JP4714265B2

JP4714265B2 - ニューログロビン酵素免疫測定キット及びその使用

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Publication number: JP4714265B2
Application number: JP2008508048A
Authority: JP
Inventors: チェンガンチャン，; リホンワン，; ティンファンチェン，; アイジァシャン，; ヤンガオ，
Original assignee: Beijing Threeman Medicine Science And Technology Ltd Co; Institute Of Radiation Medicine Academy Of Military Medical Sciences People's Libration Army Of China
Current assignee: Beijing Threeman Medicine Science And Technology Ltd Co; Institute Of Radiation Medicine Academy Of Military Medical Sciences People's Libration Army Of China
Priority date: 2005-04-30
Filing date: 2005-04-30
Publication date: 2011-06-29
Anticipated expiration: 2025-04-30
Also published as: EP1879029A1; EP1879029A4; ES2355265T3; JP2008541008A; ATE491949T1; US20100028917A1; DK1879029T3; CN101166975A; WO2006116898A1; EP1879029B1; DE602005025414D1; PL1879029T3; EP1879029B8

Description

本発明は、免疫アッセイキット、特にニューログロビンを検出するためのニューログロビンの酵素免疫測定キット（ＮＧＢ−ＥＬＩＳＡキット）及びその使用に関する。

ニューログロビン（ＮＧＢ）は、ヘモグロビン及びミオグロビンを除く第３種の酸素運搬タンパク質である。ＮＧＢタンパク質は神経系において特異的に発現し、脳に広く分布している。ミオグロビンと同様に、ＮＧＢタンパク質は非常に高い結合親和力で酸素と可逆的に結合することができる。正常な個体において検出される血清中のミオグロビンの濃度は非常に低く、心筋及び骨格筋が損傷すると、ミオグロビンは損傷細胞から血液中に放出され、その結果、血清中のミオグロビンタンパク質が大幅に増加することがよく知られている。したがって、血清中のミオグロビン（血清−ミオグロビン）の濃度は、心筋梗塞及び腎不全等の幾つかの重要な疾患に対する特異的で感度の高いバイオマーカーであると考えられている。興味深いことに、ＮＧＢ及びＭＧＢの特性は互いに非常に類似している。例えば、ＮＧＢタンパク質には１５１個のアミノ酸（ａａ）が存在し、ＭＧＢタンパク質には１５４個のａａが存在する。ＭＧＢ及びＮＧＢの分子量は共に１７ｋＤである。ＮＧＢ及びＭＧＢの機能は非常に類似しており（すなわち、ＭＧＢが心筋及び骨格筋の酸素供給に関与しているのに対し、ＮＧＢは脳の酸素供給に関与している）、且つこれらの両方が損傷細胞から血清中に放出され得るため、血清中のＮＧＢタンパク質の濃度には、アルツハイマー病、脳卒中及び他の脳損傷等の神経系疾患を臨床診断するために潜在的価値があると推測することは合理的である。同じように、血中のＮＧＢタンパク質の検出には、上記の神経系疾患の疾患段階を明らかにすることに関しても重要な価値がある。

現在、ＮＧＢタンパク質を検出する主な方法は、免疫ブロット分析である。詳細には、ユーザーは最初に試験サンプルについてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、それから抗ＮＧＢ抗体でＮＧＢタンパク質を検出した後に、特異的な酵素標識二次抗体を使用して反応させ、それからＸフィルム上にバンドのシグナルを顕在化させる必要がある。最後に、ユーザーは、フィルムをコンピューターに取り込んで、試験サンプルにおけるＮＧＢタンパク質のおおよそのレベルを測定するために、さらに画像分析を行う必要がある。この方法の最も大きな欠点は、ＮＧＢタンパク質の正確な濃度を得ることができないことである。

本発明の目的は、様々なサンプル中のＮＧＢタンパク質の濃度を測定するためのＮＧＢ−ＥＬＩＳＡキットを提供することである。

本発明のＮＧＢ−ＥＬＩＳＡキットは、抗ＮＧＢモノクローナル抗体と、抗ＮＧＢポリクローナル抗体と、酵素標識二次抗体とを含み、該抗ＮＧＢモノクローナル抗体が、ＮＧＢ抗原でマウスを免疫した後、細胞融合してハイブリドーマ細胞を産出すること、及びその後該ハイブリドーマ細胞を培養することによって得られ；該抗ＮＧＢポリクローナル抗体が、ＮＧＢ抗原で動物を免疫すること、及びそれから該動物の血清から採取することによって得られる。

上記ニューログロビンタンパク質は、以下のようにして調製される：
１）ヒトＮＧＢ遺伝子のＮＧＢ配列を含む原核細胞発現ベクターを構築すること；
２）該構築された原核細胞発現ベクターを大腸菌株に形質転換して、陽性クローンをスクリーニングすること；
３）熱刺激によって該陽性クローンを培養して、発現産物を得ること；
４）該発現産物を精製して、上記ＮＧＢ抗原を得ること。

より具体的には、上記原核細胞発現ベクターは、ｐＢＶ２２０−ｒｈＮＧＢである。

陽性クローンを培養する条件は、８０〜１２０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培養培地に上記大腸菌株を植菌すること、及び、２８〜３２℃で２〜３時間培養した後に、４０〜４４℃で振盪しながら培養して、ｒｈＮＧＢの発現を誘導することである。

本発明によるキットにおいては、上記酵素標識抗体は、代表的には、ＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンである。

一般的には、上記ＮＧＢ−ＥＬＩＳＡキットは、酵素標識プレート（ｅｎｚｙｍｅ−ｌａｂｅｌｉｎｇｐｌａｔｅ）と、標準ＮＧＢタンパク質と、発色試薬とをさらに含む。本発明においては、発色試薬が、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）である。

本発明の別の目的は、上記ＮＧＢ−ＥＬＩＳＡキットの使用を提供することである。

本発明のキットは、高い特異性と高い感度とを有する。したがって、該キットは、老年性認知症、脳梗塞、又は外傷性脳損傷等の神経系疾患の診断に使用され得る。

実施例１．ＮＧＢ−ＥＬＩＳＡキットの調製
Ｉ．ＮＧＢ抗原の調製
１．大腸菌株ｐＢＶ２２０−ｒｈＮＧＢ／ＨＢ１０１の構築
１）プライマーの合成：ＮＧＢ特異的プライマーｐＵ及びｐＤは、ヒトＮＧＢ（ｈＮＧＢ）遺伝子の既知の配列に従って設計及び合成される。ここで、「ｐＵ」プライマーの５’末端がＥｃｏＲＩ制限部位及び開始コドンＡＴＧと組み合わされ、「ｐＤ」プライマーの５’末端がＢａｍＨＩ制限部位と組み合わされる。このプライマーはＳｈａｎｇｈａｉＢｏｙａＢｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅＩｎｃ．により合成された。このプライマーの配列は、
ｐＵ：５’−ＣＣｇｇＡＡＴＴＣＡＴｇｇＡｇＣｇＣＣＣｇｇＡｇ−３’
ｐＤ：５’−ｇｇＴｇｇＡＴＣＣＴＴＡＣＴＣｇＣＣＡＴＣＣＣＡｇＣＣＴＣｇ−３’
である。

２）ＰＣＲ増幅：ヒトのニューログロビン遺伝子のｃＤＮＡフラグメント（すなわちニューロサービビン（ＮＳＶ）、これはＰＣＲ技法によってヒトの胎児脳のｃＤＮＡライブラリーからこれまでに本発明者らの研究所で得られた）を鋳型として使用し、工程１）で合成したプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行った（参考文献：ＢｕｒｍｅｓｔｅｒＴ，ＷｅｉｃｈＢ，ＲｅｉｎｈａｒｄｔＳ，ＨａｎｋｅｌｎＴ著「脳において発現した脊椎動物のグロビン（Ａｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｇｌｏｂｉｎｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｔｈｅｂｒａｉｎ）」Ｎａｔｕｒｅ．２０００；４０７（６８０３）：５２０−５２３）。ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間の変性、その後の９４℃で４５秒、６０℃で４５秒、及び７２℃で４５秒を３０サイクル、それから７２℃で５分間の伸長であった。反応後に、１．０％（ｗ／ｖ）アガロースゲルの電気泳動を行うことによって、５μｌの増幅産物を検出し、ＮＧＢ遺伝子のコード領域が首尾よく増幅されたか否かを確認した。結果を図１に示し、図中、レーンＡはＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２０００を示し、レーンＢはＮＧＢのｃＤＮＡ配列の首尾よく増幅したフラグメント（約４７０ｂｐ）を示す。

３）発現プラスミドの構築：高効率の発現ベクターｐＢＶ２２０（ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙｏｆＡｃａｄｅｍｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅＰｒｅｖｅｎｔＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ製）及び精製したＰＣＲ増幅産物の両方を、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで同時に消化し、電気泳動によって回収した。それから、このフラグメントをＴ_４ＤＮＡリガーゼで結合し、発現プラスミドｐＢＶ２２０−ｒｈＮＧＢを得た。

４）工学的細菌（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａ）の構築：プラスミドｐＢＶ２２０−ｒｈＮＧＢをＣａＣｌ_２で処理した大腸菌ＨＢ１０１のコンピテント細胞（ＢｅｉｊｉｎｇＢａｉｗｅｉｓｈｅｉｎｇＩｎｃ．製）に形質転換させた。形質転換体を選択し、ＬＢ培養培地３ｍｌに植菌し、３０℃で一晩培養した。プラスミドＤＮＡをＰＣＲで同定した陽性クローンから再び抽出し、それからさらに制限分析により同定して、構造を確認した。結果を図２に示す。図２Ａでは、レーンＡはＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ−２０００を示し、レーンＢ〜ＧはＰＣＲによるリコン（ｒｅｃｏｎｓ）の同定を示す。図２Ｂでは、レーンＡはＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ−２０００を示し、レーンＢは対照のｐＢＶ２２０空ベクターを示し、レーンＣ〜ＦはＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩを用いた二重制限酵素分析によるリコンの同定を示す。

この結果は、ＰＣＲ並びにＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩの二重制限分析による同定後、全ての組み換えプラスミド中に、約４７０ｂｐのＤＮＡフラグメントが存在することを示唆し、これは、予測されるＮＧＢ遺伝子フラグメント（ニューロサービビン）に適合する。この陽性クローンを、ｐＢＶ２２０−ｒｈＮＧＢ／ＨＢ１０１と命名し、ｒｈＮＧＢタンパク質を発現する工学的株（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｓｔｒａｉｎ）として使用した。

２．遺伝的に修飾された工学的細菌の活性化
４℃で保存された細菌安定株５μｌを使用して、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培養培地５ｍｌに植菌した後、３０℃で８時間、２００ｒｐｍで振盪しながら培養した。それから、１％（ｖ／ｖ）の培養物を培養フラスコに植菌した（培養培地は前と同じであった）。培養株を３０℃で１６時間、２００ｒｐｍで振盪しながら培養するために維持し、種培養物を得た。

３．ｒｈＮＧＢの発現の誘導
種培養物を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培養培地１５０ｍｌに３％（ｖ／ｖ）で植菌し、３０℃で２〜３時間、２００ｒｐｍで振盪しながら培養した。ＯＤ_６００が０．３〜０．４に達した後、それから速やかに培養物を４２℃の水浴に移し、５時間振盪しながら培養し続け、ｒｈＮＧＢの発現を誘導した。

４．細菌の回収、洗浄、及び凍結／解凍
４℃で１５分間６０００ｒｐｍでの遠心分離によって、誘導後の細菌を回収した。少量の細菌を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によりｒｈＮＧＢタンパク質の発現を検出した。ＴＥ緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ）で細菌を３回洗浄した。その後、細菌を５分間液体窒素に入れ、それから氷浴中で解凍した。凍結／解凍手順は３回繰り返した。それから、１０倍量のＴＥ緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ）を加え、細菌を懸濁した。

５．細菌溶解
ＴＥ緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ）で懸濁した細菌を２０秒間隔で３０秒間、氷浴中で超音波処理（４００Ｗ）した。超音波処理は１５回繰り返した。それから、サンプルを４℃で２０分間、１２０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を廃棄し、封入体を注意して回収した。

６．封入体の洗浄
封入体をトリス緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ＭのＮａＣｌ）で洗浄し、４℃で２０分間、１２０００ｒｐｍで遠心分離した。上清は取り除いた。沈殿物をＴＥ緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ）で２回洗浄した後、４℃で２０分間、１２０００ｒｐｍでさらに遠心分離した。上清を廃棄し、封入体を回収した。

７．封入体の溶解
封入体を８ｍｏｌ／Ｌのカルバミドと１％（ｖ／ｖ）のメルカプトエタノールとを含むＴＥ緩衝液で再懸濁し、２０秒間隔で３０秒間、超音波処理（４００Ｗ）した。超音波処理は６回繰り返した。得られた処理物を１００℃で５分間沸騰させた後、室温で５分間、１２０００ｒｐｍでさらに遠心分離した。上清を回収し沈殿物を廃棄した。

８．ゲルろ過
２ｍｏｌ／Ｌのカルバミドと０．１％（ｖ／ｖ）のメルカプトエタノールとを含むＴＥ緩衝液で最初に平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌｓ−２００クロマトグラフィーカラムをさらなる分析に使用した。工程７で調製したサンプルをクロマトグラフィーカラム上に充填し、２ｍｏｌ／Ｌのカルバミドと０．１％（ｖ／ｖ）のメルカプトエタノールとを含むＴＥ緩衝液で洗い出し、それから溶出画分を回収した。その後、各チューブ中の溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために移し、より多くの標的タンパク質を含むサンプルを検出した。

９．アニオン交換クロマトグラフィー
強アニオン交換クロマトグラフィーカラム（ＡｍｅｒｓｈａｍＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ）を２ｍｏｌ／Ｌのカルバミドと０．１％（ｖ／ｖ）のメルカプトエタノールとを含むＴＥ緩衝液で最初に平衡化した。より多くの標的タンパク質を含むサンプルを混合し、カラムに充填し、それぞれ０．０５Ｍ、０．１Ｍ、０．１５Ｍ、０．２Ｍ、０．５Ｍ、及び０．７Ｍ等の異なる濃度のＮａＣｌを含む平衡化緩衝液（２ｍｏｌ／Ｌのカルバミドと０．１％（ｖ／ｖ）のメルカプトエタノールとを含むＴＥ緩衝液）で徐々に溶出させた。全ての溶離ピークを回収した。その後、カラムを１ＭのＮａＣｌを含む平衡化緩衝液で再生した。同時に、異なる濃度のＮａＣｌを含む溶出液のサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により同定した。結果として、０．７ＭのＮａＣｌを含む平衡化緩衝液で溶出したサンプルが、標的タンパク質を含むことを見出した。

１０．標的タンパク質ｒｈＮＧＢの再生及び脱塩化
溶媒耐性カラムＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０を０．１％（ｖ／ｖ）のＳＤＳを含むＴＥ緩衝液で最初に平衡化した。それから、標的タンパク質を含むサンプルをカラムに充填し、それからカラムを０．１％（ｖ／ｖ）のＳＤＳを含むＴＥ緩衝液で洗浄した。全ての溶出液を回収した。

分析後、培養培地におけるｒｈＮＧＢの濃度は１．２ｇ／Ｌであった。それから、回収したタンパク質ｒｈＮＧＢを同定し、免疫ブロット分析にかけた。

ＩＩ．組み換え全長ヒトＮＧＢ（ｒｈＮＧＢ）の同定
ヒトのニューログロビン遺伝子であるニューロサービビン（ＮＳＶ）のコード領域には４５６ｂｐ存在することが知られており、これは１５１個のアミノ酸をコードし得る（参考文献：ＢｕｒｍｅｓｔｅｒＴ，ＷｅｉｃｈＢ，ＲｅｉｎｈａｒｄｔＳ，ＨａｎｋｅｌｎＴ著「脳において発現した脊椎動物のグロビン（Ａｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｇｌｏｂｉｎｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｔｈｅｂｒａｉｎ）」Ｎａｔｕｒｅ．２０００；４０７（６８０３）：５２０−５２３）。核酸及びアミノ酸の配列はそれぞれ、配列番号１及び配列番号２に示した。

質量分析計によるｒｈＮＧＢタンパク質サンプルの分析後、配列番号３に示されるとおりのアミノ酸配列を得た。ＮＳＶフラグメントと一致するアミノ酸は６６個のアミノ酸であった。これは、全長ヒトニューログロビンタンパク質（１５１個のアミノ酸）の約４３．７％である。したがって、本発明の方法で得られたサンプルは正しいと考えることができる。

さらに、４９１タンパク質配列分析機（ＡＢＩＣｏｍｐａｎｙ，ＵＳＡ、環境温度が２０℃であり、相対湿度が２８％であった）を使用して直接配列決定を行うことによって、ｒｈＮＧＢタンパク質のアミノ酸配列をシークエンシングした。この配列のＮ末端は、Ｍ−Ｅ−Ｒ−Ｐ−Ｅ−Ｐ−Ｅ−Ｌ−Ｉ−Ｒ−Ｑ−Ｓ−Ｗ−Ｒ−Ａ−Ｖであり、これはヒトＮＧＢタンパク質のＮ末端と完全に一致する。したがって、本発明の方法で得られたサンプルは完全に正しいと考えることができる。

ＩＩＩ．抗ＮＧＢ抗体の調製
１．モノクローナル抗体の調製
１）実験動物：雌のＢＡＬＢ／ｃマウス、８〜１２週齢、１８〜２０ｇ重量（ＡｎｉｍａｌＣｅｎｔｒｅｏｆＡｃａｄｅｍｙｏｆＭｉｌｉｔａｒｙＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｅｏｐｌｅ‘ｓＬｉｂｒａｔｉｏｎＡｒｍｙｏｆＣｈｉｎａから購入）。マウス由来の骨髄腫細胞ＳＰ２／０は、ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）のセルバンクから購入した。

２）免疫：１００μｇ、１２５μｇ及び１５０μｇの精製ｒｈＮＧＢを抗原として使用し、３つの群に分けた。それぞれの群では、ｒｈＮＧＢをそれぞれ等量の完全フロインドアジュバントと混合し、完全に乳化させた。それから、複数の部位での腹腔内注射及び皮下注射によって、混合物を３匹のマウスに注射した。３週間後、同じ量の抗原を等量の不完全フロインドアジュバントと混合し、複数の部位での腹腔内注射及び皮下注射によってマウスに注射した。免疫を４週間間隔で２回繰り返した。それぞれの免疫の１５日後に、血清を回収することによって効力を測定した。効力がより高いマウスに抗原１００μｇを腹腔内注射して、細胞融合の３日前に免疫を追加した。

３）支持細胞の調製：細胞融合の１日前に、１匹の正常な昆明マウスに頚椎脱臼を行い、５分間７０％のエタノールに浸した。その後、クリーンベンチで腹部の皮膚を切り出し、腹膜を露出した。５ｍｌのＧＫＮ溶液（１１ｍＭのｄ−グルコースと、５．５ｍＭのＫＣｌと、１３７ｍＭのＮａＣｌと、２５ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４と、５．５ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４とを補充したＰＢＳで構成されている）をシリンジで腹腔に注射した。それから、腹部を繰り返し圧迫することによって腹水を回収し、それから遠心分離チューブに移し、５分間１０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を廃棄した後、ＨＡＴ培養培地を加え、細胞を懸濁した。それから、支持細胞を９６ウェルプレートに移し、３７℃で一晩、５％ＣＯ_２の培養器で培養した。

４）細胞融合：血清を調製するために免疫が追加されたマウスを使用した。詳細には、マウスの眼球を取り除き、血液を採取して、血清を調製し、それを低温で保存した。それから、マウスに頚椎脱臼を行い、５分間７０％のエタノールに浸した。その後、クリーンベンチでマウスの脾臓を取り出し、これをさらに粉砕して、細胞懸濁液を調製した。それから、得られた懸濁液を室温で１０分間、１０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を廃棄した後、細胞を２回ＧＫＮ溶液で洗浄し、ＧＫＮ溶液中で再懸濁した。０．２ｍｌの溶液を取り出して、顕微鏡下で細胞計測した。

５０ｍｌの円錐の遠心分離チューブ中で脾臓細胞をＳＰ２／０細胞と１０：１の比で混合し、３７℃で１０分間、１５００ｒｐｍで遠心分離した。上清を完全に廃棄して、細胞沈殿物をチューブの底を軽く叩くことにより遊離させた。遠心分離チューブを３７℃の水浴に置いて、１分間振盪しながら５０％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）溶液１ｍｌを滴下した。１分間静置した後、１０ｍｌのＧＫＮ溶液（最初の２ｍｌを１分、最後の８ｍｌを２〜３分）を加え、細胞融合を停止させた。さらに１分間静置した後、得られた結果物を１０分間１０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を廃棄し、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン（ＨＡＴ）培養培地を加えた。それから、サッカーでゆっくりと攪拌し、均質な懸濁液を調製した。細胞を支持細胞でプレコーティングした９６ウェルプレートに植菌し、３７℃で、５％のＣＯ_２の培養器で培養した。培養培地を３日ごとに交換し、６日後にヒポキサンチン−チミジン（ＨＴ）培養培地に変えた。

５）陽性クローンのスクリーニング：変法ｄｏｔ−ＥＬＩＳＡ技法を使用して、抗ｒｈＮＧＢ抗体を分泌することができる陽性ハイブリドーマ細胞に関してスクリーニングした。詳細には、ニトロセルロース膜（ＮＣフィルター）を１５〜３０分間、０．０１ｍｏｌ／ＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に浸し、それからろ紙で乾燥させた。ｒｈＮＧＢタンパク質を０．０１ｍｏｌ／ＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）で５０μｇ／ｍｌまで希釈し、ＮＣフィルター上に液滴当たり１μｌで滴下し、室温で乾燥させた。それから、振盪しながら３０分間、この膜をブロッキング緩衝液中に置いた。この膜を３分間３回、洗浄緩衝液で洗浄した。ろ紙で乾燥させた後、この膜を培養したハイブリドーマ細胞の上清（ＳＰ２／０細胞の上清を対照として使用した）中に室温で１時間置いた。それから、この膜を３分間３回、洗浄緩衝液で洗浄して、室温で３０分間振盪しながら、ＨＲＰ標識二次抗体の使用液（ｗｏｒｋｉｎｇｓｏｌｕｔｉｏｎ）に浸した。この膜に洗浄緩衝液を用いた３分間の洗浄を４回行った。その後、このニトロセルロース膜を３，３−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）溶液に入れ、１５分間振盪した。得られた膜を数分間水で洗浄し、それから蒸留水中に入れ、反応を停止させた。それからこの膜を室温で乾燥させた。

６）ハイブリドーマ細胞のサブクローニング：限界希釈法でサブクローニングを行った。陽性シグナルを有するプレートで得られた細胞を計測した後、４．６ｍｌ当たり２３０個の細胞濃度を有する懸濁液をＨＴ培養培地で１ウェル当たり２〜５×１０^４個の支持細胞を含む９６ウェルプレートにおいて再懸濁した。それぞれ０．１ｍｌを含む３６個のウェルが存在する。残った１．０ｍｌをＨＴ培養培地４ｍｌに加え、それから別の３６個のウェルに１ウェル当たり０．１ｍｌ加えた。残った１．４ｍｌをＨＴ培養培地１．４ｍｌに加え、残りの２４個のウェルに１ウェル当たり０．１ｍｌ植菌した。したがって、細胞計測比が５：１：０．５である３つの群が存在することになる。４日間ＣＯ_２培養器で培養した後、ＨＴ培養培地１００μｌをそれぞれのウェルに加えた。ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）の培養培地を９日目に加え、それから細胞の増殖を検出し、抗体の効力を測定した。陽性率が１００％になるまで、抗体の効力がより高い１〜２個のウェルをサブクローニングに使用した。全ての他のクローンを回収し、液体窒素中で保存した。

７）モノクローン（ｍｏｎｏｃｌｏｎｅ）株：スクリーニング及びサブクローニングの後、抗ＮＧＢハイブリドーマ細胞を安定して分泌することができる４個の株を得た。これらをそれぞれ、４Ｇ７、４Ｈ１、３Ｅ６及び２Ｅ１１と命名した。

８）腹水の調製：サブクローニングで得られたモノクローナルハイブリドーマ細胞の懸濁液を５分間１０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を廃棄し、無血清培養培地で細胞を１回洗浄した。再び、無血清培養培地を加え、それから３日後にさらなる使用のために上清を回収した。マウスに１匹あたり０．５ｍｌの液体パラフィンを腹腔内注射した。７日後、マウスに１匹あたり５×１０^６個のハイブリドーマ細胞懸濁液を腹腔内注射した。７〜１０日後、マウスの腹部が膨らんでいたことを観察した。腹水を回収し、−２０℃で保存した。

２．ポリクローナル抗体の調製
２匹の若くて健常な雌のウサギを使用して、抗ＮＧＢポリクローナル抗体を調製した。最初に、ウサギに４００μｇの精製したｒｈＮＧＢタンパク質（同量の完全フロインドアジュバントと事前に混合した）を筋肉注射、及び背中の複数の部位では皮下注射した。４週間後、免疫を追加するために、同じ用量（同量のフロインド不完全アジュバントと事前に混合した）を注射した。２週間後、ウサギの頚動脈から血液を得ることによって、ウサギの血清を回収した。詳細な手順は、ＺｈｕＺｈｉｐｉｎｇ，ＣｈｅｎＸｕｅｑｉｎｇ．著「免疫学における一般的な実験方法（ＣｏｍｍｏｎＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＭｅｔｈｏｄｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」（Ｂｅｉｊｉｎｇ：Ｐｅｏｐｌｅ‘ｓＳｕｒｇｅｏｎＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＨｏｕｓｅ，２０００）に記載されている。

３．抗体の精製
得られたマウスの腹水（モノクローナル抗体）及びウサギの血清（ポリクローナル抗体）を遠心分離、沈殿、脱塩化して、未精製の抗体を得た。それから、ＰｒｏｔｅｉｎＧカラムで抗体を精製し、精製モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を得た。詳細な手順は、ＺｈｕＺｈｉｐｉｎｇ，ＣｈｅｎＸｕｅｑｉｎｇ．著「免疫学における一般的な実験方法（ＣｏｍｍｏｎＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＭｅｔｈｏｄｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」（Ｂｅｉｊｉｎｇ：Ｐｅｏｐｌｅ‘ｓＳｕｒｇｅｏｎＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＨｏｕｓｅ，２０００）に記載されている。

４．抗体の品質管理
１）モノクローナル抗体の同定
Ａ．特異性の同定：免疫ブロット分析を使用して、モノクローナル抗体の特異性を試験した。抗体２Ｅ１１の同定の結果を図３に示す。図中、レーン１はｒｈＮＧＢタンパク質を発現する大腸菌株ｐＢＶ２２０−ｒｈＮＧＢ／ＨＢ１０１の溶解物の上清を示し、レーン２は陰性対照としてのミオグロビンを示し、レーン３は大腸菌株ｐＢＶ２２０−ｒｈＮＧＢ／ＨＢ１０１の封入体を示し、レーン４は陰性対照としてのヘモグロビンを示し、レーンＭは低分子量のタンパク質マーカーを示す。モノクローナル抗体は特異性が高く、ミオグロビン及びヘモグロビン等の他のグロビンと交差反応せずにｒｈＮＧＢタンパク質を認識することが示唆される。

Ｂ．抗体のサブクラスの同定：抗体のサブクラスの同定キット（Ｒｏｃｈｅ，Ｇｅｒｍａｎ）を使用して、モノクローナル抗体のサブクラスを検出した。具体的には、０．０１ｍｏｌ／ＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈した１５０μｌの無血清培養培地を反応チューブに滴下し、室温で３０秒間インキュベートした。チューブを一時的に軽く叩いて、底のゲルを完全に再懸濁させた。サブクラスの同定試験紙を１０分間反応チューブに入れ、バンドを読み取り、モノクローナル抗体のサブクラスを求めた。結果を図４に示す。図４は、抗ＮＧＢモノクローナル抗体の重鎖はＩｇＧ１である（図４Ａ）一方で、軽鎖はк鎖である（図４Ｂ）ことを示している。

２）ポリクローナル抗体の同定
免疫ブロット分析をポリクローナル抗体の同定に使用した。原核生物又は真核生物のいずれかによって発現したｒｈＮＧＢタンパク質を認識する抗体の能力を試験した。

具体的には、原核細胞によって発現したｒｈＮＧＢタンパク質を認識するポリクローナル抗体の能力の同定において、本発明者らは、熱誘導に上記の工学的株ｐＢＶ２２０−ｒｈＮＧＢ／ＨＢ１０１及びｐＢＶ２２０空ベクターを含む大腸菌ＨＢ１０１株を使用した。発現産物の電気泳動後に、これらを免疫ブロット分析で試験した。結果を図５Ａに示す。図中、レーン１は、ウサギ抗ｒｈＮＧＢポリクローナル抗体が工学的株ｐＢＶ２２０−ｒｈＮＧＢ／ＨＢ１０１の発現産物に含まれるｒｈＮＧＢタンパク質（約１７ｋＤａ）を認識することができることを示唆し、レーン２はウサギ抗ｒｈＮＧＢポリクローナル抗体がｐＢＶ２２０空ベクターを含む大腸菌ＨＢ１０１株の発現産物のいずれのバンドも認識することができないことを示唆する陰性対照を示す。

真核細胞で発現されたＮＧＢタンパク質の認識における抗ＮＧＢポリクローナル抗体の能力を同定する場合、本発明者らは、ＮＧＢ真核細胞発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５／６×Ｈｉｓ／ＮＧＢ（フォワードプライマーの５’−ｇｇＡＴＣＣｇＣＡＴｇｇＡｇＣｇＣＣＣｇｇＡｇ−３’及びリバースプライマーの５’−ＣＴＣｇＡｇＣＴＣｇＣＣＡＴＣＣＣＡｇＣＣＴＣｇ−３’を使用して、ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５／６×Ｈｉｓ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＩｎｃ．）の制限部位ＢａｍＨＩとＸｈｏＩとの間にＮＧＢ遺伝子配列を挿入することによって構築され、得られた組み換えベクターを細胞に形質転換した後、真核細胞で発現したＮＧＢタンパク質を得ることができる）及び空ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５／６×Ｈｉｓを使用し、それぞれＣＯＳ−７細胞に導入した。４８時間後、細胞を回収し、細胞中のタンパク質を全て免疫ブロット分析のために抽出した。結果を図５Ｂに示す。図中、レーン３は、ウサギ抗ＮＧＢポリクローナル抗体がＮＧＢタンパク質を認識することができることを示唆し、レーン４はＬａｃＺ−６×Ｈｉｓタンパク質（市販のベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｕ．Ｓ．）を導入することによって、ＬａｃＺ−６×Ｈｉｓタンパク質を得た）を抗６×Ｈｉｓモノクローナル抗体によって検出することができることを示す陽性対照を示す。これは、ウサギ抗ＮＧＢポリクローナル抗体が、真核細胞で発現したＮＧＢタンパク質を認識することができることを示唆している。

ウサギ抗ＮＧＢポリクローナル抗体をさらに使用して、スナネズミの脳におけるＮＧＢタンパク質の分布を検出した。図６に示されるように、ＮＧＢ免疫反応の陽性細胞が、大脳皮質（図６Ａ）並びに海馬の錐体細胞及び軸索（図６Ｂ）に広く分布していたことがわかる。

この結果は、本発明により調製された抗ＮＧＢポリクローナル抗体がＮＧＢタンパク質を特異的に認識することができることを示している。

ＩＶ．ＮＧＢ−ＥＬＩＳＡキット
１．以下の反応試薬をＮＧＢ−ＥＬＩＳＡキットに使用した。
１）コーティング希釈緩衝液（０．８５Ｍの炭酸緩衝液（ｐＨ９．５））：Ｎａ_２ＣＯ_３１．５９ｇ、ＮａＨＣＯ_３２．９３ｇ。２回蒸留した水を１０００ｍｌまで加えた。

２）洗浄緩衝液（ＰＢＳ（ｐＨ７．４））：ＫＨ_２ＰＯ_４０．２ｇ、ＫＣｌ０．２ｇ、Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ２．９ｇ、ＮａＣｌ８．０ｇ、Ｔｗｅｅｎ−２００．５ｍｌ。２回蒸留した水を１０００ｍｌまで加えた。

３）サンプルの希釈緩衝液：０．１ｇＢＳＡ、洗浄緩衝液を１００ｍｌまで加えた。

４）ブロッキング緩衝液（１．５％のカゼイン、作用濃度：０．０５％）：カゼイン３６ｇ、ＮａＯＨ２．４ｇ、水６００ｍｌに溶解した。約１８００ｍｌのＰＢＳを２４００ｍｌの容量を満たすまで加えた。

５）基質緩衝液（クエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５．０））：０．２ＭのＮａ_２ＨＰＯ_４（２８．４ｇ／Ｌ）２５．７ｍｌ、０．１Ｍのクエン酸（１９．２ｇ／Ｌ）２４．３ｍｌ、２回蒸留した水を５０ｍｌ加えた。

６）ＴＭＢ基質希釈緩衝液：３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（１ｍｇ／ｍｌ）１．０ｍｌ、基質希釈緩衝液１０ｍｌ、３０％のＨ_２Ｏ_２７μｌ。

７）停止緩衝液（２ＭのＨ_２ＳＯ_４）：１７８．３ｍｌの水に２１．７ｍｌの濃縮硫酸を滴下した。

本発明のＮＧＢ−ＥＬＩＳＡキットは、標準ＮＧＢタンパク質及び上記の反応試薬と共に、上記で調製した抗ＮＧＢモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体から作られる。

２．ＮＧＢ−ＥＬＩＳＡキットを使用するプロトコル
ａ）コーティング：コーティング緩衝液（０．８５Ｍの炭酸緩衝液（ｐＨ９．６））で抗ＮＧＢモノクローナル抗体を１：１０００まで希釈した。９６ウェルの酵素標識プレートを４℃で一晩、１ウェル当たり１００μｌでコーティングした。

ｂ）洗浄：洗浄緩衝液ＰＢＳＴ（０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含む０．０１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４））で３回洗浄した。

ｃ）ブロッキング：１ウェル当たり１２５μｌのブロッキング緩衝液（０．０５％のカゼイン）を使用して、ウェルを室温で４時間又は４℃で一晩ブロッキングした。

ｄ）サンプルの充填：ブランク及び陰性対照用のウェルを設けた（各群に２つのウェル）。標準曲線を得るために、異なる濃度のｒｈＮＧＢ標準をウェルに加えた（それぞれの濃度に２つのウェル）。測定サンプルを加えた。全てのウェルで、サンプルの容量は、１ウェル当たり１００μｌである。３７℃の水浴で１時間インキュベートした。

ｅ）洗浄：洗浄緩衝液ＰＢＳＴ（０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含む０．０１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４））で３回洗浄した。

ｆ）ポリクローナル抗体の添加：ポリクローナル抗体を１ウェル当たり１００μｌのＰＢＳ（０．０１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４））で１：１５００に希釈した。３７℃の水浴で１時間インキュベートした。

ｇ）洗浄：洗浄緩衝液ＰＢＳＴ（０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含む０．０１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４））で３回洗浄した。

ｈ）二次抗体の添加：ＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧを１ウェル当たり１００μｌのブロッキング緩衝液（１％のカゼイン）で１：５０００に希釈した。３７℃の水浴で３０分間インキュベートした。

ｉ）洗浄：洗浄緩衝液ＰＢＳＴ（０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含む０．０１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４））で３回洗浄した。

ｊ）発色：１ウェル当たり１００μｌの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）で現像した。３７℃の水浴で１０〜２０分間インキュベートした。

ｋ）停止：１ウェル当たり１００μｌの停止緩衝液（２ＭのＨ_２ＳＯ_４）で反応を停止させた。

ｌ）検出：酵素免疫アッセイ機器でＯＤ_４５０の吸光を検出した。

ｍ）標準曲線の獲得：標準タンパク質の濃度をＸ軸に適用し、ＯＤ_{４５０ｎｍ}をＹ軸に適用して、標準曲線を引いた。結果を図７に示す。ＮＧＢタンパク質の濃度の検出可能な領域は、１５０ｎｇ／ｍｌ〜１８μｇ／ｍｌであることがわかる。

ｎ）算出：ユーザーは、標準曲線に基づいて、サンプルにおけるＮＧＢ濃度を得ることができる。希釈倍数を乗じた後、サンプルにおけるＮＧＢの正確な濃度を得ることができる。

実施例２．ＮＧＢ−ＥＬＩＳＡキットの適用
脳虚血後の血清におけるＮＧＢタンパク質の動的変化は、動物モデルの血清におけるＮＧＢタンパク質の濃度を検出することによって、明らかにすることができる。スナネズミの脳の虚血再かん流モデルを使用し、２０分の虚血発作に続く再かん流後、２時間、８時間、１６時間、２４時間、４８時間、及び７２時間で血清を回収した。最初に、本発明の抗ＮＧＢポリクローナル抗体を免疫組織化学的方法により使用することによって、虚血再かん流モデルにおける組織の変化を検出し、この結果を図８及び図９に示す。ここで、図８Ａ及び図８Ｂは、正常なスナネズミの海馬のＣＡ_１及びＣＡ_３領域におけるＮＧＢ免疫反応陽性ニューロンの正常な分布を示し、図９Ａ及び図９Ｂは、再かん流の７２時間後のスナネズミの海馬のＣＡ_１及びＣＡ_３領域におけるＮＧＢ免疫反応陽性ニューロンの分布を示す。比較すると、虚血再かん流損傷した神経細胞が破壊され、それらの多数が死滅していることがわかる。

本発明のキットを使用することによって、ＮＧＢの血清学的動的変化を検出し、それを脳切片と比較した。血清におけるＮＧＢの変化を表１及び図１０に示す。スナネズミの脳の虚血再かん流損傷の８時間後に、血清におけるＮＧＢ濃度が有意に（Ｐ＜０．０５）且つ徐々に増大し、４８時間でピークに達したことが分かる。ＮＧＢの血清学的レベルは、虚血再かん流モデルにおける脳損傷の程度に明らかに関連する。したがって、ＮＧＢの血清学的レベル及びＮＧＢの動的変化の検出により、脳損傷の程度を明らかにすることができることを結論付けることができる。この結果は、脳梗塞後の血清におけるＮＧＢタンパク質の変化パターンを研究するのに、本発明のＮＧＢ−ＥＬＩＳＡキットを使用することができることをはっきりと示している。同時に、脳梗塞の発生及び進行を評価するのに、この結果をさらに使用することができる。

実施例３．虚血関連血管疾患を患う患者及びラットの虚血再かん流損傷モデルの血清サンプルにおけるＮＧＢタンパク質濃度の検出
ＮＧＢ−ＥＬＩＳＡキットを使用して、虚血関連血管疾患を患う患者及びラットの虚血再かん流損傷モデルの血清サンプルにおけるＮＧＢタンパク質濃度を検出した。詳細なプロトコルは、以下のとおりであった。

ａ）コーティング：コーティング緩衝液（０．８５Ｍの炭酸緩衝液（ｐＨ９．６））で抗ＮＧＢモノクローナル抗体を１：１０００まで希釈した。９６ウェルの酵素標識プレートを４℃で一晩、１ウェル当たり１００μｌでコーティングした。

ｃ）ブロッキング：１ウェル当たり１２５μｌのブロッキング緩衝液（０．０５％のカゼイン）を使用して、ウェルを室温で４時間又は４℃で一晩処理した。

ｄ）サンプルの充填：ブランク及び陰性対照用のウェルを設けた（各群に２つのウェル）。
（ｉ）標準曲線を得るために、異なる濃度のｒｈＮＧＢタンパク質をウェルに加えた（それぞれの濃度に２つのウェル）、
（ｉｉ）ラットの虚血モデル（２０分の虚血の後、４８時間の再かん流）の血清を加えた、
（ｉｉｉ）虚血関連血管疾患を患う患者の血清（病院番号３０７から購入、手術前に回収し、患者は特別な薬物のいかなる治療も受けなかった。血液のルーチン試験は正常である）を加えた、
（ｉｖ）全てのウェルで、サンプルの容量は、１ウェル当たり１００μｌである。３７℃の水浴で１時間インキュベートした。

ｈ）二次抗体の添加：ＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧを１ウェル当たり１００μｌとなるようにブロッキング緩衝液（１％のカゼイン）で１：５０００に希釈した。３７℃の水浴で３０分間インキュベートした。

ｍ）標準曲線の獲得

ｎ）標準曲線に基づくと、血清におけるＮＧＢ濃度は、患者では１３μｇ／ｍｌであり、２０分間の虚血発作後、４８時間の再かん流を行ったラットモデルでは１１μｇ／ｍｌである。

この結果は、本発明のＮＧＢ−ＥＬＩＳＡキットを、患者又はラットのいずれかの血清における正確なＮＧＢ濃度を検出するのに使用することができることを示唆している。

本発明のＮＧＢ−ＥＬＩＳＡキットは、様々なサンプルにおけるＮＧＢタンパク質濃度を検出するのに十分な感度があり、老年性認知症、脳梗塞、又は外傷性脳損傷等のニューロン損傷及び変性疾患に関連する多くの疾患の臨床診断のための潜在的なガイドラインとして使用することができ、これらの疾患の進行を追跡するのを助ける。

図１は、ＰＣＲ技法により得られたｒｈＮＧＢの増幅産物の電気泳動図を示す図である。図２はそれぞれ、ＰＣＲ及び制限酵素法による同定後におけるｒｈＮＧＢ陽性クローンの制限酵素地図を示す図である。図３は、得られたモノクローナル抗体の免疫ブロット分析を示す図である。図４は、得られたモノクローナル抗体のサブクラスの同定を示す図である。図５は、得られたポリクローナル抗体の免疫ブロット分析を示す図である。図６は、得られたポリクローナル抗体によって検出された成体スナネズミの脳におけるＮＧＢタンパク質の分布を示す図である。図７は、本発明のキットによって検出されたＮＧＢタンパク質の標準曲線を示す図である。図８は、スナネズミの海馬におけるＮＧＢ陽性ニューロンの分布を示す図である。図９は、虚血再かん流損傷後７２時間の脳におけるＮＧＢ陽性ニューロンの分布を示す図である。図１０は、虚血再かん流後２〜７２時間のスナネズミの脳におけるＮＧＢの血清学的変化を示す図である。

Claims

抗ＮＧＢモノクローナル抗体と、抗ＮＧＢポリクローナル抗体と、酵素標識抗体と、標準ＮＧＢタンパク質とを含むＮＧＢ−ＥＬＩＳＡキットであって、
該抗ＮＧＢモノクローナル抗体が、ＮＧＢ抗原でマウスを免疫した後、細胞融合してハイブリドーマ細胞を産出すること、及びその後該ハイブリドーマ細胞を培養することによって得られ；
該抗ＮＧＢポリクローナル抗体が、ＮＧＢ抗原で動物を免疫すること、及びそれから該動物の血清から採取することによって得られ、
該標準ＮＧＢタンパク質が、ＮＧＢ抗原であって、
該ＮＧＢ抗原が、以下の工程によって得られる、ＮＧＢ−ＥＬＩＳＡキット：
１）全長ヒトＮＧＢｃＤＮＡ配列を含む原核細胞発現ベクターを構築する工程と、
２）該構築された原核細胞発現ベクターを大腸菌ＨＢ１０１株に形質転換して、次いで陽性クローンをスクリーニングする工程と、
３）熱刺激によって該ＮＧＢの発現を誘導して、発現産物を得る工程と、
４）該発現産物をゲルろ過し、次いでアニオン交換クロマトグラフィーすることにより、該ＮＧＢ抗原を得る工程。
前記原核細胞発現ベクターがｐＢＶ２２０−ｒｈＮＧＢである、請求項１に記載のＮＧＢ−ＥＬＩＳＡキット。
前記陽性クローンを培養する条件が、８０〜１２０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培養培地に前記大腸菌株を植菌すること、及び、２８〜３２℃で２〜３時間培養した後に、４０〜４４℃で振盪しながら培養して、ｒｈＮＧＢの発現を誘導することである、請求項１に記載のＮＧＢ−ＥＬＩＳＡキット。
前記酵素標識抗体が、ＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＮＧＢ−ＥＬＩＳＡキット。
酵素標識プレートと、発色試薬とをさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＮＧＢ−ＥＬＩＳＡキット。
前記発色試薬が、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）である、請求項５に記載のＮＧＢ−ＥＬＩＳＡキット。
老年性認知症、脳梗塞、又は外傷性脳損傷の臨床診断の支援における、請求項１に記載のＮＧＢ−ＥＬＩＳＡキットの使用。