KR0142687B1 - 사람 C3b/C4b 수용체(CR1)를 인코드하는 핵산, 이를 포함하는 재조합 벡터 및 재조합 세포 - Google Patents

사람 C3b/C4b 수용체(CR1)를 인코드하는 핵산, 이를 포함하는 재조합 벡터 및 재조합 세포

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KR0142687B1
KR0142687B1 KR1019890702249A KR890702249A KR0142687B1 KR 0142687 B1 KR0142687 B1 KR 0142687B1 KR 1019890702249 A KR1019890702249 A KR 1019890702249A KR 890702249 A KR890702249 A KR 890702249A KR 0142687 B1 KR0142687 B1 KR 0142687B1
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로이드 비 클릭스타인
윈니 더블유 왕
제너럴 알 카손
미첼 에프 콘시노
스테판 에이치 아이피
사바스 씨 마크리드
쥬니어 마쉬 헨리 씨.
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더 죤스 호프킨스 유니버시티
더 브리그함 앤드 우멘스 호스피탈
티 셀 사이언시스, 인코포레이티드
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Abstract

내용없음

Description

[발명의 명칭]
사람 C3b/C4b 수용체(CR1)
[도면의 상세한 설명]
제1도는 전체 CR1 코딩영역의 누클레오티드와 아미노산 배열순서. 이 배열순서는 클론 λT109.1에서 십량체 대장균 결합체 다음의 제1누클레오티드로 시작된다. 이 배열순서의 누클레오티드 번호 1531은 제3도에서 나타난 배열순서의 투클레오디트 번호1의 제1누클레오티드 5'이다. 이 mRNA 에 상응하는 사상체를 나타내고, 추론된 아미노산 배열순서는 아래에 나타낸다. 누클레오티드 28-147에 의해서 인코드된 상상적 신호배열 순서는 괄호로 묶었다.
제2도는 사람 CR1 cDNA의 5.5kb의 제한사상도. 흑색막대는 cDNA를 나타내고, 제한위치는 H, HindIII; B, BamHi; R, EcoRI; P, PstI; A, ApaI; S, SacI; G, Gg1II; K, KpnI 이다. 배열순서가 유도되는 cDNA 클론은 아래의 사상도에 나타낸다. 화살표는 디데옥시누클레오티드 사슬 말단방법에 의한 배열순서 분석의 방향과 정도를 나타낸다. cDNA 클론은 제한 사상도와 겹침 배열순서 동일성의 기준 배열된다.
제3도는 사람 CR1 cDNA 의 5.5kb의 누클레오티드 배열 순서이다. 이 mRNAdp 상응하는 사상체를 나타내고 염기번호1(제1도의 염기번호 1532에 상응하는)는 대부분의 5' 클론에서 대장균 결합체 뒤의 제1염기이다. 상자로 표시된 110-bp 배열순서는 누클레오티드 147과 148(화살표) 사이에서 발견되고, 사이에 끼이는 배열순서의 일부를 나타낸다.
제4도는 사람 CR1 cDNA의 5.5kb의 누클레오티드 배열순서의 도트마트릭스 분석이다. 만일 90bp 매치중 최소한 40bp가 있으면 도트를 작도한다. 사각형을 대각선으로 등분하는 진한선은 그자체의 배열순서의 동일성을 나타낸다. 동일한 선으로부터의 두개의 추가의 평행의 진한선 1.35와 2.7kb는 각각 1.35kb의 두 개의 직열의, 직접적으로 긴 균질의 반복(LHRs)을 나타낸다. 두개의 LHR사이의 여섯개의 밝은 점선은 ∼0.2kb의 짧은 일치의 길다란 균질의 반복 넘어로 0.4kb 연장한다.
제5도는 사람 CR1의 추론된 아미노산 배열순서. 각 잔사는 하나의 문자코드에 표시되어 있다. (Lehninger, A.L., 1975, Biochemistry, 2d Ed., Worth Publishers, Inc., New York, p. 72). 길다란 상동 반복물의 잔사는 일렬로 정열되어서 이들의 상동성을 나타낸다. LHR-B의 모든 잔사를 나타내고 이 잔사는 이것이 LHR-B와 상이한 경우에만 LHC-C와 LHR-D가 제시되어 있다. 수치료 윤곽은 단백질의 COOH-말단에 정열되어서 상상적 투과막 영역을 설명한다. 소수성 배열순서 바로 뒤의 네개의 양전하의 잔사의 확장은 겹쳐져 있다. 상피 생장 인자 수용체에 있는 단백질 키나제 C 포스포릴화의 위치에 대해서 67% 상동성을 가지는 여섯개의 아미노산 배열순서에 밑줄이 쳐져 있다. CR1 단백질의 개략도는 배열순서 위에 나타낸다. (TM) 투과막 영역(Cyt) 세포형질영역, (3'UT) 3' 비변역 배열순서.
제6A도는 CR1의 SCRs의 일열배열. 이 반복은 NH2-말단으로부터 COOH-말단으로 1-23번으로 번호를 붙인다. 공간을 삽입하여 일열로 최대로 한다. 사각형은 불변잔기를 나타내고 수직화살은 아미노산 전환의 위치를 나타낸다. 이 잔기는 만일 이것이나 보존치환체가 SCRs의 최소한 반속에 존재할 때 보존되는 것으로 추정된다. 수평화살은 CR1 게놈의 클론 2.38로부터 배열순서되고 단일의 엑손으로 인코드된 SCR를 나타낸다.
제6B도는 게놈 클론 λ2.38의 제한 사상도. 배열순서 전략 및 부분적 배열순서. 이 제한위치는 다음이 된다: (B) BamHI, (S) SacI, (E) EcoRV, (K) KpnI, (P) PstI. 수평화살은 배열순서의 방향과 크기를 나타내고 수직화살은 엑손-인트론 경계를 나타낸다.
제7도는 SCR의 단백질 구조를 가지는 것으로 알려진 SCR 단백직의 일치 배열순서의 배열. 공간을 삽입하여 배열을 극대화 하였다. 잔기는 하나나 둘의 SCRs를 가지는 단백질을 제외하고는 제5도에서처럼 보유되는 것으로 추정되며, 여기서 잔기는 만일 다른 단백질의 최소한 반에 이것이 존재하면 보존된다. 점선은 보존안되는 위치에 상응한다. CR2 와 C2b 의 밑줄친 부분은 배열순서 정보가 이러한 단백질에 대한 영역에서 공포되지 않았음을 나타낸다. 상자는 불변성 반-시티신을 나타낸다. 배열순서의 우측의 번호는 일치성 배열순서를 발생시키는데 사용된 SCRs의 번호를 나타낸다. 일치성 배열순서를 측정하는데 사용된 배열순서 데이터에 대한 단백질 부호와 참고는 다음이 된다: (CR1) 보충수용체 형태 1, (H) 인자 H (Kristensen, T., et al., 1986, J. Immunol. 136:3407), (C4bp) C4 결합단백질(Chung), L.P., et al., 1985, Biochem. J. 230:133), (CR2) 보체 수용체 형태2(Weis, J.J., et al., 1986, Proc. Nat1. Acad. Sci. U.S.A. 83:5639), (Ba) 인자 B의 단백질분해 단편(Morley, B.J. and Campbell, R.D., 1984, EMBO J. 3:153), (C2b) C2의 단백질 분해 단편(Gagnon, J., 1984, Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 305:301), (Clr) Cl의 r 서브유닛(Leytus, S.P. et al., 1986, Biochemistry 25:4855), (XIIIb) 인자 XIII의 b 서브유닛(Inchinose, A., et al., 1986, Biochemistry 25:4633), (β2GPl) β2 단백질 I (Lozier, J., et al., 1984, Proc. Natl., Acad. Sci. U.S.A. 81:3640), (Hap) 합토글로빈(Kurosky, A., et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77:3388), (IL-2-R) 인터로이킨-2 수용체(Leonard, W.J., et al., 1985, Science 230:633). 별도는 불완전한 배열순서를 얻을 수 있음을 나타낸다.
제8도는 사람 CRl의 제시된 구조의 개략도. COOH-말단 세포형질 영역은 지질이중층의 우측에 있다. 30 SCRs는 형질막의 세포외측에 선형으로 배치되어 있다. 삽입물은 삼중루프 구조를 설명하는 단일 SCR의 확대도이다.
제9도는 형질, pBSABCD 로 인코딩하는 사람 CRl의 삽입물의 제한도이다. 코딩 배열순서를 포함하는 영역을 나타내는 상자속에서 나타내는 것은 CR1 구성을 형성하기 위하여 결찰된 여덟 개의 cDNA 클론의 아홉 단편이다. 괄호는 각각 LHR-A, -B, -C 및 -D의 위치를 지칭한다. 상자아래의 선은 새로이 단리된 5' cDNA 클론의 위치를 나타낸다. 제한위치는 다음이 된다: A, ApaI, B, BamHI; G, BglII; H, HindIII; K, KpnI; M, BspMII; P, PstI; R, EcoRI; 및 S,SacI.
제10도는 일곱 개의 LHR-A의 SCR를 인코딩하는 5' cDNA 클론의 추론된 아미노산 배열순서와 LHR-B, -C 및 -D의 상응하는 SCRs와 이 배열순서와의 일치. 각 SCR에 보존된 네개의 시스타인은 밑줄이 쳐져있다. 잔기는 이것이 LHR-A에 있는 것과 상이한 경우에만 LHR-B, -C 및 -D에 대해서 나타낸다.
제11도는 발현 플라스미드 piABCD와 pMTABCD의 제한도이다. PmMT 와 PCMV 는 각각 쥐의 금속티오네인과 거대세포비루스 (cytomegalovirus)의 바로전의 촉진부위를 나타낸다.
제12도는 각 piABCD(판넬 a와 d)와 CDM8 전달매개체 단독(판넬 c 와 d)로서 트란스펙트되고 YZ1 단일클론의 항-CR1 항체와 형광-라벨된 염소 항-쥐 F(ab')2로 간접적으로 착색이된 COS 세포의 상반대 (phase contrast)(판넬 a와 b)와 면역형광(판넬 b와 d) 현미경의 분석.
제13도는 재조합 CR1을 발현하는 COS 세포에 의한 c3b-와 c4b-결합의 분석. piABCD (판넬 a와 b) 또는 CDM8 전달매개체 단독(판넬 b와 d)로서 트란스펙트된 COS 세포는 EAC4b(lim), 3b (판넬 a와 b) 또는 EAC4b(판넬 c와 d)로 배양시키고 상반대 현미경에 의한 로제테 형성을 보고 시험 하였다.
제14도는 SDS-PAGE에 의해서 트란스펙트된 COS 세포로 발현된 재조합 CR1의 분석. CDM8 전달 매개체단독(1열과 4열)으로 그리고 piABCD (2열과 5열)로서 각각 트란스펙트된 COS 세포와 CR1(3열과 6열)의 F 및 S 이인자형(allotype)을 가지는 개체로부터의 적혈구를 125I로서 표현 라벨을 하였다. 세포의 세제 분해질은 세파로스(sepharose)-UPC10 (1-3열)과 세파로스-YZ1 (4-6열)로서 차례로 면역 흡착시키고 용출물을 비-환원조건에서 SDS-PAGE와 방사선 사진법으로 분석하였다.
제15도는 면역고정시킨 재조합 CR1의 존재하에 인자 I에 의한125I-C3(ma)의 분할.125I-C3(ma) 복제 시료는 인자 H(1열)의 존재하에 인자 I, 세파로스-UPC10은 CDM8 전달매개체 단독(2열)으로 트란스펙트된 COS의 분해질로서 예비배양시킨 세파포스-UPC10 piABCD-트란스펙트된 COS 세포(4열)의 분해질로 예비배양시킨 세파로스-YZ1 및 piABCD-트란스펙트된 COS 세포의 분해질로 예비배양시킨 6μ1 (5열), 12μ1(6열) 및 25μ1(7열)의 세파로스-YZ1로서 처리하였다.125I-라벨이된 C3(ma)의 시료를 piABCD-트란스펙트된 COS 세포(8열)의 분해질로 예비 배양시킨 25μ1의 세파로스-YZ1로서 인자 I이 없는 상태에서 처리하였다. 환원시킨 후에125I-C3(ma)를 SDS-PAGE와 방사선 사진법으로 분석하였다.
제16도는 CR1 삭제 돌연변이체를 인코드하는 cDNA 구성물. 네개의 LHR 를 인코딩하는 cDNA 분절의 위치는 삭제 돌연변이체의 제조에 사용되는 제한위치가 표시되어 있는 전체길이 piABCD 구성위의 괄호로서 나타낸다. 각각의 돌연변이체에 남아있는 cDNA 제한 분절은 실선으로 나타낸다. 제한위치는 다음이 된다: A, ApaI; B, BsmI; E, BstEII; 및 P,PstI.
제17도는 CR1의 재조합 삭제 돌연변이체와 CR1의 야생형태 F 및 S 이인자형과의 비교.125I-표면 라벨이 된 적혈구(1열 및 7열)의 세제 분해질과 CDM8 전달 매개체 단독(2 및 8열), piABCD (3 및 9열), piBCD (4 및 10열), piCD (5 및 11열) 및 piD (6 및 12열)로서 각각 트란스펙트된 COS 세포를 세파로스-UPC10 항-레반항체(1-6열), 세라포스-YZ-1 항-CR1 단클론의 항체(7-11열) 및 토끼 항-CR1 항체 및 세파로스-단백질 A(12열)로서 각각 면역침전시켰다. 용출액은 환원조건에서 SDS-PAGE 처리하고 방사선 사진을 찍었다.
제18도는 CR1의 전체길이와 삭제 돌연변이체를 발현하는 COS 세포의 존재하에 인자 I 에 의한125I-C3(ma)의 분할.125I-C3(ma)의 복제 시료를 인자 I이 없이(1-6열) 또는 존재하에(7-12열) CDM8 전달 매개체단독(1 및 7열), piABCD(2 및 8열), piAD(3 및 9열), piBD(4 및 10열), piCD(5 및 11열) 및 piD(6 및 12열)로서 각각 트란스펙트된 COS 세포로 배양하였다. 또한125I-C3(ma)의 시료를 인자 H와 인자 I(13열)로서 각각 배양시켰다. 환원 후에125I-C3(ma)를 SDS-PAGE와 방사선 사진법으로 분석하였다.
제19도는 CR1의 각 LHR를 포함하는 SCR의 형태와 C3b와 c4b에 대한 수용체의 특이성을 결정하는 예정 위치를 나타내는 개략모델. 이들의 제2결합 특이성은 괄호로서 나타낸다.
제20도는 가용성 CR1 DNA 구성물속에 남아있는 DNA 영역을 설명 하는 개략도. 전체길이의 CR1 cDNA의 영역은 도면의 상부를 따라 있는 상자로서 나타낸다.
제21도는 발현 전달매개체의 pTCS 계열에서 주요 요소를 설명 하는 개략도.
제22도는 발현 전달매개체 pTCSgpt의 개략도. 폴리 아데닐화 위치는 쥐의 Ig 캅파 배열순서부터 되고(NBRF 핵 데이타 베이스 기탁 #Kcms, bp 1306-1714); Ad2 MLP 및 삼분 영역은 Ad2 배열순서로부터 되고(NBRF 핵 데이타 베이스 기탁 2 SV40W). gpt 유전자, 암피실린 유전자 및 복제의 박테리아 원천은 전달매개체 pSV2gpt로부터 된다(ATCC 기탁번호 37145).
제23도는 항체 친화력 정제된 sCR1의 4-20% SDS-PAGE. 비-환원조건(1,2,3열) 및 환원조건(4,5,6열). 1,3열: 분자량 표식; 3.5열: 세포배양 상청액 출발물질; 4.6열: 항체친화력 크로마토그래피로 정제된 sCR1.
제24도는 양이온 교환 HPLC 용출도면. 용출된 단백질은 280nm(y-축)에서 흡수로 감시하였다. 흐름-통과(0-100분)와 용출된 sCR1(150-165분)의 두가지 모두의 흡수는 모두 눈금초과였다. x-축은 용출시간의 분을 나타낸다.
제25도는 양이온 및 음이온 교환 HPLC 정제된 sCR1의 4-20% 경사 SDS-PAGE. SDS-폴리아크릴 아미드겔은 비-환원조건에서 실시하였다. 1열, 생체반응기 상청액의 분취량; 2열, 양이논 HPLC 출발완충액에 대해서 투석한 생체반응기의 상청액의 분취량; 3열, 양이온 교환 HPLC 칼럼으로부터의 용출된 sCR1 피크의 분취량; 4열, 양이온 교환 HPLC 칼럼에서 음이온 HPLC에 대한 출발완충액으로 투석한 sCR1 피크의 분취량; 5 및 6열, 음이온 HPLC로부터 용출된 두개의 상이한 단편의 분취량.
제26도는 사람 중성호성에서 발생한 산의 C5a 유발. C5a 유발된 산소발생 다음에 DCFDA는 산화되고 밝게 형광되었다. 형광강도는 혈구계산으로 측정하며, x-축에서 측정하고 y-축에서는 세포의 수를 측정하였다. 판넬 a, 세포에 대한 윤곽 및 게이트; 판넬 b, C5a 첨가후 0분, 판넬 c, 1분; 판넬 d, 2분; 판넬 e, 3분; 판넬 f, 4분; 판넬 g, 20분. 이러한 DCFDA 검사법은 C5a의 민감한 지시를 나타낸다.
제27도는 sCR1의 존재하에 사람보체의 활성화로 DCFDA 검사법에서 C5a 활성도의 감소를 나타낸다. 판넬 a, 자극되지 않은 세포; 판넬 b, 고도의 형광을 나타 내는 sCR1 없는 기준; 판넬 c, sCR1가 없이 DCFDA 검사법은 형광강도에서 75%의 감소를 나타낸다. y-축은 세포의 수이고 x-축은 형광의 강도이다.
제28도는 sCR1에 의한 사람 혈청에서의 기본적 통로 C5a와 C3a 생성의 억제. 유사한 윤곽을 항체 친화성 정제되거나 또는 HPLC 정제된 sCR1의 어느것에 대해 관찰되었다.
제29도는 재조합 sCR1에 의한 보체-매개된 용혈반응의 억제. 유사한 윤곽이 항체 친화력 정제되거나 또는 HPLC 정제된 sCR1에 대해서도 관찰되었다.
제30도는 sCR1-처리하거나(좌측) 또는 처리하지 않은(우측) 쥐에서 RPAR 의 전체의 형태학. (a) 두가지 쥐는 모두 오발부민을 정맥내 주사를 맞고, sCR1(왼쪽쥐) 또는 PBS(우측쥐)와 항-오발부민, 깨끗한(좌측위치)와의 혼합물을 피하 주사하고; 항-오발부민 1/2 희석(중간위치) 또는 토끼 IgG(우측위치). 주사는 중복으로 실시하고, 상부와 하부열은 같은 결과를 나타내었다. sCR1를 받은 쥐는 간신히 보이는 변화를 나타내었고, 반면에 처리않은 쥐는 RPAR와 완전한 증상을 나타내었다. (b)는 (a)로부터의 피부 생검의 피부표면이다. 처리하지 않은 쥐(우측)으로부터의 생검은 깨끗이 보이는 장애를 나타내었고, 한편으로 sCR1-처리한 쥐(좌측)로부터의 생검은 정상적인 형태를 나타내었다.
제31도는 sCR1-처리하고 (a) 처리하지 않은 (b) 쥐로부터의 피부생검의 광현미경사진. (a) 다형핵과 단핵 세포의 혈관주위의 축적은 보이지 않았다. 그러나 중성호성의 과잉침윤이나 적혈구의 일혈은 보이지 않았다. (b) 다형핵 세포의 과잉 침윤과 적혈구의 일혈은 확인되었다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 C3b/C4b 수용체(CR1) 유전자와 이것의 인코드된 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 또한 70 누클레오티드를 포함하는 CR1 핵산 배열순서와 이들의 단편애 그리고 24 아미노산을 포함하는 이들의 인코드된 펩티드와 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 또한 CR1 단백질과 이들의 단편의 발현을 제공한다. CR1 핵산과 단백질은 보체 활성도를 포함하는 장해 그리고각종 염증과 면역 장해의 진단과 치료에 유용하다.
2. 본 발명의 배경
2.1. 보체시스템
보체시스템은 사람의 정상 혈청의 글로블린의 대략 10% 를 구성하는 단백질의 그룹이다 (Hood, L.E., et al., 1984, Immunology, 2d Ed., The Benjamin/Cummings Publishing Co., Menlo Park, California, p. 339), 보체 (c) 는 면역과 알레르기 반응의 매개에 중요한 역활을 한다 (Rapp, H.J. and Borsos, T, 1970, Molecular Basis of Complement Action, Appleton-Century-Crofts (Meredith), New York). 보체성분이 활성화되면 보체에 의한 질병과 관련되는 염증을 매개하는 화학주성적 펩티드를 포함하는 한 그룹의 인자를 발생시킨다. 보체 카스케이드의 순서적 활성화는 항원-항체 복합체를 포함하는 기초통로나 또는 어떤 세포벽 다당류의 인식을 포함하는 다른 통로를 통하여 일어날 수도 있다. 활성화된 보체 단백질로 매개된 활성도는 표적세포의 분해, 화학극성, 옵소닌작용, 맥관과 기타 부드러운 근육세포의 자극, 그리고 마스트 세포의 탈입자, 작은 혈관의 증가된 투과성, 임파구의 지시된 이동 및 B 임파구와 대식세포의 활성화와 같은 기능적 미착을 포함한다 (딴두, H.N., 1974, Immunology, Harper Row Publishers, Inc. Hagerstown, Maryland, p. 512).
단백질 분해 카스케이드 단계중에 생물학적으로 활성있는 펩티드 단편인, 아나필라톡신 C3a, C4a 및 C5a (WHO Scientific Group, 1977, WHO tech. Rep. Sec. 606:5 and references cited therein)은 제3(C3), 제4(C4) 및 제5(C5) 천연의 보체성분에서 방출된다 (Hugli, T.E., 1981, CRC Crit, Rev. Immunol. 1:321; Bult, H. and Herman, A.G., 1983, Agents Actions 13:405).
C3b/C4b 보체수용체(CR1)
CR1이라 명명하는 사람 C3b/C4b는 적혈구, 단세포/대식세포, 과립구, B세포, 어떤 T세포, 비장의 난포수지상의 (dendritic)세포와 단산화(glomerular) 포도싸이트(podocytes)에 존재한다. (Fearon, D.T., 1980, J. Exp. Med. 152:20, Wilson, J.G., et al., 1983, J. Immunol. 131:684; Reynes, M., et al., 1985, J. Immunol. 135;2687; Gelfand, M.C., et al., 1976, N. 뚜히. J. Med. 295:10; Kazatchkine, M.D., et al., 1982, Clin. Immunol Immunopathol. 27:170). CR1는 특별히 C3b, C4b 및 iC3b에 결합한다. 가용형태의 수용체는 리간드 결합활성도를 가지고 막-회합된 CR1과 같은 분자량을 가지는 플라스마에서 발견되었다. (Yoon, S.H. and Fearon, D.T., 1985, J. Immunol. 134:3332). CR1는 면역 복합체와 기타 보체 활성화제에 공유로 결합된 C3b와 C4b에 결합하고 이러한 상호작용의 결과는 수용체를 가지는 세포형태에 따라 변한다 (Fearon, D.T. and Wong, W.W., 1983, Ann. Rev. Immunol. 1:243). 적혈구 CR1은 중성호성에서 간(Cornacoff, J.B., et al.l, 1983, J. Clin. Invest. 71:236; Medof, M.E., et al., 1982, J. Exp. Med. 156:1739) CR1 에의 이동을 위하여 면역복합체에 결합하고 그리고 단세포는 피복된 교합면과를 통한 흡수삽입(endocytosis)에 의하거나 (Fearon, D.T. et al., 1981, J. Exp. Med. 153:1615; Abrahamson, D.R. and Fearon, D.T., 1983, Lab. Invest. 48:162) 또는 포르볼(phorbol) 에스테르, 화학주성 펩티드 또는 피브로넥틴과 라미닌과 같은 세포외의 기질에 존재하는 단백질에 의해 수용체의 활성화한 후 식작용에 의하여(Newman, S.L., et al., 1980, J. Immunol. 125:2236; Wright, S.D. and Silverstein, S.lC., 1982, J. Exp. Med. 156:1149; Wright, S.D., et al., 1983, J. Exp. Med. 158:1338). 결합복합체를 내부이행시킨다. CR1의 포스포릴화는 식작용 활성도의 획득에 역활을 한다 (Changelian, P.S. and Fearon, D.T., 1986, J. Exp. Med. 163:101). B 임파구에서의 CR1의 기능은 비록 CR1에 대한 항체로서 이러한 세포의 처리로 아메리카자리공 유사분열물질의 부분 광학적 투여량에 대한 이들의 응답을 증대시켰다 하더라도 적게 한정된다 (Daha, M.R., et al., 1983, Immunobiol. 164:227 (Abstr.)). 난포 수지상 세포의 CR1는 항원 표시역활을 보조할 수도 있다 (Klaus, G.G.B., et al., 1980, Immunol. Rev. 53:3).
또한 CR1은 표준적 및 대체의 통로 C3/C5 전환효소를 억제하고 그리고 인자 I에 의하여 C3b 와 C4b 의 분활용 보조인자로서 작용하여 CR1이 또한 수용체로서 작용하는 이외에 보체 조절기능을 가진다는 것을 나타낸다. (Fearon, D.T., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76:5867; Iida, K. and Nussenzweig, V., 1981, J, Exp. Med. 153:1138). 보체 활성화의 대안 통로에서 이분자 복합체 C3b, Bb는 C3 활성효소(전환효소)이다. CR1 (및 고농도 에서의 인자 H)는 C3b 에 결합할 수 있고 또한 C3b가 인자 I에 의한 비가역 단백질 분해 비활성화에 민감하에 하여 비활성화한 C3b (iC3b)을 형성시킨다. 보체활성화의 표준통로에서 복합체 C4b, 2a는 C3 전환효소이다. CRI (및 고농도에서 C4b, 2a의 해리를 촉진시킨다. 이 결합으로 C4c 및 C4d (비활성화한 보체 단백질)에의 분할을 통하여 인자 I에 대한 비가역 단백질 분해 비활성에 민감되게 한다.
CRI는 단일의 폴리펩티드 사슬로 구성된 당단백질이다. CRI의 네갖 이인자형이 발견되어서 ∼40,000-50,000 달톤의 분자량의 증가로 다르게 한다. 두가지 가장 보편적 형태, 또한 A 및 B 이인자형이라 명명하는 F 및 S 이인자형은 각각 250,000 및 290,000 달톤의 분자량을 가지고 (Dykman, R.R., et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 80:1698; Wong, W.W., et al., 1983, J. Clin. Invest. 72:685), 그리고 두가지 드문 형태는 210,000 및 290,000 달톤의 분자량을 가진다 (Dykman, T.R., et al., 1984, J. Exp. Med. 159:691; Dykman, T.R., et al., 1985, J. Immunol. 134:1787). 이러한 차이는 글리코실화 상태와는 달리 CRI의 폴리펩티드 사슬에서 변화를 분명히 나타내는데 그 이유는 이들이 앤도글리코시다제 F 에 의한 정체 수용체 단백질의 처리로 폐지되지 않고(Wong, W.W., et al., 1983, J. Clin. Invest. 72:685), 이들은 수용체 이인자형이 투니카마이신의 존재하에 생체합성되었을 때 관찰되었다. (Lublin, D.M., etal., 1986, J. Biol. Chem. 261:5736). 네가지 모두의 CRI 이인자형은 C3b-결합 활성도를 가진다 (Dykman, T.R., etal., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:1698; Wong, W.W., etal., 1983, J, Clin. Invest. 72:685; Dykman, T.R., et al., 1984, J.Exp. Med. 159:691; Dykman T.R., et al., 1985, J. Immunol. 134:1787).
CIR cDNA의 두가지 겹치지 않는 제한단편을 고도의 엄격성 조건에서 교차 하이브리드화 하는 것으로 나타내었다 (Wong, W.W., et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:7711). 또한 cDNA 탐팀의 두가지 모두는 게놈의 DNA의 다중제한 단편에 하이 브리드화 하고 이의 대부분은 두탐침 모둥 보편성이 있었다(id.). CRI 속에 반복성 코디 배열순서가 존재하는 것이 배열순서 비교에서 확인되었다 (Klickstein, L.Bl, et al., 1985, Complement 2:44 (Abstr.)) 또한 CRI 유전자는 여러가지 게놈의 제한단편에 대해서 코딩 배열순서가 결핍된 게놈의 탐침의 가교하이브리드화의 전사로 인하여 반복성 간섭 배열순서를 가졌다 (Wong, W.W., et al., 1986, J. Exp. Med. 164:1531). 더우기 보다큰 S 이인자형을 가지는 개체로부터의 DNA는 F 이인자형을 가지는 개체로부터의 DNA와 비교했을 때 이 게놈탐침에 하이브리드호 하는 추가의 제한 단편을 가져서 게놈의 배열순서의 북제가 고분자 CRI 대립형질(id.)과 관련하여 발생했다는 것을 제시한다.
CRI은 보체수용체 형태 2 (CR2)에 대해서 동족관계를 갖는 것으로 나타내었다 (Weis, J.J., et al., 1986, Proc. Natl, Acad. Sci. U.S.A. 83:5639-5643).
2.3. 사람질병에서 CRI의 비정상성
전신계 낭창 에리데마토수소(SLE)가 있는 환자의 적형구에서 CRI의 감소된 발현이 일본 (Miyakawa et al., 1981, Lancet 2:493-497; Minota et al., 1984, Ar속. Rheum. 27:1329-1335), 미국 (Iida et al., 1982, J. Exp. Med. 155:1427-1438; Wilson et al., 1982, N. 뚜히. J. Med. 307-981:986) 및 유럽 (Walport et al., 1985, Clin. Exp. Immunol. 59:547; Jouvin et al., 1986, Complement 3:88-96; Holme et al., 1986, Clin. Exp. Immunol. 63:41-48)을 포함하는 여러가지 게놈의 지역영역으로부터의 연궂에 의하여 보고되었다. 그룹으로서 취하여 환자들은 정상적인 모집단의 50-60%가 되는 세포당 수용체 평균수를 가진다. 선행 보고서에서 언급하기는 적혈구의 CRI의 수가 질병 활성도에 반비례하고 SLE의 가장 심한 표현기간중에 발생되는 최저수에 그리고 같은 환자의 차도가 있는 기간중에 관찰되는 높은 수에도 반비례 한다는 것이다. (Iida et al., 1982, J. Exp. Med. 155:1427-1438). 또한 CRI 수는 면역복합체의 혈청수준, C3d의 혈청수준 및 적혈구-결합된 C3dg의 수에 역으로 상관되어서 보체-활성화 면역 복합체의 취함과 무해한 방관자로서 적혈구에의 석출이 있음을 나타내는 것으로 알려졌다 (Ross et al., 1985, J. Immunol. 135:2005-2014; Holme et al., 1986, Clin. Exp. Immunol. 63:41-48; Walport et al., 1985, Clin. Exp. Immunol. 59:547). 적혈구에 CRI가 결핍된 SLE를 가지는 환자는 CRIDP 자기-항체를 가지는 것으로 알려졌다 (Wilson et al., 1985, J. Clin. Invest. 76:183-190). 항-CRI 항체의 감소된 적정량은 환자의 입상상태의 개선과 일치하는 또한 수용체 비정상의 부분적 반전과 일치하였다. 항-CRI 항체는 다른 두 SLE 환자에서 검출되었다 (Cook et al., 1986, Clin. Immunol. Immunopathol. 38:135-138).최근에 활성 SLE 와 용혈반응 빈혈증의 경화에서 적혈구 CRI의 후천손실이 수혈된 적혈구로부터의 수용체의 급속한 손실의 관찰에서 나타내었다 (Walport et al., 1987, Clin. Exp. Immunol. 69:501-507).
적혈구로부터의 CRI의 상대적 손실도 또한 사람 면역결핍증의 환자 (Tau나, F.A., dtal., 1986, J. Clin. Invest. 78:977-982) 와 나병종 나병환자 (Tau나, F.A., et al., 1985, J. Invest. Dermat. 85:58s-61s)에서 발견되었다.
SLE의 보체 수용체 발현의 비정상은적혈구 CR1에 국한되는 것은 아니다. SLE 환자의 중성호성의 전체세포 CR1의 상대적 결핍과 B임파구의 플라스마 막 CR1도 발생되는 것으로 나타내었다 (Wilson et al., 1986, Ar속. Rheum, 29:739-747).
형태 IV SLE 중성호성의 환자에서 모두 검출가능한 CR1 항원은 포도사이트에서 손실되고, 반면에 막증식성 사구체신염 형태 I 및 II를 비롯한 SLE 중성호성의 덜심각한 형태와 증식성 중성호성의 비-SLE 형태에서 사구체 포도싸이트는 정상과 다르지 않다 (Kazatchkine et al., 1982, J. Clin. Invest. 69:900-912; Emancipator et al., 1983, Clin. Immunol. Immunopathol. 27:170-175). 그러나 형태 IV SLE 신장염 환자는 다른형태의 신장낭창이나 신장장염이 없는 SLE 환자가 가지는 것보다 더 적은 수의 적혈구 CR1를 가지지 않는다 (Jouvin et al., 1986, Complement 3:88-96).
생체내 보체에서 활성화는 중성호성의 플라스마 막에서의 CR1 발현을 조절한다 (Lee, J., et al., 1984, Clin. Exp. Immunol. 56:205-214; Moore, F.D., Jr., et al., 1986, N. Engl. J. Med. 314:948-953).
3. 본 발명의 요약
본 발명은 C3b/C4b 수용체 (CR1) 유전자와 이의 인코드된 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 또한 70 누클레오티드를 포함하는 CR1 핵산배열순서와 이들의 단편에 그리고 24 아미노산을 포함하는 이들의 인코드된 펩티드 또는 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 또한 CR1 단백질과 이들의 단편의 발현을 제공한다. 본 발명의 유전자와 단백질은 보체 활성도를 포함하는 질환 그리고 각종 면역 시스템이나 염증질환의 진단과 치료에 용도가 있다.
다음의 실시예항에서 기술한 본 발명의 특이한 구체예에서 전체 길이의 CR1 cDNA와 이들의 단편의 클로닝, 누클레오티드 배열순서 및 추론된 아미노산 배열순서를 기술한다. CR1 단백질과 이들의 단면의 발현도 또한 기술한다. C3b 및/또는 C4b 에 대한 결합위치를 포함하고 그리고 인자 I 보조인자 활성도를 나타내는 CR1 단백질과 이들의 단편의 발현을 얻는다.
또한 다음의 실시예에 기술된 것은 가용성 CR1 분자의 생산과 정제이고, 이 분자는 염증반응의 치료에 유용하고 그리고 심근증경색 크기의 감소와 리퍼퓨전(reperfusion) 상해의 방지에도 유용하다.
3.1. 정의
Ad2 MLP= 아데노비루스 2 주요끝의 촉진부위
C= 보체
C3(ma)= 메틸아민-처리한 C3
C4bp= C4 결합단백질
CMV= 시토메갈로비루스
CR1= 보체수용체 형태 1, C3b/C4b 수용체
CR2= 보체수용체, 형태2
DCFDA= 디클로로 플루어레신 디아세테이트
HPLC= 고성능 액체 크로마토그래피
iC3b= 비활성화한 C3b
LHR= 길다란 상동성 반복
mAb= 단일클론의 항체
PAGE= 폴리아크릴아미드 겔 전기영동
SCR= 짧은 일치성반복
sCR1= 가용성 CR1 분자
5. 본 발명의 상세설명
본 발명은 C3b/C4b 수용체 (CR1) 유전자와 이의 인코드된 단백질에 관한다. 또한 본 발명은 70누클레오티드를 포함하는 CR1 핵산배열순서와 이의 단편과 24 아미노산을 포함하는 이들의 인코드된 펩티드나 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 또한 CR1 단백질과 이들의 단편의 발현을 제공한다. 이러한 CR1 배열 순서와 단백질은 염증이나 면역체계의 질환과 보체활성도를 포함하는 질환의 진단과 치료가 가치를 가진다.
특이한 구체예에서 본 발명은 가용성 CR1 분자 그리고 이들의 발현, 정제 및 용도에 관한다. 여기서 사용한 용어 가용성 CR1 분자는 CR1 단백질의 부위를 의미하고 이 단백질은 천연의 CR1 단백질과는 대조적으로 막단백질로서 세포표면에 발현하지 않는다. 하나의 특별한 실시예로서 실질적으로 투과막 영역이 결핍된 CR1 분자는 가용성 CR1 분자가 된다. 하나의 바람직한 실시예에서 가용성 CR1 분자는 발현된 세포에 의해서 분비된다.
다음의 실시예 항에서 상세히 기술된 본 발명의 특이한 실시예에서 전체 길이로된 CR1 cDNA와 이들의 단편의 클로닝과 완전한 투클레오티드 그리고 추론된 아미노산 배열 그리고 인코드된 CR1 생성물의 발현을 기술한다. C3b 및/또는 C4b에 대한 결합위치를 가지고 그리고 인자 I의 조인자 활성도를 억제하는 CR1과 이들의 단편의 발현도 기술한다. 또한 본 발명은 가용성의 타절한 CR1 분자의 생산과 정제로서 설명한다. 특이한 실시예에서 이러한 분자는 염증감소에 그리고 심경근 경색크기의 감소에 그리고 리퍼퓨전 상해방지에 유용하다.
5.1. CR1 유전자의 단리
CR1 유전자의 완전한 코딩 배열순서와 이의 추론된 아미노산 배열순서를 제1도에 나타낸다.
어떤 사람세포는 CR1 유전자의 분자클로닝용의 핵산 공급용으로서 강하게 작용한다. CR1 유전자의 단리는 예컨대 C3b 또는 C$b 또는 면역 복합체의 결합, 조절성 식작용, 면역자극이나 증식 및 보체의 조절과 같은 CR1-관련된 성질이나 구조를 나타내는 단백질을 인코드하는 이러한 DNA 배열순서의 단리를 포함한다. 이 DNA는 클론이된 DNA(예컨대 DNA 라이브라리)로부터 공지된 표준방법으로 또는 소요의 사람 세포로부터 정제된 게놈의 DNA 또는 이들의 단편을 콜로닝하여 수득한다 (See, for example, Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Glover, D.M. (ed.), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K., Vol. I, II.) CR1 유전자의 cDNA 클로닝용 핵산의 공급원으로서 작용할 수 있는 세포는 단구세포/대삭세포, 과립구, B세포, T세포, 비장난포 수지상 세포 및 사구체 포도싸이트를 포함하지만 이에 국한된지는 않는다. 게놈의 DNA에서 유도된 클론은 코딩영역외에 조절 및 인트론 DNA 영역을 포함할 수도 있고; cDNA로부터의 유도된 클론은 엑손 배열순서만을 포함한다. 공급원이 무엇이든간에 CR1 유전자는 유전자의 번식을 위하여 적합한 전달매개체속으로 분자상으로 클론이 되어야 한다.
게놈 DNA 에서의 유전자의 분자클로닝에서 DNA 단편을 발생시키고 이중 일부는 소요의 CR1 유전자를 인코드한다. 이 DNA는 각종 제한효소를 사용하여 특이한 위치에서 분할할 수도 있다. 또한 망간의 존재하에 DNAse 를 사용하여 이 DNA를 단편화 하고 이 DNA는 예컨대 음파파쇄와 같이 물리적으로 전달할 수 있다. 다음에 선형 DNA 단편을 한천 및 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 그리고 칼럼 크로마토그래피를 포함하지만 이에 국한되지는 않는 표준기술로서 크기에 따라 분리할 수 있다. 일단 DNA 단편이 발생되면 CR1 유전자를 포함하는 특이한 DNA 단편의 확인은 여러가지 방법으로 실시한다. 예를 들면 만일 CR1 유전자나 이의 특이한 RNA 또는 이들의 단편의 일정량을 수득하여 정제하고 라벨을 할 수 있으며, 발생된 DNA 단편은 핵산 하이브리드화로 분류하여 라벨이된 탐침으로 만들 수가 있다 (Benton, W. and Davis, R., 1977, Science 196:180; Grunstein, M. and Hogness, D., 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72:3961). 탐침에 대해서 실질적으로 동일성을 가지는 DNA 단편을 하이브리드화한다. 만일 정제한 CR1-특이성 탐침을 얻지 못하면 CR1에서 증대된 핵산분절을 초기 선택방법으로서 탐침으로서 사용한다. 한예로서 섬유아세포에 의해서 발현된 메시지가 빼어지는 탐침 표현 B세포 cDNA를 사용할 수 있다. 제한효소 소화에 의하고 그리고 만일 가능하면 공지된 제한 사상도에 따라서 기대된 것과 단편의 크기를 비교하여 적절한 단편의 확인이 가능하다. 유전자의 성질을 기준한 추가의 선택 또는 다음에 기술한것 같이 그의 발현된 생성물의 면역학적 성질을 최초 선택후에 사용할 수가 있다.
또한 CR1 유전자를 핵산 하이브리드화에 의해 mRNA 선택을 하고 다음에 시험관 번역을 하여 확인하였다. 이 과정에서 하이브리드화에 의한 보체 mRNA의 단리에는 단편을 사용하였다. 이러한 DNA 단편은 구득가능하고, 정제된 CR1 DNA 또는 CR1 배열순서에 대해서 증대된 DNA를 나타낼 수도 있다. 단리된 RNA의 시험관 번역 생성물의 면역 침전분석이나 기능적 검사법(예컨대, C3b 또는 C4b 결합에 대해서 또는 식세포 작용의 촉진 또는 면역자극, 또는 보체조절등)으로 mRNA를 확인하고 그러므로 CR1 배열순서를 포함하는 보체 DNA 단편도 확인한다. 또한 특이한 mRNA는 세포에서 단리된 폴리즘의 흡착으로 선택되어 CR1에 대해서 특별히 지정된 항체를 고정시킨다. 방사선 라벨이된 CR1 cDNA는 형판으로서 선택된 mRNA(폴리즘에서 흡착된)를 사용하여 합성할 수 있다. 다음에 방사선 라벨이된 mRNA 또는 cDNA를 다른 게놈의 DNA 단편으로 종에서 얻는 CR1 DNA 단편을 확인하는 탐침으로서 사용할 수도 있다.
CR1 게놈의 DNA 를 단리하는 대안은 공지의 배열순서에서 유전자 배열순서 자체를 화학적으로 합성하거나 또는 cDNA를 CR1 유전자를 인코드하는 mRNA로 만드는 것을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다. 예를 들면 위에서 기술한것 같이 CR1 유전자의 cDNA 클로닝용 RNA를 단세포/대식세포, 과립구, B세포, T세포, 수지상세포 및 포도싸이트를 포함하지만 이에 국한되지는 않는다. 바람직한 구체예에서 편도세포는 cDNA 클로닝용 mRNA의 공급원으로서 작용할 수 있다(다음의 6.1.2항 참조). 다른 방법도 가능하고 본 발명의 범위에 든다.
다음에 확인하고 단리한 유전자를 적절한 클로닝 전달 매개체속으로 삽입할 수 잇다. 본 기술분야에서 알려진 보다큰 수의 전달매개체를 사용할 수도 있다. 가능한 전달매개체는 플라스미드나 수식된 비루스를 포함하지만 이에 국한되지는 않으며 이 전달매개체는 사용한 숙주세포와 사용되어야 한다. 이러한 전달매개체는 람다유도체와 같은 박테리오파지 또는 pBR322나 pUC 플라스미드와 같은 플라스미드 CDM8 플라스미드(Seed, B., 1987, Nature 329:840-842) 또는 유도체를 포함하지만 이에 국한되지는 않는다. 재조합 분자를 형질전환, 트란스펙션, 감염, 전기영동을 통하여 숙주세포속으로 삽입할 수 있다.
또다른 방법에서 CR1 유전자는 샤트건(shot gun) 시도에서 적합한 클로닝 전달매개체속으로 삽입한 후 확인하고 단리할 수도 있다. 예를 들어서 크기분류와 같은 CR1 유전자에 대한 증대는 콜로닝 전달매개체속으로 삽입하기전에 실시한다.
CR1 유전자는 클로닝 전달매개체속으로 삽입하여 이것을 적절한 숙주세포를 형질전환, 트란스펙트 또는 감염시켜서 유전자 배열 순서의 많은 복제품을 발생시키는데 사용할 수 있다. 특이한 구체예에서 클로닝 전달매개체는 CDM8 전달매개체일 수가 있고 이것은 포유동물 숙주세포에서 발현을 얻는데 사용할 수 있다. 예를 들면 클로닝 전달매개체속으로의 삽입은 보체 응집성의 말단을 가지는 클로닝 전달매개체속으로 DNA 단편을 걸찰시켜 신시할 수 있다. 그러나 만일 DNA를 단편하는데 사용된 보체 제한위치가 클로닝 전달매개체속에 존재치 않으면 DNA 분자의 단부는 효소로 수식할 수도 있다. 또한 소요되는 어떤 위치를 누클레오티드 배열순서(결합체)를 DNA 말단에 결찰시켜 생성하면; 이러한 결찰된 결합체는 제한 엔도누클레아제 인식 배열순서를 인코딩하는 특이하게 화학적으로 합성한 올리고누클레오티드를 포함할 수도 있다. 또다른 방법에서 분할된 전달매개체와 CR1 유전자는 단중합적 꼬리화로 수식할 수도 있다.
클론이된 CR1 유전자의 확인은 DNA 자체의 성질에 또는 그의 인코 드된 단백질의 물리적, 면역학적 또는 기능적 성질을 기준하는 여러방법으로 실시할 수가 있다. 예를 들면 DNA 그자체는 탐침에 라벨이된 집락핵산 하이브리화나 혈소판에 의해서 검출한다 (Benton, W. and Davis, R., 1977, Science 196:180; Grunstein, M. and Hogness, D., 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72:3961). 또한 CR1 유전자의 존재는 발현된 생성물의 성질을 기준하는 검사법에 의하여 검출할 수도 있다. 예를 들면 적합한 mRNA를 하이브리드-선택하는 cDNA 클론이나 DNA를 예를 들면 유사하거나 동일한 전기영동식 이동, 등전성 촛점성질, 단백질분해 소화 사상도, C3b 및/또는 C4b 및/또는 면역복합체 결합활성도, 보체조절 활성도, 식세포 작용이나 면역자극에 대한 효과 또는 CR1 으로서 공지된 항원성질을 가지는 단백질을 만드는 것으로 선택할 수 있다. CR1에 항체를 사용하여 CR1 단백질을 ELISA (효소-결합된 면역흡수 검사법)-형태 과정에서 추상적으로 CR1-합성하는 클론에 라벨이된 항체를 결합시켜 확인할 수도 있다. 특별한 구체예에서 CDM8 전달매개체에든 CR1 cDNA 클론은 거대 세포비루스 촉진부위(다음의 8항 참조)의 조절을 받으면서 대규모-발현을 위하여 COS(원숭이 신장) 세포속으로 트란스펙트할 수 있다.
만일 궁극적인 목적이 백신 비루스나 아데노비루스와 같은 비루스 발현 전달매개체속으로의 삽입이라면 CR1 유전자를 삽입하는 재조합 DNA 분자를 수식하여서 이 유전자가 비루스로 감염된 세포속에서 유전자 재조합이 되도록 허용하여 이 유전자가 비루스 게놈속으로 삽입될 수 있게하는 비루스 배열순서에 접하게 할 수 있다.
CR1 DNA-함유 클론을 확인하고, 생장시키고, 수거한 후에 이의 DNA 삽입물을 다음의 5.4.1항에서 기술한것 같이 특정화 할 수 있다.
CR1 유전자의 유전자구조를 알게되면 본 발명에서 최적 사용할 구조를 조절할 수가 있게된다. 예를 들면 촉진부위 DNA 는 단백질의 발현을 증가시키기 위하여 천연의 촉진부위에 추가하거나 대체하여 CR1-코딩배열순서의 결찰된 5' 가 될수도 있다. CR1 삭제 돌연변이체를 발현하는 발현 전달매개체도 또한 만들어서 CR1 배열순서(다음의 실시예 항을 참조)의 한정된 단편의 발현을 제공한다. 특별한 구체예에서 삭제돌연변이체를 예컨대 C4b 의 결합을 위한 LHR-A 또는 C3b의 결합을 위한 LHR-C와 같은 소요의 C3b 및/또는 C4b 결합활성도(다음의 9항 참조)를 나타내는 CR1 단백질의 단편을 인코드 하는 것으로 구성시킬 수가 있다. 바람직한 구체예에서 막투과 영역이 삭제된 CR1 분자를 인코드하는 발현 전달매개체를 가용성 CR1 분자를 생성하는데 사용할 수 있다(다음의 실시예항 11-14 참조). 많은 조정이 가능하고 본 발명의 범위에 포함된다.
5.2. 클론이된 CR1 유전자의 발현
CR1 단백질(제1도)이나 이들의 부위를 코딩하는 누클레오티드 배열순서를 예컨대 삽입된 단백질-코딩 배열순서의 전사와 번역에 필요한 요소를 포함하는 전달매개체와 같은 적합한 발현 전달매개체속으로 삽입할 수가 있다. 또한 필요한 전사와 번역신호를 천연의 CR1 유전자 및/또는 이의 접하는 영역으로 공급이 가능하다. 여러가지 숙주-전달매개체 시스템을 단백질-코딩 배열순서에 사용할 수도 있다. 이러한 것들은 비루스(예컨대 백신비루스, 아데노비루스등)로 감염된 포유동물의 세포시스템; 비루스로 감염된 곤충세포 시스템(예컨대, 바쿠로비루스); 효모 전달매개체를 포함하는 효모 또는 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA로서 형질전환시킨 박테리아와 같은 미생물을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다. 이러한 전달매개체의 발현 요소는 이들의 강도와 특이성에 변화가 있다. 사용된 숙주-전달매개체에 따라서 다수의 적합한 전사 및 번역요소중 어느 하나를 사용할 수도 있다. 예를 들면 포유동물 세포시스템에서 클로닝할 때 포유동물 세포의 게놈에서 또는 이러한 세포에서 생장하는 비루스(예컨대 아데노비루스, 원숭이의 비루스 40, 거대세포 비루스)에서 단리한 촉진부뤼를 사용할 수도 있다. 재조합 DNA 나 합성기술로 생성한 촉진부위도 또한 삽입된 배열순서의 전사를 제공하는데 사용할 수도 있다.
또한 특이한 개시신호가 삽입된 단백질 코딩 배열순서의 효율적 번역에 소요된다. 이러한 신호는 ATG 개시코돈과 인접하는 배열순서를 포함한다. 이의 자체의 개시코돈과 인접하는 배열순서를 포함하는 전체 CR1 유전자를 적절한 발현 전달 매개체속으로 삽입하는 경우 추가의 번역 조절신호는 불필요하다. 그러나 CR1 코딩배열순서의 단 하나의 부위만을 삽입하는 경우에는 ATG 개시코돈을 포함하는 외래의 번역 조절신호를 제공하여야 한다. 더우기 이 개시코돈은 전체 삽입물의 번역을 보장하기 위하여 단백질 코딩배열순서의 판독 프레임과 같은 상에 있어야 한다. 이러한 외래 번역 조절신호와 개시코돈은 천연과 합성의 두가지 모두로된 여러가지 공급원으로 될수가 있다.
전달매개체속으로 DNA 단편을 삽입하도록 뒤에서 기술한 방법중 어떤 것을 적절한 전사/번역 조절신호로 구성된 키메리 유전자를 포함하는 발현전달매개체와 단백질 코딩 배열순서를 구성하는데 사용할 수도 있다. 이러한 방법은 시험관내 재조합 DNA와 합성 기술 그리고 생체내 재조합(유전자 재조합)을 포함할 수도 있다.
특이한 구체예에서 가용성 CR1 분자를 발현할 수 있다. 이러한 가용성 분자는 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성시켜서 CR1 투과막 영역을 인코딩하는 DNA 배열순서를 삭제할 수 있다(다음의 11-14항 참조). 다음에서 나타내는것 같이 가용성 CR1 분자를 발현하는 능력은 CR1 핵산 배열순서의 유전자 수식의 어떤것에 한정되지는 않으며; CR1 투과막 영역의 실질적인 부위를 인코딩하는 핵산 배열순서를 삭재하는한, 가용성 CR1 구성을 얻을 수 있다.
CR1 유전자 삽입물을 포함하는 발현 전달매개체는 다음의 세가지의 일반적 방법으로 확인할 수가 있다: (a) DNA-DNA 하이브리드화, (b) 표식 유전자 관능기의 존재 또는 부재 및 (c) 삽입된 배열순서의 발현, 제1방법에서 발현 전달매개체속으로 삽입된 외래유전자의 발현은 삽입된 CR1 유전자와 동일한 다음의 실시예항에서 상세히 설명한 다른 특별한 구체예에서 CR1 코딩영역의 부분에 상응하는 CR1 cDNA 삽입물을 가진 CDM8전달 매개체를 COS 세포속으로 트란스텍트할 수 있고 여기서 CR1 또는 단편을 발현한다. 다음의 또다른 실시예에서 절두원뿌리형의 가용성 CR1 분자를 11.3.1 항에서 기술한 pTCS 전달매개체와 같은 발현 전달매개체를 사용하여 포유동물 세포에서 발현할 수 있다. 앞에서 설명한것 같이 사용가능한 발현 전달매개체는 다음의 전달매개체나 이들의 유도체를 포함하지만 이에 국한되지는 않는다: 백신비루스나 아데노비루스와 같은 사람이나 동물 비루스; 바쿠로비루스와 같은 곤충비루스; 효모 전달매개체; 박테리오파지 전달매개체(예컨대 람다) 및 플라스미드와 코스미드 DNA 전달매개체등등.
또한 삽입된 배열순서의 발현을 조절하거나 또는 소요의 특이한 형태의 키메리 유전자 생성물을 수식하고 처리하는 숙주세포 균주를 선택할 수도 있다. 어떤 촉진부위로부터의 발현은 어떤 유발제의 존재하에 상승시키고; 이렇게 하여 유전공학적으로 조작한 CR1 단백질의 발현을 조절할 수도 있다. 더우기 상이한 숙제세포는 단백질을 번역 및 후-번역 처리 및 수식하는 특성과 특이한 메카니즘을 가진다. 적절한 세포배양주와 숙주시스템을 발현한 이종의 단백질의 소요의 수식과 처리를 보장하도록 선택할 수 있다. 예를 들면 한구체예에서 박테리아 시스템의 발현을 제1도에 추론된 아미노산 배열순서를 가진 글리코실화 하지 않는 CR1 단백질 생성하는데 사용할 수 있다. 효모에서의 발현으로 글리코실화한 생성물을 만들 수 있다. 또다른 구체예에서 포유동물 COS 세포를 사용하여 이종의 CR1 단백질의 천연의 글리코실화를 보장할 수 있다. 더우기 상이한 전달매개체/숙주 발현 시스템을 상이한 정도로의 단백질 분해 분할과 같은 처리반응을 실시할 수도 있다. 이러한 여러가지의 많은 처리된 CR1 단백질을 생성하고 본 발명의 범위내에 들수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서 가용성 CR1 분자의 대량생산을 다음의 12.1항에서 기술한것 같이 실시할 수 있다.
5.3. 발현된 유전자 생성물의 확인과 정제
CR1 유전자를 발현하는 재조합물을 일단 확인하면 유전자 생성물을 분석해야 한다. 이것은 생성물의 물리적, 면역학적 또는 기능적 성질을 기준으로 검사하여 실시할 수 있다.
이 Cr1 단백질은 크로마토그래피(예컨대, 이온교환, 친화력, 분류하는 칼럼 크로마토그래피, 고압액체 크로마토그래피), 원심 분리, 불등용해도를 포함하는 표준방법으로 또는 단백질을 분해하는 어떤 다른 표준기술로서 단리하고 정제할 수도 있다.
다음의 실시예에서 상세히 설명한 본 발명의 바람직한 특징에서 대량의 가용성 CR1를 HPLC(12.2항 참조)를 포함하는 방법으로 정제할 수가 있다. 다음에서 기술하는것 같이 정제된 CR1의 대량생산은 출발물질로서 가용성 CR1을 생산하는 발현시스템을 사용하여 실시할 수가 있고 이리하여 세제로서 막-결합 CR1의 용해의 필요성을 배제한다. 생체반응기 배양물에서의 태아소의 혈청농도를 감소 그리고/또는 이러한 배양물에서의 또다른 배양물 매체의 사용으로 후속적 정제중에서 가용성 CR1-포함 출발물질로부터 외래단백질의 고농도를 제거하는 필요성을 배제한다. 양이온 HPLC 또는 양이온 HPLC 다음에 음이온 교환 HPLC 와의 결합을 이러한 바람직한 형태에서의 정제에 사용할 수 있따. 실질적으로 순수한 가용성 CR1를 고수율로 단 하나나 두단계에서 성취할 수가 있다.
또한 일단 재조합으로 만든 CR1 단백질을 정제하면 이 단백질의 아미노산 배열순서를 재조합물에 포함된 키메리 유전자의 누클레오티드 배열순서로부터 연역할 수 있다. 결과적으로 이 단백질을 공지된 표준화학 방법으로 합성할 수가 있다. (e.g., see Hunkapiller, M., et al., 1984, Nature 310:105-111).
본 발명의 특별한 구체예에서 재조합 DNA 기술에 의하거나 또는 화학적 합성방법으로 제조된 이러한 CR1 단백질은 1차 아미노산 배열순서로서 관능기가 같은 아미노산 잔기가 배열순서 안에서 잔기가 치환되어 비활성 변화를 일으키는 변경된 배열순서를 포함하는 제1도에서 나타낸 것과 실질적으로 같은 아미노산 배열순서의 전부나 일부를 포함하지만 이에 국한되지는 않는다. 예를 들면 이 배열순서에 들어있는 하나나 그이상의 아미노산 잔기를 관능기로 같게 작동하는 유사한 극성을 가지는 또다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 비보존성 치환물도 또한 관능기가 같은 단백질을 만들어낼 수 있다.
한구체예에서 CR1 배열순서안에서 아미노산을 위한 치환물을 이 아미노산이 속하는 류의 다른 부분으로부터 선택할 수 있다. 예를 들면 비극성(소수성) 아미노산은 알라닌, 로이신, 이소로이신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함한다. 극성이 중성인 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스타인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양으로 하전된(염기성의) 아미노산은 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 포함한다. 음으로 하전된 (산성의) 아미노산은 아스파라긴산과 글루타민산을 포함한다. 또한 본 발명의 범위에는 예컨대글리코실화, 단백질분해 분할등에 의해서 번역중이나 번역후에 부등 수식된 CR1 단백질이 포함된다.
다음에 상세히 기술한 본 발명의 실시예에서 트란스펙트된 세포에 의해서 클론이된 재조합 CR1은 C4b나 C3b중 어느것을 지니는 양의 적혈구의 결합을 매개할 수 있는 SDS-PAGE(제14도)에 의해서 적혈구의 F 이인자형과 3분이 안되는 것으로 나타났으며 CR1(제13도)의 배위자 특이성을 재생시킬 수 있으며 또한 C3(ma)의 알파 폴리펩티드(제15도)의 분할에 대해서 인자 I 조인자 활성도를 나타낸다.
5.4. CR1 유전자와 단백질의 구조
CR1 유전자와 단백질의 구조는 다음에 기술하는 것을 포함하지만 이에 국한되지는 않는 본 기술분야에 공지된 여러가지 방법으로 분석할 수가 있다.
5.4.1 유전의 분석
CR1 유전자에 상응하는 클론이된 DNA 또는 cDNA는 써선 하이브리드화(Southern, E.M., 1975, J. Mol. Biol. 98:503-517), 노썬 하이브리드화(예컨대, Freeman et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:4094-4098),l 제한 엔도누클라제 사상도작성(Maniatis, T., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) 및 DNA 배열순서 분석을 포함하지만 이에 국한되지는 않는 방법으로 분석할 수가 있다. 써선 및 노썬 하이브리드화에 대한 하이브리드화 조건을 엄밀성은 사용된 특이한 CR1 탐침에 대한 관련성의 소요정도로서 핵산의 검출을 보장하기 위하여 잘다룰수가 있다. 예를 들면 LHR-B와 LHR-C를 인코딩하는 CR1 유전자 배열순서를 포함하는 탐침으로 엄밀성이 낮은상태에서의 하이브리드화는 CR2 핵산 배열순서를 검출하는데 사용할 수 있다.
제한 엔도누클레아제 사상도 작성은 CR1 유전자의 유전자 구조를 대략 측정하는데 사용할 수 있다. 특별한 구체예에서 제한효소에 의한 분할은 다음에 제2도에서 나타낸 제한사상도를 유발하는데 사용할 수 있다. 제한 엔도누클레아제 분할로 유도된 제한 사상도는 DNA 배열순서 분석으로 확인할 수 있다.
DNA 배열순서 분석은 Maxam 과 Gilbert 방법(1980, Meth, Enzymol, 65:499-560), Sanger 디데옥시방법(Sanger, F., et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74:5463), 또는 자동화된 DNA 배열순서기의 사용(예컨대, Applied Biosystems, Foster City, CA) 을 포함하고 이에 국한되지는 않는 공지된 어떤 기수에 의하여 실시할 수 있다. CR1 유전자의 cDNA 배열순서는 제1도에서 6 및 7항에서 기술한 것과 실질적으로 같은 배열순서를 포함한다.
5.4.2. 단백질 분석
CR1 단백질의 아미노산 배열순서는 예컨대 자동화한 아미노산 배여리순서기와 같이 단백질의 직접적인 배열순서화에 의해서 유도할 수 있다. 대표적인 CR1 단백질의 아미노산 배열순서는 제1도에 나타내고 다음의 6항에서 상세히 설명한 것과 실질적으로 같은 배열순서를 포함한다. 다음에서 기술한것 같이 F 이인자형 CR1의 코딩 배열순서의 전부를 클론하고 41아미노산의 신호 펩티드를 분할한 후에 숙성 수용체는 30 SCR 를 형성하는 1930 잔기의 외세포 영역을 포함하는 1998 아미노산을 포함하였고 30 SCR 중 28은 LHRs-A, -B, -C 및 -D(제1도)를 조직화하고, 이것은 25아미노산의 단일의 막의 짧은 길이영역이고 43아미노산의 비교적 짧은 세포형질이다.
다중 SCR 를 포함하는 C3/C4 결합 단백질중에서 CR1은 LHR로 조직된 SCRs의 그룹을 가지는 면에서 독특하다. CR1의 네개의 LHRs의 비교로서 각각이 다음의 네가지 형태의 SCRs의 조성물임을 나타낸다: 형태 a,b,c, 및 d(제19도). 예를 들면 LHR-A의 SCR-1 및 -2의 배열순서는 각각 LHR-B, -C 및 -D의 첫번째 두개의 SCRs에 62%, 62% 및 57%만이 동일하다. 그러나, SCR-3 내지 SCR-7은 단일위치에서 LHR-B의 상응하는 SCR와 다르고 SCR-3과 4는 세위치에서(제10도) LHR-C의 그것들과 다르다. 이와 같이 LHR-A의 형태 a) SCR의 몇가지도 또한 LHR-B 와 -C에 존재한다. LHR-A와는 상이한 LHR-B의 처음의 두개의 SCRs는 LHR-C의 상응하는 SCRs와 99%가 동일하에서 LHR-B와 -C가 이러한 위치에서 형태 b SCR를 공위한다. LHR-C의 다섯번째, 여섯번째와 일곱번째의 SCR는 이러한 위치에서 형태 a SCR 에 77%만이 동일하고 형태 c SCRs 간주된다. LHR-D의 첫째에서 네째의 SCR는 비교적 독특하고 형태 d인 한편에 다섯째 내지 일곱번째 SCR는 LHR-C에서 발견된 c 형태에 대략 93%가 동일하다.
CR1 단백질 배열순서는 친수성 분석으로 추가로 특징화 할 수 있다(Hopp, T. and Woods, k., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824). 친수성 윤곽은 CR1 단백질의 소수성과 친수성 영역과 이러한 영역을 인코드하는 유전자 배열순서의 상응하는 영역을 확인하는데 사용할 수 있다. CR1 단백질의 COOH-말단의 친수성 윤곽은 제5도에 나타낸다.
제2구조분석(Chou, P. and Fasman, G., 1974, Biochemistry 13:222)도 또한 실시하여서 특이성의 제2구조를 추측하는 C11의영역을 나타낼 수 있다.
구조적 분석의 다른방법도 사용할 수 있다. 이것들은 X-선 결정학(Engstom, A., 1974, Biochem. Exp. Biol. 11:7-13)과 컴퓨터 모델화를 포함하지만 이에 국한되지는 않는다(Fletterick, R. and Zoller, M. (eds.), 1986, Computer Graphics and Molecular Modeling, in Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.
5.5. CR1-관련된 유도체, 유사체 및 펩티드
CR1과 관련된 유도체, 유사체 및 펩티드의 생산과 사용도 또한 계획하였으며 본 발명의 범위에 든다. 소요의 면역원성이나 항원성을 가지는 이러한 유도체, 유사체 또는 펩티드는 예컨대 면역을 위한 면역검사법에서 치료학적으로 사용할 수 있다. 예컨대 C3b 또는 C4b 의 결합, 보체활성도의 조절 또는 면역자극이나 식세포작용의 촉진과 같은 소요의 CR1 성질을 보유하거나 또는 이를 억제하는 이러한 분자들을 각각 이러한 성질의 유발제, 억제제로서 사용할 수 있다.
본 발명의 CR-1 관련된 유도체, 유사체 및 펩티드를 본 기술 분야에서 공지된 여러가지 방법으로 생산할 수 있다. 이들의생산의 조절 유전자나 단백질의 수준에서 발생할 수 있다. 예를 들면 클론이된 CR1 유전자는 본 기술분야에 공지된 어떤 다수의 전략으로 수식할 수 있다(Maniatis, T., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York. CR1 배열순서는 제한 엔도누클레아제로서 적절한 위치에서 분할하고, 다시 효소수식하고 만일 필요하면 시험관에서 단리하고 결찰시킬 수 있다(다음의 제8항 참조). CR1과 관려니된 유도체, 유사체 또는 펩티드를 인코드하는 유전자의 생성에서 수식된 유전자가 소요의 CR1-특이성 활성도가 인코드되는 유전자영역에서 번역정지 신호에 의해서 중단되지 않고서, CR1와 같은 번역 판독프레임속에 유지되는 것을 보장하도록 주의를 해야한다.
또한 CR1 유저자는 시험관에서나 생체조직내에서 돌연변이하여 번역, 개시 및/또는 말단배열순서를 발생시키거나/또는 파괴하고 또는 코딩영역에서 변화를 일으키거나/또는 새로운 제한 엔도누클레아제 위치를 형성시키거나 또는 기존의 것을 파괴시, 시험관에서 또다른 수식을 용이케한다. 시험관내-위치-지정된 돌연변이 유발(Hutchinson, C., et al., 1978, J. Biol. Chem. 253:6551), TABR 결합제(Pharmacia)의 사용등을 포함하지만 이에 국한되지는 않는 본 기술분야에서 공지된 돌연변이 유발기술을 사용할 수 있다.
또한 CR1 배열수니서의 조절도 단백질 수준에서 실시할 수 있다. 브롬화시아노가딘, 트립신, 키모트립신, 파파인, V8 단백질 효소, NaBH4에 의한 특이한 화학적 분해; 아세틸화, 포르밀화, 산화, 환원; 투니카마이신의 존재하에 대사합성 등을 포함하지만 이에 국한되지는 않는 공지된 어떤 기술로서 다수의 화학적 수식을 실시할 수 있다.
또한 CR1에 관련된 유사체와 펩티드를 화학적으로 합성할 수 있다. 예를 들면 소요의 활성도를 매개하는(예컨대, C3b 및/또는 C4b 결합, 면역자극, 보체조절등) CR1의 부위에 상응하는 펩티드를 펩티드 합성기를 사용하여 합성할 수 있다.
5.6. CR1의 사용
5.6.1 검사법과 진답법
CR1 단백질, 유사체, 유도체 및 이들의 배열순서 그리고 항-CR1 항체는 검사법과 진단법에서 용도를 가진다. 소요의 CR1 성질이나 기능을 나타내는 본 발명의 분자를 이러한 성질이나 기능을 검사하는데 사용할 수 있다. 예를 들면 유리형태 및/또는 복합체 형태의 C3b 및/또는 C4b의 결합을 나타내는 CR1 단백질 또는 이들의 배열순서를 예컨대 환자의 체액속에서처럼 시료의 이러한 물질의 양을 측정하는 검사법에 사용할 수 있다.
특이한 구체예에서 C3b(예컨대 다음의 9항의 표 II, 참조), iC3b 또는 C4b(예컨대 다음의 8항에서 기술된)에서 발현된 전체길이의 CR1또는 CR1 삭제 돌연변이를 한시료에서 각각 C3b, iC3b, 또는 C4b의 수준을 측정하는 검사법에서 사용할 수 있다. 또다른 구체예에서 투과막 배열순서가 부족하도록 재조합 DNA 기술로서 구성되고 그리고 분비된 CR1 단백질이나 이들의 단편을 사용할 수 있다.
특별한 구체예에서 C3b 및/또는 C4b의 이러한 측정은 보체활성도의 지시에 근거하고 염증과 면역시스템 질환의 진단에 유용할 수 있다. 이러한 질환은 화상이나 삼근경색-유발된 외상과 같은 조직손상, 성인호흡곤란 증세(충격폐, (shock lung)), 류마티스관절과 같은 자기면역질환, 전신계 낭창흥반 및 바람직하지 않거나 또는 부적절한 보체활성도를 포함하는 기타 질병이나 질환을 포함하지만 이에 국한하지는 않는다(see, e.g., Miescher, P.A. and Muller-Eberhard, H.J., eds., 1976, Text Book of Immunopathology, 2d Ed., Vols. I and II, Grune and Stratton, New York; Sandberg, A.L., 1981, in Cellular Functions in Immunity and Inflammation, Oppenheim, J.J. et al., eds., Elsevier/North Holland, New York, p. 373; Conrow, R.B. et al., 1980, J. Med. Chem. 23:242; Regal, J.F. and Pickering, R.H., 1983, Int. J. Immunopharmacol. 5:71; Jacobs, H.S., 1980, Arch. Pathol. Lab. Med. 104:617).
에피토프를 포함하는 CR1 단백질과 이의 단편은 면역검사법을 포함하지만 이에 국한되지는 않는 검사법에 농도를 가진다. 사용이 가능한 면역검사법은 방사성 면역검사법, ELISA(효소 결합된 면역흡수 검사법), 샌드위치 면역검사법, 침강소 반응, 겔 확산 침강소반응, 면역확산 검사법, 응집검사법, 보체-고정검사법, 면역방사계 검사법, 형광면역검사법, 단백질A면역검사법 및 면역전기영동검사법등을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다.
CR1 유전자와 이와 관련된 핵산 배열순서 그리고 보조 배열순서를 하이브리드화 검사법에서 사용할 수 있다. 이러한 하이브리드화 검사법은 CR1 발현과 관련된 염증 또는 면역응답을 감시하여 CR1 발현의 변화와 관련된 어떤 질병상태를 진단하고, 환자의 CR1 이인자형을 측정하고 그리고 CR1 유전자와 이와 관련된 유전자(예컨대 CR2)의 존재 및/또는 발현을 검출할 수 있다.
5.6.2. 치료
CR1 단백질과 이의 단편, 유도체 및 유사체는 CR1으로 매개된 기능의 조절에서 치료학적으로 유용할 수 있다. 이러한 기능은 유리상태나 복합체형태의 C3b 및/또는 C4b, 식세포작용의 촉진, 보체조절, 면역자극 등의 결합을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다. 본 발명의 CR1 단백질과 이와 관련된 분자의 효율적 투여량은 면역이나 염증질환과 같은 기능과 관련된 많은 질병이나 질환에 대해서 치료학적 가치를 지닌다.(예컨대 위의 5.6.1항에서 기술한것 같이). 예를 들면 소요의 활성도를 나타내는 전체길이의 CR1이나 이의 단편 그리고 이와 관련된 분자는 보체성분 C3b이나 C4b의 비가역성 비활성화를 촉진하는(Fearon, D.T., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76:5867; Iida, K. and Nussenzweig, V., 1981, J. Exp. Med. 153:1138) 인자 I 조인인자로서 작용하는 능력에 의해서 그리고/또는 대안의 또는 기본적 C3 이나 C5 전환효소를 억제하는 능력에 의해서 보체의 억제에서 치료학적 용도를 가실 수 있다.
본 발명의 특이적 구체예에서 하나의 발현 전달매개체를 투과막 영역이 결핍된 CR1 분자를 인코드하도록 구성하여(예컨대 대부분의 C-말단의 SCR로 인코드된 아르기닌에 대해서 카르복시-말단을 삭제하여) 가용성 CR1 단편의 생산시킬 수 있다. 하나의 구체예에서 이러한 단편은 유리상태이거나 복합체형태로된 C3b 및/또는 C4b를 능력을 보유할 수 있다. 특별한 구체예에서 이러한 가용성 CR1 단백질은 이미 인자 I 조인자 활성도를 나타내지 않을 수도 있다. 가용성 CR1 생성물은 환자에 생체내 투여하여서 가용성 CR1가 천연의 세포-표면 CR1에 대해서 C3b 및/또는 C4b의 결합을 효율적으로 경쟁하여 세포-표면 CR1 인자 I 조인자 활성도를 차단하고 보체활성도를 증가시킨다.
C3b가 입자 및 가용성 면역복합체의 공유로 결합된 뒤 단백질 분해 처리에 의한 C3b의 iC3b와 C3dg 으로의 비활성화는 두가지는 생물학적 결과를 가진다: 증폭과정을 통한 보체시스템의 과잉활성화를 방지 및 CR1 이외의 수용체를 맞물수 있는 배위자의 형성. iC3beks편은 인자 B 에 결합할 수 없어서 이러한 상태로의 전환은 또다른 통로 증폭 루프를 통하여 추가의 보체활성화를 차단한다. 그러나 iC3b는 골수성 단구세포에 의해서 식세포 작용을 매개하는 두개의 보체수용체인 CR1과 CR3에 의해서 결합이 가능하다. 그러므로 C3b의 iC3b 전환으로의 1차적 생물학적 거리과는 C3-피복된 복합체의 CR1-및 CR3-매개된 분할과의 간섭이 없이 보체활성화의 정지가된다. 반대로 iC3b의 C3dg에의 추가적 전환은 CR2으로만 상호작용을 하고 CR1과 CR3와는 하지 않는 단편을 생성시킨다. 이러한 환경은 CR2를 발현하는 세포형태에 C3dg-보유하는 복합체의 보체-의존성 결합을 제한하고 이러한 세포형태는 B임파구, 난포수지상의 세포 그리고 아마도 상피세포를 포함하고 식세포의 세포형태와의 상호작용을 감소시키거나 배제시킨다. 이러한 변화된 형태의 세포회합의 생물학적 결과는 입자와 복합체의 분할과 분해에 관련된 세포가 아닌 면역응답의 구심성 단계에 포함된 세포에의 C3dg-함유 복합체의 표적화가 된다. 그러므로 CR1 분자는 분할과정에 영향을 줄뿐만 아니라 항원제시와 항체생산에 관여하는 CR2-보유세포형태에 복합체를 표적화하는데에는 치료학적으로 사용한다.
또다른 구체예에서 C3b 또는 C4b를 결합하고 그리고/또는 변경되거나 기본적 C3나 C5 전환요소를 억제하는 능력을 가지고 또는 인자 I 조인자 활성도를 가지는 CR1 단백질이나 이의 단편을 보체비활성화의 촉진에 사용할 수 있다. 이러한 구체예에서 CR1 단백질이나 이들의 단편은 바람직하지 않거나부적절한 보체활성도를 포함하는 질환의 치료에 가치가 있다.(예컨대, 충격폐, 화상이나 국소 빈혈 심장상태에 기인하는 조직손상, 자기면역질환, 염증상태등).
다음의 11-14항의 실시예에서 상세히 기술한 특이적 구체예에서 예컨대 기본적 보체-매개된 용혈작용, 기본적 C5a 생성, 기본적 C3a 생성, 시험관에서의 중성호성의 산화파열을 억제하는 능력에 의해서 나타낸 것과 같이 소요의 기능적 활성도를 보유하는 가용성 CR1 문자를 발견할 수 있다. 생체조직내 치료에 유용한 이러한 CR1 분자는 역수동 아르테루스반응(14.1항 참조)와 쥐의 심근경색 모델(14.3항 참조)를 포함하지만 이에 국한되지는 않는 공지될 여러가지 모델 시스템에서 시험할 수 있다.
본 발명의 또다른 구체예에서 소요의 CR1 성질이나 기능을 억제하는 것으로 나타낸 CR1 의 단편 또는 이의 유사체나 유도체는 이기능과 관련된 질병이나 질환을 방지하거나 치료하는데 사용할 수 있다.
공지된 여러가지 방법을 예컨대 리포좀에서 포획, 유전자 치료에서 조헐제 간(stem)세포 자손에 의한 발현등과 같은 CR1 과 관려니된 분자의 전달에 사용할 수 있다. 삽입하는 다른 방법은 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비내, 구강경로를 포함하지만 이에 국한되지는 않는다.
6. 실시예:사람 C3b/C4b 수용체(CR1)의 클로닝과 배열순서화
여기서 설명한 실시예에서 CR1 코딩영역의 5.5kb염기의 클로닝 및 누클레오티드 배열순서를 기술한다(Klickstein, L.B., et al., 1987, J. Exp. Med. 165:1095-1112).
5.5kb를 건너는 열개의 겹침 CR1 cDNA 클론을 편도산 라이브라리로부터 단리하여 전체적으로나 부분적으로 배열순허화하였다. 클론의 5' 단부에서 시작하여 4.7kb 하류에서 정치코돈까지 연장하는 단일의 길디란 개방판독프레임을 확인하였다. 이 배열순서는 CR1의 F 이인자형에 대해서 코딩배열순서의 추정된 6kb 의 ∼80%를 나타낸다. 450 아미노산으로된 세개의 직렬의, 직접적인 길다란 동족체 반복물(long homolohous repeats (LHRs))를 확인하였다. 트립틱(tryptic) 펩티드의 배열순서의 분석으로 CR1의 F이인자형에서 네번째의 LHR에 대해 증거를 제공하였다. LHRs간의 아미노산 동일성은 제1과 제3의 반응물간의 70%로부터 제1과 제2의 반복물의 NH3 -말단의 250아미노산 사이의 99%의 범위가 된다. 각 LHR 는 보체수용체 형태2, 인자B 및 H, C4 결합단백질 및 C2와 같은 다른 C3/C4 결합단백질을 닯은 60-70 아미노산의 일곱개의 짧은 일치 반복물(short consensus repeats (SCRs))를 포함한다. 두개의 추가의 SCRs는 LHRs를 25 아미노산의 단일의 막-통과 영역에 연결시켜서 CR1의 F이인자형이 최소한 30의 SCR을 포함하고 이중에서 23을 배열순서화 하였다. 각 SCR는 3중의 루프구조를 형성하도록 나타내고 이중에서 네개의 보존된 반-시스틴은 이황화물 결합을 형성한다. 반-경질구조로서 30SCRs의 선형 일치는 플라스마 막으로부터 1,140A 연장하고 면역복합체와 미생물 세포벽의 틈새속에 위치한 C3b와 C4와 CR1과의 상호작용을 용이케 할 수 있다. 43 잔기의 COOH-말단의 세포형질영역은 여섯개의 아미노산 배열순서를 포함하고 이 순서는 상피 생장인자 수용체에서의 배열순서에 일치하고 수용체는 단백질 키나제C에 의해서 포스포릴화 된다.
6.1. 물질과 방법
6.1.1 CR1 트립틱 펩티드의 단리와 배열순서
CR1은 배열순서가 정해진 Matrex Red A 및 YZ-1 단일클론의 항체 친화력 크로마토그래피에 의해서 세척된 사람 적혈구막으로부터 정제하였다(Wong, W.W., et al., 1985, J. Immunol. Methods 82:303). 트립틱 펩티드는 다음으로 기술한것 같이 순서적 경사와 등력식 역-상 HPLC(고성능 액체크로마토그래피)로 제조하고 단리하였다(Wong, W.W., et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:7711). 트립틱 펩티드 분석은 470A 단백질 배열순서기로 실시하고(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) 그리고 각 분해 싸이클의 분석은 120 PTH-아미노산 분석기를 사용하여 실시하였다(Applied Biosystems, Inc.).
6.1.2. cDNA 클론과 게놈의 콜론의 단위
cDNA를 기술한것 같이 사람 편도선 폴리(A)+RNA로부터 λgtll에서 구성시켰다(Wong, W.W., et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:7711)로서 선별하였다(Maniatis, T., et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). 하이브리드화는 50% 포름아미드에서 5xSSC(1xSSC:15mM 구연산나트륨, 150mM 염화나트륨)으로 43 에서 실시하고 여과기를 CR2 cDNA 클론의 검출을 허용치 않는 0.2xSSC 클론의 검출을 허용치 않는 0.2xSSC 조건에서 60 로 세척하였다(Weis, J.J., et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:5639). 양성의 클론은 혈소판-정제를 두번하고 다음에 제한 사상도 작성과 DNA 배열순서 분석을 하였다.
게놈의 라이브라리를 사람이 임파구 DNA를 Sau3AI 으로서 부분 소화시켜서 생성시킨 15-20kb 단편을 가진 EMBL-3 에서 구성시켰다. 최초의 복합도는 1.2x106이었고 이 라이브라리를 대장균 균주 P2392에서 증폭시켰다. 또한 이 라이브라리를 cDNA 탐침 CR1-1과 CR1-2로서 분류하였다(Wong, W.W., et al., 1985, Procl. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:7711).
6.1.3. DNA 배열순서 분석
cDNA 클론의 제한단편을 M13mp19 이나 M13m19에서 서브클론시키고 디데옥시누클레오티드 사슬말단 방법으로 배열순서화하였다(Sanger, F., et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74:5463). 몇몇 클론은 엔도누클레아제 III 를 사용하여제 제1발생의 순서로된 삭제 돌연변이체에 의해서 전체적으로나 부분적으로 배열순서화 하였다(Henikoff, S., 1984, Gene 28:351). 각 영역을 두 사상체 모두에서 배열순서를 만들고 대부분의 경우에서 각 영역은 두개의 독립적으로 단리된 cDNA클론(제2도)에서 구성시킨 M13 서브클론에서 배열순서화 하였다. 배열순서 데이타는 University of Wisconsin Genetics Computer Group Package (Madison, WI)으로 분석하였다.
6.2. 결과
6.2.1. CR1 유전자의 누클레오티드 배열순서
크기로 선별된 편도선 cDNA 라이브라리 CR1 cDNA 클론, λT8.3 에서 수득한 CR1-1 및 CR1-2 탐침으로 선별하였다(Wong, W.W., et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:7711). 15개의 양하전된 파지를 1.5x106재조합물에서 확인하고 이들중 13개는 독특한 클론을 나타내었다. 10개는 제한사상도로 하고 디데누클레오티드 사슬 말단 방법으로 전체나 부분적으로 배열순서화하였다. 이 cDNA 클론을 겹침 배열순서 동일성의 기준으로 정열시키고(제2도). 5.5kb를 건너는 것으로 발견되었다(제3도). 단일의 길다란 개방판독 프레임이 cDNA 클론의 5' 단부에서 시작하여 정지코돈까지 4.7kb 하류로 연장하는 것으로 확인되었다. 이 라이브라리에서 CR1에 대한 코딩 배열순서는 비글리코실화한 수용체에 대해서 220,000 달톤의 측정분자량을 기준하여 6kb가 되는 것으로 기대되었다(Wong, W.W., et al., 1983, J. Clin. Invest. 72:685). 이와 같이 이러한 클론은 추정된 코딩배열순서의 ∼80%를 건넜다.
클론 T49.1 과 T55.1은 이들의 5' 단부에 코딩 배열순서를 포함하여서 추가의 5' 코딩 및 비코딩 배열순서를 확인해야 한다는 것을 나타낸다. 3' 영역에서 겹치는 클론 T8.2 와 T43.1 및 T87.1은 각 클론에서 같은 배열순서에 의해서 인코드된 투과막과 세포형질 영역을 포함한다. 클론연장하는 대부분의 3', T8.2 는 폴리(A) 배열순서 없이 807bp의 비번역 배열순서를 포함한다. 클론 T8.3은 누클레오티드 1,406-1,497의 91-bp 삭제를 포함하고 클론 T40.1은 클론 T6.1과 T55.1에서 발견된 배열순서에 대해서 누클레오티드 1,498-1,507의 9-bp를 포함한다. 이러한 삭제는 5' 접합위치에 일치하는 배열순서를 가지는 영역에서 발생하고 mRNA에서 접합 오차를 나타낼 수도 있다. 클론 T49.1과 T55.1는 개방판독프레임(제3도)의 누클레오티드 147 과 148의 사이에서 110bp 삽입물을 포함한다. 이러한 배열순서는 인트론(intron)의 일부분이 것으로 판단되는데 그이유는 이것이 편도선 폴리(A) +RNA의 블롯에 대해서 하이브리드화 하지 않고 이것이 5' 접합위치를 포함하고(Breathnach, R., et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:4853)(제3도), 이것이 CR1 게놈의 클론에서 cDNA 배열순서에 접해있고 그리고 이것이 판독프레임을 변화시키기 때문이다. 클론 T9.4는 편도선 폴리(A)+RNA의 블롯에 하이브리드화 하지 않는 3' 단부에서 0.88kb의 간섭 배열순서를 포함한다.
6.2.2. CR1의 누클레오티드와 아미노산 배열순서의 분석
CR1(제3도)의 누클레오티드 배열순서의 도트 기질분석은 두가지 형태의 내부동족체를 나타낸다(제4도). 내부동족체의 제1형태는 굵고, 단절되지 않는 선으로 나타내는데, 이것은 세개의 직렬의, 직접 적인 고도로 일치되는 1.35kb의 반복이 있음을 나타낸다. 이러한 누클레오티드 배열순서는 CR1의 길다란 동족체 반복물(LHRs)를 인코드한다. 제2형태의 반복물은 점선의 수평선을 나타내는데 이는 일치성이 더 적은 영역을 나타낸다. 이러한 배열순서는 매 190-210 누클레오티드에서 발생되고 CR1의 짧은 일치반복물(SCRs)를 인코드 한다.
cDNA 배열순서에서 유도된 아미노산 배열순서는 제5도에서 나타내고 LHR-B, LHR-C 및 LHR-D를 지칭하는 세개의 LHRs는 일렬로 어서 이들의 동족성을 나타낸다. LHR-B는 잔기1로부터 연장하여 잔기 438를 통하고, LHR-C는 잔기 439-891에 상응하고, 그리고 LHR-D는 잔기 892로부터 연장하여 1,341을 통한다. LRH-C의 잔기 451-694는 LRH-B의 잔기 1-244에 99% 동일하지만 LHR-D의 상응하는 잔기에는 61% 만이 일치한다. 반대로 LRH-C의 잔기 695-891 는 LHR-D의 잔기 1,148-1,341에 91%가 동일하지만 LHR-B의 상응하는 영역에 대해서는 76 만이 동일하다. 이와 같이 LHR-C는 LHR-B의 첫째의 반과 LHR-D의 두번째반에 대부분 일치하는 배열순서를 포함하는 하이브리드인 것으로 보인다. 이 LHRs는 반복되지 않는 두개의 SCRs, 25 잔기 소수성 단편 및 SCRs에 대해서 배열순서 동족체를 가지지 않는 43 아미노산 COOH-말단영역이 뒤따른다(제5도).
CR1 코딩배열순서의 5' 1.3kb는 네번째의 LHR, LHR-A를 나타낸다(위의 제1도와 다음의 7항 참조). 이러한 결론은 적혈구 CR1의 트립틱 펩티드의 분석으로 뒷받침된다. 10개의 트립틱 펩티드는 cDNA 클론에서 유도된 아미노산 배열순서에 일치한다.
*유도된 아미노산 배열순서에서 발견된 사람 적혈구 CR1로 부터의 트립틱 펩티드. 우측의 칼럼의 범위의 숫자는 유도된 아미노산 배열순서속에서의 펩티드 위치를 가르킨다. 펩티드 66,28 및 49의 각 점선은 이 싸이클에서 확인된 다중잔기를 나타낸다. 펩티드 34b 속의 점선은 잔기가 이 싸이클에서 확인되지 않았음을 나타낸다.
각 LHR는 C3 및 C4 결합 단백질(C4bp)(제6A도)의 족을 특징짓는 일곱개의 60-70 아미노산 SCRs를 포함한다. CR1의 23SCRsrks의 최대의 상동은 배열순서(제6A도)의 일렬에서 삽입되는 공간으로 관찰되었다. 또한 각 반복물에서 평균 65잔기중 29가 보존된다. 모든 SCRs에 존재하는 여섯개의 잔기가 있다: 유사한 상대적 위치에 있는 여섯개의 반-시스틴은 각각이 궁극적 이황화물 결합에 포함될 수도 있음을 제시하고 트립토판과 제2글리신은 제2의 반-시스틴(제6A도)의 뒤에 포함될 수 있음을 제시한다. Chou와 Fasman의 아라비아 기수법(Chou, P.Y. and Fasman, G.D., 1974, Biochemistry 13:222)을 사용하는 불변성 반-시스틴 사이의 배열순서의 제2구조분석으로 높은 확률의 β-회전 형성과 낮은 확률의 α-나선형성을 제시하였다. 두개의 CR1 게놈의 클론, 2.38(제6B도)와 2.46의 배열순서 분석은 SCR-14(제6A도)가 단일 엑손으로 인코드되고 SCR-23의 COOH-말단이 엑손의 단부에 상응한다는 것을 가르킨다. 이와 같이 CR1의 SCRs는 인자B(Campbell, R.D. and Bentley, D.R., 1985, Immunol. Rev. 87:19)와 IL-2-R(Leonard, W.J., et al., 1985, Science 230:633)의 SCRs에 대해서 나타낸것 같이 별개의 엑손에 의해서 인코드될 수 있다.
CR1 SCRs의 일치 배열순서를 이러한 특징적 구조(제7도)를 가지는 상과(superfamily)의 다른부분의 SCRs와 비교한다. 이러한 부분은 C3/C4 결합기능을 가지는 단백질 CR2(Weis, J.J., et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:5639), C4bp(Chung, L.P., et al., 1985, Biochem. J. 230:133), 인자 H(Kristensen, T., et al., 1986, J. Immunol. 136:3407), 인자 B(Morley, B.J. and Campbell, R.D., 1984, Embo J. 3:153; Mole, J.E., et al., 1984, J. Biol. Chem. 259:3407), 및 C2(Bentley, D.R. and Porter, R.R., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:1212; Gagnon, J., 1984, Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 306:301)뿐만 아니라 인터로이킨-2-수용체(Leonard, W.J., et al., 1985, Science 230:633), β2-당단백질I(Lozier, J., et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:3640), Clr(Leytus, S.P., et al., 1986, Biochemistry 25:4855), 합토글로빈 α사슬(Kurosky, A., et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77:3388) 및 인자 XIIIb(Ichinose, A., et al., 1986, Biochemistry 26:4633)과 같은 기능을 가지는 것으로 알려지지 않는 단백질도 포함한다. 반-시스틴 잔기는 제3반-시스틴이 결핍된 합토글로빈을 제외한고는 모든 단백질의 SCRs에서 불변계가 된다. 이 트립토판은 또한 β2-당단백질 I에서의 다섯번째의 SCR와 인자 XIIIb 에서 반복물의 두가지를 제외하고는 또한 불변계가된다. 인자 B와 C2(Christie, D.L. and Gagnon, J., 1982, Biochem, J. 201:555; Parkes, C., et al., 1983, Biochem. J. 213:201에는 하나의 유리된 티올그룹이 있고 β2-당단백질I의 SCRs에는 첫번째 반-시스틴이 세번째에 결합된-이황화물이고 네번째에 결합된 두번째가 있다(Lozier, J., et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:3640).
CR1의 유도된 아미노산 배열순서에는 N-결합된 올리고 사카리드에 대한 17 잠재력 위치가 있고 이들 모두가 외세포 영역(제6A도)에 존재한다. 투니카마이신이 있거나 없는 상태에서 합성된 CR1간의 분자량 차이와(Lublin, D.M., et al., 1986, J. Biol. Chem. 261:5736)와 글루코사민 함량의 분석으로 6-8 N-결합된 복합체 올리고사카리드만이 존재하는 것을 제시하여 모든 잠재력 위치를 사용치 않음을 나타낸다. 예를 들면 유도된 아미노산 배열순서(제5도)의 잔기 263에 있는 아스파라긴은 펩티드 41c(표1)에서 확인되어서 이 위치에 글리코실화가 없음을 나타낸다. 반대로 펩ㅌ니드 34b에 있는 미확인 아미노산은 잔기 395에서의 글리코실화한 아스파라긴에 상응하는것 같다.
5.5kb의 cDNA 에서 확인된 비반복성 CR1 배열순서만이 COOH-말단의 영역에 위치한다. 이 영역의 제2구조분석으로 강한 소수성 특성과 α-나선 형성에 대한 높은 잠재력(제5도)를 가지는 단일의 25-잔기 추론성 막-회전 단편을 확인한다. 이 배열순서는 바로 다음에 네개의 양하전된 잔기가 따르고 이는 많은 막단백질의 특성을 가진다. 추론된 CR1의 세포형질 영역은 43잔기를 포함하고 여섯개의 아미노산 배열순서인 VHPRTL로 포함하는데 이것은 상피생장인자(EGF) 수용체와 erbB 온코겐(oncogene) 생성물에서의 단백질 키나제 C 포스포릴화의 위치인 배열순서 VRKRTL에 상동한다(Hunter, T., et al., 1984, Nature 311:480; Davis, R.J. and Czech, M.P., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:1974). 팬도선 CR1의 세포형질 영역에는 티로신 잔기는 없다.
6.3. 토의
CR1의 F이인자형의 1차구조의 대략 80%를 겹침 cDNA 클론을 배열순서하여 수득하였다. 이 분석에서 관찰된 CR1의 대부분의 비정상적 구조특징은 450 아미노산의 직렬의 직접적 LHRs가 존재하는 것이고, 이중 네개는 2,000 잔기의 추정 폴리펩티드 사슬길이를 가지는 CR1 의 F이인자형에서 발생하는 것으로 나타냈다(Wong, W.W., et al., 1983, J. Clin. Invest. 72:685; Sim, R.B., 1985, Biochem. J. 232:883). LHRs 클론하고 배열순서를 만들었으며 한편으로 네번째의 존재의 입증을 트립틱 펩티드의 분석으로 제공하였다. 각 LHR는 일곱개의 SCRs로 구성되었으며 이들은 다른 C3/C4 결합단백질의 기본적 구성요소가 되었다. SCR당 네개의 반-시스틴의 보존, 이황화물 결합에의 제1과 제3 그리고 제2와 제4의 가능한 관여(Lozier, J., et al., 1984 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:3640) 그리고 β-회전에서 자주 발견되는 프롤린, 글리신 및 아스파라긴(Rose, G.D., et al., 1985, Adv. Protein Chem. 37:1)과 같은 보존된 아미노산의 존재로서 SCR가 이황화물 결합에 의하여(제8도). 유지된 3중 루프구조를 형성한다는 제안에 이르게 된다. 반-시스틴에 대한 이러한 역활은 가볍게 트립신-처리한 CR1(Sim, R.B., 1985, Biochem. J. 232:883)과 인자 H(Sim, R.B. and DiScipio, R.G., 1982, Biochem. J. 205:285)가 비-환원조건에서 SDS-폴리아크릴아키드 겔 전기영동(PAGE)으로 분석했을 때 무자의 분자로서 그리고 환원 후에 다중의 트립틱 단편으로서 이동한다는 것을 발견하여 뒷받침 되었다.
직렬로 반복된 SCRs의 이 계열은 인자H에 대해서 그리고 사람 C4bp의 각각의 서브유닛에 대해서 제시된것 같은 연장된 구조(제8도)를 형성하는 것으로 나타내었다(Sim, R.B. and DiScipio, R.G., 1982, Biochem. J. 205:285; Whaley, K. and Ruddy, S., 1976, J. Exp. Med. 144:1147; Dahlback, B., et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:3461). C4bp의 서브유닛의 전자 현미경 연구로 300x30Å 만큼 연장할 수 있다. CR1 구조의 이러한 추정에 대한 일치성은 중성호성에서 CR1에 결합된 페리틴-라벨이된 항체가 종종 원형질막의 외측앞으로부터 500옹스트롱이었다는 조기발견이 된다(Abrahamson, D.R. and Fearon, D.T., 1983, Lab. Invest. 48:162). CR1의 이러한 연장된 구조는 면역복합체와 미생물 세포막 속에서 비교적 접근이 어려운 위치에 공유로 결합된 C3b와 수용체-보유 세포와의 상호작용을 용이케 한다.
SCR가 SC1의 주요하고 그리고 어쩌면 유일한 외세포형질 요소이라는 발견으로 SCRs로 배타적으로 극도적으로 구성된 두가지 원형질 단백질인 C4bp와 수용체와 인자H간에 밀접한 관계가 있다는 구조적 증명을 제시한다(Chung, L.P., et al., 1985, Biochem. J. 230:133; Kristensen, T., et al., 1986, J. Immunol. 136:3407). CR1은 초기에는 세제용해 후에 인자 H-같은 활성도를 가지는 적혈구막 단백질로서 단리되고(Fearon, D.T., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76:5867) 그리고 플라스마 막에 있을 때 인자H와 C4bp의 조절기능을 가지는 것으로 연속적으로 발견되었다(Iida, K. and Nussenzweig, V., 1981, J. Exp. Med. 153:1138). CR1, 인자H 및 C4bp의 구조적 다중형태(polymorphisms)의 유전성을 분석하여 이러한 세가지 단백질을 인코딩하는 유전자가 결합되는 것으로 나타났으며(deCordoba, R., et al., 1985, J. Exp. Med. 161:1189), 이러한 결합그룹에 대한 그리고 구조적으로 관련된 수용체 CR2에 대한 위치가 최근에 원위치의 하이브리드화에 의해서 그리고 몸세포 하이브리드의 분석에 의해서 염색체1, 밴드 q32의 길다란 아암에 있는 것으로 발견되었다(Weis, J.H., et al., 1987, J. Immunol. 138:312). 본 연구의 이전에는 이러한 단백질간의 구조적 관련성에 대한 유일한 증거는 이들의 아미노산 조성에서의 중요한 유사성이었다(Wong, W.W., et al., 1985, J. Immunol. Methods 82:303). 그러므로 CR1에서 최소한 23의 SCRs의 본 발견이 인자 H와 C4bp(Chung, L.P., et al., 1985, Biochem. J. 230:133; Kristensen, T., et al., 1986, J. Immunol. 136:3407)를 가진 수용체, 유사한 기능을 가지고 인자 B와 C2의 Ba와 C2b 단편을 가진 단백질(Morley, B.J. and Campbell, R.D., 1984, EMBO J. 3:153; Mole, J.E., et al., 1984, J. Biol. Chem. 259:3407;Bentley, D.R. and Porter, R.R., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:1212; Gagnon, J., 1984, Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 306:301), C3b와 C4b를 가진 효소 복합체를 형성하는 성분의 구조적 관련성의 직접적이고 형식적인 전서를 각각 구성한다. 그러나 이 SCR는 또한 여러가지 비보체 단백질에서 발견되어서(Campbell, R.D., and Bentley, D.R., 1985, Immunol. Rev. 87:19; Lozier, J., et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:3640; Leytus, S.P., et al., 1986, Biochemistry 25:4855; kurosky, A., et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77:3388; Ichinose, A., et al., 1986, Biochemistry 25:4633)(제7도), 이것이 필수적으로 C3/C4 결합구조를 나타내지 않음을 나타낸다.
SCRs를 가지는 단백질중에서 CR1이 LHR의 고도의 질서로된 구조단위가 되도록 조직된 이러한 기본구조와 유전자 단위를 가지는 점에서 독특하다. F이인자형의 발현과 관련된 게놈의 DNA의 14.5kb BamHI 단편의 분석으로 CR1 최소한 하나의 반복게놈의 단위가 최소한 다섯개의 SCRs와 이들의 접하는 인트론을 인코딩하는 엑손을 포함하는 DNA의 연장된 단편임을 제시한다(Wong, W.W., et al., 1986, J. Exp. Med. 164:1531). 이러한 연구로 또한 S이인자형이 F이인자형에 존재하는 수와 비교하여 이러한 게놈단위의 추가의 사본을 포함하는 것을 제시하였다. 이러한 관찰은 트립틱 펩티드 사상도 연구(Nickells, M.W., et al., 1986, Mol. Immunol. 23:661) LHR과 ∼40-50KD의 펩티드를 나타낸다는 본 발명과의 결합으로 본인들이 F이인자형(250,000 달톤의 분자량)에서 추정되는 네개의 LHRs에 대해서 추가의 LHR의 S이인자형(290KD)에 존재함을 나타내게 한다.
복제사건에 대한 증거제시 이외에도 LHR의 배열순서가 CR1 유전자속에서 전환사건이 발생했음도 또한 제시한다. LHR-B와 -D는 이들의 길이에 걸쳐서 각각 서로 67%가 동일하고 반면에 LHR-C는 NH2-말단의 네개의 SCRs에서 LHR-B에 99%가 동일하고 COOH-말단의 세개의 SCRs에서 LHR-D에는 91%가 동일하다. 이러한 조직은 이러한 하이브리드 LHR의 공급원에서 같은 모체 이인자형 사이에서 단일의 재조합 사건으로 발생치 않았다. 오히려 하이브리드 LHR는 유전자 전환으로 발생될 수도 있으며(Atchison, M. and Adesnik, M., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:2300) LHR-C 선구물질에서 배열순서는 LHR-B 또는 LHR-D에 존재하는 배열순서에 의해서 대체되었다. 이러한 LHRs(제5도)에서의 상동 배열순서의 가까운 완전한 동일성과 정밀한 일치성도 또한 유전자 전화을 포함하는 메카니즘에 의해서 유지되었다. LHRs 를 인코딩하는 cR1 유전자의 이러한 단편의 간섭 배열순서간의 상동성의 정도의 분석은 기능적 억제를 기준으로한 유전자 전환이나 선택이 배열순서 분기를 엄격히 제한하였느냐를 측정해야 한다.
비록 상기한 역구가 CR1가 일가임을 제시하긴 하였지만(Wilson, J.G., et al., 1982, N. 뚜히. J. Med. 307:981), 각각의 LHR가 단일의 C3b/C4b 결합영역을 나타낼 수 있고 이것은 수용체 다가를 만들고 C3b/C4b의 다중분자를 보유하는 복합체의 결합에 적용 되었다. 또한 분명한 LHRs는 각각 C3b와 C4b를 결합시킬수도 있어서(다음의 9항 참조), CR1에서 인자H와 C4bp 활성도의 결합에 대한 구조적 기준을 제시한다. 끝으로 CR1의 LHRs는 제시된 구조적 모형(제8도)으로 제시된것 같이 플라스마막으로부터 CR1을 연장하는 기여하는 구조적 영역을 나타내고 인자H에 대해서 발견된것 같은(Sim, R.B. and DiScipio. R.G., 1982, Biochem. J. 205:285; Alsenz, J., et al., 1984, Biochem. J. 224:389). NH2-말단의 영역 결합 C3b 및 C4b에서의 SCRs를 나타낸다.
포르볼 에스테르에 의한 단백질 키나제C의 활성화는 중성호성, 단세포 및 호산구증다증(Changelian, P.S. and Fearon, D.T., 1986, J. Exp. Med. 163:101)에서 CR1의 포스포릴화를 유발하는 그리고 43아미노산의 CR1 세포형질 영역은 상피생장 인자 수용체에서 단백질 키나제C에 의해 포스포릴화한 위치에 상동인 배열순서를 가진다(Hunger, T., et al., 1984, Nature 311:480; Davis, R.J. and Czech, M.P., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:1974). 그러나 편도선 라이브라리의 세개의 독립적 클론에서 발견된 이러한 세포형질 배열순서는 B세포 CR1의 그것에 가장 비슷하고 이것은 단백질 키나제C의 활성한 후 포스포릴화되지 않는다(Changelian, P.S. and Fearon, D.T., 1986, J. Exp. Med. 163:101).
7. 실시예: CR1 5'cDNA 배열순서는 네번째의 길다란 상동성 반복물을 포함한다.
CR1의 부분적 cDNA 배열순서를 분석하면 450 아미노산의 세개의 LHRs, LHR-B, LHR-C, LHR-D가 각각 C3/C4 결합단백질의 65 아미노산 특징이 있는 일곱개의 짧은 일치성 반복물(SCR)로 구성되어 있는 구조를 나타내었다.(위의 6항 참조). 여기서 기술하는 실시예에서는 본인들은 5' cDNA 클론을 배열순서화 하여 네개의 아미노-말단 LHR, LHR-A(Klickstein, L.B., et al., 1987, Complement 4:180)의 클로닝과 누클레오티드 배열순서를 기술한다. LHR-A의 분석으로 이것이 다섯개의 3' SCRs 에서 LHR-B에 99% 상동하지만 두개의 5' SCRs에서는 61% 만이 상동하다는 것을 나타낸다.
7.1. 물질과 방법
7.1.1. cDNA 라이브라리의 구성
선택적으로 프라임된 cDNA 라이브라리, λHH를 기술한것 같이 DMSO-유발된 세로포부터(Chirgwin, J.M. et al., 1979, Biochemistry 18:5290; Aviv, H. and Leder, P., 1972, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69:1408; Ausubel, F.M., et al., 1987, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley Sons, New York) 다음을 수식하여 정제된 μg의 폴리(A)+RNA로서 구성하였다. 하나의 35-메르올리고누클레오티드인, LK35.1, 5'-TGAAGTCATC ACAGGATTTC ACTTCACATG TGGGG-3'를 올리고(dT) 12-18 의 자리에 사용하고 α32P-dCTP 의 40μCi를 제2사상체 합성중에 첨가하였다. cDNA의 3분의 1을 λgtll에서 클론하고 cDNA 라이브라리를 위의 6.1.2항에서 기술한것 같이 사람 편도선 폴리(A)+RNA로서 구성하였다. 750,000 독립성 재조합물을 수득하였다.
7.1.2. 클론, 탐침 및 배열순서분석의 단리
cDNA 라이브라리의 선별에 사용한 탐침은 CR1-1 (Wong, W.W., et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:7711) (ATCC accession no. 57331), CR-2 (Wong, W.W., et al., supra), CR1-4 (Wong, W.W. et al., 1986. J. Exp. Med. 164:1531) 및 cDNA 클론 λH3.1의 0.5kb EcoRI 단편으로부터의 252bp Sau3AI 단편인, CR1-18 이었다. 고도로 엄격한 조건하에서 CR1-18은 LHR-A의 NH2-말단 SCR 또는 신호 펩티드의 어느것을 인코딩하여 cDNA에만 하이브리드화 한다. cDNA 클론의 삽입물을 M13mp18과 M13mp19(Yanisch-Perron, C. et al., 1985, Gene 28:351)속으로 단편을 서브클로닝한 후에 디데옥시누클레오티드 기술(Sanger, F., et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74:5463)에 의해서 배열순서화 하였다.
7.2. 결과
7.5x105재조합물을 포함한, λHH인 특이하게 프라임된 λgtll cDNA 라이브라리는 DMSO 유도된 HL-60 세포로부터의 폴리(A)+RNA로서 합성한 cDNA로서 제조하였다. 이러한 세포는 CR1의 F 이인자형만을 발현하며(Lublin, D.M., et al., 1986, J. Biol. Chem. 261:5736) 이것은 네개의 LHRs를 가지는 것으로 나타낸다(Lapata, M.A., et al., 1984, Nucl. Acids Res. 12:5707). 프라이머, LK35.1은 제3도에서 제시한 CR1의 부분적 cDNA 배열순서의 누클레오티드 896-930에 상응하는 항-민감 35-메르(35-mer)이었다. 이 올리고누클레오티드는 역전사 조건에서 LHR-B, LHR-C 및 LHR-D에 하이브리드화 하는 것을 나타내었다. 250의 양성클론을 CR1 cDNA 탐침, CR1-1과 CR1-4 의 혼합물로서 선별한 3.8x105비증폭된 재조합 파지의 판에서 확인하였다. 38의 양성클론을 뽑아서 형판 정제하였다. 이러한 클론으로부터의 EcoRI-소화된 DNA의 써선블롯을 제3도의 부분적 CR1 cDNA 배열순서의 누클레오티드 763-785에 상응하는 23-메르올리고누클레오티드, KS23.1, 5'-CTGAGCGTAC CCAAAGGGACAAG-3'로서 선별하였다. 이 탐침은 LHR-B를 인코딩하는 배열순서의 단일위치에서 고도의 엄격성의 조건에서 하이브리드 하지만 LHR-C나 LHR-D를 인코딩하는 배열순서에는 하이브리드화하지 않는다. 클론 λH7.1의 삽입물(제9도)은 1.0kb, 0.9kb 및 0.4kb 및 0.4kb의 세개의 EcoRI 단편과 KS23.1에 하이브리드화한 두개의 더큰 단편을 포함하여 이 클론이 LHR-A의 3' 5/7과 LHR-B의 모두에 대해서 코딩하는 배열순서를 포함한 것을 나타낸다. 이 발견으로 LHR-A가 LHR-B에 고도로 상동함을 확인하였다. 클론 H3.1(제9도)는 고도의 엄격성으로서 주간으로 하이브리드화한 1.0kb, 5', 0.5kb 단편의 단일의 KS23.1-양성 EcoRI 단편을 포함하였다. 이 클론은 SCR-1과 -2 그리고 상류 배열순서를 비롯하는 LHR-A를 완성시키는 추가의 5' 배열순서를 포함하는 것으로 간주되었다. 모두를 CR1-1으로 하이브르화한, 나머지 36클론은 LHR-B, -C 또는 _D를 인코딩하는 배열순서에 하이브리드화하지 않는 클론 λH3.1의 0.5kb EcoRI 단편으로부터의 252bp Sau3AI단편이 CR1-18 탐침으로 검출되지 않았다.
λH3.1의 DNA 배열순서 분석으로 개방판독프레임이 cDNA의 5' 단부에 계속된 것을 나타내어서 클론이 번역 개시 위치까지 연장하지 않음을 나타낸다. 그러므로 cDNA 라이브라리, λHH와 λS2T를 탐침 CR1-18로서 재선별하여 각각 λH10.3과 λT109.1로부터 하나의 클론을 확인하였다. CR1-18로 하이브리드화한 이러한 클론의 EcoRI 단편을 클론 λH3.1과 λH7.1으로부터의 삽입물을 행한것 같이 배열순서화 하였다. 복합배열순서를 제1도에 제시하여 제1도의 번호 1531를 따르는 누클레오티드가 제3도의 누클레오티드 #1이 되게 하였다. HL-60과 편도선 파이브라리로부터의 cDNA 클론의 겹침 배열순서를 확인하였다.
LHR-A의 바로 상류에 있는 클론 λH10.3과 λT109.1은 진핵세포 번역개시위치(제10도)(Kozak, M., 1986, Cell 44:283)에 대해서 제안된 일치성 NNA/GNNATGG를 일치시키는 ATG를 포함하는 41 아미노산을 인코딩하는 같은 초론적 소수성 선두 배열순서(Von Heijne, G., 1986, Nucl. Acids Res. 14:4683)을 포함한다. 선택된 ATG의 여섯 코돈 상류와 프레임안의 정지코돈의 바로 하류에 위치한 제2의 ATG는 이러한 일치 배열순서에 대해서 불량한 일치가 된다. CR1, MGA 에 대한 이러한 선행 배열순서의 첫번째의 세계의 아미노산은 CR2에 대해서 보고한 것들과 같다. 이러한 두가지 클론으로부터의 배열순서는 ATG의 상류를 분기하고 클론 λ10.3으로부터의 배열순서는 위의 6항에서 다른 CR1 cDNA 클론에 대해서 기술한것 같이 간섭하는 배열순서의 일부를 나타내는 것으로 믿어진다.
신호 펩티다제 분할은 글리신-46과 글루타민-47 사이에서 발생하는 것으로 나타나서(Von Heijne, G., 1986, Nucl. Acids Res. 14:4683) CR1의 차단된 NH2-말단(Wong., W.W., et al., 1985, J. Immunol. Methods 82:303; Holeis, V.M., et al., 1986, Complement 3:63)이 피롤리돈 아미드의 존재에 기인되는 것을 제안한다: 이러한 클론에 포함된 N-말단의 LHR-A의 첫번째의 두개의 SCRs 는 LHR-B에 상응하는 영역에 대해서 61% 만이 같고, 반면에 LHR-A의 SCRs는 LHR-B(제10도)의 상응하는 SCRs에는 99%가 같다. LHR-C와 LHR-A와의 비료로서 각각의 세번째와 네번째 SCRs가 고도로 상동 (9% 동일)임을 나타낸다. LHR-A와 -D는 68%만의 총괄 동일성을 가지며, 각 LHR의 여섯번째 SCRs 사이에는 최고 81%의 동일성을 가진다. 이와 같이 CR1의 5' cDNA의 완성으로 F 이인자형이 4' 아미노산 신호펩티드 각 일곱 SCRs의 네개의 LHRs, 두개의 추가된 COOH-말단 SCRs, 25 잔기의 투과막 영역 및 43 아미노산 세포형질 영역으로 구성된 것을 나타낸다. 25의 잠재적 N-결합된 글리코실화 위치가 있다.
7.3. 토의
CR1의 F이인자형의 NH2-말단과 신호펩티드의 1차구조는 5' cDNA 클론의 단리와 배열순서화로 추리된다. CR1 배열순서의 고도의 반복성 성질은 이 수용체의 이 영역을 인코딩하는 cDNA 클론의 제조와 확인을 위한 적절한 전략의 개발을 중요시한다. cDNA 라이브라리는 LHR-B, -C 및 -D에 대한 역전사 조건에서 하이브리드 하는 것으로 알려진 35-메로 올리고누클레오티드를 프라이머로서 사용하여 제조하고; 이 가능성은 이 프라이머가 LHR-B에 대해서 고도로 상동인 것으로 예측된(위의 6항 참조). LHR-A에 대해서 또한 하이브리드화 하는 것으로 간주되었다. 적절한 cDNA 클론은 엄격한 조건에서 LHR-B에만 하이브리드하여 5' cDNA 클론을 발견하는 확률을 증가시키는 또다른 올리고누클레오티드 KS23.1을 사용하여 확인하였다. 두개의 클론이 CR1의 잔기 배열순서의 거의 모두를 포획하고 이들 CR1의 하나의 Sau3AI 단편이 나머지 5' 클론(제9도, 10도)의 확인에서 그 용도가 허용되는 충분히 독특한 배열순서를 가졌다는 것이 발견되었다.
LHR-A, CR1-18의 5' 영역으로부터의 250bp 탐침은 7.9와 9.2kb의 CR1 전자뿐만 아니라 엄격한 조건에서 사람 편도선 RNA 에서 2kb 전사에도 하이브리드 하였다. 이러한 가교-하이브리드화 mRNA는 다른 LHRs로부터의 CR1 cDNA 탐침으로 그리고 디메틸술폭시드-유도된 HL-60세포와 HSB-2 T 임파아구세포로부터의 RNA의 노썬블롯에서 관찰되지 않았다. 이와 같이 CR1은 이러한 새롭게 인식된 mRNAdp 의해서 인코드된 것인 두개의 추가의 B세포 단백질 그리고 CR2에 상동하는 배열순서를 포함한다.
8. 실시예:재조합 사람 CR1의 발현
위에서 기술한것 같이 사람 CR1 cDNA 클론은 7.0kb를 건너는 것을 단리하고 2039 아미노산(제1도)를 인코딩하는 개방판독프레임을 포함한다. 수용체의 제시된 선구물질 형태는 41 아미노산 신호펩티드, 7의 짧은 일치 반복물(SCRs)로 구성된 각 LHR를 가지는 450 아미노산의 네개의 길다란 상동성 반복물(LHRs), 65아미노산의 두개의 COOH-말단의 SCR, 25 아미노산 투과막 영역, 그리고 43 아미노산 세포형질영역을 포함한다. 이와 같이 CR1 F 이인자형은 30SCRs를 포함한다. NH2-말단 LHR, LHR-A(위의 7항 참조)는 첫번째 2개의 SCRs에서 LHR-B의 상응하는 영역에 61% 동일하고 COOH-말단의 다섯개의 SCRs에서 99%가 동일하다. 여덟개의 CR1 cDNA 클론의 제한단편은 6.9kb의 전체길이로된 구성을 형성하도록 맞추어지고 쥐의 금속티오나인 촉진부위나 거대세포비루스(cytomegaiovirus) 촉진부위의 하류에 넣고, L(쥐의)세포나 COS(원숭이)세포로 트란스펙트 하였다. 재조합 세포표면 CR1를 간접 방사선 qausdurrja사법과 면역형광으로 검출하였다. 모체의 전달매개체(CR1-)만으로 트란스펙트한 세포에서는 항원은 검출되지 않았다. 항-CR1 단일클론의 항체로서 트란스펙트되고 표면125I-라벨이된 COS(원숭이) 세포의 면역침전과 비-환원성 도데실황나트륨(SDS) 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의한 분석으로 사람 적혈구로부터 F이인자형으로 동시-이동한 190,000 달톤 분자량의 밴드를 수득하였다. 정확한 분자량의 재조합 CR1 항원의 발현으로(Klickstein, LB., et al., 1988, FASEB J. 2:A1833) cDNA가 사람 CR1의 전체 코딩배열순서를 포함한다는 증거를 제시한다.
8.1. 전체 CR1 코딩배열순서를 포함하는 플라스미드 pBSABCD의 구성
본인들은 여기서 전체길이의(SCRs 1-30) CR1 단백질을 인코딩하는 전달매개체인 플라스미드 pBSABCD의 구성을 기술한다. cDNA 클론 λT8.2로부터의 2.3kb 삽입물(Klickstein, L.B., et al., 1987, J. Exp. Med. 165:1095); see Section 6, supra)을 EcoRI 단편으로서 pUC18 속으로 서브클론하여서 5' 단부가 플라스미드 다중결합체속의 HindIII 위치에 대해서 중심부가 되도록 하였다. 이 플라스미드를 p188.2라 칭한다. p188.2를 ApaI와 HindIII로서 절단하고 3' 비번역된 영역과 전달매개체 배열순서를 통한 SCR26으로부터의 CR1 배열순서를 포함하는 큰 4.7kb 단편을 겔-정제하였다.
cDNA 클론 λT50.1으로부터의 삽입물(Klickstein, L.B., et al., 1987, J. Exp. Med. 165:1095; see Section 6, supra)을 EcoRI 단편으로서 M13mp18속으로 서브클론하였다. 이 파지를 18R50.1 이라 칭하였다. 이러한 클론의 복제형태로부터의 DNA를 HindIII과 ApaI로서 절단하고 CR SCRs 18-25를 포함하는 1.45kb 단편을 단리하고 p188.2로부터의 4.7kb 단편에 결찰하고 그리고 이 결찰물을 대장균 DH5 α 속으로 형질전화 하였다. 이 플라스미드를 p8.250.1 이라 칭하였다.
cDNA 클론 λT8.3(Wong, W.W., et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 22:7711)으로부터의 0.75kb와 0.93kb 대장균 단편을 플라스미드 pBR327속으로 서브클론하였다. 이러한 서브클론을 각각 pCR1-1과 pCR1-2라 칭하고 각각 SCRs 11-14와 SCRs 17-21을 포함하였다. 대장균 삽입물을 각각에서 정제하였다. 0.75kb pCR1-1 단편을 SmaI로 소화시키고 소화물을 EcoRI과 SmaI로서 절단한 pUC18 DNA 에 결찰시켰다. SCRs 12-14에 상응하는 0.5kb 삽입물인 서브클론인 p181-1.1 을 단리하였다. pCR1-2의 0.93kb 단편을 HindIII로서 소화시키고, EcoRI와 HindIII로 절단한 pUC19에 결찰시키고 서브클론인 p191-2.1을 단리시켜 SCR17을 포함하는 0.27kb삽입물을 함유하였다.
cDNA 클론 λT6.1(See Section 6, Supra; Klickstein, L.B., et al., 1987, J. Exp. Med. 165:1095; Wong, W.W., et al., 1987, J. Exp. Med. 164:1531)를 EcoRI으로 소화시키고 CR1 SCRs 15 및 16에 상응하는 0.37kb 단편을 pBR322로 서브클론하였다. 이 클론을 pCR1-4이라 칭한다. 클론 p181-1.1를 EcoRI과 ScaI로서 절단하고 1.4kb 단편을 단리하엿다. 클론 p191-2.1(Klickstein, L.B., et al., 1987, J. Exp. Med. 165;1095; See Section 6, supra)을 EcoRI 과 ScaI으로 소화시키고 2.0kb 단편을 단리하고 p181-1.1 에서 얻은 1.4kb 단편에 결찰하고 이 혼합물을 대장균 DH5α으로 형질전환하였다. 플라스미드 p1-11-2를 EcoRI으로 소화시키고 pCR1-4로부터의 0.37kb 삽입물 단편을 결찰로서 삽입하였다. 수득되는 플라스미드는 대장균 DH5α 를 형질 전환하는데 사용하였다.
0.39kb BamHI-HindIII 단편을 포함하는 서브클론을 선택하였다. 이 플라스미드는 p142라 칭하고 CR1 SCRs 12-17를 포함하였다. pG8.250으로부터의 3.5kb EcoRI-HindIII 삽입물 단편을 pGEM3b로 이동시켰다. 이 플라스미드는 pG8.250.1에 결찰시키고 이를 HindIII로서 절단하였다. 2.4kb PstI-ApaI 삽입물을 포함하는 서브클론을 선택하여서 정확한 배위를 선택하였다. 이 플라스미드를 pCD라 칭하고 3' 단부를 통한 SCR 12 로부터의 CR1을 포함하였다.
cDNA 클론 λ5'7.1(Klickstein, L.B., et al., Sept. 1987, Complement 4:180; see Section 7, supra)를 PstI로 절단하고 SCRs 6-12에 상응하는 1.35kb 단편을 단리하고 PstI-절단 pCD 에 결찰 하였다. 이 혼합물을 형질전환시키고 1.35kb와 1.1kb HindIII 단편을 포함하는 서브클론을 선택하였다. 이 클론을 pBCD라 칭한다.
cDNA 클론 λ5,3.1(Klickstein, L.B., et al., 1987, Complement 4:180; see Section 7, supra)를 EcoRI으로 절단하고 소화물을 EcoRI-절단 pUC18에 결찰하였다. SCR 3-7에 상응하는 1.0kb 삽입물을 포함하는 서브클론 p3.11-1을 단리하고 이 삽입물을 겔-정제하였다. cDNA 클론 λ5'10.3(Klickstein, L.B., et al., 1987, Complement 4:180; see Section 7, supra)를 EcoRI로 절단하고 SCRs1과 2를 포함하는 0.63kb 삽입물을 pUC18로 서브클론하였다. 이 클론을 p10.3.5라 칭한다. 플라스미드 p10.3.5를 EcoRI로서 부분적으로 소화시키고 선형 플라스미드에 상응하는 3.4kb 단편을 단리하고 p3.11-1로부터의 1kb 단편으로 결찰시켰다. 1.3kb 단편을 포함하는 서브클론 pLA 를 삽입과 배열의 바른 위치에서 뽑았다.
cDNA 클론 λT109.4(Klickstein, L.B., et al., 1987, Complement 4:180; see Section 7, supra)를 EcoRI로서 소화시키고 pUC18로 서브클론 하였다. 선행 배열순서와 SCR 1 및 2를 통한 5' 비번역 영역에 상응하는 0.55kb EcoRI 단편을 포함하는 서브클론을 선택하였다. 플라스미드 p109.4를 PstI과 BspMII로서 절단하고 선행 배열순서인 전달매개체와 SCR1을 포함하는 3.0kb 단편을 단리하였다. 이 단편을 SCRs 2-5를 포함하는 pLA 로부터의 0.81kb PstI-BspMII 단편에 결찰하였다. 이러한 새로운 플라스미드를 pNLA 라 칭한다. 플라스미드 EcoRI로서 부분적으로 소화시키고 PstI로서 완전히 소화시키고 SCR 5를 통한 선행 배열순서로부터의 CR1 배열순서를 포함하는 1.1kb EcoRI-PstI 단편을 단리하고 p청색원본 KS+(Stratagene, SanDiego, CA)에 결찰하여 cDNA의 5' 측에서 XhoI 위치에 놓는다. 이 플라스미드를 pXLA라 칭한다.
플라스미드 pBCD 를 EcoRV로 전달하고 다음에 PstI 으로 부분적으로 소화시키고 3' 비번역된 영역을 통한 SCR6으로부터의 CR1 배열순서를 포함하는 6.0kb PstI-EcoRV 단편을 단리하고 PstI+SmaI-소화된 pXLA 에 결찰하였다. 수득되는 전체 CR1 cDNA 코딩 배열순서를 포함하는 박테리아 발현 플라스미드를 pBSABCD라 칭한다.
8.2. 전체 CR1 코딩 배열순서를 포함하는 포유동물 발현 전달매개체인 플라스미드 piABCD의 구성과 검사
pBSABCD 플라스미드를 XhoI 과 NotI 으로 소화시키고 삽입물을 발현 전달매개체 CDM8(Seed, B., 1987, Nature 329:840-842)의 4.4kb 단편속의 CMV 촉진부위로부터 하류에 걸찰하고 이것을 또한 이러한 제한 효소로서 절단하였다. 수득되는 구성물을 piABCD이라 칭한다(제11도). 또한 6.9kb XhoI-NotI 단편을 발현 전달매개체 pMT.neol 속에서 금속티오나인 촉진부위로부터의 하유에 결찰하고 이것을 또한 이러한 제한효소로서 절단하였다. tnemjr되는 구성은 pMTABCD라 칭한다(제11도).
양의 적혈구를 토끼의 항체(EA)와 제한된 양의 C4b[EAcC4b(lim)] 으로 감작시키고 세포 [EAcC4b(lim), 3b] 당 12,000cpm125I-C3b를 C1, C2 및125I-C3로서 EAC4b(lim)(Diamedix)를 후속적 처리를 하여 제조하고 40mM EDTA를 포함하는 겔라틴 베로날-완충된 식염수에서 37℃ 에서 60분간 배양하였다. 또한 메틸아민-처리된 C3 [C3(ma)]를 3-(2-피리딜디티오)프로피온산 N-히드록시숙신이미드 에스테르(시그마)로 처리한 양의 E(적혈구)에 공유결합을 시켰다(Lambris, J.D., et al., 1983, J. Immunol. Methods 65:277). EAC4b는 정제한 C4로 제조하였다(Hammer, C.H., et al., 1981, J. Biol. Chem. 256:3995).
piABCD와 pMTABCD 의 두가지 모두를 DEAE(디에틸아미노에틸)-덱스트란 방법으로 트란스펙트시켜 COS(원숭이) 세포로 만들었다. 재조합 CR1을 항-CR1 단일클론의 항체 YZ-1를 사용하는 면역형광에 의해서; 그리고125I-라벨이된 세포의 면역침전과 다음에 비-환원성 SDS-PAGE로서 이것은 F 이인자형에 대한 수여체 상동성의 사람 적혈구로부터의 CR1 면역침전된 것과 같은 가동성을 가지는 단백질을 나타내었으며(Wong, W.W., et al., 1983, J. Clin. Invest. 72:685); 그리고 C3b 로 피복된 양의 적혈구로 로제테를 형성시켜(Fearon, D.T., 1980, J. Exp. Med. 152:20) 트란스펙트된 세포의 표면에서 검출하였따. 천연과 재조합 CR1 단백질의 동일한 전기영동식 가동으로 CR1 F 이인자형이 SCRs 1-30을 포함함을 확인하였다.
또한 쥐의 L 세포를 0, 2 또는 4μg의 piABCD 또는 pMTABCD와 그리고 성장호르몬의 발현을 지시하는 보고체플라스미드(Selden, R.F., et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6:3173)인 pXGH5의 2μg로서 중복으로 DEAE-덱스트란 방법(Ausubel, F.M., et al., 1987, Current Protocols in Molecular Biology, Seidman, J.G. and Struhl, k., eds., John Wiley Sons, New York; Seed, B., 1987, Nature 329:840) 동시-트란스펙트 하였다. 이세포를 2일후에 수거하고 YZ1 단일클론의 항-CR1 항체의 결합으로 CR1의 발현에 대해 검사하였다. 재조합 플라스미드 DNA와 CR1 항원의 발현 사이에는 투여량 응답관계가 있었다(표II).
* 방사선면역검사법(RIA)를 위하여 1% 소의 혈청알부민과 0.02% 아지화 나트륨을 포함하는 0.1ml 인산염-완충된 식염수에서 3x105트란스텍트된 세포의 복제시료를 3μg/ml YZ-1 IgG1 항-CR1로서 0℃ 에서 6분간 배양시켰다(Changelian, P.S., et al., 1985, J. Immunol. 134:1851). 이 세포를 세척하고 1-2μCi/ml의125I-F(ab')2 염소-항-쥐 IgG 또는125I-단백질 A를 포함하는 완충액 0.1ml에서 재현탁시켰다. 0℃ 에서 1-2시간후에 이 세포를 세척하고125I에 대해서 검사하였다.
플라스미드 piABCD는 pMTABCD 가 행한것 보다 거의 3배이상의 CR! 항원의 발현을 지시하였다. 배양배지에서의 생장호르몬의 농도는 판 5를 제외하고는 2배이하로 변하였다. 추가의 실험에서 L세포에서 보다 COS 세포에서 3배이상의 CR1 하우언의 일시적 발현을 지시 했음을 나타낸다.
CR1 항원은 YZ1 항-CR1 mAB(제12도)로 착색시킨 세포의 간접 면역형광으로 검사했을 때 트란스텍트된 COS 세포의 표면에서 집락속에 존재한다. COS 세포에서의 재조합 CR1의 이러한 분포는 사람 임파구에서의 야생형태의 CR1에 닮았다(Fearon et al., 1981, J. Exp. Med. 153:1615).
재조합 CR1 의 분자량은 piABCD 로 트란스텍트된 COS 세포의 표면 요오드화 세파로스-YZ1, SDS-PAGE를 가진 세포분해질의 면역 침전 그리고 방사선 사진법으로 측정하였다. 재조합 CR1은 F 이인자형과는 같고 적혈구 CR1의 S 이인자형 보다는 적은 190,000 감소안된 분자량을 가졌다(제14도).
재조합 CR1 의 C3b-결합 및 C4b-결합 기능은 트란스펙트된 COS 세포와 EAC4b 또는 EAC4b(lim), 3b간의 로제테의 형성으로 검사하였다. 31의 벼리도의 트란스펙션에서 5%-50%의 COS 세포를 플라스미드, piABCD, 결합된 5 또는 2이상의 EAC4b 또는 EAC4b(lim), 3b로서 트란스펙션하였다(제13도). CR1을 발현하는 COS 세포는 비록 이 중간물질이 CR2를 발현하는 Raji B 임파아구 세포를 가진 로제트를 형성하였지만 EAC4b(lim), 3bi를 가진 로제트는 형성하지 않았다.
8.3. CR1 단편의 발현
CR1 코딩 배열순서(삭제 돌연변이체)의 부분을 코딩하는 발현 전달매개체는 다음에 기술한것 같이 구성하였고 COS 세포로 형질 전환했을 때 그들의 해당되는 CR1 삽입물을 발현하는 것으로 발견되었다. CR1 단편은 세포-표면 단백질로서 발현되었다.
8.3.1. 삭제돌연변이체, piBCD, piABD, piACD, piAD, piBD, piCD 및 piD의 구성
이러한 삭제 돌연변이체의 구성은 네개의 CR1 길다란 상동성 반복물(LHRs)의 각각의 아미노-말단에 가까운 상동성 위치에서 단일의 BsmI 위치의 존재와 다른곳의 CR1 cDNA와 청색원본 전달매개체(STratagene, San Diego, CA)에서의 BsmI 위치의 없음을 이용하여 실시하였다.
플라스미드 pBSABCD의 미생물을 제한효소 BsmI의 50단위로서 45분간 소화시키고 이 소화물을 한천 겔 전기영동으로 분별하였다. 하나, 둘 또는 세개의 LHRs를 각각 결핍하는 모체 플라스미드의 선형 단편에 상응하는 8.55kb, 7.20kb 및 5.86kb의 DNA 단편을 정제하였다. 세개의 단편의 각각을 그자체에 결찰하고 이 결찰물은 별도로 사용하여 성분 E. coli DH5α 를 암피실린 내성이 되도록 형질전환시켰다.
8.55kb 단편을 두개의 인접한 BsmI 위치에서 pBSABCD 의 분할의 결과로서 발생시키고 이렇게 하여 결찰후에 pBCD, pACD 또는 pABD의 세개의 가능한 생성물 플라스미드가 있게되고 이때 이들 문자는 플라스미드에 남아있는 LHRs를 나타낸다. 이것들은 SmaI로서 제한 사상도를 작성하여 분별이 가능케된다. DNA 는 12 집락으로 제조하고, SmaI로 소화시키고, 그리고 한철 겔 전기영동으로 분리하였다. 다섯개의 클론은 LHR-A의 코딩 배열순서의 삭제에 상응하는 2.5kb 와 6.1kb의 두개의 SmaI 단편을 가져서 pBCD를 나타낸다. 세개의 클론은 pACDdp 상응하는 8.5kb의 단일의 선형 단편을 가졌다. 네개의 클론은 1.2kb와 7.4kb의 두가지 SmaI단편을 가졌고, 이것은 LHR-C의 코딩 배열순서를 삭제시켜 pABD를 생성을 기대케 하였다. 이러한 세개의 구성물의 각각의 5.6kb의 삽입물을 XhoI와 NotI 으로 이중 소화시킨 후 겔 정제하고, 같은 제한 효소로 소화시킨 후에 겔-정제한 발현 전달매개체 CDM8 에 결찰하였다. 대장균 DK1/P3를 결찰혼합물로 형질전환시키고 DNA를 다섯집락의 각각으로 제조하였다. 발현 전달매개체에서의 삭제된 CR1 cDNA 삽입물의 존재가 각 경우에서 SacI 소화에 의해서 나타났으며 이것으로 4.20kb와 5.75kb의 기대된 두개의 단편을 나타내었다. 이러한 플라스미드는 piBCD, piACD, 및 piABD라 칭한다.
pBSABCD의 부분적 소화에서 얻은 7.20kb 단편은 세개의 인접한 위치에서의 또는 큰 단편에 대해서 균등하게 이들 사이에서 하나의 자르지 않은 위치를 가진 두 위치에서의 BsmI 소화의 결과이고, 이라하여 형질전환물, pAD 와 pCD 의 뒤에서 수득할 수 있는 두개의 가능한 생성물이 있다. 이들은 XhoI과 PstI 에 의한 이중 소화에 의해서 구분되었으며 이것은 pAD의 경우에는 1.0kb와 6.2kb의 두개의 단편을 얻고 pCD의 경우에는 7.2kb의 하나의 선형단편을 얻는다. 이러한 플라스미드 각각으로부터의 4.2kb 삽입물을 XhoI과 NotI로 이중 소화시킨 후에 겔-정제하고 위에서처럼 CDM8로 서브클론하였다. 발현 전달매개체속의 삭제된 CR1 cDNA의 존재로서 PstI과 BglII에 의한 이중소화를 나타낸다. 클론 piAD는 2.4kb와 6.2kb의 단편을 가졌고 한편으로 piCD는 8.6kb의 단일단편을 가졌다. pBSABCD 의 BsmI 소화에서 얻는 5.85kb 단편은 완전한 소화의 생성물을 나타내고 단일클론인 pD는 대장 DH5α의 형질전환 후에 수득하였다. 이것은 기대된 3.7kb와 2.2kb의 단편을 수득하는 HindIII 과 BglII에 의한 이중소화로서 확인하였다. 클론의 2.9kb 삽입물은 XhoI과 NotI에 의한 이중 소화후에 겔-정제하고 위에서처럼 발현 전달매개체에 결찰하였다. 수득되는 piD 클론의 HindIII 소화로서 기대된 7.3kb 단편을 수득하고 XhoI+BglII 이중 소화는 2.2kb와 5.1kb 단편을 제공하였고, 그리고 SacI 소화는 기대된 1.5kb와 5.8kb 단편을 제공하였다.
플라스미드 pBD는 pBCD의 BsmI 부분적 소화로 제조하였다. 두개의 인접하는 BsmI의 분할에 상응하는 선형 7.2kb 단편을 겔 정제하고, 위에서처럼 자체-결찰하고 그리고 대장균 DH5α는 암피실린 내성으로 형질전환 하였다. pBD는 SmaI 소화 후 1.2kb와 6.0kb 단편의 존재에 의해서 확인하였다. 4.2kb 삽입물은 XhoI와 NotIdp 의한 이준 소화후에 정제하고 위에서처럼 이동시켰다. 클론 piBD는 HindIII 소화후에 기대된 0.8kb와 7.8kb 단편을관찰하여 확인하였다.
piABCD, piBCD, piCD 및 piD를 각각 임시적으로 발현하는 COS 세포는125I로 표면-라벨을 하고 그리고 항-CR1 항체로 면역 침전시켰다. SDS-PAGE를 다르는 환원에서 piABCD 구성물의 생성물은 CR1의 F 이인자형과 동시이동하고, 한편으로 삭제 돌연변이체는 대략 45,000 달통의 단계적 감소를 나타내어서 각각 하나, 둘 또는 세개의 LHRs의 삭제를 나타내었다(제17도).
8.3.2. 삭제돌연변이체 piP1, piE1, piE2, piU1, piU-2 및 piA/D의 구성
플라스미드 piABCD를 BstEII로서 완전하게 소화시키고, 1.35kb(이중선)과 8.6kb 에서의 두개의 단편을 겔-정제하고, 혼합하고, 결찰하고, 그리고 대장균 DK1/P3 을 형질전환시켜 암피실린과 테트라시클린 내성이 있게 하였다. 집락을 CR1 cDNA 탐침 CR1-4(위의 8.1항 참조)으로 하이브리드화 하여 선별하고 강력한 잠재력이 있는 집락을 뽑아서 추가로 SmaI로 소화시켜 선별하였다. piE2는 단일의 10.0kb 선형 단편으로 확인하였다. piE2는 단일의 8.6kb SmaI 단편을 포함한 약한 CR1-4 양성 클론으로서 확인하였다.
플라스미드 pip1 는 piABCD의 완전한 소화와 큰 10.0kb 단편의 겔-정제로 수득하였다. 이 단편을 결찰하고 대장균 DK1/P3 을 혼합물로서 형질전환하였다. 수득되는 플라스미드 piP1은 단일의 10.0kb SmaI 단편을 포함하였다.
플라스미드 piU1과 piU-2는 처음에 dcm 균주 GM271/P3을 플라스미드 pXLA로 형질전환하고 다음에 DNA를 단리하여 제조하였다. 이 DNA를 단리하여 제조하였다. 이 DNA를 StuI과 NotI 으로서 이중소화시키고 3.3kb 단편을 겔-정제하였다. 플라스미드 pBSABCD 를 NsiI 로서 부분적으로 소화시키고 수득되는 네개의 염기쌍 3' 현수(overhang)를 대장균 DNA 중합효소I의 Klenow 단편으로 처리하여 제거하였다. 다음에 이 DNA를 NotI로 완전하게 소화시키고 5.4kb와 4.0kb의 단편을 겔-정제하였다. 이들을 pXLA로부터의 3.3kb StuI-NotI 단편에 결찰시키고 그리고 결찰 혼합물을 사용하여 대장균 DH5α를 암피실린 내성으로 형질전환시켰다. 집락을 하이브리드화로 선별하여 CR1 cDNA 탐침 CR1-4가 되게 하고 그리고 양성의 클론은 pU1에 대해서는 0.8kb, 1.3kb 및 6.5kb의 세개의 단편과 pU-2에 대해서는 0.8kb과 0.5kb의 두개의 단편을 수득한 HindIII로서 제한소화시켜 점검하였다. StuI-무디게한 NsiI 봉합은 이러한 플라스미드의 DNA 배열순서화에 의해서 프레임안에 있는 것을 확인하였다. 각각 5.6kb와 4.2kb의 pU1과 pU-2의 삽입물은 XhoI 과 NotI의 이중 소화후에 겔-정제하고 위에서 기술한 것 같이 발현 전달매개체에 결찰하였다. 클론 piU1과 piU-2의 구조는 XhoI + PstI 에 의한 제한소화에 의해서 확인하여 piU1에 대해서는 1.2kb와 8.8kb와 piU-2에 대해서는 선형 8.7kb에 대한 두개의 단편을 수득한다.
플라스미드 piA/D는 첫번째로 PstI로서 완전하게 piABCD 소화시켜서 제조하였다. 다음에 PstI 소화물을 ApaI 로서 부분 소화시키고 3' 현수는 대장균 DNA 중합효소I의 Klenow 단편으로 제거하였다. 다음에 이 DNA를 한천 겔 전기영동으로 분류하고 7.5kb 단편을 단리하고, 결찰하고, 대장균 DK1/P3를 형질전환시켜 암피실린과 테트라시클린 내성이 되게 하는데 사용하였다. 이 구성은 KpnI + SacI 에 의한 이중소화로 확인하고, 이것으로 0.8kb, 1.5kb 1.7kb와 3.3kb의 기대한 네개의 단편을 수득하였다.
9. 실시예: C3b와 C4b 결합영역의 확인
9.1. 검사법과 결과
명칭에 (s)자가 표시된 LHR(s)를 포함하는 플라스미드 piABCD, piAD, piCD 및 piD를 COS 세포로 형질전환시키고, 이것을 이들의 인코드된 CRI 단편이 C3b이나 C4b에의 결합능력을 확인하는 검사법에 사용하였다. 결합 검사법은 이들의 세포표면에서 전체길이의 CR1 분자나 CR1 삭제 돌연변이체를 발현하는(일시적 발현) COS세포에 의해서 C3b나 C4b-피복된 적색세포의 결합에서 얻어지는 적혈구 로제트의 관찰에 의해서 실시하였다. 트란스펙트된 세포, 1-4×106/ml를 C3-또는 C4-보유, 적혈구로서 2-6×108/ml는 0.02ml에서 20ㅇC로 60분간 배양하였다. 로제트를 형성하는 트란스펙트된 세포의 %는 최소한 다섯개의 접착 적혈구가 있을경우 로제트로서 계산된 트란스펙트된 세로로서 현미경으로 평가하였다.
결과는 표III에 표시한다.
*적혈구당 C3(ma)의 수는 이 중간물질을 사용하는 세실험에서 각각 60,000, 350,000 및 900,000 이었다.
#적혈구당 C4(ma)의 수는 이 중간물질을 사용하는 두 실험에서 각각 160,000과 140,000 이었다.
π 실험의 번호.
세개의 별도의 실험에서, EC3(ma)로서 로제트를 형성한 전체 길이의 piABCD 구성을 발현하는 COS 세포의 비율은 YZ1 단일클론의 항-CR1 항체 또는 토끼 항-CI1 항혈청(표III)중 어느것을 사용하는 면역형광으로 검사하여 검출가능한 재조합 수용체를 가지는 분설에 유사하였다. 반대로 piD를 발현하는 세포는 로제트를 형성하지 않으므로서, C3-결합위치가 LHR-A, -B 또는 -C의 속의 잔유하거나 또는 이의 존재를 필요로 한다. piBD 또는 piCD 구성물의 어느것을 발현하는 세포가 E3(ma)를 가지는 로제트를 형성하였다는 것으를 나타냄으로서 LHR-B와 -C의 두가지 모두에서 존재하는 것을 나타내었다. piAD, piA/D 또는 piE-2 구성물이 LHR-C의 첫번째의 두개의 SCRs 대신에 LHR-A의 SCR-1과 -2를 가지는 점에서만 piCD와 상이하기 때문에 LHR-C에서의 C3-결합위치의 기능은 세개의 NH2-말단의 SCRs를 필요로 해야 한다.
EC4(ma)로서 로제트를 형성한 전체길이의 piABCD 재조합물을 발현하는 COS세포의 비율은 EC3(ma)를 가진 분설 로제트 보다 적어서 적혈구당 더적은 C4(ma)(표III)와 수용체당 더적은 C4-결합위치를 반영한다. LHR-A, piAD, piA/D 및 piE-2 구성물의 전부나 일부를 가지는 삭제 돌연변이체는 삭제 돌연변이체 piBD와 piCD가 가졌던것 보다 더 잘 EC4(ma)에 결합하였고; piD는 이 기능이 결핍되었다. 이와 같이 CR1의 C4-결합위치는 비록 제2위치가 LHR-B와 -C에 존재한다 하더라도 주로 LHR-A에 존재한다. piCD 구성물의 로제트 능력에 대한 piE-2 구성물의 로제트 능력의 향상으로 LHR-A의 SCR-1와 -2가 C4의 결합위치에 포함되었음을 제시한다.
단일클론의 항-CR1 항체의 결합의 방사선 면역검사로서 piABCD, piAD, piBD 및 piCD 구성물을 발현하는 COS 세포에 의한 중요한 흡수를 나타내었다(표IV). 비록 이러한 구성물의 생성물이 폴리클론의 항-CR1 항혈청에 결합한다 하더라도 LHR-A의 다섯개의 NH2-말단의 SCRs와 LHR-D의 세개의 COOH-말단의 SCRs로 구성된 piD나 piA/D로서 트란스펙트된 세포가 YZ1 항-CR1 항체에 결합하지는 않았다. 이와 같이 YZ1 에피토프는 LHR-A, -B 및 -C에서 반복되고, LHR-A의 NH2-말단 SCRs에 존재치 않고 그리고 LHR-D에 존재치 않거나 또는 접근 불가능하다.
*1% 소의 혈청 알부민과 0.02% 아지화 나트륨을 포함하는 0.1ml 인산염-완충된 식염수에든 3×105 트란스펙트된 세포의 복제 시료를 3μg/ml YZ1 IgGI 항-CR1 mAb(Changelian, P.S., et al., 1985, J. Immunol. 134:1851) 또는 90μg/ml 토끼 IgG 항-CR1 항체로서 0℃에서 60분간 배양하였다. 이 세포를 세척하고 1-2μCi/ml의125I-F(ab')2 염소-항-쥐 IgG 또는 125 I-단백질 A를 포함하는 0.1ml의 완충용액에서 재현탁 시켰다. 0℃ 에서 1-2시간 후에 세포를 세척하고125I에 대해서 검사하였다. 나타낸 값은 측정치의 평균치이고 3×105 COS 세포당 cpm를 나타낸다.
9.2. 토의
각 LHR에 있는 첫째 SCR의 코딩 배열순서를 통하여 중간에서 발견된 보존 BsmI 부위는 LHRs의 경계에 가깝게 상응하는 일련의 산제 돌연변이체의 구성을 허용하고 추론된 이황화물 결합 형성(제16도)에 대해서 필요한 네개의 시스타인의 개방 판독 프레임과 적절한 위치를 유지하였다. 이러한 삭제 돌연변이체의 C3(ma)-및 C4(ma)-결합기능의 비교로서 이러한 특이성을 가지는 LHRs 뿐만 아니라 배위자 특이성을 측정하는데 결정적인 SCRs도 또한 분별하였다. 이와 같이 트란스펙트된 COS 세포와 EC4(ma)간에 로제트 형성을 매개하는 수용체의 piAD, piA/D 및 piE-2 형태 그러나 piD 형태는 아님의 용량은 LHR-A의 NH2-말단의 두개의 SCRs가 이러한 보체 단백질(표III)과의 상호작용에 대한 부위를 포함하였음을 나타내었다. 이 부위는 C4(ma)에 대해서 상대적 특이성만이 있었는데 그 이유는 piAD와 piA/D를 발현하는 트란스펙트물이 또한 EC3(ma)을 결합할 수 있었기 때문이다(표III). EC3(ma)을 분할에 대한 로제트 검사와 인자I죈자 기능으로 나타낸 piBD와 piCD 구성물에 의해서 인코드된 수용체의 C3(ma)-결합기능은 이러한 LHRs의 첫번째의 두개의 SCRs에서 C3(ma)에 대해 특이한 부위가 있음을 나타내었다. 이와 같이 LHR-A, -B 및 -C 에는 바람직하지만 겹치는 C4-및 C3-결합활성도가 있었다.
또한 piBD와 piCD 구성물을 발현하는 COS 세포의 EC4(ma)를 결합시키는 능력은 BsmI 단편의 결찰을 통하여 LHR-A 내지 LHR-B의 SCR-1로부터의 NH2-말단의 36 아미노산을 아미노산을 인코딩하는 누클레오티드의 이동으로 비롯된 것이다. 그러나 이러한 36 아미노산 단독으로는 piD 생성물에 C4-로제트 기능을 부여하지 않았다. 본인들은 이러한 반응에서 LHR-D의 2차적 기능을 배제할 수 없는데 그이유는 이러한 LHR가 기능을 검사한 모든 구성물에 존재하였기 때문이다. CR1에서 세개의 분명한 배위자 인식부위, C3b에 대해서는 2개의 부위 그리고 C4b에 대해서는 하나의 부위의 발견으로(제19도), 각 수용체 분자가 일가의 배위자에 대해서 비교적 낮은 친화력을 가짐에도 불구하고(Arnaout, M.A., et al., 1983, Immunology 48:229). 다중 C4b와 C3b 분자를 보유하는 복합체를 효과적으로 결합할 수 있음을 나타낸다. 이 발견으로 또한 가용성 C4b의 적혈구 보유 C3b와 사람 B 임파아구 세포간의 로제트의 형성을 억제하는 무능력의 설명을 제공한다(Gaither, T.A., et al., 1983, J. Immunol. 131:899). CR1이 특별히 적용되는 가능한 배위자는 각각 기본적이나 대안적 통로의 활성화중에 발생되는 분자복합체, C4b/C3b와 CB/C3b일수도 있다. 네개의 LHRs중에서 세개에는 분명한 결합위치가 있기 때문에 LHRs의 이들의 수에 의해 달리하는 CR1의 구조적 이인자형은 배위자 결합부위의 수의 변화로서 발생된 중요한 기능적 차이를 가질 수도 있다. 비록 시험관을 사용하는 연구에서 F,S 및 F'(A,B 및 C의 각각의) 이인자형의 상이한 결합활성도를 보고하였지만 단지 세개의 LHRs만을 바람직하게 가지는 더 작은 F' 이인자형도 면역복합체를 깨끗이하는 손상된 능력을 가질 수도 있었다. F' 이인자형은 전신계 낭창 적혈구와 관련될 것으로 보고했다(Van Dyne, S., et al., 1987, Clin. Exp. Immunol. 68:570).
10. 실시예:인자I 조인자 활성도의 증명
세포-표면과 용해된 형태의 두가지 모두에서 재조합 CR1 단백질과 이들의 특이한 단편이 C3b 인자I 조인자 활성도를 가지는 것으로 증명되었다.
인자 I 조인자의 활성도에 대한 시험은 간행된 방법을 변화시켜 실시하였다(Fearon, D.T., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76:5867).
용해된 CR1 와 단편 세포-표면 CR1 단백질과 단편을 Nonidet P-40으로 용해시키고 용해질을 세파로스 방울에 결합된 항-CRI 단일클론의 항체 YZ-1 로서 면역침전시켰다. 1×106 트란스펙트된 COS 세포의 세제 용해질을 세파로스 UPC10 항-레반과 세파로스-YZ1로서 차례로 면역침전시켰다. 다음에 이 면역침전물을 0.5μg의125I-C3(ma)와 0.05ml PBS, 10.5% NP-40에든 200ng의 인자I로서 세척된 방울을 37℃에서 60분간 배양시켜서 인자I 조인자 활성도에 대한 검사를 실시하였다. 배양후에 방사선 라밸이된 C3(ma)를 포함하는 상청액을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동과 방사선 사진법으로 분석하였다. 인자I 조인자 활성도는 인자I에 의해서 단백질 분해식 분할에서 얻어지는 알파사슬의 C3(ma)의 저분자량 형태의 방사선 사진에 나타남으로서 나타낸다.
세포표면 CR1와 단백질 인자I 조인자 활성도의 시험을 위하여 CR1 발현 전달매개체 (위에서 기술한 piABCD, piAD, PiBD, PiCD, 또는 piD)를 수반하는 트란스펙트된 COS 세포를 0.5μg125I-C3(ma)와 0.2μg 인자I로서 배양하고(Fearon, D.T., 1977, J. Immunol. 119:1248) 위에서 기술한것 같이 분석하였다.
세포표면 재조합 CR1의 인자 I-조인자 활성도는 제15도에서 나타 낸다. 인자 I은 C3(ma)의 알파사슬을 면역 고정시킨 재조합 CR1 또는 인자H(제15도)의 존재하에서만 76,000 와 46,000 의 분자량의 단편으로 분할하였다. 방사선 사진으로부터의 벤드에 상응하는 영역을 겔로부터 절개하고125I에 대하여 검사하여 분할된 알파사슬의 양을 측정하였다. 인자H의 존재하에 알파사슬의 91%를 분할하였는데 이때에 증가되는 양의 재조합 CR1의 존재하에 26%, 41% 및 55%의 각각을 분할하였다. 비록 CDM8전달매개체 단독으로 트란스펙트된 COS 세포가 몇가지 내인의 인자I-조인자 활성도를 포함하였지만 이러한 기능의 증가는 piABCD, piBD와 piCD(제18도)로서 트라스펙트된 COS 세포를 가진 것으로 확인되었다.125I-C3(ma)의 비증대 분할을 PiAD 또는 piD로 트란스펙트된 COS 세포를 가진 것으로 보였다. 이와 같이 이러한 구성물중에서 COS 세포에서 C3를 결합하는 능력이 부여된 삭제 돌연변이체, piBD와 piCD만이 C3의 분할에 대한 인자I-조인자 활성도를 가졌다.
CR1와 같이 세포표면과 용해된 형태를 가진 인자I 조인자 활성도의 결과는 표V에 제시한다.
a 검사한 CR1 단백질과 또는 단편의 인코딩과 발현을 위하여 COS세포로 트란스펙트된.
b (+)는 CDM8 전달매개체 단독으로 트란스펙됐을 때 관찰된 내인성 레벨 이상의 조인자 활성도의 증가를 나타낸다.
c 측정않음.
d 항-CR1 단일클론의 항체 YZ-1에 의해 인식된 에피토프의 LHR-D가 없음으로 인해, 측정안됨.
표5에서 나타낸 것 같이 piABCE(전체길이의 CRI 단백질을 인코딩하는), piBD(LHR-B와 -D를 인코딩하는) 또는 piCD(LHR-C와 -D를 인코딩하는)의 발현으로 C3b 인자 I조인자 활서도를 생성하였다. 이와 같이 표5의 데이타는 CR1단백질과 이의 단편이 보체비활성화를 촉진할 수 있다는 증명을 제시한다.
11. 실시예 : 재조합 가용성 CR1의 발현
이 CR1 cEDNA를 재조합 DNA 방법으로 수식하여 CR1에나 단편의 가용성 형태(sCR1)를 생성하였다. sCR1 구성물은 발현된 단백질을 세포로부터의 분비되는 경우에 포유동물 시스템에서 발현되었다. 대량의 가용성 폴리펩티드를 생상하였으며 이는 CR1 단백질의 막결합 형태와는 대조적으로 용액속에서 이들을 수득하기 위하여 용해시킬 필요는 없었다.
11.1. 물질과 방법
11.1.1. 효소 소화
모든 제한효소 소화, 결합체 결찰, 및 T4 DNA 리가제(ligase) 및 대장균 DNA 중합효소 반응은 재조자(New England Biolabs, Inc., Beverley, MA)의 지시에 따라서 실시하였다. 대장균 DH1 또는 DH5α는 Morrison, D.A., 1979, Meth. Enzymol 68:326-331의 방법에 따라서 적용하였다. 적합한 박테리아 세포는(Maniatis, T., et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York)에 따라서 DNA로서 형질전환시켰다. 플라스미드는 알칼리 분해에 의하거나 또는 비등방법(Maniatis, T., et al., supra)에 의하여 정제하였다.
11.1.2. DNA 단편 단리
DNA 단편은 다음과 같이 한천(BioRad, Richmond, CA) 겔로 정제하였다. 적절한 DNA 벤드는 칼날을 써서 겔에서 절개하고, 한천 봉합은 파라필름의 조작에 놓고, 작은조작으로 봉합하고, 새조각의 파라필름이 되도록 이송하였다. 한천 조각을 분쇄하고, 한천을 1.5ml 튜브에 옮겼다. 같은 용적의 페놀(초순도, BRL, Gaighersburg, MD)를 첨가하고, 혼합물을 와동시키고, 다음에 -70℃ 에서 10분간 냉동시키고, 10분간 원심분리 하였다. 한천층을 다시 페놀/클로로포름(1:1)으로 두번 추출하고 클로로포름으로 두번 추출하였다. 다음에 DNA를 에탄올 침전시키고, 펠릿 세척하고 진공하에서 건조시키고 10mM 트리스-HCl, pH 7.0, 1mM EDTA 에서 재현탁 하였다.
DNA 단편을 다음과 같은 낮은 겔화온도 한천(롯, 채게., Rockland, ME)로부터 단리하였다. 적절한 DNA 벤드를 한천겔로부터 절개하고 1.5ml 튜브에 넣고 65℃에서 15분간 도데실황상나트륨(SDS, 초순도, BRL, Galithersburg, MD)을 포함하는 페놀로서 추출하였다. 수용액층은 페놀-SDS로서 한번 추출하고 클로로포름으로 두번 추출하였다. 다음에 이 DNA를 2.0M 아세트산 암모늄에서 에탄올 침전시키고, 건조하고, 물에서 재현탁 시켰다.
11.1.3. 포유동물 세포로의 트란스펙션
포유동물 세포로의 DNA의 트란스펙션은 CaPO4 침전과 Graham and Van der Eb의 글리세롤 충격방법(1973, Virology 52:456-467)으로 실시하였다. DNA-인산칼슘 제품을 4 내지 6시간 배양시킨 후에 옅 Bll CHO 세포를 흡입으로 생장배지를 제거하고 5ml의 20%글리세롤 DMEM 배지를 1분간 첨가하여 글리세롤 충격 처리를 하였다. 다음에 세포를 완전한 알파 MEM 에서 두번 세척ㅎ고 이 배지에서 48시간동안 배양하였다.
11.1.4. CH0 트란스펙탄트 세포배양
DUX Bll CHO 세포 트란스펙트물을 누클레오시드 없이 10%투석된 태아소의 혈청(Gibco)와 4mM L-글루타민으로 보충시킨 알파 MEM 배지(Gibco)로 구성된 DHFR(디히드로풀레이트 환원 효소) 선택 배지에서 생상시켰다. 증폭은 메토트랙세이트(Sigma, #A-6770, Amethopterin)(Kaufman, J.J., et al., 1985, Molec. Cell Biol. 5:1750-1759)의 증가된 농도에서 세포를 생장시켜 실시하였다.
11.1.5. 가용성 CRI 레벨의 검출을 위한 ELISA
11.1.5.1. CR1 표준
헤로글로빈-없는 적혈세포(균) 환영(ghost)의 세제 용해질을 ELISA(효소-결합된 면역흡수제 검사법)에서 CR1 표준으로서 사용하였다. 이 환영은 앞에서 기술한것 같이 제조하였다.(Wong, W.W. and Fearon D.T., 1987, Meth. Enzymol 150:579-585). 간략히 설명하면 죽은 전체되는 적십자사로부터 수득하였다. 적색세포를 PBS 에서 세번 세척하고 다음에 6 용적의 저침투압 분해완충액(10mM 트리스 pH 8, 0.1mM PMSF 불화페닐메틸술포닐), 0.1mM TPCK(토실아미드-페닐에틸 클로로 메틸 케톤), 아프로토닉, 2mM EDTA)에서 분해시켰다. 이 환영을 분해 완충액에서 여러번 세척하고 혈구계로 계수하고 분취하고 그리고 필요시까지 -70℃에서 냉동시켰다. CR1 ELISA에 대해서는 환영을 용해용완충액(10mM 트리스 pH 8, 50mM KCl, 0.2% NP40, 0.3% DOC, 6.2mM PMSF, 0.2mM 요오드 아세트아미드, 아프로토닌, 0.1mM TPCK, 2mM EDTA, 0.2%NaN3)에든 1.6×108환영/ml 희석시키고 그리고 ELISA의 표준으로서 사용코저 2.5*106환영/ml에 차례로 희석시켰다. 490nm 에서의 흡수를 작도하고 미지의 시료 실시를 참고하여 환영등가량/ml에 작도하였다.
11.1.5.2. CR1 ELISA
임뮤론-II 판을 PBS에든 항-CR1 단인클론의 항체(클론 J3D3, AMAC IOT 17)(Cook, J., et al., 1985, Molec. Immunol. 22:531-538)의 0.4μg/ml 농도의 100μl/웰로서 피복하고 4℃ 에서 밤새껏 배양하였다. 다음에 항체용액을 버리고 판을 300μl/웰로차단 완충액(PBS에든 1.0% BSA)를 첨가하고 37℃에서 2시간동안 배양하여 차단하였다. 차단한 후에 판을 즉시 사용하거나 또는 필요시까지 4℃에서 저장하였다.
판을 0.05% Tween-20을 포함하는 PBS를 사용하여 세번 세척하였다. 시료를 100μ/웰로 복제로 첨가하고 37℃ 에서 2시간동안 배양하였다. 표준 RBS를 사용하여 세번 세척하였다. 시료를 100μ/웰로 복제로 첨가하고 37℃ 에서 2시간동안 배양하였다. 표준 RBC 환영은 각 판에서 포함시켰다. 시료를 배양한 후에 판을 세번 세척하고 양고추냉이과산환효소(HRP)와 단일클론의 항체 YZ1(Changelian, P.S., et al., 1985, J, Immunol 184:1851-1858)의 콘쥬게이트(Wilson, M.B. and Nakane, P,K., 1978, Immunofluorescence and Related Staining Techniques, North Holland Biomedical Press, pp. 215-224)를 50% FCS, 50% 차단완충액에 1:8000으로 희석하고 그리고 100μl/웰로 첨가하였다. 37℃에서 2시간동안 배양한 후 판을 다시 0.05% Tween-20을 포함하는 PBS로서 세번 세척하였다. 기질 오르토페닐렌디아민(CPD)를 기질 완충액(0.36% 구연산 H20, 1.74% Na2HPO4.7H2O, 0.1% 티메로살, 0.4% H2O, pH 6.3)에서 100μl/웰로 0.2% 농도로 첨가하였다. 반응은 2NH2SO4의 50μl/웰을 시켰다. 흡수는 490nm에서 판독하였다.
CR1 cDNA는 대략 6,951 누클레오티드 염기쌍으로 구성된다(위의 제1도 및 6,7항). 천연의 cDNA의 번역 정지신호는 염기쌍 6145에 위치한다. 단백질은 네개의 기다란 상동성 반복물(LHRs)의 막-결합된 수용체 분자로 구성되고 이는 세포막과 대략 25 아미노산의 막-걸치는 도메인의 외측표면에 노출되고. 다음에 세포형질 속으로 연장되는 카르복시 말단의 영역으로 구성된다. 이 세포형질 도메인은 마흔세개의 아미노산으로 구성된다. 가용성 CRI분자(sCRI)을 생산하는데 사용한 전략은 세포막에서 단백질에 앵커하는 투과막 영역을 제거하고 다음에 분비된 폴리펩티드로서 거두 원뿔형의 구성물을 발현한다.
11.2.1. pBSCRlc의 구성
플라스미드 pBSASCE(위의 실시예8)은 누클레오티드 1 내지 6860으로부터의 CR1 cDNA을 포함하고 누클레오티드 6860에서의 EcoRV으로의 비번역된 배열순서가 부족하다. CR1 cDNA는 투과막 도메인의 출발로부터의 29 염기쌍인 염기쌍 5914에서의 독특한 BalI 제한 엔도누클레아제 인식위치를 소유한다. pBSABCD 는 처음에 BalI로 소화되어 플러위 단부로서 선형분자를 생성하고 다음에 T4 DNA 리가제를 사용하여 다음의 배열순서를 가지고 두개의 38 누클레오티드 보충 사상제로 구성된 합성올리고누클레오티드에 결찰되었다.
5' : CCAAATGTACCTCTCGTGCACATGATGCTtaaCTCGAG
3' : GGTTTACATGGAGAGCACGTGTACTACGAATTGAGCTC
수득되는 분자는 투과막 도메인의 출발에 알라닌 잔기를 포함하고 여기에 이르는 천연의 CR1배열순서를 재생한 변경된 배열순서와 저장된 BalI 위치를 가졌다. 또한 비번역 정지신호(위에서 낮은 경우와 밑줄처진) 알라닌 직후에 삽입되고 다음에 XhoI 제한위치가 있어서 변경된 cDNA의 서브클로닝을 용이케 한다.
이 플라스미드(pBSCRlc라 지칭함)의 XhoI 소화로서 cDNA의 올리고누클레오티드-첨가된 Xhol 위치에서 그리고 CR1 cDNA의 5'단부 에서 pBSBS+R다중클로닝 위치에서 XhoI 위치에서 절단하여 cDNA 삽입물(sCRlc라 지칭함)을 절개하였다. pBSCRlc는 다음의 C-말단 배열순서를 포함한다.
염기번호5911:CTGGCCAATGTACCTCTCGTGCACATGATGCTTAACTCGAG
아미노산 : L A K C T S R A H D A 엔드 XhoI 위치
11.2.2. pBSCRls의 구성
투과막 영역이 결핍된 제2sCR1 구성은 다음과 같이 발생되었다. pBSABCD는 pBSABCD는 CR1 cDNA는 누클레오티드 염기쌍 5485에서 독특한 SacI 위치에서 그리고 CR1 cDNA의 3' 단부에 위치한 숙주 플라스미드의 다중 클로닝 위치에서 SacI 위치에서 절단하는 SacI로서 소화시켰다. 이 소화로서 cDNA의 3' 단부로부터의 DNA배열순서의 1375 누클레오티드가 절개되었다. 다음에 이 단편을 전기영동식으로 제거하였다. 나머지 sCR1 cDNA를 포함하는 수득되는 플라스미드의 노출된 단부는 T4DNA 중합효소를 사용하여 플러쉬 하게 만들고 무딘-단부결찰을 실시하였다. 모든 세개의 판독에서 번역 정지신호를 포함하는 자체-보충성 올리고머인, Pharmacia Univeral 번역 말단기(Catalog *27-4890-01, Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ)도 또한 이 결찰에 포함되었다. 결찰시에 삽입된 올리고머는 sCR1 cDNA를 위한 새로운 번역 정지신호를 제공하였다.
11.2.3. pBM-CRlc의 구성
pBMT3X는 사람 금속 티오아인-1A 유전자를 포함하는 진핵세포발현벡터(Krystal, M., et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83-2709-2713)이며, 이는 카드뮴과 같은 중금속의 증가된 레벨에 대해 내성이 있는 세포를 제공한다. 또한 이 벡터는 Mt-1 단백질에 대한 개시코돈을 앞서는 조작된 XhoI 위치를 포함하는 쥐의 금속티오나인-1 유전자를 포함한다. XhoL 위치는 쥐의 Mt-1 촉진부위의 조절하에 유전자를 발현시키는 삽입위치로서 사용된다.
sCR1c 삽입물(대략 5.9kb)을 XhoI를 사용하여 pBSCRlc 으로 부터 절개하고 다음에 벡터 pBMT3X 의 독특한 XhoI 위치에 결찰하였다. pBMT3X 에 sCRlc 삽입물의 정확한 배위는 제한소화에 의하여 측정하였다(Maniatis, T., et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). 수득되는 플라스미드를 pBM-CRlc라 정하였다.
11.2.4. 삭제돌연변이체, pT-CRlc1, pT-CRlc2, pT-CRlc3, pT-CRlc4 및 pT-CRlc5의 구성
또한 sCR1 cDNA(제20도)의 특이하게 삭제된 부위인 여러가지 삭제 돌연변이체를 구성하였다. 각각의 삭제 돌연변이체는 전체 투과막 영역이 부족하여서 돌연변이체의 발현은 가용성 폴리펩티드를 수득하였다.
11.2.4.1. pT-CRlC1
pBSCRlc 를 SmaI로서 소화하여 크기가 2,56kb 와 7,3kb인 두개의 단편을 얻는다. 이러한 단편을 한천겔 전기영동으로 분리하여 7.3kb 단편을 정제하고 그 자체에 재결찰시켰다. 대장균 DH5α 세포를 적합하게 만들고(Morrison, D.A., 1979, Meth. Enzymol. 68:326-331) 그리고 다음에 결찰혼합물로서 형질전환시켰다. 수득되는 플라스미드를 pBL-CRlc1 이라 칭하였다. 이 구성물은 CRlc 삽입물중에서 38%의 LHR-B, 100%의 LHR-C 그리고 51% 의 LHR-D 를 제거하였다. 또한 이것을 접점 2335/4894 bp에서 SmaI 위치를 재생시켰고 정확한 번역 프레임을 유지하였다. pBL-CRlc는 XhoI 으로 소화시키고 CR1삽입물을 pBluescriptR벡터로부터 분리하였다. 다음에 단리된 CR1단편을 발현 벡터 pTCSgpt 의 독특한 XhoI 위치속으로 삽입하여 플라스미드 pT-CRlc1을 생성하였다.
11.2.4.2. pT-CRlc2
pBSCRlc를 ClaI으로 소화시켜서 크기가 3.96kb와 5.8kb인 두개의 단편을 수득하였다. 이러한 단편을 한천겔에서 정제하였다. 플라스미드 pBR322를 ClaI과 BalI으로 소화시키고 2.9kb pBR322 단편을 정제하고 pBSCRlc로부터의 5.9kb 단편에 결찰시켰다. 대장균 DH5α 세포를 결찰 혼합물로 형질전환시키고 수득되는 플라스미드를 pBR8.8이라 칭하였다. 이 플라스미드를 XalI로 소화시켜서 크기가 7.4kb 와 1.35kb인 두개의 단편을 발생시켰다. 7.45kb 단편을 한천겔에서 정제하고, 그 자체에 재결찰시켰다. 수득되는 플라스미드 pBR7.45를 ClaI과 BalI로서 소화시키고 단리된 sCRI cDNA를 포함하는 4.5kb 단편을 pBSCRlc로부터의 3.9kb 단편에 결찰시켜 플라스미드 pBL-CRlc2를 수득하였다. 이 구성물은 sCR1 삽입물에서 90%의 LHR-를 제거하고 접합 1637/2987 bp에서 XbaI 위치를 발생시키고 정확한 판독 프레임을 유지하였다. pBL-CRlc2를 XhoI으로 소화시키고 sCRI 삽입물은 pBluescriptR벡터로부터 분리하였다. 다음에 단리된 sCR1 단편을 발현 벡터 pTCSgpt의 독특한 XboI 위치속으로 삽입하여 플라스미드 pT-CRlc2를 생성시켰다.
11.2.4.3. pT-CRlc3
pBSCRlc 를 Nsil 으로 소화시켜서 크기가 1.09kb, 1.35kb 및 7.46kb인 네개의 단편을 수득하였다. 7.46kb 단편은 한천겔에서 정제하고 그 자체에 재결찰시켜서 플라스미드 pBL-CRlc3를 발생시켰다. 이 구성으로 LHR-A의 77%와 CR1-삽입물의 나머지를 제거하였다. NsiI 위치는 접점 463/2907 kb 에서 재생시켰다. 번역 프레임을 수식하여 무의미 코돈이 재생된 NsiI 위치의 바로 뒤에 삽입되게 하였다. pBL-CRlc3 를 XhoI으로 소화시키고 sCR1 삽입물은 pBluescriptR벡터로부터 분리하였다. 다음에 단리된 sCRI 단편을 발현 벡터 pTCSgpt의 독특한 XhoI 위치속으로 삽입하여 플라스미드 pT-CRlc3를 생성하였다.
11.2.4.4. pT-CRlc4
pBSCRlc를 PstI으로 소화시켰다. pBluescriptR 의 다중 결합체 영역의 PstI 위치를 이 벡터(위의 실시예 8.1)에의 CR1 cDNA의 결찰중에 제거하였다. 크기가 1.35kb와 8.5kb인 수득되는 단편을 겔전기영동으로 분리하고, 8.5kb 단편을 정제하고 그 자체에 재결찰하여 플라스미드 pBL-CRlc4를 발생시켰다. 이 구성으로 sCR1 삽입물의 LHR-A의 31%와 LHR-B의 69%를 제거하였다. 이 PstI 위치는 접점 1074/2424bp 에서 재생시켜서 정확한 판독프레임을 유지하였다. pBL-CRlc4를 XhoI으로 소화시켜서 sCR1삽입물은 pBluescriptR벡터로 분리하였다. 단리된 sCR1 단편을 발현 벡터 pTCSgpt 의 독특한 XhoI 위치속으로 삽입하여 플라스미드 pT-CRlc4를 생성하였다.
11.2.4.5. pT-CRlc5
pBL-CRlc1을 SmaI으로 소화시키고 독특한 SmaI 위치에서 플라스미드를 선형화하였다. 이 플라스미드를 탈포스포릴화하고 무의미 코돈(New England Biolabs, Beverley, MA)를 포함하는 포스폴릴화한 NheI 결합제에 결찰하였다. 이런 형태의 결합제는 모든 세개의 가능한 판독 프레임에서 번역 정지코돈을 포함하고 이것은 또한 NheI 제한위치를 포함하고 이는 sCR1 cDNA 에서 무의미 결합체의 존재의 확인을 용이하게 한다. 수득되는 플라스미드를 pBL-CRlc5라 칭하고 이것은 sCRl cDNA의 LHR-A와 LHR-B의 62%를 보유하였다. pBL-CRlc5를 XhoI으로 소화시키고 sCR1 삽입물은 pBluescriptR벡터로부터 분리하였다. 다음에 단리한 sCRl 단편을 발현 벡터 pTCSgpt의 독특한 XboI 위치속으로 삽입하여 플라스미드 pT-CRlc5를 생성하였다.
11.3. 가용성 CR1의 발현
여기서 증명한것 같이 고수율로 세포에서 분비할 수 있는 CR1의 가용성 형태의 발현이 (i) 삭제 또는 거두에 사용되는 CR1 cDNA에서 하나의 정밀한 위치에 국한되지 않고, 그리고 (ii) 또한 특별한 발현벡터(다음을 참조)의 상요에도 국한되지 않는다. 분비된 sCR1을 생성하는 능력은 두개의 상이한 발현시스템에서 증명되었다.
11.3.1. 발현 벡터의 pTCS 계열의 구성
사용된 발현벡터의 pTCS 계열은 세개의 플라스미드로 구성되고 이들 각각은 cDNAs(제21도)의 삽입을 위한 독특한 XhoI 클로닝 위치를 갖는다. 삽입된 cDNA의 전사는 한세트의 직열 촉진 부위에의 의해서 구동된다. SV40 초기 촉진부위는 아데노비투스 2 주요 후기 촉진부위(AD2 MLP)의 상류에 위치한다. cDNA와 AD2 MLP의 시작의 사이에는 아데노비루스 세분활 선두가 있다. 전사한 mRNAs는 XhoI cDNA 클로닝 위치의 하류에 위치한 쥐의 면역글로블린 캅파(Igk)가 제공하는 폴리아데닐화 신호에서 정지된다. 선택성 표식 크산틴-구아닌 포스포리보실전이표소(gpt), 디히드로폴레이트 환원요소(dhfr) 또는 네오마이신내성(neor)은 각각 pSV2헷, pSV2옭 또는 pSV2neo로부터의 상응하는 표식을 삽입하여 제공한다.
이러한 플라스미드는 또한 박테리아 공급원이나 복제 그리고 암피실린 내성에 대한 베타-락트마제 유전자이었다. 일반적으로 이러한 벡터의 선택은 선택성 표식이나 표식의 결합이 재조합물의 선택에서의 선호도에 따른다.
완전한 DNA 배열순서는 아데노비루스 2(Ad 2), SV40, pSV2cat(Gorman, C., 1985, DNA Cloning, Volume II, A Practical Approach, ed. D.M. Glover, IRL Press, pp. 143-190)와 쥐의 면역글로블린 캅파에 대해서 알려져 있다. 배열순서는 GenBankR 데이타 베이스와 National Biomedical Research annotation and reference에 위치한다. 또한 이러한 배열순서는 어떤 것을 pTCS벡터의 적절한 단편에 대한 공급원으로서 역활을 할 수 있다.
벡터 pTCSgpt, pTCSneo 및 pTCS dhfr를 중간 플라스미드 pEAXgpt 와 pMLEgpt로부터 다음과 같이 구성하였다.
11.3.1.2. pEAXgpt의 구성
단계1. Ad2 MLP DNA 단편을 M13 mp9/MLP로부터 유도하였다(Concino, M.F., et al., 1983, J. Biol. Chem. 258:8493-8496). 이 플라스미드는 누클레오티드 6069에 PvuII 제한부위와 누클레오티드 5791(NBRF 핵산 데이타 베이스 기탁번호3 dad2)에 SacII 부위 를 포함하는 누클레오티드 5778(XhoI 부위)내지 6231(HindIII 부위)의 아데노비투스 2 배열순서를 포함한다. XhoI 내지 HindIII 단편은 M13 mp9의 HindIII와 SalI 부위에 클론하여 플라스미드 M13 mp9/MLP를 발생시켰다.
플라스미드 M13 mp9/MLP를 EcoRI와 HindIII으로 소화시키고 단편을 포함하는 더작은 MLP를 단리 하였다. pUC 플라스미드(Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ)도 또한 EcoRI와 HindIII으로 소화시켜서 다음에 이 플라스미드로부터의 더큰 단편을 EcoRI 내지 HindIII MLP 단편에 결찰시켰다. 이것으로 새로운 MLP-함유 플라스미드를 얻었다. 이 플라스미드를 SmaI로 소화시키고 SalI 결합체에 결찰하고 재순환시켰다. 이러한 새로운 플라스미드를 아데노비루스 2 삽입 배열순서안에서 위치 #6069에 위치한 PvuII 부위에서 플라스미드를 분할한 PvuII로서 소화시켰다. 수득되는 선현단편을 XhoI 결합체에 결찰하고 재수니환시켰다. 이 플라스미드를 XhoI과 SalI으로 소화시키고 MLP DNA를 포함하는 작은 단편을 단리하였다(단편 #1).
단계 2. 플라스미드 pSV2gpt(ATCC 기탁번호 제37145 호)를 PvuII으로 소화시키고 SalI 결합체에 결찰하고 SalI으로 소화하였다. 최종 생성물은 선형 pSV2gpt 단편이었고, 이는 gpt유전자(단편 #2)의 공급원으로서 작용하였다.
단계 3. 쥐의 면역글로블린 Igk 단편(Hieter, P.A., et al., 1980, Cell 22:197-207)을 HaeIII과 AvaII으로 소화시키고 폴리아데닐화 배열순서를 포함하는 단편을 단리하였다. NBRF 핵산 데이타 베이스(기탁번호 #Kcms)에서 유용한 쥐의 Ig 캄파 배열순서에서 Ig 정지코돈은 위치 1296에 있고 다음에 1306에 AvaII 부위가 있고, 1484에는 AATAAA 폴리아데닐화 부위가 있고 그리고 1714에는 HaeIII 부위가 있다. 이 단편의 현수단부는 대장균 DNA 중합효소로 충진되고 다음에 이 단편을 XhoI 결합체에 결찰하고 XhoI으로 소화하였다. 이 단편은(단편 #3)은 폴리아데닐화 부위의 공급원으로서 작용한다.
단계 4. 단편 1,2 및 3을 T4 DNA 리가제에 함께 결찰하여 원형의 플라스미드를 만들었다. 이 플라스미드에서의 단편의 정확한 배위는 제한효소 분석으로 확인하였다. XhoI cDNA클로닝 부위의 하류에는 쥐의 캅파 폴리아데닐화 부위가 있고 또한 이 부위로부터의 더욱 하류에는 SV40 촉진부위와 gpt 유전자가 있다. XhoI 부위의 상류에는 MLP 족진부위가 있고 이 촉진부위의 더욱 상류에는 복제와 암피실린 유전자의 박테리아 공급원이 있다.
다음에 이 플라스미드를 SalI으로 소화시키고 현수단부를 대장균 DNA 중합효소로 채운다. 수득되는 무딘 단부단편을 EcoRI 결합제에 결찰하고 T4 DNA 리가제로 재수니환 시켰다. 최종 플라스미드를 pEAXgpt라 칭하였다.
11.3.1.2. pMLEgpt 의 구성
단계 1. 플라스미드 pMLP CAT(Lee, R.F., et al., 1988, Virology, 165:51-56)은 pML 벡터 골격을 가진 발현 플라스미드이고 아데노 비루스 2MLP와 CAT 유전자에 대해 삼분할 선행배열순서 5'를 포함한다. pMLP CAT 는 XhoI와 SacII로서 소화시키고 XhoI는 삼분할 선행의 CAT 유전자와 L3 영역의 사이의 부위에서 절단되고, SacII는 아데노비투스 DNA안의 위치 #5791에서는 절단되지만 MLP의 5' 위치에서는 절단되지 않는다. AD2 MLP와 삼분할 선행은 이와 같이 이러한 작은 XhoI 내지 SacII 한편(단편 #4)에 위치한다.
단계 2. 플라스미드 pEAXgpt를 XhoI와 SacII로서 소화시키고 작은 MLP 포함 단편은 버린다. 큰단편(단편 #5)를 단리하였다. SacII와 XhoI 단부의 두가지 모두를 가진 단편 4와 5를 결찰시켜 플라스미드 pMLEgpt를 생성하였다.
11.3.1.3. pTCSgpt 의 구성
단계 1. pMLE헷를 SacII로서 소화시키고 단부는 T DNA 중합효소로 채워서 무딘 단부의 단편(단편 #6)을 얻는다. 이러한 SacII 부위는 MLP-삼분할 선행의 아데노비투스 2 배열순서 5' 속의 누클레오티드 5791에 위치한다.
단계 2. pSV2dhfr(ATCC 기탁번호 제37146호)를 HindIII와 PvuII로서 소화하였다. SV40초기 촉진부위를 포함하는 작은 342 누클레오티드 단편을 대장균 DNA 중합효소의 Klenow 단편(단편 #7)을 사용하여 무딘 단부로 하였다. 단편 6과 7을 T4 DNA리가제로서 결찰하였다. 제한 효소 분석으로 이 단편이 바르게 배열되어서 XhoI cDNA 클로닝 부위의 상류에 두개의 직열의 촉진부위를 제공하고, 각 촉진부위는 같은 방향에서 RNA 합성을 프라임할 수 있음을 확인하였다. 이 플라스미드를 pTCSgpt라칭하였다(제22도).
11.3.1.4. pTCSdhfr의 구성
단계 1. pSV2dhrf를 HindIII과 PvrII으로 소화시키고 다음에 큰단편을 한천겔로부터 정제하였다(단편 #8). 작은 SV40 초기-촉진부위를 포함하는 단편을 버린다.
단계. pTCSgpt를 EcoRI으로 소화시키고 다음에 대장균 DNA 중합효소의 Klenow 단편으로 채워서 무딘 단부를 생성시킨다. 다음에 이러한 선형의 단편을 HindIII으로 소화시키고 SV40 촉진부위의 pTCS 전사단위, MLP, 삼분할 선행자, XhoI cDNA 클로닝부위, 쥐의 Igλ 배열순서 및 제2 SV40 촉진부위를 포함하는 단편(약 1600 누클레오티드)를 단리하였다 (단편 #9). 이단편은 하나의 플러쉬 단부와 하나의 HindIII gustn 단부를 가졌다. 단편 8과9의 결찰로서 플라스미드 pTCSdhfr를 발생시켰다.
11.3.1.5. pTEXneo의 구성
단계 1. pSV2neo(ATCC 기탁번호 제 37149호)를 HindIII와 BamHI으로 소화시키고 큰단편(단편 #10)을 단리하였다. 이 단편은 플라스미드 골격을 포함하고 neo 유전자는 포함치 않았다.
단계 2. pTCSdhfr 를 HindIII과 BamHI으로 소화시키고 pTCS 전사단위(단편 #11)를 소화재생성물을 전기영동한 후에 한천겔로부터 단리하였다. 단편 10과 11의 결찰로서 플라스미드 pTCSneo를 발생시켰다.
플라스미드 pBSCRlc, pBSCRls 및 pBM-CRlc의 발현과 검사, 가용성 CR1 코딩 배열순서를 포함하는 포유동물 발현 벡터
11.3.2.1 CR1 cDNA 속에서의 상이한 위치에서 절두된 CRI 구성물의 발현
플라스미드 pBSCRlc 과 pBSCRls를 구성하여(위의 11.1항) 투과막과 세포형질 영역을 제외한 대부분의 cDNA 코딩영역을 보존하였다(제20도). pBSCRls는 pBSCRlc 보다 짧은데 그이유는 이것이 pBSCRlc에 존재하는 LHR-D와 SCRs 29와 30의 없어진 부위이기 때문이다. 이러한 플라스미드의 sCR1 부위를 pTCSgpt속으로 삽입한 다음에 기술하는것 같이 트란스펙트하고 발현하였다.
pBSCRlc/pTCSgpt 구성: pBSCRlc를 XhoI으로 소화시켜 5.9kb 삽입물 sCRlc를 수득하였다. sCRlc를 pTCSgpt의 XhoI cDNA 클로닝 부위속으로 삽입하여 pBSCRlc/pTCSgpt를 생성하였다.
pBSCRls/pTCSgpt 구성: pBSCRls를 XhoI과 PvuI 으로 소화시켜 sCRls 삽입물을 방출하였다. 이삽입물의 단부를 T4 DNA 중합효소로 무딜게 하였다. 이 삽입물을 한천 레로부터 정제하였다. 벡터 pTCSgpt를 XhoI으로 소화시키고 현수 XhoI 단부를 대장균 DNA 중합효소I로서 채웠다. 다음에 sCRls 삽입물을 무딘 단부 벡터에 결찰하여 pBSCRls/pTCSgpt를 생성하였다.
플라스미드 pBSCRlc/pTCSgpt와 pBSCRls/pTCSgpt를 FspI 으로 소화시키고 수득되는 선형 DNA's를 플라스미드 pSV2dhfr로서 인산칼슘과의 동시침전을 통하여 dhfr 유전자(CHO 옅 Bll 세포)에서 돌연변이한 중국 Hamster 난소세포로 트란스펙트 하였다. 트란스펙트물은 DHFR 선택 배지에서의 성장능력으로 선택하였다. 트란스펙트물 클론의 배양 상청액을 ELISA 법으로 분비된 sCR1에 대한 검사를 하였다. 50개의 pBSCRlc/pTCSgpt 재조합물로부터의 배양물 상청액을 검사하고 양성 재조합물을 메토트랙세이트(methorexate)의 농도를 증가시키면서 배양시키는 증폭 방법으로 취하였다. 또한 트란스펙트물을 함께 동시 배양하고 같은 증폭과정을 통하여 이들을 운반하여 제조하였다. 증폭의 결과는 표VI에 제시한다.
*클론 2와 35를 sCR1의 대량생산용으로 선택하였다.
클론 35는 제한의식으로 서부클론하고, 그리고 가용성 CR1의 생산은 각 서브클론에 대해서 측정하였다. pBSCRlc/pTCSgpt-클론 35.6 은 생산이었으면 17.7μg/ml sCRl을 나타낸다.
MTX : 메토트랙세이트(methortreexate)
pBSCRls/pTCSgpt로부터의 열두개의 재조합물을 ELISA법으로 가용성 CR1 의 생산시험을 하였다. 12개 모두가 분비된 sCR1의 검출가능한 수준을 나타내어다. 최선의 방법은 최선의 pBSCRlc/pTCSgpt 트란스펙트물로 생성됨과 동시에 비교할만한 수준의 sCR1을 제시하였다.
pBSCRlc/pTCSgpt와 pBSCRls/pTCSgpt 재조합물은 유사한 수준의 생산량으로 가용성 CR1을 생성하였다. 이로서 가용성 CR1 폴리펩티디드 생산능력은 CR1 cDNA 에서 정밀한 절두점에 의존치 않음을 나타내었다.
두개의 상이한 발현시스템에서의 sCRlc의 발현
절두된 CRl cDNA 삽입물, sCRls를 위해서 기술한것 같이 발현벡터 pTCSgpt속으로 삽입하고 발현하였다. 이것을 또한 위의 11.2.3항에서 기술한것 같이 발현벡터 pbmt3x속으로 삽입하여 pBM-CRlc 를 수득하였다. 이러한 발현벡터의 두가지 모두를 두 시스템에서 시험하여 한시스템이 분비된 폴리펩티드를 보다 나은 수율로 생산할 수 있는지의 여부를 측정하였다.
C127I 쥐의 세포(ATCC 기탁번호 제 CRL 1616호 Rockville, Maryland) 를 인산칼슘방법(Graham, F.L. and Van der Eb, A.J., 1973, Virology 52:456-467)을 사용하는 pBM-CRlc 로서 트란스펙트하였다. 글리세롤 충격 후에 이 세포를 10% 태아소의 혈청과 2mML-글루타민을 포함하는 D-MEM 배지로 재주입하고 37℃ 에서 48시간 동안 배양하였다. 그후에 이 세포를 트립신화 하고 1:5 및 1:10의 비율로서 완전한 D-MEM 배지+10μM 염화카드뮴으로 분할하였다. 카드뮴-내성의 세균칩략이 10일 이내에 나타났다. 열개의 집락을 클로닝 실린더를 사용하여 제거하였다. 각 집략을 완전한 D-MEM 배지를 포함하는 60mm 페트리 접시에 옮기고 세포가 교회에 도달할때까지 5% CO2로 37℃에서 배양하였다. 그후에 각 접시에 대해서 세포를 트립신화 하고 세개의 60mm 접시에 분할하여 냉동된 세포, 제고의 제조, RNA 추출 및 분비된 sCRlc의 존재를 보유 세포배지의 ELISA 시험에 사용코저 하였다.
각각의 교회 페트리 접시로부터 세포배지를 제거하고 ELISA 분석처리를 했을 때 시험한 모든 pBM-CRlc 클론은 가용성 CR1 생산에 대해서 양성이었다. pBM-CRlc 재조합물로부터의 분비된 sCR1의 수준은 pBSCRlc/pTCSgpt 재조합물로부터의 수준에 비교하였다. 이것으로 분비된 sCR1 폴리펩티드의 고수준의 생산능력은 어떤 촉진부위나 발현시스템의 사용에만 의존되지 않음을 나타낸다.
11.3.3. 플라스미드 pT-CRlc1, pT-CRlc2, pT-CRlc3, pT-CRlc4 및 pT-CRlc5의 발현과 검사, 가용성 CR1코딩배열순서를 포함하는 포유동물 발현벡터
pT-CRlc 계열의 삭제 돌연변이체는 구성물 pBSCRlc과 pBSCRls과 같이 투과막과 세포형질 도메인이 없었다. 또한 삭제 돌연변이는 CR1 cDNA(제20도 참조)의 여러가지 영역의 매우큰 삭제를 포함하였다. 삭제 돌연변이체는 CHO 옅 Bll 세포에서 발현되었고 생성된 가용성 CR1 폴리펩티드 수준을 측정하였다.
각 삭제 구성물에 대해서 40개의 상이한 클론의 혼주를 ELISA 분석용으로 선택하여 가용성 CR1 폴리펩티드가 생산되는지의 여부를 측정하였다. 다섯개의 pT-CRlc 구성물의 모두가 ELISA에 의해서 또는 세포배양 배지에서의 기능적 활성도의 존재에 의해서 측정하여 세포 배양배지속으로 sCRl을 분배하는 것으로 발현되었다. 다섯개의 pT-CRlc 구성물중 네개로 트란스-펙트된 세포로부터의 상청액을 용혈검사법(다음의 표 VII와 13.2항 참조)으로 측정하여 기능적이었던 sCRl을 생성하여다.
* ELISA 나 용혈검사의 시험을한 상청액은 T75 플라스크나 24웰접시에서 생장하는 배양물에서 수득하였다. 가용성 CRl의 여러가지 량이 이러한 조건에서 배양 상청액에서 누적되기 때문에 나타난 결과는 정성적이다. (+)는 나타낸 검사법으로 검사한것 같이 기능적 sCRl의 생성을 나타낸다.
또한 삭제 돌연변이체가 가용성 CR1을 생성시킬 수 있었다는 사실로서 sCR1을 발현하는 능력이 CR1 cDNA의 정밀한 유전자 수식에 의존하지 않는다는 것을 나타내었다. 투과막 영역을 삭제 하는한 모든 구성물은 가용성 폴리펩티드를 생성시킬 수 있었다.
12. 실시예: 가용성 CR1의 생산과 경제]
다량의 sCR1을 공동 섬유 생체반응기 시스템에서 제조하였다. 수득한 sCR1의 양은 접종한 재조합 클론의 상대적 수율에 비례하였다. 최적의 정제결과를 위하여 혈청이 없는 배지를 외인으로 첨가된 태아소의 혈청 폴리펩티드 이 다량으로 없는 상태에서 sCR1의 대량생산이 되도록 선택하였다.
12.1. 가용성 CR1의 대량생산
모델 IV-L의 공동 섬유생체 반응기(30KD 분자량 절단)가 장치된 Cell-PharmR 세포 배양시스템 I(CD Medical, Inc., Miami Lakes, FL) 를 살균조건에서 조립하였다. 두개의 클론(pBSCRlc/pTCSgpt의 클론 2와 클론 35)을 여덟애의 T-225 플라스크속으로 팽창시켰다. 교회에서 세포를 트립신화하고, 세척하고, 펠릿으로 만들고 그리고 배양배지에서 재현탁하였다. 대략 5×108의 세포의 클론2와 10×108세포의 클론 35를 두개의 별도의 공동섬유 생체반응기속에 접종하였다. 알파-MEM+10%태아소의 혈청, 8mM L-글루타민, 100μg/ml 페니실린-스트렙토마이신 그리고 적절한 농도의 메토트랙세이트(클론2에 대해서 50nM; 클론 35에 대해서 500nM)의 20ℓ주입 저장기를 사용하였다. 사전 혼합한 가스(공기중에 5% CO2로된)를 pH를 유지하기 위하여 산소발생기를 통하여 저장기 배지속으로 통과시켰다. 배지의 재순화, 대체 및 가스유량은 최대의 생산량을 얻도록 조절하였다. 시료는 접종 배출구를 통하여 수거하고, 1000rpm 으로 10분간 원심분리하고 0.22μM 공극 크기의 여과기를 통하여 여과하고, 정제전에 4℃ 에서 유리하였다. 수거 용량과 빈도는 25ml 로부터 배야의 시작에서부터 주당 세번씩 점차로 증가하여 40ml이 되게하고 2-3개월 후에는 주당 다섯번씩 증가하였다. sCR1의 생산을 CR1 ELISA를 검사하였다. 배양 후 첫째달에 클론2와 클론35의 수율은 각각 66μg/일이었다. 이러한 수율은 배양물이 형성되면서 증가하였다.
12.1.1. 혈청이 없는 배지에서의 sCR1의 생산
두가지의 시판되는 혈청-없는 배지를 sCR1의 세포성장의 지지와 생산의 능력의 시험을 교회 T75 플라스크에 들어있는 pBSCRlc/pTCSgpt 클론 35 을 두개의 T75 플라스크로 분할하였다. 하나의 플라스크는 10% 태아소의 혈청, L-글루타민, 항생물질 및 500nM 메토트렉세이트로 보충된 알파 MEM로 배양하였다. 다른 플라스크는 5%, 1%, 0.5% 및 알파 MEM+L-글루타민, 항생물질, 500nM 메토트렉세이트+HB CHO 생장보충물(Hnan Biologics, Inc., Alameda, CA)에 태아소의 혈청이 없는 상태로 떼었다. 두개의 플라스크이 세포생장과 sCRl생장수준을 비교하였다. 혈청이 없는 배지에서의 세포의 쟁장은 결코 교회에 도달치 않았다. sCR1의 생산의 수준은 표 VIII에 제시한다. 각 경우에서 sCR1의 생산의 수준은 세포를 10% 태아소의 혈청에서 14일째 발견된 수준은 10% 태아소의 혈청으로 보퉁된 배지에서의 4.2×1010환영/ml에 비교하여 1.4×1010환영/ml이었다.
재조합물에서의 세포 생장과 sCR1 생산은 혈청없는 배지의 제2의 공급원(CH0-1, Ventrex Laboratories, Inc., Portland, ME)를 사용하였다. 이 배지속으로 혈청-생장세포를 주입할 필요가 없기 때문에 세포를 녹여서 혈청-없는 배지에서 직접 배양하였다. 이 배지는 DME-F12 기질과 생장 첨가제로 구성된다. 같은 수의 세포를 녹여서 24웰판에도 별도의 웰에 파종하였다. 세포를 부착시킨 후에 배지를 버리고 10% 태아소의 혈청을 포함하는 배지나 또는 혈청이 없는 배지를 적절한 웰에 첨가하였다. 각 조건은 이중으로 실시하였다. 앞에서 시험한 혈청-없는 배지 CHO-1와는 달리 Ventrex Laboratories 배지는 태아소의 혈청을 포함하는 배지로서 실시한 것과 유사한 수준의 세포생장을 수득하였다.
12.1.2. 결론
위에서 거론한 결론으로 sCR1을 생성시키는 CHO 세포가 한정된 혈청-없는 배지에서 유지될 수 있음을 나타낸다. 이것으로 대단위 생산시설에서 배양배지의 비용을 절감케한다. 더우기 세포배양 상청액으로부터의 sCR1의 정제가 간단해지고 이는 태아소의 단백질을 제거할 필요가 없기 때문이라는 장점이다.
12.2. 가용성 CR1의 정제
특이성 항-CR1 항체의 출현으로 정제된 CR1을 생성하는데 필요한 많은 염색체 단계를 간략화한 2단계 방법으로 대체가 가능케 되었다. 이것으로 수득할 수 있는 CR1로 증가시켰다(Wong, W,W., et al., 1985, J. Immunol. Methods 82:303-313). 그러나, 보고된 정제가 CR1의 막-결합된 형태이기 때문에 항상 세제에서 CR1 포함물질 용해시키는 것이 필요하다.
재조합 트란스펙트물로 생성된 CR1이 정제를 목적으로 세제로서 용해시킬 필요가 없다; 이것은 이미 용해되어었다. 비록 가용성 CR1을 항-CR1 항체 크로마토그래피(다음 참조)로서 정제가 가능하기 때문에 이 방법은 대규모 생산에 그 자체로서 용이치가 않다. 대량생산의 규모는 항체정제의 칼럼의 항체기질을 준비하기 위하여 얻을 수 있는 항-CR1 항체의 양으로 제한을 받는다. 또한 CR1에 대한 YZ-1과 같은 항체의 고결합 친화력은 예컨대 pH 12.2와 같은 오히려 가혹한 조건을 항체기질로부터 결합된 sCR1 생성물을 제거하는데 사용해야 한다는 것을 의미한다.(Wong, W.W., et al., 1985 J. Immunol. Methods 82:303-313).
가용성 CR1의 대량정제의 용량을 얻기 위하여 HPLC 칼럼을 포함하는 정제방법이 개발되었다. 이러한 HPLC 칼럼은 정제된 가용성 CR1의 대량생산이될 정도로 용이하게 대형화 할수가 있다. 또한 이들은 sCR1의 용출과 희수를 목적으로 가혹한 조건을 필요로 하지 않는다.
12.2.1. 항체 친화력 칼럭 정제
12.2.1.1. 방법
sCR1항체 친화력 정제를 위하여 100mg의 단일클론의 항체 YZ-1을 제작자의 지시에 따라서 7mg의 AffiGel-10(BioRad, Richmond, CA)에 공유결합시켰다. 세포배양물로부터의 CR1 함유상청액을 플라스크 진동에서 4℃로 밤새껏 고정된 YZ-1로서 배양하였다. 이 물질을 유리칼럼에 쏟고, 10mM Hepes, 0.1M NaCl, pH 7로서 완전하게 세척하였다. sCR1을 20mM 인산나트륨, 0.7M NaCl, pH 12를 사용하여 용출시켰다(Yoon, S.H. and Fearon, D.T., 1985, J. Immunol. 134:3332-3338). 용출된 분설을 Biorad 단백질 검사법을 사용하여 단백질의 유무 시험을 하였다(BioRad, Richmonk, CA). 단백질을 포함하는 시료를 즉시 혼주하고 0.1M Hepes pH 7에서 4℃로 밤새껏 투석하였다.(2×1 ).
다음에 이 시료를 PBS 에서 투석하였다. sCR1의 존재는 CR1 ELISA로 분석하였다.
12.2.1.2. 결과
트란스펙트롤 pBSCRlc/pTCSgpt 클론2에 의해서 생성된 sCR1 을 포함하는 세포배양물 상청액을 항-CR1 항체 친화력 칼럼에 채우고 피크 sCR1 분설은 혼주하였다. 이러한 정제한 물질의 분취량을 4-20% SDS-PAGE 겔에서 실시하였다(DAIICHI; Inc., polyacrylamide gels; modified procedure of Laemmli, U.K., 1975, Nature 227:680-685). 또한 이러한 정제된 CR1은 보체-매개된 용혈작용은 물론 C5a와 C3a 생성을 억제하는 능력으로 활성이 있는 것으로 나타났다(다음의 13항 참조)
12.2.2. HPLC에 의한 CR1 정제
12.2.2.1. 방법
12.2.2.1.1. 출발물질
배양물을 처음에 생체반응기에서 형성시켰을 때 sCR1 생성의 수준은 배양물을 수개월동안 생장시켰을 때 보다 더 잦은 수준이었다. 일반적으로 생체반응기에의 세포가 합류에 도달하여 최대수준의 sCR1을 생성하기전에 수주일의 기간이 걸린다. 낮은 수준의 sCRlDMF 가지는 세포배양물 상청액을 농축시키고 다음에 황산암모늄 침전에 의하거나 또는 한외여과에 의하여 정제한다. 60 내지 80% 포화이상의 상청액의 황상암모늄유분이 필수적인 등가수율로서 sCRL을 침전시켰다. 이 침전물을 최소 용량으로 용해시키고 양이온 교환 HPLC를 위하여 출발완충액으로 투석하였다. 또한 CHO 세포배양물 상청액을 한외여과로서 농축시키고 양이온 교환 크로마토그래피를 목적으로 출발완충액에 투석하였다.
생체반응기가 고농도의 가용성 sCRl을 생성하였기 때문에 이러한 배양물로부터의 CHO 세포의 배양상청액은 양이온 교환 크로마토그래피를 위하여 출발완충용액속으로 직접 투석할 수 있었다.
12.2.2.1.2. 양이온 교환 HPLC 방법
시료를 출발완충액(0.02M 인산나트륨, 0.06N 염화암모늄, pH 7.0)에 투석하고 다음에 0.2μm 여과기를 통하여 여과하여 어떤 입자 물질을 제거하였다. 다음에 이 시료를 양이온 교환 고압 액체 크로마토그래피칼럼(10cm×10mm, Hydropore-SCX HPLC column from Rainin)에 채웠다. 이 칼럼을 세척하고 0.02M 인산염, 0.5N NaCl, pH 7.0을 사용하여 나타낸 염화나트륨 경사로 용출시켰다.
sCR1은 0.06N와 0.25N NaCl 사이의 어딘가에 용출되었다. 용출은 280nm 에서 흡수시키고 ELISA 로 분석하였다.
12.2.2.1.3. 음이온 교환 HPLC 방법
만일 필요하면 양이온 HPLC 정제된 sCRl의 초가정제를 음이온 HPLC로서 수득할 수 있었다. 양이온 HPLC로부터의 피크분설을 음이온 HPLC에 대한 출발완충액에 투석하였다. 시료를 채우고 칼럼(Hydropore-AX form Rainin)을 0.01M 인산염 pH 7.5에서 세척하였다. 이 칼럼을 일련의 단계와 0.01M 인산염 pH 7.5를 사용하여나타나는 경사로서 용출시켰다. 이 sCRl은 0.0N과 0.3N NaCl 사이의 어디서 용출되었다. 용출은 양이온 교환 HPLC에 대한 앞의 것과 같이 탐지하였다. 양이온과 음이온의 HPLC칼럼완충액의 농도와 pH는 실시예에서처럼 제시한다. 다른 완충액용도, 염조건 또는 pH 조건도 또한 작용한다.
12.2.2.1.4. 웨스턴 블롯 분석
웨스턴 블롯팅은 Towbin, H., et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:4350-4354로부터의 수식된 방법을 사용하여 실시하였다. 간략히 설명하면 정제된 sCRl을 4-20% SDS-PAGE에서 실시하고 니트로셀룰로오스에 옮기고 특이하게 항-CR1(쥐의 mAb YZ-1 또는 J3D3)으로 탐침하고, 알칼리 인산염으로 콘쥬게이트된 염소 항-쥐 항체로서 검출하였다.
12.2.2.2. 결과
대표적인 실시에 대해서 생물반응기 배양물에서 취한 50-100ml의 상청액을 출발 완충액에 투석하고 10cm×10mm 양이온 교환 HPLC에 채웠다. 피크 유분을 ELISA와 280nm에서의 흡수로 측정하고 혼주하였다. 혼주의 단백질 농도를 280nmDPTJ 흡수시켜 측정하였다(∈ (1%) 280nm=10, CR1 아미노산 조성으로 측정하여). 수십 mg을 100ml의 증폭시킨 배양물 상청액에서 정제하였다.
하나의 실시예로서 트란스펙트된 pBSCRlc/pTCSgpt 클론2로부터의 배양물상청액 100mlfhtj 양이온 HPLC 로서 정제하였을때(제24도) 280nmFH 흡수하여 측정하여 22mg 의 정제한 sCR1를 생성하였다. CR1 ELISA로 감시했을 때 수율은 220%로 계산되었고 흐름-통과 또는 칼럼 세척 유뷴에서는 13% 이었다. 100% 이상의 수율은 아마도 ELISA에서의 메트릭스 효과를 반영하는것 같다.
배양물 상청액을 생물반응기로부터 배출시킬 수 있는 율을 책정할 때, 이정도의 메토트랙세이트 증폭에서 생물반응기당 일주간에 약 100mg의 정제한 가용성 CR1를 생산할 수 있어야 하겠다. 이러한 수준의 생산을 얻도록 대형화 하는 몇가지 방법은 생물반응기에 주입하기전에 최고수준의 메토트랙세이트로 출발배양물을 증폭시키고 일시에 생산하는 생물반응기의 수를 늘리고, 그리고 대용량의 HPLC 칼럼을 사용하는 것을 포함한다.
12.2.2.3. 정제한 가용성 CR1 의 특성화
양이온 HPLC(제24도)로부터의 sCRl포함 피크유뷴을 음이온 HPLC 에서 추가로 정제하였다. 여러단계에서 sCRl 물질의 순도를 SDS-PAGE(제25도)로서 시험하였다. 이렇게 대량으로 채워진 겔에서 보이는 작은 벤드는 항-CR1 단일클론의 항체 YZ1 또는 J3D3를 사용하는 웨스턴 블롯분석으로 측정하여 sCR1의 단편을 나타낸다. 단편 sCR1벤드는 대부분의 제품에서는 보이지 않았다.
정제한 sCR1의 기능적 활성도는 0.25μ/ml 의 정제한 sCR1 농도에서 기본적 보체-매게된 용혈작용을 50%로 억제하는 능력으로 시험하였다. 정제한 가용성 CR1도 또한 5μg/ml에서 기본적 보체 C5a 생산율 50%억제할 수 있었고 13μ/ml에서는 C3a 생산을 50% 억제할 수 있었다(다음의 13항 참조)
12.2.2.4. 결론
위에서 기술한것 같이 본인들은 치료의 용도에 필요한 양의 sCR1 을 생산하도록 용이하게 대형화할 수 있는 가용성 CR1의 정제하는 개량된 방법을 개발하였다. 이 방법의 기본요소는 이미 용해되어서 ㅅ헤제로서 막결합된 CR1을 용해시켜야 하는 필요서을 배제시키는 출발물질을 포함한다. 생물반응기에서의 태아소의 혈청농도의 감소 및/도는 이러한 배양물에서의 다른 배양매체의 사용으로후속적 정제과정중에 sCR1-포함 출발물질로부터 고농도의 외래단백질을 제거하는 필요성을 배제한다. 더우기 정제를 목적으로한 HPLC 방법의 개발로서 대단위 정제방법을 제시한다.
양이온 HPLC이거나 또는 양이온 HPLC와 그다음의 음이온 교환 HPLC와의 결합의 어느것을 정제에 사용할 수 있다. 실질적으로 고수율의 순수한 가용성 CR1을 1 또는 2단계만으로된 이 방법을 성취할 수 있다.
13. 실시예:가용성 CR1의 생체의 활성도의 증명
13.1. 중성호성 산화파열의 억제
심근경색중에 발생된 조직상태의 반사 상해 모델중에서 활성화한 보체성분은 중성호성 접착과 활성화를 유발하였다. 활성화한 중성호성은 고도의 독성 산소라디칼을 발생되는 산화파열을 일으킨다. 이러한 그리고 다른 잠재적 독성은 중성호성 과립감소중에 방출되어서 주위의 조직에 손상을 입힌다. 가용성 CR1는 중성호성 활성화에 관련된 보체성분인 C3a와 C5a의 발생을 방지하여 손상된 조직의 면적을 감소시킨다.
생체외에서의 보체　성화중에 C5a의 발생을 차단하는 가용성 CR1의 능력을 감시하기 위하여 C5a 유발된 산소 파열증의 중성호성으로 생성된 산소 라디칼의 발생을 정량화할 수 있는 생체검사법을 사용하였다(Bass, D.A., et al., 1983, J. Immunol. 130:1920-1927). dl 검사법은 세포에 들어가서 포획되고 산화시에 고도로 형광이 되는 지질가용성 분자인 디아트산디클로로플로리신(DCFDA)를 사용한다.
13.1.1. 물질과 방법
13.1.1.1. 물질
신선한 전체의 혈액, 사람 보체 공급원(Beth Israel Hospital, boston, MA), 건조한 Baker의 효모, 0.1% 겔라틴과 5mM 포도당이 있는 PBS 100mM EDTA, BGSS(Kodak)에든 10mM DCFDA 적혈세포(RBC) 분해완충액(Ortho Diagnostics), 정제한 C5a(Sigma Chmical Co., St., Louis, MO) 및 가용성 CR1을 사용하였다.
13.1.1.2. 중성호성의 제조
중성호성은 Bass가 기술한것 같이 제조하였다(1983, J. Immunol. 130:1910-1917). 2.0ml의 전체 혈액을 PBS-겔라틴-포도당에서 세번 세척하고 HBSS에든 10μM DCFDA의 5ml의 PBS-겔라틴-포도당에서 재현탁시키고 37℃에서 15분간 배양하였다. 다음에 세포를 원심분리하고 2.0ml의 PBS-겔라틴-포도당과 5mM EDTA 에 재현탁 시켰다.
13.1.1.3. 효모입자의 제조
건조한 baker의 효모를 H2O에서 재현탁하고, 두번 세척하고, 30분간 비등하였다. 입자를 H20에서 두번 다시 세척하고 H2O에도 0.5g/ml에서 재현탁하였다(Simpson, P.J., et al., supra).
13.1.1.4. 정제한 C5a에 의한 중성호성의 활성화
10μl의 DCFDA-충전된 세포를 RBC 분해 완충액으로 처리하고, PBS-겔라틴-포도당-EDTA에서 한번 세척하고 1.0ml의 PBS-겔라틴-포도당에서 재현탁시켰다. 200ng/ml에서의 정제된 C5a의 50μl 또는 기준을 0.5ml의 표적세포에 37℃ 에서 첨가하고 흐름혈구계산기에서 여러간격으로 분석하였다.
13.1.1.5. 사람혈청이나 플라스마에서 정제한 C5a에 의한 중성소성의 활성화
100μl의 DCFDA-충전된 세포를 사람혈청이나 헤파린화한 플라스마(100ng/ml)에서 1:1로 희석된 C5a 또는 기준 50μl 로서 37℃에서 30분간 배양하였다. 이 RBC를 분해하고, 중성모성을 흐름혈구계산기에서 분석하였다.
13.1.1.6. 효모입자-활성화한 사람혈청이나 플라스마에 의한 호중구의 활성화
425μl의 새로 냉동시킨 혈청과 플라스마와 50μl의 sCR1이나 기준을 25μl의 효모입자로서 37℃ 에서 30분간 배양하였다. 보체-활성화된 그리고 기준시료를 원심분리하여 효모입자를 제거하였다. 이렇나 시료의 각각의 2배의 희석물 열개를 PBS-겔라틴-포도당-EDTA에서 실시하였다. 기준 그리고 활성호된 혈청과 플라스마의 각각의 첨가하고 37℃에서 30분간 배양하였다. 다음에 이 RBC를 용해시켜내고 중성구를 흐름 혈구계산기에서 분석하였다.
13.1.2. 결과
13.1.2.1. C5a는 DCFDA를 사용하여 측정할 수 있는 사람 중성구에서의 산소 파열을 유발한다
제26도는 정제한 C5a로 자극시킨 후에 사람 중성구의 형광강도의 급속한 증가를 나타낸다. C5a(20ng/ml의 최종농도로)를 첨가한 후에 4분내에 중성구는 기준 DCFDA-충전된 중성구 보다 10배나 더 밝았다. 20분까지 중성구는 기준의 20배나 더 밝았다. 이 검사로서 C5a의 민감성의 지시가 되는 것으로 보인다.
13.1.2.2. 사람혈청은 중성구에서의 정제된 C5a의 산소파열효과를 차단한다
형광 강도의 증가가 DCFDA 로 충전된 중성구에서 관찰되지 않았으며 사람혈청에서 희석된 정제 C5a로 배양하였다. 이 효과는 혈병중에 소판으로부터 배출된 소판 유발된 생장인자(PDGF) 때문인것으로 보인다. 낮은 수준의 PDGF가 C5a-유도된 중성구 활서화를 억제할 수 있음을 나타내었다(Wilson, E., et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:2213-2217).
13.1.2.3. 헤파린화한 플라스마든 중성구에서의 C5a의 효과를 차단하지 않는다
헤파린화한 플라스에서 1:1로 희석된 C5a는 DCFDA 충진된 중성구 에서 산소파열을 유발하였다. 비록 완충액에서의 C5a처럼 극적이진 않지만 중성구로 배양한 30분후에 형광강도에서 10배의 증가가 있었다. 감소된 신호는 정맥절개나 플라스마 단리중에 PDGF 배출에 의해 기인될 수도 있다. 혈액의 세포성분으로부터의 플라스마의보다 완만하고 급속한 단리로서 PDGF의 배출을 최소화 하고 C5a 기능을 보다 좋게하다.
13.1.2.4. 보체 활성화중에 존재하는 sCR1는 C5a 발생을 차단한다.
가용성 CR1의 존재하의 사람보체의 지몬산의 유발된 활성화는 DCFDA 검사법으로 측정하여 감소된 C5a 활성도를 나타내었다. 제27도에서 볼수 있는 것같이 sCR1의 존재하에 활성화된 사람 플라스마의 1:16 희석은 sCR1이 없이 활성화된 1:16의 희석 플라스마에서 보다 중성구에서 70% 적은 형광강도 증가를 발생시켰다. 이것으로 sCR1으로 발생된 C5a 억제를 의미한다.
DCFDA 검사법과 플라스마 수거의 추가적 최적화는 가용성 CR1활성도에 보다 동적이고 민감성인 검사법이 되어야 한다.
13.2. 보체 매개된 용혈작용의 억제
13.2.1. 방법
보체를 억제하는 능력은 보체-매개된 적색세포용해(용혈작용)의 억제에 대한 검사법으로 시험하였다. 용혈작용의 억제는 가용성 CR1 농도의 함수로서 측정하였다. 시험할 sCR1 시료는 0.1M Hepes 완충액(0.15N NaCl, pH 7.4)에 희석하고 50μl 를 V-형태 바닥의 미량적정 평판의 각웰에 대표적으로 세번 반복하는 식으로 첨가하였다. 다음에 시판되는 항-양 항체를 가진 양의 적혈구(Diamedix Cat, No. 789-002)를 수령한 상태로 사용하고
100μ1/웰에 첨가하여 용혈작용에 이르는 보체통로를 개시하였다. 이 평판을 37℃ 에서 60분간 배양하고 다음에 500xg으로 10분간 원심분리하였다. 상청액을 제거하고 바닥이 편평한 미량적정 평판에 옮긴다. 용혈작용의 정도는 410nm에서의 시료흡수의 함수로서 측정하였다. 최대흡수(최대 용혈작용에 따른), A max 는 사람혈청만을 포함하는 적혈구시료의 흡수As로부터 적색세포만을 포함하는 시료의흡수,AO를 빼서 수득하였다. 이와 같이Amax =AS -AO 가 된다. 사람혈청과 sCR1의 두가지 모두를 포함하는 적혈구시료의 흡수와 sCR1 만을 포함하는 세포시료의 흡수간의 차이는 A sample 로서 정의한다. 엊게 IH는 함수(Amax-Asample/Amax) 로서 정의하고, IH50은 IH = 1/2의 값을 얻는데 소요되는 sCR1의 농도로서 정의한다. 크로마토그래피 유분을 추적하기 위하여 혈청이 없는 기준을 포함시키지 않고 항-보체 활성도를 시료의 410nm에서 흡수에서의 감소와 같게 정성적으로 추적하였다.
위에서 기술한 용혈작용 검사는 또한 기니아 돼지와 쥐와 같은 다른 종으로부터의 보체에 의한 양의 적색세포 용해의억제에 대한 사람 재조합 sCR1의 능력을 검사하는데 사용하였다. 각각의 종에 대해서 새로이-냉동시킨 혈청이나 새로이 동결건조시킨 혈청이나 플라스마를 보체원으로서 사용하였다. 몇몇경우에 혈청은 구입하였다(Sigma Chemical Company, St. Louis, MO).
혈청은 처음에 활성화한 적색세포를 용해시키는 이의 능력을 적정하였다. 최소한 80%의 최대 적색세포 용해를 얻은 최대의 희석은 첨가한 사람 sCR1의 효과를 검사하도록 선택하였다. 다음에 사람혈청에 대해서 바람직한 희석으로 동물로 대체하여 위에서 기술한것 같이 실시하였다.
13.2.2. 결과
제28도에서 나타낸것 같이 정제한 sCR1은 0.12μg/ml의 sCR1농도에서 기본적으로 보체-매개된 용해를 50%로 억제하였다. 항체 친화력 정제된 sCR1의 용혈작용 검사에 대한 억제력을 정제치 않은 물질(세포배양물 상청액을 포함하는 sCR1)의 그것에 비교하였다. 정제한 sCR1은 정제안된 sCR1의 그것에 비교할만한 활성도를 가졌는데 이들은 모두 1.6x108환영/ml에서의 용혈작용 검사에 50%억제를 나타내었다. 이것으로 정제방법이 sCR1 생성물의 기능적 활성도를 실질적으로 감소시키지 않음을 나타낸다.
정제된 sCR1의 냉동저장 가능성을 확인하기 위하여 분취량을 -70℃에서 일주일간 저장하였다. 냉동한 sCR1의 농도는 280nm에서의 흡수와 CR1 ELISA로 측정하여 냉동안된 sCR1의 그것과 같았다. 또한 냉동된 sCR1는 용혈작용의 억제로서 측정하여 냉동안된 sCR1과 같은 활성도를 가졌다.
여러가지 종으로부터의 보체로 매개된 용혈작용을 억제하는 사람 재조합 sCR1의 능력은 표IX에 요약한다.
기니아 돼지와 쥐의 보체는 모두가 사람 sCR1에 의해서 억제되는 것으로 나타났다. 다른종에 대한 분명한 억제력의 결핍은 다음을 반영한다. (a) 검사시스템에서 토끼항체와 양의 적혈구를 사용함을 부적절하고 또는 (b)이 시스템에서 용혈작용에 대해 소요되는 혈청의 고농도.
13.3. C3a와 C5a 생성의 억제
13.3.1. 방법
보체를 억제하는 능력도 또한 C3a와 C5a 생성의 특이성 억제의 검사로서 시험하였다. 모든 실험에 대해서 보체원으로서 사용할 단일의 사람혈청 혼주를 분취하고 -70℃에서 냉동시켜서 저장하엿다. 사람 IgG를 열-응집시키고 분취하고, -70℃에서 냉동 저장하였다. 각 실험에 대해서 혈청 분취량을 시험할 sCR1의 농도를 변화시켜면서 37℃에서 평형화 하였다. 보체통로를 응집된 사람 IgG를 첨가하여 개하였다. IgG를 포함하지 않는 기준 시료를 항상 포함시켰다. 15분의 고정반응시간후에(C5a 또는 C3a)의 생성이 예컨대 90%이상으로 거의 완벽하게 되는 중의 편리한 기간을 제공하도록 이른 시간-과정 연구에서 측정하여), 방출된 보체 펩티드(C5a 또는 C3a)의 수준은 구입한 방사선 면역검사(RIA) 키트(C5a RIA, Amersham cat no. RPA.520; C3a RIA Amersham Cat. No. RPA.518)를 변형한 방법으로 사용하는 방사선 면역검사법으로 측정하였다.
경쟁력 있는 면역검사법을 사용했기 때문에 보체펩티드(C5a 와 C3a)의 농도는 계수에 반비례하였다. 시료에 대해 결합된 계수(CB)는 펠릿에서 측정된 전체계수(분당계수, cpm)로서 정의하였다.
제29도에서 Y-축은 분육억제를 나타낸다. 이 억제분율은 시료에 대한 결합계수(CB)에서 sCR1이 있는 시료의 결합 계수(CB)를 뺀것을 IgG 없는 기준에 대한 결합계수(CB)에서 sCR1이 없는 시료에 대한 결합계수(CB)를 뺀것으로서 나눈 값이 된다.
Figure kpo00001
13.3.2. 결과
정제한 sCR1의 활성도는 활성화한 사람 혈청시료에서의 C5a와 C3a 생성을 억제하는 능력을 시험하여 검사하였다.
제29도에서 나타낸것 같이 시험한 조건에서 정제한 sCR1는 C5a의 생산을 100% 최대로 억제하고 C3a의 생산을 60% 억제할 수 있었다. 50% 억제에서 C5a 생산에 대해서는 5μg/ml의 sCR1 농도가 그리고 C3a 생산에 대해서는 15-20μg/ml의 sCR1 농도가 관찰되었다. 이 대이타로서 재조합 sCR1이 C3 전환효소 보다 C5 전환효소를 더욱 효과적으로 억제하는 것을 제시한다.
14. 실시예: 가용성 CR1의 생체내의 기능적 치료활성도의 증명
아류투스 반응은 순환에서 항체와 반응하는 항원을 국소적으로 주사하여 유발된 염증응답으로 면역학적으로 유발된 기초이다. 주요 생물학적 응답은 면역복합체 석출, 복합체 고정, 다형태핵(PMN) 임파구침윤, 리소솜 효소의 방출, 맥관활성아민, 및 국소적 조직 손상으로 특징지운다(Uriuhura, T. and Movat, H.Z., 1966, Exp. Mol. Pathol. 5:539-558; Cochrane C.G., 1968, Adv. Immunol. 9:97-162). 역수동 아류투스반응(RPAR)인 직접 아류투스 반응의 수식은 항-염증제의 확인모델로서 사용하였다(Pflum, L.R. and Graeme, M.L., 1979, Agents and Actions 9:184-189). RPAR 에서 항체를 국소적으로 주사하고 항원은 혈액에 존재한다.
쥐의 RPAR 모델에서 시험했을 때 가용성 CR1s 는 국소적 염증 반응을 차단할 수 있었다. 생체내에서의 이러한 가용성 CR1 의 기능의 작용메카니즘은 보체통로 효소의 억제를 통하여 매개할 수도 있다.
14.1.1. 물질과 방법
무게가 약 100-125g이 되는 암컷의 5주된 Sprague Dawley쥐(CD Laboratories, Wilmington, MA)를 0.1 내지 0.3ml의 아베르틴 용액을 복강내 주사하여 마취시켰다. 이 용액을 15ml의 아멜 에탄올에 1g의 트리브로모에탄올로 만든 저장용액의 1:2 희석이다. 동물의 등의 털을 깎고 다음에 꼬리를 덥혔는데 첫번째는 더운물로 하고 다음에는 가열램프로 하였다. 1ml의 주사기를 사용하여 0.15M 인산염 완충액 식염수(PBS)에 5mg/ml로 놓는 오브알브민(Calbiochem Corp., San Diego, CA)의 0.35ml를 정맥내를 통해 꼬리의 끝에서 약 1-2인치 되는 곳의 꼬리 정맥에서 정맥내 주사하였다. 5분후에 쥐를 4mg/ml의 항체적정을 가지는 항-오바알부민항체(Organon Teknika Corp., Cappel Division, West Chester, PA)의 20mg/ml 토끼 Ig 분설의 0.08ml로서 또는 20mg/ml 토끼 IgG(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)의 0.08ml로 또는 PBS로서 피내 주사하였다. 각 주사는 이중으로 실시하고 주사부위는 표식편으로 둥근표시를 하였다. 다음에 쥐를 1,4 및 18시간 추적하였다. 24시간 후에 쥐를 얼음속에 3분간 잠겨서 죽었다. 피부시료는 주사위치로부터 해부하였다. 두개의 시료중 하나를 파라핀 봉매하기 위하여 10% 포르말린에 고정시키고 다른하나는 저온조 부분에서 냉동시켰다. 조직 부분을 제조하고 헤마톡실린과 에오신으로 착색하였다.
14.1.2. 결과
항-오브알부민 항체를 피하주사한 3 내l 5시간 후에 약한 RPAR반응(예컨대 부종과 홍반)이 보이기 시작했다. 반응의 강도는 24시간 후에(제30b도) 반응의 크기가 3-5mm 직경이될 때까지 점차로 증가하였다. 비-면역 토끼 IgG 또는 PBs만을 주사한 곳에는 쥐의 피부에 반응이 관찰되지 않았다.
병변 부위로부터 제조된 조직 생성물의 현미경 시험에서 많은 급성 염증세포가 외피에서 보였고 특히 혈관 주위에 보였다(제31b도). 이것은 대표적으로는 맥관염과 혈관주위염으로서 인식된다. 이 조직은 혈관의 바깥의 RMN의 과잉침투, 연결조직의 적혈구의 존재 그리고 교원질 섬유의 소성을 가진 대포적인 염증상태를 나타내었다.
14.1.3. 가용성 CR1의 피내 투여의 효과
정제한 sCR1의 혼합물을 40μ1의 0.75mg/ml sCR1과 동일용적의 항-오브알브민 혼합물이나 또는 정상 토끼 IgG나 PBS를 포함하도록 제조하였다. sCR1:항-오브알브민 홉합물이나 또는 sCR1:토끼 IgG 혼합물 또는 sCR1:PBS 혼합물을 오브알브민 프라임한 쥐에 피내 또는 정맥내로 주사하였다. sCR1과 항-오브알브민 항체를 받은 주사부위(제30a도)에서 겨우 보이는 병변이 나타났다. 기대했던것 같이 sCR1:토끼 IgG 또는 sCR1:PBS 를 받은 주사 부위에는 병변이 나타나지 않았다. sCR1:항-오브알브민 주사를 맞은 부위를 에워싸는 조직의 부분을 현미경으로 검사하고, RMN과 단핵세포의 집락이 세정맥 주위에서 발견할 수 있었지만 RMN의 과잉침투과 적혈구의 일혈이 없었다(제31a도). 이러한 데이타는 가용성 CR1 투여로 내피성식 세포의 손상의 억제와 염증반응의 억제를 일으키지 않았음을 나타낸다.
위의 아브알부민 쥐의 모델에서 RPAR 를 차단하는데 소요되는 sCR1의 최소 유효 투여량을 측정하기 위하여 0.75mg/ml sCR1 접본의 10배의 계열희석물(깨끗하고 1/10, 1/100, 1/1,000 및 1/10,000)을 시험하였다. 각 sCR1 희석물은 작은 용적의 깨끗하거나 또는 항-오브알부민 항체의 1/2 희석물로 혼합하였다. 각 부위를 총량 80μ1로 주사하였다. sCR1의 RPAR의 억제 능력은 투여량의 존성이 있으며 복종의 효과적 감소가 부위당 300ng 에서 관찰되었다(표 X).
14.2. 생체내 투여된 sCR1의 약물동태학
생체내의 sCR1의 생물학적 반감기는 다음과 같이 측정하였다. 나이(6주)와 체중(110-125g)이 유사한 쥐를 0.35ml에 탄 250μg의 sCR1을 용해시킨 것을 정맥내로 주사하였다. 주사후 2분후에 5분, 10분, 60분 및 24시간에 쥐를 죽이고 혈액을 정맥 대정맥 전자로부터 수득하였다. 각 쥐에서 1-2ml의 혈청을 10분간 1800rpm으로 원심분리하여 수득하고 각 시료에든 sCR1의 량을 CR1 ELISA로 측정하였다. 기준 쥐혈청이나 또는 헤모글로빈이 없는 적혈구 환영(1.6x108환영/ml)의 세제 용해물 속으로 극파한 정제 sCR1의 1μg/ml의 2배 희석물을 CR1 표준으로서 사용하였다. 결과는 표XIdp 표시한다.
이러한 데이타는 sCR1이 정맥내 주사 후 24시간에 검출될 수 있음을 나타낸다. 24시간에서 혈청의 sCR1의 농도는 주사후 10분에 관찰하여 피크의 50%가 되었다.
14.3. sCR1은 리퍼퓨즈(reperfused)되고 경색된 심근을 가진 쥐의 경색 부위를 감소시킨다.
여기서 기술한것 같이 생체외에서 보체통로 C3/C5 전환효소의 활성도를 억제할 수 있는 sCR1은 생체내의 쥐의 심근 경색 모델에서 리퍼퓨전 상해의 정도를 감소시킬 수 있다.
심근경색은 관상의 결찰에 의해서 쥐에 유발될 수 있다. 만일 심근경색 후 처음 수시간내에 형성되면 리퍼퓨전은 경색크기를 감소시키고 좌심실의 기능을 향상시키고 사망율을 감소시키는 것으로 나타났다(Braunwald, E. and Kloner, R.A. 1985, J. Clin. Invest. 76:1713-1719). 그러나 심한 국소빈혈이지만 비가역 상해가 아닌 심근층에 대한 리퍼퓨전은 그자체가 생성될 수 있고 상해를 연장시킬 수 있다. 리퍼퓨전-유발된 상해의 원인이 되는 메카니즘은 무산소 라디칼과 세포성 칼슘 과로로 매개된 상해를 포함한다. 단독으로나 또는 미세맥관 내피세포와 함께 작용하는 백혈구가 이 상해의 원인이 될 수도 있다. 보체활성화는 이 방법에 포함될 수도 있다(Rossen, R.D., et al., 1985, Cir. Res. 57:119-130; Crawford, M.H., et al., 1988, Circulation 78:1449-1458).
14.3.1. 방법
14.3.1. 쥐의 심근경색의 유발
200 내지 250g의 무게가 나가는 쥐(n=14)에 매톡시풀루란을 흡입시켜 마취시키고 우측 경정맥을 절단하고 카눌레 삽입하였다. 절반(n=7)은 카뉼라를 통하여 sCR1 2ml(1mg)를 받고, 나머지 절반은 유사하게 제조되고 투여되는 2ml 식염 위약을 받았다. 이 동물의 경정맥 카눌라를 제거하고 경정맥을 묶고 부위를 폐쇄하였다. 다음에 좌측 개흉술은 5 내지 6의 늑간공간에서 실시하고 한편으로 95%의 산소와 %%의 이산화탄소로서 간헐적 정압 통기를 실시하였다. 다음에 심낭 절개술을 실시하고 좌측 관상동맥을 기부대동맥의 2-3mm 이내에서 봉밥 결찰로 폐색시켰다. 이러한 관산 결찰의 효과는 전방의 벽투과 경색에 대한 위험할 정도의 큰 영역을 만드는 것이다. 이 쥐를 마취상태에서 가슴을 일시적으로 폐쇄하였다. 봉합 35분후에 가슴을 가시열고 결찰물을 방출시켰다. 이러한 시간간격은 위험 영역의 중요한 부분을 크게 구조되도록 선택한다. 다음에 개흉술은 영구식으로 닫고, 동물이 마취에서 깨어나게 하는데 통상적으로 수술 후 5 내지 10분이내가 된다. 100,000 단위의 벤조아틴 페닐실린G와 0.25mg/kg의 황산모르핀을 근육내로 투여하였다. 이 동물을 일주일간 물과 표준 쥐먹을 주고 다음에 헤파린화와 메톡시플루란으로 마취시킨후 심장절개하여 죽였다.
14.3.1.2. 실험적 경색의 형태학 분석:연구목적의 심장제작
심장 절개후에 대동맥을 급히 캐뉼러하고 첫번째로 Krebs Henseleit 용액으로 관동맥을 관류시켜 심장의 피와 덩어리를 깨끗이 하고 다음에 심장이완성 심장제동을 위하여 30m KCl로 환류 시켰다. 이 심장을 맥과내 관류와 10% 완충액 포르말린에 함침시켜 고정시켰다. 충진압력을 적절히 조절하기 위하여 심장을 플라스틱 튜브로서 심장의 승모판을 통하여 배기하였다. 고정후에 심장을 바닥에서 정상까지 2mm부분으로된 방실계 요홈에 평행으로 세로방향으로 얇게 자르고 조직학적 부분을 만들었다.
14.3.2. 결과
생존은 두 그룹에서 모두 같았는데 예를 들면 6/7 쥐가 7일간 살아서 분석하였다. 조직학적 슬라이드를 육안검사하여 6마리의 위약-처리한 쥐중에서 5마리가 큰 벽투과 심근경색을 가졌다(전체 좌심실 물질의 최소한 15%로 추정됨). 살아있는 sCR1-처리한 동물중 단지 1/6만이 이러한 큰 벽투과 경색을 가지는 것으로 발견되었다. 다른 sCR1-처리한 동물은 좌심설 물질의 훨씬 소량을 포함하는 작은 조각의 경색을 가졌다(15%이하). 실제로 이들의 대부분은 현미경으로만 검출이 가능하였으며 반면에 위약-처리한 쥐의 경색은 육안검사로도 분명하였다.
14.3.3. 결론
이 결과로서 sCR1 처리가 생체내에서의 재관류 상해의 감소에 효과가 있는 그리고 심근경색의 효과를 개선하는데 효능이 있음을 나타낸다. 재관류 상해를 개선할 수 있을 정도까지 살아있는 심근층의 절대량을 증가시킬 수 있고 재관류가 치료상 유용한 시간창 (time window)을 연장할 수 있다. sCR1에 의한 치료는 금성 경색증에 혈정붕괴나 기구관상 혈관형성에 의한 유용한 부수적 치료가 되어야 한다.
15. 미생물의 기탁
플라스미드 piABCD(pCR1-piABCE 를 지칭함)를 수반하고 전체길이의 CR1 단백질을 인코딩하는 대장균 균주 DK1/P3 를 1988년 3월 31일에 NRRL, Peoria, Illinois에 기탁하고 기탁번호 제 B-18355호를 수령하였다.
플라스미드 pBSCR1c/pTCSgpt 클론 35.6을 수반하고 가용성 CR1 분자를 인코딩하는 중극 햄스터 큰쥐의 난소세포 배양주 DUX Bll을 1989년 3월 23일에 ATCC, Rockville, Maryland에 기탁하고 기탁번호 제 10052호를 수령하였다.

Claims (37)

  1. 제1도에서 누클레오티드 번호 28번부터 6147번까지 나타낸 것과 실질적으로 같은 전체-길이의 CR1 단백질을 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열.
  2. 제1항에 있어서, DNA 서열을 포함하는 핵산서열.
  3. 제1항에 있어서, RNA 서열을 포함하는 핵산서열.
  4. 제1항에 따른 핵산서열을 포함하는 재조합 핵산벡터(Vector).
  5. 제2항의 배열순서를 포함하는 재조합 핵산벡터.
  6. pABCD를 포함하는 재조합 DNA 벡터.
  7. NRRL에 기탁하여 기탁번호 제 B-18355 호를 받은 piABCD를 포함하는 재조합 DNA 벡터
  8. 제1항의 배열순서를 포함하는 재조합 발현 벡터.
  9. 제8항에 있어서, 박테리아에서 핵산서열를 발현시킬 수 있는 발현 벡터
  10. 제8항에 있어서, 인체를 제외한 포유동물세포에서 핵산서열을 발현시킬 수 있는 발현 벡터
  11. 제10항에 있어서, NRRL에 기탁하여 기탁번호 제B-18355 호를 받은 piABCD를 포함하는 발현벡터.
  12. 제1항에 따른 핵산 서열을 포함하는 재조합 세포.
  13. 제4항에 따른 핵산벡터를 포함하는 세포로 구성된 것을 특징으로 하는 재조합 세포.
  14. 제5항에 따른 핵산벡터를 포함하는 세포로 구성된 것을 특징으로 하는 재조합 세포.
  15. 제8항에 따른 핵산벡터를 포함하는 세포로 구성된 것을 특징으로 하는 재조합 세포.
  16. 제10항에 따른 핵산벡터를 포함하는 세포로 구성된 것을 특징으로 하는 재조합 세포.
  17. 제12,13 또는 14항에 있어서 박테리아를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 세포.
  18. NRRL에 기탁번호 기탁번호 제B-18355호를 받은 대장균(Escherichia coli).
  19. 제1도에서 누클레오티드 번호 28 내지 1533 으로 나타낸 것과 실질적으로 같은 배열순서를 포함하는 핵산 서열.
  20. 제19항에 있어서, 투과막 영역이 실질적으로 결핍된 단백질을 인코드하는 핵산 서열.
  21. 제20항에 있어서, 단백질은 이를 발현시키는 세포에 의해서 분비되는 핵산 서열.
  22. 제21항에 있어서, 단백질이 시험관에서의 호중구 산화 파열, 보체-매개된 용혈작용 똔느 C3a와 C5a 생산을 억제하는 능력으로 측정된 기능인 핵산 서열.
  23. 제19항에 있어서, DNA 배열 서열을 포함하는 핵산 서열.
  24. 제19항에 있어서, RNA 배열 서열을 포함하는 핵산 서열.
  25. 제19항에 따른 서열을 포함하는 재조합 핵산벡토 또는 발현벡터.
  26. 제25항에 있어서, pBSCR1c, pBSCR1s, pBM-CR1c, pBSCR1c/pTCSgpt 및 pBSCR1s/pTCSgpt로 구성된 그룹에서 선택된 재조합 발현벡터.
  27. pT-CR1c1, pT-CR1c2, pT-CR1c3, pT-CR1c4 및 pT-CR1c5로 구성된 그룹에서 선택되는 재조합 발현벡터.
  28. ATCC에 기탁하여 기탁번호 제 CRL 10052 호를 받은 플라스미드 pBSCR1c/pTCSgpt를 포함하는 재조합 DNA 벡터.
  29. 제19항에 따른 핵산 서열을 포함하는 재조합 세포.
  30. 제29항에 있어서 박테리아를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 세포.
  31. 제25항에 따른 벡터를 포함하는 세로포 구성된 것을 특징으로 하는 재조합 세포.
  32. ATCC에 기탁하여 기탁번호 제CRL10052호를 qkqe은 플라스미드 pBSCR1c/pTCSgpt를 수반하는 중극의 햄스트(hamster) 큰쥐 난소세포 DUX B11.
  33. 제1도에 나타낸 번호 28 내지 1533의 누쿨레오티드에 의해서 인코드된 것과 실질적으로 같은 아미노산 배열순서를 포함하는 단백질을 인코드하는 핵산 배열순서.
  34. 세포 표면에 제1도에 나타난 것과 실질적으로 같은 아미노산 배열순서를 포함하는 단백질의 단백질을 발현하는 재조합 세포.
  35. 제1도에 나타낸 번호 28 내지 1533 의 누클레오티드에 의해서 인코드된 것과 실질적으로 같은 아미노산 배열순서를 포함하는 단백질을 발현하는 재조합 세포.
  36. 24개 아미노산을 포함하는 제1도에 나타낸 아미노산 서열로 구성된 단백질 단백질의 단편을 발현하는 재조합세포에 있어서, 이 단백질단편이 세포에 의해서 분비되는 것을 특징으로 하는 재조합 세포.
  37. 제29항에 따른 재조합 세포를 생장시키는 것을 포함하는 CR1 분자의 제조 방법.
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