JP4360902B2 - 融合タンパク質 - Google Patents
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Description
のアイソフォームが存在する理由は明らかでない。
99/02552号では、PC−sIL−6Rに連結されたIL−6を含む融合タンパク質が開示されている。
発明の融合タンパク質は、その機能においてH−IL−6とは実質的に異なる。本発明の融合タンパク質およびH−IL−6はともにMCP−1の発現を増大することが見出されているが、本発明の融合タンパク質のみは、MIP−1α、MIP−1β、RANTESおよびIP−10のうちの1つまたはそれ以上の発現を増大する。本発明の融合タンパク質は、その他のケモカイン、例えばMIG(CXCL9)またはITAC(CXCL11)の発現も増大する。
指す。相同性は、好ましくはBLAST解析を用いて確定される。相同体は図3の残基1〜182(配列番号9)との少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは95%の配列相同性を有することがさらに好ましい。好ましくはこのような機能性相同体は、図3の残基1〜182(配列番号9)とは約1〜10アミノ酸が異なっている。
を可能にする配列が挙げられる。例えばC末端の10個のアミノ酸は、上記のように保存的アミノ酸変化により修飾され得る。さらに、図4に示された配列を有するDS−sIL−6R分子を用いた場合に達成される上記のDS−sIL−6R機能性分子の機能を増大する(すなわちMIP−1α、MIP−1β、RANTESまたはIP−10の発現のレベルを増大する)修飾がなされ得る。適切な修飾は、C末端の10個のアミノ酸中のアルギニンの一続きの長さを増大することを包含し得る。その他の適切な修飾は、無作為アミノ酸置換、特にアラニン置換、ならびにC末端の10個のアミノ酸の切断であり得る。このような修飾は、本明細書中に記載された方法を用いて試験され得る。特にRT−PCRは、DS−sIL−6RをコードするcDNAを生成した。このcDNA分子は、GSRRRGSCGL配列またはDS−sIL−6Rの任意のその他の配列を修飾するための鋳型として用いられ得る。この配列を基礎にしたオリゴヌクレオチドプライマーは、近位DS−sIL−6R配列内に新規のコドンを導入するためのPCRアプローチに用いられ得る。これは、発現されるとDS−sIL−6RCOOH末端の連続切断ならびにPC−sIL−6RへのDS−sIL−6R配列の段階的変換を生じるcDNA断片の生成を可能にする。突然変異誘発キット(Stratagene)に向けられるクイックチェンジ(QuickChange)TM部位も、GSRRRGSCGL配列内の個々の残基を修飾するために用いられて、DS−sIL−6R活性の媒介を担うアミノ酸を指摘し得る。すべての変異体がシーケンシングされ、適切なベクター、例えばSF9細胞中でのバキュロウイルス発現のためのpVL1393(Horiuchi, 1998(上記))およびCOS−7細胞中での一過性/安定発現のためのpcDNA−3(Elson et al., 2000, Nature Neuroscience, 3: 867-872)中でクローン化される。DS−sIL−6Rの機能を増大するその他の突然変異も作製され得る。
ましくは少なくとも15倍、最も好ましくは少なくとも25倍、MIP−1α、MIP−1β、RANTESまたはIP−10の発現を増大することが特に好ましい。MIP−1α、MIP−1β、RANTESまたはIP−10の発現の増大は、in vivoまたはin vitroで測定され得る。好ましくは増大は、適切な細胞系で、例えばin vitroで成長されたヒト腹膜中皮細胞(HPMC)で測定される。MIP−1α、MIP−1β、RANTESまたはIP−10における増大を測定するための適切な方法は、本明細書中に開示されている。
たは融合タンパク質の阻害形態の使用も提供する。細胞系におけるシグナル伝達の調整により、シグナル伝達経路に関する情報が得られ、これが、標的化され得る経路の他の部分の同定をもたらして、所望の結果を達成し得る。細胞系は、in vitro細胞系、例えば細胞培養、またはin vivo細胞系、例えば生物体であり得る。
イ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、蝋、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が挙げられるが、これらに限定されない。
試薬
バキュロウイルス発現sIL−6Rアイソフォームを、上記のようにして得た(Horicuhi et al., Immunology 95, 360-369, 1994)。モノクローナル抗IL−6および抗sIL−6R(それぞれmAb−226およびmAb−227)は、R & D systemsから購入
した。抗DS−sIL−6R(mAb−2F3)を、DS−sIL−6Rの特有のCOOH末端配列に対して産生した(Horiuchi et al.,(上記))。
待機腹腔手術を受けている同意患者からの大網組織の連続トリプシン(0.1%w/vトリプシン:0.02%w/vEDTA)消化により、ヒト腹膜中皮細胞(HPMC)を単離した(Topley et al., American. J. Pathology, 142, 1876-1886, 1993)。湿潤5%CO2大気中で37℃で、10%(v/v)ウシ胎児血清、2mMのL−グルタミン、100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、5μg/mlのトランスフェリン、5μg/mlのインスリンおよび0.4μg/mlのヒドロコルチゾン(Life TechnologiesまたはSigma)を含有するアール緩衝化199培地中で、細胞を培養した。実験前に、HPMC単層を成長させ、血清の非存在下で停止させた。これらの条件下で、HPMCは96時間もの間、生育可能および静止状態のままであった(Topley et al., 1993(上記))。血清の非存在下で、第二継代より古くない細胞で、刺激を実施した。
サンドイッチELISA技法を用いて、炎症媒介物質濃度を定量化した。対応抗体対OptEIAキット(Pharmingen, Becton-Dickinson)を用いて、ヒトMCP−1レベルを確定した。適切な対応抗体対(mAb678/NAF278)(R & D Systems)を用いてヒトRANTESを定量化し、一方、アマーシャムバイオトラック(Amersham BIOTRAK)ELISAキットを用いてヒトMIP−1α、MIP−1βおよびエオタキシンを解析した。
既知の転写因子結合モチーフ内に完全プロモーター配列または突然変異を保有するルシフェラーゼ連結RANTESプロモーター構築物を、長崎大学のH. Moriuchi教授から入手した(Moriuchi et al., J. Immunol. 159, 5441-5449, 1997)。簡潔には、10%FCSを含有するM199培地中で、HPMC(1x104細胞/6ウエルマイクロタイタープレート)を、それらが60〜70%の集密に達するまで培養した。単層を洗浄し、個々のルシフェラーゼ連結プロモーター構築物(0.5〜1.0μg)で一晩、細胞をトランスフェクトした。標準リン酸カルシウム沈殿技法を用いて、一過性トランスフェクションを実施した(Graham and van de Eb, Virology, 52, 456-458, 1973)。一旦HPMCを回収したら、実施例4に示したように、細胞を24時間刺激した。細胞溶解物を調製し、市販のルシフェラーゼアッセイキット(Promega)を用いて発光測定によりルシフェラーゼ活性を確定した。
DNA結合タンパク質の抽出のために、迅速技法を用いてHPMCから核抽出物を調製した。簡潔には、氷冷PBS(pH7.4)中に細胞を収集し、遠心分離によりペレット化した。冷緩衝液A(10mMのHEPES−KOH(pH7.9)、1.5mMのMgCl2、0.2mMのEDTA、0.3mMのDTT、0.2mMのPMSF)中に細胞を再懸濁し、氷上でさらに20分間インキュベートした。遠心分離により細胞砕片をペレット化し、必要になるまで上清を−80℃で保存した。
前に記載されたように、EMSAを実施した(Zhang et al., J. Biol. Chem. 272, 30607-30609, 1997)。NF−kB(5’−GATCCATGGGGAATTCCCC−3’&5’−CATGGGGAATTCCCCATGGA−3’)、STAT−3(SIE−m67 5’CGACATTTCCCGTAAATCG−3’&5’−CGACGATTTACGGGAAATG−3’)およびC/EBP(5’GACGTCACATTGCACAATCTTAA−3’&5’−TATTAAGATTGTGCAATGTGACG−3’)結合に関するコンセンサスモチーフを含有するオリゴヌクレオチドを、EMSAで用いるためにアニーリングした。これらの二本鎖断片を、DNAポリメラーゼIのクレノウ断片を用いて[α32P]−dTTPで放射能標識した。核抽出物を標識コンセンサス配列とともにインキュベートし、6%ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動によりDNAタンパク質相互作用を解明した。
CCR5−リガンドの示差的誘導
ヒト腹膜中皮細胞を48時間成長を停止させた後、種々の濃度(0−50ng/ml)のDS−sIL−6R(●)またはPC−sIL−6R(○)を10ng/mlのヒトIL−6と組み合わせて用いて刺激した。一晩インキュベートした後、無細胞上清を収集し、特異的ELISAを用いてケモカイン産生を測定した。値は、4つの個々の実験からの平均±SEMを表す。データは、DS−sIL−6Rが、IL−6の存在下で、CCL3(MIP−1α)、CCL4(MIP−1β)、CCL5(RANTES)およびCXCL10(IP−10)の発現を誘導し、一方、PC−sIL−6Rは影響を及ぼさないことを示す(図6参照)。CCL2(MCP−1)およびCCL11(エオタキシン)の誘導を、それぞれ陽性および陰性対照として示す。
DS−sIL−6R媒介性ケモカイン放出の阻害
30ng/mlのDS−sIL−6Rを10ng/mlのIL−6と組み合わせて用いて、成長停止ヒト腹膜中皮細胞を刺激した(24時間)。ELISAを用いて、CCL2およびCCL5の放出を定量化した。図7Aは、ヒト腹膜中皮細胞を処理前に48時間成長停止したことを示す。10ng/mlのIL−6+20ng/mlのDS−sIL−6Rの存在下(中黒記号)または非存在下(中白記号)で、種々のモノクローナル抗体(0−50μg/ml)を用いて細胞を処理した。MAb206(抗IL−6)で処理した細胞を、中黒正方形として示す。MAb227(抗可溶性IL−6)で処理した細胞を、中黒円形として示す。(DS−sIL−6Rのカルボキシ末端に対する)MAb2F3で処理した細胞を、中黒菱形として示す。馴化培地を24時間後に収集し、ELISAを用いてCCL2/MCP−1およびCCL5/RANTESレベルを定量化した。値は、4つの個々の実験からの平均±SEMを表す。
ケモカイン誘導に関する時間経過
10ng/mlのIL−6の存在下で、50ng/mlのDS−sIL−6R(●)またはPC−sIL−6R(○)で成長停止HPMCを刺激した。比較のために、非刺激細胞を示す(中白矩形)。設定時間間隔で無細胞上清を収集し、CCL2(MCP−1)およびCCL5(RANTES)の放出を測定した。値は、4つの個々の実験からの平均±SEMを表す。データは、CCL2産生がsIL−6Rによる3〜4時間の刺激後に検出可能であるが、CCL5のDS−sIL−6R媒介性放出は、初期刺激後15時間まで観察されないことを示す(図8参照)。これらの所見は、CCL5の発現の調節がCCL2の場合と異なることを示唆する。
ルシフェラーゼレポーターアッセイ
1.4kbのRANTESプロモーター断片(RANTES−1.4)を含有するルシフェラーゼレポーター構築物または既知の転写因子コンセンサス配列内の種々の突然変異(△NF−kB、△STATおよび△NF−IL−6)(Moriuchi et al., 1997 (上記))を、ヒト腹膜中皮細胞中に一過性にトランスフェクトした。回収後、100pg/mlのIL−1β、10ng/mlのIL−6単独または50ng/mlのPC−sIL−6R(PC)またはDS−sIL−6R(DS)との組み合わせを用いて、細胞を刺激した。24時間刺激した後、ルシフェラーゼ活性をモニタリングした。対照としてイオノマイシンを用いて△NF−IL−6構築物の活性を確証したが、イオノマイシンはルシフェラーゼ活性のおよそ40倍の増大を誘導した(データは示されていない)。値は、個々の一次中皮細胞単離物を用いて実施した実験から得られた誘導の倍数を表し、平均±SEM(n=4)を示す(図9参照)。これらのデータは、NF−IL−6の崩壊がルシフェラーゼ活性のDS−sIL−6R媒介性誘導を大幅に遮断したが、一方、PC−sIL−6RおよびIL−6単独は対照レベルを上回る構築物のいずれかによる増大を示さなかったことを示す。
EMSA解析
10pg/mlのIL−βまたは10ng/mlのIL−6を50ng/mlのPC−sIL−6R(PC)またはDS−sIL−6R(DS)と組み合わせて用いて、30分間刺激したHPMCから核抽出物を単離した。NF−κB、STAT−3(SIE m67)およびC/EBP(NF−IL−6)に関するコンセンサス配列を放射能標識し、核抽出物とともにインキュベートした。電気泳動による6%ポリアクリルアミドゲル上での分離によりタンパク質−DNA相互作用を解析し、オートラジオグラフィーによりバンドを可視化した(図10参照)。NF−κBおよびSTAT−3の活性化を対照として用いた。これらの初期実験は、DS−sIL−6RがC/EBPコンセンサス配列との結合強化を誘導することを重視する。このコンセンサスオリゴヌクレオチドは個々のC/EBPファミリー成員が区別されるようできないため、特異的抗体を用いる競合EMSAおよびスーパーシフトアプローチを一般的に用いて、NF−IL−6α(C/EBPβ)またはNF−IL−6β(C/EBPδ)の関与を確証する。
ハイパーDS−sIL−6Rの発現および機能的特性化
無血清条件下でpcDNA−3(モック(Mock))またはpcDNA−3/ハイパーDS−sIL−6R(ハイパーDS−sIL−6R)を用いて、COS−7細胞を一過性にトランスフェクトした。37℃で24時間インキュベートした後、馴化培地を収集し、特異的ELISAを用いてヒトIL−6およびsIL−6Rの濃度を定量化した(図11A参照)。この馴化培地をさらに、血清不足ヒト滑膜繊維芽細胞に添加した。37℃で24時間イ
ンキュベートした後、馴化培地を収集し、特異的ELISAを用いてヒトCCL2/MCP−1およびCCL5/RANTESの濃度を定量化した(図9B参照)。値は、単一実験からの平均±SDを表す。
炎症能力
表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)から調製された無細胞上清(SESと呼ばれる)を用いて、野生型およびIL−6欠損(IL−6 -/-)マウスの両方における腹膜炎症モデルの特性化を、本発明者等は以前報告した(Hurst et al., Immunity, 14, 705-714, 2001)。このモデルを用いて、IL−6 -/-マウスにおけるDS−およびPC−sIL−6Rの炎症能力を調べた。マウスに滅菌PBS(対照)、100ng/マウスのDS−sIL−6Rおよび25ng/マウスのヒトIL−6(DS−sIL−6R)、100ng/マウスのPC−sIL−6Rおよび25ng/マウスのヒトIL−6(PC−sIL−6R)、SES単独(SES)あるいはDS−sIL−6RおよびIL−6またはPC−sIL−6RおよびIL−6と組み合わせて(それぞれSES+DS−sIL−6RまたはSES+PC−sIL−6R)、腹腔内投与した。3時間刺激した後、腹腔を洗浄し、炎症パラメーターを確定した。PC−sIL−6Rに関して前に報告されたように(Hurst et al., Immunity, 14, 705-714, 2001)、両アイソフォームは、SESへの曝露後、好中球の浸潤を阻害した(図12A参照)。CCL5/RANTESのレベルを洗浄液中でも測定し、それはDS−sIL−6R+IL−6の作用により優先的に誘導されることが判明した本発明者等のin vitroデータと一致した(図12B参照)。値は、平均±SEMを表す(n=3〜4匹の動物/条件*=p<0.05;**=p<0.001)。
野生型(IL−6+/+)およびIL−6欠損(IL−6−/−)マウスにおけるCCL5およびCXCL10の発現
DS−sIL−6Rによる受容体CCR5(CCL3、CCL4、CCL5)およびCXCR3(CXCL10)に特異的なケモカインの選択的誘導は、このアイソフォームが炎症の部位にTリンパ球および単球を誘引するのに重要であり得ることを示唆する。これを試験するために、腹膜炎症の最近特性化されたモデルを用いて、IL−6+/+およびIL−6−/−マウスにおけるCCL5およびCXCL10(CRG−2、IP−10のネズミ相同体)の一過性発現を確定した。このモデルは、腹膜透析患者が通常遭遇する細菌性腹膜炎エピソードに非常によく似ており、表皮ブドウ球菌から得られる無細菌細胞上清(SESと呼ばれる)の腹腔内投与に基づいている(Hurst et al., 2001)。図13Aに示したように、SES曝露IL−6−/−マウスにおいて観察されたCCL5およびCXCL10発現に関するプロフィールは、IL−6+/+マウスにおいて遭遇するものとはかなり変更されていた。可溶性gp130(sgp130)によるIL−6+/+マウスにおけるsIL−6R活性の遮断は、SES処理IL−6+/+マウスで観察されるCCL5およびCXCL10放出のプロフィールを、IL−6−/−マウスにおいて観察されるものに変換するため、発現のこれらの修飾パターンは、sIL−6Rシグナル伝達の結果であった(図13B)。
IL−6−/−マウスにおけるDS−sIL−6R活性の機能的特性化
IL−6−/−マウスにおけるCCL5およびCXCL10放出の修飾パターンが白血球漸増に直接影響を及ぼすか否かを調べるために、IL−6+/+およびIL−6−/−マウスをSESで曝露し、ネズミCCR5およびCXCR3に対する抗体を用いて腹腔か
ら洗浄した細胞にFACS染色を施した(図14)。SESによるIL−6+/+マウスの処理は、CCR5およびCXCR3を保有する細胞型における増大を誘導したが、しかしながらこの浸潤はSES処理IL−6−/−マウスにおいては減損された(図14)。CCR5+/CXCR3+細胞の浸潤は、DS−sIL−6RおよびIL−6の存在下でSESで曝露しておいたIL−6−/−マウスでも評価した(図15A)。ケモカインデータにより予測されるように、DS−sIL−6RによるIL−6シグナル伝達の再構築は、CCR5+/CXCR3+陽性細胞の流入をIL−6+/+マウスにおいて遭遇するレベルに回復させた。これらの白血球の漸増増大はDS−sIL−6Rに特異的であり、sgp130により遮断された(図15A)。抗CD3および抗CCR5で二重標識された細胞集団に関して、同様のデータを得た(図15B)。これらの応答はDS−sIL−6Rに特異的であり、PC−sIL−6Rによって誘導されなかった(図15AおよびB)。すべての場合に、IL−6−/−マウスへのSESの投与は、腹腔に補充された白血球の総数における有意の増大を誘導した(図15B)。その結果として、IL−6はDS−sIL−6R結合によりCXCR3およびCCR5を発現する白血球の誘引に影響を及ぼすと思われ、DS−sIL−6Rの生物学的特性がPC−sIL−6Rの場合と明らかに異なっていることに重点を置く。
Loetscher, 2001)。実際、CCR5は、通常ある種の炎症性疾患に関連するTh1細胞性応答に関するマーカーである(Qin et al., J. Clin. Invest. 101: 746-754, 1998; Sallusto et al., J. Exp. Med. 187: 875-883, 1998)。DS−sIL−6RによるRANTES、MIP−1αおよびMIP−1βの特異的アップレギュレーションは、このsIL−6Rアイソフォームがこれらの部位へのこのT細胞サブセットのホーミングの制御に関与し得ることを示唆する。しかしながら、IL−6がT細胞に作用して、Th1細胞へのそれらの分化を阻害することが近年報告された(Diehl et al., Immunity 13, 805-815, 2000)。この点で、sIL−6Rは可溶性gp130の阻害能力を強化する拮抗性分子として作用することが示唆されている(Mueller-Newen et al., Eur. J. Biochem. 236, 837-842, 1998)ため、T細胞からのDS−sIL−6Rの放出(Horiuchi et al., Immunology 95, 360-369, 1994)は、Th1分極の制御における別の役割も務め得る。したがって、任意の遊離IL−6を片付けることにより、DS−sIL−6Rは、IL−6がT細胞サブセットに直接作用し、それらの表現型に影響を及ぼすのを防止し得る。
Braun et al., J. Immunol, 164, 3009-3017, 2000)。したがって、sIL−6RアイソフォームによるCCケモカインの示差的発現は、異なる単核球亜集団の漸増に寄与するだけでなく、炎症の消散に関与するその他の媒介物質の発現プロフィールにも影響し得る。
Claims (17)
- 機能性IL−6分子および機能性DS−sIL−6R分子を含む融合タンパク質であって、
該タンパク質は、MIP−1α、MIP−1β、RANTESおよびIP−10のうちの1つまたはそれ以上の発現を増大し、
該機能性IL−6分子および該機能性DS−sIL−6R分子は一緒に連結され、
該機能性IL−6分子は、配列番号9を含むか、または配列番号9に対し少なくとも90%の配列同一性を有し、機能性IL−6分子の活性を保有する機能性相同体であり、
該機能性DS−sIL−6R分子は、配列番号10の残基113〜365を含むか、または配列番号10の残基113〜365に対し少なくとも90%の配列同一性を有し、配列番号10の残基356〜365を含み、機能性DS−sIL−6R分子の活性を保有する機能性相同体である、タンパク質。 - 前記機能性IL−6分子および前記機能性DS−sIL−6R分子は、配列RGGGGSGGGGSVEを含むリンカーにより一緒に連結される請求項1記載の融合タンパク質。
- 前記機能性DS−sIL−6R分子は配列番号10を含む請求項1または2に記載の融合タンパク質。
- 1つの機能性IL−6分子および1つの機能性DS−sIL−6R分子を含む請求項1ないし3のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- MIP−1α、MIP−1βおよびRANTESの発現を増大する請求項1ないし4のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- MIP−1α、MIP−1β、RANTESおよびIP−10の発現を増大する請求項1ないし5のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- MIP−α、MIP−βまたはRANTESの発現を少なくとも5倍増大する請求項1
ないし6のいずれか1項に記載の融合タンパク質。 - 請求項1ないし7のいずれか1項に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子。
- 請求項8記載の核酸分子を含む発現ベクター。
- 前記核酸分子の発現を得るためにプロモーターおよびその他の調節配列を含む請求項9記載のベクター。
- 請求項9または請求項10記載のベクターで形質転換される宿主細胞。
- 請求項1ないし7のいずれか1項に記載の融合タンパク質の産生方法であって、適切な宿主細胞中で請求項8記載の核酸分子を発現すること、および前記タンパク質を単離することを包含する融合タンパク質の生産方法。
- 請求項9または請求項10記載のベクターで宿主細胞を形質転換すること、請求項1ないし7のいずれか1項に記載の融合タンパク質の産生のための適切な条件下で宿主細胞を培養すること、および前記融合タンパク質を単離することを包含する請求項12記載の方法。
- 請求項1ないし7のいずれか1項に記載の融合タンパク質のアゴニストまたはアンタゴニストを特定するスクリーニング方法であって、候補分子が前記融合タンパク質の機能に影響を及ぼすか否かを確定するために前記候補分子を試験することを包含する方法。
- 請求項1ないし7のいずれか1項に記載の融合タンパク質、および薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を含む薬学的組成物。
- 請求項9または10記載の発現ベクター又は請求項8記載の核酸分子、および薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を含む薬学的組成物。
- 細菌性腹膜炎の予防もしくは治療のための、請求項15または16に記載の薬学的組成物。
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