JP2002537761A - トランスジェニック循環内皮細胞 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
事前選択された生理活性ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むベクターでトランスフェクトされることができる末梢血から得られた内皮細胞の集団を拡大する方法を提供する。得られたトランスジェニック内皮細胞は、移植可能な医療デバイスを生体適合性にするために有用であり、又は、例えば、遺伝子治療のために直接使用されることができる。
Description
【０００１】 本発明の背景 本発明は、ＮＩＨ認可第ＨＬ５５１７４（現在、ＨＬ３０１６０）の支援によ
り行われた。合衆国政府は本発明内に一定の権利を有する。
り行われた。合衆国政府は本発明内に一定の権利を有する。
【０００２】 内皮細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）は、血管生理学の多くの働き
に参加する。多数の因子、例えば、サイトカインが、内皮細胞の表面を変更し、
そしてそれにより血液凝固、炎症、血管調節、及び接着における内皮の役割を調
節する。例えば、R.P.Hebbel et al., J.Lab.Clin.Med., 129, 288 (1997) ; J.
S.Pober, Am.J.Path., 133, 426 (1988) ; E.J.Favaloro, Immunol.Cell.Biol.,
71, 571 (1993) を参照のこと。内皮細胞は、急性痛性分利（ａｃｕｔｅ ｐａ
ｉｎｆｕｌ ｃｒｉｓｅｓ）を引き起こす血管閉塞を含む、鎌状赤血球貧血の血
管病変においても重要な役割を演じることができる。しかしながら、この領域に
おける調査は、患者における血管内皮が手に入らないことにより妨害されてきた
。例えば、Ｅ．Ｍ．Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ．（米国特許第５，１３２，２２
３号）は、脳死であるが心鼓動する死体臓器由来の成人ヒト内皮細胞のクローニ
ング及び連続培養について開示した。K.Gupta et al., Exp.Cell.Res., 230, 24
4(1997) は、新生ヒト包皮由来微小血管内皮細胞を報告した。従って、循環性内
皮細胞は、血管病理学の研究、遺伝子治療、及び生体臨床医学の操作用途のため
の有用な材料を提供するかもしれない。先の調査においては、増加数の循環内皮
細胞が、鎌状赤血球貧血その他の血管損傷に関連する症状、例えば、サイトメガ
ロウイルス感染、リケッチア感染、心筋梗塞、血管内器具使用、及び内毒素血症
に因るものにおいて、見つかっている。例えば、F.George et al., Blood, 80,
Suppl:12a, abstract (1992) ; E.Percivalle et al., J.Clin.Invest., 92, 66
3 (1993) ;F.George et al., Blood, 82, 2109 (1993) ; C.A.Bouvier et al., Thomb. Diath. Haemorrh. Suppl. , 40, 163 (1970) ; F.George et al., J.Immu nol.Meth. , 139, 65 (1991) 及びR.G.Gerrity et al., Exp.Mol.Pathol., 24, 5
9 (1976) を参照のこと。
に参加する。多数の因子、例えば、サイトカインが、内皮細胞の表面を変更し、
そしてそれにより血液凝固、炎症、血管調節、及び接着における内皮の役割を調
節する。例えば、R.P.Hebbel et al., J.Lab.Clin.Med., 129, 288 (1997) ; J.
S.Pober, Am.J.Path., 133, 426 (1988) ; E.J.Favaloro, Immunol.Cell.Biol.,
71, 571 (1993) を参照のこと。内皮細胞は、急性痛性分利（ａｃｕｔｅ ｐａ
ｉｎｆｕｌ ｃｒｉｓｅｓ）を引き起こす血管閉塞を含む、鎌状赤血球貧血の血
管病変においても重要な役割を演じることができる。しかしながら、この領域に
おける調査は、患者における血管内皮が手に入らないことにより妨害されてきた
。例えば、Ｅ．Ｍ．Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ．（米国特許第５，１３２，２２
３号）は、脳死であるが心鼓動する死体臓器由来の成人ヒト内皮細胞のクローニ
ング及び連続培養について開示した。K.Gupta et al., Exp.Cell.Res., 230, 24
4(1997) は、新生ヒト包皮由来微小血管内皮細胞を報告した。従って、循環性内
皮細胞は、血管病理学の研究、遺伝子治療、及び生体臨床医学の操作用途のため
の有用な材料を提供するかもしれない。先の調査においては、増加数の循環内皮
細胞が、鎌状赤血球貧血その他の血管損傷に関連する症状、例えば、サイトメガ
ロウイルス感染、リケッチア感染、心筋梗塞、血管内器具使用、及び内毒素血症
に因るものにおいて、見つかっている。例えば、F.George et al., Blood, 80,
Suppl:12a, abstract (1992) ; E.Percivalle et al., J.Clin.Invest., 92, 66
3 (1993) ;F.George et al., Blood, 82, 2109 (1993) ; C.A.Bouvier et al., Thomb. Diath. Haemorrh. Suppl. , 40, 163 (1970) ; F.George et al., J.Immu nol.Meth. , 139, 65 (1991) 及びR.G.Gerrity et al., Exp.Mol.Pathol., 24, 5
9 (1976) を参照のこと。
【０００３】 しかしながら、正常なドナーにおいては、血液１ml当りほんの約２〜３の循環
内皮細胞が存在し；そららは、静止性の（ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ）表現型をもち、
そしてその中の約５０％が、ＣＤ３６陽性により証明されるように微小血管性で
ある。先に引用したＧｕｐｔａ ｅｔ ａｌ．の方法論を用いて、一次微小血管
内皮細胞（ＭＶＥＣ）と、鎌状赤血球貧血をもつ患者の血液中で同定された生き
た循環内皮細胞を同時培養することを報告したA.Solovey et al., New Engl.J.M ed. , 337, 1584 (1997) を参照いこと。T.Asahara et al., Science, 275, 964(
1997) は、細胞表面抗原の発現に基づく磁気ビーズ選択によるＣＤ34+ 濃縮後ヒ
ト末梢血液から推定内皮細胞（ＥＣ）の先駆細胞を単離した。細胞を、ウシ脳抽
出物と２０％胎児ウシ血清を含む修飾Ｍ−１９９培地中のフィブロネクチン被覆
ウェル上で培養した。Q.Shi et al., Blood, 92, 362 (1998) は、ネズミ抗−Ｃ
Ｄ３４+ 抗体結合性を用いその後抗マウス免疫磁気ビーズに暴露して末梢血液由
来ＣＤ３４+ 細胞を単離することにより骨髄由来前駆内皮細胞を特徴付けた。上
記細胞を、ＶＥＧＦ，ＦＢＳ，ｂＦＧＦ、及びＩＧＦを含有するＭ１９９培地中
でセラチン又はフィブロネクチン被覆プラスチックのウェル内で培養した。
内皮細胞が存在し；そららは、静止性の（ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ）表現型をもち、
そしてその中の約５０％が、ＣＤ３６陽性により証明されるように微小血管性で
ある。先に引用したＧｕｐｔａ ｅｔ ａｌ．の方法論を用いて、一次微小血管
内皮細胞（ＭＶＥＣ）と、鎌状赤血球貧血をもつ患者の血液中で同定された生き
た循環内皮細胞を同時培養することを報告したA.Solovey et al., New Engl.J.M ed. , 337, 1584 (1997) を参照いこと。T.Asahara et al., Science, 275, 964(
1997) は、細胞表面抗原の発現に基づく磁気ビーズ選択によるＣＤ34+ 濃縮後ヒ
ト末梢血液から推定内皮細胞（ＥＣ）の先駆細胞を単離した。細胞を、ウシ脳抽
出物と２０％胎児ウシ血清を含む修飾Ｍ−１９９培地中のフィブロネクチン被覆
ウェル上で培養した。Q.Shi et al., Blood, 92, 362 (1998) は、ネズミ抗−Ｃ
Ｄ３４+ 抗体結合性を用いその後抗マウス免疫磁気ビーズに暴露して末梢血液由
来ＣＤ３４+ 細胞を単離することにより骨髄由来前駆内皮細胞を特徴付けた。上
記細胞を、ＶＥＧＦ，ＦＢＳ，ｂＦＧＦ、及びＩＧＦを含有するＭ１９９培地中
でセラチン又はフィブロネクチン被覆プラスチックのウェル内で培養した。
【０００４】 しかしながら、血液中のＣＥＣの低濃度に因り、先に討議した付帯単離困難性
を伴わずに、血液からＣＥＣの速い増加を許容するであろう培養方法及び培養基
に関する必要性が存在する。 本発明の要約 本発明は、末梢哺乳動物血液、すなわち、動物又はヒト患者から得られた血液
のアリコート中に存在する内皮細胞（ＥＣ）の集団の拡大方法を提供する。本法
は、末梢哺乳動物血液から容易に得られる、軟層（ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ）単核
細胞を培養することを含む。この軟層単核細胞を、Ｉ型コラーゲンで被覆された
表面、例えば、被覆されたプラスチック培養ウェル、培養フラスコ又はバイオリ
アクターの壁と接触させて、ウシ脳抽出物を含有しない、血管内皮成長因子（Ｖ
ＥＧＦ）の有効量を含有する培養基中で、培養する。場合により、上記軟層単核
細胞を、その後、フィブロネクチン／ゼラチンで被覆された表面に接触させて、
培養することができる。上記培養は、ヘパリン及び／又は硫酸デキストラン、並
びに他の成長因子であって内皮細胞培養基中で慣用されているものを含むことも
できる。本発明は、軟層単核細胞の集団中に存在する内皮細胞及びいずれかの内
皮前駆細胞の初期集団の速い、かつ、大きな拡大を達成する。例えば、本発明の
方法は、典型的には、内皮細胞が最初にカウントされるとき、２日目の培養物上
に同定されることができる２０〜３０の内皮細胞よりも少なくとも１０億倍多い
内皮細胞の成長（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）をもたらす。この内皮細胞の成長は、２
つの集団の拡大を含む。新鮮血液中に存在する血管壁起源をもつ成熟内皮細胞の
限定された拡大、並びに骨髄由来細胞、例えば、同じく新鮮血液中に存在する内
皮前駆細胞又は血管芽細胞のより稀な集団の遅れているが、より大きな拡大が存
在する。
を伴わずに、血液からＣＥＣの速い増加を許容するであろう培養方法及び培養基
に関する必要性が存在する。 本発明の要約 本発明は、末梢哺乳動物血液、すなわち、動物又はヒト患者から得られた血液
のアリコート中に存在する内皮細胞（ＥＣ）の集団の拡大方法を提供する。本法
は、末梢哺乳動物血液から容易に得られる、軟層（ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ）単核
細胞を培養することを含む。この軟層単核細胞を、Ｉ型コラーゲンで被覆された
表面、例えば、被覆されたプラスチック培養ウェル、培養フラスコ又はバイオリ
アクターの壁と接触させて、ウシ脳抽出物を含有しない、血管内皮成長因子（Ｖ
ＥＧＦ）の有効量を含有する培養基中で、培養する。場合により、上記軟層単核
細胞を、その後、フィブロネクチン／ゼラチンで被覆された表面に接触させて、
培養することができる。上記培養は、ヘパリン及び／又は硫酸デキストラン、並
びに他の成長因子であって内皮細胞培養基中で慣用されているものを含むことも
できる。本発明は、軟層単核細胞の集団中に存在する内皮細胞及びいずれかの内
皮前駆細胞の初期集団の速い、かつ、大きな拡大を達成する。例えば、本発明の
方法は、典型的には、内皮細胞が最初にカウントされるとき、２日目の培養物上
に同定されることができる２０〜３０の内皮細胞よりも少なくとも１０億倍多い
内皮細胞の成長（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）をもたらす。この内皮細胞の成長は、２
つの集団の拡大を含む。新鮮血液中に存在する血管壁起源をもつ成熟内皮細胞の
限定された拡大、並びに骨髄由来細胞、例えば、同じく新鮮血液中に存在する内
皮前駆細胞又は血管芽細胞のより稀な集団の遅れているが、より大きな拡大が存
在する。
【０００５】 予想外に、上記の培養された内皮細胞が、慣用の冷凍保存培地中での冷凍保存
に、そしてその後の解凍及び連続培養／拡大になじみやすいことが分っている。
従って、本発明は、例えば、Ｅ．Ｍ．Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ．（米国特許第
５，１３２，２２３号）中に記載されたような、成人血管ヒト内皮細胞のプロセ
ッシング及び培養に基づく方法よりも便利であり、かつ、簡単である。それは、
抗体及び／又は磁気ビーズ技術を用いたＥＣに富む造血細胞のサブ集団の選択を
含まない。
に、そしてその後の解凍及び連続培養／拡大になじみやすいことが分っている。
従って、本発明は、例えば、Ｅ．Ｍ．Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ．（米国特許第
５，１３２，２２３号）中に記載されたような、成人血管ヒト内皮細胞のプロセ
ッシング及び培養に基づく方法よりも便利であり、かつ、簡単である。それは、
抗体及び／又は磁気ビーズ技術を用いたＥＣに富む造血細胞のサブ集団の選択を
含まない。
【０００６】 本発明は、少なくとも１の生物学的に活性な事前選択されたタンパク質又はポ
リペプチド、例えば、第VIII因子タンパク質をコードする組換えＤＮＡ配列、並
びに場合により、選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子を含む、単離、精製
されたトランスジェニック哺乳動物内皮細胞をも含む。好ましくは、上記トラン
スジェニック内皮細胞は、本発明に従って血液から成長した循環性内皮細胞の集
団を、上記内皮細胞内で働くプロモーターに作用可能な状態で連結された着目の
タンパク質／ポリペプチドをコードする単離ＤＮＡ配列を含むベクターで、安定
して形質転換（トランスフェクト／形質導入）することにより作製される。
リペプチド、例えば、第VIII因子タンパク質をコードする組換えＤＮＡ配列、並
びに場合により、選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子を含む、単離、精製
されたトランスジェニック哺乳動物内皮細胞をも含む。好ましくは、上記トラン
スジェニック内皮細胞は、本発明に従って血液から成長した循環性内皮細胞の集
団を、上記内皮細胞内で働くプロモーターに作用可能な状態で連結された着目の
タンパク質／ポリペプチドをコードする単離ＤＮＡ配列を含むベクターで、安定
して形質転換（トランスフェクト／形質導入）することにより作製される。
【０００７】 上記トランスジェニック細胞の集団は、医薬組成物に配合さっれ、そして好ま
しくは医薬として許容される担体とともに、血友病にかかった哺乳動物、例えば
ヒト患者に投与されることができる。上記担体は、液体担体（例えば、生理食塩
水溶液）又は固体担体；例えば、インプラントであることができる。液体担体の
使用においては、操作された細胞が、例えば、静脈内、皮下、筋中、腹腔内、病
巣内、その他の経路で、導入されることができる。上記ポリペプチド、例えば、
第VIII因子タンパク質（単数又は複数）は、すなわち、上記血友病を治療する（
軽減させる）ために有効な量で上記哺乳動物の血流中に、その場で発現される。
上記トランスジェニック内皮細胞は骨髄にも転移するけれども、それらは、循環
性の病状を治療することとは別に、遺伝子治療の多くの局面のためにも有用であ
る。例えば、移植可能な装置の生物学的適合化、診断、及び局所ドラッグ・デリ
バリーにおける上記トランスジェニックＥＣの他の使用を、本明細書中以下に討
議する。
しくは医薬として許容される担体とともに、血友病にかかった哺乳動物、例えば
ヒト患者に投与されることができる。上記担体は、液体担体（例えば、生理食塩
水溶液）又は固体担体；例えば、インプラントであることができる。液体担体の
使用においては、操作された細胞が、例えば、静脈内、皮下、筋中、腹腔内、病
巣内、その他の経路で、導入されることができる。上記ポリペプチド、例えば、
第VIII因子タンパク質（単数又は複数）は、すなわち、上記血友病を治療する（
軽減させる）ために有効な量で上記哺乳動物の血流中に、その場で発現される。
上記トランスジェニック内皮細胞は骨髄にも転移するけれども、それらは、循環
性の病状を治療することとは別に、遺伝子治療の多くの局面のためにも有用であ
る。例えば、移植可能な装置の生物学的適合化、診断、及び局所ドラッグ・デリ
バリーにおける上記トランスジェニックＥＣの他の使用を、本明細書中以下に討
議する。
【０００８】 本発明の拡大された循環内皮細胞を形質転換させるために有用な新規ベクター
も、本発明の範囲内にある。 本発明の詳細な説明 本発明の方法において使用される内皮細胞培養基は、内皮細胞成長因子（ＥＣ
Ｇ又はＶＥＧＦ）の有効量を含むように、かつ、ウシ脳抽出物を除外するように
、本発明の方法に従って修飾されるような、上記タイプの細胞の培養のために便
利に使用される培地のいずれかを含む。ウシ脳抽出物の除外は、配合物のコンシ
ステンシーの点から、そして細胞が上記抽出物中に存在するかもしれない感染剤
（ウイルス、プリオン、等）による汚染のリスクに晒されないという点で、健康
の点から、有利である。
も、本発明の範囲内にある。 本発明の詳細な説明 本発明の方法において使用される内皮細胞培養基は、内皮細胞成長因子（ＥＣ
Ｇ又はＶＥＧＦ）の有効量を含むように、かつ、ウシ脳抽出物を除外するように
、本発明の方法に従って修飾されるような、上記タイプの細胞の培養のために便
利に使用される培地のいずれかを含む。ウシ脳抽出物の除外は、配合物のコンシ
ステンシーの点から、そして細胞が上記抽出物中に存在するかもしれない感染剤
（ウイルス、プリオン、等）による汚染のリスクに晒されないという点で、健康
の点から、有利である。
【０００９】 好ましくは、上記培地は、ヘパリン、硫酸デキストラン又はそれらの組合せ物
を含む。これらの材料は、米国特許第５，１３２，２２３号中に詳細に記載され
ている。さまざまな基本内皮細胞成長培地の中で、ＥＧＭ（商標）−２（Clonet
ics, Inc., San Diego, CA）が特に好ましい。それは、ＣＣＭＤ（商標）１３０
培養基プラスヒト上皮成長因子（ｈＥＧＦ）、ヒト塩基性線維芽細胞成長因子（
ｈＦＧＦ−Ｂ）、ヒト組換えインスリン様成長因子（Ｌｏｎｇ Ｒ３−ＩＧＦ−
１）に基づく。ＦＧＦは約０．５〜５ng／mlにおいて存在することができ、ＥＧ
Ｆは約０．５〜１０ng／mlにおいて存在することができ、そしてＩＧＦは約１〜
７．５ng／ml上記培養基において存在することができる。
を含む。これらの材料は、米国特許第５，１３２，２２３号中に詳細に記載され
ている。さまざまな基本内皮細胞成長培地の中で、ＥＧＭ（商標）−２（Clonet
ics, Inc., San Diego, CA）が特に好ましい。それは、ＣＣＭＤ（商標）１３０
培養基プラスヒト上皮成長因子（ｈＥＧＦ）、ヒト塩基性線維芽細胞成長因子（
ｈＦＧＦ−Ｂ）、ヒト組換えインスリン様成長因子（Ｌｏｎｇ Ｒ３−ＩＧＦ−
１）に基づく。ＦＧＦは約０．５〜５ng／mlにおいて存在することができ、ＥＧ
Ｆは約０．５〜１０ng／mlにおいて存在することができ、そしてＩＧＦは約１〜
７．５ng／ml上記培養基において存在することができる。
【００１０】 上記培地は、ヒドロコルチゾン（０．１〜２μｇ／ml）、ヘパリン（１〜２０
μｇ／ml）、ゲンタマイシン、アンフォテリシン−Ｂ（０．１〜０．５mg／ml）
、及び胎児ウシ血清を含むことができる。血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、約
１〜１００ng／ml、好ましくは約５〜２５ng／mlで存在する。それは、いくつか
の商業的に入手できる培地又は補給物においては上記濃度レンジ内に含まれ、又
はCollaborative Research, Inc.から入手されうる。ＶＥＧＦは、Maciag et al
., PNAS USA, 76, 5674(1979) により記載されるように調製されることもできる
。
μｇ／ml）、ゲンタマイシン、アンフォテリシン−Ｂ（０．１〜０．５mg／ml）
、及び胎児ウシ血清を含むことができる。血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、約
１〜１００ng／ml、好ましくは約５〜２５ng／mlで存在する。それは、いくつか
の商業的に入手できる培地又は補給物においては上記濃度レンジ内に含まれ、又
はCollaborative Research, Inc.から入手されうる。ＶＥＧＦは、Maciag et al
., PNAS USA, 76, 5674(1979) により記載されるように調製されることもできる
。
【００１１】 培養前に軟層単核細胞を分散させ、そして前洗浄するために有効な培地は、K.
Gupta et al., Exp. Cell Res., 230, 244 (1997) により記載されている。この
内皮培養基は、１μｇ／mlの酢酸ヒドロコルチゾン、５×１０-4Ｍジブチリルｃ
ＡＭＰ、１．６ＮＭＬ−グルタミン、１００Ｕ／mlペニシリン、１００Ｕ／mlス
トレプトマイシン、０．２５mg／mlアンホテリシンＢ、０．００４％ヘパリン、
及び２０％ヒト男性血清を補ったＭＣＤＢ１３１培地から成る。ＶＥＧＦ（０．
０１〜１００ng／ml）を、この培地に添加することもできる。
Gupta et al., Exp. Cell Res., 230, 244 (1997) により記載されている。この
内皮培養基は、１μｇ／mlの酢酸ヒドロコルチゾン、５×１０-4Ｍジブチリルｃ
ＡＭＰ、１．６ＮＭＬ−グルタミン、１００Ｕ／mlペニシリン、１００Ｕ／mlス
トレプトマイシン、０．２５mg／mlアンホテリシンＢ、０．００４％ヘパリン、
及び２０％ヒト男性血清を補ったＭＣＤＢ１３１培地から成る。ＶＥＧＦ（０．
０１〜１００ng／ml）を、この培地に添加することもできる。
【００１２】 循環内皮細胞を、本分野において周知の方法論により軟層単核細胞の単離を弁
して白血球から単離することができる。例えば、A.Solovey et al., New Engl.J .Med. , 337, 1584 (1997) を参照のこと。白血球は、抗−凝固化され、そしてＥ
ＤＴＡとＢＳＡを含む生理学的塩溶液で希釈される。この希釈された血液を、Hi
stopaque(商標）1077（Sigma Chem. Co.）上に重層し、そして周囲温度で遠心分
離する。軟層被覆単核細胞を集め、そして上述のK.Gupta et al., Exp.Cell. Re search , 230, 244 (1977）中に記載された培地、すなわち、補足ＭＣＤＢ１３１
培地とともに遠心分離することにより洗浄される。
して白血球から単離することができる。例えば、A.Solovey et al., New Engl.J .Med. , 337, 1584 (1997) を参照のこと。白血球は、抗−凝固化され、そしてＥ
ＤＴＡとＢＳＡを含む生理学的塩溶液で希釈される。この希釈された血液を、Hi
stopaque(商標）1077（Sigma Chem. Co.）上に重層し、そして周囲温度で遠心分
離する。軟層被覆単核細胞を集め、そして上述のK.Gupta et al., Exp.Cell. Re search , 230, 244 (1977）中に記載された培地、すなわち、補足ＭＣＤＢ１３１
培地とともに遠心分離することにより洗浄される。
【００１３】 軟層被覆単核細胞は、内皮細胞培養基（すなわち、ＥＧＭ（商標）−２）中に
再懸濁され、そしてＩ型コラーゲンで被覆されたその壁をもつ好適な血管内に保
持される。Ｉ型コラーゲンは、Sigma Chem. co.(st.Louis, Mo）から商業的に入
手可能であり、そしてウシ・アキレス腱、ウシ皮膚、ラット尾部、及びヒト胎盤
から得られうる。例えば、Niy:loizi et al., J.Biol.Chem., 259, 14170 (1984
) を参照のこと。培養２日目に、付着していない軟層単核細胞及び細胞死骸を、
上記培地交換時に除去し、そして少数の接着細胞が内皮細胞形態を示し、そして
ｍＡｂ Ｐ１Ｈ１２で陽性に染色される。
再懸濁され、そしてＩ型コラーゲンで被覆されたその壁をもつ好適な血管内に保
持される。Ｉ型コラーゲンは、Sigma Chem. co.(st.Louis, Mo）から商業的に入
手可能であり、そしてウシ・アキレス腱、ウシ皮膚、ラット尾部、及びヒト胎盤
から得られうる。例えば、Niy:loizi et al., J.Biol.Chem., 259, 14170 (1984
) を参照のこと。培養２日目に、付着していない軟層単核細胞及び細胞死骸を、
上記培地交換時に除去し、そして少数の接着細胞が内皮細胞形態を示し、そして
ｍＡｂ Ｐ１Ｈ１２で陽性に染色される。
【００１４】 培養された細胞を、倒立位相差顕微鏡により評価して、内皮細胞の特徴的な丸
石（ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅ）形態を確認し、そして内皮細胞以下の細胞の存在
について調べた。細胞を、免疫蛍光及びフロー・サイトメトリーによりヴォン・
ヴィレブランド因子（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ（ｖＷＦ）
）及びＣＤ３６発現についても分析した。細胞表面ＣＤ３６の存在は、ヒト微小
血管内皮細胞（ＨＤＭＥＣ）のためのマーカーとして使用されている。なぜなら
、ほとんどのＭＥＣがＣＤ３６を発現するが、大きな血管をライニングする内皮
細胞はそれを発現しないことが示されているからである。簡単に言えば、懸濁液
中の細胞を、パラホルムアルデヒドで固定し、ガラス・スライド上にサイトスピ
ンさせ（ｓｙｔｏｓｐｕｎ）、洗浄し、そしてウサギ抗−ヒトｖＷＦ（１：４０
０希釈）又は抗−ＣＤ３６ ｍＡｂ ＦＡ６−１５２（５μｇ／ml）（Ｉｍｍｕ
ｎｏｔｅｃｈ，Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ，ＭＥ）のいずれかとともにインキュベート
した。次にスライドを、洗浄し、そしてローダミン又はフルオレセインに結合さ
せた２次抗体とともにインキュベートし、洗浄し、そして蛍光顕微鏡下で観察し
た。
石（ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅ）形態を確認し、そして内皮細胞以下の細胞の存在
について調べた。細胞を、免疫蛍光及びフロー・サイトメトリーによりヴォン・
ヴィレブランド因子（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ（ｖＷＦ）
）及びＣＤ３６発現についても分析した。細胞表面ＣＤ３６の存在は、ヒト微小
血管内皮細胞（ＨＤＭＥＣ）のためのマーカーとして使用されている。なぜなら
、ほとんどのＭＥＣがＣＤ３６を発現するが、大きな血管をライニングする内皮
細胞はそれを発現しないことが示されているからである。簡単に言えば、懸濁液
中の細胞を、パラホルムアルデヒドで固定し、ガラス・スライド上にサイトスピ
ンさせ（ｓｙｔｏｓｐｕｎ）、洗浄し、そしてウサギ抗−ヒトｖＷＦ（１：４０
０希釈）又は抗−ＣＤ３６ ｍＡｂ ＦＡ６−１５２（５μｇ／ml）（Ｉｍｍｕ
ｎｏｔｅｃｈ，Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ，ＭＥ）のいずれかとともにインキュベート
した。次にスライドを、洗浄し、そしてローダミン又はフルオレセインに結合さ
せた２次抗体とともにインキュベートし、洗浄し、そして蛍光顕微鏡下で観察し
た。
【００１５】 内皮細胞を同定するために、上記抗体Ｐ１Ｈ１２をも使用した。このネズミＩ
ｇＧ１モノクローナル抗体を、ＨＵＶＥＣでマウスを免疫感作させ、ハイブリド
ーマ系を作製し、そしてプロテインＧカラムを用いてハイブリドーマ細胞培養物
の上清からＩｇＧを分離することにより、得た。いくつかの試験のために、the
Fluoro Tag F1TC Conjugationキット（Sigma）を用いて調製した、フルオレセイ
ン・イソチオシアネート標識されたＰ１Ｈ１２を使用した。
ｇＧ１モノクローナル抗体を、ＨＵＶＥＣでマウスを免疫感作させ、ハイブリド
ーマ系を作製し、そしてプロテインＧカラムを用いてハイブリドーマ細胞培養物
の上清からＩｇＧを分離することにより、得た。いくつかの試験のために、the
Fluoro Tag F1TC Conjugationキット（Sigma）を用いて調製した、フルオレセイ
ン・イソチオシアネート標識されたＰ１Ｈ１２を使用した。
【００１６】 Ｐ１Ｈ１２は、血液中の内皮細胞と特異的に反応する。それは、１次ＨＵＶＥ
Ｃ及びＭＶＥＣ培養物、並びにヒトの皮膚、腸、卵巣、扁桃腺、リンパ節、肺、
及び腎臓の冷凍切片内の全血管の内皮細胞を染める。それは、上記組織内の他の
タイプの細胞は染色しない。それは、癌腫細胞系ＨＴ−２９及びＣＯＬＯ２０５
、メラノーマ細胞系Ａ−３７５及びＭ２１、Ｔ細胞系Ｊｕｒｋａｔ及びＨｕＴ７
８、線維芽細胞、ＨＬ−６０又はＣｈｉｎｅｓｅ−ハムスター卵巣細胞、又はエ
プスタイン−バール・ウイルスで形質転換されたＢ細胞系を染色しない。それは
、骨髄又は末梢血からの、単球、顆粒球、赤血球、血小板、Ｔ細胞、又はＢ細胞
を染色せず；それはまた、骨髄巨核球又は巨核球系ＨＵ３と反応しない。Ｐ１Ｈ
１２と染色しない末梢血細胞は、ヴォンビレブランド因子及びトロンボモジュリ
ンに関しても陽性であり（その同時発現は内皮に限定される）、そしてそれらは
、ｆｌｔ及びｆｌｋ（内皮特異的血管内皮成長因子のためのレセプター）に関し
て染まる。Ｐ１Ｈ１２陽性血液細胞のサブグループは、ＣＤ３４と２つの内皮特
異的活性化マーカー（ＶＣＡＭとＥ−セレクチン）に関しても染まる。
Ｃ及びＭＶＥＣ培養物、並びにヒトの皮膚、腸、卵巣、扁桃腺、リンパ節、肺、
及び腎臓の冷凍切片内の全血管の内皮細胞を染める。それは、上記組織内の他の
タイプの細胞は染色しない。それは、癌腫細胞系ＨＴ−２９及びＣＯＬＯ２０５
、メラノーマ細胞系Ａ−３７５及びＭ２１、Ｔ細胞系Ｊｕｒｋａｔ及びＨｕＴ７
８、線維芽細胞、ＨＬ−６０又はＣｈｉｎｅｓｅ−ハムスター卵巣細胞、又はエ
プスタイン−バール・ウイルスで形質転換されたＢ細胞系を染色しない。それは
、骨髄又は末梢血からの、単球、顆粒球、赤血球、血小板、Ｔ細胞、又はＢ細胞
を染色せず；それはまた、骨髄巨核球又は巨核球系ＨＵ３と反応しない。Ｐ１Ｈ
１２と染色しない末梢血細胞は、ヴォンビレブランド因子及びトロンボモジュリ
ンに関しても陽性であり（その同時発現は内皮に限定される）、そしてそれらは
、ｆｌｔ及びｆｌｋ（内皮特異的血管内皮成長因子のためのレセプター）に関し
て染まる。Ｐ１Ｈ１２陽性血液細胞のサブグループは、ＣＤ３４と２つの内皮特
異的活性化マーカー（ＶＣＡＭとＥ−セレクチン）に関しても染まる。
【００１７】 良好なＥＣ成長の後、好ましくは、約１０3 倍の拡大後、又は１５〜２５日目
に、細胞をトリプシン処理し、そして遠心分離により上記上清から単離する。次
に上記細胞を、連続培養のためにフィブロネクチン／ゼラチンで被覆したフラス
コ内で上記初期培養基中に懸濁させた。クローンは、２次培養物から誘導され、
そして約１０細胞／フラスコ表面１cm2 において植菌されることができる。次に
、上記クローンは、上記培養基中で順次培養される。
に、細胞をトリプシン処理し、そして遠心分離により上記上清から単離する。次
に上記細胞を、連続培養のためにフィブロネクチン／ゼラチンで被覆したフラス
コ内で上記初期培養基中に懸濁させた。クローンは、２次培養物から誘導され、
そして約１０細胞／フラスコ表面１cm2 において植菌されることができる。次に
、上記クローンは、上記培養基中で順次培養される。
【００１８】 本発明に従って培養されたＥＣを冷凍保存し、そして次にそれらの増殖能力の
有意な損失を伴わずに解凍され、そして培養に復帰させることができる。上記細
胞を冷凍保存するために、上記培養された細胞を、上記したように脱着させ、そ
して好適な冷凍保存培地、すなわち、冷凍保存剤、例えば、糖（単数又は複数）
、ＢＳＡ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、グリセロール・
エステルその他を含むものの中に再懸濁させることができる。
有意な損失を伴わずに解凍され、そして培養に復帰させることができる。上記細
胞を冷凍保存するために、上記培養された細胞を、上記したように脱着させ、そ
して好適な冷凍保存培地、すなわち、冷凍保存剤、例えば、糖（単数又は複数）
、ＢＳＡ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、グリセロール・
エステルその他を含むものの中に再懸濁させることができる。
【００１９】 造血細胞、例えば、前駆幹細胞に富む骨髄及び末梢血画分の冷凍保存は、自己
骨髄移植のための標準的な臨床手順となっている（Areman et al., Bone Marrow and Stew Cell Processing : A Manual of Current Techniques , F.A.Davis, P
hilade (phia, PA, 1st edition(1992))。造血細胞を冷凍保存するために２つの
基本技術が用いられる。臨床実験室において最も一般的に使用される技術は、９
５％胎児ウシ血清（“ＦＣＳ”）と５ｖ／ｖ％ジメチルスルホキシド（“ＤＭＳ
Ｏ”）と併合された組織培養基を使用する。冷凍保存培地中に懸濁させた後、細
胞を約５分間氷上に置き、次に−７０℃で一夜、そして最後に液体窒素中に置く
。この技術は、１９６０年代初めにAshwood-Smith (Sputtek et al., Clinical Applications of Cryobiology , Chapter 5, 127-147 (CRC Press, Boca Raton,
FL, 1991) 参照）により開発され、そして臨床実務において使用されている主な
技術である。１９８３年初期に、Ｓｔｉｆｆとその共同研究者らは、幹細胞の保
存のための修飾された技術を開発した（Stiff et al., Cryobiology, 20, 17-24
(1983))。この方法においては、ＤＭＳＯの濃度は５％まで低下され、そして追
加の冷凍保存剤、ヒドロキシエチル・デンプン（“ＨＥＳ”）が、上記溶液に添
加された。上記細胞を、速度制御フリーザーを用いて又は−８０℃においてメカ
ニカル・フリーザー内で冷凍することができた。
骨髄移植のための標準的な臨床手順となっている（Areman et al., Bone Marrow and Stew Cell Processing : A Manual of Current Techniques , F.A.Davis, P
hilade (phia, PA, 1st edition(1992))。造血細胞を冷凍保存するために２つの
基本技術が用いられる。臨床実験室において最も一般的に使用される技術は、９
５％胎児ウシ血清（“ＦＣＳ”）と５ｖ／ｖ％ジメチルスルホキシド（“ＤＭＳ
Ｏ”）と併合された組織培養基を使用する。冷凍保存培地中に懸濁させた後、細
胞を約５分間氷上に置き、次に−７０℃で一夜、そして最後に液体窒素中に置く
。この技術は、１９６０年代初めにAshwood-Smith (Sputtek et al., Clinical Applications of Cryobiology , Chapter 5, 127-147 (CRC Press, Boca Raton,
FL, 1991) 参照）により開発され、そして臨床実務において使用されている主な
技術である。１９８３年初期に、Ｓｔｉｆｆとその共同研究者らは、幹細胞の保
存のための修飾された技術を開発した（Stiff et al., Cryobiology, 20, 17-24
(1983))。この方法においては、ＤＭＳＯの濃度は５％まで低下され、そして追
加の冷凍保存剤、ヒドロキシエチル・デンプン（“ＨＥＳ”）が、上記溶液に添
加された。上記細胞を、速度制御フリーザーを用いて又は−８０℃においてメカ
ニカル・フリーザー内で冷凍することができた。
【００２０】 現在の臨床実務においては、ほとんどの冷凍保存溶液のベースは、潜在的に多
くの異なる成分を含有する、組織培養基である。典型的な組織培養基は、ＲＰＭ
Ｉ １６４０、ＩＭＤＭ，ＡＩＭ−５，Ｘ−ＶＩＶＯ １０、又はαＭＥＭを含
む。 次に上記細胞懸濁液が、冷凍され、すなわち、好適な容器内で液体窒素の温度
で冷凍され、そして必要とされるまで保存される。次にこの冷凍懸濁液を、温水
浴内に上記容器を沈めることにより、解凍し、そして培養を再開することができ
る。得られたＥＣの増殖は、冷凍保存に供されなかった細胞のものと同様である
。
くの異なる成分を含有する、組織培養基である。典型的な組織培養基は、ＲＰＭ
Ｉ １６４０、ＩＭＤＭ，ＡＩＭ−５，Ｘ−ＶＩＶＯ １０、又はαＭＥＭを含
む。 次に上記細胞懸濁液が、冷凍され、すなわち、好適な容器内で液体窒素の温度
で冷凍され、そして必要とされるまで保存される。次にこの冷凍懸濁液を、温水
浴内に上記容器を沈めることにより、解凍し、そして培養を再開することができ
る。得られたＥＣの増殖は、冷凍保存に供されなかった細胞のものと同様である
。
【００２１】 上記の培養されたＥＣは、タンパク質、ポリペプチド、酵素又は他の産物を産
生する遺伝子が上記ＥＣのＤＮＡ内に挿入されるような遺伝子治療において使用
されることもできる。次に上記トランスジェニックＥＣは、例えば、患者の血流
中への輸注により、哺乳動物に投与される。例えば、B.P.Luskey et al., Annal s.N.Y.Acad.Sci. , 612, 398 (1990), B.A.Naughton et al.（米国特許第４，７
２１，０９６号）、及びAnderson et al.（米国特許第５，３９９，３４６号）
を参照のこと。
生する遺伝子が上記ＥＣのＤＮＡ内に挿入されるような遺伝子治療において使用
されることもできる。次に上記トランスジェニックＥＣは、例えば、患者の血流
中への輸注により、哺乳動物に投与される。例えば、B.P.Luskey et al., Annal s.N.Y.Acad.Sci. , 612, 398 (1990), B.A.Naughton et al.（米国特許第４，７
２１，０９６号）、及びAnderson et al.（米国特許第５，３９９，３４６号）
を参照のこと。
【００２２】 上記ＥＣにより担持される遺伝子は、それらが元来もっていないであろう治療
効果を上記血液細胞が発揮することを許容する遺伝子、例えば、血友病の治療に
おいて有用な、血液凝固因子、例えば第VIII因子であることができる。上記遺伝
子は、治療効果をもつ１以上の産物をコードすることができる。好適な遺伝子の
例は、サイトカイン、例えばＴＮＦ、インターロイキン（インターロイキン１〜
１２）、インターフェロン（α，β，γ−インターフェロン）、Ｔ細胞レセプタ
ー・タンパク質、及び抗体の抗原結合性ドメイン、例えば免疫グロブリンのため
のＦｃレセプターをコードするものを含む。
効果を上記血液細胞が発揮することを許容する遺伝子、例えば、血友病の治療に
おいて有用な、血液凝固因子、例えば第VIII因子であることができる。上記遺伝
子は、治療効果をもつ１以上の産物をコードすることができる。好適な遺伝子の
例は、サイトカイン、例えばＴＮＦ、インターロイキン（インターロイキン１〜
１２）、インターフェロン（α，β，γ−インターフェロン）、Ｔ細胞レセプタ
ー・タンパク質、及び抗体の抗原結合性ドメイン、例えば免疫グロブリンのため
のＦｃレセプターをコードするものを含む。
【００２３】 好適な遺伝子の追加の例は、上記血液細胞が元来“標的”にしないであろう体
内の部位を“標的”にし、それによりその部位における上記血液細胞の治療特性
の使用を可能にするように、ＥＣを修飾する遺伝子を含む。このやり方で、血液
細胞、例えば、ＴＩＬは、例えば、モノクローナル抗体のＦａｂ部分を上記細胞
内に導入し、それにより上記細胞が選ばれた抗原を認識することを可能にするこ
とにより、修飾されることができる。同様に、治療特性をもつ血液細胞は、例え
ば、血液細胞が正常には標的としない腫瘍を標的とするために、使用されること
ができる。癌治療において有用な他の遺伝子を、特定の部位において炎症応答を
引き起こし、それにより治療効果をもつ化学走性因子をコードするために、使用
することができる。好適な遺伝子の他の例は、ＨＩＶ感染の治療に使用される可
能性ＣＤ４をコードする遺伝子及びα−アンチトリプシン不全により引き起こさ
れる肺気腫の治療において有用なα−アンチトリプシンをコードする遺伝子、又
は骨成長を促進する因子、例えば、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰｓ）又はＢＭ
Ｐ経路内の他の因子をコードする遺伝子を含む。
内の部位を“標的”にし、それによりその部位における上記血液細胞の治療特性
の使用を可能にするように、ＥＣを修飾する遺伝子を含む。このやり方で、血液
細胞、例えば、ＴＩＬは、例えば、モノクローナル抗体のＦａｂ部分を上記細胞
内に導入し、それにより上記細胞が選ばれた抗原を認識することを可能にするこ
とにより、修飾されることができる。同様に、治療特性をもつ血液細胞は、例え
ば、血液細胞が正常には標的としない腫瘍を標的とするために、使用されること
ができる。癌治療において有用な他の遺伝子を、特定の部位において炎症応答を
引き起こし、それにより治療効果をもつ化学走性因子をコードするために、使用
することができる。好適な遺伝子の他の例は、ＨＩＶ感染の治療に使用される可
能性ＣＤ４をコードする遺伝子及びα−アンチトリプシン不全により引き起こさ
れる肺気腫の治療において有用なα−アンチトリプシンをコードする遺伝子、又
は骨成長を促進する因子、例えば、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰｓ）又はＢＭ
Ｐ経路内の他の因子をコードする遺伝子を含む。
【００２４】 本発明の遺伝子治療は、非限定的に、アデソシン・デアミナーゼ欠乏症、鎌状
赤血球貧血、サラセミア、血友病、糖尿病、α−アンチトリプシン欠乏症、脳疾
患、例えば、アルツハイマー病、及び他の病気、例えば、成長障害及び心臓疾患
、例えば、コレステロールが代謝される方法における変化により生じるもの及び
免疫系に関する欠陥を含むさまざまな疾患の治療において、並びに骨折を修復し
、又は骨粗しょう症を治療し又は防止するために、有用である。
赤血球貧血、サラセミア、血友病、糖尿病、α−アンチトリプシン欠乏症、脳疾
患、例えば、アルツハイマー病、及び他の病気、例えば、成長障害及び心臓疾患
、例えば、コレステロールが代謝される方法における変化により生じるもの及び
免疫系に関する欠陥を含むさまざまな疾患の治療において、並びに骨折を修復し
、又は骨粗しょう症を治療し又は防止するために、有用である。
【００２５】 さらに他の態様においては、患者内に存在するヒトＣＥＣの存在を検出するた
めの方法であって：（ｉ）上記患者から除去されたヒトＣＥＣの拡大集団内に、
そのマーカーが上記ＣＥＣ内で発現されるよな条件下で検出可能なマーカーをコ
ードするＤＮＡセグメントを挿入し；（ii）ステップ（ｉ）から生じた細胞を上
記患者に導入し；（iii)ステップ（ii）から生じた細胞及びそれらの子孫を含む
（例えば、正常組織、癌性組織、血管組織、血液、リンパ節、等であることがで
きる）組織のアリコートを上記患者から取り出し；そして（iv）上記アリコート
中の、ステップ（ii）から生じた細胞及びそれらの子孫の量を検出又は測定する
、を含む前記方法が提供される。
めの方法であって：（ｉ）上記患者から除去されたヒトＣＥＣの拡大集団内に、
そのマーカーが上記ＣＥＣ内で発現されるよな条件下で検出可能なマーカーをコ
ードするＤＮＡセグメントを挿入し；（ii）ステップ（ｉ）から生じた細胞を上
記患者に導入し；（iii)ステップ（ii）から生じた細胞及びそれらの子孫を含む
（例えば、正常組織、癌性組織、血管組織、血液、リンパ節、等であることがで
きる）組織のアリコートを上記患者から取り出し；そして（iv）上記アリコート
中の、ステップ（ii）から生じた細胞及びそれらの子孫の量を検出又は測定する
、を含む前記方法が提供される。
【００２６】 ヒトＥＣの実質的に純粋な集団を用いて遺伝子治療を行うために、ある遺伝子
を上記ＥＣ内に挿入するために以下の一般方法を使用することができる。形質転
換方法のレビューのためには、Friedman, Science, 244, 1275 (1989) 及びLanc et , Jun.4, 1988, p1271を参照のこと。正常な遺伝子の誤りを正すために、構造
遺伝子を導入するために、遺伝子が、ドナーの細胞から単離されることができる
。上記細胞は、組織（単数又は複数）、血液又は他の体液から単離されることが
できる。欠陥タンパク質をコードする遺伝子を発見するために、上記ドナー細胞
からのＤＮＡが単離され、そして当業者に知られた手段によりさまざまな長さの
セグメントに、酵素による消化により、解裂される。次にＤＮＡのセグメントを
、遺伝子産物の発現のための適当な調節配列を含むベクター内に、個々に挿入す
ることができる。次にこれらのベクターは、その正常遺伝子の配列が知られてい
る場合、慣用手段、例えば、ノーザン・ブロッティングによりスクリーニングさ
れることができ、又はその発現産物は、ウェスタン・ブロッティングによりスク
リーニングされることができる。
を上記ＥＣ内に挿入するために以下の一般方法を使用することができる。形質転
換方法のレビューのためには、Friedman, Science, 244, 1275 (1989) 及びLanc et , Jun.4, 1988, p1271を参照のこと。正常な遺伝子の誤りを正すために、構造
遺伝子を導入するために、遺伝子が、ドナーの細胞から単離されることができる
。上記細胞は、組織（単数又は複数）、血液又は他の体液から単離されることが
できる。欠陥タンパク質をコードする遺伝子を発見するために、上記ドナー細胞
からのＤＮＡが単離され、そして当業者に知られた手段によりさまざまな長さの
セグメントに、酵素による消化により、解裂される。次にＤＮＡのセグメントを
、遺伝子産物の発現のための適当な調節配列を含むベクター内に、個々に挿入す
ることができる。次にこれらのベクターは、その正常遺伝子の配列が知られてい
る場合、慣用手段、例えば、ノーザン・ブロッティングによりスクリーニングさ
れることができ、又はその発現産物は、ウェスタン・ブロッティングによりスク
リーニングされることができる。
【００２７】 あるいは、所望の遺伝子のＤＮＡ配列又は正常タンパク質の配列が知られてい
る場合、その遺伝子は、合成方法により、例えば、ＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉ
ｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により作製されることができる。いずれの場合に
おいても、その遺伝子配列の単離又は構築は、所望の遺伝子産物をコードする“
正常（ｎｏｒｍａｌ）”遺伝子を作り出すことができる。一旦、単離されれば、
機能的構造遺伝子、例えば、第VIII因子タンパク質、ヒト第VIII因子、ブタ第VI
II因子、その他をコードするＤＮＡ配列が、好適な制御領域、例えば、プロモー
ターへの結合により、インビボにおける発現のために修飾されることができる。
ハイブリッド又は修飾遺伝子、例えば、それらの抗原性及び免疫原性を低下させ
るように修飾された第VIII因子分子をコードするＤＮＡ配列も構築されることが
できる。ＤＮＡ法が、動物の第VIII因子の要素を対応のヒトの第VIII因子の要素
で置き替えて、ハイブリッド・ヒト／動物第VIII因子分子をもたらすために、使
用されうる。キメラ・ハイブリッド第VIII因子分子をコードするＤＮＡ配列を含
む形質転換ベクターの作製は、Ｌｏｌｌａｒ ｅｔ ａｌ．（米国特許第５，７
４４，４４６号）中に開示されている。ＤＮＡ法は、修飾されていないヒトの第
VIII因子に比較して改良された治療特性、例えば、低下した抗原性又は免疫原性
又はより高い効果をもつ第VIII因子構築物を作り出すために、選択された部位、
例えば、エピトープにおいてアミノ酸残基を置換するために使用されることもで
きる。
る場合、その遺伝子は、合成方法により、例えば、ＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉ
ｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により作製されることができる。いずれの場合に
おいても、その遺伝子配列の単離又は構築は、所望の遺伝子産物をコードする“
正常（ｎｏｒｍａｌ）”遺伝子を作り出すことができる。一旦、単離されれば、
機能的構造遺伝子、例えば、第VIII因子タンパク質、ヒト第VIII因子、ブタ第VI
II因子、その他をコードするＤＮＡ配列が、好適な制御領域、例えば、プロモー
ターへの結合により、インビボにおける発現のために修飾されることができる。
ハイブリッド又は修飾遺伝子、例えば、それらの抗原性及び免疫原性を低下させ
るように修飾された第VIII因子分子をコードするＤＮＡ配列も構築されることが
できる。ＤＮＡ法が、動物の第VIII因子の要素を対応のヒトの第VIII因子の要素
で置き替えて、ハイブリッド・ヒト／動物第VIII因子分子をもたらすために、使
用されうる。キメラ・ハイブリッド第VIII因子分子をコードするＤＮＡ配列を含
む形質転換ベクターの作製は、Ｌｏｌｌａｒ ｅｔ ａｌ．（米国特許第５，７
４４，４４６号）中に開示されている。ＤＮＡ法は、修飾されていないヒトの第
VIII因子に比較して改良された治療特性、例えば、低下した抗原性又は免疫原性
又はより高い効果をもつ第VIII因子構築物を作り出すために、選択された部位、
例えば、エピトープにおいてアミノ酸残基を置換するために使用されることもで
きる。
【００２８】 好ましい、態様においては、そのブタ配列がドメイン又は部分ドメイン、例え
ば、Ａ２ドメイン又は部分ドメインをコードするところの、第VIII因子をコード
するハイブリッド・ヒト／ブタｃＤＮＡが、哺乳動物の発現ベクター、例えば、
ＲｅＮｅｏに挿入されて、ハイブリッド第VIII因子構築物が作られる。上記第VI
II因子の予備的な特徴付けは、上記ハイブリッドｃＤＮＡを上記ＲｅＮｅｏ哺乳
動物発現ベクター内に挿入し、そしてＣＯＳ−７細胞内で上記ハイブリッド・タ
ンパク質を過渡的に発現させることにより達成される。活性ハイブリッド・タン
パク質が発現されているかどうかの決定が次に行われる。上記発現ベクター構築
物は、本分野において定常的な方法、例えば、リポソーム仲介トランスフェクシ
ョン（Lipofectin(商標）、Life Technologies, Inc.）を用いて、培養物中の細
胞、例えば、ベビー・ハムスター腎臓細胞を安定的にトランスフェクトさせるた
めに、さらに使用される。組換えハイブリッド第VIII因子タンパク質の発現は、
例えば、シーフェンシング、ノーザン・ブロッティング及びウェスタン・ブロッ
ティング、又はポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）により、確認
されうる。上記タンパク質を安定して発現するトランスフェクトされた細胞がそ
の中で維持されているところの培養基中のハイブリッド第VIII因子タンパク質は
、適当なバッファー中で沈降され、ペレット化され、洗浄され、そして再懸濁さ
れ、そして上記組換えハイブリッド第VIII因子タンパク質は、例えば、モノクロ
ーナル抗−Ａ２−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）を用いた免疫アフィンティー・ク
ロマトグラフィーを含む、標準的な技術により精製される。
ば、Ａ２ドメイン又は部分ドメインをコードするところの、第VIII因子をコード
するハイブリッド・ヒト／ブタｃＤＮＡが、哺乳動物の発現ベクター、例えば、
ＲｅＮｅｏに挿入されて、ハイブリッド第VIII因子構築物が作られる。上記第VI
II因子の予備的な特徴付けは、上記ハイブリッドｃＤＮＡを上記ＲｅＮｅｏ哺乳
動物発現ベクター内に挿入し、そしてＣＯＳ−７細胞内で上記ハイブリッド・タ
ンパク質を過渡的に発現させることにより達成される。活性ハイブリッド・タン
パク質が発現されているかどうかの決定が次に行われる。上記発現ベクター構築
物は、本分野において定常的な方法、例えば、リポソーム仲介トランスフェクシ
ョン（Lipofectin(商標）、Life Technologies, Inc.）を用いて、培養物中の細
胞、例えば、ベビー・ハムスター腎臓細胞を安定的にトランスフェクトさせるた
めに、さらに使用される。組換えハイブリッド第VIII因子タンパク質の発現は、
例えば、シーフェンシング、ノーザン・ブロッティング及びウェスタン・ブロッ
ティング、又はポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）により、確認
されうる。上記タンパク質を安定して発現するトランスフェクトされた細胞がそ
の中で維持されているところの培養基中のハイブリッド第VIII因子タンパク質は
、適当なバッファー中で沈降され、ペレット化され、洗浄され、そして再懸濁さ
れ、そして上記組換えハイブリッド第VIII因子タンパク質は、例えば、モノクロ
ーナル抗−Ａ２−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）を用いた免疫アフィンティー・ク
ロマトグラフィーを含む、標準的な技術により精製される。
【００２９】 さらなる態様においては、サブユニット、ドメイン、又はアミノ配置換を含む
ハイブリッド第VIII因子は、例えば、安定性、分泌、検出、単離その他を強化す
るタンパク質又はペプチドをコードする配列が第VIII因子コーディング配列に隣
接して挿入されている組換え分子から融合タンパク質として発現される。融合タ
ンパク質の調製における、例えば、プロモーター、オペレーター、及びレギュレ
ーターを含む同種又は異種発現制御配列の使用のための確立されたプロトコール
は、本分野において知られており、そして定常的に使用されている。Current Pr otocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M.et al., eds.), Wiley Intersci
ence, New Yorkを参照のこと。
ハイブリッド第VIII因子は、例えば、安定性、分泌、検出、単離その他を強化す
るタンパク質又はペプチドをコードする配列が第VIII因子コーディング配列に隣
接して挿入されている組換え分子から融合タンパク質として発現される。融合タ
ンパク質の調製における、例えば、プロモーター、オペレーター、及びレギュレ
ーターを含む同種又は異種発現制御配列の使用のための確立されたプロトコール
は、本分野において知られており、そして定常的に使用されている。Current Pr otocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M.et al., eds.), Wiley Intersci
ence, New Yorkを参照のこと。
【００３０】 精製されたハイブリッド第VIII因子又はその断片は、無血漿第VIII因子アッセ
イ、１段階血液凝固アッセイ、及び標準として精製組換えヒト第VIII因子を用い
た酵素結合イムノソルベント・アッセイを含む標準的なアッセイにより血液凝固
活性について評価されることができる。第VIII因子構築物の抗原性及び免疫原性
は、標準ベセスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）インヒビター・アッセイを用いてインビ
トロにおいて、又はノックアウト血友病マウス・モデルを用いてインビボにおい
てテストされることができる。
イ、１段階血液凝固アッセイ、及び標準として精製組換えヒト第VIII因子を用い
た酵素結合イムノソルベント・アッセイを含む標準的なアッセイにより血液凝固
活性について評価されることができる。第VIII因子構築物の抗原性及び免疫原性
は、標準ベセスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）インヒビター・アッセイを用いてインビ
トロにおいて、又はノックアウト血友病マウス・モデルを用いてインビボにおい
てテストされることができる。
【００３１】 両プラスミド及び真核ウイルス・ベクターを含む他のベクターが、熟練者の好
み及び判断に依存して、真核細胞内で組換え遺伝子構築物を発現させるために使
用されることができる。バクテリア、酵母、及び昆虫細胞系を含む他のベクター
及び発現系が使用されうるが、糖添加（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）の相違又
は欠如に因り好ましくない。
み及び判断に依存して、真核細胞内で組換え遺伝子構築物を発現させるために使
用されることができる。バクテリア、酵母、及び昆虫細胞系を含む他のベクター
及び発現系が使用されうるが、糖添加（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）の相違又
は欠如に因り好ましくない。
【００３２】 サブユニット、ドメイン、又はアミノ酸置換をもつハイブリッド・ヒト／ブタ
第VIII因子を製造するために使用される同一方法は、他の組換えハイブリッド第
VIII因子タンパク質及びその断片、並びに上記ハイブリッド、例えば、ヒト／非
ヒト、非ブタ哺乳動物又は動物／動物をコードする核酸配列を調製するために使
用されることができる。本明細書中に使用するとき、用語“第VIII因子タンパク
質”は、先に列記したアッセイにより決定されるとき生物学的に活性である、す
なわち、インビトロにおいてアッセイされるとき血液凝固活性を有する上記材料
の中のいずれかを含む。ネズミ第VIII因子ｃＤＮＡ及びブタ第VIII因子ｃＤＮＡ
の一部がクローン化されている。ハイブリッド・ヒト／動物又は動物／動物第VI
II因子分子の製造における使用のための他の種の第VIII因子配列は、出発点とし
て知られたヒト及びブタＤＮＡ配列を用いて得られうる。使用されうる他の技術
は、動物組織ＤＮＡを用いたＰＣＲ増幅方法、及び第VIII因子配列をクローン化
するための動物由来のｃＤＮＡライブラリーの使用を含む。
第VIII因子を製造するために使用される同一方法は、他の組換えハイブリッド第
VIII因子タンパク質及びその断片、並びに上記ハイブリッド、例えば、ヒト／非
ヒト、非ブタ哺乳動物又は動物／動物をコードする核酸配列を調製するために使
用されることができる。本明細書中に使用するとき、用語“第VIII因子タンパク
質”は、先に列記したアッセイにより決定されるとき生物学的に活性である、す
なわち、インビトロにおいてアッセイされるとき血液凝固活性を有する上記材料
の中のいずれかを含む。ネズミ第VIII因子ｃＤＮＡ及びブタ第VIII因子ｃＤＮＡ
の一部がクローン化されている。ハイブリッド・ヒト／動物又は動物／動物第VI
II因子分子の製造における使用のための他の種の第VIII因子配列は、出発点とし
て知られたヒト及びブタＤＮＡ配列を用いて得られうる。使用されうる他の技術
は、動物組織ＤＮＡを用いたＰＣＲ増幅方法、及び第VIII因子配列をクローン化
するための動物由来のｃＤＮＡライブラリーの使用を含む。
【００３３】 一旦、上記遺伝子を含むＤＮＡが調製されれば、そのＤＮＡが先のように単離
・拡大されたＥＣの集団内に挿入されることができる。上記ＤＮＡは、１）物理
的方法、例えば、リン酸カルシウムとの共沈、エレクトロポレーション、リポフ
ェクション又はマイクロインジェクション（例えば、米国特許第４，８７３，１
９１号）、及び／又は２）ウイルス・ベクター、例えば、そのＤＮＡが約７〜８
ＫＢ未満の場合、アデノウイルス、又はより長いＤＮＡセグメントのためにはレ
トロウイルス、の使用、により、挿入されることができる。後者の場合、上記レ
トロウイルスのＤＮＡは、制限酵素により切断され、そして所望の配列を含むヒ
トＤＮＡが挿入され、そしてライゲートされる。次に上記挿入物を含むレトロウ
イルスが上記ＥＣにトランスフェクトされる。次に上記ＥＣは、所望のタンパク
質の産生についてアッセイされることができる。例えば、米国特許第４，９０２
，７８３号及び第５，６８１，７４６号を参照のこと。
・拡大されたＥＣの集団内に挿入されることができる。上記ＤＮＡは、１）物理
的方法、例えば、リン酸カルシウムとの共沈、エレクトロポレーション、リポフ
ェクション又はマイクロインジェクション（例えば、米国特許第４，８７３，１
９１号）、及び／又は２）ウイルス・ベクター、例えば、そのＤＮＡが約７〜８
ＫＢ未満の場合、アデノウイルス、又はより長いＤＮＡセグメントのためにはレ
トロウイルス、の使用、により、挿入されることができる。後者の場合、上記レ
トロウイルスのＤＮＡは、制限酵素により切断され、そして所望の配列を含むヒ
トＤＮＡが挿入され、そしてライゲートされる。次に上記挿入物を含むレトロウ
イルスが上記ＥＣにトランスフェクトされる。次に上記ＥＣは、所望のタンパク
質の産生についてアッセイされることができる。例えば、米国特許第４，９０２
，７８３号及び第５，６８１，７４６号を参照のこと。
【００３４】 一般に、分子ＤＮＡクローニング法は、本分野において周知であり、そして本
発明の実施において限定するものではない。同様の方法のさらなる説明に関して
は、Friedmann, Scieuce, 244, 1275 (1989) 及びMolecular Cloning:A Laborat ory Manual (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Sambrook, Fri
tsch and Maniatis eds. (1989) を参照のこと。
発明の実施において限定するものではない。同様の方法のさらなる説明に関して
は、Friedmann, Scieuce, 244, 1275 (1989) 及びMolecular Cloning:A Laborat ory Manual (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Sambrook, Fri
tsch and Maniatis eds. (1989) を参照のこと。
【００３５】 異種ＤＮＡ又はＲＮＡを安定して取り込み、かつ、発現している、トランスジ
ェニック、すなわち、形質導入された内皮細胞並びにその治療用途は、Ｍｕｌｌ
ｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（米国特許第５，６７４，７２２号）中に記載されてい
る。特に、レトロウイルス・ベクターは、内皮細胞内で生物学的に又は治療的に
有意なレベルで通常発現されない着目のポリペプチド又はタンパク質をコードす
る遺伝子材料を含む遺伝子材料を、内皮細胞に安定して形質導入するために使用
されてきた。このやり方で導入された遺伝子材料は、優勢な選択マーカー、例え
ば、抗生物質又は除草剤マーカーをコードする遺伝子材料を含むこともできる。
着目のポリペプチド、例えば、第VIIIタンパク質だけをコードするＤＮＡ、又は
着目のポリペプチドと優勢選択マーカーをコードするＤＮＡを含む遺伝子材料を
、培養された内皮細胞内に導入することができる。それらがその内に入り込まれ
ているところの内皮細胞（すなわち、レトロウイルス・ベクターの使用により形
質導入された内皮細胞）による上記遺伝子の発現も証明されている。
ェニック、すなわち、形質導入された内皮細胞並びにその治療用途は、Ｍｕｌｌ
ｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（米国特許第５，６７４，７２２号）中に記載されてい
る。特に、レトロウイルス・ベクターは、内皮細胞内で生物学的に又は治療的に
有意なレベルで通常発現されない着目のポリペプチド又はタンパク質をコードす
る遺伝子材料を含む遺伝子材料を、内皮細胞に安定して形質導入するために使用
されてきた。このやり方で導入された遺伝子材料は、優勢な選択マーカー、例え
ば、抗生物質又は除草剤マーカーをコードする遺伝子材料を含むこともできる。
着目のポリペプチド、例えば、第VIIIタンパク質だけをコードするＤＮＡ、又は
着目のポリペプチドと優勢選択マーカーをコードするＤＮＡを含む遺伝子材料を
、培養された内皮細胞内に導入することができる。それらがその内に入り込まれ
ているところの内皮細胞（すなわち、レトロウイルス・ベクターの使用により形
質導入された内皮細胞）による上記遺伝子の発現も証明されている。
【００３６】 上記遺伝子材料をインビトロにおいて形質導入された内皮細胞を、次に、さま
ざまな知られた方法の中の１を用いて移植することができる。このような方法は
、非限定的に、形質導入された内皮細胞でライニングされた合成血管又は人工（
ｐｒｏｔｈｅｔｉｃ）弁の移植、又は形質導入された内皮細胞を滞めるようにデ
ザインされたデバイス又はマトリックスの移植を含む。
ざまな知られた方法の中の１を用いて移植することができる。このような方法は
、非限定的に、形質導入された内皮細胞でライニングされた合成血管又は人工（
ｐｒｏｔｈｅｔｉｃ）弁の移植、又は形質導入された内皮細胞を滞めるようにデ
ザインされたデバイス又はマトリックスの移植を含む。
【００３７】 所望の遺伝子を含むＥＣを投与するために、上記細胞は、単に、慣用手段、例
えば、一定時間期間にわたる静脈輸注により患者の血流中に導入されることがで
きる。 インビトロにおいて形質導入されている内皮細胞は、血管再構築手術において
使用される、シャント、ステント、及びグラフトを含む、補てつインプラント（
例えば、合成材料、例えば、ダクロン（Ｄａｃｒｏｎ（商標））、ゴアテックス
（Ｇｏｒｔｅｘ（商標））及び他のプラスチック又は金属プラスチック・ラミネ
ートから作られた血管）を改良するために特に有用である。例えば、人工動脈グ
ラフトは、生きた臓器又は肢を灌流する罹患動脈を置き替えるために、しばしば
使用される。しかしながら、現在入手可能なグラフトは、通常、合成材料から作
られ、そして多くの合併症を受ける。その中で最悪のものは、高率の血栓又は閉
塞である。動物試験は、移植前の自己内皮細胞で上記グラフトをライニングする
ことが、その付帯罹患結果によるグラフトの再閉塞を、防止はしないが減少させ
ることができるということを示唆する。
えば、一定時間期間にわたる静脈輸注により患者の血流中に導入されることがで
きる。 インビトロにおいて形質導入されている内皮細胞は、血管再構築手術において
使用される、シャント、ステント、及びグラフトを含む、補てつインプラント（
例えば、合成材料、例えば、ダクロン（Ｄａｃｒｏｎ（商標））、ゴアテックス
（Ｇｏｒｔｅｘ（商標））及び他のプラスチック又は金属プラスチック・ラミネ
ートから作られた血管）を改良するために特に有用である。例えば、人工動脈グ
ラフトは、生きた臓器又は肢を灌流する罹患動脈を置き替えるために、しばしば
使用される。しかしながら、現在入手可能なグラフトは、通常、合成材料から作
られ、そして多くの合併症を受ける。その中で最悪のものは、高率の血栓又は閉
塞である。動物試験は、移植前の自己内皮細胞で上記グラフトをライニングする
ことが、その付帯罹患結果によるグラフトの再閉塞を、防止はしないが減少させ
ることができるということを示唆する。
【００３８】 しかしながら、内皮細胞は、移植されたグラフトに関してそれらの性能を改善
し、又は局所ドラッグ・デリバリーのための手段を提供する方法で、本発明の方
法に従って、修飾されることができる。例は、管腔内血液凝固形成を防止するた
めの抗再狭窄、抗増殖、又は血栓溶解剤の管腔内側へのデリバリー、平滑筋肥大
に因る管腔狭窄を防止するための平滑筋増殖のインヒビターの分泌、並びに内皮
細胞増殖を刺激し、かつ、上記グラフト管腔の内皮細胞ライニングの程度又は持
続時間を改善するための内皮細胞マイトジェン又はオートワリン因子の発現及び
／又は分泌を含む。後者の剤は、“生体適合化（ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉ
ｚａｔｉｏｎ）”剤（ポリペプチド又はタンパク質）といわれる。
し、又は局所ドラッグ・デリバリーのための手段を提供する方法で、本発明の方
法に従って、修飾されることができる。例は、管腔内血液凝固形成を防止するた
めの抗再狭窄、抗増殖、又は血栓溶解剤の管腔内側へのデリバリー、平滑筋肥大
に因る管腔狭窄を防止するための平滑筋増殖のインヒビターの分泌、並びに内皮
細胞増殖を刺激し、かつ、上記グラフト管腔の内皮細胞ライニングの程度又は持
続時間を改善するための内皮細胞マイトジェン又はオートワリン因子の発現及び
／又は分泌を含む。後者の剤は、“生体適合化（ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉ
ｚａｔｉｏｎ）”剤（ポリペプチド又はタンパク質）といわれる。
【００３９】 同様の適用に関しては、本発明の内皮細胞は、弁表面の血栓形成性を低下させ
ることにより塞栓の形成のリスクを低下させるために人工心弁の表面を覆うため
に使用されることもできる。 本発明の方法により形質導入された内皮細胞又は形質導入された内皮細胞でラ
イニングされた血管インプラントを、血友病を治療するために、疾患の予防又は
治療において有用なポリペプチド又はタンパク質、例えば、第VIII因子タンパク
質の構成的合成及びデリバリーを提供するために使用することもできる。この方
法で、上記ポリペプチドは、長い時間期間にわたり、循環細胞から、個体の血流
中に直接分泌される。反対に、最近利用可能な方法は、所望のポリペプチドの非
経腸投与を含む。
ることにより塞栓の形成のリスクを低下させるために人工心弁の表面を覆うため
に使用されることもできる。 本発明の方法により形質導入された内皮細胞又は形質導入された内皮細胞でラ
イニングされた血管インプラントを、血友病を治療するために、疾患の予防又は
治療において有用なポリペプチド又はタンパク質、例えば、第VIII因子タンパク
質の構成的合成及びデリバリーを提供するために使用することもできる。この方
法で、上記ポリペプチドは、長い時間期間にわたり、循環細胞から、個体の血流
中に直接分泌される。反対に、最近利用可能な方法は、所望のポリペプチドの非
経腸投与を含む。
【００４０】 さらに、単離されたポリペプチド（例えば、インスリン）を用いるとき一般に
必要である、それが個体に投与される前の上記ポリペプチドの徹底的な精製の必
要性はない。本発明に従って修飾された内皮細胞は、それが通常産生されるであ
ろうようなペプチド・ホルモンを産生する。 遺伝子操作された内皮細胞の使用に対する他の利点は、特定の臓器又は肢への
治療レベルの選択された産物のデリバリーを標的にすることができるということ
である。例えば、インビトロにおいて形質導入された内皮細胞でライニングされ
た血管インプラントは、特定の臓器又は肢に移植されることができ；又は特定の
肢、臓器又は血管の内皮細胞がインビボにおいて形質導入されることができる。
上記形質導入された内皮細胞の分泌産物は、灌流された組織に高濃度でデリバリ
ーされ、それにより、標的とされた解剖学的な位置に望ましい効果を達成するこ
とができる。次にこの産物は、心臓まで戻る間に静脈循環において非治療レベル
に希釈されるであろう。
必要である、それが個体に投与される前の上記ポリペプチドの徹底的な精製の必
要性はない。本発明に従って修飾された内皮細胞は、それが通常産生されるであ
ろうようなペプチド・ホルモンを産生する。 遺伝子操作された内皮細胞の使用に対する他の利点は、特定の臓器又は肢への
治療レベルの選択された産物のデリバリーを標的にすることができるということ
である。例えば、インビトロにおいて形質導入された内皮細胞でライニングされ
た血管インプラントは、特定の臓器又は肢に移植されることができ；又は特定の
肢、臓器又は血管の内皮細胞がインビボにおいて形質導入されることができる。
上記形質導入された内皮細胞の分泌産物は、灌流された組織に高濃度でデリバリ
ーされ、それにより、標的とされた解剖学的な位置に望ましい効果を達成するこ
とができる。次にこの産物は、心臓まで戻る間に静脈循環において非治療レベル
に希釈されるであろう。
【００４１】 本発明のデリバリー・システムの他の重要な利点は、それが連続デリバリー・
システムであるため、ホルモン・ポリペプチドの短い半減期が制限ではないとい
うことである。例えば、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）の半減期は、約１９分であ
り、そして副甲状腺ホルモンの半減期は、２ １／２〜５分である。 本発明を、以下の詳細な実施例を参照してさらに説明する。
システムであるため、ホルモン・ポリペプチドの短い半減期が制限ではないとい
うことである。例えば、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）の半減期は、約１９分であ
り、そして副甲状腺ホルモンの半減期は、２ １／２〜５分である。 本発明を、以下の詳細な実施例を参照してさらに説明する。
【００４２】 実施例１ 末梢血由来内皮細胞の培養 へパリン又はクエン酸塩のいずれかで抗血液凝固処理された新鮮静脈血１００
mlを、１mM ＥＤＴＡ及び０．５％ウシ血清アルブミンを含むHank's Balanced
Salt Solution（HBSS）で１：２希釈し、界面を破壊しないように、等容量のHis
topague（商標）-1077（Sigma Chemical Co.）上に注意して重層し、そして室温
で３０分間４００×Ｇで遠心分離した。単核細胞を含む層を集め、そしてその細
胞を、ＥＧＧＳを除去するために、１０％ヒト男性血漿を含むように修飾され、
そして１μｇ／mlヒドロコルチゾンを含む先に記載されたＭＥＣ培地（Cupta et
al., Exp.Cell.Res., 230, 244-251 (1997)）を用いて、１０分間２５０×Ｇで
遠心分離することにより３回洗浄した。上記培養基での洗浄は、バッファーでの
洗浄よりも好ましい。なぜなら上記培地は、より高レベルの細胞生存能力を維持
するからである。
mlを、１mM ＥＤＴＡ及び０．５％ウシ血清アルブミンを含むHank's Balanced
Salt Solution（HBSS）で１：２希釈し、界面を破壊しないように、等容量のHis
topague（商標）-1077（Sigma Chemical Co.）上に注意して重層し、そして室温
で３０分間４００×Ｇで遠心分離した。単核細胞を含む層を集め、そしてその細
胞を、ＥＧＧＳを除去するために、１０％ヒト男性血漿を含むように修飾され、
そして１μｇ／mlヒドロコルチゾンを含む先に記載されたＭＥＣ培地（Cupta et
al., Exp.Cell.Res., 230, 244-251 (1997)）を用いて、１０分間２５０×Ｇで
遠心分離することにより３回洗浄した。上記培養基での洗浄は、バッファーでの
洗浄よりも好ましい。なぜなら上記培地は、より高レベルの細胞生存能力を維持
するからである。
【００４３】 上記軟層単核細胞がＥＧＭ（商標）−２培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）中に再懸
濁され、そして１００mlの出発血液からの軟層単核細胞の全てを、Ｉ型コラーゲ
ン（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で被覆されたｂ−ウェル・プレートの
１の壁上に置いた。これを１日目と定め、その日に、上記プレートを、制御され
た温度（３７℃）及び温度制御された環境（５％ＣＯ2 ）でインキュベーター内
に置く。このＥＧＭ（商標）−２培地を毎日代える。２日目に、上記軟層単核細
胞のほとんどが接着せずに残り、そしてそれら及び細胞死骸を、培養基交換時に
除去した。これは、上記培養ウェルの底に、典型的な内皮細胞形態をもち、そし
て抗内皮モノクローナル抗体Ｐ１Ｈ１２で陽性に染まる少数の細胞を残した。典
型的には、１００〜２００の他の単核細胞と一緒に、２日目に、約２０〜３０の
同定可能な上記細胞が存在した。
濁され、そして１００mlの出発血液からの軟層単核細胞の全てを、Ｉ型コラーゲ
ン（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で被覆されたｂ−ウェル・プレートの
１の壁上に置いた。これを１日目と定め、その日に、上記プレートを、制御され
た温度（３７℃）及び温度制御された環境（５％ＣＯ2 ）でインキュベーター内
に置く。このＥＧＭ（商標）−２培地を毎日代える。２日目に、上記軟層単核細
胞のほとんどが接着せずに残り、そしてそれら及び細胞死骸を、培養基交換時に
除去した。これは、上記培養ウェルの底に、典型的な内皮細胞形態をもち、そし
て抗内皮モノクローナル抗体Ｐ１Ｈ１２で陽性に染まる少数の細胞を残した。典
型的には、１００〜２００の他の単核細胞と一緒に、２日目に、約２０〜３０の
同定可能な上記細胞が存在した。
【００４４】 良好な細胞成長が確立された後（典型的には、約２０日目に、細胞は集密であ
ってもなくもよい）、それらを、フィブロネクチン／ゼラチン−コートされたＴ
２５フラスコに移し、そして次にフィブロネクチン／ゼラチン−コートされたＴ
７５フラスコに移す。上記細胞を継代培養するために、上記ウェルを、無カルシ
ウムＨＢＳＳで２回、そして次に０．５×トリプシン（すなわち、細胞の拾い上
げのために推奨されるＧｉｂｃｏ ＢＲＬ トリプシン産物のための濃度の５０
％、なぜならそれは、完全長産物よりも過酷ではないからである。）プラス１mM
ＥＤＴＡで１回、洗浄した。細胞は２分後に脱着する。トリプシンを、２０％
ヒト血清を含有するＭＥＣ培地又はヒト血漿の等容量を添加することにより、中
和する。細胞を、２５０×Ｇで５分間遠心分離により上記溶液から集め、そして
連続培養のためにＥＧＭ（商標）−２倍地中に再懸濁させた。
ってもなくもよい）、それらを、フィブロネクチン／ゼラチン−コートされたＴ
２５フラスコに移し、そして次にフィブロネクチン／ゼラチン−コートされたＴ
７５フラスコに移す。上記細胞を継代培養するために、上記ウェルを、無カルシ
ウムＨＢＳＳで２回、そして次に０．５×トリプシン（すなわち、細胞の拾い上
げのために推奨されるＧｉｂｃｏ ＢＲＬ トリプシン産物のための濃度の５０
％、なぜならそれは、完全長産物よりも過酷ではないからである。）プラス１mM
ＥＤＴＡで１回、洗浄した。細胞は２分後に脱着する。トリプシンを、２０％
ヒト血清を含有するＭＥＣ培地又はヒト血漿の等容量を添加することにより、中
和する。細胞を、２５０×Ｇで５分間遠心分離により上記溶液から集め、そして
連続培養のためにＥＧＭ（商標）−２倍地中に再懸濁させた。
【００４５】 図１は、上記方法を用いて増加させた内皮細胞の成長のプロットである。５つ
の異なる血液ドナーを用いた５つの異なる培養実験の平均±ＳＤを、培養継代５
までプロットした。その後、４つの異なる培養をプロットした。上記方法の高い
再現性のために、誤差バーは、上記グラフ上、明白ではない。図に示されるよう
に、本発明の方法は、一定の成長をもたらすことができ、そして培養２日目に同
定されることができる２０〜３０の内皮細胞よりもかなり高い内皮細胞の１０18 倍の増加をもたらすことができる（２日目には、軟層からの付着していない単核
細胞を細胞死骸が除去され、そしてＥＣが最初に同定されることができる）。
の異なる血液ドナーを用いた５つの異なる培養実験の平均±ＳＤを、培養継代５
までプロットした。その後、４つの異なる培養をプロットした。上記方法の高い
再現性のために、誤差バーは、上記グラフ上、明白ではない。図に示されるよう
に、本発明の方法は、一定の成長をもたらすことができ、そして培養２日目に同
定されることができる２０〜３０の内皮細胞よりもかなり高い内皮細胞の１０18 倍の増加をもたらすことができる（２日目には、軟層からの付着していない単核
細胞を細胞死骸が除去され、そしてＥＣが最初に同定されることができる）。
【００４６】 上記倍数の増加は最大増加ではないということに留意すべきである。それは、
細胞がさらなる実験のために使用される前に許容される増加の程度にすぎない。
それ故、上記細胞の拡大（増加）能における最大限度は（存在するとしたら）、
上記実験においては未だ、確立されておらず又は到達されていない。 上記成長細胞は、静止期の、微小血管ＥＣの特徴をもつ。それらは典型的には
“小石状の”内皮形態をもち；それらは、ヴォン・ヴィレブランド因子、Ｐ１Ｈ
１２抗原、１ＣＡＭ１，αv β3 ，β2 −マイクログロブリン、トロンボモジュ
リン、ｆｌｋ−１（ＶＥＧＥレセプター）、及びＣＤ３４についての陽性発現を
示し；それらは、等しくＣＤ３６−陽性であり；それらはアセチル化されたＬＤ
Ｌを取り込み；それらは組織因子又はＶＣＡＭを構成的に発現しないが、適当な
刺激の間、両者を発現する。
細胞がさらなる実験のために使用される前に許容される増加の程度にすぎない。
それ故、上記細胞の拡大（増加）能における最大限度は（存在するとしたら）、
上記実験においては未だ、確立されておらず又は到達されていない。 上記成長細胞は、静止期の、微小血管ＥＣの特徴をもつ。それらは典型的には
“小石状の”内皮形態をもち；それらは、ヴォン・ヴィレブランド因子、Ｐ１Ｈ
１２抗原、１ＣＡＭ１，αv β3 ，β2 −マイクログロブリン、トロンボモジュ
リン、ｆｌｋ−１（ＶＥＧＥレセプター）、及びＣＤ３４についての陽性発現を
示し；それらは、等しくＣＤ３６−陽性であり；それらはアセチル化されたＬＤ
Ｌを取り込み；それらは組織因子又はＶＣＡＭを構成的に発現しないが、適当な
刺激の間、両者を発現する。
【００４７】 実施例２ 培養された内皮細胞の冷凍保存 激しいＥＣ成長が冷凍保存後にさえ得られうる。これは重要なことである。な
ぜなら、本発明の有用性は、培養されたＥＣがその後の使用のために冷凍保存さ
れることができる場合に、より大きなものであるからである。
ぜなら、本発明の有用性は、培養されたＥＣがその後の使用のために冷凍保存さ
れることができる場合に、より大きなものであるからである。
【００４８】 このことを示すために、ＥＣを、それらの成長が２つのＴ７５フラスコの容量
に到達した後に、冷凍保存した。これを行うために、上記細胞を、上記のように
脱着させ、そしてＨＢＳＳで２回洗浄した。細胞を、９５０μｌ血清当り１００
万個の細胞の濃度で１００％胎児ウシ血清中に懸濁させ、そして次に５０μｌの
ジメチルスルホキシドを添加した。懸濁液を素速く混合し、そして５分間氷上に
置いた。その後、上記細胞を−７０℃で一夜保存し、そしてそれらを次に液体窒
素に移した。
に到達した後に、冷凍保存した。これを行うために、上記細胞を、上記のように
脱着させ、そしてＨＢＳＳで２回洗浄した。細胞を、９５０μｌ血清当り１００
万個の細胞の濃度で１００％胎児ウシ血清中に懸濁させ、そして次に５０μｌの
ジメチルスルホキシドを添加した。懸濁液を素速く混合し、そして５分間氷上に
置いた。その後、上記細胞を−７０℃で一夜保存し、そしてそれらを次に液体窒
素に移した。
【００４９】 ６週間の保存の後、上記細胞を解凍し、そして１００万個の細胞を、過剰（２
０ml）のＥＧＭ（商標）−２倍地を含むＴ７５フラスコ上に入れた。培地を、初
期プレーティングから４時間後、再び交換した。次に上記細胞を実施例１におけ
るように培養した。 得られた増殖は、図２に示すように、冷凍保存に供されなかったＥＣのものと
同様である。再び、データを、３つの実験について平均±ＳＤとして示す。元の
細胞カウントは、解凍され、そして出発した細胞の数を示す。これらのデータは
、血液から拡大した内皮成長細胞が、冷凍保存後にそれらの激しい成長速度を再
開することを示唆する。
０ml）のＥＧＭ（商標）−２倍地を含むＴ７５フラスコ上に入れた。培地を、初
期プレーティングから４時間後、再び交換した。次に上記細胞を実施例１におけ
るように培養した。 得られた増殖は、図２に示すように、冷凍保存に供されなかったＥＣのものと
同様である。再び、データを、３つの実験について平均±ＳＤとして示す。元の
細胞カウントは、解凍され、そして出発した細胞の数を示す。これらのデータは
、血液から拡大した内皮成長細胞が、冷凍保存後にそれらの激しい成長速度を再
開することを示唆する。
【００５０】 実施例３ 血液中のＣＥＣの起源の研究 新鮮血液中で同定されることができるＣＥＣの起源は知られていないし、かつ
、ＣＥＣと培養血液から成長した内皮との間の関係も知られていない。これに答
えるために、異性のドナーを用いて５〜２０ヶ月前に、（悪性腫瘍のために）同
種異系骨髄移植を経験した４人の成人を試験した（３人の女性ドナーが３人の男
性レシピエントに、そして１人の男性ドナーが１人の女性レシピエントに）。４
人の被験体の全てが疾患をもたず；そしてＲＦＬＰにより１００％ドナーである
末梢血及び／又は骨髄吸引物をもち；２人が１００％ドナーを示す骨髄細胞遺伝
をもっていた。
、ＣＥＣと培養血液から成長した内皮との間の関係も知られていない。これに答
えるために、異性のドナーを用いて５〜２０ヶ月前に、（悪性腫瘍のために）同
種異系骨髄移植を経験した４人の成人を試験した（３人の女性ドナーが３人の男
性レシピエントに、そして１人の男性ドナーが１人の女性レシピエントに）。４
人の被験体の全てが疾患をもたず；そしてＲＦＬＰにより１００％ドナーである
末梢血及び／又は骨髄吸引物をもち；２人が１００％ドナーを示す骨髄細胞遺伝
をもっていた。
【００５１】 新鮮血液中のＣＥＣ、プラス内皮成長因子とともに培養された軟層単核細胞か
ら成長した末梢血内皮を実施例１の培養条件を用いて試験した。内皮であると細
胞を同定するためにＭＡｂ Ｐ１Ｈ１２を使用し、そして蛍光イン・サイチュー
・ハイブリダイゼーションを、ＸＸ又はＸＹ遺伝子型をもつ細胞を同定するため
に使用した。
ら成長した末梢血内皮を実施例１の培養条件を用いて試験した。内皮であると細
胞を同定するためにＭＡｂ Ｐ１Ｈ１２を使用し、そして蛍光イン・サイチュー
・ハイブリダイゼーションを、ＸＸ又はＸＹ遺伝子型をもつ細胞を同定するため
に使用した。
【００５２】 新鮮血液中のＣＥＣは、ほとんど独占的に受容者の遺伝子型（９５，１００，
１００，８８％）をもっていた。このことは、血管壁からのそれらの起源に賛成
する。しかしながら、培養における２６〜２８日目（１００倍増加後）に成長し
た血液内皮は、ほとんどドナーの遺伝子型であり（８２，８６，７７，８５％）
、このことは、骨髄誘導細胞からの主要な起源を表している。顕著には、同時培
養におけるほんの９日目（５倍増加）において成長した内皮は、未だ広く受容者
の遺伝子型（７８，８８％）であった。これらのデータは、新鮮血液中で検出さ
れたＣＥＣが血管壁由来であり、そして一定であるが限定された増殖能力をもつ
ことを示している。反対に、血液は、増加するためにより長い時間を要するがよ
り大きな増殖力をもつ移植可能な骨髄由来細胞を含む。従って、上記ＣＥＣは、
より成熟し、かつ、分化した細胞集団を含み、一方、より原始の前駆集団（推定
血管芽細胞）を含む循環性骨髄由来内皮形成性細胞も存在する。
１００，８８％）をもっていた。このことは、血管壁からのそれらの起源に賛成
する。しかしながら、培養における２６〜２８日目（１００倍増加後）に成長し
た血液内皮は、ほとんどドナーの遺伝子型であり（８２，８６，７７，８５％）
、このことは、骨髄誘導細胞からの主要な起源を表している。顕著には、同時培
養におけるほんの９日目（５倍増加）において成長した内皮は、未だ広く受容者
の遺伝子型（７８，８８％）であった。これらのデータは、新鮮血液中で検出さ
れたＣＥＣが血管壁由来であり、そして一定であるが限定された増殖能力をもつ
ことを示している。反対に、血液は、増加するためにより長い時間を要するがよ
り大きな増殖力をもつ移植可能な骨髄由来細胞を含む。従って、上記ＣＥＣは、
より成熟し、かつ、分化した細胞集団を含み、一方、より原始の前駆集団（推定
血管芽細胞）を含む循環性骨髄由来内皮形成性細胞も存在する。
【００５３】 実施例４ 第VIII因子発現ベクターでのＣＥＣのトランスフェクション 内皮細胞を、実施例１に記載したように、血液から増加させた。上記トランス
フェクション実験のために、それらを４〜５継代培養後に使用した。それらを、
２×１０5 ／ウェルの密度でｂウェル・プレート内にプレーティングし、そして
一夜、付着せしめた。次に、以下の表１に要約したように、４つのベクターの中
の１を用いたリポフェクションにより、異なるウェル内の細胞をトランスフェク
トさせた。
フェクション実験のために、それらを４〜５継代培養後に使用した。それらを、
２×１０5 ／ウェルの密度でｂウェル・プレート内にプレーティングし、そして
一夜、付着せしめた。次に、以下の表１に要約したように、４つのベクターの中
の１を用いたリポフェクションにより、異なるウェル内の細胞をトランスフェク
トさせた。
【００５４】 表１．ＣＥＣトランスフェクションのためのプラスミドベクター Ａ．緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）で置き替えられた Ｂ−ドメインレスFVIIIをもつＯｃｔａｇｅｎからの２つのベクター： ＃１ ＨＳＱ／ｅＧＦＰ／ＲｅＮｅｏ ＃２ ＨＳＱ／ｅＧＦＰ／ＣＰ Ｂ．第VIII因子ではなくＧＦＰをもつＯｃｔａｇｅｎからの対照ベクター： ＃３ ｐＥＧＦＰ−Ｎ１ Ｃ．商業的なベクターｐｃＤＮＡ３．１（−）内のＸｈｏＩとＮｏｔＩ部位 の間に挿入されたＯｃｔａｇｅｎからのFVIII／ＧＦＰをもつ、 University of Minnesota, Department of Medicineにおいて構築され たベクター： ＃４ ｐｃＨＳＱ／ｅＧＦＰ 上記トランスフェクション・ベクターの全てが、選択マーカーとしてネオマイ
シン耐性遺伝子（ＲｅＮｅｏ）を含む。
シン耐性遺伝子（ＲｅＮｅｏ）を含む。
【００５５】 ベクター１，２、及び４は、fVIII−ｄＧＦＰ融合タンパク質をコードするＨ
ＳＱ／ｅＧＦＰ挿入物を含む。この挿入物は、配列の順番において、１）ヒトfV
IIIヒト活性化ペプチド、２）ヒトfVIII Ａ１ドメイン、３）ヒトfVIII Ａ２ド
メイン、４）ＳＱ Ｂドメイン・リンカー・ペプチドの最初の５アミノ酸、５）
エンハンスされた緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、６）ＳＱリンカー・ペプチ
ドの最後の９アミノ酸、７）ヒトfVIII軽鎖活性化ペプチド、８）ヒトfVIII Ａ
３ドメイン、９）ヒトfVIII Ｃ１ドメイン、及び１０）ヒトfVIII Ｃ２ドメイ
ン、をコードするＤＮＡを含む。
ＳＱ／ｅＧＦＰ挿入物を含む。この挿入物は、配列の順番において、１）ヒトfV
IIIヒト活性化ペプチド、２）ヒトfVIII Ａ１ドメイン、３）ヒトfVIII Ａ２ド
メイン、４）ＳＱ Ｂドメイン・リンカー・ペプチドの最初の５アミノ酸、５）
エンハンスされた緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、６）ＳＱリンカー・ペプチ
ドの最後の９アミノ酸、７）ヒトfVIII軽鎖活性化ペプチド、８）ヒトfVIII Ａ
３ドメイン、９）ヒトfVIII Ｃ１ドメイン、及び１０）ヒトfVIII Ｃ２ドメイ
ン、をコードするＤＮＡを含む。
【００５６】 ＨＳＱ／ｅＧＦＰのＤＮＡ配列を図３に示す（配列番号１）。このＤＮＡ配列
は、表２上に列記したペプチドをコードする、５０９４塩基を含む。 表２．ＨＳＱ／ｅＧＦＰペプチド配列番号１ １〜５７シグナル・ペプチド ５８〜１１７３ Ａ１ ドメイン １１７４〜２２７４ Ａ２ドメイン ２２７５〜２２９２ ＳＱ配列（第１部） ２２９３〜３０１２ ｅＧＦＰ配列 ３０１３〜３０３９ ＳＱ配列（第２部） ３０４０〜３１６２ 軽鎖活性化ペプチド ３１６３〜４１５２ Ａ３ドメイン ４１５３〜４６１１ Ｃ１ドメイン ４６１２〜５０９１ Ｃ２ドメイン ５０９２〜５０９４ 終結コドン ＲｅＮｅｏは哺乳動物発現ベクター（所有権のない物）。第２プラスミド、Ｈ
ＳＱ／ｅＧＦＰ／ＣＰは、同一fVIII構築物を含んでいたが、上記ベクターは、
ｅＣＦＰを発現させるために使用されるものである（以下を見よ）。上記ｅＧＦ
Ｐタンパク質は、ｐ−ＥＧＦＰ−Ｎ１から除去され、そしてＨＳＱ／ｅＧＦＰ構
築物で置き替えられた。第３プラスミドは、ｅＧＦＰだけを発現する、ｃｌｏｎ
ｔｅｃｈからのｐ−ＥＧＦＰ−Ｎ１である。
は、表２上に列記したペプチドをコードする、５０９４塩基を含む。 表２．ＨＳＱ／ｅＧＦＰペプチド配列番号１ １〜５７シグナル・ペプチド ５８〜１１７３ Ａ１ ドメイン １１７４〜２２７４ Ａ２ドメイン ２２７５〜２２９２ ＳＱ配列（第１部） ２２９３〜３０１２ ｅＧＦＰ配列 ３０１３〜３０３９ ＳＱ配列（第２部） ３０４０〜３１６２ 軽鎖活性化ペプチド ３１６３〜４１５２ Ａ３ドメイン ４１５３〜４６１１ Ｃ１ドメイン ４６１２〜５０９１ Ｃ２ドメイン ５０９２〜５０９４ 終結コドン ＲｅＮｅｏは哺乳動物発現ベクター（所有権のない物）。第２プラスミド、Ｈ
ＳＱ／ｅＧＦＰ／ＣＰは、同一fVIII構築物を含んでいたが、上記ベクターは、
ｅＣＦＰを発現させるために使用されるものである（以下を見よ）。上記ｅＧＦ
Ｐタンパク質は、ｐ−ＥＧＦＰ−Ｎ１から除去され、そしてＨＳＱ／ｅＧＦＰ構
築物で置き替えられた。第３プラスミドは、ｅＧＦＰだけを発現する、ｃｌｏｎ
ｔｅｃｈからのｐ−ＥＧＦＰ−Ｎ１である。
【００５７】 上記トランスフェクション・プロトコールは、リポフェクタミンを用いたＬｉ
ｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏ．により供給された指示に基づくもので
あった。簡単に言えば、プラスミドＤＮＡ ２μｇを、抗生物質を含まないＥ−
ＳＴＩＭ（商標）基本培地（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）２００μｌ中
でリポフェクタミン１５μｌと緩やかに混合した。この混合物を３０分間室温で
放置する。６ウェル−プレート内の増加した内皮細胞を、ＤＮＡ−リポソーム複
合体を添加する前にＥ−ＳＴＩＭ（商標）基本培地で２回洗浄した。一滴ずつ、
１．８mlのＥ−ＳＴＩＭ（商標）を上記ＤＮＡ−リポソーム複合体に添加し、次
にその混合物を上記内皮細胞上に重層した。５時間のインキュベーションの後、
上記ＤＮＡ−リポソーム混合物を、実施例１の内皮培養基で置き替えた。次に、
トランスフェクションから２日後に、１の培養ウェルからの細胞を、５０〜１０
０μｇ／mlのGeneticin（Life Technologies Co.）を含む内皮培養基中、１の１
０cm皿内で継代培養した。この選択培地を１日おきに交換した。
ｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏ．により供給された指示に基づくもので
あった。簡単に言えば、プラスミドＤＮＡ ２μｇを、抗生物質を含まないＥ−
ＳＴＩＭ（商標）基本培地（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）２００μｌ中
でリポフェクタミン１５μｌと緩やかに混合した。この混合物を３０分間室温で
放置する。６ウェル−プレート内の増加した内皮細胞を、ＤＮＡ−リポソーム複
合体を添加する前にＥ−ＳＴＩＭ（商標）基本培地で２回洗浄した。一滴ずつ、
１．８mlのＥ−ＳＴＩＭ（商標）を上記ＤＮＡ−リポソーム複合体に添加し、次
にその混合物を上記内皮細胞上に重層した。５時間のインキュベーションの後、
上記ＤＮＡ−リポソーム混合物を、実施例１の内皮培養基で置き替えた。次に、
トランスフェクションから２日後に、１の培養ウェルからの細胞を、５０〜１０
０μｇ／mlのGeneticin（Life Technologies Co.）を含む内皮培養基中、１の１
０cm皿内で継代培養した。この選択培地を１日おきに交換した。
【００５８】 ２人のドナーの血液由来の内皮細胞のトランスフェクションが、今日まで達成
されている。（２×１０5 より多くの細胞のトランスフェクションから得られた
）内皮コロニーの数を、表３に示すように、２人のドナーに関して選択培地中、
２０日目にチェックした。 表３．選択培地中２０日後のコロニーの数 ベクター＃１ ドナー１ ドナー２ １ ３ ９ ２ ２ ８ ３ ４ ７ ４ １ ８ ２０日目に、蛍光顕微鏡は、選択されたコロニーの全てが緑色蛍光タンパク質
（ＧＦＰ）について陽性であることを示した。２０日目に、上記コロニーをプー
ルし、そして通常の内皮成長条件に移した。
されている。（２×１０5 より多くの細胞のトランスフェクションから得られた
）内皮コロニーの数を、表３に示すように、２人のドナーに関して選択培地中、
２０日目にチェックした。 表３．選択培地中２０日後のコロニーの数 ベクター＃１ ドナー１ ドナー２ １ ３ ９ ２ ２ ８ ３ ４ ７ ４ １ ８ ２０日目に、蛍光顕微鏡は、選択されたコロニーの全てが緑色蛍光タンパク質
（ＧＦＰ）について陽性であることを示した。２０日目に、上記コロニーをプー
ルし、そして通常の内皮成長条件に移した。
【００５９】 過去においては、多くの基礎及び応用研究が動物種からの内皮細胞に対して行
われなければならなかった。なぜなら、現在の培養技術が、ヒト内皮細胞の制限
された増殖だけを許容したからである。本法は、循環ヒトＥＣの少なくとも１０ 18 倍の増加を達成する。この方法は、生きたドナーからの末梢血液が多数の培養
された内皮細胞の世代について使用されることを許容するであろう。従って、内
皮に係るヒト病理の問題に今日、ヒト内皮細胞モデルを使用することにより直接
にアプローチすることができる。さらに、増加された哺乳動物ＥＣは、さまざま
な臨床用途、例えば、生管作動性剤のインビトロ・テスティング、人工移植材料
のコーティング及び血管病理及び遺伝子障害を治療するためにデザインされた遺
伝子治療、局所的ドラッグ・デリバリー、並びに高められた生体適合性能のため
に貴重なものであることを証明するはずである。
われなければならなかった。なぜなら、現在の培養技術が、ヒト内皮細胞の制限
された増殖だけを許容したからである。本法は、循環ヒトＥＣの少なくとも１０ 18 倍の増加を達成する。この方法は、生きたドナーからの末梢血液が多数の培養
された内皮細胞の世代について使用されることを許容するであろう。従って、内
皮に係るヒト病理の問題に今日、ヒト内皮細胞モデルを使用することにより直接
にアプローチすることができる。さらに、増加された哺乳動物ＥＣは、さまざま
な臨床用途、例えば、生管作動性剤のインビトロ・テスティング、人工移植材料
のコーティング及び血管病理及び遺伝子障害を治療するためにデザインされた遺
伝子治療、局所的ドラッグ・デリバリー、並びに高められた生体適合性能のため
に貴重なものであることを証明するはずである。
【００６０】 実施例５ 疾患診断における内皮細胞培養方法の使用 最近、疾患に寄与する後天的又は遺伝的欠陥についてそれを評価するために患
者の内皮を検査する直接的又は非侵入的方法は存在しない。２５歳の男性の患者
が、高血液凝固能障害の存在について評価されている。上記患者は、多くの血栓
の病歴をもち、そして血栓に対する家族性の素因を示唆する家族歴をもっていた
。知られた遺伝子及び素因性原因に関する広範な評価の後、陽性の診断は全く得
られなかった。それ故、上記患者を、トロンボモジュリンにおける欠陥について
評価した。トロンボモジュリンは、内皮細胞表面上に発現され、そして抗−血栓
防御物である。弱い働きを導くトロンボモジュリンにおける突然変異をもつ患者
は、血栓について高いリスクをもつであろう。
者の内皮を検査する直接的又は非侵入的方法は存在しない。２５歳の男性の患者
が、高血液凝固能障害の存在について評価されている。上記患者は、多くの血栓
の病歴をもち、そして血栓に対する家族性の素因を示唆する家族歴をもっていた
。知られた遺伝子及び素因性原因に関する広範な評価の後、陽性の診断は全く得
られなかった。それ故、上記患者を、トロンボモジュリンにおける欠陥について
評価した。トロンボモジュリンは、内皮細胞表面上に発現され、そして抗−血栓
防御物である。弱い働きを導くトロンボモジュリンにおける突然変異をもつ患者
は、血栓について高いリスクをもつであろう。
【００６１】 内皮細胞を、本法を用いて上記患者及び３人の正常対照ドナーの血液から増殖
させた。トロンボモジュリン活性を標準的な生物化学的アッセイにおいて評価し
た。簡単に言えば、既知数の内皮細胞を、ウシ・プロテインＣ（ウェル当り１０
０μＬの１μＭ溶液）及びヒト組換えトロンビン（１０μＬの１０nM）とともに
インキュベートする。それを３７℃で２．５時間インキュベートする。上記反応
をＥＤＴＡとＩ−２５８１(Chromogenix AB, Molndal, Sweden）を添加すること
により終了させ、そしてクロマトグラフィー支持体Ｓ−２３６６（Dia Pharma G
roup, Inc., Franklin, DH）を添加する。上清の吸光度を４０５nmで読む。
させた。トロンボモジュリン活性を標準的な生物化学的アッセイにおいて評価し
た。簡単に言えば、既知数の内皮細胞を、ウシ・プロテインＣ（ウェル当り１０
０μＬの１μＭ溶液）及びヒト組換えトロンビン（１０μＬの１０nM）とともに
インキュベートする。それを３７℃で２．５時間インキュベートする。上記反応
をＥＤＴＡとＩ−２５８１(Chromogenix AB, Molndal, Sweden）を添加すること
により終了させ、そしてクロマトグラフィー支持体Ｓ−２３６６（Dia Pharma G
roup, Inc., Franklin, DH）を添加する。上清の吸光度を４０５nmで読む。
【００６２】 結果を、５０，０００内皮細胞当り１分間当りのＯＤ単位において与える。上
記３人の正常ドナーからの１８サンプルについての値は５３±７であった。一方
、上記患者からの６サンプルについての値は４１±５、有意差（ｐ＝０．００３
４）であった。従って、上記患者からの増殖された内皮細胞は、対照患者のもの
よりも有意に低いトロンボモジュリン活性を有していた。従って、トロンボモジ
ュリン欠陥をもたらすトロンボモジュリンにおける遺伝子突然変異は、上記患者
の失調のための基礎的根拠となりうる。分子生物学的分析を、上記トロンボモジ
ュリン欠陥に関する遺伝子的基礎を確認するために使用する。
記３人の正常ドナーからの１８サンプルについての値は５３±７であった。一方
、上記患者からの６サンプルについての値は４１±５、有意差（ｐ＝０．００３
４）であった。従って、上記患者からの増殖された内皮細胞は、対照患者のもの
よりも有意に低いトロンボモジュリン活性を有していた。従って、トロンボモジ
ュリン欠陥をもたらすトロンボモジュリンにおける遺伝子突然変異は、上記患者
の失調のための基礎的根拠となりうる。分子生物学的分析を、上記トロンボモジ
ュリン欠陥に関する遺伝子的基礎を確認するために使用する。
【００６３】 実施例６ 安定的トランスフェクション、選択、及び拡大 エンハンスされた緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）のための配列を含むプラス
ミドｐＬＥ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、ＰＡ３１７系にトランスフェクトさせた。
得られたクローン化トランスフェクト体、ｐＬＥ９の中の１からのウイルスを、
内皮細胞を感染させるために使用した。
ミドｐＬＥ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、ＰＡ３１７系にトランスフェクトさせた。
得られたクローン化トランスフェクト体、ｐＬＥ９の中の１からのウイルスを、
内皮細胞を感染させるために使用した。
【００６４】 血液軟層単核細胞の培養を本発明の方法に従って設定した。細胞が第４継代及
び約１０6 倍の拡大に達したとき、それらを１０5 細胞／皿において植菌した。
ここで、１０cm皿は、１％ゼラチン中、６μｇ／cm2 のＩ型コラーゲン及び２５
０μｇ／皿のフィブロネクチンでコートされていた。 ２日間の培養後、細胞を、４μｇ／mlのポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）と
ともに、上記パッケージング細胞系からの条件培地に晒して、７０％集密であっ
た皿までとした。３日間晒した後、細胞を（上記のようにコートされた）１０cm
皿に１：２に分割し、そして新たな培養基を添加した。次にそれらを、１９日間
Ｇ４１８を含有する培地中で選択に供した。
び約１０6 倍の拡大に達したとき、それらを１０5 細胞／皿において植菌した。
ここで、１０cm皿は、１％ゼラチン中、６μｇ／cm2 のＩ型コラーゲン及び２５
０μｇ／皿のフィブロネクチンでコートされていた。 ２日間の培養後、細胞を、４μｇ／mlのポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）と
ともに、上記パッケージング細胞系からの条件培地に晒して、７０％集密であっ
た皿までとした。３日間晒した後、細胞を（上記のようにコートされた）１０cm
皿に１：２に分割し、そして新たな培養基を添加した。次にそれらを、１９日間
Ｇ４１８を含有する培地中で選択に供した。
【００６５】 図５に示すように、本発明の方法に従って調製された培養内皮細胞は、化学選
択を生き延び、そしてその後増殖し、そして安定的にトランスフェクトされて外
来（選択されていない）遺伝子を発現することができる。その上、成長した細胞
は、正常な内皮細胞形態を保存していた。 実施例７ ヒト第VIII因子（hFVIII）発現ベクターによるＣＥＣのトランスフェクション 材料と方法 トランスフェクション １０cm皿とＴ７５フラスコを６μｇ／mlのＩ型コラーゲンと５０μｇ／mlのフ
ィブロネクチンでコートした。第４又５継代の成長した内皮細胞を実施例１に記
載したように得た。それらを、上記皿又はフラスコに植菌し、そして４０％集密
（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）まで増殖させた。次に、上記細胞を、製造者のプロト
コールに従って、トランスフェクション試薬Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ Ｍｓ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃｏｌｓ）を用いてhFVIIIベクターでトラン
スフェクトさせた（表４）。簡単に言えば、Ｆｕｇｅｎｅ６を２．５：１の比で
各ベクターに添加した。１０μｇのＤＮＡを、１０cm皿内の細胞のトランスフェ
クションのために使用し；そして１５μｇのＤＮＡをＴ７５フラスコ内の細胞の
ために使用した。
択を生き延び、そしてその後増殖し、そして安定的にトランスフェクトされて外
来（選択されていない）遺伝子を発現することができる。その上、成長した細胞
は、正常な内皮細胞形態を保存していた。 実施例７ ヒト第VIII因子（hFVIII）発現ベクターによるＣＥＣのトランスフェクション 材料と方法 トランスフェクション １０cm皿とＴ７５フラスコを６μｇ／mlのＩ型コラーゲンと５０μｇ／mlのフ
ィブロネクチンでコートした。第４又５継代の成長した内皮細胞を実施例１に記
載したように得た。それらを、上記皿又はフラスコに植菌し、そして４０％集密
（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）まで増殖させた。次に、上記細胞を、製造者のプロト
コールに従って、トランスフェクション試薬Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ Ｍｓ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃｏｌｓ）を用いてhFVIIIベクターでトラン
スフェクトさせた（表４）。簡単に言えば、Ｆｕｇｅｎｅ６を２．５：１の比で
各ベクターに添加した。１０μｇのＤＮＡを、１０cm皿内の細胞のトランスフェ
クションのために使用し；そして１５μｇのＤＮＡをＴ７５フラスコ内の細胞の
ために使用した。
【００６６】 上記Ｆｕｇｅｎｅ６−ＤＮＡ混合物を、１０％ヒト血清を含有する培地中の上
記細胞に添加し、そして３日間インキュベートした。細胞は３日後１００％集密
まで達した。 表４．プラスミド・ベクター pTracerHSQは：pTracer-CMV（Invitrogen）内にクローン化された HSQ（eGFP挿入物をもたないＢ−ドメインレスhFVIII)をもつ PcF8Gは：プラスミドpCDNA3.1（Invitrogen）内にクローン化され たHSQ/eGFP(eGFPはhFVIIIのＢドメインを置き替える）をもつ pcHSQは：プラスミドpCDNA3.1（Invitrogen）内にクローン化され たHSQをもつ pTracerCMV：Invitrogenから得られたもの HSQ/GFP/ReNeoは：pRENeo（Biogen）内にクローン化されたHSQ/eGFP をもつ 一過性発現（Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ） ３日目の終りに、Ｔ７５フラスコからの条件培地を集め、そして遠心分離にか
けた。上清中のhFVIIIの存在を、ＥＬＩＳＡキット（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａ
ｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて検出した。Ｔ７５フラスコからの細胞を収獲し、溶
解させ、そしてhFVIII ｍＲＮＡの検出のためにプロセスした（RT-PCR, Titan
One Tube RT-PCR System, Roche Molecular Biochemicols）。逆転写酵素反応を
、４５分間５０℃で行い、次にサンプルを、９４℃、２分間；１０サイクルの、
９４℃、３０秒間、５５℃、３０秒間、及び７２℃、１分間；２０サイクルの、
９４℃、３０秒間、５５℃、３０秒間、及び７２℃、１分間、加えて７２℃、７
分間の各サイクル伸長のための５秒間のサイクル伸長、において行った。使用し
たプライマー対は、hFVIII Ｃ−Ｓ（５′ＧＣＣ ＣＴＴ ＴＴＣ ＴＴＧ Ｇ
ＡＴ ＣＡＡ ＧＧＴ ＧＧ ３′；配列番号３）及びhFVIII Ｃ−ＡＳ（５′
ＣＴＣ ＣＣＴ ＧＡＧ ＴＡＧ ＴＴＡ ＣＴＣ ＣＴＧ ＴＧ ３′；配
列番号４）であった。
記細胞に添加し、そして３日間インキュベートした。細胞は３日後１００％集密
まで達した。 表４．プラスミド・ベクター pTracerHSQは：pTracer-CMV（Invitrogen）内にクローン化された HSQ（eGFP挿入物をもたないＢ−ドメインレスhFVIII)をもつ PcF8Gは：プラスミドpCDNA3.1（Invitrogen）内にクローン化され たHSQ/eGFP(eGFPはhFVIIIのＢドメインを置き替える）をもつ pcHSQは：プラスミドpCDNA3.1（Invitrogen）内にクローン化され たHSQをもつ pTracerCMV：Invitrogenから得られたもの HSQ/GFP/ReNeoは：pRENeo（Biogen）内にクローン化されたHSQ/eGFP をもつ 一過性発現（Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ） ３日目の終りに、Ｔ７５フラスコからの条件培地を集め、そして遠心分離にか
けた。上清中のhFVIIIの存在を、ＥＬＩＳＡキット（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａ
ｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて検出した。Ｔ７５フラスコからの細胞を収獲し、溶
解させ、そしてhFVIII ｍＲＮＡの検出のためにプロセスした（RT-PCR, Titan
One Tube RT-PCR System, Roche Molecular Biochemicols）。逆転写酵素反応を
、４５分間５０℃で行い、次にサンプルを、９４℃、２分間；１０サイクルの、
９４℃、３０秒間、５５℃、３０秒間、及び７２℃、１分間；２０サイクルの、
９４℃、３０秒間、５５℃、３０秒間、及び７２℃、１分間、加えて７２℃、７
分間の各サイクル伸長のための５秒間のサイクル伸長、において行った。使用し
たプライマー対は、hFVIII Ｃ−Ｓ（５′ＧＣＣ ＣＴＴ ＴＴＣ ＴＴＧ Ｇ
ＡＴ ＣＡＡ ＧＧＴ ＧＧ ３′；配列番号３）及びhFVIII Ｃ−ＡＳ（５′
ＣＴＣ ＣＣＴ ＧＡＧ ＴＡＧ ＴＴＡ ＣＴＣ ＣＴＧ ＴＧ ３′；配
列番号４）であった。
【００６７】 結果 感染から３日後、hFVIIIは、トランスフェクトされた細胞の上清中に検出され
たが（図６）、対照細胞においては検出されなかった。図７は、上記細胞からの
ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す。hFVIII ｍＲＮＡの発現は、対照細胞
に対してトランスフェクトされた細胞内で上昇している。
たが（図６）、対照細胞においては検出されなかった。図７は、上記細胞からの
ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す。hFVIII ｍＲＮＡの発現は、対照細胞
に対してトランスフェクトされた細胞内で上昇している。
【００６８】 ３日目の終りに、１０cm皿からの細胞を、６μｇ／mlのＩ型コラーゲン及び５
０μｇ／mlのフィブロネクチンでコートされた１０cm皿２つに分割した。翌日、
細胞を、５０〜１００μｇ／mlのＧ４１８又は５０μｇ／mlのＺｅｏｃｉｎ又は
両者を含む選択培地ＥＧＭ−２（Ｃｌｏｎｅｃｔｉｓ）に晒した（Ｚｅｏｃｉｎ
をｐＴｒａｃｅｒＨＳＱの選択のために使用し；Ｇ４１８をpcFVIIIGとＨＳＱ／
ＧＦＰ／ＲｅＮｅｏのために使用し；そしてＺｅｏｃｉｎとＧ４１８を同時トラ
ンスフェクションに供した細胞のために使用した）。hFVIIIの安定的発現は、化
学的選択後上記細胞内に検出される。
０μｇ／mlのフィブロネクチンでコートされた１０cm皿２つに分割した。翌日、
細胞を、５０〜１００μｇ／mlのＧ４１８又は５０μｇ／mlのＺｅｏｃｉｎ又は
両者を含む選択培地ＥＧＭ−２（Ｃｌｏｎｅｃｔｉｓ）に晒した（Ｚｅｏｃｉｎ
をｐＴｒａｃｅｒＨＳＱの選択のために使用し；Ｇ４１８をpcFVIIIGとＨＳＱ／
ＧＦＰ／ＲｅＮｅｏのために使用し；そしてＺｅｏｃｉｎとＧ４１８を同時トラ
ンスフェクションに供した細胞のために使用した）。hFVIIIの安定的発現は、化
学的選択後上記細胞内に検出される。
【００６９】 先に引用した特許、特許出願、及び刊行物の全てを、本明細書中に援用する。
本発明の好ましい態様を記載してきたけれども、さまざまな変更、改作、及び修
正が、本発明の本質及び添付請求の範囲から逸脱せずに行いうると理解すべきで
ある。
本発明の好ましい態様を記載してきたけれども、さまざまな変更、改作、及び修
正が、本発明の本質及び添付請求の範囲から逸脱せずに行いうると理解すべきで
ある。
【図１】 図１は、本発明に従った内皮細胞の成長をプロットするグラフである。矢印は
、培養物が継代された時を示す。データ点の全てが平均±ＳＤとしてプロットさ
れる。データを、第６継代までに関してｎ＝５について、そしてその後の継代に
関してはｎ＝４について示す。
、培養物が継代された時を示す。データ点の全てが平均±ＳＤとしてプロットさ
れる。データを、第６継代までに関してｎ＝５について、そしてその後の継代に
関してはｎ＝４について示す。
【図２】 図２は冷凍保存に供された、内皮細胞の成長をプロットするグラフである。
【図３】 図３は、ＨＳＱ／ｅＧＦＰのＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。（HFVIII／Ｓ
Ｑ／ｅｇｆｐ）は、Lind et al., Eur. J. Biochem., 232に基づくＢ−ドメイン
ＳＱ挿入物をもつ元のＨＢ；及びｅＧＦＰタンパク質配列を含むｐ２１プライマ
ー配列を含む。
Ｑ／ｅｇｆｐ）は、Lind et al., Eur. J. Biochem., 232に基づくＢ−ドメイン
ＳＱ挿入物をもつ元のＨＢ；及びｅＧＦＰタンパク質配列を含むｐ２１プライマ
ー配列を含む。
【図４】 図４はＨＳＱＲＥＮｅｏのＤＮＡ配列（配列番号２）を示す。
【図５】 図５は、ｅＧＦＰをコードするベクターで安定的にトランスフェクトされた成
長した内皮細胞のＧ４１８選択の結果（暗領域）を示す。
長した内皮細胞のＧ４１８選択の結果（暗領域）を示す。
【図６】 図６は、各種構築物でトランスフェクトされた細胞からの条件培地中の第VIII
因子の活性を示す。
因子の活性を示す。
【図７】 各種構築物でトランスフェクトされた細胞内のヒトFVIII ｍＲＡについての
ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す。
ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ ４Ｃ０８７ 5/10 5/00 Ｂ 15/09 ＺＮＡ Ａ６１Ｋ 37/48 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ａ６１Ｌ 33/00 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ヘベル，ロバート ピー． アメリカ合衆国，ミネソタ 55127，ノー ス オークス，アイランド ロード 25 (72)発明者 リン，イー アメリカ合衆国，ミネソタ 55108，セン ト ポール，カーリング ドライブ 1410 ＃108 (72)発明者 ロラー，ジョン エス． アメリカ合衆国，ジョージア 30033，デ ィケイター，オーク クロッシング ドラ イブ 2568 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 CA07 GA13 GA18 HA17 4B063 QA19 QQ08 QR48 QR77 QS24 QX01 4B065 AA90Y AA93X AB01 AC14 BA01 BB19 BB34 BC41 CA24 CA44 CA46 4C081 AB13 AB17 AC14 BA05 CD18 CD34 4C084 AA03 BA44 CA56 DC15 ZA54 4C087 AA01 AA02 BB64 BB65 CA16 ZA54
Claims (36)
- 【請求項１】 末梢血液から得られた内皮細胞の集団を拡大する方法であっ
て、Ｉ型コラーゲン被覆表面に接触させて、有効量の血管内皮成長因子（ＶＥＧ
Ｆ）を含有する細胞培養基の存在下で末梢哺乳動物血液から得られた軟層細胞を
培養して、上記軟層細胞中の内皮細胞の集団を拡大することを含む、前記方法。 - 【請求項２】 前記血液がヒト血液である、請求項１に記載の方法。
- 【請求項３】 前記細胞培養基が、ヘパリン、硫酸デキストラン又はそれら
の混合物を含む、請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 前記軟層細胞が、２０％ヒト男性血漿を含む細胞培養基中の
ヒト血液から得られた軟層の層から細胞を洗浄することにより得られる。 - 【請求項５】 前記細胞培養基が、ヒト塩基性線維芽成長因子を含む、請求
項１に記載の方法。 - 【請求項６】 前記細胞培養基がインスリン様成長因子を含む、請求項１〜
５のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項７】 前記細胞培養基がヒト上皮成長因子を含む、請求項１〜５の
いずれか１項に記載の方法。 - 【請求項８】 前記細胞培養基が、約０．５〜１０容量％の胎児ウシ血清及
び９５〜９９．５容量％の細胞培養基を含む、請求項１に記載の方法。 - 【請求項９】 前記培養された細胞が、約１０3 倍の増加においてトリプシ
ン化し、遠心分離により集め、細胞培養基中に再懸濁させ、そしてフィブロネク
チン／ゲラニン被覆された表面に接触させて連続培養に供する、請求項１に記載
の方法。 - 【請求項１０】 前記培養された細胞が冷凍保存に供される、請求項１に記
載の方法。 - 【請求項１１】 前記細胞が、有効量のジメチルスルホキシドを含む胎児ウ
シ血清を含む冷凍保存培地中で冷凍される、請求項１０に記載の方法。 - 【請求項１２】 前記冷凍保存された細胞が、解凍され、そして培養が上記
細胞培養基中で再開される、請求項１０又は１１に記載の方法。 - 【請求項１３】 前記拡大された集団が、微小血管内皮細胞を含む、請求項
１に記載の方法。 - 【請求項１４】 前記微小血管内皮細胞が、ＣＤ３４+ 、ＣＤ３６+ であり
、そしてＰＩＨ１抗原を発現する、請求項１３に記載の方法。 - 【請求項１５】 組換え第VIII因子タンパク質をコードする単離ＤＮＡを含
むトランスジェニック哺乳動物内皮細胞。 - 【請求項１６】 前記第VIII因子タンパク質が、ハイブリッド・ヒト／ブタ
・タンパク質である、請求項１５に記載のトランスジェニック内皮細胞。 - 【請求項１７】 血液から外成長した循環ヒト内皮細胞の集団を、ヒト内皮
細胞内で働くプロモーターに作用可能な状態で連結された事前選択タンパク質を
コードする単離ＤＮＡ配列を含むベクターで、安定して形質転換させることを含
む方法により製造されたトランスジェニック内皮細胞。 - 【請求項１８】 前記ＤＮＡ配列が、第VIII因子タンパク質をコードする、
請求項１７に記載のトランスジェニック内皮細胞。 - 【請求項１９】 前記ＤＮＡ配列が配列番号１又は配列番号２を含む、請求
項１７に記載のトランスジェニック内皮細胞。 - 【請求項２０】 前記第VIII因子タンパク質が、ハイブリッド・ヒト／ブタ
・タンパク質である、請求項１８に記載のトランスジェニック内皮細胞。 - 【請求項２１】 前記第VIII因子タンパク質が、キメラ・ヒト・タンパク質
である、請求項１８に記載のトランスジェニック内皮細胞。 - 【請求項２２】 前記ＤＮＡ配列が、選択マーカー遺伝子又はリポーター遺
伝子をさらに含む、請求項１７に記載のトランスジェニック内皮細胞。 - 【請求項２３】 リポフェクションにより製造された、請求項１７に記載の
トランスジェニック内皮細胞。 - 【請求項２４】 医薬として許容される担体とともに、請求項１５又は１７
に記載のトランスジェニック内皮細胞の集団を含む医薬組成物。 - 【請求項２５】 血友病の治療方法であって、血友病にかかった哺乳動物の
血流中に請求項１５又は１７に記載の内皮細胞の一定量を導入することを含み、
第VIII因子タンパク質の有効量が上記哺乳動物の血流中に分泌される、前記方法
。 - 【請求項２６】 前記哺乳動物がヒトである、請求項２５に記載の方法。
- 【請求項２７】 請求項１７に記載の内皮細胞で被覆された表面を含む移植
可能な医療補てつ装置であって、前記タンパク質が、哺乳動物内への移植に際し
、上記装置の生物学的適合性を高めるために有効な量で発現される、前記装置。 - 【請求項２８】 プラスチック表面、金属表面又はラミネート表面を含む、
請求項２７に記載の装置。 - 【請求項２９】 血管移植片である、請求項２８に記載の装置。
- 【請求項３０】 シャント（ｓｈｕｎｔ）又はステント（ｓｔｅｎｔ）であ
る、請求項２８に記載の装置。 - 【請求項３１】 心弁である、請求項２８に記載の装置。
- 【請求項３２】 制御された医薬放出貯蔵庫（ｄｅｐｏｔ）である、請求項
２８に記載の装置。 - 【請求項３３】 後天的又は遺伝的症状又は疾患のリスクいない哺乳動物か
ら得られた内皮細胞の対照拡大集団に比較して、テスト哺乳動物から得られた内
皮細胞の拡大集団が、後天的又は遺伝的症状又は疾患をもつかどうかを検出し又
は決定することを含む診断方法であって、ここで、上記増加された細胞は、内皮
細胞の拡大集団を得るために、Ｉ型コラーゲン被覆表面に接触して、血管内皮成
長因子（ＶＥＧＦ）の有効量を含む細胞培養基の存在下で末梢哺乳動物血液から
得られた軟層細胞を培養することにより得られ、ここで上記培養基は、ウシ脳抽
出物を含有しない、前記方法。 - 【請求項３４】 前記症状又は疾患が、血液凝固障害である、請求項３３に
記載の方法。 - 【請求項３５】 前記症状又は疾患が、酵素の活性における低下に関係する
、請求項３３に記載の方法。 - 【請求項３６】 前記症状又は疾患が後天的に得られる、請求項３３に記載
の方法。
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|---|---|---|---|
| US10968798P | 1998-11-24 | 1998-11-24 | |
| US60/109,687 | 1998-11-24 | ||
| PCT/US1999/028033 WO2000032750A1 (en) | 1998-11-24 | 1999-11-24 | Transgenic circulating endothelial cells |
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|---|---|
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|---|---|---|---|
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|---|---|
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| EP (1) | EP1144594A1 (ja) |
| JP (1) | JP2002537761A (ja) |
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| CA (1) | CA2351671A1 (ja) |
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| US8046171B2 (en) | 2003-04-18 | 2011-10-25 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods and apparatus for genetic evaluation |
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