ES2283308T3 - Anticuerpo monoclonal para el factor viii, que incluso cuando esta presente en exceso molar inactiva el factor viii solo en parte y metodo para producir dicho anticuerpo. - Google Patents
Anticuerpo monoclonal para el factor viii, que incluso cuando esta presente en exceso molar inactiva el factor viii solo en parte y metodo para producir dicho anticuerpo. Download PDFInfo
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Abstract
Estirpe celular denominada KRIX 1 depositada en la Belgian Coordinated Collections of Microorganisms (¿Depósitos coordinados de microorganismos en Bélgica¿), con el número de entrada LMBP 5089CB.
Description
Anticuerpo monoclonal para el factor VIII, que
incluso cuando está presente en exceso molar inactiva el factor VIII
solo en parte y método para producir dicho anticuerpo.
La presente invención se refiere a nuevas
estirpes celulares y a ligandos, particularmente anticuerpos
monoclonales humanos y/o humanizados, así como a fragmentos tales
como Fab, Fab', F(ab')_{2}, scFv, dominios variables
simples, regiones que determinan la complementariedad, derivados,
homólogos y combinaciones de los mismos, que se pueden obtener a
partir de dichas estirpes celulares. Se refiere también a
composiciones farmacéuticas que comprenden dichos ligandos y a
métodos de prevención y de tratamiento de trastornos en la
coagulación y a los procesos patológicos trombóticos resultantes en
seres humanos mediante la administración de dichos ligandos a
pacientes que necesitan los mismos. Se refiere también a métodos de
obtención de anticuerpos específicos de mamíferos.
La formación de coágulos sanguíneos no
únicamente limita las hemorragias en el caso de las heridas
(hemostasis), sino que puede provocar daños orgánicos graves y la
muerte en el contexto de trastornos ateroescleróticos a causa de la
oclusión de una arteria o vena importante. La trombosis es, por lo
tanto, la formación de coágulos sanguíneos en el momento y en el
lugar inapropiado. Implica una sucesión de reacciones bioquímicas
complejas y reguladas que tienen lugar entre las proteínas de la
sangre en circulación (factores de coagulación), las células
sanguíneas (en particular los trombocitos) y los elementos de la
pared de un vaso lesionado.
Los tratamientos anticoagulantes y
antitrombóticos pretenden inhibir la formación de coágulos
sanguíneos a fin de evitar dichas consecuencias peligrosas, tales
como el infarto de miocardio, los accidentes cardiovasculares, la
pérdida de un miembro debido a una arteriopatía periférica o a una
embolia pulmonar. Debido a la importancia de dichas enfermedades,
resulta bastante sorprendente que los tratamientos antitrombóticos
se hayan basado en unos pocos fármacos desde hace varios años,
particularmente la aspirina para inhibir la actividad de los
trombocitos, la heparina, que inhibe indirectamente los factores de
coagulación IX, X y II (trombina), y la warfarina oral que inhibe
los factores que dependen de la vitamina K (VII, IX, X, II y la
proteína C). Más recientemente, las heparinas de bajo peso
molecular (factores de inhibición X y II en diversos grados) se han
convertido en anticoagulantes preferidos, principalmente debido a
su facilidad de aplicación (una inyección subcutánea diaria sin
necesidad de monitorización). A medida que aumentan los
conocimientos sobre los procesos implicados en la trombosis, se ha
desarrollado un número cada vez mayor de inhibidores específicos de
los factores de coagulación. Sin embargo, hasta la fecha no se ha
podido obtener con ellos una mayor proporción eficacia/seguridad.
Los inhibidores directos de la trombina, en particular, se han
relacionado con unos mayores trastornos hemorrágicos en ensayos
clínicos extensos.
La aspirina proporciona también un efecto
protector contra la trombosis. Provoca un defecto funcional
duradero en los trombocitos, detectable clínicamente como una
prolongación de la duración de la hemorragia, debido a la
inhibición de la actividad de la cicloxigenasa del enzima de los
trombocitos humanos prostaglandina H-sintasa
(PGHS-1) con dosis tan reducidas como de 30 a 75
mg. Debido a que los efectos secundarios gastrointestinales de la
aspirina se manifiestan como dependientes de la dosis, y en la
prevención secundaria, el tratamiento con aspirina se recomienda
para un período indefinido, existen razones prácticas para elegir
la menor dosis eficaz. Además, se ha especulado con el hecho de que
una dosis baja (30 mg diarios) resulta más antitrombótica pero los
intentos de identificación de la dosis óptima han producido unos
resultados contradictorios. Se ha afirmado que la dosis de aspirina
necesaria para inhibir completamente la agregación de trombóticos
puede resultar superior en los pacientes con un trastorno
cerebrovascular que en pacientes sanos y puede variar
periódicamente en el mismo paciente. Sin embargo, la aspirina en
cualquier dosificación de 30 mg o superior reduce el riesgo de
cualquier episodio vascular importante como máximo en un 20%, lo
que deja mucho lugar para mejorar.
Además, el papel inhibidor de la aspirina puede
conducir a la prevención de la trombosis y de las hemorragias
excesivas. El equilibrio entre los dos casos depende
fundamentalmente del riesgo absoluto de trombosis frente al de
hemorragia por parte del paciente.
En los pacientes que presentan un infarto de
miocardio agudo, la reducción del tamaño del infarto, la
conservación de las funciones ventriculares y la disminución de la
mortalidad se ha demostrado con diversos agentes trombolíticos. Sin
embargo, dichos agentes presentan unas limitaciones significativas,
comprendiendo la necesidad de unas dosificaciones terapéuticas
elevadas, una especificidad limitada de la fibrina y una tendencia
significativa relacionada con las hemorragias. El activador del
t-plasminógeno (t-PA) recombinante
restaura completamente la permeabilidad solamente en la mitad de
los pacientes, mientras que la estreptocinasa alcanza dicho
objetivo en una proporción inferior a un tercio. Además, se produce
la reoclusión tras el tratamiento trombolítico en un 5 a un 10% de
los casos durante la estancia hospitalaria y en hasta un 30%
durante el primer año según Verheugt et al., en J. Am.
Coll. Cardiol. (1996) 27: 618-627. Por lo
tanto, numerosos estudios han examinado los efectos de los
tratamientos auxiliares antitrombóticos en pacientes con infarto de
miocardio agudo. A título de ejemplo, la patente US nº 5.589.173 da
a conocer un métodos para disolver y evitar que se vuelvan a formar
trombos ocluyentes que comprende la administración de un
antagonista proteico de un factor tisular, que puede ser un
anticuerpo monoclonal o policlonal, además de un agente
trombolítico.
Se ha demostrado previamente que los anticuerpos
monoclonales resultan de valor terapéutico como agentes
antitrombóticos. El primer fármaco autorizado fue el Abciximab
(ReoPro^{TM}), un fragmento Fab humanizado de un anticuerpo
monoclonal murino (7E3) contra los receptores de la GP IIbIIIa de
los trombocitos. Los anticuerpos murinos presentan unas
características que pueden limitar enormemente su utilización en el
tratamiento de seres humanos. En el caso de las xenoproteínas,
pueden provocar la respuesta contra la inmunoglobulina mediante la
formación de anticuerpos antimurinos humanos (HAMA, por sus siglas
en inglés), tal como se describe en Jaffers et al.,
Transplantation (1986) 41:572. La necesidad de volver a
administrar en los tratamientos de tromboembolias incrementa la
probabilidad de dichas reacciones inmunitarias. A pesar de que la
utilización de anticuerpos monoclonales humanos contrarresta dicha
limitación, resulta difícil generar grandes cantidades de dichos
anticuerpos mediante técnicas convencionales de hibridomas.
Se han utilizado, por lo tanto, las técnicas de
recombinación para construir anticuerpos "humanizados" que
conserven la elevada afinidad de enlace de los anticuerpos
monoclonales murinos pero que presenten una inmunogenicidad
reducida en los seres humanos. En particular, se han propuesto
anticuerpos quiméricos en los que la región variable (V) de un
anticuerpo no humano se combina con la región constante (C) de un
anticuerpo humano. A título de ejemplo, el fragmento murino Fc se
eliminó del 7E3 y se sustituyó por la región constante Fab de la
inmunoglobulina G humana para formar la quimera conocida como c7 E3
Fab o abciximab. Los métodos de obtención de dichas
inmunoglobulinas quiméricas se describen en detalle en la patente
US nº 5.770.198.
La sinergia potencial entre la inhibición de los
GP IIb/IIIa mediante el anticuerpo monoclonal 7 E3 Fab y el
tratamiento trombolítico fue analizado por Kleiman et al.,
en J. Am. Coll. Cardiol. (1993) 22: 381-389.
Las hemorragias importantes resultaron frecuentes en dicho estudio.
Por lo tanto, las hemorragias potencialmente mortales constituyen
una cuestión principal en dicha combinación de potentes compuestos
antitrombóticos.
En un intento reciente de reducir la
inmunogenicidad de los anticuerpos murinos, se trasplantó a un
anticuerpo humano únicamente la región determinante de la
complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés), es decir,
regiones de hipervariabilidad de las regiones V, en vez del
dominio V entero. Dichos anticuerpos humanizados se conocen como
anticuerpos con la CDR injertada. Se construyó satisfactoriamente
uno de dichos anticuerpos con la CDR injertada contra el antígeno
relativamente simple del nitrofenilacetilo, sin embargo, la
construcción de anticuerpos con la CDR injertada que reconozcan
antígenos más complejos ha producido anticuerpos que presentan una
actividad de enlace significativamente inferior a los anticuerpos
naturales no humanos. En muchos casos se demostró que la simple
introducción de CDRs no humanas en un anticuerpo humano resulta
insuficiente para conservar totalmente la actividad de enlace. A
pesar de que se requiere un modelo informático elaborado de un
anticuerpo murino de interés a fin de identificar los aminoácidos
críticos a considerar en el diseño de un anticuerpo humanizado y se
han propuesto pautas teóricas para dicho diseño, en todos los casos
el procedimiento se ha de adaptar y optimizar para el anticuerpo
no humano particular de interés.
El factor tisular (TF, por sus siglas en
inglés), al ser una glucoproteína de membrana que actúa como
receptor de los factores VII y VIIa y, por lo tanto, iniciar dicha
vía extrínseca, se ha investigado como objetivo en los tratamientos
anticoagulantes. Además de dicho papel, se ha implicado el TF en
patologías tales como los trastornos vasculares o los choques
sépticos causados por gramnegativos. Un estudio que intentaba
caracterizar el potencial anticoagulante de los anticuerpos
monoclonales murinos demostró que la función del TF por parte de la
mayor parte de los anticuerpos monoclonales examinados dependía de
la disociación del complejo TF/VIIa que se forma rápidamente
cuando el TF entra en contacto con el plasma. Un anticuerpo
monoclonal, el TF8-5G9, pudo inhibir el complejo
TF/VIIa sin disociarlo, proporcionando de este modo un efecto
anticoagulante inmediato en el plasma, tal como se da a conocer en
el documento WO 96/40.921.
Los factores de coagulación seleccionados
presentan tanto una variación del peso molecular medio (comprendido
aproximadamente entre 45.000 y 160.000) y una concentración
plasmática normal relativamente elevada (por lo menos 0,01
micromol/l).
Un tema de interés persistente relativo a todos
los agentes antitrombóticos disponibles es el riesgo de sobredosis
y, por lo tanto, de hemorragias excesivas y potencialmente
mortales. La mayor parte de los agentes antitrombóticos actuales,
por lo tanto, implican la realización de un seguimiento minucioso
del paciente.
Por lo tanto, existe la necesidad de unos
compuestos eficaces en el tratamiento de los trastornos de
coagulación, con los que no se pueda producir una sobredosis, que
no requieran realizar un seguimiento minucioso del paciente y que
no presenten problemas con las hemorragias. En el caso de un
agente terapéutico basado en anticuerpos, el compuesto ideal sería
un anticuerpo humano con una eficacia total como anticoagulante que
no provoque inmunogenicidad.
El factor VIII es una proteína que proporciona
una importante actividad como cofactor y es uno de los factores de
la coagulación con un peso molecular bastante elevado (265.000) y
una concentración plasmática muy baja (0,0007 micromol/litro). Con
2.332 aminoácidos, el factor VIII constituye una de las cadenas
polipeptídicas más largas conocidas y se sintetiza en el hígado, en
el bazo y en la placenta. Se ha demostrado que su gen comprende
186.000 nucleótidos.
El factor VIII circula como una proteína
plasmática inactiva. Los factores V y VIII son proteínas homólogas
que comparten una configuración estructural común con unos dominios
A triplicados y unos dominios C duplicados, y unos dominios B
estructuralmente divergentes que conectan los dominios A2 y A3. El
factor VIII circula en una pluralidad de especies fragmentadas de
un complejo unidas fuertemente con el factor de Von Willebrand con
una concentración de 1 nmol/l. La activación del factor VIII se
produce mediante la separación de los dominios A1 y A2,
produciéndose la molécula inestable heterotrimérica factor VIIIa.
El factor VIIIa se enlaza fuertemente a las membranas que
comprenden fosfolípidos acídicos. El factor VIII comprende una
zona de enlace con fosfolípidos en el dominio C2, entre los
aminoácidos 2302 y 2332, según Arai et al. en J. Clin.
Invest. (1989) 83: 1978. En la misma región del factor VIII se
encuentra asimismo una zona de enlace con el factor Von Willebrand
que actúa junto con los aminoácidos 1645 a 1689 en el dominio A3
según Shima et al., en Throm. Haemost. (1993) 69: 240
y en J. Biol. Chem. (1994) 269: 11601.
Los anticuerpos policlonales que inhiben la
actividad como cofactor del factor VIII se han clasificado como
inhibidores del tipo I o del tipo II en función de su capacidad
para inhibir el factor VIII completamente (tipo I) o únicamente
parcialmente (tipo II). Según Gawryl et al., en Blood
(1982) 60: 1103-9, se considera la inactivación
reducida del factor VIII mediante anticuerpos humanos del tipo II
debido a un efecto estérico del factor Von Willebrand. No se
mencionan los anticuerpos monoclonales y, hasta la fecha, no se ha
hecho uso terapéutico alguno de dichos inhibidores del tipo II.
Biggs et al., en Br. J. Haematol. (1972) 23: 137,
proporcionaron previamente la interpretación, a partir de los datos
obtenidos al utilizar anticuerpos policlonales humanos, de que la
pauta de inhibición del tipo II se podría relacionar con una baja
afinidad. B. Ly et al., en Scandinavian Journal of
Haematology (1982), 28: 132-140 dan a conocer
anticuerpos policlonales contra el factor VIII que muy
frecuentemente pertenecen a la clase de las IgG tanto en
hemofílicos que desarrollan aloanticuerpos como en pacientes más
infrecuentes que presentan autoanticuerpos contra su propio factor
VIII. Dichos anticuerpos policlonales inhiben parcialmente la
actividad del factor VIII tal como los anticuerpos descritos en
Biggs et al. (1972) y en Hoyer et al. (1982). Dicho
documento de nuevo deja sin mencionar si los anticuerpos
monoclonales pueden reproducir la pauta de inactivación del factor
VIII que presentan los anticuerpos policlonales de los pacientes.
De nuevo, no se mencionan los anticuerpos
monoclonales.
monoclonales.
Las solicitudes de patente europea
EP-A-123.945,
EP-A-152.746 y
EP-A-432.134 todas descubren
anticuerpos monoclonales producidos a partir de estirpes celulares
de hibridomas y que presentan una pauta de reactividad específica
con fragmentos polipeptídicos del factor VIIIc. Se dice que dichos
anticuerpos monoclonales resultan útiles en la detección de la
presencia del factor VIIIc y polipéptidos relacionados en el plasma
mediante técnicas de inmunoanálisis, pero no se sugiere uso
terapéutico potencial alguno en dichos documentos.
J. Battle et al., en Annals of
Hematology (1997) 75: 111-115, da a conocer un
aloanticuerpo policlonal obtenido a partir de un paciente que
presentaba la enfermedad de Von Willebrand en un estado grave que
presenta, de un modo similar a un anticuerpo policlonal de conejo
contra el factor de Von Willebrand, una actividad inhibidora del
factor VIII plasmático. Dichos anticuerpos policlonales antifactor
VIII inhiben, por lo tanto, el factor VIII siguiendo una pauta
similar a los anticuerpos antifactor VIII del tipo II encontrados
en pacientes con hemofilia A (Gawryl et al., en Blood
(1982) 60: 1103-9). Sin embargo, en dicho
aloanticuerpo humano no se detectaron anticuerpos contra el factor
VIII, lo que sugiere que se trata de una inhibición no
específica.
J. Ingerslev et al., en Clínica
Chimica Acta (1988) 174: 65-82 da a conocer una
serie de anticuerpos monoclonales murinos contra el factor de Von
Willebrand humano: dos de los mismos, que pertenecen al isotipo de
la inmunoglobulina IgG1, presentan una inhibición extremadamente
baja (1,3 BU/mg de inmunoglobulina) del factor VIII tal como se
ilustra en la tabla I de dicho documento. En comparación, el
anticuerpo monoclonal humano BO2C11, obtenido del paciente de
hemofilia A con el inhibidor, presenta una actividad específica de
7.000 BU/mg de proteína (Jacquemin et al., en Blood,
(1998) 92: 496-506). Ello indica que la
administración de anticuerpos tal como describió Ingerslev a un
animal o a un ser humano no afecta a la actividad del factor VIII,
excepto en el caso de que se encuentre presente una cantidad
extremadamente elevada de anticuerpos (cientos de mg/mi) en el
plasma. Los autores no dan a conocer si cuando se utilizan dichos
anticuerpos en una gran cantidad presentan una actividad inhibidora
como el inhibidor policlonal del factor VIII humano del tipo I o
del tipo II (es decir, inactivación parcial), tal como se describe
en Gawryl et al., en Blood (1982) 60:
1103-9.
Maraganore et al., en Circulation
(1992) 86: 413, demostró que un péptido artificial de 12
aminoácidos, que corresponde a los residuos 1675 a 1686 del factor
VIII, inhibe la separación por parte de la trombina de la cadena
pesada requerida en la activación de la actividad procoagulante del
factor VIII y asimismo de la cadena ligera requerida para disociar
el factor VIII del factor de Von Willebrand y que la sulfatación de
la tirosina de dicho péptido su reconocimiento por parte del factor
VIII.
J. Clin. Invest. (1988) 82:
206-211 describe la obtención de un modelo animal
para la hemofilia A mediante la venoclisis del anticuerpo
antifactor VIII humano en conejos. Según el documento WO 95/01570,
los anticuerpos contra la cadena ligera del factor VIIIc humano o
porcino se produjeron en un primer animal y posteriormente se
provocó una hemofilia temporal en un segundo animal mediante el
anticuerpo monoespecífico obtenido. La patente US nº 5.804.159 da
a conocer también la provocación de un trastorno temporal en la
coagulación en un mamífero mediante la preparación de un anticuerpo
antiplasma que actúa contra varios factores de coagulación, por
ejemplo, una preparación que comprende anticuerpos contra el
factor de Von Willebrand y el factor VIII humanos, o contra el
complejo factor VIII/Von Willebrand, o contra procoagulantes,
anticoagulantes, factores que intervienen en la estructura del
coágulo, factores fibrinolíticos, y fosfolípidos.
Sin embargo, ninguno de los compuestos de
anticuerpos mencionados anteriormente que implica el factor VIII se
ha descrito con un objetivo terapéutico. De hecho existe un cierto
prejuicio entre los expertos en la materia contra la investigación
de los anticuerpos antifactor VIII en los tratamientos
antitrombóticos debido a que se presupone que, debido a que una
deficiencia en el factor VIII constituye la causa de la hemofilia
A, dichos anticuerpos podrían provocar una situación de
hemorragia.
El documento WO 97/26010 da a conocer unos
anticuerpos monoclonales que presentan una actividad neutralizante
autolimitadora contra un factor de coagulación que resulta útil en
composiciones farmacéuticas para trastornos trombóticos. La
actividad neutralizante autolimitadora en dicho documento se define
como la actividad de un anticuerpo que se enlaza con un factor de
coagulación humano y que inhibe la trombosis de tal modo que se
produce una modulación limitada de la coagulación. La modulación
limitada de la coagulación a su vez se define como un incremento en
el período de coagulación determinado como la prolongación de la
duración de la tromboplastina parcial activada (aPTT, por sus sigas
en inglés) durante la que el plasma continúa siendo coagulable con
la aPTT alcanzando un valor máximo, preferentemente comprendido
entre 35 y 100 segundos a pesar de las concentraciones crecientes
del anticuerpo monoclonal. Por lo tanto, la aPTT se utiliza como
criterio primario en el estudio de la eficacia en relación con el
inconveniente de las hemorragias de los agentes
antitrombóticos.
Más particularmente, dicho documento demuestra
que un policlonal de oveja contra el factor VIII
(SAF8C-IG, adquirido en Affinity Biologicals)
provoca una prolongación autolimitadora de la aPTT (la aPTT
aumentó hasta un máximo aproximadamente de 65 segundos). Hemos
demostrado, sin embargo, que el SAF8C-IG inhibe
completamente la actividad del factor VIII humano (véase la Figura
10), es decir, es un inhibidor del tipo I en la clasificación de
Gawryl et al., en Blood (1982) 60:
1103-9. Ello demuestra que un incremento limitado
en el período de coagulación hasta un determinado valor máximo no
se encuentra necesariamente correlacionado con la inactivación
parcial de un factor de coagulación, y aún menos con un descenso
del riesgo de hemorragia. Por ejemplo, resulta muy conocido que los
pacientes con un déficit completo de factores de coagulación
presentan una prolongación limitada de la aPTT, habitualmente
comprendida entre 60 y 100 segundos, pero no obstante se exponen a
un riesgo considerable de hemorragia (Hathaway
et al., en Am. J. Clin. Pathol. (1979) 71: 22-25, y Hoffmann et al., en Thromb. Haemostas. (1978) 39: 640-645).
et al., en Am. J. Clin. Pathol. (1979) 71: 22-25, y Hoffmann et al., en Thromb. Haemostas. (1978) 39: 640-645).
Por el contrario, resulta muy conocido que una
aPTT prolongada no proporciona un parámetro válido de la reducción
del riesgo de trombosis. Particularmente, la deficiencia en el
factor XII, otro factor de coagulación de las rutas de coagulación
intrínsecas produce una prolongación de la aPTT de hasta 6 veces
(Hathaway et al., en Am. J. Clin. Pathol. (1979) 71:
22-25, y Hoffmann et al., en Thromb.
Haemostas. (1978) 39: 640-645). Sin embargo, un
número significativo de pacientes que presentan dicha deficiencia
ha sufrido infartos de miocardio o tromboembolias, demostrando la
falta de protección ante los trastornos trombóticos en los
pacientes deficientes en el factor XII, a pesar de la prolongación
importante de la aPTT (McPherson R. A., Am. J. Clin. Pathol.
(1977) 68: 420, y Glueck H. I. et al., en Ann. Intern.
Med. (1966) 64:390).
Jacquemin et al., en Blood (1998)
92: 496-506 se refieren al anticuerpo monoclonal
humano IgG4 específico del factor VIII (BO2C11) producido por una
estirpe celular obtenida a partir del repertorio de linfocitos B de
memoria de un paciente con hemofilia A con inhibidores. Se supone
que el BO2C11 reconoce el dominio C2 del factor VIII y que inhibe su
enlace tanto con el factor de Von Willebrand como con los
fosfolípidos. Se supone que inhibe completamente la actividad
procoagulante del factor VIII natural y activado con una actividad
de 7000 unidades Bethesda/mg. Los presentes inventores han
demostrado, además, que el BO2C11, a pesar de que inhibe
totalmente la actividad del factor VIII humano, proporciona una
prolongación aproximadamente de 110 segundos del período de
coagulación tal como se determina mediante la aPTT, lo que
demuestra de nuevo que un incremento en el período de coagulación
hasta un cierto valor máximo no se encuentra necesariamente
correlacionado con la inactivación parcial de un factor de
coagulación. Dicha reducción de los niveles del factor VIII
expondrá el paciente a unos riesgos graves de hemorragia, tal como
en el caso de los pacientes con hemofilia A grave (Levine P. H., en
Ann. NY Acad. Sci. (1975) 240: 201; Gilbert M. S. Mount
Sinaí J. Med. (1977) 44: 339).
La presente invención se refiere a nuevos
ligandos, particularmente nuevos anticuerpos monoclonales humanos o
humanizados, a fragmentos, derivados y homólogos de los mismos tal
como se especifica en las reivindicaciones adjuntas, que se
enlazan con el factor VIII o un complejo del mismo; a una nueva
estirpe celular a partir de la que se pueden obtener dichos
anticuerpos monoclonales; y a nuevas composiciones farmacéuticas
que comprenden dichos ligandos.
El objetivo principal de la presente descripción
es, por lo tanto, proporcionar un tratamiento antitrombótico
eficaz y seguro que reduzca el riesgo de hemorragia en los
mamíferos, más particularmente en los seres humanos.
Otro objetivo adicional de la presente invención
es proporcionar unas composiciones terapéuticas que proporcionen
un tratamiento antitrombótico eficaz que reduzca el riesgo de
hemorragia en los mamíferos, más particularmente en los seres
humanos.
Otro objetivo adicional de la presente
descripción es proporcionar un tratamiento antitrombótico y unos
compuestos terapéuticos antitrombóticos que resulten más seguros de
utilizar que los tratamientos y composiciones conocidos
previamente.
Un aspecto de la presente invención se refiere a
seleccionar el factor VIII o un complejo del mismo, utilizando
ligandos específicos. Dichos ligandos, al ser anticuerpos
monoclonales, proporcionan una concentración estable
terapéuticamente útil al inhibir únicamente parcialmente la función
del factor seleccionado de modo que permanece una actividad
residual del factor incluso cuando se utiliza el ligando en un
excedente molar. Se puede realizar una curva del efecto inhibidor
de un ligando según la presente invención con respecto a un
determinado factor seleccionado en relación con la concentración
de dicho ligando y se puede determinar la concentración en la que
todavía existe una mínima actividad residual del factor que es por
lo menos del 1%, preferentemente por lo menos del 2%. La actividad
residual del factor a una concentración de cinco veces dicha
concentración no ha de resultar sustancialmente distinta de la
actividad residual en el punto mínimo. La presente invención
proporciona anticuerpos monoclonales de alta afinidad, tanto
humanos como humanizados, así como fragmentos, derivados y
homólogos de cualquiera de los mismos, que presentan la capacidad
de inactivar únicamente parcialmente el factor VIII o un complejo
del mismo, incluso con un excedente molar del ligando, evitando,
por lo tanto, el riesgo de sobredosis y las complicaciones
hemorrágicas resultantes. Otro aspecto adicional de la presente
invención es proporcionar una nueva estirpe celular que produzca el
anticuerpo monoclonal humano respectivo.
La presente invención comprende también
secuencias de polinucleótidos que codifican los anticuerpos
mencionados anteriormente o fragmentos de los mismos. Se podrá
apreciar que existe una pluralidad de secuencias de nucleótidos que
caen dentro del alcance de la presente invención como resultado de
la redundancia del código genético. La presente invención comprende
también secuencias complementarias que corresponden a anticuerpos
monoclonales, o fragmentos de los mismos, mencionados
anteriormente. En particular, la presente descripción comprende
sondas construidas a partir de anticuerpos monoclonales, o
fragmentos de los mismos, mencionados anteriormente o a partir de
polinucleótidos o a partir de las secuencias complementarias
mencionadas anteriormente
La presente descripción proporciona, además, un
métodos de atenuación de la coagulación en seres humanos, que
comprende la administración de un anticuerpo monoclonal, tanto
humano como humanizado, un fragmento, un derivado o un homólogo del
mismo, que puede inactivar únicamente parcialmente el factor VIII
o un complejo del mismo en un paciente que necesita dicha
atenuación incluso cuando dicho ligando se encuentra en un
excedente molar. Da a conocer, además, un métodos de tratamiento o
prevención de una patología trombótica en mamíferos,
particularmente en seres humanos, que comprende la administración
de una cantidad terapéuticamente eficaz de un ligando,
particularmente un anticuerpo monoclonal, tanto humano como
humanizado, un fragmento, un derivado o un homólogo del mismo, que
puede inactivar únicamente parcialmente, incluso cuando dicho
ligando se encuentra en un excedente molar, el factor VIII o un
complejo que comprende el factor VIII, a un mamífero que necesita
dicho tratamiento o prevención. En una forma de realización
preferida, la patología trombótica se puede seleccionar, por
ejemplo, de entre la coagulación intravascular, la trombosis
arterial, la reestenosis arterial, la trombosis venosa y la
arterioesclerosis.
Otra forma de realización de la presente
invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende
un anticuerpo monoclonal, que presenta la capacidad de enlazarse a
una zona del factor VIII o de un complejo que comprende el factor
VIII, para inactivar únicamente parcialmente dicho factor o
complejo que comprende el factor incluso cuando el ligando se
encuentra en un excedente molar, mezclado con un excipiente
farmacéuticamente aceptable. Dicho ligando es un anticuerpo
monoclonal de alta afinidad contra el factor VIII o contra el
complejo factor VIII - factor de Von Willebrand, tanto humano como
humanizado, o híbrido, o un fragmento, derivado u homólogo del
mismo. La composición farmacéutica de la presente invención puede
comprender opcionalmente, además, una cantidad terapéuticamente
eficaz de un agente trombolítico.
Otra forma de realización de la presente
invención se refiere a métodos de selección de anticuerpos
monoclonales específicos. Las técnicas convencionales de
inmunización de animales tales como un ratón con una proteína tal
como el factor VIII provocan una respuesta inmunitaria que puede
implicar a diversos epítopos de la molécula del factor VIII. La
presente invención proporciona unos métodos más selectivos de
obtención de anticuerpos monoclonales específicos contra un epítopo
de una proteína natural. En primer lugar, se proporciona (es decir,
se selecciona) un mamífero no humano que presenta una versión
funcional modificada por lo menos parcialmente de una proteína
natural. Dicha modificación, que se encuentra en un dominio de la
proteína, se puede deber a cualquier causa, por ejemplo raza o
variedad, a defectos genéticos al nacer, a una enfermedad o por una
interferencia humana, por ejemplo inmunotolerancia contra la
versión funcionalmente modificada. A continuación se administra la
proteína natural al donante mamífero no humano a fin de provocar
una respuesta inmunitaria; en la presente etapa, resulta importante
que se administre una cantidad suficiente de proteína natural (por
ejemplo el factor VIII) hasta que se produce una respuesta
inmunitaria. A continuación, en una etapa final del método, la
selección de los linfocitos V del donante mamífero no humano
permitirá mayores posibilidades de obtener anticuerpos
monoclonales contra un epítopo de la región de la modificación, por
ejemplo al seleccionar linfocitos B del donante que produzcan
anticuerpos que inactiven la proteína natural únicamente
parcialmente.
El potencial anticoagulante del factor de
inhibición VIII no se ha explorado hasta la fecha, posiblemente
debido a las complicaciones muy conocidas que se producen en los
pacientes de hemofilia A que carecen de la actividad del factor
VIII completamente (hemofilia grave) o en gran parte (hemofilia
moderada). La hemofilia A, sin embargo, no demuestra únicamente la
importancia del factor VIII como cofactor limitante de la
coagulación, sino también la relación existente entre la
coagulación y el desarrollo de la aterosclerosis. Se descubrió que
la aterosclerosis y sus complicaciones trombóticas resultaban
significativamente más inusuales entre los pacientes con hemofilia
A. El antagonizar la actividad del factor VIII en un nivel que
permita una hemostasis suficiente como para evitar las hemorragia
pero que proteja ante la formación de trombos intravasculares
patológicos, por lo tanto constituye una promesa sustancial en
relación con una anticoagulación segura en trastornos
protrombóticos tales como la trombosis venosa profunda (DVT, por
sus siglas en inglés), la embolia pulmonar (PE, por sus siglas en
inglés), en tratamiento postoperatorios, en el embarazo, en
arteriopatías coronarias (CAD, por sus siglas en inglés),
enfermedades cerebrovasculares (CVD, por sus siglas en inglés),
arteriopatías periféricas (PAD, por sus siglas en inglés) y en
intervenciones vasculares.
La presente invención se basa en la sorprendente
determinación de nuevos ligandos, particularmente nuevos
anticuerpos monoclonales humanos y humanizados, y fragmentos,
derivados y homólogos de los mismos tal como se especifica en las
reivindicaciones adjuntas. Ellos presentan un inesperado "efecto
meseta", es decir, se alcanza únicamente una inactivación
parcial del factor VIII implicado en la hemostasis, en particular
en la cascada de coagulación, tanto individualmente como en
combinación, cualquiera que sea el excedente de ligando. Los
ligandos se pueden enlazar con el factor VIII o con un complejo del
factor VIII incapacitando únicamente parcialmente la función de una
zona fisiológicamente funcional de dicho factor o complejo del
factor. Dicho "efecto estable" hace que los ligandos resulten
particularmente adecuados en el tratamiento de los trastornos de
coagulación y las patologías trombóticas resultantes al mismo
tiempo que se minimiza el riesgo de hemorragia, en comparación,
particularmente, con los anticuerpos con una actividad
neutralizante autolimitadora mencionados en el documento WO
97/26010. Se produce, por lo tanto, un claro contraste entre la
actividad neutralizante autolimitadora de los anticuerpos contra
los factores dé coagulación descritos en el documento WO 97/26010 y
la inhibición estable clínicamente significativa que comprende la
presente invención, en la que los anticuerpos antifactor VIII, tal
como el KRIX-1, inhiben la actividad del factor
VIII en no más del 85%.
Resulta particularmente útil una propiedad de
los ligandos según la presente invención para permitir alguna
función fisiológica de la región afectada incluso cuando el ligando
se encuentra en un excedente molar. Los ligandos son anticuerpos
antifactor VIII o anticuerpos contra un complejo del factor VIII,
en particular anticuerpos monoclonales humanos o híbridos humanos
que se enlazan con el factor VIII o con un complejo del factor VIII
e inhiben por lo menos parcialmente la actividad del factor VIII.
Los datos indican que los inhibidores del tipo II reaccionan con
unos determinantes antigénicos distintos que los anticuerpos del
tipo I y que dichos determinantes se bloquean parcialmente en el
complejo factor VIII/factor de Von Willebrand.
A continuación se describirá la presente
invención más detalladamente haciendo referencia a los siguientes
dibujos. La presente invención se define mediante las
reivindicaciones adjuntas.
La Figura 1 presenta los resultados de producir
anticuerpos monoclonales humanos obtenidos a partir de un paciente
de hemofilia A, expresados en forma de anticuerpo IgG enlazándose
con el factor VIII en una prueba ELISA.
La Figura 2 ilustra la inhibición de la
actividad del factor VIII mediante el anticuerpo monoclonal
BO2C11.
La Figura 3 ilustra la inhibición de la
actividad del factor VIII mediante el anticuerpo monoclonal
producido por la estirpe celular KRIX 1.
La Figura 4 ilustra la inhibición del enlace del
factor VIII activado en la
fosfatidil-L-serina mediante el
anticuerpo producido por la estirpe celular KRIX 1.
La Figura 5 ilustra la influencia de
determinados anticuerpos policlonales en la disociación del factor
VIII activado del factor de Von Willebrand.
Las Figuras 6 y 8 ilustran las secuencias de
aminoácidos (las líneas inferiores) y las secuencias de nucleótidos
(las líneas superiores) de las regiones variables V_{H} de las
cadenas pesadas de los anticuerpos monoclonales BO2C11 y KRIX 1,
respectivamente. Se ilustran también tres regiones determinantes de
la complementariedad (CDR) de cada cadena, cada una de ellas siendo
un ligando polipeptídico individual según una forma de realización
particular de la presente invención.
Las Figuras 7 y 9 ilustran las secuencias de
aminoácidos (las líneas inferiores) y las secuencias de nucleótidos
(la líneas superiores) de las regiones variables V_{L} de las
cadenas ligeras de los anticuerpos monoclonales BO2C11 y KRIX 1,
respectivamente. Se ilustran también tres CDR de cada cadena, cada
una dé ellas siendo un ligando polipeptídico individual según una
forma de realización particular de la presente invención.
La Figura 10 presenta un gráfico que ilustra la
inhibición de la actividad del factor VIII mediante el anticuerpo
SAF8C-Ig mencionado en el documento WO
97/26010.
La Figura 11 ilustra la cinética de la
inhibición del factor VIII mediante el KRIX-1.
La Figura 12 ilustra la inhibición de la
trombosis venosa en un modelo con hámsteres mediante el
KRIX-1.
El termino "anticuerpo" se refiere a
moléculas intactas así como a fragmentos de las mismas, tales como
Fab, Fab', F(ab')_{2}, o Fv, que se pueden enlazar con un
epítopo determinante de un factor relevante o dominio del
factor.
"Anticuerpo humanizado", tal como se
utiliza en la presente memoria, se refiere a moléculas de
anticuerpos en las que se han sustituido los aminoácidos de las
regiones no antigénicas de enlace a fin de que se parezca mucho a
un anticuerpo humano.
Un "anticuerpo humano rediseñado" o un
"anticuerpo híbrido humano", tal como se utiliza en la presente
memoria, se refiere a un anticuerpo humano en el que se han
sustituido los aminoácidos de las regiones antigénicas de enlace
con secuencias según la presente invención, por ejemplo con CDR u
otras partes de regiones variables que se han obtenido del
repertorio de anticuerpos humanos.
El término "homología" u "homólogo",
tal como se utiliza en la presente memoria haciendo referencia a
ligandos según la presente invención se refiere a una molécula que
competirá con o inhibirá el enlace de uno de los ligandos según la
presente invención con la región seleccionada. El enlace ha de ser
específico, es decir, el enlace de la molécula alternativa ha de
ser tan específico con la región como el ligando según la presente
invención. Allí donde los ligandos según la presente invención
comprenden secuencias de aminoácidos, el grado de homología ha de
ser por lo menos del 80%, preferentemente del 90% y más
preferentemente del 95% de identidad de la secuencia de aminoácidos
con el ligando relevante.
A continuación se describirá la presente
invención haciendo referencia a determinadas formas de realización
y a determinadas figuras pero la presente invención no se encuentra
limitada por las mismas sino únicamente por las reivindicaciones.
La presente memoria describe el concepto general de la obtención
de una "inhibición estable" terapéuticamente útil al inactivar
únicamente parcialmente un factor en hemostasis mediante la
selección de determinados anticuerpos monoclonales, así como
mediante la producción de dichos anticuerpos monoclonales humanos o
humanizados, o fragmentos, derivados u homólogos de los mismos, y
utilizar los mismos en tratamientos antitrombóticos y en
composiciones para tratamientos antitrombóticos. Dichos ligandos y
composiciones presentan la propiedad ventajosa de que la
inactivación del factor es únicamente parcial incluso cuando el
ligando se encuentra en un excedente molar. Ello significa que
incluso cuando se utilice el ligando en una cantidad de la que se
espera que inactive completamente el factor seleccionado, la
inactivación resulta todavía incompleta.
La presente invención proporciona una estirpe
celular particular que produce anticuerpos monoclonales humanos que
reaccionan con el factor VIII humano y más específicamente
presentan la capacidad de inactivas la actividad como cofactor del
factor VIII humano al interferir con la región de escisión
proteolítica o del factor de Von Willebrand o realizar reacciones
complejas o al provocar cambios conformacionales tridimensionales
en el factor VIII, en particular seleccionando un dominio del
factor VIII y reconociendo epítopos que se encuentran en dicho
dominio. Un dominio preferido es el dominio C1 del factor VIII pero
la presente invención no se limita al mismo. Se puede inhibir
parcialmente asimismo una región del dominio C2 del factor VIII.
La presente invención comprende también ligandos distintos a los
anticuerpos policlonales, en particular anticuerpos monoclonales,
que reducen el ritmo de separación del factor VIII del factor de
Von Willebrand. Dichos anticuerpos monoclonales seleccionan
específicamente el factor VIII cuando se enlazan con el factor de
Von Willebrand y, por lo tanto, seleccionan un epítopo asociado al
complejo del factor VIII y el factor de Von Willebrand. La
presente invención proporciona también fragmentos de cualquiera de
los anticuerpos monoclonales anteriores tales como Fab, Fab',
F(ab')_{2}, scFv, CDR, dominios variables simples así como
derivados, homólogos y combinaciones de los mismos. Más
particularmente, dichos anticuerpos monoclonales y fragmentos
pueden seleccionar un dominio del factor VIII, en particular el
dominio C1 del factor VIII. Asimismo, pueden inhibir parcialmente
una región del dominio C2 del factor VIII. Pueden seleccionar
también un epítopo asociado al complejo del factor de Von
Willebrand y el factor VIII. Un aspecto de la presente descripción
es, por lo tanto, proporcionar ligandos distintos de los
anticuerpos policlonales que se enlazan a una primera región (por
ejemplo en el dominio C1 del factor VIII) alejada de una segunda
región funcional (por ejemplo la región del dominio C2 del factor
VIII responsable del enlace con los fosfolípidos) de modo que la
función de la segunda región se ve únicamente reducida parcialmente
incluso cuando el ligando se encuentra en un excedente molar
y
terapéutico.
terapéutico.
La estirpe celular denominada KRIX 1 que produce
los anticuerpos monoclonales según la presente invención se
depositó en la BCCM/LMBP (Belgian Coordinated Collections of
Microorganisms/Plasmid Collection Laboratorium voor Moleculaire
Biologie, University of Ghent ["Depósitos coordinados de
microorganismos en Bélgica/Laboratorio de depósito de plásmidos de
Biología Molecular, Universidad de Ghent"] K. L. Ledeganckstraat
35, B-9000 Ghent, BE con el número de entrada LMBP
5089CB el 1 de julio de 1999.
La presente descripción proporciona, además,
unas estirpes celulares que producen anticuerpos monoclonales que
presentan una reactividad sustancialmente similar a la de los
anticuerpos monoclonales obtenidos a partir de la estirpe celular
depositada mencionada anteriormente, así como los anticuerpos
monoclonales humanos que se pueden obtener a partir de dichas
estirpes celulares adicionales.
La presente invención proporciona, además,
anticuerpos monoclonales humanos rediseñados o anticuerpos
monoclonales híbridos humanos contra el factor VIII, que se enlazan
con e inactivan únicamente parcialmente el factor VIII o un
complejo que comprende el factor VIII y el factor de Von Willebrand
que comprende únicamente elementos obtenidos del repertorio de
anticuerpos humanos. Por anticuerpos monoclonales híbridos humanos
se entiende un anticuerpo híbrido construido a partir de un
anticuerpo humano y a partir de regiones variables según la
presente invención. Tradicionalmente en la técnica, hasta la fecha
únicamente ha resultado posible obtener anticuerpos contra el factor
VIII obtenidos a partir de animales, por ejemplo ratones, o
construir anticuerpos quiméricos a partir de anticuerpos humanos
con partes variables obtenidas a partir de anticuerpos murinos.
La presente memoria proporciona también
ligandos, distintos de los anticuerpos policlonales, que presentan
la capacidad de inactivar únicamente parcialmente un factor (o un
complejo que comprende un factor) implicado en la hemostasis, en
particular en la cascada de la coagulación sanguínea,
preferentemente el factor VIII o un complejo que comprende el
factor VIII, al enlazarse a una región de dicho factor o complejo,
teniendo lugar dicha inactivación únicamente parcial cuando el
ligando de la presente invención se encuentra en un excedente
molar con respecto a dicho factor. La región a la que se enlaza el
ligando puede encontrarse o no implicada directamente o
sustancialmente en una interacción fisiológica de dicho factor o
complejo. Por ejemplo, el ligando se puede enlazar con una región
que se encuentra a una distancia predeterminada de una región
fisiológicamente funcional de dicho factor. Por inactivación
"estable" parcial en la presente memoria se entiende una
inactivación como máximo del 98%, preferentemente una inactivación
como máximo del 95%, tal como se puede determinar mediante un
método de ensayo adecuado tal como por ejemplo un ensayo
cromogénico disponible en Coatest® (Kabi Vitrum, Bruselas, Bélgica)
o en Chromogenix AB, Mólndal (Suecia). El nivel de activación
requerido puede depender de la función fisiológica del factor
implicado en la hemostasis. Por otro lado, a fin de proporcionar
una utilidad terapéutica, la inactivación del factor sanguíneo ha
de ser por lo menos aproximadamente del 65%, preferentemente por lo
menos aproximadamente del 70%, tal como se puede determinar
mediante el mismo método de ensayo comentado anteriormente. Se
puede apreciar que los ligandos según la presente invención actúan
de un modo distinto del mecanismo atribuido convencionalmente a los
anticuerpos del tipo II contra el factor VIII,. Un mecanismo
convencional es el de competencia con otro factor, por ejemplo el
factor de Von Willebrand. La cinética de un mecanismo de
competencia significa que si una especie se encuentra en una
concentración elevada en comparación con la otra (por ejemplo en un
excedente molar), la inhibición es de hecho completa. En cambio,
los ligandos de la presente invención alcanzan un nivel estable en
la inactivación del factor relevante, que es sustancialmente
independiente del excedente del ligando. El otro mecanismo
convencional atribuido a los anticuerpos del tipo II es el de la
baja afinidad: también en dicho caso, un excedente conducirá la
reacción a una inhibición completa.
Cuando el factor sanguíneo seleccionado es el
factor VIII, lo ligandos de la presente invención pueden ser
anticuerpos monoclonales humanos que se pueden obtener de la
estirpe celular KRIX 1 depositada, siendo preferentemente de la
clase IgG, y que presentan la capacidad de inactivar únicamente
parcialmente la actividad como cofactor del factor VIII. Más
específicamente la presente memoria se refiere, en una forma de
realización preferida, a anticuerpos monoclonales humanos de dicho
origen que pueden reconocer epítopos que se encuentran en el
dominio C1 del factor VIII. A pesar de que los inventores no desean
limitarse a una explicación o teoría simple, se cree que el enlace
de dichos anticuerpos monoclonales humanos obstaculiza únicamente
parcialmente el enlace del factor VIII activado con los
fosfolípidos, una etapa necesaria para la expresión de la actividad
como cofactor.
La presente memoria proporciona, además, unos
anticuerpos que presentan sustancialmente las mismas
características descritas anteriormente y que se producen mediante
la inmunización realizada a propósito en animales, preferentemente
en ratones, por ejemplo inyectando el factor VIII humano en
ratones y a continuación fusionando los linfocitos esplénicos con
una estirpe celular de mieloma murino, seguido por la
identificación y la clonación de los cultivos celulares que
producen anticuerpos antifactor VIII. A continuación se humanizan
los anticuerpos monoclonales producidos en animales, por ejemplo
al asociar la región determinante de la complementariedad
("CDR") del anticuerpo monoclonal no humano con regiones
estructurales humanas - en particular la región C constante del gen
humano - tal como describen Jones et al., en Nature
(1986) 321: 522 o Riechmann en Nature (1988) 332: 323.
La presente invención proporciona también
fragmentos y derivados, en particular regiones determinantes de la
complementariedad ("CDR") de los anteriores anticuerpos
monoclonales antifactor VIII así como homólogos de los mismos. Por
ejemplo, la presente invención proporciona fragmentos de enlace
con antígenos Fab, Fab' y F(ab')_{2} generados mediante la
digestión proteolítica de dichos anticuerpos monoclonales
utilizando procedimientos muy conocidos en la técnica, tales como
los que describen Stanworth et al., en Handbook of
Experimental Immunology ("Manual de inmunología
experimental") (1978), vol. 1 capítulo 8 (Blackwell Scientific
Publications). Dichos fragmentos, que comprenden la zona de enlace
del anticuerpo, han perdido un cierto número de propiedades del
anticuerpo original, tales como la activación del complemento o la
capacidad de enlazarse con receptores gamma Fc. La presente
invención comprende asimismo fragmentos variables de cadena simple
(scFv, por sus siglas en inglés), fragmentos de dominios variables
simple de los anticuerpos y combinaciones de dichos fragmentos y
los fragmentos mencionados anteriormente.
La presente invención proporciona asimismo
partes variables de cadena simple solubles o fijadas a la membrana
de los anteriores anticuerpos monoclonales y un método para su
obtención tal como sigue. Las secuencias de ADN de las partes
variables de las cadenas humanas pesada y ligera se amplifican en
reacciones separadas y se clonan. Una secuencia conectora de quince
aminoácidos, por ejemplo (Gly_{4}ser)3 se introduce entre
VH y VL mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por
sus siglas en inglés) de dos etapas, por ejemplo según Dieffenbach
y Dveksler, "PCR Primer, a laboratory manual" ("Iniciadores
de la PCR, manual de laboratorio") (1995), Cold Spring Harbour
Press, Plainview, NY, EE.UU. El fragmento resultante se introduce
a continuación en un vector adecuado para la expresión de un
fragmento variable de cadena simple (scFv) como un polipéptido
soluble o expuesto en fagos. Ello se puede conseguir mediante
métodos muy conocidos por los expertos en la materia, tal como
describen Gillilánd et al., en Tissue Antigens
("Antígenos tisulares") (1996) 47: 1-20. La
presente invención comprende también un ligando que comprende
péptidos representativos de regiones hipervariables de un
anticuerpo monoclonal que se puede obtener por síntesis utilizando
un biosistema sintetizador aplicado, por ejemplo un sintetizador de
polipéptidos tal como el modelo 9050 disponible en Milligen (EE.
UU.) o un modelo de una tecnología relacionada, que solo o junto
con otras o similares regiones hipervariables ejercerá unas
propiedades similares a las del anticuerpo
original.
original.
La presente descripción proporciona, además, una
composición farmacéutica para la prevención o el tratamiento de
trastornos de la hemostasis, en particular de la cascada de la
coagulación y las patologías trombóticas resultantes en los seres
humanos, que comprenden, como principio activo, un ligando distinto
de un anticuerpo policlonal, preferentemente un anticuerpo
monoclonal humano tal como se ha descrito anteriormente en la
presente memoria, mezclado con un excipiente farmacéuticamente
aceptable. Más preferentemente dicho anticuerpo monoclonal es un
anticuerpo monoclonal humano, o un fragmento, derivado u homólogo
del mismo, que se puede obtener a partir de la estirpe celular KRIX
1 depositada en la Belgian Coordinated Collections of
Micro-organisms con el número de entrada LMBP
5089CB. El grado de homología con dicho anticuerpo monoclonal es
por lo menos del 80%, preferentemente del 90% y más preferentemente
del 95%, y la homología se considera particularmente
preferentemente con respecto a las regiones determinantes de la
complementariedad del anticuerpo. Un ligando según la presente
invención puede comprender también un polipéptido artificial con
una potencia equivalente. La composición farmacéutica de la
presente memoria ha de comprender una cantidad terapéuticamente
eficaz de dicho ingrediente, tal como se indica de aquí en
adelante en relación con el procedimiento de tratamiento o de
prevención.
La composición farmacéutica de la presente
descripción puede comprender, además, particularmente en vista del
denominado tratamiento antitrombótico auxiliar, una cantidad
terapéuticamente eficaz de un agente trombolítico. Dichos agentes
trombolíticos, así como sus dosificaciones habituales en función
del tipo al que pertenecen, resultan muy conocidos por los
expertos en la materia. Entre los numerosos ejemplos de agentes
trombolíticos que las composiciones farmacéuticas de la presente
invención pueden comprender, la siguiente lista no limitativa se
puede citar particularmente: t-Pa, estreptocinasa,
venombina A, TNK-tPA o estafilocinasa.
Los excipientes farmacéuticos aptos para
utilizar en las composiciones farmacéuticas de la presente
invención se describen por ejemplo en Remington's Pharmaceutícal
Sciences 16th ed. ("Ciencia farmacéutica de Remington, 16ª
ed.") (1980) y su formulación resulta muy conocida para los
expertos en la materia. Comprenden todos y cada uno de los
disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes
antibióticos y antifúngicos (por ejemplo fenol, ácido sórbico,
clorobutanol), agentes isotónicos (tales como glúcidos o cloruro
sódico) y similares. Los ingredientes adicionales se pueden añadir
a fin de controlar la duración de la acción del principio activo
del anticuerpo monoclonal de la composición. De este modo se pueden
conseguir composiciones de liberación controlada al seleccionar
los excipientes poliméricos apropiados tales como por ejemplo
poliésteres, poliaminoácidos, povidona, copolímeros de
etileno-acetato de vinilo, metilcelulosa,
carmelosa, sulfato de protamina y similares. El ritmo de liberación
de fármaco y la duración de la acción se puede controlar también al
incorporar el principio activo del anticuerpo monoclonal en
partículas, por ejemplo microcápsulas, de una sustancia polimérica
tal como hidrogeles, ácido poliláctico, hidroximetilcelulosa,
polimetacrilato de metilo y otros polímeros descritos
anteriormente. Dichos métodos comprenden sistemas coloidales de
administración de fármacos tales como liposomas, microsferas,
microemulsiones, nanopartículas, nanocápsulas, etcétera. En función
de la vía de administración, la composición farmacéutica que
comprende el principio activo puede requerir recubrimientos
protectores. La forma farmacéutica apta para utilizar en inyecciones
comprende disoluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos
estériles para la preparación improvisada de la misma. Los
excipientes habituales comprenden, por lo tanto, disoluciones
acuosas amortiguadoras del pH, etanol, glicerina, propilenglicol,
macrogol y mezclas de los mismos.
La presente descripción proporciona también la
utilización de un ligando, distinto de un anticuerpo policlonal
(tal como se ha comentado anteriormente) como medicamento. Más
preferentemente el medicamento utilizado en la presente invención
constituye un medio de prevención y/o tratamiento de trastornos de
la hemostasis, en particular, trastornos de la coagulación y otras
patologías trombóticas de los mamíferos, preferentemente de los
seres humanos. Se puede administrar dicho ligando a un paciente
mediante cualquier medio conocido en la técnica, es decir, por vía
oral, intranasal, subcutánea, intramuscular, intradérmica,
intravenosa, intraarterial, parenteral o mediante cateterismo.
Según la presente invención, el ligando se puede utilizar también
como medicamento junto o asociado a otro medicamento, por ejemplo
un agente trombolítico tal como los descritos anteriormente
haciendo referencia a las composiciones farmacéuticas.
La presente descripción proporciona, por lo
tanto, un método de tratamiento y/o prevención de la hemostasis,
los trastornos de la coagulación y patologías trombótica's así como
un método de atenuación de la coagulación en mamíferos,
preferentemente en un ser humano, que comprende la administración a
un mamífero que necesita dicho tratamiento o prevención o
atenuación de la coagulación una cantidad terapéuticamente eficaz
de un ligando distinto de un anticuerpo policlonal tal como se ha
descrito anteriormente. Preferentemente dicho ligando es un
anticuerpo monoclonal humano o humanizado que se puede obtener a
partir de la estirpe celular KRIX 1 depositada en la Belgian
Coordinated Collections of Micro-organisms con el
número de entrada LMBP 5089CB o un fragmento de logando antígeno
Fab, Fab' o F(ab')_{2}, una región (CDR) de determinación
complementaria, una parte variable de cadena simple (scFv) soluble
o fijado a la membrana, un dominio variable simple o un derivado o
combinación de cualquiera de dichos elementos.
Una cantidad terapéuticamente eficaz tal como se
utiliza en la presente memoria significa desde aproximadamente 1
microgramo hasta aproximadamente 10 miligramos por kilogramo de
peso corporal, más preferentemente desde aproximadamente 10
microgramos hasta aproximadamente 1 miligramo por kilogramo de
peso corporal del mamífero a tratar. Se podrá apreciar que, en
vista del período de vida media prolongado de la mayor parte de los
anticuerpos IgG humanos, los ligandos de la presente descripción que
son anticuerpos monoclonales de dicha clase permiten una
periodicidad de tratamiento que colabora en el bienestar del
paciente.
Entre formas de realización preferidas, como
patologías trombóticas a prevenir o tratar, se pueden citar la
coagulación intravascular, la trombosis arterial (que puede ser
responsables de infartos de miocardio agudos de accidentes
cardiovasculares), la reestenosis arterial, la trombosis venosa
(que habitualmente se produce en venas periféricas como
consecuencia de un trauma o inmovilización accidental o quirúrgica)
o la arterioesclerosis. En un método de tratamiento más preferido,
se proporciona al paciente una inyección intravenosa en embolada
con una dosis determinada por la experiencia del médico en función
de los criterios que determinan el cuadro clínico del paciente
particular.
El método de tratamiento y/o prevención según la
presente descripción puede comprender, además, el tratamiento o
prevención de las mismas patologías trombóticas al administrar al
paciente, preferentemente mediante una administración secuencial,
una cantidad terapéuticamente eficaz del agente trombolítico tal
como se ha descrito anteriormente haciendo referencia a las
composiciones farmacéuticas. Secuencial, tal como se utiliza en la
presente descripción, significa que el ligando de la presente
invención y el agente trombolítico conocido se administran al
paciente secuencialmente y no simultáneamente.
La presente invención proporciona, además, un
método de obtención de anticuerpos monoclonales obtenidos a partir
de mamíferos no humanos, que comprende las etapas de:
- a)
- seleccionar un mamífero no humano que presente una proteína funcional por lo menos parcialmente fisiológicamente activa, realizándose la modificación con respecto a una proteína natural y encontrándose en un dominio de la proteína;
- b)
- administrar la proteína natural a un mamífero no humano a fin de provocar una respuesta inmunitaria, y
- c)
- seleccionar linfocitos B del mamífero no humano que produzcan anticuerpos que inactiven únicamente parcialmente la proteína natural.
Según el presente método, la práctica habitual
comprende sacrificar los mamíferos no humanos y extraer su bazo a
fin de realizar la etapa (c).
La presente descripción proporciona
adicionalmente un método de obtención de anticuerpos monoclonales a
partir de la sangre de un ser humano que presenta una proteína
funcional modificada y por lo menos parcialmente fisiológicamente
activa, realizándose la modificación con respecto a una proteína
natural y encontrándose en un dominio de la proteína, y a quién se
administró la proteína natural, comprendiendo dicho método la etapa
de seleccionar, a partir de la sangre del ser humano, linfocitos B
que produzcan anticuerpos que inactiven únicamente parcialmente la
proteína natural.
La presente invención, en las formas de
realización que describen los diversos aspectos mencionados
anteriormente y definidos en las reivindicaciones adjuntas,
presenta numerosas ventajas. La ventaja principal de la utilización
terapéutica de los anticuerpos monoclonales de la presente
invención es que el tratamiento resulta altamente específico en
relación con la respuesta inmunitaria a considerar. En estados de
hipercoagulación, la especificidad de los anticuerpos monoclonales
humanos de la presente invención garantiza que la interacción en la
ruta de la cascada de la coagulación se limite al factor reconocido
por el anticuerpo.
Más específicamente, la utilización de
anticuerpos antifactor VIII que presentan las características
preferidas mencionadas anteriormente supone una combinación única
de ventajas relacionadas con la selección del factor VIII, las
relacionadas con las características de la inhibición del factor
VIII y las relacionadas con la utilización de anticuerpos:
- -
- La selección del factor VIII significa que al neutralizar la actividad como cofactor tal como la del factor VIII no supone riesgo alguno de inhibir completamente la actividad enzimática que el mismo potencia y, por lo tanto, representa una ventaja sobre otros métodos en los que se seleccionan directamente enzimas tales como el factor IX.
- -
- Las formas de realización de los inhibidores descritos anteriormente presentan en común que inhiben eficazmente pero únicamente parcialmente la actividad como cofactor del factor VIII, determinando una estabilidad terapéuticamente útil, incluso cuando el anticuerpo monoclonal de la presente invención se utiliza en un excedente superior a 100 veces. Los anticuerpos monoclonales según la presente invención alcanzan el efecto estable de la inactivación del factor VIII, permitiendo la aplicación de inyecciones intravenosas en embolada, obteniéndose una protección antitrombótica rápida durante varias semanas sin la necesidad de realizar un seguimiento minucioso y sin el riesgo de sobredosis.
- -
- Los anticuerpos IgG humanos presentan un período de vida media prolongado de tres semanas (excepto en el caso de la IgG3 que es de una semana), proporcionando de este modo unos niveles plasmáticos muy estables del agente antitrombótico y permitiendo una reducción drástica de la frecuencia de administración. Además, la utilización de anticuerpos humanos o derivados supone un riesgo mínimo de producción de respuestas inmunitarias.
La presente invención se describe más
detalladamente a partir de los siguientes ejemplos que se
proporcionan únicamente a título ilustrativo.
Se producen los anticuerpos monoclonales humanos
con la especificidad y características pretendidas mediante la
transformación de linfocitos B obtenidos a partir de la sangre
periférica de pacientes que padecen hemofilia A o hemofilia
adquirida. El método de selección de los pacientes es una forma de
realización de la presente invención. A fin de provocar una
respuesta inmunitaria más específica, se buscan pacientes que
presenten una función reducida de una proteína fisiológicamente
activa, por ejemplo, el factor VIII. Por "reducida" se
entiende que se encuentra disponible una cierta función residual
pero que es inferior a la conocida para el tipo natural de la
misma proteína. La comparación entre la autoproteína y la proteína
natural ha de mostrar la diferencia entre las dos proteínas,
preferentemente en una región o dominio que resulte de interés. La
diferencia puede comprender la eliminación o la sustitución de uno
o más aminoácidos con otros. A continuación se administra a los
pacientes una cantidad suficiente de la proteína natural para
provocar una respuesta inmunitaria. A continuación se extraen los
linfocitos B de los pacientes y se seleccionan en función de la
producción de anticuerpos que presentan las propiedades
pretendidas. A pesar de que anteriormente se ha hecho referencia a
"pacientes", el método según la presente forma de realización
se puede aplicar en líneas generales a los mamíferos. El
procedimiento anterior conlleva una gran posibilidad de obtener
anticuerpos que seleccionan el dominio que comprende el
defecto.
Los linfocitos B se transforman mediante la
infección con el virus de Epstein-Barr y la
activación de antígenos de superficie utilizando técnicas muy
conocidas por los expertos en la materia. Los sobrenadantes
celulares que comprenden los anticuerpos apropiados se identifican
mediante un procedimiento de análisis específico tal como se
describe posteriormente con más detalle.
De este modo, se identifican los anticuerpos
contra el factor VIII al hacer reaccionar el sobrenadante con
placas de microvaloración de poliestireno recubiertas con el factor
VIII o con complejos del factor VIII/factor de Von Willebrand. El
enlace de los anticuerpos específicos se detecta mediante la
adición de un reactivo de IgG no humano acoplado a un enzima. La
adición de un sustrato enzimático que se convierte en un compuesto
coloreado en presencia del enzima permite detectar los anticuerpos
específicos. Dichos métodos conocidos como pruebas de
inmunoabsorción enzimática (ELISA) resultan muy conocidos por los
expertos en la materia y se describen en detalle, por ejemplo, en
Current Protocols in Immunology ("Protocolos actuales en
inmunología"), capítulo 2, John Wiley & Sons (1994).
Más específicamente en el presente caso, el
enlace de los anticuerpos IgG antifactor VIII se detectó mediante
la adición de un anticuerpo monoclonal murino marcado con
peroxidasa de rábano específico del Fc gamma humano. La subclase
IgG del anticuerpo antifactor VIII se detecto mediante una prueba
ELISA, tal como se ilustra en la Figura 1. La inhibición de la
actividad funcional del factor VIII se ensayó en un análisis de
coagulación funcional del siguiente modo. Se incubó un volumen
equivalente del sobrenadante de un cultivo celular y de una reserva
de plasma normal durante 2 horas a 37ºC y se determinó a
continuación la actividad residual del factor VIII. Aquellos
anticuerpos que inhiben significativamente la actividad del factor
VIII se destacan con un asterisco en la Figura 1.
Los linfocitos B (tales como los BO2C11) que
producen anticuerpos antifactor VIII y a continuación se hacen
crecer y se clonan mediante disolución limitante tal como se
describe, por ejemplo, en Current Protocols in Immunology
(véase supra). Los anticuerpos antifactor VIII que presentan
la capacidad de inhibir la actividad procoagulante del factor VIII
tal como se ha descrito anteriormente se identifican utilizando un
equipo de ensayo cromogénico tal como el ensayo cromogénico del
factor VIII de Dade, Düchingen, Alemania o el Coatest® disponible
comercialmente en Kabi Vitrum (Bruselas, Bélgica) o el Chromogenix
AB (Mölndal, Suecia).
Se incubaron unos volúmenes equivalentes de
anticuerpos BO2C11 y de una reserva de plasma normal durante 2
horas a 37ºC. Las concentraciones de BO2C11 antes de realizar la
mezcla se ilustran en el eje X. La reducción de la actividad del
factor VIII se determinó en un ensayo de coagulación y se expresó
como porcentaje de la actividad obtenida en ausencia del anticuerpo
(véase la Figura 2). La actividad residual tiende a cero
asintóticamente (inhibición completa).
Se seleccionaron anticuerpos que inhiben la
función del factor VIII con una afinidad suficiente pero no inhiben
completamente la actividad procoagulante del factor VIII, incluso
cuando se utiliza un gran excedente de anticuerpo, en una forma de
realización adicional de la presente invención. Un ejemplo
representativo de dicho anticuerpo se ilustra en la Figura 3, en la
que se incubaron volúmenes equivalentes de KRIX 1 y del factor VIII
recombinante o de plasma normal durante 2 horas a 37ºC y siendo
las concentraciones (expresadas en \mug/ml) de KRIX 1 antes de
mezclar con el plasma las indicadas, se determinó la actividad
residual del factor VIII utilizando el ensayo cromogénico mencionado
anteriormente. De un modo interesante, la Figura 3 muestra como
aproximadamente el 60% de la inhibición del factor VIII a una
concentración de 0,1 \mug/ml y de un modo más interesante la
inhibición asintótica de aproximadamente el 80% en el intervalo
completo de concentraciones desde 0,5 hasta 300 \mug/ml.
Los anticuerpos seleccionados de este modo se
producen a continuación en un cultivo masivo y se purifican
mediante cromatografía de afinidad utilizando métodos que resultan
muy conocidos por los expertos en la materia.
Los detalles de una técnica de preparación no
limitante son los siguientes. Se obtuvo el factor VIII recombinante
humano (actividad específica 4000 UI/mg) de Hyland (Glendale, Ca)
como material para uso exclusivo en laboratorio; el complejo
obtenido a partir del plasma (pd, por sus siglas en inglés) del
factor VIII - factor de Von Willebrand, purificado por
cromatografía de intercambio de iones (actividad específica
\pm160 UI/mg de proteína; proporción p/p del factor de Von
Willebrand en relación con el factor VIII de 15:1), y el complejo
factor VIII purificado - factor de Von Willebrand reducido
(proporción p/p del factor de Von Willebrand en relación con el
factor VIII de 4800:1; lote 951016) se obtuvieron en la Cruz Roja
Belga (Bruselas, Bélgica).
Las muestras de sangre periférica se recogieron
a partir de donantes que padecían hemofilia leve y con inhibidores.
Se perpetuaron los monocitos de la sangre periférica (PBMC, por sus
siglas en inglés) mediante la infección con EBV concomitante a la
activación de los antígenos de superficie. Se realizó la detección
sistemática de cuatrocientos ochenta estirpes celulares mediante la
prueba ELISA en relación con la producción de anticuerpos contra el
factor VIII. Por ejemplo, una estirpe celular, denominada KRIX 1,
se clonó satisfactoriamente por disolución limitante. Se verificó
la clonalidad mediante amplificación por RT-PCR de
la secuencia de ARNm de las regiones V de las cadenas pesada y
ligera del anticuerpo: se obtuvo una secuencia simple a partir de
10 clones de los productos de PCR. Se obtuvieron los anticuerpos
purificados mediante el paso del sobrenadante del cultivo celular
de KRIX 1 en proteína-A sefarosa. Se realizó una
prueba ELISA con la subclase IgG y se identificaron los
anticuerpos específicos de cadena ligera del KRIX-1
como un IgG4k.
Se purificaron los anticuerpos monoclonales
humanos mediante la absorción en proteína A inmovilizada (Proteína
A high-TRAP®; Pharmacia, Uppsala, Suecia). Los
fragmentos Fab de los anticuerpos monoclonales se prepararon
mediante digestión en papaína. Se diluyó un mg de un anticuerpo
seleccionado en 500 \mug/ml en una disolución amortiguadora de
fosfato (40 mol/l de KH_{2}PO_{4}, 60 mM de
Na_{2}HPO_{4}\cdot2H_{2}O, 0,15 M NaCl) que comprendían 50
mmol/l de L-cisteína (sigma), 1 mmol/l de ácido
edético (Merck) y 10 microgramos de papaína (Sigma). Se incubó la
mezcla durante 3 h a 37ºC mientras se sometía a agitación continua.
Se detuvo la reacción mediante la adición de yodoacetamida hasta
una concentración final de 75 mmol/l durante 30 minutos a
temperatura ambiente. El anticuerpo digerido se dializó contra una
disolución amortiguadora salina dé fosfato (140 mmol/l de NaCl, 67
mmol/l de KC1, 20 mol/l de Na_{2}HPO_{4}, 4,4 mmol/l
KH_{2}PO_{4}, a un pH de 7,4). Los fragmentos de IgG y Fc sin
digerir se eliminaron a continuación mediante el pase en
proteína-A sefarina (Proteína A
high-TRAP®; Pharmacia). A continuación se siguió
purificando el fragmento Fab por cromatografía de filtración en gel
en un Superdex 200 (Pharmacia).
Se utilizaron métodos convencionales en la
detección de los anticuerpos IgG antifactor VIII, la determinación
de la subclase IgG y el análisis de la inhibición del enlace del
factor VIII con el factor de Von Willebrand. En el caso del
análisis de la inhibición del enlace del factor r. VIII a un
anticuerpo seleccionado mediante Fab y a un anticuerpo nativo, se
recubrieron unas placas de poliestireno Maxisorb (Nunc) durante 2 h
con 50 \mul del anticuerpo diluido en 5 \mug/ml en una
disolución amortiguadora de glicina (20 mmol/l de glicina, 34
mol/l NaCl, pH 9,2). Tras realizar el lavado, se mezclaron 50
\mul del factor VIII marcado con biotina diluido hasta 1
\mug/ml en tris-caseína (10 mol/l de
tris-(hidroximetil)-aminoetano, a un pH de 7,3, que
contenía 150 mol/l de NaCl y caseína al 0,5%) durante 1 h a 37ºC
con 50 \mul de IgG humana a diversas diluciones. Se añadió una
alícuota de 50 \mul de la mezcla a las placas durante 2 horas a
temperatura ambiente. Tras realizar el lavado, se detectó el
enlace del factor r. VIII biotinado mediante la adición secuencial
de avidina-peroxidasa y OPD.
El factor r. VIII (concentración final de 0,2
pg/ml) se incubó con el anticuerpo IgG humano a distintas
concentraciones durante 2 h a 37ºC y se examinó la actividad
residual del factor VIII mediante un análisis cromogénico (Coatest
Factor VIII, Chromogenix AB, Mölndal, Suecia o Kabi Vitrum,
Bruselas, Bélgica). La inhibición de la actividad plasmática del
factor VIII se determinó mediante el método Bethesda, en el que se
utilizó como fuente de factor VIII una reserva de plasma normal
depositada en una disolución amortiguadora de citrato trisódico.
La actividad residual del factor VIII se determinó mediante un
análisis cromogénico o mediante un análisis de coagulación de
una
etapa.
etapa.
Alternativamente, los anticuerpos monoclonales
que presentan las mismas características descritas en el Ejemplo 1
se pueden producir con el objetivo de la inmunización en animales.
De este modo, se inyectan ratones con el factor VIII en un aditivo
de Freund.
Los anticuerpos monoclonales antifactor VIII
humano se obtienen a continuación mediante la fusión de linfocitos
de bazo con una estirpe celular de mieloma murino. Los
sobrenadantes del cultivo celular que producen anticuerpos
antifactor VIII se identifican y se clonan mediante disolución
limitante, utilizando métodos descritos en Current Protocols in
Immunology (véase supra). La posterior selección de los
inhibidores que presentan la capacidad pretendida de inhibición de
la actividad procoagulante del factor VIII se realiza tal como se
ha descrito en el Ejemplo 1.
Los anticuerpos monoclonales producidos en los
ratones se humanizan a continuación. De este modo, las secuencias
de las partes variables de las cadenas pesadas y ligera murinas se
alinean con las regiones variables de la inmunoglobulina humana
para identificar el anticuerpo humano con un mayor grado de
homología en las regiones estructurales. El fragmento de ADN que
codifica las regiones variables humanizadas se sintetiza a
continuación mediante un método de inserción de regiones
determinantes de la complementariedad (CDR) basado en la PCR tal
como se describe, por ejemplo, en Sato et al., Cancer
Research (1993) 53: 851-6. La secuencia del
producto final de la PCR de la parte variable de la cadena pesada
del anticuerpo humanizado se digiere y se subclona antes del gen
humano C gamma-1 en un primer plásmido de
expresión. La región variable de la cadena ligera del constructo
final se inserta en el gen C kappa en un segundo plásmido de
expresión. A continuación se realiza la cotransfección de los dos
constructos en un sistema de expresión con células COS.
Los anticuerpos monoclonales tanto de origen
animal (Ejemplo 1) o animal (Ejemplo 2) se caracterizaron
utilizando un sistema de ensayo mediante el que se analizó su
capacidad de inhibición del enlace del factor VIII con los
fosfolípidos. De este modo, se recubren placas de microvaloración
de poliestireno con
fosfatidil-L-serina. El factor VIII
recombinante soluble a una concentración final de 2 \mug/ml se
mezcla durante 30 minutos a 37ºC con diversas concentraciones del
anticuerpo a analizar. A continuación se activa rápidamente la
mezcla con trombina y se añade a la placas recubiertas con
fosfatidil-L-serina. A continuación
se incubaron dichas placas durante 2 minutos a 21ºC y se detectó
el factor VIII mediante la adición del dominio mAbF14A2 antifactor
VIII Al durante dos minutos, seguido por una incubación de dos
minutos con Fc gamma antimurino de cabra conjugado con HRP. Los
resultados de dicho experimento se ilustran en la Figura 4 para el
anticuerpo monoclonal producido a partir de la estirpe celular KRIX
1. En la figura se indica la media de enlace del factor VIII
activado en ausencia (símbolos cerrados) o presencia (símbolos
abiertos) del anticuerpo, así como la desviación típica de los
triplicados. Los controles en ausencia del factor VII
proporcionaron una DO 490 interior a 0,05. La Figura 4 demuestra
claramente que el anticuerpo monoclonal producido a partir de la
estirpe celular KRIX 1 inhibe significativamente el enlace del
factor VIII con los fosfolípidos pero que realiza una inhibición
incompleta incluso cuando se añade en un gran excedente.
Para demostrar que en ausencia de plasma, el
KRIX 1 no reconoce la cadena ligera del factor VIII mutado del
donante, se sintetizaron unos fragmentos de ADN que codificaban las
cadenas ligeras del factor VIII natural y mutada. Las proteínas
correspondientes se expresaron en lisados de reticulocitos. El
pliegue correcto de las cadenas ligeras naturales y mutadas se
determinó mediante inmunoprecipitación con el anticuerpo monoclonal
humano BO2C11, que reconoce un epítopo conformacional en el extremo
C de la cadena del factor VIII. Los experimentos de
inmunoprecipitación indicaron que el BO2C11 se enlazó con las
cadenas ligeras naturales y Arg2150His, mientras que el KRIX 1
capturó exclusivamente la cadena ligera natural. La exposición
prolongada de geles de SDS-PAGE (electroforesis en
geles de poliacrilamida que se realiza en presencia de
sodiododecilsulfato) a la película autorradiografía no consiguió
detectar enlace significativo alguno del KRIX 1 con la cadena ligera
mutada. Los experimentos de control no mostraron enlace alguno con
los reactivos del ensayo a excepción del factor VIII o fragmentos
del factor VIII, y la incubación previa con el factor r. VIII
soluble evitó el enlace con los fragmentos del factor VIII marcados
con metionina, confirmando la especificidad de enlace.
El KRIX 1 no reconoció el factor VIII en la
inmunotransferencia de tipo Western indicando que el epítopo
reconocido era conformacional. La posterior cartografía del epítopo
se realizó, por lo tanto, con fragmentos del factor VIII producidos
en lisados de reticulocitos. Los experimentos preliminares habían
indicado que dicho enfoque resultaba eficaz en la síntesis de los
dominios del factor VIII. El procedimiento de inmunoprecipitación
utilizando los dominios del factor VIII marcado producidos en los
lisados de reticulocitos se validó mediante la cartografía del
epítopo reconocido por el anticuerpo monoclonal BO2C11. Se observó
una concordancia completa entre el enlace con los fragmentos de
eliminación C2 del factor VIII producidos en los lisados de
reticulocitos y el enlace con los fragmentos recombinantes
producidos en E. coli o en células COS. El KRIX 1 se enlazó
con la cadena ligera en toda su longitud, a los fragmentos
correspondientes a los dominios A3C1, C1C2 y al dominio aislado C1.
En cambio, el KRIX 1 no se enlazó con los dominios C1 o C1C2 con la
sustitución con Arg2150His, a pesar de que en un experimento de
control, el dominio C1C2 Arg2150His se enlazó con el BO2C11 como su
homólogo normal.
Se realizó la búsqueda de otras mutaciones de la
cadena ligera que pudiesen alterar el enlace del KRIX 1. Tal como
se ilustra en la Tabla I, el KRIX 1 inhibió la actividad de todas
las moléculas del factor VIII mutado analizadas hasta el momento,
excepto aquellas que comprendían la mutación Arg2150His.
Al utilizar el KRIX 1 como medicamento para
inhibir parcialmente el factor VIII, las mutaciones moderadas del
factor VIII no afectarán a la eficacia del tratamiento.
El KRIX 1 inhibió el enlace del factor VIII con
el factor de Von Willebrand de un modo dependiente de la dosis. La
concentración de KRIX 1 requerida para alcanzar el 50% de
inhibición (CI_{50}) del enlace del factor VIII fue de 0,25
\mug/ml y se obtuvo un valor superior al 95% de inhibición con 20
\mug/ml de KRIX 1. Los fragmentos Fab del KRIX 1 inhibieron
también el enlace del factor VIII con el factor de Von Willebrand.
Sin embargo, en una base molar se requirió 15 veces más del
fragmento Fab que del KRIX 1 natural para inhibir el 50% del enlace
del factor VIII con el factor de Von Willebrand. Se realizaron
unos experimentos adicionales para descartar que los fragmentos Fab
del KRIX 1 contenían todavía el anticuerpo intacto o parcialmente
digerido. La SDS-PAGE (electroforesis en geles de
poliacrilamida en presencia de sodiododecilsulfato) de los
fragmentos Fab purificados por absorción con
proteína-A y cromatografía de filtración en gel
mostró una banda simple. La presencia de trazas de fragmentos de Fc
gamma que continuasen enlazados a los fragmentos Fab se excluyó
mediante una prueba ELISA. Unos pocillos con el factor VIII
insolubilizado se incubaron con KRIX 1 natural o Fab. Se pudo
detectar el enlace de tanto el KRIX 1 natural como del Fab mediante
la adición de una IgG de cadena ligera antikappa marcada con
peroxidasa. En cambio, la adición de una IgG gamma
anti-Fc marcada con peroxidasa no reveló enlace
específico alguno incluso cuando se incubaron en los pocillos 100
\mug/ml de la preparación de Fab. En comparación, la adición de
0,1 \mug/ml del anticuerpo natural dio lugar a un enlace
significativo. En la prueba ELISA, se requirió una concentración 15
veces superior de Fab que de anticuerpo natural para inhibir el
50% del enlace del KRIX 1 biotinado con el factor VIII
insolubilizado, indicando que el fragmento Fab del KRIX 1
presentaba una afinidad inferior hacia el factor VIII que el
anticuerpo natural. Por consiguiente, el requisito de unas
concentraciones superiores del fragmento Fab del KRIX 1 que del
anticuerpo natural para inhibir el enlace del factor VIII con el
factor de Von Willebrand se ha de atribuir a la afinidad reducida
de los fragmentos Fab del KRIX 1 hacia el factor VIII.
Para determinar si el KRIX 1 era representativo
de los anticuerpos policlonales del donante, se realizó un ensayo
competitivo. El enlace del KRIX 1 biotinado con el factor VIII
insolubilizado se determinó en presencia de unas concentraciones
crecientes de KRIX 1, IgG policlonal del donante e IgG policlonal
de control. La IgG del donante inhibió el enlace del KRIX 1 con el
factor VIII en función de la dosis. La concentración de KRIX 1 y de
IgG del donante que inhibía el 50% del enlace del KRIX 1 biotinado
con el factor VIII resultó de 0,3 \mug/ml y de 170 \mug/ml,
respectivamente, mientras que no se observó inhibición alguna con
la IgG de control.
Alternativamente, los anticuerpos que reducen el
ritmo de liberación del factor VIII del factor de Von Willebrand
se identificaron del siguiente modo. Se recubrieron unas placas de
microvaloración de poliestireno con un anticuerpo específico para
el factor de Von Willebrand. Una disolución del factor VIII
recombinante biotinado (0,5 \mug/ml) formando un complejo con el
factor de Von Willebrand (5 \mug/ml) se mezcló con diversas
concentraciones de IgG obtenida a partir de un donante (cuadrados
oscuros de la Figura 5), por ejemplo el mismo paciente descrito
anteriormente (del que se obtuvo el KRIX 1), MoAb4H1D7 o IgG de un
paciente no hemofílico (triángulos oscuros de la Figura 5). Se
añadió IgG en las concentraciones indicadas a las placas de
microvaloración recubiertas con un anticuerpo murino, el MoAb4H1D7
contra el factor de Von Willebrand y se incubó durante dos horas a
temperatura ambiente. Después de realizar el lavado, se activó el
factor VIII con trombina durante 2 minutos a 37ºC. Se detectó el
enlace del factor VIII con el factor de Von Willebrand mediante la
adición de peroxidasa de avidina. Los controles comprendían la
detección del factor VIII biotinado enlazado en ausencia de la
digestión con trombina (DO 450 = 460 + 47,7 SD (DT)) y del factor
VIII biotinado enlazado tras la digestión con trombina en ausencia
del anticuerpo (DO 450 = 160 + 16,0 SD (DT)).
Los resultados de dichos experimentos se
ilustran en la Figura 5 para los anticuerpos policlonales. En dicha
figura, se indican los valores medios así como la desviación típica
de los triplicados. La Figura, 5 demuestra claramente que una
proporción significativamente superior del factor VIII activado
permanece enlazada a la placa en presencia de concentraciones
crecientes del anticuerpo, es decir, demuestra una reducción de la
disociación del factor VIII activado del factor de Von Willebrand
en presencia de un anticuerpo inhibidor que reconoce, el factor
VIII enlazado con el factor de Von Willebrand. Los anticuerpos
monoclonales se han obtenido a partir de dichos anticuerpos
policlonales según los métodos descritos en la presente invención,
indicando de este modo que la presente invención se puede ampliar a
los anticuerpos monoclonales y a fragmentos y derivados de los
mismos que se enlazan con los complejos del factor VIII/factor de
Von Willebrand.
La secuenciación de los dominios variables de
los anticuerpos se realizó del siguiente modo. El aislamiento del
ARN obtenido a partir de estirpes celulares de linfocitos B humanos
perpetuados se realizó utilizando el reactivo TRIzol según las
instrucciones del fabricante (Life Technologies). Se sintetizó el
ADN_{c} con el sistema de preamplificación SuperScript para la
síntesis de la primera cadena de ADN_{c}. El ADN_{c} que
codificaba los genes de la región variable de la cadena pesada
(V_{H}) se amplificó mediante la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) utilizando iniciadores específicos de la secuencia
delantera de las familias V_{H} y para el exón inicial de la
región C gamma, se realizó el apareamiento tal como se ha descrito
(Bakkus et al., Blood, 80: 2326, 1992) a 60ºC durante 40
ciclos de PCR. Los productos de la PCR con un tamaño adecuado (460
pares de bases) se aislaron con gel de agarosa al 1,5% y se
clonaron utilizando el TA Cloning Kit (Invitrogen BV, Leek,
Holanda). Se realizó una detección sistemática con la PCR
utilizando parejas de iniciadores correspondientes a la familia
génica V_{H} de interés en cultivos de colonias seleccionadas al
azar. Se aisló el ADN plasmídico de las colonias positivas
utilizando el Wizard Plus Minipreps (Promega, Menlo Park, CA) y se
secuenció en ambas direcciones con el Sequenase (US Biochemical,
Cleveland, OH), según las instrucciones del fabricante. El análisis
de las secuencias genéticas se realizó utilizando el V BASE
Sequence Directory (Tomlinson et al., MRC Centre for Protein
Engineering, Cambridge, Reino Unido).
Las secuencias completas de las regiones V_{H}
y V_{L} del anticuerpo BO2C11 descrito en el Ejemplo 1 se
enviaron a la EMBL Nucleotide Sequence Database con los números de
entrada AJ224083 y AJ224084, respectivamente.
Las secuencias de aminoácidos ilustradas en las
Figuras 6 y 7 definen las regiones V_{H} y V_{L} del anticuerpo
BO2C11 comprendiendo las tres CDR para cada una de las cadenas
pesada y ligera. Se proporcionan asimismo las secuencias de
polinucleótidos que codifican dichas regiones. Las SEC. Nº 2 y 3 son
las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera del
BO2C11, respectivamente, mientras que las SEC. Nº 5 y 6
proporciona las secuencias de polinucleótidos que codifican dichas
regiones variables.
Las secuencias de aminoácidos ilustradas en la
Figuras 8 y 9 definen las regiones V_{H} y V_{L} del anticuerpo
KRIX-1 comprendiendo las CDR 1 a 3 para cada una de
las cadenas pesada y ligera. Se proporcionan asimismo las
secuencias de polinucleótidos que codifican dichas regiones. Las
SEC. Nº 8 y 1 son las secuencias de aminoácidos de las cadenas
pesada y ligera del KRIX-1, respectivamente,
mientras que las SEC. Nº 7 y 4 proporciona las secuencias de
polinucleótidos que codifican dichas regiones variables.
\newpage
(Comparativo)
Se determinaron los niveles del factor VIII en
un ensayo funcional a continuación de un período de incubación de
dos horas a 37ºC con diversas concentraciones del anticuerpo
SAF8C-Ig, utilizando el ensayo cromogénico descrito
en el Ejemplo 1. Tal como se ilustra en la Figura 10, la actividad
residual del factor VIII se reduce de un modo dependiente de la
dosis. Ya a los 100 pg/ml de SAF8C-Ig, la actividad
residual del factor VIII es inferior al 1% de la actividad normal.
Dichos niveles bajos del factor VIII exponen al paciente a un
riesgo elevado de hemorragias espontáneas, tal como resulta muy
conocido, por ejemplo, a partir de Levine, Ann. NYAcad. Sci.
(1975) 240: 201 y Gilbert, Mount Sinai J. Med. (1977) 44:
339.
Se provocó experimentalmente la trombosis en la
vena femoral de hámsteres anestesiados, al inyectar el tinte rosa
bengala en la vena yugular y al exponer la vena femoral a la luz
verde de una lámpara de xenón durante 4 minutos (Kawazaki et
al., Thromb. Haemost. (1999) 81: 306-11). Como
consecuencia de la iluminación del vaso, se descompone el tinte y
genera unos radicales que dañan las células endoteliales del vaso.
Por lo tanto, se exponen la estructuras subendoteliales a la
circulación sanguínea y se inicia la formación de trombos. La
cantidad de trombos formados se determina mediante la
transiluminación del vaso dañado (Kawazaki et al., Thromb.
Haemost. (1999) 81: 306-11) y se realiza la
determinación cuantitativa mediante la cantidad de luz blanca que
se transilumina a través del vaso. Tal como se ilustra en la Figura
11, cuando se realizó dicho experimento en animales de control, el
tamaño medio de los trombos determinado en 13 hámsteres fue de
220,000 \pm 32,575 (media \pm SEM [error típico de la media])
unidades luminosas arbitrarias (A.U., por sus siglas en inglés),
mientras que el tratamiento de un grupo de 12 hámsteres con
KRIX-1 (400 a 800 \mug/kg, administrados mediante
inyección intravenosa en embolada inmediatamente antes de la
provocación de la trombosis) redujo el tamaño medio de los trombos
122,000 \pm 27,100 A.U. (p = 0,0188 test de
Mann-Whitney).
Además, se analizó la cinética de la inhibición
del factor VIII por parte del KRIX-1 ex vivo
del siguiente modo: se inyectaron los hámsteres por vía
intravenosa con KRIX-1 (1600 \mug/kg). Se
determinaron los niveles del factor VIII:c en un ensayo
cromogénico (Coatest Factor VIII®, [Chromogenix AB, Mölndal,
Suecia] y Factor VIII Chromogenic Assay (Dade, Düdingen, Suiza)
utilizando plasma recogido antes y en distintos períodos de tiempo
tras la inyección. La Figura 12 ilustra como en dichos hámsteres,
la actividad del factor VIII se reduce desde 1,6 UI/ml hasta 0,3
UI/ml ya a los 30 minutos tras la inyección de los anticuerpos,
confirmando de este modo que inhibe únicamente parcialmente el
factor VIII.
<110> Investigación y desarrollo LEUVEN
vzw
\hskip1cmJacquemin, Marc G
\hskip1cmSaint-Remy, Jean Marie R.
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<120> Ligandos para utilizar en
composiciones farmacéuticas en el tratamiento de trastornos de la
hemostasis
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<130> K1564-PCT
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<140>
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<150> GB9916450.1
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14-07-1999
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 143
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<212> PRT
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<213> anticuerpo monoclonal humano
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<400> 1
\newpage
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<210> 2
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<211> 150
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<213> anticuerpo monoclonal humano
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<212> PRT
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<213> anticuerpo monoclonal humano
\newpage
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<211> 429
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<212> ADN
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<213> anticuerpo monoclonal humano
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<220>
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<221> Región V
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<222> (1)..(429)
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<221> característica_misc
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<222> (127)..(162)
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<223> región que determina la
complementariedad número uno
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<220>
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<221> característica_misc
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<222> (205)..(225)
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<223> región que determina la
complementariedad número dos
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
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<222> (325)..(354)
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<223> región que determina la
complementariedad número tres
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<400> 4
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<210> 5
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<212> ADN
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<213> anticuerpo monoclonal humano
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<220>
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<221> Región V
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<222> (1)..(450)
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<220>
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<222> (130)..(159)
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<223> región que determina la
complementariedad número uno
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<220>
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<221> característica_misc
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<222> (202)..(258)
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<223> región que determina la
complementariedad número dos
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<220>
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<222> (343)..(357)
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complementariedad número tres
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<400> 5
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<221> Región V
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complementariedad número uno
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<222> (205)..(225)
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complementariedad número dos
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<220>
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<222> (325)..(351)
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complementariedad número tres
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<400> 6
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<212> ADN
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<213> anticuerpo monoclonal humano
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<221> Región V
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<222> (1)..(468)
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<222> (124)..(192)
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complementariedad número uno
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<222> (232)..(285)
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<223> región que determina la
complementariedad número dos
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<222> (282)..(435)
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complementariedad número tres
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<400> 7
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<212> PRT
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<213> anticuerpo monoclonal humano
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<400> 8
Claims (17)
1. Estirpe celular denominada KRIX 1 depositada
en la Belgian Coordinated Collections of Microorganisms
("Depósitos coordinados de microorganismos en Bélgica"), con
el número de entrada LMBP 5089CB.
2. Anticuerpo monoclonal que se enlaza con una
región del factor VIII o con un complejo de dos o más factores que
comprende el factor VIII, caracterizado porque dicho
anticuerpo monoclonal presenta la capacidad de inactivar el factor
VIII o un complejo de dos o más factores que comprende el factor
VIII en por lo menos un 98% tal como se puede determinar mediante
un ensayo cromogénico del factor VIII, cuando dicho anticuerpo
monoclonal se encuentra en un excedente molar.
3. Estirpe celular que produce anticuerpos
monoclonales humanos según la reivindicación 2.
4. Anticuerpo monoclonal según la
reivindicación 2, en el que la región de enlace del anticuerpo
monoclonal no se encuentra directamente implicada en una
interacción fisiológica de dicho factor o complejo.
5. Anticuerpo monoclonal según la
reivindicación 2, en el que el Krix-I es el
anticuerpo producido por la estirpe celular denominada KRIX 1
depositada en la Belgian Coordinated Collections of Microorganisms,
con el número de entrada LMBP 5089CB o un anticuerpo que presenta
por lo menos un nivel de homología en la secuencia del 80% con el
mismo en las regiones determinantes de la complementariedad
(CDR).
6. Anticuerpo monoclonal según la
reivindicación 2, siendo un anticuerpo monoclonal humano que se
puede obtener a partir de la estirpe celular de la reivindicación
1.
7. Anticuerpo monoclonal según la reivindicación
2, la reivindicación 4 o la reivindicación 6, siendo de la clase
IgG.
8. Anticuerpo monoclonal según la
reivindicación 2 o cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7,
pudiendo reconocer un epítopo que se encuentre en el dominio G1 del
factor VIII.
9. Anticuerpo monoclonal según la
reivindicación 2, 4, 7 u 8, que se puede obtener mediante la
inmunización realizada a propósito en animales.
10. Anticuerpo monoclonal humanizado que se
puede obtener a partir del anticuerpo monoclonal de la
reivindicación 9.
11. Fragmento de enlace con un antígeno tal
como Fab, Fab', F(ab')_{2}, una región determinante de la
complementariedad, una parte variable de cadena simple soluble o
fijada a la membrana, un derivado o un dominio variable simple de
un anticuerpo monoclonal según la reivindicación 2 o cualquiera de
las reivindicaciones 4 a 9 o de un anticuerpo monoclonal humanizado
según la reivindicación 10, presentando dicho fragmento de enlace
con un antígeno la capacidad de inactivar el factor VIII o un
complejo de dos o más factores que comprende el factor VIII en por
lo menos el 98% tal como se puede determinar mediante un ensayo
cromogénico del factor VIII, cuando dicho fragmento se encuentra en
un excedente molar.
12. Composición farmacéutica para la prevención
o el tratamiento de trastornos de la hemostasis, trastornos de la
coagulación, patologías trombóticas o la atenuación de la
coagulación en mamíferos, que comprende como principio activo un
anticuerpo monoclonal según la reivindicación 2 o cualquiera de
las reivindicaciones 4 a 9 o un anticuerpo monoclonal humanizado
según la reivindicación 10 o un fragmento de enlace con un antígeno
según la reivindicación 11, mezclado con un excipiente
farmacéuticamente aceptable.
13. Composición farmacéutica según la
reivindicación 12, que comprende, además, una cantidad
terapéuticamente eficaz de un agente trombolítico.
14. Un polinucleótido que codifica un fragmento
de enlace con un antígeno tal como Fab, Fab', F(ab')_{2} o
una región determinante de la complementariedad, una parte variable
de cadena simple soluble o fijada a la membrana, o un dominio
variable simple o un derivado según la reivindicación 11.
15. Método de obtención de anticuerpos
monoclonales de un mamífero no humano, que comprende las etapas
de:
- a)
- seleccionar un mamífero no humano que presente una proteína modificada y parcialmente funcional, realizándose la modificación con respecto a una proteína natural de la cascada de coagulación y encontrándose en un dominio de la proteína;
- b)
- administrar la proteína natural a un mamífero no humano a fin de provocar una respuesta inmunitaria, y
- c)
- seleccionar linfocitos B del mamífero no humano que produzcan anticuerpos que inactiven únicamente parcialmente la proteína natural.
16. Anticuerpo monoclonal aislado según la
reivindicación 2, en el que dicho anticuerpo es producido por
linfocitos B humanos.
17. Uso del anticuerpo monoclonal de cualquiera
de las reivindicaciones 2, 4 a 10 ó 16, o del fragmento de enlace
con un antígeno según la reivindicación 11, en la producción de un
medicamento destinado a la prevención o tratamiento de un
trastorno de la hemostasis, un trastorno de la coagulación o una
patología trombótica o la atenuación de la coagulación en un
mamífero.
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