DK175703B1 - Human vævsfaktor-relaterede DNA-segmenter, polypeptider og antistoffer, hybridomaer, bestemmelsesmetoder, diagnostiske systemer og metoder, isoleringsmetoder og fremstillingsmetoder - Google Patents

Description

i DK 175703 B1

Den foreliggende opfindelse angår et rekombinant DNA-molekyle (rDNA), som bærer et strukturelt gen, som koder for proteinet med tung kæde af human vævsfaktor (huTFh). Opfindelsen angår nærmere bestemt en ekspressionsvektor, I 5 som er i stand til at eksprimere huTFh i værtsceller inde holdende denne vektor. Den foreliggende opfindelse angår også en syntetisk polypeptidanalog af huTFh og monoklonale antistoffer, der binder huTFh og polypeptidanalogene.

Koagulering af blod involverer en seriekaskade af 10- enzym-, cofaktor-, proteolyse- og gelatineringsreaktioner, der medieres af en gruppe af cellulære proteiner og plasmaproteiner, der er kendte som koagulationsfaktorer. Initiering af denne kaskade kan forekomme, når den cellulære receptor, der er kendt som vævsfaktor (TF), binder koagule-15 ringsfaktor VII eller dens derivat faktor Vila til dannelse af et katalytisk aktivt kompleks. I fraværelse af TF og uden fortsat binding til et kompleks initierer faktor VII/-Vlla ikke koagulering. Den kemiske og biologiske karakterisering af TF er derfor klart af betydning for forståelsen 20 af koaguleringsmekanismen.

Vævsfaktor er et membranbundet glycoprotein, der ikke normalt findes opløst i kredsløbet eller tilgængeligt for plasmaproteiner omfattende faktor VII/VIIa og de andre koagulationsfaktorer. Medens vævsfaktor ikke normalt ekspri-25 meres på overfladen af celler, som danner karvæv, kan dets ekspression af monocyter i karvævet fremkaldes af bestanddele af infektiøse agenser, såsom bakterielt lipopolysac-charid, lymphokiner afledt af nogle antigenstimulerede T--hjælperceller, direkte af nogle stimulerede T-hjælperceller 30 og immunkomplekser. Visse inflammatoriske mediatorer af monocyt/makrofag-oprindelse, f.eks. interleukin 1 og tumor--nekrose-faktor α samt bakterielt lipopolysaccharid, kan stimulere endotheliale celler, som forer den humorale overflade af blodkar til eksprimering af TF. Ekspression af TF 35 i kar-rummet medfører typisk spredt intravaskulær koagulering Η

I DK 175703 B1 I

2 I

eller lokaliseret initiering af · koagulering, dvs. throm- I

bogenese. I

Vævsfaktor eksprimeres konstitutivt på overfladen af I

I visse ekstravaskulære celler i kultur in vitro, herunder I

5 fibroblaster, nogle endnu ikke identificerede typer af hjer- ' I

I neceller og visse epitheler, der er adskilt fra de cirkule- I

H rende plasmaproteiner af basismembran-barrierer. Tilstede- .j I

I værelsen af TF på disse celler medfører koage1-dannelse ved : I

j kontakt med blod som resultat af vævsbeskadigelse. TF er I

I 10 således grundlaget for initieringen af det hæmostatiske I

H system. I

I Rapporten af Howell, Am. J. Physiol, 31:1 (1912) var I

I den første til at foreslå, at et isoleret vævsproteinpræparat I

I indeholdende TF kun kunne fremme koagulering, når det var I

15 til stede som et phospholipidprotein-kompleks (lipoprotein- I

I -kompleks). Rekonstitution af den pro-koagulerende aktivitet I

af TF ved relipidering af det isolerede protein har været j

I nødvendig, fordi isolering af det TF-holdige vævsprotein I

I typisk medfører fjernelse af phospholipiderne, som normalt

20 er knyttet til TF-proteinet, og en sådan rekonstitution er ‘ I

I blevet undersøgt af et antal forskere. Det er f.eks. blevet ! I

I rapporteret, at rekonstitutionen af koagulerende aktivitet ; I

I påvirkes af phospholipidtypen, forholdet mellem phospholipid | I

I og protein og detergentet og den ioniske sammensætning af I

25 rekonstitutionsblandingen, se Nemerson, J. Clin. Invest.,

I 47-72 (1968); Nemerson, J. Clin. Invest., 48-322 (1969); og I

Carson et al., Science, 208:307 (1980). I

I Både isolerede og relipiderede TF-holdige proteinpræ- I

I parater er blevet fremstillet ved ekstraktion fra væv af ' I

30 forskellige arter. Historisk har de anvendte metoder været I

I vanskelige, tidskrævende og givet lave udbytter, fordi vævs-

I faktor kun er til stede i yderst små mængder i naturligt I

I forekommende væv. Vedrørende en gennemgang af de klassiske I

I metoder, se Nemerson et al., Prog. Hem, Thromb., 6:237-261

I 35 (1982). I

3 DK 175703 B1

Senere har Broze et al., J. Biol. Chem., 260:10917-20 (1985), Bom et al., Thromb. Res., 42:635-643 (1986) og

Guha et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 83:299-302 (1986) rapporteret isolering af human vævsfaktor-protein (huTF-5 -protein) ved anvendelse af en metode baseret på opdagelsen af, at delipideret vævsfaktorprotein kan binde faktor VII/-VIla, når proteinet er opløst i en vandig opløsning indeholdende et ikke-ionisk detergent og calciumchlorid. Imidlertid er anvendeligheden af denne metode, hvorved der anvendes et 10 faktor VII/VIIa-affinitetssorptionsmiddel som middel til isolering af vævsfaktorprotein, ikke blot begrænset af van-1 skelighederne ved at opnås væsentlige mængder af isoleret faktor VII/VIIa, men også af labiliteten af faktor VII/VIIa.

Broze et al., supra, har foreslået, at udvikling af 15 monoklonale antistoffer, som er specifikke for huTF, og deres anvendelse som immunoaffinitets-sorptionsmidler kan omgå problemer forårsaget af den begrænsede tilgængelighed af faktor VII/VIIa. Der er imidlertid ikke rapporteret nogen j monoklonale anti-huTF-antistoffer i litteraturen. Endvidere 20 immunoreagerer to monoklonale antistoffer fremkaldt mod bovin TF [Carson et al., Blood, 662-156 (1985)] ikke med huTF (Guha et al., supra).

Ifølge en udførelsesform angår den foreliggende opfindelse et DNA-segment, der ikke omfatter mere end ca.

25 12.000 nukleotid-basepar og omfattende en sekvens, der defi nerer et strukturelt gen, som koder for et protein med tung kæde af human vævsfaktor (huTFh). Det strukturelle gen koder fortrinsvis for et protein, der har en aminosyrerest-sekvens vist i fig. 1 fra ca. rest nr. 1 til ca. rest nr. 263. Mere 30 foretrukket har det strukturelle gen en nuklotid-basesekvens vist i fig. 2 fra ca. base nr. 130 til ca. base nr. 918.

Ifølge foretrukne udførelsesformer omfatter DNA-seg-mentet også en anden sekvens, der støder op til 5'-terminussen af den første sekvens og koder for en aminosyrerest-le-35 dersekvens bundet til aminoterminussen af huTFh-proteinet.

Den første og den anden DNA-sekvens definerer sammen et

DK 175703 B1 I

I I

sammensat strukturelt gen, der koder for et forstadium af I

et protein med tung kæde af human vævsfaktor {pre-huTFh) . I

Det sammensatte strukturelle gen koder fortrinsvis for et I

H protein, der har en aminosyresekvens vist i fig. 1 fra ca. I

5 rest nr. -32 til ca. rest nr. 263. Det sammensatte struk- ’ I

. turelle gen har mere foretrukket en nukleotid-basesekvens I

vist i fig. 2 fra ca. base nr. 34 til ca. base nr. 918. I

I en anden udførelsesform angår den foreliggende I

opfindelse et rekombinant DNA-molekyle omfattende en vektor, I

10 der er operativt bundet til et først DNA-segment, som defi- I

nerer et strukturelt gen, der koder for et protein med tung I

kæde af human vævsfaktor. Det rekombinante DNA-molekyle I

omfatter yderligere fortrinsvis et andet DNA-segment, der I

støder op til 5'-terminussen af det første segment og koder I

15 for en aminosyrerest-ledersekvens bundet til det nævnte I

protein. Det første og det andet DNA-segment definerer sammen I

et sammensat strukturelt gen, som koder for en forstadie-form I

for det nævnte protein. I

Ifølge en anden udførelsesform angår den foreliggende I

20 opfindelsen en polypeptidanalog af bindingsstedet af human I

vævsfaktor, der ikke omfatter mere end ca. 50 aminosyrerester I

H og omfatter en aminosyresekvens, der svarer til en sekvens I

med formlen: I

I -VNQVYT-. I

I 25 Mere foretrukket angår den foreliggende opfindelse I

I en polypeptidanalog af bindingsstedet af human vævsfaktor, I

I der ikke omfatter mere end ca. 50 aminosyrerester og omfatter I

I en aminosyresekvens, der svarer til en sekvens med formlen: I

I -VNQVYTVQIST-, eller I

I 30 -LYYWKSSSSGKKT-. I

I En yderligere udføreIsesform for den foreliggende I

I opfindelse er et antistofpræparat omfattende antistofmole- I

kyler, der I

I a) immunoreagerer med protein med tung kæde af human I

35 vævsfaktor, I

I b) immunoreagerer med et polypeptid med formlen: I

5 DK 175703 B1 H-EWE PKPVNQVYT-OH, H-EPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKC -OH, H-VFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKT-OK, H-RDVFGKDLIYTLYYWK-OH, 5 H-IYTLYYWKSSSSGKKTAK-OH, H-S S S G KKTAKTNTNE FLIDVDKG ENYC FS V-OH, H-SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWE PKPV-OH, H-TKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTY-OH, H-KSGDWKSKC-OH, 10 H-ECDLTDEIVKDVKQTY-OH, H-LARVFSYPAGNVE STGSAGEPLY ENS PE FTPYLC-OH, H-YENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKV-OH eller ; H-QAVIPSRTVNRKSTDSPVEC-OH; og c) i det væsentlige ikke immunoreagerer med et poly- 15 peptid med formlen vist i fig. 1 fra position 204 til position 226.

Også omfattet af den foreliggende opfindelse er hy-bridomaerne TF8-5G9, TF9-10H10, TF9-5B7 og TF9-6B4, samt præparater af monoklonalt antistof omfattende antistofmole-20 kyler, der produceres af disse hybridomaer.

Den foreliggende opfindelse angår også en fremgangsmåde til bestemmelse af tilstedeværelsen af protein med tung kæde af human vævsfaktor i en kropsvæskeprøve, omfattende følgende trin: 25 a) blanding af en kropsvæskeprøve med antistoffer, der immunoreagerer med protein med tung kæde af human vævsfaktor til dannelse af en immunoreak-tionsblanding, b) bibeholdelse af blandingen i et tilstrækkeligt 30 tidsrum til, at antistofferne immunoreagerer med eventuel humanvævsfaktor til stede i prøven og danner et immunoreaktionsprodukt, og c) påvisning af tilstedeværelsen af eventuelt immunoreaktionsprodukt dannet i trin b).

35 Opfindelsen omfatter også en metode til påvisning af en thrombus in vivo, omfattende følgende trin:

I DK 175703 B1 I

I i

a) intravenøs indgivelse til en person af et præparat I

af monoklonalt antistof omfattende et fysiologisk I

acceptabelt fortyndingsmiddel og en vis mængde I

antistof molekyler produceret af hybridoma TF9-10H10 I

5 bundet til et in vivo-indikerende middel, der er I

effektivt til at immunreagere med human vævsfaktor, I

som er til stede i en thrombus, I

b) bibeholdelse af personen, der har modtaget ind- I

giveisen, i et forud bestemt tidsrum, der er til- I

10 strækkeligt til, at antistofmolekylerne immuno- I

I reagerer med vævsfaktor til stede in vivo som del I

af en thrombus og danner et immunoreaktionsprodukt, I

I °g i

c) bestemmelse af tilstedeværelsen af eventuelt im- I

15 munoreaktionsprodukt dannet i trin b). I

I Opfindelsen omfatter endvidere en metode til neutra- I

. lisering af evnen af human vævsfaktor til at binde koagule- I

ringsfaktor VII/VIla in vivo, omfattende intravenøs indgi- I

velse til en person af et præparat af monoklonalt antistof I

20 omfattende et fysiologisk acceptabelt fortyndingsmiddel ! I

indeholdende en vis mængde antistofmolekyler produceret af | I

I et hybridoma valgt blandt TF8-5G9 og TF9-6B4, der er effektiv I

I til at binde til tilstedeværende human vævsfaktor. I

H Den foreliggende opfindelse angår også en metode til I

25 inhibering af bindingen af human vævsfaktor til koagule- I

I ringsfaktor VII/VIIa in vivo, omfattende intravenøs indgi- I

velse til en person af et polypeptidpræparat omfattende et I

I fysiologisk acceptabelt fortyndingsmiddel indeholdende et . ; I

I polypeptid valgt blandt: I

I 30 H-EWEPKPVNQVYT-OH, I

I H-EPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKC-OH, I

I H-VFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKT-OH, I

I H-RDVFGKDLIYTLYYWK-CH, I

H-IYTLYYWKSSSSGKKTAK-OH, og I

I 35 H-S S SGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSV-OH; I

7 DK 175703 B1 ! hvor polypeptidet er til stede i præparatet i en effektiv mængde til reaktion med faktor Vll/VIIa.

Ifølge en anden udførelsesform omfatter den foreliggende opfindelse et diagnostisk system i form af et sæt til 5 bestemmelse af tilstedeværelsen af protein med tung kæde af human vævsfaktor i en prøve, omfattende en pakning indeholdende et antistofpræparat ifølge opfindelsen. Antistofpræparatet omfatter fortrinsvis monoklonale antistofmolekyler produceret af et hybridoma valgt blandt 10 a) TF8-5G9, b) TF9-6B4, c) TF9-10H10 og j d) TF9-5B7.

! Opfindelsen omfatter også en fremgangsmåde til iso- 15 lering af blodkoaguleringsfaktor Vll/VIIa fra en prøve. Fremgangsmåden omfatter følgende trin: a) blanding af prøven med en fast bærer, der omfatter et polypeptid ifølge krav 15 bundet til en fast matriks, hvor der ved blandingen dannes en bin- 20 dingsreaktionsblanding, b) bibeholdelse af bindingsreaktionsblandingen i et tidsrum, der er tilstrækkeligt til, at koaguleringsfaktoren binder til polypeptidet og danner et fastfase-kompleks og en ovenstående væske, 25 c) fraskillelse af den ovenstående væske fra komplek set, og d) genvinding af koaguleringsfaktoren fra det fraskilte kompleks fra trin c).

Opfindelsen omfatter yderligere et præparat omfattende ’ 30 en vandig opløsning af biologisk aktivt protein med tung kæde af human vævsfaktor, der i det væsentlige er frit for protein med let kæde af human vævsfaktor. Det biologisk aktive protein med tung kæde af human vævsfaktor er fortrinsvis dispergeret i et phospholipid eller et ikke-ionisk 35 detergent.

DK 175703 B1 I

I I

Opfindelsen omfatter også et diagnostisk system i I

form af et sæt til bestemmelse af koaguleringskompetencen i I

en karsystem-væskeprøve. Det omfatter en pakning indeholdende I

et præparat i vandig opløsning af biologisk aktivt protein I

5 med tung kæde af human vævsfaktor, der i det væsentlige er I

frit for protein med let kæde af human vævsfaktor, hvor I

proteinet med tung kæde er til stede i en tilstrækkelig I

mængde til gennemførelse af mindst én bestemmelse. Proteinet I

med tung kæde er fortrinsvis dispergeret i et phospholipid. I

10 I en anden udførelsesform omfatter opfindelsen en I

fremgangsmåde til fremstilling af modent protein med tung - I

kæde af human vævsfaktor og protein-ekspressionsproduktet I

af denne fremgangsmåde. Fremgangsmåden omfatter følgende I

I trin: I

H 15 a) igangsætning af en kultur i et næringsmedium af I

pattedyrceller transformeret med et rekombinant. I

I DNA-molekyle omfattende en ekspressionsvektor, . I

som er forenelig med de nævnte celler, operativt I

I bundet til et første DNA-segment, der definerer I

.20 et strukturelt gen, som koder for et protein med I

tung kæde af human vævsfaktor, og et andet DNA- I

segment, der støder op til det første segment og I

. koder for en aminosyrerest-ledersekvens, der er I

i

bundet til proteinet, hvor det første og det andet i I

25 DNA-segment sammen definerer et sammensat struk- I

turelt gen, der koder for en forstadieform af det I

nævnte protein, I

I b) bibeholdelse af den nævnte kultur i et tidsrum, _ I

H der er tilstrækkeligt til, at cellerne eksprimerer I

I 30 protein ud fra det nævnte rekombinante DNA-molekyle . I

H og danner det nævnte modne protein, og I

I c) udvinding af det modne protein fra kulturen. I

I Kort beskrivelse af tegningen. I

I 35 Fig. 1 illustrerer den komplette aminosyresekvens af I

I den modne form og forstadieformen af proteiner med tung I

9 DK 175703 B1 kæde af human vævsfaktor (henholdsvis huTFh og pre-huTFh) , der vist fra venstre til højre og i retning fra aminoter-minussen til carboxyterminussen ved anvendelse af etbogstavs--aminosyrekoden. Aminosyresekvensen af det overvejende na-5 turligt forekommende modne protein er nummereret 1 til 263. Sekvensen af den i mindre omfang forekommende modne form begynder ved aminosyrerest nr. 3 og ender ved rest nr. 263.

Aminosyresekvensen svarende til ledersekvensen (forstadiedelen) af pre-huTFh-proteinet, som fjernes under mod-10 ningsprocesen, er betegnet ved negative tal. Det ekstracel-lulære domæne og transmembran-forankringsregionen svarer til aminosyrerest nr. 1 til 219 henholdsvis 220 til 242.

Fig. 2 illustrerer nukleotidsekvensen af et cDNA. der koder for pre-huTFh- og huTFh-proteinerne, vist fra 15 venstre til højre og i retning fra 5'-terminussen til 3'-terminussen ved anvendelse af etbogstavs-nukleotidbasekoden.

Det strukturelle gen for huTFh begynder ved base nr. 130 og ender ved base nr. 918.

Læserammen er vist ved placering af den afledte ami-20 nosyresekvens over nukleotidsekvensen således, at bogstavet, der repræsenterer hver aminosyrerest, er placeret over den midterste base i det tilsvarende kodon.

Fig. 3 er en graf, der illustrerer koaguleringsbestemmelsen anvendt til måling af huTF-prokoaguleringsak-25 tiviteten som beskrevet i eksempel 2. Der er vist en dob-beltlogaritmisk afsætning af koaguleringstiden af humant : citratplasma i sekunder mod koncentrationen af human vævs faktor (huTF) i picogram (pg) pr. ml.

Fig. 4 illustrerer et autofluorogram af faktor VII/-30 VIIa-affinitetsisoleret huTF, som er underkastet elektrofo-rese i en 10%'s polyacrylamidgrl. Bane A viser -mærket huTF, som er isoleret og reduceret med dithiothreitol (DTT) før elektroforese som beskrevet i eksempel 4. Bane B viser molekylvægtstandarder med tilsyneladende molekylvægte anført 35 i kilodalton (k).

I DK 175703 B1 I

Hi I

I I

H Fig. 5 illustrerer et autofluorogram af faktor VII/- I

H Vlla-affinitetsisoleret huTF underkastet elektroforese i I

H 15%'s polyacrylgeler. Isoleringen, mærkningen med 125I og I

H elektroforesen af huTF gennemføres som beskrevet i eksempel I

H 54. Bane A viser det isolerede huTF efter reduktion med DTT. I

H Bane B viser den samme prøve underkastet elektroforese uden I

reduktion med DTT. Det øvre og nedre bånd (mærket U og L) I

svarer til formerne med en størrelse på ca. 58 og 47 k af

I huTF. Efter autofluorografi udskæres de øvre og nedre bånd, I

I

10 rehydreres i SDS-prøvepuffer indeholdende DTT, indsættes i I

prøvebrønden af en anden 15%'s polyacrylamidgel og underka- I

stes elektroforese. Bane C viser reelelektroforesen af det I

nedre bånd fra bane B. Bane D viser reelektroforesen af det I

øvre bånd fra bane B. Proteinerne med en tilsyneladende I

I 15 molekylægt på 12,5 og 47 kilodalton (k) er vist ved pile.

Fig. 6 illustrerer et autofluorogram af faktor VII/- I

B Vlla-affinitetsisoleret huTF, som først er immunopræcipiteret I

B med det huTF-specifikke monoklonale antistof TF8-5G9 og I

B derefter er underkastet elektroforese i en 8-17%'s polya- I

B 20 crylamid-gradientgel som beskrevet i eksempel 4. Bane A I

B viser ^2^I-mærket huTF, som er underkastet elektroforese med fl B reduktion med DTT. Bane B viser den samme prøve underkastet fl

B elektroforese uden reduktion. I

B Fig. 7 illustrerer et autofluorogram af faktor VII/- fl

B 25 Vlla-affinitetsisoleret huTF, som er underkastet elektrofo- I

B rese i 15%fs polyacrylamidgeler. Isoleringen, mærkningen med I

B 12^I, reduktionen og deglycosyleringen gennemføres som be- .1

B skrevet i eksempel 4. Bane 1 indeholder følgende protein- I

B standarder, der underkastes elektroforese som markører med I

B 30 de tilsyneladende molekylvægte (Mr) anført i kilodalton: I

B lysozym 14,3, carbonsyreanhydrase 30,0, ovalbumin 46,0, I

B bovint serumalbumin 69,0, phosphorylase b 92,5 og myosin I

fl 200,0, alle fra Amersham, Arlington Heights, IL. 125I-huTF- I

B -holdige prøver underkastes elektroforese, enten med DTT fl

I 35 (bane 2 og 3) eller uden DTT (bane 4 og 5). Nogle af disse B

B 125i-huTF-holdige prøver er deglycosylerede (bane 3 og 5), B

11 DK 175703 B1 medens andre ikke er deglycosvlerede (bane 2 og 4) før elek-troforese. De -huTP-holdige prøver i bane 3 og 5 degly- cosyleres før elektroforese, medens prøverne i bane 2 og 4 ikke deglycosyleres.

5 Fig. 8 illustrerer et autofluorogram af immunoaf- finitetsisoleret huTF, som er underkastet elektroforese i 10%'s polyacrylamidgeler som beskrevet i eksempel 9. Bane 1 indeholder følgende proteinstandarder, der er underkastet elektroforese som markører og med tilsyneladende molekylvægte 10 (Mr) anført i kg dalton: cytochrom c 12,4, lactoglobulin 18,4, carbonsyreanhydrase 29,0, lactat-dehydrogenase 36,0, ovalbumin 43,0, glutamat-dehydrogenase 55,0 og phosphorylase b 95,5, alle fra Diversified Biotech (Newton Centre, MA).

Bane 2 indeholder ca. 20 ftg protein, bestemt ved 15 anvendelse af BCA-proteinbestemmelsesmetoden ifølge Smith et al. , Anal. Bioch., 150:76-85 (1985), og reduceret under anvendelse af DTT. Tung kæde af huTF (huTFh) er klart synlig ved ca. 47 Mr, og let kæde af huTF ses svagt ved ca. 12,5 Mr. Proteinet gøres synligt ved farvning med Coomassie-blåt 20 som beskrevet af Laemmli, Nature, 227:680-685 (1970).

Fig. 9 er en graf, der illustrerer dosis-reaktions-kurven for inhibering af huTF-initieret coagulering ved hjælp af ikke-phospholipiderede (ikke-lipiderede) polypep-fcidanaloge af huTFh. Den procentiske inhibering af koagule-25 ring ved forskellige koncentrationer af ikke-lipiderede polypeptider måles som beskrevet i eksempel 12. De undersøgte i polypeptider omfatter p26-49 (åben trekant, TF26.49), pl21- -155 (åben cirkel, TF121.155), pl46-167 (udfyldt cirkel, TF146.167) og p204-226 (udfyldt firkant, TF204.226).

30 Fig. 10 er en graf, der illustrer dosis-reaktionskur ven for inhibering af huTF-initieret koagulering ved hjælp af phospholipiderede (lipiderede) polypeptidanaloge af huTFh.

De procentiske inhiberinger måles ved samme metode og for de samme analoge som beskrevet for fig. 9.

35 Fig. 11 illustrerer restriktionskortene for EcoRI- segment-indsatserne i rekombinant DNA-plasmiberne pCTF64,

I DK 175703 B1 I

li I

' pCTF314 og pCTF403. Indsatserne (vist ved en bjælke) repræ- I

senterer overlappende dele af nukleotidsekvenser, der sammen I

I svarer til den komplette nukleotidsekvens af pre-huTFh-genet. I

Hver for sig omfatter indsatserne nukleotidrester, der fra

5 venstre til højre og i retning fra 5' til 3' svarer til I

nukleotidsekvensen vist i fig. 2 fra base nr. 1 til 486 I

I (indeholdt i pCTF64), fra base nr. 135 til 775 (indeholdt i I

I pCTF314) og fra base nr. 776 til 1125 (indeholdt i pCTF403). I

Der er også vist den omtrentlige placering af restriktions- I

I 10 endonuklease-spaltningsstederne i indsatserne, der er anvendt I

til konstruktion af de forskellige rekombinante DNA-molekyler I

I beskrevet i eksempel 16. Der er endvidere vist den omtrent- I

I lige placering af det tilsvarende pre-huTFh-protein med I

H dets lederpeptid (prikket felt) og transmembran-forankrings- I

15 domæne (skraveret felt) vist intakte. I

Fig. 12 er en graf, der illustrerer dosis-reaktions- I

-kurven for inhibering af huTF-initieret koagulation ved I

I hjælp af ikke-phospholipiderede (ikke-lipiderede) polypep- I

I . tidanaloge af huTFh. Den procentiske inhibering (%) for I

H 20 koagulering ved forskellige molære koncentrationer af ikke- I

lipiderede polypeptider måles som beskrevet i eksempel 12. I

H De undersøgte polypeptider omfatter p24-35 (åben trekant), I

p26-49 (åben cirkel), pl52-169 (åben firkant) og peptiderne I

I p40-71, p72-104, p94-123 og pl61-189, som alle i det væsent- I

I 25 lige ikke giver nogen inhibering og i fælleskab er betegnet I

I ved en udfyldt cirkel. I

I Fig. 13 er en graf, der illustrerer de kinetiske I

I forhold for inhibering af koagulering ved hjælp af et TF8- I

-5G9-antistofpræparat. Den procentiske inhibering (%) af I

I 30 koagulering er afsat over forskellige antistof-immunoreak- I

I tionstider målt som beskrevet i eksempel 18. I

I Fig. 14 er en graf, der illustrerer dosis-reaktionen I

I for inhibering af huTF-initieret koagulering ved hjælp af I

I anti-huTF-antistoffer. Den procentiske inhibering {%) af I

I 35 koagulering med forskellige koncentrationer af det mono- I

13 DK 175703 B1 klonale anti-huTF-antistof TF8-5G9 måles som beskrevet i eksempel 19.

Fig. 15 er en graf, der illustrerer dosis-reaktions-kurven for inhibering af huTF-initieret koagulering med 5 anti-huTF-antistoffer, hvor kilden til huTF er et humant cellelysat af fibroblast-cellelinien GM1381. Den procentiske inhibering af koagulering ved forskellige koncentrationer af det monoklonale anti-huTF-antistof TF8-5G9 måles som beskrevet i eksempel 19. Åbne cirkler betegner TF8-5G9-an-10 tistof, og udfyldte cirkler betegner et irrelevant antistof.

Fig. 16 illustrerer inhibering af den pro-koagulerende aktivitet af renset humant hjerne-TF med monoklonalt an-ti-TF-antistof TF8-5G9. Koaguleringsaktiviteten af renset i I humant hjerne-TF rekonstitueret i phospholipid-vesikler ! 15 bestemmes efter forinkubering i 30 minutter ved 37°C med forskellige koncentrationer af renset IgG. Cirklerne betegner I anti-TF-antistof TF8-5G9, og trekanter betegner et irrelevant I kontrol-antistof PAblOO. Resultaterne er anført som procen- tisk inhibering i forhold til den aktivitet, der observeres 20 i fraværelse af tilsat antistof.

Fig 17 illustrerer inhibering af faktor VII-binding til og faktor Xa-dannelse af dyrkede J82-blærecarcinom-celler behandlet med rensede monoklonale anti-TF-antistoffer. Værdierne for inhibering af hastigheden af faktor Xa-dannelse 25 er vist ved trekanter, og værdierne for inhibering af faktor VII-binding er vist ved cirkler. Resultaterne er anført som procentisk inhibering i forhold til værdierne, der opnås for celler inkuberet uden tilsat antistof. Panel A viser effekten af antistof TF9-2C4, og panel B viser effekten af 30 antistof TF9-5B7.

Fig. 18 illustrerer en Western-blot-analyse af im-munoaffinitetsisoleret huTF som beskrevet i eksempel 25.

15%'s polyacrylamidgeler lades på følgende måde: bane 1 indeholder molekylvægtsstandarder med tilsyneladende mole-35 kylvægte anført til venstre for panel A i kilodalton (k), bane 2 indeholder 1 μg renset humant hæmoglobin reduceret

I DK 175703 B1 I

I I

før elektroforese, bane 3 indeholder 0,5 μg isoleret huTF I

reduceret før elektroforese, og bane 4' indeholder 0,5 μ9 I

I ikke-reduceret og isoleret huTF. Efter SDS-PAGE overføres I

de fremkomne p'roteinbånd elektroforetisk til nitrocellulose.

5 De således dannede Western-blots immunoreageres med 0,2 H

I Mg/ml affinitetsrenset kanin-anti-huTF-IgG (panel A) , 1 I

μ9-/πι1 kanin-antihæmoglobin-IgG (panel B) eller 1 Mg/ml ikke- H

immun-kanin-IgG (panel C) . De tilsyneladende molekylvægte

af immunofarvede bånd er anført i kDa til højre. I

I 10 I

I Detaljeret beskrivelse af opfindelsen. I

A. Definitioner. I

Aminosyrer: Alle de i den foreliggende beskrivelse I

anførte aminosyrerester har den naturlige L-konfiguration. I

15 I overensstemmelse med standard-polypeptidnomenklatur J. I

I Biol. Chem., 243:3557-59, (1969), anvendes der forkortelser I

for aminosyreresterne som vist i den følgende tabel: I

I i I

15 DK 175703 B1

Symbol Aminosyre 1-Bogstav 3-bogstav 5 Y Tyr L-tyrosin G Gly glycin F Phe L-phenylalanin M Met L-methionin A Ala L-alanin 10 S Ser L-serin L Ile L-isoleucin L Leu L-leucin T Thr L-threonin I V Val L-valin 15 P Pro L-prolin K Lys L-lysin H His L-histidin Q Gin L-glutamin E Glu L-slutaminsyre ! 20 W Trp L-tryptophan R Arg L-arginin D Asp L-asparaginsyre N Asn L-asparagin C Cys L-cystein 25

Det skal bemærkes, at alle aminosyresekvenser er vist i den foreliggende beskrivelse ved formler, hvis orientering fra venstre til højre er i den konventionelle retning fra ami-noterminussen til carboxyterminussen. Endvidere skal det 30 bemærkes, at en streg ved starten eller slutningen af en aminosyresekvens viser en binding til en gruppe, såsom H og OH {hydrogen og hydroxyl) ved henholdsvis amino- og carboxyterminussen eller en yderligere sekvens på en eller flere aminosyrerester op til i alt ca. 50 rester i polypeptidkæden.

35 Polvoeptid og peptid: Polypeptid og peptid er udtryk, der anvendes ensbetydende i den foreliggende beskrivelse til at betegne en lineær række af ikke mere end ca. 50 ami-

I DK 175703 B1 I

I

nosyrerester forbundet med hinanden via peptidbindinger I

mellem α-aminogruppen og carboxygruppen af tilstødende re- I

ster. I

Protein: Protein er et udtryk, der anvendes i den I

5 foreliggende beskrivelse til at betegne en lineær række af I

over 50 aminosyrerester, der er forbundet med hinanden som I

i et polypeptid. I

Nukleotid: En monomer enhed af DNA eller RNA bestående I

af en sukkerdel (pentose), et phosphat og en nitrogenholdig I

10 heterocyclisk base. Basen er bundet til sukkerdelen via det I

glvcosidiske carbonatom (l'-carbonatornet af pentosen), og I

denne kombination af base og sukkerart er et nukleosid. Når I

nukleosidet indeholder en phosphatgruppe bundet til 3'- I

eller 5'-positionen af pentosen, betegnes det et nukleotid. I

I 15 Basebar (bo) : En kombination af adenin (A) med thymin I

(T) eller af cytosin (C) med guanin (G) i et dobbeltstrenget I

: DNA-molekyle. I

B. DNA-segmenter. I

I levende organismer er aminosyresekvensen af et I

I 20 protein eller polypeptid direkte relateret via den genetiske I

kode til deoxyribonukleinsyresekvensen (DNA-sekvensen) af I

I det strukturelle gen, der koder for proteinet. Et strukturelt I

gen kan således defineres som den aminosyresekvens, dvs. I

protein eller polypeptid, som det koder for. I

25 Et vigtigt og velkendt træk ved den genetiske kode I

er dens redundans. Dette betyder, for de fleste af aminosy- I

I rerne, der anvendes til at danne proteiner, at mere end én I

H kodende nukleotidtriplet (kodon) kan kode for en bestemt I

I aminosyrerest. Derfor kan et antal forskellige nukleotidse- I

I 30 kvenser kode for en bestemt aminosyresekvens. Sådanne nu- ·; I

I kleotidsekvenser betragtes som funktionelt ækvivalente, da I

I de kan resultere i produktion af den samme aminosyresekvens I

I i alle organismer. Lejlighedsvis kan en methyleret variant . I

I af et purin eller pyrimidin være inkorporeret i en given I

I 35 nukleotidsekvens. Sådanne methyleringer påvirker imidlertid I

I ikke kodningsforholdene på nogen måde. I

17 DK 175703 B1 DNA-segmenterne ifølge den foreliggende opfindelse er karakteriseret ved at indeholde en DNA-sekvens, der koder for et protein med tung kæde af human vævsfaktor (huTFh) .

! Ifølge foretrukne udførelsesformer indeholder DNA-segmentet j 5 en DNA-sekvens, der koder for et forstadieprotein med tung kæde af human vævsfaktor (pre-huTFh). Dette betyder, at DNA-segmenterne ifølge den foreliggende opfindelse er karakteriseret ved tilstedeværelsen af et huTFh-strukturgen eller, j mere foretrukket, et pre-huTFh-strukturgen. Yderligere fo- 10 retrukne er DNA-segmenter, der indeholder en DNA-sekvens, der danner et strukturelt gen, som koder for et opløseligt huTFh- eller opløseligt pre-huTFh-protein. Genet er fortrinsvis til stede som en ubrudt lineær række af codoner, hvor hvert codon koder for en aminosyrerest, som findes i huTFh-15 eller pre-huTFh-proteinet, dvs. et gen, som er frit for introner.

Et DNA-segment, der i det væsentlige består af sekvensen vist i fig. 2 fra ca. position 130 ved 5'-terminussen til ca. position 918 ved 3'-terminussen, der er i stand til 20 at eksprimere huTFh, udgør således en udførelsesform for den foreliggende opfindelse. Et DNA-segment, der i det væsentlige består af sekvensen vist i fig. 2 fra ca. position 34 til ca. position 918 og er i stand til at eksprimere pre-huTFh, udgør en anden udførelsesform for opfindelsen.

25 Et foretrukket opløseligt huTFh-molekyle mangler aminosyreresterne kodet af de sidste ca. 150 baser ved 5'--terminussen af DNA, der koder for huTFh. Et DNA-segment, der i det væsentlige består af sekvensen vist i fig. 2 fra ca. position 130 ved 51-terminussen til en position fra ca.

30 position 756 til ca. position 801 ved 3 1-terminussen, og som er i stand til at eksprimere opløseligt huTFh, udgør en yderligere foretrukken udførelsesform for opfindelsen. Eksempler på foretrukne DNA-segmenter, der danner strukturelle gener for opløseligt huTFh, er sådanne, *der har en nukleo-35 tidbasesekvens vist i fig. 2 fra ca. base nr. 130 til ca. base nr. 756, fra ca. base nr. 130 til ca. base nr. 771,

I DK 175703 B1 I

I I

I fra ca. base nr. 130 til ca. base nr. 786 og fra ca. base I

I nr. 130 til ca. base nr. 801. I

Foretrukne DNA-segmenter, der koder for et opløseligt I

pre-huTFh, ligner dem, der koder for opløseligt huTFh, bort- I

I 5 set fra at de koder for proteiner indeholdende en aminoter- I

H minal ledersekvens, såsom aminosyreresterne -32 til 0 som I

vist i fig. 1. Et foretrukket DNA-segment, der danner et I

strukturelt gen, som koder for opløseligt pre-huTFh, består I

således i det væsentlige af sekvensen vist i fig. 2 fra ca. I

H 10 position 34 ved 5' -termminussen til en position fra ca. I

I position 756 til ca. position 801 ved 3'-terminussen. Ek- I

sempler på foretrukne DNA-segmenter, der koder for opløseligt I

pre-huTFh, er sådanne, der har en nukleotidbasesekvens vist I

i fig. 2 fra ca. base nr. 34 til ca. base nr. 756, fra ca. I

I 15 base 34 til ca. base nr. 771, fra ca. base nr. 34 til ca. I

base nr. 786 og fra ca. base nr. 34 til ca. base nr. 801. I

H Homologe DNA- og RNA-sekvenser, der koder for de I

H ovennævnte huTFh- og pre-huTFh-proteiner, inklusive deres I

I I opløselige former, er også omfattet, som ovenfor diskuteret. I

I 20 DNA-segmenter, der koder for huTFh- og pre-huTFh- I

proteiner, kan let syntetiseres ved kemiske metoder, f.eks. I

I ved phosphotriestermetoden ifølge Matteucci et al., J. Am. I

I Chem. Soc., 103:3185 (1981). Ved kemisk syntese af den ko- I

dende sekvens kan enhver ønsket modifikation naturligvis I

I 25 foretages ved blot at indføje de rette baser i stedet for I

I de, der koder for den oprindelige aminosyresekvens. Imidler- I

I tid foretrækkes DNA-molekyler, der indeholder sekvenser,

I som er nøjagtigt homologe med de, der er vist i fig. 2. I

Endvidere kan DNA-segmenter, der i det væsentlige I

I 30 består af strukturelle gener, som koder for huTFh- og pre-

-huTFh-proteinerne, fås ud fra rekombinante DNA-molekyler I

indeholdende disse gener. F.eks. indeholder de rekombinante I

I DNA-molekyler af plasmidtypen pCTF64, pCTF314 og pCTF403 I

I hver især DNA-sekvenser, der koder for forskellige dele af I

I 35 huTFh- og pre-huTFh-proteinerne og sammen har hele den DNA- I

-sekvens, der er nødvendig for ekspression af hvert af pro- I

i DK 175703 B1 | 19 i teinerne. Kulturer af Escherichia coli (E. coli) transformeret med pCTF64, pCTF314 eller pCTF403 er deponeret i overensstemmelse med Budapest-traktaten hos American Type Culture i Collection (ATCC) den 27. marts 1987 og har fået depone- | 5 ringsnumrene 67.370, 67.368 henholdsvis 67.369.

Et DNA-segment, der indeholder en DNA-sekvens, som koder for huTFh eller pre-huTFh, kan fremstilles ved operativ binding (ligering) af passende restriktionsfragmenter fra hver af de ovenfor nævnte deponerede plasmider ved anvendelse 10 af velkendte metoder. DNA-molekylerne ifølge opfindelsen produceret på denne måde har typisk klæbende ender, dvs. udragende enkeltstrengede dele, som strækker sig ud over den dobbeltstrengede del af molekylet. Tilstedeværelse af klæbende ender på DNA-molekylerne ifølge den foreliggende 15 opfindelse foretrækkes. Også omfattet af den foreliggende opfindelse er ribonukleinsyreækvivalenter (RNA-ækvivalenter) af de ovenfor beskrevne DNA-segmenter.

C. Rekombinante DNA-molekvler.

De rekombinante DNA-molekyler ifølge den foreliggende 20 opfindelse kan fremstilles ved operativ binding af en vektor til DNA-segment ifølge den foreliggende opfindelse.

Som anvendt i den foreliggende beskrivelse refererer udtrykket "vektor" til et DNA-molekyle, der er i stand til autonom replikation i en celle, og hvortil et andet DNA-25 -segment kan bindes operativt, således at der fås replikation af det tilføjede segment. Vektorer, der er i stand til at styre ekspressionen af huTFh- og pre-huTFh-gener, betegnes i den foreliggende beskrivelse "ekspressionsvektorer". Et rekombinant DNA-molekyle (rDNA) er således et hybridt DNA-30 -molekyle, der omfatter mindst to nukleotidsekvenser, som ikke normalt findes sammen i naturen.

Valget af vektor, hvortil et DNA-segment ifølge den foreliggende opfindelse bindes operativt, afhænger direkte, således som det er velkendt, at de ønskede funktionelle 35 egenskaber, f.eks. proteinekspression, og værtscellen, der skal transformeres, idet disse er iboende begrænsninger ved Η

I DK 175703 B1 I

I I

I konstruktion af rekombinante DNA-molekyler. Imidlertid er I

en vektor ifølge den foreliggende opfindelse i det mindste I

i stand til at styre replikationen og fortrinsvis også eks- I

H pressionen af huTFh- eller. pre-huTFh-strukturgenerne in- I

H 5 kluderet i DNA-segmenter, hvortil den er operativt bundet. I

Ifølge foretrukne udførelsesformer omfatter en vektor I

ifølge opfindelsen et prokaryotisk replikon, dvs. én DNA- I

-sekvens, der har evnen til direkte autonom replikation og I

ekstrakromosomal bibeholdelse af det rekombinante DNA-mole- I

10 kyle i en prokaryotisk værtscelle, såsom en bakterie-værts- I

celle, der er transformeret dermed. Sådanne replikoner er I

velkendte. Desuden omfatter de udførelsesformer, der omfatter I

et prokaryotisk replikon, også et gen, hvis ekspression I

giver lægemiddelresistens til en bakterievært, der er trans- I

15 formeret dermed. Typiske bakterielle lægemiddelresistens-

H -gener, er sådanne der giver resistens mod ampicillin eller I

I tetracyclin. I

I De vektorer, der omfatter et prokaryotisk replikon, I

H kan også omfatte en prokaryotisk promotor, der er i stand I

20 til at styre ekspressionen (transskriptionen og translatio-

nen) af huTFh- eller pre-huTFh-generne i en bakterie-værts- I

I celle, såsom E. coli, der er transformeret dermed. En pro- I

motor er et ekspressionsregulerende element dannet af en I

I DNA-sekvens, der muliggør binding af RNA-polymerase og til- I

25 lader transskriptionen at forekomme. Promotorsekvenser, som I

er forenelige med bakterielle værter, tilvejebringes typisk I

I i plasmidvektorer indeholdende bekvemme restriktionssteder I

I til indføjelse af et DNA-segment ifølge den foreliggende I

I opfindelse. Typiske for sådanne vektorplasmider er pUC8, I

I 30 pUC9, pBR322 og pBR329, der kan fås fra Biorad Laboratories, I

I (Richmond, CA) og pPL og pKK223, der kan fås fra Pharmacia, I

I Piscataway, N.J. I

I Ekspressionsvektorer, der er forenelige med eukaryo- I

I tiske celler, fortrinsvis sådanne, der er forenelige med I

35 hvirveldyr-celler, kan også anvendes til dannelse af rekom- I

I binante DNA-molekyler ifølge opfindelsen. Eukaryotiske cel- I

21 DK 175703 B1 leekspressionsvektorer er velkendte og kan fås fra flere kommercielle kilder. Typisk fås sådanne vektorer med bekvemme restriktionssteder til indføjelse af det ønskede DNA-segment. Typiske for sådanne vektorer er pSVL og pKSV-10 (Pharmacia) , 5 pBPV-l/pML2d {International Biotechnologies, Inc.), og pTDTl (ATCC31255).

Ifølge foretrukne udførelsesformer indeholder ekspressionsvektorerne af eukaryotiske celler, der anvendes til konstruktion de rekombinante DNA-molekyler ifølge den 10 foreliggende opfindelse, en selektionsmarkør, der er effektiv i en eukarvotisk celle, fortrinsvis en lægemiddelresistens-- selektionsmarkør. En foretrukken lægemiddelresistens-markør er genet, hvis ekspression resulterer i neomycinresistens, dvs. neomycin-phosphortransferase-genet (neo), jf. Southern 15 et al., J. Mol. Appl. Genet., 1:327-341 (1982).

Anvendelsen af retrovirus-ekspressionsvektorer til dannelse af rDNA1 er ifølge den foreliggende opfindelse er ; også omfattet. Som anvendt i den foreliggende beskrivelse j refererer udtrykket "retrovirus-ekspressionsvektor" til et 20 DNA-molekyle, der indeholder en promotorsekvens, som hidrører fra den lange terminale gentagelsesregion (LTR) af et retro-virus-genom.

Ifølge foretrukne udførelsesformer er ekspressionsvektoren typisk en retrovirus-ekspressionsvektor, som for-25 trinsvis er replikations-inkompetent i eukaryotiske celler. Konstruktionen og anvendelsen af retrovirus-vektorer er beskrevet af Sorge et al., Mol. Cell. Biol., 4:1730-37 (1984) .

Forskellige metoder er blevet udviklet til operativ ·' 30 binding af DNA til vektorer via komplementære klæbende ender.

F.eks. kan komplementære homopolymere områder føjes til DNA - segmentet, der skal indføjes, og til vektor-DNA. Vektoren og DNA-segmentet sammenføjes derefter ved hydrogenbinding mellem de komplementære homopolymere "haler" til dannelse 35 af rekombinante DNA-molekyler.

Η

I DK 175703 B1 I

I 22 I

Syntetiske linkere, der indeholder et eller flere I

restriktionssteder, udgør en alternativ metode til indføjelse I

af DNA-segmentet i vektorer. DMA-segmentet, dannet ved en- I

donuklease-restriktionsnedbrydning som tidligere beskrevet, I

5 behandles med bakteriofag T4-DNA-polymerase eller E. coli- ‘ I

-DNA-polymerase I, som er enzymer, der fjerner fremspringende I

H enkeltstrengede 3'-ender på grund af deres 3'-5'-eksonuk- I

I leolytiske aktiviteter og udfylder tilbageliggende 31-ender I

på grund af deres polymeriserende aktiviteter. Kombinationen I

10 af disse aktiviteter danner derfor stumpendede DNA-segmenter. I

De stumpendede segmenter inkuberes derefter med et stort I

molært overskud af linkermolekyler i nærværelse af et enzym, I

som er i stand til at katalysere ligeringen af stumpendede I

DNA-molekyler, såsom bakteriofag T4-DNA-ligase. Produkterne 15 af reaktionen er således DNA-segmenter, der bærer polymere

linkersekvenser ved deres ender. Disse DNA-segmenter spaltes I

B derefter med et passende restriktionsenzym og ligeres til I

en ekspressionsvektor, der er blevet spaltet med et enzym, I

der producerer terminusser, som er forenelige med DNA-seg- I

20 mentets terminusser. I

: Syntetiske linkere, der indeholder forskellige re- I

striktionsendonukleasesteder, er kommercielt tilgængelige

fra et antal kilder, herunder International Biotechnologies, B

Inc., New Haven, CN. ^ I

25 Den foreliggende opfindelse omfatter også RNA-ækvi- I

valenter af de ovenfor beskrevne rekombinante DNA-molekyler. B

B D. Transformerede celler og kulturer. B

B Den foreliggende opfindelse angår også en værtscelle B

B transformeret med et rekombinant DNA-molekyle ifølge opfin- B

B 3 0 delsen, fortrinsvis et rDNA, som er i stand til at eksprimere B

B en opløselig form af huTFh eller pre-huTFh. Værtscellen kan B

B enten være prokaryotisk eller eukaryotisk. Bakterieceller B

B er foretrukne prokaryotiske værtsceller og er typisk en B

B stamme af E. coli, f.eks. E. coli, stamme DH5, der kan fås B

Bi 35 fra Bethesda Research Laboratories, Inc., Bethesda, MD. B

B Foretrukne eukaryotiske værtsceller omfatter gærceller og B

23 DK 175703 B1 pattedyrsceller, fortrinsvis hvirveldyr-celler, såsom celler fra en fibroblast-cellelinie fra mus, rotte, abe eller menneske. Foretrukne eukaryotiske værtsceller omfatter ovarieceller af kinesisk hamster (CHO-celier) , der kan fås fra ATCC 5 som CCL61, og NHI Swiss musefosterceller NHI/3T3, der kan fås fra ATCC som CRL1658. Transformation af passende celleværter med et rekombinant DNA-molekyle ifølge den foreliggende opfindelse gennemføres ved velkendte metoder, som typisk afhænger af typen af den anvendte vektor. Med hensyn 10 til transformation af prokaryotiske værtsceller kan der f.eks. henvises til Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

USA, 69:2110 (1972); og Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982). Med hensyn til transformation af 15 hvirveldyr-celler med retrovirus-vektorer indeholdende rDNA kan der f.eks. henvises til Sorge et al., Mol. Cell. Biol., 4:1730-37 (1984); Graham et al., Virol., 52:456 (1973),· og

Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:1373-76 (1979).

Celler, som er transformeret med held, dvs. celler, 20 der indeholder et rekombinant DNA-molekyle ifølge den foreliggende opfindelse, kan identificeres ved velkendte metoder.

F.eks. kan celler, som hidrører fra indføring af rDNA ifølge den foreliggende opfindelse, klones til dannelse af mono-, klonale kolonier. Celler fra disse kolonier kan høstes, ; 25 lyseres, og deres DNA-indhold kan undersøges for tilstede værelsen af rDNA ved anvendelse af en metode som f.eks. beskrevet af Southern, J. Mol. Biol., 98:503 (1975) eller

Berent et al., Biotech., 3:208 (1985).

Foruden direkte bestemmelse af tilstedeværelsen af 30 rDNA kan vellykket transformation bekræftes ved velkendte immunologiske metoder, når rDNA er i stand til at styre ekspressionen af huTFh eller pre-huTFh. F.eks. producerer celler, som er vellykket transformeret med en ekspressions-vektor, proteiner, der udviser huTFh- eller pre-huTFh-anti-35 genitet. Prøver af celler, som formodes at være transformerede, høstes og undersøges for huTFh eller pre-huTFh ved

DK 175703 B1 I

anvendelse af antistoffer, som er specifikke for disse an- I

tigener, såsom de, der produceres af et hybridoma ifølge I

opfindelsen. Ud over de transformerede værtsceller selv H

angår den foreliggende opfindelse også en kultur af disse H

5 celler, fortrinsvis en monoklonal kultur {en klonalt homogen H

kultur) eller en kultur afledt af en monoklonal kultur i et H

næringsmedium. Kulturen indeholder fortrinsvis også et pro- H

tein, der udviser huTFh- eller pre-huTFh-antigenitet og H

mere foretrukket biologisk aktivt huTFh. H

10 Næringsmedier, som er anvendelige til dyrkning af H

transformerede værtsceller, er velkendte og kan fås fra H

flere kommercielle kilder. I udførelsesformer, hvor værts- H

cellen er en pattedyrscelle, anvendes der fortrinsvis et H

"serumfrit" medium. H

15 E. Metoder til fremstilling af huTFh- og I

pre-huTFh-proteiner. H

Et andet aspekt af den foreliggende opfindelse vedrø- H

rer en metode til fremstilling af proteiner, som udviser H

huTFh-antigenitet. Proteiner, som udviser huTFh-antigenitet, H

20 er proteiner, som immunoreagerer med antistoffer fremkaldt H

af naturlig vævsfaktor. Proteiner, som udviser huTFh-anti- H

genitet, er anvendelige som antigener og til dannelse af H

antistoffer, der hver især kan anvendes i de diagnostiske H

systemer og ved metoderne ifølge opfindelsen. H

25 Den her omhandlede metode omfatter igangsætning af H

en kultur omfattende et næringsmedium indeholdende værtscel- H

ler, fortrinsvis humane celler, der er transformeret med et H

rekombinant DNA-molekyle ifølge opfindelsen, der er i stand I

til at eksprimere et huTFh- eller pre-huTFh-protein, for- H

30 trinsvis et opløseligt huTFh- eller pre-huTFh-protein. Kul- I

turen bibeholdes i et tilstrækkeligt tidsrum til, at de I

transformerede celler eksprimerer et huTFh- eller pre-huTFh- H

protein. Det eksprimerede protein udvindes derefter fra H

kulturen. Ifølge foretrukne udførelsesformer udviser huTFh- H

35 -proteinerne produceret ved metoderne ifølge opfindelsen H

desuden biologisk huTFh-aktivitet, dvs. evne til at binde H

25 DK 175703 B1 faktor VII/VIIa. Disse metoder omfatter dyrkning af pattedyr-værtsceller transformeret med et rekombinant DNA-mole-kyle, der er i stand til at eksprimere pre-huTFh-genet i cellerne. Dyrkningen medfører ekspression af pre-huTFh-pro-5 teinet og efterfølgende intracellulær post-translations-mo-difikation af pre-huTFh til dannelse af et biologisk aktivt huTFh-protein.

Metoder til udvinding af et eksprimeret protein fra en kultur er velkendte og omfatter fraktionering af den 10 proteinholdige del af kulturen ved anvendelse af velkendte biokemiske metoder. F.eks. kan gelfiltrering, gelchromato-grafi, ultrafiltrering, elektroforese, ionbytning, affini-tetschromatografi og lignende, som er kendte til proteinfraktioneringer, anvendes til isolering af de eksprimerede 15 proteiner, som findes i kulturen. Desuden kan immunokemiske metoder, såsom immunoaffinitet, immunoadsorption og lignende, gennemføres ved anvendelse af velkendte metoder.

F. huTFh- og pre-huTFh-proteinpræparater og -ekspressionsprodukter.

20 Den foreliggende opfindelse omfatter også huTFh- og pre-huTFh-ekspressionsprodukter af rDNA'er ifølge opfindelsen. Ifølge foretrukne udførelsesformer har huTFh- og pre--huTFh-ekspressionsprodukterne en aminosyresekvens svarende til resterne 1 til 263 henholdsvis -32 til 263 som vist i 25 fig. 1. Fortrinsvis har det eksprimerede protein en længde på mindst 90%, mere foretrukket mindst 95% af længden af ! pre-huTFh- og huTFh-aminosyresekvensen vist i fig. 1.

I en anden udførelsesform angår opfindelsen opløselige former af huTFh og pre-huTFh og præparater indeholdende 30 opløseligt huTFh og/eller opløseligt pre-huTFh. Udtrykket "opløseligt" som anvendt i den foreliggende beskrivelse refererer til huTFh- og pre-huTFh-molekyler, som er karakteriseret ved i det væsentlige at bestå af det ekstracel-lulære domæne af native huTFh- og pre-huTFh-molekyler, dvs.

35 den del af huTFh- og pre-huTFh-molekylerne, der er aminoter-minal til rest nr. 220 som vist i fig. 1. Opløseligt huTFh H ^β

I DK 175703 B1 I

^B

26 1

og opløseligt pre-huTFh indeholder derfor ikke nogen væsent- I

lig del af transmembran-forankringsregionen, som dannes i I

I de native molekyler {resterne 220 til 242 som vist i fig. I

I 1). Det skal bemærkes, at udtrykkene "huTFh" og "pre-huTFh" I

I 5 som anvendt i den foreliggende beskrivelse omfatter de op- I

I løselige former af disse proteiner, med mindre andet er I

anført. I

Da opløseligt huTFh og opløseligt pre-huTFh ikke I

I i indeholder en hydrofob transmembran-forankringsregion, ag-

B J 10 gregerer de ikke væsentligt i fysiologisk acceptable vandige I

B opløsninger. Derfor er opløseligt huTFh og opløseligt pre- I

B huTFh yderligere karakteriseret ved deres evne til at danne I

B en vandig opløsning ved anvendelse af et fysiologisk accep- I

B tabelt fortyndingsmiddel i en proteinkoncentration på ca. I

B 15 0,1 pg/ml til ca. 100 ng/ml, hvor mindst ca. 70 vægt% for- I

B trinsvis ca. 80 vægt% og mere foretrukket ca. 90 vægt% af I

B huTFh- eller pre-huTFh-proteinet, som er til stede, er i I

B ikke-aggregeret (monomer) form. Metoder til bestemmelse af I

B graden af aggregering i en proteinopløsning er velkendte og I

B 20 omfatter størrelsesfraktionering ved udelukkelses-søjlechro- I

B matografi. I

B Et foretrukket opløselige huTFh-protein har en amino- I

B syresekvens vist i fig. 1 fra ca. rest nr. 1 ved aminoter- I

B minussen til en rest fra ca. 209 til ca. 224 ved carboxyter- I

B 25 minussen. Foretrukne opløselige huTFh-proteiner er således I

B sådanne, der har en aminosyresekvens som vist i fig. 1 fra I

B ca. rest nr. 1 til ca. rest nr. 209, fra ca. rest nr. 1 til I

B ca. rest nr. 214, fra ca. rest nr. 1 til ca. rest nr. 219 ; I

B og fra ca. rest nr. 1 til ca. rest nr. 224. | I

B 30 Et foretrukket opløseligt pre-huTFh-protein har en - ! I

I aminosyresekvens vist i fig. 1 fra ca. rest nr. -32 ved j I

B aminoterminussen til en rest fra ca. 209 til ca. 224 ved : I

B carboxyterminussen. Foretrukne opløselige pre-huTFh-proteiner

B er således sådanne, der har en aminosyresekvens som vist i I

B 35 fig. 1 fra ca, rest nr. -32 til ca. rest nr. 209, fra ca. I

B rest nr. -32 til ca. rest nr. 214, fra ca. rest nr. -32 til I

27 DK 175703 B1 ca. rest nr. 219 og fra ca. rest nr. -32 til ca. rest nr.

224 .

Ifølge en udførelsesform er huTFh- og pre-huTFh-eks-pressionsprodukterne ikke glycosyleret( dvs. de er produceret 5 i en prokaryotisk celle transformeret med et rDNA ifølge opfindelsen. En ikke-glycosyleret form af huTFh og pre-huTFh er anvendelig som et immunogen og som et antigen, i pcdema-teriale og et diagnostisk system ifølge opfindelsen.

Eukaryotisk produceret huTFh og pre-huTFh er typisk 10 glycosyleret og biologisk aktivt foruden at være antigent og immunogent. Som anvendt i den foreliggende beskrivelse referer udtrykket "biologisk aktivt" til et huTFh- eller pre-huTFh-protein eller -polypeptid, der har evne til at fremkalde faktor Vll/VIIa-afhængig koagulering.

15 Den foreliggende opfindelse angår således et præparat omfattende en vandig opløsning indeholdende biologisk aktivt huTFh, som i det væsentlige er frit for protein med let : kæde af human vævsfaktor. Præparatet er fortrinsvis også i ! det væsentlige frit for sådanne stoffer som ioniske deter- 20 genter, f.eks. natriumdodecylsulfat (SDS), polyacrylamid og proteiner hidrørende fra væv og med en tilsyneladende molekylvægt på mindre end ca. 15.000 dalton som bestemt ved SDS--polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE).

De vandige huTFh-holdige opløsninger indeholder bio-25 logisk aktivt huTFh i en tilstrækkelig mængde til at bestemme koaguleringskompetencen af en karsystem-væskeprøve, såsom blod eller produkter afledt af blod, såsom citratplasma. Udtrykket "koaguleringskompetence" refererer til evnen af karvæskeprøven til at koagulere i nærværelse af biologisk 30 aktivt huTFh. Typiske huTFh-proteinkoncentrationer, som er tilstrækkelige til bestemmelse af koaguleringskompetence, er ca. 0,1 pg/ml til ca. 100 ng/ml, fortrinsvis ca. 1 pg/ml til ca. 10 Mg/ml og mere foretrukket ca. 10 pg/ml til ca.

1 ng/ml, ved anvendelse af volumenforhold mellem prøve og 35 huTFh, der ligner de i eksempel 2 anførte. Der kan naturligvis også være tale om opløsninger, der indeholder huTFh i

DK 175703 B1 I

koncentrationer, som er højere end de, der er nødvendige H

til bestemmelse af koaguleringskompetence, men som kan for- H

tyndes til en foretrukken koncentration. I

Ifølge foretrukne udførelsesformer omfatter de huTFh- I

5 -holdige vandige opløsninger huTFh dispergeret i et phospho- H

lipid eller ikke-ionisk detergent. Typiske vægtforhold mellem H

phospholipid og huTFh-protein er fra ca. 5:1 til 12.000:1, H

fortrinsvis ca. 50:1 til ca. 5.000:1 og mere foretrukket ca. - H

100:1 til 2.500:1. I

10 G. Polvoeptider. I

Polypeptiderne ifølge den foreliggende opfindelse H

indeholder hver især ikke mere ca. 50. aminosyrerester, mere H

sædvanligt færre end ca. 35 aminosyrerester og fortrinsvis H

færre end ca. 25 aminosyrerester og indeholder mindst ca. H

15 10 aminosyrerester. Desuden er polypeptiderne ifølge opfin- I

delsen karakteriseret ved deres aminosyresekvens og nye H

funktionelle egenskaber. H

En udførelsesform for et polypeptid ifølge den fore- H

liggende opfindelse er således en huTFh-bindingssted-poly- I

20 peptidanalog, som til dels er karakteriseret ved dens evne I

til kompetitiv inhibering af bindingen af huTF til blodkoagu- I

leringsfaktor VII/VIIa. En bindingssted-analog ifølge den I

foreliggende opfindelse binder fortrinsvis faktor VII/VIIa I

uden at danne et aktiveret kompleks, dvs. uden at initiere I

25 koagulering. I

Ordet "kompleks" som anvendt i de foreliggende be- H

skrivelse refererer til produktet af en specifik bindings- I

reaktion, såsom en antistof-antigen- eller receptor-ligand- I

-reaktion. Eksempler på komplekser er immunoreaktionsproduk- I

30 ter og vævsfaktor-faktor Vll/VIIa-bindingsreaktionsprodukter, I

der i den foreliggende beskrivelse betegnes TF:VII/VIIa. H

Ifølge foretrukne udførelsesformer omfatter en huTF- I

-bindingssted-analog i det mindst følgende aminosyresekvens: H

-VNQVYT-, I

35 der repræsenterer aminosyreresterne 30-35 som vist i fig. 1. I

29 DK 175703 B1

Mere foretrukket omfatter en huTFh-bindingssted-analog mindst én af følgende aminosyresekvenser: -VNQVYTVQIST-, og -LYYWKSSSSGKKT-.

5 Disse sekvenser repræsenterer huTFh-aminosyreresteme 30-40 henholdsvis 155-167 som vist i fig. 1.

Yderligere mere foretrukket omfatter en huTFh-bin-dingssted-analog en aminosyresekvens valgt blandt -EPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKC-, og 10 -VFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKT-, der repræsenterer aminosyreresterne 26-49 og 146-167 som vist i fig. 1.

Foretrukne huTFh-bindingssted-polypeptidanaloge omfatter sådanne, hvis aminosyresekvenser er vist i tabel 1.

15

Tabel 1

Betegnelse5^ Åmi nosvresekvens

p24-35 H-EWEPKPVNQVYT-OH

p2 6 -4 9 H-EPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKC-OH

20 pl44- 159 H-RDVFGKDLIYTLYYWK-OH

pl46-167 H-VFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKT-OH

pl59-169 H-IYTLYYWKSSSSGKKTAK-OH

pl57-169 H-YWKSSSSGKKTAK-OH

pl61-189 H- S S SGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYC FS V-OH

2 5 - a) Laboratoriebetegnelsen for hvert polypeptid repræsenterer den omfattede aminosyresekvens som vist i fig. 1.

Polypeptiderne p26-49, pl46-167 og pl61-189 er også 30 karakteriseret ved deres evne til at neutralisere (kompeti-tivt inhibere) bindingen af anti-huTFh-antistofmolekyler til huTFh. Andre polypeptider ifølge den foreliggende opfindelse, der har evne til at neutralisere bindingen af anti--huTFh-antistoffer til huTFh, omfatter de, der er anført i 35 tabel 2.

I DK 175703 B1 I

I 30 I

I Tabel 2 I

Betegnelse5) Aminosvresekvens I

I pl-30 H-SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPV-OH I

I p40-71 H-TKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTY-OH I

I 5 p41-49 H-KSGDWKSKC-OH I

I p56- 71 H-ECDLTDEIVKDVKQTY-OH I

p72-104Ca' H - LARVES YP AGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLC-OH I

I p94-123 H-YENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGIKY-OH I

I pl90-209 H-QAVIPSRTVNRKSTDSPVEC-OH I

10 - I

a) »c", som er føjet til laboratoriebetegnelsen, angiver, I

at en cysteinrest er føjet til den anførte sekvens som I

linker til proteinkonjugering. I

I 15 Det vil forstås, at et polypeptid ifølge den forelig-

gende opfindelse ikke behøver at være identisk i aminosy- I

resekvens med huTFh, sålænge de omhandlede polypeptider er I

i stand til at konkurrere med nativ vævsfaktor om binding I

I 1 til faktor VII/VIIa og/eller er i stand til kompetitiv in- I

H 20 hibering af bindingen af anti-huTFh-antistofmolekyler til I

I huTFh. Derfor kan et her omhandlet polypeptid være genstand I

for forskellige ændringer, såsom indføjelser, udeladelser I

og substitutioner, enten konservative eller ikke-konserva- I

I tive, hvor sådanne ændringer giver visse fordele ved anven- I

I 25 delsen.

I Konservative substitutioner er sådanne, hvor en ami- I

I I nosyrerest er erstattet med en anden, biologisk lignende I

rest. Eksempler på konservative .substitutioner omfatter I

I anvendelse af en hydrofob rest, såsom isoleucin, valin, I

I 30 leucin eller methionin i stedet for en anden, eller anven-

I delse af en polær rest i stedet for en anden, såsom erstat- I

ning af arginin med lysin, glutaminsyre med asparaginsyre I

I eller glutamin med asparagin og omvendt og lignende. Udtryk- I

ket "konservativ substitution" omfatter også anvendelse af I

I 35 en substitueret aminosyre i stedet for en tilsvarende usub- I

31 DK 175703 B1 stitueret aminosyre, forudsat at et sådant polypeptid også udviser den nødvendige bindingsaktivitet.

Når et polypeptid ifølge den foreliggende opfindelse har en sekvens, der ikke er identisk med sekvensen af nativt 5 huTFh, fordi der er foretaget en eller flere konservative eller ikke-konservative substitutioner, er sædvanligvis ikke mere end 20% og mere sædvanligt ikke mere end 10% af antallet af aminosyrerester substitueret, bortset fra når yderligere rester er tilføjet ved hver terminus med det 10 formål at tilvejebringe en linker, ved hjælp af hvilken polypeptiderne ifølge opfindelsen på bekvem måde kan bindes til en mærkning eller en fast matriks eller bærer. Mærknin-1 ger, faste matrikser og bærere, der kan anvendes med poly peptiderne ifølge opfindelsen, beskrives nedenfor.

15 Aminosyrerest-linkere er sædvanligvis mindst én rest og kan være 40 eller flere rester, mere ofte 1-10 rester. Typiske aminosyrerester, som anvendes til binding, er tyro-; sin, cystein, lysin, glutaminsyre og asparaginsyre eller lignende. Desuden kan en polypeptidsekvens ifølge opfindelsen 20 adskille sig fra den naturlige sekvens ved, at sekvensen er modificeret ved acylering af endestillet NH2, f.eks. acety-lering, eller thioglycolsyre-amidering, amidering af terminalt carboxyl, f.eks. ammoniak, methylamin osv.

Når et polypeptid ifølge opfindelsen er koblet til i 25 en bærer via en linker til dannelse af, hvad der er kendt som et bærer-hapten-konjugat, er det i stand til at fremkalde antistoffer, der immunoreagerer med huTFh. På baggrund af det veletablerede princip med immunologisk krydareaktivitet angår den foreliggende opfindelse derfor antigenrelaterede 30 varianter af polypeptiderne vist i tabel 1 og 2. En "antigent relateret variant" er et polypeptid, der omfatter en sekvensdel på mindst seks aminosyrerester af et polypeptid fra tabel 1 eller tabel 2, og som er i stand til at fremkalde antistof molekyler, der immunoreagerer med et polypeptid 35 fra tabel 1 eller 2 og huTFh.

I DK 175703 B1 I

I I

B Også omfattet af den foreliggende opfindelse er et B

B præparat omfattende en vandig opløsning af en huTFh-bindings- B

B sted-polypeptidanalog, hvor polypeptidet er dispergeret i B

et phospholipid eller ikke-ionisk detergent. Typiske vægt- I

5 forhold mellem phospholipid og polypeptidanalog er fra ca. I

5:1 til 200:1, fortrinsvis fra ca. 30:1 til 80:1 og mere B

B foretrukket ca. 45:1 til 55:1. Foretrukne huTFh-bindings- B

B sted-polypeptidanaloge, der er egnede til anvendelse dis- fl

B ! pergeret i et phospholipid, er de, der er anført i tabel I

I 10 4, afsnit II. I

I Et polypeptid ifølge opfindelsen kan syntetiseres B

ved enhver metode, der er velkendt af en fagmand inden for B

polypeptid-teknikken. En udmærket sammenfatning af de mange B

Η i metoder, der står til rådighed, kan findes i J.M. Steward B

15 og J.D. Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman B

B Co., San Francisco, 1959, og J. Meienhofer, "Hormonal B

B Proteins and Peptides", bind 2, s. 46, Academic Press (New B

I York), 1983, vedrørende fastfase-peptidsyntese, og E. B

I i Schroder og K. Kubke, "The Peptides", bind 1, Academic Press B

20 (New York), 1965, vedrørende klassisk syntese i opløsning. B

H. Podematerialer. B

B Ifølge en anden udførelsesform anvendes et polypeptid B

B ifølge opfindelsen eller en antigent relateret variant deraf B

B i et farmaceutisk acceptabelt vandigt fortyndingsmiddelpræ- B

B 25 parat til dannelse af et podemateriale, der ved indgivelse B

B j i en effektiv mængde er i stand til at fremkalde antistoffer, B

B [ der immunoreagerer med huTFh. Udtrykket "podemateriale" fl

I I

B anvendes i den foreliggende beskrivelse til at betegne et B

B præparat indeholdende et polypeptid ifølge opfindelsen som B

B 30 aktiv bestanddel anvendt til fremstilling af antistoffer B

B mod huTFh. Når et polypeptid anvendes til at fremkalde an- B

B tistoffer, vil det forstås, at polypeptidet kan anvendes B

B alene eller bundet til en bærer som et konjugat eller som B

B en polypeptidpolymer, men for nemheds skyld betegnes de B

B 35 forskellige udførelsesformer for polypeptiderne ifølge op- B

B findelsen kollektivt ved udtrykket "polypeptid". B

33 DK 175703 B1

For et polypeptid, der indeholder færre end ca. 35 aminosyrerester, foretrækkes det at anvende peptidet bundet til en bærer, når formålet er at fremkalde produktion af antistoffer som allerede anført.

5 Som allerede anført kan en eller flere yderligere aminosyrerester tilføjes til amino- eller carboxyterminus-serne af polypeptidet for at bistå ved bindingen af polypep-tidet til en bærer. Cvsteinrester tilføjet ved amino- eller carboxyterminysserne af polypeptidet har vist sig at være 10 særlig anvendelige til dannelse af konjugater via disulfid-bindinger. Imidlertid kan andre metoder, der er velkendte til fremstilling af konjugater, også anvendes. Eksempler på yderligere forbindelsesdannende procedurer omfatter anvendelse af Michael-additionsreaktionsprodukter, dialdehyder, 15 såsom glutaraldehyd, Klipstein et al., J. Infect. Dis., 147, 318-326 (1983) og lignende eller anvendelse af car- bodiimid-metoder, som ved anvendelse af et vandopløseligt carbodiimid til dannelse af amidbindinger til bæreren. Vedrørende en gennemgang af proteinkonjugering eller -kobling 20 via aktiverede funktionelle grupper henvises der til Aurameas, et al., Scand. J. Immunol., bind 8, Supp-1. 7, 7-23 (1978).

i

Anvendelige bærere er velkendte og er i almindelighed selv proteiner. Eksempler på sådanne bærere er nøglehuls-25 -albueskæl-hæmocyanin (KLH), edestin, thyroglobulin, al-I buminer som bovint serumalbumin (BSA) eller humant serumal- j bumin (HSA), røde blodlegemer, såsom fåre-erythrocyter (SRBC), tetanus-toxoid, kolera-toxoid samt polyaminosyrer, såsom poly-(D-lysin: D-glutaminsyre) , og lignende.

30 Valget af bærer er mere afhængigt af den sluttelige anvendelse af podematerialet og er baseret på kriterier, som ikke er specielt involveret i den foreliggende opfindelse. Der bør f.eks. vælges en bærer, der ikke fremkalder en uheldig reaktion i det særlige dyr, der skal podes.

35 Det her omhandlede podemateriale indeholder en effek tiv immunogen mængde af et polypeptid ifølge opfindelsen,

DK 175703 B1 I

H

typisk som et konjugat bundet til en bærer. Den effektive H

mængde polypeptid pr. enhedsdosis afhænger bl.a. af dyrear- I

ten, som podes, dyrets kropsvægt. og den valgte podeplan,

således som det er velkendt. Podematerialer har typisk po- I

5 lypeptidkoncentrationer på ca. 10 μς til ca. 500 mg pr. H

podning (dosis), fortrinsvis ca. 50 μg til ca. 50 mg pr. H

dosis. I

Udtrykket "enhedsdosis" refererer for så vidt det I

angår podematerialer ifølge den foreliggende opfindelse til I

10 fysisk særskilte enheder, der er egnede som enhedsdoser til H

dyr, hvor hver enhed indeholder en forud bestemt mængde H

aktivt materiale, der er beregnet til at give den ønskede I

immunogene effekt, i kombination med det ønskede fortyn-

dingsmiddel, dvs. bærer eller bærestof. Specifikationerne I

15 for den omhandlede enhedsdosis af et podemateriale ifølge I

opfindelsen bestemmes af og er direkte afhængige af (a) de H

særlige egenskaber af det aktive materiale, og den særlige j I

immunologiske effekt der skal opnås, og (b) de iboende be- | I

grænsninger ved formulering af sådant aktivt materiale til : I

1 20 immunologisk anvendelse i dyr, således som det er beskrevet ! I

detaljeret i den foreliggende beskrivelse, idet disse fak- H

torer er træk af den foreliggende opfindelse. I

Podematerialer fremstilles typisk ud fra det tørrede I

faste polypeptid-konjugat ved at dispergere polypeptidkon- I

25 jugatet i et fysiologisk acceptabelt fortyndingsmiddel, I

såsom vand, saltvand eller phosphatpufret saltvand, til I

dannelse af et vandigt præparat. H

Podematerialer kan også indeholde et adjuvans som en . I

del af fortyndingsmidlet. Adjuvanser som komplet Freund's I

30 adjuvans (CFA), ukomplet Freund's adjuvans (IFA) og alun er I

materialer, der er velkendte inden for teknikken og er kom- I

mercielt tilgængelige fra flere kilder. I

I. Antistoffer og antistofpræparater. I

Udtrykket "antistof" anvendes i den foreliggende H

35 beskrivelse til at betegne immunoglobulinmolekyler og im- I

munologisk aktive dele af immunoglobulinmolekyler, dvs. I

35 DK 175703 B1 molekyler, der indeholder et antistofkombinerende sted eller paratop. Eksempler på antistofmolekyler er intakte immuno-globulinmolekyler, i det væsentlige intakte immunoglobulin-molekyler og de dele af et immunoglobulinmolekyle, der in-5 deholder paratopen, herunder de dele, der er kendte som Fab, Fab', F(ab')2 og F(v).

, Et antistofpræparat ifølge den foreliggende opfindelse er et anti-peptid-antistof, der er karakteriseret ved at indeholde antistofmolekyler, der immunoreagerer med huTfh 10 og mindst ét specifikt polypeptid ifølge opfindelsen.

F.eks. er et antistofpræparat ifølge opfindelsen, der indeholder antistofmolekyler, som immunoreagerer med huTFh og en polypeptidanalog af vævsfaktor-bindingsstedet, men ikke immunoreagerer væsentligt med p204-226, i stand 15 til at neutralisere evnen af vævsfaktor til at binde faktor VII/VIla. Foretrukne antistofpræparater er således sådanne, der indeholder antistofmolekyler, som immunoreagerer med huTFh og p26-49 eller pl46-167 og i det væsentlige er frie for immunoreaktion med p204-226.

20 Det skal bemærkes, at polyklonale antisera, som er dannet med huTFh, indeholder antistoffer, der immunoreagerer med p204-226. Det hovedsagelige fravær af anti-p204-226-immunoreaktivitet er således et træk, der adskiller de her omhandlede antistofpræparater fra præparaterne beskrevet I 25 ifølge kendt teknik.

Et antistof præparat ifølge den foreliggende opfindelse produceres typisk ved at immunisere et pattedyr med et podemateriale ifølge opfindelsen og derved fremkalde antistofmolekyler i pattedyret, der har den rette polypeptid-im-30 munospecificitet. Antistofmolekylerne udvindes derefter fra pattedyret og isoleres i ønsket omfang ved velkendte metoder, f.eks. ved immunoaffinitetschromatografi. Det således fremstillede antistofpræparat kan bl.a. anvendes ved de diagnostiske metoder og systemer ifølge opfindelsen til 35 påvisning af huTFh i en kropsprøve.

_ _ _____i

DK 175703 B1 I

36 I

Præparater af monoklonalt antistof er også omfattet I

af den foreliggende opfindelse. Et præparat af monoklonalt H

antistof indeholder inden for påvisningsgrænserne kun én

art af antistofkombineringssted, som er i stand til effektivt I

5 at binde huTFh. Et præparat af monoklonalt antistof ifølge opfindelsen udviser således typisk en enkelt bindingsaf-

finitet til huTFh, selv om det kan indeholde antistoffer, I

der er i stand til at binde andre proteiner end huTFh. Ifølge I

en udførelsesform indeholder et præparat af monoklonalt I

10 antistof antistofmolekyler, der immunoreagerer med huTFh og I

en polypeptidanalog af vævsfaktor-bindingsstedet, fortrinsvis H

p26-49 eller pl46-167. I

Ifølge en anden udførelsesform omfatter opfindelsen I

et antikoagulerende (neutraliserende) monoklonalt antistof I

15 (MoAb) indeholdende antistofmolekyler, der immunoreagerer H

med huTFh og inhiberer huTFh-initieret koagulering. Et fore- I

1 -trukket monoklonalt antistof, der inhiberer koagulering, er H

yderligere karakteriseret ved at immunoreagere med en poly-

peptid ifølge opfindelsen, fortrinsvis en huTFh-bindings- I

20 sted-polypeptidanalog og mere foretrukket et polypeptid som I

vist i tabel 1. I

Ifølge en anden udførelsesform indeholder et antikoa- I

gulerende monoklonalt antistof antistofmolekyler, der im- I

munoreagerer med huTFh og et huTFh: faktor VII/VIIa-kompleks I

25 og inhiberer (neutraliserer) huTFh-initieret koagulering. I

Et foretrukket antikoagulerende monoklonalt antistof er I

yderligere karakteriseret ved at immunoreagere med huTFh- I

-polypeptiderne pl-30 eller p26-49 og immunoreagerer for- H

trinsvis ikke med huTFh-polypeptid p56-71. I

30 Den foreliggende opfindelse angår også et præparat I

af ikke-neutraliserende monoklonalt antistof indeholdende H

antistof molekyler, der ikke neutraliserer evnen af vævsfaktor I

til at initiere koagulering. Et sådant præparat indeholder I

fortrinsvis antistofmolekyler, der immunoreagerer med huTFh H

35 og polypeptidet pl-30 og produceres (udskilles) af hybridoma I

TF9-10H10. i I

37 DK 175703 B1

Et præparat af monoklonait antistof ifølge opfindelsen kan produceres ved at igangsætte en kultur af monoklonait ; hybridoma omfattende et næringsmedium indeholdende et hybri- doma, der udskiller antistofmolekyler med den rette polypep-5 tid-specificitet.

Kulturen holdes under betingelser og i et tidsrum, der er tilstrækkeligt til, at hybridomaet udskiller antistofmolekylerne i mediet. Det antistofholdige medium opsamles derefter. Antistofmolekylerne kan derpå isoleres yderligere ! 10 ved velkendte metoder.

Medier, som er anvendelige til fremstilling af disse præparater, er både velkendte og kommercielt tilgængelige og omfatter syntetiske kulturmedier, indavlede mus og lignende.

Et eksempel på et syntetisk medium er Dulbecco's minimale 15 essentielle medium (DMEM; Dulbecco et al., Virol. 8:396 (1959) suppleret med 4,5 g/liter glucose, 20 mM glutamin og 20% kalvefosterserum. Et eksempel på en indavlet musestamme er Balb/c. Præparaterne af monoklonait antistof, der er fremstillet ved den ovenfor anførte metode, kan f.eks. an-20 vendes diagnostisk og terapeutisk, hvor dannelsen af et huTFh-holdigt immunoreaktionsprodukt ønskes.

J. Hybridomaer.

Hybridomaerne ifølge opfindelsen er karakteriseret ved at producere antistofmolekyler, der immunoreagerer med 25 huTFh. Et foretrukket hybridoma er yderligere karakteriseret ved at producere antistofmolekyler, der inhiberer huTFh-ini-tieret koagulering og fortrinsvis immunoreagerer med et polypeptid ifølge opfindelsen, fortrinsvis en huTFh-bin-dingssted-polypeptidanalog og mere foretrukket et polypeptid 30 som vist i tabel 1. Ved yderligere foretrukne udførelsesformer immunoreagerer et antikoagulerende monoklonait antistof med ikke-humant primat-Tf.

Ifølge en anden foretrukken udførelsesform producerer et hybridoma ifølge opfindelsen antistofmolekyler, der im-35 munoreagerer med huTFh og et huTFh: faktor VII/VIIa-kompleks og neutraliserer huTFh-initieret koagulering. Fortrinsvis

I DK 175703 B1 I

I I

er et hybridoma, der producerer antistoffer, som immunorea- H

gerer med et huTFh:faktor VII/VIla-kompleks yderligere ka- H

rakteriseret ved evnen af antistofmolekylerne til at im- H

I munoreagere med huTFh-polypeptiderne pl-30 eller p26-49, I

I 5 fortrinsvis begge, idet det er mere foretrukket, at de nævnte H

I antistofmolekyler ikke immunoreagerer med poly-huTFh-poly- H

I peptid ρ5β-71. H

Metoder til fremstilling af hybridomaer, der produ- H

I cerer (udskiller) antistofmolekyler, der har en ønsket im- H

I 10 munospecificitet, dvs. har evnen til at immunoreagere med H

I et bestemt protein og/eller polypeptid, er velkendte. Særlig H

I anvendelig er hybridoma-teknologien beskrevet af Niman et H

al., Proc. Natl . Acad. Sci. USA, 80:4949-4953 (1983). Fore- I

trukne hybridomaer er de, der er anført i tabel 5 i eksempel H

13. I

I Hybridomakulturerne TF8-5G9, TF9-6B4 og TF9-10H10 er I

I deponeret i overensstemmelse med Budapest-traktaten hos H

I ATCC den 27. marts 1987 og har fået deponeringsnumrene H

I HB9382, HB9381, henholdsvis HB9383. I

I 20 En yderligere hybridomakultur TF9-5B7 er deponeret i H

I overensstemmelse med Budapest-traktaten hos ATTC den 9. H

I marts 1988 og har fået deponeringsnummeret HB9658. H

I K. Terapeutiske metoder og præparater. H

huTFh-f aktor-VII/VIIa-bindingssted-polypeptidanalo- H

25 gene, antistofpræparaterne, præparaterne af monoklonalt H

I antistof og de antikoagulerende monoklonale antistoffer H

I ifølge den foreliggende opfindelse kan hver især anvendes H

I til at modulere bindingen af faktor VII/VIIa af vævsfaktor H

I in vivo. H

I 30 F.eks. kan en huTFh-faktor vil/viia-bindingssted-po- H

I lypeptidanalog anvendes i et farmaceutisk acceptabelt præ- H

I parat, der ved indgivelse til en person i en effektiv mængde : H

I er i stand til kompetitiv inhibering af bindingen af faktor i H

I VII/VIIa til vævsfaktor. Denne inhibering antages at bevirke H

I 35 en nedsat hastighed af dannelsen af vævsfaktor-faktor VII/- H

I Vlla-kompleks. Således kan indgivelse in vivo af en huTFh- H

39 DK 175703 B1 -faktor VII/VIIa-bindingssted-polypeptidanalog anvendes til at modulere enhver fysiologisk reaktion, der initieres af binding af vævsfaktor til faktor VII/VIIa, såsom koagulering og nogle inflammatoriske reaktioner. Ifølge foretrukne ud-; 5 førelsesformer indgives polypeptidet dispergeret i et phos pholipid som ovenfor beskrevet.

En anden metode til modulering af bindingen af faktor VII/VIIa af vævsfaktor in vivo er intravenøs indgivelse af en effektiv mængde af et antistofpræparat (anti-peptid-an-10 tistof) eller et antikoagulerende monoklonalt antistof ifølge opfindelsen. Fortrinsvis er antistofmolekylerne sådanne, der indeholder denne paratopiske region og er frie for Fc-i -regionen, såsom immunoglobulinfragmenterne P(ab')2» Fab og lignende. Terapeutisk effektive mængder af et antikoagule-15 rende monoklonalt antistof ligger i området fra 15 Mg/kg legemsvægt til 5 mg/kg legemsvægt, fortrinsvis i området fra ca. 100 /^g/kg legemsvægt til ca. 1 mg/kg legemsvægt og mere foretrukket i området fra ca. 150 Mg/kg legemsvægt til ca. 500 Mg/kg legemsvægt.

20 Ifølge en anden udførelsesform bindes antistofmole kylerne af et monoklonalt antistof, antikoagulerende monoklonalt antistof eller ikke-neutraliserende monoklonalt antistof ifølge opfindelsen til et antitumormiddel til dannelse af et antitumorvirksomt terapeutisk præparat. En ef-25 fektiv mængde antitumorvirksomt terapeutisk præparat dannet på denne måde kan indgives til en person, der har tumorceller, som eksprimerer vævsfaktor på deres overflade. Eksempler på sådanne tumorceller er brystkarcinom og lungekar-cinom.

30 Typiske for de her omhandlede antitumormidler er 131 188 212 radionuklider, såsom I, Re, Bi og lignende. Metoder til fremstilling af terapeutiske præparater af radionuklid--konjugeret monoklonalt antistof og deres anvendelse er beskrevet i Kozak et al.. Trends In Biotech., 4:259-264 35 (1986).

I DK 175703 B1 I

I I

I De indgivne polypeptid- eller antistofmolekyleholdige I

I præparater har form af opløsninger eller suspensioner, men H

polypeptiderne kan også have form af tabletter, piller, H

I kapsler, formuleringer med langvarig frigivelse eller pul- H

I 5 vere. I alle tilfælde indeholder præparaterne 0,10-95% aktiv H

I bestanddel, fortrinsvis 25-70%. H

I Fremstillingen af terapeutiske præparater, der in- H

I deholder polypeptider eller antistofmolekyler som aktive H

bestanddele, er velkendt. Typisk fremstilles sådanne præpa- I

I 10 rater som injektionspræparater, enten som væskeopløsninger H

I eller suspensioner, men faste former, der er egnet til op- I

løsning eller suspension i væske før injektion, kan også H

I fremstilles. Præparatet kan også være emulgeret. Den aktive H

I terapeutiske bestanddel blandes ofte med ekscipienser, der H

I 15 er farmaceutisk acceptable og forenelige med den aktive I

I bestanddel. Egnede ekscipienser er f.eks. vand, saltvand, H

I dextrose, glycerol, ethanol eller lignende og kombinationer H

I deraf. Desuden kan præparatet om ønsket indeholde mindre H

I mængder af hjælpestoffer, såsom befugtningsmidler eller H

I 20 emulgatorer, pH-puffermidler, som forøger effektiviteten af H

I den aktive bestanddel. H

I Et præparat af polypeptid eller antistof kan i det I

I terapeutiske præparat formuleres som neutraliserede, far- H

I maceutisk acceptable saltformer. Farmaceutisk acceptable H

I 25 salte omfatter syreadditionssalte (dannet med de frie amino- H

I grupper af polypeptidet eller antistoffet) og dannes med H

I uorganiske syrer, f.eks. saltsyre eller phosphorsyre, eller H

I med sådanne organiske syrer som eddikesyre, oxalsyre, vin- . H

I syre, mandelsyre og lignende. Salte dannet med de frie carb- I H

I 3 0 oxylgrupper kan også fås ud fra uorganiske baser, f.eks. . ; H

I natrium-, kalium-, ammonium-, calcium- eller ferrihydroxid, H

I og sådanne organiske baser som isopropylamin, trimethylamin, H

I 2-ethylaminoethanol, histidin, procain og lignende. H

I De terapeutiske polypeptid- eller antistofholdige H

I 35 præparater indgives sædvanligvis topisk eller intravenøst, H

I f.eks. ved injektion af en enhedsdosis. Udtrykket "enheds- H

41 DK 175703 B1 dosis" refererer i sammenhæng med et terapeutisk præparat ifølge den foreliggende opfindelse til fysisk særskilte enheder, der er egnede som enhedsdoser til mennesker, idet hver enhed indeholder en forud bestemt mængde aktivt mate-5 riaie, der er beregnet til at give den ønskede terapeutiske effekt i kombination med det nødvendige fortyndingsmiddel, dvs. bærer eller bærestof.

Præparaterne indgives på en måde, der er forenelig med dosisformuleringen, og i en terapeutisk effektiv mængde.

10 Mængden, der skal indgives, afhænger af patienten, der skal i behandles, evnen af patientens blodkoaguleringssystem til at udnytte den aktive bestanddel og den ønskede grad af inhibering eller neutralisering af vævsfaktor-bindingskapacitet. De nøjagtige mængder af aktiv bestanddel, der skal 15 indgives, afhænger af lægens vurdering og er specielle for hvert individ. Imidlertid er egnede polypeptid-dosisområder af størrelsesordenen et til flere mg aktiv bestanddel pr. individ pr. dag og afhænger af indgivelsesmåden. Egnede planer for begyndelsesindgivelse og booster-indgivelser er også 20 variable, men udgøres typisk af en begyndelsesindgivelse efterfulgt af gentagne doser med mellemrum på en eller flere timer, som indgives ved injektion eller på anden måde. Alternativt kan der foretages en kontinuerlig intravenøs infusion, der er tilstrækkelig til at opretholde koncentratio-25 ner på 10 nM til 10 mM i blodet.

L. Diagnostiske systemer.

Et diagnostisk system i form af et sæt ifølge den foreliggende opfindelsen omfatter, i en tilstrækkelig mængde til mindst én bestemmelse, et eksprimeret protein, polypep-30 tid, antistofpræparat eller præparat af monoklonalt antistof ifølge opfindelsen som særskilt pakket reagens. Instruktioner vedrørende anvendelsen af det pakkede reagens er også typisk j inkluderet.

"Instruktioner vedrørende anvendelse" omfatter typisk 35 en konkret anvisning, som beskriver reagenskoncentrationen eller mindst én bestemmelsemetodeparameter, såsom de relative Η

I DK 175703 B1 I

I I

mængder af reagens og prøve, der skal blandes, holdetider I

for blandinger af reagens og prøve, temperatur, pufferbetin- I

gelser og lignende. I

Ifølge foretrukne udførelsesformer omfatter et diag- I

5 nostisk system ifølge den foreliggende opfindelse yderligere I

en mærkning eller et indikerende middel, der er i stand til I

at vise dannelsen af et kompleks indeholdende et reagens- I

-stof. I

H Som anvendt i den foreliggende beskrivelse refererer I

10 udtrykkene "mærkning" og "indikerende middel" til enkelte I

atomer og molekyler, som enten er direkte eller indirekte I

H involveret i tilvejebringelsen af et påviseligt signal, der I

indikerer tilstedeværelden af et kompleks. "In vivo"-mærk- I

ninger eller -indikerende midler er sådanne, der er anven- I

15 delige i kroppens hos en person. Enhver mærkning eller in- I

dikerende middel kan bindes til eller inkorporeres i et I

eksprimeret protein, polypeptid eller antistofmolekyle, der I

udgør en del af et præparat af antistof eller monoklonalt I

antistof ifølge den foreliggende opfindelse eller anvendes ' I

20 separat, og disse atomer eller molekyler kan anvendes alene I

I eller sammen med yderligere reagenser. Sådanne mærkninger I

er i sig selv velkendte inden for klinisk diagnostisk kemi I

og udgør kun en del af den foreliggende opfindelse, for så · I

vidt de anvendes sammen med i øvrigt hidtil ukendte protei- I

I 25 ner, metoder og/eller systemer. I

Bindingen af mærkninger, dvs. mærkningen af, polypep- I

H tider og proteiner er velkendt. F.eks. kan antistofmolekyler I

I produceret af et hybridoma mærkes ved metabolisk inkorpore- I

I ring af radioisotopholdige aminosyrer, der foreligger som j I

I 30 komponent i kulturmediet, se f.eks. Galfre et al., Meth. ' I

Enzymol., 73:3-46 (1981), metoderne til protein-konjugering I

eller -kobling via aktiverede funktionelle grupper er særlig I

anvendelige, se f.eks. Aurameas, et al., Scand. J. Immunol., I

I bind 8, suppl. 7:7-23 (1978), Rodwell et al., Biotech., I

35 3:889-894 (1984), og US patentskrift nr. 4.493.795. I

43 DK 175703 B1

De diagnostiske systemer kan også omfatte, fortrinsvis som en separat pakning, et specifikt bindende middel. Et "specifikt bindende middel" er en molekylær helhed, der er i stand til selektivt at binde et reagens-stof ifølge den 5 foreliggende opfindelse men ikke i sig selv er et proteinekspressionsprodukt, polypeptid eller antis tof molekyle ifølge opfindelsen. Eksempler på specifikke bindende midler er antistofmolekyler, komplementproteiner eller fragmenter deraf, protein A, blodkoaguleringsfaktor VII/VIIa, bovin 10 vævsfaktor og lignende. Fortrinsvis kan det specifikt bindende middel binde reagens-stoffer, når stoffet er til stede som en del af et kompleks.

I Ifølge foretrukne udførelsesformer er det specifikt ' bindende middel mærket. Når det diagnostiske system omfatter 15 et specifikt bindende middel, der ikke er mærket, anvendes midlet imidlertid typisk som et forstærkende middel eller reagens. I disse udførelsesformer er det mærkede specifikke bindende midel i stand til specifikt at binde forstærknings-midlet, når forstærkningsmidlet er bundet til et reagensstof-20 -holdigt kompleks.

De diagnostiske sæt ifølge den foreliggende opfindelse kan anvendes ved en ELISA-bestemmelse til bestemmelse af tilstedeværelsen eller mængden af huTFh i en kropsvæskeprøve, såsom serum, plasma eller urin. "ELISA" refererer til en 25 enzymbundet immunosorbensbestemmelse, hvorved der anvendes et antistof eller antigen bundet til en fast fase og et enzym-antigen- eller enzym-antistof-konjugat til påvisning og mængdebestemmelse af et antigen eller antistof,' som er til stede i en prøve. En beskrivelse af ELISA-metoden findes 30 i kapitel 22 i 4. udg. af Basic and Clinical Immunology af D.P. Sites et al., Lange Medical Publications, Los Altos, CA (1982), og i US patentskrift nr. 3.654.090, 3.850.752 og 4.016.043 .

Ifølge foretrukne udførelsesformer kan det eksprime-35 rede protein, polypeptid eller antistofmolekyle ifølge den foreliggende opfindelse være bundet til en fast matriks til

I DK 175703 B1 I

I I

I dannelse af en fast bærer, som er pakket separat i det om- I

handlede diagnostiske system. I

Reagenset er typisk bundet til den faste matriks ved B

B adsorption fra et vandigt medium,, selv om andre bindingsme- I

5 toder, der er velkendte af fagmanden, kan anvendes. I

Anvendelige faste matrikser er velkendte. Sådanne. I

B ; materialer omfatter tværbundet dekstran, der kan fås under I

B navnet "SEPHADEX" fra Pharmacia Fine Chemicals (Piscataway, fl

B NJ) , agarose, polystyrenperler fra ca. 1 μπι til ca. 5 mm i B

I 10 diameter, der kan fås fra Abbott Laboratories, North Chicago, Η B IL, polyvinylchlorid, polystyren, tværbundet polyacrylamid, fl I nitrocellulose- eller polyamidbaserede materialer, såsom fl I ark, strimler eller stykker, eller rør, plader eller brønde fl af en mi'krotiterplade, såsom de, der er fremstillet af poly- fl I · 15 styren eller polyvinylchlorid. fl I Reagens-stoffet, det mærkede specifikke bindende fl I middel eller forstærkningsreagenset af ethvert diagnostisk fl system beskrevet i den foreliggende beskrivelse kan foreligge fl i opløsning, som væskedispersion eller som i det væsentlige fl

I 20 tørt pulver, f.eks. i frysetørret form. Når det indikerende H

I middel er et enzym, kan enzymets substrat også foreligge i H

I en separat pakning af et system. En fast bærer, såsom den H

I ovenfor beskrevne mikrotiterplade og en eller flere puffere H

I kan også være inkluderet som separat pakkede elementer i I

I 25 dette diagnostiske bestemmelsessystem. H

Pakningerne, der er diskuteret her i sammenhæng med fl

I diagnostiske systemer, er sådanne, som er almindeligt an- I

I vendte i diagnostiske systemer. Sådanne pakninger omfatter H

glas- og plast-(f.eks. polyethylen-, polypropylen- og poly- H

I 30 carbonat-)-flasker, -glas, plast- og plastfolielaminerede H

I hylstre og lignende. B

I M. Bestemmelsesmetoder. B

I Den foreliggende opfindelse omfatter enhver metode, B

I der medfører påvisning af huTFh ved at producere et kompleks, B

I 35 der indeholder et eksprimeret protein, polypeptid eller B

antistofmolekyle indeholdt i et præparat af antistof eller B

: 45 DK 175703 B1 monoklonelt antistof ifølge den foreliggende opfindelse.

Det vil forstås af en fagmand, at der er adskillige velkendte kliniske diagnostiske kemiske procedurer, der kan anvendes til dannelse af disse komplekser. Selv om der er beskrevet 5 eksempler på bestemmelsesmetoder i den foreliggende beskrivelse, er opfindelsen derfor ikke begrænset til disse.

1. Thrombus-påvisning.

Opfindelsen omfatter en metode til påvisning af tilstedeværelsen af en thrombus hos en person. En effektiv 10 mængde af et præparat af monoklonalt antistof ifølge den foreliggende opfindelse indeholdende antistofmolekyler bundet j til et in vivo-indikerende middel indgives intravenøst til personen. Ifølge foretrukne udførelsesformer er de mærkede antistofmolekyler sådanne, der immunoreagerer med huTFh og 15 et polypeptid fra tabel 1 og 2, men ikke p204-226, mere foretrukket sådanne, der produceres af hybridoma TF8-5G9, TF9-6B4 eller TF9-10H10.

Personen bibeholdes derefter i et forud bestemt tidsrum, der er tilstrækkeligt til, at de mærkede antistofmole-20 kyler reagerer med huTFh, som er til stede som en del af en thrombus, og danne et kompleks og fortrinsvis i et yderligere tidsrum, der er tilstrækkeligt til, at en væsentlig mængde af eventuelt ikke-reagerede antistofmolekyler fjernes fra kroppen. Personen undersøges derefter for tilstedeværelse 25 og fortrinsvis placering af eventuelt dannet kompleks.

2. Påvisning af huTFh i en kropsprøve.

Der kan anvendes forskellige heterogene og homogene bestemmelsesprocedurer, enten kompetitive eller ikke-kompe-titive, til påvisning af tilstedeværelsen og fortrinsvis ’ 30 mængden af huTFh i en kropsprøve, fortrinsvis en kropsvæ skeprøve. F.eks. blandes en flydende kropsvæskeprøve og mærket p26-49 med en fast bærer omfattende antistofmolekyler produceret af hybridoma TF8-5G9 eller TF9-10H10 bundet til | den indre væg af en mikrotiterpladebrønd til dannelse af en 35 fastfase-væskefase-immunoreaktionsblanding. Blandingen holdes under biologiske bestemmelsesbetingelser i et tilstrækkeligt

I DK 175703 B1 I

I 46 I

tidsrum til, at eventuelt tilstedeværende huTFh i prøven og I

I mærket p26-49 konkurrerer om binding til antis tof molekylerne, I

I der er til stede som fast bærer, og danne et fastfase-im- I

munoreaktionsprodukt. Det ikke-bundne mærkede p26-49 skilles I

I 5 derefter fra immunoreaktionsprodukterne. Mængden af mærket I

p26-49 bundet som immunoreaktionsprodukt bestemmes derpå, I

og derved fås ved bestemmelse af differensen et mål for til- " I

stedeværelsen af huTFh. I

10 Eksempler I

I De følgende eksempler tjener til at illustrere, men I

I ikke begrænse, den foreliggende opfindelse. I

I 1. Fremstilling af vævsfaktorholdia human hiemeeks- I

trakt

15 Normale hjerner tilvejebragt ved autopsi forarbejdes I

enten inden for 12 timer eller opbevares nedfrosset ved I

-80°C. Hjernehinderne og cerebellum fjernes, og de tilbage- I

værende hjernedele homogeniseres i et lige så stort volumen H

I kold (0°C) acetone ved anvendelse af en Polytron-homogeni- I

I 20 seret (Brinkman Instruments, Co., Westbury, NY). Det frem- H

H komne homogenisat blandes med yderligere tre volumener kold acetone, og fraktionen af fast væv fraskilles ved filtrering

under anvendelse af en sintret glastragt. Acetoneopløseligt I

I materiale ekstraheres fra det tilbageholdte faste stof syv H

I 2 5 yderligere gange, idet der hver gang blandes med to volumener H

kold acetone og derefter filtreres. Efter den sidste filtre- H

I ring får tilbageværende acetone lov at fordampe ved atmos- I

I færetryk fra det tilbageværende faste stof natten over ved I

I ca. 20°C. I

3 0 Det tilbageværende faste stof af hjernevæv underkastes I

I derefter fem ekstraktioner, der hver især gennemføres ved H

I at blande det faste stof med en heptan/butanol-opløsning i I

I forholdet 2:1 i et forhold på 1 g fast stof pr. 25 ml hep- I

I tan/butanol efterfulgt af filtrering til fraskillelse af H

I 35 det faste stof. Efter den sidste filtrering tørres det til- I

bageværende faste stof natten over ved ca. 2 0°C under atmos- H

47 DK 175703 B1 færetryk, hvorved der fås delipideret hjernevæv-pulver, som opbevares ved -S0°C indtil anvendelsen.

25 g af hjernevæv-pulveret blandes derefter med 500 ml TS/EDTA-puffer (100 mM natriumchlorid, 50 mM tris-HCl 5 (pH-værdi 7,5), 0,02% natriumazid, 5 mM ethylendiamintetra-eddikesyre (EDTA), 0,1 volumenprocent "Triton X-100" (poly-arylethylen-9-octyl-phenylether)) og omrøres natten over ved 4°C. Blandingen centrifugeres derefter ved 15.300 g i 1 time. Den fremkomne pellet resuspenderes i 500 ml puffer A 10 (100 mM natriumchlorid, 50 mM tris-HCl (pH-værdi 7,5), 0,02% natriumazid, 2% "Triton X-100") til dannelse af en opslæmning. Efter omrøring i 1 time ved stuetemperatur centrifugeres opslæmningen som ovenfor beskrevet. Den fremkomne ovenstående væske fraskilles, frysetørres og opløseliggøres 15 derefter i 100 ml puffer A til dannelse af en huTF-holdig hjerneekstraktopløsning.

2. Koaguleringsbestemmelse til måling af huTF-pro-koagulerende aktivitet. huTF-pro-koagulerende aktivitet måles ved,en ettrins 20 koaguleringsbestemmelse gennemført med alle reagenser og blandinger holdt ved 37°C. En pool af normalt humant plasma citratbehandles ved blanding af et volumen plasma med et volumen af en opløsning indeholdende 20 mM natriumcitrat-di-hydrat og 140 mM natriumchlorid, pH-værdi 7,4. 100 μΐ af en 25 prøve indeholdende huTF fortyndet i TBS/BSA-opløsning (150 mM natriumchlorid, 50 mM tris-HCl, pH-værdi 7,5, 0,1% bovint serumalbumin) blandes med 100 μΐ af det citratbehandlede plasma. 100 μΐ af en 25 mM calciumchloridopløsning iblandes derefter til dannelse af en koaguleringsblanding, der vugges 30 forsigtigt, indtil koaguleringen sker. Tidsrummet mellem tilsætningen af calciumchlorid og dannelsen af koagel måles.

En standardkurve for huTF-aktivitet konstrueres derefter ved at afsætte fortyndingen mod koaguleringstiden i sekunder, et eksempel på en standardkurve er vist i fig. 3.

I DK 175703 B1 I

I I

3. Fremstilling af en faktor Vll-holdig fast I

I bærer til affinitetsisolerina af huTF. I

Human faktor VII/VIIa isoleres som beskrevet af Fair, I

I Blood, 62:784-91 (1983). Denne isolerede faktor VII/VIIa I

5 aktiveres til kobling til en fast agarosematriks ved at I

I dialysere 5 mg mod 0,1 M 2-(N-morpholino)-ethansulfonsyre I

I (MES) (pH-værdi 6,5) natten over ved 4°C. Calciumchlorid I

I tilsættes til en slutkoncentration på 1 mM. Faktor VII/VIIa I

blandes derefter med 4 ml "AffiGel-15"-aktiverede agaroseper-

10 ler (Biorad Laboratories, Richmond, CA) , og den resulterende I

H koblingsreaktionsblanding roteres i 4 timer ved 4°C ifølge I

producentens anbefalinger (Biorad). I

Overskydende proteinbindingssteder på den faste bærer I

I blokeres ved forsigtig omrøring af den faste bærer i 0, 1 N I

15 glycin-ethylester i 1 time ved stuetemperatur. Derefter I

I vaskes den faste bærer successivt på en sintret glastragt

medens ca. 20 ml af hver af følgende: 1) puffer A, 2) puffer I

A indeholdende 1 M natriumchlorid, 3) puffer A indeholdende I

5 mM EDTA og 4) puffer A indeholdende 1 mM calciumchlorid. I

20 Overskydende væske fjernes ved hjælp af vakuum til dannelse I

I af en halvtør partikelmasse (kage).

I 4. Faktor VII/VIIa-affinitetsisolerinq I

I af huTF. I

I 20 ml af en opløsning indeholdende 0,1 M glycinethyl- I

25 ester og 0,1 M MES, pH-værdi 6,5, blandes med 22,5 ml I

I "AffiGel-15"-agaroseperler (Biorad) til dannelse af en kob- I

I lingsreaktionsblanding. Koblingsreaktionsblandingen holdes I

ved stuetemperatur i 1 time. Det fremkomne konjugat vaskes I

på en sintret glastragt 4 gange med 10 volumener puffer 1 I

I 30 og filtreres under vakuum til dannelse af en glycinethyl- I

I ester-agarose-kage. I

I 30 ml hjerneekstraktopløsning fremstillet i eksempel I

I 1 dialyseres natten over ved 4°C mod 6 liter puffer A in- I

I beholdende 1 mM calciumchlorid. Dialyseret hjerneekstrakt I

I 35 blandes med glvcinethylester-agarose-kage til dannelse af I

I en fastfase-væskefase-reaktionsblanding. Efter at være blevet I

49 DK 175703 B1 holdt i 2 timer ved stuetemperatur under rotering adskilles den faste fase og den flydende fase ved filtrering under anvendelse af en sintret glastragt. Væskefasen fraskilles og blandes med "Trasylol" (aprotinin; Sigma Chemical Co.

5 St. Louis, MO) til en slutkoncentration på 10 enheder/ml.

Den fraskilte væskefase blandes med faktor VII/VIIa-agarose--kagen fremstillet i eksempel 3 til dannelse af en anden fastfase/væskefase-blanding.

Denne blanding holdes natten over ved 4°C under ro-10 cation for at muliggøre dannelse af et huTF-faktor VII/VIIa--holdigt fastfase-produkt. Den faste fase og den flydende fase adskilles derefter ved filtrering som ovenfor beskrevet.

Den faste fase, som tilbageholdes på den sintrede glastragt, j vaskes med 25 ml puffer A indeholdende 1 mM calciumchlorid.

' 15 Den faste fase overføres derefter til en chromatografisøj le af sintret glas (0,5 x 15 cm, Biorad) og vaskes med 6 ml af den samme vaskepuffer. huTF, som er bundet til den faste bærer efter de ovennævnte vaskninger, frigøres (elueres) derefter ved vaskning af den faste bærer med puffer A in-20 deholdende 5 mM EDTA, medens den tilbageholdes på søjlen af sintret glas. Slueret materiale opsamles i fraktioner på 1 ml, og hver fraktion undersøges for tilstedeværelse af huTF som beskrevet i eksempel 2. huTF-holdige fraktioner pooles og dialyseres natten over mod 6 liter TBS (150 mM natrium-25 chlorid, 50 mM tris-HCl, pH-værdi 7,5) indeholdende 1% "Triton X-100" (TBS/Triton) ved 4°C.

Det således dannede dialysat blandes derefter med fire volumener kold acetone til udfældning af huTF-proteinet. Bundfaldet opsamles ved centrifugering ved 5.000 g i 30 30 minutter ved ca. -10°C. Den fremkomne pellet tørres under nitrogen. Typiske udbytter er 2 Mg huTF pr. g (tør vægt) af delipideret hjernevæv-pulver.

En prøve af det således isolerede huTF suspenderes i TBS/Triton og mærkes derefter med Na125I (16 /xCi/Mg, 35 Amersham, Arlington Heights, IL) ved anvendelse af iodogen ifølge producentens anvisninger (Pierce Chemical Co., Η

I DK 175703 B1 I

I I

Rockford, IL) . Efter mærkningen fraskilles overskydende I

125 uomsat I fra det mærkede huTF ved afsaltningschromatografi

! på "Sephadex G25" (Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ) under I

anvendelse af TBX/Triton. I

5 125I-mærkede huTF-holdige prøver vurderes ved natri- I

umdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) I

H ifølge Laemmli, Nature, 227:680-685 (1970). Dithiotreitol I

(DTT, Sigma) inkluderes i prøvepufferen i en koncentration I

på 100 mM for de prøver, der vurderes under reducerende I

10 betingelser. Immunopræcipitationerne gennemføres ved inku- I

I bering natten over ved 4°C af 125I-huTF i 1% "Triton X-100", I

I 50 mM tris-HCl (pH-værdi 7,4), 150 mM natriumchlorid med I

I 1/10 volumen TF8-5G9 eller PAb 100 (ATCC TIB 115, et hybri- I

doma, der producerer et SV40 stort T-antigenspecifikt anti- I

15 stof, som her anvendes som negativ kontrol) hybridomakultur- I

ovenstående væske. Gede-anti-muse-IgG immubiliseret på aga- I

roseperler (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) anvendes I

derefter til at adsorbere de primære immunoreaktionsproduk- I

I ter. Perlerne vaskes grundigt med den samme puffer, og det I

20 bundne 125I-huTF elueres ved kogning i 5 minutter i prøve- I

puffer med eller uden DTT. Proteinbåndene gøres synlige I

I efter SDS-PAGE ved autofluorografi. I

Når isoleret huTF er radioioderet, reduceret med DTT I

I og analyseret ved SDS-PAGE på 10%'s acrylamidgeler, obser- I

H 25 veres der et enkelt større bånd med en tilsyneladende mole- I

kylvægt på 47 kDa (fig. 4). Når ikke-reduceret huTF analy- I

seres på lignende måde, observeres der imidlertid to bånd I

H på ca. 58 og 47 kDa i relativt lige store mængder (fig. 5, I

H bane B), hvilket tyder på mindst to forskellige størrelses- I

I 30 former. · I

H Mulige forklaringer af de to bånd, der observeres i I

I fravær af reduktion, er, at det større, dvs. langsommere I

I vandrende bånd kan være kraftigere glycosyleret, kan have I

yderligere uforarbejdet protein eller kan være knyttet til I

I 35 yderligere disulfidbindings-bundne polypeptider. Tilstede- I

I værelsen af et enkelt bånd efter reduktion stemmer ikke I

51 DK 175703 B1 overens med de to første forslag. Den sidste mulighed forekommer mest sandsynlig, men på grund af den ringe størrelsesforskel vil yderligere polypeptidkæder formentlig være små nok til at vandre ved eller nær farvefronten og ikke 5 blive opløst ved elektroforese på 10%'s acrylamidgeler efter reduktion. Elektroforese af reduceret og ikke-reduceret huTF på 15%'s polyacrylamidgeler viser ingen enkelt særskilt let kæde, selv om flere mindre, hurtigt vandrende bånd observeres (fig. 5, bane A og B) . Disse små polypeptider i 10 mindre mængde kan repræsentere urenheder, som tidligere er blevet bemærket (Broze et al., J. Biol. Chem., 260:10917- 20 {1985) og Guha et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:299-302 (1986)). For klart at løse problemet udskæres båndene på 47 og 58 kDa fra den ikke-reducerede gel, og hvert bånd 15 reduceres med dithiothreitol og underkastes særskilt SDS-PAGE på en 15%'s acrylamidgel (fig. 5, bane C og D). 58 kDa-pro-teinet opløses i en let' kæde på 12,5 kDa og en tung kæde på i 47 kDa. Når 47 kDa-proteinet undersøges, observeres der kun [ en tung kæde med samme molekylvægt. Således har begge former 20 tunge kæder med lignende opførsel ved SDS-PAGE.

For at påvise tilstedeværelsen af den lette kæde direkte immupræcipiteres -huTF med det huTF-specif ikke monoklonale antistof TF8-5G9 og underkastes elektroforese i nærværelse af reduktionsmiddel. Det større 47 kDa-bånd ob-25 serveres sammen med et særskilt bånd på ca. 12,5 kDa (fig.

6, bane A). Elektroforese af prøven uden forudgående reduktion giver bånd på ca. 47 og 58 kDa, men ikke noget polypep-tid med lav molekylvægt (fig. 6, bane B). Elektroforese af ikke-reduceret huTF giver også mindre mængder af et 90 kDa-30 protein, hvilket stemmer overens med en dimer af den tunge kæde af huTF, der er blevet foreslået af Broze et al., J.

Biol. Chem., 260:10917-20 (1985).

For at undersøge muligheden for, at den lette kæde af huTF kan være afledt proteolytisk fra den tunge kæde, 35 underkastes de lette og tunge kæder, der er isoleret ved SDS-PAGE, en N-terminal aminosyresekvensanalyse.

-----------

I DK 175703 B1 I

I I

De tunge og lette kæder adskilles ved SDS-PAGE og H

elektroblottes på aktiverede, aminoderivatiserede glasfiber- H

filtre ved anvendelse af høj-pH-værdimetoden ifølge Abersold I

I et al., J. Biol. Chem., 261:4229-4238 (1986). Proteinbåndene I

5 gøres synlige på blottene ved fluorescensfarvning ifølge ' I

H samme reference, udskæres og sekvensbestemmes, stadig bundet I

til glasfibermaterialet, i et Applied Biosystems 470A-pro- I

teinsekvensbestemmelsesapparat med on-line-HPLC-analyse af I

PTH-derivater. Alternativt gøres proteinbåndene synlige på I

10 gelen ved farvning med Coomassie-blåt og elektroelueres til I

sekvensbestemmelse. Begge metoder giver ækvivalente resul- I

H tater. I

I Mikrosekvensbestemmelse af de tunge kæder af huTF I

I giver konsekvent to samtidige aminosyresekvenser i tilnær- I

15 melsesvis ækvimolære mængder. I næsten alle tilfælde viser I

I hver aminosyrerest sig to gange med to cyclers adskillelse. I

I Dette er et tegn på forskudte N-terminusser af to varianter

I af tung kæde af huTF, der adskiller sig med to rester i I

I længde ved N-terminussen. N-terminussen af den større variant I

I 20 udledes at være Ser-Gly-X-X-Asn-Thr-Val-Ala-Ala-Tyr-X-Leu- I

Thr-Trp-Lys-Ser, hvor X betyder en uspecificeret aminosyre- I

rest. I

Flere forsøg på at sekvensbestemme den lette kæde I

har ikke givet nogen sekvensinformation, hvilket stemmer H

I 25 overens med en blokeret N-terminus. Imidlertid er den tunge I

I og lette kæde af huTF antigent forskellig, idet to kanin- I

I -anti-huTF-antisera og 28 monoklonale muse-antistoffer frem- I

I kaldt mod isoleret huTFh alle viser sig at binde til den H

I tunge kæde alene. Derfor er det usandsynligt, at den lette H

I 30 kæde er et proteolytisk fragment af den tunge kæde. Desuden H

I reagerer den lette kæde ikke med antisera mod S2"mikroglo- I

I bulin. I

I Betydningen af den 12,5 kDa lette kæde af huTF er i I

øjeblikket ukendt. Det er usandsynligt at den er blevet H

I 35 tilvejebragt kunstigt under isoleringen ved tilfældig disul- H

I fidudveksling, da den er en enkelt særskilt molekylart. Når H

53 DK 175703 B1 affinitetsisoleret huTF underkastes SDS-PAGE uden reduktion, elueres huTF-aktivitet fra gelerne svarende til både 58 kDa I og 47 kDa molekylvægtsformerne. huTF-aktiviteten svarende til disse to molekylvægtsformer påvises også, når rå hjerne 5 eller delvis isoleret placentaekstrakt underkastes elektro-forese på SDS-geler (resultater ikke vist). I alle tilfælde er aktiviteten faktor VII-afhængig, hvilket viser huTF-specifik aktivitet. Disse resultater viser, at huTFh alene kan aktivere faktor VII, og at den lette kæde ikke er nødvendig 10 til denne funktion.

Det er af interesse, at den lette kæde kun er disul-fidbundet til ca. halvdelen af de tunge kæder af huTF. Den er enten fraværende in vivo fra en væsentlig andel af huTF eller er til stede, men er tilknyttet via ikke-kovalente 15 vekselvirkninger, der kan brydes med detergenter. Den lette ! kæde af huTF kan have været ubemærket ved tidligere under søgelser, fordi den ringe størrelse vil bevirke vandring ved farvestof fronten ved SDS-PAGE, og fordi publicerede analyser af huTF er blevet gennemført efter reduktion. De 20 begrænsede mængder, der kan isoleres ved anvendelse af gængse affinitetsmetoder, gør det vanskeligt at påvise en associeret lille polypeptidkæae ved proteinfarvning.

Selv om monomert huTF vil initiere koagulering in vitro, forekommer der fysiologisk initiering af koagulering 25 ved hjælp af huTF på celleoverfladen. Man kan forestille sig, at den lette kæde kan spille mere subtile roller ved huTF-funktionen eller -organisationen, end man kan påvise ved en sædvanlig koaguleringsbestemmelse. F.eks. kan den lette kæde være involveret i samlingen af receptoren af to 30 underenheder for faktor VII, hvilket er fremsat som hypotese for at forklare den tilsyneladende positive samvirken af binding af faktor Vll/Vlla til vævsfaktor. Alternativt kan organisationen af huTF i strukturelle domæner på celleoverfladen og regulering af huTF-aktivitet på celleoverflader 35 være medieret af den lette kæde af huTF.

I DK 175703 B1 I

II I

i I

Rollen af N-bundne oligosaccharider undersøges ved I

H at deglycosylere en prøve af ^25χ-huTF. Ca. 12,74 ng af I

I mærket huTF indeholdende ca. 3,6 x 10^ tællinger pr. minut I

(cpm) blandes med 20 μΐ af en opløsning indeholdende 0,4 I

I 5 enheder glycopeptidase F {Boehringer-Mannheim Biochemicals, I

I Indianapolis, IN), 20 mM tris-HCL (pH-værdi 7,5), 20 mM I

I EDTA og 1% "Triton X-100" og holdes derefter i 16 timer ved I

37°C. De deglycosylerede produkter analyseres derefter ved I

I SDS-PAGE som ovenfor beskrevet. I

I 10 Resultaterne af deglycosyleringsunaersøgelserne, de I

er vist i fig. 7, bane 4 og 5, viser, at 58 kDa-formen af I

H huTF udviser en højere relativ molekylær end 47 kDa-formen I

på grund af tilstedeværelsen af yderligere proteindele, dvs. I

den lette kæde. I

H 15 Det således isolerede huTF relipideres til rekonsti- I

I tuering af dets prokoagulerende aktivitet. Det nødvendige I

forhold mellem vævsfaktor og lipid til tilvejebringelse af I

et relipideret vævs faktorprodukt, der har maksimal aktivitet, I

I bestemmes empirisk ved at opløse det isolerede huTF, der er I

I 20 fremstillet ovenfor, i forskellige koncentrationer i HBS- I

I -pufferopløsning {20 mM Hepes, pH-værdi 6,0, 140 mM natrium- I

I chlorid, 0,01% natriumazid) indeholdende 0,1% BSA. De for- I

skellige huTF-fortyndinger relipideres derefter som beskrevet I

I nedenfor, og det forhold, der giver den højeste rekonstitue- I

I 25 rede aktivitet som bestemt ved koaguleringsbestemmelsen I

beskrevet i eksempel 2, benyttes til senere anvendelse. I

I Lipider til relipidering af huTF fremstilles ved : I

I ekstraktion fra kaninhjerne/acetone-pulver fra Sigma Chemical

I Co., St. Louis, MO. Pulveret blandes med heptan/butanol i I

I 30 volumenforholdet 2:1 i et forhold på 25 ml heptan/butanol I

I pr. g pulver, og det faste stof indeholdt deri genvindes I

I ved filtrering ved anvendelse af sintret glastragt. Denne I

I ekstraktionsproces gentages seks gange på det tilbageværende I

I faste stof. Det tilbageværende faste stof tørres derefter i I

I 35 en rotationsfordamper, opløses i chloroform og opbevares ved I

I -80°C. Efter behov tørres portioner af det chloroformopløste I

a 55 DK 175703 B1 faste stof under nitrogen og opløses til en koncentration på 4 mg/ml i en opløsning af frisk fremstillet 0,25%'s na-triumdeoxypolat til dannelse af en kaninhjerne-phospholipid--opløsning (RBPL).

5 Til relipidering blandes 100 μΐ af hver huTF-fortyn- ding med 100 μΐ RBPL-opløsning, 0,76 ml HBS-opløsning indeholdende 0,1% bovint serumalbumin (HBS/BSA) og 40 μΐ af en 100 mM cadmiumchloridopløsning. Denne blanding holdes ved 37°C i 2 dage, og aktiviteten af huTF deri bestemmes ved 10 koaguleringsbestemmelsen beskrevet i eksempel 2.

5. Fremstilling af hybridomaer og monoklonale antistoffer.

Alle hybridomaer fremstilles ved anvendelse af milt-celler fra Balb/c-hunmus med en alder på 6-8 uger, der fås 15 fra Scripps Clinic and Research Institute's vivarium.

a. Immunisering af TF8-mus.

5 μg affinitetsisoleret huTF fremstillet i eksempel 4 opløses i normalt saltvand i en koncentration på 100 μg/ml, og kombineres og emulgeres derefter i volumenforholdet 1:1 20 med R-700-adjuvans fra Ribi Immunochem Research, Inc., Hamilton, MO. Emulsionen injiceres derefter subcutant (s.c.} i TF8-mus.

TF8-mus podes på lignende måde ca. 2 uger senere ved anvendelse af en emulsion indeholdende denatureret huTF og 25 R-700-adjuvans. Denatureret huTF fremstilles ved kogning i 5 minutter af TBS (150 mM calciumchlorid, 50 mM tris-HCl (pH-værdi 7,5)) indeholdende 0,09% "Triton X-100", 0,93% SDS, 0,2 N 2-mercaptoethanol og huTF i en mængde på 27 0 μ9/ιη1. Derefter blandes det denaturerede huTF med et lige 30 så stort volumen normalt saltvand indeholdende 0,6 mg/ml museserumalbumin. Derefter blandes 4 volumener acetone med opløsningen af denatureret huTF, og den fremkomne blanding holdes natten over ved -20°C. Det fremkomne bundfald opsamles ved centrifugering ved ca. 13.000 g i 10 minutter, vaskes én 35 gang med en blanding af acetone og vand i volumenforholdet

I DK 175703 B1 I

I ' I

4:1 og suspenderes derefter i 200 μΐ normalt saltvand i en

koncentration på 0,1 mg/ml. I

Ca. 4 uger efter den første injektion blandes 33 μg I

affinitetsisoleret (ikke-denatureret) huTF i 0,1 ml normalt I

I 5 saltvand med 0,1 ml komplet Freund's adjuvans (CFA) til I

dannelse af en emulsion. Denne emulsion injiceres derefter I

I intraperitonealt (i.p.) i TF8-mus. I

I Ca. 8 uger efter den første podning injiceres 15 I

affinitetsisoleret huTF i phosphatpufret saltvand (PBS) I

10 intravenøst (i.v.), og en identisk huTF/?BS-podning gives I

I intravenøst 24 timer senere. TF8-musenes miltceller høstes I

I til fusion 3 dage senere. I

b. Immunisering af TF9-mus. I

I TF9-mus underkastes den samme podningsplan som TF8- I

I 15 -mus, bortset fra, at der ved begge Ribi-adjuvansinjektioner anvendes huTF, der er denatureret før emulgering. Desuden fl

I indgives det første PBS-podemateriale intraperitonealt og I

I 4 1/2 måned efter det CFA-holdige podemateriale.

I c. Hvbridoma-dannelse. I

I 20 Der anvendes samme fusionsprocedure for både TF8- og

I TFS-afledte miltceller. Ca. 1 x 10® miltceller fra hver mus I

blandes med 2 x 107 P3X63 Ag8.653.1-myelomaceller i 200 μΐ I

af et fusionsmedium omfattende 30% (vægt/volumen) polyethy- I

lenglycol (PEG 4000, ATCC 25322-68-3). Efter cellefusion I

25 udsås de resulterende hybridomaer i 96-brønds plader, dyrkes I

I i HAT-medium (hypoxanthin, aminopterin og thymidin) og I

I screenes derefter for evnen til at producere antistofmole- , I

I kyler, der reagerer med huTF.

I Bade TF8- og TF9-muse-miltcelle-fusionerne resulterer I

I 30 i HAT-medium-resistente hybridoma-cellekloner. TF8-fusionen I

giver 907 HAT-resistente hybridomaer, medens TF9-fusionen I

I giver 348 HAT-resistente hybridomaer. I

* 57 DK 175703 B1 6. Screening af hybridomaer for produktion af anti-huTF-antistofmolekyler.

a. Pastfase-RIA.

100 μΐ gede-anti-muse-IgG (Boehringer-Mannheim Bio-5 chemicals, Indianapolis, IN) fortyndet til 20 ^g/ml i TBS blandes i brøndene af "Immulon" 96-brønds fleksible vinyl--mikrotiterplader (Dynatech Laboratories, Alexandria, VA) .

! Pladerne holdes derefter i 1 time ved 37°C, således at IgG

I får lov at adsorbere til væggene af brøndene. Efter vaskning 10 tre gange med TBS blandes 100 μΐ TBS/"Triton" indeholdende 3% ovalbumin i hver brønd til blokering af overskydende proteinbindingssteder.

Brøndene holdes i 1 time ved ca. 20°C, og derefter fjernes blokeringsopløsningen ved opsugning. 50 μΐ ovenstå-15 ende væske fra hybridomakultur blandes i hver brønd. Den resulterende fast fase/væske fase - i mmunoreakt i onsblanding holdes ved 37°C i 1 time. Brøndene skylles derefter tre gange med TBS, og overskud af væske·fjernes ved opsugning.

50 μΐ 125I-mærket huTF fremstillet i eksempel 4 og 20 indeholdende ca. 1 ng huTF og ca. 5 x 10^ cpm i TBS/"Triton" blandes i hver brønd til dannelse af en anden fastfase/væ-i skefase-immunoreaktionsblanding. Brøndene holdes i 2 timer ved 37°C og skylles derefter tre gange med TBS/"Triton" til isolering af de fastfasebundne 12^I-huTF-holdige immunoreak-25 tionsprodukter. Overskydende væske fjernes ved opsugning, og brøndene får lov at tørre. De enkelte brønde skæres fra hinanden, og 125j indeholdt i hver brønd bestemmes med en r-tæller.

Baggrundsradioaktiviteten (ingen reaktion af huTF 30 med antistof) er i gennemsnit ca. 200-300 cpm pr. brønd, medens positive reaktioner af huTF med antistof giver 10.000 cpm pr. brønd. Hybridomaer, der bestemmes som positive med hensyn til produktion af anti-huTF-antistoffer, udvælges og udgør hybridomaer ifølge opfindelsen. Derefter screenes 35 disse hybridomaer ved den nedenfor beskrevne dot-blot-bestemmelse .

I DK 175703 B1 I

I 58 1

I b. Dot-blot-ELISA. I

Acetoneudfældet huTF fremstillet i eksempel 4 ekstra- I

heres to gange med en blanding af acetone og vand i volumen- I

I forholdet 4:1. Det tilbageværende bundfald resuspenderes i I

5 en mængde på 20 μg/ml i TBS. 20 ng (1 μΐ) af denne huTF-ορ- I

I løsning afsættes som en plet på BA83-nitrocellulosepapir I

(Schleicher and Schuell, Keene, NH) ved siden af et tal I

skrevet på papiret med mærkeblæk. huTF afsat som en plet I

I lufttørres, og de enkelte pletter udskæres derefter til I

10 cirkulære papirskiver ved anvendelse af en perforator. De I

I ' enkelte papirstykker nedsænkes i enkeltbrønde af en bakke I

med flere brønde indeholdende "BLOTTO" (Johnson et al., I

I Gene. Anal. Tech., 1:3 (1984)) og holdes ved 37°C i ca. 1 I

time.

I 15 "BLOTTO" fjernes fra brøndene ved opsugning, og der I

I sættes 200 μΐ ovenstående væske fra hybridomakultur til I

I hver brønd. Brøndene holdes derefter ved 37°C i 2 timer. I

Papirstykkerne skylles to gange med TBS, fjernes fra brøndene I

og samles i enkelt større beholder til yderligere skylning I

I I 20 i TBS. Overskud af væske fjernes derefter fra beholderen. I

Alkalisk phosphatase-konjugeret anti-muse-IgG i pro- toblot-reagenssættet (Promega Biotech, Ann Arbor, MI) for-

I tyndes 1:5700 i BLOTTO og kontakteres med papirstykkerne. I

Protoblot-opløsningen holdes i kontakt i 30 minutter ved I

I 25 37°C. Papirstykkerne skylles derefter tre gange i TBS. Bundet H

alkalisk phosphatase påvises på papirstykkerne ved anvendelse I

I af chromogene substrater, der leveres med protoblot-sættet

I ifølge producentens anvisninger. H

c. Western blot-bestemmelse. H

I 30 Til Western-blot-bestemmelser opløses ca. 10 μg huTF

isoleret som beskrevet i eksempel 4 i prøvepuffer (2% SDS, I

I 50 mM dithiothreitol, 10% glycerol, 125 mM tris-HClt pH- I

værdi 6,8) og koges i 5 minutter. Det underkastes derefter

I SDS-polyacrylamidgel-elektroforese på en præparativ pladegel I

I 35 som beskrevet af Laemmli, Nature, 226:680 (1970) i en bred I

I bane, der på begge sider er flankeret af smalle baner in- DK 175703 B1 i } deholdende for-farvede molekylvægtstandarder (Diversified Biotech, Newton Centre, MA). Efter elektroforese og elektro-blotting på nitrocellulose som beskrevet af Towbin et al.,

Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:4350 (1979) blokeres blottet 5 med en opløsning af 5% fedtfrit mælkepulver i TBS og fastgøres i en manifold (Miniblotter: Immunetics, Cambridge, MA) . Pools af otte ovenstående væsker fra hybridomacellekul-tur anbringes i hver manifold-spalte og inkuberes i 1 time ved 37°C, hvorefter blottet fjernes og skylles med TBA (TBS 10 indeholdende 0,02% natriumazid). Baner, som har bundet antistof, gøres synlige ved anvendelse af et alkalisk phospha-tase-konjugeret andet antistof fremkaldt med et chromogent substrat (Protoblot; Promega Biotech, Madison, WI) ifølge producentens foreslåede metoder. Ovenstående væsker fra 15 kultur fra positive pools testes igen enkeltvis ved en fortynding på 1:8 i 5% fedtfrit mælkepulver/TBA til identificering af individuelle hybridoma-kloner, der producerer : anti-TF-antistoffer.

Hybridomaer, der bestemmes at være positive med hensyn 20 til produktion af anti-huTF-antistoffer, udvælges til yderligere karakterisering. F.eks. karakteriseres hybridomaer fra den ovennævnte TF8-fusion som anti-huTF-antistofproducerende hybridomakulturer, hvis de ovenstående væsker fra hybridomakulturen udviser immunoreaktion med huTF ved dot-25 -blot-bestemmelsen beskrevet i eksempel 6b og fastfase-RIA beskrevet i eksempel 6a. Denne karakterisering giver fire TF8-hybridoma-cellelinier som vist i tabel 5 i eksempel 13.

Hybridomaer fra TF9-fusionen karakteriseres som anti--huTF-antistofproducerende hybridomakulturer, hvis de oven-30 stående væsker fra hybridomakulturen udviser immunoreaktion med huTF ved fastfase-RIA beskrevet i eksempel 6a og ved Western blot-bestemmelsen beskrevet i eksempel 6c. Denne karakterisering giver 24 TF9-hybridoma-cellelinier, hvoraf de fleste er vist i tabel 5 i eksempel 13.

35 Antistofmolekyler produceret af et bestemt hybridoma, der er udvalgt ved de ovennævnte screeningsmetoder, betegnes

I DK 175703 B1 I

I 60 1

i den foreliggende beskrivelse ved tegn, der viser 1) den I

H immuniserede mus (dvs. TF8 eller TF9), der giver miltceller I

I til en bestemt fusion, og 2) 96-brønds kulturpladen, ræk- I

kenummeret og brøndnummeret, som den særlige HAT-resistente I

H 5 hybridomacelle er isoleret fra (dvs. 5B7, 11D12 osv.). I

7. Isolering af immunoglobulin IqG I

Immunoglobulin IgG isoleres fra ascitesvæsken af en I

mus indeholdende musehybridoma-cellelinien TF8-5G9 (ATCC I

I nr. HB9382) ved anvendelse af et Biorad Laboratories MAPS I

10 II system ifølge producentens anvisninger. Proteinkoncentra- I

I tionen af det isolerede IgG bestemmes ved anvendelse af "BCA I

Protein Assay Reagent" (Pierce Chemical Co.) ifølge produ-

centens anvisninger. I

8. Fremstilling af en anti-huTF-holdig fast bærer I

15 til immunoaffinitetsisolering af huTF I

Anti-huTF-antistoffer aktiveres til kobling til en I

fast matriks af agarose ved dialysering af 10 mg MAPS-iso- I

leret monoklonalt TF8-5G9-antistof, fremstillet som beskrevet I

i eksempel 7, mod 500 ml af en dialysepuffer bestående af I

I ^ 2 0 0,1 M MES, pH-værdi 6,5, i 16 timer ved 4°C med mindst én I

H udskiftning af dialysepufferen. De aktiverede TF8-5G9-anti- I

I stoffer blandes derefter med 2 ml "AffiGel-10"-agaroseperler I

(Biorad), og den fremkomne koblingsreaktionsblanding forar- I

bejdes ifølge producentens anvisninger til dannelse af en I

25 fast bærer af TF8-5G9/agarose. I

Overskydende proteinbindingssteder på den faste bærer I

blokeres derefter, og der vaskes og vakuumfiltreres som I

I beskrevet i eksempel 3 til dannelse af en TF8-5G9/agarose- I

I -kage. I

30 9. Immunoaffinitetsisolering af huTF I

I Hjerneekstraktopløsning svarende til ca. 1/2 menne- I

I skehjerne, dvs. ca. 100 ml, og fremstillet som i eksempel 1 I

dialyseres i 3 dage med to udskiftninger mod i alt 6 liter I

puffer A ved 4°C. Den dialyserede hjerneekstrakt centrifu- I

I 35 geres derefter ved 10.000 g i 1,5 timer. Den fremkomne oven- I

I stående væske blandes med glycinethylester-agarose-kagen I

! 61 DK 175703 B1 fremstillet i eksempel 4 til dannelse af en fastfase/væ-skefase-reaktionsblanding. Efter bibeholdelse ved stuetemperatur i 2 timer under rotering adskilles den faste fase og væskefasen ved filtrering under anvendelse af en sintret 5 glastragt. Den huTF-holdige væskefase fraskilles og blandes med TF8-5G9/agarose-kagen fremstillet i eksempel 8 til dannelse af en fastfase/væskefase-immunoreaktionsblanding.

Immunoreaktionsblandingen holdes nattes over ved 4°C under rotering for at muliggøre dannelse af et vævsfaktor-10 holdigt fastfase-immunoreaktionsprodukt. Den faste fase og væskefasen adskilles derefter ved filtrering som ovenfor beskrevet. Den faste fase beholdes og vaskes derefter med 10 volumener puffer A. Den faste fase overføres derefter til en glaschromatografisøjle og vaskes successivt med 1) 15 to volumener 1 M natriumchlorid indeholdende 1% "Triton ; X-100" og 2) to volumener 0,1 M glycin, pH-værdi 4,0, in deholdende 1% "Triton X-100".

huTF, som er bundet immunogisk til den faste bærer efter de ovennævnte vaskninger, frigøres (elueres) derefter 20 ved vaskning af den faste bærer, medens den tilbageholdes på en sintret glastragt, med 2 0 ml 0,1 M glycin, pH-værdi 2,5, og 1% "Triton X-100". Elueret materiale opsamles, undersøges for huTF, pooles og dialyseres, alt som beskrevet i eksempel 4.

25 Dialvsatet blandes derefter med fire volumener kold acetone til udfældning af huTF-proteinet. Bundfaldet opsamles ved centrifugering ved 5.000 g i 30 minutter ved ca. -10°C.

Den fremkomne pellet tørres under nitrogen, og en portion af pelieten analyseres ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese 30 (SDS-PAGE) under denaturerende betingelser.

Resultaterne af denne analyse, der er vist i fig. 8, viser, at huTFh kan immunoaffinitetsisoleres med et udbytte på 33 mg huTFh pr. g delipideret hjernepulver.

li DK 175703 B1 I

I I

10. Inhibering af koagulering med anti-huTF-antistof- I

I fer. I

H 10 fil af ovenstående væske af en hybridomakultur I

I blandes med 90 μΐ HBS/BSA indeholdende ca. 2 ng af det re- I

H 5 lipiderede huTF fremstillet i eksempel 4. Immunoreaktions- I

I i blandingerne dannet på denne måde holdes ved 37°C i 30 mi- I

I nutter for at gøre det muligt for anti-huTF-antistofmoleky- I

I lerne at binde huTF immunologisk og danne et immunoreak-

tionsprodukt. Immunoreaktionsblandingerne undersøges derefter I

I 10 for huTF-prokoagule.ringsaktivitet som beskrevet i eksempel I

2. Et irrelevant IgG-præparat anvendes i stedet for anti- I

I huTF-antistof som negativ kontrol.

En effektiv huTF-koncentration ekstrapoleres ud fra I

i standardkurven dannet som i eksempel 2 ved anvendelse af I

I 15 den målte koaguleringstid i nærværelse af inhibitor. In- I

I hiberingen udtrykkes som det procentiske forhold mellem den

I effktive huTF-koncentration og den faktisk anvendte huTF- I

-koncentration. Præparater af monoklonalle antistoffer, der I

I giver mindst 50% inhibering, udvælges som neutraliserende I

20 antistofpræparater ifølge opfindelsen. I

Adskillige ovenstående væsker fra kulturerne af hy-

bridomaer dannet mod isoleret huTF som beskrevet i eksempel I

5 måles ved den ovennævnte procedure for deres evne til at I

inhibere initiering af koagulering. Hybridomaer, der visér I

I 25 sig at give en væsentlig inhibering af initieringen af koa- I

gulering, er anført i tabel V. I

I Inhibering af koagulering med anti-huTF-antistoffer I

I er også blevet opnået ved anvendelse af forud dannede huTF- I

I -faktor VII-komplekser. 10 μΐ indeholdende ca. 1 ng relipi- I

I 30 deret huTF fremstillet i eksempel 4 blandes med 70 μΐ HBS/- I

BSA, 10 μΐ 20 mM calciumchlorid og, hvor det er anført, 10 I

μΐ indeholdende ca. 25 ng faktor VII fremstillet som be- I

I skrevet i eksempel 3. Denne blanding holdes ved 37°C i 15 I

I minutter for at gøre det muligt for huTF at danne et kompleks I

I 35 med eventuel faktor VII, som foreligger i blandingen. Der- I

I efter iblandes der yderligere 10 μΐ af en opløsning indehol- I

* DK 175703 B1 63 dende ca. 10 ng MAPS-isoleret monoklonalt antistof fremstillet som beskrevet i eksempel 7, og denne anden blanding holdes ved 37°C i 30 minutter. Inhibering af koagulering måles derefter i den resulterende blanding ved først at 5 tilsætte 100 μΐ 20 mM calciumchlorid og derefter 100 μΐ af enten humant citratplasma eller faktor VII-frit plasma fremstillet som beskrevet i eksempel 12 og observere koaguleringstiden i sekunder. Den procentiske inhibering udtrykkes som beskrevet i eksempel 10, og resultaterne af disse in-10 hiberinger med forud dannet huTF-faktor VII-kompleks er vist i tabel 6a.

15 20 25 30 35

I DK 175703 B1 I

I I

I Tabel 6 I

Inhibering af huTF-faktor VII-initieret I

koagulering med anti-huTF-antistoffer I

51. Koagulering med citratbehandlet humant plasma I

I Antistof Fakcor VI1^) % Inhibering H

I Blind3^ + 0 I

I TF8-5G9b) + 58% I

I i Kontrol0^ + 0 I

I 10 TF8-5G9 · - 83% I

I Kontrol 0 I

II. Koagulering med faktor VII-frit humant plasma I

: Antistof Faktor VII % Inhibitor I

I Blind + 0 I

I 15 TF8-5G9 + 58% I

I Kontrol + 0 I

I s) "Blind" betegner, at der ikke anvendes monoklonalt anti- I

stof ved bestemmelsen. I

20 b) "TF8-5G9" betegner, at det monoklonale antistof isoleret I

I fra hybridoma TF8-5G9 er antistoffet anvendt ved bestem- I

I melsen. I

I c) "Kontrol" betegner, at et irrelevant monoklonalt antistof I

er antistoffet anvendt ved bestemmelsen. I

I 25 "+" betegner, at faktor VII tilsættes og får lov at danne I

I et kompleks med renset huTF, før antistof sættes til I

blandingen. I

I ' Yderligere undersøgelser af inhibering af koagulering H

I . 30 med anti-huTF-antistoffer er gennemført under betingelser, I

I hvorved man sammenligner inhiberingen før og efter at TF er H

I associeret til faktor VII/VIIa til dannelse af et TF:faktor H

I Vli/VIIa-kompleks. I

I Ved disse undersøgelser gennemføres inhiberingen af I

I 35 koagulering med anti-huTFh-antistoffer ved anvendelse af I

I forud dannede TF:VI1/VIla-komplekser i det væsentlige som I

beskrevet ovenfor i eksempel 10, bortset fra at de anvendte I

I 10 nliter opløsning indeholdende monoklonalt antistof er I

DK 175703 B1 65 ovenstående væske fra hybridomakultur i stedet for en opløsning indeholdende MAPS-isoleret monoklonalt antistof. Til , sammenligning vurderes inhiberingen af koagulering med anti- huTF-antistoffer ved dannelse af immunokomplekser mellem 5 disse antistoffer og relipideret huTF før blanding med citratbehandlet plasma indeholdende faktor Vll/Vlla som beskrevet ovenfor i eksempel 10.

Selv om alle de her beskrevne antistoffer undersøges ved denne sammenlignende inhiberingsbestemmelse, anses kun 10 de antistoffer, der udviser en mere end ca. 60%'s inhibering, for at have en væsentlig evne til at inhibere koagulering I initieret af et huTF:VII/VlIa-kompleks. Disse monoklonale antistoffer er TF9-1B8, TF9-5B7, TF8-5C4, TF8-11D12 og TF8-21F2 .

15 11. Polypept idsvntese

Polypeptiderne svarende til de forskellige huTFh-regioner, som anvendes her, syntetiseres kemisk på en Applied Biosystems Model 430A Peptide Synthesizer ved anvendelse af ; 20 den symmetriske anhydrid-metode ifølge Hagenmaier, et al.,

Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 353:1973 (1982). Ud over polypeptiderne anført i tabel 1 og 2 syntetiseres også polypeptiderne anført i tabel 3 nedenfor og udgør polypeptider ifølge den foreliggende opfindelse, der er anvendelige til 25 produktion af anti-polypeptid-antistoffer, der kan reagere med huTFh.

Tabel 3

Antigene polypeptider

30 pl21-155 H-TKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTL-OH

p204 -226 H-DSPVECMGQEKGEFREIFY11GA-OH

p225-244 H-GAWFWIILVIILAISLHK-OH

p245- 263 H-CRKAGVGQSWKENS PLNVS-OH

35 12. Inhibering af koagulering med polypeptider Η

I DK 175703 B1 I

I 66 I

I Evnen af polypeptiderne ifølge opfindelsen til at I

inhibere huTF-initieret koagulering bestemmes ved først at I

inkubere polypeptiderne i nærværelse af faktor Vll/VIIa og . I

H calciumioner oq derefter sætte denne blanding til faktor I

j 5 VII/VIIa-frit plasma og vurdere koaguleringstiderne. I

H Human faktor Vll/VIIa isoleres som beskrevet i eksem- I

pel 3. 10 μΐ^ετ af en opløsning af 200 ng af denne isolerede I

I faktor Vll/VIIa pr. ml HBS/BSA sættes til en opløsning om- I

fattende 100 μΙ^εΓ HBS, 20 >liter 25 mM calciumchlorid og I

I 10 100 μΐΐίθτ TBS/"Triton" indeholdende syntetisk polypéptid. I

H Der fremstilles på denne måde adskillige blandinger, der I

indeholder forskellige koncentrationer af polypeptidet, og I

I de holdes derefter ved 37°C i 15 minutter. Relipideret vævs- I

faktor fremstillet som beskrevet i eksempel 4 fortyndes i I

I 15 H3S/BSA, således at 10 μϋίθΓ vil give en koaguleringstid I

på ca. 45 sekunder ved undersøgelse ved koaguleringsbestem- I

I melsen beskrevet i eksempel 2. Den ovenfor nævnte blanding I

blandes yderligere med denne 10 μ1ϊίθΓ5 fortynding af reli- I

I pideret huTF, med 100 μΐίίετ 25 mM calciumchlorid og med I

I 20 100 μΙ^θΓ faktor VII/VIIa-frit plasma (George King Bio- I

I , Medical, Inc., Overland Park, KA) fortyndet i forholdet 1 I

I del plasma til 1,5 dele HBS. Koaguleringstiden bestemmes I

I derpå og afsættes som beskrevet i eksempel 2. Én forlængelse I

af koaguleringstiden viser inhibering af koagulering' med I

I 25 det syntetiske polypéptid. Den procentiske inhibering bereg- I

I nes som beskrevet i eksempel 10. Polypeptider, der giver I

mindst 30% inhibering af koagulering, betragtes som huTFh- I

I bindingssted-polypeptidanaloge, dvs. polypeptiderne ρ2β-49, I

pl46-167 og pl61-189 som vist i afsnit I i tabel 4. I

I 30 Alternativt er der ved den ovenfor beskrevne inhibe- I

ringsbestemmelse blevet anvendt faktor VII/VIIa-frit plasma I

I fremstillet ud fra plasma, der er befriet for faktor Vll/VIIa I

I ved immunoaffinitetsadsorption med monoklonale antistoffer. I

I Et monoklonalt antistof mod human faktor Vll/VIIa fremstilles I

35 i det væsentlige som beskrevet i eksempel 5, bortset fra at I

I faktor Vll/VIIa isoleret som beskrevet i eksempel 3 anvendes I

DK 175703 B1 67 som immunogen i stedet for huTF. De resulterende hybridomaer vurderes ved ELISA til identificering af et hybridoma, som ikke reagerer med de humane blodproteiner protein S, faktor IX, faktor X og faktor II, der kan fås fra Enzyme Research 5 Laboratories, Inc., South Bend, IN. Et sådant hybridoma FV11. FI.2H3-3.2 kan fås fra Dr. T.S. Edgington (Scripps Clinic and Research Foundation, La Jolla, CA) . Immunoglobulin IgG isoleres fra ascites fra en mus indeholdende hybridoma FV11 F1.2H3-3.2, og det isolerede IgG konjugeres til en 10 fast bærer som beskrevet i eksempel 8. Den fremkomne faste bærer indeholdende monoklonalt faktor VII/VIIa-antistof anvende til at fjerne faktor VII/VIla fra poolet normalt citratbehandlet plasma ved anvendelse af immunoaffinitets-proceduren beskrevet i eksempel IX, bortset fra, at væs-15 kefasen indeholdende plasma opsamles og beholdes.

Evnen af nogle af polypeptiderne til kompetitivt at inhibere koagulering ved anvendelse i lipideret form vurderes ved den ovennævnte bestemmelse ved at anvende 100 μΐiter lipideret syntetisk polypeptid i stedet for de 100 μliter 20 opløsning af syntetisk polypeptid.

Lipiderede syntetiske peptider fremstilles som beskrevet i eksempel 4 for relipidering af isoleret huTF, bortset fra at der anvendes syntetisk polypeptid i stedet for isoleret huTF. Der anvendes rutinemæssigt vægtforholdet 25 52:1 mellem lipid og polypeptid. Lipiderede polypeptider, der giver mindst 30% inhibering af koagulering, betragtes som huTFh-bindingssted-polypeptidanaloge, når de foreligger i lipideret form, dvs. polypeptiderne anført i afsnit II i tabel 4.

30 35

I DK 175703 B1 I

t

I

I Tabel 4 I

Inhibering af huTF-initieret koagulering med ' I

I polypeptidanaloge af huTFh I

I 5 Peptid Inhibering5 Koncentration I

H

I. Ikke-phospholipiderede peptider

I pl-30 25,0 10 μΜ I

I p26-49 88,8 10 μΜ I

I . p41-71 25,0 10 μΜ I

I 10 p40-49 25,0 10 μΜ I

I p56-71 25,0 10 μΜ I

p72-104 25,0 10 μΜ I

I p94-123 20,0 10 μΜ I

I pl21-155 10,0 10 μΜ I

I 15 pl46-167 87,5 10 μΜ I

I P161-189 32,5 10 μΜ I

I pl90-209 20,0 10 μΜ I

I p204-226 20,0 10 μΜ I

I I

I 20 I

II. Phospholipiderede peptider I

I pl-30 81,0 10 μΜ I

I ρ26-40 83,0 10 μΜ I

p40-71 65,0 10 μΜ I

I 25 p50-71 73,3 30 μΜ I

p94-123 93,7 10 μΜ I

I pl21-155 55,0 10 μΜ I

pl46-167 80,0 10 μΜ I

I Ρ161-189 94,0 10 μΜ , I

30 ___ I

I a De procentiske inhiberinger bestemmes som beskrevet i I

eksempel 12. I

I Eksempler på dosis/reaktions-kurver opnået ved gen- I

I 35 nemførelse af de ovennævnte polypeptid-inhiberingsundersø- I

I gelser er vist i fig. 9 og 10 I

DK 175703 B1 69 13. Inhibering af antistof-huTF- -immunoreaktion med oolvpeotider

Brøndene af "Immulon" plader med 96 brønde (U-bund) fremstillet af fleksibelt vinyl (Dynatech) overtrækkes med 5 gede-anti-muse-IgG (Boehringer-Mannheim) som beskrevet i eksempel 6, bortset fra at blokeringen af overskydende proteinbindingssteder gennemføres i 20 minutter ved 37°C.

50 //liter af ovenstående væske fra hybridomakultur anbringes i hver brønd og holdes i 1 time ved 37°C. Brøndene 10 skylles derefter tre gange med TBS, og væskeoverskud fjernes ved opsugning.

Isoleret huTF fremstilles på immunoaffinitetssøjler som beskrevet i eksempel 9. Det fremkomne acetonebundfald indeholdende isoleret huTF opløses i TBS/"Triton", og pro-15 teinkoncentrationen bestemmes ved anvendelse af "BCA Protein Assay Reagent" (Pierce) ifølge producentens specifikationer. Kulhydrat-sidegrupper på huTF biotinyleres ved anvendelse af biotin-hydrazid {ICN Biomedicals Inc., Plainview, NY) ved metoden beskrevet af O'Shannessy et al., Immunol. Let-20 ters, 8:273-277 (1984) til dannelse af en opløsning af bioti ny le ret huTF.

50 /tliter af en opløsning af biotinyleret huTF fremstillet til 60 ng/ml af TBS/"Triton" anbringes derefter i hver brønd sammen med 5 μ.Μ syntetisk polypeptid og holdes i 25 en time ved 37°C. Brøndene skylles derefter tre gange med TBS/"Triton".

100 /tliter streptavidin-konjugeret alkalisk phosphatase (Detek. i-alk, Enzo Biochem Inc., New York, NY) fortyndet 1:100 i TBS indeholdende 5 mM EDTA, 0,5% "Triton X-100" og 30 1% BSA anbringes i hver brønd og holdes i 30 minutter ved 37°C. Brøndene skylles derefter fire gange med en opløsning indeholdende 10 mM kaliumphosphat (pH-værdi 6,5), 2% BSA, 0,5% "Triton X-100", 0,5 M natriumchlorid og 1 mM EDTA, efterfulgt af en enkelt skylning med detektionspuffer (0,1 35 M Tris-HCl (pH-værdi 8,8), 0,1 M natriumchlorid, 5 mM mag-nesiumchlorid).

I DK 175703 B1 I

U 70

i 100 pliter af en opløsning indeholdende 2 mM p-nitro- I

phenylphosphat i detektionspuffer sættes derefter til hver I

I brønd og holdes i 1 time ved 37°C. Den optiske absorption I

ved 405 nm måles derefter for hver brønd ved anvendelse af I

5 en Bio-Tek-mikropladelæser (Bic-Tek Instruments, Winooski, '

I VT). I

Resultaterne af undersøgelsen af kompetitiv inhibering I

er vist i tabel 5. I

DK 175703 B1 71

Tabel 5

Oversigt over peptidvekselvirkninger med monoklonale antistoffer 5

Maba) ABCDEFGHIJK

TF85G9 + I TF811D12 + TF85C4 + 10 TF821F2 + TF91D5 + + + TF92C4 + + + + TF92F6 + + TF95C7 + + + + 15 TF96B4 + + TF99C3 + + + + TF910C2 + + TF91F1 + TF91E7 + + + 20 TF91B8 + + + TF91B9 + TF94D11 + + + TF95G4 + + TF95B7 + + 25 TF96G4 + TF97E10 + + j TF98E8 + + + TF99E1 + + + TF99B4 + + 30 TF96C8b) + + + TF910H5b) + + TF99D6b> + + TF910 H10b> + - + + 35 A = pi-30, B = p2 6-49, C = p40-7l, D = p41-49, E = p56-71, F = p72-104, G = p94-123, Η = pl21-155, I = D146-167, J = ρΙδΙ-189, K = pi 90 - 2 09

I DK 175703 B1 I

I 72 I

a Hvert monoklonalt antistof (Mab) produceres af et hybri- I

doma med samme betegnelse. Alle monoklonale antistoffer I

screenes ved anvendelse af ovenstående væsker fra hybri-

I domakultur som beskrevet i eksempel 13. . I

I 5 ^ Disse antistoffer betragtes som ikke-neutraliserende I

I ifølge resultaterne i eksempel 10. Alle andre antistoffer I

betragtes som neutraliserende ifølge disse samme resul- I

tater. I

H 10 Inhibering betragtes som signifikant, hvis den målte I

I absorptionsværdi i nærværelse af polypeptid er mere end en I

H standardafvigelse fra middelværdien opnået for et givet I

antistof i fraværelse af polypeptid. I

15 14. Påvisning af huTF i en kropsprøve ved to-steds ELISA I

huTF kan påvises i en kropsprøve, såsom blod, plasma, I

I spyt, urin osv., ved anvendelse af to monoklonale antistof- I

I 1 fer, der sideløbende kan binde det samme huTF-molekyle. I

I Immulon"-polystyrenplader med 96 brønde med U-bund I

I 20 (Dynatech) overtrækkes med gede-anti-muse-IgG (Boehringer- I

I Mannheim) ved, at der i hver brønd først anbringes 100 μlitex I

af IgG fortyndet til 10 μg/ml i TBS, og IgG-opløsningen I

derefter holdes i kontakt med brønden natten over ved 4°C. I

I Brøndene skylles tre gange med TBS, og 100 μϋΡβΓ TBS/"Tri- I

I 25 ton" indeholdende 3% BSA sættes til hver brønd. Brøndene I

I holdes derefter i 1 time ved 37°C, skylles tre gange med I

TBS, og overskydende væske fjernes ved opsugning. : I

I 100 μϋΐθΓ af en anti-huTF-antistofmolekylholdig - i I

ovenstående væske fra en kultur af et første hybridoma, I

30 TF9-6B4, blandes i hver brønd og holdes i 1 time ved 37°C. I

I Brøndene skylles derefter tre gange med TBS, og overskydende I

I væske fjernes ved opsugning. I

I Immunoaffinitetsisoleret og acetoneudfældet huTF I

I fremstillet som i eksempel 9 opløses i TBS/"Triton". Fortyn- 1 I

I 35 dinger af huTF-opløsningen fremstilles i området fra 5 μ9/κι1 I

I til 0,5 ng/ml af TBS/"Triton", og 100 μΙ^εΓ af en fortynding j I

I 1 I

DK 175703 B1 ! 73 anbringes i en brønd af "Immulon"-pladen. Fortyndingerne af huTF holdes i kontakt med det første antistof i 1 time ved , 37°C. Fortyndingerne fjernes derefter, og brøndene skylles tre gange med TBS/"Triton". Overskydende væske fjernes ved i 5 opsugning.

Anti-huTF-antistoffer MAPS-isoleres fra ascites af et andet hybridoma, TF9-10H10, ved metoderne beskrevet i eksempel 7. Den fremkomne antistofopløsning måles for protein og mærkes derefter ved biotinylering som beskrevet i eksempel 1 10 13.

Det biotinylerede anti-huTF-antistof fortyndes til 60 mg/ml af TBS/"Triton", og 100 μΙ^βΓ af denne opløsning blandes i hver brønd. Brøndene holdes ved 37°C i 1 time og skylles derefter tre gange i TBS/"Triton".

15 Det bundne biotinylerede anti-huTF-antistof påvises derefter ved anvendelse af Detek I-alk systemet beskrevet i eksempel 13. De monoklonale antistoffer, der anvendes som det første og andet antistof ved denne bestemmelse, kan varieres, så længe de har evnen til at binde sideløbende 20 til huTF. Når TF9-6B4 er anvendt som det første antistof, kan f.eks. TF9-11D12 anvendes som det andet antistof i stedet for TF9-10H10. Opfindelsen omfatter således enhver kombination af antistoffer, der kan binde sideløbende ved denne bestemmelse.

25 15. Konstruktion af et DNA-segment indeholdende hele den pre-huTFh-kodende sekvens

Et DNA-segment indeholdende hele den pre-huTFh-kodende . sekvens kan konstrueres på følgende måde ved anvendelse af 30 de rekombinante plasmider pCTF64, pCTF403 og pCTF314, hvis restriktionskort er vist i fig. 11, og procedurer, der er velkendte, se f.eks. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, ΝΎ (1983).

35 Indsats-segmenterne indeholdt i de rekombinante DNA- plasmider vist i fig. 11 har EcoRI-linkeren 5'-GGAATTCC-3' Η

I DK 175703 B1 I

I 74 I

(Collaborative Research Lexington, MA) ved hver terminus I

for at lette kloningsprocessen. Disse linkersekvenser er I

ikke til stede i nukleotidsekvensen vist i fig. 2, idet de I

ikke er en del af den naturligt forekommende huTFh-DNA-ko- I

5 dende sekvens. For at de følgende beskrivelser af konstruk- ' I

tion af rekombinante DNA-molekyler kan være klare med hensyn I

til de involverede huTFh-DNA-sekvenser, vil segmenter dannet I

ved nedbrydninger, der omfatter EcoRI-terminusser og således I

kan indeholde disse yderligere linkersekvenser, blive beteg- I

10 net ved nukleot i dba senummeret vist i fig. 2. Det vil forstås, I

at segmenterne kan indeholde disse yderligere sekvenser ved I

deres terminusser. I

Plasmid pCTF64 nedbrydes med restriktionsendonuk- I

leaserne EcoRI og Drain til dannelse af et DNA-segment I

15 omfattende en nukleotidsekvens svarende til sekvensen vist I

i fig. 2 fra baserest nr. 1 til rest nr. 296. Segmentet på I

H 302 nukleotid-basepar (bp) produceret på denne måde isoleres I

ved størrelsesfraktionering under anvendelse af en agarosegel I

og dephosphoryleres derefter ved behandling med alkalisk I

20 phosphatase. I

I Plasmid pCTF403 nedbrydes med restriktionsendonu- I

I kleasen EcoRI til dannelse af et DNA-segment omfattende en

H nukleotidsekvens svarende til sekvensen vist i fig. 2 fra I

I ' rest 776 til rest nr. 1125. Det resulterende 352 bp segment I

I 25 isoleres ved størrelsesfraktionering under anvendelse af en I

I agarosegel. I

I Plasmid pCTF314 nedbrydes med restriktionsendonu-

I kleasen EcoRI, og det resulterende 647 bp segment isoleres . I

I ved størrelsesfraktionering. Dette segment omfatter en nu- I

I 30 kleotidsekvens, der svarer til sekvensen vist i fig. 2 fra I

rest nr. 13 5 til rest nr. 775. 647 bp segmentet isoleres I

I ved størrelsesfraktionering og dephosphoryleres ved alkalisk I

phosphatase. I

I 3 52 bp segmentet og det dephosphorylerede 647 bp I

I 35 segment forbindes derefter operativt (ligeres) ved reaktion I

I med T4-DNA-ligase, hvorved der dannes et 999 bp segment, I

DK 175703 B1 75 der har en nukleotidsekvens svarende til sekvensen vise i fig. 2 fra rest nr. 135 til rest nr. 1125. 999bp segmentet • nedbrydes, derefter med restriktionsendonukleasen Dralll, der spalter 999 bp segmentet ved en position mellem baseres -5 terne 296 og 297 vist i fig. 2, hvorved der dannes et 168 1 bp segment og et 831 bp segment. Det dephosphorylerede 302 bp segment og 831 bp segmentet forbindes derefter operativt ved anvendelse af T4-DNA-ligase til dannelse af et 1125 bp segment omfattende en nukleotidsekvens svarende til sekvensen 10 vist i fig. 2 fra rest nr. 1 til rest nr. 1125.

Kloningsplasmidvektoren pUC8 lineariseres ved nedbrydning med EcoRI. Det ovenfor fremstillende 1133 bp segment og denne EcoRI-nedbrudte vektor forbindes operativt ved anvendelse af T4-DNA-ligase til dannelse af det cirkulære 15 rekombinante DNA-molekyle pUC-pre-huTFh.

E. coli stamme RR1 (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD) transformeres med pUC-pre-huTFh, og vellykkede transformanter udvælges på basis af ampicillinresi-stens. De udvalgte transformanter klones derefter og screenes 20 for tilstedeværelse af et rekombinant DNA-molekyle, der har pre-huTFh-strukturgenet.

Screeningen for tilstedeværelse af rekombinante DNA-molekyler, der har pre-huTFh-strukturgenet, gennemføres ved at nedbryde rDNA fra hver udvalgt transformant med EcoRI.

25 De resulterende EcoRI-fragmenter opløses i et mønster efter størrelse på en agarosegel. Rekombinante DNA-molekyler, som giver et mønster af tre bånd svarende til DNA-segmenter på 352, 781 og 2682 bp, indeholder pre-huTFh-strukturgenet. E. coli RR1-transformanter, som har rDNA, der giver det ovenfor 30 beskrevne EcoRI-nedbrydningsmønster, indeholder et rekombinant DNA-molekyle ifølge den foreliggende opfindelse og udvælges (beholdes).

Et DNA-segment, der indeholder en væsentlig del af : den pre-huTFh-kodende sekvens omfattende den ekstracellulære 35 forankringsregion, men mangler transmembran-forankringsre-

I DK 175703 B1 I

I

li I

gionen ved carboxyterminussen og derved koder for et opløse- I

ligt huTFh-protein, konstrueres på følgende måde. I

Plasmid pCTF64 nedbrydes med restriktionsendonukleasen I

EcoRI til dannelse af et DNA-segment omfattende en nukleo- I

5 tidsekvens svarende til sekvensen vist i fig. 2 fra rest I

n'r. 1 til rest nr. 486. Segmentet på 486 nukleotid-basepar I

(bp) fremstillet på denne måde isoleres ved størrelsesfrak- I

tionering under anvendelse af en agarosegel og dephosphory- ' I

leres derefter ved behandling med alkalisk phosphatase. Det I

10 dephosphorylerede 486 bp segment nedbrydes derefter med I

restriktionsendonukleasen Drain, der spalter 486 bp segmen- I

tet ved en position mellem base nr. 296 og 297 vist i fig. I

2, hvorved der dannes et 296 bp segment og 190 bp segment. I

296 bp segmentet isoleres ved størrelsesfraktionering under I

H 15 anvendelse af en agarosegel. I

Plasmidet pCTF314 nedbrydes med restriktionsendonu- I

kleasen EcoRI til dannelse af et DNA-segment omfattende en

H nukleotidsekvens svarende til sekvensen vist i fig. 2 fra I

rest nr. 135 til rest nr. 775. Det resulterende 641 bp seg- * I

20 ment isoleres ved størrelsesfraktionering under anvendelse I

af en agarosegel og dephosphoryleres derefter ved behandling I

med alkalisk phosphatase. Det dephosphorylerede 641 bp seg- . I

I ment nedbrydes derefter med Dralll, der spalter 641 bp seg- H

mentet ved en position mellem baserest nr. 296 og 297 vist t I

25 i fig. 2, hvorved der dannes et 162 bp segment og et 479 bp ' I

H segment. 479 bp segmentet isoleres ved størrelsesfraktione- I

1' ring under anvendelse af en agarosegel. H

De ovenfor fremstillede segmenter på 296 og 479 bp I

I forbindes derefter operativt (ligeres) ved reaktion med T4-

30 DNA-ligase, hvorved der dannes et 775 bp segment, der har I

I en nukleotid-adapter-sekvens svarende til sekvensen vist i I

I fig- 2 fra rest nr. 1 til rest 775. I

I Kloningsplasmidvektor pUC18 lineariseres ved nedbryd- ; I

ning med EcoRI. Det ovenfor fremstillede 775 bp segment og : I

35 den EcoRI-nedbrudte vektor forbindes operativt ved anvendelse 1 I

DK 175703 B1 i j i 77 i af T4-DNA-ligase til dannelse af det cirkulære rekombinante DNA-molekyle pUC-pre-huTFh-T.

E. coli RR1 transformeres med pUC-pre-huTFh-T, og ampicillinresistente transformanter, dvs. kloner indeholdende 5 pUC-pre-huTFh-T, udvælges.

Det rekombinante DNA-molekyle pUC-pre-huTFh-T nedbrydes med EcoRI, og det resulterende 775 bp segment isoleres ved størrelsesfraktionering.

Syntetiske oligonukleotid-adaptersegmenter med se-10 kvenserne: 5'-AATTTAGAGAATAAGAATTCGGG- 31 og 3'-ATCTCTTATTCTTAAGCCC-51 fremstilles ved metoden ifølge Caruthers et al., J. Am.

Chem. Soc., 103:3185 (1981), og Gait et al., Cold Spring 15 Harbor Symp. Quant. Biol., 47:393 (1983), bortset fra, at de således fremstillede oligonukleotider ikke phosphoryleres med polynukleotid-kinase for at forhindre operativ binding (Tigering) af disse oligonukleotider til hinanden. Oligonu-kleotiderne kondenseres til dannelse af et dobbeltstrenget 20 DNA-linker-segment indeholdende en klæbende EcoRI-terminus og en stump terminus ved metoderne ifølge Rotherstein et al.. Methods in Enzymol. , 68:98 (1979) . Dette linker-segment forbindes derefter operativt til 775 bp segmentet fremstillet ud fra pUC-pre-huTFh-T til dannelse af et 817 bp segment 25 indeholdende et kondenseret segment ved hver ende af 775 bp segmentet. Det resulterende 817 bp segment nedbrydes derefter med EcoRI til omdannelse af hver terminus af 817 bp segmentet fra en stump ende til en EcoRI-klæbende ende, hvorved der dannes et 805 bp segment. Det resulterende 805 bp segment 30 isoleres ved størrelsesfraktionering under anvendelse af en agarosegel.

Kloningsplasmidvektoren pUC18 lineariseres ved nedbrydning med EcoRI. Det ovenfor fremstillede 805 bp segment og den EcoRI-nedbrudte vekcor forbindes operativt ved anven-35 delse af T4-DNA-ligase til dannelse af det cirkulære rekombinante DNA-molekyle pUC-pre-huTFh-TR.

I DK 175703 B1 I

I I

E. coli RR1 transformeres med pUC-pre-huTFh-TR, og I

I ampicillinresistente transformanter, dvs. kloner indeholdende I

I pUC-pre-huTFh-TR, udvælges. I

I 5 16. Fremstilling af huTFh ved ekspression af rekombinante I

huTFh-kodende sekvenser I

Ekspressionen af rekombinant huTFh fra rekombinante

DNA-molekyler kan gennemføres i forskellige ekspressionsme- I

dier, omfattende prokaryotiske bakterieceller, eukaryotiske I

I 10 celler af hvirvelløse dyr og eukaryotiske celler af hvirvel- I

I dyr. Eksempler på sådanne ekspressionsmedier er E. coli, S. I

I cerevisiae og ovarieceller af kinesisk hamster (CHO-celler).

a. Ekspression af pre-huTFh i E. coli I

I 15 Et rekombinant DNA-molekyle, der kan eksprimere pre- I

I huTFh-strukturgenet i E. coli-celler, kan konstrueres ved I

at isolere et pre-huTFh-gen-holdigt DNA-segment fra det I

rekombinante pUC-pre-huTFh-DNA-molekyle fremstillet i eksem- I

I pel 15 og forbinde dette segment operativt med en prokaryo-

I 20 tisk ekspressionsvektor. I

I ! Det rekombinante DNA-molekyle pUC-pre-huTFh nedbrydes I

I med EcoRI under sådanne betingelser, at nogle, men ikke I

I alle EcoRI-stederne i plasmidet spaltes. Denne partielle I

nedbrydningsprocedure er beskrevet mere detaljeret i Maniatis I

25 et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs I

I Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY (1982). Et 1133 I

I bp segment omfattende en nukleotidsekvens svarende til se- I

kvensen vist i fig. 2 fra rest nr. 1 til rest nr. 1125 iso- I

I leres fra produkterne af den delvise EcoRI-nedbrydning ved I

I 30 størrelsesfraktionering. I

I Den prokaryotiske ekspressionsvektor pKK223-3 (Phar- I

I macia Fine Chemicals, Pisctaway, NJ) lineariseres ved ned- I

brydning med EcoRI. Den nedbrudte vektor og 1133 bp segmentet I

I indeholdende pre-huTFh-strukturgenet forbindes operativt I

I 35 ved anvendelse af T4-DNA-ligase til dannelse af det cirkulære H

I rekombinante DNA-molekyle pKK-pre-huTFh. I

DK 175703 B1 79 E. coli RR1 transformeres med pKK-pre-huTFh, og am-picillinresistente transformanter, dvs. kloner indholdende pKK-pre-huTFh, udvælges.

5 b. Ekspression af huTFh i E. coli

Et rekombinant DNA-molekyle, der kan eksprimere huTF-genet i E. coli, konstrueres ved manipulering af 1133 bp segmentet fremstillet i eksempel 16a. Dette segment dephos-phoryleres først med alkalisk phosphatase og nedbrydes der-10 efter med restriktionsendcnukleasen Bbvl. Det resulterende 964 bp segment omfatter en nukleotidsekvens svarende til sekvensen vist i fig. 2 fra rest nr. 164 til rest nr. 1125 og isoleres ved størrelsesfraktionering.

Syntetiske oligonukleotid-adapter-segmenter med se-15 kvenserne: 5’-AATTGACATGTCAGGCACTACAAATACTGTGGCAGCATATAATT-3' og 3'-CTGTACAGTCCGTGATGTTTATGACACCGTCGTATATTAAATTG-5' fremstilles som ovenfor beskrevet og kondenseres til dannelse 20 af et dobbeltstrenget DNA-linker-segment indeholdende klæbende EcoRI- og Bbvl-ender ved metoden ifølge Rotherstein et al.. Methods in Enzymol., 68:98 (1979). Linkeren forbindes først operativt til 964 bp segmentet til dannelse af 1008 bp segment. 1008 bp segmentet forbindes derefter operativt 25 til den EcoRI-nedbrudte vektor pKK223-3 ved anvendelse af T4-DNA-ligase til dannelse af det cirkulære rekombinante DNA-molekyle pKK-huTFh.

Det rekombinante DNA-molekyle pKK-huTFh adskiller sig kun fra pKK-pre-huTFh ved, at 1) et segment fra rest nr.

30 1 til rest nr. 129 er udeladt, og 2) et nyt methionin-kodon er operativt forbundet før rest nr. 130, således at proteinekspressionen (translationen) begynder ved det indføjede methionin-kodon.

De rekombinante DNA-molekyler pKK-pre-huTFh og pKK-35 huTFh indføres i et prokaryotisk værtsmedium foreneligt med ekspression af huTFh- eller pre-huTFh-proteinet, som kodes

DK 175703 B1 I

I I

af det strukturelle gen indeholdt deri. Eksempler på værts- I

celler indeholdende sådant medium er E. coli stamme RR1. I

H Værten transformeres med det rekombinante DNA-molekyle og I

dyrkes under betingelser, der er forenelige med cellevækst I

5 og ekspression af det rekombinante DNA, og det eksprimerede I

H protein høstes ved velkendte metoder. I

H c. Ekspression af pr-huTFh i CHO-celler I

Et rekombinant-DNA-molekyle, der er i stand til at I

10 eksprimere pre-huTFh-genet i hvirveldyr-celler, konstrueres I

ved anvendelse af 1133 bp segmentet fremstillet i eksempel I

I 16a. I

Syntetiske oligonukleotid-adapter-segmenter med se- I

kvenserne: I

I 15 5'-AATTCCCGGG-3’ og I

: 5'-GATCCCCGGG-3’ I

fremstilles ved metoden ifølge Caruthers et al., supra og I

Gait et al., supra. Oligonukleotid-adaptersegmenterne for- I

bindes derefter til hver terminus af 1133 bp segmentet ved I

20 anvendelse af metoderne beskrevet af Rotherstein et al., I

Methods in Enzymol., 68:98 (1979). De klæbende EcoRI-ender, I

som oprindelig er til stede på 1133 bp segmentet, omdannes I

derved til klæbende Bglll-ender. I

Den eukaryotiske abevirus-(SV40-)-baserede ekspres- I

25 sionsvektor pKSV-10 (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, I

H NJ) lineariseres ved nedbrydning med restriktionsendonu- I

kleasen Bglll. Det Bglll-adapterede 1133 bp segment og den I

Bglll-nedbrudte vektor forbindes operativt ved anvendelse I

H af T4-DNA-ligase til dannelse af det cirkulære rekombinante I

I 30 DNA-molekyle pSV-pre-huTFh. I

Ξ. coli RR1 transformeres med pSV-pre-huTFh, og vel- I

lykkede transformanter udvælges på basis af ampicillinresi- I

I stens og klones. De udvalgte transformanter klones derefter I

og screenes for tilstedeværelse af pSV-pre-huTFh ved under- I

I 35 søgelse af hver klon for tilstedeværelsen af eksprimeret I

DK 175703 B1 81 ! pre-huTFh-protein ved anvendelse af det monoklonalle antistof TF8-5G9.

d. Ekspression af huTFh i CHO-celler 5 Et rekombinant DNA-molekyle, der er i stand til at eksprimere huTFh-genet i pattedyrceller, konstrueres ved at nedbryde pSV-pre-huTFh fra eksempel 16c med restriktionsen-donuklease Bglll. Det resulterende 1153 bp segment isoleres ved størrelsesfraktionering og nedbrydes derefter med re-10 striktionsendonukleåsen Bbvl. Det resulterende 974 bp segment omfatter en nukleotid-adapter-sekvens svarende til sekvensen vist i fig. 2 fra rest nr. 164 til rest nr. 1125 og isoleres ved størrelsesfraktionering.

Syntetiske oligonukleotid-adapter-segmenter med se-15 kvenserne: 5'-GATCGACATGTCAGGCACTACAAATACTGTGGCAGCATATAATT- 31 og 3'-CTGTACAGTCCGTGATGTTTATGACACCGTCGTATATTAAATTG-5' fremstilles som ovenfor beskrevet og kondenseres til dannelse 20 af et dobbeltstrenget DNA-linker-segment indeholdende klæbende Bglll-ender og klæbende Bbvl-ender. Linkeren forbindes derefter operativt til 974 bp segmentet ved anvendelse af T4-DNA-ligase til dannelse af 1018 bp segment omfattende en nukleotidsekvens svarende til sekvensen vist i fig. 2 fra 25 rest nr. 130 til rest nr. 1125.

Plasmidekspressionsvektoren pKSV-10 iineariseres ved nedbrydning med Bglll og forbindes derefter operativt til 1018 bp segmentet ved anvendelse af T4-DNA-ligase til dannelse af det cirkulære rekombinante DNA-molekyle pSV-huTFh.

30 De rekombinante DNA-molekyler pSV-pre-huTFh og pSV- huTFh indføres i et eukaryotisk værtsmedium foreneligt med ekspression af huTFh- eller pre-huTFh-proteinet kodet af det strukturelle gen indeholdt deri. Eksempler på værtsceller indeholdende et sådant medium er CHO-celler.

35 Værten transficeres med det rekombinante DNA-molekyle, og stabile transformancer udvælges ved velkendte metoder.

I . DK 175703 B1 I

I i I

Η ' I

I 82 .. I

se f.eks. Graham et al., Virol., 52:456 (1973); og Southern I

et al., J. Mol. Appl. Genet., 1:327-341 (1982). Transforme- I

rede værtsceller dyrkes under betingelser, der er forenelige I

I med cellevækst og ekspression af det rekombinante DNA, og I

I J 5 det eksprimerede protein høstes ved velkendte metoder. I

e. Ekspression af pre-huTFh i gær I

Et rekombinant DNA-molekyle, der er i stand til at I

eksprimere pre-huTFh-genet i S. cerevisiae, konstrueres ved I

10 at fremstille oligonukleotid-adapter-segmenter med sekvensen: I

I 5’-AATTCCCGGG-31 og I

5’-CGCCCGGG- 3' I

og forbinde dem til terminusserne af 1133 bp segmentet fra I

i eksempel 16a som ovenfor beskrevet. Det adapterede segment I

I I

I 15 dannet på danne måde har klæbende Clal-ender. I

I Gærekspressionsvektoren pTDTl (ATCC 31255) lineari- I

seres ved nedbrydning med restriktionsendonukleasen Clal. I

H Det ovennævnte Clal-adapterede 1133 bp segment og den Clal- I

H nedbrudte vektor forbindes operativt ved anvendelse af T4- I

I 20 DNA-ligase til dannelse af det cirkulære rekombinante DNA- I

I molekyle pY-pre-huTFh. I

E. coli RR1 transformeres med pre-huTFh, og transfor- I

manter, der eksprimerer pre-huTFh-strukturgenet, identifice- I

I res og udvælges som beskrevet i eksempel 16c. I

I 25 I

I f. Ekspression af huTFh i gær I

I Et rekombinant DNA-molekyle, der er i stand til at I

I eksprimere huTFh-strukturgenet i S. cerevisiae, konstrueres I

I ved at nedbryde pY-pre-huTFh med Clal til dannelse af et I

30 1151 bp segment omfattende en nukleotidsekvens svarende til I

sekvensen vist i fig. 2 fra rest nr. 1 til rest nr. 1125. I

I Efter isolering ved størrelsesfraktionering nedbrydes 1151 I

I bp segmentet med Bbvl til dannelse af et 978 bp segment I

I omfattende en nukleotidsekvens svarende til sekvensen vist I

I 35 i fig. 2 fra rest nr. 164 til rest nr. 1125. 978 bp segmentet I

I isoleres derefter ved størrelsesfraktionering. I

DK 175703 B1 83

Syntetiske oligonukleotid-adapter-segmenter med sekvenserne : 5'-CGGACATGTCAGGCACTACAAATACTGTGGCAGCATATAATT-3' og 5 3'-CTGTACAGTCCGTGATGTTTATGACACCGTCGTATATTAAATTG- 5' fremstilles og kondenseres som ovenfor beskrevet til dannelse af DNA-adapter-segmenter, der har klæbende Clal- og Bbvl-ender. Adaptersegmentet forbindes først operativt til 978 bp segmentet til dannelse af 1020 bp segment. 1020 bp seg-10 mentet forbindes derefter til den Clal-nedbrudte pTDTl-vek-tor, fremstillet som beskrevet i eksempel 16e, ved anvendelse af T4-DNA-ligase til dannelse af det cirkulære rekombinante DNA-molekyle pY-huTFh.

De rekombinante DNA-molekyler pY-pre-huTFh og pY-huTFh 15 indføres i et gær-værtsmedium foreneligt med ekspression af huTFh- eller pre-huTFh-proteinet kodet af strukturgenet indeholdt deri. Eksempler på værtsceller omfattende et sådant medium er S. cerevisiae-celler.

Værten transformeres med det rekombinante DNA-molekyle 20 og dyrkes i selektionsmedium til isolering af vellykket transformerede celler ved velkendte metoder, se f.eks. Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:1929 (1978); og Mi-yajima et al., Mol. Cell. Biol., 4:407 (1984). Transformerede celler dyrkes under betingelser, der er forenelige med cel-25 levækst og ekspression af det rekombinante DNA, og det eks-primerede protein høstes ved velkendte metoder.

g. Fremstilling af opløseligt huTFh ved ekspression af rekombinante huTFh-kodende sekvenser.

Ekspressionen af opløseligt huTFh ud fra rekombinante 30 DNA-molekyler kan opnås i forskellige ekspressionsmedier på lignende måde som beskrevet i eksempel 16 for pre-huTFh og huTFh. I det eksempel produceres et 1133 bp segment indeholdende pre-huTFh-strukturgenet og med klæbende EcoRI-ender i eksempel 16a og manipuleres derefter i eksempel 16b-f, hvor-35 ved der fås vektorer, som er i stand til at eksprimere enten pre-huTFh eller huTFh i tre eksempelvise ekspressionsmedier,

I DK 175703 B1 I

I 84 I

E. coli, S. cerevisiae og CHO-celler. På lignende måde mani- I

' puleres 805 bp segmentet indeholdende et strukturgen for I

opløseligt pre-huTFh og med klæbende EcoRI-ender og fremstil- I

H let i eksempel 16a ved metoderne beskrevet i eksempel 16b-f I

5 til fremstilling af ekspressionsvektorer, der er i stand I

! til at eksprimere en opløselig form af enten pre-huTFh eller I

huTFh {dvs. pre-huTFh-TR eller huTfh-TR) i de samme ekspres- I

sionsmedier. I

17. Inhibering af koagulering med polypep- I

I I 10 tiderne P24-35 og P159-169 I

I

! Polypeptiderne p24-35 og pl59-169, hvis aminosyre-

sekvenser er vist i tabel 7, syntetiseres som beskrevet i I

eksempel 11. I

I I

I Tabel VII I

Betegnelse3) Aminosvresekvens I

I p24-35 H-EWEPKPVNQVYT-OH I

I pl59-169 H-IYTLYYWKSSSSGKKTAK-OH I

I 20 _ I

I a) Laboratoriebetegnelsen for hvert polypeptid repræ- I

I senterer den inkluderede aminosyresekvens som vist i fig. 1. I

Polypeptiderne p24-35 og pl59-169 undersøges derefter I

for deres evne til kompetitiv inhibering af huTF-initieret I

25 koagulering som beskrevet i eksempel 12. Resultaterne af I

I denne undersøgelse er vist i fig. 12 og viser, at p24-35 og I

I pl59-169 er i stand til at inhibere huTF-initieret koagule- I

I ring henholdsvis 45 og 25% ved anvendelse i koncentrationer I

på 10 μΜ. Det skal bemærkes, at ved denne undersøgelse er I

I 30 baggrundsinhiberinger som for peptiderne vist ved en udfyldt . I

I cirkel i fig. 12 lavere end ved undersøgelsen vist i tabel I

I 4. Som resultat heraf betragtes polypeptider, der giver I

I mindst 20% inhibering af koagulering ved en koncentration I

I på 10 μΜ ved denne undersøgelse, som huTF-bindingssted-poly- I

I 35 peptidanaloge. I

' 85 DK 175703 B1

Polypeptiderne p24-35 og pi59-169 udgør således huTFh-polypeptid-bindingssted-analoge ifølge opfindelsen. Det skal også bemærkes, at resultaterne opnået med p24-35, på baggrund af de lignende resultater opnået med polypeptid 5 p25-49, viser, at et huTFh-faktor VII/VIIa-bindingssted kan dannes af aminosyresekvensen, som disse to polypeptider har fælles, dvs. resterne 30-35 som vist i fig. 1 (-VNQVYT-).

18. De kinetiske forhold for inhibering af koagulering med anti-huTF-antistoffer 10 Til bestemmelse af tidsrummet, i hvilket anti-huTF- antistoffer er i stand til at inhibere huTF-initieret koagulering, måles tidsforløbet for inhibering ved anvendelse af inhiberingsbestemmelsen beskrevet i eksempel 10.

Ca. 1 ng af MAPS-isoleret monoklonalt TF8-5G9-antistof 15 fremstillet som beskrevet i eksempel 7 blandes i 100 μΐ HBS/BS med ca. 1 ng relipideret huTF fremstillet som be skrevet i eksempel 4. De forskellige blandinger, der er dannet på denne måde, holdes ved 37°C i varierende tidsrum fra ca. 1 til ca. 60 minutter til immunologisk binding af 20 anti-huTF-antistofmolekylet til huTF og dannelse af et immu-noreaktionsprodukt. På tidspunkterne anført i fig. 13 undersøges hver blanding derefter for huTF-prokoagulerende aktivitet som beskrevet i eksempel 2, og den procentiske inhibering udtrykkes derefter som beskrevet i eksempel 10.

25 Fig. 13 viser resultaterne af en sådan kinetisk må ling, der viser, at inhiberinger af huTF-initieret koagulering på over 65% forekommer på mindre end 10 minutter ved den ved denne bestemmelse anvendte koncentration af antistof og renset huTF. Det antages, at der fås en mere hurtig og 30 fuldstændig inhibering ved højere koncentrationer af anti-huTF-antistof.

19. Dosis-reaktion for inhibering af huTF--initieret koagulering med anti-huTF--antistoffer 35 Evnen af anti-huTF-antistofferne ifølge den forelig gende opfindelse til at inhibere huTF-initieret koagulering ^fl

I DK 175703 B1 I

I 86 I

over et område af antistofdoseringer bestemmes ved metoderne I

beskrevet i eksempel 10 med følgende modifikationer. 1 ng I

I j relipideret huTF fremstillet ifølge eksempel 4 blandes i I

I 0,1 ml HBS/BSA med forskellige mængder af monoklonalt I

fl 5 TF8-5G9-antistof isoleret som beskrevet i eksempel 7. De fl

således fremstillede blandinger bibeholdes til dannelse af I

imtnunoreaktionsprodukter og undersøges derefter for huTF- I

prokoagulerende aktivitet som beskrevet i eksempel 10. I

Resultaterne af en sådan dosis-reaktions-bestemmelse I

10 er vist i fig. 14 og viser, at inhiberingerne er det halve I

af maksimum ved ca. 1-5 ng anti-huTF pr. ml ved den i denne H

undersøgelse anvendte koncentration af huTF. H

En lignende dosis-reaktion gennemføres ved anvendelse I

B af lyserede humane celler som kilde til huTF. H

fl 15 Den humane fibroblast-cellelinie GM1381 (NIGMS Human I

B Genetic Mutant Cell Repository) dyrkes i Dulbecco's modifi- H

B cerede Eagle's medium (DMEM, Gibco Laboratories, Grand Is- I

fl land, NY) suppleret med 2 mM glutamin, 5% kalvefosterserum fl fl og antibiotika ved 37°C og under en atmosfære af 7 volumen- fl

fl 20 procent carbondioxid i luft. GM1381-cellerne dyrkes og høs- I

fl · tes, og en pellet af 30x10^ celler fremstilles ved centri- fl

fl fugering og fryses ved -70°C. Denne frosne pellet optøes I

I hurtigt ved tilsætning af 9 ml 15 mM β-octylglucopyranosid fl fl (Sigma) i HN-puffer (25 mM Hepes, 140 mM natriumchlorid, fl fl 25 pH-værdi 7,0) og holdes ved 37°C i 10 minutter til lyse af fl fl cellerne, hvorefter der iblandes 18 ml HN til dannelse af fl

fl et cellelysat. I

B Monoklonalt antistof TF8-5G9 isoleret som beskrevet B

B i eksempel 7 fortyndes med 0,01% BSA (Sigma, RIA-kvalitet) B

B 30 til de forskellige doseringer anført i fig. 15. 25 μΐ af B

B hver antistoffortynding blandes derefter med 225 μΐ af det B

B ovenfor fremstillede cellelysat og holdes ved 37°C i 60 B

B minutter for at gøre det muligt for antistoffet at immuno- B

B reagere med huTF, som er til stede i cellelysatet, og danne B

B 35 et immunoreaktionsprodukt. Derefter blandes 50 μΐ af en 25 B

B mM calciumchloridopløsning med 50 μΐ af opløsningen indehol- fl fl 1 fl DK 175703 B1 87 dende immunoreaktionsprodukcet, hvorefter der tilsættes 50 μΐ citratbehandlet humant plasma til initiering af koagulering. De således dannede blandinger holdes ved 37°C, og tidsrummet mellem tilsætning af plasma og dannelse af et 5 koagel måles. Den effektive huTF-koncentration og den pro- i centiske inhibering beregnes som beskrevet i eksempel 10.

Resultaterne af en dosis-reaktions-inhiberingsbestem-melse ved anvendelse af lysater af humane GM1381-celler som kilde til huTF er vist i fig. 15. Disse resultater viser, 10 at TF8-5G9-anti-huTF-antistof giver det halve af maksimal inhibering af denne cellelysatkilde til huTF ved ca. 8-10 ng antistof pr. ml.

2 0. Krvdsreaktivitet af monoklonale antistoffer med ikke-human vævsfaktor 15 Vævsfaktor isoleres fra enten hjernevæv {rotte, kanin, okse, hund, får, svin og bavian) eller vævskulturceller (nyreceller af afrikansk grøn abe (COS-celler) . Væv eller i celler cptøes, befries for membraner, hakkes, homogeniseres ! i 1 ml kold acetone pr. g væv og filtreres under vakuum 20 gennem Whatman nr. 1-papir. Det faste stof resuspenderes i acetone og filtreres yderligere fem gange, hvorefter det lufttørres natten over og opbevares ved -30°C. Acetone-pulverne, som udgør 16-19% af udgangsvægten (våd), pulveriseres med en morter og pistil, resuspenderes i en koncentration 25 på 5% (vægt/volumen) i TBS indeholdende 5 mmol/liter EDTA og blandes 1 time ved omgivelsestemperatur. Fast stof fraskilles ved centrifugering ved 10.000 g i 30 minutter ved 20°C, og TF-holdige membraner opsamles ved centrifugering af den ovenstående væske ved 100.000 g i 1 time. Pelleten 30 resuspenderes i TBS og opbevares ved -80°C.

Antistof -inhibering af animalsk TF (rå vævsekstrakter indeholdende TF-aktivitet) bestemmes på følgende måde. Lige volumener af TF (1 mg/ml) og ovenstående hybridoma-væske (fortyndet 1:10 med T3S/BSA) inkuberes i 2 timer ved 37°C.

35 Tilbageværende TF-aktivitet måles ved tilsætning af 100 μΐ af inkuberingsblandingen til 50 μΐ human faktor VII-frit

I DK 175703 B1 I

I I

plasma og 50 μΐ 50 mM calciumchlorid. Efter 1 minut ved ' I

37°C tilsættes 50 μΐ af en 1:10-fortynding af homolog-art- I

serum som kilde til faktor VII, og der foretages en dob- I

. beltbestemmelse af tidsrummet til dannelse af koage1. I

5 18 af de 24 monoklonale antistoffer inhiberer den I

prokoagulerende aktivitet af bavianhjerne-TF eller nyrecel- I

leekstrakter af afrikansk grøn abe (tabel 8) . Imidlertid I

udviser ingen af de monoklonale antistoffer krydsreaktivitet I

! med TF fra rotte, kanin, okse, hund, får eller svin, dvs. I

10 ingen inhiberer evnen af disse TF-præparater til at frem- I

skynde recalcificeringstiden af humant faktor VII-frit plasma I

i nærværelse af en kilde til homolog faktor VII. Ingen af I

antistofferne inhiberer den prokoagulerende aktivitet af I

I kanin-TF bestemt med normalt humant plasma. I

I I

89 DK 175703 B1 +-I —.

Π5 m Du H C

*H M

u ω

Qj f—I m CO Π3 CD CQ CQ CQ CQ CQ CO 03 CQ CO CO CQ CO P3 CQ

Π (¾ III · ..... ..... · i i .... i i -he ... s ς ς ς ς ς ς ς ς ς ς ς ς « ς ς ς ς ς > j: -η c c H «j U-l οι ~ rj* * ·* *

(J Η O- O OJ ro ιχΐ o Π ^ CO CTi Η ΓΟ (N CO 03 Γ' -7 rH OJ 04 Η © O

C w lo co co co r- σ» ω co h o- co co ο* o- σι h ^ in h o- co oo o- oj •H > ω λ — -Η ΓΟ Λ ri εη Η nj Ο νη er. σ> in m r· οο t*· r- r- η r~ ιο m in in ^ r* οι^ιηωο o ^ ffi Ol <Tl C7> σ> 0Λ CA (Jl (?, Ol Dl Cft Ch CT> CTi Cl C Ci C\ CT\ 04

JJ

co 0

H oi + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + I

-3 CQ 2 ω § s

Eh <D

u ω Φ

s (¾ +| i i + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + I

OJ

0

rH

CQ

+ + + + + + + 4-+ + + + + + + + + + + + + + + + ,

-U

0

Q

— oir-co ro π id m n in 04 ^ m cr> m ^ ιλ f ιλ <s σ\ oi co oj m cr> η E ^ co in ro o- co in oj m οι o\ h <$* cn id in m in id oj n cri co oj < Qi cn m t η ro in in in ^ ^ οι o ro in ooooorH h cn Γ' id in cn

H U ID CO D> in ro CO CO CO ·+ O Li") -+ <+ r» ^ 00 CO <Tl . 00 Ο ΓΟ 00 ^ 1-H

Oi 04 Ol 04 OJ 04 OJ 04 03040J040J Η (N OJ Η Π CO Ol M

0)

Q, Y X X Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y

iJ rl Η H rH rl rl H rl iH t—IrHrHi-(r-l rHf—lr-Hr-lt-4 rInI tH rH H iH

O [3 0 0 u O O O O O OOOOO OOOOC5 OOOOC5 o u> cnDicn σι cnmcncncji οισιοισισι cn σι tn οι σι σι σι σ> σι σι σι

M HHH Η HMMMM MHHMiH MUMMM Μ Η Μ Η Μ M

IN O

i—I ι-H Ο N H

if oi Q η m r~ co oi .r m H r~ r- τ ^ οι h co r-ι no ·3< U X

u ο h x Qtammu x q o m u αουωω wucaoo o in m η η η η η h m m f in in in vo m in r~- co m m m η η o

O .1. I t I . . I I . . J . * I » I I ( I I . I rH

2 co co co o\ σ\ a\ <T\ o\ G\ o\ o\ o\ o\ o\ o\ Q\ o\ o\ o\ c c c c c. λ O tu tu tu tu ti.Cututi.tu tu tu tu Cu tu tututututu CuCuCuCutu <0

2 HHH Η HHHHH HHHHH HHHHH HHH HH X

I DK 175703 B1 I

I 90 I

^ Medmindre andet er anført, er alle resultater I

opnået ved anvendelse af ovenstående væsker fra hybridoma- I

vævskultur ved en 1:10-fortynding. Radioimmunobestemmelses- I

resultaterne, udtrykt i tællinger pr. minut (cpm), under I

5 anvendelse af mærket ved anvendelse af lactoperoxi- I

dase. I

2) Western blots gennemføres ved anvendelse af enten I

B reduceret (R) eller ikke-reduceret (NR) TF. I

Inhibering af koagulering af humant plasma frem- I

10 kaldt med renset humant hjerne-TF. I

^ Inhibering af specifik 125j_faktor VII/VIIa-binding I

til J82-celler. I nogle tilfælde (vist ved en stjerne) in- I

hiberer ovenstående væsker fra kultur i en fortynding på I

B j 1:10 ikke væsentligt faktor VII/VIIa-binding, og der er I

I 15 anført resultater for renset IgG i en koncentration på 10 I

B μς/πΐ. I

I I Inhibering af koagulering af humant plasma frem- I

I kaldt af rå bavian-hjerneekstrakt (B) eller lyserede COS- I

B celler (M) . Der er anført et bogstav for en art, hvis det I

2 0 monoklonale antistof (MoAb) inhiberer den prokoagulerende ak- I

B tivitet 60% eller mere. I

B Inhiberingen af prokoagulerende aktivitet, der ud- I

B trykkes af forskellige humane celler og væv, undersøges I

B 25 mere detaljeret ved anvendelse af det monoklonale antistof I

B TF8-5G9. TF8-5G9 neutraliserer funktionen af renset relipi- I

B deret humant TF med mere end 90% ved IgG-koncentrationer på I

B al μg/ml (fig. 16) . Evnen af dette monoklonale antistof I

B til at inhibere den prokoagulerende aktivitet af humane I

30 cellelysater og rå vævsekstrakter påvises også (tabel 9) . I

I TF8-5G9 ved en.IgG-koncentration på 10 ^g/ml inhiberer kvan- I

I titativt a 80% af den prokoagulerende aktivitet af rå hjer- I

I neekstrakt og placenta-acetone-pulver og af lyserede humane I

I fibroblaster, blærecarcinomceller og endotoxinstimulerede I

35 perifere mononucleære blodlegemer. I

DK 175703 B1 91

TABEL IX

Inhibering af koagulerende aktivitet af forskellige celler og væv med monoklonalt antistof TF8-5G9 5 TF-Aktivitet (% Inhibering)1^

Intet anti-

Kilde til TF-aktivitet2) stof PAblOO TF8-5G9 10 renset human hjerne-TF 1569 1520 (3%) 245 (84%) rå hjerneekstrakt 2059 2059 (0%) 411 (80%) i rå placentaekstrakt 1287 1344 (0%) 159 (88%) GM1381-fibroblaster (lyserede) 990 966 (2%) 143 (86%) 15 humane monocyter (lyserede) 2893 2745 (5%) 176 (94%) J82 blærecarcinoma- celler (lyserede) 882 902 (0%) 93 (89%) kanin-thromboplastin 2108 2108 (0%) 2157 (0%) 2 0 _ -1-) Renset humant hjerne-TF rekonstitueres i lipid-vesikler før undersøgelsen.

25 I de to søjler til højre er der anført tilbage værende TF-aktivitet i millienheder målt efter behandling med det anførte rensede IgG og som gennemsnittet af to bestemmelser. Prøverne inkuberes med 10 ^g/ml IgG i 30 minutter ved 3 7 °C før måling af den tilbageværende TF-aktivitet.

30 Værdierne i parentes er den procentiske inhibering. I hvert enkelt tilfælde er dette den relative værdi i forhold til aktiviteten af den samme prøve, der ikke er behandlet med antistof. 1 21. Faktor Vll-bindinqsundersøaélser 35 Da binding af faktor VII/VIIa til TF er nødvendig til samling af det funktionelle TF:Vll/VIIa-prokoagulerende kompleks,

I DK 175703 B1 I

I i

undersøges evnen af de monoklonale antistoffer anført i I

tabel VIII til at neutralisere TF-aktivitet via blokering I

af bindingen af faktor VII/VIla til TF. I

Human vævsfaktor-medieret binding af faktor VII til I

5 overfladen af J82-blærecarcinom-ceIler er blevet godt karak- I

teriseret, jf. Fair et al., J. Biol. Chem., 262:11692 (1987). I

Følgelig undersøges virkningerne af de monoklonale antistof-

fer på samlingen af celleoverflade-huTF:VII/VIla-komplekset I

ved forinkubering af J82-celler med antistof og derefter I

10 mængdebestemmelse af den specifikke binding af -^^i-faktor

I Vll/VIIIa. I

J82-celler dyrkes indtil sammenflydning i 12-brønds I

kulturplader som beskrevet af Fair et al., J. Biol. Chem. I

I 262:11692 (1987) , vaskes med puffer A (137 mM natriumchlorid, I

15 4 mM kaliumchlorid, 11 mmol/liter glucose, 5 mM natriumazid, I

10 mM HEPES, pH-værdi 7,45) og inkuberes i 2 timer ved 37°C I

med 0,7 ml puffer A indeholdende renset monoklonalt antistof I

I IgG eller en 1:10-fortynding af ovenstående væske fra hybri- I

domakultur. Calciumchlorid og 125I-faktor VII/VIla tilsættes I

H 20 til slutkoncentrationer på henholdsvis 5 mM og 1 nM og in- I

I kuberes med celler i yderligere 2 timer ved 37°C. Celle- I

monolag vaskes derefter 5 gange med kold puffer B (140 mM I

natriumchlorid, 0,5% 3SA, 5 mM tris-HCl, pH-værdi 7,45), I

lyseres i 1 ml 0,2 M natriumhydroxid, 1% SDS, 10 mM EDTA, I

I 25 og lysatet tælles i en m-tæller. Den specifikke binding I

I bestemmes ved fratrækning af ikke-specifikt bundet radioak- I

I tivitet (12^I-faktor VII/VIla knyttet til celler i nærværelse I

I af et 100 ganges molært overskud af umærket faktor VII/VIla) . I

I Den procentiske inhibering af specifik binding bestemmes I

. 30 for J82-celler behandlet med monoklonale antistoffer i for- I

hold til kontrolceller behandlet med 9 dele puffer A og 1 I

del kulturmedium. I

I Når faktor VII/VIla bindes til TF, bliver det ikke I

I normalt inkorporeret, men for at eliminere muligheden for I

I 35 TF-inkorporering fremkaldt af antistofbinding forgiftes I

I J82-cellerne metabolisk med 5 mM natriumazid. Der opnås I

DK 175703 B1 93 lignende resultater, hvadenten cellerne behandles med azid eller ej.

Resultaterne af denne undersøgelse er anført i tabel 8 ovenfor. Alle 23 monoklonale antistoffer, der inhiberer 5 TF-aktivitet, blokerer også faktor VII/VIla-binding. Som forventet bevirker det monoklonale antistof, der ikke inhiberer TF-aktivitet, TF9-10H10, ikke blokering af faktor VII-binding.

22. Inhering af faktor Xa-dannelse 10 af J82-celler.

Hastighederne for faktor Xa-dannelse af huTF:VII/VIIa-komplekset på J82-celler bestemmes ved en dobbeltbestemmelse under anvendelse af flerbrønds-kulturpladebestemmelsen beskrevet af Fair et al., J. Biol . Chem. , 262:11692 (1987) ! 15 med følgende modifikationer. Celler dyrkes i 12-brønds-piader og forinkuberes i 2 timer ved 37°C med forskellige koncentrationer af renset IgG-fraktion af monoklonale antistoffer før bestemmelsens påbegyndelse, som beskrevet ovenfor for faktor VII/VIIa-binding til J82-celler. Der anvendes en 20 enkelt koncentration af faktor Vll/VIIa (1 mM) ved bestemmelsen. Med intervaller på 5, 10 og 15 minutter efter tilsætning af faktor X til en slutkoncentration på 50 /xg/ml fjernes 50 μΐ ovenstående væske og sættes til 550 μΐ 50 mM Tris-HCl, 225 mM natriumchlorid, 50 mM EDTA (pH-værdi 8,2).

25 Efter tilsætning af chromogent faktor Xa-substrat (50 μΐ 3,4 mM ''3-2222’', Helena Labs, Beaumont, TX) , bestemmes faktor Xa-aktiviteten ved måling af hastigheden for forøgelse af absorptionen ved 405 nm i et Beckman DU-30 spektrofotometer med kinetisk analysemodul. Baggrundshydrolyse af "S-2222" 30 med den ovenstående væske fra J82-celler inkuberet i fraværelse af faktor Vll/VIIa trækkes fra hver bestemmelse.

Den procentiske inhibering ved antistofbehandlingen beregnes i forhold til celler, der ikke er forinkuberet med antistof.

Inhiberingskurverne for behandling af J82-celler med 35 de monoklonale antistoffer TF9-2C4 og TF9-5B7 viser, at hastigheden for faktor Xa-dannelse inhiberes af lignende

I DK 175703 B1 ! I

I 94 I

antistofkoncentrationer som dem, der inhiberer faktor VII- I

binding (fig. 17). Det ikke-inhiberende (ikke-neutralise- I

rende) monoklonale antistof TF9-10H10 har ringe eller ingen I

effekt på prokoagulerende aktivitet, faktor VII/VIIa-binding I

I 5 eller hastigheden for faktor Xa-dannelse ved IgG-koncentra- I

H tioner op til 10 ^g/ml, og det samme gælder det monoklonale I

antistof PAblOO, der tjener som kontrol (ikke vist). I

23. Inhibering af faktor X-aktivering på ί I

J82-celler ved kompetitiv binding af , I

10 huTPh-polvpeptider til I

I faktor VII/Vila I

Som det er velkendt, er cellulær aktivering af koa- I

gulerings-protease-kaskaderne knyttet til en heterogen gruppe I

af sygdomme, der betegnes konsumptive thrombohæmorrhagiske I

15 sygdomme. Koagulations-protease-kaskaden initieres mest I

almindeligt på celleoverflader ved højaffinitetsbinding af I

faktor vil/vila til dens membranreceptor og essentielle I

co-faktor, vævsfaktor (TE) . Det bimolekylære prokoagulerende I

I kompleks af TF og faktor VII/VIIa (TF:VII/VIIa), aktiverer I

I 20 faktor X og IX ved begrænset proteolyse, der tilsidst fører I

H til thrombindannelse og fibrinafsætning. Udover rollen af I

TF ved hæmostase er initiering af koagulations-protease- I

I kaskaden af TF blevet impliceret i dissemineret intravaskulær I

koagulation og i thrombogenese, jf. Niemetz et al., Blood, I

I 25 42:47 (1973) og Bevilacgua et al., J. Exp. Med., 160:618 I

H (1984) . TF er et vigtigt effektormolekyle, der eksprimeres I

I på overfladen af monocyter og endotheliale celler som reak- . I

I tion på inflammatoriske mediatorer og ved cellulære immun- I

I reaktioner. I

I 30 Evnen af huTFh-polypeptiderne ifølge den foreliggende

I opfindelse til at binde faktor VII/VIIa og derved inhibere I

I dannelsen af et TF:VII/VIIa-kompleks, som er i stand til at I

I aktivere faktor X, er undersøgt. I

I 50 μΐ af en opløsning indholdende en huTF-polypep- I

35 tidanalog i en koncentration på 100 μΜ i TBS sættes til I

I hver brønd af en 96-brønds fladbundet polystyren-bestemmel- I

DK 175703 B1 95 sesplade. Derefter blandes der i hver brønd 25 μΐ af en opløsning indeholdende faktor VII/VIla isoleret som beskrevet i eksempel 3 i en koncentration på 1 nm i TBS, og der iblandes yderligere 25 μΐ 20 taM calciumchlorid i TBS, og den 5 fremkomne blanding holdes ved stuetemperatur i 30 minutter.

Humane J82-blærecellecarcinom-celler (ATCC HTB 1) dyrkes som beskrevet af Fair et al., J. Biol. Chem., 262:11692-11698.

j 5 x 104 J82-celler suspenderes i 50 μΐ TBS og blandes 10 i hver brønd af polystyren-bestemmelsespladen efter den ovennævnte bibeholdelsesperiode. Umiddelbart derefter iblandes 25 μΐ faktor X, isoleret som beskrevet af Fair et al., J. Biol. Chem., 262:11692-11698 (1987) i en koncentration på 100 nM i TBS og 50 μΐ af Xa-chromogent substrat "S-2222" 15 (1 mg/ml i TBS), og den fremkomne blanding holdes i 2 minut ter ved stuetemperatur til dannelse af en opløsning indeholdende chromogent reaktionsprodukt.

Den dannede mængde chromogent produkt bestemmes ved måling af den optiske tæthed (OD) ved 405 nm, idet der an-20 vendes et V-max 96-brønds spektrofotometer (Molecular Devices, Mountain View, California). Kontroller med PBS i stedet for polypeptid eller uden tilsat faktor VII gennemføres også til bestemmelse af de maksimalt og minimalt mulige OD-værdier. Resultaterne af disse målte inhiberinger er vist i 25 tabel X.

30 i 35

I DK 175703 B1 I

I I

I ' Tabel X

Inhibei'ing af X-aktivering på JS2-celler I

: ved anvendelse af huTF-polvpeptider I

I i 5 I

I huTFh-polypeptider Optisk tæthed1) I

I PBS 0,960 ± 0,083 I

ingen faktor VII/VIIa 0,005 + 0,001 I

pi-18 1,007 + 0,087 I

10 pi-30 1,098 ± 0,028 I

I pil-28 0,687 + 0,071 I

I p24-25 0,477 ± 0,017 I

I p26-49 0,437 + 0,020 I

I p40-71 0,814 ± 0,053 I

I 15 p72-104 0,781 + 0,047 I

I P94-123 0,818 + 0,055 I

P121-155 0,889 ± 0,067 I

I pl44-159 0,507 + 0,053 I

I p!46-167 0,004 ± 0,001 I

20 p!57-169 0,389 ± 0,035 I

I pl61-190 0,600 ± 0,023 I

P190-209 0,625 ± 0,031 I

I p204-226 0,715.+ 0,042 I

I ' p244-263 0,619 ± 0,047 I

I 25 ____ I

I ~λ) Inhibering af faktor X-aktivering (Xa-dannelse) betragtes I

I som signifikant, hvis den optiske tæthed (OD) er ca. 0,500 I

I eller mindre. I

30 Resultaterne af denne undersøgelse viser, at huTFh- I

I polypeptiderne p24-25, p26-49, pl44-159, pl46-167 og I

pl57-169 binder til faktor VII/VIIa og inhiberer dens evne I

I til at danne et TF: VII/VIIa-kompleks, der kan aktivere faktor I

I X. Disse resultater viser, at en huTFh-bindingssted-polypep- , I

35 tidanalog ifølge den foreliggende opfindelse kan anvendes I

I til at inhibere koagulering. I

DK 175703 B1 97 24. In vivo-inhibering af koagulering med monoklonale Anti-huTFh-antistoffer

Sepsis på grund af gramnegative bakterier involverer ofte en choktilstand, der tilsidst kan føre til døden. For-5 styrrelser af det hæmostatiske system er tæt knyttet til udviklingen af en chok-tilstand. Taylor et al., J. Clin. Invest., 79:913-825 (1987) har vist, at exogent tilsat ak tiveret protein C, et naturligt forekommende antikoagulerende enzym, forhindrer koagulopatisk reaktion og dødelige effek-10 ter af LD^qq-koncentrationer E· hos bavianer.

Evnen af et antikoagulerende monoklonalt antistof ifølge opfindelsen til at inhibere koagulering in vivo undersøges ved anvendelse af bavianmodellen for septisk chok beskrevet af Taylor et al., se ovenfor. Bavianer med en 15 vægt på 7-8 får lov at faste natten over før undersøgelsen og immobiliseres om morgenen før forsøget med ketamin (14 mg/kg, intramuskulært). Natriumpentobarbital indgives derefter i hjernevenen via et percutant kateter til opretholdelse af et let niveau af kirurgisk anæstesi (2 mg/kg 20 ca. hvert 45. minut). En femoral vene frilægges aseptisk og kateteriseres i det ene bagben til udtagelse af blodprøver.

Det percutane kateter anvendes til infusion af E. coli og andre midler, herunder det monoklonale antistof TF9-5B7, som har vist sig at krydsreagere med bavian-TF ifølge eksem-25 pel 20. Efter en ækvilibreringsperiode på 30 minutter modtager dyrene i løbet af ca. 10 minutter en infusion af enten 500 /ig/kg eller 150 /xg/kg af det monoklonale antistof TF9-5B7 (MAPS-isoleret som i eksempel 7 og derefter dialyseret mod sterilt normalt saltvand til en koncentration på 30 0,58 μg/ml) eller 500 μg/kg af et irrelevant monoklonalt antistof.

Efter indgivelse af monoklonalt antistof og en ækvilibreringsperiode på 30 minutter modtager hvert dyr en LD100 dosis af E. coli (ca. 1010 organismer, en mængde, der frem-35 kalder død på grund af septisk chok ca. 8-16 timer efter infusionen). E. coli indgives ved infusion over en periode Η

I DK 175703 B1 I

I I

I på 2 timer. Resultaterne af denne undersøgelse er vist i I

I tabel 11. I

I j Tabel 11 I

I' 5 I

In vivo-standsning af letalitet af I

septisk, chok hos bavianer I

Dosis, Hæmo- E. coli I

10 Gruppe MoAb ug/kg stase1^ Infuseret Død I

I. Kontrol TF9-5B7 500 Normal Nej Nej I

II. Kontrol HB2^ 500 Normal Ja Ja I

I III. Under- I

søgelse TF9-5B7 500 Normal Ja Nej I

15 TF9-5B7 150 Normal Ja Nej I

Forskellige hæmostatiske parametre, herunder blod- I

I tryk, aktivering af koagulering og fibrinnedbrydningsproduk- I

B ter, bestemmes efter indgivelse af monoklonalt antistof B

B 20 (MoAb), men før infusion af E. coli. I

B HB er et monoklonalt antistof af samme klasse og I

B underklasse som TF9-5B7, men immunoreagerer med et irrelevant I

B antigen. I

B 25 Som det fremgår af tabel 11, overlever bavianer, der I

B modtager det monoklonale antistof TF9-5B7, udsættelse for I

B en LD100-dosis af E. coli. Både dosen på 150 /ig/kg og dosen I

B på 500 μg/kg af det monoklonale antistof beskytter. Desuden B

B dæmpes den kraftige hypotension, koagulationskaskadeaktive- B

B 30 ring og nedbrydning af fibrin, der er knyttet til koagulo- B

B pati, tydeligt hos dyrene, der modtager det monoklonale B

B antistof TF9-5B7. B

I 35 I

DK 175703 B1 99 25. Karakterisering af den lette kæde af 58 kDa huTF-heterodimeren som hæmoglobin-or-kæde

Immunoaffinitetsisoleret huTF karakteriseres yder-5 ligere ved Western blot-analyse til identificering af komponenterne af 58 kDa huTF-heterodimeren, nemlig 47 kDa og 12,5 kDa proteinerne beskrevet i eksempel 4.

Western blot-analyse, gennemføret som beskrevet i eksempel 6c, gennemføres ved anvendelse af immunoaffinitets-10 isoleret huTF fremstillet som beskrevet i eksempel 9, renset humant hæmoglobin eller molekylvægtsstandarder som prøverne, j der underkastes elektroforese. Hvor det er anført, inkluderes 50 mM dithiothreitol i prøvepufferen til reduktion af di-sulfidbindingerne. Western blots immunoreageres som anført 15 ved anvendelse af ikke-immun-kanin-IgG, kanin-anti-huTF-IgG fremstillet ved anvendelse af velkendte metoder eller kanin-anti-humant hæmoglobin-IgG fra Dako (Santa Barbara, California) . De første to IgG-præparater MAPS-II-isoleres som beskrevet i eksempel 7.

20 Resultaterne af den ovennævnte Western blot-analyse er vist i fig. 18. Anti-huTF-IgG immunoreagerer kun med 47 kD-båndet af reduceret huTF og ikke med 12,5 kDa-båndet (panel A, bane 3) , medens det samme IgG immunoreagerer med både 58 og 47 kDa-formerne af ikke-reduceret huTF (panel 25 A, bane 4). Disse resultater stemmer overens med en identifikation af huTF som 47 kDa-komponenten af 58 kDa-hetero-dimeren. Anti-hæmoglobin-IgG immunoreagerer på Western blots kun med 58 kDa-båndet i den ikke reducerede huTF-prøve og ikke med 47 kDa-monomeren (panel B, bane 4) . Imidlertid 30 immunoreagerer anti-hæmoglobin-IgG med 12,5 kDa-båndet i den reducerede huTF-prøve (panel B, bane 3) og immunoreagerer med 12,5 kDa renset humant hæmoglobin-protein (panel B, bane 2) . Der er ingen reaktivitet med et ikke-immun-kanin-IgG.

35

I DK 175703 B1 I

I i

H i De ovenfor anførte resultater støtter den konklusion, I

at 58 kDa formen af ikke-reduceret huTF består af 4 7 kDa I

huTF-protein, som er disulfid-bundet til hæmoglobin. I

i Det antages derfor nu, at let-kæde-komponenten på I

H 5 12,5 kDa af 58 kDa-heterodimeren beskrevet i eksempel 4 er I

or-kæden af hæmoglobin, og at dens tilknytning til 47 kDa- I

huTF-proteinet er et kunstprodukt af huTFh-isoleringsproce- I

duren. I

10 Sammenfatning qq diskussion af resultaterne i I

eksempel 1-25 I

Der er beskrevet et bibliotek af 24 monoklonale anti- I

stoffer mod human hjerne-TF, opnået ud fra to forskellige I

cellefusioner. Immunspecificiteten af hvert monoklonalt I

H 15 antistof er karakteriseret ved dot-blot, Western blot og I

radioimmunobestemmelse. De fleste monoklonale antistoffer I

reagerer med humant TF under alle tre betingelser og med I

både nativt og denatureret TF. Et af de monoklonale anti- I

stoffer, TF8-5G9, er blevet anvendt med held til rutinemæssig I

20 oprensning af TF-proteinet. Det adsorberer kvantitativt TF- I

aktivitet fra vævsekstrakter og giver konsekvent udbytter I

H af renset humant TF i mg-mængder. I

Alle undtagen et af de monoklonale. antistoffer neu- I

traliserer stærkt den funktionelle aktivitet af renset human I

I 25 hjerne-TF. Selvom adskillige monoklonale antistoffer viser I

sig at krydsreagere med TF fra bavian og abe, inhiberer I

I ingen af antistofferne koagulering af faktor Vil-frit humant I

plasma initieret af thromboplastin fra rotte, kanin, okse, I

hund, får eller svin i nærværelse af homolog faktor VII. I

I 30 Endvidere inhiberes initieringen af koagulering af normalt I

I humant plasma med kanin-hjerne-thromboplastin ikke af nogle I

af disse monoklonale antistoffer, hvilket støtter konklu- I

sionen, at inhiberingen af human TF-prokoagulerende aktivitet I

I ikke skyldes interferens af antistofferne med opløselige I

I 35 plasmakoagulationsproteiner, herunder faktor VII/VIla. I

DK 175703 B1 101

Den enkleste basis for inhiberingen af TF-prokoagu-lerende aktivitet med anti-TF-antistoffer er blokering af faktor VII/VIIa-binding. Som forventet ophæver alle 23 anti-koagulerende (neutraliserende) monoklonale antistoffer den 5 specifikke binding af faktor VII/VIIa til J82-celler, hvilket stemmer overens med den primære receptorfunktion af TF.

Dette underbygges yderligere ved dosisbestemmelse af udvalgte rensede monoklonale antistoffer, hvorved halvmaksimal in-! hibering af faktor VII-binding og halvmaksimal inhibering j 10 af hastigheden for faktor Xa-dannelse forekommer ved lignende i IgG-koncentrationer.

Et monoklonalt antistof mod humant TF er for nyligt blevet beskrevet af Carson et al., Blood, 70:490 (1987) at inhibere TF-aktivitet, tilsyneladende ved at inferere med 15 faktor VII/VIIa-binding, selvom dette ikke er undersøgt direkte. At 23 ud af 24 af de her beskrevne monoklonale antistoffer neutraliserer TF-aktivitet stærkt, er bemærkelsesværdigt. Det har været erfaringen med monoklonale antistoffer mod forskellige humane koaguleringsproteiner, at 20 kun en mindre andel neutraliserer funktionel aktivitet. Det er usandsynligt, at hybridomaerne alle er søsterkloner på grund af forskellene i deres reaktiviteter, herunder krydsreaktiviteter med primat-TF. Desuden viser igangværende epitop-kortlægningsundersøgelser, at mindst tre særskilte, 25 ikke-konkurrerende antistofbindingssteder genkendes af dette panel af monoklonale antistoffer. Det er derfor usandsynligt, at den store andel af neutraliserende monoklonale antistoffer mod TF er konsekvensen af få immunodominante epitoper, som .

også har fælles funktion. TF-aminosyresekvensen forudsiges 30 da også ved metoden ifølge Hopp et al., Mol. Immunol., ·

20:483 (1983) at indeholde flere antigene determinanter. I

Den lille størrelse af TF kan delvis forklare, hvorfor så mange monoklonale anti-TF-antistoffer blokerer faktor VII/VIIa-binding. TF forudsiges ud fra cDNA-kloning at have 35 et ekstracellulært domæne på 25 kDa, ekslusive glycosylering.

Derfor kan antistof- og faktor VII/VIIa-molekyler udvise i

I DK 175703 B1 I

I I

I sterisk hindring ved binding til det meget mindre ekstracel- I

lulære domæne af TF. Hypotesen med sterisk hindring stemmer I

overens med observationen af, at concanavalin A inhiberer I

I TF-aktivitet {Pitlick. J. Clin. Invest., 55:175 (1975)), da I

H 5 kulhydratgrupperne på TF sandsynligvis ikke er nødvendige I

I for funktionen (Nakamura, Throm. Hemost., 58:135 (1987)). I

Det er blevet overvejet, at den faktor Vll-afhængige I

prokoagulerende aktivitet, der eksprimeres af forskellige I

I celler og væv, kunne skyldes mere end en molekyleart af TF- I

I 10 lignende proteiner med lignende funktion. Imidlertid in- I

hiberer det monoklonale antistof TF8-5G9 kvantitativt den I

prokoagulerende aktivitet af rå hjerne- og placentaekstrakter I

og af lyserede fibroblaster, blærecarcinomceller og perifere I

I mononucleære blodlegemer. Selvom disse resultater ikke er I

I 15 udtømmende, støtter de konklusionen, at cellulære prokoagu- I

I lerende aktiviteter, som i øjeblikket tilskrives TF, er I

I antigent relaterede, hvis de ikke er identiske. Dette stemmer I

I overens med resultatet, at der formentlig er et enkelt gen I

for TF. I

20 Det er fornyligt blevet påvist, at de letale effekter i I

I af septisk chok kan forhindres hos bavianer ved infusion I

I af aktiveret protein C, et antikoagulerende protein, der : I

virker på mellemstadier i koagulerings-protease-kaskaden. . I

I De i den foreliggende beskrivelse omtalte undersøgelser ' I

25 viser, at monoklonale antistoffer, der inhiberer TF-aktivi- I

I tet, er høj specifikke in vivo-antikoagulerende midler, idet I

I de ved at blokere initieringen af koagulerings-protease- I

I kaskaden forhindrer det forbrug af plasmakoaguleringsfak- , I

I torer, der normalt er knyttet til patologisk aktivering af I

I 30 intravaskulær koagulering. I

I 58 kDa-formen af huTF beskrevet i eksempel 4 er påvist : I

I at være en disulfid-bundet heterodimer af 47 kDa-TF-proteinet J I

I og et ca. 12,5 kDa polypeptid, der nu er identificeret im- | I

I munokemisk og ved delvis aminosyresekvensbestemmelse som a- I

I 35 kæden af hæmoglobin. Tidligere antagelser om, at 58 kDa- I

I båndet kunne udgøre en naturligt forekommende heterodimer I

DK 175703 B1 103 form af cellulært TF, er formentlig ukorrekt, idet det er sandsynligt, at 58 kDa-heterodimeren dannes under isoleringen.

, a-Kæden af hæmoglobin har en enkelt cysteingruppe, 5 og TF forudsiges ud fra cDNA at have en enkelt cysteingruppe i det cytoplasmiske domæne. TF har også fire cysteingrupper i det ekstracellulære domæne, men mindst to må være involveret i disulfidbinding mellem kæder, da TF-funktionen går tabt efter reduktion. Den enkelte cysteingruppe i det cyto-1 10 plasmiske domæne af TF bibeholdes formentlig, ligesom cysté- iner i de fleste cytosoliske proteiner, i den reducerede tilstand. Denne (eller mindre sandsynligt en anden cysteingruppe af TF) kan være let tilgængelig for blandet disulfid-! dannelse efter cellelyse, og det foreslås, at oxidation 15 under isoleringsproceduren medfører dannelse af en disulfidbinding mellem cysteinresten af det cytoplasmiske domæne af TF og hæmoglobin. En støtte for denne konklusion er observationen af, at heterodimer-dannelsen tilsyneladende er tidsafhængig, idet minimering af tidsrummet mellem detergent-20 ekstraktion af TF fra hjerne-acetone-pulver og binding til immunoaffinitetsmatrixen formindsker mængden af dannet hete-rodimert TF. Den formodede 96 kDa TF-dimer kan også dannes ved en lignende mekanisme under isoleringen.

En anti-hæmoglobin-antistofsøjle binder specifikt 58 25 kDa-heterodimeren, men fjerner ikke kvantitativt alle stofferne med højere molekylvægt, der observeres i de immunoaf finitetsrensede TF-præparater. Spormængder af andre mindre bånd med molekylvægte over 47 kDa observeres at reagere med anti-TF-antistoffer. Disse stoffer i mindre mængder, omfat-30 tende en del af 58 kDa-båndet, kan være blandede disulfider dannet mellem TF og andre uidentificerede proteiner.

Claims (30)

1. Human vævsfaktor-bindingssted-polypeptidanalog, I omfattende ikke mere end ca. 50 aminosyrerester og omfattende I en aminosyresekvens, der svarer til en sekvens med en formel I H 5 valgt blandt følgende I I ' -VNQVYTVQIST- og I I -LYYWKS S S SGKKT- . I

2. Polypeptid ifølge krav 1, hvor polypeptidet har I formlen: I I 10 H-VNQVYTVQIST-OH eller K-LYYWKS S S SGKKT-OH. I

3. Human vævsfaktor-bindingssted-polypeptidanalog I med en formel valgt blandt følgende: I I H-EPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKC-OH, I I H-VFGKDLIYTLYYWKSS S SGKKT-OH, I I 15 H-SSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSV-OH, I I H-SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPV-OH, I I H-TKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVRQTY-OH, I I H-KSGDWKSKC-OH, I H-ECDLTDEIVKDVKQTY-OH, I I 2 0 H-LARVFSY PAGNVESTGSAGEPLYENS PEFTPYLC-OH, I I H-YENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKV-OH, og I I H-QAVIPSRTVNRKSTDSPVEC-OH. I

4. Antistofpræparat,' omfattende antistofmolekyler, I I der I I 25 a) immunoreagerer med protein med tung kæde af human I I vævsfaktor, I I b) immunoreagerer med et polypeptid med en formel I I valgt blandt følgende: I I H-EPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKC-OH I I 30 H-VFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKT-OH I I H-SSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSV-OH, I I H-SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPV-OH, I I H-TKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTY-OH, I I H-KSGDWKSKC-OH, I I 35 H-ECDLTDEIVKDVKQTY-OH, I I H-LARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLC-OH, I DK 175703 B1 105 H-YENSPEPTPYLETNLGQPTIQS FEQVGTKV-OH, og H-QAVIPSRTVNRKSTDSPVEC-OH, c) i det væsentlige ikke immunoreagerer med et poly-peptid med formlen vist i fig. 1 fra position 204 til posi-5 tion 226.

5. Hybridoma, valgt blandt hybridomaerne betegnet TF8-5G9, TF9-10H10, TF9-5B7 og TF9-6B4, der producerer antistofmolekyler, som immunoreagerer med protein med tung kæde af human vævsfaktor og et polypeptid med formlen vist i 10 fig. 1 fra rest nr. 26 til rest nr. 49, rest nr. 26 til rest nr. 49, rest nr. 26 til rest nr. 49, henholdsvis rest nr. 146 til rest nr. 167.

6. Præparat af monoklonalt antistof omfattende antistofmolekyler produceret af et hybridoma ifølge krav 5.

7. Metode til bestemmelse af tilstedeværelsen af protein med tung kæde af human vævsfaktor i en kropsvæske-prøve, omfattende følgende trin: a) blanding af en kropsprøve med antistoffer, der immunoreagerer med protein med tung kæde af human vævsfaktor, 20 som svarer til mindst rest nr. 1 til rest nr. 209 i fig. 1, til dannelse af en immunoreaktionsblanding, b) bibeholdelse af blandingen i et tilstrækkeligt tidsrum til, at antistofferne immunoreagerer med eventuel tilstedeværende human vævsfaktor i prøven og danner et immu- 25 noreaktionsprodukt, og c) påvisning af tilstedeværelsen af eventuelt immunreaktionsprodukt dannet i trin b).

8. Diagnostisk system i form af et sæt til bestemmelse af tilstedeværelsen af protein med tung kæde af human 30 vævsfaktor i en prøve, omfattende: a) en pakning indeholdende et antistofpræparat ifølge krav 4.

9. Fremgangsmåde til isolering af blodkoaguleringsfaktor VII/VIIa fra en prøve, omfattende følgende trin: 35 a) blanding af prøven med en fast bærer omfattende en polypeptidanalog ifølge krav 1 eller 3 bundet til en I DK 175703 B1 I I I ! I fase matrix, hvor der ved blandingen dannes en bindingsreak- I tionsblanding, I b) bibeholdelse af bindingsreaktionsblandingen i et I tidsrum, der er tilstrækkeligt til, at den nævnte koagule- I 5 ringsfaktor binder til det nævnte polypeptid og danner et ‘ I fastfase-kompleks og en ovenstående væske, I I c) fraskillelse af den ovenstående væske fra komplek- set, og I d) genvinding af koaguleringsfaktoren fra det fra- I 10 skilte kompleks fra trin c). I

10. Præparat omfattende en vandig opløsning af bio- I logisk aktivt protein med tung kæde af human vævsfaktor, der I i det væsentlige er frit for protein med let kæde af human I vævsfaktor, hvor proteinet med tung kæde af human vævsfaktor I ; 15 har en aminosyresekvens svarende til mindst rest nr. 1 til I I rest nr. 209 i fig. 1 og er til stede i en koncentration I I fra 0,1 pg til 100 ng pr. ml. I

11. Præparat ifølge krav 10, hvor det biologisk aktive I I protein med tung kæde af human vævsfaktor er opløst eller I I 20 dispergeret i et phospholipid, og opløsningen eventuelt I I indeholder et ikke-ionisk detergent. I

12. Diagnostisk system i form af et sæt til bestem- I H melse af koaguleringskompetencen i en karsystem-væskeprøve, I I omfattende: I 25 a) en pakning indeholdende et præparat af en vandig I I opløsning af biologisk aktivt protein med tung kæde af human I I ; vævsfaktor, der i det væsentlige er frit for protein med I let kæde af human vævsfaktor, hvor proteinet med tung kæde I har en aminosyresekvens svarende til mindst rest nr. 1 til I 30 rest nr. 209 i fig. 1, og proteinet med tung kæde er til I I stede i en mængde, der er tilstrækkelig til gennemførelse I af mindst én bestemmelse. I

13. Diagnostisk system ifølge krav 12, hvor proteinet I I med tung kæde er opløst eller dispergeret i et phosphorlipid I 35 og har en aminosyresekvens vist i fig. 1 fra position 1 til I I position 219. I DK 175703 B1 107

14. Fremgangsmåde til fremstilling af modent protein med tung kæde af human vævsfaktor, omfattende følgende trin: a) igangsætning af en kultur i et næringsmedium af pattedyrceller transformeret med et rekombinant DNA-molekyle 5 omfattende en ekspressionsvektor forenelig med de nævnte celler og operativt bundet til et første DNA-segment, der definerer et strukturelt gen, som koder for et protein med tung kæde af human vævsfaktor, som har en aminosyresekvens svarende til mindst rest nr. 1 til rest nr. 209 i fig. 1, 10 og et andet DNA-segment, der støder op til 5'-enden af det 1 første segment og koder for en aminosyrerest-leder-sekvens, der er bundet til proteinet, hvor det første og det andet DNA-segment sammen definerer et sammensat strukturelt gen, der koder for en forstadieform for det nævnte protein, 15 b) bibeholdelse af kulturen i et tidsrum, der er tilstrækkeligt til, at cellerne eksprimerer protein ud fra det rekombinante DNA-molekyle og danner det nævnte modne protein, og c) udvinding af det modne protein fra kulturen.

15. Fremgangsmåde ifølge krav 14, hvor det sammensatte strukturelle gen har en nucleotidbasesekvens vist i fig. 2 fra base nr. 34 til base nr. 786.

16. Præparat af monoklonalt antistof omfattende et fysiologisk acceptabelt fortyndingsmiddel og en mængde af 25 antistofmolekyler produceret af hybridomaet TF9-10H10 (ATCC HB 93 83) bundet til et in vivo-indikerende middel, som er effektiv til at immunoreagere med human vævsfaktor, som er til stede i en thrombus, til anvendelse ved påvisning af en thrombus in vivo.

17. Præparat af monoklonalt antistof omfattende et fysiologisk acceptabelt fortyndingsmiddel indeholdende antistofmolekyler produceret af et hybridoma valgt blandt TF9-5B7, TF8-5G9 og TF9-6B4 (ATCC HB 9658, HB 9382 og HB 9381), til anvendelse ved neutralisering af evnen af human vævs-35 faktor til at binde koagulationsfaktor VII/VIIa in vivo. I DK 175703 B1 I I 108 I

18. Polypeptidpræparat omfattende et fysiologisk I acceptabelt fortyndingsmiddel og indeholdende et polypeptid I valgt blandt: I I H-EPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKC-OH, I I ! 5 H-VFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKT-OH og I I 1 H-SSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSV-OH, I I hvor polypeptidet er til stede i præparatet i en mængde, I som er effektiv til at reagere med faktor VII/VIIa, til I anvendelse ved inhibering af bindingen af human vævsfaktor I 10 til koagulationsfaktor VII/VIIa in vivo. I H

: 19. Præparat af monoklonalt antistof omfattende et I fysiologisk acceptabelt fortyndingsmiddel og indeholdende I I antistofmolekyler produceret af hybridomaet TF8-5G9 (ATCC I HB 9382), til anvendelse ved neutralisering af evnen af I 15 human vævsfaktor til at initiere koagulation in vivo. I

20. Præparat af monoklonalt antistof omfattende et I I fysiologisk acceptabelt fortyndingsmiddel og indeholdende I I j antistofmolekyler produceret af hybridomaet TF9-5B7 (ATCC I HB 9658) til anvendelse ved neutralisering af evnen af human I 20 vævsfaktor til at initiere koagulation in vivo. I

21. Præparat af antikoagulerende monoklonalt antistof I I indeholdende antistofmolekyler, som immunoreagerer med a) I human vævsfaktor-tung kæde-protein huTFh, som har en amino- I syresekvens som vist i fig. 1 fra rest nr. 1 til rest nr. I H 25 209, og derved inhiberer evnen af det nævnte protein til at I I binde faktor VII/VIIa, og b) et huTFh:VII/VIIa-kompleks, I huTFh, som har en aminosyresekvens som vist i fig. 1 fra I rest nr. 1 til rest nr. 209, og derved inhiberer evnen af I I det nævnte kompleks til at aktivere faktor X, til anvendelse I I 30 ved inhibering af koagulation in vivo. I

22. Anvendelse af et antistof ved fremstilling af et I I medikament til neutralisering af evnen af human vævsfaktor I til at binde faktor VII/VIIa in vivo eller til inhibering I af koagulation in vivo, hvor antistoffet er produceret af I I 35 et hybridoma valgt blandt TF9-5B7, TF8-5G9 eller TF9-6B4 I I (ATCC HB 9658, HB 9382 eller HB 9381) . I DK 175703 B1 109

23. Fremgangsmåde til fremstilling og isolering af et protein, som er i stand til at binde faktor VII/VIIa, omfattende: a) start af en kultur i næringsmedium af værtsceller 5 transformeret med et DNA-molekyle omfattende en sekvens, som koder for et human vævsfaktor-tung kæde-protein, som har en aminosyresekvens svarende til mindst rest nr. 1 til rest nr. 209 i fig. 1, b) bibeholdelse af kulturen i et tilstrækkeligt tids-10 rum til, at de transformerede celler eksprimerer proteinet, og c) at delen af kulturen, som indeholder proteinet, underkastes gelfiltrering, gelchromatografi, ultrafiltrering, elektroforese, ionbytning, affinitetschromatografi eller 15 immunokemiske metoder til isolering af proteinet.

24. Fremgangsmåde til fremstilling og isolering af et protein, som er i stand til at binde faktor VII/VIIa, omfattende: a) start af en kultur i et næringsmedium af værts-20 celler transformeret med et DNA-molekyle omfattende en sekvens, som koder for mindst 90% af human vævsfaktor-tung kæde-proteinet, som har en aminosyresekvens svarende til rest nr. 1 til rest nr. 263 i fig. i, b) bibeholdelse af kulturen i et tilstrækkeligt tids-25 rum til, at de transformerede celler eksprimerer proteinet, og . c) at delen af kulturen, som indeholder proteinet, underkastes gelfiltrering, gelchromatografi, ultrafiltrering, elektroforese, ionbytning, affinitetschromatografi eller 30 immunokemiske metoder til isolering af proteinet.

25. Human vævsfaktor-protein bestående af aminosyre-resterne nr. 1 til nr. 209, nr. 1 til nr. 214 eller nr. 1 til nr. 224 i fig. 1.

26. Diagnostisk bestemmelsesmetode til bestemmelse 35 af koagulationskompetance i en prøve, omfattende følgende trin: I DK 175703 B1 I I 110 I 1. gennemførelse af en koagulationsbestemmelse til I bestemmelse af koaguleringstid ved anvendelse af en forud I valgt mængde af et human vævsfaktor-protein (huTF-protein), I som har en aminosyresekvens svarende til mindst rest nr. 1 I 5 til rest nr. 209 i fig. 1, hvor proteinet er i stand til at ' I starte koagulation i citratbehandlet plasma i nærværelse af I calciumchlorid, I H 2) tilvejebringelse af en standardkurve af koagule- I ringstider opnået ved bestemmelsen i trin 1) ved anvendelse I 10 af en række af mængder af huTF-proteinet, I 3. gennemførelse af en koagulationsbestemmelse ifølge I trin 1), idet der anvendes en prøve, som menes at indeholde I huTF, i stedet for den nævnte forud valgte mængde af huTF- I proteinet, og I 15 4) bestemmelse af koagulationskompetancen af prøven I ved sammenligning af prøvens koaguleringstid med standard- I H kurven. I

27. Diagnostisk bestemmelsesmetode ifølge krav 26, I hvor huTF-proteinet anvendt i trin 1) er et huTF-protein I 20 ifølge krav 25. I

28. DNA-segment omfattende ikke mere end 1133 nucleo- I tidbasepar, omfattende en sekvens, som koder for et opløse- I I ligt human vævsfaktor-tung kæde-protein-forstadium, med en I aminosyresekvens vist i fig. 1 fra rest nr. -32 til rest I 25 nr. 219. I

29. DNA-segment ifølge krav 28, som omfatter en nu- I cleotidbasesekvens vist i fig. 2 fra base nr. 34 til base I I nr. 786. I

30. Rekombinant DNA-molekyle omfattende vektoren I I 30 pKSV-10 forbundet operativt til et DNA-segment ifølge krav I M 29. I I 35 I