CN104726412A - 特异结合人心型脂肪酸结合蛋白的单克隆抗体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株能稳定分泌高效价的抗人 HFABP 蛋白的杂交瘤细胞株，其保藏号为CCTCC NO：C2014196，其是用纯化的重组表达HFABP作为抗原免疫雌性BALB/c小鼠，将免疫小鼠淋巴细胞与sp2/0细胞融合，间接ELISA和Western blotting检测其效价分别达到1:10⁴和1:4000。该细胞株分泌的单克隆抗体具有良好的特异性和相对亲和力，可作为HFABP早期检测的关键原料，为建立快速、高灵敏检测HFABP的包括免疫金标、免疫试纸条、酶联免疫试剂、免疫比浊法等临床诊断试剂提供重要原料；也可作为检测脑脊液HFABP，监测与预测老年人从轻度认知功能障碍到呆痴转变诊断试剂的重要原料。

Description

特异结合人心型脂肪酸结合蛋白的单克隆抗体及其用途

技术领域

本发明涉及一种针对人心型脂肪酸结合蛋白的特异性单克隆抗体，这种抗体可以用于心肌损伤的早期诊断、风险评估和预后的判断。

背景技术

心血管疾病已成为 21 世纪人类健康的头号杀手，其中最为凶险的是急性冠脉综合征(Acute Coronary Syndrome，ACS)，ACS 包括不稳定心绞痛和急性心肌梗死（acute myocardial infarction, AMI）。统计资料显示，全球每年有 1700 万人死于心血管疾病，其中一半以上死于急性心肌梗死。近十年来，我国急性心肌梗死的发病率一直呈明显上升趋势，已接近国际上的平均水平。急性心肌梗死起病突然，急性期死亡率约为30%。诱发急性心肌梗死的主要原因是为心脏供血的冠状动脉突然堵塞，从而导致由冠状动脉供应的心肌发生变性坏死。目前，国际上治疗急性心肌梗死的最佳方法是急性介入治疗，即通过植入支架的办法迅速开通堵塞的冠状动脉。

对于AMI的诊断，心电图的观察是常用的检测手段，但对于那些心电图正常的 AMI 患者，其作用就变得十分渺小。选择一种合适的生化指标来诊断 AMI是十分必要。目前常用的临床指示剂有肌红蛋白、肌钙蛋白和肌酸激酶及其同工酶，但是都存在不同程度的缺陷。HFABP是一种可溶性胞质蛋白，由132个氨基酸组成，分子量为14-15KD^[1]，HFABP特异地大量存在于心肌组织中，约占心脏全部可溶性蛋白的4-8%，正常人每克湿重心肌中含 HFABP 约 0.5mg。HFABP稳定性好，重组的 HFABP 蛋白可反复冻融8次而不影响其免疫活性^[2]。HFABP 与心肌内的长链脂肪酸结合将其从细胞质膜向发生质变和氧化的部位运输，从而进入线粒体的能量代谢系中氧化分解，为心肌提供能量^[3]。正常人的血浆和尿中不含有HFABP，或含量甚少。当心肌细胞受到损伤后，HFABP 迅速释放至细胞外，出现于血流中，1-3 h就可以检测到其存在，6-8 h其血液中的浓度达到峰值，12-24 h 后又可以恢复正常^[4]，其血浆动力学与肌红蛋白一致，但其特异性比肌红蛋白更高。在AMI 的早期诊断方面HFABP比 cTnI、CK-MB 更灵敏、准确^[5]。有研究表明^[6]，当 HFABP 与 cTnI 联合检测时，对于AMI的早期诊断和预后风险评估比两者任何一种单独使用都要好。同时血浆中 HFABP 大量升高与梗塞面积间也有良好的相关性。因此，HFABP 可以作为 AMI 早期诊断、风险评估和预后判断的一种更好的生化指标。

吕娇凤等^[7]运用胶体金免疫层析技术定性检测 104 例发病 3 h 内胸痛患者的血清 HFABP，比较其与心肌肌钙蛋白（cTnI）、肌酸激酶同功酶MB（CK-MB）、肌红蛋白（MYO）诊断早期 AMI 的敏感度、特异度。从 HFABP 检出 AMI 的敏感度、特异性来看， HFABP 显著高于 MYO（P＜0.05），与 cTnI 和 CK-MB无显著差异（P＞0.05）。在四种心肌损伤标志物中，HFABP 的准确诊断指数最高。

心肌损伤标志物 HFABP 在早期诊断 ACS中 发挥着不可替代的作用^[8-11]，能在发病早期检测发病情况，利于患者及早诊断和治疗。冠状动脉旁路移植术（coronary artery bypass grafting，CABG）和 冠状动脉介入治疗（PCI）是治疗心血管病的比较成熟的治疗方法，但在手术过程中会对心肌细胞造成再次的伤害，因此 HFABP 也可以对 CABG 和 PCI 术后的心肌受伤程度和不利临床结果进行有效的预测^[14-16],有助于术后患者的恢复和再治疗。

随着对 HFABP 临床研究的深入，HFABP 的临床应用价值越来越重要，可能对检测潜在疾病心血管代谢危险有预测作用。Evrim Cakir 等^[12]的研究表明：HFABP 对于胰岛素抵抗和雄性激素过多的多囊卵巢综合症女性患者的代谢反应和动脉硬化有重要的指示作用。Bob Olsson 等^[13]发现，脑脊液中 HFABP 的浓度可能是老年人从轻度认知功能障碍到呆痴转变的早期诊断生物标志物。

HFABP 作为心血管疾病早期诊断、危险评估和预后判断的一种很有潜力的生化指标，有很大的临床应用价值。目前国内还没有高质量的 HFABP 检测原料供应，检测的关键原料完全依赖进口，但进口抗体价格昂贵，给病人带来了沉重的经济负担。建立拥有自主知识产权的抗 HFABP 单克隆抗体生产技术和 HFABP 定量快速检测技术是目前我国心脏受损疾病诊断试剂的发展方向。

参考文献：

[1]  Karthik Viswanathan,Alistair S Hall,Julian H Barth.An evidence-based  approch to the assessment of heart-type fatty acid binding protein in acute coronary syndrome.Clin Biochem Rev Vol 33 February 2012:3-11.

[2]  Yasunobu Hayabuchi，MD；Miki Inoue，MD；Noriko Watanabe， MD；Miho Sakata， MD；Tatsuya Ohnishi，MD；Shoji Kagami， MD. Serum Concentration of Heart-Type Fatty Acid-Binding Protein in Children and Adolescents With Congenital Heart Disease.Circulation Journal 2011；75：1992–1997.

[3]  刘洪梅，黄体钢.心型脂肪酸结合蛋白在临床诊断中的研究进展[J].实用心脑肺血管病杂志，2006,14（5）:417-418

[4]  Hsu BG,Chen YC,Lee RP,Lee CC,Lee CJ,Wang JH.Fasting serum level of fatty-acid-binding protein 4 positively correlates with metabolic syndrome in patients with coronary artery disease. Circulation Journal 2010；74:327-331.

[5]  Ozcan Ruzgar,Ahmet Kaya Bilge,Zehra Bugra,Sabahattin Umman,Ercument Yilmaz,Beste Ozben,Berrin Umman,Mehmet Meric.The use of human heart-type fatty acid-binding protein as an early diagnostic biochemical marker of myocardial necrosis in patients with acute coronary syndrome,and its comparison with troponin-T and creatine kinase-myocardial band.Heart Vessels 2006;21:309-314.

[6]  Conor J.McCann,Ben M.Glover,Lan B.A.Menown,Michael J.Moore,Jane McEneny,Colum G.Owen,Bernie Smith,Peter C.Sharpe,Lan S.Young,Jennifer A.Adgey.Novel biomarkers in early diagnosis of acute myocardial infarction compared with cardiac troponin T.European Heart Journal(2008) 29,2843-2850.

[7]  吕娇凤，谢爱民，姚全良..心脏型脂肪酸结合蛋白定性检测对急性心肌梗死早期诊断的价值 [J]. 实用医学杂志,2012,28(4):647-649.

 [8]  Wright RS，Anderson JL，Adams CD，Bridges CR，Casey DE Jr，Ettinger SM，et al. 2011 ACCF/AHA focused update incorporated into the ACC/AHA 2007 Guidelines for the management of patients with unstable angina/non-ST-elevation myocardial infarction：a report of the American College of Cardiology Foundation/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines developed in collaboration with the American Academy of Family Physicians，Society for Cardiovascular Angiography and Interventions，and the Society of Thoracic Surgeons J. Journal of the American College of Cardiology ，2011；57：e215-367.

[9]  Bertrand ME，Simoons ML，Fox KA，Wallentin LC，Hamm CW，McFadden E，et al.Management of acute coronary syndromes in patients presenting without persistent ST-segment elevation.The task force on the Management of Acute Coronary Syndromes of the European Society of Cardiology. European Heart Journal ，2002；23：1809-40.

[10]  Hamm CW，Bassand JP，Agewall S, Bax J，Boersma E，Bueno H，et al.ESC guidelines for the management of acute coronary syndromes in patients presenting without persistent ST-segment elevation: The Task Force for the management of acute coronary syndromes (ACS) in patients presenting without persistent ST-segment elevation of the European Society of Cardiology (ESC) .European Heart Journal，2011；32：2999-3054.

[11]  Van de Werf F，Bax J, Betriu A，Blomstrom-Lundqvist C，Crea F，Falk V,et al.Management of acute myocardial infarction in patients presenting  with persistent ST-segment elevation. European Heart Journal ，2008；29：2909-45.

[12] Evrim Cakir, Mustafa Ozbek, Mustafa Sahin, Erman Cakal, Askin Gungunes, Zeynep Ginis, Taner Demirci,Tuncay Delibasi. Heart type fatty acid binding protein response and subsequent development of atherosclerosis in insulin resistant polycystic ovary syndrome patients. Journal of Ovarian Research 2012, 5:45.

 [13]  Bob Olssona, Joakim Hertzee, Mattias Ohlsson , Katarina Nagga, Kina H¨oglund, Hans Basun,Peter Annas, Lars Lannfelt, Niels Andreasen, Lennart Minthon, Henrik Zetterberg, Kaj Blennow ,Oskar Hansson. Cerebrospinal Fluid Levels of Heart Fatty Acid Binding Protein are Elevated Prodromally in Alzheimer’s Disease and Vascular Dementia. Journal of Alzheimer’s Disease 34 (2013) 673–679.

[14]  T. Petzolda,P. Feindt, U. Sunderdiek, U. Boeken, Y. Fischer, E. Gams. Heart-type fatty acid binding protein (hFABP) in the diagnosis of myocardial damage in coronary artery bypass grafting. European Journal of Cardio-thoracic Surgery 19 (2001) 859±864

[15]  Vishwas Malik, MD Shailaja C.Kale, MD Ujjwal K. Chowdhury,MCh, NB Lakshmy Ramakrishnan,PhD Sandeep Chauhan, MD Usha  Kiran, MD. Myocardial Injury in Coronary Artery Bypass Grafting. Tex Heart Inst J 2006;33:321-7.

[16]  Jochen D. Muehlschlegel, MD,Tjorvi E. Perry, MD,Kuang-Yu Liu, PhD,Amanda A. Fox, MD,Charles D. Collard, MD,Stanton K. Shernan, MD, Simon C. Body, MD. Heart-Type Fatty Acid Binding Protein Is an Independent Predictor of Death and Ventricular Dysfunction After Coronary Artery Bypass Graft Surgery. Anesth Analg2010;111:1101–9。

.发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种一株能稳定分泌高效价的抗人 HFABP 蛋白的杂交瘤细胞株12H11，该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有良好的特异性，37℃ 保存7 天效价不下降，可以作为HFABP 早期检测的关键原料，为建立快速、灵敏检测 HFABP的包括免疫金标、酶联免疫试剂、免疫比浊法等临床诊断试剂提供重要原料；也可以作为检测脑脊液HFABP， 监测与预测老年人从轻度认知功能障碍到呆痴转变诊断试剂的重要原料。

本发明提供的技术方案是：一株能稳定分泌高效价的抗人 HFABP 蛋白的杂交瘤细胞株12H11，其保藏号为CCTCC NO：C2014196，于2014年10月27日保藏于中国典型培养物保藏中心（保藏地址是：中国.武汉.武汉大学），经检测存活。

本发明还提供一种抗人 HFABP 蛋白单克隆抗体，其由所述的杂交瘤细胞株产生的。

本发明还提供包含所述的单克隆抗体的试剂盒。

所述的试剂盒，其是HFABP 早期检测试剂盒。

所述的试剂盒是免疫金标、酶联免疫试剂、或免疫比浊法的诊断试剂盒；也可以作为检测脑脊液HFABP，监测与预测老年人从轻度认知功能障碍到呆痴转变诊断试剂的重要原料。

本发明具有以下有益效果：

本发明用纯化的重组表达HFABP 作为抗原免疫雌性BALB/c小鼠，将免疫小鼠淋巴细胞与 sp2/0 细胞融合，采用间接 ELISA 法筛选阳性克隆、测定单抗效价、稳定性和相对亲和力，再用 Western blotting 进行抗体特异性鉴定。最终获得1株能稳定分泌高效价的抗人 HFABP 蛋白的杂交瘤细胞株，命名为 12H11，其亚型为 IgG1。间接 ELISA 和 Western blotting 检测其效价分别达到 1:10⁴ 和1:4000。间接 ELISA 和 Western blotting结果显示，该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有良好的特异性，37℃ 保存7 天效价不下降，且亲和力达到了进口抗 HFABP 单抗的标准，可以作为HFABP 早期检测的关键原料，为建立快速、灵敏检测 HFABP的包括免疫金标、酶联免疫试剂、免疫比浊法等临床诊断试剂提供重要原料；也可以为检测脑脊液HFABP， 监测与预测老年人从轻度认知功能障碍到呆痴转变诊断试剂提供的重要原料。

附图说明

图1 HFABP 蛋白纯化后鉴定，lane M：蛋白质相对分子质量标准品；lane 1：离心上清；lane 2：60% 硫酸铵沉淀；lane 3：Ni-IDA resin 纯化后的蛋白；lane 4：分子筛层析纯化后的蛋白。

图2重组 HFABP 免疫反应性分析。

图3单克隆抗体纯化和SDS-PAGE鉴定， A：腹水纯化采集图； B：SDS-PAGE 鉴定图，lane M：蛋白质相对分子质量标准；lane 1：纯化前腹水（非沸水浴）；lane 2：纯化前腹水（沸水浴）；lane 3：纯化后单克隆抗体（非沸水浴）；lane 4：纯化后单克隆抗体（沸水浴）。

 图4 12H11 免疫特异性鉴定，lane M：蛋白质相对分子质量标准；lane 1：重组 HFABP；lane 2：人心肌细胞总蛋白；lane 3：人肾上皮细胞总蛋白；lane 4：人正常肝细胞总蛋白；lane 5：人脐静脉内皮细胞总蛋白；lane 6：人结肠癌细胞细胞总蛋白；lane 7：人肺腺癌细胞总蛋白。

图5 抗体效价测定，A：Western blotting 测定单抗效价，其中，lane 1:1:1000 稀释；lane 2:1:2000 稀释；lane 1: 1:3000 稀释；lane 1:1:4000 稀释；lane 1:1:5000 稀释；lane 1:1:6000 稀释）；B：间接 ELISA 测定单抗效价。

图 6 单抗稳定性检测。

图 7 单抗相对亲和力测定。

具体实施方式

下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。

实施例1 重组菌株HFABP蛋白的表达纯化及免疫反应性鉴定

1．重组菌株HFABP蛋白的表达纯化

HFABP 重组原核表达质粒转化大肠杆菌 ER2566，涂布到含 Kan⁺ 的 LB平板上，37 ℃ 培养 12 h 后，从平板上挑取单菌落接种到 10 mL LB 培养基（含 Kan⁺）中，37 ℃ 培养 8 h，然后将 10 mL 培养好的菌接种到 1L LB 培养基（含 Kan⁺）中培养，在菌液 OD₆₀₀ 值达到 0.6 时加入终浓度为 0.4 mmol/L 的 IPTG 进行诱导表达。4 h 后，室温 12000 g 离心 5 min 收集菌体，加入 40 mL 细胞裂解液（50 mmol/L Tris·HCl，1 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl，pH 8.0），Ф10 mm 探头 200W 功率超声破碎细胞，4℃ 12000 g 离心 10 min 收集上清。上清用硫酸铵沉淀、PBS透析后用His-taq 柱和分子筛层析柱纯化，收集样品并用 SDS-PAGE 鉴定蛋白纯度。

重组 HFABP 诱导表达后经过硫酸铵沉淀、His-taq 柱和分子筛层析柱后进行 SDS- PAGE，结果发现，经 Ni-IDA resin 纯化后的重组蛋白纯度达到 50% 以上，凝胶上只能看到几条弱小的杂蛋白条带（图 1 lane 3），且杂蛋白分子量和 HFABP 分子量相差大，适合使用分子筛层析做进一步纯化，而且还可以起到脱盐的作用。经分子筛层析后进行 SDS- PAGE 分析，结果显示，HFABP 重组蛋白的纯度进一步得到了提高，从丙烯酰胺凝胶上观察到 15 kDa 左右的目的蛋白条带（图 5 lane 4），达到了制备单抗的纯度要求。

2． 重组 HFABP 免疫反应性鉴定

将重组 HFABP 进行 12% SDS-PAGE 后电转移到 PVDF 膜上（300 mA，50min），用脱脂奶-TN 缓冲液（5% 脱脂奶，50 mmol/L Tris·HCl，150 mmol/L NaCl，pH7.5）封闭 2 h，用 TNT 缓冲液（50 mmol/L Tris·HCl，150 mmol/L NaCl，0.05％Tween-20，pH7.5）洗膜 3 次，每次 10 min，然后加入抗 HFABP 单克隆抗体（脱脂奶 1:2000 稀释），室温反应 2 h，洗膜 3 次，每次 10 min，加入 HRP 酶标羊抗兔二抗（脱脂奶 1:2000 稀释），室温反应 2 h，TNT 洗膜 3 次，每次 10 min，最后用 HRP-DAB 显色试剂盒显色。

以纯化的重组 HFABP 制备蛋白样品进行 SDS-PAGE，并进行 Western blotting 检测，结果显示表达的重组蛋白能与进口兔源抗 HFABP 单克隆抗体发生强的特异性反应（图 2 B），说明重组表达的 HFABP 蛋白具有良好的免疫反应性，可以作为免疫小鼠制备单克隆抗体的主要原料。

实施例2 动物免疫与血清效价检测

含有热灭活的结核分枝杆菌的弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂分别于涡旋振荡器上振荡充分混匀，确保菌液充分悬浮，将上述混匀悬液分别与溶于磷酸缓冲液的 1.0 mg/mL 的重组 HFABP 按 1∶1（V/V）混合，然后用 1.0 mL 的注射器来反复抽吸混合液，直到重组蛋白和佐剂充分混匀成为均匀的乳液。

将 6-8 w SPF 级雌性BALB/c小鼠以弗氏完全佐剂和热灭活的结核分枝杆菌乳化免疫抗原 HFABP 对每只小鼠从跗关节处注射 40 μg 抗原，第一次免疫 2 周后，用弗氏不完全佐剂和热灭活的结核分枝杆菌乳化免疫抗原 HFABP 对每只小鼠再次从跗关节处注射40 μg 抗原。免疫 8 d 后，小鼠尾静脉采血，4 ℃，4000 g 离心 5 min，取上清，间接ELISA法检测血清效价，选取血清效价大于 10⁶ 的小鼠进行细胞融合试验。将小鼠颈椎脱臼处死。消毒并无菌解剖小鼠，用镊子取下颈部和腋下淋巴结转移到无菌细胞筛网上（下放置无菌平皿），用注射器内芯轻轻研磨淋巴结，不断用生理盐水冲洗筛网，收集细胞并用新的无菌网筛过滤细胞，滤过细胞收集于2 个2.0 mL 离心管中，室温 4000 g 室温离心3 min，弃上清，取 50 μL 生理盐水重悬沉淀获得淋巴细胞。

重组蛋白 HFABP 免疫 6-8 w SPF 级雌性 BALB/c 小鼠后，小鼠尾静脉采血，以小鼠免疫前血清为阴性对照，通过间接 ELISA 试验检测血清抗体效价（以阴性值的 2.1 倍设为临界值判断是否为阳性值），5 只小鼠在第 1 次免疫后血清即转阳，说明重组 HFABP 蛋白具有很好的免疫原性，能在小鼠体内引起较强的免疫反应，在第 2 次免疫后，百万倍稀释后血清效价已高达 2.0 以上（表 1），达到制备单克隆抗体的要求。

表1  间接 ELISA 检测小鼠血清中抗体效价

实施例3 细胞融合、阳性杂交瘤细胞筛选与亚克隆

1．选择生长状态良好的 sp2/0 骨髓瘤细胞与免疫小鼠的淋巴细胞以约 1∶2 - 1∶3 混合，1200 g 离心 2 min，弃上清。轻敲离心管使细胞均匀分散，缓缓加入 1 mL 37 ℃ 预热的 PEG 1500，轻轻混匀，60 s 后立即加入 20 mL 无血清 1640 培养基。1000 g 离心 2 min 后弃上清，细胞沉淀中加入 20% FBS 血清的 HAT-1640 培养基并轻轻混匀，均匀铺于 96 孔板中，每孔 200 μL，于 37 ℃ 5% CO₂ 的培养箱中培养。5-7 d 后观察融合效果并换液，3 d 后取上清液用间接 ELISA 方法初筛阳性克隆。选择阳性值与细胞数比值较高的孔，通过有限稀释法进行亚克隆，经过 4 次亚克隆后，即得到能够稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株。

sp 2/0 细胞与免疫小鼠淋巴细胞融合，经 HAT 选择培养后，3-5 d 即有小克隆出现，第 9 d 时可长至孔底面积的1/3，每孔含数个细胞克隆，通过间接 ELISA 筛选出阳性克隆。经 4 次克隆化后，从阳性克隆中筛选到一株能稳定高效分泌抗 HFABP 单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为 12H11。

2. 单克隆抗体亚型鉴定

将纯化的 HFABP用 CB 缓冲液（15mmol/L Na₂CO₃，35mmol/L NaHCO₃）稀释至浓度为 1 mg/L，包被 ELISA 板，4℃ 过夜。洗板一次后，加入杂交瘤细胞上清，37℃ 孵育 30 min 后，洗板 5 次，加入 HRP-羊抗鼠二抗，37℃ 孵育 30 min，洗板 5 次，最后加入 TMB 底物显色剂，37℃ 反应 10 min，加入终止液，于 450/630 nm 双波长检测。经间接 ELISA 鉴定，制备的单克隆抗体为 IgG1 亚型。

实施例4 单克隆抗体的产生与纯化

取 8-10 w BALB/c 小鼠，先每只腹腔注射无菌石蜡油 0.5 mL，7 d 后向腹腔内注入12H11杂交瘤细胞，调整细胞密度为 1×10⁶ - 2×10⁶ /mL，每只小鼠大约注射 0.5 mL。8-10 d 后可明显看到小鼠腹部膨大,待小鼠腹水达到一定的抗体滴度后，即开始采集腹水。将采集好的腹水 1:1（V/V） 缓慢加入饱和硫酸铵初步纯化，冰上搅拌 30 min，4 ℃，12000 g 离心 10 min 后弃上清。沉淀用一定体积 PBS 溶解后于 20 倍体积的 Binding buffer（Protein A Sefinose Kit 中提供）中透析，然后用 Protein A 亲和柱柱纯化，SDS- PAGE 鉴定纯化效果。

上样约 1 min 时开始出现穿透峰，第 8 min 开始出现洗脱峰（图3 A），收集洗脱峰。将纯化前与纯化后的腹水抗体制备蛋白样品经 SDS-PAGE电泳，纯化后的抗体，出现了三条带：50 kDa左右的重链、20 kDa左右的轻链和100 kDa 左右的完整抗体，但非沸水浴时主要为 100 kDa 的条带，沸水浴后重链条带明显变强，100 kDa 的条带变弱，且大小是重链的约 2 倍，轻链煮沸前后条带强弱相差不大（图3 B lane 3，4），因此，100 kDa 的条带为重链与重链的聚合体，是由于两条重链间的二硫键没有完全破坏。从凝胶上看不到其它杂蛋白条带，这说明经亲和柱层析后单克隆抗体达到了相当高的纯度，可以用于进一步的研究。

实施例5 单克隆抗体特异性、效价鉴定

用免疫印迹法检验纯化单克隆抗体 12H11 的免疫反应性和特异性。

将人心肌细胞、人肾上皮细胞、人脐静脉内皮细胞、人结肠癌细胞细胞、人肺腺癌细胞总蛋白进行 12% SDS-PAGE，电转移至 PVDF 膜上（300 mA，50 min），用脱脂奶-TN 缓冲液（5% 的脱脂奶，50 mmol/L Tris·HCl，150 mmol/L NaCl，pH7.5）封闭 2 h，用 TNT 缓冲液（50 mmol/L Tris·HCl，150 mmol/L NaCl，0.05％Tween-20，pH7.5）洗膜 3 次，每次 10 min，然后加入抗 HFABP 单克隆抗体 12H11（脱脂奶 1:2000 稀释），室温反应 2 h，洗膜 3 次，每次 10 min，加入 HRP 酶标羊抗鼠二抗（脱脂奶 1:2000 稀释），室温反应 2 h，TNT 洗膜 3 次，每次 10 min，最后用 HRP-DAB 显色试剂盒显色。

将纯化的重组 HFABP 进行 12% SDS-PAGE，电转移至 PVDF 膜上，用脱脂奶-TN 缓冲液（5% 的脱脂奶，50 mmol/L Tris·HCl，150 mmol/L NaCl，pH7.5）封闭 2 h，用 TNT 缓冲液（50 mmol/L Tris·HCl，150 mmol/L NaCl，0.05％Tween-20，pH7.5）洗膜 3 次，每次 10 min，然后分别加入抗 HFABP 单克隆抗体 12H11（按 1:100、1:500、1:1000、1:2000、1:3000 稀释），室温反应 2 h，洗膜 3 次，每次 10 min，加入 HRP 酶标羊抗鼠二抗（脱脂奶 1:2000 稀释），室温反应 2 h，TNT 洗膜 3 次，每次 10 min，最后用 HRP-DAB 显色试剂盒显色。

结果显示，人心肌细胞在膜上出现特异性条带（图 4 lane 2），与阳性对照位置一直（图 4 lane 1），说明单抗不但与重组 HFABP 抗原发生特异性反应，而且与人心肌细胞中的 HFABP 也有特异性免疫反应，而与人肾上皮细胞、人正常肝细胞、人脐静脉内皮细胞、人结肠癌细胞细胞、人肺腺癌细胞总蛋白无交叉反应（图 4 lane 3-7）。

将纯化的重组 HFABP 用 CB 液（15mmol/L Na₂CO₃，35 mmol/L NaHCO₃）稀释至浓度为 1 mg/L，包被 ELISA 板，4℃ 过夜。洗板一次，加入梯度稀释的单克隆抗体 12H11 （1:10²、1:10³、 1:10⁴、1:10⁵、1:10⁶），37℃ 孵育 30 min 后，洗板 5 次，加入 HRP-羊抗鼠二抗，37℃ 孵育 30 min，洗板 5 次，最后加入 TMB 底物显色剂，37℃ 反应 10 min，加入终止液，于 450/630 nm 双波长检测。

12H11 经稀释后，进一步进行间接 ELISA 和 Western blotting 检测，结果显示抗体具有较高的灵敏度，其效价可高达 1:10⁴ 和 1:4000（图 5）。上述实验结果说明，该单抗具有良好的免疫反应特异性和灵敏度，具有作为心肌损伤免疫诊断关键原料开发的潜力。

实施例6 单抗稳定性的鉴定

将纯化后的单抗 12H11 分别置于 -20 ℃、4 ℃和37 ℃ 环境中，每 24 h 取样一次，间接 ELISA 检测其免疫反应活性的变化。

单抗不加任何保护剂，分别置于 -20 ℃、4 ℃和 37 ℃ 温育24 h，其效价与-20 ℃对照组无差别，超过 7 d 后 37 ℃ 组的抗体效价才开始有下降（图 6）。说明单抗具有良好的温度稳定性，在加入保护剂后可开发成试剂盒，并具有较长的货架期，因此具有良好的应用前景。

实施例7 单抗相对亲和力测定

测定纯化后的 12H11 浓度，将 12H11 与 Proteintech 公司 HFABP3 单抗浓度均调为 1mg/mL，然后包被 HFABP 抗原，把两种单抗稀释成不同浓度，用间接 ELISA 比较两种单抗的相对亲和力。

用 ELISA 法测定 12H11 与 Proteintech 公司进口单抗的相对亲和力大小，以达到 50% 最大结合率的单抗浓度来分析相对亲和力，亲和力越大，所需抗体浓度越低。结果显示，达到 50% 最大结合率的两种单抗浓度基本一致(图 7)，说明 12H11具有作为免疫诊断试剂原材料的潜力。

Claims (6)

1.一株能稳定分泌高效价的抗人 HFABP 蛋白的杂交瘤细胞株，其保藏号为CCTCC NO：C2014196。

2.一种抗人 HFABP 蛋白单克隆抗体，其特征在于，其由权利要求1所述的杂交瘤细胞株产生的。

3.包含权利要求2所述的单克隆抗体的试剂盒。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其是HFABP 早期检测试剂盒。

5.如权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是免疫金标、免疫试纸条、酶联免疫试剂，或免疫比浊法的诊断试剂盒。

6.如权利要求3-6任一项所述的试剂盒，其特征在于，其用于心肌损伤的早期诊断、风险评估或预后的判断，脑脊液HFABP，或监测与预测老年人从轻度认知功能障碍到呆痴转变。