JPH10500282A

JPH10500282A - ハイブリッドヒト／動物第ｖｉｉｉ因子

Info

Publication number: JPH10500282A
Application number: JP7523430A
Authority: JP
Inventors: ジョンエス．ロラー，; マーシャルエス．ランジ，
Original assignee: Emory University
Current assignee: Emory University
Priority date: 1994-03-11
Filing date: 1994-11-15
Publication date: 1998-01-13
Anticipated expiration: 2018-05-12
Also published as: EP0749444B1; DE69427997T2; AU693837B2; ATE204298T1; PT749444E; DK0749444T3; CA2185327A1; EP0749444A1; DE69427997D1; WO1995024427A1; JP3406607B2; AU1209695A; US5663060A; ES2161278T3

Abstract

(57)【要約】ハイブリッド凝血促進第VIII因子が、ヒトおよび他の非ヒト哺乳動物第VIII因子サブユニットまたはドメインの単離および組換えにより、あるいはヒトおよび動物第VIII因子遺伝子の遺伝子操作により産生される。ヒトまたは動物血漿から精製される第VIII因子のサブユニットまたはドメインが単離され、そしてハイブリッドヒト／動物第VIII因子が、以下により産生される：（１）動物重鎖サブユニットとヒト軽鎖サブユニットとの混合またはヒト重鎖サブユニットと動物軽鎖サブユニットとの混合のいずれかを行い、それによってヒト軽鎖／動物重鎖およびヒト重鎖／動物軽鎖ハイブリッド分子を産生すること；あるいは（２）一方の種の１種以上のドメインと他方の種の１種以上のドメインとを混合すること。これらのハイブリッド分子は、イオン交換クロマトグラフィーにより単離される。あるいは、組換えDNA方法を用いて動物第VIII因子またはヒト第VIII因子の成分を、それぞれ対応するヒト第VIII因子または動物第VIII因子に変更し、ハイブリッドヒト／動物第VIII因子を産生する。

Description

【発明の詳細な説明】ハイブリッドヒト／動物第VIII因子政府は、本発明において、権利を有し、本発明は本発明を導く研究に一部資金を提供した国立衛生研究所承認番号HL40921、HL46215、およびHL36094に基づく。発明の背景本発明は、概してヒトおよび動物第VIII因子アミノ酸配列を有するハイブリッド第VIII因子ならびにその調製方法および使用方法に関する。血小板が障害部位で損傷した血管の切断壁に粘着すると、血液クッロッティングが始まる。続いて、酵素的に制御された反応のカスケードにおいて、可溶性フィブリノーゲン分子は酵素トロンビンにより、血栓において血小板を一緒に収容するフィブリンの不溶性の鎖に変換される。カスケードにおける各ステップで、タンパク質前駆体は、連続して次のタンパク質前駆体を切断するプロテアーゼに変換される。補因子がほとんどのステップで必要とされる。その活性型において、タンパク質の第VIII因子は、プロテアーゼ（活性型第IX因子）による第X因子の活性化に必要とされる補因子である。第VIII因子または抗血友病因子は、血漿中で認められ、そして1930年代に命名された。1940年代に、第VIII因子の欠乏症はクッロッティング障害性血友病Ａに結びつけられた。第VIII因子は、Ｘ連関であることが見出され、そしてタンパク質であると仮定された。1980年代には、ウシ、ヒト、およびブタの血漿に関連する研究により、第VIII因子がタンパク質であると同定されたが、その決定的な細胞源は依然として不明である。血液凝固において第VIII因子が正確にどのように機能するかは知られていない。第VIII因子が、トロンビンまたは第Xa因子によりタンパク質分解的に第VIIIa 因子に活性化されることが知られている。カルシウムおよびリン脂質と組み合わせて、第VIIIa因子は、第IXa因子を未知の機構により第Ｘ因子のより有効な活性化因子にする。第VIII因子で処置されない、第VIII因子の欠乏したヒトまたは第VIII因子に対する抗体を有するヒトは、関節における炎症反応から早期の死までの範囲の重度の症状を引き起こし得る未調節の内出血を被る。米国で約10,000人の重度の血友病患者は、第VIII因子の注入で処置され得、この第VIII因子は十分な頻度および濃度で投与されると、血液の正常なクッロッティング能を回復する。事実、第VI II因子の古典的な定義は、血友病Ａを有する個体由来の血漿におけるクッロッティング欠陥を矯正する正常な血漿中に存在する物質である。種々の程度の純度のヒト血漿由来第VIII因子のいくつかの製剤は、血友病Ａの治療用として市販されている。これらは、ウィルスに対して加熱処理およびデタージェント処理されるが有意なレベルの抗原タンパク質を含有する多数のドナーのプール血液由来の部分精製した第VIII因子；より低いレベルの抗原性不純物およびウィルス汚染物を有するモノクローナル抗体精製第VIII因子；および臨床治験のために進行中の組換えヒト第VIII因子を包含する。さらに、部分精製したブタ第VIII因子の製剤は、ヒト第VIII因子に対するインヒビターを有する患者、すなわち、ヒト第VIII因子を結合し、かつ中和する循環抗体分子を有する患者を処置するのに有用である。血友病患者は、再発性出血の数年後、関節に生じる変形性血友病性関節症を防止するために、連日、第VIII因子の交代を必要とする。しかし、商業的生産および治療的使用における問題のため、第VIII因子濃縮物の供給は、血友病患者を適切に処置するに決して十分に多くはない。例えば、一般に使用される血漿由来物は、単離および精製することが困難であり、免疫原性であり、そしてAIDSおよび肝炎ウィルスからの感染能の危険を除去するための処理を必要とする。組換えヒト第VIII因子は、後者の２つの問題を減らし得る。ブタ第VIII因子もまた、代替物を提供し得る。なぜなら、ヒト第VIII因子は生理学的濃度およびpHで不安定であり、極端に低い濃度（0.2μg/ml血漿）で血液中に存在し、そしてその比クッロッティング活性がブタ第VIII因子と比較して低いからである。多くのヒト第VIII因子のインヒビターが、ブタ第VIII因子とより強くは反応しないので、ブタ第VIII因子は、ヒト第VIII因子の注入に応答しない条件下で患者の第VIII因子欠乏を矯正するために現在使用されている。ブタ第VIII因子の限界は、１回以上の注入後にブタ第VIII因子に対する阻害的抗体が発達することである。一般に使用され、市販されている血漿由来第VIII因子に関連する問題は、より良い第VIII因子生産の開発に重大な関心をもたらしている。分子当たりクッロッティング活性のより多いユニットが送達され得るようなより強力な第VIII因子分子；選択されるpHおよび生理学的濃度で安定な第VIII因子分子；阻害的抗体を産生しにくい第VIII因子分子；およびヒト第VIII因子に対する抗体をすでに獲得している患者における免疫検出を免れる第VIII因子分子の必要性がある。米国出願番号07/864,004は、凝固因子活性を有するハイブリッドヒト／ブタ第 VIII因子分子の発見を記述しており、１つの種の第VIII因子の成分で、他の種の第VIII因子分子の対応する成分を置換する。米国出願番号08/212,133は、ハイブリッドヒト／動物第VIII因子分子を記述しており、この第VIII因子の１種の成分で、他の種の第VIII因子分子の対応する成分を置換する。従って、本発明の目的は、第VIII因子の欠損患者の血友病またはヒト第VIII因子のインヒビターを有する患者の血友病を矯正する第VIII因子を提供することである。本発明のさらなる目的は、血友病患者の処置方法を提供することである。本発明のさらに別の目的は、選択されるpHおよび生理学的濃度で安定な第VIII 因子を提供することである。発明の要旨１つの実施態様において、ヒトおよびブタまたは他の非ヒト哺乳動物（本明細書中で「動物」という）由来の第VIII因子アミノ酸配列を含む；または第２の実施態様において、ヒトまたは動物あるいは両方由来の第VIII因子アミノ酸配列と好ましくは第VIII因子の抗原性領域内で置換された第VIII因子に由来しないアミノ酸配列とを包含する凝固因子活性を有するハイブリッド第VIII因子が記載される。このハイブリッド第VIII因子分子は、ヒトおよび動物第VIII因子サブユニットまたはドメインの単離および組換えによるか；またはヒトおよび動物第VIII因子遺伝子の遺伝子操作により産生される。好適な実施態様において、組換えDNA方法は、動物第VIII因子の成分で、対応するヒト第VIII因子を置換するために用いられ、ハイブリッドヒト／動物第VIII 因子分子を生じる。別の実施態様において、組換えDNA方法は、ヒトまたは動物第VIII因子における、あるいは２つの種のハイブリッドにおける１種以上のアミノ酸を、第VIII因子に同一な配列を有さないアミノ酸、好ましくは第VIII因子に対して天然に存在する阻害抗体と非免疫反応性であるアミノ酸の配列で置き換えるために用いられる。特に免疫原性エピトープを置き換えるために用いられ得るアミノ酸配列の例は、アラニン残基の配列である。別の実施態様において、第VIII因子のサブユニットは、ヒト血漿または動物血漿から単離および精製され、そしてハイブリッドヒト／動物第VIII因子は、動物重鎖サブユニットとヒト軽鎖サブユニットとの混合物またはヒト重鎖サブユニットと動物軽鎖サブユニットとの混合物のいずれかにより産生され、それによってヒト軽鎖／動物重鎖およびヒト重鎖／動物軽鎖ハイブリッド分子を産生する。これらのハイブリッド分子はイオン交換クロマトグラフィーにより単離される。あるいは、第VIII因子の１つ以上のドメインまたは部分的ドメインは、ヒト血漿または動物血漿から単離および精製され、そしてハイブリッドヒト／動物第VI II因子が、１つの種からのドメインまたは部分的ドメインと第２の種のドメインまたは部分的ドメインとの混合物により産生される。ハイブリッド分子は、イオン交換クロマトグラフィーにより単離され得る。高度に精製したハイブリッド第VIII因子を調製するための方法は、以下の工程を有すると記載されている：（ａ）血漿由来ヒト第VIII因子のサブユニットおよび血漿由来動物第VIII因子のサブユニットの単離、続いてヒトおよび動物サブユニットの混合物による凝固因子活性の再構成、続いてイオン交換クロマトグラフィーによるハイブリッドヒト／動物第VIII因子の単離；（ｂ）血漿由来ヒト第VI II因子のドメインまたは部分的ドメインおよび血漿由来動物第VIII因子のドメインまたは部分的ドメインの単離、続いてヒトドメインおよび動物ドメインの混合物による凝固因子活性の再構成、続いてイオン交換クロマトグラフィーによるハイブリッドヒト／動物第VIII因子の単離；（ｃ）組換えDNA技術による動物第VII I因子のドメインまたは部分的ドメインの構築、続いて凝固因子活性を有するハイブリッドヒト／動物第VIII因子を生産するための動物およびヒト第VIII因子の交換；（ｄ）ヒト第VIII因子の特異的アミノ酸残基の、部位特異的突然変異生成により置き換えられたヒトアミノ酸に同一な配列を有する動物第VIII因子アミノ酸残基との置き換えによるハイブリッドヒト／動物第VIII因子の作製；または（ｅ）ヒトまたは動物アミノ酸配列あるいは両方を有するハイブリッド第VIII因子分子の作製、ここで第VIII因子の特異的アミノ酸残基は、部位特異的突然変異による第VIII因子と同一の配列を有さないアミノ酸残基で置き換えられる。ハイブリッド第VIII因子のある種は、ヒト第VIII因子より大きく、かつブタ第 VIII因子と同等かあるいはわずかに高い比活性を有する。ハイブリッド第VIII因子のある種は、ヒトまたはブタ第VIII因子と同等かあるいは低い第VIII因子に対する阻害抗体との免疫反応性を有する。図面の簡単な説明図1Aおよび1Bは、ヒト、マウス、およびブタ第VIII因子A2ドメインのアミノ酸配列の並びであり、ここで残基の番号はヒト第VIII因子の完全長配列（配列番号２）に関して373位から始まる。発明の詳細な説明 −定義別に明細に記述するかまたは指示しなければ、本明細書中で使用する「ハイブリッド第VIII因子」または「ハイブリッドタンパク質」とは、以下を有する任意の機能性第VIII因子タンパク質分子を示す：（１）ヒトおよびブタ（ヒト／ブタ）第VIII因子の両方または他の非ヒト哺乳動物（ヒト／非ブタ哺乳動物）第VIII 因子由来のアミノ酸配列；（２）ブタおよびマウスのような２種の異なる非ヒト哺乳動物種（動物−１／動物−２、ブタ／非ヒト、非ブタ哺乳動物）由来のアミノ酸配列；および（３）第VIII因子に対する公知の配列同一物を有しないアミノ酸配列が置換されるハイブリッド、ヒト、または動物第VIII因子由来のアミノ酸配列。本明細書中で使用する「哺乳動物第VIII因子」は、別に詳細に記述しなければ、任意の非ヒト哺乳動物由来のアミノ酸配列を有する第VIII因子を包含する。本明細書中で使用する「動物」とは、ブタおよび他の非ヒト哺乳動物をいう。ハイブリッドヒト／ブタ第VIII因子は、ヒト第VIII因子アッセイにおいて凝固因子活性を有する。この活性および他のハイブリッド第VIII因子の活性は、血漿由来第VIII因子または組換えヒト第VIII因子のいずれかの活性より低いか、同等であるか、または高くあり得る。ある実施態様において、このハイブリッド第VI II因子は、全ての天然に存在する第VIII因子阻害抗体と交叉反応性でないか、あるいはヒトまたはブタ第VIII因子より交叉反応性でない。このハイブリッド第VIII因子は、以下により作製され得る：（１）単離された血漿由来動物サブユニットまたはヒトサブユニット（重鎖または軽鎖）の、対応するヒトサブユニットまたは動物サブユニットに対する置換；（２）ヒトドメインまたは動物ドメイン（A1、A2、A3、B、C1、およびC2）の、対応する動物ドメインまたはヒトドメインに対する置換；（３）ヒトドメインまたは動物ドメインの一部分の、動物ドメインまたはヒトドメインの一部分に対する置換；（４）１種以上のヒトまたは動物特異的アミノ酸残基の、対応する動物またはヒト特異的アミノ酸残基に対する置換；または（５）ヒト、動物、またはハイブリッド第VI II因子における１種以上の特異的アミノ酸残基の、第VIII因子に対する公知の配列同一物を有しないアミノ酸配列での置換。融合タンパク質は、ハイブリッド遺伝子の産物であり、ここで１種のタンパク質に対するコード配列は、例えば、融合タンパク質をコードするハイブリッド遺伝子を産生する異なる遺伝子からの第２のタンパク質に対するコード配列にタンパク質の一部分を融合することにより広範に変更される。本明細書中で使用するように、融合タンパク質は、本出願に記載するハイブリッドタンパク質のサブセットである。「対応するアミノ酸」とは、別の第VIII因子分子の部位と同一の構造および／または機能を有する第VIII因子分子の部位に存在するアミノ酸であるが、アミノ酸残基番号は同一でなくてもよい。本明細書中で使用する「比活性」とは、ヒト第VIII因子欠損血漿の凝固欠陥を矯正する活性をいう。比活性は、標準アッセイにおいて総第VIII因子タンパク質１ミリグラム当たりのクッロッティング活性のユニットで測定され、ここでヒト第VIII因子欠損血漿のクッロッティング時間は正常なヒト血漿のクッロッティング時間と比較される。第VIII因子活性の１ユニットは、正常なヒト血漿の１ミリリットルに存在する活性である。アッセイにおいて、血餅形成の時間が短くなるほど、アッセイされる第VIII因子の活性が大きくなる。ヒト第VIII因子cDNAヌクレオチド配列を配列番号１に示す。ヒト第VIII因子予想アミノ酸配列を配列番号２に示す。第VIII因子分子において、本明細書中で使用する「ドメイン」とは、内部アミノ酸配列同一物およびトロンビンによるタンパク質分解的切断の部位により定義されるアミノ酸の連続配列である。別に指定しなければ、第VIII因子ドメインは、配列をヒトアミノ酸配列（配列番号２）と並べると、以下のアミノ酸残基を包含する：A1、残基1-372；A2、残基373-740； B、残基741-1648；A3、残基1690-2032；C1、残基2033-2172；C2、残基2173-2332 。A3-C1-C2配列は、残基1690-2332を包含する。残りの配列、残基1649-1689は、通常第VIII因子軽鎖活性化ペプチドという。本明細書中で使用する「部分的ドメイン」とは、ドメインの一部分を含むアミノ酸の連続配列である。本明細書中で使用する「ハイブリッドヒト／動物第VIII因子等価物」または「ハイブリッド第VIII因子等価物」とは、活性第VIII因子分子であり、ここで（１）内因性第VIII因子阻害抗体と免疫反応性であるエピトープを形成するヒト、動物、またはハイブリッド第VIII因子の１種以上の特異的アミノ酸残基は、ヒトまたは動物第VIII因子配列に対する公知の同一物を有さず、かつ内因性第VIII因子阻害抗体と免疫反応性であるエピトープを形成しない１種以上のアミノ酸残基で置換される；および／または（２）凝固因子活性に重要なヒト、動物、またはハイブリッド第VIII因子の１種以上の特異的アミノ酸残基は、凝固因子活性をも有するヒトまたは動物第VIII因子配列に対する公知の同一物を有しない１種以上の特異的アミノ酸残基で置換される。得られるハイブリッド第VIII因子等価分子は、非置換ヒト第VIII因子よりも低い第VIII因子阻害的抗体との反応性を有し、そして凝固因子活性を有する。本明細書中で使用する「第VIII因子欠損」は、欠損第VIII因子の産生、第VIII 因子の不十分な産生または産生しないこと、あるいはインヒビターによる第VIII 因子の部分的または完全な阻害により生じるクッロッティング活性の欠損を包含する。血友病Ａは、Ｘ連関遺伝子の欠陥およびそれがコードする第VIII因子タンパク質の非存在または欠損から生じる第VIII因子欠損のタイプである。本明細書中で使用するヒトまたは動物第VIII因子の「サブユニット」とは、タンパク質の重鎖および軽鎖である。第VIII因子の重鎖は、３つの「ドメイン」A1 、A2、およびBを含む。第VIII因子の軽鎖はまた、３つの「ドメイン」A3、C1、およびC2を含む。本明細書中で使用する「診断アッセイ」とは、ある様式で、医学治療の選択を助けるための試験サンプルに存在する特定の抗体の量を検出および／または定量するために抗原−抗体相互作用を利用するアッセイを包含する。当業者に公知の多数のこのようなアッセイがある。しかし、本明細書中で使用するように、ハイブリッドヒト／動物DNAおよびそれから発現されるタンパク質は、全体または一部が、別の公知のアッセイで対応する試薬を置換し得、それによって改変アッセイが、第VIII因子に対する抗体を検出および／または定量するために用いられ得る。これらの試薬、ハイブリッドヒト／動物DNAおよびそれから発現されるタンパク質あるいはハイブリッドヒト／動物等価第VIII因子DNAおよびそれから発現されるタンパク質を使用すれば、ヒトまたは動物第VIII因子あるいはハイブリッドヒト／動物第VIII因子に対する抗体の検出のための公知のアッセイの改変が可能になる。このようなアッセイは、ELISA、免疫拡散アッセイ、およびイムノブロットを包含するがこれらに限定されない。任意のこれらのアッセイを実施するための適切な方法は、当業者に公知である。本明細書中で使用するように、少なくとも１種のタンパク質のエピトープを含有するハイブリッドヒト／動物または等価第VIII因子あるいはその一部は、診断試薬として使用され得る。本明細書中で使用する用語「エピトープ」、「抗原性部位」、「免疫原性部位」、および「抗原性決定基」は、同義的に使用され、そして抗体により特異的に認識されるハイブリッド第VIII因子タンパク質の部分として定義される。それはアミノ酸残基の任意の数から成り得、そしてそれはタンパク質の一次、二次または三次構造に依存し得る。この開示に従い、少なくとも１種のエピトープを含有する第VIII因子タンパク質または等価物は、診断アッセイにおいて試薬として使用され得る。 −方法の概略ハイブリッドヒト／動物および等価第VIII因子分子（これらのいくつかは、高度に精製したヒト第VIII因子と比較した場合に標準クッロッティングアッセイにおいてより大きな凝固因子活性を有し、そしてこれらのいくつかは、ヒトまたはブタ第VIII因子に対する阻害抗体に対するより低い免疫反応性を有する）は以下のように構築され得る。５つのタイプのハイブリッドヒト／ブタまたは等価第VIII因子分子およびそれらを調製するための方法が、本明細書に開示される：これらは以下により得られる（１）ブタサブユニット（すなわち、重鎖または軽鎖）で、対応するヒトサブユニットを置換すること；（２）１種以上のブタドメイン（すなわち、A1、A2、 A3、B、C1、およびC2）で、対応するヒトドメインを置換すること；（３）１種以上のブタドメインの一部分で、対応する１種以上のヒトドメイン一部分を置換すること；（４）ヒト第VIII因子における１種以上の特異的アミノ酸残基を、ブタ配列からの対応する残基で置換すること；および（５）ヒト、ブタ、またはハイブリッドヒト／ブタ第VIII因子における１種以上の特異的アミノ酸を、第VIII 因子に対する公知の配列同一物を有しない１つまたは複数のアミノ酸残基で置換すること。ヒト第VIII因子アミノ酸配列および非ブタ哺乳動物第VIII因子アミノ酸配列を有する５つのタイプのハイブリッド第VIII因子分子、あるいは第５のカテゴリーにおけるように、ヒト、非ブタ哺乳動物、またはハイブリッド第VIII因子がまた、同様の方法により調製され得る。グループ（１）〜（３）に属する上に挙げたハイブリッドヒト／動物および等価第VIII因子タンパク質は、血漿由来第VIII因子のサブユニット、ドメイン、またはドメインの一部分の単離、続いて再構成および精製により作製される。上記のグループ（３）〜（５）に属する記載のハイブリッドヒト／動物および等価第 VIII因子タンパク質は、組換えDNA方法により作製される。ハイブリッド分子は、以下により詳細に記述するように、種々の領域の起源に依存して、動物配列よりも高いかまたは低いヒト配列のパーセントを含み得る。ブタ重鎖／ヒト軽鎖からなり、そして上に挙げた第１のタイプのハイブリッドに対応するハイブリッドヒト／ブタ第VIII因子が、ヒト第VIII因子と比較して標準クッロッティングアッセイにおいてより大きな比凝固因子活性を有することが以下に示される。凝固因子活性を有するハイブリッドヒト／動物または等価第VI II因子は、その活性がヒト第VIII因子の活性より高いか、同等であるか、または低いかに関わらず、インヒビターを有する患者の処置に有用であり得る。なぜなら、これらのインヒビターは、ヒトまたはブタ第VIII因子のいずれかとよりもハイブリッドヒト／動物または等価第VIII因子とより反応し得ないからである。再構成による単離したヒトおよび動物第VIII因子サブユニットからのハイブリッドヒト／動物第VIII因子分子の調製：ハイブリッドヒト／動物第VIII因子分子が調製および単離され、そしてそれらの凝血促進活性が特徴付けられる。Fay P.J.ら、265 J ．Biol．Chem. 6197(1990 )；およびLollar J.S.ら、263 J ．Biol．Chem. 10451(1988)により報告されている手順から改変した１つの方法は、ヒトおよび動物第VIII因子のサブユニット（重鎖および軽鎖）の単離、続いてヒト重鎖と動物軽鎖との組換えまたはヒト軽鎖と動物重鎖との組換えを包含する。ヒトおよび動物の個々のサブユニットの両方の単離は、カルシウムとエチレンジアミン四酢酸（EDTA）とのキレート化による軽鎖／重鎖二量体の解離と、続く monoS^TMHPLC（Pharmacia-LKB、Piscataway、NJ）を包含する。ハイブリッドヒト／動物第VIII因子分子は、カルシウム存在下で、単離したサブユニットから再構成される。ハイブリッドヒト軽鎖／動物重鎖または動物軽鎖／ヒト重鎖第VIII因子は、Lollar,J.S.ら、71 Blood 137-143(1988)により記載されているようなブタ第VIII因子の単離のための手順により、monoS^TMHPLCにより未反応重鎖から単離される。以下の実施例に詳細に記述されるこれらの方法は、ヒト第VIII因子の凝血促進活性の６倍よりも大きな凝血促進活性を有するハイブリッドヒト軽鎖／ブタ重鎖分子を生じる。他のハイブリッドヒト／非ブタ哺乳動物第VIII因子分子は、同様の方法により調製、単離、および活性に関して特徴付けられ得る。再構成による単離したヒトおよび動物第VIII因子ドメインからのハイブリッドヒト／動物第VIII因子分子の調製：ドメイン置換を有するハイブリッドヒト／動物第VIII因子分子が、調製および単離され、そしてそれらの凝血促進活性が特徴付けられる。１つの方法は、Loll ar P.ら、267(33)J ．Biol．Chem. 23652-23657（1992年11月25日）により記載されているように、ヒト第VIII因子の１種以上のドメインおよび動物第VIII因子の１種以上のドメインの単離、続いて凝固因子活性を有するハイブリッドヒト／動物第VIII因子を形成するためのヒトおよび動物ドメインの組換えを包含する。血漿由来動物およびヒトA1/A3-C1-C2二量体は、NaOH存在下で第VIII因子aからのA2ドメインの解離により単離され、この後、混合物は希釈され、そして二量体はmonoS^TMHPLC（Pharmacia-LKB、Piscataway、NJ）を用いて溶出される。A2ドメインは、monoS^TMHPLCにおける副成分として第VIIIa因子から単離される。ハイブリッドヒト／動物第VIII因子分子は、等量の１つの種のA2ドメインと他の種のA1 /A3-C1-C2二量体との混合により再構成される。１種以上のドメイン置換を有するハイブリッド第VIII因子は、J.S.Lollarら、71 Blood 137-143(1988)により記載されているようなブタ第VIII因子の単離のための手順により、monoS^TMHPLCにより未反応二量体とA2ドメインとの混合物から単離される。以下の実施例に詳細に記載されるこれらの方法は、凝血促進活性を有するハイブリッド第VIII因子分子を生じる。ヒト、動物、およびハイブリッド第VIII因子サブユニット、ドメイン、またはドメインの一部分をコードする配列の組換え操作によるハイブリッド第VIII因子分子の調製：サブユニット、ドメイン、ドメインの一部分の置換：ヒト第VIII因子遺伝子が、Toole,J.J.ら、312 Nature 342-347(1984)（Geneti cs Institute）；Gitschier,J.ら、312 Nature 326-330(1984)（Genentech）；W ood,W.I.ら、312 Nature 330-337(1984)（Genentech）；Vehar,G.A.ら、312 Nat ure 337-342(1984)（Genentech）により報告されているように、哺乳動物細胞中で単離および発現され、そしてアミノ酸配列がcDNAから推測された。Caponらの米国特許第4,965,199号は、哺乳動物宿主細胞での第VIII因子の産生およびヒト第VIII因子の精製のための組換えDNA方法を開示している。CHO（チャイニーズハムスターの卵巣）細胞およびBHKC（ベビーハムスター腎臓細胞）における第VIII 因子の発現が報告されている。ヒト第VIII因子をコードするcDNA配列および予想アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１および配列番号２に示される。組換えハイブリッド第VIII因子が調製され、これはドメインA1-A2-A3-C1-C2に対応する第VIII因子配列をコードするヒトcDNA（Biogen，Inc.）から始まる。このcDNAによりコードされる第VIII因子は、完全なBドメインを欠いており、そしてWoodら、312 Nature 330-337(1984)の番号付けシステムに従って、単鎖ヒト第 VIII因子（配列番号２を参照のこと）のアミノ酸残基1-740および1649-2332に対応する。Bドメインは、生物学的機能のために必要でないようなので、欠失される。ブタ第VIII因子は、血漿から単離および精製されている（Fass,D.N.ら、59 Bl ood 594(1982)）。Bのアミノ酸配列およびブタ第VIII因子のA2ドメインの一部分は、Toole,J.J.ら、83 Proc ．Nat'l．Acad．Sci．U.S.A. 5939-5942(1986)により報告されている。ブタおよびヒト第VIII因子の両方とも、２つのサブユニットタンパク質として血漿から単離される。重鎖および軽鎖として知られているサブユニットは、カルシウムまたは他の２価金属イオンを必要とする非共有結合により結合される。第 VIII因子の重鎖は、３つのドメイン、A1、A2、およびBを含み、これらは共有的に結合される。第VIII因子の軽鎖もまた、３つのドメイン（A3、C1、およびC2と示される）を含む。Bドメインは、公知の機能を有さず、そして第VIII因子の任意の測定可能なパラメーターを有意に変更することなく、分子からタンパク質分解的に、または組換えDNA技術の方法により除去され得る。ヒト組換え第VIII因子は、血漿由来第VIII因子と同様の構造および機能を有するが、哺乳動物細胞中で発現されない限りグリコシル化されない。ヒトおよびブタ活性化第VIII因子（第VIIIa因子）の両方とも、A1ドメインとA 2ドメインとの間の重鎖の切断による３つのサブユニットを有する。この構造は、 A1/A2/A3-C1-C2で示される。ヒト第VIIIa因子は、ブタ第VIIIa因子を安定化する条件下で安定でない。これは、ヒト第VIIIa因子のA2サブユニットのより弱い会合のためである。ヒトおよびブタ第VIIIa因子のA2サブユニットの解離は、第VII Ia因子分子における活性の損失に関連する。成熟ヒト第VIII因子において、配列番号１の残基373-740に対する配列同一物を有するブタ第VIII因子cDNAの完全なA2ドメイン（配列番号３）が配列決定された。予想アミノ酸配列を配列番号４に示す。ブタ第VIII因子のA2およびBドメインのみが完全に配列決定されたが、ブタ第V III因子分子の残りは、完全長ハイブリッドが構築され得るように、Current Pro tocols in Molecular Biology 、F.M.Ausubelら編（1991）中のWeis J.H.、「組換えDNAライブラリーの構築」に記載されているような標準クローニング技術により配列決定され得る。ブタまたはヒト第VIII因子cDNAの個々のサブユニット、ドメイン、またはドメインの一部分は、クローン化され得、そして確立された変異誘発技術により、対応するヒトまたはブタサブユニット、ドメイン、あるいはドメインの一部分を置換し得る。例えば、Lubin,I.M.ら、269(12)J ．Biol．Chem. 8639-8641（1994年３月）は、ブタA2ドメインでヒトドメインを置換するための技術を記載している。これらのハイブリッド第VIII因子cDNA分子は、Current Protocols in Molecul ar Biology 、F.M.Ausubelら編（1991）中のSelden,R.F.ら、「哺乳動物細胞への DNAの導入」により記載されているような確立された技術により、活性ハイブリッドヒト／ブタ第VIII因子タンパク質分子の最後の発現のための発現ベクターにクローン化され得る。好適な実施態様において、第VIII因子をコードするハイブリッドヒト／ブタcD NA（ここでブタ配列は、ドメインまたは部分ドメイン、このようなA2ドメインまたは部分ドメインをコードする）は、リポソーム仲介トランスフェクション（Li pofectin^TM、Life Technologies、Inc.）のような当該分野でルーチンの方法を用いて、ReNeoのような哺乳動物発現ベクターに挿入され、ベビーハムスター腎臓細胞のような培養中の細胞を安定にトランスフェクトするために使用される構築物を形成する。組換えハイブリッド第VIII因子タンパク質の発現は、例えば、配列決定、ノーザンブロッティングおよびウエスタンブロッティング、あるいはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により確認され得る。培養培地中のハイブリッド第VIII因子タンパク質（ここでタンパク質を発現するトランスフェクトされた細胞は維持される）は、沈澱され、ペレットにされ、洗浄され、適切な緩衝液中に再懸濁され得、そして組換えハイブリッド第VIII因子タンパク質が、免疫アフィニティークロマトグラフィーを包含する標準技術により精製され得る。１つの実施態様において、第VIII因子は、組換え分子から融合タンパク質として発現され、ここで安定性、分泌、欠失、または単離を増強するタンパク質をコードする分子は、第VIII因子コード配列に隣接する位置に挿入される。精製したハイブリッド第VIII因子は、例えば、無血漿第VIII因子アッセイ、１段階クッロッティングアッセイ、および精製した組換えヒト第VIII因子を標準として用いる酵素結合免疫吸着測定法を包含する標準的なアッセイにより、免疫反応性および凝固因子活性についてアッセイされ得る。プラスミドおよび真核ウィルスベクターの両方を含有する他のベクターは、当業者の選択および判断に従って、真核細胞中で組換え遺伝子構築物を発現するために使用され得る（例えば、Sambrookら、16章を参照のこと）。細菌、酵母、および昆虫細胞系を包含する他のベクターおよび発現系が使用され得るが、グリコシル化における相違またはグリコシル化の欠落のため好ましくない。組換えハイブリッド第VIII因子タンパク質は、培養および組換え哺乳動物タンパク質発現のために一般に使用される種々の細胞中に発現され得る。アメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection）、Rockvi lle，MDから入手可能な好適な細胞株は、ベビーハムスター腎臓細胞であり、これはルーチンの手順および培地を用いて培養される。同様の方法が、ヒト／非ブタ哺乳動物のような他の組換えハイブリッド第VIII 因子タンパク質を調製するために使用され得る。公知のヒトDNA配列からのプライマーから始めて、マウスおよびブタ第VIII因子cDNAの一部分がクローン化されている。ハイブリッドヒト／動物第VIII因子分子を調製するのに使用するための他の種の第VIII因子配列は、公知のヒトDNA配列を開始点として用いて得られ得る。利用され得る他の技術は、動物組織DNAを用いるPCR増幅方法、および第VIII 因子配列をクローン化するための動物からのcDNAライブラリーの使用を包含する。例として、ハイブリッドヒト／マウス第VIII因子タンパク質は、以下のように作製され得る。ヒト第VIII因子遺伝子のマウス相同体に対応するDNAクローンを、単離および配列決定し、そしてマウス第VIII因子のアミノ酸配列を、Elder G. 、ら、16(2)Genomics 374-379（1993年５月）（これはマウス、ヒト、およびブタ第VIII因子分子の一部分の予想アミノ酸配列の比較も包含する）に記載のように予想した。マウス第VIII因子cDNA配列および予想アミノ酸配列を、それぞれ配列番号５および配列番号８に示す。好適な実施態様において、Sarkar G.およびS .S.Sommer、244 Science 331-334(1989)に記載の転写物配列決定方法を用いるRN A増幅法（RNA amplification with transcript sequencing（RAWTS））が使用され得る。簡潔には、工程は（１）オリゴ（dT）またはmRNA特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いるcDNA合成；（２）ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、ここで一方または両方のオリゴヌクレオチドは、増幅しようとする領域に相補的な配列に結合したファージプロモーターを含む；（３）ファージプロモーターを用いる転写；および（４）転写物の逆転写酵素仲介ジデオキシ配列決定（これはネスト（内部）オリゴヌクレオチドでプライム（prime）される）である。配列情報を示すことに加えて、この方法は、翻訳開始シグナルを適切なPCRプライマーに組み込むことによりインビトロでの翻訳産物を生成し得；そして他の種からの新規mRNA配列情報を得るために使用され得る。１つまたは複数のアミノ酸の置換： A2ドメインは、第VIII因子分子の凝血促進活性のために必要である。Lollar,P .ら、267 J ．Biol．Chem. 23652-23657(1992)に従って、ヒト第VIII因子とブタ第VIII因子との間の凝固因子活性の相違は、A2ドメインにおける１種以上の残基間のアミノ酸配列の相違に基づくようである。さらに、ヒト第VIII因子分子におけるA2およびC2ドメインは、Hoyer L.W.およびD.Scandella、31 Semin ．Hematol . 1-5(1994)に従うと、全てではないとしても、ほとんどの阻害抗体が反応するエピトープを有すると考えられる。組換えハイブリッド第VIII因子分子は、動物A2 、C2、および／または他のドメインからのアミノ酸配列のヒト第VIII因子への置換、あるいはヒトA2、C2、および／または他のドメインからのアミノ酸配列の動物第 VIII因子への置換により作製され得、動物分子とヒト分子との間で異なるいずれかの場合のアミノ酸配列を選択する。ハイブリッド分子も作製され得、ここで１より多い動物からのアミノ酸配列がヒト第VIII因子分子内で置換されるか、もしくはヒトおよび他の動物アミノ酸配列が動物第VIII因子分子に挿入される。ハイブリッド等価分子も作製され得、ここでヒト、動物、またはハイブリッド第VIII 因子が、第VIII因子に対する公知の配列同一物を有しない１種以上のアミノ酸を含む。次いで、これらのハイブリッド分子は、増強された凝固因子活性および／または減少した抗体免疫反応性を有するハイブリッド第VIII因子分子を同定するために、凝固因子活性に関して、および第VIII因子に対する阻害抗体との反応性に関して、標準的手順によりアッセイされ得る。ヒトと比較して減少した凝固因子活性を有するが、まだ減少した抗体反応性を有するハイブリッド分子も同定され得る。アミノ酸の置換を有するハイブリッドヒト／ブタ第VIII因子を調製するための本明細書に記載される方法は、組換えハイブリッドヒト／非ブタ哺乳動物第VIII因子タンパク質、およびアミノ酸配列置換を有するハイブリッド動物−１／動物−２第VIII因子を調製するために使用され得る。改変された凝固因子活性を有するハイブリッド第VIII因子分子ハイブリッドヒト／ブタ第VIII因子が調製され得、ここで、A2ドメインにおける、プロ凝固因子活性を有するヒト第VIII因子のアミノ酸配列が、同様にプロ凝固因子活性を有する対応するブタアミノ酸配列で置換される。置換される配列は、以下のように選択および調製される。ヒトおよびブタのA2ドメインは共に368 残基(それぞれ、配列番号２および６)を有する。図1A〜1B(ヒトおよびブタ第VII I因子のA2ドメインのアミノ酸配列(残基の番号付けはヒト第VIII因子の全長アミノ酸配列(配列番号２)に対して373位で開始する)の並置を比較する)に示されるように、これらの残基の50個は異なっており、そして318個は同一である；すなわち、ヒトおよびブタ第VIII因子のA2ドメインが並置されるとき、86％の配列同一性がある。従って、数が大量ではあるが有限である組み合わせが存在し、この組み合わせは、50の異なる残基に基づいて、増強した凝固因子活性を有するハイブリッドヒト／ブタ第VIII因子分子を生じる。ハイブリッドヒト／ブタ第VIII因子分子を調製するため、変異誘発のための最初の標的候補物(これらは、ヒトA2ドメイン内において、ヒトおよびブタのA2アミノ酸配列(それぞれ、配列番号２および６)の比較により示された)を表Ｉに示す。表Ｉおよび図1A〜1Bの太字は、このA2ドメインの17％のみを構成するが、ヒトおよびブタA2ドメインの間で70％の配列相違を含むヒトおよびブタのA2ドメインアミノ酸配列(それぞれ、配列番号２および６)の７つの配列を示す。ハイブリッドは、配列相違に基づいてブタの配列を選択し、そしてこれをヒトA2ドメインに置換することにより作成される。特異的変異誘発技術が、凝固因子活性(この活性は、ヒト第VIII因子に比べて、高いか、等しいかまたは低いものであり得るが、好ましくは高い)を有するハイブリッドタンパク質を同定するために使用される。特定のヒト配列をブタ配列で、好ましくは、Ho，S.N.ら、77 Gene 51-59(1994)ならびに実施例７および８に記載されているようにオーバーラップ伸長法によるスプライシング(SOE)を用いて置換する。他の実施態様では、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発が、ヒト A2ドメイン部分のアミノ酸配列をループアウトするために行われたように使用され得る(実施例７を参照)。これらのハイブリッドの機能的分析が凝固因子活性を明らかにすると、その配列はさらに、標準部位特異的変異誘発技術を用いる点変異分析により、プロ凝固因子配列について詳細に分析され、そしてマッピングされ得る。A2ドメインにおけるアミノ酸配列置換を実施例７および８に記載する。低下した免疫反応性を有するハイブリッド第VIII因子分子先の章に記載されている、第VIII因子分子中のアミノ酸の置換に関するアプローチが、A2、C2、および／または他のドメインの１つまたはそれ以上の、阻害性抗体が特異的である重要な領域を同定し、そして実施例８に示されているように、ヒト第VIII因子における１つまたはそれ以上のエピトープを対応するブタアミノ酸配列で置換することにより、免疫反応性を有しないかまたは免疫反応性が低下した効果的なプロ凝固因子ハイブリッド分子を調製するために使用され得る。通常、ブタ第VIII因子は、阻害性抗体とは限定的に反応するか、または反応しない。ヒト第VIII因子に対する阻害性抗体の90％以上は、A2またはC2ドメインのいずれかまたはその両方に特異的である。A2ドメインにおけるアミノ酸置換に基づく阻害性抗体との反応性を有しないかまたは反応性が低下したハイブリッドヒト／ブタ第VIII因子分子は、以下のように調製される。ブタA2ドメインを、上記ならびに実施例６、７および８に記載されている標準クローニング技術によりクローン化し、続いて、通常の手順を用いて切断し、そしてA2ドメイン内にスプライシングする(例えば、制限部位の使用によるcDNAの切断またはオーバーラップ伸長によるスプライシング(SOE))。生じた公知のブタアミノ酸配列の構築物をヒトA2ドメイン中に置換して、ハイブリッド第VIII因子構築物を形成する。この構築物は、上記のように、哺乳動物の発現ベクター(好ましくはReNeo)に挿入され、培養細胞(好ましくは、ベビーハムスター腎臓細胞)に安定にトランスフェクトされ、そして発現される。ハイブリッド第VIII因子は、通常のベセスダアッセイにより、または血漿を含有しない染色基質アッセイにより、例えば、抗A2抗体との免疫反応性についてアッセイされる。ベセスダ単位(BU)は、インヒビター力価を測定するための標準方法である。ハイブリッドにおいてベセスダ力価が測定不能である場合(＜0.7BU/mg IgG)、置換された対応するブタ配列の領域において、ヒトA2エピトープは除去されていた。このエピトープは漸次的に縮小され、このようにして、特異的なA2エピトープが決定され得て、できるだけ少ないブタ配列を有するハイブリッドヒト／ブタ分子を生成する。 C2または他のドメインにおけるアミノ酸配列の置換に基づく、阻害性抗体との反応性を有しないかまたは低下した反応性を有するハイブリッドヒト／ブタ第VI II因子分子は、A2ドメインにおいて置換させるかまたは置換させずに調製され得る。これらの手順は、A2ドメインにおけるアミノ酸置換について本明細書中に記載されている手順と同じであり得るかまたは類似し得る。これらの手順には、例えば、RT-PCRを用いることにより、またはブタ肝臓cDNAライブラリーをヒトC2ドメインDNAまたは他のドメインDNAでプローブすることにより、ブタC2または他のドメインをクローニングすること；制限部位技術および／または連続的なSOEによりC2ドメインまたは他のドメインにおいてエピトープをマッピングし、そして同時にエピトープを置換すること；培養細胞での発現；および免疫反応性についての通常のアッセイが包含される。アッセイのために、C2ドメインに特異的な抗体(例えば、Scandella，Dら、Thromb ．Haemostasis 67:665-671(1992)およびLub inら、(1994)に記載されている阻害性自己抗体IgG)が、例えば、Dorothea Scand ella博士，American Red Cross，Rockville，MDから入手し得る。このC2ドメインは、アミノ酸残基2173-2332(配列番号２)からなる。この154アミノ酸領域内で、インヒビター活性は、Shima，M.ら、69 Thromb ．Haemostas. 2 40-246(1993)によれば、残基2248および2312の間の65アミノ酸領域に特異的であるようである。ヒトおよびブタ第VIII因子のC2配列は、この領域で約85％が同一であれば、第VIII因子の機能的活性領域の他の場所と同様に、ヒトおよびブタの第VIII因子C2アミノ酸配列間には約10個の相違があり、これらの相違は、ハイブリッドを置換C2配列で構築するための最初の標的として使用され得る。臨床的に有意な第VIII因子エピトープはA2およびC2ドメインに制限されると思われる。しかし、第VIII因子の他の領域(A1、A3、Bまたはc1ドメイン)に対する抗体が同定されれば、これらは、同じアプローチでハイブリッドヒト／ブタ第VI II因子分子を用いることにより、マッピングおよび除去され得る。ヒトおよび非ブタ哺乳動物の第VIII因子アミノ酸配列を用いるハイブリッド第VIII因子分子の調製特定のアミノ酸の置換を有するハイブリッドヒト／ブタ第VIII因子を調製するために使用される方法は、組換えハイブリッドヒト／非ブタ哺乳動物第VIII因子タンパク質を調製するために使用され得る。この組換えハイブリッドヒト／非ブタ哺乳動物第VIII因子タンパク質は、ヒト第VIII因子に比べて、A2、C2、および／または他のドメイン内の１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換に基づいて、改変されたまたは同じ凝固因子活性および／または等しいまたは低下した免疫反応性を有する。アミノ酸配列同一性の同様の比較が、ヒトおよび他の非ブタ哺乳動物の第VIII 因子タンパク質の間で行われ、プロ凝固因子活性および抗A2および抗C2免疫反応性または他のドメインの免疫反応性が存在するアミノ酸配列を決定し得る。続いて、類似の方法が、他のハイブリッドヒト／動物第VIII因子分子を調製するために使用され得る。上記のように、各ハイブリッドの機能的な分析は、阻害性抗体に対する低下した反応性および／または増加した凝固因子活性を有するものを明らかにし、そしてその配列は点変異分析によりさらに詳細に分析され得る。例えば、ハイブリッドヒト／マウス第VIII分子は上記のように調製され得る。ヒトA2ドメイン(配列番号２)およびマウスA2ドメイン(配列番号６)のアミノ酸配列並置を図1A〜1Bに示す。Elderらにより報告されているように、マウスcDNA(配列番号５)によりコードされる第VIII因子タンパク質は、2319アミノ酸を有し、そのうち、ヒト配列(配列番号２)の全体に対して74％の配列同一性があり(この比較からBドメインを排除する場合は、87％が同一である)、そしてヒト第VIII因子よりも32アミノ酸短い。マウスAおよびCドメイン(配列番号６)中のアミノ酸配列は、高度に保持され、ヒト配列(配列番号２)に対して84〜93％の配列同一性を有し、一方、Ｂドメインおよび２つ短い酸性ドメインは42〜70％の配列同一性を有する。特に、A1、A2、およびA3マウスアミノ酸配列(配列番号６)は、対応するヒトアミノ酸配列(配列番号２)とは85％、85％、および90％同一である。C1およびC2マウスアミノ酸配列は、対応するヒトアミノ酸配列と93％および84％同一である。推定マウス第VIII因子のアミノ酸配列(配列番号６)では、A1、A2、および A3ドメインは、番号付け目的のためにアミノ酸配列同一性を用いて、それぞれ、アミノ酸1〜330位、380〜711位、および1664〜1987位を含む。トロンビン／第Xa因子および1つを除いて全ての活性化プロテインC切断部位がマウス第VIII因子に保持されている。フォンビルブランド因子結合のためのチロシン残基もまた保持されている。 Elderらによれは、マウス第VIII因子のヌクレオチド配列(配列番号５)は7519 塩基を含有し、そしてヒトヌクレオチド配列(配列番号１)とは全体で67％の同一性を有する。マウスのコード配列の6957塩基対はヒト第VIII因子中のコード配列の7053塩基対とは82％の配列同一性を有する。Bドメインがこの比較に含まれない場合、88％のヌクレオチド配列同一性がある。 Elderらは、ヒトおよびマウス第VIII因子分子が全体で74％同一であること、および改変される場合に血友病をもたらすヒト残基の95％がマウスにおいて同一であることを報告している。これらのデータは、ブタ第VIII因子分子における凝固因子活性および／または抗体への免疫反応性を有するアミノ酸配列を同定するために使用される同じ技術を、マウスまたは他の動物の第VIII因子に対し、同様のアミノ酸配列を同定してハイブリッド分子を調製することに応用できることを裏付ける。他の実施態様では、ヒト血漿がブタ第VIII因子と反応する交差反応性は、ハイブリッドブタ／動物第VIII因子の調製により減少され得る。まず、通常のベセスダアッセイおよび標準として特定の哺乳動物血漿を用いて、ヒトA2特異的インヒビターが他の哺乳動物由来の第VIII因子と反応するかどうかを決定する。インヒビター力価は通常、血漿において測定されるため、精製された動物第VIII因子は必要ではない。A2インヒビターがその配列が公知の動物第VIII因子(例えば、マウス第VIII因子)と反応しない場合、対応する動物の配列は、ヒト／ブタハイブリッドを用いることにより同定されるように、ブタエピトープ領域中に置換され得る。一旦動物の配列が知られると、部位特異的変異誘発技術(例えば、Kunkel, T.A.ら、204 Meth ．Enzymol. 125〜139(1991)に記載の、オリゴヌクレオチド介在変異誘発)は、ハイブリッドブタ／動物第VIII因子分子を調製するために使用され得る。他の動物血漿が、A2インヒビターとの反応性がマウスまたはブタの第 VIII因子よりも低い場合、ブタエピトープに対応する動物配列は、通常の手順（例えば、RT-PCR）および部位特異的変異誘発により構築されたハイブリッドヒト／動物またはブタ／動物第VIII因子により決定され得る。また、１種またはそれ以上の他の動物に由来の対応するアミノ酸配列置換を有する、ハイブリッドヒト／動物またはブタ／非ブタ哺乳動物第VIII因子もまた調製され得る。臨床的に有意なエピトープを同定した後、組換えハイブリッド第VIII因子分子が発現され、この分子は、インヒビター血漿の広範な調査に対してインビトロで試験されるとき、ヒト第VIII因子より低い交差反応性またはこれに等しい交差反応性を有する。好ましくは、これらの分子は、これらのドメイン内の免疫反応性のアミノ酸配列がブタまたは他の動物配列で置換される混合A2／C2ハイブリッドである。これらの領域のさらなる変異誘発は交差反応性を低減するために行われ得る。低減された交差反応性は、好ましいが、存在するブタ第VIII因子濃縮物以上の利点を有し得る産物を産生するためには必要はない。この濃縮物は、汚染ブタタンパク質に起因する副作用を生じ、そしてブタ第VIII因子配列の免疫原性に起因する望ましくない効果を生じ得る。ハイブリッドヒト／動物またはブタ／動物の第VIII因子分子は外来のブタタンパク質を含有しない。さらに、ブタA2ドメインにおいて達成された広範なエピトープマッピングは、治療的ハイブリッドヒト／ブタ第VIII因子配列の95％より多くがヒトであることを示す。ハイブリッドヒト／動物またはブタ／動物第VIII因子の等価物の調製：上記および実施例に記載の方法はまた、プロ凝固因子ハイブリッドヒト／動物、非ブタの動物-1／動物-2またはブタ／非ブタ哺乳動物第VIII因子等価分子を調製するために使用され得る。ヒトまたは動物第VIII因子あるいはハイブリッド第 VIII因子における、内因性第VIII因子阻害性抗体と免疫反応性である抗原性部位として機能する１つまたはそれ以上の特定のアミノ酸残基は、記載されているようにして同定され得、続いて、ヒトまたは動物第VIII因子配列に公知の同一性を有さず、かつ内因性第VIII因子阻害性抗体と免疫反応性の抗原性部位を形成しない１つまたはそれ以上の特定のアミノ酸残基で置換され得る。１つまたはそれ以上の抗原性部位は置換されて、活性なハイブリッド第VIII因子等価分子を形成し得る。得られた活性ハイブリッド第VIII因子等価分子は、非置換型ヒトまたは動物あるいはハイブリッドヒト／動物第VIII因子に比べて、第VIII因子阻害性抗体とは同等またはより低い反応性を有する。あるいは、またはさらに、活性ハイブリッド第VIII因子等価分子は、上記および実施例に記載の方法を用いて調製され得、ここで、ヒトまたは動物第VIII因子あるいはハイブリッドヒト／動物第VIII因子中の、凝固因子活性に重要な１つまたはそれ以上の特定のアミノ酸残基は分子が、記載されているようにして同定され得、続いて、同様に凝固因子活性を与えるヒトまたは動物第VIII因子配列に対し公知の同一性を有さない１つまたはそれ以上のアミノ酸残基で置換され得る。凝固因子活性を有する１つまたはそれ以上の特定のアミノ酸残基は置換されて、活性なハイブリッド第VIII因子等価分子を形成し得る。生じたプロ凝固因子ハイブリッド第VIII因子等価分子は、非置換型の第VIII因子分子の凝固因子活性より低い、等しい、またはより大きい凝固因子活性を有する。好ましくは、このハイブリッド第VIII因子等価分子は、ヒト第VIII因子の凝固因子活性より優れた凝固因子活性を有する。ヒトまたは動物の第VIII因子あるいはハイブリッドヒト／動物第VIII因子において凝固因子活性および／または抗原性活性に重要なアミノ酸の配列を置換し得る適切な特定のアミノ酸残基には、凝固因子活性を有するおよび／または内因性阻害性抗体との反応性が第VIII因子より低いまたは等しい動物またはヒト第VIII 因子アミノ酸配列と配列同一性を有さない任意の特定のアミノ酸が包含される。ハイブリッド第VIII因子等価分子は、凝固因子活性のための１つまたはそれ以上の特定のアミノ酸配列および／または抗原性部位のための１つまたはそれ以上の特定のアミノ酸配列の置換を有し得る。本明細書中に記載のハイブリッド第VI II因子等価分子はまた、凝固因子活性または抗原性活性には重要ではないアミノ酸残基が動物第VIII因子配列と公知の同一性を有さないアミノ酸残基で置換されている分子を含む。１実施態様では、ハイブリッド第VIII因子等価分子、好ましくはハイブリッドヒト／ブタ分子が調製され得、ここで、インヒビター血漿との交差反応性が以下のように低減される。１つまたはそれ以上のエピトープが上記のようにして同定され、続いて、例えば、Cunningham，B.C.およびJ.A．Wells，244 Science 1081 -1085(1989)に記載のアラニンスキャンニング変異誘発方法を用いてアラニン残基により置換される。ヒトA2エピトープは、実施例８に記載のように、26またはより少ないアミノ酸に限定されているため、アラニンスキャンニング変異誘発は、限定された数のハイブリッドタンパク質において行われて、A2アミノ酸置換に基づき、どれが活性で、非交差反応性のハイブリッド第VIII因子であるかを決定し得る。 −診断アッセイハイブリッドヒト／動物または等価の第VIII因子cDNAおよび／またはこれらから発現されたタンパク質は、全体またはその一部で、基質(例えば、第VIII因子欠損ヒト患者からの血清試料および体液を含む)におけるヒトまたは動物第VIII 因子あるいはハイブリッドヒト／動物第VIII因子に対する阻害性抗体を検出するための診断試薬として、アッセイにおいて使用され得る。これらの抗体アッセイには、例えば、ELISAアッセイ、免疫ブロット法、放射免疫アッセイ、免疫拡散アッセイ、および第VIII因子の生物学的活性(例えば、凝固アッセイによる)アッセイのようなアッセイが挙げられる。これらの試薬を調製するための技術およびこれらを使用するための方法は当業者に公知である。例えば、患者の血清試料中の阻害性抗体を検出するための免疫アッセイは、この試験試料を、充分量の、少なくとも１つの抗原性部位を含有するハイブリッドヒト／動物第VIII因子と反応させる工程を包含し得、ここで、この量は、試料中の阻害性抗体と共に検出可能な複合体を形成するのに充分な量である。核酸およびアミノ酸プローブは、ハイブリッドヒト／動物第VIII因子分子の配列に基づいて調製され得る。これらは、市販されている染料、あるいは酵素標識、蛍光標識、化学発光標識、または放射性標識を用いて標識され得る。アミノ酸プローブは、例えば、ヒト、動物、またはハイブリッドヒト／動物第VIII因子に対するインヒビターの存在が疑われる血清または他の体液をスクリーンするために使用され得る。インヒビターのレベルは患者において定量され、健常コントロールと比較され得、そして例えば、第VIII因子欠損患者がハイブリッドヒト／動物第VIII因子で処置され得るかどうかを決定するために使用され得る。 −薬学的組成物ハイブリッドヒト／動物、ブタ／非ブタ哺乳動物、動物-1／動物-2、またはヒト／動物等価第VIII因子を単独でまたは適切な薬学的安定化化合物、送達ビヒクル、および／またはキャリアビヒクルと合わせて含有する薬学的組成物が、E．W ．MartinによるRemington's Pharmaceutical Scienceに記載されているような公知の方法に従って調製される。１つの好適な実施態様では、静脈注入用の好ましいキャリアビヒクルまたは送達ビヒクルは、生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水である。他の好適な実施態様では、適切な安定化化合物、送達ビヒクル、およびキャリアビヒクルには、他のヒトまたは動物タンパク質(例えば、アルブミン)が包含されるが、これらに限定されない。リン脂質ビヒクルまたはリポソーム懸濁液もまた、薬学的に受容可能なキャリアまたは送達ビヒクルとして好適である。これらは、当業者に公知の方法に従って調製され得、そして例えば、ホスファチジルセリン／−ホスファチジルコリンまたは他のリン脂質または界面活性剤の組成物(一緒になって表面に負電荷を与える)を含有し得る。なぜなら、第VIII因子は負に荷電したリン脂質膜に結合するからである。リポソームは、適切な脂質(例えば、ステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ステアロイルホスファチジルコリン、アラカドイルホスファチジルコリン、およびコレステロール)を無機溶媒に溶解させることにより調製され得、続いて溶媒を蒸発させると、後に乾燥脂質の薄膜が容器の表面上に残る。続いて、ハイブリッド第VIII因子の水溶液をこの容器に導入する。続いて、容器を手で振とう攪拌し、脂質物質を容器の側壁から遊離させ、そして脂質凝集体を分散させ、それにより、リポソーム懸濁液を形成する。ハイブリッド第VIII因子は、ビタミンK依存性凝血因子、組織因子、およびフォンビルブランド因子(vWf)または第VIII因子結合部位を含有するvWfのフラグメント、および多糖類(例えば、スクロース)を含む、他の適切な安定化化合物、送達ビヒクル、および／またはキャリアビヒクルと組み合わされ得る。ハイブリッド第VIII因子はまた、ヒト第VIII因子が送達され得る方法と同じ方法で、レトロウイルスベクターのような送達手段を用いて、遺伝子治療により送達され得る。この方法は、第VIII因子cDNAを、第VIII因子欠損患者に直接移植されるか、あるいは第VIII因子に対し透過可能であり、細胞に対し透過不可能である、続いて移植されるインプラント可能なデバイスに置かれるヒト細胞に取り込むことからなる。好ましい方法は、レトロウイルス仲介遺伝子導入である。この方法では、外因性遺伝子(例えば、第VIII因子cDNA)が、改変されたレトロウイルスのゲノム中にクローン化される。この遺伝子は、そのゲノムが細胞により発現されるウイルス機構により、宿主細胞のゲノムに挿入される。レトロウイルスベクターがウイルスを産生しないように改変され、それにより、宿主のウイルス感染を防ぐ。このタイプの治療の一般的原則は、当業者に公知であり、文献(例えば、Kohn，D.B.およびP.W．Kantoff，29 Transfusion 812-820，1989)に概説されている。ハイブリッド第VIII因子は、vWfに結合されて貯蔵され、ハイブリッド分子の半減期および保存期(shelf-life)を増大させ得る。さらに、第VIII因子の凍結乾燥は、vWfの存在下の活性分子の収率を向上させ得る。販売業者により使用されるヒトおよび動物の第VIII因子を貯蔵する現在の方法は、ハイブリッド第VIII因子を貯蔵するために利用され得る。これらの方法は、以下を包含する：(1)部分的に精製した状態で(さらに精製することなく注入される第VIII因子の「濃縮物」として)第VIII因子の凍結乾燥；(2)チンマーマン方法およびアルブミン(これが第VIII因子を安定化させる)の存在下での凍結乾燥による第VIII因子の免疫アフィニティー精製；(3)アルブミンの存在下での組換え第VIII因子の凍結乾燥。さらに、ハイブリッド第VIII因子は、４℃で、pH６の0.6M NaCl、20mM MES、および５mM CaCl₂中で無限に安定であり、同様にこれらの緩衝液中で冷凍貯蔵され、そして活性の損失を最低限にして融解され得る。 −処置の方法ハイブリッド第VIII因子は、阻害性抗体を有するかまたは有しない血友病者、あるいは阻害性抗体の発達に起因する後天性第VIII因子欠損の患者において、第 VIII因子欠損に起因するコントロールされない出血(例えば、関節内、頭蓋内、または胃腸出血)を処置するために使用される。活性物質は、好ましくは、静脈内に投与される。さらに、ハイブリッド第VIII因子は、上記のように、ハイブリッドを産生するように遺伝子操作された細胞の移植により、またはこのような細胞を含有するデバイスのインプラントにより投与され得る。好ましい実施態様では、ハイブリッド第VIII因子単独または安定剤、送達ビヒクル、および／またはキャリアと組み合わせた薬学的組成物は、ヒトまたは動物第VIII因子の注入のために使用されるのと同じ手順に従って、患者の静脈内に注入される。このような処置を必要とする患者に投与されなければならないハイブリッド第 VIII因子組成物の処置投与量は、第VIII因子欠損の重篤度に依存して変化する。一般に、投与量レベルが、各患者の出血エピソードの重篤度および期間に合わせた頻度、期間、および単位で調整される。従って、ハイブリッド第VIII因子は、標準クロッティングアッセイにより測定されるように、患者に止血するために治療有効量のハイブリッドを送達するのに充分な量で、薬学的に受容可能なキャリア、送達ビヒクル、または安定剤に含まれる。第VIII因子は、典型的には、正常血漿に存在する、血友病Aの個体由来の血漿のクロッティング欠陥を矯正する物質として定義される。精製および部分的に精製された形態の第VIII因子のインビトロでの凝固因子活性は、ヒト患者への注入の第VIII因子の用量を算定するために使用され得、そして患者血漿から回収される活性およびインビボ出血欠陥の矯正の信頼性のある指標である。Lusher，J.M. ら、328 New ．Engl．J．Med. 453-459(1993)；Pittman，D.D.ら79 Blood 389-39 7(1992)、およびBrinkhousら、82 Proc ．Natl．Acad．Sci. 8752-8755(1985)によれば、新規な第VIII因子分子のインビトロでの標準アッセイとイヌ注入モデルまたはヒト患者におけるそれらの挙動との間の矛盾は報告されていない。通常、ハイブリッド第VIII因子の投与によって患者において達成される所望の血漿第VIII因子レベルは、正常の30〜100％の範囲内である。ハイブリッド第VII I因子の投与の好ましい様式では、組成物は約20〜50単位／kg体重の範囲の好ましい投与量で静脈内投与される；間隔頻度は約８〜24時間の範囲である(重度の罹患血友病者)；そして処置の期間(日)は１〜10日間の範囲であるか、または出血エピソードが解決されるまでである。例えば、Roberts，H.R.およびM.R．Jone s，「血友病および関連状態−プロトロンビンの先天的欠損(第II因子、第V因子および第VII因子から第XII因子)」Ch．153，1453-1474，1460，Hematology, Wil liams，W.J.ら、編(1990)を参照。インヒビターを持つ患者は、より多くのハイブリッド第VIII因子を必要し得、または患者は、ハイブリッド第VIII因子のヒト第VIII因子よりも高い比活性または低下した抗体反応性のため、ヒト第VIII因子よりもより少ないハイブリッド第VIII因子を必要し得る。ヒトまたはブタ第VIII 因子を用いる処置のように、注入されるハイブリッド第VIII因子の量は、１段階第 VIII因子凝固アッセイにより規定され、そして選択された例では、インビボでの回収が、注入後の患者血漿中の第VIII因子を測定することにより決定される。特定の被験体のために、特定の投与レジメが、個体の必要およびこの組成物の投与を行う者またはその投与を管理する者の職業的な判断に従って、時間を通じて調節されるべきであり、そして本明細書中で記載の濃度範囲は例示に過ぎず、本発明の組成物の範囲または実施を限定することを意図しないことが理解されるべきある。処置は、組成物の単回静脈投与、あるいは必要に応じて、長期間にわたる周期的または連続的投与の形態で行われ得る。あるいは、ハイブリッド第VIII因子は、リポソームと共に、種々の時間間隔にて１回または数回で、経皮的または経口的に投与され得る。ハイブリッド第VIII因子はまた、ヒト第VIII因子に対する抗体を生じた血友病者における第VIII因子欠損に起因するコントロールできない出血を処置するために使用され得る。この場合は、ヒトまたは動物第VIII因子単独での凝固因子活性より優れた凝固因子活性が必要ではない。ヒト第VIII因子の凝固因子活性より劣る凝固因子活性(すなわち、3,000単位/mg未満)は、この活性が患者血漿中の抗体により中和されないのであれば、有用である。上述の一般的に記載されているハイブリッド第VIII因子分子、およびそれを単離、特徴付け、製造および使用する方法は、以下の非限定的な実施例を参考としてさらに理解される。実施例１：ブタ第VIII因子とハイブリッドヒト／ブタ第VIII因子のアッセイブタ第VIII因子はヒト第VIII因子より、分子の比活性に基づき、より高い凝固因子活性を有する。これらの結果は、実施例４の表IIIに示される。この結論は適切な標準曲線の使用に基づき、それによりヒトおよびブタ第VIII因子の十分な比較が可能である。凝固アッセイは、血友病Ａ患者由来の血漿のクロッティング時間を短縮させる第VIII因子の能力に基づく。２つのタイプのアッセイを用いた：１段階のアッセイおよび２段階のアッセイである。１段階のアッセイでは、0.1mlの血友病Ａ血漿（George King Biomedical,Inc. ）を、0.1mlの活性化部分トロンボプラスチン試薬(activated partial thrombop lastin reagent)(APTT)（Organon Teknika)および0.01mlの、希釈された、クエン酸塩化された正常ヒト血漿からなる試料または標準品とともに、水浴中５分間 37℃でインキュベートした。インキュベーションの後に、0.1mlの20mM CaCl₂を添加し、そしてフィブリンクロットの展開の時間を目視観察により測定した。１ユニットの第VIII因子は、1mlのクエン酸塩化された正常ヒト血漿中に存在する量として定義される。標準としてヒト血漿を用いて、ブタおよびヒトの第VI II因子の活性を直接比較した。血漿の標準品または精製されたタンパク質の希釈を0.15Ｍ NaCl、0.02Ｍ HEPES、pH7.4中に作製した。標準曲線を、血漿の３つまたは４つの希釈（最大希釈は1/50であった）に基づき、そしてlog₁₀(血漿濃度) に対してプロットしたlog₁₀(クロッティング時間)に基づいてた。その結果、直線上のプロットが得られる。未知試料中の第VIII因子のユニット数をこの標準曲線からの内挿により決定した。１段階のアッセイは、血友病Ａ血漿中で形成されるアクチベータによる第VIII 因子の内因性の活性化に依存する。一方、２段階のアッセイは、あらかじめ活性化された第VIII因子のプロ凝固因子活性を測定する。２段階のアッセイでは、トロンビンと反応させた第VIII因子を含む試料を、活性化部分トロンボプラスチンおよびヒト血友病Ａ血漿の５分間37℃でプレインキュベートした混合物に添加した。次いで、得られたクロッティング時間を、上記の同一のヒト標準曲線に基づいてユニット/mlに変換した。２段階のアッセイにおける相対活性は１段階のアッセイでの相対活性より高かった。なぜなら、それは、第VIII因子があらかじめ活性化されていたからである。実施例２：ヒトおよびブタ第VIII因子間の機能的差異の特徴付けブタおよびヒト血漿由来の第VIII因子およびヒト組換え第VIII因子の単離は以下の文献に記載されている。Fulcher,C.A.およびT.S.Zimmerman、79 Proc.Nat'l .Acad.Sci.U.S.A. 1648-1652(1982)；Toole,J.J.ら、312 Nature 342-347(1984) (Genetics Institute)；Gitschier,J.ら、312 Nature 326-330(1984)(Genentec h)；Wood,W.I.ら、312 Nature 330-337(1984)(Genentech)；Vehar,G.A.ら、312 Nature 337-342(1984)(Genentech)；Fass,D.N.ら、59 Blood 594(1982)；Toole, J.J.ら、83 Proc.Nat'l.Acad.Sci.U.S.A. 5939-5942(1986)。これは、幾つかの方法で達成し得る。これらの調製物のすべてはサブユニット組成において同様であるが、これは、ヒト第VIII因子およびブタ第VIII因子間の機能的差異に関する最初の記載であり、部分的にはそれらを比較するための共通の標準が使用されないために以前には記されていない。ヒト組換え第VIII因子およびブタ第VIII因子の比較のために、高度に精製されたヒト組換え第VIII因子（Cutter Laboratories,Berkeley,CA）およびブタ第VII I因子（Fass,D.N.ら、59 Blood 594(1982)に記載のように免疫精製された）の調製物を、Mono Q^TM（Pharmacia-LKB,Piscataway,NJ）陰イオン交換カラム（Pharm acia,Inc.）を使用して高速液体クロマトグラフィー（HPLC）に供した。Mono Q^T ^M HPLC工程の目的は、微量の不純物の除去および比較目的のための共通の緩衝液へのヒトおよびブタ第VIII因子の交換であった。1000〜2000ユニットの第VIII因子を含むバイアルを、５ml H₂Oで再構成した。次いで、Hepes（２Ｍ、pH7.4）を添加して、最終濃度を0.02Ｍとした。第VIII因子を、0.15Ｍ NaCl、0.02Ｍ Hepe s、５mM CaCl₂、pH7.4（緩衝液Ａ＋0.15Ｍ NaCl）で平衡化したMono Q^TMHR 5/5 カラムにかけ；10mlの緩衝液Ａ＋0.15Ｍ NaClで洗浄し；そして緩衝液Ａ中の0.1 5Mから0.90Ｍ NaClの直線勾配20mlを用いて1ml/分の流速で溶出した。ヒト第VIII因子（血漿由来でMono Q^TMHPLCにより精製された）およびブタ第VI II因子の比較のために、イムノアフィニティー精製された血漿由来のブタ第VIII 因子を、0.04Ｍ Hepes、５mM CaCl₂、0.01％ Tween-80、pH7.4で１：４に希釈し、そしてヒト第VIII因子についての前段落に記載されている条件と同じ条件下で Mono Q^TMHPLCにかけた。ヒトおよびブタ第VIII因子の単離に対するこれらの手順は、当業者にとっては標準的である。カラム画分を、１段階の凝固アッセイにより第VIII因子活性についてアッセイした。アッセイの平均の結果（物質のＡ₂₈₀当たりの活性のユニット数で表現する）を表IIに示し、そしてこれは１段階のアッセイを用いる場合、ブタ第VIII因子が、ヒト第VIII因子より少なくとも６倍高い活性を有することを示す。実施例３：ヒトおよびブタ第VIII因子の安定性の比較第VIII因子の１段階のアッセイの結果は、試料中の第VIII因子の第VIIIa因子への活性化を反映し、そしておそらく形成された第VIIIa因子活性の喪失を反映する。ヒトおよびブタの第VIII因子の安定性の直接の比較がなされた。Mono Q^TM HPLC（Pharmacia,Inc.,Piscataway,N.J.）からの試料を、同一濃度および同一緩衝液組成に希釈し、そしてトロンビンと反応させた。種々の時間で、試料を２段階凝固アッセイのために取り出した。代表的には、ピーク活性（２分で）はブタ第VIIIa因子ついてヒト第VIIIa因子より10倍高かった。そしてブタおよびヒトの第VIIIa因子の両者の活性はその後減少した。その場合、ヒト第VIIIa因子の活性はより急速に減少した。一般に、安定なヒト第VIIIa因子を単離する試みは、安定なブタ第VIIIa因子を生じる条件を用いても、成功しない。これを示すために、Mono Q^TMHPLC精製ヒト第VIII因子をトロンビンで活性化し、そしてMono S^TM陽イオン交換（Pharmacia, Inc.）HPLCに、Lollar,J.S.およびC.G.Parker、28 Biochemistry 666(1989)に記載されている安定なブタ第VIIIa因子を生成する条件で、かけた。 0.2Ｍ NaCl、0.01Ｍ Hepes、2.5mM CaCl₂、pH7.4中43μg/ml（0.2μＭ）のヒト第VIII因子を、10mlの全容量で、トロンビン（0.036μＭ）と10分間反応させた。その時にトロンビンの不可逆的不活性化のためにFPR-CH₂Cl D-フェニル-プロリル-アルギニル-クロロメチルケトンを0.2μＭの濃度になるように添加した。次いで、この混合物を、40mM 2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸（MES）、５ mM CaCl₂、pH6.0で１：１に希釈し、そして５mM MES、５mM CaCl₂、pH6.0（緩衝液Ｂ）＋0.1Ｍ NaClで平衡化したMono S^TMHR 5/5 HPLCカラム（Pharmacia,In c.）に２ml/分でロードした。第VIIIa因子を、カラム洗浄を行うことなしに、緩衝液Ｂ中の0.1Ｍ NaClから0.9Ｍ NaClまでの20mlの勾配で１ml/分で溶出した。２段階のアッセイにおいて凝固因子活性を有する画分を、これらの条件下で単一のピークとして溶出した。このピーク画分の比活性は、約7,500 U/A₂₈₀であった。このMono S^TM第VIIIa因子ピークのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）、およびその後のタンパク質の銀染色により、第VIII因子由来のヘテロ二量体（A3-C1-C2/A1）誘導体に対応する２本のバンドが明らかにされた。濃度が低いためにA2フラグメントはこれらの条件下での銀染色により同定されなかったが、¹²⁵Ｉ−標識により、微量の構成成分として同定された。ヒト第VIII因子での結果とは対照的に、同じ条件下でMono S^TMHPLCにより単離したブタ第VIIIa因子は、1.6×10⁶U/A₂₈₀の比活性を有した。SDS-PAGEによるブタ第VIIIa因子の分析により、A1、A2、およびA3-C1-C2サブユニットに対応する３つのフラグメントが明らかにされ、このことは、ブタ第VIIIa因子が３つのサブユニットを有することを表す。 pH6.0でのヒトトロンビン活性化第VIII因子調製物のMono S^TMHPLCの結果は、安定なブタ第VIIIa因子が得られる条件下では、ヒト第VIIIa因子は不安定であることを示す。しかし、微量のA2フラグメントがピーク画分に同定されたが、凝固因子活性が、少量のヘテロ二量体の第VIIIa因子に由来するか、または低い比活性を有するヘテロ二量体の第VIIIa因子に由来するかどうかの決定は、この方法単独ではできなかった。 A2サブユニットを失う前にヒト第VIIIa因子を単離する方法が、この疑問を解決するために所望される。このために、Mono S^TM緩衝液のpHをpH５に低下させることを含む手順で単離を達成した。Mono Q^TM精製ヒト第VIII因子（0.5mg）をH₂O で希釈して、0.25Ｍ NaCl、0.01Ｍ Hepes、2.5mM CaCl₂、0.005％ Tween-80、pH 7.4中0.25mg/ml（１μＭ）の第VIII因子の最終組成物を得た（全容量7.0ml）。トロンビンを0.072μＭの最終濃度になるように添加し、そして３分間反応させた。次いでトロンビンをFPR-CH₂Cl（0.2μＭ）で不活性化させた。次いでこの混合物を、40mM酢酸ナトリウム、５mM CaCl₂、0.01％ Tween-80、pH5.0で１：１に希釈し、そして２ml/分で、0.01Ｍ酢酸ナトリウム、５mM CaCl₂、0.01％ Tw een-80、pH5.0＋0.1Ｍ NaClで平衡化したMono S^TMHR 5/5 HPLCカラムにロードした。第VIIIa因子を、カラム洗浄を行うことなしに、同一の緩衝液中の0.1Ｍ NaC lから1.0Ｍ NaClまでの20mlの勾配で１ml/分で溶出した。これにより、SDS-PAGE および銀染色によって示される、検出可能な量のA2フラグメントを含むピーク中に凝固因子活性の回収がもたらされた。このピーク画分の比活性は、pH6.0で回収されたピーク画分の比活性より10倍高かった（75,000 U/A₂₈₀対7,500 U/A₂₈₀ ）。しかし、pH6.0で単離されたブタ第VIIIa因子とは対照的に（４℃で限りなく安定である）、ヒト第VIIIa因子の活性は、Mono S^TMからの溶出後、数時間の期間で絶え間なく減少した。さらに、pH5.0で精製しそして直ちにアッセイした第V IIIa因子の比活性は、ブタ第VIIIa因子の比活性のわずか５％であり、これは実質的な解離がアッセイ前に起こったことを示す。これらの結果は、ヒトおよびブタの第VIIIa因子の両者が３つのサブユニット（A1、A2、およびA3-C1-C2）からなることを示す。A2サブユニットの解離は、（生理学的イオン強度、pH、および濃度のような）特定の条件下で、ヒトおよびブタの第VIIIa因子の両者の活性喪失の原因である。ブタ第VIIIa因子の特定の条件下での相対的安定性は、A2サブユニットのより強い会合に起因する。実施例４：サブユニットを用いた再構成によるハイブリッドヒト／ブタ第VIII 因子の調製ブタ第VIII因子軽鎖およびブタ第VIII因子重鎖を以下のようにして単離した。 pH7.4の0.5M EDTA溶液を、MonoＱ^TM-精製ブタ第VIII因子に加え、最終濃度を0.0 5Mとし、そして室温で18時間〜24時間放置した。等量の10mMヒスチジン-Cl、10m M EDTA、0.02％ v/v Tween80(pH6.0)(緩衝液Ｂ)を加え、そしてこの溶液を1ml／分で、0.25M NaClを含む緩衝液Ａ中で前もって平衡化したMonoＳ^TMHR5/5カラムにかけた。第VIII因子の重鎖は、SDS-PAGEによる判断では樹脂と結合しなかった。第VIII因子の軽鎖を、20ml、1ml／分の緩衝液Ａ中の0.1M〜0.7MのNaClの直線グラジエントで溶出し、そしてSDS-PAGEによると均質であった。第VIII因子の重鎖を、MonoＱ^TMHPLC(Pharmacia、Inc.、Piscataway、N.J.)により以下の方法で単離した。第VIII因子の重鎖は、第VIII因子の軽鎖の精製の間にはMonoＳ^TMに吸着しない。第VIII因子の重鎖を含有する素通り物質を、0.5M Hepes緩衝液(pH 7.4) を加えることによりpH7.2に調整し、そして0.1M NaCl、0.02M Hepes、0.01％ Tw een-80(pH7.4)で平衡化したMonoＱ^TMHP5/5 HPLCカラム(Pharmacia、Inc.)にかけた。このカラムを10mlの上記緩衝液で洗浄し、そして第VIII因子の重鎖を、20ml のこの緩衝液中の0.1M〜1.0MのNaClのグラジエントで溶出した。ヒト軽鎖および重鎖を、同様の方法で単離した。ヒト軽鎖、ヒト重鎖、ブタ軽鎖およびブタ重鎖を、以下の工程に従って再構成した。10μlのヒトまたはブタ第VIII因子の軽鎖(100μg／ml)を、1M NaCl、0.02 M Hepes、５mM CaCl₂、0.01％ Tween-80(pH7.4)中で、14時間室温にて、(1)25μ lの上記と同一の緩衝液中の異種重鎖(60μg／ml)；(2)10μlの0.02M Hepes、0.0 1% Tween-80(pH 7.4)；(3)５μlの0.6M CaCl₂と混合した。この混合物を0.02M M ES、0.01% Tween-80、５mM CaCl₂(pH６)を用いて1/4に希釈し、そして0.1M NaCl 、0.02M MES、0.01% Tween-80、５mM CaCl₂(pH 6.0)中で平衡化したMonoＳ^TMHr5 /5にかけた。20mlの上記と同一の緩衝液中の0.1M〜1.0M NaClのグラジエントを行い、そして0.05mlの画分を集めた。画分の280nmでの吸光度を読み、そして吸光度を有する画分を、１段階のクロッティングアッセイにより第VIII因子活性についてアッセイした。重鎖を過剰に存在させた。なぜなら、遊離軽鎖(重鎖とは会合していない)もまた、MonoＳ^TMと結合し；過剰な重鎖によって、遊離軽鎖が調製物の一部ではなくなることが確実になるからである。MonoＳ^TMHPLC精製後の再構成の実験は、４つの全ての考えられる鎖の組み合わせ(ヒト軽鎖／ヒト重鎖、ヒト軽鎖／ブタ重鎖、ブタ軽鎖／ブタ重鎖、ブタ軽鎖／ヒト重鎖)を用いて実施した。表IIIは、ヒト軽鎖／ブタ重鎖第VIII因子が、天然のブタ第VIII因子(表 II)に匹敵する活性を有することを示し、このことはブタ重鎖中の構造要素は、ヒト第VIII因子と比較してブタ第VIII因子の凝固因子活性が上昇することの原因となることを示している。実施例５：ドメインを用いた再構成による活性ハイブリッドヒト／ブタ第VIII 因子の調製ブタA1/A3-C1-C2二量体、ブタA2ドメイン、ヒトA1/A3-C1-C2二量体、およびヒトA2ドメインを、Lollar、P.ら、267(33)J ．Biol．Chem. 23652-23657(1992年11 月25日)に記載された方法に従って、ブタの血液またはヒトの血液から各々単離した。例えば、ブタA1/A3-C1-C2二量体、ブタ第VIIIa因子(140μg)のpH(6.0)を、５ＮのNaOHを加えることにより30分間pH8.0に上昇させ、A2ドメインの解離およびクロッティングアッセイによる95％の不活化を生じた。この混合物を緩衝液Ｂ(20mM HEPES、５mM CaCl₂、0.01％ Tween 80(pH7.4))を用いて１：８に希釈し、そして緩衝液Ｂ中で平衡化したMonoＳカラムにかけた。A1/A3-C1-C2二量体は、緩衝液Ｂ中の0.1M〜1.0MのNaClのグラジエントを用い、約0.4M NaClで単独の鋭いピークとして溶出した。ブタA2ドメインを単離するために、Lollar、P.、およびC.G．Parker、28 Biochem. 666-674(1989)の方法に従って、0.64mgの第VIII 因子を用いて開始し、ブタ第VIIIa因子を生成した。遊離ブタA2ドメインを、Mon oＳ^TMクロマトグラムにおいて、0.3M NaClでの少量の成分(50μg)として単離した。ハイブリッドヒト／ブタ第VIII因子分子を、二量体およびドメインから以下のように再構成した。精製した成分についての濃度および緩衝液条件は以下の通りであった：ブタA2、緩衝液Ａ(0.3M NaClを含む５mM MES；５mM CaCl₂、0.01% Tw een 80(pH 6.0))中0.63μM；ブタA1/A3-C1-C2、0.4M NaClを含む緩衝液Ｂ中0.27 μM；ヒトA2、0.3M NaCl、10mMヒスチジン-HCl、５mM CaCl₂、0.01% Tween 20(p H6.0)中、１μM；ヒトA1/A3-C1-C2、0.5M NaCl、10mM ヒスチジン-C1、2.5mM Ca Cl₂、0.1% Tween 20(pH6.0)中0.18μM。再構成実験を、等量のA2ドメインとA1/A3-C1-C2二量体とを混合することによって行った。ブタA1/A3-C1-C2二量体を用いた混合実験では、0.5M MES(pH6.0)を70mMまで加えることによりpHを6.0に下げた。４つの全ての考えられるハイブリッド第VIIIa因子分子（[pA2/(hA1/A3-C1-C2) ]、[hA2/(pA1/A3-C1-C2)]、[pA2/(pA1/pA3-C1-C2)]、および[hA2/(hA1/A3-C1-C2 )]）の凝固活性を、様々な時間での２段階のクロッティングアッセイにより得た。 A2ドメインとA1/A3-C1-C2二量体とを混合した後の活性の生成は、１時間でほぼ完了し、そして少なくとも24時間、37℃で安定であった。表IVは、１時間でアッセイした場合の再構成されたハイブリッド第VIIIa因子分子の活性を示す。２段階のアッセイ（これにより第VIIIa因子分子の特定の活性が得られた）は、１段階のアッセイとは異なり、そしてこの値は１段階のアッセイにより得られた第 VIII因子分子の活性値とは比較し得ない。表IVは、最も高い活性が、ブタA2ドメイン／ヒトA1/A3-C1-C2二量体によって示され、ブタA2ドメイン／ブタA1/A3-C1-C2がそれに続くことを示す。このように、ブタ第VIIIa因子のA2ドメインと、ヒト第VIIIa因子のA1/A3-C1-C 2二量体とを混合した場合、凝固因子活性が得られた。さらに、ヒト第VIIIa因子のA2ドメインと、ブタ第VIIIa因子のA1/A3-C1-C2二量体とを混合した場合、凝固因子活性が得られた。それら単独では、A2、A1、およびA3-C1-C2領域は、凝固因子活性を有さない。実施例６：ブタ第VIII因子のA2ドメインの単離および配列決定ブタ第VIII因子のＢドメインおよびA2ドメインの一部をコードするヌクレオチド配列のみが、以前に配列決定されている(Toole、J.J.ら、83 Proc ．Nat'l．Ac ad．Sci．U.S.A. 5939-5942(1986))。完全なブタ第VIII因子のA2ドメインについてのcDNA配列および推定アミノ酸配列（それぞれ配列番号５および６）は、本明細書中で開示される。ブタ第VIII因子のA2ドメインを、公知のヒト第VIII因子cDNA配列に基づく縮重プライマーおよびブタ第VIII因子の一部に基づく正確なブタプライマーを用いて、ブタ脾臓全RNAの逆転写およびPCR増幅によってクローン化した。1kbのPCR産物が単離され、そしてBluescript^TM(Stratagene)プラスミドベクターに挿入して増幅した。ブタA2ドメインを、ジデオキシ配列決定により完全に配列決定した。このcDNA 配列および推定アミノ酸配列は、それぞれ配列番号５および６に記載される通りである。実施例７：組換えハイブリッドヒト／動物第VIII因子の調製ヒト第VIII因子のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列(それぞれ配列番号１および２)は、文献(Toole、J.J.ら、312 Nature 342-347(1984)(Genetics I nstitute)；Gitschier、J.ら、312 Nature 326-330(1984)(Genentech)；Wood、W .I.ら、312 Nature 330-337(1984)(Genentech)；Vehar、G.A.ら、312 Nature 33 7-342(1984)(Genentech))に記載されている。組換えハイブリッドヒト／動物第VIII因子を生成するためには、ヒト第VIII因子cDNA(Biogen Corp.)の領域を除去し、そして配列同一性を有する動物cDNA配列を挿入することが必要である。その後、ハイブリッドcDNAを、適切な発現系で発現させる。例としては、ハイブリッド第VIII因子をクローン化し、その中で一部およびすべてのヒトA2配列で、対応するブタA2ドメインを置換した。最初に、ヒト第VIII因子のA2ドメインに対応する全cDNA配列、そして次いてA2ドメインのより少ない部分を、当業者に一般に公知の方法であるオリゴヌクレオチド媒介変異誘発によってループアウトした（例えば、Sambrook、J.、E.F.Fritsch、およびT .Maniatis、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第15章、Cold Spring H arbor Press、Cold Spring Harbor,、1989を参照のこと）。工程は以下の通りであった。材料メトキシカルボニル-D-シクロヘキシルグリシル-グリシル-アルギニン-p-ニトロアニリド(Spectrozyme^TMXa)および抗第VIII因子モノクローナル抗体ESH4およびESH8を、American Diagnostica(Greenwich、CT)から購入した。ユニラメラホスファチジルコリン／ホスファチジルセリン(75/25、w/w)小胞を、Barenholtz、 Y.ら、16 Biochemistry 2806-2810(1977)の方法に従って調製した。組換えデスルファトヒルジン(desulfatohirudin)を、Dr.R.B.Wallis、Ciba-Geigy Pharmace uticals(Cerritos、CA)から得た。ブタ第IXa、Ｘ、Xa因子およびトロンビンを、 Lollar、P.ら、63 Blood 1303-1306(1984)、ならびにDuffy、E.J.およびP.Lolla r、207 J ．Biol．Chem. 7621-7827(1992)の方法に従って単離した。アルブミン非含有純粋組換えヒト第VIII因子を、Baxter-Biotech(Deerfield、IL)から得た。ブタ第VIII因子のA2ドメインのクローニングブタA2ドメインをコードするcDNAを、Chomczyneki、P.およびSacohi、N.、162 Anal ．Biochem. 156-159(1987)に記載の通りに単離して逆転写したブタ脾臓mRN AのPCRの後に得た。cDNAを、プライマーとしてランダムヘキサマーを用いて一本鎖cDNA合成キット(Pharmacia、Piscataway、N.J.)を用いて調製した。公知の限定されたブタA2アミノ酸配列に基づく5'-末端縮重プライマー5’AARCAYCCNAARAC NTGGG 3'（配列番号11）、およびブタA2ドメインの公知のブタDNA配列のすぐ3' 側に基づく3'-末端正確プライマー5’GCTCGCACTAGGGGGTCTTGAATTC 3'（配列番号 12）を用いてPCRを実施した。これらのオリゴヌクレオチドは、ヒト配列（配列番号１）におけるヌクレオチド1186〜1203および2289〜2313に対応する。TagDNA ポリメラーゼ(Promega Corp.、Madison、WI)を用いて、増幅を35サイクル（１分 94℃、２分50℃、２分72℃）行った。Murchuk、D.ら、19 Nucl ．Acids Res. 115 4(1991)により記載されたT-ベクター手順を用いて、1.1キロベースの増幅されたフラグメントをpBluescript II KS-(Straragene)に、EcoRV部位でクローン化した。Escherichia coli XL1-Blue-コンピテントセルを形質転換し、そしてプラスミドDNAを単離した。Sequenase^TMversion 2.0(U.S.Biochemical Corp.、a Divis ion of Amersham LifeScience、Inc.、Arlington Hts、IL)を用いて、両方向で配列決定を行った。この配列は、同一のブタ由来の脾臓RNAの独立した逆転写由来のPCR産物(CircumVent^TM、New England Biolabs、Beverly、MA)を直接配列決定することによって得られた同一の配列によって確認された。自己抗体RCについてエピトープを含有する領域は、ヒト第VIII因子（配列番号２）における373-53 6として同定された。ハイブリッドヒト／ブタ第VIII因子cDNAの構築および発現 B-ドメインのないヒト第VIII因子（HB-、Biogen，Inc．Cambridge、MAより）は、アミノ酸残基741〜1648（配列番号２）をコードする配列を欠き、そしてハイブリッドヒト／ブタ第VIII因子の構築のために出発物質として用いた。HB-を発現ベクターReNeo中にクローン化した。操作を促進するため、第VIII因子のcDN Aを、ReNeo由来のXhoI/HpaIフラグメントとして単離し、そしてXho1/EcoRV消化したpBlueSsript II KS中にクローン化した。オリゴヌクレオチド5’CCTTCCTTTA TCCAAATACGTAGATCAAGAGGAAATTGAC 3'（配列番号７）を、ウラシル含有ファージD NAを用いる部位特異的変異誘発反応において、Kunkel、T.A.ら、204 Meth ．Enzy mol. 125-139(1991)に記載のように用い、ヒトA2配列（配列番号１中のヌクレオチド1169〜2304）を同時にループアウトしてSnaBI制限部位を導入した。A2ドメインのない第VIII因子を含有するプラスミドをSnaBIで消化し、次いでClaIリンカーを付加した。次いでリン酸化5'プライマー5'GTAGCGTTGCCAAGAAGCACCCTAAGAC G 3'（配列番号８）および3'プライマー5'GAAGAGTAGTACGAGTTATTTCTCTGGGTTCAAT GAC 3'（配列番号９）をそれぞれ使用して、ブタA2ドメインをPCRで増幅した。C laIリンカーを、PCR産物に付加し、次いでヒト第VIII因子含有ベクター内に結合した。A1/A2連結部およびA2/A3連結部を補正し、正確なトロンビン切断配列および隣接配列を、部位特異的変異誘発によって、配列番号８に示すオリゴヌクレオチドおよびヌクレオチド１〜22(配列番号９中の5'GAA・・・TTC)（それぞれ5'-および3'-末端連結部を補正するため）を用いて回復した。HP1と命名した得られた構築物において、ヒトA2ドメインはブタA2ドメインで正確に置換された。予備の産物は所望されないチミンをA1-A2連結部で、ブタA2ドメインのPCR増幅の結果として含有した。この１つの塩基は、変異オリゴヌクレオチド5’CCTTT ATCCAAATACGTAGCGTTTGCCAAGAAG 3'（配列番号１０）を使用してループアウトし得る。 63％のブタNH₂末端A2ドメインを含有する領域（推定A2エピトープを含有する）を、ヒト第VIII因子cDNAを含有するpBluescriptプラスミドとヒト／ブタA2第V III因子cDNAを含有するpBluecriptプラスミドとの間でSpeI/BamHIフラグメントを交換することにより、ＢドメインのないcDNAの相同ヒト配列を置換した。この配列を、A2ドメインおよびスプライス部位を配列決定することにより確認した。最後に、完全なA2配列を含有するSpeI/ApaIフラグメントを、HB-中の対応する配列の位置で置換し、HP2構築物を生成した。 COS-7細胞におけるHB-およびHP2の予備発現を、Seldon、R.F.、Current Proto cols in Molecular Biology （Ausubel、F.M.ら編）、9.21頁〜9.26頁、Wiley In terscience、N.Y.によって記載されているようにDEAE-デキストラン媒介DNAトランスフェクションの後に試験した。活性第VIII因子の発現を確認し、そして予備的な抗体阻害研究を行った後、次いでHB-およびHP2 DNAを、リポソーム媒介トラを用いて、ベビーハムスター腎臓細胞に安定にトランスフェクトした。プラスミド含有クローンを、400μg/mlのG418を含有するG418耐性について、Dulbecco's 改変Eagle's培地-F12、10％ウシ胎児血清(DMEM-F12/10% ウシ胎児血清)中で選択し、次いで100μg/mlのG418を含有するDMEM-F12/10%ウシ胎児血清中で維持した。HB-およびHP2第VIII因子活性の最大の発現を示すコロニーを、リングクローニング(ring cloning)により選択し、そしてさらなる特徴付けのために拡大した。 HB-およびHP2第VIII因子発現を、血漿非含有第VIII因子アッセイ、１段階のクロッティングアッセイ、および精製組換えヒト第VIII因子を標準として用いる酵素結合免疫吸着剤検定法により比較した。2600および2580単位/mgの比凝固因子活性が、それぞれHB-およびHP2について得られた。HB-およびHP2は、それぞれ1. 2単位/ml/48時間/10⁷細胞および1.4単位/ml/48時間/10⁷細胞を産生した。これは、野生型構築物(2,600±200単位/mg)の比凝固因子活性と同一である。HB-および HP2の比活性は、血漿非含有第VIII因子アッセイと区別し得なかった。ハイブリッドヒト／非ブタ哺乳動物第VIII因子の構築および発現他の動物のA1、A3、C1、およびC2ドメインならびに部分ドメインのクローニングは、ブタA2ドメインをクローニングするために用いたストラテジーと同一のストラテジーを用いて実施可能である。これらのドメインのフラグメントを、ループアウト変異誘発技術によってクローン化し得る。ヒト第VIII因子中の対応するドメインおよびその任意のフラグメントの切除（１つのアミノ酸の除去を含む）は、上記のループアウト変異誘発によって実施可能である。全ての考えられるドメインの置換、ドメイン置換のフラグメント、または１つのアミノ酸残基の置換は、このアプローチにより可能である。 A1、A2、A3、C1、および／またはC2ドメイン置換を有する組換えハイブリッドヒト／動物第VIII因子の生物学的活性を、最初にCOS細胞哺乳動物一過性発現系を用いて評価し得る。ハイブリッドヒト／動物cDNAをCOS細胞中にトランスフェクトし得、そして上清を上記に記載したように１段階および２段階の凝固アッセイを用いて第VIII因子について分析し得る。さらに、第VIII因子を、色素原基質アッセイを用いて測定し得る。このアッセイはより高感度であり、そしてより多くの数のサンプルの分析を可能にする。同様のアッセイが、第VIII因子活性のアッセイにおいて標準的である(Wood、W.I.ら、312 Nature 330-337、1984；Toole 、J.J.ら、312 Nature 342-347、1984)。COS細胞における組換え第VIII因子の発現もまた、標準手順である(Toole、J.J.ら、312 Nature 342-347、1984；Pittma n、D.D.、およびR.J．Kaufman 85 Proc ．Nat'l．Acad．Sci．U.S.A 2429-2433、 1988)。本明細書中で記載される組換え分子のための出発物質として用いられるヒト第VIII因子cDNAをCOS細胞中で発現して生物学活性を有する産物を生じた。この物質は、上記のように、ハイブリッドヒト／動物第VIII因子分子を比較するための標準として用いられ得る。アッセイにおける活性を、ハイブリッド分子を適切に比較するために比活性に変換する。このために、この細胞によって産生される第VIII因子の量の測定が必要となり、そしてそれは精製ヒトおよび／または動物第VIII因子を標準として用いるイムノアッセイによって測定され得る。第VIII因子についてのイムノアッセイは、当業者にとっては通常である(例えば、Lollar 、P.ら、71 Blood 137-143、1988を参照のこと)。実施例８．ハイブリッドヒト／動物第VIII因子における阻害活性の測定エピトープとして（すなわち、第VIII因子と反応する阻害抗体についての認識部位として）関与していると思われるヒトおよび動物第VIII因子の配列を、例えば以下に示すように、部位特異的変異誘発技術(例えば、オーバーラップ伸長によるスプライシング方法(splicing by overlap extension method)(SOE))と組み合わせて第VIII因子に対する抗体を用いるアッセイを用いて、通常の手順を用いて測定し得る。対応する抗原性ヒト配列と比較して抗原性でない動物第VIII因子の配列を同定し得、そして標準組換えDNA方法に従って置換を行って動物配列を挿入し、そしてヒト配列を欠失し得る。ブタ第VIII因子は、ヒト第VIII因子よりもいくつかの阻害性抗体と少ししか反応しない；このことにより、インヒビターを用いる患者の現在の治療に対する基礎が提供される。組換えハイブリッドを作製後、これらを、通常のアッセイ（Bethesdaインヒビターアッセイを含む）を用いて反応性についてインビトロで試験し得る。天然ヒト第VIII因子および天然動物第VIII因子よりも反応性が低い構築物は、置換治療のための候補である。ヒト第VIII因子に反応性の大部分の(全てでないとしても)阻害性抗体に対するエピトープは、2332のアミノ酸ヒト第VIII因子分子中の２つの領域である、A2ドメイン(アミノ酸残基373〜740)、およびC2ドメイン(アミノ酸残基2173〜2332、両方の配列を配列番号２に示す)中に存在すると考えられる。A2エピトープは、ヒトA2ドメインの一部が、置換されるヒトアミノ酸配列と同一の配列を有するブタの配列によって置換される組換えハイブリッドヒト／ブタ第VIII因子分子を作製することによって除去されている。これは、実施例７に記載のように、ブタA2 ドメインを、標準分子生物学的技術によりクローン化し、そして次いで制限部位を用いてA2ドメイン内で切断およびスプライシングを行うことによって達成された。得られた構築物(HP2と称する)中で、ブタ第VIII因子の残基373〜603（配列番号４）をヒトA2ドメインに置換した。HP2を、以下の方法を用いて抗ヒト第VII I因子抗体との免疫反応性についてアッセイした。第VIII因子の酵素結合免疫吸着検定法マイクロタイタープレートのウェルを、0.15mlの６μg/mlのESH4（ヒト第VIII 因子軽鎖抗体）でコートし、一晩インキュベートした。このプレートをH₂Oで３回洗浄した後、ウェルを１時間、0.15M NaCl、10mM リン酸ナトリウム、0.05％T ween 20、0.05％脱脂粉乳、0.05% アジ化ナトリウム(pH7.4)で１時間ブロックした。感度を増加させるため、第VIII因子を含有するサンプルを30nMのトロンビンで15分間活性化した。次いで、組換えデスルファトヒルジンを100nMで加え、トロンビンを阻害した。プレートを再度洗浄し、そして0.1mlのサンプルまたは純粋な組換えヒト第VIII因子(10ng/ml〜600ng/ml)(これらは標準として用いた)を添加した。２時間のインキュベーションの後、プレートを洗浄し、そして0.1ml のビオチン化ESH8（他の第VIII因子軽鎖抗体）を各々のウェルに加えた。ESH8を、Pierceスルホスクシンイミジル-6-(ビオチンアミド)ヘキサノエートビオチン化キットを用いてビオチン化した。１時間のインキュベーションの後、プレートを洗浄し、そして0.1mlのストレプトアビジン(strcpavidin)アルカリホスファターゼを各々のウェルに添加した。このプレートをBio-Radアルカリホスホターゼ基質試薬キットを用いて発色させ、そして生じた各々のウェルについての405nm での吸光度を、Vmaxマイクロタイタープレートリーダー(Molecular Devices、In c.、Sunnyville、CA)を用いることにより測定した。未知の第VIII因子の濃度を、第VIII因子標準曲線の直線部分から決定した。第VIII因子アッセイ HB-およびHB2第VIII因子を、１段階のクロッティングアッセイで測定した。このアッセイは上記の通り(Bowie、E.J.W.、およびC.A.Owen、Disorders of Hemos tasis(RatnoffおよびForbes編)、43-72頁、Grunn & Stratton、Inc.、Orlando、 FL(1984))、または、以下のような血漿非含有アッセイによって実施した。HB-またはHB2第VIII因子を、10nM 第IXa因子、425nM 第Ｘ因子、および50μM ユニラメラホスファチジルセリン／ホスファチジルコリン(25/75、w/w)小胞の存在下、 0.15M NaCl、20nM HEPES、５mM CaCl₂、0.01％ Tween 80(pH 7.4)中の40nM トロンビンによって活性化した。５分後、反応を0.05M EDTAおよび100nM 組換えデスルファトヒルジンを用いて停止させ、そして得られた第Xa因子を、Hill-Eubanks 、D.C.、およびP.Lollar、265 J ．Biol．Chem. 17854-17858(1990)の方法に従って、色素原基質アッセイによって測定した。これらの条件下、形成された第Xa因子の量は、精製組換えヒト第VIII因子(Baxter Biotech、Deerfield、IL)を標準として用いることによって判断したところ、出発第VIII因子の濃度に直線的に比例した。クロッティングアッセイの前に、HB-またはHP2第VIII因子を、48時間目の馴化培地から10〜15単位/mlに、ヘパリン-Sepharose^TMクロマトグラフィーにより濃縮した。HB-またはHP2第VIII因子を、血友病A血漿(George King Biomedical)に、最終濃度が１単位/mlになるように添加した。RC血漿またはMR血漿中もしくはm Ab 413 IgG(４μM)のストック溶液中のインヒビター力価を、Kasper、C.K.ら、3 4 Thromb ．Diath．Haemorrh. 869-872(1975)に記載されたように、Bethesdaアッセイにより測定した。インヒビターIgGを、Leyte、A.ら、266 J ．Biol．Chem. 7 40-746(1991)により記載されたように調製した。 HP2は、抗A2抗体と反応しない。従って残基373〜603は、抗A2抗体についてのエピトープを含有しているに違いない。ハイブリッドヒト／ブタ第VIII因子の調製およびオーバーラップ伸長によるスプライシング(SOE)によるアッセイヒトA2領域中にブタアミノ酸置換を有するいくつかのより多くのハイブリッドヒト／ブタ第VIII因子分子を調製し、A2エピトープをさらに狭めた。制限部位技術に加え、Ho、S.N.ら、77 Gene 51-59(1989)によって記載される「オーバーラップ伸長によるスプライシング」方法(SOE)を用いて、ブタ第VIII因子cDNAの任意の恣意的な領域で置換した。SOEにおいては、スプライス部位を、オーバーラップするオリゴヌクレオチドにより規定し、これをPCRにより増幅して、所望のc DNAを生成し得る。８個のcDNA構成物（HP4〜HP11と称する）を作製した。これらを実施例７に記載のように、ReNeo発現ベクターに挿入し、ベビーハムスター腎臓細胞に安定にトランスフェクションし、そして高レベルまで発現させた。ハイブリッドヒト／ブタ第VIII因子構造物を、Bethesdaアッセイ(Kasper、C.K .ら、34 Thromb ．Diath．Haemorrh. 869-872(1975))を用いて、抗A2インヒビターMab413との反応性についてアッセイした。Bethesda単位(BU)は、インヒビター力価を測定するための標準的な方法である。結果を表Ｖに示し、そしてそれを組換えヒト第VIII因子と比較する。表Ｖに示したように、Bethesda力価が測定不能(0.7 BU/mg IgG未満)であれば、A2エピトープは置換されたブタ配列の領域中に存在する。エピトープを、HP9 に対するMAb413の非反応性によって例証されるように、わずか26個の残基からなる残基484〜509（配列番号２）に漸次狭めた。 484〜509の間の領域は分割され得る。このような分割が例えば、残基484〜497 および残基498〜509のブタ配列を生成し、これらの配列のいずれもが抗A2阻害性抗体と反応しない場合、このことにより、エピトープが分断され、そして479-49 8のスプライス部位の両側のアミノ酸が、エピトープの生成に必要であることが示される。実施例７および８に記載の方法は、ヒトA2ドメイン内のアミノ酸置換を有する他のハイブリッドヒト／非ブタ哺乳動物第VIII因子、任意のドメイン内のアミノ酸置換を有するハイブリッドヒト／動物第VIII因子、または抗第VIII因子抗体との免疫反応性が減少したか、またはなくなったハイブリッド第VIII因子分子またはこのようなハイブリッド第VIII因子等価物を調製するために用いられ得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｋ 19/00 0276−2ＪＧ０１Ｎ 33/53 ＤＣ１２Ｐ 21/02 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 ＡＣＡＧ０１Ｎ 33/53 9051−4Ｃ 37/465

Claims

【特許請求の範囲】１．非ヒト哺乳動物およびヒトのアミノ酸配列を含む精製されたハイブリッド第 VIII因子分子であって、ここで該分子はインビトロでの凝固アッセイにおいて凝血促進活性を有し、そして該分子は、他方の種の第VIII因子の対応する配列を置換する一方の種の第VIII因子の１以上の固有のアミノ酸を含むドメインよりも短い少なくとも１つの特異的な配列を含むヒトまたは非ヒト哺乳動物の第VIII因子からなる群より選択され、ここで、該対応する配列は、配列番号２に示すヒト第 VIII因子の484位〜509位に対応するアミノ酸配列を少なくとも含み、そして該ハイブリッド第VIII因子は、第VIII因子に対する阻害抗体に対する免疫反応性がヒトまたはブタ第VIII因子よりも低い、ハイブリッド第VIII因子分子。２．他方の種の第VIII因子の１以上の固有のアミノ酸を含む前記特異的な配列により置換される一方の種の第VIII因子の１以上のアミノ酸の対応する配列が、37 3位〜540位、373位〜509位、445位〜509位、および404位〜509位のアミノ酸からなる群より選択される配列番号２に示すヒトアミノ酸配列に対応する、請求項１に記載のハイブリッド第VIII因子分子。３．前記分子がハイブリッドヒト/ブタ分子であり、前記特異的な配列により置換される前記対応する配列がヒトであり、そして該特異的な配列がブタである、請求項２に記載のハイブリッド第VIII因子分子。４．前記ハイブリッド第VIII因子が凝固活性を阻害する第VIII因子に対する抗体を有するヒト患者を処置するのに有用である、請求項１に記載のハイブリッド第 VIII因子分子。５．ボンウィレブランド因子、ビタミンＫ依存性クロッティング因子、および凝固因子組織因子からなる群より選択されるクロッティング因子と組み合わせて、請求項１に記載のハイブリッド第VIII因子分子を含む、組成物。６．前記対応するヒトドメインを置換する前記非ヒト哺乳動物ドメインがブタA2 ドメインまたは、マウスA2ドメインである、請求項１に記載のハイブリッド第VI II因子分子。７．前記対応するヒト配列を置換する前記非ヒト哺乳動物配列がブタまたはマウスであり、そして対応するヒトアミノ酸の484位〜509位を置換する１以上の固有のアミノ酸を含む前記非ヒト哺乳動物の特異的配列がマウスまたはブタである、請求項１に記載のハイブリッド第VIII因子分子。８．前記分子がＢドメインを欠損する、請求項１〜７のいずれかに記載のハイブリッド第VIII因子分子。９．第VIII因子欠乏症のヒト患者を処置するための薬剤を製造するための方法であって、請求項１〜７のいずれかにより規定されるハイブリッド第VIII因子分子を調製する工程を包含する、方法。１０．精製されたハイブリッド第VIII因子を調製する方法であって、ここで該ハイブリッド第VIII因子がマウスおよびヒトアミノ酸配列を含み、マウスＡ１、Ａ２、Ｂ、Ａ３、Ｃ１、およびＣ２からなる群より選択される１以上のドメイン、ならびにヒトＡ１、Ａ２、Ａ３、Ｃ１、およびＣ２からなる群より選択される１以上のドメインを単離し、そして精製する工程；およびヒトドメインおよびマウスドメインを混合して凝固因子活性を有するハイブリッド第VIII因子分子を形成する工程を包含する、方法。１１．前記ヒトまたはマウス第VIII因子ドメインがヒト血漿またはマウス血漿から単離される、請求項１０に記載の方法。１２．精製されたハイブリッド第VIII因子を調製する方法であって、ここで該ハイブリッド第VIII因子はマウスおよびヒトアミノ酸配列を含み、マウスおよびヒト第VIII因子のＡ１、Ａ２、Ｂ、Ａ３、Ｃ１、およびＣ２ドメインからなる群より選択されるドメインをコードする組換えDNAを発現させる工程を包含し、マウス第VIII因子およびヒト第VIII因子の１以上のドメインを置換する工程をさらに包含する、方法。１３．前記ドメインがＡ２である、請求項１２に記載の方法。１４．Ｂドメインを欠失させてＢドメイン欠失ハイブリッド第VIII因子を作製する工程をさらに包含する、請求項１２〜１３のいずれかに記載の方法。１５．精製された凝血促進性ハイブリッド第VIII因子を調製する方法であって、ここで該ハイブリッド第VIII因子がブタアミノ酸配列またはマウスアミノ酸配列およびヒトアミノ酸配列を含み、コードする核酸の部位特異的変異誘発により、配列番号２に示すヒト第VIII因子の484位〜509位に対応する少なくとも１つの特異的な配列で他方の種の第VIII因子のアミノ酸の対応する配列を置換する工程を包含する、方法。１６．請求項１、請求項２、および請求項７に記載の前記ハイブリッド第VIII因子分子を調製するための、請求項１５に記載の方法。１７．他方の種の前記第VIII因子の１以上の固有のアミノ酸を含む前記特異的な配列により置換される一方の種の該第VIII因子の１以上のアミノ酸の前記対応する配列が、373位〜540位、373位〜509位、445位〜509位、および404位〜509位のアミノ酸からなる群より選択される配列番号２に示すヒトアミノ酸配列に対応する、請求項１５に記載の方法。１８．他方の種の第VIII因子の１以上のアミノ酸の対応する配列を置換する一方の種の第VIII因子の１以上の固有のアミノ酸を含む前記特異的な配列が、凝固因子活性の決定因子を含む、請求項１５に記載の方法。１９．ヒト血漿が１段階のインビトロ凝固アッセイにおいて標準として使用される場合、前記ハイブリッド第VIII因子がヒト第VIII因子よりも高い凝固因子活性を有する、請求項１８に記載の方法。２０．他方の種の第VIII因子の１以上の固有のアミノ酸を含む前記特異的な配列により置換される一方の種の第VIII因子の１以上のアミノ酸の前記対応する配列が、凝固因子活性を阻害する第VIII因子に対する抗体と反応する抗原部位を含み、そして前記ハイブリッド第VIII因子が、第VIII因子に対する阻害抗体に対する免疫反応性がヒト第VIII因子よりも低い、請求項１５に記載の方法。２１．Ｂドメインを欠失させてハイブリッドＢドメイン欠失第VIII因子を作製する工程をさらに包含する、請求項１５〜２０のいずれかに記載の方法。２２．精製されたハイブリッド第VIII因子を調製する方法であって、ここで該ハイブリッド第VIII因子はブタおよびヒトアミノ酸配列を含み、ブタおよびヒト第VIII因子のＡ１、Ｂ、Ａ３、Ｃ１、およびＣ２ドメインからなる群より選択されるドメインをコードする組換えDNAを発現させる工程を包含し、ブタおよびヒト第VIII因子の１以上のドメインを置換する工程をさらに包含する、方法。２３．Ｂドメインを欠失させてハイブリッドＢドメイン欠失第VIII因子を作製する工程をさらに包含する、請求項２２に記載の方法。２４．精製されたハイブリッド第VIII因子分子であって、一方の種の第VIII因子の非ヒト哺乳動物アミノ酸および別の種の第VIII因子の非ヒト哺乳動物アミノ酸を含み、ここで該分子がインビトロ凝固アッセイにおいて凝血促進活性を有し、そして凝固因子活性を阻害する、ヒト第VIII因子に対する抗体に対して低下した免疫反応性を有する、ハイブリッド第VIII因子分子。２５．精製されたハイブリッド第VIII因子の等価分子であって、ヒト第VIII因子、非ヒト哺乳動物第VIII因子、またはハイブリッドヒト/非ヒト哺乳動物第VIII 因子を包含し、ここで該分子はインビトロ凝固アッセイにおいて、凝血促進活性を有し、ヒト第VIII因子、非ヒト哺乳動物第VIII因子、またはハイブリッドヒト /非ヒト哺乳動物第VIII因子において配列番号２に示すヒト第VIII因子の484位〜 509位に対応する特異的アミノ酸配列を置換する第VIII因子に同一な公知の配列を有さない少なくとも１つの配列を含む、等価分子。２６．ヒト血漿を標準として用いる一段階のインビトロ凝固アッセイにおいて、ヒト第VIII因子より高い凝血促進活性を有する、請求項２５に記載の等価分子。２７．第VIII因子に同一な公知の配列を有さない前記アミノ酸配列が１以上のアラニン残基を含む、請求項２５に記載の等価分子。２８．ヒト第VIII因子、非ヒト哺乳動物第VIII因子、またはハイブリッドヒト/ 非ヒト哺乳動物第VIII因子において前記特異的アミノ酸配列が、第VIII因子の凝固因子活性を阻害する抗体に対する免疫反応性を有するエピトープを含み、ここでハイブリッド第VIII因子の等価分子の該抗体に対する低下した免疫反応性を有する、請求項２５に記載の等価分子。２９．第VIII因子に同一な公知の配列を有さない前記アミノ酸配列が１以上のアラニン残基を含む、請求項２５に記載の等価分子。３０．Ｂドメインを欠損する、請求項２５〜２９のいずれかに記載の等価分子。３１．ヒト第VIII因子、非ヒト哺乳動物第VIII因子、またはハイブリッドヒト/ 非ヒト哺乳動物第VIII因子を含むハイブリッド第VIII因子の等価分子を調製する方法であって、ここで該等価分子はインビトロ凝固アッセイにおいて凝血促進活性を有し、ヒト第VIII因子、非ヒト哺乳類第VIII因子、またはハイブリッドヒト/非ヒト哺乳類第VIII因子において配列番号２で示すヒト第VIII因子の484位〜509位に対応する特異的なアミノ酸配列を第VIII因子に同一な公知の配列を有さない少なくとも一つの配列で置換する工程を包含する、方法。３２．第VIII因子に同一な公知の配列を有さない前記アミノ酸配列が、１以上のアラニン残基を含む、請求項３１に記載の方法。３３．別の種の第VIII因子の１以上のアミノ酸の対応する配列、または前記ハイブリッド第VIII因子の１以上のアミノ酸の対応する配列を、一方の種の第VIII因子の凝固因子活性の決定因子を含む１以上の固有のアミノ酸の少なくとも１つの特異的な配列で置換する工程であって、ここでヒト血漿を標準として用いる１段階の凝固アッセイにおいて、該ハイブリッド第VIII因子の等価分子がヒト第VIII 因子よりも高い凝固因子活性を有する工程をさらに包含する、請求項３１に記載の方法。３４．ヒト第VIII因子、非ヒト哺乳動物第VIII因子、またはハイブリッドヒト/ 非ヒト哺乳動物第VIII因子における前記特異的なアミノ酸配列が第VIII因子の凝固因子活性を阻害する抗体に対して免疫反応性を有するエピトープを含み、ここで前記ハイブリッド第VIII因子の等価分子が該抗体に対する低下した免疫反応性を有する、請求項３１に記載の方法。３５．第VIII因子に同一な公知の配列を有さない前記アミノ酸配列が１以上のアラニン残基を含む、請求項３１に記載の方法。３６．Ｂドメインを欠失させる工程をさらに包含する、請求項３１〜３５のいずれかに記載の方法。３７．請求項１、請求項２４、または請求項２５に記載の前記ハイブリッド第VI II因子分子を含む、融合タンパク質。３８．ヒトおよび非ヒト哺乳動物のアミノ酸配列を含むハイブリッドヒト/非ヒト哺乳動物第VIII因子分子をコードする単離された核酸配列であって、ここで該分子はインビトロ凝固アッセイにおいて凝血促進活性を有し、そして該分子は他の種の第VIII因子のアミノ酸の対応する配列を置換するドメインよりも短い一方の種の第VIII因子の固有のアミノ酸を含む少なくとも一つの特異的な配列を含み、ここで置換される該対応する配列は配列番号２に示すヒト第VIII因子の484位〜509位に対応するアミノ酸の配列を含み、そして該ハイブリッド第VIII因子は第VIII因子に対する阻害抗体に対する免疫反応性がヒト第VIII因子よりも低い、単離された核酸配列。３９．１段階の凝固アッセイにおいてヒト血漿が標準として使用される場合、前記分子がヒト第VIII因子よりも高い特異的な活性を有する、請求項３８に記載の単離された核酸配列。４０．前記他方の種の第VIII因子の固有のアミノ酸を含む特異的な配列により置換される一方の種の第VIII因子のアミノ酸の前記対応する配列が、アミノ酸373 位〜540位、373位〜509位、そして45位〜509位からなる群より選択される配列番号２に示すヒトアミノ酸配列に対応する、請求項３８に記載の単離された核酸配列。４１．前記ハイブリッド第VIII因子が凝固活性を阻害する第VIII因子に対する抗体を有するヒト患者を処置するのに有用である、請求項３８に記載の単離された核酸配列。４２．前記分子がＢドメインを欠損する、請求項３８〜４１のいずれかに記載の単離された核酸配列。４３．ヒト第VIII因子、非ヒト哺乳動物第VIII因子、またはハイブリッドヒト/ 非ヒト哺乳動物第VIII因子を含むハイブリッド第VIII因子の等価分子をコードする単離された核酸配列であって、ここで該分子はインビトロ凝固アッセイにおいて凝血促進活性を有し、ヒト第VIII因子、非ヒト哺乳動物第VIII因子、またはハイブリッドヒト/非ヒト哺乳動物第VIII因子において、配列番号２に示すヒト第V III因子の484位〜509位に対応する特異的なアミノ酸配列を置換する第VIII因子に同一な公知の配列を有さない少なくとも１つの配列を含む、核酸配列。４４．ヒト血漿を標準として用いる１段階のインビトロ凝固アッセイにおいてヒト第VIII因子よりも高い凝固因子活性を有する、請求項４３に記載の単離された核酸配列。４５．ヒト第VIII因子、非ヒト哺乳動物第VIII因子、またはハイブリッドヒト/ 非ヒト哺乳動物第VIII因子において、前記特異的なアミノ酸配列が第VIII因子の凝固因子活性を阻害する抗体に対する免疫反応性を有するエピトープを含み、そして前記ハイブリッド第VIII因子の等価分子が該抗体に対する低下した免疫反応性を有する、請求項４３に記載の単離された核酸配列。４６．第VIII因子に同一な公知の配列を有さない前記アミノ酸配列が１以上のアラニン残基を含む、請求項４３に記載の単離された核酸配列。４７．前記分子がＢドメインを欠損する、請求項４３〜４６に記載の単離された核酸配列。４８．薬剤に使用するための、請求項１〜８、請求項２４〜３０、または請求項３７のいずれかに記載のハイブリッド第VIII因子分子。４９．ヒト第VIII因子欠乏症の処置での使用のための薬剤の製造における、請求項１〜８、請求項２４〜３０、または請求項３７のいずれかに記載の分子の使用。５０．前記ハイブリッドヒト/非ヒト哺乳動物またはハイブリッド等価分子のクロッティング活性が第VIII因子の凝固因子活性を阻害する抗体に対する低下した免疫反応性を有する、請求項４９に記載の使用。５１．前記患者が第VIII因子に対する抗体の存在により特徴づけられる、請求項５０に記載の使用。