PT91500A - Processo para a preparacao de antigenio de nefrite clonado - Google Patents

Description

Referência a Pedidos de Patente Relacionados:

Este pedido de patente è uma continuação em parte dos pedidos U,S„ NQ de Serie 0 7/313.682 entregue em 22 de Fevereiro 19 89 . o qual é uma continuação em parte do pedido U„S, Νδ de Serie 07/235,211 entregue em 23 de Agosto 1988»

CAMPO DA INVENÇÃO A invenção situa-se no campo da genetica recombinante FUNDAMENTO DA INVENÇÃO» A nefrite de Heymann e um modelo induzivel em rato bem conhecido da glomerulonefrite membra-nosa humana (heymann W et al.. Proc Soc. Exp Biol. Med 100: 660 (19 59 ); Heymann et al. Ann, N,Y, Acad. Sei 124: 310 (1965)). A nefrite de Heymann è iduzida no rato através da imunização com homogenatos de rim total incorporados em adjuavante completo de Freund O antigènio responsável pela doença (designado um "nefritogènio") esta contido numa preparação de membranas derivada das regiões das bordaduras em escova tubulares dos tribulos convulotos proximais (conhecido como FX1A) e uma fraeção mais purificada (conhecida como RTE 25) foi também descrita como sendo nefritogenica (Edgington T S. et al J Exp Med 127; 555 (19 68) )

Outros investigadores identificaram glicoproteinas nefritogenicas era tais preparações de tubulos renais Por exemplo Naruse T $t al Lab Invest 33:141 (1975) descreveram o isolamento e purificação de uma gli-coproteina tubular 8 45 que era nefritogenica Kerjaschki e Farquihar isolaram uma glicoproteina tendo um peso molecular estimado em 33000 daltons (gp330) que era um antigenio patoge--nico da nefrite de Heymann Esta glicoproteina da membrana das bordaduras em escova foi purificada e caracterizada (Kerjaschki e Farquihar Kidney International 30: 229 (1986)) Outros investigadores divulgaram que uma glicoproteina de 600 000 daltons (gp 600) também um componente de FX1A. pode induzir esta doença (Makker, S.P. e Singh A,K, Lab Invest 50; 287 (19 84) No total, foram isoladas quatro subunidades de gp600 (gp330 . gp 140, gpllQ e gp70) e demonstrou-se serem nefritogenicas (Singh, A„K. e Schwartz N.M. . Clin. Immunol-Immunopathol, 48: 61-77 (1988); Makker S.P. e Singh A K..

Lab Invest, 50 ; 28 7 (19 84)) Foi também identificada (Kerjaschki. D et al - . Am. J Pathol 129 :183 (19 8 7)) uma proteina de 400 kd presente nas bordaduras em escova dos tubulos renais humanos a qual e semelhante a gp330 O papel patofisiologico de gp330 na formação de complexos imunes "in situ'1 que resulta na glomerulonefrite não esta definido No entanto pensa-se que a formação de depositos e iniciada pela reacção de autoanticorpos com gp330 na superfície de podocitos com o subsequente derrame de complexos para a membrana basal (Andre G et al Lab Invest 55: 520 (1986); Von Danne B J C et al Lab Invest 38: 50 2 (19 78); Couser W G et a) J Clin Invest 62 1275 (19 78)) O p330 foi encontrada no dominio -5-

apical do plasmalama de algumas células epiteliais, em particular túbulos renais proximais , prodocitos glomerulares intestino, pulmão (pneumòcitos tipo II) epiderme e saco da gema (Doxsey, S. et al. J. Cell. Biol. 9 7: 1784 (1983); Cha-telet, F. et al., Am. J. Pathol., 122: 512 (1986)). os estudos de imuno-microscopia electrònica demonstraram que gp330 está encqntrada nas investigações revestidas ("coated--pits") de clatrina (Bhan. A.K. et al,. Lab. Invest. 53 421 (1986)). A investigação revestida parece actuar como um filtro molecular e mediea a internalização por endocitose de proteinas receptoras especificas e seus ligandos associados. Assumiu-se que gp330 tal como uma seérie de receptores de membrana. está concentrada em imaginações revestidas e introduz o seu ligando na célula por um mecanismo conhecido como "endocite mediada por receptores" (Brown. M.S. e Goldstein. J.L.. Science. 53: 421 (1986): Goldtsein. J.L. et al. . Nature 270 :679 (19 79 )). Apesar dos avanços proporciona dos pelo estudo da nefrite de Heymann. mantem-se a necessidade de existir fontes abundantes dos polipeptideos e glicopro-teinas implicados na doença autoimune do rim para permitir o desenvolvimento de armas de diagnóstico e de novas formas de terapia para a glomerulonefrite membranosa humana e outras condições clinicas.

SOMARIO DA INVENÇÃO A invenção esta relacionada com um gene elonado que codifica φ330 da preparação de bordaduras em escova dos tubulos renais, PX1A ou um seu derivado funcional e com a proteina gp330 e seus derivados funcionais- A invenção também está relacionada com vectores compreendendo o gene elonado do invento . hospedeiros transformados com os vectores do invento e o processo para a produção da proteina por técnicas recombi-antes

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1 descreve um traçado de HPLC dos peptideos tripticos de gp33Q separados por HPLC de fase reversa

Figura 2 descreve a sequência de aminoacidos de cinco peptideos tripticos derivados de gp330

Figura 3 descreve um mapa de restrição de três fragmentos de DNA de gp330 (1,4. 0 ,6 e 0 ,4 kb) e identifica o sitio de hibridação para uma sonda oligonucleotidica de 23 bases.

Figura 4 desxeve a sequência de DNA do fragmento de DNA do fragmento de DNA de gp330 com 2.9 kb e a sequência de aminoacidos expressa a partir dele % -7-

Esta sequência foi obtida a partir de dois clones sobreponi-veis de 2.4 kb, 0 segmento transmemebranar de 29 aminoacidos esta sublinhado com um unico traço.. 0 codão de paragem esta sublinhado com dois traços.

Figura 5 descreve as estruturas comparativas de gp330 deduzidas a partir da seguêocia de nucleotideos de seis e DNAs parciais e do receptor LDL humano. As localizações de duas sequências peptidicas tripticas de gp330 estão indicadas por segmentos marcados com um ou dois asteriscos A sequência proteica deduzida a partir da sequência de DNA de 2 9 kb foi obtida a partir de dois clones sobreponiveis de 2 4 kb conforme descrito e contem um segmento transmembranar de 29 aminoacidos (marcado X) e uma cauda citoplasmatica de 188 aminoacidos (codão de paragem marcado com um triângulo aberto As regiões A a F correspondem as sequências de aminoacidos mostradas nas Figuras 6 e 6A

Figura 6 descreve uma comparação das seq-utências de aminoacidos de&330 de rato LD1R humano e EGF de ratinho.

P

Figura 7 descreve uma analise matricial de pontos das sequências de aminoacidos de gp330 de rato e de LDLp humano.

Figura 8 descreve a sequência de DNA de um fragmento de DNA de gp330 com 480 pares de bases e a sequência de aminoacidos expressa a partir dele A sequência codificada desde o par de bases 122 ate 235 e desde 245 ate 361 consiste num segmento de aproximadamente 40 aminoacidos rica em cis-teina que e homologa do dominio de ligação ao ligando do -8-

receptor cie LDL (ver Figura 6). Esta região repete-se pelo menos 14 vezes no DNA de gp330 e 7 vezes no gene do receptor do LDL. Dois segmentos cada um contendo 5 resíduos de cistei-na. também relacionados com o dominio de ligação ao ligando do receptor de LDL encontram-se entre os pares, de bases 1-109 e 33 7-480.

Figura 9 descreve a sequência de DNA de um fragmento de DNA de gp330 com aproximadamente 2,2 kb e a sequência de aminoácidos codificada a partir dele. Esta sequência, derivada cá sequência de um clone de 1,4 kb e de um clone de 1,2 kb sobreponivel (Figura 5) codifica três segmentos ricos em cisteina que são homólogos do dominio de ligação do receptor de LDL (ver Figuras 5 e 6).

DESCRIÇÃO DAS REALIZAÇÕES PREFERIDAS A invenção esta relacionada com um gene donado que codifica o antigénio gp330 de FX1A ou um seu derivado funcional. A invenção está também relacionada com vectores compreendendo os genes clonados da invenção , hospedeiros transformados com os vectores da invenção e proteínas expressas a partir deles. A invenção também proporciona métodos de tratamento de vários estados patofisiolbgicos num animal através da administração de uma composição farmacêutica compreendendo gp330 ou um seu derivado funcional. A invenção também tira partido da homologia entre o gene codificador de gp330 e o receptor de lipoproteinas de baixa densidade (LDL ) e proporciona 9- 9-

métodos para o diagnostico molecular e estudo de doenças relacionadas com anormalidades nos genes que controlam a produção de LDLR e seu funionamento tais como por exemplo Familial Hypercholesterolemia (FH). O antigenio gp330 purificado tem um psso molecular aparente de 440 000 por electroforese em gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (DSP-PAGE) Portanto o termo "gp330“ significa glicoproteina de fracção de tubulos renais de rins ou ratos normais da estirpe Spuague-Dawley ou Lewis tendo uma banda em SDS-PAGE correspondendo a Mr = 440 kd A molécula homologa de outras estirpes de ratos pode ter pesos moleculares semelhantes mas variaveis como e do conhecimento geral,

Um "derivado funcional" de gp330 è um composto que possui uma estrutura biológica ou aeti-vidade biologica funcional substancialmente semelhante a gp330, O termoi"derivado funcional" pretende incluir "fragmentos" "variantes", "analogos" ou "derivados químicos" de gp330 . 0 termo "derivado funcional" pretende também incluir glicoproteinas homologas de gp330 que estão presentes noutras especies em particular em humanos e que são os alvos de anticorpos na nefrite autoimune Um "fragmento" de gp330 refere-se a qualquer polipeptideo ou subserie de glicopeptideos da molécula Uma "variante" de gp33Q refere-se a uma molécula substancialmente semelhante em estrutura e função a totalidade da molécula ou a um seu fragmento

Uma molécula e referida como sendo 'substancialmente semelhante" a uma outra molécula se ambas as moléculas possuírem estruturas substancialmente semelhantes ou se ambas as moléculas possuírem actividade biologica substancialmente semelhante Assim. desde que duas -10-

moléculas possuam actividade substanc ialmente semelhantes, elas são consideradas "variantes" uma vez que aquele termo é aqui usado mesmo se a estrutura completa de uma das moléculas não estiver contida dentro da estrutura da outra ou se a sequência de residuos de aminoãcidos não for idêntica . Um "análogo" de gp330 refere-se a uma molécula substancialmente semelhante em função a totalidade da molécula ou a um seu fragmento. Conforme aqui e usado, uma molécula è referida como "um derivado quimico" de uma outra molécula quando contem outras fracções quimicas que não são normalmente uma parte da molécula Tais fracções podem melhorar a solubilidade abosrção ligação a receptores ou ligandos semi-vida biologica etc da molécula As fracções podem em alternativa diminuir a toxicidade da molécula eliminar ou alternar qualquer efeito secundário indesejável da molécula etc Fracções capazes de mediar tais efeitos estão descritas em Remington s Pharmaceutical Sciences (19 80 ) os processos para o acoplamento de tais fracções a uma molécula são conhecidos na area

Conforme aqui e usado o termo "substancialmente puro" ou "substancialmente purificado" pretende descrever uma proteína que esta substancialmente livre de qualquer composto normalmente associado â proteína ou no seu estado natural. i e-, sem outros componentes proteicos e açucares. O termo pretende ainda descrever uma proteína que èhomogenea por um ou tnais critérios de pureza ou homogeneidade usados pelos familiarizados com a matéria. Por exemplo. gp330 substancialmente pura apresentara caracteristicas constantes e reprodutíveis dentro dos desvios padrões experimentais para parâmetros tais como peso molecular aparecimento num meio de cromatografia. etc Os termos "substancialmente puro" ou "sufostancialmente puri ficado" não pretendem excluir misturas artificiais ou sintéticas da proteína com outros compostos Ainda os termos 11- 11-

não pretendem excluir a presença de impurezas maximas que não interferem com a actividade biologica da proteina e que podem estar presentes por exemplo. <fevido a purificação incompleta. O processo para a obtenção de gp330 por engenharia genética e seus derivados funcionais de acordo com o invento, e facilitado pela clonagem de sequências genéticas que são capaees de codificar a proteina e através da expressão de tais sequências geneticas, Conforme aqui é usado, o termo "sequência genética" pretende referir uma molécula de acido nucleico (de preferência DNA) As sequências geneticas que são capazes de codificar gp330 e seus derivados funcionais podem ser derivadas de uma variedade de fontes Estas fontes incluem DNA genomico cDNA DNA sintético e suas combinações DNA genomico pode ou não incluir introes naturais Ainda tal DNA genomico pode ser obtido em associação com sequências da região 5 do promotor do gene de gp330 Desde que a célula hospedeira para reconhecer os sinais reguladores da transcrição e de iniciação de tradução associados a expressão de proteina a região 5 pode ser mantida e empregue na regulação da transcrição e iniciação da tradução

Pode-se clonar cDNA e os clones resultantes testados com a sonda adequada para cDNA codificador das sequências pretendidas. Uma vez isolado o clone ou clones desejados, o cDNA pode ser manipulado essencialmente como o DNA genomico. No entanto, o cDNA não conterá intrões ou sequências intervenientes. 0 isolamento de DNA codificador de gp330 pode ser conseguido por uma serie de métodos Por -12- -12-

exemplo, o DMA pode ser extraido e purificado de células adequadas por meio de métodos bem conhecidos 0 DNA é então clivado em fragmentos lineares, qualquer um dos quais pode conter o gene que codifica gp33Q ou seus fragmentos. Tal fragmentação e conseguida usando enzimas do tipo nu-cleases tais como por exemplo . endonucleases de restrição que clivam o DNA em sequências de bases especificas Os fragmentos de DNA lineares são então separados de acordo com o tamanho por técnicas convencionais Tais técnicas de DNA recombinante podem ser efectuadas como descrito por Maniatis T et al Molecular Cloning A Laboartory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor New York (19 82)

Como alternativa e possivel isolar DNA codificador de gp330 ou seus fragmentos através do isolamento de mDNA que codifica gp330 (ou seus fragmentos ) e produção de cDNA a partir deles usando transcriptase reversa

Um método preferido para a clona-gem do gene gp33Q inclui a determinação da sequência de aminoãcidos de proteína ou dos seus fragmentos, apòs purificação da proteína gp33Q. tal purificação e de preferência efectuada usando cromatografia de afinidade com anticorpos policlonais ou monoclonais A proteína pode ser ainda purificada usando SDS-PAGE preparativa e electroeluição.

Ss bem que seja possivel determinai toda a sequência deaminoacidos da proteína e preferível determinar a sequência de fragmentos peptidicos Gp33Q e clivada com brometo de cianogenio ou com proteinases tais como papaina quimotripsina ou trípsina (Oike Y et al J Biol Chem 257; 9 751-9 758 (19 82)· Liu C et al Int J Pept Protein Res 21 % 209-215 (19 83)) Os peptti- 13-

deos resultantes foram separados por cromatografia liquida de alto resolução era fase reversa (HPLC) e sujeitos a se-quenciação de aminoacidos. de preferência, em sequenciadores automáticos - A sequência dos resíduos de amino· ácidos num peptideo é aqui designada pelas designações de três letras ou de uma única letra normalmente empregues que podem ser encontradas em livros de texto tais como Biochemistry. Lehninger. A. Worth Publishers New York (19 70), Quando a sequência de aminoacidos e dada na horizontal . o extremo amina esta no extremo esquerdo e o extremo carboxilo esta no extremo direito e os resíduos de aminoacidos podem ser separados por hifens Tais hifens destinam-se apenas a facilitar a apresentação de uma sequência e não devem ser pensados como indicadores de ligações químicas

Foram sequenciados um ou mais fragmentos peptldicos adequados e exmainadas as sequências de DNA capazes de os codificar Devido ao codigo genetico ser degenerado pode-se usar mais do que um codão para codificar um aminoacido partciular (Watson J D Em; Molecular Biology of the Gene 3a edição. W A Benjamin Inc Menlo Park CA (1® 77) pag 356-357) Os fragmentos peptidicos foram analisados para identificar sequências de aminoacidos que podem ser codificados pelos oligonu-cleotideos tendo o grau mais baixo de degenerescência.

Isto é conseguido através da identificação de sequências que contêm amioacidos os quais são codificados por um único codão.

Se bem que ocasionalmente uma sequência de aminoacidos possa ser codificada por apenas um unico oligonucleotideo. frequentemente a sequência de aminoacidos pode ser codificada por qualquer um de uma serie -14-

Ν de oligonucleotideos. Ê importante que enquanto todos os membros desta serie contêm oligonucleotideos capazes de codificar o fragmento peptidico e assim potencialmente contem a mesma sequência oligonucleotidica do gene. apenas um membro da série contem a sequência de nucleotideos presente no gene. Devido a este membro estar presente na série e ser capaz de hibridar com DNA mesmo na presença dos outros membros da série, é possivel empregar uma série não fraccionada de oligonucleotideos do mesmo modo que se empregaria um único oligonucleotideo para clonar o gene codificador do peptideo , A desoxinosima pode também ser usada como um "codão ambíguo" para reduzir o grau de degenerescência. Ohtsuka , E. et al J. Biol. Chem. 260 ; 2 60 5 (1985).

Usando o código genético (Watson J.D. et al ., Molecular Biology of the Gene, 4ã ed. Benjamim Cummings Publishing Co.f Menlo Park CA (1987)), podem ser identificados um ou mais oligonuclmeotideos diferentes, cada um dos quais seria capaz de codificar gp330. A probabilidade de um oligonucleotideo particular constituir de facto a sequência codificadora de gp330 pode ser calculada considerando as relações de emparelhamento de bases anormais e a frequência com que um codão partciualr é de facto usado (para codificar um aminoàcido particular) em células eucarióticas . Usando tais "regras de utilização de codões" como descrito por Lathe. R. et al J. Molec. Biol. 183 1-12 (1985) identifica-se um unico oligonucleotideo ou uma serie de oligonucleotideos que contem uma sequência de nucleotideos teoricamente mais provável capaz de codificar as sequências de gp330. O oligonucleotideo ou série de oligonucleotideos contendo a sequência teoricamente "mais provável" capaz de codificar fragmentos do gene gp330 , facultativamente contendo desoxinosina, foi usado para identificar a sequência de um oligonucleotideo complementar 15-

ou série de oligonucleotideos que e capaz de hibridar com a sequência "mais provável" ou serie de sequências Um oligo-nucleotídeo contendo tal sequência complementar pode ser empregue como sonda para identificar e isolar o gene gp330 a partir de uma preparação de DNA genomico ou de cDNA (Maniatis T et al Molecular Cloning A Laboratory Manual Cold Spring Harfoor Press Cold Spring Harbor NY (1982)

Assim resumindo a identificação de uma sequência de aminoacidos de um fragmento de gp330 prmite a identificação de uma sequência de DNA teoricamente "mais provável" ou de uma serie de tais sequências capazes de codificar tal peptideo Através da construção de um oligo-nucleotideo ou serie de oligonucleotideos complementares desta sequência teórica ou sequências "mais prováveis" , obtem-se uma molécula de DNA ou serie de moléculas capazes de funcionaram como sondas para identificai e isolar o gene gp330

Um oligonucleotideo adequado ou serie de oligonucleotideos que è capaz de codificar um fragmento do gene gp330 (ou que e complementar de tal oligonucleotideo. ou serie de oligonucleotideos) foi identificado usando o processo atras descrito sintetizado e hibri-dado por meios bem conhecidos na area com uma preparação de DNA derivada de células capazes de expressar o gene gp330 A fonte de DNA ou cDNA usado tera sido preferencialmente enriquecido em sequências de gp33Q Tal enriquecimento pode ser facilmente ser obtido a partir de cDNA obtido por extracção de RNA de células que expressam niveis elevados do gene gp330 Os membros da biblioteca de DNA atras descrita que se observou serem capazes de tal hibridação foram então analisados para determinar o grau e natureza das sequências codificadoras de gp330 que eles contêm

As técnicas de hibridação de ácidos nucleicos estão descritos por Maniatis, T., et_ al (Em: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring

Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY (19 82)) e por Haymes, B. D. et al^ (Em: Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985)), am -17- -17-

vel. Exemplos de tais enzimas incluem mas não estão limitados a. beta-galactosidase. fosfatase alcalina e peroxida-se. Técnicas como as descritas atrás ou semelhantes a elas. permitiram a clonagem com êxito de genes de aldei'do-desidrogenases humanas (Hsu, L.C. et al. , Proc. Natl. Acad . Sei. USA 82: 3771-3775 (1985)). fibromecti-na (Suzuki, S. et al. , Eur. Mol. Biol. Organ. J. 4: 2519--2524 (1985)) o receptor de estrogênios humano (Walter, P. et al., Proc. Natl. Acad, Sei. USA 82 : 78 89-^789 3 (19 85)) activador do plasminogénio de tecido (Pennica. D. et^ al. . Nature 301: 214-221 (1983)) e fosfatase alcalina de placenta humana (Kam. W. et al^. . Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82: 8 715-8 719 (19 85 )).

Uma sequência de DNA codificadora de gp330 ou dos seus derivados funcionais pode ser recombinada com DNA compreendendo um DNA de acordo com técnicas convencionais. incluindo extremos cerses ou coesivos para ligação. digestão com enzimas de restrição para proporcionar os extremos adequados. preenchimento dos extremos coesivos conforme adequado, tratamento com fosfatase alcalina para evitar uniões indesejàeis e ligação em ligases adequadas. As técnicas para tais manipulações estão descritas por Maniatis et al., supra e são bem conhecidas na área.

Uma molécula de ácido nucleico como seja DNA é rderida como sendo "capaz de expressar" um polipeptideo se ela possuir sequências nucleotidicas que contêm informação reguladora da transcrição e da tradução e tais sequências são "operacionalmente" ligadas às sequências de nucleotideos que codificam o polipeptideo.

Uma ligação "operacional" é uma ligação em que as sequências 18-

de DMA regulador e a sequência de DNA a ser expressa estão ligadas de modo a permitir a expressão de genes A natureza precisa das regiões reguladoras necessárias a expressão do gene podem variar de organismo para organismo mas geralmente incluem uma região promotora que em procariotas contem o promotor (o qual dirige a iniciação da transcrição de RNA) assim como as sequências de DNA que quando transcritas em RNA servem de sinal a iniciação da síntese proteica Tais regiões normalmente incluem as sequências não codificadoras 5 envolvidas na iniciação da transcrição e da tradução tais como caixa TATA sequência de “capping" sequência CAAT e similares

Caso se pretenda. a região não codificadora 3· para a sequência codificadora pode ser obtida pelos métodos atras descritos Esta região pode ser mantida devido as suas sequências reguladoras de terminaÇfo da transcrição e de poliadenilação- Assim, através da retenção da região 3‘ naturalmente contígua a sequêcia codificadora da proteína podem ser conseguidos sinais de terminação da transcrição. Sempre que os sinais de terminação da transcrição nao sejam satisfatoriamente funcionais para a expressão numa célula hospedeira particular então pode--se substituir por uma região 5 funcional na célula hospedeira

Duas sequências de DNA (e g uma sequência da região promotora e uma sequência codificadora de gp330) sáo referidas como estando operacionalmente ligadas se a natureza da ligação entre as duas sequências de DNA não; (1) resultar na introdução de uma mutação por desvio da grelha de leitura (2) interferir com a capacidade da sequência da região do promotor para dirigir a transcrição do gene gp330 ou (3) interferir com a capacidade da sequência do gene gp330 para ser transcrita sob o controle da sequência da região do promotor. Assim, uma região do promotor estará operacionalmente ligada a tuna sequência de DNA se o promotor for capaz de efectuar a transcrição daquela sequência de DNA„

Para expressar a proteina. são necessários sinais de transcrição e tradução reconhecidos por um hospedeiro adequado. 0 presente invento engloba a expressão da proteina gp330 (ou um seu derivado funcional) em células procariotas ou eucariotas Hospedeiros procario-ticos preferidos incluem bactérias tais como E coli Salmonella typhimurium Seratia marcescens especies de Bacillus especies de Streptomyces especies de Pseudomonas etc 0 hospedeiro procariotico fhais preferido e E coli Quando expresso em tais hospedeiros bacterianos gp33G não sera gLicosilado 0 hospedeiro procariotico deve ser compa-tivel com o replicão e sequências de controle no vector de expressão ou plasmldeo

Para expressar a proteina gp330 (ou um seu derivado funcional) em células procariòticas , è necessário ligar operacionalmente a sequência codificadora de gp330 a um promotor procariotico funcional. Tais promotores podem ser constitutivos ou de preferência, reguláveis (i,e. . iduziveis ou desreprimiveis). Exemplos de promotores constitutivos incluem o promotore int do bacteriofago 0 promotor bla do gene da p-lactamase do pBR322 e o promotor CAT do gene de cloramfenicol-acetil-transferase do pPR325. etc. Exemplos de promotores procarioticos induziveis incluem os principais promotores direito e esquerdo do bacteriofago /"'(P^ e Ρ^) os promotores trp recA lacZ lacl e gal de E coli os promotores específicos da ^-amilase / Ulmanen

1 et al J Bacteriol 162" 176-182 (19 85)) e de ^-28 de B subtilus (Gilman Μ Z et a^l Gene 32; 11-20 (1984)) os promotores dos bacteriofagos de Bacillus (Gryczan T J 20-

Ems The Molecular Biology of the Bacilli Academic Press.

Inc NY (1982) ) e promotores de Streptomyces (Ward J M et al . Mol Gen Genet- 20 3: 468-4 78 (19 86))

Os promotores procarioticos foram revistos por Glick. B,R„. (J, Ind Microbiol.. 1: 277-282 (1987)); Cenatiempo. Y, (Bio-chimie 68: 505-516 (19 86))“ e Gottesman, S, (Ann, ReVo Genet ±8 , 415-442 (19 84))* A expressão correcta numa célula procariòtica também requere a presença de um sitio de ligação ao ribossoma a montante da sequência codificadora. Sitio de ligação ao ribossoma. tais como a sequência de Shine--Dulgarno foram divulgados por exemplo por Gold L et al . (Ann. Rev Microbiol 35: 365-404 (1981)).

Hospedeiros eucarioticos preferidos incluem leveduras fungos células de mamífero (especialmente células humanas) in vivo ou em cultura de tecidos As células de mamifero proporcionam modificações pos-tradu-çâo as moléculas de proteína incluindo glicosilação nos sitios correctos e enrolamento tridimensional correcto As células de mamifero que podem ser uteis como hospedeiros incluem células de origem fibroblastica tais como VERO ou CHo -Kl ou células de porigem linfoide tais como o hibridoma SP2/0-AG14 ou o mieloma P3x63Sg8 e seus derivados As células hospedeiras de mamifero preferidas incluem SP2/0 e J558L, assim como linhas celulares de neuroblastoma tais como IMR 332 que podem proporcionar melhores capacidades para o processamento pòs-tradução correcto* s

Para um hospedeiro mamifero, existem vários sistemas de vectores disponíveis para a expressão gp330. Pode ser empregue uma grande variedade de sequência reguladoras da transcrição e da tradução dependendo da natureza da célula hospedeira Os sinais reguladores da -21

s transcrição e da tradução podem ser derivados de fontes animais F tais como adenovirus, virus do papiloma bovino vírus Símio ou similares onde os sinais reguladores estão associados com um gene particular que tem um nivel de expressão elevado - Como alternativa, podem ser empregues promotores de genes em mamiferos, tais como os da actina. cola-génio, miosina, etc.. Os sinais reguladores da iniciação da transcrição podem ser seleccionados de modo a permitir a repressão ou activação para a expressão dos genes poder ser modulada São de interesse os sinais reguladores sensive:. a temperatura de tal modo que a variação de temperatura pode ser usada para reprimir ou iniciar a expressão ou sinais que estão sujeitos a regulação quimica e g metaboli- tos

As células de levedura proporcionam vantegens substanciais como células hospedeiras devido a sua capacidade para efectuar modificações dos peptideos pos--tradução incluído glicosilação Existe uma serie de estratégias de DNA recombinante que utilizam sequências promotoras fortes e plasmideos de elevado numero de copias que podem ser utilizados na produção das proteinas pretendidas em levedura. As células de levedura reconhecem sequências lider em prpodutos de genes clonados de mamífero e secretam peptideos portadores de sequências lider (i.e. . pré-pepti-deos),

Pode ser utilizado qualquer um de uma serie de sistemas de expressão de genes em levedura incorporando elementos promotores e de terminação derivados de genes activamente expressos codificadores de enzimas glicoliticas produzidas em grandes quantidades quando as leve duras são cultivadas em meio rico em glucose Genes glico-liticos conhecidos podem também proporcionar sinais de controle da transcrição muito eficazes Por exemplo podem ser utilizados os sinais de promotor e terminador do gene -22-

da fosfoglicerato-cinase

Conforme discutido atras, a expressão da proteina gp330 em hospedeiros euaariotas requere a utilização de regiões reguladoras eucarioticas, Tais regiões incluirão, em geral, uma região promotora suficiente para dirigir a iniciação da sintese de RNA. Os promotores eucariòticos preferidos incluem o promotor do gene da meta-lo tioneina I de ratinho (Hanner, D, , et al. , J.. Mol. Appl. Gen. 1^: 2 73-288 (1982)); o promotor TK do virus Herpes (Mcknight S,, Cell 31: 355-365 (1982)); o promotor precoce de SV40 (Acnoist, C. . et ai, Nature (London) 290 : 30 4-310 (1981)); o promotor do gene ga!4 de levedura (Johnston. S A et al Proc. Natl Acad Sei (USA) 79 69 71-69 75 (19 82); Silver. P A. et al Proc Natl Acad Sei (USA) 81: 5& 51--59 5 2 (19 8 4))

Conforme e largamente conhecido a tradução de mRNA eucariotica e iniciada no codão que codifica a primeira metionina Por este motivo e preferível assegurar que a ligação entre um promotor eucariotico e uma sequência de DNA que codifica a proteina gp330 (ou um seu derivado funcional) não contenha quaisquer codões intervenientes que sejam capazes de codificar metionina (i e AUG) A presença de tais codões resulta na formação de uma proteina de fusão (se o codão AUG estiver na mesma grelha de leitura da sequência de DNA codificador de gp330 ou mma mutação por desvio da grelha de leitura (se o codão AUG não estiver na mesma grelha de leitura da sequência codificadora de gp330). A sequência codificadora de gp330 e um promotor operacionalmente ligado podem ser introduzidos numa célula recipiente procariotica ou eucariotica como uma molécula de DNA não replicativo (ou RNA) que -23-

pode ser uma molécula linear ou. de preferência uma molécula circular covalentemente fechada Uma vez que tais moléculas são incapazes de replicação autonoma a expressão da proteína gp330 pode ocorrer atrves da expressão transitória da sequência introduzida Como alternativa aaexpressão permanente pode ocorrer através da integração da sequência introduzida no cromossoma do hospedeiro

Numa realização empregou-se um vector que e capaz de integrar as sequências de DNA pretendidas no cromossoma da célula hospedeira. As células que possuem o DNA introduzido estavelmente intergrado nos seus cromossomas podem ser seleccionadas através da introdução de uma ou mais marcas que permitam a selecção de células hosped^ ras que contenham o vector de expressão. A marca pode proporcionar prototrofia a um hospedeiro auxotrófico, resistência ã biocidas, e„g antibióticos ou metais pesados, tais como cobre ou similares. 0 gene da marca seleccionavel pode ser directamente ligado as sequências de DNA do gene a ser expresso ou introduzido na mesma célula por co-transfo^ mação ou cotransfecção Podem também ser necessários elementos adicionais para a sintese óptima de mRNA de cadeia simples de ligação a proteínas Estes elementos podem incluir sinais de "splicing" assim como promotores poten-ciadores e sinais de terminação da transcrição Vectores de expressão de cDNA incorporando tais elementos incluem os descritos por Okayama H Mol Cell Biol 3 i 280 (19 8 3)

Numa realização preferida a sequência introduzida sera incorporada num plasmideo ou vector virai capaz de replicação autonoma no hospedeiro recipiente Para esta finalidade pode ser empregue qualquer um de uma larga variedade de vectores. Factores importantes na selecção de um plasmideo particular ou vector virai incluem: a facilidade com que as células recipientes que contêm o 24-

vector podem ser reconhecidas e seleccionadas de entre as células recipientes que não contêm povector; o numero de cópias do vector que se pretendem num hospedeiro particular; e se e desejável ser-se capaz de fazer "vai-vem" do vector entre células hospedeiras de especies diferentes Vectores procariotas preferidos incluem plasmideos tais como os capazes de replicação em E coli (como seja por exemplo pBR322 Col EI pSClOl pACYC 184 VX) Tais plasmideos são por exemplo cfescritos por Maniatis T et al . (Em: Molecular Cloning A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press Cold Spring Harbor NY (1982)) Os plasmideos de Bacillus incluem pCl94 pC221 pTl27 etc Tais plasmideos estão descritos por Gryczan T (Em: The Molecular Biology of the Bacilli. Academic Press NY (19 82) pag. 30 7-329 ) Plasmideos de Streptomyces adequados incluem pIJlOl (Kendall. K.J., et al. . J- Bacteriol. 169 : 41 77-41 83(19 8 7)) e bacteriófagos de Streptomyces tais como 0 C31 (Chater, K.P., et al., Em: Sixth International Symposium on Acti-nomycetales Biology, Akademiai Kaido, Budapest, Hungary (1986), pãg. 45-54). os plasmideos de Pseudomonas foram revistos por John, J.F. et al (Rev. Infect. Pis. 8: 693--70 4 (19 86)) e Izaki, K„ (Jpn. J. Bacteriol, 33: 729-742 (19 78)).

Plasmideos eucarioticos preferidos incluem BPV. vacina SV40 . circulo de 2 micron. etc. ou seus derivados tais plasmideos são bem conhecidos na area (Botstein. D et, al Miami Writr Symp 19 : 265-2 74 (1982); Broach J R Em: The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor NY p 445-470 (1981); Broach J R Cell 28:20 3-20 4 (1982): Bollon D P ei: al J Clin Hematol Oncol 10: 39-48 (19 80 ); Maniatis T Em: Cell Biology: A Comprehensive Treatise Vol 3 -25- -25-

Gene Expression, Academic Press, NY. pag„ 563-60 8 (19 80 )),

Uma vez preparado para expressão o vector ou sequência de DNA contendo a(s) construção(ões) o DNA da(s) construção(ões) pode ser introduzido numa célula hospedeira adequada através de uma variedade de meios adequados: transformação, transfecção, conjugação, fusão de protoplastos, electroporação. precipitação com fosfato de cálcio, microinjecção directa. etc Apos a introdução do vector . as células recipientes são cultivadas num meio selectivo o qual selecciona o crescimento de celulasxcon-tendo o vector A expressão da(s) sequência(s) do gene clo-nado resulta na produção da proteina gp33Q ou na produção de um fragmento desta peoteina Isto pode ter lugar nas células transformadas como tal ou apos a indução destas células no saiido da diferenciação (por exemplo através da administração de bromodesoxiuridina a células de neuro-blastoma ou similares) A proteina expressa pode ser- isolada e purificada de acordo com condições convencionais tais como extracção. precipitação, cromatografia cromato-grafia de afinidade, electroforese ou similares, O invento também esta relacionado com genes clonados que codificam uma proteina de fusão compreendendo gp339 ou um seu fragmento e uma enzima de-tectãvel como seja- a beta-galactosidase„ Métodos para a produção de tais proteínas de fusão estão descritos . por exemplo, em Bai, D.H. et al.. J. Biol. Chem. 261: 1239 5-(1986) ou Huynh, T„V. et al , em DNA Cloning Techniques: : A Practical Approach . D Glover (ed). IRL Press Oxford 19 85. pag 49 - 77. -26- -26-

A gp330 seu derivado funcional ou proteina de fusão contendo gp330 ou um seu fragmento e uma enzima detectavel pode ser isolada de acordo com métodos convencionais conhecidos dos familiarizados com a matéria Por exemplo as células podem ser colhidas por centrifugação ou com tampões adequados lisadas e a proteina isolada por croaatografia em coluna, por exemplo, em DEAE--celulose , f osf ocelulose .. acido poliribocitidilico-agarose hidroxiapatite ou por electroforese ou imunoprecipitação, A gp330 ou um seu derivado funcional ou proteina de fusão compreendendo gp330 e uma enzima detectavel podem ser isolados através da utilização de anticorpos anti-gp330 A preparação de soros policlonais de coelho anti-gp330 esta descrita no Exemplo 2 abaixo

Os métodos atras descritos permitem pois. a identificação de sequências geneticas que sejam capazes de codificar a proteina gp33Q ou fragmentos desta proteina Para caracterizar melhor tais sequências geneticas e desejável expressar as proteinas que estas sequências codificam e confirmar que elas possuem caracte-risticas dos peptideos gp330 Tais caracteristicas podem incluir a capacidade para ligar anticorpos anti-gp330 a capacidade para induzir a produção de anticorpos anti--gp33Q ou para desempenhar qualquer uma das funções biológicas de gp330 tais como ligação a proteina 76KD de soro que poderá ser um ligando para gp330 (Kanalas JJ et al J Immunol 141: 4152 (19 88)).

Um anticorpo é referido como sendo "capaz de ligação" a uma molécula se fôr capaz de reagir especificamente com a molécula formando uma ligação não covalente. 0 termo "epitopo" refere-se à porção minima de uma estrutura maior que pode ser reconhecida por um anticorpo resultando em ligação, 2 7

0 epitopò e assim definido em termos do anticorpo que se liga especificamente a ele e não a outros epitopos na estrutura naior. Conforme è usado na área e aqui nesta invenção. 0 termo "antigenio" inclui uma estrutura molecular compreendendo um ou mais de um epitopo. Um "antigenio" adequadamente apresentado è capaz de induzir um animal para produzir um anticorpo capaz de ligar "especi-ficamente" um epitopo daquele antigenio, A "especificidade" pretende indicar que o anticorpo reagira de modo altamente selectivo com o seu correspondente antigenio e não com outros antigenios Inversamente. o antigenio especifico não reagira com o enorme numero de outros anticorpos que foram induzidos por outros antigenios

Os termos "anticorpo" (Ab) ou "anticorpo monoclonal" (Mato) conforme aqui usados pretendem incluir moléculas intactas assim como fragmentos tais como por exemplo os fragmentos Fafo e F(ab ) que são capazes de se ligar a um antigenio Os fragmentos Fab e F(ab )2 não possuem o fragmento Fc do anticorpo intacto são removidos mais rapidamente da circulação e podem apresentar menor ligação inespecifica a tecidos do que uma molécula intacta de anticorpo (Wahl et al J Nucl Med 24; 316-325 (1983)

Os anticorpos do presente invento podem ser preparados por qualquer um de uma variedade de métodos, Por exemplo, as células que expressam a proteína gp330. ou um seu derivado funcional podem ser administrados a um animal, Os soros de tais animais imunizados contêm anticorpos policlonais que são capazes de ligação a gp330.

Numa realização mais preferida os anticorpos do presente invento são anticorpos monoclonais Tais anticorpos monoclonais podem ser preparados usando tecnologia de hibridomas (Kohler et al Nature 256;495 -28-

(19 75); Kohler et al Eur J Immunol 6; 511 (19 76);

Kohler et al Eur J Inununol 29 2 (19 76); Hammerling et al Em; Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas Elsevier N Y pag 563-681 (1981)) Era geral tais processos envolvera imunização de um ratinho ou rato cora o antigenio gp33Q As células do baço de animais imunizados são então removidas e fundidas com células de uma linha celular de mieloma adequada Qualquer linha celular de mieloma adequada pode ser empregue de acordo cora o presente invento Apos fusão, as células de hibridoma resultantes são selecciona-das em meio HAT e depois clonadas por qualquer um de uma série de métodos incluindo o da diluição limite como descrito por Wands . J.R„„ et al (Gastroenterology, 80 : 225-236 (1981) cuja referência è aqui incluida por referência). As células de hibridoma clonadas assim obtidas são então testadas para se identificar clones que secretem anticorpos capazes de se ligarem a gp330.

As sequências de DMA que codificara gp330 ou um seu fragmento podem ser usadas como sondas de DNA para isolar DNA codificador da molécula analoga em humanos ("analogo humano1) de acordo com os métodos atras descritos para o siolamento de gp330 de rato com sondas marcadas Os genes humanos podem ser então clonados e expressos num hospedeiro para produzir o analogo humano de gp330 Esta proteína humana ou glicoproteina pode ser então usada em ensaios de diagnostico para detecção do correspondente autoanticorpo e para o tratamento terapêutico de glomerulonefrite membranosa humana A invenção também esta relacionada com um método para o tratamento de glomerulonefrite através do acoplamento de gp330 ou um seu derivado funcional a um polifenol seguido de imunização de um animal com o polifenol-gp330, resultando assim na supressão da produção -29- -29-

de anticorpos caracteristicos de glomerulonefrite e na prevenção ou melhoramento dos sintomas da doença Tais conjugados de polifenol podem ser preparados de acordo com a Patente U S No 4 702 907 de Becker et al a divulgação da qual aqui e incluída por referência na sua totalidade Em particular este aspecto do invento esta relacionado com um método para a imuno-supressão selectiva de anticorpos anti~gp330 em que o referido anticorpo não e do isotipo IgE o qual se caracteriza por: (a) acoplamento de um polifenol do tipo rutina. tendo pelo menos dois grupos hidroxilo. a gp330 ou um seu derivado funcional que e capaz de induzir nefrite do rim. formando assim um produto resultante, desde que se estiverem presentes apenas dois grupos hidroxilo no referido polifenol, os grupos hidroxilo estão numa posição orto um em relação ao outro e (to) injecção de uma quantidade suficiente do conjugado resultante por via intradermica a um indivíduo conduzindo a supressão selectiva de anticorpos específicos de gp330 ou seus derivados funcionais E também possível utilizar gp330 ou seus derivados funcionais para remover selectivamente autoanticorpos reactivos com gp330 do soro de um animal ou humano Nesta realização a gp330 ou seu derivado funcional e imobilizado num suporte de fase solida O sangue ou soro do animal e passado através deste suporte contendo antige-nio para remover selectivamente autoanticorpos os métodos para ligar peptideos a superfícies são bem conhecidos e podem ser facilmente adaptados para usar nesta invenção. 30- 30-

Por exemplo, um aminoácido terminal do antigénio polipeptidico pode reagir com um grupo reactivo carbonilo, carboxilato. hidroxilo ou amina de um polimero solido (ou de um grupo de ligação ligado ao polímero), 0 revestimento de superfícies de plazstico ou de vidro com peptideo não modificado pode também ser usado para proporcionar uma superfície imunologicamente reactiva Ver Pedido PCT Publicação No W086/0409 3 e patente U S NQ 4 362 155

Assim numa realização o invento inclui um método paratratar glomerulonefrite membranosa humana que se caracteriza por^ (a) obtenção de um suporte solido com gp330 um seu derivado funcional ou um seu analogo humano imobilizado que e capaz de se ligar com um autoanticorpo caracteristico de glomerulonef ri te membranosa humana; e (b) contactar o sangue de um paciente com a gp33Q. seu deriva do funcional ou um seu analogo humano imobilizado obtido no passo (a). através da qual autoanticorpos caracteristicos de glomerulonef rite humana são removidos do sangue A remoção dos anticorpos anti~gp330 do sangue do paciente diminuirá a formação de complexos imunes in vivo e reduzira a subsequente doença inflamatória A gp330 ou seu derivado funcional produzido de acordo com este invento pode também ser directa-mente administrado a um hospedeiro necessitado de modo a evitar a formação de complexos imunes Ver Pedido PCT Publi- -31-

cação No WO86/0 4Q9 3 A formação de complexos imunes num estado autdmune depende da presença de concentrações criticas do antigenio e do anticorpo; apenas em certas proporções se dara a formação dos complexos Presume-se que esta proporção seja óptima durante periodos de crise no estado autoimune. Através do método do presente invento, a injecção de gp330 substancialmente pura ou de seus derivados funcionais. altera rá a proporção de antigenio-anticorpo e inibe a formação de novos complexos.. 0 sistema retiçuloendotelial e fagòcitos pode remover eficazmente complexos imunes pre-formados e evitar o depósito de complexos imunes no rim que conduz a glomerulonefrite-

Peptideos sintéticos de gp330 ou seus derivados funcionais são terapêuticamente uteis devido a sua capacidade para inibir a activação ou função de células T "auxiliares1 ('helper") e citotoxicos especificas de antigenio (Guillet J G etsd Science 235; 865-8 70 (1987)) especificas para gp33Q ou ura antigenio analogo humano associado a glumerolonefrite aembranosa Tais peptideos iraunogenicos sáo produzidos e selecionados através da sinte-se de aries de peptideos sobreponiveis e testando estes em ensaios de proliferação de linfocitos ou de citotoxicidade Tal terapia destina-se a reduzir as respostas de células T que actuam na glomerulonefrite membranosa auto-imune. incluin do imunidade mediada por células e a produção de autoanti-corpos que são regulados por células T "auxiliares" especificas de antigenio

Peptideos sintéticos ou proteínas de fusão truncadas são também uteis na localização de sitios imunodominantes de gp330 que os linfocitos B ou T reconhecem. Alguns destes peptideos antigènicos permitem assim a detecção de autoanticorpos específicos de gp330 e de células T "auxiliares". citotoxicas ou supressoras que sejam especificas para gp330 ou antigenios nefritogenicos relacionados E também claro para os faliliari-zados com a matéria que os reagentes de imunodiagnostico deste invento incluindo as preparações de antigenio e de anticorpo são uteis na identificação de pacientes que possam desenvolver glomerulonefrite memforanosa autoimune idiopatica assim como a identificação de pacientes que possam desenvolver glomerulonefrite memforanosa autoimune apos receber um transpalante renal

Surpreendentemente. os inventores descobriram que a sequência proteica de gp330 apresenta homologia com o precursor do factor de crescimento epidérmico (EGF ) de ratinho e com o receptor de lipoproteinas de baixa ir densidade humano (LDLR)„ 0 LDLR inclui 7 segmentos repetidos com cerca de quarenta aminoacidos (Yamamoto. T- et al ,

Cell 39 : 27-38 (19 84) aqui incluídos como referência). Uma sequência homologa 9 de cerca de 40 aminoacidos foi encon-1 trada em gp330 em pelo menos quatorze repetições separadas O dominio citoplasmico altamente conservado de LDLir contem uma sequência de sete aminoacidos (NFDNPVY) que e semelhante as duas sequências que foram identificadas num receptor de asialoglicoproteinas do figado A sequência proteica de gp330 revela três de tais sequências repetidas· a primeira começa em 2370 (Figura 4) e tem a sequência IFENPMY* a segunda começa em 2470 (Figura 4) e tem a sequência NVENQNY; a terceira começa em 2608 (Figura 4) e tem a sequência ΝΪΕΝΡΪΥ pensa-se que estas sequências repetidas sejam importantes no rpocesso de endocitose Assim o seu reconhecimento permite que se construam proteínas receptoras recombi-nantes (contendo uma ou mais destas sequências) e localizar tais receptores artificiais em vesículas endodticas·

Assim unindo a(s) sequência(s) repetida(s) ao extremo car-boxilo de uma molécula, e possível transferir tal molécula -33

V * »· para o endossoma. A molécula gp330 tem uma cauda carboxi-terminal de 188 aminoacidos de comprimento e difere do LDL^ na sequência que vai desde o extremo da região trans-membranar ate ao extremo carboxilo da molécula 0 reconhecimento da homologia entre gp33Q e o peptideo precursor de FGF permite a utilização de gp330 ou de um seu derivado funcional para o diagnostico ou tratamento de outras condições patofisiologicas em animais Por exemplo gp330 substancialmente puro ou um seu derivado funcional pode ser administrado a um animal para induzir uma resposta caracteristica de EGF por exemplo aumentando a cicatrização de feridas tais como queimaduras e raspaduras Ver Patente U S N® 4 743 6 79 (19 88).

Uma realização deste invento esta relacionada com um método para o tratamento de feridas, compreendendo a administração a um animal de uma composição farmacêutica caracterizada pors (a) gp330, um seu derivado funcional ou um seu analogo humane e (b) um veiculo farmacêuticamente aceitavel em que o referido gp330 seu derivado funcional ou seu analogo humano esta presente numa quantidade eficaz para tratar a ferida

Alguém familiarizado com a matéria poderá determinar a quantidade de gp33Q seu derivado funcional ou analogo humano eficaz para o tratamento de -34-

feridas através de experimentação de rotina EGP e também conhecido como um forte inibidor da secreção acida gastrica, Ver Patente U.S. No. 4 7436 79 (19 88) Pedido de Patente Europeia, Publicação No. 0 177 915 (publicado em 19 86) e Pedido PCT Publicação No. WO85/Q0369 , Assim. gp33Q . um seu derivado funcional ou um seu analogo humano e util no tratamento ou prevenção de Ulceras gastricas.

Este aspecto da invenção relaciona-se com um método para o tratamento ou prevenção de ulceras gastricas num animal caracterizado pela administração a um animal de uma composição farmacêutica compreendendot (a) gp330 um seu equivalente funcional ou um seu analogo humano; e (b) um veiculo farmacêuticamente aceitavel em que a referida gp330 seu equivalente funcional ou seu analogo humano esta presente numa quantidade eficaz para tratar ou prevenir a referida ulcera.

Alguém familiarizado com a matéria poderá determinar a quantidade de gp330 , seu derivado funcional ou seu analogo humano que è eficaz no tratamento ou prevenção de úlceras gástricas apenas com experimentação de rotina

Os indivíduos com Familial Hyper-· cholesterolemia (PH) poderão ser diagnosticados através da determinação da presença de uma mutação no gene que co-

difica o receptor de LDL Isto pode ser conseguido através do despiste de DNA fragmentado de um paciente com cDNA re-combinante codificador da proteina receptora de LDL» Ver patente U„S» No 4 745 050 (1988)» Uma ve2 que clones de cDNA codificadores de fracções de gp330 apresentam 41 e 35% de homologia com o gene do receptor de LDL, cDNA de gp330 ou seus fragmentos deverão também ser úteis no diagnostico de pacientes tendo mutações no gene LDL, A hibridação efectua da no nivel adequado de pressão forte bem conhecida na àrea permitira que DNA genòmico derivado de individuos com mutações no gene do receptor de LDL hibridem com gp33Q ou seus fragmentos. mais ou menos fortemente do que o DNA de um indivíduo normal Tal hibridação alterada permite a detecção de FH em pacientes

Uma realização deste invento relaciona-se com um método para a detecção de uma anormalidade genetica envolvendo o gene do receptor de LDL (e g FH) num animal caracterizado pors (a) isolamento de DNA de um animal suspeito de ter FH * (b) fragmentação do referido DNA obtido no passo (a) para dar fragmentos de DNA; (c) separação dos fragmentos de DNA obtidos no passo (b); (d) contactar os referidos fragmentos de DNA separados obtidos no passo (c) com o cDNA de gp33G marcado de modo detectá-vel ou um seu fragmento; e (e) detecção de hibridação do cDNA de gp330 ou seu fragmento com os referidos fragmentos de DNA sqarados -36-

o padrão dos fragmentos do gene do receptor de LDL obtido a partir de um indíviduo suspeito de ter PH pode ser comparado com o padrão obtido a partir de um indivíduo normal Se o padrão dos fragmentos do gene do receptor de LDL identificados no indivíduo suspeito apresentar uma alteração relativamente ao padrão da testemunha foi detectada uma anormalidade genetica ou mutação Tais anormalidades geneticas podem incluir mutações pontuais desvios de grelhas de leitura deleções , inserções inversões . etc . e são do conhecimento geral

De acordo com este método. o DNA pode ser fragmentado segundo qualquer método conhecido dos familiarizados com a matéria, por exemplo através da digestão com enzimas de restrição, Osfrag*}@ntos de DNA resultantes podem ser separados, por exemplo, por peso molecular usando sedimentação por velocidade através de um gradiente êe densidade ou por tamanho molecular usando cromatografia de exclusão em gel. Como alternativa os fragmentos podem ser separados por electroforese através de uma matrix de gel de agarose ou de poliacrilamida O cDNA de gp330 ou seus fragmentos pode ser marcado de modo detectavel com radio-isotopos que permitem uma visualização facil do correspondente padrão de fragmentos do DNA genomico do receptor de LDL apos hibridação e autoradiografia Outras técnicas de marcação incluindo isotipos pesados são também uteis

Tendo agora descrito de um modo geral o invento o mesmo sera melhor compreendido por referência a exemplos sspecificos que são aqui apresentados com fins ilustrativos e não pretendem limitar a invenção ou qualquer realização dele

-3 7-

EXEMPLOS EXEMPLO 1

Purificação de gp330

Preparou-se uma fracção bruta rica em túbulos de rins de ratos normais (FX1A) por um método anteriormente descrito que envolve a filtração para remover glomerulos seguido de centrifugação diferencial (edgington. T S et al J Exp Med 12 7; 565-572 (1968)) usando PX1A numa concentração de proteína de 3 mg/ml as proteínas solúveis de membranas (PXDOC) foram extraídas com 50 mM Tris HC1 pH 8 6 contendo fluoreto de fenilmetilsul-fonilo (PMSP) lmM e 1% de desoxicolato de sodio (DOC) durante 1 hr em gelo PXDOC foi separado do material insolúvel por centrifugação a 17000xg durante 20 minutos

Gp330 de rato purificada por afinidade fel preparada a partir de FXDOC com um anticorpo monoclonal anti-gp330 14C1 (Bham A et_ al Lab Invest 53: 421-432 (19 85)) usando o método de Schneider. C et al . J Biol- Chem 257: 10 766,-10 768 (19 82) conforme modificado por Gluck. F. e Coldwell. J , J. Biol - Chem, 2 62: 15 780-15 789 (1987).,

Gp330 purificada foi analisada em SDS-PAGE (Laemuli, V,, Nature 227: 680 (19 70))com um gradiente de 4-12% de acrilamida em condições redutoras e não redutoras- A fibromectina não reduzida foi usada como marcador de peso molecular Os geis foram corados com azul Coomassie A gp33Q purificada por afinidade com um monoclonal apresentou uma única banda corada com azul Coomassie tendo um peso molecular aparente de 440 000 tanto em condições redutoras como não redutoras, EXEMPLO 2

Preparação de anti-gp330 de coelho

Preparou-se um soro policlonal de coelho anti-gp330 através da imunização de coelhos brancos New Zealand com aproximadamente 25 ug de gp330 de rato purificada por afinidade que as administrou por via intradermica em adjuvante completo de Freund com sensibilização as 2 e 4esemanas com a proteina em adjuvante incompleto de Freund, os animais foram sangrados 2 semanas apos a última injecção.

Os anti-soros de coelho foram testados quanto á reactividade com o imunogenio por radioimunoensaio em fase solida (RIA) de acordo com Kamata, K, et al. J, Immunol 135: 2400-240 8 (19 85). Os anticorpos reagiram com o imunogenio numa diluição de 1:10 000. -39

EXEMPLO 3

Preparação de eluatos glonerulares da nefrite de Heymann

Obtiveram-se rins a partir de ratos com nefrite de Heymann activa induzida por imunização com PX1A de ratos mais adjuvantes de acordo com Edgington T S et al. J. Exp Msd 127; 555-572 (19 68)

Os eluatos glomerulares foram preparados usando um método anteriormente descrito (Kamata. K. et al . J Immunol 139 ; 2400-2408 (1985)) O tecido foi picado finamente lavado para remoção das dos eritrocitos com tampão de fosfatos salino 0 01M (PBS). pH 73 e forçado a passar através de crivos metálicos empilhados Obtoe-se uma fracção rica em glomerulos com um o crivo de 200 mesh sedimentou-se a 400 xg durante 5 min e lavou-se com PBS contendo lnM PMSP ate o sobrenadante estar limpido Apos a centrifugação final adicionou-se tampão de citratos 0 02 M pH 3 2 para dar uma suspensão a 10% A suspensão foi colocada em gelo e sonicada em condições suaves usando um sonicador rebentador de células (Heat Systems-Ultra-sonics Inc Plainview Long Island NY) Apos incubação durante 4 h a 37SC a suspensão foi centrifugada a 10 OOOxg durante 20 minutos recuperou-se o sobrenadante e ajustou--se o pH a 7 3 com a adição da base Tris 1M O eluato foi concentrado por ultrafiltração de pressão negativa (filtro imersivel Cx-10 , Millipore Corp . Bedford . Ma) e dialisado (Spectrapor 2. Sprectrum Medicai Industries, Los Angeles CA) contra 50x volume de PBS durante a noite a 4QC. EXEMPLO 4

Clonagem de gp330 A Clivagem triptica do antigenio da nefrite de Heymann

Os fragmentos peptidicos tripticos de gp33Q foram preparados de acordo com Wong W W et_ al P N A S (USA) 82: 7711 (19 85) Três nanomoles de gp330 purificado em hidrocloreto de guanidina 7M foram reduzidos -14 por tratamento com ditiotreitol e alquilados com / C_/--acido iodoacetico (Amersham 56 Ci/mmol; 1 Ci « 37 CBq) a 372C Aps precipitação da proteina radioalquilada com 4 vol de acetona-metanol (50:50. vol/vol) a proteina foi redissol-vida por aquecimento durante 15 min., a 702C em NH^HCO^ 0,1M com 0,2% de Zwittergent 3-14 (Calbiochem-Boehringer) e clivada durante a noite com tripsina tratada com L-l-tosil-amido-2-fenilmetilclorometil-cetona (TPCK). (E.C. 3.4.21.4. Cooper Biomedical Malvern, PA) durante 22 h a 37QC. A análise por SDS-PAGE de 1% da amostra mostrou gue não restavam quaisquer fragmentos de gp330 com Mn 20 .000 B Cromatografia Liquida de Alta Resolução (HPLC) dos Peptidicos Tripticos

Os peptideos tripticos de gp330 foram purificados de acordo com Wong W W et al supra e Bennett H P J et al Biochem J 168: 9 (19 77) Apos remoção do NH^HCQg por liofilização os peptideos foram ressuspensos em 200 ul de hidrocloreto de guanidina 6M em 01% de acido -41- -41-

trifluoroacetico (TFA) e separados por cromatografia liquida de alta pressão em fase inversa (HRLC) usando uma coluna Vydac fenilo (25 x 0 46 cm) e um gradiente linear de 120 min . de 0-6% de acetonitrilo em 0,1 x TFA. Os picos croma-togrãficos foram colhidos manualmente e os peptideos recuperados por liofilização« As fracções seleccionadas foram purificadas por recromatografia. Os peptideos foram detecta-dos por absorção a 214 e 280 nm. Cinco peptideos foram purificados por recromatografia para analise da sequência de aminoãcidos, identificados como os peptideos 53, 54, 60 , 74 e 77 (Fig. 1). C Analise da sequência proteica

As sequências de aminoacidos dos peptideos tripticos foram determinados pela degradação automa-tica de Edman usando um Sequenciador Applied Biosystem 470A e um 120 Pth Analyser A sequência de cinco destes peptideos estão descritos na Figura 2 D, Sintese de uma sonda oligonucleotidica degenerada

Sintetizou-se um oligonucleotideo de 23 bases com uma degenerescência de : 16 vezes correspondendo aos nove primeiros aminoãcidos de peptideo -4^77 apresentado na Figura 2 usando urn Sintetizador de DNA Applied Biosystem 330A e purificado por electroforese em gel de poliacrilamida -42-

Usou-se desoxinosina (I) como uma s! posição de codão ambíguo" (Ohtsuka S et al -J Biol Chem 260 i 2605 (19 85): Lathe R J Mol Biol 183. 1 (19 85)) para reduzir o grau d® degenerescência de 256 para 16 vezes .¾ sonda oligonucleotidica sintética tinha a seguinte sequência; TA (T/C) TGG-GT(I)-GA (T/C)-GC (I)-TT (T/C)-TT(T/C)--GA E. Despiste da biblioteca de cDNA de ritn de rato em | gtll

Uma biblioteca de cDNA de rim de rato effi ^ gtll (ciontech Laboratories Inc.. Paio Alto. CA) foi despistada com o anti-soro de coelho anti gp330. como descrito por Huynh et al DMA Cloning A Pratrical Approach D,M Glover et al. IRC Press. Oxford 1^; 49 (19 8 5) O anti--soro de coelho foi diluido para 1 :1000 com TBST (50 mM Tris-Cl pH 7 9+ 150 mM NaCl tO 05% Tween 20) 1% de albu mina de soro bovino (BSA) e 0 02¾ NaN3 e usado sem qualquer purificação 0 anticorpo ligado foi incubado com anticorpo de cabra anti-coelho conjugado com peroxidase de rabano silvestre ou com um segundo anticorpo biotinilado seguido da formação de um complexo avidina-biotina-peroxidase de rabano silvestre (Ciontech Laboratories Inc ) Usou-se 4-cloro-l-naftol como substracto para a peroxidase A pureza das placas foi obtida numa terceira volta de despiste Sete clones identificados como imuno-reactivos foram depois examinados e observou-se compreenderem fragmentos de DMA de gp330 de 0.4. 0.48 06. 1 2 1.4 e dois de 2 .4 kfo f

Hi.br id ação 0 oligonucleotideo de 23 bases foi marcado nos extremos cora polinucleotideo-cinase de T4 (New England Siolabs) e pj ATP (New England Nuclear) (Zoeller M e Smith. M DNA 3i 479 (19 84)) para uma acti- 8 vidade especifica de 10 cpm/ug de DNA.

Isolou-se DNA ffagico total a partir de clones imuno-reactivos (Maniatis. T . ejb ad . Molecular Gloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor. N Y pag 353) e digerido com EcoRI (New England Biolabs) Os fragmentos de DNA foram separados por electroforese em gel de 1% de agarose e transferidos para filtros Zetabind (Stratagene) como descrito por Southern fí J Mol Biol 18; 503 O filtro foi pre-hibridado com uma solução de 5 x SSC 5x Denhardts 0 05% de pirofosfato de sodio 0 05% de SDS e 100 ug/ml de DNA de esperma de arenque a 422C durante a noite O filtro foi então deixado a nibridar com a preparação de oligonucleotideo marcado radioactivamente numa solução contendo GxSSC ix Denhardts 0 5% de pirofosfato de sodio e 100 ug/ml de DNA de esperma de arenque a 502C durante a noite A transferência foi lavada duas vezes a temperatura ambiente durante 5 min cora 6xSSC e 0 05% de pirofosfato de sodio e iima vez a 502C durante 5 min e exposta a filme kodak XAR a -70 2C durante a noite O fragmento de DNA de 1.4 kb. que hibri-<±u com a sonda oligonucleotidica foi purificado em gel e /66- P7 dCTP (New England Nuclear) incorporado no fragmento por "nick-translation" com um "kit" de ".nick-translation" BRL (Bethesda Research Laboratories) A hibridação foi também feita com esta sonda sujeita a "nick-translation"

G. Analise da sequência de DNA

As inserções de cDNA purificadas em gel dos clones positivos digeridos com EcoRI foram subclonadas (Maniatis, T„ et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. 19 82. pag„ 390) de Bluescript (Stratagene, San Diego. CA), O DNA de plasmideo foi isolado de acordo com o método de Birnboim e Doly (Nucl Acids Res 7: 1513 (19 79 )) e as sequências de DNA foram determinadas pelo método de terminação de cadeias didesoxinucleotidicas de Sanger. F et al (Proc Natl Acad Sei (USA) 74; 5463 (19 77))

Os mapas de restrição parciais das inserções subclonadas em Bluescript foram obtidos por digestão simples e dupla com as enzimas de restrição Accl Ciai EcoRI HindIII e PstI (New England Biolabs) A Figura 3 mostra o sitio de hibrida-ção com a sonda oligonucleotidica Esta figura também mostra que as três inserções têm mapas de restrição sobre-poniveis -45-

EXEMPLO 6

Reacção de proteínas de fusão de gp330 parcial com anticorpos eluidos do rim com nefrite de Heymann

Três proteínas de fusão, codificadas pelos clones parciais apresentados na Fig. 1 foram produzidas usando o método do lisado de placas de Bai et_ al. , J. Biol. Chem. 261: 1239 5 (19 86). Os clones fágicos e Vgtll não recombinantes foram usados para infectar Esche-richia coli Y 1090. os fagos foram propagados em E. coli a 422C durante 3,5h. As placas foram cobertas com 0,8 ml de B-D-tiogalactopiranosido isopropilico (IPTG da Sigma) 5,0mM durante mais 3,5 horas a 3 7°C. Usou-se uma quantidade igual de água como testemunha. Após indução, as placas foram incubadas durante mais 15 minutos com 0,8 ml de tampão de amostra de Laemmli de dupla força (Laemmli, Nature 227; 680 (19 70 )) à temperatura ambiente com agitação rotatória suave. As soluções combinadas foram colhidas e amostras de 80 ul das proteínas solubilizadas foram separadas por electroforese em géis de NaDodSO^-7.5% poliacrilamida.

Um gel foi corado com azul Coomassie para determinação do peso molecular. As proteínas de outros géis foram transferidas electroforéticamente para papel de nitrocelulose (Millipore) de acordo com Towbin. H. et^ a^L. . Proc. Natl Acad. Sei (USA) 76: 4350 (19 79 ) e deixadas reagir com anti-soro policlonal anti-gp330 (diluição 1:1000) e eluido com autoanticorpos de rins com nefrite de Heymann (diluído para 0,5 ug de IgG/ml) durante a noite com agitação suave à temperatura ambiente após bloqueamento do filtro em tampão com 3% de BSA. IgG de cabra anti-ratinho foi conjugado com peroxidase de rábano silvestre (Bio-RAd) foi usado como segundo anticorpo com eluatos de Heymann. -46-

Αε proteínas de fusão" foram imuno-reacti·-vas com o anti-soro policlonal contra gp330 conforme demonstrado por analise de imunotransferência. E. coli infectada com gtll recombinante produz pequenas quantidades de proteína de fusão imuno-reactiva com IPTG relativamate a E. coli crescida com IPTG. Não houve reacção com proteínas de E. coli infectàdas com gtll não recombinante. A análise de transferências western de proteinas de fusão com B-galactosidase com eluatos de Heymann demonstrou uma reacção forte com as proteinas de fusão. Assim, cada proteína de fusão contem pelo menos um sitio antigénico recortecido pelos autoanticorpos patológicos. A inserção de 0 .4 kb (Figura 5. barra sólida acima da região D) contem um sitio imuno-reactivo de gp330. È interessante que a região D contem oito repetições consen-sus de LDL^ (Figuras 5, 6, 7 e 8). Ainda, uma vez que esta região de gp330 está colocada no extremo NH2 (se bem que a determinação da sua posição exacta na molécula de gp330 aguarde a finalização de toda a sequência nucleotidica), é provável que este sitio antigénico se situe numa região de gp330 que se projecta a partir da superfície externa de uma membrana de célula epitelial. É pouco claro se estão presentes outras regiões imuno-reactivas nas regiões delimitantes deste sitio. Outras proteinas de fusão derivadas de inserção sobrepcniveis de 2,4 kb não reagem com os autoanticorpos, no entanto cada uma destas proteinas de fusão contem repetições consensus adicionais (Figura 5, 6 e 7 região E). Uma vez que as proteinas de fusão não são glicosiladas. os sitios antigénicos devem estar no componente proteico de gp330.

-4 7-

SUMARIO

Resumindo o anti-soros policlonais de coelho induzidos contra gp330 foram usados para fazer o despiste de uma biblioteca de cDNA de rim de rato em fv.gtll permitindo o isolamento de clones de cDNA parcial de gp330 (0,4, 0,48. 0,6. 1. 2, 1,4 e dois clones de 2,4 kb). A presença da sequência nucleotidica do oligonucleoti-deo de despiste no extremo 5’ da inserção de 1,4 kb provou que é um clone parcial de cDNA de gp330„ Ainda, a proteina de fusão expressa por três destes clones foi fortemente reactiva com este anticorpo. indicando que as proteínas expressas são parte de gp33Q. Uma vez que o anticorpo e de origem policlonal. alguns epitopos reconhecidos podem não fazer parte do antigenio de tecido envolvido na formação de complexos imunes in vivo

Para avaliar a especificidade epitopica das proteínas de fusão expressas elas foram testadas com elatos de glomerulos de ratos com nefrite de Heymann os quais se sabe conterem autoanticorpos específicos para gp330 Todas as proteínas de fusão reagiram fortemente com os autoanticorpos da nefrite de Heymann Os mapas de restrição destes três clones sugeriu que um dos epitopos reconhecido pelos autoanticorpos da nefrite de Heymann deve ser codificado pelo DNA presente na região em que os clones se sobrepõem

A proteina de fusão produzida pela inserção mais pequena é 130 KD- Uma vez que o peso molecular aparente da p-galactosidase ê 116KD, os autoanticorpos da nefrite de Heymann reagiram com um epitopo contido numa proteina com um peso molecular, aparente tão pequeno quanto 14KD -48- -48-

Comparação da sequência de DNA de gp33Q com as sequências de LDLn humano e de EGF de ratinho R p

Para determinar se as sequências parciais deduzidas de gp330 apresentam semelhanças da sequência proteica com outras proteínas, fizeram-se pesquisas com base em computadores usando a base de dados de proteínas da National Biomedical Research Foundation e o programa FASTP (Devereux J et al Nucl Acad Res 12: 387 (1984): Lipman D J ejt al Science 22 7: 1435 (19 85)) Foram encontradas semelhanças das sequências proteicas entre gp330 de rato LDLR humano (Yamamoto T . et al Cell 39 : 27 (1984)) EGFp de ratinho (Gray. A et al. Nature 303: 722 (19 83); Scott. J . et al. Science 221: 236 (1983)) A Figura 6 descreve uma comparação da estrutura de gp330 deduzida a partir da sequência de nucleotideos dos cinco cDNAs parciais finais e de LDLR humano. O clone representado na Figura 8 não se sobrepõe com qualquer um dos outros cinco clones e a sua localização dentro da sequência tem ainda de ser determinada.

As sequências de proteína gp33Q das duas regiões entre as marcas de interrupção não foram determinadas. A sequência proteica da região contendo as regiões A-D foi deduzida a partir das sequências de cDNA derivadas dos clones de 0.4 kb. 0.6 kb e 1.4 kb. A sequência proteica da sequência carboxi-terminal de gp330 (contendo regiões E e F um segmento transmembranar de 29 resíduos (marcado com X) e um segmento de cauda citoplasmica) foi deduzida a partir de dois clones de cDNA parcial contendo sequências de DNA de 2 4 kb parcialmente sobreponiveis as quais deram em conjunto uma sequência de nucleotideos de 2.9 kb As localizações de duas sequências peptidicas tripticas de gp330 determinado pela degradação automatica de Edman estão indicadas por linhas marcadas com um ou dois arteriscos.

As regiões A-F correspondem ãs sequências de aminoácidos apresentadas na Figura 6. A região com linhas cruzadas (ioe. diagon&is sobrepostas) no LDLR corresponde às regiões D e E em gp330. A Figura 6 descreve as comparações das sequências de aminoácidos de gp330 de rato „ LDLd humano e EGFp de ratinho, Usou-se o código de uma única letra para os aminoácidos. A numeração corresponde ao número do residuo de aminoacido das sequências publicadas (Yamamoto. et al.,

Ce 11 39 : 2 7 (19 84); Scott. J et al Science 221:236 (19 83)) ou o numero do residuo de aminoacido (i e o residuo NA2~ -terminal foi designado como 1) atribuído as sequências de gp33Q derivadas das sequências de nucleotideos de 1 4 kb (regiões A-D) e de 2 9 kb (regiões Ξ e F) As comparações entre as sequências de aminoácidos de gp330 LDLR e EGFp de ratinho estão apresentadas nas regiões A-C e F (ver Figura 6) As sequências das repetições consensus contendo aproximadamente 40 aminoácidos cada estão mostradas nas regiões D e Ξ Os hiatos foram inseridos para optimizar os alinhamentos Uma comparação das repetições consensus para gp330 e LDLR esta mostrada separadamente para as regiões D e E A Figura 7 descreve a análise de matrizes de pontos (".dots') das sequências de aminoácidos de gp33Q de rato e de LDLR humano (Devereux, J. et aJU , Nucl Acids, Res, 12; 387 (19 84); Maizel, J,V . et al, . Proc. Natl Acad.. Sei USA 78 7665 (1981)), As sequências proteicas de gp330 foram deduzidas a partir das sequências de cDNA de 1.4 kb e de 2,9 kb (constituídas por duas sequências de 2.4 kb sobreponiveis). A sequência proteica da LDtiR humana esta descrita segundo Yamamoto et al-. supra- As letras -50-

maisculas referem-se as regiões correspondentes na Figura 6. "TM" identifica a posição do segmento transmembranar em ambas as proteínas. A sonda oligonucleotidica hibrida com o extremo 5‘ da inserção de 1,4 kb (linha com um asterisco). A região que hibrida com o oligonucleotideo continha a sequência codificadora definida pelo peptideo triptico a qual è parcialmente idêntica a LDLR (Figura 6, região A) A sequência de DNA da inserção de 0.4 kb esta totalmente contida dentro da inserção de 0.6 kb. a qual por sua vez esta totalmente contida dentro da inserção de 0 6 kb. a qual por sua vez esta totalmente contida dentro da inserção de 14 kb Duas inserções sobreponiveis de 2 4 kb proporcionam uma sequência nucleotidica adicional de 2 9 kb (Figura 5 o segmento contem as regiões E e F) A sequência proteica deduzida a partir da sequência de DNA de 2 .9 kb continha uma sequência idêntica a um outro peptideo triptico. Val-Leu-val -Val-Asn-Pro-Trp-leu-Tre-Gln-Val (Figura 5 linhé. com dois asteriscos) assim como um segmento transmembranar de 29 aminoacidos (Figura 5, marcado com X) e a fracção carboxi-terminal de gp330, LDLR e gp330 são semelhantes em oitio regiões separadas (Figura 6t regiões A-F, mais as duas sequências consensus no segmento de 480 pares de bases da Figura 8 que não foram ainda localizadas relativamente as outras sequências de gp330). E interessante que gp330 e LDLR contem sequências consensus repetitivas ricas em cisteina (aproximadamente 40 residuos de aminoacidos/repetição) nas regiões D e E (Figura 6), Pelo menos 14 repetições consensus estão distribuidas dentre do interstício da molécula de gp330 (Figura 5 diagonais mais um segmento na Figura 8) enquanto a LDL>R tem oito repetições consensus colocadas no extremo NH2 (Yamamoto T et al Cell 39: 27 (1984)) (Figura 5 linhas cruzadas) Devido a LDL»r e gp330 possuírem semelhanças acentuadas um em relação ao outro -51-

poderão ser membros da mesma familia de genes A proteína do complemento humano C8 cadeias ote e o precursor C9 também possuem uma copia da repetição consensus de LDLR (Rao AG et al . Biochemistry 26; 3556 (1987);

Howard Ο Μ Z et al Biochemistry 26: 3565 (19 8 7);

Stanley K K et al . EMBO J 4: 375 (1985)). Ainda gp330 LDLr e EGFp apresentam semelhanças na sequência proteica em regiões não repetitivas (Figura 6, regiões A-C e F)c

Tendo agora descrito esta invenção na sua totalidade serã aparente para os familiarizados com a matéria que a mesma pode ser efectuada dentro de uma larga gama de parâmetros equivalentes sem se afastar do espirito e âmbito da invenção ou qualquer uma das suas realizações.

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES: lâ. - Processo para a preparação de uma molécula de DNA recombinante» caracterizado por se incorporar na referida molécula uma sequência genética que codifica o antigénio da nefrite de Heymann, gp 330 ou um seu derivado funcional. 2§ - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por se preparar uma molécula de DNA recombinante em que a referida sequência genetica compreende a seguinte sequência: -53-

   10 90 SO CATGAGCAAMCTGCCTTCCTCCCGAGTCCTCAGAGAGCGAGTTTCGATGTGCTGATCAG DEEKCVPRECSESEFRCADQ 70 90 110 CAATCCATCCCCTCTCGATCGGTCTCTGACCAAGAAAATMCTCTCCACÀCAACTCCGAT QCIPSRWVCDQENDCGDNSD 130 ISO 170 caacgggactgtcagatgaâgacttcccatcctcaacattttcagtgtacgagtggacac ERDCEMKTCHPEHFQCTSCH 190 210 230 tgtctcgccÃaggccttggcatgcgatgggagggcagactgtctggatgcgtctgatgaa CVAKALACDGRADCLDASDE 250 270 290 tctgcttgtcctactcgctttcccaacggcacctactgcccagccgccaígttccaatct SACPTRFPNGTYCPAAMFEC 310 330 350 aaaaaccacgtgtgcatccãgtcgttttggatatctgatggggaaaatcãctgtctcgac knhvciqsfwicdgendcvd 370 . 390 410 GCmCGATGACGAGATCCÀcCTGTGCnCAACATTCCCTGTGAATCACCACAGCGATTC GSDEEIHLCFNIPCESPQRF 430 450 470 CGCT GT GACAACAGCCGCTGTCTTTATGGCCATCAGCTCTGCAATGCTCTGGATGACTGC RCDNSRCVYGHQLCNGVDDC 490 510 530 ggagatggaâctgacgacaÃagaacagcactgtagaaaaccaacccacaâaccgtgcacá GDGSDEKEEHCRKPTHKPCT 550 570 590 GACACTGAATATAAGT GTAGCAATGGGAACTGCATTTCGCAGCACTACGTGTGTGATAAT DTEYKCSNGNCISQHYVCDN 510 630 650 GTGAATGACTGCGGAGACCtnaGATGAÀACTGCnGCÀATCTAGGAGÀTAACAGAACG VNDCGDLSDETCCNLGDNRT 670 690 710 . TGTGCT GAAAACAT AT GT CAACAGAACT GT ACCCAGCT GÃGCAGCGGAGGCTrT AT CT GC CAENICEQNCTQLSSCCFIC 730 750 770 TCCTCCAGACCCGGGTTCAÂACCCAGTACTTTGGACAAAÁAnCCTGTCÃAGACATCAAT SCRPGFKPSTLDKNSCQDIN 790 810 830 CAATGTGAGGACmCGCATCTGCCCCCAGAGCTCTCCAÁACAGCAAAGGAACnATGAÁ ECEEFCICPQSCRNSKCSYE 850 870 890 -54-

   TGTTTCTGTCTCCATCCCTTCAACTCTATCACTACCCATTATGGACAACCCTCTCCAGCT CFCVDCFKSMSTHYCERCAA 910 930 950 CATCCAACCCCTCCTCTCTTGCTCCTGCCTGAGAATGTCCGAATCCGGAÁGTACATACCT DCSPPLLLLPENVRIRKYIP 970 990 1010 CCTCTGAGAÂTGTTCTCAGÂGTATCTGGAÂGAGGAGGAGCATATCCAAACTAnGACTAT PLRMFSEYLEEEEHIQTIDY 1030 1050 1070 CACTCGGATCCCCAGCACATAGCCCTCAGTGTTGTCTATTACACTCTCCTGGCACACGCC OfDPEHICLSVVYYTVLAQG 1090 1110 1130 TCTCAATTCCGTGCTATCAÂaCGTGCCTACATTCCCAACTTTCAATCTGGTAGTAACAAT SQFCAIKRAYIPNFESGSNN 1150 1170 1190 CCCATACGTCAACTTGACCTCGGCTTGAAÁTATTTAATGCAGCCACATGGATTAGCCGTC PIREVDLGLKYLMftPDGLAV 1210 1230 1250 CACTCCGTCCCAACCCATATTTACTCCTCÁGATCCTAACACCCAACCCATTCACCTCCCT DWVGRHIYWSDANSQRIEVA 1270 1290 1310 accctcgatggaaggtaccggaagtggctgatcaccacccaactggatcÃgccagctgcc TLDCRYRKWLITTQLDQPAA 1330 1350 1370 attgctctgâatcctaagctagggcttatgttctggactcaccagggaaÃacaccccaaá IAVNPKLGLMFWTDRCKRPK 1390 1410 1430 ATCCACTCTGCCTGGATGAACCGGGAACATCGCAGCCTTCTCGTTTCTGAGAACCTTGGC I E S A W.M NGEHRSVLVSENLG 1450 1470 1490 TGGCCAAACGGTCTTTCCATAGATTACCTGAATGATGACCGGGTCTACTGGAGCGACTCC WPNCUSIDYLNODRVYWSDS 1510 1530 1550 AAACAAGATGTCATTGAAGCCATAAAATATGATGGGACTGACAGGAGACTTATCATAAAT KEDVIEAIKYDGTDRRLIIN 1570 1590 1610 cacccgatcÃagcccttcagtctggacatcttcgaagacÁagctatactccgtagctaag EAMKPFSLD1FEDKLYWVAK 1630 1650 1670 caaaagggagaagtgtggagacaaaataaãttcgggaaagagaacaaagágaaagtgctg EKGEViRRNKFCKENKEKVL 1690 1710 1730 FIGURE 4A -55 -55

   CTGCTCAACCCCTCGCTCACTCAACTTCCAATCTTCCATCAACTGAGATACAATCAGTCA VVNPVLTQVRIFHRLRYNqs 1760 1770 1790 CTCTCCAACCCTTCCAACCACCTCTCTACTCACCTCTCCCTCCTCACACCACCACCCTAC VSNPCKQVCSHLCLLRPCCY 1810 1830 1850 AGCTCTCCCTGTCCCCAAGGCTCCGACTTCCTAACTCGCÁCCACTCTCCAGTCTCATCCÂ SCACPRCSDFVTCSTVQCDA 1870 1890 1910 CCCACTCAACTTCCCCTCACCATCCCTCCCCCATCCACCTCCATCCACCCACCAAATTCC A5ELPVTMPPPCRCMHCCNC I93O 1950 1970 TATTTTCATGACAATCAACTCCCCAAATCCAACTGTTCCÁgTGCCTATAGCCGAGAATAC YFDENELPKCKCSSCYSCEY 1990 2010 2030 TGTCAGCTTGCGCTCTCCACAGCCATCCCTCCACCGACCÁCAATGCCTCTTCTCTTCACC CEVCLSRGIPPCTTMAVLLT 2050 ’ 5Õ7Õ 2Õ9Õ TTCCTCATAGTCATCATTGTTCCAGCTCTCCTCCTTCTTCCACTCTncÀCTACAGGAAÀ FVIVIIVCALVLVCLF Η Y R K 2ΓΪ0 5T30 2150 ACTCCCTCCCTCTTACCCACTCTCCCCAAGCTGCCAACCCTAACCACCCT7CCCAAACCC TCSLLPTLPKLPSLSSLAKP 2170 2190 2210 T CT CAAAATCGAAATGGCGTCACCTTCAGCTCGCCCCCTCATCTCAACATCCACATCCCT SENCNCVTFRSCADVNMDIC 2230 2250 2270 ctctctcctttcccccctcÁcacaattattgacagatccãtcgcgatgaÂtcaacacttt VSPFCPET1XDRSMAMNEHF 2290 2310 2330 gtcatgcaggtgggcaaccágcctctcatátttcaaaacccaatctatccacccaaggac VMEVCKQPVIFENPMYAAKD 2350 2370 2390 aacacttccàaagtccccctcgcagttcagcgcccatcaÁcacccgcacággtcactctã NTSKVALAVQCPSTCAQVTV 2410 2430 2450 ccagaaaatctgcaaaaccÁgaattatcgÁagccccatacatccttctcÂcatacttccà PENVENQNYCRPIDPSEJVP 2470 2490 2510 CACCCAAACCCACCCT CCCCTGGAGCTCAT CAAATTCACGGCΑΑΑΛΑΑΤCGAACAT CTTC EPKPASPCADEIQCKKfNIF 2530 2550 2570 FIGURE 4B -56

   AAACGAAAACCCAAACAGACAACGAACATTCAGAACCCAATCTACGCAGAGATCCACAGT KRKPKQTTNIENPIYAEMDS 2590 2610 2630 CAGGTAAACGATGCTGTGCTGTGGCCCCCCCTCCGTCTCCTTCTCTCCCTGCCAAAGCTT EVKDAVLIPPLRLLLSLPKL 2650 2670 2690 CAAAAAGAAATCEfiACTCCAGGCTACACTGCCACAGAAGACACCTrrAAAGACACTGCAA R K E I · 2710 2730 2750 atctcgttaàagaagattccgacgtatagcctcgccagctctctagggaÀcatttagacâ 2770 2790 2810 CT CAC7TTTT GCACAT ATATTTTTTACAGÀCAAAT GAAAÂaGAAGHAACATTC AAT ACT 2630 2850 2870 TT AT AAAAAAAT AT ATTTTT CT CT GTTT GC CT AT ΑΛΤΤ GAAGGT GT GT CGT GT GT CTTTT 2690 2910 2930 TTACTGATGCCACTTCATATTTTTACAATTATCACCGGCÁCTCTCTATATCTTGCCC FIGURE 4Ç ÍS3S3*3* 3ã - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por se preparar uma molécula de DNA recombinante em que a referida sequência genetica compreende a seguinte sequência: 10 30 50 GCCACACTTGCCCGCCGGATTTCACAAÂATGCCAGACCACGAATATTTGTGnCCCCÒAO HTCPPDFTKCRTTNICVPRA 70 90 110 CTTTCTTGTGTGATGGACACAATCACTGTGGAGACGGGAGTGACGAGÀaCCCCATTTÀCT FLCDGDNDCGDGSDENPIYC 130 ISO 170 GCGCCTCÃCACACATGCCGCAGCAACGÂGTTCCAGTGCCTCTCCCCTCAGCGGTGTATTC ASHTCRSNEFQCLSPtlRCIP 190 210 230 CAAGCTATTCGTT CTGTGACGGTCAAGCCGACTGTGCACATGCCTCGGATGAACCTGACA SYWFCDGEADCADGSDEPOT 250 270 290 CTT GT GGGCATT CTGTGAACACCTGCAGGGCCAGTCAGTTCCAGTGTGATAATGGCAGGT CGHSVNTCRASQFqCDNGRC 310 330 350 GCATCTCÀGGCAATTGGGTCTGTGATGGTGATAACGACTGTGGGGACATGAGTGACGAGG ISGNWVCDGDNOCGDMSDEO 370 390 410 accagcggcatcactgtgagcttcacaâctgttccagcactcagtttÁcctgtgtcaàca QRHHCELqNCSSTRFTCVNS 430 450 470 GCAGACCTCCCAACAGGÁGGTGCATCCCACAGTACTGGGTCTGTGACGGTGATGCGGÀCC RPPNRRCIPQYWVCOGDAD FIGURE 8 4â - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por se preparar uma molécula de DNA recombinante em que a referida sequência genetica compreende a seguinte sequênciaí 10 30 50 ΟΟΟΠΟΟΟΟΑΤΟΟΑπΟΟΑότοΟΤΤΟΑΟΟΑπΟΤΑαΤΟοότΑΟΑΤΟΟαππΤΟΑΤΑΑό RLAIDWSASRLYWVDAFFDK 70 90 110 attgaacacagcacccttgÀtggtttagatagaaaaaggctgggccatgtagaccagatg IEHSTLDGLDRKRLGHVDQM 130 150 170 actcatccatttggactcaccgtttttaaÀgataatgtgttcataacagÀctggagactg THPFGLTVFKDNVFITDW.RL 190 210 230 GGTGCTATTATTCGAGTGAGGAAATCAGATGGTGGTGATÃTGACAGTrATTCGAAGAGGC GAIIRVRKSDGGDMTVIRRG 250 270 290 ATCAGCAGCGTAATGCACGTGAAAGCCTACGATGCTGACCTCCAGACTGGGTCTAACTAC ISSVMHVKAYDADLQTGSNY 310 330 350 TGCAGTC AGACC ACCC ACGCC AACGGT GACTGC AGCC ACTTCTGCTTCCCGGT CCCG AAC CSQTTHANGDCSHFCFPVPN 370 390 410 ttccagcgggtgtgtggctgtccctatggÂatgaaacttcagagggatcãaatgacttgt FQRVCGCPYGMKLQRDQMTC 430 450 470 GAGGGAGACCCAGCCCGAGÁGCCACCCACÂCAGCAGTGTGGCTCCCTCTCCTTTCCCTGC EGDPAREPPTQHCGSLSFPC 490 510 530 aacaatggcmgtgtgtgcccagtttcttccgctgtgatggagtggacgãttgccatgac NNGKCVPS FFRCDGVDDCHD 550 570 590 AACAGTG ATGAGCAT C AGTGCGGGGTGTTTAATAATACTTGCTC ACCTTCGGCTTTCGCC NSDEHQCGVFNNTCSPSAFA 610 630 650 TGCGTCCGCGGTGGACAGTGCATCCCTGGCCAGTGGCACTGTGACAGACAGAATGACTGT CVRGGQCIPGRWHCDRQNDC 670 690 710 ttagatggcÀgtgatgagcãaaaatgccccacacatgccÀcgtcgtccacttgcccgtcc LDGSDEQKCPT. HATSSTCPS 730 750 770 acctccttcácctgcgacaÃtcacgtgtgcatcccaaaagactgggtctgtgacacagac TSFTCDNHVCIPKDWVCDTD 790 810 830 aatgattgctcggatggctcggatgaaaagaactgccaagcttcagggacctgccagcct NDCSDGSDEKNCQASGTCQP 850 870 390 FIGURE 9A -59-

   ACACAGTTTCGGTGCCCTGACCACCGATGCATCAGCCCGCTGTATGTCTGTCATGGGGAC TQFRCPDHRCISPLYVCDGD . 910 930 950 AAGGACTGCGCGGATGGGTCTGATGAGGCGGGCTGTGTGTTAAACTGTACGAGTGCCCAG KDCADGSDEACCVLNCTSAQ 970 990 1010 ttcaaatgtgccgatgggagttcttgcattaacagcaggtaccgctgcgàtggggtttac FKCADGSSCINSRYRCDGVY 1030 1050 1070 GACTGCAGGGACAACTCTGÃCGAGGCAGGCTGCCCCACCÁgGCCTCCCGGCATGTGCCAC DCRDNSDEAGCPTRPPGMCH 1090 1110 1130 CCGGATGAGTTCCAGTGCCMGGAGACGGTACATGCATCCCTAACACCTGGGAGTGTGAC PDEFQCQGDGTCIPNTWECD 1150 1170 1190 GGGCATCCAGACTGTATCCÃCGGGTCCGACGAGCACACTGGCTGTGTTCCTAAGACCTGC GHPDCIHGSDEHTGCVPKTC 1210 1230 1250 TCGCCGACTCATTTCCTCTGTGACAATGGÃAACTGCATCTACAAAGCGTGGATCTGTGAT SPTHFLCDNGNCIYKAWICD 1270 1290 1310 ggggacaatgattgtagggÁtatgagtgatgagaaggactgtcctacccagccttttcac GDNDCRDMSDEKDCPTQPFH 1330 1350 1370 tgtcctagcÃcgcagtggcÁgtgcccgggctacagcacctgtatcaatctgagtgccctg CPSTQWQCPGYSTCINLSAL 1390 1410 1430 TGTGACGGCGTCTTTGACTGTCCGAATGGGACTGACGAGTCCCCACTTTGCAATCAAGAC CDGVFDCPNGTDESPLCNRD 1450 1470 1490 agctgctcccattttaatggtggctgtactcatcagtgcÂtgcaagggcccttcggagcc SCSHFNGGCTHQ CM Q G P F G A 1510 1530 1550 acatgcctatgcccattaggataccaacttgccaatgataccaagacctgtgaagatatc tclcplgyrlanotktcedi 1570 1590 1610 AA1G AGTGCG ATATT CC AGGCTTCT GC AGCC AGC ACT GCGT CA AC AT G AG AGGTT CCTT C NECDIPGFCSRHCVNMRGSF 1630 1650 1670 cggtgcgcttgtgatccagÁatatacgctggaaagtgatgggcggacttgcaaagtcacà RCACDPEYTLESDGRTCKVT 1690 1710 1730 ggatctgaaãatccgttgttagttgtagcÀagtcgtgacÃaaatcattgtggacaacatc GSENPLLVVASRDKIIVDNI 1750 1770 1790 FIGURE 9B ACTGCCCACACGCACAATCTCTACTCGTTCGTCCAGGATGTTTCTTTTGTGGTTGCTCTT TAHTHNLYSLVtlDVSFVVAL. 1810 1830 1850 GATT7TGATTCAGTCACTGGTCGTGTCTTCTGGAGTGACTTACTGCAGGGTAAAACCTGG DFDSVTGRVFWSDLLQGKTW 1870 1890 1910 AGTGTCTTTCAAAACGGAACAGACAAGAGAGTGGTCCATGACAGTGGCCTCTCTGTGACA SVFQNGTDKRVVHDSGLSVT 1930 1950 1970 GAAATGATTGCAGTAGATTGGATTGGTCGCAACCTTrACTGGACGGACTÃTGCTCTTGAà EMIAVDWIGRNLYWTDYALE 1990 2010 2030 ACAATCGAAGTTTCTAAAATTGATGGAAGTCACAGAACAGTACTGATCAGCAAAAATGTC TIEVSKIDGSHRTVLISKNV 2050 2070 2090 ACAAAACCG AGGGG ACT CGCGTTAG ATCCCAG AAT GGGT GATAAT GTAAT GTTTT GGT CT TKPRGLALDPRMGONVMFWS 2110 2130 2150 GACTGGGGCCATCACCCTCGCATTGAGCGAGCCAGCATGGATGGCACCATGCGCACAGTC DWGHHPRIERASMDGTMRTV 2170 ATTGTCCAGGAAAAGATCTAC I V Q E K I Y FIGURE 9C -61-

   5ã- - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por se preparar uma molécula de DNA recombinante que e um vector replicavel 6§ - Hospedeiro caracterizado por ser transformado ou transfectado com o vector da reivindicação 5 - Processo para a preparação de uma molécula de antigenio da nefrite de Heymann, gp330 ou um seu derivado funcional substancialmente purificado e sem impurezas derivadas de ratazana, caracterizado por ser codificada com a sequência genética de acordo com a reivindicação 1. 8§. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por se preparar uma molécula compreendendo a sequência de aminoacidos referida na reivindicação 2 9 i - Processo de acordo com a reivindicação 7 caracterizado por se preparar uma molécula compreendendo a sequência de aminoacidos referida na reivindicação 3 10â - Processo de acordo com a reivindicação 7 caracterizado por se preparar uma molécula compreendendo a sequência de aminoacidos referida na reivindicação 4 llã, - Processo para a preparação de gp330 ou um seu derivado funcional caracterizado por compreender: 62-

   a) o fornecimento de um hospedeiro transformado ou transfecta do com o vector da reivindicação 5. b) o crescimento do referido hospedeiro em condições suficientes para permitir a expressão da referida sequência genética e u) a recuperação da referida gp33Q expressa ou seu derivado funcional 12ã - Método para a detecção de uma anormalidade genetica no gene do receptor de LDL num animal, caracterizado por compreender: a) o isolamento de DNA de um animal suspeito de possuir a referida anormalidade; b) o contacto do referido DNA obtido no passo a) com a sequência de DNA codificadora de gp330 ou um seu derivado funcional em condições de hibridação; e c) a detecção da hibridação da referida sequência de DNA de gp330 com o referido DNA isolado 13ã - Método de acordo com a reivindicação 12 caracterizado por a referida anormalidade genetica ser Hipercolesterolemia Pamilial 14§ - Método para o tratamento de uma ferida caracterizado por compreender a administração a um animal de uma composição farmacêutica compreendendo: a) gp330 ou um seu derivado funcional e b) um veiculo farmaceuticamente aceitável. em que a referida gp330 ou seu derivado funcional esta presente numa quantidade eficaz para tratar a referida ferida; sendo a gama de dosagem de composto activo de 0 .001 a 100 mg por quilograma de peso corporal 15â - Método para a prevenção ou tratamento de ulceras gastrointestinais num animal caracterizado por compreender a administração a um animal de uma composição farmacêutica compreendendo: a) gp330 ou um seu derivado funcional e b) um veiculo farmaceuticamente aceitavel em que a referida gp330 ou seu derivado funcional esta presente numa quantidade eficaz para evitar ou tratar a referida ulcera sendo a gama de dosagem de composto activo de 0 001 a 100 mg por quilograma de peso corporal Lisboa 21 de Agosto de 19 89

   J. PEREIRA DA CRUZ

   rua ViCTCR COHOSN, 10* A, 1.» 1200 «8BQA