JP2809415B2

JP2809415B2 - ヒトの組織因子に関連するｄｎａ断片・ポリペプチド及び抗体

Info

Publication number: JP2809415B2
Application number: JP63503555A
Authority: JP
Inventors: トーマスエスエッジングトン; ジェイムズエイチモーリジー
Original assignee: SUKURITSUPUSU KURINITSUKU ANDO RISAACHI FUAUNDEESHON
Current assignee: SUKURITSUPUSU KURINITSUKU ANDO RISAACHI FUAUNDEESHON
Priority date: 1987-03-31
Filing date: 1988-03-29
Publication date: 1998-10-08
Anticipated expiration: 2013-10-08
Also published as: US5622931A; FI100184B; NO885326D0; FI885543A0; FI97813B; NO885326L; NO305211B1; AU1627488A; PT87138A; ES2009590A6; ATE246200T1; FI954347A; FI954347A0; EP0309548B1; CA1340544C; DK666888A; EP1364969A3; EP1364969A2; FI97813C; US5223427A

Description

【発明の詳細な説明】（本出願の関連文献）本出願は、1987年３月31日に出願された米国出願第03
3,047号及び1987年６月25日に出願された出願第067,103
号の部分継続出願である。

（技術分野）本発明は、ヒトの組織因子重鎖タンパク質（huTFh）
をコードする構造遺伝子を有する組換えDNA分子（rDN
A）に関し、より詳細には、本発明は、宿主細胞中に含
まれる、huTFhを発現しうる発現ベクターに関するもの
である。また、本発明はhuTFhの合成ポリペプチド類似
物及びhuTFh及び該ポリペプチド類似物と結合するモノ
クローナル抗体に関する。

（発明の背景）凝血は、一群の凝集因子として知られる細胞性及び血
漿性タンパク質によって仲介される。一連の、酵素、共
因子、タンパク質分解及びゲル化反応のカスケードによ
って起こる。このカスケードの開始は、組織因子（TF）
として知られる細胞性レセプターが、凝集因子VIIはそ
の誘導体、因子VII aと結合し、触媒的に活性のある複
合体を形成したときに起こる。TFの非存在下、及び複合
体への連続する結合がない場合には、VII/VII aは凝集
を開始しない。従って、TFの化学的かつ生化学的特性
が、凝集のメカニズムを理解する上で重要なことは明白
である。

組織因子は、通常循環器中で可溶化しておらず、ま
た、因子VII/VII a及び他の凝集因子を含む血漿タンパ
ク質と接触できないことが分っている、膜に結合した糖
タンパク質である。組織因子は通常、血管を形成してい
る細胞の表面上には発現されていないが、血管中の単球
によるその発現は、バクテリアのリポ多糖のような感染
性試薬成分、ある抗原により刺激されたＴヘルパー細胞
から誘導され、直接的にはある刺激されたＴヘルパー細
胞由来のリンホカイン及び免疫複合体によって誘導する
ことができる。例えばバクテリアのリポ多糖同様、イン
ターロイキン１及び腫瘍壊死因子アルファのような単細
胞／マクロファージのある炎症仲介物は血球の体液側表
面にTFを発現する内皮細胞を刺激することができる。典
型的に、血管要素におけるTFの発現は、拡大する血管内
凝血又は、局部的な凝血の開始、すなわち血栓形成を起
こす。

組織因子は、試験管内の繊維芽細胞を含む培養物中の
ある血管外細胞、未同定型の脳細胞及び基底膜バリヤー
により、循環する血漿タンパク質から分離されている上
皮細胞の表面上に構成的に発現される。これら細胞上の
TFの存在は、組織損傷の結果としての血液との接触でク
ロットを形成する。従って、TFは、凝血システムが開始
する基礎である。

ハウウェル（Howell）（アメリカン・ジャーナル・オ
ブ・フィジオロジー（Am.J.Physiol.）31巻１頁（1912
年））の報告は、TFを含む単離した組織タンパク質調製
物は、リン脂質−タンパク質（リポタンパク質）複合体
として存在するときのみ凝集を促進することができるこ
とを示す最初の報告である。典型的に、TF含有組織タン
パク質の単離が、通常TFタンパク質と会合しているリン
脂質を除去してしまうので、単離したタンパク質を再脂
質化することによるTFの機能的プロコアグラント活性の
再構成が必要であることから、これら再構成の研究が多
くの研究者によって行なわれてきている。例えば、凝集
活性の回復は、リン脂質のタイプ、タンパク質に対する
リン脂質の比、及び再構成混合物の界面活性剤及びイオ
ン組成に影響されると報告されている。ネマーソン（Ne
merson），ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスチ
ゲーション（J.Clin.Invest.）47〜72頁（1968）；ネマ
ーソン（Nemerson），ジャーナル・オブ・クリニカル・
インベスチゲーション（J.Clin.Invest.）48〜322頁（1
969年）；及びカーソン（Carson）等、サイエンス（Sci
ence）、208巻、307頁（1980年）参照。

単離した、もしくは、再脂質化したTF含有タンパク質
調製物は、数々の種の組織から抽出物によって調製し
た。組織因子は、天然の組織中に非常に少量しか存在し
ないので、歴史的に使用されてきた方法は、困難で、時
間もかかり、かつ低収率であった。古典的方法のレヴュ
ーとしては、ネマーソン（Nemerson）等の報告（プログ
レス・イン・ヘマトシス・アンド・トロンボシス（Pro
g.Hem.Thron.）６巻、237〜261頁（1982年）を参照せ
よ。

最近、ブローズ（Broze）等（ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）260巻、1
0917〜20（1985年））ボム（Bom）等（トロンボ・リサ
ーチ（Thromb.Res.）42巻、635〜643頁（1986年）及び
グハ（Guha）等（プロシーディング・イン・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sc
i.）USA83巻、299〜302頁（1986年））は、脱脂質化組
織因子タンパク質を、非イオン性界面活性剤及びCaCl₂
を含む水溶性溶液に溶かした時、該タンパク質が因子VI
I/VII aと結合するという発見に基づいた方法を用い
て、ヒトの組織因子（huTF）タンパク質を単離したこと
を報告している。しかし、組織因子タンパク質を単離す
る手段として、因子VII/VII親和性吸着体を用いる。こ
れら方法の使用は、有意量の単離VII/VII aを入手する
ことの困難性のみならず、因子VII/VII aの不安定性に
よっても制限される。

ブローズ等（上記）は、huTFに特異的なモノクローナ
ル抗体の開発及び免疫親和性吸着体としてのそれらの使
用は、因子VII/VII a使用の制限によって起こる問題を
回避できることを指差している。しかし、抗−huTFモノ
クローナル抗体は、該文献中には報告されていない。さ
らに、子牛のTFによって生じる２つのモノクローナル抗
体（カーソン（Carson）等、ブラッド（Blood）,662巻1
56頁（1985年））は、huTFとは免疫反応を起こさない
（グハ（Guha）等、上記）。

（本発明の概要）１つの態様において、本発明はヒトの組織因子重鎖
（huTFh）タンパク質をコードする構造遺伝子を限定す
る配列を含む、わずか約12,000塩基対を含むDNA断片を
考案している。該構造遺伝子が、第１図の約１番から約
263番で示されているアミノ酸残基を有するタンパク質
をコードしていることが好ましい。さらに、該構造遺伝
子は、第２図の約130番から、約918番で示されるヌクレ
オチド塩基配列を有することが好ましい。

望ましい態様においては、そのDNA断片は、第１の配
列の５′末端と連続し、かつ、huTFhタンパク質のアミ
ノ末端に結合したアミノ酸残基リーダー配列をコードす
る第２の配列をも含む。その第１及び第２のDNA配列は
一緒になって、ヒトの組織因子重鎖前駆体（プレhuTF
h）タンパク質をコードする混成構造遺伝子を定義して
いる。該混成構造遺伝子は第１図の約−32番から約263
番で示されるアミノ酸残基を有するタンパク質をコード
していることが好ましい。さらに、該混成構造遺伝子
は、第２図の約34番から約918番のヌクレオチド塩基配
列を有することが望ましい。

別の態様において、本発明は、ヒトの組織因子重鎖タ
ンパク質をコードする１つの構造遺伝子を定義する第１
のDNA断片と機能的に結合したベクターを含む組換えDNA
分子を考案している。さらに該組換えDNA分子は、第１
の断片の５′末端に連続し、上記タンパク質に結合する
アミノ酸残基リーダー配列をコードする第２のDNA断片
を含むことが好ましい。すなわち、上記の第１及び第２
のDNA断片は一緒になって、上記タンパク質の前駆体を
コードする混成構成遺伝子を定義している。

別の態様において、本発明は、わずか約50アミノ酸残
基を含み、かつ式で表わされる配列に相当するアミノ酸残基配列を含むヒ
トの組織因子結合部位のポリペプチド類似物を考案して
いる。

さらに好ましくは、本発明はわずか約50アミノ酸残基
を含み、かつ、からなる群から選択される式で表わされる配列に相当す
るアミノ酸残基を含むヒトの組織因子結合部位のポリペ
プチド類似物を考案している。

さらに本発明の態様には、ａ）ヒトの組織因子重鎖タンパク質と免疫反応する、からなる群から選択される式で表わされるポリペプチド
と免疫反応する、ｃ）実質的に第１図の部位204から部位226で示される式
で表わされるポリペプチドとは免疫反応しない、抗体分子を含む抗体組成物である。

また、本発明は、ハイブリドーマTF8−5G9、TF9−10H
10、TF9−5B7及びTF9−6B4と、それらハイブリドーマに
よって生成される抗体分子を含むモノクローナル抗体組
成物を考案している。

本発明は、ａ）身体試料を、ヒトの組織因子重鎖タンパク質と混合
し、免疫反応混合物を作る、ｂ）その混合物を、抗体が、その試料中に存在するヒト
の組織因子と免疫反応し、免疫反応産物を作るのに十分
な時間維持する、そして、ｃ）ステップｂ）で生じた免疫反応産物の存在を検出す
る、以上のステップを含む体液試料中のヒトの組織因子重鎖
タンパク質の存在を検定する方法も考案している。

また、本発明は、ａ）生理学的に許容される希釈剤及び効果的な生体内指
示手段と結合させたハイブリドーマTF9−10H10によって
作られたある量の抗体分子を含むモノクローナル抗体組
成物を被検者に静脈注射により投与し、血栓中に存在す
るヒトの組織因子と免疫反応させる、ｂ）該抗体分子が、血栓の一部として生体内に存在する
組織因子と免疫反応し、かつ、免疫反応物質を形成する
のに十分な時間、その投与を受けた被検者を維持する、ｃ）ステップｂ）で生成した免疫反応生成物の存在を検
定する、以上ａ）〜ｃ）のステップを含む、生体内で血栓を検出
する方法も考案した。

さらに、本発明は、TF8−5G9及びTF9−6B4からなる群
から選択されるハイブリドーマにより生産され、存在す
るヒトの組織因子と効率よく結合する、ある量の抗体分
子を含む生理学的に許容される希釈剤を含有するモノク
ローナル抗体組成物を、被検者に静脈注射によっと投与
することを含む、生体内で、凝集因子VII/VII aと結合
するヒトの組織因子の能力を中和する方法も考案してい
る。

また、本発明は、因子VII/VII aと反応するのに有効
な量の、からなる群から選ばれるポリペプチドを含む生理学的に
許容される希釈剤を含有するポリペプチド組成物を、静
脈注射で被検者に投与することを含む、生体内で、ヒト
の組織因子が、凝集因子VII/VII aに結合することを阻
害する方法を考案している。

別の態様において、本発明は、本発明の抗体組成物を
含有するパッケージを含む、試料中のヒトの組織因子重
鎖タンパク質の存在を検定する、キットの形をとった診
断システムを考案している。

その抗体組成物は、ａ）TF8−5G9, ｂ）TF9−6B4, ｃ）TF9−10H10, ｄ）TF9−5B7。

からなるハイブリドーマの群から選ばれたハイブリドー
マにより生産されるモノクローナル抗体を含むことが望
ましい。

また、試料から血液凝集因子VII/VII aを単離する方
法も考案された。

この方法は、ａ）固体マトリックスに固定した、上記ポリペプチドを
含む固体サポートと試料を混合することにより結合反応
混合物を作る、ｂ）上記結合反応混合物を、上記凝集因子が上記ポリペ
プチドと結合し、固体複合体及び上清を作るのに十分な
時間、維持する、ｃ）上記複合体から、上記上清を分離する、そしてｄ）ステップｃの分離した複合体から、上記凝集因子を
回収する、以上、ａ）〜ｄ）のステップを含む。

さらに、実質的に、ヒトの組織因子軽鎖タンパク質を
含まない、生物学的に活性のあるヒトの組織因子重鎖タ
ンパク質の水溶液を含む組成物を考案した。この生物学
的に活性のあるヒトの組織因子重鎖タンパク質は、リン
脂質又は、非イオン性界面活性剤中に分散されているこ
とが望ましい。

血管系液体試料中の凝集能力を検定するための、キッ
トの形をとった診断システムも考案された。それは、実
質的にヒトの組織因子軽鎖タンパク質を含まない、少な
くとも１回の検定を行うのに十分な量の、生物学的に活
性のある、ヒトの組織因子重鎖タンパク質の水溶液組成
物を含有するパッケージを含む。その重鎖タンパク質
は、リン脂質中に分散されていることが望ましい。

別の態様において、成熟したヒトの組織因子重鎖タン
パク質の調製法及びその方法によるタンパク質発現産物
も考案されている。この方法は、ａ）栄養培地中、ヒトの組織因子重鎖タンパク質をコー
ドする構造遺伝子を定義する第１のDNA断片及びその第
１の断片に連続し、かつ、上記タンパク質に付随するア
ミノ酸残基リーダー配列をコードする第２のDNA断片と
機能的に結合し、宿主ホ乳類細胞と適合する発現ベクタ
ーで、上記第１及び第２のDNA断片が上記タンパク質の
前駆体型をコードする混成構造遺伝子を定義するもので
あるようなベクターを含む組換えDNA分子でトランスホ
ームした宿主ホ乳類細胞の培養を開始する、ｂ）その培養物を、上記細胞が、上記組換えDNA分子か
らタンパク質を発現し、かつ、上記成熟型のタンパク質
を形成するのに十分な時間維持する、そして、ｃ）上記培養物から、上記成熟型のタンパク質を回収す
る、以上ａ）〜ｃ）のステップを含む。

図面の簡単な説明図式は本公開の一部を形成している。

第１図は、１文字アミノ酸残基コードを用い、左から
右に、アミノ末端からカルホボキシ末端の方向で、ヒト
の組織因子重鎖タンパク質の成熟型及び前駆体（各々、
huTFh及びプレhuTFh）の完全なアミノ酸残基配列を示し
ている。主な天然の成熟型タンパク質のアミノ酸残基配
列は、１番から263番に対応する。マイナーな成熟型タ
ンパク質の配列は、３番のアミノ酸残基から始まり、26
3番の残基で終わる。成熟プロセスで除去されるリーダ
ー配列（前駆体領域）に相当するアミノ酸残基配列は、
マイナス番号で示した。細胞外ドメイン及びトランスメ
ンブレン・アンカー領域は各々、部位１〜219及び220〜
242に対応する。

第２図は、１文字ヌクレオチド塩基コードを用い、左
から右に５′末端から３′末端の方向で、プレhuTFh及
びhuTFhタンパク質をコードする、cDNAのヌクレオチド
配列を示している。huTFhの構造遺伝子は塩基130から始
まり、塩基918で終わる。

その読み枠は、各アミノ酸を示す１文字を、対応する
コドンの中央の塩基上に置くやり方で、ヌクレオチド配
列の上に推察されるアミノ酸残基を付置することにより
示した。

第３図は、例２で説明されている、huTFの凝血活性を
測定するのに用いる、凝集検定を示す図である。両対数
プロットは、秒とミリリットル当りのピコグラムで表わ
したヒトの組織因子（huTF）濃度で示される、ヒトのク
エン酸化血漿凝集（凝血）時間を示したものである。

第４図は、10％ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動
した、因子VII/VII a親和性で単離したhuTFhのオートフ
ルオログラムを示している。レーンＡは、例４で説明さ
れているように、単離され、電気泳動前に、ジチオスレ
イトール（DTT）で還元した¹²⁵Iラベル化huTFを示して
いる。レーンＢは、キロダルトン（ｋ）で示した見かけ
の分子量をもつ分子量標準物質を示している。

第５図は、15％ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動
した、因子VII/VII aの親和性で単離したhuTFのオート
フルオログラムを示している。huTFの単離、¹²⁵Iによる
ラベル化及び電気泳動は、例４と同様に行った。レーン
Ａは、DTTによる還元後の単離したhuTFを示している。
レーンＢは、DTT還元なしで、電気泳動した同サンプル
を示している。上のバンド及び下のバンド（Ｕ及びＬと
表示した）は、各々、約58及び47kの大きさのhuTFに対
応している。オートフルオログラフィー後、上のバンド
及び下のバンドを切り出し、DTTを含むSDSサンプルバッ
ファ中で再水和し、第２の15％アクリルアミドゲルのサ
ンプルウェルに入れ、電気泳動した。レーンＣは、レー
ンＢから得られた、下のバンドの再電気泳動の結果を示
している。レーンＤは、レーンＢから得られた上のバン
ドの再電気泳動の結果を示している。12.5及び47キロダ
ルトン（ｋ）の見かけ上の分子量をもつタンパク質が矢
印で示されている。

第６図は、例４で説明されているように、まずhuTF特
異的モノクローナル抗体で免疫沈殿化し、ついで８〜17
％のポリアクリルアミド勾配ゲルで電気泳動した、因子
VII/VII aの親和性で単離したhuTFのオートフルオログ
ラムを示している。レーンＡは、DTTによる還元を伴
う、電気泳動した¹²⁵Iラベル化huTFを示している。レー
ンＢは、還元なしで電気泳動した同サンプルを示してい
る。

第７図は、15％アクリルアミドゲル中で電気泳動し
た、因子VII/VII aの親和性で単離したhuTFのオートフ
ルオログラムを示している。単離、¹²⁵Iによるラベル
化、還元及び脱グリコシル化は、例４で説明されている
ように行った。レーン１は、キロダルトンで表わされた
見かけ上の分子量をもつ標準物質として電気泳動したタ
ンパク質標準物質：リゾチーム、14.3;カルボニック・
アンヒドラーゼ、30.0;オバルブミン、46.0;ウシ血清ア
ルブミン、69.0;ホスホリラーゼｂ、92.5;ミオシン、20
0.0（すべてIL州、アーリントンハイツ・アマーシャム
社より入手）を示している。¹²⁵I−huTFを含むサンプル
をDTT存在下（レーン２及び３）又は非存在下（レーン
４及び５）で電気泳動した。これら¹²⁵I−huTF含有サン
プルのいくつかは電気泳動前に脱グルコシル化し（レー
ン３及び５）、他のものは脱グリコシル化しなかった
（レーン２及び４）。

レーン３及び５に流した¹²⁵I−huTF含有サンプルは、
電気泳動前に脱グリコシル化され、レーン２及び４のも
のは脱グリコシル化しなかった。

第８図は、例９で説明されているように、10％のポリ
アクリルアミドゲル中で電気泳動した、免疫親和性で単
離されたhuTFのオートフルオログラムを示してい。レー
ン１は、キロダルトンで表わされる見かけの分子量をも
つ、マーカーとして電気泳動した標準タンパク質；チト
クロムＣ、12.4;ラクトグロブリン、18.4;カルボニック
・アンヒドラーゼ、29.0:ラクテート・デヒドロゲナー
ゼ、36.0;オバルブミン、43.0;グルタメート・デヒドロ
ゲナーゼ、55.0;及びホスホリラーゼｂ、95.5（全て、M
A州ニュートンセンターのディバーシファィド・バィオ
テク（Diversified Biotech.）から入手した）を含んで
いる。

レーン２は、スミス（Smith）等のBCAタンパク質検定
法（アナリティカル・バイオケミストリー（Anal.bioch
em.）150巻、76〜85頁（1985年））を用いて測定し、か
つDTTを用いて還元した約20μｇのタンパク質を含んで
いる。huTF重鎖（huTFh）は、明らかに、およそ47Mrの
位置に確認され、huTF軽鎖は、およそ12.5Mrの位置にわ
ずかに確認された。タンパク質は、レムリ（Laemmli）
（ネイチャー（Mature）、227巻、680〜685頁（197
0））の報告に従がい、コマージ・ブルー染色により可
視化した。

第９図は、huTFhの非リン脂質化（非脂質化）ポリペ
プチド類似物による、huTF由来の凝集開始阻害の投与−
応答曲線を示すグラフである。種々の濃度の非脂質化ポ
リペプチドによる凝集阻害率は、例12に説明されている
ように測定した。テストしたポリペプチドは、p26−49
（△TF26.49）、p121−155（○、TF121、155）、p146−
167（●、TF146、167）及びp204−226（■、TF204、22
6）である。

第10図は、huTFhのリン脂質化した（脂質化した）ポ
リペプチド類似物による、huTF由来の凝集開始阻害に関
する投与−応答曲線を示すグラフである。その阻害率は
例９で説明されているように、同方向法により、同類似
物に対して測定した。

第11図は、組換えDNAプラスミドpCTF64、pCTF314及び
pCTF403内のEcoR I断片挿入物の制限地図を示したもの
である。その挿入物は、プレhuTFh遺伝子の完全なヌクレオチド配列に対応
する重複するヌクレオチド配列領域を示している。別
に、その挿入物は、第２図で示されている、残基１〜48
6（pCTF64に含まれている）、残基135〜775（pCTF314に
含まれている）、及び残基776〜1125（pCTF403に含まれ
ている）由来のヌクレオチドに対応するヌクレオチド配
列を、左から右に５′から３′の方向で含んでいる。ま
た、例16で述べられている種々の組換えDNA分子を構築
するのに用いられた挿入物内の制限酵素切断部位のおよ
その位置も示されている。さらに、完全な形で示される
リーダーペプチド及びトランスメンブレン・アンカードメインをもつhuTFhタンパク質のおよその位置も示してある。

第12図は、huTFhの非リン脂質化（非脂質化）ポリペ
プチド類似物による、huTF由来の凝集開始の阻害を示
す、投与−応答曲線のグラフである。モル濃度で表わし
た種々の濃度の非脂質化ポリペプチドによる凝集の阻害
率（％）は、例12に述べられているように測定した。試
験したポリペプチドは、p24−35（△）、p26−49
（○）、p152−169（□）及びペプチドp40〜71、p72〜1
04、p94〜123及びp161189であるがこれらは全て、実質
的な阻害を示さず、集約的に黒丸（●）で示した。

第13図は、TF8−5G9抗体組成物による凝集阻害の速度
論を示すグラフである。凝集の阻害率（％）は、例18で
述べられているように測定された種々の抗体免疫反応時
間にわたってプロットしてある。

第14図は、huTF由来の凝集の抗huTF抗体による阻害の
投与−応答を示すグラフである。種々の濃度の抗huTFモ
ノクローナル抗体TF8−5G9による凝集の阻害率（％）は
例19に述べられているように測定した。

第15図は、huTF源がヒトの繊維芽細胞系列GM1381の細
胞破壊物である、huTF由来の凝集の、抗huTF抗体による
阻害の投与−応答のグラフである。種々の濃度の抗huTF
モノクローナル抗体TF8−5G9による凝集の阻害率（％）
は、例19に述べられているように測定した。白丸（○）
はTF8−5G9抗体を示し、黒丸（●）は無関係の抗体を示
している。

第16図は、抗TFモノクローナル抗体TF8−5G9による精
製したヒトの脳TFの凝血活性の阻害を示している。リン
脂質ベシクル中に再構成された、精製したヒトの脳TFの
凝血活性は、種々の濃度の精製IgGと、37℃30分間、前
処理した後測定した。丸は、抗TF抗体TF8−5G9に対する
もので、三角は、無関係なコントロール抗体PAb100に対
するものである。データは、抗体を加えない場合の活性
に対する阻害率として表わされている。

第17図は、精製した抗TFモノクローナル抗体で処理し
た、培養されたJ82膀胱がん細胞に対する阻害因子VIIの
結合及び、その細胞による因子X aの形成を示してい
る。因子X aの形成率の阻害の値は、三角で表わされ、
因子VIIの結合阻害の値は、丸で表わされている。デー
タは、抗体を加えないでインキュベートした細胞を用い
て得られる値に対する阻害率で表現されている。パネル
Ａは抗体TF9−2C4の効果、パネルＢは、抗体TF9−5B7の
効果を示している。

第18図は、例25で述べられているような、免疫親和性
で単離したhuTFのウェスタンブロット分析を示してい
る。15％ポリアクリルアミドゲルに次に示すものがかけ
られた。レーン１は、キロダルトン（ｋ）でパネルＡの
左に示された見かけの分子量をもつ分子量標準が含まれ
る。レーン２は、電気泳動前に還元された、精製ヒトヘ
モグロビン１μｇを含んでいる。レーン３は、単離した
huTFを電気泳動前に還元したもの0.5μｇを含んでい
る。レーン４は、非還元の、単離されたhuTF0.5μｇを
含んでいる。SDS−PAGE後、生じたタンパク質バンドを
電気泳動的にニトロセルロースに移した。このようにし
て作ったウエスタン・ブロットを0.2μg/mlの親和性精
製したウサギ抗huTF IgG（パネルＡ）、１μg/mlのウ
サギ抗ヘモグロビンIgG（パネルＢ）又は、１μg/mlの
非免疫ウサギIgG（パネルＣ）と免疫反応させた。免疫
染色したバンドの見かけの分子量を右にkDaで示した。

発明の詳細な説明 A.定義アミノ酸；ここで同定される全てのアミノ酸は、天然の
Ｌ−型のものである。標準的ポリペプチド命名法に従が
い（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（J.Biol.Chem.）、243巻、3557〜59頁（1969））、ア
ミノ酸残基の略号は、次の照会表に示されているとおり
である。

ここでは、全てのアミノ酸配列は、従来どおり左から
右に、アミノ酸末端からカルボキシ末端への方向で示さ
れていることに注意を要する。さらに、アミノ酸残基配
列の始め又は終りのダッシュは、各々、アミノ及びカル
ボキシ末端のＨ及びOH（水素及び水酸基）のようなラジ
カルへの結合、もしくは、ポリペプチド鎖における１か
ら約15残基の１つ以上のアミノ酸残基配列を示してい
る。

ポリペプチド及びペプチド；ポリペプチド及びペプチド
はここでは、隣合う残基のアルファアミノ基とカルボキ
シル基の間のペプチド結合により互いに直鎖的に結合し
た、わずか約50アミノ酸残基を意味するものとして互換
的に用いられている。

タンパク質；タンパク質は、ポリペプチドのように互い
に直鎖的に結合した50以上のアミノ酸残基を意味して用
いられている。

ヌクレオチド；糖部分（ペントース）、リン酸及び窒素
ヘテロ環塩基からなるDNA又はRNAの単量体ユニット。こ
の塩基はグリコシド炭素（ペントースの１′炭素）を介
して糖部分と結合しており、塩基と糖の組合せはヌクレ
オシドと呼ばれる。ヌクレオシドがペントースの３′又
は５′部位に結合するリン酸基を含むとき、それをヌク
レオチドと呼ぶ。

塩基対（bp）；二本鎖DNA分子内でのアデニン（Ａ）と
チミン（Ｔ）又はシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）の組
合せ。

B.DNA断片生物において、タンパク質又はポリペプチドのアミノ
酸配列は遺伝子コードを介して、そのタンパク質をコー
ドする構造遺伝子のデオキシリボ核酸（DNA）配列に直
接関係づけられる。従って、構造遺伝子は、それがコー
ドするタンパク質又はポリペプチドのアミノ酸残基配列
で定義することも可能である。

重要でかつよく知られた遺伝子コートの性質にリダン
ダンシーがある。すなわち、タンパク質を作るのに用い
られるほとんどのアミノ酸に対し、１つ以上のコードす
るヌクレオチド・トリプレット（コドン）が、１つのア
ミノ酸残基をコード又は指定している。それ故、１つの
アミノ酸残基配列をコードするのに多くの異なるヌクレ
オチド配列が存在することになる。そのようなヌクレオ
チド配列は、全ての生物において、同じアミノ酸残基配
列を生産することが可能なので、機能的には等価である
と考えられている。場合によっては、プリン又はピリミ
ジンのメチル化物がヌクレオチド配列の中に組込まれて
いる事もある。しかし、そのようなメチル化は、コード
関係にはなんら影響しない。

本発明のDNA断片は、ヒトの組織因子重鎖タンパク質
（huTFh）をコードするDNA配列を含むという特徴をも
つ。好ましい態様において、このDNA断片は、ヒトの組
織因子重鎖前駆体タンパク質（プレhuTFh）をコードす
るDNA配列を含んでいる。すなわち、本発明のDNA断片
は、huTFh、また、より好ましくは、プレ−huTFhの構造
遺伝子の存在で特徴づけられる。さらに、可溶性のhuTF
h又は可溶性のプレ−huTFhタンパク質をコードする構造
遺伝子を形成するDNA配列がDNA断片中に含まれることが
望ましい。その遺伝子はhuTFh又はプレhuTFhタンパク質
中にあるアミノ酸残基をコードする各コドンが中断する
ことなく連続して存在する、すなわち、イントロンを含
まない遺伝子であることが好ましい。

従って、第２図に示される、５′末端の約130番か
ら、３′末端の約918番の部位の配列を基本的に含み、
かつ、huTFhを発現することができるDNA断片が本発明の
１態様を構成している。第２図に示される、約34番から
約918番の部位の配列を基本的に含み、かつ、プレhuTFh
を発現できるDNA断片が、本発明のもう１つの態様を構
成している。

好ましい、可溶性のhuTFh分子は、huTFhをコードする
DNAの５′末端の約150塩基によってコードされるアミノ
酸残基を欠いている。従って、第２図で示される、５′
末端の約130番から約756番を経由して、３′末端の約80
1番の部位までの配列を基本的に含み、かつ、可溶性のh
uTFhを発現できるDNA断片は、本発明のさらに好ましい
態様を構成する。可溶性のhuTFh構造遺伝子を形成す
る、典型的な好ましいDNA断片は、第２図で示されてい
る、約130番から約756番約130番から約771番、約130番
から約786番、及び約130番から約801番で表わされるヌ
クレオチド配列を有するものである。

可溶性プレhuTFhをコードする、好ましいDNA断片は、
それらが、第１図で示されるように、−32番から０番ま
でのアミノ酸残基で示されるような、アミノ末端リーダ
ー配列を含むタンパク質をコードしていること以外は、
可溶性huTFhをコードしているものと同じである。従っ
て、可溶性プレ−huTFhをコードする構造遺伝子を形成
している、好ましいDNA断片は、基本的に、第２図で示
されている５′末端の約34番から756番を経由して、
３′末端の約801番で示される配列を含んでいる。典型
的な好ましい可溶性のプレhuTFhコードのDNA断片とは、
第２図で示されているところの、約34番から約756番、
約34番から約771番、約34番から約786番及び約34番から
約801番のヌクレオチド塩基配列を有するものである。

可溶型も含めて、上記huTFh及びプレhuTFhタンパク質
をコードする相同的DNA及びRNAも先に議論したように考
案された。

huTFh及びプレhuTFhをコードするDNA断片は化学的技
術、例えばマテウシ（Matteucci）等のホスホトリエス
テル法（ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソ
サイアティー（J.Am.Chem.Soc.）103巻3185頁（1981
年））により容易に合成できる。（ここで引用されてい
る技術の公開は参考として組込まれている。）もちろ
ん、コード配列を化学的に合成することにより本来のア
ミノ酸残基配列をコードする代りに適当な塩基を用いる
ことにより、いかなる修正も望みどおりにすることがで
きる。しかし第２図に示されているものと全く相同的な
配列を含むDNA分子の方が望ましい。

さらに、基本的にhuTF及びプレhuTFhタンパク質をコ
ードする構造遺伝子を含むDNA断片は、これらの遺伝子
を含む組換えDNA分子から得ることができる。例えば、
プラスミドタイプの組換えDNA分子pCTF64、pCTF314及び
pCTF403はいずれもhuTFh及びプレhuTFhタンパク質の異
なる領域をコードするDNA配列を含んでおり、また、こ
れらを合せると、各タンパク質を発現するのに必要な全
てのDNA配列を有することになる。各々、pCTF64、pCTF3
14又はpCTF403でトランスホームした大腸菌の培養物
は、1987年３月27日、プダペスト協定に基づき、MD州、
ロックビル、パークローン、ドライブ12301番、アメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）に保
管され、各々、受理番号67370、67368及び67369が割当
てられた。

huTFh又はプレhuTFhをコードするDNA配列を含むDNA断
片は、よく知られている方法を用い、先に述べた各プラ
スミドからの適当な制限断片を機能的に結合することに
より作ることができる。典型的に、本方法で作られた本
発明のDNA分子は、粘着末端、すなわちこの分子の二本
鎖領域を越えて伸びた“突き出した”一本鎖領域をもっ
ている。本発明のDNA分子上に粘着末端があることは望
ましいことである。

本発明は、上述のDNA断片と等価なリボ核酸（RNA）も
考案している。

C.組換えDNA分子本発明の組換えDNA分子は、本発明のDNA断片をベクタ
ーに機能的に結合することにより作ることができる。

ここで用いられているように、“ベクター”という言
葉は、細胞中で自己複製できるDNA分子で、別のDNA断片
を機能的に結合することができ、その結合した断片の複
製をもたらすものを意味する。huTFh及びプレhuTFh遺伝
子の発現を司ることができるベクターは、ここでは“発
現ベクター”と呼ばれる。従って、組換えDNA分子（rDN
A）とは、天然においては通常一緒にいることはない少
なくとも２つのヌクレオチド配列を含むハイブリッドDN
A分子のことである。

本発明のDNA断片を機能的に結合させるベクターの選
択は、この分野ではよく知られているように、例えば、
タンパク質の発現などの機能的性質及びトランスホーム
される宿主細胞などが組換えDNA分子の構築技術の上で
本質的な制限となることから、これらに直接依存する。
しかし、本発明によって考案されたベクターは、これに
機能的に結合しているDNA断片中に含まれるhuTFh又はプ
レhuTFh遺伝子の、少なくとも複製を、好ましくは発現
をも可能にする。

好ましい態様において、本発明により考案されたベク
ターは、原核性のレプリコン、すなわち、バクテリア宿
主細胞のような原核細胞中の、これをトランスホームし
た染色体外組換えDNA分子の自己複製及び維持を可能と
するDNA配列を含んでいる。このようなレプリコンは、
この分野ではよく知られている。さらに、原核性レプリ
コンを含むこれら態様は、これをトランスホームしたバ
クテリア宿主に薬剤耐性を与える遺伝子も含んでいる、
典型的なバクテリアの薬剤耐性遺伝子は、アンピシリン
又はテトラサイクリンに対する耐性を与えるものであ
る。

原核性レプリコンを含む、これらのベクターは、これ
をトランスホームした大腸菌のようなバクテリア宿主細
胞中で、huTFh又はプレhuTFh遺伝子を発現（転写及び翻
訳）させることができる原核性プロモーターも含んでい
る。プロモーターとは、RNAポリメラーゼの結合を許
し、転写を開始させる、DNA配列でできた発現コントロ
ール要素である。バクテリア宿主と適合するプロモータ
ー配列の典型的なものは、本発明のDNA断片の挿入に便
利な制限部位を含むプラスミドベクター中に存在する。
このようなベクタープラスミドの典型的なものには、pU
C8、pUC9、pBR322、pBR329（CA州、リッチモンド、バイ
オラド・ラボラトリーズ社）及びpPL、pKK223（NJ州、
ビスカタウェイ、ファルマシア社）がある。

真核細胞、好ましくは脊椎生物細胞と適合する発現ベ
クターも、本発明の組換えDNA分子を作るのに用いられ
る。真核細胞発現ベクターもこの分野でよく知られてお
り、数社から市販されている。典型的にはこれらのベク
ターは、目的とするDNA断片の挿入に便利な制限部位を
含んでいる。これらのベクターの典型的なものには、pS
UL及びpKSV−10（ファルマシア社）、pBPV−1/pML2d
（インターナショナルバイオテクノロジー社）及びpTDT
1（ATCC,＃31255）がある。

好ましい態様において、本発明の組換えDNA分子を構
築するのに用いられる真核性細胞発現ベクターは、真核
性細胞中で効果的な選択マーカー、好ましくは、薬剤耐
性選択マーカーを含んでいる。好ましい薬剤耐性マーカ
ーとは発現によりネオマイシン耐性となる遺伝子、すな
わち、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（neo）
遺伝子である。サウザーン（Southern）等、ジャーナル
・オブ・モレキュラー・アンド・アプライド・ジェネテ
ィクス（J.Mol.Appl.Genet.）１巻、327〜341頁（1982
年）。

本発明のrDNAを作るための、レトロウイルス発現ベク
ターの使用も考案されている。ここで用いられているよ
うに、“レトロウイルス発現ベクター”とは；レトロウ
イルスゲノムのロング・ターミナル・リピート（LTR）
領域由来のプロモーター配列を含むDNA分子を意味す
る。

好ましい態様において、典型的な発現ベクターは、真
核細胞中では複製不能なレトロウイルス発現ベクターで
ある。レトロウイルスの構築と使用法は、ソージ（Sorg
e）等により報告されている（モレキュラー・アンド・
セルラー・バイオロジー（Mol.Cell.Biol.）４巻、1730
〜37頁（1984年）。

相補的なホモポリマー末端を介して、DNAをベクター
に機能的に結合する多くの方法が開発されてきている。
例えば、相補的なホモポリマーを、挿入するDNA断片及
びベクターDNAに付加することができる。それから、こ
のベクターとDNA断片を相補的ホモポリマー末端間の水
素結合で結合し、組換えDNA分子を作る。

１つ以上の制限部位を含む合成リンカーは、DNA断片
をベクターに結合するもう１つの方法を提供する。先に
報告されているように、エンドヌクレアーゼで制限消化
することによって生成したDNA断片を、３′−５′エン
ドヌクレアーゼ活性で突出する３′、一本鎖末端を除
き、また重合活性で、くぼんだ３′末端を充填する酵
素、バクテリオファージT4DNAポリメラーゼ又は、大腸
菌DNAポリメラーゼＩで処理する。従って、これらの活
性の組合せで、平滑末端DNA断片が生ずる。それから、
この平滑末端断片を、バクテリオファージT4DNAリガー
ゼのような、平滑末端DNA分子のライゲーションを触媒
することができる酵素の存在下、大過剰のリンカー分子
とインキュベーションする。このような反応でその末端
にポリリンカーをもつDNA断片ができる。さらにこのDNA
断片を適当な制限酵素で切断し、このDNA断片と適合す
る末端を作る酵素で切断した発現ベクターとライゲーシ
ョンする。

多種の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカ
ーは、CN州ニューヘブン、インターナショナルバイオ
テクノロジー社を含む多くの会社から市販されている。

本発明は、上述の組換えDNA分子と等価なRNAも考案し
ている。

D.トランスホームした細胞と培養本発明は、本発明の組換えDNA分子、好ましくは可溶
性のhuTFh又はプレhuTFhを発現できるrDNAでトランスホ
ームした宿主細胞にも関連している。この宿主細胞は、
原核性でも真核性でもよい。バクテリア細胞は、原核宿
主細胞であることが好ましく、また典型的には、ND州ベ
セスダ、ベセスダ・リサーチラボラトリース社から入手
できる大腸菌DH5株のような、大腸菌の株である。好ま
しい真核性宿主細胞には、イースト及びホ乳類細胞、好
ましくはマウス、ラット、サル又はヒトの繊維芽細胞系
列のような脊椎動物細胞が含まれる。好ましい真核性宿
主細胞には、CCL61としてATCCから入手できるチャイニ
ース・ハムスターの卵巣（CHO）細胞及びCRL1658として
ATCCから入手できるNIHスイスマウス胚細胞がある。

本発明の組換えDNAによる適当な細胞宿主のトランス
ホーメーションは、典型的には用いるベクターのタイプ
に応じて、よく知られている方法により行なわれる。例
えば、原核性宿主細胞のトランスホーメーションに関し
ては、コーエン（Cohen）等のプロシーディング・イン
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.N
atl.Acad.Sci.）USA、69巻、2110頁（1972年）；及びマ
ニアチス（Maniatis）等のNY州コールド・スプリング・
ハーバー・コールド・スプリングハーバー・ラボラトリ
ー、ラボラトリー・マニュアル・モレキュラー・クロー
ニングを参照せよ。脊椎動物細胞のrDNAを含むレトロウ
イルス・ベクターによるトランスホーメーションに関し
ては、例えば、ソージ（Sorge）等、モレキュラー・ア
ンド・セルラー・バイオロジー（Mol.Cell.Biol.）４
巻、1730〜37頁（1984年）、グラハム（Graham）等、ウ
ィロロジー（Virol.）,52巻、456頁（1973年）；及びウ
ィグラー（Wigler）等、プロシーディング・イン・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Ac
ad.Sci.）USA、76巻、1373〜76頁（1979年）を参照せ
よ。

うまくトランスホームされた細胞、すなわち、本発明
の組換えDNA分子を含む細胞は、従来の方法によって同
定することができる。例えば、本発明のrDNAの導入から
生じた細胞をクローン化し、モノクローナルコロニーを
作る。これらのコロニーから細胞を収穫し、溶解し、そ
のDNA内容物について、サウザーン（Southern）（ジャ
ーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.Bi
ol.）98巻、503頁（1975年）又は、ベレント（Borent）
等（バイオテクノロジー（Biotech.）３巻、208頁（198
5年）によって報告されている方法を用いて、そのrDNA
の存在を調べた。

rDNA存在の直接的検定に加え、成功したトランスホー
メーションは、そのrDNAがhuTFh又はプレhuTFhを発現す
ることができるときは、従来の免疫学的方法で確かめる
ことができる。例えば、発現ベクターでうまくトランス
ホーメーションできた細胞は、huTFh又はプレhuTFh抗原
性を示すタンパク質を生産する。トランスホームさせた
細胞試料を収穫し、本発明のハイブリドーマによって生
産される抗原等に特異的な抗体を用い、huTFh又はプレh
uTFhを検定する。

このように、トランスホームした宿主細胞それ自体に
加え、本発明は、栄養培地中のそれらの細胞の培養物好
ましくは、モノクローナル（クローン的に均一な）培養
物、又は、モノクローナル培養物由来の培養物も考案し
た。この培養物は、huTFh又はプレhuTFh抗原性を示すタ
ンパク質、またさらに好ましくは、生物学的に活性なhu
TFhを含むことが望ましい。

トランスホームした宿主細胞を培養するのに有用な栄
養培地は当分野ではよく知られており、また、いくつか
の販売会社より市販されている。宿主細胞がホ乳類細胞
であるような態様においては、“無血清”培地を使うこ
とが望ましい。

E.huTFh及びプレhuTFhタンパク質の生産方法本発明の別の特徴には、huTFh抗原性を示すタンパク
質の生産方法がある。huTFh抗原性を示すタンパク質は
天然の組織因子によって誘導される抗体と免疫反応を起
こすタンパク質である。huTFh抗原性を示すタンパク質
は、抗原として有用であり、又、抗体を生じさせるとき
にも有用で、その各々が本発明の診断システムや診断法
で使用することができる。

本方法は、huTFh又はプレhuTFh、好ましくは可溶性の
huTFh又は可溶性のプレhuTFhを発現することができる、
本発明の組換えDNA分子でトランスホームした宿主細
胞、好ましくは、ヒトの細胞を含有する栄養培地を含む
培養の開始する。この培養を、そのトランスホームした
細胞がhuTFh又はプレhuTFhタンパク質を発現するのに十
分な時間維持する。発現したタンパク質をその培地から
回収する。好ましい態様において、本発明の方法によっ
て作られたhuTFhタンパク質はさらにhuTFhの生物学的活
性すなわち、因子VII/VII aと結合する能力を示す。こ
れらの方法は、宿主細胞においてプレhuTFh遺伝子を発
現できる組換えDNA分子でトランスホームしたホ乳類宿
主細胞の培養を含んでいる。その培養により、プレhuTF
hタンパク質が発現し、つづいて、そのプレhuTFhの細胞
内での翻訳後の修正が起こり、生物学的に活性のあるhu
TFhタンパク質が生じる。

培養物から、発現したタンパク質を回収する方法は、
当分野ではよく知られたことであり、従来の生化学的方
法を用い、その培養物のタンパク質含有画分の分画が含
まれる。例えば、タンパク質の分画に対して知られてい
るゲル濾過法、ゲルクロマトグラフィー、アフィニティ
・クロマトグラフィー及びそれに類するものが、培養物
中にある発現タンパク質の単離に用いることができる。
さらに、免疫親和性、免疫吸着やそれに類するもののよ
うな、免疫化学的方法も、従来法を用いて行なわれる。

F.huTFh及びプレhuTFhタンパク質組成物と発現産物本発明は、また本発明のrDNAのhuTFh及びプレhuTFhタ
ンパク質発現産物も考案している。好ましい態様におい
て、huTFh及びプレhuTFh発現産物は第１図で示されてい
るように、各々残基１から263及び−32から263に対応す
るアミノ酸残基を有している。その発現タンパク質は、
第１図で示されるプレhuTFh及びhuTFhのアミノ酸残基配
列の長さの少なくとも90％、好ましくは少なくとも95％
であることが望ましい。

別の態様において、可溶型のhuTFh及びプレhuTFhと、
可溶性huTFhそして、または可溶性プレhuTFhを含む組成
物も考案されている。ここで用いている“可溶性”とい
う言葉は、本来のhuTFh及びプレhuTFh分子の細胞外ドメ
イン、すなわち、第１図に示すところのアミノ末端から
残基220までの、huTFh及びプレhuTFh分子領域を基本的
に含むことを特徴とするhuTFh及びプレhuTFh分子を意味
する。それゆえ、可溶性huTFh及び可溶性プレhuTFhは、
本来の分子で形成されるトランスメンブレン・アンカー
領域の実質的部分（第１図で示すところの残基220から2
42）を含まない。ここで用いている“huTFh"及び“プレ
huTFh"という言葉は今後特にことわらないかぎり、その
タンパク質の可溶型を含んでいる。

可溶性のhuTFh及び可溶性プレhuTFhは、疏水的なトラ
ンスメンブレン・アンカー領域を含んでいないので、こ
れらは、生理学的に許容される水溶液中で実質的に凝集
することはない。それゆえ、可溶性のhuTFh及び可溶性
のプレhuTFhは、存在するhuTFh又はプレhuTFhタンパク
質の少なくとも約70％、好ましくは約80％、そしてより
好ましくは約90％（重量パーセント）が非凝集（単量
体）型であり、タンパク質濃度約0.1pg/mlから約100ng/
mlの生理学的に許容された希釈剤を用いた水溶液を作り
うることを特徴とする。タンパク質溶液中に存在する凝
集量の測定法は、当分野ではよく知られているところで
あり、排除カラムクロマトグラフィーによるサイズ分画
を含んでいる。

好ましい可溶性huTFhタンパク質は第１図で示されて
いるところの、アミノ末端の残基約１番から、209番を
経由してカルボキシ末端の残基224番で示されるアミノ
酸残基を示している。従って、好ましい可溶性huTFhタ
ンパク質は第１図で示すところの約１番から約209番、
約１番から約219番及び約１番から約224番の残基で表わ
されるアミノ酸残基配列を有するものである。

好ましい可溶性プレhuTFhタンパク質は、第１図で示
すところの、アミノ末端の−32番から、209番を経由し
て、カルボキシ末端の224番の残基で表わされるアミノ
酸残基を有している。従って、好ましい可溶性プレhuTF
hタンパク質は、第１図で示すところの約−32番から214
番、約−32番から219番、及び約−32番から約224番の残
基で表わされるアミノ酸残基配列を有するものである。

１つの態様において、huTFh及びプレhuTFh発産物はグ
リコシル化されていない。すなわち、それらは、本発明
のrDNAでトランスホームした原核細胞中で生産される。

非グリコシル化型のhuTFh及びプレhuTFhは、本発明の
接種物及び診断システムにおける免疫原及び抗原として
有用である。

典型的には、真核細胞で生産されたhuTFh及びプレhuT
Fhはグリコシル化されており、また抗原性及び免疫原性
に加えて、生物学的活性を有する。ここで用いられてい
るように、“生物学的活性”という語句は、因子VII/VI
I aの依存の凝集を誘導する能力をもつhuTFh又はプレhu
TFhタンパク質又はポリペプチドを指して使われる。

このように、本発明は、実質的にヒトの組織因子軽鎖
タンパク質を含まない生物学的に活性なhuTFhを含有す
る水溶液を含む組成物を考案している。その組成物も実
質的に例えばラウリル硫酸ナトリウム等のイオン性界面
活性剤、ポリアクリルアミド及びSDS−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）で測定される約、15000
ダルトン以下の見かけの分子量を有する組織由来のタン
パク質のような物質を含まないことが望ましい。

水溶性のhuTFh含有溶液は血液又はクエン酸化した血
漿のような血液由来の産物のような血管系液状サンプル
の凝集能力を検定するのに十分な生物学的に活性のある
huTFhを含んでいる。“凝集能力”という語句は生物学
的に活性なhuTFh存在下、血管系液状サンプルを凝集す
る能力を意味する。凝集能力を検定するのに十分な、典
型的huTFhタンパク質濃度は、例２におけるサンプル/hu
TFh比と同じ比を用いたとき、約0.1pg/mlから約100ng/m
l、好ましくは、約1pg/mlから約10μg/ml、そしてより
好ましくは約10pg/mlから約1ng/mlである。もちろん、
凝集能力を検定するときに必要な濃度よりも高い濃度で
あるが、好ましい濃度に希釈しうるhuTFh溶液も考慮さ
れている。

好ましい態様において、huTFh含有水溶液は、リン脂
質又は非イオン性界面活性剤中に分散されたhuTFhを含
んでいる。典型的リン脂質:huTFhタンパク質重量比は、
約5:1から12000:1、好ましくは、約50:1から約5000:1そ
してさらに好ましくは、約100:1から2500:1の範囲であ
る。

G.ポリペプチド本発明の各ポリペプチドは、せいぜい約50個、より通
常には約35個以下の、そして好ましくは約25個以下のア
ミノ酸残基を含んでおり、かつ、少なくとも10個の残基
を含んでいる。さらに、本発明のポリペプチドは、その
アミノ酸残基配列及び新しい機能特性を特徴としてい
る。

従って、本発明のポリペプチドの１つの態様は、血液
凝集因子VII/VII aへのhuTFhの結合を競合的に阻害する
能力をその特徴の１部としている、huTFh結合部位ポリ
ペプチド類似物である。本発明の結合部位類似物は活性
化した複合体を作ることなく、すなわち、凝集を開始す
ることなく因子VII/VII aに結合することが望ましい。

ここで用いている“複合体”という言葉は、抗原−抗
体又は、レセプター−リガンド反応のような特異的結合
反応の産物を意味している。代表的複合体としては、免
疫反応産物及びここでTFi VII/VII aと示されていると
ころの組織因子−因子VII/VII a結合反応産物がある。

好ましい態様において、huTFh結合部位類似物は、少
なくとも第１図に示されている30〜35番のアミノ酸残基
を表わしている次に示すアミノ酸残基配列；を含んでいる。

さらに好ましくは、huTFh結合部位類似物は、少なく
とも、次のアミノ酸残基配列；のうちの１つを含んでいる。

これらの配列は、第１図で示すところの各々、30〜40
及び155〜167番の、huTFhのアミノ酸残基を示してい
る。

さらに一層好ましい場合は、huTFh結合部位類似物は
第１図で示すところの、各々26〜49番及び146〜167番で
表わされている、次のアミノ酸残基配列；からなる群から選ばれたアミノ酸残基配列を含む。

好ましいhuTFh結合部位ポリペプチド類似物は第１表
で示されているアミノ酸残基配列を含んでいる。

ポリペプチドp26〜49、p146〜167及びp161〜189も、
抗huTFh抗体分子がhuTFhに結合するのを中和（競争的阻
害）する能力を特徴としている。抗huTFh抗体のhuTFhへ
の結合を中和する能力をもつ本発明の他のポリペプチド
は、第２表に示されているものである。

本発明のポリペプチドは、そのポリペプチドが因子VI
I/VII aへの結合に対し、本来の組織因子と競合でき、
そして、または、huTFhに対する抗huTFh抗体分子の結合
を競合的に阻害しうるかぎり、huTFhのアミノ酸残基配
列と同一である必要がないことを理解すべきである。そ
れ故、本ポリペプチドは、使用する際に有利となるよう
な、保存的、非保存的にかかわらず挿入、欠失及び置換
のような種々の変化を与えることができる。

保存的置換には、あるアミノ酸残基が他の生物学的に
同様の残基に置き換ったものである。保存的置換の例に
は、イソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニンの
ような疏水的残基間の置換又は、アルギニンとリジン、
グルタミン酸とアスパラギン酸又はグルタミンとアスパ
ラギン及びそれに類するもののような極性残基間の置換
がある。また“保存的置換”という語句には、もし、ポ
リペプチドが、必要とされる結合活性を示すならば、未
置換の元々のアミノ酸の代りに、置換されたアミノ酸を
置いることも含まれる。

本発明のポリペプチドが、１つ以上の保存的、もしく
は非保存的置換をしているために、本来のhuTFhの配列
と同一ではない場合、本発明のポリペプチドがラベル又
は固体マトリックス、又はキャリヤーにうまく固定する
“リンカー”を提供する目的で、その各末端に付加的残
基をつけ加える場合は別にして、アミノ酸残基の通常せ
いぜい約20パーセント、より普通には、せいぜい10％が
置換している。本発明のポリペプチドと共に使用される
ラベル、固体マトリックス及びキャリヤーは以下に述べ
る。

通常、アミノ酸残基リンカーは、少なくとも１残基で
あり、また40以上の残基のこともあり、しばしば１〜10
残基が用いられる。リンキングに使われる典型的アミノ
酸残基は、チロシン、システイン、リジン、グルタミン
酸及びアスパラギン酸とそれに類するものである。さら
に、本発明のポリペプチドは、末端NH₂基アシル化、例
えばアセチレーション又はチオグリコン酸アミデーショ
ン、ターミナルカルボキシアミデーション、例えば、ア
ンモニア、メチルアミン、その他により配列が修飾を受
けていることで、天然の配列とは異なることがある。

キャリャー・ハプテンのように、当分野でよく知られ
ているリンカーを介してのキャリヤーとの結合の場合、
本発明のポリペプチドは、huTFhと免疫反応する抗体を
誘導することができる。免疫学的な交差反応性の明白な
原則からみて、本発明は、第１表及び第２表で示されて
いるポリペプチドの抗原的に関連したバリアントも考案
している。“抗原的に関連したバリアント”とは、第１
表もしくは第２表のポリペプチドの、少なくとも６個の
アミノ酸残基配列領域を含み、かつ、第１表又は第２表
のポリペプチド及びhuTFhと免疫反応を起こす抗体分子
を誘導することができるポリペプチドのことである。

また、ポリペプチドがリン脂質又は非イオン性界面活
性剤中に分散した、huTFh結合部位ポリペプチド類似物
の水性溶液を含む組成物を、本発明は考案している。典
型的なリン脂質：ポリペプチド重量比は、約5:1から20
0:1、好ましくは約30:1〜80:1、さらに好ましくは、約4
5:1〜55:1の範囲にある。リン脂質中に分散して使用す
るのに適している好ましいhuTFh結合部位類似物をセク
ションIIの第４表にリストした。

本発明のポリペプチドは、ポリペプチドの分野ではよ
く知られているいくつかの方法で合成することができ
る。使用しうる多くの技術のすぐれたまとめは、J.M.ス
チワード（Steward）及びJ.D.ヤング（Young）の“固相
ペプチド合成”（1969年、サンフランシスコ、W.H.フリ
ーマン（Freeman）社）及びJ.メイエンホーファー（Mei
enhofer）の“ホルモン性タンパク質及びペプチド”（1
983年、アカデミックプレス社（ニューヨーク）、２
巻、46頁）が固相ペプチド合成について、またE.シュロ
ーダー（Schroder）とK.クブケ（Kubke）の“ペプチ
ド”（1965年、アカデミックプレス社（ニューヨーク）
１巻）が古典的な液相法について行なわれている。

H.接種物別の態様において、本発明のポリペプチド又は、その
抗原的に関連したバリアントは、生理学的に許容しうる
水性希釈剤組成物として、その効果的量が投与された
時、huTFhと免疫反応する抗体を誘導することができる
接種物となる。種々の文法型の“接種物”という語は、
huTFhに対する抗体の調製に用いられる活性成分とし
て、本発明のポリペプチドを含む組成物として、ここで
使用されている。ポリペプチドの抗体を誘導するのに用
いられるとき、そのポリペプチドは、単独で、又は結合
体としてキャリヤーと結合して、又は、ポリペプチド重
合体として用いられるのであるが、表現の簡便性のた
め、本発明のポリペプチドの種々の態様は、全て、“ポ
リペプチド”という語及びその種々の文法型で呼ばれて
いることを理解されよう。

約35以下のアミノ酸残基を含むポリペプチドに対し、
すでに記されているように抗体生産の誘導のためには、
キャリヤーに結合したペプチドを使用する方が望まし
い。

すでに記してきたように、１つ以上の付加的アミノ酸
残基をポリペプチドのキャリヤーへの結合を助けるた
め、そのポリペプチドのアミノ又はカルボキシ末端に付
加することができる。ポリペプチドのアミノ又はカルボ
キシ末端へ付加したシスティン残基は、ジスルフィド結
合を介して、結合体を作るのに特に有用であることが分
っている。しかし、結合体を調製の当分野でよく知られ
ている他の方法も使用しうる。代表的付加結合法にはミ
カエル付加反応産物、グルタルアルデヒドのようなジア
ルデヒド（クリプスタイン（Klipstein）等（ジャーナ
ル・オブ・インフェクシャス・デシーズ（J.Inpect.Di
s）、147巻、318〜326頁、（1983年））及びそれに類す
るものの使用、又は、キャリヤーに対し、アミド結合を
生ずる、水溶性カルボジイミドの使用ような、カルボジ
イミド法の使用が含まれる。活性官能基を介してのタン
パク質の結合については、オーラメアス（Aurameas）等
のスカンジナビアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー
（Scand.J.Immunol.）８巻、補１、７、７〜23頁（1978
年）を参照せよ。

有用なキャリヤーは、当分野ではよく知られており、
一般的にはタンパク質そのものである。そのようなキャ
リヤーの代表例としては、キーホール、リンペット、ヘ
モシアニン（KLH）、エデスチン、チログロビン、子ウ
シ血清アルブミン（BSA）やヒト血清アルブミン（HSA）
のようなアルブミン類、ヤギ赤血球（SRBC）のような赤
血球類、テタナストキソイド、コレラトキソイド、ポリ
（Ｄ−リジン:D−グルタミン酸）のようなポリアミノ酸
及びこれに類するものがある。

キャリヤーの選択は、その接種物の最終的使用法に依
存しており、本発明に特に関係しない基準に基づいてい
る。例えば、接種される動物中で不都合な反応を起こさ
ないキャリヤーが選択されるべきである。

本発明の接種物は、典型的には、キャリヤーに結合し
た結合物として、効果的な免疫原量の本発明のポリペプ
チドを含む。他の事項の中で、単位投与量当りの効果的
なポリペプチド量は、当分野ではよく知られているよう
に、接種される動物種、その動物の体重及び選択した接
種レジメンに依存する。典型的に、接種物は、接種（投
与）当り約10マイクログラムから約500ミリグラム、好
ましくは、約50マイクログラムから約50ミリグラムのポ
リペプチドを含んでいる。

本発明の接種物に用いられている“単位投与”という
語句は、各ユニットが、必要とする希釈剤、すなわち、
キャリヤー又はビヒクルと共に望ましい免疫原的効果を
産むのに必要な予め決められた量の活性物質を含む、動
物に対する１回の投与に適した物理的に分離した単位を
意味する。本発明の接種物の新しい単位投与に関する明
細は、（ａ）活性物質の独特な特性及びその独自の免疫
学的効果、及び（ｂ）ここで詳細に公開されている動物
中での免疫学的使用に内在する制限により説明され、か
つ直接依存しており、これらが本発明の特徴となってい
る。

典型的には、接種物は、水、食塩水又はリン酸緩衝食
塩水などの生理学的に許容された（受容できる）希釈剤
中にポリペプチド−結合体を分散させることにより、乾
燥した固体のポリペプチド結合体から水性組成物を調製
することができる。

また、接種物は希釈剤の一部として、アジュバントを
含んでいる。完全フロイントアジュバント（CFA）、不
完全フロイントアジュバント（IFA）及びミョウバンの
ようなアジュバントは、当分野ではよく知られており、
いくつかの会社から市販されている。

I.抗体及び抗体組成物種々の文法型の“抗体”という語は、イムノグロブリ
ン分子及びイムノグロブリン分子の免疫学的に活性な領
域すなわち抗体結合部位又はパラトープを含む分子を意
味する。代表的抗体分子には、本来のイムノグロブリン
分子、実質的に本来のものと同じイムノグロブリン分子
及びFab、Fab′、Ｆ（ab′）_２及びＦ（ｖ）として、当
分野で知られている領域を含む、パラトープを含有す
る、イムノグロブリン分子の一部がある。

本発明の抗体組成物は、huTFh及び本発明の特異的ポ
リペプチドの少なくとも１つと免疫反応を起こす抗体分
子を含むことを特徴とする抗ペプチド抗体である。

例えば、huTFh及び組織因子結合部位のポリペプチド
類似物と免疫反応する抗体分子を含む、本発明の抗体組
成物は組織因子が因子VII/VII aと結合する能力を中和
できる。従って、好ましい抗体組成物は、huTFh及びp26
−49又はp146−167と反応し、かつ、p204〜226と実質的
に免疫反応しない抗体分子を含むものである。huTFhに
対して生ずるポリクローナル抗血清は、p204−226と免
疫反応する抗体を含むことに注意すべきである。このよ
うに、抗204−226免疫反応性が実質的にないことが、本
抗体組成物と従来の報告されているものとを区別する特
性となっている。

本発明の抗体組成物の典型的生産は、ホ乳動物を、本
発明の接種物で免疫化し、適当なポリペプチド免疫特異
性を有するホ乳類抗体分子を誘導することによって行な
われる。さらに、その抗体分子をそのホ乳動物から収集
し、例えば、免疫アフィニティ・クロマトグラフィーの
ような従来技術によって、その必要量を単離する。この
ように生産した抗体組成物は、なかんずく、診断法及び
身体サンプルにおけるhuTFhを検出するための、本発明
のシステムで用いることができる。

モノクローナル抗体組成物も、本発明で考案されてい
る。検出限界内で、モノクローナル抗体組成物は、効果
的にhuTFhと結合しうる、唯一種類の抗体結合部位を含
んでいる。従って、典型的に、本発明のモノクローナル
抗体組成物は、それがhuTFh以外のタンパク質を結合で
きる抗体をたとえ含んでいたとしても、huTFhへの結合
親和性を示す。ひとつの態様において、モノクローナル
抗体組成物は、huTFh及び、組織因子結合部位のポリペ
プチド類似物、好ましくはp26〜49又はp146〜167と免疫
反応する抗体分子を含んでいる。

他の態様において、本発明は、huTFhと免疫反応し、h
uTFhにより開始する凝集を阻害する抗体分子を含む抗凝
集（中和）MoAbを考案した。さらに凝集を阻害する好ま
しいMoAbは本発明のポリペプチド、好ましくは、huTFh
結合部位ポリペプチド類似物、及びさらに好ましくは、
第１表で示されているポリペプチドと免疫反応すること
を特徴とする。

他の態様において、抗凝集MoAbは、huTFh及びhuTFh:
因子VII/VII aの複合体と免疫反応し、huTFhによって開
始する凝集を阻害（中和）する抗体分子を含んでいる。
さらに、好ましい抗凝集MoAbはhuTFhポリペプチドp1−3
0又はp26−49と免疫反応することを特徴とし、またこれ
は、huTFhポリペプチドp56−71と免疫反応しないことが
好ましい。

また、本発明は、組織因子の凝集を開始する能力を中
和しない抗体分子を含む非中和性モノクローナル抗体組
成物も考案した。そのような組成物は、huTFh及びポリ
ペプチドp1−30と免疫反応し、かつ、ハイブリドーマTF
9−10H10により生産（分泌）される抗体分子を含むこと
が望ましい。

本発明のモノクローナル抗体組成物は、適当なポリペ
プチド特異性をもつ抗体分子を分泌するハイブリドーマ
を含有する栄養培地を含む、モノクローナルハイブリド
ーマの培養を開始することによって生産することができ
る。

このハイブリドーマが培地中に、その抗体分子を分泌
するのに十分な条件及び時間、培養を維持する。それか
ら、抗体含有培地を収集する。さらにこの抗体分子を従
来法により単離する。

これらの組成物の調製に有用な培地は、当分野ではよ
く知られておりまた、市販されていて、合成培養培地、
同血統繁殖マウス及びそれに類するものが含まれでい
る。代表的合成培地は、4.5g/のグルコース、20mgグ
ルタミン及び20％ウシ胎児血清を補足した、ダルベコ最
小培地（DMEM;ダルベコ（Dolbecco）等、ヴィロロジー
（Vivol）、８巻、396頁（1959年））である。代表的同
血繁殖マウス株はBalb/eである。上述の方法で生産した
モノクローナル抗体組成物は、例えば、huTFh含有免疫
反応の形成が必要である。診断及び治療法で用いること
ができる。

J.ハイブリドーマ本発明のハイブリドーマは、huTFhと免疫反応する抗
体分子を生産することを特徴とする。さらに、好ましい
ハイブリドーマは、huTFhで開始する凝集を阻害し、ま
た、望ましくは、本発明のポリペプチド、好ましくは、
huTFh結合部位ポリペプチド類似物、そしてさらに好ま
しくは、第１表に示されているポリペプチドと免疫反応
する抗体分子を生産することを特徴としている。さらに
好ましい態様においては、抗凝集MoAbは、非ヒト、霊長
類、Tfと免疫反応する。

他の好ましい態様において、本発明のハイブリドーマ
はhuTFh及びhuTFh;因子VII/VII aの複合体と免疫反応
し、huTFhにより開始する凝集を中和する抗体分子を生
産する。さらに、huTFh;因子VII/VII aの複合体と免疫
反応するハイブリドーマ生産抗体は、該抗体の、huTFh
ポリペプチドp1−30又はp26−49、好ましくはその両方
と免疫反応し、かつ、より好ましくは、該抗体分子が、
ポリhuTFhポリペプチドp56−71とは免疫反応を起こさな
いことを特徴としている。

望ましい免疫特異性を有する、すなわち、特別なタン
パク質そして、またはポリペプチドと免疫反応する抗体
分子を生産する（分泌する）ハイブリドーマの作成法
は、当分野ではよく知られている。特に、ニマン（Nima
n）等により報告されたハイブリドーマ技術は（プロシ
ーディング・イン・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンス（Pvoc.Natl.Acad.Sci.）USA、80巻、4949〜49
53頁（1983年））、有用である。好ましいハイブリドー
マを、例13の第５表に示した。

ハイブリドーマ培養物TF8−5G9、TF9−6B4、TF9−10H
10はブタペスト協定に従がい、1987年３月27日ATCCに保
管され、各々受理番号、HB9382、HB9381及びHB9383が割
当てられた。同様に、ハイブリドーマ培養物TF9−5B7
も、ブタペスト協定に従がい、1988年３月９日ATCCに保
管され、受理番号HB9658が割り当てられた。

K.治療方法及び組成物本発明のhuTFh因子VII/VII aの結合部位ポリペプチド
類似物、抗体組成物、モノクローナル抗体組成物及び抗
凝集MaAbは各々、生体内において、組織因子による因子
VII/VII aの結合を調整するのに用いることができる。

例えば、huTFh因子VII/VII aの結合部位ポリペプチド
類似物は、効果量を被検者に投与したとき、因子VII/VI
I aの組織因子への結合を競争的に阻害することができ
る、医療的に許容しうる組成物に用いることができる。
この阻害は、組織因子−因子VII/VII a複合体形成速度
の減少によると考えられている。従って、生体内におい
て、huTFh因子VII/VII a結合部位ポリペプチド類似物の
投与は、凝集やある炎症反応のような、組織因子の因子
VII/VII aへの結合により開始する生理学的応答を調節
するのに用いることができる。好ましい態様において、
このポリペプチドは、先に述べたように、リン脂質中に
分散して投与される。

生体内における組織因子による因子VII/VII aの結合
を調節する他の方法は、本発明の抗体組成物（抗ペプチ
ド抗体）又は抗凝集MoAbの効果量を静脈注射により投与
することである。この抗体分子は、パラトピック領域を
含み、かつイムノグロブリン分断片Ｆ（ab′）_２、Fab
及びそれに類するもののような、Fc領域を含まないもの
である。治療的に効果的量の抗凝集MoAbは、体重kg当り
15μｇから5mg、好ましくは体重kg当り、約100μｇから
約1mg、より好ましくは、体重kg当り約150μｇから約50
0μｇの範囲である。

他の態様において、本発明のMoAb、抗凝集MoAb又は非
中和性MoAbの抗体分子を抗腫瘍試薬に結合し、抗腫瘍治
療組成物が作られる。このようにして作った、効果量の
抗腫瘍治療組成物を、その表面に組織因子を発現する腫
瘍細胞を有する被検者に投与することができる。このよ
うな腫瘍細胞の代表例は、胸及び肺のがん細胞である。

ここで考案された抗腫瘍試薬の代表例には¹³¹I、¹⁸⁸R
e、²¹²Bi及びこれに類するもののような放射性核種があ
る。放射性核種結合モノクローナル抗体治療組成物の製
造法及びその使用法は、コザック（Kozak）等（トレン
ズ・イン・バイオテクノロジー（Trends in Biotech.）
４巻、259〜264頁（1986年））により報告されている。

投与されたポリペプチド又は抗体分子含有組成物は、
溶液又はサスペンジョンの形をしているが、ポリペプチ
ドは、錠剤、丸薬、カプセル、放出持続製剤又は粉末の
形もとる。どの場合にも、この組成物は、0.10％〜95
％、好ましくは、25％〜70％の活性成分を含んでいる。

活性成分としてポリペプチド又は抗体分子を含む治療
組成物の調製は、この分野ではよく知られている。典型
的には、このような組成物は、液体溶液又はサスペンジ
ョンのような注射可能な形に調製されるが、注射前の液
体溶液又はサスペンジョンを作るのに適している固体形
としても調製される。またこの調製物はエマルジョン化
されることもある。この活性治療成分は、しばしば、医
療的に許容でき、かつ、活性成分に適合する賦形剤と混
合する。例えば、典型的賦形剤としては、水、食塩水、
デキストロース、グリセロール、エタノール又はそれら
に類するもの及びこれらの組合せたものがある。加え
て、もし、望ましいなら、この組成分は、加湿剤又はエ
マルジョン化剤、pH緩衝剤のような、活性成分の効果を
促進する補助物質を少量含ませることも可能である。

ポリペプチド又は抗体分子組成物は、中和した医療的
に受容しうる塩の形に調整することもできる。医療的に
受容しうる塩には、酸付加塩（ポリペプチド又は抗体分
子の遊離しているアミノ基で形成される）及び、例え
ば、塩酸又はリン酸のような無機酸又は、酢酸、シュウ
酸、酒石酸、マンデル酸のような有機酸及びこれらに類
するもので形成されるものがある。遊離したカルボキシ
ル基で形成する塩も、例えば、ナトリウム、カリウム、
アンモニウム、カルシウム又は鉄の水酸化物のような無
機塩基及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２
−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン及
びこれらに類するもののような有機塩基から誘導され
る。

治療用のポリペプチド又は抗体分子含有組成物は例え
ば、単位投与量の注射によるように、局所的に又は静脈
注射により簡便に投与される。

本発明の治療組成物に対して用いられる“単位投与”
という語句は、ヒトに１回投与するのに適した、必要と
される希釈剤、すなわち、キャリヤー又はビヒクルと共
に、望ましい治療効果をあげるために計算された、予め
決められた量の活性物質を含む、物理的に分離されてい
る単位を意味する。

該組成物は、投与物形状に適した方法で、治療的に効
果的な量が投与される。投与される量は処置される検
体、活性成分を利用する検体の血液凝集システムの容量
及び望ましい組織因子結合能の阻害又は中和度に依存す
る。投与される必要のある活性成分の精密な量は、医師
の診断に依存し、かつ、各個人によっても異なる。しか
し、適当なポリペプチド投与範囲は、１日に、患者当
り、１から５ミリグラムの活性物質というオーダーであ
り、投与の経緯に依存する。第１回投与及び二次免疫の
適正な治療計画もいろいろであるが、典型的には、一次
投与後、１時間以上の間隔をおいて、さらに注射又は他
の方法による投与が繰り返えされる。別に、血液中、10
ナノモル濃度から10マイクロモル濃度を維持するのに十
分な、持続的静脈注入注も考案されている。

L.診断システム本発明のキット型の診断システムは、少なくとも１回
の検定に十分な量の、分包試薬として、本発明の発現タ
ンパク質ポリペプチド、抗体組成物又はモノクローナル
抗体組成物を含んでいる。また、この分包試薬の使用説
明書も含まれているのが普通である。

典型的に、“使用説明書”には、試薬濃度には、混合
する試薬とサンプルの相対量、試薬／サンプル混合物の
維持時間、温度、バッファ条件及びそれに類するものの
ような、少なくとも１回の検定法のパラメーターを明確
に記述してある。

好ましい態様において、さらに、本発明の診断システ
ムは、試薬を含む複合体の形成を知らせるラベル又は指
示手段を含んでいる。

ここで用いられているように、種々の文法型の“ラベ
ル”及び“指示手段”は、複合体の存在を示す検出可能
な信号を産み出すのに直接又は間接的に関連する単一の
原子及び分子を意味する。“生体内”ラベル又は指示手
段とは、被検者の体内で有用なものである。どのラベル
又は指示手段も、本発明の抗体又はモノクローナル抗体
組成物の一部である抗体分子、発現したタンパク質、又
はポリペプチドに結合又は組込まれていることもある
し、また別々に使用されることもあり、また、これらの
原子又は分子は付加的試薬と組合せて、又は単独で使用
されうる。このようなラベルは、臨床的診断化学におい
ては、よく知られているものであり、それらが、他の新
しいタンパク質、方法、そして、又はシステムとともに
使用されるときに限り、本発明の一部を構成する。

ラベルの結合、すなわち、ポリペプチド及びタンパク
質のラベル化は、当分野ではよく知られている。例え
ば、ハイブリドーマによって生産される抗体分子は、培
養培地中の成分として与えられたとき、放射性同位元素
含有アミノ酸の代謝的取込みによるラベル化が可能であ
る。例えば、ガルフレ（Galfre）等の、メソッズ・イン
・エンザイモロジー（Meth.Enzymol.）73巻、３〜46頁
（1981年））参照。活性化官能基を介するタンパク質の
結合又はカップリング技術は特に有用である。例えば、
オーラメアス（Aurameas）等の、スカンジナビアン・ジ
ャーナル・オブ・イムノロジー（Scand.J.Jmnunol.）８
巻、補版７巻、７〜23頁（1978年）、ロッドウェル（Ro
dwell）等の、バイオテクノロジー（Biotech.）、３
巻、889〜894頁（1984年）及び米国特許第4,493,795号
参照。

また、診断システムは、好ましくは分包の、特異的試
薬を含む。“特異的結合試薬”は、本発明の試薬を選択
的に結合できる分子であるが、本発明のタンパク質発現
産物、ポリペプチド又は抗体分子そのものではない。代
表的な特異的結合試薬は、抗体分子、補体タンパク質又
はその断片、タンパク質Ａ、血液凝集因子VII/VII a、
子ウシ組織因子及びそれに類するものがある。この特異
的結合試薬は、反応物が複合体の一部として存在すると
き、これと結合することが望ましい。

好ましい態様において、特異的結合試薬はラベル化さ
れる。しかし、その診断システムが、ラベル化されてい
ない特異的結合試薬を含むとき、典型的には、この試薬
は、増巾手段又は試薬として用いられる。これらの態様
において、このラベル化した特異的結合試薬は、この増
巾手段が、反応種含有複合体に結合しているとき、この
増巾手段に特異的に結合することができる。

本発明の診断キットは、血清、血漿又は尿のような体
液サンプル中のhuTFhの存在又は量を検出するのに“イ
ライザ”方式で用いることができる。“イライザ法”
は、サンプル中に存在する抗原又は抗体量を検出及び定
量するための、固相に結合した抗体又は抗原及び酵素−
抗原又は酵素−抗体結合物を用いた、酵素結合免疫吸着
検定法のことである。イライザ法の説明は、全て参考と
してここに組込まれている、1982年、CA州ロサンゼェル
スのラング・メディカル・パブリケーションから出版さ
れた、D.P.サイツ（Sites）等の基本的及び臨床的免疫
学、第４編、第22章及び米国特許第3,654,090号、第3,8
50,752号及び第4,016,043号に報告されている。

このように、好ましい態様において、本発明の発現し
たタンパク質、ポリペプチド又は抗体は固相マトリック
スに固定され、この診断システム中に、分包されている
固体サポートを形作っている。

典型的に、この試薬の固体マトリックスの固定は、他
の固定法もあるが、この分野でよく知られている水性媒
体からの吸着が用いられている。

有用な固体マトリックスは、当分野でよく知られてい
る。このような物質には、ファルマシア・ファイン・ケ
ミカルズ社（NJ州、ピスカタウェイ）から、セファデッ
クスという登録商標で市販されている、架橋デキストラ
ン；アガロース;IL州、北シカゴ、アボット・ラボラト
リーズ社から市販されている直径約１ミクロン〜約５ミ
リメートルのポリスチレンビーズ；シート状、ヒモ状又
はヘラ状のポリ塩化ビニルポリスチレン、架橋ポリアク
リルアミド、ニトロセルロース又はナイロンベースの織
物、又は、ポリスチレン又はポリ塩化ビニルでできてい
るチューブ、プレート又はマイクロプレートのウェルが
含まれる。

ここで述べられている診断システムの試薬、ラベル化
結合試薬又は、増巾試薬は、液体分散物として溶液とし
て、又は、例えば、凍結乾燥型のような、実質的に乾燥
粉として提供される。指示手段が酵素である場合、この
酵素基質も、システムの別の包むに提供される。先に述
べた、マイクロプレートのような固体サポート及び１つ
以上のバッファも、この診断検定システム中に別にパッ
ケージされた要素として含まれている。

診断システムに関連して、ここで議論されているパッ
ケージは、診断システムにおいて通常使われるものであ
る。このようなパッケージには、ガラス及びプラスチッ
ク製の（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン及びポ
リカーボネート）ボトル、バイアル、プラスチック及び
プラスチックホイルでラミネートした外袋物及びこれら
に類するものが含まれている。

M.検定法本発明は、本発明の抗体又はモノクローナル抗体組成
物中に含まれている、発現されたタンパク質、ポリペプ
チド又は抗体分子を含む複合体を生産することによりhu
TFhを検出する方法を考案した。当業者には、これらの
複合体を形成するのに利用できる多くの、よく知られて
いる臨床的診断の化学手段があることが理解できよう。
従って、典型的検定方法がここで説明されているが、こ
れは、本発明を制限するものではない。

1.血栓検出被検者中に存在する血栓検出法が考案された。生体内
での指示手段と結合する抗体を含む本発明の、効果的量
のモノクローナル抗体組成物を、被検者に静脈注射す
る。好ましい態様において、ラベル化した抗体は、huTF
h及び第１表及び第２表のポリペプチドと免疫反応する
がp204〜226とは反応しないもので、好ましくはハイブ
リドーマTF8−5G9、TF9−6B4又はTF9−10H10から生産さ
れたものである。

それから被検者を、ラベル化した抗体分子が、血栓の
一部に存在するhuTFhと反応し、複合体を作るのに十分
な決められた時間、及び、好ましくは、未反応の抗体分
子が体内から一掃されるのに十分な付加的時間維持す
る。その後、被検者を、生成した複合体の存否及び好ま
しくはその位置について検定する。

2.身体サンプル中のhuTFhの検出身体サンプル、好ましくは体液サンプル中のhuTFhの
存在、及び好ましくはその量を検出するため、競合的又
は非競合的な、種々の不均一及び均一検定法が利用でき
る。例えば、液体体液サンプルと、ラベル化したp26−4
9を、マイクロプレートのウェルの内壁に固定した、ハ
イブリドーマTF8−5G9又はTF9−10H10から生産された抗
体分子を含む固体サポートと混合し、固液相免疫反応混
合物を作る。この混合物をサンプル中に存在するhuTFh
及びラベル化したp26−49が、固体サポートとして存在
する抗体分子への結合を競争し、固相免疫反応産物を形
成するのに十分な時間、生物学的検定条件下に維持す
る。未結合のラベル化p26−49を、免疫反応産物から取
り除く。その後、免疫反応産物として結合したラベル化
p26−49の量を測定し、その差により、huTFhの存在を検
定できる。

例次に示す例は、本発明の説明を意図したもので、これ
を制限するものではない。

1.組織因子含有ヒト脳抽出物の調製生検で得られた正常なヒトの脳を12時間以内に処理す
るかもしくは、−80℃に保存する。その髄膜及び大脳を
除き、ついで残存する脳部分を、ポリトロンホモジナイ
ザー（NY、ウェストバリー、ブリンクマン、インスツラ
メント社）を用いて、等容量の冷（０℃）アセトン中で
ホモジネートした。このホモジネートしたものをさらに
３倍容の冷アセトンと混合し、その組織固体画分を、焼
結ガラスロートを用いて濾過して回収した。各々７回の
２倍容の冷アセトンとの混合及び引きつづく濾過によ
り、残留固体からアセトン可溶性物質を抽出した。最後
の濾過の後、残存するアセトンを、20℃、一晩、残留固
体から大気圧下でエバポレートした。

その後、残留脳組織固体を各々、その固体をヘプタ
ン：ブタノール（2:1）25ミリリットル（ml）当り、組
織固体1gの割で、ヘプタン：ブタノール（2:1）と混合
することによって行う５回の抽出を行ない、ついで濾過
により、その固体を回収する。最後の濾過後、残留脳組
織固体を再び大気圧下、約20℃一晩で乾燥し、脱脂脳組
織粉末を作り、必要になるまで、−80℃に保存する。

つづいて、脳組織粉末25グラムをTS/EDTAバッファ〔1
00ミリモル濃度（mM）NaCl、50mMトリス・塩酸（せ7.
5）、0.02％アジ化ナトリウム、5mMエチレンジアミン四
酢酸（EDTA）、0.1％（V/V）トリトンＸ−100（ポリア
リルエチレン−９−オクチルフェニルエーテル））500m
lと混合し、ついで４℃で一晩撹拌する。さらにこの混
合物を15,300×ｇで１時間遠心する。生じたペレットを
500mlのバッファＡ〔100mM NaCl、50mMトリス・塩酸（p
H7.5）、0.02％アジ化ナトリウム、２％トリトンＸ−10
0）に再懸濁し、スラリーを作る。室温で１時間の撹拌
後、このスラリーを上述のように遠心する。生じた上清
を回収し、凍結乾燥した後、100mlのバッファＡに溶か
して、huTFh含有脳抽出溶液を作る。

2.huTFの凝血活性を測定するための凝集検定法 huTFプロコアグラント活性を、37℃に維持した、全試
薬及び混合物を用いて行う、１段階凝集検定法で測定し
た。血漿と同容積の、20mMクエン酸ナトリウム２水和物
及び140mM NaCl（pH7.4）を含む溶液を混合することに
より、正常なヒト血漿をクエン酸化した。TBS/BSA溶液
（150mM NaCl、50mMトリス・HCl（pH7.5）、0.1％子ウ
シ血清アルブミン）で希釈したhuTFを含むサンプル100
マイクロリットルを、100μのクエン酸化血漿と混合
した。25mM CaCl₂溶液100μを混合し、凝集反応混合
物を作り、凝集が始まるまでゆっくりと揺らした。CaCl
₂添加と、凝血形成の間の時間を測定した。それから、h
uTF活性の標準曲線を、秒で示した凝集時間と希釈率を
プロットすることにより作った。代表的標準曲線を第３
図に示した。

3. huTFの親和性単離のための、因子VII含有固体サポ
ートの調製ヒトの因子VII/VII aを参考文献として組込まれてい
る、フェア（Fair）の報告（ブラッド（Blood）、62
巻、784〜91頁（1983年））に従って単離した。この単
離した因子VII/VII aを、アガロース固体マトリックス
に結合するため、４℃で一晩、その５ミリグラム（mg）
を、0.1M2−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ME
S）（pH6.5）に対して透析した。塩化カルシウムを最終
濃度1mMとなるように添加した。それから因子VII/VII a
を4mlのアファゲルー15活性化アガロースビーズ（CA
州、リッチモンド、バイオラド・ラボラトリーズ社）と
混合し、生じた結合反応混合物を、製造業者が推薦する
もの（バイオラド）に従って４℃、４時間の回転処理を
行った。

固体サポート上の過剰タンパク質結合部位を、その固
体サポートを、0.1Mグリシンエチルエステル中、室温で
１時間撹拌することにより、ブロックした。その後、こ
の固体サポートを、焼結ガラスロート上各約20mlの
（１）バッファＡ、（２）1M NaCl含有バッファＡ、
（３）5mM EDTA含有バッファＡ及び（４）1mM CaCl₂含
有バッファＡをこの順序で用いて洗浄した。それから過
剰の液体を減圧下で除き、半乾燥状の粒子物質（ケー
キ）を作った。

4.huTFの因子VII/VII a親和性による単離 0.1Mのグリシンエチルエステル及び0.1M MES（pH6.
5）を含む20mlの溶液を、22.5mlのアフィゲル−15アガ
ロースビーズ（バイオラド）と混合し、結合反応混合物
を作る。この結合反応混合物を室温に１時間維持する。
この生成した結合物を、焼結ガラスロート上、10倍容の
バッファ１を用い、減圧下で濾過することにより洗浄
し、グリシンエチルエステル−アガロースケーキを作
る。

例１で調製した30mlの脳抽出溶液を、1mM塩化カルシ
ウムを含む６リットルのバッファＡに対し、４℃、１晩
透析を行う。透析した脳抽出物を、グリシンエチルエス
テル−アガロースケーキと混合し、固液相反応混合物を
作る。回転しながら室温で２時間維持した後、この固液
相を焼結ガラスロートを用いて濾過することで分離す
る。この液相を回収し、最終濃度ml当り10ユニットとな
るようにトラシロール（MO州、セントルイス、シグマケ
ミカル社、アプロチニン）と混合する。この回収した液
相を例３で調製した因子VII/VII a/アガロースケーキと
混合し、第２の固／液相混合物を作る。

この混合物を回転しながら、一晩４℃に維持し、huTF
−因子VII/VII a含有固相産物を形成させる。その後、
この固相及び液相を先に述べたように濾過により分離す
る。焼結ガラスロート上に残留物する固相を1mM塩化カ
ルシウムを含むバッファA25mlで洗浄した。さらに、こ
の固相を焼結ガラスクロマトグラフィーカラム（0.5×1
5cm、バイオラド）に移し、6mlの同洗浄バッファで洗浄
した。上記の洗浄後、この固体サポートに結合したhuTF
を、焼結ガラスカラム上に保持されている固体サポート
を5mMのEDTAを含むバッファＡで洗浄することにより、
遊離（溶出）させる。溶出した物質を1ml画分づつ回収
し、各画分について、例２で述べた方法により、huTFの
存否を検定した。huTF含有画分を集め、４℃で、１％ト
リトンＸ−100を含む６リットルのTBS（150mM NaCl、15
0mMトリス塩酸、pH7.5）に対して１晩透析した。

このようにして作った透析物をつづいて、４倍容の冷
アセトンと混合し、huTFタンパク質を沈殿した。この沈
殿をおよそ−10℃、5000×ｇ、30分間の遠心で集めた。
生成したペレットを窒素雰囲気下で乾燥した。典型的な
収量は、脱脂した脳組織粉末１グラム（乾燥重量）当
り、２μｇのhuTFであった。

このようにして生じた単離huTFサンプルをTBS/トリト
ン中に懸濁し、ついで、製造業者の指示に従がい（IL、
ロックフォード、ピアス・ケミカル社）、ヨードゲンを
用い、Na ¹²⁵Iでラベル化した（IL州、アーリントンハ
イツ、アマーシャム社、マイクログラム当り16マイクロ
キューリ）。ラベル化後、過剰の未反応¹²⁵IをTBS/トリ
トンを用いたセファデックスG25（NJ.ピスカタウィイ、
ファルマシア社）での脱塩クロマトグラフィーにより、
ラベル化したhuTFから分離した。

¹²⁵Iラベル化huTF含有サンプルのラウリル硫酸ナトリ
ウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による（SDS−P
AGE）評価は、レムリ（Laemmli）（ネイチャー（Natur
e）、227巻、680〜685頁（1970年））の方法に従った。
還元条件下で評価するサンプルに対しては、100mMのジ
チオスレイトールを、サンプルバッファ中に含有させ
た。１％トリトンＸ−100、50mMトリス塩酸（pH7.4）、
150mM NaCl中の¹²⁵I huTFを、10分の１容のTF8−5G9又
はPAb100（ATCC−TIB115;ここでネガティブコントロー
ルとして用いられているSV40ラージＴ抗原特異的抗体を
生産するハイブリドーマ）ハイブリドーマ培養上清とと
もに、４℃で１晩インキュベートすることにより免疫沈
殿化を行った。アガロースビーズ（MO州、セントルイ
ス、シグマ・ケミカル社）上に固定したヤギの抗マウス
IgGを、その第１次免疫反応産物を吸収するのに用い
た。このビーズを同バッファでよく洗浄し、結合した
¹²⁵I−huTFを、DTT存在下又は非存在下、同バッファ中
で５分間煮沸することにより溶出した。SDS−PAGE後、
タンパク質バンドはオートフルオログラフィーで可視化
した。

単離したhuTFを放射性ヨウ素化し、DTTで還元し、つ
いで10％アクリルアミドゲルでSDS−PAGE分析したと
き、47kダルトンの見かけの分子量をもつ単一のメイン
バンドが観察された（第４図）。しかし、未還元のhuTF
を同様に分析した場合は、およそ58及び47kDaの２つの
バンドが相対的に等しい量で観察され（第５図レーン
Ｂ）、このことは、少なくとも２つの異なる多きさのも
のの存在を示している。

非還元で観察されるこの２つのバンドに対する説明と
しては、その大きな方、すなわち、泳動が遅いバンド
は、非常に多くのグリコシル化を受けたものか、付加的
なプロセッシングを受けていないタンパク質を有してい
るのか、又は、付加的な、ジスルフィド結合で結合した
ポリペプチドと会合しているのかもしれないというもの
である。還元後の単一バンドの存在は、はじめの２つの
示唆と一致している。その後者の可能性は中でも一番大
きいように思えるが、その小さいサイズの差のために、
付加的ポリペプチド鎖は、色素の場所又はその付近に泳
動するような十分小さいものらしく、還元後、10％アク
リルアミドでは分離されないのであろう。15％のポリア
クリルアミドゲルの還元及び非還元huTFの電気泳動は、
単一の分離した軽鎖を示すのには失敗したが、いくつか
の少量の、速く泳動するバンドが観察された（第５図、
レーンＡ及びＢ）。これらの小さい、少量のポリペプチ
ドは、以前に報告されているように（ブローズ（Broz
e））等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリー（J.Biol.Chem.）、260巻;10917〜20頁（1985
年）及びグハ（Guha）等、プロシーディング・イン・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.
Acad.Sci.）USA、83巻、299〜302頁（1986年））、汚染
物を示している。この可能性を明らかにするため、47kD
a及び58kDaのバンドは非還元ゲルから切り出され、その
各々を、ジチオスレイトールで還元し、その各々を、15
％アクリルアミドゲルを用いたSDS−PAGEにかけた（第
５図、レーンＣ及びＤ）。58kDタンパク質は12.5kD軽鎖
及び47kDa重鎖であると分った。47kDaのタンパク質を分
析したとき、同分子量の重鎖のみが観察された。このよ
うに、両者は、SDS−PAGEで同様の挙動をもつ重鎖を保
有していた。

直接軽鎖の存在を示すため、¹²⁵I−huTFを、huTF特異
的モノクローナル抗体TF8−5G9で免疫沈殿化し、それを
還元剤存在下の電気泳動にかけた。主要な47kDaバンド
がおよそ、12.5kDaの分離したバンドとともに観察され
た（第６図、レーンＡ）。還元化しないサンプルの電気
泳動でおよそ47kDa及び58kDaのバンドを生じたが、低い
分子量のポリペプチドは生じなかった（第６図、レーン
Ｂ）。また非還元huTFの電気泳動は、ブローズ（Broz
e）等（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー（J.Biol.Chem.）、260巻;10917〜20頁（1985
年））により示唆されているhuTF重鎖のダイマーと一致
する、少量の90kDaタンパク質も示した。

huTF軽鎖が重鎖からタンパク質の分解によって生ずる
という可能性を研究するため、SDS−PAGEにより単離し
た軽鎖及び重鎖を、Ｎ末端アミノ酸配列分析にかけた。

重鎖及び軽鎖をSDS−PAGEで分離し、アバーソールド
（Abersold）等の高pH法（ジャーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）、261巻、4225
〜4238頁（1986年））を用い、活性化した、アミノ被覆
ファイバーガラスフィルター上に電気ブロットした。こ
のタンパク質バンドを、蛍光染料（アバーソールド（Ab
ersold）等、上記）により、このブロットを可視化し、
切り出し、そして、まだファイバーガラスに結合したま
ま、PTH誘導体のオン・ラインHPLC分析を用いたアプラ
イド・バイオシステムズ470Aタンパク質シークエンサー
で配列決定した。別にタンパク質バンドをコマージ・ブ
ルーによる染色によりゲルを可視化し、シークエンシン
グのために、電気溶出した。両方法とも等しい結果を与
えた。

huTF重鎖のマイクロシークエンシングは、ほぼ等モル
量のアミノ酸配列で一致した結果となった。ほとんど全
ての場合、各アミノ酸残基は２サイクル離れて、２度出
現する。これは、長さがＮ末端で２残基異なるhuTF重鎖
の２つのバリアントがねじれたＮ末端をもつことの明白
な証拠である。大きい方のバリアントのＮ末端は、非特
定のアミノ酸Ｘを含むであることが誘導された。

軽鎖の配列決定するいくつかの試みは、ブロックされ
たＮ末端と一致して、なんら配列の情報を与えなかっ
た。しかし、huTFの重鎖及び軽鎖は、単離されたhuTFに
対して生じた、２つのウサギの抗huTF抗血清及び28個
の、マウスモノクローナル抗体の全てが、重鎖のみに結
合することが分っていることから、抗原的に全く別のも
のである。それゆえ、軽鎖は、重鎖のタンパク質分解断
片とは考えにくい。さらに軽鎖は、ベーター_２ミクログ
ロブリンに対する抗血清とは反応しなかった。

現在、12.5kDのhuTF軽鎖の意味は知られていない。そ
れは、単一の、独立した分子種なので、ランダムなジス
ルフィド交換による、単離の際にアーティファクトとし
て誘導されたものでもないようだ。還元なしに、親和性
による単離を行ったhuTFをSDS−PAGEにかけたとき、huT
F活性は、58kDaと47kDaの分子量に対応するゲルから溶
出した。これら２つの分子量に対応するhuTF活性も、粗
脳又は部分的に単離した胎盤の抽出物を、SDSゲルの電
気泳動にかけたとき（データ示さず）も検出された。全
ての場合において、その活性は、因子VII依存で、この
ことは、huTF特異的活性を示している。これらの知見
は、huTFのみが因子VIIを活性化でき、かつ、軽鎖はこ
の機能に必要ないことを示している。

軽鎖がhuTF重鎖のおよそ半分のみにジスルフィド結合
していることは興味深い。生体内で、huTFの重要な領域
に不在なのか、存在するのかとは別に、界面活性剤で分
解される、非共有的相互作用を介して会合しているので
あろう。軽鎖は、サイズが小さく、SDS−PAGEの際にマ
ーカー色素の部分に泳動してしまうため、また、huTFの
報告されている分析例が還元後行なわれていることか
ら、初期の研究では気づかれなかった。現行の親和性を
用いた方法で単離することができる制限された量では、
タンパク質染色によって、会合した小ポリペプチド鎖を
検出することは困難である。

イン・ビトロでは、単量体huTFが凝集を開始するにも
かかわらず、huTFによる凝集の生理的開始は、細胞表面
で起こる。軽鎖は、直接的凝集検定法で検出することが
できる、huTF機能又は機構において重要な役割をはたし
ていることが推察できるであろう。例えば、軽鎖は、因
子VII/VII aの組織因子への結合の正の協同性を説明す
ると仮定されてきている、因子VIIに対する２つのサブ
ユニットレセプターのアッセンブリーに関与している可
能性がある。別に、細胞表面上の構造ドメインでのhuTF
の機構及び、細胞表面上でのhuTF活性の制御は、huTF軽
鎖に仲介されるのかもしれない。

Ｎ結合オリゴ糖の役割は、¹²⁵I−huTFサンプルの脱グ
ルコシル化により試験した。毎分およそ3.6×10⁵カウン
トを含む、ラベル化huTF約12.74ナノグラムを0.4ユニッ
トのグリコペプチダーゼＦ（IN州、インディアナポリ
ス、ベーリンガー、マンハイム・バイオケミカルス
社）、20mMトリス塩酸（pH7.5）、10mM EDTA、及び１％
トリトンＸ−100を含む20μの溶液と混合し、37℃に1
6時間維持した。それから、この脱グリコシル化した産
物を、先に述べたSDS−PAGEで分析した。

第７図、レーン４及び５に示した、脱グリコシル化の
研究結果は、58kDaのhuTFは、別のタンパク質部分、す
なわち軽鎖の存在のため、47kDaのものよりも、高い相
対分子量を示すことを表わしている。

このようにして単離したhuTFを、再脂質化し、そのプ
ロコアグラント活性が再構成された。最高の活性を有す
る再脂質化組成因子産物を提供するのに必要な組織因
子：脂質比が、0.1％BSAを含むHBSバッファ溶液（20mM
ヘペス、pH6.0、140mM NaCl、0.01％アジ化ナトリウ
ム）中、種々の濃度となるように、上述の得られた単離
huTFを溶かすことにより実験的に測定された。それか
ら、種々huTF希釈物を以下に述べるように再脂質化し、
さらに、例２で報告されている凝集検定法で測定され
た、最も高い活性を示す比が、後の使用のために準備さ
れた。

huTFの再脂質化のための脂質は、MO州、セントルイ
ス、シグマケミカル社から入手できるウサギの脳アセト
ン抽出粉末から抽出することにより調製した。この粉末
を、粉末1gに対し、25mlのヘプタン：ブタノール（2:
1、v/v）の割でヘプタン：ブタノールと混合し、ついで
これに含まれる固体を焼結ガラスロートを用いた濾過に
より回収した。残留固体について、この抽出を６回くり
返した。さらに、この残留固体をロト・エバポレーショ
ンで乾燥し、クロロホルムに溶解後、−80℃に保存し
た。必要なときに、そのクロロホルムに溶解した固体を
窒素雰囲気下で乾燥し、新しく調製した0.25％のデオキ
シコール酸ナトリウム溶液中、4mg/mlとなるように溶解
し、ウサギ脳リン脂質溶液（PBPL）を作った。

再脂質化には、各huTF希釈物100μを、100μのRB
PL溶液、0.76mlの１％ウシ血清アルブミンを含むHBS溶
液（HBS/BSA）及び40μの100mM塩化カドミウムと混合
する。この混合物を２時間、37℃に維持し、ついで、こ
こに含まれるhuTF活性を、例２で述べた凝集検定法で測
定した。

5. ハイブリドーマ及びモノクローナル抗体の作成全てのハイブリドーマは、６〜８週間の年令の、スク
リプス・クリニック・アンド・リーサーチ・インスチチ
ュート、動物飼育場から入手できるメスのBalb/cマウス
由来の脾臓細胞を用いて作成された。

a.マウスTF8の免疫化例４で調製した親和性単離化huTF5マイクログラムを1
00μg/mlとなるよう生理食塩水に溶かし、MO州ハミルト
ンのリビ・イム／ケム・リサーチ社から入手したＲ−70
0アジュバントと1:1の割合で混ぜ：エマルジョン化し
た。ついで、このエマルジョンをマウスTF8に皮下注射
した。

このマウスTF8は同様に、約２週間後、変性huTF及び
Ｒ−700アジュバントを含むエマルジョンの接種を受け
た。変性huTFは、0.09％トリトンＸ−100、0.93％SDS、
0.2M−２−メルカプトエタノール及び270μg/ml huTHを
含むTBS（150mM CaCl₂、50mMトリス−HCl（pH7.5）を、
５分間煮沸して調製した。その後、この変性したhuTF
を、等容量の、0.6mg/mlマウス血清アルブミンを含む生
理食塩水と混合した。つづいて、４倍容のアセトンを、
この変性huTF溶液に混ぜ、生じた混合物を、一晩、−20
℃に保った。生じた沈殿を約13000×ｇ、10分間の遠心
で集め、4:1（v/v）のアセトン：水で一度洗浄してか
ら、0.1mg/mlの濃度となるよう、200μｇの生理食塩水
で懸濁した。

最初の注射から、約４週間後、0.1ml生理食塩水中33
μｇの親和性単離化huTFを、0.1mlの完全フロイント・
アジュバント（cFA）と混合し、エマルジョンを作り、
これをマウスTF8に腹腔内注射した。

最初の接種から８週間後、リン酸緩衝食塩水中15μｇ
の親和性単離化huTFを静脈注射（i.v.）し、同じhuTF/P
BS接種を24時間後にも行った。そのマウスTF8の脾細胞
を融合のため３日後に採取した。

b.マウスTF9の免疫化マウスTF9は、２回のリビ・アジュバント注射に、エ
マルジョン化前に変性したhuTFを用いること以外は、マ
ウスTF8と同じ接種スケジュールがほどこされた。さら
に、第１回目のPBS接種の腹腔内注射をCFA含有接種後４
ケ月半後に行なった。

c.ハイブリドーマの作成 TF8及びTF9由来の脾細胞に、同じ融合操作を行った。
各マウス由来の脾細胞約１×10⁸個を、30％ポリエチレ
ングルコール（PEG4000、ATCC25322−68−３）を含む20
0μの融合媒体中、２×10⁷のP3X63Ag8,653.1ミエロー
マ細胞と混合した。細胞融合後、生じたハイブリドーマ
を96穴プレートに植種し、HAT培地（ヒポキサンチン、
アミノプテリン、及びチミジン）中で培養し、つづい
て、huTFと反応する抗体分子生産能でスクリーニングし
た。

両マウスTF8及びTF9脾細胞由来の融合体共、HAT融合
媒体耐性ハイブリドーマ細胞クローンを生じた。TF8融
合体は907個のHAT耐性ハイブリドーマを、一方TF9融合
体は、348個のHAT耐性ハイブリドーマを生じた。

6. 抗huTF抗体分子の生産によるハイブリドーマのスク
リーニング a.固相RIA TBS中、20μ/mlに希釈した100μのヤギ抗マウスI
gG（IN州、インデアナポリス、ベーリンガー・マンハイ
ム・バイオケミカルズ）をイムロン・96穴フレキシブル
・ビニルマイクロプレートのウェルに入れた。それから
このプレートを、１時間、37℃を維持し、IgGをウェル
の壁に吸着させた。TBSで３回洗浄した後、３％オバル
ミンを含む100μのTBS/トリトンを各ウェルに入れ、
過剰のタンパク質結合部位をブロックした。

ウェルを、１時間、約20℃に維持したのち、そのブロ
ッキング溶液を、アスピレータで除いた。そして、各ウ
ェルに50μのハイブリドーマ培養上清を加えた。でき
た固液相免疫反応混合物を１時間、37℃に維持した。そ
の後ウェルをTBSで３回洗浄し、過剰の液は、アスピレ
ータで除いた。

例４で調製した、TBS/トリトン中、およそ1ngのhuTF
と、およそ５×10⁵cpmを含む、50μの¹²⁵Iラベル化hu
TFを各ウェルに入れ、第２の固液相免疫反応混合物を作
った。そのウェルをTBS/トリトンで３回洗浄し、固相に
結合した¹²⁵I−huTF含有免疫反応産物を単離した。過剰
の液体はアスピレータで除き、ウェルを乾燥させた。個
々のウェルを切り離し、各ウェルに含まれる¹²⁵Iを、ガ
ンマカウンタで計数した。

バックグランド放射活性（huTFと抗体の反応無しの場
合）はウェル当り、平均約200〜300cpmであったが、一
方、huTFと抗体の反応が有る場合は、ウェル当り10000c
pmのカウントがある。抗huTF抗体の生産が正と検定され
たハイブリドーマを選択し、本発明のハイブリドーマと
した。つづいて、これらのハイブリドーマを、以下に述
べるドット・ブロット検定でスクリーニングした。

b.ドット・ブロット・イライザ法例４で調製した、アセトン沈殿したhuTFを、4:1（v/
v）のアセトン：水溶液で抽出した。残存する沈殿をTBS
中に20μg/mlとなるように懸濁した。このhuTF溶液20μ
ｇ（１μ）を、消えないインクで、BA83ニトロセルロ
ース紙（シュレイチャー・アンド・シュエル,NH州、キ
ーン）上に書いた数字の隣にスポットする。スポットし
たhuTFを空気乾燥し、個々のスポットをパンチを用い
て、ディスクに切り出す。個々のディスクを、BLOTTOPB
Sにおける、５％w/v非脂肪乾燥ミルク、0.01％アンチフ
ォームＡ（シグマ製）、及び0.0001％マーチオレート
（merthiolate）〕（ジョンソン（Johnson）等、ジェネ
ッティック・アナリティカル・テクニック（Gene.Anal.
Tech.）１巻、３頁（1984年））を含む、多穴トレイの
個々のウェルに浸し、約１時間、37℃に維持した。

このBLOTTOを、ウェルからアスピレータで除き、各ウ
ェルに、200μのハイブリドーマ培養上清を加えた。
さらにこのウェルを２時間、37℃に保ち、その後、この
ペーパーディスクを、TBSで２回洗浄し、ウェルから取
り出し、TBSにより、さらに洗浄するため、１つの大き
な容器に入れた。ついで、過剰の液体をその容器から除
去する。

プロトブロット試薬キットの（MI州、アン・アーバ
ー、プロメガバイオテク社）アルカリホスファターゼ結
合抗マウスIgGを、BLOTTOで5700倍に希釈し、このペー
パーディスクと接触させた。このプロトブロット溶液と
の接触を、37℃で30分間保った。その後、ペーパーディ
スクを、TBS中で３回洗浄した。業者の指示に従い、プ
ロトブロットキット中に含まれている発色物質により、
ディスク上に結合したアルカリホスファターゼが検出さ
れる。

c.ウェスタン・ブロット検定法ウェスタン・ブロット検定のため、例４で報告したよ
うに単離した約10μｇのhuTFをサンプルバッファ（２％
SDS、50mMジチオスレイトール、10％グリセリン）に溶
かし、５分間、煮沸した。それから、これを、レムリ
（Laemmli）により報告された（ネイチャー（Natur
e）、226巻、680頁（1970年））、参考としてここに組
込まれている、予め染色された分子量標準の小さい両側
のレーンの間の広いレーンに試料をロードする、分取型
のスラブゲルを用いたSDS−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動にかけた（分子量標準:MA州、ニュートンセンタ
ー、ディバーシファアイド・バイオテク社）。参考とし
てここに組込まれている、トウビン（Towbin）等（プロ
シーディング・イン・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sic.）USA,76巻、4350頁
（1979））により報告されているように、電気泳動及び
ニトロセルロースへの電気ブロッティング後、このブロ
ットを、TBS中の５％脱脂粉乳溶液でブロットし、マニ
ホルドに固定した（MA州、ケンブリッジ、イムネチクス
社、ミニブロッタ）。８個のハイブリドーマ細胞培養上
清のストックを、各マニホルドスロットにロードし、37
℃で１時間インキュベートした後、このブロットを取り
除き、TBSで洗浄した（0.02％アジ化ナトリウム含有TB
S）。抗体が結合したレーンを、発色物質で発色させた
アルカリホスファターゼを結合した第２抗体を用い、供
給業者の推める方法に従って可視化した（WI州、マジソ
ン、プロメガバオテク、プロトブロット）。陽性のスト
ック由来の培養上清を、５％脱脂粉乳TBSによる８倍希
釈物について、別個に再テストし、抗TF抗体を生産する
個々のハイブリドーマクローンの同定を行った。

抗huTF抗体産生が正と判断されたハイブリドーマをさ
らに特徴づけるために選択した。例えば、上記のTF8融
合体由来のハイブリドーマは、例6bで述べられているド
ット・ブロット検定法及び例6cで述べられているウェス
タンブロット検定法でhuTFとの免疫反応を、そのハイブ
リドーマ培養上清が示すならば、抗huTF抗体産生ハイブ
リドーマ培養と特徴づけられる。これらの特徴は、24個
のTF9ハイブリドーマ細胞系列についてみられ、そのほ
とんどは、例13の第５表に示した。その他のスクリーニ
ング法で選択したハイブリドーマにより産生される抗体
分子は（１）脾細胞を独自の融合体に提供する免疫化マ
ウス（すなわちTF8又はTF9）、及び、独特のHAT培地耐
性ハイブリドーマ細胞が単離される、96穴培養プレー
ト、列番号及びウェル番号を示す文字によって呼ばれる
（すなわち、5B7、11D12、その他）。特殊な意味の文字
は、１語、ハイフン語又は２語として、ここにリストさ
れる。例えば次の文字は同じモノクローナル抗体分子組
成を意味している;TF85G9、TF8−5G9及びTF8 5G9。

7. イムノグロブリンIgGの単離イムノグロブリンIgGは、製造業者の指示に従がい、
バイオラドラボラトリーズMAPS IIシステムを用い、マ
ウスのハイブリドーマ細胞系列TF8−5G9（ATCC第HB9382
号）を含むマウスの腹水液から単離される。単離したIg
Gのタンパク質濃度は、製造業者の説明書に従がい、BCA
タンパク質検定試薬（ピアスケミカル社）を用いて測定
した。

8. huTFの免疫親和性による単離のための、抗huTF含有
固体サポートの調製抗huTF抗体を、アガロース固体マトリックスへカップ
リングするため、少なくとも１回透析液交換を行う、0.
1M MES、pH6.5を含む500mlの透析バッファに対する、４
℃、16時間の、例７で報告したように調製した、MAPS単
離TF8−5G9モノクローナル抗体10mgの透析により、活性
化した。活性化したTF8−5G9を、2mlのアフィゲルー10
アガロースビーズ（バイオラド）と混合し、できたカッ
プリング反応混合物を、製造業者の指示に従がい処理し
て、TF8−5G9/アガロース固体サポートを作った。

それから、例３で報告したように、固体サポート上の
過剰のタンパク質結合部位をブロックし、洗浄後、減圧
濾過して、TF8−5G9/アガロースケーキを作った。

9. huTFの免疫親和性による単離ヒトの脳のおよそ半分、すなわち約100mlに等しい、
例１で調製した脳抽出溶液を、計６のバッファＡに対
し、２回の外液交換をしつつ、４℃で３日間透析した。
その透析した抽出物を1.5時間、10,000×ｇで遠心し
た。できた上清を、例４で調製したグリシンエチルエス
テル−アガロースケーキと混合し、固液相反応混合物を
作る。回転しながら、２時間室温に維持したのち、その
固相と液相を焼結ガラスロートによる濾過で分離した。
そのhuTF含有液相を回収し、例８で調製したTF8−5G9/
アガロースケーキと混合し、固／液相免疫反応混合物を
作った。

この免疫反応混合物を、回転しながら一晩、４℃に保
ち、組織因子含有固相免疫反応産物を形成させた。それ
から、この固相及び液相を先に述べたように濾過で分離
した。固相が残留し、これを10倍容のバッファＡで洗浄
した。その後、固相をガラスクロマトグラフィーカラム
に移し、順次、（１）１％トリトンＸ−100を含む２倍
容の1M NaCl、及び（２）１％トリトンＸ−100を含む２
倍容の0.1Mグリシン（pH4.0）で洗った。

上述の洗浄後、その固体サポートに免疫学的に結合し
ているhuTF、その固体サポートを、焼結ガラスロート上
に保持したまま、0.1Mグリシン、pH2.5及び１％トリト
ンＸ−100溶液20mlで洗浄することにより、開放（溶
出）した。それから、例４に全て述べたように、溶出物
質を回収し、huTF検定を行ない、集めて透析した。

透析物を４倍容の冷アセトンと混合し、huTFタンパク
質を沈殿化した。さらにこの沈殿をおよそ−10℃、5,00
0×ｇ、30分の遠心で集めた。生成したペレットを窒素
雰囲気下で乾燥し、そのペレットの一部を変性条件での
SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した（SDS
−PAGE）。

第８図に示したこの分析結果は、huTFが免疫親和性に
より、脱脂脳粉末１グラム当り、33mgのhuTFの収率で単
離されることを示している。

10. 抗huTF抗体による凝集の阻害 10μのハイブリドーマ培養上清を、例４で調製した
約2ngの再脂質化huTFを含む90μのHBS/BSAと混合し
た。このようにして作った免疫反応混合物を30分間37℃
に保ち、抗huTF抗体分子を免疫学的にhuTFに結合させ、
免疫反応産物を形成させた。つづいて、この免疫反応混
合物について、例２で述べたように、huTFのプロコアグ
ラント活性を検定した。ネガディブ・コントロールとし
て、無関係のIgG調製物を抗huTF抗体の代りに用いた。

効果的huTF濃度は、インヒビターの存在下測定した凝
血時間を用い、例２のように作った標準曲線から外挿し
た。阻害は、用いた実際のhuTF濃度について、効果的hu
TF濃度の比率として表わされる。少なくとも50パーセン
トの阻害をするモノクローナル抗体分子調製物は、本発
明の抗体分子成分を中和するものとして選択された。

例５に述べたように、単離したhuTFに対して生じたハ
イブリドーマ由来の数多い培養上清を、凝集開始を阻害
する能力について、先の操作により測定した。有意に凝
集を阻害することが分ったハイブリドーマを、第５表に
示した。

また、抗huTF抗体による凝集阻害は、予め形成された
huTF−因子VII複合体を用いて行った。例４で調製した
再脂質化したhuTF1ngを含む10μを、HBS/BSA70μ、
20mM塩化カルシウム10μ及び、例３で述べられている
ように調製した因子約25ngを含む10μと混合する。こ
の混合物を15分間37℃に保ち、huTFを、混合物として使
える因子VIIと複合体をつくらせる。その後、10μの
溶液に、例７で述べたように調製したMAPS−単離化モノ
クローナル抗体約10ngを混合し、この第２の混合物を、
30分間37℃に保った。さらに、第１に20mM塩化カルシウ
ム100μついで、ヒトのクエン酸化血漿又は例12で述
べてように調製した因子VII欠損血漿を加え、ついで秒
で表わされた凝血時間を観測することにより、生成した
混合物の凝集阻害の測定を行った。例10で述べられてい
るように、阻害率を表わし、予め形成したhuTF−因子VI
I複合体での阻害の結果を、第2A表に示した。

抗huTF抗体による凝集阻害の別の研究が、TFを因子VI
I/VII aと会合させ、TF:因子VII/VII a複合体を形成さ
せる前後の阻害を比較する条件下で行った。

これらの研究で、予め形成したTF:VII/VII a複合体を
用いた抗huTFh抗体による凝集阻害を、利用するモノク
ローナル抗体含有溶液10μにMAPS単離化モノクローナ
ル抗体含有溶液の代りに、ハイブリドーマ培養上清を用
いた以外、例10で述べたのと基本的に同様に行った。比
較のため、抗huTF抗体による凝集阻害を、例10で述べた
ように、因子VII/VII aを含むクエン酸化血漿との混合
の前、それら抗体及び再脂質化huTFの免疫複合体を形成
することにより検定した。

ここで述べている全ての抗体は、この比較阻害検定試
験を行ったが、約60％以上の阻害を示すものだけが、hu
TF:VII/VII a複合体により開始する凝集を阻害する能力
を有意にもつと考えた。これらのMoAbには、TF9−1B8、
TF9−5B7、TF8−5C4、TF8−11D12、及びTF8−21F2があ
る。

11.ポリペプチド合成ここで使用されている種々のhuTFh領域に対応するポ
リペプチドをハゲンメイヤー（Hagenmaier）等（ポップ
−セイラーズ（Hoppe−Seyler's）Z,フィジオロジカル
・ケミストリー、353巻、1973頁（1982年））のシンメ
トリカル・アンハイドライド法を用いたアプライド・バ
イオシステムズモデル430Aペプチド合成機で化学合成し
た。第１及び第２表のポリペプチドに加え、以下に示す
第３表のポリペプチドも合成し、これには、huTFhと反
応できる抗ポリペプチド抗体の生産に有用な、本発明の
ポリペプチドが含まれている。

12.ポリペプチドによる凝集阻害 huTF依存の凝集開始を疎開する、本発明のポリペプチ
ドの能力を、まず、このポリペプチドを因子VII/VII a
及びカルシウムイオン存在下でインキュベーションし、
さらにこの混合物を、因子VII/VII a欠損血漿に加え
て、凝血時間を見積った。

ヒトの因子VII/VII aを例３に述べた方法で単離し
た。HBS/BSAml当り、この単離した因子VII/VII 200ngの
溶液10μに、100μHBS、20μ25mM CaCl₂及び100
μの合成ポリペプチド含有TBS/トリトンを加えた。種
々の濃度で含まれる多種の混合物をこのように調製し、
それを、15分間、37℃に維持した。例４で述べたように
調製した再脂質化した組織因子を、HBS/BSAで希釈し、
例２で述べたような凝集検定法でテストしたとき、10μ
でおよそ45秒の凝集時間が得られるように調製した。
上記のように維持した混合物をさらに、再脂質化huTF10
μ希釈物、25mM CaCl₂100μ及び１容の血漿に対し
1.5容のHBSで希釈した因子VII/VII a欠損血漿100μ
（KA州、オーバーランド・パーク、ジョージ・キング・
バイオメティカル社）と混合した。凝血時間の延長は、
この合成ポリペプチドによる凝集の阻害を示しているこ
とになる。阻害率を、例10で述べているように計算し
た。少なくとも30％の凝集阻害を示すポリペプチドはhu
TFh結合部位ポリペプチド類似物、すなわち；第４表の
セクションＩで示されているポリペプチド、p26−49、p
146−167及びp161−189である。

別に、上記阻害検定において、モノクローナル抗体に
よる免疫親和性吸着により、因子VII/VII a欠損血漿で
ある因子VII/VII a欠損血漿を用いた。ヒトの因子VII/V
II aに対するモノクローナル抗体を、例３で述べたよう
に単離した因子VII/VII aをhuTFの代りに免疫原として
用いた以外、例５で述べたものと基本的に同様に調製し
た。できたハイブリドーマを、イライザ法で評価し、IN
州、サウスベンド、エンザイム・リサーチ・ラボラトリ
ーズ社から入手できるヒトの血液タンパク質、タンパク
質Ｓ、因子IX、因子Ｘ及び因子IIと反応しないハイブリ
ドーマを同定した。そのようなハイブリドーマ、FV11、
F1、2H3−3.2は、T.S.エジントン（Edgington）博士か
ら載いた（CA州、ラジョラ・スクリプス・クリニック・
アンド・リサーチ・ファンデーション社）。イムノグロ
ブリンIgGを、ハイブリドーマFV11、F1、2H3−3.2を含
むマウスの腹水から単離し、この単離したIgGを、例８
に述べたように、固体サポートに結合させた。できた抗
因子VII/VII aモノクローナル抗体含有固体サポートを
貯留した正常なクエン酸化血漿から、血漿含有液相を収
穫し、保留すること以外、例９で述べた免疫親和性操作
を用いて、因子VII/VII aを除くのに用いた。

脂質化型で用いたとき、競合的に凝集を阻害する、い
くつかのポリペプチドの能力を、100μの合成ポリペ
プチド溶液の代りに、100μの脂質化合成ポリペプチ
ドを用いることにより上記検定法での評価を行った。

脂質化合成ペプチドは、合成ポリペプチドを、単離し
たhuTFの代りに用いること以外は、単離したhuTFの再脂
質化で用いた、例４で述べた方法で調製した。ルーチン
には脂質とポリペプチドの比は52:1（w/w）が用いられ
た。少なくとも30％の凝集阻害を起こす脂質化ポリペプ
チドが、脂質化型で存在するとき、huTF結合部位ポリペ
プチド類似物すなわち、第４表のセクションIIで示され
たポリペプチドと考えた。

上記のポリペプチド阻害研究で得られた代表的投与−
応答曲線を第９及び第10図に示した。

13.ポリペプチドによる抗体−huTF免疫反応の阻害フレキシブルビニルでできたイムロンＵ底96穴プレー
ト（ダィナテク社）のウェルを過剰タンパク質結合部位
のブロッキングを、37℃20分間行うこと以外、例６で述
べた方法でヤギ抗マウスIgG（ベーリンガーマンハイム
社）によりコーティングした。

50μのハイブリドーマ培養上清を各ウェルに入れ、
１時間37℃に維持した。さらにこのウェルをTBSで３回
洗浄し、過剰の液体をアスピレータで除いた。

単離化huTFは、例９で述べたように、免疫親和性カラ
ムで調製した。単離化huTFを含むアセトン沈殿をTBS/ト
リトンに溶かし、そのタンパク質濃度を、製造業者の説
明書に従がい、BCAタンパク質検定試薬（ピアス）を用
いて測定した。huTFの炭化水素側鎖を、オシャネシー
（O'shannessy）等の報告した方法（イムノロジカル・
レターズ（lmmnuol.Letters）,8巻、273〜227頁（1984
年））に従がい、ビオチン−ヒドラジド（NY州、プレイ
ンビュー、ICNバイオメディカル社）を用いて、ビオチ
ン化し、ビオチン化huTF溶液を作った。

TBS/トリトン中60ng/mlに調製した50μのビオチン
化huTF溶液を、５μＭ合成ポリペプチドとともに、各ウ
ェルに入れ、１時間、37℃に維持した。その後、このウ
ェルをTBS/トリトンで３回洗浄した。

5mM EDTA、0.5％トリトンＸ−100及び１％BSAを含むT
BSで1/100に希釈した、100μのストレプトアビジン−
結合アルカリホスファターゼ（NY州、ニューヨーク、エ
ンゾバイオケム社、デテクＩ−alk）を各ウェルに入
れ、30分間、37℃に維持した。その後、このウェルを、
10mMリン酸カリウム（pH6.5）、２％BSA、0.5％トリト
ンＸ−100、0.5M塩化ナトリウム及び1mM EDTAを含む溶
液を４回洗い、ついで検出バッファ（0.1Mトリス・塩酸
（pH8.8）、0.1M NaCl、5mM MgCl₂）で１度洗った。

その後、検出バッファ中、2mMのｐ−ニトロフェニル
リン酸を含む溶液100μを各ウェルに加え、１時間37
℃に維持する。ついで、405ナノメーターでの光学密度
を各ウェルについて、バイオ・テク・マイクロプレート
リーダー（VT州、ウィノースキ、バイオ・テク・インス
ツルメント）を用いて測定した。

この競合的阻害研究の結果を第５表に示した。

もし、ポリペプチド存在下で得られた吸光度測定値
が、ポリペプチド非存在下で与えられた抗体に対して得
られた平均値値から１以上の標準偏差をもつとき、阻害
が有意に起ったと考えた。

14.2部位イライザ法による身体サンプルにおけるhuTF検
出血液、血漿、唾液、尿、その他の身体サンプル中のhu
TFは、同じhuTF分子に同時に結合することができる２つ
のモノクローナル抗体を用いて検出できる。

イムロン・ポリスチレンＵ底96穴プレートを、まず、
各ウェルに、TBS中10μg/mlに希釈したIgG100μを入
れ、ついで、ウェルと、IgG溶液との接触を、４℃、一
晩維持することにより、ヤギ抗マウスIgG（ベーリンガ
ーマンハイム社）でコートした。そのウェルを、TBSで
３回洗浄し、ついで、各ウェルに、３％BSAを含むTBS/
トリトン100μを加えた。その後、これらのウェルを
１時間、37℃に維持してから、TBSで３回洗浄し、さら
に、過剰の液体をアスピレータで除いた。

第１のハイブリドーマ、TF9−6B4由来の抗huTF抗体分
子含有培養上清100μを各ウェルに入れ、１時間37℃
に維持した。それから、これらのウェルをTBSで３回洗
浄し、ついで過剰の液体を、アスピレータで除いた。

例９で調製したように、免疫親和性単離し、アセトン
沈殿化huTFを、TBS/トリトンに溶した。このhuTF溶液の
希釈物をTBS/トリトンで５μg/mlから0.5ng/mlの範囲で
調製し、希釈液100μをイムロンプレートのウェルに
入れた。このhuTF希釈液を、第１の抗体と接触させ、１
時間37℃に維持した。さらにこの希釈物をウェルから除
き、ウェルをTBS/トリトンで３回洗浄した。過剰の液体
をアスピレータで除いた。

抗huTF抗体を、例７で述べた方法により、第２のハイ
ブリドーマTF9−10H10の腹水からMAPSで単離した。この
抗体溶液のタンパク質を測定し、ついで、例13で述べた
ようにビオチン化によりラベル化した。

このビオチン化した抗huTF抗体をTBS/トリトンで60ng
/mlに希釈し、この溶液100μを各ウェルに入れた。そ
のウェルを１時間、37℃に維持し、ついでTBS/トリトン
で３回洗った。

この結合した、ビオチン化抗huTF抗体を、例13で述べ
たデテクＩ−alkシステムを用いて検出した。この検定
法で第１及び第２の抗体として用いているモノクローナ
ル抗体は、その２つがhuTFに同時に結合できる能力をも
つ限り、いろいろ変えることができる。例えば、第１抗
体として、TF9−6B4を用いたとき、TF9−11D12を、TF9
−10H10の代りに、第２の抗体として用いることができ
る。このように、本発明は、本検定法で同時に結合でき
る種々の抗体の組合せを考案した。

15.全プレhuTFhコード配列を含むDNA断片の構築全プレhuTFコード配列を含むDNA断片を第11図にその
制限地図に示されている、組換えプラスミドpCTF64、pC
TF403及びpCTF314と、この分野でよく知られている操作
を用いて構築することができる。例えば、マニアチス
（Maniatis）等、NY州、コールドスプリングハーバー、
モレキュラー・ラボラトリー、ラボラトリーマニュア
ル、モレキュラー・クローニング（1983年）参照。

第11図で示されている組換えDNAプラスミド中に含ま
れる挿入断片は、クローニングを可能にする、各末端の
EcoR Iリンカー５′−GGAATTCC−３′（MA州、レキシン
トン、コラボラチブリサーチ社）を有している。これら
のリンカー配列は、天然のhuTFh DNAコード配列の一部
ではないので、第２図に示されるヌクレオチド配列中に
は存在しない。組換えDNA分子構築の説明は、関係するh
uTFh DNA配列についても明らかなように、EcoR I末端を
含む消化により生じ、これらの付加的なリンカー配列を
含む断片は、第２図で示したヌクレオチド塩基番号によ
って示されるだろう。この断片は、その末端にこれら付
加的配列を含むことが理解できよう。

プラスミドpCTF64を、制限エンドヌクレアーゼEcoR I
及びDra IIIで消化し、第２図で示される、塩基残基１
〜296番に対応するヌクレオチド配列を含むDNA断片を作
った。このようにして作った、302ヌクレオチド塩基対
（bp）断片をアガロースゲルを用いたサイズ分画により
単離し、アルカリホスファターゼを用いた処理により脱
リン酸化した。

プラスミドpCTF403を制限エンドヌクレアーゼEcoR I
で消化し、第２図の残基776〜1125番に対応するヌクレ
オチド配列を含むDNA断片を作った。生成した352bpの断
片を、アガロースゲルを用いたサイズ分画により単離し
た。

プラスミドpCTF314を、制限エンドヌクレアーゼEcoR
Iで消化し、生成した647bpの断片をサイズ分画で単離し
た。この断片は、第２図の残基135〜775番の配列に対応
するヌクレオチド配列を含んでいる。647bp断片をサイ
ズ分画で単離し、アルカリホスファターゼで脱リン酸化
した。

この352bp断片及び脱リン酸化した647bp断片をT4DNA
リガーゼの反応によって機能的に結合（ライゲーショ
ン）し、第２図の残基135〜1125番に対応するヌクレオ
チド配列を有する999bpの断片を作った。

さらに、この999bp断片を、制限エンドヌクレアーゼD
ra IIIで消化し、第２図の残基296と297番の間でこの99
9bp断片を切断し、これによって、168bpと831bpの断片
が生ずる。さらに脱リン酸化した302bpの断片と、831bp
の断片をT4DNAリガーゼで機能的に結合し、第２図の１
〜1125番に対応するヌクレオチド配列を含む1125bp断片
を作った。

EcoR Iで消化して、クローニングプラスミドベクター
pUC8を線状にした。先に調製した1133bp断片と、EcoR I
消化したベクターをT4DNAリガーゼで機能的に結合して
環状組換えDNA分子pUC−プレhuTFhを作った。

大腸菌RR1株（MD州、ゲイサーズバーグ、ベセスダ・
リサーチラボラトリーズ）をpCU−プレhuTFhでトランス
ホームし、そしてアンピシリン耐性に基づいて、トラン
スホーマントを選択した。それから、この選択したトラ
ンスホーマントをクローン化し、プレhuTFh構造遺伝子
をもつ組換えDNA分子の存在によりスクリーニングし
た。

プレhuTFh構造遺伝子をもつ組換えDNA分子の存在によ
るスクリーニングは、各選択されたトランスホーマント
由来のrDNAをEcoR Iで消化することによって行った。生
じたEcoR I断片をアガロースゲルでサイズに従って分解
した。352bp、781bp及び2682bpのDNA断片に対応する三
つのバンドパターンを示す組換えDNA分子でプレhuTFh構
造遺伝子の存在を確めた。上述のEcoR I消化パターンを
生ずるrDNAを有する大腸菌RRIトランスホーマントは、
本発明の組換えDNA分子を含み、かつ、選択され（回
収）された。

細胞外アンカー領域を含むが、カルボキシル末端にト
ランスメンブレン・アンカー領域を欠く、プレhuTFhコ
ード配列の実質的領域を含み、従って、可溶性huTFhタ
ンパク質をコードするDNA断片を次のように構築した。

プラスミドpCTF64を制限エンドヌクレアーゼEcoR Iで
消化し、第２図の１〜486番の残基に対応するヌクレオ
チド配列を含むDNA断片を作った。このようにしできた4
86bpの断片を、アガロースゲルを用いたサイズ分画で単
離し、その後、アルカリホスファターゼ処理で脱リン酸
化した。つぎに、このように脱リン酸化した486bpの断
片を制限エンドヌクレアーゼDra IIIを用いで消化し、
第２図の296番と297番の間の部位で、486bp断片を切断
し、296bp及び190bpの断片とした。この296bpの断片を
アガロースゲルのサイズ分画で単離した。

プラスミドpCTF314を制限エンドヌクレアーゼEcoR I
で消化し、第２図の135〜775番の残基に対応するヌクレ
オチド配列を含むDNA断片を作った。この641bp断片をア
ガロースゲルを用いたサイズ分画で単離し、ついで、ア
ルカリホスファターゼ処理により脱リン酸化した。この
脱リン酸化した641bp断片を、Dra IIIで消化し、第２図
の296番及び297番の間の部位で、この641bp断片を切断
し、これにより、162bp及び479bpの断片とした。このう
ち、479bp断片をアガロースゲルを用いたサイズ分画に
より単離した。

上述のように調製した296bp及び479bpの断片を、T4DN
Aリガーゼを用いた反応により機能的に結合（ライゲー
ション）し、第２図の１番から775番の配列に対応する
ヌクレオチドアダプター配列を有する775bp断片を作っ
た。

クローニングプラスミドベクターpUC18をEcoR Iによ
る消化で線状化する。上記のように調製した775bp断片
と、EcoR I消化ベクターをT4DNAリガーゼで機能的に結
合し、環状組換えDNA分子pUC−プレhuTFh−Ｔを作っ
た。

大腸菌RRIを、pUC−プレhuTFh−Ｔでトランスホーム
し、pUC−プレhuTFh−Ｔを含むクローンであるアンピシ
リン耐性トランスホーマントを選択した。

組換えDNA分子pUC−プレhuTFh−ＴをEcoR Iで消化
し、生成した775bp断片をサイズ分画で単離した。

カルーザース（Caruthers）等（ジャーナル・オブ・
アメリカン・ケミカル・ソサイアティー（J.Am.Chem.So
c.）、103巻、3185頁（1981年））及びゲイト（Gait）
等（コールド・スプリング・ハーバー・シンポジウム・
クオント・バイオロジー（Cold.Spring Harbor Symp.Qu
ant.Biol.）47巻、393（1983年））の方法に従がい、互
いにオリゴヌクレオチドが機能的に結合するのを防ぐた
め、ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化を行なわ
れなかったこと以外は同様にして、の配列をもつ、合成オリゴヌクレオチドアダプター断片
を作った。このオリゴヌクレオチドをアニールし、粘着
EcoR I末端を含む二本鎖DNAリンカー断片を作り、ロー
ザースタイン（Rotherstein）の方法（メソッズ・イン
・エンザイモロジー（Motheds in Enzymol.）、68巻、9
8頁（1979年））に従って、平滑末端とした。つぎに、
このリンカー断片を、pUC−プレhuTFh−Ｔから得た775b
p断片に機能的に結合し、775bp断片の各末端に１つのア
ニール断片を含む817bp断片を作った。その後、この817
bp断片をEcoR Iで消化し、817bp断片の各末端を平滑か
らEcoR I粘着末端へと転換し、805bp断片とした。この8
05bp断片をアガロースゲルを用いたサイズ分画で単離し
た。

クローニングプラスミドベクターpUC18をEcoR Iで消
化し線状化した。先に調製した805bp断片とEcoR I消化
したベクターをT4DNAリガーゼを用いて機能的に結合
し、環状組換えDNA分子pUC−プレhuTFh−TRとした。

大腸菌RRIをpUC−プレhuTFh−TRでトランスホーム
し、pUC−プレhuTFh−TRを含むクローンである、アンピ
シリン耐性トランスホーマントを選択した。

16.組換えhuTFhコード配列の発現に反huTFhの生産組換えDNA分子由来の組換えhuTFhの発現は原核性細菌
細胞、非脊椎真核性細胞及びより高等な（脊椎）真核性
細胞を含む種々の発現媒体中で行うことができる。その
ような発現媒体の代表例には、各々、大腸菌S.セレビシ
アエ（cerevisiae）及びチャイニーズハムスター卵巣
（CHO）細胞がある。

a.大腸菌におけるプレhuTFhの発現大腸菌において、プレhuTFh構造遺伝子を発現できる
組換えDNA分子は、例15で作ったpUC−プレhuTFh組換えD
NA分子由来のプレhuTFh遺伝子含有DNA断片を単離し、つ
いで、この断片を原核性発現ベクターに機能的に結合す
ることにより構築することができる。

組換えDNA分子pUC−プレhuTFhを、そのプラスミド中
に存在するEcoR I部位を部分的に切断するような条件
で、EcoR I消化する。この部分消化法は、アニアチス
（Maniatis）等、NY州、コールドスプリング・ハーバ
ー、コールドスプリングハーバー・ラボラトリーズ、ラ
ボラトリーマニュアル、モレキュラー・クローニングに
より詳細に報告されている。図２の残基１番から、1125
番で示される配列に対応するヌクレオチド配列を含む11
33bp断片を、サイズ分画によりEcoR I部分分解産物から
単離した。

原核性発現ベクターpKK223−３（NJ州、ピスカタウェ
イ、ファルマシア・ファイン・ケミカルズ社）を、EcoR
Iによる消化で線状化した。この消化ベクター及び1133
bpプレhuTFh構造遺伝子含有断片をT4DNAリガーゼを用い
て機能的に結合し、環状組換えDNA分子pKK−プレhuTFh
を作った。

大腸菌RR1をpKK−プレhuTFhでトランスホームし、pKK
−プレhuTFh含有クローンとしてアンピシリン耐性トラ
ンスホーマントを選択した。

b.大腸菌におけるhuTFhの発現大腸菌においてhuTF遺伝子を発現することができる組
換えDNA分子は、例16aで調製した1133bp断片を操作して
構築した。まずこの断片をアルカリホスファターゼで脱
リン酸化し、ついで、制限エンドヌクレアーゼBbv Iで
消化した。生じた964bpの断片は、第２図の残基164〜11
25番に対応するヌクレオチド配列を含んでおり、サイズ
分画により単離した。

先に述べたように、の配列をもつ合成オリゴヌクレオチドアダプター断片を
作り、ロザーステイン（Rotherstein）等（メソッズ・
イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymol.）68
巻、98頁（1979年））の方法に従って、粘着EcoR I及び
Bbv I末端を含む二本鎖DNAリンカー断片をアニーリング
することにより作った。このリンカーをまず964bp断片
に機能的に結合して、1008bp断とした。ついで、1008bp
断片を、T4DNAリガーゼを用い、EcoR I消化したベクタ
ーpKK223−３と機能的に結合し、環状組換えDNA分子pKK
−huTFhを作った。

組換えDNA分子pKK−huTFhは、pKK−プレhuTFhと、
（１）残基１〜129番の残基がない、及び（２）新しい
メチオニンコドンが、残基130番の前に機能的に結合し
ており、その結果タンパク質発現（翻訳）が挿入された
メチオニンコドンの場所で始まることだけが異なる。

組換えDNA分子pKK−プレhuTFh及びpKK−huTFhを、そ
の中に含まれる構造遺伝子によりコードされるhuTFh又
はプレhuTFhの発現に適合する原核性宿主媒体に導入し
た。そのような宿主媒体の代表例は、大腸菌RRI株であ
る。この宿主を、組換えDNA分子でトランスホームし、
細胞増殖とこの組換えDNAの発現に適合する条件下で培
養し、この発現したタンパク質を従来の技術を用いて収
穫した。

c.CHO細胞におけるプレhuTFhの発現脊椎動物細胞中、プレhuTFh遺伝子を発現できる組換
えDNA分子を例16aで調製した1133bp断片を用いて構築し
た。

カルーザース（Caruthers）等及びゲイト（Gait）等
の方法（上記）を用い、の配列をもつ合成オリゴヌクレオチドアダプター断片を
作った。ついでこのオリゴヌクレオチドアダプター断片
を、ロザースタイン（Rotherstein）等の方法（メソッ
ズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymol.）6
8巻、98頁（1979年））を用い、1133bp断片の各末端に
結合し、元々1133bp断片に存在するEcoR I粘着末端を、
Bgl II粘着末端に転換した。

真核性シミアンウイルス（SV40）を基本とする発現ベ
クター、pKSV−10（NJ、ピスカタウェイ、ファルマシア
・ファイン・ケミカルズ社）を、制限エンドヌクレアー
ゼBgl IIによる消化で線状化した。1133bpのBgl II適合
断片及び、Bgl II消化ベクターを、T4DNAリガーゼを用
いて、機能的に結合し、環状組換えDNA分子pSV−プレhu
TFhを作った。

大腸菌RRIを、pSV−プレhuTFhでトランスホームし、
アンピシリン耐性のトランスホーマントを選択し、クロ
ーン化した。それからこの選択したトランスホーマント
をクローン化し、モノクローナル抗体TF8−5G9を用い
て、発現するプレhuTFhタンパク質の存在を各クローン
について検定して、pSV−プレhuTFhの存在に関する選択
を行った。

d.CHO細胞におけるhuTFhの発現ホ乳類細胞において、huTFhを発現することができる
組換えDNA分子を、例16c由来のpSV−プレhuTFhを、制限
エンドヌクレアーゼBgl IIで消化することにより構築し
た。生成した1153bp断片をサイズ分画で単離し、つづい
て、制限エンドヌクレアーゼBbv Iで消化した。生じた9
74bp断片は、図２の残基164〜1125番の配列に対応する
ヌクレオチドアダプター配列を含み、これを、サイズ分
画により単離した。

先に述べた方法で、の配列をもつ合成オリゴヌクレオチドアダプター断片を
合成し、アニールして、粘着性Bgl II及びBbv I末端を
含む二本鎖DNAリンカー断片を作った。ついで、このリ
ンカーをT4DNAリガーゼを用いて974bp断片に機能的に結
合して、第２図の残基130〜1125番の残基の配列に対応
するヌクレオチド配列を含む、1018bp断片を作った。

プラスミド発現ベクターpKSV−10を、Bgl IIで消化し
て線状とし、ついで、T4DNAリガーゼを用いて、1018bp
断片に機能的に結合し、環状組換えDNA分子pSV−huTFh
を作った。

組換えDNA分子pSV−プレhuTFh及びpSV−huTFhを、内
在する構造遺伝子によりコードされるhuTFh又はプレhuT
Fhタンパク質の発現するのに適合した真核性宿主媒体中
に導入した。このような媒体を含む宿主細胞の代表例に
は、CHO細胞がある。

宿主を、組換えDNA分子でトランスフェクトし、安定
のトランスホーマントを従来法で選択した。例えば、グ
ラハム（Graham）等、ビロロジー（Virol.）、52巻、45
6頁（1973年）及びサウザーン（Southern）等、ジャー
ナル・オブ・モレキュラー・アンド・アプライド・ジェ
ネティクス（J.Mol.Appl.Genet.）１巻、327〜341頁（1
982年）参照。トランスホームした宿主細胞を、細胞増
殖及びその組換えDNA発現に適合した条件下で培養し、
発現したタンパク質を、従来法により収穫した。

e.イーストにおけるプレhuTFhの発現 S.セレビシアエ（cerevisiae）において、プレhuTFh
遺伝子を発現できる組換えDNA分子を、先に述べたよう
に、の配列をもつオリゴヌクレオチド、アダプター断片を合
成し、ついで例16aの1133bp断片の末端に、それを結合
することにより構築した。このようにして作ったアダプ
ター化した断片は、Cla I粘着末端をもつ。

イーストの発現ベクター、pTDT1（アメリカン・タイ
プ・ティシュコレクション、＃ATCC31255）を、制限エ
ンドヌクレアーゼCla Iでの消化により線状化した。上
記のCla Iアダプター化1133bp断片及びCla I消化ベクタ
ーを、T4DNAリガーゼを用いて、機能的に結合し、環状
の組換えDNA分子pY−プレhuTFhを作った。

大腸菌RRIをプレhuTFhでトランスホームし、プレhuTF
h構造遺伝子を発現するトランスホーマントを、例16cで
述べた方法により同定及び選択を行った。

f.イーストにおけるhuTFhの発現 S.セレビシアエ（cerevisiae）において、huTFh構造
遺伝子を発現できる組換えDNA分子を、pY−プレhuTFhの
Cla Iによる消化により、第２図の残基１〜1125番の配
列に対応するヌクレオチド配列を含む1151bp断片を作る
ことで構築した。サイズ分画による単離後、1151bp断片
をBbv Iで消化し、第２図の残基164〜1125番の配列に対
応するヌクレオチド配列を含む978bp断片を作った。こ
の978bp断片は、サイズ分画により単離した。

の配列をもつ合成ポリヌクレオチドアダプター断片を作
り、先に述べたように、アニールすることで、Cla I及
びBbv I粘着末端をもつDNAアダプターを作った。まず、
このアダプター断片を、978bp断片に機能的に結合する
ことにより、1020bp断片とした。つづいて、この1020bp
断片を、T4DNAリガーゼを用い、例16eで述べられている
ように調製したCla I消化pTDT1ベクターと結合し、環状
組換えDNA分子pY−huTFhを作った。

組換えDNA分子pY−プレhuTFh及びpY−huTFhを、内在
する構造遺伝子によりコードされるhuTFh又はプレhuTFh
タンパク質の発現に適合するイースト宿主媒体中に導入
した。このような媒体を含む宿主細胞の代表例には、S.
セレビシアエ（cerevisiae）細胞がある。

宿主細胞を、この組換えDNA分子でトランスホーム
し、選択培地で培養して、従来法により、トランスホー
ムした細胞を単離した。例えば、ハイネン（Hinnen）等
プロシーディング・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、75巻、1929頁
（1978年）及び、ミヤジマ（Miyajima）等、モレキュラ
ー・アンド・セルラー・バイオロジー（Mol.Cell.Bio
l.）４巻、407頁（1984年）参照。トランスホームした
細胞を、細胞増殖及び組換えDNA発現に適合する条件下
で培養し、ついでこの発現したタンパク質を従来法で収
穫した。

g.組換えhuTFhコード配列の発現による可溶性huTFhの生
産組換えDNA分子からの可溶性huTFhの発現は、プレhuTF
h及びhuTFhに対し、例16で述べたのと同様に、種々の発
現媒体で行なわれた。その例において、EcoR I粘着末端
を有する断片を含む1133bpのプレhuTFh構造遺伝子の例1
6aでの作成と、つづいて、例16b−ｆでの操作で、大腸
菌、S.セレビシアエ（cerevisiae）及びCHO細胞の３種
の発現媒体において、プレhuTFh又はhuTFhを発現できる
ベクターを作った。同様に、EcoR I粘着末端を有する可
溶性プレhuTFh構造遺伝子を含み、例16aで調製した805b
pの断片を例16b〜ｆで述べた方法に従がって操作し、こ
れら同発現媒体中可溶性プレhuTFh又はhuTFhを発現でき
る発現ベクター（すなわち、プレhuTFh−TR又はhuTFh−
TR）を作った。

17.ポリペプチドp24−35及びp159−169による凝集阻害第７表にそのアミノ酸残基配列を示した例11で述べた
ように合成した。

それから、ポリペプチドp24−35及びp159−169につい
て、例12で述べられているように、huTFによる凝集開始
を競合的に阻害する能力を検定した。この研究の結果を
第12図に示し、p24−35及びp159−169は、10μＭ濃度で
用いたとき、各々、huTFで開始した凝集を、45％及び25
％阻害できることを示している。この研究において、第
12図で白丸により示したこれらペプチドに対する阻害バ
ックグランドは、第４表で示した実験結果よりも低いこ
とに注意しなければならない。結果として、この研究に
おいて、10μＭ濃度での凝集阻害を少なくとも20％起こ
すポリペプチドは、huTF結合部位ポリペプチド類似物と
考えた。

従って、ポリペプチドp24−35及びp159−169は本発明
のhuTFhポリペプチド結合部位類似物を示している。ま
た、ポリペプチドp25−49で得られた同様の結果を考慮
すると、p24−35で得られた結果は、huTFh−因子VII/VI
I a結合部位は、これら２つのポリペプチドの共通部
分、すなわち、第１図で示した残基30〜35、（−VNQVYT
−）のアミノ酸残基配列で作られていることを示してい
ることに注目すべきである。

18.抗huTF抗体による凝集阻害の速度論抗huTF抗体が、huTFの凝集開始を阻害できる時間を測
定するため、この阻害の時間経過を、例10で述べた阻害
検定法を用いて測定した。

例７で述べたように調製した、MAPS単離化TF8−5G9モ
ノクローナル抗体およそ1ngを、100μHBS/TBS中、例
４で述べたように調製した再脂質化huTFおよそ1ngと混
合した。このように形成した種々の混合物を、37℃で、
約１から60分の間の種々の時間維持し、抗huTF抗体を、
huTFと免疫学的に結合させ、免疫反応産物を作った。第
13図で示した時間に、各混合物について、例２で述べた
ように、huTFの凝血活性を検定し、ついで、例10で述べ
たように阻害率を示した。

第13図で、このような速度論的測定の結果は、この検
定で用いた抗体及び精製したhuTFの濃度で、65％以上の
huTFによる凝集開始の阻害が、10分以内に起こることを
示すことが分る。より高い抗huTF抗体濃度では、より速
く、完全な阻害が起こると考えられる。

19.抗huTF抗体による、huTFによる凝集開始阻害の投与
−応答抗体投与範囲にわたる、huTF凝集開始を阻害する本発
明の抗huTF抗体の能力は、次の修正をした例で述べた方
法により検定した。例４で調製した再脂質化huTF1ng
を、0.1mlのHBS/BSA中、例７で述べたように単離した。
種々の量のTF8−5G9モノクローナル抗体と混合した。こ
のように調製した混合物を維持して免疫反応産物を作
り、つづいて例10で述べたように、huTFの凝血活性に関
する検定を行った。

そのような投与−応答検定の結果を、第14図に示し、
また、このことはこの研究で用いたhuTF濃度に対し、ml
当り、およそ１〜5ngの抗huTFでの最高値の半分の阻害
を示している。

同様の投与−応答実験を、huTF源として溶解したヒト
細胞を用いて行なった。

ヒトの繊維芽細胞系列GM1381（NIGMSヒューマン・ジ
ェネチック・ミュータント・セル・レポジトリー）を、
2mMグルタミン、５％ウシ胎児活性及び抗生物質を補っ
た、ダルベコ修正イーグル培地（DMEM、NY州、グランド
アイランド、ギブコラボラトリー）中、37℃で、７％
（v/v）二酸化炭素空気雰囲気下で培養した。GM1381細
胞を増殖し、そして収穫し、さらに30×10⁶個の細胞の
ペレットを遠心で調製し、−70℃で凍結した。この凍結
ペレットをNHバッファ（25mMヘペス、140mM NaCl、pH7.
0）中の15mMベータ、オクチルグルコピラノシド溶液9ml
を加えて急速に融解し、さらに10分間37℃に維持して、
細胞を溶解した後、HN18mlを加えて、細胞溶解物を作っ
た。

例17で述べたように単離したモノクローナル抗体TF8
−5G9を、第15図に示した種々の投与に対し、0.01％BSA
（シグマ、RIA級）で希釈した。それから各抗体希釈物2
5μに、先に調製した細胞溶解物225μを加え、60分
間37℃に保って、抗体を細胞溶解物中に存在するhuTFと
免疫反応させ、免疫反応産物を形成させた。その後、25
mM CaCl₂50μを、免疫反応産物を含む溶液50μと混
合し、ついで、50μのクエン酸化ヒト血漿と混合し、
凝集を開始させた。このようにして作った混合物を37℃
に維持し、血漿の添加と、凝血形成の間の時間を測定し
た。効果的huTF濃度及び阻害率を例10に述べたように計
算した。

huTF源として、ヒトGM1381細胞溶解物を用いた投与−
応答阻害検定からの結果を、第15図に示した。これらの
結果は、TF8−5G9抗huTF抗体が、ml当り、およそ８−10
ngの抗体濃度でhuTFのこの細胞溶解源の半分の阻害を起
こしたことを示している。

20.非ヒト組織因子とMoAbの交差反応性組織因子を、脳組織（ラット、ラビット、子ウシ、イ
ヌ、羊、ブタ及びヒヒ）又は、組織培養細胞（アフリカ
ミドリザル腎臓（COS）細胞）から単離した。組織又は
細胞を融解し、膜をはぎ、ミンチし、組織1g当り、1ml
の冷アセトン中でホモジネートし、ついで、減圧下、ワ
ットマン＃１ペーパーで濾過した。この固体をアセトン
に懸濁し、もう５回濾過し、一晩空気乾燥したのち、−
30℃で保存した。開始湿重量の16〜19％を含むアセトン
粉末を細かくしてから、5m mol/LEDTを含むTBS中、５％
（w/v）となるよう懸濁し、室温で１時間混合した。10,
000×ｇ、20℃、30分間の遠心で固体を集め、ついでTF
含有膜を100,000×ｇ、１時間の上清の遠心で集めた。
このペレットを、TBSに懸濁し、−80℃に保存した。

動物TF（TF活性をもつ粗組織抽出物）による抗体阻害
を、次のように測定した。等容量のTF（1mg/ml）及びハ
イブリドーマ上清（TBS/BSAでの10倍希釈物）を、37℃
で２時間インキュベートした。残存するTF活性を、その
インキュベーション混合物100μを、50μのヒト因
子VII欠損血漿及び50μの50mM CaCl₂に添加すること
により測定した。37℃、１分後、相同種の血清の10倍希
釈物50μを因子VII源として加え、凝血形成時間を２
度測定した。

24個のMoAbのうちの18個がバブーン脳TF又は、アフリ
カ・ミドリザル腎臓細胞抽出物のプロコアグラント活性
を阻害した（第８表）。しかし、MoAbのいずれも、ラッ
ト、ウサギ、子ウシ、イヌ、羊又はブタのTFと、交差反
応を示さなかった。すなわち、相同的因子VII源の存在
下、ヒト因子VII欠失血漿のリカルシフィケーション時
間促進能を示すTF調製物ではなかった。抗体のいずれ
も、正常なヒト血漿での検定による、ウサギTFのコアグ
ラント活性を示さなかった。

種々のヒト細胞及び組織により発現される凝血活性の
阻害をMoAb TF8−5G9を用いて詳細に試験した。TF8−5G
9は、IgG濃度≧１μg/mlのときの90％以上、精製再脂質
化したヒトTFの機能を中和する（第16図）。ヒトの細胞
溶解物及び粗組織抽出物の凝血活性を阻害する、このMo
Abの能力も示されている（第９表）。10μg/mlのIgG濃
度でのTF8−5G9は、粗脳及び胎盤のアセトン粉末及び溶
解したヒトの繊維芽細胞、膀胱がん細胞及び内毒素活性
化末梢血液単核細胞の凝血活性の80％以上を定量的に阻
害する。

21.因子VII結合の研究因子VII/VII aのTFへの結合は、機能性TF:VII/VII a
凝集促進複合体の集合に必要とされるので、因子VII/VI
I aのTFに対する結合を妨げることによる、第８表に示
したMoAbのTF活性中和能がテストされた。

ヒトの組織因子仲介による、因子VIIのJ82の膀胱がん
細胞表面への結合はよく調べられている。フェア（Fai
r）等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー（J.Biol.Chem.）、262巻、11692（1987年）。従っ
て、細胞表面huTF:VII/VII a複合体会合に関するMoAbの
効果は、J82細胞を、抗体とプレインキュベートし、さ
らに、¹²⁵I−因子VII/VII aの特異的結合を定量するこ
とにより試験した。

J82細胞を12穴培養プレート中、フェア（Fair）等に
よって報告されているように（上述）、集密化するまで
培養し、バッファＡ（137mM NaCl、4mM KCl、11m mol、
Ｌ−グルコース、5mMアジ化ナトリウム、10mMヘペス、p
H7.45）で洗浄し、ついで、精製したMoAb IgG又は、ハ
イブリドーマ培養上清10倍希釈物を含むバッファA0.7ml
とともに、37℃で２時間インキュベートした。塩化カル
シウム及び、¹²⁵I−因子VII/VII aを各々、最終濃度5mM
及び1nMとなるよう添加し、さらに37℃、２時間インキ
ュベートした。その後、細胞単層を、冷バッファＢ（14
0mM NaCl、0.5％BSA、5mMトリスHCl、pH7.45）で５回洗
浄し、1mlの0.2M NaOH、１％SDS、10mM EDTA溶液中で溶
解し、その溶解物のガンマ線をカウントした。特異的結
合は（非ラベル因子VII/VII aを100倍過剰存在下、細胞
と会合する¹²⁵I因子VII/VII a）、非特異的結合放射活
性を差し引いて測定した。特異的結合の阻害率は９容の
バッファＡと、１容の培養培地で処理したコントロール
細胞に対する、MoAbで処理したJ82細胞という形で測定
した。

因子VII/VII aがTFに結合したとき、それはうまく取
り込まれないが、抗体結合によるTFインターナリゼーシ
ョンの可能性を除くため、J82細胞を、5mMアジ化ナトリ
ウムで代謝的に毒殺した。細胞のアジド処理の有無にか
かわらず同じ結果が得られた。

この研究の結果は、上の第８表に示されている。TF活
性を阻害する全ての23個のMoAbは、因子VII/VII a結合
も阻害した。予想されるように、TF活性を阻害しないMo
Ab、TF9−10H10は、因子VIIの結合を阻害しなかった。

22.J82細胞による因子X a形成の阻害 J82細胞上でのhuTF:VII/VII a複合体による因子X a形
成速度を、次の修正をした、フェア（Fair）等（ジャー
ナル・オブ・バイオロシカル・ケミストリー（J.Biol.C
hem.）、262巻、11692頁（1987年））により報告され
た、多穴培養プレート検定法を用い２度定量した。細胞
を、12穴プレート中で培養し、J82細胞への因子VII/VII
a結合の際に上述したように、検定開始前、種々の濃度
の精製した、MoAbのIgG画分と37℃で２時間プレインキ
ュベートした。単一の濃度の因子VII/VII a（1mM）を検
定で採用した。因子Ｘを最終濃度50μg/mlとなるよう添
加した後、５、10、15分の間隔で、50μの上清を採取
し、550μの50mMトリス・HCl、225mM NaCl、50mM EDT
A（pH8.2）の溶液中に入れた。発色性因子X a基質添加
後（TX州、ビューモント、ヘレナラブ社、3.4mM S−222
2 50μ）、速度論的分析モジュールをつけたベックマ
ンDU−30分光器で405nmの吸光度の増加を測定すること
により、因子Ｘの活性を定量した。因子VII/VII a非存
在下でインキュベートしたJ82細胞上清のＳ−2222加水
分解によるバックグランドを各測定値から差引いた。抗
体処理の阻害率は抗体とのプレインキュベーションなし
の細胞に対して計算した。

MoAb TF9−2C4及びTF9−5B7によるJ85細胞の処理に対
する阻害曲線は、因子X a形成速度が、因子VII結合を阻
害したものと同様の抗体濃度で阻害されることを示して
いる（第17図）。非阻害的（非中和性）MoAb TF9−10H1
0はIgG濃度10μg/mlまで、凝血促進活性、因子VII/VII
a結合又は因子X a生成速度にほとんど影響を与えない
し、また、コントロールMoAb PAb100は全く効果がない
（データ示さず）。

23.huTFhポリペプチドの因子VII/VII aへの競合的結合
による、J82細胞上での因子Ｘ活性化の阻害当分野ではよく知られているように、凝血促進プロテ
アーゼカスケードの細胞活性化は、消費性血栓出血症と
呼ばれる種々の病気と関連している。一般に、凝血促進
プロテアーゼカスケードは、膜レセプター及び基本的共
因子、組織因子（TF）に対する因子VII/VII aの高い親
和性による発見により、細胞表面で開始する。TF及び因
子VII/VII aの二分子凝血促進複合体〔TF:VII/VII a〕
は、最終的にトロンビン形成及びフィブリンの析出につ
ながる限定したタンパク質分解による因子Ｘ及びIXの活
性化を起こす。さらに、凝血におけるTFの役割、TFによ
る凝集プロテアーゼカスケードの開始は、播種性血管内
凝固及びトロンボジェネシスと関連する。ニーメツ（Ni
emetz）等、ブラッド（Blood）42巻、47頁（1973年）及
びベビラクア（Bevilacqua）等、ジャーナル・オブ・エ
クスペリメンタル・メディシン（J.Exp.Med.）、160
巻、618頁（1984年）。TFは、炎症性仲介物に対する応
答及び細胞性免疫応答で、単球及び内皮細胞の表面で発
現する重要なエフェクター分子である。

本発明のhuTFhポリペプチドが、因子VII/VII aに結合
し、それにより、因子Ｘを活性化することができる、T
F:VII/VII a複合体の形成を阻害する能力を研究した。

TBS中、100μＭのhuTFポリペプチド類似物を含む溶液
50マイクロリットル（μ）を、96穴平底ポリスチレン
検定プレートの各ウェル96個に入れ、ついでその各ウェ
ルに、例３で述べたように単離した、TBS中1nMの濃度に
調整した因子VII/VII aを含む溶液25μを加え、さら
に、TBS中20mMの塩化カルシウム25μを加え、その混
合物を30分間室温に維持した。

ヒト膀胱がん細胞J82細胞を、アメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクション（ATCC HTB1;MD州、ロック
ビル）から入手し、参考としてここに組込まれているフ
ェア（Fair）等の方法（ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー）、262巻、11692−11698頁（1987
年））に従って培養した。

50μのTBSに５×10⁴個のJ82細胞を懸濁し、上述の
維持を行った後、ポリスチレン検定プレートの各ウェル
に入れた。その後、ただちに、フェア（Fair）等の報告
のように（上述）単離した、TBS中100nMの濃度の因子X
25μ及び、X a発色基質Ｓ−2222（1mg/mlTBS）50μ
を加え混合し、その混合物を２分間室温に維持して、発
色反応産物を含む溶液とした。

生成した発色産物量を、Ｖ−max96穴スペクトロホト
メータ（カリホルニア、マウンテン・ビュー・モレキュ
ラー・デバイス社）を用い、405ナノメーター（nm）で
の光学密度（O.D.）を測定して定量した。ポリペプチド
の代りにTBSを用いるか、又は、因子VII無添加のコント
ロールも測定し最高及び最低OD値を決定した。これら阻
害の測定結果を第10表に示す。

本研究の結果は、huTFhポリペプチドp24−35、p26−4
9、p144−159、p146−167及びp157−169は、因子VII/VI
I aに結合し、因子Ｘを活性化できる。TF:VII/VII a複
合体の形成を阻害することを示している。これらの結果
は、本発明のhuTF結合部位ポリペプチド類似物が凝集を
阻害するのに用いることができることを示している。

24.抗huTFh MoAbによる凝集の生体内での阻害しばしば、グラム陰性細菌による腐敗症は、最終的に
死に至らしめるショック状態を起こす。このヘモスタチ
スシステムの乱れは、このショック状態の展開と密接に
関係している。テイラー（Taylor）等（ジャーナル・オ
ブ・クリニカル・インベスチゲーション（J.Clin.Inves
t.）79巻、918〜825頁（1987年））は、外的に加えられ
た活性化した、タンパク質Ｃ、天然の抗凝血酵素、は、
凝集応答及びヒヒにおけるLD₁₀₀の大腸菌濃度の致命的
効果を妨害する。

本発明の抗凝集MoAbの生体内における凝集阻害能力
を、テイラー（Taylor）等（上述）によって報じられた
腐敗ショックのヒヒモデルを用いて試験してみた。重さ
を計った７〜８のヒヒを実験前一晩絶食し、実験の朝、
ケタミン（筋肉注射、14mg/kg）で免疫化した。つい
で、ペントバルビタール酸ナトリウムを、経皮カテーテ
ルを通し、頭の静脈に投与し、軽いレベルの外科的麻酔
状態に維持した（約45分毎2mg/kg）。大腿部静脈を無菌
的に露出させ、血液採取の為１方の後足にカニュールを
差込んだ。経皮カテーテルは大腸菌及び例20で示した、
MoAb TF9−5B7を含む試剤を与え、ヒヒのTFと交差反応
させるのに用いた。30分間の平衡化時間の後、この動物
に約10分間にわたって、MoAb TF9−5B7 500μg/kg又は1
5μg/kg（例７で述べたように単離し、ついで無菌生理
食塩水に透析し、0.58μg/mlの濃度としたもの）又は、
無関係のMoAb500μg/kgを与えた。

MoAb投与及び30分間の平衡化の後、各動物は、LD₁₀₀
の大腸菌の投与を受けた（約10¹⁰個、投与後約８〜16時
間で敗血症ショックのため死をもたらす量である）。大
腸菌は２時間に渡り注入により投与した。この研究結果
を第11表に示す。

第11表にみられるとおり、MoAb TF9−5B7を受けたヒ
ヒはLD₁₀₀の大腸菌の投与に対しても生存しつづけた。M
oAb150μg/kg及び500μg/kgの両投与で保護された。さ
らに、コアグロパシーと関係する、顕著な低血圧、凝集
カスケード活性化およびフィブリンの分解は、MoAb TF9
−5B7を受けた動物で著しく緩和された。

25.ヘモグロビン・アルファ鎖としての、58kDa huTFヘ
テロダイマー軽鎖の特徴免疫親和性単離したTFをさらにウェスタン・ブロット
分析で特性を調べ、58kD huTFヘテロダイマーの成分、
すなわち、例４で述べた47kDa及び12.5kDaタンパク質を
同定した。

例6cで述べたように行った、ウェスタンブロット分析
を、電気泳動するサンプルとして、例９で述べたように
調製した、免疫親和性により単離したhuTF、精製したヒ
トヘモグロビン、又は、分子量標準を用いて行った。指
示されているところではジスルフィド結合の還元のた
め、サンプルバッファの中に50mMジチオスレイトールを
含めた。ウェスタンブロットを、非免疫化ウサギIgG、
従来の方法で調製したウサギ抗huTF IgG又は、ダコ（Da
co）（カリホルニア、サンタバーバラ）社から入手した
ウサギ抗ヒトヘモグロビンIgGを用いて、示されている
ように免疫反応した。最初の２つのIgG調製物は、例７
で述べたように単離したMAPS−IIである。

上で述べたウェスタンブロット分析の結果は、第18図
に示した。抗huTF IgGは、還元型huTFの47kDaのバンド
とのみ免疫反応を起こし、12.5kDaのバンドとは反応し
なかったが（パネルＡ、レーン３）、一方、同IgGは、
非還元型huTFの58kDa及び47kDaの両バンドと免疫反応を
起こした（パネルＡ、レーン４）。これらの結果は、58
kDaヘテロダイマーの47kDa成分としてのhuTFの同定と一
致している。抗ヘモグロビンIgGは、非還元型huTFサン
プル中の58kDaバンドとのみ免疫反応を起こし、47kDaの
モノマーとは反応しなかった（パネルＢ、レーン４）。
しかし、抗ヘモグロビンIgGは、還元型のhuTFサンプル
中の12.5kDaバンドと免疫反応し（パネルＢ、レーン
３）また、12.5kDaの精製したヒトヘモグロビン・タン
パク質と免疫反応した（パネルＢ、レーン２）。非免疫
ウサギIgGとの反応はなかった。

上記の結果は、非還元型huTFの58kDaの分子は、ジス
ルフィド結合でヘモグロビンと結合した47kDa huTFから
なるという結論を支持している。

従って、現在、例４で述べられている58kDaヘテロダ
イマーの12.5kDa軽鎖成分は、ヘモグロビンのアルファ
鎖であり、47kDa huTFタンパク質との会合は、huTF単離
操作のアーテファクトであると考えられている。

例１〜25の結果のまとめと討論２つの異なる細胞融合体由来の、ヒト脳TFに対する、
24種のMoAbライブラリーについて報じられている。各Mo
Abの免疫特異性は、ドットブロット、ウェスタンブロッ
ト及びラジオイムノアッセイにより特徴づけられた。ほ
とんどのMoAbは、全ての３条件下、ヒトの本来のTF及び
変性TFと反応した。MoAbの１つ、TF8−5G9は、TFタンパ
ク質のルーチンな精製にうまく使用することができる。
それは組織抽出物由来のTF活性を吸着し、ミリグラム量
の精製ヒトTFを一定して与える。

MoAbの１つ以外の全ては、精製したヒト脳TFの機能活
性を強く中和する。いくつかのMoAbは、ヒヒ及びサルの
TFと交差反応をすることが分っているが、相同的因子VI
Iの存在下、ラット、ウサギ、子ウシ、イヌ、羊、又は
ブタのトロンボプラスチンにより開始した因子VII欠損
ヒト血漿の凝集を、どの抗体も阻害しなかった。さら
に、ウサギ脳トロンボプラスチンによる正常なヒト血漿
の凝集開始は、どの抗体によっても阻害を受けず、この
ことは、ヒトTF凝血活性の阻害は、因子VII/VII aを含
む、可溶性血漿凝血タンパク質への抗体の妨害によるも
のではないという結論を支持する。

抗TFによるTF凝血活性の阻害に対する最も明解な原因
は、因子VII/VII a結合のブロックである。予想される
とおり、全部で23個の抗凝血（中和性）MoAbは、TFの基
本的レセプター機能と一致して、J82細胞への因子VII/V
II aの特異的結合を妨ぐ。さらに、このことは、因子VI
I結合及び、因子X a形成速度の阻害のハーフ・マキシマ
ルが同じIgG濃度のときに起こる、選択した精製MoAbの
投与滴定においても実証される。

ヒトTFに対するMoAbは、最近、カーソン（Carson）等
（ブラッド（Blood）、70巻、490頁（1987年））によ
り、これを直接試験したのではないが、因子VII/VII a
結合の妨害によることは明白に、TF活性を阻害するもの
であると報じられた。24個のここで述べられているMoAb
のうちの23個が、TF活性を強く中和するという知見は注
目に値する。種のヒト凝血タンパク質に対するMoAbを用
いた当出願者の研究室で行った実験は、少数の割合のも
のが機能活性を中和するというものである。基本的TFと
の交差反応性が含む、反応性が各々異なることから、ハ
イブリドーマ全てが兄弟クローンであるとは思えない。
さらに、進行中のエピトープマッピング研究は、この種
のMoAbに少なくとも３つの別々の非競合抗体結合部位が
確認されることを示している。それゆえ、TFに対するMo
Abを中和する大部分のものは、機能にも関係するわずか
な免疫的に優勢なエピトープによるものでもないらし
い；事実、ホプ（Hopp）等により（モレキュラー・イム
ノロジー（Mol.Immunol.）20巻、483頁（1983年））TF
のアミノ酸配列は、多くの抗原活定基を含んでいること
が報告されている。

小さいサイズのTFは、なぜ、そんなに多くの抗TF MoA
bが因子VII/VII a結合をブロックするのかを部分的に説
明している。TFは、cDNAクローニングにより、グルコシ
ル化を除いて、25kDaの細胞外ドメインをもつことが予
想されている。それゆえ抗体及び因子VII/VII a分子
は、より小さいTFの細胞外ドメインへの結合に立体障害
を示したことになる。この立体障害仮説は、TF上の炭化
水素鎖がおそらく機能には必要ないことから（ナカムラ
（Nakamura）、トロンボヘモスタチス（Trom.Hemost.）
58巻、135頁（1987年））、コンカナバリーノＡはTF活
性を阻害する（ピトリック（Pitlick）ジャーナル・オ
ブ・クリニカル・インベスチゲーション（J.Clin.Inves
t.）55巻、175頁（1975年））という観察と一致する。

それは、種々の細胞及び組織により発現した因子VII
依存凝血活性は、同様の機能をもつ、１つ以上の分子種
に寄因するということに、いくらか関連している。しか
し、MoAb TF8−5G9は粗脳及び胎盤抽出物及び溶解した
繊維芽細胞、膀胱がん細胞及び末梢単核細胞の凝血活性
を定量的に阻害する。完全ではないが、これらの結果
は、現にTFに寄因する細胞性凝血活性は、同一ではない
ときも抗原的に関連しているという結論を支持してい
る。このことは、TFに対する単一の遺伝子がおそらく存
在しているという知見と一致している。

最近、敗血性ショックの致死効果は、凝血プロテアー
ゼカスケードにおいて、中間段階での役割を果している
抗凝血タンパク質、活性化したタンパク質Ｃを注入する
ことにより、ヒヒにおいて妨ぐことができることが示さ
れている。本研究は、TF活性を阻害するMoAbは、凝血プ
ロテアーゼカスケードの開始のブロックにより、それら
が、血管内凝血の病理学的活性化と通常関連している、
血漿凝血因子の消費を妨ぐので、生体内で、非常に特異
性の高い抗凝血剤であることを示している。

例４で述べた58kDa型のhuTFは47kDaのTFタンパク質
と、現在では免疫化学的にまた部分的アミノ酸配列によ
り、ヘモグロビンのアルファ鎖と同定されている、およ
そ12.5kDaのポリペプチドの、ジスルフィド結合で結合
しているヘテロダイマーであることが示されている。58
kDaのヘテロダイマーが、単離の途中で形成されている
らしいので、58kDaのバンドは、天然の細胞性TFのヘテ
ロダイマー型であるという以前の推察は誤りであるだろ
う。

ヘモグロビンのアルファ鎖は、１つのシステインをも
ち、またTFは、cDNAから、その細胞質ドメインに１つの
システインを有することが予想される。またTFは、細胞
外ドメインには４個のシステインをもつが、TF機能が還
元により失なわれることから、少なくとも２つが鎖内ジ
スルフィド結合に使われているはずである。TFの細胞質
ドメイン中の１つのシステインは、ほとんどの細胞質ゾ
ルタンパク質中のシステインのように、還元型で維持さ
れているだろう。この（TFの他のシステインは、ありそ
うもない）システインは、細胞溶解後、混合ジスルフィ
ド形成のため容易にアクセスでき、そして、単離操作間
での酸化で、TFの細胞質及びヘモグロビンのシステイン
間でジスルフィド結合が形成すると提唱される。この結
論は、ヘテロダイマー形成は、明らかに時間依存性があ
り、脳アセトン粉末由来のTFの界面活性剤抽出と、免疫
親和性マトリックスへの結合との間の時間を小さくする
ことが、得られるヘテロダイマーTF量を減少させる観察
を支持する。推定される96kDaのTFダイマーも、単離の
際同様のメカニズムで形成するであろう。

抗ヘモグロビン抗体カラムは、３つの58kDaのヘテロ
ダイマーを特異的に結合したが、免疫親和性で精製した
TF調製物中に観察できる高分子量種全てを定量的に除く
ことはなかった。47kDa以上の分子量をもつ他の痕跡量
のマイナーバンドは、抗TF抗体との反応で観察された。
58kDaバンドの一部を含む、これらマイナーな分子種
は、TFと他の未同定タンパク質間で形成された、混合ジ
スルフィド結合物を示している。

特別の態様及び例を含む先の明細は、本発明の説明を
意図したものであり、これを限定するものではない。多
くの他の変化や、修正が、本発明の精神や範囲を逸脱す
ることなく行うことができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 21/08 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＤＧ０１Ｎ 33/53 Ｌ 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ｃ１２Ｎ 15/02 ＺＮＡ 15/00 ＺＮＡＣ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号１６５，９３９ (32)優先日 1988年３月９日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (56)参考文献特開昭63−301797（ＪＰ，Ａ) Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．70，Ｎｏ．２（1987）ｐ．490−493 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ. 260，Ｎｏ．20（1985）10917−10920 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｐ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，Ｖｏｌ．83（1986) ｐ．299−302 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 5/10 C12P 21/02 C12P 21/08 C12N 15/12 C12N 15/06 - 15/08 C07K 14/705 C07K 16/28 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＥＲＷＥＮＴ) ＷＰＩ（ＤＥＲＷＥＮＴ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】50個以下のアミノ酸残基を含み、かつ、からなる群から選ばれた式で表わされる配列に対応する
アミノ酸残基を含む、ヒト組織因子結合部位ペプチド類
似物。
【請求項２】前記ポリペプチドが、式：で表われる、請求項１に記載のポリペプチド類似物。
【請求項３】前記ポリペプチドが、式：で表われる、請求項１に記載のポリペプチド類似物。
【請求項４】からなる群から選ばれた式で表わされるヒト組織因子結
合部位ポリペプチド類似物。
【請求項５】からなる群から選ばれた式で表わされるヒト組織因子結
合部位ポリペプチド類似物。
【請求項６】ａ）ヒト組織因子重鎖タンパク質と免疫反
応し、からなる群から選ばれた式で表わされるポリペプチドと
免疫反応し、かつｃ）DSPVECM CQEKGEFREI FYIIGAで示されるポリペプ
チドと実質的に免疫反応しない、抗体分子を含む、組織因子による因子VII/VII aの結合
を調整する抗体組成物。
【請求項７】上記抗体分子がラベルに結合している、請
求項６に記載の組成物。
【請求項８】上記抗体分子が、生理学的に許容しうる希
釈剤中に存在する、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】ヒト組織因子重鎖タンパク質及び配列:EPK
PV NQVYTVQIST KSGDWKSKCで表わされるポリペプチド
と免疫反応する抗体分子を産生する、TF8−5G9と命名さ
れたハイブリドーマ。
【請求項１０】請求項９に記載のハイブリドーマにより
産生される抗体分子を含む組織因子による因子VII/VII
aの結合を調整するモノクローナル抗体組成物。
【請求項１１】ヒト組織因子重鎖タンパク質及び配列:E
PKPV NQVYTVQIST KSGDWKSKCで表わされるポリペプチ
ドと免疫反応する抗体分子を産生する、TF9−10H10と命
名されたハイブリドーマ。
【請求項１２】請求項11に記載のハイブリドーマにより
産生される抗体分子を含む組織因子による因子VII/VII
aの結合を調整するモノクローナル抗体組成物。
【請求項１３】ヒト組織因子重鎖タンパク質及び配列:V
FGKD LIYTLYYWKS SSSGKKTで表わされるポリペプチド
と免疫反応する抗体分子を産生する、TF9−6B4と命名さ
れたハイブリドーマ。
【請求項１４】請求項13に記載のハイブリドーマにより
産生される抗体分子を含む組織因子による因子VII/VII
aの結合を調整するモノクローナル抗体組成物。
【請求項１５】ａ）身体サンプルを、ヒト組織因子重
鎖タンパク質と免疫反応する抗体分子と混合し、免疫反
応混合物を作る、ｂ）この混合物を、前記抗体分子がサンプル中に存在
するヒト組織因子と免疫反応し、免疫反応産物を形成す
るのに十分な時間維持する、そして、ｃ）ステップｂ）で生成した免疫反応産物の存在を検
定する、以上ａ）〜ｃ）のステップを含む、体液サンプル中のヒ
ト組織因子重鎖タンパク質の存在を検定する方法。
【請求項１６】ａ）請求項６に記載の抗体組成物を含
有するパッケージを含むサンプル中に存在するヒト組織
因子重鎖タンパク質の存在を検定するための、キットの
形をした診断システム。
【請求項１７】前記モノクローナル抗体分子を含む前記
抗体組成物が、ａ）TF8−5G9、ｂ）TF9−6B4、ｃ）TF9−10H10 からなる群から選ばれたハイブリドーマにより産生され
る、請求項16に記載の診断システム。
【請求項１８】ａ）サンプルを、請求項１に記載のポ
リペプチドを固体マトリックスに固定した固体サポート
と混合して、結合反応混合物を形成する、ｂ）前記結合反応混合物を、凝血因子が前記ポリペプ
チドと結合し、固相複合体及び上清を形成するのに十分
な時間維持する、ｃ）前記複合体から上記上清を分離する、及びｄ）ステップｃ）の分離した複合体から、上記凝血因
子を回収する、以上、ａ）〜ｄ）のステップを含む、サンプルから血液
凝固因子VII/VII aを単離する方法。
【請求項１９】ヒト組織因子重鎖タンパク質及び配列:E
PKPV NQVYTVQIST KSGDWKSKCで表わされるポリペプチド
と免疫反応する抗体分子を産生する、TF9−5B7と命名さ
れたハイブリドーマ。
【請求項２０】請求項19に記載のハイブリドーマにより
産生される抗体分子を含む組織因子による因子VII/VII
aの結合を調整するモノクローナル抗体組成物。
【請求項２１】ａ）ヒト組織因子重鎖タンパク質と免疫
反応し、からなる群から選ばれた式で表わされるポリペプチドと
免疫反応し、かつｃ）DSPVECM GQEKGEFREI FYIIGAで示されるポリペプ
チドと実質的に免疫反応しない、抗体分子。
【請求項２２】抗体結合部位を含む分子である請求項21
に記載の抗体分子。
【請求項２３】モノクローナル抗体分子である請求項21
に記載の抗体分子。
【請求項２４】前記抗体結合部位が、Fab、Fab′、Ｆ
（ab′）_２及びＦ（ｖ）からなる群から選択される請求
項21に記載の抗体分子。
【請求項２５】前記抗体分子がラベルに結合している請
求項21に記載の抗体分子。