PT1194528E - Anticorpo monoclonal para o factor viii, que mesmo quando presente em exesso molar inactiva o factor viii apenas em parte e um método para a produção de tal anticorpo. - Google Patents

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ΡΕ1194528 3 DESCRIÇÃO "ANTICORPO MONOCLONAL PARA O FACTOR VIII, QUE MESMO QUANDO PRESENTE EM EXCESSO MOLAR INACTIVA O FACTOR VIII APENAS EM PARTE E UM MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE TAL ANTICORPO"

ÁREA DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a novas linhas celulares e um ligandos, nomeadamente anticorpos monoclo-nais humanos e/ou humanizados, assim como a fragmentos tais como Fab, Fab', F(ab')2/· scFv, dominios únicos variáveis, regiões determinantes de complementaridade, derivados, homólogos e suas combinações, que se podem obter a partir das referidas linhas celulares. Refere-se igualmente a composições farmacêuticas que compreendem os referidos ligandos e aos métodos de prevenção e tratamento de distúrbios da coagulação e estados patológicos trombóticos resultantes em humanos administrando os referidos ligandos a doentes que deles necessitam. Refere-se igualmente a um método para obtenção de anticorpos específicos de mamífero.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A formação de coágulos sanguíneos não só limita hemorragia no caso de uma lesão (hemostase), mas pode levar a graves lesões nos órgãos e morte no contexto de doenças 4 ΡΕ1194528 arterioscleróticas por oclusão de uma artéria ou veia importante. Uma trombose é pois a formação de um coágulo sanguíneo no local e no momento errado. Envolve uma cascata de reacções bioquímicas reguladas e complicadas entre proteínas sanguíneas circulantes (factores de circulação), células sanguíneas (em particular plaquetas) e elementos da parede de um vaso danificado. 0 tratamento de anticoagulação e antitrombótico tem como objectivo inibir a formação de coágulos sanguíneos de modo a prevenir consequências perigosas, tais como enfarte do miocárdio, enfarte, perda de um membro devido a doença arterial periférica ou embolismo pulmonar. Dada a importância destas doenças, é bastante surpreendente que a terapia antitrombótica se tenha baseado, desde há muitos anos, em poucos fármacos, nomeadamente Aspirina para inibir plaquetas, Heparina que inibe indirectamente os factores de circulação IX, X e II (trombina), e Warfarina oral que inibe factores dependentes da Vit K (VII, IX, X, II e Prot C). Mais recentemente, as Heparinas de baixo peso molecular (factores de inibição X e II de diferentes graus) tornaram-se os anticoagulantes de eleição, sobretudo devido à sua facilidade de aplicação (injecção subcutânea uma vez por dia sem necessidade de monitorização). Com uma compreensão crescente dos processos envolvidos na trombose foram desenvolvidos um número crescente de inibidores específicos de factores de circulação. No entanto, até à data, ainda não foi com eles obtida uma melhor razão eficácia/segu-rança. Os Inibidores directos da trombina, em particular, 5 ΡΕ1194528 foram associados com o aumento de complicações hemorrágicas em grandes testes clínicos. A aspirina proporciona também um efeito protector contra a trombose. Induz um defeito funcional de longa duração nas plaquetas, clinicamente detectável como um prolongamento do tempo de hemorragia, através da inibição da actividade da cicloxigenase da enzima plaquetária humana prostaglandina H sintase (PGHS-1) com doses tão baixas como 30 a 75 mg. Uma vez que os efeitos colaterais gastrointestinais da aspirina parecem ser dependentes da dose, e para prevenção secundária, o tratamento com aspirina é recomendado por um período indefinido, existem razões de ordem prática para escolher a dose eficaz mais baixa. Adicionalmente foi especulado que uma dose baixa (30 mg diariamente) pode ser mais antitrombótica mas as tentativas para identificar a dosagem óptima produziram resultados contraditórios. Foi defendido que a dose de aspirina necessária para suprimir completamente a agregação plaquetária pode ser superior em doentes com doença cerebrovascular do que em sujeitos saudáveis e que pode variar ao longo do tempo no mesmo doente. No entanto, a aspirina em qualquer dose diária de 30 mg ou mais reduz no máximo até 20% o risco de eventos vasculares graves, o que deixa muito a desejar.

Adicionalmente, o papel inibidor da aspirina pode levar à prevenção de trombose assim como de hemorragia excessiva. O equilíbrio entre as duas depende de modo crítico do risco absoluto trombótico versus hemorrágico do doente. 6 ΡΕ1194528

Foi demonstrado, com vários agentes tromboli-ticos, em doentes com enfarte agudo do miocárdio, a redução do tamanho do enfarte, a preservação da função ventricular e a redução da mortalidade. No entanto, estes agentes ainda possuem inconvenientes significativos, incluindo a necessidade de grandes doses terapêuticas, especificidade limitada para a fibrina, e associada tendência significativo para hemorragia. 0 activador tecidular do plasminogénio (t-PA) recombinante restitui desobstrução completa em pouco mais de metade dos doentes, enquanto que a estreptoquinase alcança este objectivo em menos de um terço. Adicionalmente, a reoclusão após terapia trombolítica ocorre em 5 a 10% dos casos durante a estada no hospital e até 30% no decorrer do primeiro ano de acordo com Verheugt et al., J. Am. Coll. Cardiol. (1996) 27: 618-627. Consequentemente numerosos estudos examinaram os efeitos da terapia anti-trombina auxiliar em doentes com enfarte agudo do miocárdio. Como um exemplo, A Patente U.S. 5 589 173 divulga um método para dissolver e prevenir a reformação de um trombo oclusivo que compreende a administração de um factor tecidular antagonista de proteínas, que pode ser um anticorpo monoclonal ou policlonal, em junção com um agente trombo-litico. Já foi demonstrado que os anticorpos monoclonais possuem valor terapêutico como agentes antitrombóticos. O primeiro fármaco aprovado neste campo foi o Abciximab (ReoPro™), um fragmento Fab humanizado de um anticorpo 7 ΡΕ1194528 monoclonal de murino (7E3) contra os receptores plaque-tários GP Ilbllla. Os anticorpos de murino possuem caracteristicas que podem limitar severamente a sua utilização em terapias para humanos. Como proteínas estranhas, eles podem desencadear uma resposta anti-imunoglobulina designada anticorpo humano anti-ratinho (HAMA) que diminui ou destrói a sua eficácia terapêutica e/ou provoca reacções alérgicas ou de hipersensibilidade em doentes, como apresentado por Jaffers et al., Transplantation (1986) 41: 572. A necessidade de readministração em terapias de distúrbios tromboembólicos aumenta a probabilidade de tais reacções imunes. Enquanto que a utilização de anticorpos humanos monoclonais resolveria esta limitação, provou-se dificil produzir grandes quantidades de tais anticorpos pela tecnologia convencional de hibridoma. A tecnologia recombinante tem sido pois utilizada para a elaboração de anticorpos "humanizados" que mantêm a elevada afinidade de ligação dos anticorpos monoclonais de murino mas exibem imunogenicidade reduzida em humanos. Em particular, foram sugeridos anticorpos quiméricos em que a região variável (V) de um anticorpo não humano é combinado com a região constante (C) de um anticorpo humano. Por exemplo, o fragmento Fc de murino foi removido do 7 E3 e substituído pela região Fab constante da imunoglobulina G humana para formar uma quimera conhecida como Fab cl E3 ou abciximab. Os métodos para obtenção de tais imunoglobulinas quiméricas são descritos detalhadamente na Patente U.S. 5 770 198. ΡΕ1194528 0 potencial para sinergismo entre inibição GPIIb/IIIa pelo anticorpo monoclonal 7 Fab E3 e terapia trombolitica foi avaliado por Kleiman et ai., J. Am. Coll. Cardiol (1993) 22: 381-389. Foram frequentes hemorragias graves neste estudo. Consequentemente, o potencial para hemorragias que põem a vida em risco é uma preocupação séria com esta combinação de compostos antitrombóticos fortes . e que foram

Numa tentativa recente para reduzir a imunogeni-cidade de anticorpos de murino, apenas a região determinante de complementaridade (CDR), i.e. regiões hiperva-riáveis nas regiões V, em vez do dominio V completo, são transplantadas num anticorpo humano. Tais anticorpos humanizados são conhecidos como anticorpos enxertados com CDR. Tal anticorpo enxertado com CDR foi preparado com sucesso contra o antigénio nitrofenacetilo relativamente simples, no entanto a construção de anticorpos enxertados com CDR que reconhecem antigénios mais complexos teve como resultado anticorpos com actividade de ligação significativamente mais baixa do que os anticorpos nativos não humanos. Foi demonstrado em numerosos casos que a mera introdução de CDRs não humanas num anticorpo humano é insuficiente para manter actividade de ligação plena. Enquanto que é necessário um modelo computacional aperfeiçoado do anticorpo de murino de interesse de modo a se identificarem os aminoácidos criticos a serem considerados na concepção de anticorpos humanizados, 9 ΡΕ1194528 propostas linhas teóricas gerais de orientação para tal concepção, o procedimento, em todos os casos, tem de ser ajustado e optimizado para o anticorpo não humano particular de interesse. 0 factor tecidular (TF), sendo uma glicoproteina de membrana funcionando como um receptor para os factores vil e vila e consequentemente iniciando a referida via extrínseca, foi investigado como um alvo para terapia anticoagulante. Para além deste papel, o TF foi implicado em estados patogénicos, tais como, doença vascular e choque séptico gram-negativo. Um estudo desenhado para caracte-rizar o potencial anticoagulante de anticorpos monoclonais de murino demonstrou que a inibição da função do TF pela maioria dos anticorpos monoclonais estudados era dependente da dissociação do complexo TF/VIIa que se forma rapidamente quando o TF entra em contacto com o plasma. Um anticorpo monoclonal, o TF8-5G9, teve a capacidade de inibir o complexo TF/VIIa sem dissociação do complexo, proporcionando assim efeito anticoagulante imediato no plasma, como divulgado no documento WO 96/40 921.

Os factores de coagulação alvo exibem um intervalo de peso molecular médio (cerca de 45 000 a 160 000) e uma concentração plasmática normal relativamente elevada (pelo menos 0,01 micromol/L).

Uma preocupação constante com todos os agentes antitrombóticos disponíveis é o risco de sobredosagem e 10 ΡΕ1194528 consequentemente de hemorragia excessiva e que ponha a vida em risco. A maioria dos agentes antitrombóticos correntes justificam por isso uma monitorização rigorosa do doente.

Assim sendo, são necessários compostos eficazes para o tratamento de distúrbios da coagulação, que não possam ser sobredoseados, que não requeiram monitorização e que não possuam problemas hemorrágicos. Para um agente terapêutico baseado em anticorpos, o composto ideal seria um anticorpo humano com eficácia anticoagulante total que não induza imunogenicidade. O factor VIII é uma proteína que proporciona uma importante actividade cofactor coagulante e é um dos factores humanos de coagulação com um peso molecular relativamente elevado (265 000) e uma concentração plas-mática normal muito baixa (0,0007 micromol./litro). Com os seus 2 332 resíduos aminoacídicos, o factor viu é uma das cadeias polipeptídicas conhecidas mais longas e é sintetizada no fígado, no baço e na placenta. Foi demonstrado que o seu gene inclui 186 000 nucleótidos. O factor VIII circula como uma proteína plas-mática inactiva. Os factores V e VIII são proteínas homólogas que partilham a mesma configuração estrutural de domínios A triplicados e domínios C duplicados com domínios B estruturalmente divergentes que ligam os domínios A2 e A3. O factor VIII circula numa multiplicidade de espécies fragmentadas num complexo fortemente associado com o factor 11 ΡΕ1194528 von Willebrand numa concentração de 1 nmol/L. A activação do factor VIII ocorre por uma clivagem entre os domínios AI e A2, resultando na molécula heterotrimérica instável factor VlIIa. 0 factor Vllla liga-se firmemente a membranas que possuem fosfolípidos acídicos. 0 factor VIII um sítio de ligação de fosfolípidos no domínio C2, entre os aminoácidos 2 302 e 2 332, de acordo com Arai et al. em J. Clin. Invest. (1989) 83: 1978. Na mesma região do factor VIII, encontra-se também um sítio de ligação de factor von Willebrand que actua em conjunção com os resíduos amino-acídicos 1 645-1 689 no domínio A3 de acordo com Shima et ai. em Throm. Haemost. (1993) 69: 240 e J. Biol. Chem. (1994) 269: 11 601.

Os anticorpos policlonais que inibem a actividade do co-factor do factor VIII foram classificados como inibidores de tipo I ou de tipo II de acordo com a sua capacidade para inibir o factor VIII completamente (tipo I) ou apenas parcialmente (tipo II) . De acordo com Gawryl et al., Blood (1982) 60: 1103-9, crê-se que a inactivação reduzida do factor VIII devido a auto-anticorpos humanos do tipo II é devida a um efeito estérico do factor von Willebrand. Os anticorpos monoclonais não são mencionados e, até à data, não foi feita qualquer utilização terapêutica de tais inibidores de tipo II. Biggs et al., Br. J. Haematol. (1972) 23: 137 proporcionaram anteriormente uma interpretação derivada a partir de dados obtidos utilizando anticorpos humanos policlonais, que um padrão inibitório do tipo II poderia estar relacionado com baixa afinidade. B. 12 ΡΕ1194528

Ly et al., Scandinavian Journal of Haematology (1982), 28: 132-140 divulgam anticorpos policlonais para o factor VIII que na maior parte dos casos pertencem à classe IgG tanto em hemofílicos desenvolvendo alo-anticorpos como nos doentes mais raros possuindo auto-anticorpos contra os seus próprios factores VIII. Estes anticorpos policlonais inactivam parcialmente a actividade do Factor VIII tal como os anticorpos descritos em Biggs et al. (1972) e Hoyer et al. (1982). Este documento não menciona uma vez mais se os anticorpos monoclonais têm a capacidade de reproduzir o padrão de inactivação do Factor vm demonstrado pelos anticorpos policlonais do doente. Não foram mencionados novamente anticorpos monoclonais.

Os pedidos Europeus de patentes EP-A-123 945, EP-A-152 746 e EP-A-432 134 todos divulgam anticorpos monoclonais produzidos por linhas celulares de hibridomas e que possuem um padrão de reactividade específica com os fragmentos polipeptídicos do factor VIIIc. Estes anticorpos monoclonais são designados úteis para a detecção da presença do factor villc e polipéptidos relacionados no plasma por técnicas de imunoensaio, mas não é sugerida nestes documentos uma potencial utilização terapêutica. J. Battle et al., Annals of Hematology (1997) 75: 111-115, divulgam um alo-anticorpo policlonal de um doente com doença de von willebrand grave mostrando, como um anticorpo policlonal de coelho contra o factor von Willebrand, uma actividade parcialmente inibitória para o 13 ΡΕ1194528

Factor VIII plasmático. Estes anticorpos policlonais anti-factor VIII inactivam assim o factor VIII seguindo um padrão similar aos anticorpos anti-factor VIII tipo II encontrados em doentes com hemofilia A (Gawryl et al., Blood (1982) 60: 1103-9). No entanto, os anticorpos factor VIII não foram detectados no referido alo-anticorpo humano, sugerindo assim que se tratava de uma inibição não especifica. J. Ingerslev et al., Clinica Chimica Acta (1988) 174: 65-82 divulgam uma série de anticorpos monoclonais de murino contra o factor humano von Willebrand: dois deles, pertencendo à imunoglobulina isotipo IgGl, exibem uma inibição extremamente baixa (1,3 BU/mg imunoglobulina) do factor VIII como presente na tabela I do referido documento. Por comparação, o anticorpo monoclonal humano B02C11, derivado de doente com hemofilia A com inibidor, possui uma actividade específica de 7 000 BU/mg proteína (Jacquemin et al., Blood, (1998) 92: 496-506). Isto indica que a administração de anticorpos como descrito por Ingerslev a um animal ou ser humano não afectará a actividade do factor VIII, a menos que esteja presente no plasma uma quantidade extremamente elevada de anticorpos (centenas de mg/mL). Os autores não divulgam se quando utilizados em grande excesso estes anticorpos exibem actividade inibidora como o inibidor do factor policlonal VIII humano tipo I ou tipo li (í.e. inactivação parcial), tal como descrito em Gawryl et al., Blood (1982) 60: 1103-9. 14 ΡΕ1194528

Maraganore et al., Circulation (1992) 86: 413, demonstraram que um péptido sintético de 12 aminoácidos correspondendo aos resíduos 1 675-1 686 do factor VIII inibe a clivagem pela trombina da cadeia pesada necessária para a activação da actividade pró-coagulante do factor VIII e também da cadeia leve necessária para dissociar o factor VIII do factor von Willebrand e que a sulfatação de tirosina do referido péptido potência o seu reconhecimento pelo factor VIII. J. Clin. Invest. (1988) 82: 206-211 descreve a obtenção de um modelo animal para hemofilia A por infusão de anticorpos humanos anti-factor VIII em coelhos. De acordo com o documento WO 95/01570, os anticorpos contra a cadeia leve de factor VIIIc humano ou suíno foram produzidos num primeiro animal e subsequentemente foi induzida uma a hemofilia temporária num segundo animal por intermédio do anticorpo monoespecífico purificado obtido. A Patente U.S. 5 804 159 divulga igualmente a indução temporária de um distúrbio da coagulação num mamífero por intermédio de uma preparação de anticorpo anti-plasma que actua em diversos factores sanguíneos de circulação, e.g. uma preparação compreendendo anticorpos contra o factor von Willebrand e factor VIII humanos, ou contra o complexo factor VlII/factor von Willebrand, ou contra pró-coagu-lantes, anticoagulantes, factores de estrutura do coágulo, factores de fibrinólise e fosfolípidos.

No entanto, nenhum dos compostos de anticorpos 15 ΡΕ1194528 acima mencionados envolvendo o factor VIII foi descrito para fins terapêuticos. Existe de facto um preconceito entre os peritos na técnica contra a investigação em anticorpos anti-factor VIII para terapia antitrombótica porque é assumido que, sendo uma deficiência no factor VIII a causa de hemofilia A, tais anticorpos induziriam um estado de hemorragia. 0 documento WO97/26010 divulga anticorpos mono-clonais possuindo actividade neutralizadora auto-limitante contra um factor de coagulação, os quais são úteis em composições farmacêuticas para distúrbios trombóticos. A actividade neutralizadora auto-limitante neste documento é definida como uma actividade de um anticorpo que se liga a um factor de coagulação humano e inibe trombose de um tal modo que é produzida modulação limitada da coagulação. A modulação limitada da coagulação é por sua vez definida como um aumento no tempo de coagulação medido pelo prolongamento do tempo de tromboplastina parcial activado (aPTT) em que o plasma permanece coagulável com o aPTT atingindo um valor máximo, preferencialmente de 35 a 100 segundos, apesar das concentrações crescentes do anticorpo monoclonal. o aPTT é então utilizado como o principal critério par a avaliação de eficácia versus responsabilidade hemorrágica de agentes antitrombóticos.

De modo mais particular, este documento demonstra que um policlonal de ovelha para o factor VIII (SAF8C-IG, comprado à Affinity Biologicals) induz um prolongamento 16 ΡΕ1194528 auto-limitante do aPTT (o aPTT aumentado até a um máximo de cerca de 65 segundos). Demonstrámos, no entanto, que SAF8C-IG inibe totalmente a actividade do factor VIU humano (ver Figure 10), i.e. é um inibidor de tipo I na classificação de Gawryl et al., Blood (1982) 60: 1103-9. isto demonstra que um aumento limitado no tempo de coagulação até a um certo valor máximo não está necessariamente correlacionado com a inactivação parcial de um factor de coagulação, e muito menos com um decréscimo no risco de hemorragia. Por exemplo, é bem conhecido que doentes com um défice total de factores de coagulação possuem um prolongamento limitado do aPTT, normalmente à volta de 60 a 100 segundos, mas de qualquer modo estão expostos a um risco dramático de hemorragia (Hathaway et al. Am J Clin Pathol (1979) 71: 22-25, e Hoffmann et al. Thromb Haemostas (1978) 39: 640-645).

Contrariamente, é bem conhecido que um APTT prolongado não proporciona um parâmetro válido da redução do risco de trombose. De modo notável, a deficiência no factor XII, outro factor de coagulação da via de coagulação intrínseca resulta num APTT prolongado até 6 vezes (Hathaway et al. Am J Clin Pathol (1979) 71: 22-25, e; Hoffmann et al. Thromb Haemostas (1978) 39: 640-645). No entanto, um número significativo de doentes com esta deficiência sofreu enfarte do miocárdio ou tromboembolismo, demonstrando a falta de protecção contra doença trombótica em doente deficientes em factor XII, apesar do importante prolongamento do APTT (McPherson RA Am J Clin Pathol (1977) 68: 420, e; Glueck Hl et al. Ann Intern Med (1966) 64: 390) . 17 ΡΕ1194528

Jacquemin et al. na Blood (1998) 92: 496-506 referem-se a um anticorpo monoclonal IgG4 humano específico para o factor VIII (B02C11) produzido por uma linha celular derivada do reportório de células B de memória de um doente com hemofilia A com inibidores. É afirmado que o B02C11 reconhece o domínio C2 do factor VIII e que inibe a sua ligação quer ao factor von Willebrand como a fosfolípidos. É afirmado inibir completamente a actividade pró-coagulante do factor VIII nativo e activado com uma actividade específica de 7 000 unidades Bethesda/mg. Os presentes inventores demonstraram adicionalmente que o B02C11, enquanto que inibe totalmente a actividade do factor VIII humano, proporciona um prolongamento de cerca de 110 segundos no tempo de coagulação medido por aPTT, o que mais uma vez demonstra que um aumento no tempo de coagulação até um certo valor máximo não está necessariamente correlacionado com a inactivação parcial de um factor de coagulação. Tal redução dos níveis do factor VIII exporiam o doente a um risco elevado de hemorragia, como em doentes com hemofilia A grave (Levine PH Ann NY Acad Sei (1975) 240: 201; Gilbert MS Mount Sinai J Med (1977) 44: 339).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a novos ligandos, nomeadamente novos anticorpos monoclonais humanos ou humanizados, fragmentos, derivados e seus homólogos como 18 ΡΕ1194528 especificado nas reivindicações em anexo, que se ligam ao factor VIII ou a um seu complexo; a uma nova linha celular a partir da qual os referidos anticorpos monoclonais podem ser obtidos e, a composições farmacêuticas compreendendo os referidos ligandos.

Um primeiro objectivo principal da presente invenção é consequentemente proporcionar uma terapia anti-trombolítica eficaz e segura que reduz o risco de hemorragia em mamíferos, mais particularmente em humanos.

Um objectivo adicional desta invenção é proporcionar composições terapêuticas que proporcionam uma terapia antitrombolitica eficaz que reduz o risco de hemorragia em mamíferos, mais particularmente em humanos. É ainda um objecto adicional da presente invenção proporcionar uma terapia antitrombolitica e compostos terapêuticos antitrombóticos cuja utilização é mais segura do que as terapias e composições previamente conhecidas.

Um aspecto da presente invenção é ter como alvo o factor vm ou um seu complexo, utilizando ligandos específicos. Estes ligandos, sendo anticorpos monoclonais, proporcionam um nível de plataforma terapeuticamente útil inibindo apenas parcialmente a função do factor alvo de tal modo que é mantida uma actividade residual do factor mesmo quando o ligando é utilizado em excesso molar. Pode ser estabelecida uma curva do efeito inibidor de um ligando de 19 ΡΕ1194528 acordo com a presente invenção em relação a um certo factor alvo contra a concentração do referido ligando e pode ser determinada a concentração à qual ainda existe uma acti-vidade residual mínima do factor que é pelo menos 1%, de modo preferido pelo menos 2%. A actividade residual do factor a cinco vezes esta concentração não deve ser substancialmente diferente da actividade residual no ponto mínimo. A presente invenção proporciona anticorpos mono-clonais de elevada afinidade, humanos e humanizados, assim como fragmentos, derivados, e homólogos de quaisquer destes, possuindo a capacidade para inactivar apenas parcialmente o factor VIII ou um seu complexo, mesmo em excesso molar do ligando, prevenindo assim o risco de sobredosagem e as resultantes complicações hemorrágicas. Ainda outro aspecto da presente invenção é proporcionar uma nova linha celular que produz o respectivo anticorpo monoclonal humano. A presente invenção inclui também sequências polinucleotídicas que codificam os anticorpos ou seus fragmentos acima mencionados. Será reconhecido que existe um grande número de sequências nucleotídicas que estão abrangidas pela presente invenção devido à redundância do código genético. A presente invenção inclui também sequências complementares que correspondem aos anticorpos monoclonais, ou seus fragmentos, acima mencionados. Em particular, a presente divulgação inclui sondas construídas a partir dos anticorpos monoclonais, ou seus fragmentos, acima mencionados ou a partir dos polinucleótidos ou das sequências complementares acima mencionadas. 20 ΡΕ1194528 A presente divulgação proporciona adicionalmente um método de redução de coagulação em humanos, compreendendo a administração de um anticorpo monoclonal, humano ou humanizado, fragmento, derivado ou seu homólogo, com a capacidade de inactivar apenas parcialmente o factor VIII ou um seu complexo a um doente com necessidade de tal redução mesmo quando o referido ligando se encontra em excesso molar. Divulga ainda um método de tratamento ou prevenção de um estado trombótico patológico em mamíferos, nomeadamente em humanos, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ligando, nomeadamente um anticorpo monoclonal, humano ou humanizado, ou um fragmento, derivado ou seu homólogo, com capacidade de inactivação apenas parcial, mesmo quando o referido ligando se encontra em excesso molar, do factor VIII ou de um complexo incluindo o factor VIII, a um mamífero necessitado de tal tratamento ou prevenção. Numa forma de realização preferida, o estado trombótico patológico pode ser seleccionado, por exemplo, entre coagulação intravascular, trombose arterial, restenose arterial, trombose venosa e arteriosclerose .

Outra forma de realização da presente invenção diz respeito a uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo monoclonal, que possui a capacidade de se ligar a um sítio num factor VIII ou num complexo incluindo o factor VIII, para inactivar apenas parcialmente o referido factor ou complexo do factor mesmo quando o ligando se encontra em 21 ΡΕ1194528 excesso molar, misturado com um transportador farmaceuti-camente aceitável. 0 referido ligando é um anticorpo monoclonal com elevada afinidade anti-factor VIII ou anti-complexo factor VIII - factor von Willebrand, humano ou humanizado, ou hibridado, ou um fragmento, derivado ou seu homólogo. A composição farmacêutica da presente invenção pode ainda de modo opcional compreender uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente trombolítico.

Outra forma de realização da presente invenção é dirigida um método para a selecção de anticorpos monoclo-nais específicos. A técnica convencional de imunização de um animal tal como um ratinho com uma proteína tal como o factor VIII provoca uma resposta imunitária que pode envolver vários epitopos na molécula do factor VIII. A presente invenção proporciona métodos mais selectivos para obtenção de anticorpos monoclonais específicos contra um epitopo de uma proteína de tipo selvagem. Primeiro, é proporcionado (i.e. seleccionado) um mamífero não humano, que possui uma versão modificada de uma proteina de tipo selvagem pelo menos parcialmente funcional. A referida modificação, localizada num domínio da proteina, pode ser devida a qualquer razão, e.g. raça ou variedade, a defeitos genéticos de nascença, a uma doença ou interferência humana, e.g. imunotolerância contra a versão modificada funcional. Ao dador mamífero não humano é então administrado a proteína de tipo selvagem de modo a desencadear uma resposta imune; neste momento, é importante que seja administrada uma quantidade suficiente de proteína de tipo selvagem (e.g. factor VIII) até que seja produzida uma resposta 22 ΡΕ1194528 imune. Seguidamente, num passo final do método, a selecção de células B a partir do dador mamífero não humano resultará numa probabilidade muito maior de se obterem anticorpos monoclonais contra um epitopo na região da modificação, por exemplo seleccionando-se linfócitos B do dador que produzem anticorpos que inactivam apenas parcialmente a proteína de tipo selvagem. 0 potencial anticoagulante do factor VIII inibi-dor não foi explorado até à data, talvez devido às bens conhecidas complicações hemorrágicas que ocorrem em doente com hemofilia A que não possuem de todo (hemofilia grave) ou bastante (hemofilia moderada) actividade do factor VIII. A hemofilia A, no entanto, não só demonstra a importância do factor VIII como um co-factor limitante da coagulação, mas também a ligação existente entre coagulação e o desenvolvimento de arteriosclerose. A arteriosclerose e as suas complicações trombóticas foram de facto identificadas como sendo significativamente mais raras entre doentes com hemofilia A. A actividade antagonista do factor VIII a um nível que permite hemostase suficiente para evitar hemorragia mas que protege contra a formação patológica de trombos intravasculares constitui consequentemente uma hipótese com substancial potencial para anticoagulação segura em doenças pró-trombóticas, tais como, trombose venosa profunda (DVT), embolismo pulmonar (PE), pós-operatoriamente, na gravidez, na doença arterial coronária (CAD), doença cerebrovascular (CVD), doença arterial periférica (PAD) e em intervenções vasculares. 23 ΡΕ1194528 A presente invenção é baseada na determinação surpreendente de novos ligandos, nomeadamente novos anticorpos monoclonais humanos e humanizados e fragmentos, derivados e seus homólogos como especificado nas reivindicações em anexo. Estes exibem um "efeito de plataforma" não previsto, i.e. realização de inactivação apenas parcial de um factor VIII envolvido em hemostase, em particular na cascata de coagulação, quer individualmente ou em combinação, independentemente do excesso de ligando. Os ligandos podem-se ligar ao factor VIII ou a um complexo do factor VIII afectando apenas parcialmente a função de um sitio fisiologicamente funcional do referido factor ou complexo do factor. Este "efeito de plataforma" torna os ligandos particularmente adequados para o tratamento de distúrbios da coagulação e estados patológicos trombóticos resultantes enquanto que minimizam o risco de hemorragia, por comparação, em particular, com anticorpos com actividade neutralizadora auto-limitante mencionados no documento W097/26010. Existe pois um forte contraste entre a "a actividade neutralizadora auto-limitante de anticorpos para factores de circulação divulgados no documento WO 97/26010 e a inibição de plataforma com significado clinico abrangido pela presente invenção, em que os anticorpos anti-factor VIII, tais como, KRIX-1 inibem a actividade do factor VIII em não mais do que 85%. É particularmente útil a propriedade dos ligandos de acordo com a presente invenção que permite alguma função fisiológica do sítio afectado mesmo quando o ligando se 24 ΡΕ1194528 encontra em excesso molar. Os ligandos são anticorpos anti-factor VIII ou anticorpos contra um complexo do factor VIII, em particular anticorpos monoclonais humanos ou híbridos humanos que se ligam ao factor VIII ou a um complexo do factor VIII e inibem pelo menos parcialmente a actividade do factor VIII. Os dados indicam que os inibidores tipo II reagem com determinantes antigénicos diferentes do que os anticorpos tipo I e que estes determinantes estão parcialmente bloqueados no complexo factor VlII/factor von Willebrand. A presente invenção será agora descrita em maior detalhe com referência às seguintes figuras. A invenção é definida pelas reivindicações em anexo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Fig. 1 apresenta os resultados da produção de anticorpos humanos monoclonais derivados a partir de um doente com hemofilia A, expressos na forma de anticorpo IgG ligado a factor VIII em ELISA. A Fig. 2 apresenta a inibição da actividade do factor VIII pelo anticorpo monoclonal B02C11. A Fig. 3 apresenta a inibição da actividade do factor viu pelo anticorpo monoclonal produzido a partir da linha celular KRIX 1. 25 ΡΕ1194528 A Fig. 4 apresenta a inibição da ligação do factor VIII activado a fosfatidil-L-serina pelo anticorpo monoclonal produzido a partir da linha celular KRIX 1. A Fig. 5 apresenta a influência de certos anticorpos policlonais na dissociação do factor viu activado do factor von Willebrand.

As Figs. 6 e 8 apresentam sequências de amino-ácidos (as linhas inferiores) e sequências nucleotidicas (linhas superiores) respectivamente para as regiões variáveis VH das cadeia pesadas dos anticorpos monoclonais B02C11 e KRIX 1. São também apresentadas as três regiões determinantes de complementaridade (CDR) de cada cadeia que são, cada uma, um ligando polipeptídico individual de acordo com uma forma de realização individual da presente invenção.

As Figs. 7 e 9 apresentam sequências de amino-ácidos (as linhas inferiores) e sequências nucleotidicas (linhas superiores) respectivamente para as regiões variáveis VL das cadeias leves dos anticorpos monoclonais B02C11 e o KRIX 1. São também apresentadas as três CDRs de cada cadeia que são, cada uma, um ligando polipeptídico individual de acordo com uma forma de realização individual da presente invenção. A Fig. 10 proporciona um gráfico que mostra a inibição da actividade do factor VIII pelo anticorpo SAF8C-Ig mencionado no documento WO97/26010. 26 ΡΕ1194528 A Fig. 11 ilustra a cinética de inibição do factor VIII por KRIX-1. A Fig. 12 ilustra a inibição da trombose venosa no modelo hamster por KRIX-1.

DEFINIÇÕES O termo "anticorpo" refere-se a moléculas intac-tas assim como a seus fragmentos, tais como Fab, Fab', F(ab')2 ou Fv, que possuem a capacidade de se ligaram ao epitopo determinante do factor relevante ou domínio do factor. "Anticorpo humanizado" como aqui utilizado, refere-se a moléculas anticorpo em que os aminoácidos foram substituídos nas regiões de ligação a não-antigénios de modo a melhor se assemelharem a um anticorpo humano.

Um "anticorpo humano modificado" ou um "anticorpo humano híbrido" como aqui utilizado, refere-se a um anticorpo humano em que os aminoácidos nas regiões de ligação do antigénio foram substituídos por sequências de acordo com a presente invenção, e.g. CDRs, ou outras partes das regiões variáveis que foram obtidas a partir do reportório de anticorpos humanos. 0 termo "homologia" ou "homólogo" como aqui uti- 27 ΡΕ1194528 lizado relativamente um ligandos de acordo com a presente invenção refere-se a uma molécula que irá competir com ou inibir a ligação de um dos ligandos de acordo com a presente invenção ao sitio alvo. A ligação deve ser especifica, i.e. a ligação da molécula alternativa ao sitio deverá ser tão especifica como do ligando de acordo com a presente invenção. Em que os ligandos de acordo com a presente invenção incluem sequências de aminoácidos, a homologia pode incluir possuir pelo menos 80%, de modo mais preferido 90% e de modo ainda mais preferido 95% de identidade de sequência de aminoácidos com o ligando relevante.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção será descrita com referência a certas formas de realização e a certas figuras mas a presente invenção não é por elas limitada mas apenas pelas reivindicações. A presente divulgação refere-se a um conceito geral para a obtenção de uma "inibição de plataforma" terapeuticamente útil que inactiva apenas parcialmente um factor na hemostase pela selecção de certos anticorpos monoclonais, assim como para a produção de tais anticorpos monoclonais humanos ou humanizados, ou fragmentos, derivados ou seus homólogos, e a utilização destes para terapia antitrombolítica e em composições terapêuticas anti-trombóticas. Estes ligandos e composições podem possuir a propriedade vantajosa de que a inactivação do factor é apenas parcial mesmo quando o ligando se encontra 28 ΡΕ1194528 em excesso molar. Isto significa que mesmo que o ligando seja utilizado numa quantidade que possa ser esperada inactivar completamente o factor alvo, a inactivação continua a ser incompleta. A presente invenção proporciona uma linha celular particular que produz anticorpos humanos monoclonais que são reactivos com o factor VIII humano e mais especifi-camente possuem a capacidade de inactivação da actividade do co-factor do factor VIII humano por interferência com o sitio de clivagem proteolitica ou factor von Willebrand ou reacção do complexo tenase ou por indução de uma alteração de conformação tridimensional no factor VIII, em particular focando um domínio do factor VIII e por reconhecimento de epitopos localizados no referido dominio. Um dominio preferido é o domínio Cl do factor viu mas a presente invenção não lhe está limitada. Um sítio no domínio C2 do factor VIII pode também ser parcialmente inibido. A presente invenção inclui também ligandos para além de anticorpos policlonais, em particular anticorpos monoclonais, que reduzem a taxa de libertação do factor VIII do factor von Willebrand. Estes anticorpos monoclonais têm especificamente como alvo o factor VIII quando ligado ao factor von Willebrand e consequentemente têm como alvo um epitopo associado com o complexo do factor VIII e factor von Willebrand. A presente invenção proporciona também fragmentos de qualquer dos acima mencionados anticorpos monoclonais, tais como, Fab, Fab', F(ab')2, scFv, CDRs, domínios únicos variáveis assim como derivados, homólogos e suas combinações. Mais particularmente, estes anticorpos 29 ΡΕ1194528 monoclonais e fragmentos podem ter como alvo um domínio do factor VIII, em particular o domínio Cl do factor VIII. Podem também inibir parcialmente um sítio no domínio C2 do factor VIII. Podem também ter como alvo um epitopo associado com o complexo do factor von Willebrand e factor viu. Um aspecto da presente divulgação é consequentemente proporcionar ligandos para além de anticorpos policlonais que se ligam a um primeiro sítio (e.g., no domínio Cl do factor VIII) afastado de um segundo sítio funcional (e.g. o sítio no domínio C2 do factor VIII que é responsável pela ligação de f osf olípidos) de tal modo que a função do segundo sítio é apenas parcialmente afectada mesmo quando o ligando se encontra em excesso molar e terapêutico. A linha celular designada KRIX 1 que produz anticorpos monoclonais de acordo com a presente invenção foi depositada na BCCM/LMBP (Belgian Co-ordinated Collections of Microorganisms/Plasmid Collection Laboratorium voor Moleculaire Biologie, Universidade de Ghent K.L. Ledegan-ckstraat 35, B-9000 Ghent, BE com o número de acesso LMBP 5089CB em 1 de Julho, 1999. A presente divulgação proporciona adicionalmente linhas celulares que produzem anticorpos monoclonais humanos possuindo uma reactividade substancialmente similar à dos anticorpos monoclonais humanos obtidos a partir da linha celular depositada acima mencionada, assim como os anticorpos monoclonais humanos obteníveis a partir destas linhas celulares adicionais. 30 ΡΕ1194528 A presente invenção proporciona adicionalmente anticorpos monoclonais humanos modificados ou anticorpos monoclonais híbridos humanos contra o factor VIII, que se ligam e apenas inactivam parcialmente o factor VIII ou um complexo incluindo o factor VIII e o factor von Willebrand que compreendem apenas elementos derivados do reportório de anticorpos humanos. Por anticorpos monoclonais híbridos humanos quer se dizer um anticorpo híbrido construído a partir de um anticorpo humano e de regiões variáveis de acordo com a presente invenção. Até ao momento, convencionalmente na técnica, só foi possível a obtenção de anticorpos contra o factor VIII derivados de animais, e.g. ratinhos, ou a construção de anticorpos quiméricos a partir de anticorpos humanos com as porções variáveis derivadas de anticorpos de ratinhos. A presente divulgação proporciona também ligandos, para além de anticorpos policlonais, que possuem a capacidade de inactivarem apenas parcialmente um factor (ou um complexo incluindo um factor) envolvido em hemostase, em particular na cascata da coagulação do sangue, de modo preferido o factor VIII ou um complexo incluindo o factor VIII, ligando-se a um sítio do referido factor ou complexo, ocorrendo também a referida inactivação apenas parcial quando o ligando da invenção se encontra em excesso molar em relação ao referido factor. O sítio ao qual se liga pode ou não estar directamente ou substancialmente envolvido numa interacção fisiológica do referido factor ou complexo. Por exemplo, o ligando pode-se 31 ΡΕ1194528 ligar a um sítio que se encontra a uma distância pré-determinada de um sítio fisiologicamente funcional do referido factor. Inactivação parcial "de plataforma", significa aqui uma inactivação no máximo de 98%, de modo preferido uma inactivação no máximo de 95%, como determinado por um método de teste adequado, tal como por exemplo, o teste cromogénico da Coatest® (Kabi Vitrum, Bruxelas, Bélgica) ou da Chromogenix AB, Mõlndal (Suécia). 0 nível de activação necessário pode depender da função fisiológica do factor envolvido em hemostase. Por outro lado, de modo a proporcionar utilidade terapêutica, a inactivação do factor sanguíneo deverá ser de pelo menos cerca de 65%, de modo preferido pelo menos cerca de 70%, como determinado pelos mesmos métodos de teste acima mencionados. Será reconhecido que os ligandos de acordo com a presente invenção operam de um modo diferente do mecanismo convencionalmente atribuído aos anticorpos tipo II contra o factor VIII. Um mecanismo convencional é o de competição com outro factor, e.g. factor von Willebrand. A cinética de um mecanismo de competição significa que se uma espécie se encontra a uma concentração elevada comparada com a outra (e.g. em excesso molar), a inibição é efectivamente completa. Contraria-mente, os ligandos da presente invenção atingem uma plataforma na inactivação do factor relevante, que é substancialmente independente do excesso de ligando. O outro mecanismo convencional atribuído aos anticorpos tipo II é o de baixa afinidade: também neste caso, um excesso levará a reacção a inibição completa. 32 ΡΕ1194528

Quando o factor sanguíneo alvo é o factor VIII, os ligandos da invenção podem ser anticorpos monoclonais humanos que se podem obter a partir da linha celular depositada KRIX 1, sendo de modo preferido da classe IgG, e que possuem a capacidade de inactivarem apenas parcialmente a actividade do co-factor do factor VIII. Mais especifi-camente a divulgação refere-se, numa forma de realização preferida, a anticorpos monoclonais humanos de tal origem que possuem a capacidade de reconhecer epitopos localizados no domínio Cl do factor VIII. Embora os inventores não desejem ficarem restringidos a uma única explicação ou teoria, crê-se que a ligação de tais anticorpos monoclonais humanos afecte parcialmente a ligação do factor VIII activado a fosfolípidos, um passo necessário para a expressão de actividade do co-factor. A presente divulgação proporciona ainda anticorpos monoclonais possuindo substancialmente as mesmas características como acima divulgado e que são produzidos por imunização propositada em animais, de modo preferido em ratinho, por exemplo por injecção de factor VIII humano em ratinhos e depois fundindo os linfócitos do baço com uma linha celular de mieloma de ratinho, seguida pela identificação e clonagem das culturas celulares produtoras de anticorpos anti-factor VIII. Os anticorpos monoclonais produzidos em animais são depois humanizados, por exemplo associando a região determinante de complementarariedade ("CDR") do anticorpo monoclonal não humano com regiões humanas de grelha - em particular a região C constante do 33 ΡΕ1194528 gene humano - tal como divulgado por Jones et al. na Nature (1986) 321: 522 ou Riechmann na Nature (1988) 332: 323. A presente invenção proporciona também fragmentos e derivados, em particular regiões determinantes de complementaridade ("CDRs") dos acima mencionados anticorpos monoclonais anti-factor VIII assim como seus homólogos. Por exemplo, a invenção proporciona fragmentos Fab, Fab' e F(ab')2 de ligação a antigénios produzidos por digestão proteolitica dos referidos anticorpos monoclonais utilizando métodos bem conhecidos na técnica, tal como descrito por Stanworth et al., Handbook of Experimental Immunology (1978), vol. 1 capitulo 8 (Blackwell Scientific Publica-tions). Tais fragmentos, os quais contêm o sítio de ligação do anticorpo, perderam várias das propriedades do anticorpo original, tais como activação complementar ou capacidade de ligação a receptores gama Fc. A presente invenção inclui também fragmentos variáveis de cadeia única (scFv), fragmentos de dominio variável único dos anticorpos e combinação destes fragmentos e dos fragmentos acima mencionados . A invenção proporciona também partes variáveis de cadeia única solúveis ou ancoradas na membrana dos acima mencionados anticorpos monoclonais e um método para a sua obtenção como se segue. As sequências de DNA das partes variáveis das cadeias humanas pesada e leve são amplificadas em reacções separadas e clonadas. É inserida uma sequência ligante de quinze aminoácidos, por exemplo (Gly4 34 ΡΕ1194528

Ser) 3, entre a VH e a VL por intermédio de uma reacção em cadeia da polimerase (PCR) em dois passos, por exemplo, de acordo com Dieffenbach e Dveksler, "PCR Primer, a laboratory manual" (1995), Cold Spring Harbour Press, Plainview, NY, EUA. 0 fragmento resultante é depois inserido num vector adequado para expressão de fragmento variável de cadeia única (scFv) como um polipéptido solúvel ou exposto num fago. Isto pode ser conseguido por métodos bem conhecidos dos peritos na técnica, tal como descrito por Gilliland et al., Tlssue Antigens (1996) 47: 1-20. A presente invenção inclui também um ligando compreendendo péptidos representativos de regiões hipervariáveis de um anticorpo monoclonal que podem ser obtidos por síntese utilizando um sintetizador da Applied Biosystem, por exemplo um sintetizador de polipéptidos tal como o modelo 9050 da Milligen (EUA) ou um modelo de uma tecnologia semelhante, que por si só ou em combinação com outras ou similares regiões hipervariáveis terão propriedades similares às do anticorpo original. A divulgação proporciona adicionalmente uma composição farmacêutica para a prevenção ou tratamento de distúrbios de hemostase, em particular da cascata de coagulação e estados patológicos trombóticos resultantes em humanos, compreendendo, como um ingrediente activo, um ligando que não um anticorpo policlonal, de modo preferido um anticorpo monoclonal humano tal como aqui acima divulgado, misturado com um transportador farmaceuticamente aceitável. De modo mais preferido o referido anticorpo 35 ΡΕ1194528 monoclonal é um anticorpo monoclonal humano, ou um seu fragmento, derivado ou homólogo, que pode ser obtido da linha celular KRIX 1 depositada na Colecções Coordenadas Belgas de Microrganismos com o número de acesso LMBP 5089CB. 0 grau de homologia com o referido anticorpo monoclonal é de modo preferido pelo menos 80%, de modo mais preferido 90% e de modo ainda mais preferido 95%, e a homologia diz respeito de modo preferido particularmente às regiões determinantes de complementaridade do anticorpo. Um ligando de acordo com a presente invenção pode também incluir um polipéptido sintético de potência equivalente. A composição farmacêutica da presente divulgação deve compreender uma quantidade terapeuticamente eficaz do acima referido ingrediente, tal como indicado daqui para a frente no que diz respeito ao método de tratamento ou prevenção. A composição farmacêutica da presente divulgação pode ainda compreender, nomeadamente com vista a um designado tratamento anti-trombótico auxiliar, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente trombolitico. Tais agentes trombolíticos, assim como a sua dosagem normal dependendo da classe a que pertencem, são bem conhecidos dos peritos da técnica. Entre vários exemplos de agentes trombolíticos que podem ser incluídos nas composições farmacêuticas da invenção, a seguinte lista não limitante pode particularmente citada: t-PA, estreptoquinase, reptilase, TNK-t-PA ou estafiloquinase.

Os transportadores farmaceuticamente aceitáveis 36 ΡΕ1194528 para utilização nas composições farmacêuticas da invenção são descritos, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences 16a ed. (1980) e a sua formulação é bem conhecida para os peritos na técnica. Eles incluem todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes anti-bacterianos e antifúngicos (por exemplo, fenol, ácido sórbico, clorobutanol), agentes isotónicos (tais como açúcares ou cloreto de sódio) e afins. Podem ser incluídos outros ingredientes para controlar a duração de acção do ingrediente activo do anticorpo monoclonal na composição. Podem ser obtidas composições de libertação controlada seleccionando polímeros transportadores adequados como, por exemplo, poliésteres, poli-aminoácidos, polivinil pirroli-dona, copolímeros de acetato de vinil-etileno, metil-celulose, carboximetilcelulose, sulfato de protamina e afins. A taxa de libertação de fármaco e a duração de acção podem também ser controladas incorporando o ingrediente activo do anticorpo monoclonal em partículas, e.g. microcápsulas, de uma substância polimérica, tais como, hidrogéis, ácido poliláctico, hidroximetilcelulose, meta-crilato de polimetilo e os outros polímeros acima descritos . Tais métodos incluem sistemas colóides de libertação de fármacos como lipossomas, microesferas, microemulsões, nanopartícuias, nanocápsulas e outros. Dependendo da via de administração, a composição farmacêutica compreendendo o ingrediente activo pode necessitar de revestimentos protectores. A forma farmacêutica adequada para utilização injectável inclui soluções aquosas ou dispersões estéreis e pós estéreis para a sua preparação extemporânea. Os trans- 37 ΡΕ1194528 portadores típicos incluem assim tampões aquosos biocompa-tíveis, etanol, glicerol, propilenoglicol, polietileno-glicol e suas misturas. A presente divulgação proporciona também a utilização de um ligando, que não um anticorpo policlonal (como acima divulgado) como um medicamento. De modo mais preferido o medicamento utilizado na presente invenção constitui um modo para prevenir e/ou tratar distúrbios de hemostase, em particular, distúrbios da coagulação e outros estados patológicos trombóticos em mamíferos, de modo preferido em humanos. 0 referido ligando pode ser proporcionado a um doente por qualquer modo bem conhecido na técnica, í.e., oralmente, intranasalmente, subcutaneamente, intramuscularmente, intradérmico, intravenosamente, intra-arterialmente, parentericamente ou por cateterização. De acordo com a presente invenção, o ligando pode também ser utilizado como um medicamento em conjugação ou associação com outro medicamento, por exemplo, um agente trombolítico tal como aqui acima divulgado sob o título de composições farmacêuticas. A presente divulgação proporciona assim um método de tratamento e/ou prevenção de hemostase, distúrbio da coagulação ou estado trombótico patológico, assim como um método de redução da coagulação num mamífero, de modo preferido num humano, compreendendo a administração a um mamífero necessitado de tal tratamento ou prevenção ou redução da coagulação de uma quantidade terapeuticamente 38 ΡΕ1194528 eficaz de um ligando que não um anticorpo policlonal tal como aqui acima divulgado. De modo preferido o referido ligando é um anticorpo monoclonal humano ou humanizado obtido a partir da linha celular KRIX 1 depositada na Colecções Coordenadas Belgas de Microrganismos com o número de acesso LMBP 5089CB ou um fragmento Fab, Fab' ou F(ab')2 que se liga a um antigénio, uma região determinante de complementaridade (CDR), uma parte variável de cadeia única solúvel ou ancorada a uma membrana (scFv), um domínio variável único ou um derivado ou uma combinação de quaisquer destes elementos.

Uma quantidade terapeuticamente eficaz como aqui utilizado significa de cerca de 1 micrograma a cerca de 10 miligrama por quilograma de peso corporal, de modo mais preferido de cerca de 10 micrograma a cerca de 1 miligrama por quilograma de peso corporal do mamífero a ser tratado. Será reconhecido que, tendo em conta o longo tempo de semi-vida da maioria dos anticorpos humanos IgG, os ligandos da presente divulgação que são anticorpos monoclonais da referida classe possuirão uma periodicidade de tratamento que contribui para o conforto do doente.

Como formas de realização preferidas do referido estado trombótico patológico a ser evitado ou tratado, podem ser citadas coagulação intravascular, trombose arterial (que pode ser responsável por enfarte agudo do miocárdio e enfarte), restenose arterial, trombose venosa (que ocorre normalmente nas veias periféricas em conse- 39 ΡΕ1194528 quência de trauma acidental ou cirúrgico ou imobilização) ou arteriosclerose. Num método de tratamento mais preferido, é proporcionado ao doente um bolus (injectado intravenosamente) a uma dosagem determinada pelo médico com experiência dependendo dos critérios que estabelecem o estado clínico particular do doente. 0 método de tratamento e/ou prevenção de acordo com a invenção pode incluir adicionalmente tratamento ou prevenção do mesmo estado trombótico patológico administrando, de modo preferido por administração sequencial, ao doente uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente trombolítico, tal como aqui acima divulgado, sob o título de composições farmacêuticas. Sequencial, como aqui utilizado, significa que o ligando da presente invenção e o conhecido agente trombolítico são administrados ao doente sequencialmente mas não simultaneamente. A presente invenção proporciona adicionalmente um método para obtenção de anticorpos monoclonais a partir de um mamífero não humano, compreendendo os passos: a) selecção de um mamífero não humano possuindo uma proteína modificada activa fisiologicamente e pelo menos parcialmente funcional, a modificação dizendo respeito a uma proteína de tipo selvagem e localizada num domínio da proteína; b) administração da proteína de tipo selvagem ao 40 ΡΕ1194528 mamífero não humano de modo a desencadear uma resposta imune, e c) selecção de linfócitos B a partir do mamífero não humano que produzem anticorpos que inactivam apenas parcialmente a proteína de tipo selvagem.

De acordo com este método, a prática convencional é sacrificar o mamífero não humano e remover o seu baço de modo a se realizar o passo (c). A presente divulgação proporciona ainda um método para obtenção de anticorpos monoclonais a partir do sangue de um ser humano possuindo uma proteína modificada fisiolo-gicamente activa e pelo menos parcialmente funcional, a modificação dizendo respeito a uma proteína de tipo selvagem e estando localizada num domínio da proteína, e a quem foi administrada a proteína de tipo selvagem, o referido método compreendendo o passo de selecção, a partir do sangue do referido ser humano, linfócitos B que produzem anticorpos que inactivam apenas parcialmente a proteína de tipo selvagem. A presente invenção, como incluída nos vários aspectos acima divulgados e definida nas reivindicações em anexo, possui várias vantagens. A vantagem principal da utilização terapêutica dos anticorpos monoclonais humanos da invenção é que o tratamento é altamente específico para a resposta imune em questão. Em estados de hipercoagulação, 41 ΡΕ1194528 a especificidade dos anticorpos monoclonais humanos da invenção assegura que a interacção na via da cascata de coagulação é limitada ao factor reconhecido pelo anticorpo.

Mais especificamente, a utilização dos anticorpos anti-factor vm possuindo as características preferidas acima mencionadas características produz uma combinação única das vantagens relacionadas com a escolha do factor VIII como alvo, as relacionadas com as características de inibição do factor VIII e as relacionadas com a utilização de anticorpos: - escolher o factor VIII como alvo significa que neutralizar a actividade de um co-factor tal como a do factor VIII não acarreta risco algum de inibição completa da actividade enzimática que intensifica, representando assim uma vantagem sobre métodos que têm como alvo directo enzimas tal como o factor IX. - as formas de realização dos inibidores acima descritas possuem em comum o facto de inibirem eficazmente mas apenas parcialmente a actividade co-factor do factor VIII, estabelecendo uma plataforma terapeuticamente útil, mesmo quando o anticorpo monoclonal da invenção é utilizado num excesso de mais de 100 vezes. Os anticorpos monoclonais de acordo com a presente invenção realizam um efeito de plataforma na inactivação do factor VIII, permitindo a aplicação de bolus, proporcionando protecção antitrombótica segura ao longo de várias semanas sem a necessidade de monitorização ou o risco de sobredosagem. 42 ΡΕ1194528 - os anticorpos humanos IgG exibem um periodo de semi-vida prolongado de três semanas (excepto o IgG3 que é uma semana), proporcionando assim niveis plasmáticos muito estáveis do agente antitrombótico e permitindo uma redução drástica na frequência de administração. Adicionalmente, a utilização de anticorpos humanos ou derivados implica um risco minimo de indução de respostas imunes. A presente invenção descrita adicionalmente pelos exemplos seguintes que são proporcionados apenas para fins ilustrativos. EXEMPLO 1 - produção de anticorpos monoclonais deri-vados de doentes com hemofilia A.

Os anticorpos monoclonais humanos com a especificidade e caracteristicas desejadas são produzidos por transformação de linfócitos B obtidos a partir do sangue periférico de doentes que sofrem de hemofilia A ou hemofilia adquirida. 0 método de selecção de doentes é uma forma de realização da presente invenção. De modo a desencadear uma resposta imunitária mais especifica, são procurados doentes que possuem função deficiente de uma proteína activa fisiologicamente, e.g. factor VIII. "Deficiente" significa que existe alguma função residual mas que esta é menor do que é conhecido para o tipo selvagem da mesma proteína. A comparação entre a proteína própria e a proteína de tipo selvagem deve mostrar uma diferença nas 43 ΡΕ1194528 duas proteínas, de modo preferido numa região ou domínio que é de interesse. A diferença pode ser uma deleção ou uma substituição de um ou mais aminoácidos por outros. Aos doentes é seguidamente administrada proteína de tipo selvagem suficiente para desencadear uma resposta imunitária. Depois, são extraídos linfócitos B a partir de doentes e seleccionados com base na produção de anticorpos que possuem as propriedades desejáveis. Embora em cima tenha sido feita referência a "doentes", o método de acordo com esta forma de realização pode ser aplicado de modo geral a mamíferos. 0 procedimento acima mencionado resulta numa probabilidade maior de obtenção de anticorpos dirigidos para o domínio que possui o defeito.

As células B são transformadas por infecção com o vírus Epstein-Barr e por activação de antigénios de superfície utilizando técnicas bem conhecidas dos peritos na técnica. Os sobrenadantes celulares contendo os anticorpos adequados são identificados por um procedimento de ensaio específico tal como em baixo descrito em maior detalhe.

Assim sendo, os anticorpos contra o factor VIII são identificados fazendo reagir o sobrenadante com placas para microtitulação de poliestireno revestidas com factor VIII ou com complexos de factor VlII/factor von Willebrand. A ligação de anticorpos específicos é detectada pela adição de um reagente IgG não humano ligado a uma enzima. A adição de um substrato enzimático que é convertido num composto 44 ΡΕ1194528 colorido na presença da enzima permite a detecção de anticorpos específicos. Tais métodos referidos como imunoensaios enzimáticos (ELISA) são bem conhecidos dos peritos na técnica e descritos em detalhe e.g. em Current Protocols in Immunology, capítulo 2, John Wiley & Sons (1994) .

Mais especificamente no caso presente, a ligação de anticorpos IgG anti-factor VIII foi detectada pela adição de um anticorpo monoclonal de ratinho específico para o Fc gama humano marcado com peroxidase de rábano bravo. A subclasse IgG do anticorpo anti-factor VIII foi detectada por ELISA, como apresentado na Fig. 1. A inibição actividade funcional do factor VIII foi testada num ensaio funcional de coagulação como se segue. Foram incubados volumes iguais de sobrenadante de cultura celular e de uma mistura de plasma normal durante duas horas a 37 °C e a actividade residual do factor VIII foi de seguida medida. Os anticorpos que inibem significativamente a actividade do factor VIII são apresentados com um asterisco na Fig. 1.

As células B (tais como BO 2C11) que produzem anticorpos anti-factor VIII são depois expandidas e clonadas por diluição limitante como descrito por exemplo em Current Protocols in Immunology (ver supra). Os anticorpos anti-factor VIII que possuem a capacidade para inibir a actividade pró-coagulante do factor vm como acima descrito são identificados utilizando um kit de teste cromogénico tal como um teste cromogénico para o factor 45 ΡΕ1194528 VIII da Dade, Duchingen, Alemanha ou Coatest® comercializado pela Kabi Vitrum (Bruxelas, Bélgica) ou Chromogenix AB (Mõlndal, Suécia).

Foram incubados volumes iguais de anticorpos monoclonais BO 2C11 e uma mistura de plasma sanguíneo normal durante 2 horas a 37 °C. As concentrações de BO 2C11 antes da agitação estão representadas no eixo x. A redução de actividade do factor VIII foi medida num teste de coagulação e foi expressa como uma percentagem da actividade obtida na ausência do anticorpo (ver Fig. 2). A actividade residual atinge assimptoticamente o zero (inibição completa).

Os anticorpos que inibem a função do factor VIII com afinidade suficiente mas que não inibem completamente a actividade pró-coagulante do factor VIII, mesmo quando utilizados em grande excesso do anticorpo, foram selecci-onados numa forma de realização adicional da presente invenção. Um exemplo representativo de tal anticorpo é proporcionado na Fig. 3 em que, sendo incubados volumes iguais de KRIX 1 e de factor VIII recombinante ou de plasma normal durante duas horas a 37 °C e sendo as concentrações (expressas em microgr/mL) de KRIX 1 antes da mistura com o plasma como indicadas, a actividade residual do factor VIII foi medida utilizando o teste cromogénico acima mencionado. A Fig. 3 apresenta de modo interessante cerca de 60% de inibição do factor VIII a uma concentração de 0,1 microgr/mL e de modo ainda mais interessante uma inibição 46 ΡΕ1194528 assimptótica do factor VIII cerca de 80% em todo o intervalo de concentrações de 0,5 a 300 microgr/mL.

Os anticorpos assim seleccionados são seguidamente produzidos em culturas volumosas e purificados por cromatografia de afinidade utilizando métodos bem conhecidos dos peritos na técnica.

Os detalhes de uma técnica de preparação não limitativa são apresentados seguidamente. O factor VIII recombinante humano (actividade especifica: 4 000 iu/mg) foi adquirido à Hyland (Glendale, CA) como material apenas para uso laboratorial; o complexo derivado do plasma (pd) factor VIII- factor von Willebrand, purificado por cromatografia de troca iónica (actividade especifica ± 160 IU/mg proteína; razão p/p factor von Willebrand para factor VIII 15:1), e o factor von Willebrand sem factor VIII purificado (razão p/p factor von Willebrand para factor VIII 4 800:1; lote 951016) foram adquiridos à Cruz Vermelha Belga (Bruxelas, Bélgica).

Foram recolhidas amostras de sangue periférico de dadores que sofriam de hemofilia moderada e com inibidores. As células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram imortalizadas por infecção por EBV concomitantemente à activação dos antigénios de superfície. Foram rastreadas por ELISA quatrocentas e oito linhas celulares para a produção de anticorpos contra o factor VIII. Por exemplo, uma linha celular, designada KRIX 1, foi clonada com 47 ΡΕ1194528 sucesso por diluição limitante. A clonagem foi verificada por amplificação RT-PCR de mRNA que codifica para as regiões V das cadeias pesada e leve do anticorpo: foi obtida uma única sequência a partir de 10 clones de produtos de PCR. Foram obtidos anticorpos purificados fazendo passar o sobrenadante de culturas celulares KRIX 1 em Proteina-A Sepharose. Uma ELISA realizada com a subclasse igG e anticorpos específicos para a cadeia leve identificou KRIX-1 como IgG4k.

Os anticorpos monoclonais humanos foram purificados por adsorção em Proteína A imobilizada (Proteína A high-TRAPR; Pharmacia, Uppsala, Suécia). Os fragmentos Fab de anticorpo monoclonal humano foram preparados por digestão com papaína. Foi diluída uma mg do anticorpo seleccionado para 500 microgr/mL em tampão fosfato (KH2PO4 a 40 mmol/L, Na2HP04.2H20 a 60 mM, NaCl a 0,15M) contendo L-cisteína a 50 mmol/L (Sigma), EDTA a 1 mmol/L (Merck) e 10 micrograma de papaína (Sigma). A mistura foi incubada durante 3 h a 37 °C com agitação contínua. A reacção foi interrompida pela adição de iodoacetamida até uma concentração final de 75 mmol/L durante 30 min a RT. O anticorpo digerido foi submetido a diálise contra solução salina tamponada com fosfato (NaCl a 140 mmol/L, KC1 a 6 7 mmol/L, Na2HP04 a 20 mmol/L, KH2PO4 a 4,4 mmol/L, pH 7,4). O IgG e os fragmentos Fc não digeridos foram seguidamente eliminados através de passagem por Proteína A Sepharose (Hi Trap Proteína A; Pharmacia). O fragmento Fab foi adicionalmente purificado por cromatografia por filtração em gel numa Superdex 200 (Pharmacia). 48 ΡΕ1194528

Foram utilizados métodos convencionais para a detecção de anticorpos IgG anti-factor VIII, a determinação da subclasse IgG, e a avaliação de inibição da ligação do factor VIII ao factor von Willebrand. Para a análise da inibição da ligação do factor r VIII a um anticorpo seleccionado por um anticorpo Fab e nativo, foram revestidas placas Meixoorb de poliestireno (Nunc) durante 2 h com 50 pL do anticorpo diluído para 5 microgr/mL em solução salina tamponada com glicina (glicina a 20 mmol/L, NaCl a 34 mmol/L, pH 9,2). Após lavagem, foram misturados 50 pL de factor VIII r marcado com biotina diluído para 1 microgr/mL em Tris-caseína (10 mmol/L tris (hidroximetil)-aminoetano, pH 7,3, contendo NaCl a 150 mmol/L e caseína a 0,5%) durante 1 h a 37 °C com 50 pL de IgG humano a várias diluições. Foi adicionada às placas uma alíquota de 50-pL da mistura durante 2 h a RT. Após lavagem, a ligação do factor VIII r biotinilado foi detectado por adição sequencial de avidina- peroxidase e OPD. O factor VIII r (concentração final 0,2 microgr/ mL) foi incubado com anticorpo IgG humano a diferentes concentrações durante 2 horas a 37 °C e a actividade residual do factor VIII foi avaliada por um teste cromogénico (Coatest Factor VIII, Chromogenix AB, Mõlndal, Suécia ou Kabi Vitrum, Bruxelas, Bélgica). A inibição da actividade plasmática do factor VIII foi medida pelo método Bethesda, em que uma mistura de plasma normal recolhido em citrato trissódico tamponado foi utilizada como fonte de factor VIII. A actividade residual do factor VIII foi 49 ΡΕ1194528 avaliada por um ensaio cromogénico ou de coagulação de passo único. EXEMPLO 2-Produção de anticorpos monoclonais através de imunização em animais.

Alternativamente, os anticorpos monoclonais com as mesmas caracteristicas dos divulgados no exemplo 1 podem ser produzidos por imunização propositada de animais. Deste modo, são injectados ratinhos com factor VIII humano em Adjuvante de Freund.

Os anticorpos monoclonais anti-factor VIII humano são então obtidos por fusão de linfócitos do baço com uma linha celular de mieloma de ratinho. Os sobrenadantes de culturas celulares que produzem anticorpos anti-factor VIII são identificados e clonados por diluição limitante, utilizando os métodos descrito em Current Protocols in Immuno-logy (ver supra). A selecção adicional de inibidores com a capacidade desejada para inibir a actividade pró-coagulante do factor VIII é efectuada como descrito no exemplo 1.

Os anticorpos monoclonais produzidos em ratinhos são seguidamente humanizados. Assim, as sequências das partes variáveis das cadeias pesadas e leves de ratinho são alinhadas com regiões variáveis de imunoglobulinas humanas para a identificação de anticorpo humano com a maior homologia nas regiões de grelha. Os fragmentos de DNA que codificam para regiões variáveis humanizadas são então 50 ΡΕ1194528 sintetizados por um método de enxertia de CDR (regiões determinantes de complementaridade) baseado em PCR como descrito por exemplo em Sato et al., Câncer Research (1993) 53: 851-6. O produto de PCR final que codifica a parte variável da cadeia pesada dos anticorpo humanizado é digerido e subclonado a montante do gene C gama-1 humano num primeiro plasmideo de expressão. A região variável da cadeia leve humanizada da construção final é inserida a montante do gene C capa num segundo plasmideo de expressão. As duas construções são seguidamente co-transfectadas num sistema de expressão de células COS. EXEMPLO 3 - Caracterização de anticorpos anti-factor VIII.

Os anticorpos monoclonais de origem humana (exemplo 1) ou animal (exemplo 2) são caracterizados utilizando um sistema de teste em que é avaliada a sua capacidade para inibir a ligação do factor VIII a fosfolipidos. Assim, são revestidas placas de poliestireno para microtitulação com fosfatidil-L-serina. É misturado factor VIII recombinante solúvel a uma concentração final de 2 microgr/mL durante 30 minutes a 37 °C com diversas concentrações do anticorpo a ser avaliado. A mistura é seguidamente rapidamente activada com trombina e adicionada a placas revestidas com fosfatidil-L-serina. As referidas placas foram depois incubadas durante dois minutos a 21 °C e a ligação do factor VIII foi detectada pela adição do domínio Al mAbFl4A2anti-factor VIII, durante dois minutos, seguida pela incubação durante dois minutos com Fc gama anti- 51 ΡΕ1194528 ratinho de cabra conjugado com HRP. Os resultados desta experiência são apresentados na Fig. 4 para o anticorpo monoclonal produzido pela linha celular KRIX 1. São indicados na figura a média de ligação de factor viu activado na ausência (símbolos preenchidos) ou presença (símbolos não preenchidos) do anticorpo, assim como o desvio padrão de triplicados. Os controlos na ausência do factor VIII produziram OD 490 inferior a 0,05. A Fig. 4 demonstra claramente que o anticorpo monoclonal produzido pela linha celular KRIX 1 inibe significativamente a ligação do factor VIII a fosfolípidos mas provoca inibição incompleta mesmo quando adicionado em grande excesso.

Para demonstrar que na ausência de plasma, KRIX 1 não reconheceu a cadeia leve do factor viu mutado do dador, foram sintetizados fragmentos de DNA que codificam cadeia leves de factor vm tipo selvagem e mutado. As proteínas correspondentes foram expressas em lisados de reticulócitos. O dobramento correcto das cadeias leves nativas e mutadas foi determinado por imunoprecipitação com o anticorpo monoclonal humano B02C11, o qual reconhece um epitopo conformacional na porção carboxi-terminal da cadeia leve do factor VIII. As experiências de imunoprecipitação indicam que o B02C11 se liga a cadeias leves tipo selvagem e Arg2150His, enquanto que o KRIX 1 captura exclusivamente a cadeia leve de tipo selvagem. A exposição prolongada de géis SDS-PAGE a filmes de autorradiografia não detectou qualquer ligação significativa de KRIX 1 à cadeia leve mutada. As experiências controlo não demonstraram ligação a reagentes do teste para além do factor VIII ou fragmentos 52 ΡΕ1194528 do factor VIII, e a pré-incubação com factor VIII r solúvel impediu a ligação a fragmentos do factor VIII marcados com metionida, confirmando a especificidade da ligação. 0 KRIX 1 não reconheceu o factor VIII em transferência de Western indicando que o epitopo reconhecido era conformacional. Foi por isso realizado mapeamento adicional do epitopo com fragmentos de factor VIII produzidos em lisados de reticulócitos. As experiências preliminares indicaram que tal abordagem era eficaz para a síntese dos domínios do factor VIII. 0 procedimento de imunopreci-pitação utilizando domínios de factor VIII marcados produzidos em lisado de reticulócito foi validado mapeando o epitopo reconhecido pelo anticorpo monoclonal humano B02C11. Foi observada uma concordância completa entre a ligação de fragmentos C2 de deleção do factor VIII produzidos em lisados de reticulócitos e a ligação a fragmentos recombinantes produzido em E. coli ou células COS. 0 KRIX 1 liga-se à extensão completa da cadeia leve, a fragmentos correspondendo aos domínios A3C1, C1C2, e ao domínio isolado Cl. Contrariamente, o krix 1 não se ligou aos domínios Cl ou C1C2 com a substituição Arg2150His, embora numa experiência controlo, o domínio C1C2 Arg2150His foi ligado por B02C11 como a sua contraparte normal.

Foram investigadas outras mutações na cadeia leve que podem alterar a ligação de KRIX 1. Como apresentado na Tabela I, o KRIX 1 inibiu a actividade de todas as moléculas mutadas do factor VIII testadas até ao momento, excepto as que possuíam a mutação Arg2150His. 53 ΡΕ1194528

Tabela I. Inibição da actividade do factor viu no plasma de doentes com hemofilia A moderada. mutação no factor VIII actividade do factor VIII (IU/mL) Inibição por KRIX-1 (%) Argl689Leu 0, 04 >70 Argl749His 0, 39 >70 Glyl750Arg 0, 38 >70 Alal82 4Val 0, 16 >70 Aspl825Gly 0, 17 >70 Hisl961Tyr 0, 24 >70 Argl966Gln 0, 080 >70 Met201011e 0, 04 >70 Ser2011Asn 0, 23 >70 Val2016Ala 0, 05 >70 Asn2019ser 0, 13 >70 Leu2052Phe 0, 23 >70 Asp2074Gly 0, 13 >70 Thr2 08 6Ile 0, 08 >70 Ile2098Ser 0, 20 >70 Phe210ILeu 0, 06 >70 Asn2129Ser 0, 20 >70 Arg2150His 0, 03 0 Pro2153Gln 0, 02 65 Arg2159Leu 0, 16 >70 Trp2229Cys 0, 02 >70 Gln2246Arg 0, 08 >70 54 ΡΕ1194528 A utilização de KRIX 1 como um medicamento para inibir parcialmente mutações suaves do factor VIII do factor VIII não afectará a eficácia da terapia. 0 KRIX 1 inibiu a ligação do factor VIII ao factor von Willebrand de um modo dependente da dose. A concentração de KRIX 1 necessária para se atingir 50% de inibição (IC50) da ligação do factor VIII foi 0,25 microgr/mL e obteve-se mais de 95% de inibição com 20 microgr/mL de KRIX 1. Os fragmentos Fab de KRIX 1 também inibiram a ligação do factor VIII ao factor von Willebrand. No entanto, foi necessário 15 vezes mais KRIX 1 Fab do que nativo, em termos molares, para inibir 50% da ligação do factor VIII ao factor von Willebrand. Foram realizadas experiências adicionais para excluir que os fragmentos Fab de KRIX 1 ainda possuíssem anticorpo intacto ou parcialmente digerido. A análise por SDS-PAGE dos fragmentos Fab purificados por adsorção em proteina A e cromatografia por filtração em gel exibiram uma única banda. A presença de quantidades vestigiais de fragmentos Fc gama que se mantiveram ligados a fragmentos Fab foi excluida por ELISA. Foram incubados poços com factor VIII não solúvel com KRIX 1 nativo ou Fab. A ligação de KRIX 1 Fab e nativo pode ser detectada pela adição de cadeia leve de IgG anti-capa marcada com peroxidase. Por oposição, a adição de IgG anti-Fc gama marcada com peroxidase não revelou nenhuma ligação especifica mesmo quando foram incubados nos poços 100 microgr/mL da preparação Fab. Por comparação, a adição de 0,1 microgr/mL do anticorpo nativo deu origem a uma ligação significativa. Na ELISA, foi 55 ΡΕ1194528 necessária uma concentração 15 vezes superior de Fab comparada com o anticorpo nativo para inibir 50% da ligação de KRIX 1 biotinilado a factor VIII não solúvel, indicando que o fragmento Fab de KRIX 1 possuía uma afinidade mais baixa para o factor vm do que o anticorpo nativo. Consequentemente, a necessidade de concentrações maiores de KRIX 1 Fab comparado com o anticorpo nativo para inibir a ligação do factor VIII ao factor von Willebrand deverá ser atribuida à afinidade mais baixa dos fragmentos Fab de KRIX 1 para o factor VIII.

Para determinar se o KRIX 1 seria representativo dos anticorpos policlonais do dador, foi utilizado um ensaio competitivo. A ligação de KRIX 1 biotinilado ao factor VIII não solúvel foi medida na presença de concentrações crescentes de KRIX 1, igG policlonal do dador, ou igG policlonal controlo. A igG do dador inibiu de modo dependente da dose a ligação do KRIX 1 ao factor VIII. A concentração de KRIX 1 e IgG do dador que inibem 50% de KRIX 1 biotinilado no factor VIII foi respectivamente de 0,3 microgr/mL e de 170 microgr/mL, enquanto que não foi observada inibição com a IgG controlo. EXEMPLO 4 - Produção de anticorpos monoclonais derivados de doentes com hemofilia A e que se ligam ao complexo factor VIII- factor von Willebrand.

Alternativamente, os anticorpos que reduzem a taxa de libertação do factor VIII do factor von Willebrand são identificados como se segue. As placas de poliestireno 56 ΡΕ1194528 para microtitulação são revestidas com um anticorpo especifico para o factor von Willebrand. É misturada uma solução de factor vm recombinante biotinilado (0,5 microgr/mL) em complexo com o factor von Willebrand (5 microgr/mL) com várias concentrações de IgG de um dador (Fig. 5 quadrados preenchidos), e.g. o mesmo doente como acima descrito (a partir do qual se produziu KRIX 1), MoAb4HlD7, ou de IgG de um sujeito não hemofílico (Fig. 5 triângulos preenchidos). Foi adicionada IgG às concentrações indicadas a placas de microtitulação revestidas com um anticorpo de ratinho, MoAb4HlD7 contra o factor von Willebrand para uma incubação de duas horas à temperatura ambiente. Após lavagem, o factor VIII foi activado por trombina durante dois minutos a 37 °C. O factor VIII ligado ao factor von Willebrand foi detectado pela adição de avidina peroxidase. Os controlos incluíram a detecção de factor VIII ligado biotinilado na ausência de digestão com trombina (OD450 = 460 + 47,7 SD) e de factor VIII recombinante biotinilado após digestão com trombina na ausência de anticorpo (OD450 = 160 + 16,0 SD).

Os resultados destas experiências para anticorpos policlonais são apresentados na Fig. 5. Nesta figura, são indicados os valores médios assim como o desvio padrão de triplicados. A Fig. 5 demonstra claramente que uma proporção significativamente maior do factor VIII activado se mantêm ligado à placa na presença de concentrações crescentes do anticorpo, i.e. demonstra a redução da dissociação do factor VIII activado do factor von Willebrand na presença de um anticorpo inibidor que reconhece o factor 57 ΡΕ1194528 VIII ligado ao factor von Willebrand. Foram obtidos anticorpos monoclonais a partir destes anticorpos policlonais de acordo com o métodos descrito nesta invenção, indicando assim que a presente invenção pode ser estendida a anticorpos monoclonais e fragmentos e seus derivados que se ligam a complexos Factor vm/factor von Willebrand. EXEMPLO 5: Sequenciação de domínios variáveis de anticorpos. A sequenciação de domínios variáveis de anticorpos foi efectuada como se segue. O isolamento de RNA a partir de linha de células humanas B imortalizadas por EBV foi realizado utilizando o Reagente TRlzol de acordo com as instruções do fabricante (Life Technologies). Foi sintetizado cDNA com o sistema de pré-amplificação SuperScript para a síntese da primeira cadeia de cDNA. 0 cDNA que codifica os genes da região variável da cadeia pesada genes (VH) foi amplificado por reacção em cadeia da polimerase (PCR) utilizando iniciadores específicos para a sequência líder das famílias VH e para o primeiro exão da região C gama, como descrito (Bakkus et. al.r Blood, 80: 2326, 1992). O emparelhamento foi realizado a 60°C durante 40 ciclos de PCR. Os produtos de PCR de tamanho adequado (460 bp) foram isolados em gel de agarose a 1,5% e clonados utilizando o Kit TA Cloning (Invitrogen BV, Leek, Holanda). Foi realizado um rastreio por PCR utilizando pares de iniciadores correspondendo à família de genes VH de interesse em culturas de colónias escolhidas ao acaso. Foi 58 ΡΕ1194528 isolado DNA plasmídico de colónias positivas utilizando o kit Wizard Plus Minipreps (Promega, Menlo Park, CA) e sequenciado em ambas as direcções com Sequenase (US Biochemical, Cleveland, OH), de acordo com as instruções do fabricante. A análise das sequências génicas variáveis foi realizada utilizando ο V BASE Sequence Directory (Tomlinson et. ai., MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK) .

As sequências completas da Vh e Vl do anticorpo BO 2C11 descrito no exemplo 1 foram submetidas à EMBL Nucleotide Sequence Database, respectivamente com os números de acesso AJ224083 e AJ224084.

As sequências de aminoácidos exibidas nas Figuras 6 e 7 definem as regiões VH e VL do anticorpo B02C11 incluindo as três CDRs para cada uma das cadeias pesada e leve. São também apresentadas as sequências polinucleo-tídicas que codificam para estas regiões. As SEQ. NOs. 2 e 3 são, respectivamente, as sequências de aminoácidos das cadeia pesada e leve de B02C11, enquanto que as SEQ. NOs. 5 e 6 proporcionam as sequências polinucleotidicas que codificam estas regiões variáveis.

As sequências de aminoácidos presentes na Figuras 8 e 9 definem as regiões VH e VL do anticorpo KRIX-1 incluindo as três CDRs 1-3 para cada uma das cadeias curtas e longas. São também apresentadas as sequências polinucleotidicas que codificam para estas regiões. As SEQ. NOs. 8 e 1 são, respectivamente, as sequências de aminoácidos das 59 ΡΕ1194528 cadeias pesada e leve do KRIX-1, enquanto que as SEQ. NOs. 7 e 4 proporcionam as sequências polinucleotidicas que codificam estas regiões variáveis. EXEMPLO 6 (COMPARATIVO) - Inibição da actividade do factor VIII pelo anticorpo SAF8C-Ig.

Os níveis do factor VIII são medidos num ensaio funcional após um período de incubação de duas horas a 37 °C com várias concentrações do anticorpo SAF8C-Ig, utilizando o teste cromogénico descrito no exemplo 1. Como exibido na Figura 10, a actividade residual do factor VIII é reduzida de um modo dependente da dose. Já a 100 microgr/mL de SAF8C-Ig, a actividade residual do factor VIII é menos do que 1% da actividade normal. Tais níveis baixos do factor VIII expõem o doente a um risco elevado de hemorragias espontâneas, como é bem conhecido por exemplo de Levine, Ann. NYAcad. Sei. (1975) 240: 201 e Gilbert, Mount Sinai J. Med. (1977) 44: 339. EXEMPLO 7 - Inibição de trombose venosa em hamsters por KRIX 1.

Foi induzida experimentalmente trombose na veia femoral de hamsters anestesiados, injectando o corante rosa-bengala na veia jugular e por exposição da veia femoral à luz verde de uma lâmpada Xenon durante 4 minutos (Kawazaki et. al.r Thromb Haemost (1999) 81: 306-11). Como consequência da iluminação do vaso, o corante decompõe-se e produz radicais que provocam lesões nas células endoteliais 60 ΡΕ1194528 do vaso. Consequentemente, as estruturas subendoteliais são expostas à circulação sanguínea e inicia-se a formação de um trombo. A quantidade de trombo formado é medida via transiluminação do vaso com lesões (Kawazaki et. al., Thromb Haemost (1999) 81: 306-11) e é quantificada via a quantidade de luz branca que é transiluminada através do vaso. Como representado na Figura 11, quando esta experiência é realizada em animais controlo, o tamanho médio do trombo medido em 13 hamsters é 220,000 ± 32,575 (média ± SEM) Unidades Arbitrárias de luz (A.U.), enquanto que o tratamento de um grupo de 12 hamsters com KRIX-1 (400-800 microgr/kg, administrados como um bolus imediatamente antes da indução de trombose) reduziu o tamanho médio do trombo para 122,000 ± 27,100 A.U. (p = 0,0188, teste de Mann-Whitney).

Adicionalmente, a cinética da inibição do factor VIII por KRIX-1 foi analisada ex-vivo como se segue: foram injectados hamsters intravenosamente com KRIX-1 (1 600 microgr/kg). Os níveis do factor VIII:c foram medidos num teste cromogénico (Coatest Factor vmR (Chromogenix AB, Mõlndal, Suécia), e Factor VIII Chromogenic Assay (Dade, Dudingen, Suíça)) utilizando plasma recolhido e a diferentes períodos de tempo após a injecção. A figura 12 mostra que nestes hamsters, a actividade do factor VIII é reduzida de 1,6 IU/mL para 0,3 IU/mL apenas 30 minutos após a injecção de anticorpo, confirmando assim que o KRIX-1 apenas inibe parcialmente o factor VIII. 61 ΡΕ1194528

LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS

<110> LEUVEN RESEARCH & DEVELOPMENT vzw Jacquemin, Marc G Saint-Remy, Jean-Marie R

PARA O

<120> LIGANDOS PARA UTILIZAÇÃO EM COMPOSIÇÕES TERAPÊUTICAS TRATAMENTO DE DISTÚRBIOS DA HEMOSTASE <130> K1564-PCT <140> <141> <150> GB9916450.1 <151>199-07-14 <150> US 60/143,891 <151> 1999-07-14 <160> 8 <170> Patentln Ver 2.1

< 210 > 1 <211> 143 <212 > PRT <213> anticorpo monoclonal humano <400> 1

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< 212 > DNA <213> anticorpo monoclonal humano < 2 2 0 >

<2 21> região_V <222> (1) .. (426) <220> <221> característica_misc <222> (7)..(162) <223> região determinante de complementaridade número um 65 ΡΕ1194528 <2 2 Ο > <221> característica_misc <222> (205)..(225) <223> reg ião determinante de complementaridade número dois < 2 2 0 > <221> característica_misc <222> (325) . . (351) <223> região determinante de complementaridade número três <400> 6 asggaaâíos tetetfceefce gsaattgcgt tgacgçagtc fcccs.ggcacc CtCtCçtÇC* gggccsçtta gagttttagc cGtggccagg· ctccc&fçfct «ctcatciat cetgaagatt ttgcagtgtâ tAacfcgt«ag cmgggas&e gactggag&t fcsaaggaaet ccatet ctgctactct ggctcececa tacoaccsggs 60 ctgtctttft ctceagggeíi aaça<jçc«Cc 120 ageaget&st tagcctggta te*gca«j&&« ISO (|gtg«*t<3«a ccaggçccec tggeato©©» 240 ejacttcacte tcacc*'tc4g cagaetggag 300 aagtatggta «gtoaç-egat cscet.«cgçg 3«o gtggctgcac catctgtstfc catcfetcscg 430 42:6 <210> 7 <211> 468 < 212 > D NA < 213 > anticorpo monoclonal humano <220> <221> região_V <222> (1)··(468) <220> <221> característica_misc <222> (124) .. (192) <223> região determinante de complementaridade número um <220> <221> característica_misc <222> (232)..(285) <223> região determinante de complementaridade número dois <220> <221> característica_misc <222> (282)..(435) <223> região determinante de complementaridade número três <400> 7 atggactgga cctggaggat cctcttcttg gtggcagcag cuacag^agc eca«tc©eag 60 gtgcaacfcgg tgcaatcfcgg ggctgeggtg aag»«gcctg ggecctcagt g««ggtetee 120 tgcaagasct ctggatacaa cttcaccggc tectctgsfct: ««.ggacatafc cttcaccgcc ISO tactctgtgc aetgçgttgcf acaqgccccfc ggacaagggc ttgagtgçat çggaaçgatc 240 aaccc«aaea gtggtgccac agectatfea eataaatt-te agggeagggt ©«ccatgteç SOO agggacacgt ccatcagcac agcctaeatg gaactgagea ggctgacatc tgacgacaeg 360 gceatgtatfc actgtçcgag *gecç«ea*c *atft«çgat;a ttgtgactgg ««atacttct 420 tíattacSttq actafrtgggíf ceqrgggaauc ctggtcaccg tfit.cctca 468 ΡΕ1194528 66 < 210 > 8 <211> 156 <212 > PRT <213> anticorpo monoclonal humano < 4 0 0 > 8

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Lisboa 22 de Maio de 2007

Claims (17)

1. ΡΕ1194528 1 REIVINDICAÇÕES 1. Linha celular designada KRIX 1 depositada na Colecções Coordenadas Belgas de Microrganismos, com o número de acesso LMBP 5089CB.
2. 2. Anticorpo monoclonal que se liga a um sitio do factor VIII ou de um complexo de dois ou mais factores envolvendo o factor VIII, caracterizado por o referido anticorpo monoclonal possuir a capacidade de inibir o factor VIII ou um complexo de dois ou mais factores envolvendo o factor VIII no máximo até 98% como determinado por um teste cromogénico ao factor VIII, quando o referido anticorpo monoclonal se encontra em excesso molar.
3. 3. Linha celular que produz anticorpos monoclo-nais humanos de acordo com a reivindicação 2.
4. 4. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 2, em que o sítio de ligação do anticorpo monoclonal não está directamente envolvido numa interacção fisiológica do referido factor ou complexo.
5. 5. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 2, que é o anticorpo Krix-I produzido pela linha celular designada KRIX 1 depositada na Belgian Coordinates Collections of Micro-organisms, com o número de acesso LMBP 5089CB ou um anticorpo possuindo pelo menos 80% de homologia de sequência com ele nas regiões CDR. 2 ΡΕ1194528
6. 6. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 2, sendo um anticorpo monoclonal humano que pode ser obtido a partir da linha celular da reivindicação 1.
7. 7. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 2, reivindicação 4 ou reivindicação 6, pertencendo à classe igG.
8. 8. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 2, ou quaisquer das reivindicações 4 a 7, com a capacidade de reconhecer um epitopo localizado no domínio G1 do factor VIII.
9. 9. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 2, 4, 7 ou 8, que pode ser obtido por imunização propositada em animais.
10. 10. Anticorpo monoclonal humanizado que pode ser obtido a partir do anticorpo monoclonal da reivindicação 9.
11. 11. Fragmento de ligação ao antigénio, tais como, um Fab, Fab' ou F(ab')2, uma região determinante de complementaridade, uma parte variável de cadeia única solúvel ou ancorada na membrana, um derivado ou domínio variável único de um anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 2 ou quaisquer das reivindicações 4 a 9 ou de um anticorpo monoclonal humanizado de acordo com a reivindicação 10, possuindo o referido fragmento de ligação 3 ΡΕ1194528 ao antigénio a capacidade de inactivar o factor VIII ou um complexo de dois ou mais factores envolvendo o factor viu até ao máximo de 98% como determinado por um teste cromogénico ao factor VIII, em que o referido fragmento se encontra em excesso molar.
12. 12. Composição farmacêutica para a prevenção ou tratamento de distúrbios da hemostase, distúrbios da coagulação, estados patológicos trombóticos ou redução da coagulação em mamíferos, compreendendo como um ingrediente activo um anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 2 ou quaisquer das reivindicações 4 a 9 ou um anticorpo monoclonal humanizado de acordo com a reivindicação 10 ou um fragmento de ligação ao antigénio de acordo com a reivindicação 11, misturado com um transportador farmaceu-ticamente aceitável.
13. 13. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 12, compreendendo adicionalmente uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente trombolítico.
14. 14. Polinucleótido que codifica para um fragmento de ligação ao antigénio Fab, Fab' ou F(ab')2 ou uma região determinante de complementaridade ou uma parte variável de cadeia única solúvel ou ancorada na membrana ou um domínio variável único ou um derivado de acordo com a reivindicação 11.
15. 15. Método para obtenção de anticorpos monoclo- 4 ΡΕ1194528 nais a partir de um mamífero não humano, compreendendo os passos : a) selecção de um mamífero não humano possuindo uma proteína modificada e parcialmente funcional, dizendo a modificação respeito a uma proteína de tipo selvagem da cascata de coagulação e estando localizada num domínio da proteína; b) administração da proteína de tipo selvagem ao mamí fero não humano de modo a desencadear uma resposta imune, e c) selecção de linfócitos B a partir do mamífero não humano que produzem anticorpos que inactivam apenas parcialmente a proteína de tipo selvagem.
16. 16. Anticorpo monoclonal isolado de acordo com a reivindicação 2, em que o referido anticorpo é produzido por linfócitos B humanos.
17. 17. Utilização do anticorpo monoclonal de quaisquer das reivindicações 2, 4 a 10 ou 16, ou do fragmento de ligação ao antigénio de acordo com a reivindicação 11, para a produção de um medicamento para a prevenção ou tratamento de um distúrbio da hemostase, distúrbio da coagulação ou estado trombótico patológico ou redução da coagulação num mamífero. 5 ΡΕ1194528 Lisboa, 22 de Maio de 2007