合蛋白B细胞表位肽的衍生物制备的杂交瘤细胞株。

优选的，所述杂交瘤细胞株的生物保藏号为CCTCC NO：C201269。

本发明的目的之四在于提供杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体，技术方案为：

所述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。

本发明的目的之五在于提供单克隆抗体的应用，技术方案为：

所述的单克隆抗体在制备检测心脏型脂肪酸结合蛋白的诊断试剂中的应用。

本发明的有益效果在于：心脏型脂肪酸结合蛋白B细胞表位肽，该表位肽的抗原性好，能够刺激免疫系统产生免疫反应，免疫后血清效价达到1:3200，因此该表位肽可用于制备杂交瘤细胞株并分泌相应的单克隆抗体，单克隆抗体的纯度大于96%，纯化后的抗体用间接ELISA法检测效价达1：256000用间接ELISA法检测效价达1：256000，且特异性好，可大批量制备，通过本发明制备的单克隆抗体和多克隆抗体可用于病人血液心脏型脂肪结合蛋白的检测，能够用于急性心肌梗死的早期诊断，为临床治疗急性心肌梗死提供指导。

培养物保藏

本发明中杂交瘤细胞株3-Fabp送中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO: C201269，地址位于中国武汉武汉大学，保存日期为2012年6月6日，保藏的培养物名称为杂交瘤细胞株3-Fabp。

附图说明

图1为纯化后的H-FABP重组蛋白SDS-PAGE电泳分析图。

图2为H-FABP单克隆抗体的纯化色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件如分子克隆：实验手册（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989）和现代免疫学实验技术（沈关心周汝麟主编）中所述的条件或制造商建议的条件进行或配置，未注明来源的产品均可通过市场途径获得。

实施例1、H-FABP重组蛋白的制备

通过逆转录PCR扩增H-FABP基因编码区核苷酸序列，克隆入原核表达载体pET28a，经测序鉴定后诱导蛋白表达，经性质鉴定后，纯化制备的H-FABP重组蛋白，该重组蛋白可用于制备多克隆抗体的免疫原及筛选原，同时可以作为后续建立H-FABP检测时的校准品，具体的：

根据报道的可参考心脏型脂肪酸结合蛋白（heart type fatty acid-binding protein，H-FABP）的基因序列（Genbank：NM_004102），其编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。翻译为氨基酸后相应的多肽序列如SEQ ID NO.2所示，编码133个氨基酸，具体为：

MVDAFLGTWK LVDSKNFDDY MKSLGVGFAT RQVASMTKPT TIIEKNGDIL TLKTHSTFKN

TEISFKLGVE FDETTADDRK VKSIVTLDGG KLVHLQKWDG QETTLVRELI DGKLILTLTH

GTAVCTRTYE KEA

上述氨基酸的中英文对照如下：

谷酰胺gln Q；甘氨酸 gly G；丝氨酸 ser S；丙氨酸 ala A；苏氨酸 thr T；缬氨酸 val V；异亮氨酸 ile I；亮氨酸 leu L；酪氨酸 tyr Y；苯丙氨酸 phe F；组氨酸 his H；脯氨酸 pro P；天冬酰胺 asn N；甲硫氨酸 met M；谷氨酸 glu E；色氨酸 trp W；赖氨酸 lys K；半胱氨酸 cys C；精氨酸 arg R；天冬氨酸Asp D

用Trizol Reagent法提取心脏总RNA，然后用ToYoBo FSK-100试剂盒逆转录制备心脏cDNA。H-FABP基因的核苷酸序列设计扩增编码区的上、下游引物，上游引物为5’-catgccatggtggacgctttcctgg-3’（SEQ ID NO.3），下划线处为Nco

酶切位点，下游引物为5’-ccgctcgagttatcatgcctctttctcataagtgc-3’（SEQ ID NO.4），下划线处为Xho

酶切位点，引物序列由Invitrogen公司合成。以制备的cDNA为模板，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO.4的序列为引物，扩增H-FABP基因编码区序列，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（普通离心柱型）回收PCR产物。测序结果与报道的H-FABP基因编码区序列一致。

对H-FABP基因的糖基化位点进行预测分析，发现该蛋白序列上无糖基化位点。因此，结合原核体系大肠杆菌特点，选择大肠杆菌表达体系，使用菌株Escherich coli BL21，具有成本低、遗传背景清楚、周期短等优点。选用的基因表达载体pET28a具有基因表达载体应有的优点，且携带Kan⁺基因，易于筛选。

利用Nco I和 Xho I双酶切pET28a载体后与经同样酶切的H-FABP基因连接，得pET28a-H-FABP载体，连接反应为4℃过夜，然后将pET28a-H-FABP载体转化DH5α感受态细胞，并将其涂于含有卡那霉素的LB琼脂平板上，37℃培养过夜。次日挑取单个白色菌落扩大化培养，将扩大培养的菌体用于提取质粒，取10μL质粒用Nco I和 Xho I双酶切后用质量分数为1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果显示pET28a-H-FABP重组质粒经过双酶切切下了约400bp大小的片段，证实pET28a-H-FABP重组载体构建成功。

将pET28a-H-FABP重组载体转化大肠杆菌BL21感受态细胞，过夜培养后挑取单个菌落37℃扩大化培养。取100μL菌液接种于5mL含50μg/L卡那霉素LB培养液，37℃摇菌至OD600达到0.6～0.8时，加入IPTG(至终浓度1mmol/L)诱导表达6小时。

分析表达情况：培养后每克湿菌以10倍体积的PBS缓冲液(pH7.3)重悬，混匀后超声破菌，破菌完全后于4℃ 10000rpm离心15分钟，上清以0.45μm微孔滤膜过滤。分别取少量上清与沉淀SDS-PAGE电泳鉴定目的蛋白可溶性。将诱导表达的菌液超声破菌后收集沉淀，沉淀用20mmol/L Tris HC1(pH8.0)充分重悬，悬液缓慢滴加入约100mL包涵体溶解液中，磁力搅拌溶解数小时(视溶解情况而定)，6000rpm离心20分钟，取上清，0.45μm滤膜过滤。将溶解的包涵体与复性液按1：1比例混合后，于4℃放置2h后，装入透析袋，用0.02mol/L Tris HCI溶液pH8.0，4℃透析过夜，期间需更换液3～4次。采用高效的Q Sepharose F.F.阴离子层析柱等方法纯化重组蛋白，采用BCA法(按碧云天BCA蛋白测定试剂盒说明书操作)测定H-FABP重组蛋白浓度。采用HPLC测定纯化后H-FABP重组蛋白的纯度。

结果：诱导表达后的菌液进行SDS-PAGE电泳，结果如图1所示，发现预期分子量(14～15kD)附近出现了诱导表达的目的条带。经过IPTG诱导筛选出的高表达菌株进行扩大化培养及大量诱导表达，经鉴定表达物破菌后几乎都存在沉淀中，为包涵体表达。凝胶自动扫描分析显示，目的蛋白的表达量超过了菌体蛋白的30%。将包涵体溶解并复性处理，复性后的蛋白溶液用0.45μm滤膜过滤，然后使用Q Sepharose F.F.阴离子层析柱(Amersham XK 16/20)纯化重组H-FABP多肽。纯化后的重组蛋白SDS-PAGE电泳分析可见在约15kD处出现清晰可见的粗大条带。纯化后用BCA法测得H-FABP重组蛋白浓度为0.48mg/mL，检测其纯度为95％。

Lowry法测定H-FABP重组蛋白含量（Lowry法测定的试剂盒购于上海美季生物技术有限公司）

试剂A：1） 10克 Na₂CO₃，2克 NaOH和0.25克酒石酸钾钠（KNaC₄H₄O₆·4H₂O）。溶解于500毫升蒸馏水中；2） 0.5克硫酸铜（CuSO₄·5H₂O）溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前，将50份（A）与1份（B）混合，即为试剂甲。

试剂B：在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠（Na₂WO₄·2H₂O）,25克钼酸钠（Na₂MoO₄·2H₂O）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克硫酸锂（Li₂SO₄），50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1N左右。

标准蛋白质溶液：精确称取结晶牛血清清蛋白，溶于蒸馏水，浓度为250 mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用0.9 % NaCl溶液。

详见表1：

表1、Lowry法测定H-FABP重组蛋白含量

在650nm波长下，以空白管为对照调零，分别测定各管的吸光度，以蛋白浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，制作标准曲线。将待测蛋白稀释后，紫外分光光度计测定A260值与A280值。根据公式，蛋白浓度C=(1.45×A280－0.75×A260)×稀释倍数，计算出待测蛋白的粗略浓度，然后将蛋白样品用蒸馏水稀释至 25～150μg范围，按照上表的操作程序反应，测定处650nm吸光度值，然后在标准曲线上查出相应的浓度，再乘以稀释倍数即为待测蛋白的浓度，多管计算平均值，测得浓度为1.10g/mL。

高效液相色谱法（HPLC）进行纯度测定和H-FABP重组蛋白获得量计算

将纯化的蛋白用HPLC分析其纯度，可知经SP Sepharose Fast Flow阳离子交换柱初纯化后H-FABP多肽的纯度达92%以上，再次过分子筛纯化后H-FABP重组蛋白纯度可达98%。经计算，每升诱导菌可获得9.5mg H-FABP重组蛋白。

实施例2、H-FABP的B细胞表位肽的制备

根据H-FABP的氨基酸序列，采用DNAStar Lasergene软件包中的Protean软件，对H-FABP的亲水性，抗原指数及其二级结构中的柔性区域进行分析，并结合抗原指数预测法预测其B细胞表位。并利用Chou & Fasman预测β转角、Emini法预测抗原表面可及性、Karplus& Schulz法预测蛋白柔韧性、Kolaskar & Tongaonkar蛋白质抗原性分析、Parker法蛋白质疏水分析和Bepipred线性抗原表位预测等技术参数，筛选H-FABP 的B细胞表位肽，具体为位于SEQ ID NO.2中第32-47位氨基酸残基（QVASMTKPTTIIEKNG，SEQ ID NO.5），为了提高B细胞表位肽与载体蛋白的交联能力，在B细胞表位肽N端通过肽键引入半胱氨酸，即CQVASMTKPTTIIEKNG。

化学合成上述多肽序列，然后与载体蛋白（血蓝蛋白，KLH）交联。具体步骤为，用甲基丙烯酸甲酯、丁二烯、苯乙烯三元共聚物(MBS)活化KLH，使KLH上面的自由-SH与多肽N端引入的半胱氨酸的侧链-SH连接起来。此步骤也可以用碳二亚胺（EDC）活化KLH，使KLH上结合-COOH基团，然后与多肽N端引入的半胱氨酸-NH2基团连接，获得肽-载体蛋白交联体，命名为心脏型脂肪酸结合蛋白B细胞表位肽的衍生物，简写为H-FABP’。多肽与载体蛋白的交联率大于50%，交联后保存于-80℃冰箱，备用。

本实施例中载体蛋白可以用免疫学领域常用的载体蛋白替代，如牛血清白蛋白 (Bovine Serum Albumin，BSA)、鸡卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)等均可实现发明目的。

实施例3、单克隆抗体的制备与鉴定

一、B细胞表位肽衍生物免疫Balb/c小鼠

将实施例1保存于-80℃冰箱的H-FABP’取出作为抗原，溶解后过滤。然后选取6周龄、体重约20g的雌性Balb/c小鼠免疫。首次免疫时，将H-FABP’与等体积的弗氏完全佐剂乳化混合，并用双注射器互推法乳化抗原，得抗原混合物。每只小鼠注射100μg的抗原混合物；注射后第14和第28天分别进行第二次第三次免疫，免疫用抗原相同，佐剂改用不完全弗氏佐剂，抗原量、注射体积和途径不变。第3次免疫后用间接ELISA法测定效价，融合前3天进行加强免疫，每只小鼠腹腔注射不加佐剂的100μg H-FABP’，3天后细胞融合。

二、被免疫Balb/c小鼠血清效价测定

（1）材料、试剂、溶液

① 酶标反应板、微量移液器、洗板机、酶标板振荡器、37℃孵箱、酶标仪

②包被稀释液（0.05M pH9.6 Na₂CO₃/NaHCO₃缓冲液）

分别称量1.59g Na₂CO₃，2.93g NaHCO₃，0.2g Na₃N₃ 蒸馏水定容至1000mL，NaOH调节pH至9.6。

③封闭液（1×PBS（pH7.2～7.4）2‰Tween-20 ）

分别称量0.2g KH₂PO₄，2.9g Na₂HPO_４·12H₂O，8.0g NaCl，0.2g KCl，2mL Tween-20，蒸馏水定容至1000ml，调节pH至7.2～7.4。

④洗涤液（PBST pH7.2～7.4）：

A液：1×PBS（pH7.2～7.4）1‰Tween-20

分别称量0.2g KH₂PO₄，2.9g Na₂HPO_４·12H₂O，8.0g NaCl，0.2g KCl，1ml Tween-20，蒸馏水定容至1000ml，调节pH为pH7.2～7.4。

B液：1×PBS（pH7.2～7.4）

⑤抗体稀释液：同洗涤液

⑥酶标二抗

单抗：辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(H＋L)0.8mg/ml　1∶2000稀释为工作浓度

多抗：辣根酶标记山羊抗兔IgG(H＋L) 0.8mg/ml　1∶2000稀释为工作浓度

⑦底物液：OPD-H2O2

A液：0.1M柠檬酸、0.2M Na₂HPO_４溶液

分别称量10.206g柠檬酸，36.854g Na₂HPO_４·12H₂O，蒸馏水定容至1000ml。

　B液：20×OPD储存液

取0.8g OPD溶于100mlA液中，1ml/支分装后避光存储于－20℃。临用A、B液按20∶1混合后，加入30％（v/v）的H₂O₂ 50μl，即成底物应用液。

⑧终止液：2M H₂SO₄

双蒸水600ml，浓硫酸100ml（缓慢滴加并不断搅拌），加双蒸水至900ml。

不完全培养基配制：将RPMI 1640干粉1袋，溶于900 ml纯水中，加青链霉素溶液1ml，加去离子纯水至1L，磁力搅拌30min，pH调为7.4，0.22μm 滤膜过滤除菌后分装，－20℃贮存）不完全培养基为RPMI 1640不完全培养基。

完全培养基：为RPMI 1640完全培养基，配制方法为：RPMI 1640不完全培养基192ml，胎牛血清50ml，1mol/L HEPES溶液2ml，7.5% NaHCO₃2ml，1mol/L丙酮酸钠溶液2ml，0.2 mol/L谷氨酰胺溶液2ml。

（2）测定步骤：

第3次免疫后10天从小鼠尾静脉取血检测血清抗体效价。将新购酶标板用双蒸水浸泡过夜，晾干后备用；用包被液将实施例1所得H-FABP’（抗原）稀释为最佳工作浓度5μg/mL，每孔加100μL抗原稀释液，37℃温育1小时后，以胶带封口，于4℃过夜。倒尽板孔中液体，吸干孔内残余反应液，加满洗涤液过一次，再注满洗涤液缓缓晃动2分钟，倾去，反复五次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。自然干燥后以胶带封口，此为H-FABP’（抗原）包被的酶标板，加封闭液300μL，37℃孵育1.5小时，洗涤5次；采血及稀释血清：捏住鼠尾，75%酒精消毒后用剪刀在尾静脉剪一缺口，取血20μL，2000rpm离心30min，取上清1μL加入999μL抗体稀释液混匀，然后进行体积倍比稀释，从1:100至1:3200，将稀释的被检血清每孔加入100μL，同时取小鼠免疫前血清1:100稀释做阴性对照，抗体稀释液做空白对照。37℃孵育1～1.5小时，洗涤5次；将辣根过氧化物酶羊抗小鼠IgG（上海亿欣生物科技有限公司）按体积比为1:10000稀释，每孔加100μL稀释液，37℃孵育1.5小时，洗涤5次；加邻苯二胺溶液100μL /孔，室温暗处15分钟，每孔加终止液100μL观察结果，辣根过氧化物酶底物（OPD）急性心肌梗死的早期诊断氧化后的产物呈橙红色，用酶联免疫检测仪记录495nm读数，以空白对照孔调零后测各孔OD值大于阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性，血清效价达到1:3200，可用于细胞融合。

三、小鼠脾细胞悬液和SP2/0细胞悬液的制备

取免疫好的Balb/c小鼠，摘除小鼠眼球放血处死，眼血离心后收集血清作ELISA的阳性对照，无菌操作取出脾脏，放入盛有10mL不完全培养基的玻璃皿中，洗涤，小心剥去周围的结缔组织和脂肪组织，换一玻璃皿，将脾脏捞出，置于200目不锈钢网中，用注射器的内芯研磨，不时用不完全培养基冲洗，使脾细胞穿过网孔进入溶液中，将脾细胞移至10mL玻璃离心管中，800rpm水平离心10min，去上清。同法用不完全培养基10mL洗涤细胞1次，离心收集沉淀的细胞，将细胞用10mL不完全培养基重悬混匀，细胞计数约为1×10⁸个细胞。

将骨髓瘤细胞SP2/0从液氮中取出（骨髓瘤细胞SP2/0由本实验室保存），迅速放入37℃水浴中，不断摇晃，直至细胞溶液完全溶解，将细胞转移到10mL离心管中，800rpm水平离心10min，弃上清，10mL完全培养液重悬沉淀，把细胞悬液转移到50mL培养瓶中，置37℃、5%CO₂培养箱中培养。待细胞生长良好后用含8-AG的选择培养基（含8-AG（1×）的完全培养基稀释；8-AG (50×)购自 SIGMA公司）筛选细胞一周；融合前2天，将1瓶细胞传至4瓶，则融合当天细胞正处于对数生长期，活力正好，细胞大小均匀，圆而透亮，融合当天，用弯头滴管将骨髓瘤细胞SP2/0从管壁上轻轻吹下，收集于离心管中，离心，弃上清，沉淀用不完全培养基洗涤后，10mL不完全培养基重悬，细胞计数，约为5×10⁷。

四、滋养细胞的制备

取一只未免疫的Balb/c小鼠，摘眼球放血处死，75%乙醇浸泡消毒5min，剪开小鼠皮肤，用镊子提起腹膜，用剪刀剪一小口，弯头滴管吸取预冷的不完全培养基冲洗腹腔，将洗液吸至50mL离心管中。同法用不完全培养基冲洗腹腔3次，收集洗液，室温下1000rpm水平离心10min，去上清，加入10mL不完全培养基重悬细胞并计数。

五、骨髓瘤细胞和脾脏B淋巴细胞融合

融合前将PEG1500置于37℃培养箱中预温，吸取1×10⁷个骨髓瘤细胞悬液SP2/0和1×10⁸个小鼠脾细胞悬液（骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞的细胞数比例为1:10）至一个50mL离心管中，补加30mL不完全培养基，充分混匀，1000rpm离心10分钟，弃上清，轻弹管底，使细胞团松散成糊状，将离心管37℃水浴，用滴管吸取0.8mL预温的质量分数为50% PEG1500溶液，在离管底约2cm处沿管壁慢慢加入细胞中，边加边转动离心管，在1分钟左右加完，然后静置90秒，逐滴加入37℃预温的不完全培养基30mL终止融合，3分钟之内加完，速度先慢后快，动作轻柔，将离心管在37℃培养箱中静置5分钟，取出离心管，1000rpm离心5分钟，弃去上清，加入10ml HAT培养基重悬细胞，轻轻吹打，混匀，将融合细胞接种至已铺有滋养细胞的96孔细胞培养板，按100μL/孔，每块培养板留6孔接种SP2/0细胞，作为HAT选择的阴性对照，置37℃，体积分数为5% 的CO₂培养箱中培养。

六、融合细胞的选择性培养及杂交瘤细胞株的筛选

融合后第5天即可在倒置显微镜下观察细胞的生长情况，并补加HAT培养基100μL，第14天换HT培养基培养。融合后10～14天，待细胞长到满培养孔的1/2孔底时，采用间接ELISA法检测培养上清，筛选阳性克隆；以上述方法制备的重组H-FABP多肽抗原包被酶标板（0.5μg/孔），4℃过夜，洗涤缓冲液洗涤5次，每次5分钟，拍干液体，每孔加入封闭液300μL，37℃孵育2小时，加入100μL细胞培养上清，阳性对照选小鼠的免疫血清，阴性对照选SP2/0培上清，空白对照用洗涤液，37℃孵育2小时；洗涤酶标板：每孔加入100μL 1：10000稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体，37℃孵育2小时；洗涤，拍干液体，加新鲜配制的邻苯二胺溶液100μL /孔，室温暗处反应10～15分钟，加终止液每孔100μL终止反应，酶标仪检测450nm吸光度值。结果为以H-FABP’为抗原，免疫 BALB/C小鼠，融合成功后，经克隆化和ELISA筛选后，得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分泌的单克隆抗体命名为H-FABP单克隆抗体，其细胞培养上清效价达到1:6400。该杂交瘤细胞株经数次冻存，体外传代培养3个月以上仍能稳定分泌H-FABP单克隆抗体。

七、阳性杂交瘤细胞株的克隆化

筛选出阳性克隆后，立即采用有限稀释法将阳性杂交瘤细胞株进行克隆化培养，制备饲养细胞，用10mL不完全培养基重悬，收集阳性克隆细胞并计数，用不完全培养基将阳性克隆细胞稀释到100个/20mL，取一块预先已加有滋养细胞的96孔细胞培养板，加入200μL细胞悬液，将剩下的阳性克隆细胞转移到24孔板中扩大培养，收集细胞液氮冻存，同时将培养板在37℃，体积分数为5% 的CO₂培养箱培养，第3天后显微镜下观察细胞生长情况，10天后用ELISA法检测效价，并将最强的阳性克隆再次克隆化，直至细胞阳性率达100%，即可定株；测取定株的杂交瘤细胞株培养上清的效价后再将定株的杂交瘤细胞株扩大培养，并送中国典型培养物保藏中心保藏，地址位于中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC NO: C201269，其可稳定分泌H-FABP单克隆抗体。

八、小鼠腹水制备、抗体纯化及效价测定

选用健康雌性Balb/c小鼠10只，腹腔注射0.5ml灭菌石蜡油/鼠，1-2周后每只小鼠腹腔注射0.5×10⁶～1×10⁶个杂交瘤细胞株，同时注射0.25ml等量混合的液体石蜡与不完全弗氏佐剂的混合物。小鼠明显产生腹水后拉颈处死，用吸管从腹腔取出腹水，4℃离心15min，分离收集中段的澄清腹水液。选用HiTrap rProtein A HP柱接入AKTA Explorer纯化抗体，结果如图2所示，经SDS-PAGE检测纯度大于96%。纯化的抗体用间接ELISA法检测效价达1：256000，初步说明获得的H-FABP单克隆抗体对H-FABP’抗原分子有较高结合能力，分装冷冻保存。

九、H-FABP单克隆抗体的亲和力测定

为检验H-FABP单克隆抗体的对H-FABP’抗原的结合能力，运用基于抗原/抗体竞争结合原理的单抗亲和力常数(Kd)检测方法对所获单抗进行亲和力测定。将H-FABP’（抗原）溶解在0.05mol/l的碳酸缓冲液(pH9.5)中，调整其的终浓度为1μg/ml，于ELISA板孔中每孔加100μL，胶带封闭条板4℃过夜。次日拍干孔中液体，以含1%BSA的PBS溶液对各孔封闭2小时，洗板并干燥后4℃保存备用。根据测定原理及方法建立抗原抗体反应系统，H-FABP单克隆抗体初始反应浓度稀释至40ng/mL，重组多肽抗原初始浓度稀释至360mg/mL。抗原浓度倍比稀释按30、15、7.5、3.75、1.875、0.938、0.469、0.235(单位为10^-12mol/L)进行，计算H-FABP单抗的亲和力常数。结果显示其具有高亲和力， Kd=2.18×10^-8mol/L。实验步骤详见《现代免疫学实验技术》（沈关心周汝麟主编）。

实施例4、H-FABP多克隆抗体的制备与鉴定

一、免疫动物

以H-FABP重组蛋白为抗原，采用背部皮下及四肢多点注射免疫新西兰大白兔。免疫程序：基础免疫前耳缘静脉取血5mL分离血清作为阴性对照。每只用抗原500μg与等体积完全弗氏佐剂充分乳化后进行注射，首次免疫后3天用等量抗原配以完全弗氏佐剂加强免疫，第28天用等量抗原配以不完全弗氏佐剂第3次免疫。第3次免疫后7天，耳缘静脉取血5mL分离血清，用间接ELISA检测抗血清的效价。效价达1:32000时颈动脉插管收集全血，4℃放置过夜，4000rpm离心收集血清，-70℃保存。效价达不到要求可再加强免疫1次。

二、特异性亲和纯化抗体

将待纯化的血清用上样缓冲液（0.1M磷酸钠，0.1M柠檬酸三钠，pH7.0）适当稀释后加入到Protein A柱中，用洗脱缓冲液（0.1M磷酸钠，0.1M柠檬酸钠，pH3.0）洗脱柱子，收集单峰。收集的纯化产物再经抗原抗体特异性亲和纯化，得到纯化的H-FABP多克隆抗体。将纯化后的抗体通过斑点杂交的方式鉴定其识别并结合抗原的能力。

抗原抗体特异性亲和纯化方法：H-FABP重组蛋白（抗原）用buffer A（0.1mol/L碳酸氢钠，0.5mol/L氯化钠，pH 8.0），按照buffer A: 样品的体积比为0.5:1处理，将填料NHS-activated Sepharose 4FAST Flow装柱，室温下将H-FABP重组蛋白偶联在柱上，清洗过量的抗原后，备用。反复上样，保证特异性的H-FABP多克隆抗体与柱结合，用100mol/L甘氨酸，pH 2.5洗脱，特异性抗体直接被洗脱收集入1mol/L Tris（pH 9.0），通过纯化获得H-FABP多克隆抗体，证实了H-FABP重组蛋白具有较好的免疫原性，多抗效价可达1：512000。获得的多抗-20℃保存备用。实验步骤详见《现代免疫学实验技术》（沈关心周汝麟主编）。

实施例5、双抗体夹心ELISA检测人血H-FABP

一、操作方法

用0.05 mol/L碳酸盐缓冲液（pH 9.6）稀释H-FABP单克隆抗体包被酶标板H-FABP单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO: C201269的杂交瘤细胞株分泌或体内诱生法所得，100μL/孔，4℃过夜，用洗液（0.05% PBST，pH 7.4）洗3次；5% BSA封闭，200μL/孔，37℃孵育2小时后洗3次；加入标准品（H-FABP重组蛋白）和待测血清样本，100μL/孔，标准品做倍比稀释。37℃孵育1小时后洗3次；加入H-FABP多克隆抗体，100μL/孔，37℃孵育1小时后洗3次；再加入HRP标记的羊抗兔IgG（上海亿欣生物科技有限公司），37℃孵育45分钟后用洗涤液（0.1% PBST，pH 7.4）洗6次；加3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）底物，100μl/孔，37℃显色10分钟，以2mol/L硫酸终止反应，在酶标板450nm处测吸光度值（OD₄₅₀）。

二、ELISA最佳反应条件的确定

用棋盘滴定法确定各抗体的最佳工作浓度，将H-FABP单克隆抗体按照1:2000、1:10000、1:50000稀释3个浓度包被酶标板，阳性对照（0.5μg/ml H-FABP重组蛋白为标准品）和阴性对照（PBS）为样品，H-FABP多克隆抗体按1:2000、1:5000、1:10000稀释3个浓度，HRP标记羊抗兔IgG按实际说明书推荐稀释度，按照上述实验步骤操作，确定抗体的最佳工作浓度。然后将HRP标记羊抗兔IgG倍比稀释，再次做棋盘滴定。使阳性对照OD₄₅₀值在1.5左右，阴性对照OD₄₅₀值小于0.1的条件下为最佳，初次结果不理想，可进一步缩小或扩大稀释度以取得抗原抗体的最佳反应浓度。结果：在捕获抗体（所述H-FABP单克隆抗体）稀释度为1:10000、夹心抗体（为实施例3所得H-FABP多克隆抗体）的稀释度为1:5000和所述HRP标记的羊抗兔IgG稀释度为1:5000条件下该ELISA检测方法的性价比最高。

实施例6、检测人血H-FABP的胶体金免疫层析试纸的制备

制备检测人血H-FABP的胶体金免疫层析试纸，主要包括：

（1）胶体金的制备：用柠檬酸三钠还原氯金酸（HAuCl₄）得微粒直径在40～60nm的胶体金，具体为，分别配置0.01%的HAuCl₄水溶液和1.0%柠檬酸三钠水溶液；将0.01%的HAuCl₄溶液1000mL置烧杯中，加热至沸腾；加入1.0%柠檬酸三钠水溶液6.5mL，搅匀；继续煮沸10～15分钟至溶液透明；冷却至室温，加纯水恢复至原体积；

（2）胶体金标记的H-FABP多克隆抗体的制备：1）将实施例4获得的H-FABP多克隆抗体用pH7.2、浓度为0.1M PBS稀释至蛋白浓度为1.2mg/mL；2）将稀释的抗体溶液加入到胶体金溶液中，室温反应10分钟，不时缓慢搅动；3）加入 pH7.2、浓度为0.1M PBS-0.01%BSA缓冲液，纯化浓缩胶体金标记的抗体；

（3）将胶体金标记的H-FABP多克隆抗体包被到玻璃纤维素片上制得免疫胶体金纤维素结合垫。

（4）将实施例2制得的H-FABP单克隆抗体稀释至2.0mg/ml，羊抗鼠IgG（为抗H-FABP多克隆抗体的二抗）稀释至2.5mg/ml，将两种溶液喷点于硝酸纤维素膜的检测带与质控带，干燥，获得免疫硝酸纤维素膜检测反应区；

（5）试纸条组装：所述的层析试纸的组成包括：样品垫、结合垫（玻璃纤维素膜）、检测反应区（硝酸纤维素膜条）、吸水垫依次固定于塑料板条上，组装成检测人血H-FABP的试纸条。样品垫是滴加被检样品的部位；结合垫中含有胶体金标记抗体结合物，其中的抗体可特异性地结合检测样品中可能存在的H-FABP被检物；检测带与质控带均固定于检测反应区膜的某一具体位置；吸水垫通过虹吸作用提供液体流过整个试纸条的动力。各个部分之间的重叠区域保证了液体在试纸条上流动的连续性。

所述的试剂条的检测原理，具体的，将待测生物样本滴加到样品垫上，样品通过渗透与虹吸作用进入结合垫，其中胶体金抗体结合物重新溶解游离，并与样品中可能存在的被检物发生免疫反应；生成的免疫复合物以及游离的胶体金抗体结合物在吸水垫的作用下，离开结合垫进入检测反应区，并在其内部向吸水垫的方向流动，此过程中免疫复合物以及游离的胶体金抗体结合物将和检测带以及质控带上的生物活性分子特异性的发生反应，显示检测结果。

所述的待测生物样本是指来自受试者血液、血清或血浆，优选受试者血清。

所述的试剂条检测带的结果判读，由于复合物中胶体金呈红色，因此在检测带位置显示出一条红色线条，为阳性结果；如果待测样本中无H-FABP抗原，则不会在检测带位置显示红色，为阴性结果；

所述的试剂条质控带的结果判读，通过观察质控带的红色线条是否出现来判断检测操作是否正确，无论待测样本中有无H-FABP，喷点了羊抗鼠IgG的质控带位置总应有红色线条出现，该红线条表示检测操作正确；如无红色线条出现，则表示操作不正确，或试剂条失效，应换新的的试剂条重新检测。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

<110> 重庆业为基生物科技有限公司

<120> 心脏型脂肪酸结合蛋白B细胞表位肽及其抗体和应用

<160> 5

<210> 1

<211> 402

<212> DNA

<213> 智人（homo sapiens）

<220>

<223> 心脏型脂肪酸结合蛋白编码区

<400> 1

atggtggacg ctttcctggg cacctggaag ctagtggaca gcaagaattt cgatgactac 60

atgaagtcac tcggtgtggg ttttgctacc aggcaggtgg ccagcatgac caagcctacc 120

acaatcatcg aaaagaatgg ggacattctc accctaaaaa cacacagcac cttcaagaac 180

acagagatca gctttaagtt gggggtggag ttcgatgaga caacagcaga tgacaggaag 240

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caagagacca cacttgtgcg ggagctaatt gatggaaaac tcatcctgac actcacccac 360

ggcactgcag tttgcactcg cacttatgag aaagaggcat ga 402

<210> 2

<211> 133

<212> PRT

<213> 智人（homo sapiens）

<220>

<223> 心脏型脂肪酸结合蛋白氨基酸

<400> 2

Met Val Asp Ala Phe Leu Gly Thr Trp Lys Leu Val Asp Ser Lys

1 5 10 15

Asn Phe Asp Asp Tyr Met Lys Ser Leu Gly Val Gly Phe Ala Thr

20 25 30

Arg Gln Val Ala Ser Met Thr Lys Pro Thr Thr Ile Ile Glu Lys

35 40 45

Asn Gly Asp Ile Leu Thr Leu Lys Thr His Ser Thr Phe Lys Asn

50 55 60

Thr Glu Ile Ser Phe Lys Leu Gly Val Glu Phe Asp Glu Thr Thr

65 70 75

Ala Asp Asp Arg Lys Val Lys Ser Ile Val Thr Leu Asp Gly Gly

80 85 90

Lys Leu Val His Leu Gln Lys Trp Asp Gly Gln Glu Thr Thr Leu

95 100 105

Val Arg Glu Leu Ile Asp Gly Lys Leu Ile Leu Thr Leu Thr His

110 115 120

Gly Thr Ala Val Cys Thr Arg Thr Tyr Glu Lys Glu Ala

125 130 133

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工片段

<220>

<223> H-FABP基因上游引物

<400> 3

catgccatgg tggacgcttt cctgg 25

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工片段

<220>

<223> H-FABP基因下游引物

<400> 4

ccgctcgagt tatcatgcct ctttctcata agtgc 35

<210> 5

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工片段

<220>

<223> 心脏型脂肪酸结合蛋白B细胞表位肽

<400> 5

Gln Val Ala Ser Met Thr Lys Pro Thr Thr Ile Ile Glu Lys Asn

1 5 10 15

Gly

16

Claims

1.心脏型脂肪酸结合蛋白B细胞表位肽，其特征在于：所述心脏型脂肪酸结合蛋白B细胞表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2.含有权利要求1所述心脏型脂肪酸结合蛋白B细胞表位肽的衍生物，其特征在于：所述心脏型脂肪酸结合蛋白B细胞表位肽的衍生物为N端引入半胱氨酸的心脏型脂肪酸结合蛋白B细胞表位肽与载体蛋白的交联体。

3.根据权利要求2所述心脏型脂肪酸结合蛋白B细胞表位肽的衍生物，其特征在于：所述载体蛋白为血蓝蛋白、牛血清白蛋白或鸡卵白蛋白。

4.权利要求2所述心脏型脂肪酸结合蛋白B细胞表位肽的衍生物制备的杂交瘤细胞株。

5.根据权利要求4所述的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株的生物保藏号为CCTCC NO：C201269。

6.权利要求5所述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。

7.权利要求6所述的单克隆抗体在制备检测心脏型脂肪酸结合蛋白的诊断试剂中的应用。