ES2347078T3 - Materiales y metodos para alterar una respuesta inmunologica a inmunogenos exogenos y endogenos, incluyendo celulas, tejidos u organos singeneicos y no singeneicos. - Google Patents

Abstract

Un material implantable, que comprende una matriz biocompatible y células endoteliales ancladas o incluidas, células de tipo endotelial o sus análogos para ser usado en la reducción de una respuesta inmune o una reacción inflamatoria en un método que comprende la etapa de proporcionar dicho material implantable a un receptor en una cantidad suficiente para reducir la respuesta inmune o la reacción inflamatoria en dicho receptor, en que la matriz tiene una configuración tridimensional de forma que las células ancladas y/o incluidas pueden crear y ocupar un hábitat multi-dimensional.

Description

Materiales y métodos para alterar una respuesta inmunológica a inmunógenos exógenos y endógenos, incluyendo células, tejidos u órganos singeneicos y no singeneicos.

Campo de la invención

Esta invención se dirige a materiales y métodos para modular una respuesta inmunológicamente adversa a un inmunógeno exógeno o endógeno, que incluye un inmunógeno asociado a células, tejidos u órganos. Por ejemplo, la presente invención puede modular una reacción de respuesta inmune o inflamatoria adversa a inmunógenos exógenos o endógenos, que incluyen células, tejidos u órganos no singeneicos o singeneicos, así como para mejorar un estado autoinmune.

Antecedentes de la invención

La investigación sobre xenotrasplantes se ha intensificado durante los últimos años para aliviar la escasez de órganos. Sin embargo, las respuestas inmunes de los hospedantes presentan una enorme barrera para el trasplante entre las especies. Aunque los anticuerpos naturales provocan un rechazo inmediato de estos trasplantes discordantes, la lesión de células endoteliales (EC) y la activación de los vasos injertados que recubren las EC desempeñan una función clave en el inicio del rechazo crónico de injertos. La interrupción de la integridad de la capa endotelial tiene una importancia indudable en numerosos estados, que incluye en trasplantes de tejidos singeneicos y no singeneicos así como enfermedades infecciosas, neoplásticas, inflamatorias y cardiovasculares.

Hasta ahora la inmunomodulación y la aceptación de los trasplantes ha requerido una dependencia de agentes inmunosupresores administrados por vía sistémica. Aunque estos agentes permiten algún grado de aceptación del trasplante, el éxito es limitado y quizás, de forma más significativa, el sistema inmune del paciente queda profundamente comprometido como consecuencia de estos agentes. Por tanto, continúa habiendo una necesidad de materiales terapéuticos y paradigmas de tratamiento que puedan conseguir la ausencia de una inmunomodulación y de efectos de toxicidad y adversos en el sistema inmune de un paciente.

Análogamente, los inmunógenos o estímulos exógenos han planteado un desafío clínico. También, estos pueden dar lugar a acontecimientos inmunológicos adversos o reacciones inflamatorias que necesitan un tratamiento.

Hasta ahora, la gestión clínica de estos acontecimientos adversos se ha basado casi exclusivamente en tratamientos con agentes farmacéuticos que suprimen el sistema inmune de forma no específica.

Las enfermedades autoinmunes y otras enfermedades similares, sin embargo, son otra manifestación clínica de reacciones inflamatorias destacadas o respuestas inmunes adversas. La gestión satisfactoria de estas enfermedades se ha escapado a los facultativos hasta ahora.

Un objeto de la presente invención es proporcionar una solución de ingeniería de tejidos para conseguir una inmunomodulación sin basarse en productos químicos o farmacéuticos que comprometan el sistema inmune de un paciente. Esta solución de ingeniería de tejidos puede ser empleada para alterar, de una manera clínicamente práctica, una respuesta inmune para inmunógenos exógenos y endógenos, que incluyen inmunógenos asociados a células, tejidos u órganos no singeneicos así como singeneicos. Otro objeto de la presente invención es facilitar la aceptación de un paciente de células, tejidos u órganos no singeneicos así como singeneicos. Otro objeto de la presente invención es emplear esta solución de ingeniería de tejidos para modular una reacción inflamatoria como la asociada a lesiones y diversas enfermedades. Otro objeto es utilizar los materiales y métodos de la presente invención para gestionar enfermedades de autoinmunidad y relacionadas.

Nugent et al. (2002) Journal of Vascular Research 39(6): 524-533 describen la implantación de implantes endoteliales alógenos que comprenden una matriz tridimensional basada en colágeno en la que se han sembrado células endoteliales aórticas porcinas y el uso de dichos implantes para inhibir la hiperplasia íntima.

Nugent et al. (1999) Circulation Research 84(4): 384-391 describen la sembradura de células endoteliales aórticas bovinas y porcinas en una matriz tridimensional de colágeno y el uso de la matriz sembrada como un implante para inhibir la hiperplasia íntima.

Sumario de la invención

La presente invención explota el descubrimiento de que las células ancladas y/o incluidas en una matriz biocompatible, preferentemente una que tenga una configuración tridimensional, pueden modular una respuesta inmunológicamente adversa o una reacción inflamatoria respecto a cualquier inmunógeno exógeno o endógeno. Inmunógeno incluye cualquier inmunógeno singeneico o no singeneico, que incluye un inmunógeno asociado a células, tejidos u órganos, así como lesiones, enfermedades y estímulos medioambientales.

La presente invención proporciona un material implantable como se describe en las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A, 1B y 1C exponen gráficamente los niveles de anticuerpos específicos PAE en circulación según una realización ilustrativa de la inven-
ción.

La Figura 2 expone gráficamente la actividad lítica de esplenocitos según una realización ilustrativa de la invención.

La Figura 3A expone gráficamente las frecuencias de células productoras de citoquinas según una realización ilustrativa de la invención.

La Figura 3B expone pocillos ELISPOT representativos según una realización ilustrativa de la invención.

La Figura 3C expone gráficamente las frecuencias de células T según una realización ilustrativa de la invención.

Las Figuras 4A y 4B representan gráficamente los niveles de células efectoras según una realización ilustrativa de la invención.

Las Figuras 5A, 5B y 5C exponen gráficamente niveles de anticuerpos según una realización ilustrativa de la invención.

La Figura 6 expone gráficamente niveles de esplenocitos según una realización ilustrativa de la invención.

Las Figuras 7A y 7B exponen gráficamente niveles de anticuerpos según una realización ilustrativa de la invención.

Las Figuras 8A y 8B exponen gráficamente la frecuencia de células productoras de citoquinas según una realización ilustrativa de la invención.

Las Figuras 9A y 9B exponen gráficamente niveles de células efectoras según una realización ilustrativa de la invención.

Las Figuras 10A y 10B exponen correlaciones entre la frecuencia esplenocitos productores de citoquinas Th2 y el alcance de la diferenciación de células T en células efectoras según una realización ilustrativa de la invención.

La Figura 11 expone gráficamente el grado de deterioro de células endoteliales según una realización ilustrativa de la invención.

Las Figuras que hacen referencia a PAE, HAE o EC "incluidas" o "incluidas en matrices" significan PAE, HAE o EC ancladas a matrices y/o incluidas en una matriz.

Descripción detallada de la invención

La ingeniería de tejidos es una aproximación prometedora para explotar células endoteliales, células de tipo endotelial o análogos de una terapia celular para enfermedades acompañadas de componentes inmunológicos adversos o tipificadas como tales. Por ejemplo, ciertas enfermedades como, pero sin limitación, las enfermedades vasculares, provocan respuestas inmunológicas adversas y/o reacciones inflamatorias. La presente invención se basa en el descubrimiento de que las células como las células endoteliales, que son ancladas o incluidas en matrices tridimensionales, secretan factores reguladores esenciales que pueden mejorar o modular de algún otro modo una respuesta inmunológica adversa.

El material implantable de la presente invención se desarrolló sobre los principios de la ingeniería de tejidos y representa una nueva aproximación para abordar las necesidades clínicas descritas en la presente memoria descriptiva. El material implantable de la presente invención es único en cuanto que las células viables ancladas y/o incluidas en la matriz biocompatible son capaces de suministrar al sitio de administración múltiples productos basados en células en proporciones fisiológicas bajo un control de la retroalimentación fisiológica. Como se describe en otro lugar en la presente memoria descriptiva, las células adecuadas para ser usadas con el material implantable son células endoteliales o de tipo endotelial, o análogas de cada una de las que anteceden. El suministro local de múltiples compuestos por estas células y una dosificación fisiológicamente dinámica proporcionan una regulación más eficaz de los procedimientos responsables de modular una respuesta inmune. El material implantable de la presente invención puede proporcionar un entorno que emule la fisiología de soporte y conduzca a la modulación de una respuesta inmune.

Esto es un descubrimiento inesperado ya que las células endoteliales pueden desempeñar una función clave en el inicio de respuestas alo- y xeno-inmune adversas. Además de ello, las células endoteliales pueden activar células T a través de procedimientos mediados por antígenos y la activación de células T puede modificar la función crucial de las células endoteliales, incluida la presentación de antígenos a través de la activación por citoquinas, contribuyendo así a una respuesta inmune adversa. Las células endoteliales expresan constitutivamente moléculas de complejo de histocompatibilidad principal (MHC) de clase I y el IFN-\gamma puede inducir células endoteliales para expresar moléculas de MHC clase II que les permite proporcionar señales dependientes de antígeno a células T CD8^{+} y CD4^{+} a través de la trayectoria directa. Las células endoteliales puede proporcionar también principalmente la co-estimulación a células T. Además la capacidad de capturar células T a través de la expresión endotelial de moléculas de adhesión permite la formación de zonas de contacto que favorece la respuesta inmune adversa en la forma de inflamación. Además de ello, la autoinmunidad puede exacerbar una enfermedad vascular, en particular en la forma de anticuerpos de células anti-endoteliales. La morbilidad destacada de las enfermedades cardiovasculares conjuntamente con la diabetes mellitus, hipertensión y otros estados de enfermedad refleja la presencia y potencia aumentadas de estos anticuerpos.

Por el contrario, como se describe en la presente memoria descriptiva, las células endoteliales ancladas y/o incluidas en matrices, cuando son implantadas en un hospedante actúan como reguladores potentes del sistema inmune, como lo indica una reducción significativa en la respuesta inmune sistémica y/o la inflamación esperada. Como se ilustra en la presente memoria descriptiva, la capacidad de estas sales para mejorar o modular la respuesta inmune ha sido demostrada comparando la respuesta inmune frente a células endoteliales ancladas y/o incluidas en matrices frente a las libres en ratones sin inmunizar así como en ratones con reactividad inmune de células endoteliales destacada. Las células endoteliales asociadas a matrices, como se describen en la presente memoria descriptiva, proporcionan una protección inmune a múltiples niveles; las células endoteliales humanas y porcinas demuestran una considerable reducción de moléculas de clase MHC elaboradas; moléculas co-estimuladoras y moléculas de adhesión cuando son ancladas y/o incluidas en matrices como se describe en la presente memoria descriptiva.

El anclaje y/o la inclusión en matrices de células endoteliales puede tener también una influencia sobre la formación de una memoria inmunológica, como se ilustra en la presente memoria descriptiva. Mientras que la reimplantación de sedimentos de células endoteliales en suspensión en solución salina libres o como sedimentos situados adyacentes a matrices vacía provocó una xeno-respuesta humoral y celular aumentada significativa, los ratones nuevamente estimulados con células endoteliales ancladas y/o incrustadas en matrices condujeron a una capacidad lítica reducida de esplenocitos sin aumentar las respuestas inmunes humorales. Además de ello, resultó evidente un desplazamiento ligero en el equilibrio Th1/Th2 hacia el primero en los ratones que recibieron células endoteliales xenogénicas ancladas y/o incluidas en
matrices.

Por tanto, la introducción de células endoteliales libres adyacentes a matrices vacía no consiguió reducir la respuesta inmune del hospedante, indicando la importancia de un anclaje y/o inclusión en matriz. El fallo de las células endoteliales ancladas y/o incluidas para expresar MHC II, co-estimuladoras y moléculas de adhesión tras la estimulación podría suponer la diferenciación atenuada de células T en células efectoras en respuesta a células endoteliales xenogenicas ancladas y/o incluidas en matrices implantadas. Como se explica en la presente memoria descriptiva, la activación de esplenocitos de ratones es mutada cuando es expuesta a células endoteliales xenogeneicas ancladas y/o incluidas en matrices de una manera dependiente de las MHC clase II.

Globalmente, la naturaleza isotrópica de las células endoteliales contribuye a esta forma única de inmunomodulación en la que el anclaje y/o inclusión de células en una matriz adecuada proporciona una inmunoprotección a través del aislamiento o enmascaramiento de antígenos críticos. Está bien reconocido que la función de las células endoteliales in vivo es dependiente del anclaje y la densidad. Unos estudios previos han mostrado que la membrana del basamento endotelial (EBM) controla aspectos de la adhesión, extensión, desplazamiento, contractilidad, diferenciación proliferación, síntesis de proteínas y secreción celular. Además de ello, la EBM es alterada en muchos estados de enfermedad in vivo desde diabetes hasta glorulopatía o aterosclerosis. La disfunción de células endoteliales se correlaciona con cambios en la composición de la membrana de basamento acumulando el grado de unión de células endoteliales y la calidad del anclaje de la membrana de basamento desempeña una función para la inmunobiología de las células endoteliales.

La presente invención está basada en el descubrimiento inesperado de que el anclaje y/o inclusión de células endoteliales en una matriz biocompatible adecuada como, pero sin limitación una matriz basada en colágeno tridimensional puede transformar células endoteliales xenogeneicas en un fenotipo de células inmunológicamente no agresivas. Este descubrimiento puede ser seguidamente explotado por el experto en la técnica siguiendo las indicaciones proporcionadas en la presente memoria descriptiva, como una aproximación inductora de tolerancia a terapias singeneicas o no singeneicas como, pero sin limitación, un alotrasplante o xenotrasplante, como se ilustra en la presente memoria descriptiva. Por ejemplo, un facultativo puede disminuir y/o retrasar el rechazo implantando células endoteliales ancladas y/o incluidas en matrices antes del trasplante de un tejido u órgano de alo- o xeno-injerto. Para los fines de la presente invención, la sangre es un tipo de tejido.

El tratamiento previo aclimata el sistema inmune del receptor y puede dar lugar a una respuesta inmune atenuada y/o retrasada o reducida a un injerto. La presente invención no requiere que el material implantable comprenda células ancladas y/o incluidas que sean iguales o similares a las finalmente trasplantadas al receptor. Todo lo que se necesita es que el material implantable que comprende células ancladas y/o incluidas tenga un efecto inmunomodulador cuando es proporcionado a un receptor. En ciertas circunstancias, una administración única previa o coincidente con el trasplante puede ser suficiente. En otras circunstancias, se prefieren administraciones múltiples o en serie. El facultativo experto reconocerá estas circunstancias.

Como está bien reconocido, incluso el trasplante de células alogeneicas está acompañado a menudo de una respuesta inmune. Una cuestión de gran interés es si esto es una propiedad constitutiva e inmutable de células extrañas o que pueda ser regulada. Los experimentos expuestos en la presente memoria descriptiva demuestran que la inmunogenicidad de las células que están normalmente ancladas a membranas de basamento puede ser considerablemente reducida si se implantan en un estado anclado y/o incluido en una matriz y no se observa un efecto cuando estas mismas células son inyectadas en un estado libre. Otros experimentos expuestos en la presente memoria descriptiva investigan la influencia de la inmunidad de células anti-endoteliales destacadas, que es una característica clínica común en una diversidad de enfermedades autoinmunes y endocrinas.

Adicionalmente, algunos de los experimentos resumidos en la presente memoria descriptiva demuestran que las inyecciones en serie de células endoteliales aórticas porcinas (PAE) libres inducían anticuerpos anti-PAE en circulación, elevando la inmunosensibilidad. La respuesta a inyecciones de PEAD posteriores fue incluso mayor que la observada tras la primera exposición. Por el contrario, cuando las PAE fueron implantadas en un estado anclado y/o incluido en una matriz, la respuesta inmune a exposiciones posteriores se mutó y cayó significativamente a lo largo del tiempo. También, como se ilustra con posterioridad, inferior a la respuesta de IgG posterior y mutó cuando estuvo precedida por inyecciones en serie. La respuesta de IgM es más evidente en animales sin inmunizar que en los previamente sensibilizados y tarda más en disminuir después de una exposición a PAE libres que después de una exposición a células endoteliales ancladas y/o incluidas en matrices.

La sensibilización previa de ratones con suspensiones de PAE libre se parece a la inmunidad anti-endotelial accionada por IgG_{1} en la diabetes mellitus hipertensión y enfermedades autoinmunes. La respuesta inmune celular a células libres y ancladas y/o incluidas en matrices siguió el modelo de la inmunidad humoral. Una exposición repetida a antígenos dio lugar a una formación aumentada de memoria y posteriormente a una reacción inmune más vigorosa por células T efectoras. Por tanto, la inducción de esplenocitos productores de IL-4 y de IL-10 xeno-reactivos y células T efectoras aumentó a lo largo del tiempo y era visible después de una implantación de células endoteliales en ratones sin inmunizar y previamente sensibilizados. En todos los ratones, los niveles de citoquinas se correlacionaron de forma lineal y precisa con la inducción de células T efectoras, apoyando adicionalmente la noción de una respuesta celular accionada por t2 en la xeno-reactividad y acentuando los aspectos inmunosilenciadores de células endoteliales incluidas en matrices para activar mecanismos inmunes adaptivos. El deterioro de células endoteliales implantadas se correlacionó con el alcance de la respuesta inmune provocada. Las células implantadas estaban más profundamente afectadas después de la sensibilización previa y con PAE libre. La inducción disminuida de respuestas inmunes humorales y celulares en ratones sin inmunizar que recibieron células endoteliales incrustadas en matrices dio lugar a un grado menor de deterioro por células inmunes hospedantes.

Estos experimentos proporcionan indicios sobre la activación y el deterioro de células endoteliales, sugiriendo una función clave del contacto de la matriz celular. La estructura de tipo panal de abejas de una matriz actualmente preferida Gelfoam, permite que las células endoteliales se asocien, se anclen o se incluyan en su configuración tridimensional y, en ciertas realizaciones recubran las superficies internas de esta matriz de una forma que simula la apariencia del endotelio confluente en vasos estáticos. Por tanto, en ciertas realizaciones, el anclaje y/o inclusión de células endoteliales en una matriz con las propiedades de Gelfoam, se parece al estado tridimensional fisiológico del endotelio intacto. Los experimentos expuestos con posterioridad demuestran que el anclaje y/o inclusión en la matriz no solamente protege las células endoteliales de reacciones inmunes sino que cambia la perfección del hospedante de la inmunogenenicidad de células endoteliales.

Por tanto, durante la enfermedad, por ejemplo, la transformación fenotípica de células endoteliales dislocadas de un estado intacto adherente a la matriz hasta un estado libre probablemente es crítica para el inicio y la perpetuación de una enfermedad vascular, por ejemplo. Las explicaciones de la presente memoria descriptiva indican que el desprendimiento de células endoteliales precede la expresión de la adhesión, co-estimulación y las moléculas de MHC, lo que va seguido de una atracción de células inmunes, perpetuando la activación endotelial y el deterioro celular. A este respecto, las cuales inmunobiológicas e inmuno-reactivas de las células endoteliales se correlacionan con la morfología y la función. Las células endoteliales de diferentes lechos vasculares y la conectividad de membranas de basamentos divergentes demuestran diferencias marcadas en la expresión constitutiva e inducible de la adhesión, co-estimulación y moléculas de MHC. Adicionalmente, hay una apreciación creciente de que el depósito de proteínas de matrices extracelulares transicionales como fibronectina y fibrinógeno en la matriz subendotelial, así como el desprendimiento de células endoteliales de la membrana del basamento, afecta a la señalización de células intra-endoteliales.

La manipulación del fenotipo celular, la inmunogenicidad y la función se puede usar para adaptar las propiedades de constructos de ingeniería de tejidos desarrollados in vitro para fines regenerativos; en particular, este uso de la presente invención es clínicamente ventajoso ya que las terapias actuales basadas en células están limitadas por las profundas reacciones inmunes del hospedante. Por ejemplo, la presente invención es particularmente útil para el tratamiento de la enfermedad aterosclerótica, ya que la presencia de células inmunes activadas y de inflamación son componentes patofisiológicos claves. Análogamente, la inmunidad anti-endotelial destacada ha sido identificado como un efecto limitador de la velocidad esencial para terapias basadas en células endoteliales como, pero sin limitación, las terapias que incluyen la sembradura del interior de una estructura vascular con células o tejido. Por el contrario, la presente invención puede ser explotada para gestionar desplazamientos xenotípicos de células endoteliales que se producen en una patología vascular, por ejemplo, a través de la desagrupación del contacto con la matriz celular y se pueden realizar entonces opciones terapéuticas apropiadamente dirigidas a diana en el campo clínico usando materiales practicables de la presente invención.

Tomadas conjuntamente, las explicaciones presentadas en la presente memoria descriptiva demuestran también que las características de una matriz como, pero sin limitación, la biocompatibilidad, porosidad, carácter tridimensional, pueden apoyar el crecimiento de una población de células endoteliales y pueden modular la inmunogenicidad de estas células. Las células endoteliales ancladas y/o incluidas en una matriz tridimensional provocaron una activación mucho menor de los mecanismos inmunes del hospedante y estuvieron sometidas a un ataque y deterioro muy inferior de células inmunes hospedantes. Los descubrimientos en ratones sin inmunizar fueron amplificados en hospedantes con inmunidad anti-endotelial destacada. Los estudios in vivo presentados en la presente memoria descriptiva muestran una disminución considerable en la respuesta inmune activada por Th2 en animales implantados con una matriz como Gelfoam que comprendía células endoteliales ancladas y/o incluidas frente a animales inyectados con células endoteliales libres. Con el fin de que las células endoteliales activaran células T de hospedantes sin inmunizar, se requirieron dos señales: 1) presentación de antígenos en el contexto de moléculas DMHC expresadas en las células endoteliales del donante y 2) una segunda señal proporcionada por una molécula co-estimuladora expresada también en la superficie de las células endoteliales del donante. Por lo tanto, aunque no se desean vinculaciones teóricas, una posible explicación para los resultados observados es que la interacción entre una matriz biocompatible y las células endoteliales incluidas dio lugar a una disminución de la expresión superficial de moléculas MHC y/o de adhesión co-estimuladoras cruciales en las células endoteliales del donante. De hecho, un análisis in vitro de la expresión de moléculas de adhesión crítica, MHC-II y co-estimuladoras tanto en PAE como en HAE (células endoteliales aórticas humanas) muestra un perfil dependiente de células ancladas y/o incluidas en una matriz. Los perfiles de expresión de adhesión (E-selectina, P-selectina, ICAM-1, VCAM-1, y CD58) co-estimuladora (CD40, CD8, CD86) y moléculas MHC-II se redujeron todos en células endoteliales ancladas y/o incluidas con una matriz Gelfoam en comparación con las mismas células endoteliales hechas crecer en placas de cultivo de tejidos estándar. La P-selectina, E-selectina y UCAM-1 están estrechamente asociadas con el reclutamiento de células T en sitios inflamación inmune. Como la presentación de antígenos a células T CD4+ a través de moléculas de MHC clase II es esencial para el reconocimiento inmune del hospedante en el ajuste de implantes xenogeneicos no vascularizados, la expresión de MHC-II reducida observada en células endoteliales ancladas y/o incluidas en matrices se plasmó en una respuesta proliferativa reducida de esplenocitos del hospedante. Además de ello, la exposición in vitro repetida de los mismos esplenocitos a células endoteliales hechas crecer en placas de cultivo de tejidos provocó una respuesta secundaria más vigorosa, mientras que no hubo ninguna respuesta secundaria aumentada y, por lo tanto, ninguna memoria de exposición previa a células endoteliales ancladas y/o incluidas en matrices. Estos descubrimientos in vitro se correlacionan con la relación inmune significativamente mutada observada en ratas y ratones después de la implantación y nueva estimulación con células endoteliales ancladas y/o incluidas en matrices como se ilustra en la presente memoria descriptiva.

Análogamente, un mecanismo mediante el cual el cultivo de células endoteliales en una matriz biocompatible como, pero sin limitación Gelfoam, afecta a la expresión de moléculas de MHC clase II y la posterior inmunogenicidad endotelial posterior in vitro, fue adicionalmente dilucidado investigando las trayectorias de señalización intracelular. La expresión endotelial de moléculas MHC clase II es inducida por citoquinas proinflamatorias (por ejemplo, interferón (IFN-\gamma) que son secretadas por células inmunes activadas (por ejemplo, células T). La unión de citoquinas proinflamatorias a sus receptores en células endoteliales inicia una cascada de señalización intracelular que da lugar a la fosforilación de tirosina-quinasa de proteína de Jauns (por ejemplo JAK-1 y 2) y a transductores y activadores de señales de transcripción (por ejemplo, STAT-1). La activación de JAK y STAT habitualmente está estrictamente regulada en una célula diana. Como se expone con posterioridad unos análisis in vitro detallados demostraron diferencias en trayectorias de señalización intracelular inducidas por IFN-\gamma entre células endoteliales hechas crecer para confluir en placas de cultivo de tejidos en comparación con las ancladas y/o incluidas en matrices Gelfoam. Las HAE incluidas en Gelfoam exhibieron velocidades inferiores de fosforilación y activación de STAT de factor 1 regulador de interferón (IRF-1) crucial, sin cambios en la expresión de receptor IFN\gamma superficial. Las velocidades inferiores de activación de JAK se observaron también tras la estimulación de HAE en Gelfoam con IFN-\gamma.

Tras una investigación adicional se observó que las HAE no estimuladas con IFN-\gamma en una matriz Gelfoam expresaban niveles significativamente superiores de molécula inhibidora de acción contraria, supresor de señalización de citoquinas (SOCS) 1 y 3, que el crecimiento en placas de cultivos de tejidos. Por lo tanto, una explicación para la señalización intracelular inducida por IFN-\gamma mutada es que los niveles aumentados de SOCS-1 y 3 dieron lugar a un aumento en el umbral de activación inducida por citoquinas de células endoteliales.

El material implantable de la presente invención puede ser implantado en un sitio no luminal. Por tanto, no es necesaria la exposición inmediata de células del donante a la circulación del hospedante. Una evidencian reciente ha demostrado la importancia del factor endotelial soluble CX_{3}CL 1 (fractalquina) para la atracción de células inmunes (es decir, células asesinas naturales) y formas expresadas en la superficie de fractalquina para la adherencia de esas células inmunes. Dado que solamente se observó una infiltración celular leve en el interior y las proximidades de las células endoteliales ancladas y/o incluidas en matrices xeno- y alo-geneicas, se cuantificó la liberación de la expresión soluble y superficial de fractalquina en HAE. Como se ilustra en los experimentos expuestos a continuación, las células endoteliales ancladas y/o incluidas en matrices mostraron una secreción reducida y una regulación descendente de la expresión superficial de fractalquina tras la estimulación de citoquinas, en comparación con HAE hechas crecer en placas de cultivos de tejidos. Esto dio lugar a una adherencia significativamente menor de células asesinas naturales humanas a HAE ancladas y/o incluidas en matrices in vitro.

Tomados conjuntamente, los cambios en la señalización intracelular, niveles aumentados de SOCS-1 y 3 (que dan lugar a una expresión atenuada de moléculas MHC-II y posterior activación de células T) así como la secreción reducida y la expresión superficial de fractalquina en células endoteliales ancladas y/o incluidas en matrices en comparación con células hechas crecer en placas de cultivos de tejidos indicaron una inmunogenicidad de células endoteliales alterada atribuible a la inclusión en la
matriz.

Fuente celular

Las células endoteliales, células de tipo endotelial o sus análogos para ser usadas según la presente invención pueden ser singeneicas, alogeneicas, xenogeneicas o autólogas. En ciertas realizaciones, una fuente de células vivas puede derivar de un donante adecuado. En otras ciertas realizaciones, una fuente de células puede derivar de un cadáver o de un banco de células.

En una realización actualmente preferida, las células son células endoteliales. En una realización particularmente preferida, estas células endoteliales son obtenidas a partir de tejido vascular, preferentemente, pero sin limitación tejido arterial. Como se ilustra con posterioridad, un tipo de célula endotelial vascular adecuado para ser usado es una célula endotelial aórtica. Otro tipo de célula endotelial vascular adecuada para ser usada está constituido por células endoteliales de venas del cordón umbilical. Otro tipo célula endotelial vascular adecuada para ser usada está constituida por las células endoteliales de arterias coronarias. Todavía, otros tipos de células endoteliales vasculares adecuadas para ser usadas en la presente invención incluyen células endoteliales de arterias pulmonares y células endoteliales de arteria ilíaca.

En otra realización actualmente preferida, las células endoteliales adecuadas pueden ser obtenidas a partir de tejido no vascular. El tejido no vascular puede derivar de cualquier estructura anatómica tubular como se describe en cualquier otro lugar en la presente memoria descriptiva o puede derivar de cualquier tejido u órgano no vascular.

Todavía, en otra realización, las células endoteliales pueden derivar de células progenitoras endoteliales o células madre; todavía, en otra realización, las células endoteliales pueden derivar de células progenitoras o células madre generalmente. En una realización preferida, las células pueden ser células progenitoras o células madre. En otras realizaciones preferidas, las células pueden ser células no endoteliales que sean singeneicas, alogeneicas, xenogeneicas o autólogas derivadas de un tejido u órgano vascular o no vascular. La presente invención contempla también cualquiera de los casos que anteceden que sean genéticamente alterados, modificados o tratados por ingeniería genética.

En una realización adicional, dos o más tipos de células son conjuntamente cultivados para preparar el presente material implantable. Por ejemplo, una primera célula puede ser introducida en la matriz biocompatible y cultivada hasta que se haga confluente. El primer tipo de célula puede incluir, por ejemplo, células de músculos lisos, fibroblastos, células madre, células progenitoras endoteliales, una combinación de células de músculos lisos y fibroblastos, cualquier otro tipo de célula deseada o una combinación de los tipos de células deseadas adecuadas para crear un entorno conductor para el crecimiento de células endoteliales. Una vez que el tipo de célula ha alcanzado la confluencia, es sembrado un segundo tipo de célula en la parte superior del primer tipo de célula confluente en el interior, por encima o con la matriz biocompatible y es cultivado hasta que el primer tipo de célula y el segundo tipo de célula hayan alcanzado la confluencia. El segundo tipo de célula puede incluir, por ejemplo, células endoteliales o cualquier otro tipo deseado de células o combinaciones de tipos de células. Está contemplado que el primero y segundo tipos de células puedan ser introducidos por etapas, o como una única mezcla. Está también contemplado que la densidad celular pueda ser modificada para alterar la relación de células de músculos lisos a células endoteliales. Análogamente, pueden ser sembradas matrices con una mezcla de diferentes células adecuadas para la indicación o régimen clínico previsto.

Las células endoteliales ancladas y/o incluidas células de tipo endotelial o sus análogos exhiben uno o más fenotipos o propiedades funcionales deseados. La presente invención se basa en el descubrimiento de que una célula que tiene un fenotipo fácilmente identificable (descrito en otro lugar en la presente memoria descriptiva) cuando se asocia con una matriz preferida puede reducir, mejorar y/o modular de algún otro modo una respuesta inmune o reacción inflamatoria a través efectos sistémicos y/o locales.

Para los fines de la presente invención, uno de estos fenotipos preferidos fácilmente identificables típico de las células de la presente invención es un fenotipo inmunogénico alterado medido mediante los ensayos in vitro descritos en otro lugar en la presente memoria descriptiva. Otro fenotipo fácilmente identificable típico de las células de la presente invención es una capacidad para bloquear o interferir con la maduración de células dendríticas según se mide mediante los ensayos in vitro descritos en otro lugar en la presente memoria descriptiva. Cada fenotipo es denominado en la presente memoria descriptiva un fenotipo inmunomodulador.

Evaluación de la funcionalidad inmunomoduladora

Para los fines de la invención descritos en la presente memoria descriptiva, el material implantable puede ser ensayado en cuanto a indicios de la funcionalidad inmunorreguladora antes del implante. Por ejemplo, son evaluadas muestras del material implantable para determinar su capacidad para reducir la expresión de moléculas MHC clase II, para reducir la expresión de moléculas co-estimuladoras, para inhibir la maduración de células dendríticas conjuntamente cultivadas y para reducir la proliferación de células T. En ciertas realizaciones preferidas, el material implantable puede ser usado para los fines descritos en la presente memoria descriptiva cuando el material es capaz de reducir la expresión de moléculas MHC clase II en al menos aproximadamente 25-80%, preferentemente 50-80%, lo más preferentemente al menos aproximadamente 80%, para reducir la expresión de moléculas co-estimuladoras en al menos aproximadamente 25-80%, preferentemente 50-80%, lo más preferentemente al menos aproximadamente 80%; inhibir la maduración de células dendríticas conjuntamente cultivadas en al menos aproximadamente 25-95%, preferentemente 50-95%, lo más preferentemente al menos aproximadamente 95%; y/0 reducir la proliferación de linfocitos en al menos aproximadamente 25-90%, preferentemente 50-90%, lo más preferentemente al menos aproximadamente 90%.

Los niveles de expresión de moléculas DMHC clase II y moléculas co-estimuladoras puede ser cuantificados usando análisis de citometría de flujo rutinarios, descritos en detalle con posterioridad. La proliferación de linfocitos puede ser cuantificada in vitro cultivando conjuntamente linfocitos CD3+ marcados con ^{3}[H]-timidina con la composición implantable a través de recuento por centelleo como se describe en detalle con posterioridad. La inhibición de la maduración de células dendríticas puede ser cuantificada cultivando conjuntamente el material implantable con células dendríticas y evaluando la expresión superficial de diversos marcadores en las células dendríticas mediante citometría de flujo y análisis FACS, o midiendo la absorción de células dendríticas de dextrano conjugado a FITC mediante citometría de flujo. Cada uno de estos métodos se describe en detalle con posterioridad.

En una realización operativa típica de la presente invención, las células solo necesitan exhibir uno de los fenotipos que anteceden. En ciertas realizaciones, las células pueden exhibir más de uno de los fenotipos que anteceden.

Aunque los fenotipos que anteceden tipifican cada uno una célula endotelial funcional como, pero sin limitación una célula endotelial vascular, una célula no endotelial que exhiba este (o estos) fenotipo(s) es considerada de tipo endotelial para los fines de la presente invención y, por tanto, es adecuada para ser usada con la presente invención. Las células que son de tipo endotelial se denominan también, en la presente memoria descriptiva, análogos funcionales de células endoteliales; o emuladores funcionales de células endoteliales. Por tanto, a modo de ejemplo solamente, las células adecuadas para ser usadas con los materiales y métodos descritos en la presente memoria descriptiva incluyen también células madre o células progenitoras que dan lugar a células de tipo endotelial; las células que son células no endoteliales en origen sin embargo rinden con una funcionalidad como una célula endotelial usando los parámetros expuestos en la presente memoria descriptiva; las células de cualquier origen que son tratadas por ingeniería genética o modificadas de algún otro modo para tener una funcionalidad endotelial usando los parámetros expuestos en la presente memoria descriptiva.

Normalmente, las células de la presente invención exhiben uno o más de los fenotipos anteriormente mencionados cuando presentan poblaciones confluentes, casi confluentes o confluentes con posterioridad y están asociadas con una matriz biocompatible preferida como las descritas en otro lugar en la presente memoria descriptiva. Como se apreciará por un experto en la técnica, las poblaciones de células confluentes, casi confluentes o confluentes con posterioridad son fácilmente identificables mediante una diversidad de técnicas, de las que las más comunes y ampliamente aceptadas están constituidas por el examen microscópico directo. Otras incluyen la evaluación del número de células por área superficial usando técnicas de recuento de células estándar como, pero sin limitación, un hemocitómetro o contador Coulter.

Adicionalmente, para los fines de la presente invención, las células de tipo endotelial incluyen, pero sin limitación células que emulan e imitan células endoteliales funcional y fenotípicamente confluentes, casi confluentes o confluentes con posterioridad, según se mide mediante los parámetros expuestos en la presente memoria descriptiva.

Por tanto, usando la descripción y las indicaciones detalladas expuestas con posterioridad, el usuario de los conocimientos de la técnica apreciará el modo de preparar, usar, ensayar e identificar realizaciones operativas del material implantable descrito en la presente memoria descriptiva. Es decir, las explicaciones proporcionadas en la presente memoria descriptiva exponen todo lo necesario para preparar y usar los materiales implantables de la presente invención.

En ciertas realizaciones preferidas, las células endoteliales usadas en el material implantable de la presente invención son aisladas de los donantes de aortas o cadáveres humanos. Cada lote de células deriva de un único o de múltiples donantes, ensayados extensivamente en cuanto a la pureza de células endoteliales, función biológica, la presencia de bacterias, hongos, elementos patógenos humanos conocidos y otros agentes perjudiciales. Las células son crioconservadas y almacenadas en bancos usando técnicas bien conocidas para las posterior expresión en cultivos y para una posterior formulación en materiales implantables biocompatibles. En otras realizaciones, pueden ser recolectadas células vivas a partir de un donante o a partir del paciente para el que está previsto el material implantable.

Preparación de células

Como se estableció anteriormente, las células adecuadas pueden ser obtenidas a partir de una diversidad de tipos de tejidos y tipos de células. En ciertas realizaciones preferidas, las células endoteliales aórticas humanas usadas en el material implantable son aisladas a partir de la aorta de donantes cadáveres. En otras realizaciones, son aisladas células endoteliales aórticas porcinas (Cell Applications, San Diego, CA) a partir de aorta porcina normal mediante un procedimiento similar al usado para aislar células endoteliales aórticas humanas. Cada lote de células deriva de un único o de múltiples donantes, son ensayadas extensivamente en cuanto a la viabilidad de células endoteliales, pureza, función biológica, la presencia de micoplasma, bacterias, hongos, levaduras, elementos patógenos humanos conocidos y otros agentes perjudiciales. Las células son adicionalmente expandidas, caracterizadas y crioconservadas para formar un banco de células de trabajo en la tercera a sexta pasada usando técnicas bien conocidas para un expansión en cultivo posterior y para la subsecuente formulación en forma de un material implantable biocompatible.

Lo que sigue es un protocolo ilustrativo para preparar células endoteliales adecuadas para ser usadas con la presente invención. Las células endoteliales aórticas humanas o porcinas se preparan en matraces T-75 previamente tratados mediante la adición de aproximadamente 15 ml de medios de crecimiento de células endoteliales por matraz. Las células endoteliales aórticas humanas se preparan en medios de crecimiento endoteliales (EGM-2, Cambrex Biosciences, East Rutherford, NJ). El EGM-2 consiste en medios basales de células endoteliales (EBM-2, Cambrex Biosciences) complementados con EGM-2 que contiene FBS al 2%. Las células porcinas se preparan en EBM-2 complementado con FBS al 5% y 50 \mug/ml de gentamicina. Los matraces se colocan en un incubador mantenido a aproximadamente 37ºC y 5% CO_{2}/95% aire, 90% de humedad durante un mínimo de 30 minutos. Uno o dos viales de las células son retirado del congelador a -160ºC -140ºC y descongelados a aproximadamente 37ºC. Cada vial de células descongeladas es sembrado en dos matraces T-75 a una densidad de aproximadamente 3 x 10^{3} células por cm^{3}, preferentemente, pero no menos de 1,0 x 10^{3} y no más de 7,0 x 10^{3}; y los matraces que contiene las células son devueltos al incubador. Después de aproximadamente 8-24 horas, los medios agotados se retiran y se restituyen con medios de nueva aportación. Los medios se cambian cada dos a tres días y, posteriormente, hasta que las células alcanzan aproximadamente 85-100% de confluencia, preferentemente pero no menos de 60% y no más de 100%. Cuando el material implantable está destinado a una aplicación clínica, solamente se usan medios exentos de antibióticos en el cultivo posterior a la descongelación de células endoteliales aórticas humanas y la fabricación del material implantable de la presente invención.

Los medios de crecimiento de células endoteliales son seguidamente retirados y la monocapa de células se aclara con 10 ml de solución salina tamponada HEPES (HEPES). El HEPES es retirado y se añaden 2 ml de tripsina para desprender las células de la superficie del matraz T-75. Una vez que se ha producido el desprendimiento se añaden 3 ml de solución neutralizante de tripsina (TNS) para detener la reacción enzimática. Se añaden 5 ml adicionales de HEPES y las células son enumeradas usando un hemocitómetro. La suspensión celular se centrifuga y se ajusta, en el caso de células humanas, a una densidad de aproximadamente 1,75 x 10^{6} células/ml usando EGM-2 sin antibióticos o, en el caso de células porcinas, aproximadamente 1,50 x 10^{6} células/ml usando EBM-2 complementado con FBS al 5% y 50 \mug/ml de gentamicina.

Matriz biocompatible

Según la presente invención, el material implantable comprende una matriz biocompatible que tiene una configuración tridimensional de forma que las células ancladas y/o incluidas pueden crear y ocupar un hábitat multi-dimensional. La matriz permite el crecimiento celular y el anclaje y/o inclusión de células en la matriz. Son preferidas las matrices porosas. La matriz puede ser sólida o no sólida. Algunas matrices no sólidas son fluidas y adecuadas para una administración a través de métodos de tipo inyección o de tipo infusión. En ciertas realizaciones, la matriz es flexible y cómoda. La matriz puede estar también en la forma de una forma plana flexible. La matriz puede estar también en la forma de un gel, una espuma, una suspensión, una partícula, un microportador, una microcápsula o una estructura fibrosa. En ciertas realizaciones preferidas, las formas no sólidas de la matriz a la que están ancladas las células y/o en las que son incluidas las células, puede ser inyectada o aplicada por infusión cuando es administrada.

Una matriz actualmente preferida es Gelfoam® (Pfizer, New York, NY) y una esponja de gelatina absorbible (en lo sucesivo "matriz Gelfoam"). La matriz Gelfoam es una matriz de tipo esponja porosa y flexible preparada a partir de solución de gelatina dérmica porcina especialmente tratada y purificada.

Según otra realización, el material de la matriz biocompatible puede ser un material de matriz modificado. Las modificaciones para el material de la matriz se pueden seleccionar para optimizar y/o para controlar la función de las células, incluido el fenotipo de las células (por ejemplo el fenotipo inmunomodulador), como se describe en otro lugar en la presente memoria descriptiva, cuando las células están asociadas con la matriz. Según una realización, las modificaciones para el material de la matriz incluyen revestir la matriz con factores de enlace o péptidos de adhesión. Ejemplos de factores de enlace incluyen, por ejemplo, fibronectina, gel de fibrina y ligandos de adhesión celular covalentemente unidos (que incluyen, por ejemplo, RGD) que utilizan una química de carbodiimidas acuosas estándar. Los ligandos de adhesión celular adicionales incluyen péptidos que tienen secuencias de reconocimiento de la adhesión celular que incluyen, pero sin limitación: RGDY, REDVY, GRGDF, GPDSGR, GRGDY y REDV.

Según otra realización, la matriz es una matriz distinta de Gelfoam. Ejemplos adicionales de materiales de matrices incluyen, por ejemplo, gel de fibrina, alginato, microportadores de poliestireno-sulfonato de sodio, microportadores de dextrano revestido con colágeno, celulosa, PLA/PGA y copolímeros de pHEMA/MMA (con relaciones de polímeros que varían en el intervalo de 1-100% para cada polímero). Según una realización preferida, estas matrices adicionales son modificadas para incluir factores de enlace, como se mencionó y se describió anteriormente.

Según otra realización, el material de la matriz biocompatible es físicamente modificado para mejorar la unión celular a la matriz. Según una realización, la matriz es reticulada para aumentar sus propiedades mecánicas y para mejorar su unión celular y sus propiedades de crecimiento. Según una realización preferida, una matriz de alginato es reticulada en primer lugar usando sulfato de calcio seguido de una segunda etapa de reticulación usando cloruro de calcio y protocolos rutinarios.

Todavía, según otra realización, es modificado el tamaño de poros de la matriz biocompatible. Un tamaño de poros de la matriz actualmente preferido es de aproximadamente 25 \mum a aproximadamente 100 \mum; preferentemente de aproximadamente 25 \mum a 50 \mum; más preferentemente de aproximadamente 50 \mum a 75 \mum; incluso más preferentemente de aproximadamente 75 \mum a 100 \mum. Otros tamaños de poros preferidos incluyen tamaños de poros por debajo de aproximadamente 25 \mum y por encima de aproximadamente 100 \mum. Según una realización, el tamaño de poros es modificado usando una técnica de lixiviación de sales. Se mezcla cloruro de sodio en una solución del material de la matriz y un disolvente, la solución se vierte en un molde y el disolvente se deja evaporar. El bloque de matriz/sal es seguidamente sumergido en agua y la sal es separada por lixiviación, dejando una estructura porosa. El disolvente es escogido con el fin de que la matriz esté en solución, pero la sal no lo esté. Un ejemplo de solución incluye PLA y cloruro de metileno.

Según una realización alternativa, son incorporadas burbujas de dióxido de carbono gaseoso en una forma no sólida de la matriz y seguidamente son estabilizadas en un tensioactivo apropiado. Las burbujas gaseosas son posteriormente retiradas aplicando un vacío, dejando un estructura porosa.

Según otra realización, se emplea una técnica de liofilización para controlar el tamaño de poros de la matriz, usando la velocidad de congelación de las micropartículas de hielo para formar poros de tamaños diferentes. Por ejemplo, una solución en gelatina de aproximadamente 0,1-2% de gelatina porcina o bovina puede ser vertida en un molde o un plato y previamente congelada a una diversidad de temperaturas diferentes y seguidamente liofilizada durante un período de tiempo. El material puede ser seguidamente reticulado usando, preferentemente, luz ultravioleta (254 nm) o añadiendo glutaraldehído (formaldehido). Las variaciones en la temperatura previa de congelación (por ejemplo, -20ºC, -80ºC o -180ºC), temperatura de liofilización (congelación en seco a aproximadamente -50ºC) y concentración de gelatina (0,1% a 2,0%; el tamaño de poros generalmente es inversamente proporcional a la concentración de gelatina en la solución) pueden afectar al tamaño de poros resultantes del material de la matriz y pueden ser modificadas para crear un material preferido. El experto en la técnica apreciará que un tamaño de poros adecuados es el que favorezca y mantenga poblaciones celulares óptimas que tengan los fenotipos descritos en otros lugares en la presente memoria descriptiva.

Sembradura celular de la matriz biocompatible

Lo que sigue es una descripción de un ejemplo de configuración de una matriz biocompatible. Como se establece en otros lugares, las matrices preferidas son sólidas o no sólidas y pueden ser formuladas para implantación, inyección o infusión.

Trozos previamente cortados de una matriz biocompatible adecuada o una parte alícuota de matriz fluida biocompatible adecuada son nuevamente hidratados mediante la adición de EGM-2 sin antibióticos a aproximadamente 37ºC y 5% de CO_{2}/95% de aire durante 12 a 24 horas. El material implantable es seguidamente retirado de sus recipientes de nueva hidratación y se coloca en platos de cultivo de tejidos individuales. La matriz biocompatible es sembrada a una densidad preferida de aproximadamente 1,5-2,0 x 10^{5} células (1,25-1,66 x 10^{5} células/cm^{3} de matriz) y se coloca en un incubador mantenido a aproximadamente 37ºC y 5% de CO_{2}/95% de aire, 90% de humedad durante 3-4 horas para facilitar la unión de células. La matriz sembrada se coloca seguidamente en tubos recipientes individuales (Evergreen, Los Angeles, CA) cada uno de ellos provisto con una tapadera que contiene un filtro de 0,2 \mum con EGM-2 y se incubó a aproximadamente 37ºC y 5% de CO_{2}/95% de aire. Los medios se cambian cada dos a tres días, posteriormente, hasta que las células hayan alcanzado la confluencia. Las células en una realización preferida tienen preferentemente 6 pasadas, pero pueden ser usadas células de menos o más pasadas.

Crecimiento celular

Una muestra de material implantable es retirada aproximadamente los días 3 ó 4, 6 ó 7, 9 ó 10 y 12 ó 13, las células son sometidas a recuento y ensayadas en cuanto a viabilidad, y se elabora una curva de crecimiento que se evalúa con el fin de valorar las características de crecimiento y determinar si se ha conseguido la confluencia, casi la confluencia o la confluencia posterior. Generalmente, un experto en la técnica apreciará los indicios de un crecimiento celular aceptable en valores de tiempo tempranos, medios y tardíos, como mediante la observación de un aumento exponencial en el número de células en valores de tiempo tempranos (por ejemplo, entre aproximadamente 2-6 días usando células endoteliales aórticas porcinas), seguido de una fase casi confluente (por ejemplo, entre aproximadamente 6-8 días), seguida de una plataforma en el número de células una vez que las células han alcanzado la confluencia (por ejemplo, entre aproximadamente 8-10 días) y mantenimiento del número de células cuando las células son confluentes con posterioridad (por ejemplo, entre aproximadamente 10-14 días).

Los recuentos celulares se consiguen mediante la digestión completa de la parte alícuota de material implantable con una solución de 0,5 mg/ml de colagenasa en solución de HEPES/Ca^{++}. Después de medir el volumen del material implantable digerido, se diluye un volumen conocido de la suspensión celular con 0,4% de azul de trípano (4:1 células a azul de trípano) y la viabilidad se valora mediante exclusión de azul de trípano. Las células viables, no viables y totales se enumeran usando un hemocitómetro. Se elaboran curvas de crecimiento representando gráficamente el número de células viables frente al número de días en cultivo.

Para los fines de la presente invención, la confluencia se define como la presencia de al menos aproximadamente 4 x 10^{5} células/cm^{3} cuando está en un ejemplo de forma plana flexible del material implantable (1,0 x 4,0 x 0,3 cm) y preferentemente de aproximadamente 7 x 10^{5} a 1 x 10^{6} células totales por parte alícuota (50-70 mg) cuando está en una composición inyectable o aplicable por infusión. Para ambos casos, la viabilidad celular es de al menos 90%, preferentemente, pero no menor que 80%.

En una realización actualmente preferida, el material implantable está en una forma plana flexible y comprende células endoteliales, preferentemente células endoteliales vasculares como, pero sin limitación células endoteliales aórticas humanas y la matriz biocompatible de esponja de gelatina Gelfoam® (Pfizer, New York, NY, en lo sucesivo "matriz Gelfoam").

El material implantable de la presente invención comprende células ancladas y/o incluidas en una matriz biocompatible que tiene una configuración tridimensional, de forma que las células ancladas y/o incluidas pueden crear y ocupar un hábitat multi-dimensional. Anclado y/o incluido con medios significa unidos de forma segura a través de interacciones de célula a célula y/o de célula a matriz de forma que las células resistan los rigores de las manipulaciones preparatorias descritas en la presente memoria descriptiva. Como se explica en otro lugar en la presente memoria descriptiva, una realización operativa del material implantable comprende una población celular casi confluente, confluente o posteriormente confluente que tenga un fenotipo preferido. Debe entenderse que las realizaciones del material implantable albergan células durante las manipulaciones preparatorias y/o que ciertas células no están unidas de forma segura como lo están otras células.

El material implantable de la presente invención fue desarrollado sobre los principios de la ingeniería de tejidos y representa una nueva aproximación para abordar las necesidades clínicas descritas en la presente memoria descriptiva. El material implantable de la presente invención es único en cuanto que las células viables ancladas y/o incluidas en la matriz biocompatible son capaces de suministrar al sitio de administración múltiples productos basados en células en proporciones fisiológicas bajo un control de retroalimentación fisiológica. El suministro local de múltiples compuestos por estas células y la dosificación fisiológicamente dinámica proporcionan una regulación más eficaz de los procedimientos responsables de modular una respuesta inmune. El material implantable de la presente invención puede proporcionar un entorno que emule una fisiología de soporte y conduzca a la modulación de una respuesta inmune.

Evaluación de la funcionalidad

Para los fines de la invención descritos en la presente memoria descriptiva, el material implantable es ensayado en cuanto a indicios de funcionalidad antes del suministro a un receptor. Por ejemplo, como una determinación del carácter adecuado, se recogen medios acondicionados durante el período de cultivo para determinar los niveles de sulfato de heparano o factor de crecimiento transformante \beta1 (TGF- \beta1) o factor de crecimiento de fibroblastos básico (b-FGF) o de óxido nítrico, que son producidos por las células endoteliales cultivadas. En ciertas realizaciones preferidas, el material implantable puede ser usado para los fines descritos en la presente memoria descriptiva cuando el número de células total es de al menos aproximadamente 1, preferentemente de aproximadamente 2, más preferentemente al menos aproximadamente 4 x 10^{5} células/cm^{3} de forma plana flexible; el porcentaje de células viables es de al menos aproximadamente 80-90%, preferentemente \sim 90%, lo más preferentemente al menos 90%; el sulfato de heparano en los medios acondicionados es de al menos aproximadamente 0,1-0,5, preferentemente al menos aproximadamente 0,23 microgramos/ml/día. Si se desean otros indicios, entonces el TGF-\beta1 en medios acondicionados es de al menos aproximadamente 200-300, preferentemente al menos aproximadamente 300 picogramos/ml/día; el b-FGF en medios acondicionados está por debajo de aproximadamente picogramos/ml, preferentemente es de no más de aproximadamente 400 picogramos/ml.

Los niveles de sulfato de heparano pueden ser cuantificados usando un ensayo espectrofotométrico de digestión ABC de azul de dimetilmetileno-condroitinasa. Los niveles totales de glicosaminoglicano (GAG) sulfatado se determinan usando un ensayo de unión de colorante de azul de dimetilmetileno (DMB) en el que las muestras desconocidas son comparadas con una curva estándar generada usando cantidades conocidas de sulfato de condroitina purificado en medios de recogida. Se mezclan muestras adicionales de medio acondicionado con condroitinasa-ABC para digerir condroitina y sulfatos de dermatano antes de la adición del reactivo colorante de DMB. Todas las absorbancias son determinadas a la absorbancia de longitud de onda máxima del colorante DMB mezclado con patrón de GAG, generalmente aproximadamente a 515-525 nm. La concentración de sulfato de heparano por día se calcula restando la concentración de condroitina y sulfato de dermatano de la concentración total de glicosaminoglicano sulfatado en muestras de medios acondicionadas. La actividad de condroitinasa-ABC es confirmada mediante digestión de una muestra de sulfato de condroitina purificado. Las muestras de medios acondicionados son corregidas apropiadamente si se digiere menos de 100% de sulfato de condroitina purificado. Los niveles de sulfato de heparano pueden ser cuantificados también usando un ensayo ELISA empleando anticuerpos monoclonales.

Si se desea, los niveles de TGF-\beta1 y b-FGF pueden ser cuantificados usando un ensayo ELISA que emplea anticuerpos monoclonales o policlonales, preferentemente policlonales. Los medios de recogida testigos pueden ser cuantificados también usando un ensayo ELISA y las muestras pueden ser corregidas apropiadamente para los niveles de TGF-\beta1 y b-FGF presentes en medios testigos. Los niveles de óxido nítrico (NO) pueden ser cuantificados usando un ensayo de reacción de Griess. La naturaleza transitoria y volátil del óxido nítrico la hace inadecuado para la mayoría de los métodos de detección. Sin embargo, dos productos de descomposición estables del óxido nítrico, el nitrato (NO_{3}) y el nitrito NO_{2}) pueden ser detectados usando métodos fotométricos rutinarios. El ensayo de la reacción Griess convierte enzimáticamente nitrato en nitrito en presencia de nitrato reductasa. El nitrito es detectado por colorimetría en forma de un producto colorante azoico coloreado, absorbiendo luz visible en el intervalo de aproximadamente 540 nm. El nivel de óxido nítrico presente en el sistema se determina convirtiendo todo el nitrato en nitrito, determinando la concentración total de nitrito en las muestras desconocidas y comparando seguidamente la concentración resultante de nitrito de una curva estándar generada usando cantidades conocidas de nitrato convertido en nitrito.

También, puede ser usado uno cualquiera o más de los ensayos que anteceden solos o en combinación como un ensayo de selección para identificar una célula que sea adecuada para ser usada con el material implantable de la presente invención.

Aunque el fenotipo inmunomodulador preferido descrito con anterioridad puede ser valorado usando uno o más de los ensayos funcionales cuantitativos opcionales de sulfato de heparina, TGF-\beta1, NO y/o b-FGF, el material implantable puede ser evaluado en cuanto a la presencia de uno o más fenotipos inmunomoduladores preferidos como sigue. Para los fines de la presente invención, uno de estos fenotipos fácilmente identificables típicos de las células de la presente invención es un fenotipo inmunogénico alterado medido mediante los ensayos in vitro descritos con posterioridad. Otro fenotipo fácilmente identificable típico de las células de la presente invención es una capacidad para bloquear o interferir con la maduración de células dendríticas medidas mediante los ensayos in vitro descritos con posterioridad. Cada fenotipo es citado en la presente memoria descriptiva como un fenotipo inmunomodulador y las células que exhiben este fenotipo tienen una funcionalidad inmunomoduladora.

Evaluación de la funcionalidad inmunomoduladora

Para los fines de la invención descrita en la presente memoria descriptiva, la funcionalidad inmunomoduladora del material implantable puede ser ensayada como sigue. Por ejemplo, las muestras del material implantable son evaluadas para determinar su capacidad para reducir la expresión de moléculas MHC clase II, para reducir la expresión de molécula co-estimuladoras, para inhibir la maduración de células dendríticas conjuntamente cultivadas y para reducir la proliferación de células T. En ciertas realizaciones preferidas, el material implantable puede ser usado para los fines descritos en la presente memoria descriptiva cuando el material es capaz de reducir la expresión de moléculas MHC clase II en al menos aproximadamente 25-80%, preferentemente 50-80%, lo más preferentemente al menos aproximadamente 80%; para reducir la expresión de moléculas conjuntamente estimuladoras en al menos aproximadamente 25-80%, preferentemente 50-80%, lo más preferentemente al menos aproximadamente 80%; inhibir la maduración de células dendríticas conjuntamente cultivadas en al menos 25-95%, preferentemente 50-95%, lo más preferentemente al menos aproximadamente 95% y/o reducir la proliferación de linfocitos en al menos aproximadamente 25-90%, preferentemente, 50-90%, lo más preferentemente al menos aproximadamente 90%.

Los niveles de expresión de moléculas MHC clase II y moléculas co-estimuladoras pueden ser cuantificados usando citometría de flujo rutinaria y análisis FACS, descritos en detalle con posterioridad. La proliferación de linfocitos puede ser cuantificada mediante el cultivo conjunto in vitro de linfocitos CD3+ marcados con ^{3}[H]-timidina con la composición implantable a través de recuento por centelleo como se describe en detalle con posterioridad. La inhibición de la maduración de células dendríticas puede ser cuantificada cultivando conjuntamente el material implantable con células dendríticas y evaluando la expresión superficial de diversos marcadores en las células dendríticas mediante citometría de flujo y análisis FACS, o midiendo la absorción de células dendríticas de dextrano conjugado con FITC mediante citometría de flujo. Cada uno de estos métodos se describe en detalle con posterioridad.

También, puede ser usado uno cualquiera o más de los ensayos que anteceden solos o en combinación con un ensayo de selección para identificar una célula que sea adecuada para ser usada con el material implantable de la presente invención.

Métodos de uso e indicaciones clínicas

Esta invención encuentra aplicación en diversos métodos, como se define en las reivindicaciones.

Los siguientes términos y conceptos pueden facilitar una comprensión del alcance de aplicación de la presente invención.

Una respuesta inmune de fase temprana depende de la inmunidad innata. Durante una respuesta inmune innata, una diversidad de mecanismos inmunes innatos reconocen y responden a la presencia de un inmunógeno. La inmunidad innata está presente en todos los individuos en todo momento y discrimina principalmente entre propia, propia alterada y no propia. Por ejemplo, un tipo de célula inmune innata es la célula Natural Killer (NK), la célula dendrítica y el monocito. La respuesta inmune innata está seguida de una respuesta inmune adaptativa, mediada por la selección clonal de linfocitos específicos y dando lugar a una respuesta inmune más adaptada y de larga duración contra el antígeno reconocido.

La respuesta inmune adaptativa, o inmunidad adaptativa es la respuesta de linfocitos específicos a antígenos a un antígeno, que incluye el desarrollo de una memoria inmunológica. Las respuestas inmunes adaptativas son generadas mediante la selección clonal de linfocitos. Las respuestas inmunes adaptativas son distintas de las fases innatas y no adaptativas de inmunidad que no están mediadas por una selección clonal de linfocitos específicos para antígenos. La respuesta inmune adaptativa incluye una inmunidad mediada por células así como una inmunidad humoral. Por ejemplo, una célula adaptativa es un linfocito de células B o células T.

Una de las características distintivas de la respuesta inmune adaptativa es el establecimiento de una memoria inmunológica. La memoria inmunológica es la capacidad del sistema inmune para responder de forma más rápida y eficaz a inmunógenos que han sido encontrados previamente y refleja la existencia previa de una población clonalmente expandida de linfocitos específicos para antígenos.

La inmunidad protectora puede ser inmunidad mediada por células o inmunidad humoral. La inmunidad humoral es una inmunidad específica mediada por anticuerpos preparados en una respuesta inmune humoral. La inmunidad mediada por células describe cualquier respuesta inmune adaptativa en la que las células T específicas para antígenos desempeñan una función principal.

Las enfermedades autoinmunes están mediadas por respuestas inmunes adaptativas sostenidas específicas para antígenos propios. Las lesiones de tejidos resultan porque el antígeno es un componente intrínseco del cuerpo y, consecuentemente, los mecanismos efectores del sistema inmune son dirigidos a los tejidos propios. También, como el autoantígeno atacante no puede ser suprimido del cuerpo, la respuesta inmune persiste y hay un suministro constante de nuevo autoantígeno que amplifica la respuesta.

Aunque algunos injertos o trasplantes singeneicos pueden ser aceptados a largo plazo, incluso los injertos singeneicos pueden ser problemáticos para un receptor. De hecho, incluso cuando son recolectadas células autólogas, manipuladas ex vivo y hechas retornar al donante original, se puede producir una falta de aceptación en alguna medida. Normalmente, los injertos que difieren en las MHZ u otros lugares genéticos son rechazados a corto plazo por una respuesta de células T del receptor. Cuando el donante y receptor difieren en las MHC, por ejemplo, la respuesta inmune es dirigida a la molécula MHC no propia u otras moléculas superficiales expresadas por el injerto. La aceptación o rechazo de un injerto o trasplante provoca acontecimientos inmunes como reconocimiento de antígenos, activación de células T, reclutamiento de células T-helper y finalmente destrucción del injerto.

Una reacción inflamatoria es iniciada por una respuesta inmune local. La inflamación aguda es un episodio transitorio temprano, mientras que la inflamación crónica persiste de cómo tal durante las respuestas autoinmunes. La inflamación refleja los efectos de las citoquinas sobre los vasos sanguíneos locales. Las citoquinas tienen efectos importantes sobre las propiedades adherentes del endotelio de los vasos sanguíneos, provocando que los leucocitos en circulación colisionen con las células endoteliales de la pared del vaso sanguíneo y se desplacen a través de la pared. Las respuestas inflamatorias en fases posteriores incluyen también linfocitos de la respuesta inmune adaptativa que han sido activados por inmunógenos.

Se describen a continuación ejemplos de métodos de tratamiento e indicaciones clínicas. Esto no está previsto que sea una explicación exhaustiva.

Trasplantes singeneicos y no singeneicos: La presente invención puede ser usada para reducir o disminuir la respuesta adversa del receptor de un trasplante a un trasplante de células, tejidos y/o órganos, tanto si es un trasplante singeneico como no singeneico. La presente invención puede ser usada también para establecer o mantener la aceptación del receptor del trasplante de un trasplante de células, tejidos u órganos, tanto si es un trasplante singeneico o no singeneico. Como se expone en la presente memoria descriptiva, la modulación de una respuesta inmune adversa se produce cuando se usa un material implantable como un tratamiento previo al trasplante, tratamiento coincidente o tratamiento posterior al trasplante. Por ejemplo, está contemplado que un tratamiento previo pueda aclimatar el sistema inmune del receptor, lo que facilita la aceptación posterior del trasplante. Análogamente, un tratamiento coincidente puede acortar el período de tiempo de los acontecimientos fisiológicos que dan lugar finalmente a una aceptación y una mejora de cualesquiera acontecimientos inmunológicos adversos provocados por el trasplante. Los tratamientos posteriores al trasplante, ya sean únicos o múltiples, pueden perpetuar un estado de aceptación y mantener los acontecimientos inmunológicos adversos en la comprobación si/cuando se producen estos acontecimientos. Clínicamente, las indicaciones típicas adecuadas para un tratamiento con el material implantable de la presente invención incluyen, pero sin limitación, alo-rechazo, xeno-rechazo, lesión isquemia-reperfusión asociada con tejidos u órganos trasplantados y programas de tratamientos repetidos. Los programas de tratamientos repetidos incluyen, por ejemplo, aterosclerosis recurrente en diferentes sitios de vasos que requieren una intervención repetida e inyecciones de reposición repetidas de células de los islotes del páncreas. Para los fines de la presente invención, la sangre es un tipo de tejido y los receptores de transfusiones sanguíneas se pueden beneficiar del tratamiento con la presente invención por todas las razones que anteceden. Análogamente, las enfermedades de base inmunológica asociadas con los trasplantes de células, tejidos y/o órganos se puede beneficiar de los paradigmas de tratamientos expuestos anteriormente.

El material implantable de la presente invención puede reducir, modular o eliminar la gravedad la cascada de complementos y efectos secundarios inflamatorios de la activación de los complementos. Por ejemplo, la atenuación de la cascada de complementos usando el material implantable de la presente invención reduce la lisis de células mediada por complementos de tejidos u órganos trasplantados, mejorando así la disfunción del trasplante y prolongando la duración del tratamiento satisfactorio.

Terapias intervencionistas: Como se expone en la presente memoria descriptiva, la presente invención puede modular la gravedad o la entereza de una respuesta inmune ya existente así como una respuesta futura provocada por exposición(es) posterior(es) o anterior(es) a un inmunógeno. Bajo estas circunstancias el material implantable puede intervenir bloqueando la escalada de la respuesta inmune adversa o disminuyendo la aparición de la hipersensibilidad, respectivamente. La supresión de la respuesta de memoria puede evitar una agresión fisiológica adicional que puede poner en riesgo la salud del órgano de un paciente, por ejemplo. En el caso de un estado ya existente, como un estado autoinmune, la presente invención puede calmar los efectos devastadores de los ataques inmunológicos no disminuidos sobre los tejidos u órganos de un paciente. Esencialmente, estos pacientes están continuamente expuestos a inmunógenos agresivos y su respuesta inmune crece fuera de control dando lugar a secuelas de enfermedades graves a menudo mortales.

Aunque un estado autoinmune puede estar asociado a estimulaciones en serie con un inmunógeno agresivo, pueden ser consideradas análogamente otras indicaciones clínicas. Por ejemplo, como se sugirió anteriormente, un receptor de un trasplante singeneico o no singeneico es sometido a estimulaciones en serie. La reposición de un trasplante, como células de los islotes de riñón, que puede deteriorarse a lo largo del tiempo, constituye una estimulación en serie. Los infartos secundarios o lesiones vasculares secundarias pueden ser considerados estimulaciones en serie. Otro ejemplo es una enfermedad como, pero sin limitación, la vasculitis. Cualquiera de los que anteceden puede ser eficazmente gestionado usando los materiales y métodos de la presente invención. Agentes inmunosupresores de suplantación: Como se explica en otro lugar en la presente memoria descriptiva, la administración del material implantable de la presente invención puede inhibir suficientemente al menos la activación de células T, de forma que se puede eliminar o reducir significativamente la necesidad de administrar agentes inmunosupresores perjudiciales. Cierta clase de pacientes, como un paciente predispuesto a respuestas inmunes altamente exacerbadas, puede ser tratado con un material implantable y con un agente inmunosupresor. El material implantable de la presente invención, cuando es administrado antes o de forma coincidente con el trasplante de tejido singeneico o no singeneico, puede permitir dosificaciones reducidas de agente inmunosupresor, si es necesario uno, para gestionar una respuesta potencial de rechazo al injerto.

Los agentes inmunosupresores potentes, por ejemplo, ciclosporina A, tacrolimus (FK-506), sirolimus (rapamicina), micofenolato mofetilo, leflunomida, glucocorticoides, citostáticos, azatioprina, y prednisona, son administrados al receptor de un trasplante para inhibir la activación de células T y aumentar la probabilidad de supervivencia del injerto. Sin embargo, la administración de agentes inmunosupresores potentes aumenta el riesgo de cáncer y de infección y contribuye al riesgo de otros efectos secundarios que incluyen hipertensión dislipidemia, hiperglicemia, ulceras pépticas y lesiones del hígado y el riñón. La presente invención puede permitir regímenes dosificadores más prudentes y menos arriesgados de estos agentes. Adicionalmente, los inmunosupresores que son normalmente administrados a un receptor de órganos pueden ser administrados con anterioridad de forma coincidente y/o posteriormente a la administración del material implantable de la presente invención. Por ejemplo, los materiales implantables pueden ampliar los efectos ventajosos de los inmunosupresores, mientras minimizan los riesgos de estos agentes en receptores cuyo sistema inmune esté sobre estimulado sobre sensibilizado, reduciendo quizás el tiempo en el que se consigue realmente la inmunomodulación. Está adicionalmente contemplado que las dosificaciones de inmunosupresores, en ciertas realizaciones, sean menores que las normalmente administradas en ausencia de material implantable, exponiendo así un receptor a menos dosis tóxicas de inmunosupresores.

Alteración del transcurso de tiempo de una respuesta inmune: La aplicación de la invención puede disminuir o retrasar una respuesta inmune o inflamatoria. No es necesario que el material implantable elimine completamente una respuesta inmune o inflamatoria para que sea considerado eficaz. En lugar de ello, el material solo necesita alterar el período de tiempo de una respuesta, tal como reduciendo la duración de una respuesta inmune o inflamatoria o reduciendo una respuesta inflamatoria aguda hasta una respuesta inflamatoria crónica. El retraso de una respuesta inmune o inflamatoria permite que una terapia administrada de forma coincidente o posterior pueda tratar eficazmente un receptor en ausencia de una respuesta inmune o inflamatoria y/o aumentar la duración de la aceptación del trasplante. Por tanto, cualquier retraso o reducción de la gravedad de una respuesta inmune adversa es clínicamente ventajosa para un paciente.

Además de ello, el material implantable de la presente invención puede ser usado también para gestionar o reducir una respuesta inmune y una reacción inflamatoria asociada con cualquier estructura extraña exógena de material extraño introducido a un paciente, o cualquier forma de estímulo exógeno. La presente invención contempla inmunógenos exógenos que se producen de forma natural. La presente invención contempla también inmunógenos exógenos que incluyen, pero sin limitación, agentes farmacéuticos, toxinas, implantes quirúrgicos, agentes infecciosos y productos químicos. Para los fines de la presente invención un inmunógeno exógeno puede ser un estímulo exógeno como, pero sin limitación la tensión medioambiental, lesiones, exposición a cualquier estímulo que provoque una respuesta inmune adversa o una reacción inflamatoria.

Por ejemplo, los materiales de injertos sintéticos, como el injerto arteriovenoso PTFE® sintético, u otros materiales quirúrgicos sintéticos o dispositivos prostéticos, pueden inducir una reacción de estructuras extrañas en el hospedante. Este tipo de respuesta inmune inflamatoria puede ser reducida o eliminada también administrando el material implantable de la presente invención al paciente o en el momento de implantar el material sintético. La administración posterior al implante es también eficaz. La reducción de cualquier reacción de estructuras extrañas en el hospedante mejora la función y/o el rendimiento global del tratamiento.

Consideraciones generales

En ciertas realizaciones de la invención, son administrados agentes terapéuticos adicionales de forma anterior, coincidente y/o a continuación de la administración del material implantable. Por ejemplo, las citoquinas o factores de crecimiento pueden ser incorporados también en el material implantable, dependiendo de la indicación clínica que necesita el implante, que incluyen agentes que pueden mutar un acontecimiento humoral o celular de relación inmune o una cascada bioquímica asociada a tejidos. Otros tipos de agentes terapéuticos incluyen los que favorecen la longevidad de células ancladas y/o incluidas en el material implantable y/o agentes que pueden retrasar la bio-erosión de una matriz biocompatible erosionable con posterioridad a la implantación. Cualquiera de los que antecede puede ser administrado por vía local o sistémica; Si es por vía local, ciertos agentes pueden estar contenidos en el material implantable o pueden ser contribuidos por las células por sí mismas.

Consideraciones de la administración

Como se contempla en la presente memoria descriptiva, el material implantable de la presente invención puede ser suministrado o situado en cualquier sitio anatómico compatible, con las condiciones de que el sitio no provoque una perturbación de tipo mecánico o de tipo físico o finalmente una disgregación del material implantable, ni comprometa de algún otro modo la integridad física o la funcionalidad del material implantable. Por ejemplo, la presente invención puede ser situada por vía subcutánea, perivascular o intraperitoneal. Un sitio preferido es un parche para la piel. Otros sitios preferidos pueden ser perivasculares o no perivasculares. El material implantable puede estar situado adyacente o en contacto con respecto a un órgano o una estructura anatómica tubular que puede ser una estructura vascular o no vascular. La presente invención puede ser suministrada a cualquier sitio compartible para fines de una modulación sistémica de una respuesta inmune humoral o celular, o para los fines de una modulación local de una reacción de inflamación, o ambas cosas. Ciertas realizaciones preferidas del material implantable pueden ubicarse en un sitio de implantación durante al menos aproximadamente 56-84 días, preferentemente de aproximadamente al menos 7 días, más preferentemente aproximadamente al menos 14 días, incluso más preferentemente aproximadamente al menos 28 días y lo más preferentemente más de aproximadamente 28 días antes de su erosión biológica.

Cuando esté preparado para un suministro a un receptor, el material implantable, cuando esté, por ejemplo en una forma plana flexible, es una pieza esterilizada de 1 x 4 x 0,3 cm (1,2 cm^{3}) preferentemente con aproximadamente 5-8 x 10^{5}, preferentemente al menos aproximadamente 4 x 10^{5} células/cm^{3} y al menos aproximadamente 90% de células viables, por ejemplo, células endoteliales aórticas humanas derivadas de una única fuente de un donante cadáver, por centímetro cúbico en aproximadamente 45-60 ml, preferentemente aproximadamente 50 ml de medio de crecimiento endotelial (por ejemplo, medio de crecimiento endotelial EGM-2) que no contiene rojo de fenol ni antibióticos. Cuando se usan células endoteliales aórticas porcinas, el medio de crecimiento es también EBM-2 que no contiene rojo de fenol, pero complementado con 5% de FBS y 50 \mug/ml de gentamicina.

En ciertas realizaciones contempladas en la presente memoria descriptiva, el material implantable de la presente invención es una composición fluida que comprende una matriz biocompatible en forma de partículas que puede estar en la forma de un gel, una espuma, una suspensión, una partícula, un microportador, una microcápsula u otro material fluido. Cualquier composición fluida no sólida para ser usada con un dispositivo de suministro de tipo inyección o de tipo infusión está contemplada en la presente invención. En ciertas realizaciones, la composición fluida es preferentemente una composición que retiene su forma. Un material implantable que contiene células por encima o dentro de una matriz en forma de partículas de tipo fluida, como se contempla en la presente invención, puede ser formulado para ser usado con cualquier dispositivo de suministro de tipo de inyección que varía en un intervalo de diámetro interno de aproximadamente calibre 22 a aproximadamente calibre 26 y capaz de suministrar aproximadamente 50 mg de composición fluida que comprende material en forma de partículas que contiene preferentemente aproximadamente 1 millón de células en aproximadamente 1 a aproximadamente 3 mm.

Según una realización actualmente preferida, la composición fluida comprende una matriz biocompatible en forma de partículas como partículas de Gelfoam®, polvo Gelfoam®, Gelfoam® pulverizado (Pfizer Inc., New York, NY) (en lo sucesivo "partículas de Gelfoam"), un producto derivado de gelatina dérmica porcina. Según otra realización, la matriz en forma de partículas es microplacas Cytodex-3 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ), comprendidos por colágeno desnaturalizado acoplado a una matriz de dextrano reticulado.

Administración endovascular. La composición fluida puede ser administrada también a través de una vía intraluminal o endovascular incluso aunque el sitio de depósito final no sea intraluminal. Por ejemplo, la composición puede ser suminstrada mediante cualquier dispositivo capaz de ser insertado en el vaso sanguíneo. Pueden ser usados sistemas de guía endoscópica para ubicar el dispositivo de suministro en el sitio de administración que incluyen, por ejemplo, ultrasonidos intravasculares (IVUS)ultrasonidos Doppler con color, ultrasonidos dúplex otros ultrasonidos rutinarios, angiografía, angiografía de resonancia magnética (MRA), formación de imágenes por resonancia magnética (MRI), exploración CT, fluoroscopía para identificar la ubicación una endoprótesis y/o otros sistemas de guía endoscópicos conocidos en el sector. Adicionalmente, el sitio de administración puede ser ubicado mediante palpación táctil.

En un ejemplo, el dispositivo de suministro intraluminal está equipado con un dispositivo de atravesamiento o penetración que penetra la pared luminal de un vaso sanguíneo hasta alcanzar una superficie no luminal de un vaso sanguíneo. La composición fluida es seguidamente depositada en la superficie no luminal. Está contemplado en la presente invención que una superficie no luminal, denominada también extraluminal, puede incluir cualquier sitio exterior a un vaso sanguíneo o cualquier superficie perivascular de un vaso o puede estar en las partes adventicias, medias o íntimas de un vaso sanguíneo, por ejemplo. Para los fines de esta invención, los medios no luminales o extraluminales significan cualquier superficie, excepto una superficie interior del lumen. Está contemplado también que el depósito en el espacio perivascular se pueda realizar a través de un dispositivo de suministro intraluminal y no necesita un contacto con la superficie extraluminal de vaso atravesado.

Los dispositivos de penetración contemplados en la presente invención pueden permitir por ejemplo, un punto único de suministro o una pluralidad de puntos de suministro dispuestos en una configuración geométrica deseada para realizar el suministro de la composición fluida a una superficie no luminal de un vaso sanguíneo sin perturbar un sitio diana herido o enfermado. Puede ser dispuesta una pluralidad de puntos de suministro, por ejemplo, en una ordenación en círculo, de ojo de buey o lineal, por citar unas pocas. El dispositivo de penetración puede estar también en la forma de un perforador de endoprótesis como, pero sin limitación una endoprotesis de balón que incluye una pluralidad de puntos de suministro.

Administración percutánea. La composición fluida puede ser suministrada a través de una vía percutánea usando una aguja, catéter u otro dispositivo de suministro adecuado. La composición fluida puede ser suministrada por vía percutánea de forma coincidente con el uso de un método de guía para facilitar el suministro al sitio que necesita tratamiento. La etapa de guía es opcional. Pueden ser usados sistemas de guía endoscópico para ubicar un sitio de administración extraluminal que incluye, por ejemplo, ultrasonidos intravasculares (IVUS), ultrasonidos Doppler con color, ultrasonidos dúplex, otros ultrasonidos rutinarios, angiografía, angiografía de resonancia magnética (MRA), formación de imágenes por resonancia magnética (MRI) o fluoroscopía de exploración CT. Adicionalmente, el sitio de administración puede ser colocado usando palpación táctil. Tras la entrada en el espacio perivascular o peritoneal, por ejemplo, el facultativo puede depositar la composición fluida en cualquier superficie no luminal o en cualquier sitio no luminal. La etapa de guía o identificación se realiza de forma opcional y no necesita la práctica de los métodos de la presente invención. En otra realización, la composición fluida implantable es suministrada por vía local a una sitio extraluminal quirúrgicamente expuesto.

También está contemplada la administración por infusión. La infusión se puede realizar en forma de una dosis de tipo bolo o una dosis gradual de tipo ralentizada. El facultativo experto reconocerá las ventajas de cada administración y reconocerá las circunstancias en las que emplear unos u otros modos de administración. Solo es necesario un aparato de infusión clínica rutinario.

Materiales y procedimientos experimentales Preparación y evaluación de materiales

Como se describe más en detalle en otros lugares de la presente memoria descriptiva, las células endoteliales aórticas porcinas y las células endoteliales aórticas humanas fueron individualmente aisladas y cultivadas. Las células cultivadas fueron seguidamente sembradas en una matriz biocompatible tridimensional, como Gelfoam y fueron incubadas hasta que las células alcanzaron la confluencia. La funcionalidad de las células endoteliales ancladas y/o incluidas en la matriz se evaluó según los protocolos anteriormente expuestos.

Reacción inmune inducida por células endoteliales en ratas

Cincuenta ratas Sprague-Dawley recibieron 5 x 10^{5} trasplantes de células endoteliales aórticas porcinas en el espacio dorsal subcutáneo en forma de células incluidas en Gelfoam, sedimentos celulares puestos en suspensión en solución salina o como sedimentos adyacentes a Gelfoam vacío. Después de una incisión dorsal, se construyó una pequeña cavidad subcutánea técnica roma y se insertaron cuidadosamente células incluidas en Gelfoam o se inyectaron células. Se incubaron matrices Gelfoam testigos vacías en DMEM completo antes de la implantación. Se recogieron sueros en serie de 0 a 56 días, se dividieron en partes alícuotas y se almacenaron a -70ºC.

Reacción inmune inducida por células endoteliales en ratones

Treinta y seis ratones B6 recibieron 5 x 10^{5} implantes de células endoteliales aórticas porcinas en el espacio dorsal subcutáneo en forma de células incluidas en Gelfoam, sedimentos celulares puestos en suspensión en solución salina o como sedimentos adyacentes a Gelfoam vacío. Se incubaron matrices Gelfoam testigos vacías en DMEM completo antes de la implantación. Para evaluar el impacto de la memoria de inclusión en la matriz o inmunológica, los mismos grupos de ratones fueron nuevamente estimulados con el tratamiento idéntico en el día 100. Se recogieron sueros de 0 a 90 días después de cada procedimiento de implantación, se dividieron en partes alícuotas y se almacenaron a -70ºC. Se sacrificaron cuatro ratones de cada grupo en el día 28 y el día 128, respectivamente, para el aislamiento de esplenocitos.

Reacción inmune inducida por células endoteliales en ratones estimulados en serie

Células endoteliales aórticas porcinas (PAE) aisladas a partir aorta porcina blanca grande, fueron sembradas en Gelfoam como se describió previamente o se hicieron crecer hasta confluencia en placas de poliestireno. Los ratones B6 recibieron inyecciones en el espacio dorsal subcutáneo en los días 0, 21, 35 de 5 x 10^{5} PAE (n=24, ratones previamente sensibilizados) o solución salina (n= 24, ratones sin inmunizar). En el día 42 y 12 los ratones de cada grupo recibieron 5 x 10^{5} PAE incluidas en matriz o libre. Se estudiaron las reacciones inmunes y el deterioro lítico de los hospedantes durante los siguientes 90 días. Se recogieron sueros en serie de los días 42 a 132, se dividieron en partes alícuotas y se almacenaron -70ºC. Fueron sacrificados seis ratones de cada grupo en el día 70 y el resto en el día 132 para el aislamiento de
esplenocitos.

Experimentos Células endoteliales incluidas en una matriz tridimensional hecha crecer en un modelo tridimensional

Se realizó una microscopía electrónica de exploración para evaluar el modelo de crecimiento de células endoteliales hechas crecer en una matriz biocompatible. El material implantable que comprendía células endoteliales ancladas y/o incluidas en una matriz Gelfoam se aclaró con PBS, se dividió en muestras de 0,5 cm, se fijó con glutaraldehído al 3% (Sigma Chemicals; St. Louis, MO) durante 90 minutos y se transfirió a agua destilada. Después de incubar en OsO_{4} al 1%, las muestras se aclararon con agua destilada y se deshidrataron en soluciones en serie de etanol (30, 50, 75, 80,85, 90, 95,y 100%) a intervalos de 15 minutos y con hexaetildisilazano (Sigma) (50%, 100%) a intervalos de 30 minutos. Las muestras se evaporaron durante una noche en HMDS al 100% y posteriormente se aplicaron como revestimiento con oro en un dispositivo de revestimiento de plasma (Edwards Coating System, Reino Unido). Se obtuvieron microfotografías electrónicas de exploración a un voltaje de aceleración de 5 kV (Stereoscan 240, Cambridge Instruments, Reino Unido).

La microscopía electrónica de exploración puso de manifiesto un modelo de crecimiento de 3-D de células endoteliales aórticas porcinas a lo largo de los espacios intersticiales de la matriz de Gelfoam. La viabilidad celular permaneció a un 95% durante el transcurso del cultivo de dos semanas.

Los datos experimentales indican que la inmunoaceptación in vivo de las células incluidas en Gelfoam es un efecto del modelo de crecimiento tridimensional de las células endoteliales en la matriz más que a partir de la presencia de la matriz biocompatible sola. Normalmente, las células o proteínas implantadas combinadas con biomateriales tratados por ingeniería genética de tejidos sirven como una fuente de inmuno-estimulación de antígenos. Sin embargo, la matriz Gelfoam es inmunoneutra y por sí misma no tiene ningún efecto inmunoprotector ya que la inyección de células endoteliales aórticas porcinas adyacentes a la matriz Gelfoam sola provocaron la misma respuesta inmune que las células endoteliales inyectadas libres. La naturaleza de las células endoteliales contribuye a esta forma única de inmunomodulación observada con las preparaciones celulares incluidas en matrices. En particular, estas células tienen una peculiaridad: una superficie basal que interacciona con la membrana de basamento y una superficie superior que interacciona con el flujo de sangre y elementos celulares. Los datos sugieren que la función de las células endoteliales es dependiente del anclaje y la densidad. Las enfermedades sistémicas como hipertensión, alteraciones en el metabolismo de lípidos y glucosa o exposición a toxinas alteran la regulación dependiente del anclaje y la amplitud y naturaleza de las respuestas inmunes contra el endotelio y transformación fenotípica de células endoteliales intactas de la matriz adherente en libres contribuye al inicio de la enfermedad vascular.

Modulación de moléculas superficiales que incluyen moléculas co-estimuladoras y de adhesión

Los niveles de expresión de moléculas co-estimuladoras y de adhesión en células endoteliales in vitro se cuantificaron mediante citometría de flujo. Se usaron anticuerpos marcados con FITC y PE y se incluyeron en anticuerpo de P-selectina anti-porcino de ratón, CD31 anti-porcino de ratón (clon LCI-4), CD54 anti-humano (clone 15.2), CD62E anti-humano (clon 1.2 B6), CD58 anti-humano (clon 1C3), CD80 anti-humano (clon BB1), CD86 anti-humano (clon 2331), ligando 4-1BB anti-humano (marcado con PE, clon 665-485), IgG_{1} anti-ratón de rata (clon A85-1) y IgGM anti-ratón (clon R6-60.2), IgG anti-rata de conejo, CD40 anti-humano de conejo, IgG anti-conejo de cabra, CD106 anti-humano de ratón (clon 1.G11B1), HLA-DP,DQ,DR anti-humano de ratón (clon CR3/43), MHC de clase I anti-ratón (IgG_{2a}), IgG_{2a} anti-ratón de rata, ox40-ligando anti-humano de ratón, ligando 1 de muerte programada anti-humano de ratón (PD-L 1, clon MIH1), PD-L2 anti-humano (clon MIH18), y ligando coestimulador inducible anti-humano (ligando ICOS, clon MIH12).

Monocapas de células endoteliales o células endoteliales incluidas en Gelfoam fueron recolectadas después de un cultivo en medio completo (CD31, CD58, PD-L2, ligando ox40, MHC-I), cultivadas con 100 U/ml de TNF-\alpha (CD54, CD80, CD86, CD106, E-selectina, P-selectina) o 200 U/ml de TNF-\alpha (ICOS-L) durante 24 horas, 10 \mug/ml de LPS durante 24 horas (ligando 4-1BB), 1.000 U/ml de IFN-\gamma (MHC-II, CD40) o 100 U/ml de IFN-\gamma y 25 ng/ml de TNF-\alpha (PD-L1) durante 48 horas. Los medios fueron aspirados y las células se lavaron con PBS. Las monocapas se incubaron en PBS/EDTA 1,0 mM durante 5 minutos y se disgregaron mediante agitación suave. El Gelfoam fue digerido con tipo I de colagenasa y mostró que no tenía ningún efecto sobre la expresión de moléculas superficiales. Las suspensiones celulares se lavaron y 3 x 10^{5} células se volvieron a poner en suspensión en tampón FACS (PBS que contenía 0,1% de BSA y 0,1% de azida de sodio, Sigma Chemicals; St. Louis, MO). Las células endoteliales se incubaron con anticuerpos primarios durante 30 minutos a 40ºC. Si fue necesario, las células se volvieron a poner en suspensión en tampón SACS y se tiñeron con un anticuerpo secundario durante 30 minutos a 4ºC. Las células seguidamente se lavaron, se fijaron en paraformaldehído al 1% 10^{4} células fueron analizadas mediante citometría de flujo usando un instrumento FAC-Scalibur y un programa de ordenador CellQuest (Becton Dickinson, San Diego,
CA).

La inclusión de células endoteliales aórticas porcinas en una matriz biocompatible tridimensional alteró la expresión de moléculas superficiales. La expresión constitutiva de CD58 se redujo significativamente en células endoteliales aórticas porcinas incluidas en Gelfoam en comparación con la expresión de CD58 de células endoteliales aórticas porcinas hechas crecer en placas de poliestireno de cultivo de tejidos (-60,4%, p < 0,002). Hubo también una reducción significativa en la sobre regulación de moléculas co-estimuladoras y de adhesión y de células endoteliales aórticas porcinas MHC clase II incluidas en una matriz, en comparación con células endoteliales aórticas porcinas hechas crecer en placas de poliestireno bajo un análisis FACS (CD80: -64,9%, p < 0,002; CD86: -65,4%, p < 0,001; CD40: -53,8%, p < 0,005; ICAM-1: -68,7%, p < 0,001; VCAM-1: -53,9%, p < 0,005; E-selectina: -71,8%, p < 0,0005; P-selectina: -79,9%, < 0,0002; MHC II: -78,3%, p < 0,0002). No hubo diferencias significativas en la expresión superficial de clase I de MHC y CD31.

Análogamente, a la inclusión de células endoteliales aórticas humanas en una matriz biocompatible tridimensional alteró la expresión de moléculas superficiales. Las células endoteliales aórticas humanas hechas crecer en una matriz 3D exhibieron un perfil de expresión significativamente reducido de CD58 y mostraron una falta significativa de sobre-regulación de moléculas co-estimuladoras y de adhesión. Sin embargo, no hubo diferencias significativas en los niveles de expresión de ICAM-1, E-selectina, MHC I y CD31 entre células endoteliales aórticas humanas incluidas en Gelfoam y células endoteliales aórticas humanas hechas crecer en placas de poliestireno de cultivo de tejidos. Además de ello, no hubo diferencias significativas en la expresión constitutiva de PD-L2 (100%, p=0,73) y en la sobre regulación de PD-L1 (86%, p=0,09).

Por tanto, la inclusión de células endoteliales en una matriz biocompatible tridimensional reduce las moléculas co-estimuladoras y de adhesión. Las células endoteliales aórticas porcinas y células endoteliales aórticas humanas incluidas en matrices exhibían niveles de expresión significativamente inferiores de moléculas co-estimuladoras y de adhesión en células endoteliales activadas.

La expresión de CD31, MHC-II, CD58, ICAM-1 y E-selectina se analizó también en los implantes in vitro mediante microscopía confocal y en ratas in vivo mediante análisis inmunohistoquímico. Las células endoteliales fueron sembradas en cubreobjetos o incluidas en matrices Gelfoam. Después de lavar con PBS y de una fijación con paraformaldehído al 3% durante 20 minutos (cubreobjetos) o durante una noche (Gelfoam), las células endoteliales fueron bloqueadas con suero de rata (Bethyl Laboratories, TX) durante 30 minutos. Antes de teñir con anticuerpos, las matrices Gelfoam se cortaron en forma de láminas de 2 mm de grosor. Las células endoteliales fueron teñidas con la cantidad apropiada de anticuerpos durante 1 (cubreobjetos) o 2 horas (Gelfoam) y se analizaron en un microscopio confocal de exploración láser Zeiss LSM510. La intensidad del teñido se cuantificó con un programa de ordenador Image J (National Institute of Health, Bethesda, MD) y se normalizaron frente a la expresión de CD31.

Una microscopía confocal puso de manifiesto niveles de expresión reducida de CD58, ICAM-1, E-selectina y MHC-II en células endoteliales aórticas porcinas incluidas en matrices, mientras que la expresión de CD31 permaneció inalterada (p < 0,02). El anclaje del sustrato a las células no tuvo ningún efecto sobre la expresión de MHC-I, pero mutó apreciablemente la sobre-regulación esperada de moléculas MHC-II. Las células endoteliales aórticas porcinas incluidas en Gelfoam provocaron solamente una proliferación escasa de células T CD4+ xenogeneicas in vitro similar a la respuesta observada con el bloqueo de unión de MHC-II en células endoteliales aórticas porcinas libres.

Modulación de la respuesta inmune in vivo

Las células endoteliales aórticas porcinas incluidas en matrices mostraron una estimulación inferior del acontecimiento inicial en el reclutamiento de leucocitos que incluye P- y E-selectina y USAM-1 que está estrechamente asociado con sitios de reclutamiento de células T de inflamación inmune. El panel completo de moléculas co-estimuladoras específicas generales y de especies fue infra-regulado por la inclusión en la matriz, incluido el primer informe de expresión de células endoteliales y la expresión de ligando 4-1 BB. Al mismo tiempo, la expresión y sobre-regulación de PD-L1 y PD-L2, miembros de la familia B7 que actúa como moléculas inhibidoras compensatorias, permanecieron intactos después de la inclusión en la matriz. Estos descubrimientos in vitro se plasmaron en una reacción inmune significativamente mutada en ratas después de la implantación de las células endoteliales aórticas porcinas incluidas en matrices.

La respuesta celular a la implantación fue evaluada inmunohistoquímicamente en seis ratas de cada grupo en el día 28 posterior a la implantación. Se cortaron secciones de parafina de 5 micrómetros y la recuperación de antígenos se realizó mediante calentamiento por microondas durante 10 minutos en un tampón de citrato de 0,01 mol/l, pH 6,0. Los leucocitos y los linfocitos T y B fueron identificados mediante un método complejo de avidina-biotina peroxidasa. Los anticuerpos primarios eran CD45 R0 anti-rata de ratón, para identificar leucocitos (Research Diagnostics; dilución 1:50), CD4 anti-rata de ratón, para identificar células T CD4^{+} (Pharmingen; dilución 1:10) y CD8 anti-rata de ratón, para identificar células T CD8^{+} (Pharmingen; dilución 1:50). Se usó bazo de rata como testigo positivo e IgG de ratón como testigos negativos. Los anticuerpos primarios fueron aplicados durante 1 hora a temperatura ambiente y las secciones fueron contra-teñidas con solución de hematoxilina de Mayer (Sigma). Se examinaron 6 campos no solapantes (X600). Se obtuvo la media de los resultados para cada grupo.

La inclusión de células endoteliales en una matriz biocompatible tridimensional, en comparación con PAE libres inyectadas o PAE inyectadas adyacentes a una matriz biocompatible tridimensional, redujo también la respuesta inmune en ratas in vivo. La inclusión de células endoteliales aórticas porcinas en Gelfoam redujo significativamente la formación de IgG específico para células endoteliales aórticas porcinas in vivo. Crecieron citoquinas de suero (MCP-1, IL-6, TNF-\alpha), con valores picos cinco días después de la implantación, en ratas que recibieron células endoteliales aórticas porcinas libres de células endoteliales porcinas adyacentes a Gelfoam. Por el contrario, el nivel de citoquinas no aumentó por encima del valor de fondo en animales con células endoteliales aórticas porcinas incluidas en matrices.

Unos estudios inmunohistológicos pusieron de manifiesto la infiltración celular en el interior y alrededor del sitio de los implantes/inyección en 28 días. Después de la inyección de células endoteliales aórticas porcinas libres y la inyección de células endoteliales aórticas porcinas adyacentes a Gelfoam, las células T eran abundantes en el lado del implante/inyección, mientras que se encontraron también grandes números de leucocitos positivos CD45R0 en la periferia del injerto. Por el contrario, el tejido que rodeaba al implante y las propias células endoteliales aórticas porcinas de Gelfoam fueron infiltradas con 4,5 veces menos leucocitos y células T CD4^{+} y 3,3 veces menos de células T CD^{+} que los demás grupos de implantación de células.

Las inmunoglubulinas de ratas en circulación específicas para las células endoteliales aórticas porcinas implantadas fueron medidas también mediante citometría de flujo. Se desprendieron 2 x 10^{5} células endoteliales aórticas porcinas de placas de poliestireno de cultivo de tejidos con 0,25% de tripsina/0,04% de EDTA, se sedimentaron, se lavaron, se volvieron a poner en suspensión en tampón FACS y se incubaron con suero de ratas receptoras durante 30 minutos a 4ºC (diluido 1:10 en tampón FACS). Después de lavar dos veces con tampón FACS frío, las células se incubaron con IgG anti-rata conjugado con FITC. Después de 30 minutos de incubación a 4ºC en la oscuridad, las muestras se lavaron nuevamente dos veces con tampón FACS frío, se fijó en paraformaldehído al 1% y se analizaron 10^{4} células mediante citometría de flujo usando un instrumento FACS Scalibur y un programa de ordenador CellQuest. Las concentraciones en suero de IL-6 de rata (R&D Systems, MN, límite de detección 21 pg/ml), TNF-\alpha de rata, (R&D Systems, limite de detección < 5 pg/ml), y MCP-1 de rata (Amersham, limite de detección < 5 pg/ml) se cuantificaron mediante un ensayo ELISA en los días 0, 5, 12 y 88 posteriores a la implantación. Las mediciones se realizaron al miso tiempo mediante el mismo ensayo ELISA para evitar variaciones de las condiciones del ensayo.

Los niveles de inmunoglobulinas específicos para las células endoteliales aórticas porcinas implantadas en suero de los ratones experimentales se midieron también mediante citometría de flujo. Se desprendieron 2 x 10^{5} células endoteliales aórticas porcinas, a partir de la misma cepa que las células implantadas, de placas de cultivo de células con 0,25% de tripsina/0,04% de EDTA se sedimentaron, se lavaron y se volvieron a poner en suspensión en tampón FACS (PBS, 1% de FCS, 0,1% de azida de sodio). Estas células fueron seguidamente incubadas con suero de ratones receptores durante 60 minutos a 4ºC (diluidas 1:10 en tampón FACS). Después de lavar dos veces con tampón FACS, las células se incubaron con IgG_{2a} anti-ratón de rata conjugado con FITC (Southern biotechnology, AL), IgG_{1} (clon A85-1) o IgM (clon R6-60.2, BD Pharmingen, CA), respectivamente. Después de 30 minutos de incubación a 4ºC en la oscuridad, las muestras se lavaron nuevamente dos veces con tampón FACS frío, se fijaron en 0,25 ml de paraformaldehído al 1% y se analizaron 10^{4} células mediante citometría de flujo usando un instrumento FAC-Scalibur y un programa de ordenador CellQuest.

Las células endoteliales incluidas en una matriz biocompatible tridimensional, en comparación con PAE libres inyectadas y PAE inyectadas adyacentes a una matriz biocompatible tridimensional, redujeron la respuesta inmune accionada por Th2en ratones in vivo. Para caracterizar la magnitud y la naturaleza de la respuesta de anticuerpos específicos para células endoteliales aórticas porcinas, se recogió suero de los ratones después de la implantación de células endoteliales aórticas porcinas en el espacio dorsal subcutáneo en forma de células incluidas en Gelfoam, sedimentos celulares en suspensión en solución salina o con sedimentos adyacentes a Gelfoam vacío Los niveles de IgG_{1} y de IgM de células endoteliales aórticas anti-porcinas posteriores a la implantación fueron similares y significativamente superiores en los ratones que recibieron sedimentos de células endoteliales aórticas porcinas o sedientos de células endoteliales aórticas porcinas adyacentes a Gelfoam vacío en comparación con los receptores de células endoteliales aórticas porcinas incluidas en Gelfoam (Figuras 1A y 1B). Hubo una elevación transitoria y menor de IgG_{2a} en células endoteliales aórticas anti-porcinas 12 días después de la implantación (p < 0,005) después de la implantación de las células endoteliales aórticas porcinas incluidas en matrices que no fue observada en los ratones que recibieron células endoteliales aórticas porcinas sedimentadas o implantes de Gelfoam vacío con inyección de células endoteliales aórticas porcinas sedimentadas (Figura 1C).

Las Figuras 1A, 1B y 1C exponen gráficamente la IgG específica para PAE en circulación después de una inyección subcutánea de PAE libres, Células endoteliales hechas crecer en Gelfoam o después de una inyección simultánea de PAE adyacentes al Gelfoam solas o determinadas mediante citometría de flujo. La representación gráfica de los resultados de todos los ratones (n=18 por grupo hasta el día 28, n=12 por grupo los días 50-100 posteriores a la implantación) demuestran una diferencia estadísticamente significativa entre las formas incluidas en matrices y otras de la implantación de PAE para IgG_{1} (Figura 1A) y de IGM (Figura 1B). Hubo una elevación transitoria y menor en IgG_{2a} anti-PAE 12 días después de la implantación de PAE incluidas en matrices (Figura 1C).

En comparación con HAE sin estimular hechas crecer en placas de cultivos de tejidos, las HAE incluidas en matrices expresaban niveles significativamente superiores de las moléculas señalizadoras inhibidoras supresoras de señalización de citoquinas (SOCS)3 (0,007 \pm 0,001 frente a 0,003 \pm 0,0003 RU, p < 0,001). Por tanto, la estimulación con IFN-\gamma dio lugar a una expresión significativamente inferior de MHC II en HAE incluidas en matrices (37 \pm 5 frente a 68 \pm 4%, p < 0,001). A pesar de los niveles de expresión de receptor de IFN-\gamma inalterados (p =0,39) la adherencia al sustrato redujo la fosforilación inducida por IFN-\gamma de quinasa 1 y 2 de Janus y de transductor y activador de señales de transcripción 1. Esto estuvo seguido de una expresión disminuida del factor 1 regulador de interferón, CIITA (0,01 \pm 0,004 frente a 0,03 \pm 0,004 RU, p < 0,005), y HLA-DR (0,17 \pm 0,04 frente a 0,27 \pm 0,05 RU, p < 0,02) en HAE incluidas en matrices. La expresión reducida de MHC II en HAE incluidas en matrices dio lugar a una capacidad mutada de inducir la proliferación de células T alogeneicas (4152 \pm 255 frente a 19619 \pm 327 cpm, p < 0,001).

De forma interesante, la inclusión de células endoteliales en una matriz tridimensional disminuye casi completamente la respuesta inmune accionada por Th2 observada, muta la actividad lítica y atenúa la diferenciación de células T sin inmunizar en forma de células efectoras. De acuerdo con los resultados previos, estos datos sugieren que la inclusión en Gelfoam de células proporciona una protección inmune mediante la activación inmune del nivel de células T a través de niveles reducidos de expresión de moléculas de MHC clase II así como de moléculas co-estimuladoras y de adhesión.

Modulación de la proliferación de linfocitos y de la actividad lítica

Las células endoteliales aórticas porcinas hechas crecer en pocillos de poliestireno o incluidas en Gelfoam fueron sembradas en placas de 96 pocillos a 5 x 10^{4} células/pocillo y fueron estimuladas con 40 ng/ml de INF-\gamma porcino durante 48 horas, seguido de un tratamiento con mitomicina C (Sigma, 50 \mug/ml durante 30 minutos) para evitar la proliferación de fondo. Se purificaron linfocitos CD4+ humanos mediante selección negativa con un estuche de ensayo II de aislamiento de células T CD4+ (Miltenyi Biotec, Alemania) según las instrucciones del fabricante y se añadieron a 2 x 10^{5} células/pocillo. En algunos experimentos se dirigió anticuerpo de múrido contra la activación bloqueada de HLA-DP, DQ, DR a través de moléculas MHC clase II. Se midió la incorporación de ^{3}[H]-timidina solamente el día 6 mediante un impulso de 16 h (1 \muCi/ml, Amersham). SE usó la absorción en timidina de células endoteliales aórticas porcinas tratadas con mitomicina, medio o células T solamente como testigos negativos.

Para evaluar la actividad lítica de linfocitos en ratones in vivo, se realizó un aislamiento y evaluación de esplenocitos. Los bazos de cuatro ratones de cada grupo fueron aislados asépticamente en una carcasa de flujo laminar el día 28 después de la implantación de células endoteliales aórticas porcinas. Los órganos se cortaron en varios trozos. Las agrupaciones fueron adicionalmente dispersadas extrayendo y expulsando la suspensión varias veces a través de una jeringuilla esterilizada con una aguja de calibre 19. Posteriormente, la suspensión fue expulsada a través de un tamiz de nilón de maya de 200 \mum. Las células se lavaron dos veces con RPMI (que contenía L-glutamina 2 mM, HEPES 0,1 M, 200 U/ml de penicilina G, 200 \mug/ml de estreptomicina y 5% de suero de ternera inactivado con calor, Life Technologies) y se usaron inmediatamente.

Para evaluar adicionalmente la actividad lítica de linfocitos en ratones in vivo, se realizó un ensayo de liberación de Calcein-AM. Las células endoteliales aórticas porcinas de la misma cepa de células inyectadas se volvieron a poner en suspensión en medio completo a una concentración final de 2 x 10^{4}/pocillo y se incubaron con calceína-AM 15 \muM (Molecular Probes) durante 40 minutos a 37ºC con agitación ocasional. Después de dos lavados con medio completo, se añadieron esplenocitos como células efectoras a una concentración final de 5 x 10^{5}/pocillo. La liberación espontánea y máxima se examinaron como testigos en seis pocillos repetidos que contenían solamente células diana en medio completo y seis pocillos con células dianas en medio más 2% de Triton X-100 durante los últimos 20 minutos. Después de una incubación de 3 horas a 37ºC/5% de CO_{2} las muestras se midieron usando un luminofluorímetro de microplacas de exploración dual Fluoroskan Ascent FL (Thermo Electron Corporation, TX). Los datos se expresaron como unidades fluorescentes arbitrarias (AFU). Se calculó la lisis específica según la fórmula [(liberación del ensayo-liberación espontánea)/(liberación máxima-liberación espontánea)] x 100.

La inclusión de células endoteliales en una matriz biocompatible tridimensional redujo la proliferación de linfocitos. La respuesta proliferativa de de células T CD4+ humanas aisladas y células endoteliales aórticas porcinas tratadas con INF-\gamma (40 ng/ml, 48 horas) hechas crecer en placas de cultivo de tejidos o incluidas en Gelfoam se ensayó mediante incorporación de timidina. La considerable proliferación de células T CD4+ apreciada después de una exposición a células endoteliales aórticas porcinas previamente tratadas con INF-\gamma fue casi eliminada cuando las células endoteliales aórticas porcinas fueron incluidas en matrices (17087,2 \pm 3749,75 frente a 5367,8 \pm 1976,3 cpm, p < 0,01). La presencia de anticuerpo de MHC II bloqueó la proliferación de linfocitos en respuesta a células endoteliales aórticas porcinas tratadas con INF-\gamma en un 65% para un nivel comparable respecto a células endoteliales aórticas porcinas incluidas en matrices. Las células endoteliales aórticas porcinas tratadas con mitomicina no mostraron una proliferación significativa después de un cultivo de 6 días (61 \pm 13 cpm) así como el cultivo de células T CD4+ aisladas solas (83 \pm 27 cpm).

Análogamente, la inclusión de células endoteliales en una matriz biocompatible tridimensional, en comparación con PAE libres inyectadas y PAE inyectadas adyacentes a una matriz biocompatible tridimensional, redujo la actividad lítica de linfocitos en ratones in vivo. Los linfocitos e bazos de ratones de los tres grupos de tratamiento diferentes fueron aislados 28 días después de la implantación de las células endoteliales aórticas porcinas. Las células endoteliales aórticas porcinas de donantes fueron marcadas con calceína-AM y la lisis de células endoteliales se midió mediante un ensayo de liberación de fluorescencia de calceína después de una incubación conjunta con linfocitos. Los linfocitos de los ratones después de una inyección de células endoteliales aórticas porcinas puras (36,8 \pm 3,9%) y después de la inyección coincidente de células endoteliales aórticas porcinas (33,9 \pm 4,7%) mostró la actividad lítica más elevada en comparación con linfocitos aislados a partir de ratones después de una implantación de constructos de Gelfoam de células endoteliales aórticas porcinas (22,4 \pm 4,2%, p < 0,05; Figura 2).

La Figura 2 representa gráficamente esplenocitos de ratones que recibieron PAE libres y muestra una actividad lítica significativamente aumentada cuando se compara con PAE incluidas en matrices. Una nueva estimulación de ratones con PAE libres aumentó significativamente la actividad lítica xenogeneica de esplenocitos aislados.

Modulación de células productoras de citoquinas de Th2 y citoquinas

Se revistieron placas Immunospot (Millipore, Bedford, MA) con 5 \mug/ml de interferón anti-ratón (IFN-\gamma), interleucina anti-ratón (IL)-2, IL-4 anti-ratón o IL-10 anti-ratón mAb (todos ellos de la empresa BD Pharmingen) en PBS esterilizada durante una noche. Las placas fueron seguidaente bloqueadas durante dos horas con medio RPMI completo sin rojo de fenol, que contenían 10% de suero de ternera inactivado con calor. Los esplenocitos (0,5 x 10^{6} en 100 \mul de medio RPMI completo) y la misma cepa de células endoteliales aórticas porcinas usadas para la implantación (0,5 x 10^{6} en 100 \mul de medio RPMI completo) se colocaron seguidamente en cada pocillo y se cultivaron durante 48 horas a 37ºC en 5% de CO_{2}. Después de lavar con agua desionizada y lavar seguidamente con PBS que contenía 0,05% de Tween (PBST), se añadieron 2 \mug/ml de IFN-\gamma anti-ratón biotinilado, IL-2 anti-ratón, IL-4 anti-ratón o IL-10 anti-ratón mAb (todos ellos de la empresa BD Pharmingen) durante una noche, respectivamente. Las placas se lavaron seguidamente tres veces en PBST, seguido de una hora de incubación con streptavidina conjugada a peroxidasa de rabanillo (BD Pharmingen). Después de lavar cuatro veces con PBST seguido de PBS, las placas fueron reveladas usando 3-amino-9-etil-carbazol (BD Pharmingen). Las manchas resultantes se sometieron a recuento en un analizador de imágenes immunospot asociado a enzimas asistido por ordenador (Cellular Technology Ltd., ORT). El número de manchas en los pocillos con medio, esplenocitos o células endoteliales aórticas porcinas solas fue sustraído de las xeno-respuestas para tener en cuenta el valor en fondo en el análisis de datos.

La inclusión de células endoteliales en una matriz biocompatible tridimensional, en comparación con PAE libres inyectadas y PAE inyectadas adyacentes a una matriz biocompatible tridimensional, redujo las células productoras de citoquinas Th2 en ratones in vivo. La frecuencia de células productoras de citoquinas Th1 (IFN-\gamma, IL-2 y citoquinas Th2 (IL-4, IL-10) se midió mediante un ensayo ELlSPOT en esplenocitos recuperados de animales después de la implantación de formas diferentes de células endoteliales aórticas porcinas. Después de una implantación posterior de 28 días, la frecuencia de células productoras de citoquinas Th2 era significativamente inferior en esplenocitos aislados de ratones que recibieron células endoteliales aórticas porcinas incluidas en matrices en comparación con las aisladas de ratones que recibieron células endoteliales aórticas porcinas libres o células endoteliales aórticas porcinas adyacentes a Gelfoam vacío (IL-4: p < 0,0001, IL-10 < 0,001; Figura 3A). Por el contrario no hubo diferencias significativas en la frecuencia de células productoras de citoquinas Th1 en esplenocitos aislados a partir de los tres grupos (Figura 3B).

La Figura 3A representa gráficamente las frecuencias de células productoras de citoquinas específicas de xenoantígenos en receptores después de una implantación de ratones con PAE libres, PAE incluidas en matrices o PAE de inyección adyacente a Gelfoam vacío. No hubo diferencias significativas en la frecuencia de células T productoras de INF-\gamma e IL-2 xenorreactivas entre los tres grupos en el día 28. Sin embargo una nueva estimulación con PAE incluidas en matrices provoca un aumento significativo en células T productoras de INF-\gamma e IL-2 específicas de xenoantígenos.

La Figura 3B expone pocillos ELlSPOT representativos para un ratón de cada grupo de tratamiento 28 días después de la primera implantación y la segunda implantación, respectivamente. Se midió la producción de IL-4 en respuesta a PAE. El número de manchas de IL-4 en cada pocillo se determinó mediante análisis de imágenes asistida por ordenador.

La Figura 3C representa gráficamente que los receptores de PAE libres exhibían una frecuencia aumentada significativa de células T productoras de IL-4 y de IL-10 xenorreactivas en comparación con los receptores de PAE incluidas en matrices en el día 28. Una nueva estimulación con PAE libres o inyección de PAE adyacente a matrices Gelfoam vacías aumentó significativamente la frecuencia de células T productoras de IL-4 y de IL-10 específicas de xenoantígenos en el día 128.

Modulación de células efectoras

Los esplenocitos recuperados de los receptores se pusieron nuevamente en suspensión en tampón FACS a una concentración de 2 x 10^{6}/ml. Las células se tiñeron con FITC anti-CD4 (clon L3T4) FITC anti-CD8 (clon Ly-2), R-PE anti-CD44 (clon Ly-24), y alocicocianina anti-CD62L (clon Ly-22) y testigos de isotipos (todos de la empresa BD PharMingen). Las células efectoras CD4+ y CD8+ que expresaban CD44^{alto} y CD62L^{bajo} fueron enumeradas, como se describió anteriormente.

La inclusión de células endoteliales en una matriz biocompatible tridimensional evitó el xeno-rechazo en ratones in vivo. Para determinar el efecto de la inclusión en matrices sobre la generación y la función de células T CD4+ y CD8+ xenorreactivas, se midió el número de CD62L^{bajo} y CD44^{alto} encontrado en los bazos de ratones tratados después de la implantación de células endoteliales aórticas porcinas incluidas en matrices, implantación de sedimentos celulares en suspensión en solución salina o en forma de sedimentos adyacentes a Gelfoam 28 vacío 28 días después de la implantación (Figura 4). Las células efectoras CD4+ y 8+ han sido fiablemente identificadas como células células CD4^{+} T CD62L^{bajo} y CD44^{alto}. El porcentaje de células CD62L^{bajo} y CD44^{alto} aumentó significativamente en receptores de células endoteliales aórticas porcinas y ratones que recibieron células endoteliales aórticas porcinas adyacentes a Gelfoam a vacío, en comparación con ratones que recibieron células endoteliales aórticas porcinas incluidas en matrices; la frecuencia de células T CD4+, CD62L^{bajo} y CD44^{alto} rebasó las células efectoras CD8+ en todos los grupos (relación 1,7-2,3).

La Figura 4A representa gráficamente las células efectoras CD4+ y Cd8+ significativamente aumentadas en ratones que recibieron PAE libres. Las células efectoras CD4+ sobrepasaron las células T CD8+ en los días 28 y 128. Los esplenocitos CD4+ recuperados de ratones fueron analizados mediante citometría de flujo usando CD62L y CD44 como marcadores para células T efectoras. Los gráficos son representativos de ratones que recibieron PAE libres (a), incluidas en matrices (b) o adyacentes a Gelfoam (c) 28 días después de la implantación.

La Figura 4B representa gráficamente la expansión de aumentos de células efectoras después de una nueva estimulación en ratones que recibieron PAE libres pero no PAE incluidas en matrices.

Modulación del xeno-rechazo y la memoria inmunológica

La inclusión de células endoteliales en una matriz biocompatible tridimensional produjo una memoria inmunológica después de una implantación de tejido xenogeneico no vascularizado. Las citoquinas Th1 desempeñan funciones críticas en la prevención de xeno-rechazo mediante la infra-regulación de respuestas humorales accionadas por Th2. A este respecto, los datos demuestran que las células endoteliales tratadas por ingeniería genética de tejidos pueden producir una aumento significativo de anticuerpos IgG_{2a} específicos de células endoteliales aórticas porcinas y un aumento significativo en esplenocitos productores de Th1 xenorreactivos después de una nueva estimulación.

Cien días después de la primera implantación, los ratones restantes en cada grupo fueron nuevamente estimulados con células endoteliales aórticas porcinas idénticas a su primera presentación. Los ratones que recibieron sedimentos de células en suspensión en solución salina o sedimentos adyacentes a Gelfoam vacío mostraron una respuesta de anticuerpos específicos de células endoteliales aórticas porcinas accionadas por IgG_{1} significativa que sobrepasaba la respuesta observada después del primer transcurso de implantación (Figura 5A). Solamente se observó una liberación de anticuerpos IgM de una semana (Figura 5B). En un contraste considerable, los ratones que recibieron células endoteliales aórticas porcinas incluidas en matrices no mostraron ningún aumento de niveles de anti-IgG_{1} y de IgM específicos de células endoteliales aórticas porcinas, pero exhibieron una liberación significativa de anticuerpos IgG_{2a} específicos de células endoteliales aórticas porcinas que estaba ausente en los otros dos grupos (Figura 5C).

Las Figuras 5A, 5B y 5C representan gráficamente los ratones nuevamente estimulados (n = 12 por grupo el día 128, n = 6 por grupo los días 156-190 posteriores a la implantación) con PAE libres o PAE adyacentes a Gelfoam que aumentaron significativamente la formación de anticuerpos IgG_{1} específicos de PAE, en comparación con una nueva estimulación con PAE incluidas en matrices (Figura 5A). La nueva estimulación no tuvo ninguna influencia sobre la formación de IgM específica de PAE (Figura 5B) y no hubo diferencias significativas de anticuerpos IgG_{2a} específicos de PAE entre los tres grupos (Figura 5C).

En consonancia con estos resultados, los esplenocitos aislados de ratones que recibieron células endoteliales aórticas porcinas libres o inyecciones de células endoteliales aórticas porcinas adyacentes a Gelfoam vacío mostraron una capacidad significativamente aumentada de lisar células endoteliales aórticas porcinas 28 días después de la nueva estimulación, mientras que la capacidad de lisados de esplenocitos de ratones que recibieron un segundo implante de células endoteliales aórticas porcinas incluidas en matrices era significativamente más débil que después de la primera implantación (Figura 6). La frecuencia de células T productoras de IL-4 y de IL-10 xenorreactivas aumentó significativamente en los ratones después de una nueva implantación de células endoteliales aórticas porcinas, la frecuencia de esplenocitos productores de Th2 después de una nueva estimulación con células endoteliales aórticas porcinas incluidas en matrices estaba inalterada. Sin embargo, una nueva estimulación con células endoteliales aórticas porcinas incluidas en matrices indujo una frecuencia superior de esplenocitos productores de INF-\gamma y de IL-2 xenorreactivos que después del primer programa de implantación.

La Figura 6 representa gráficamente la inclusión en matrices o proliferación de restauración del bloqueo de MHC II de esplenocitos de ratones expuestos a PAE hasta niveles no estimulados. Los esplenocitos de ratones proliferan en respuesta a PAE estimuladas con INF-\gamma. Las células endoteliales incluidas en matrices o la presencia de anticuerpo MHC II bloqueó la proliferación de esplenocitos en respuesta a PAE tratadas con INF-\gamma en \sim79%. Cada valor representa la media \pm SD.

Además de ello, 28 días después de la nueva estimulación, el porcentaje de células efectoras CD4+ aumentó adicionalmente en ratones que recibieron células endoteliales aórticas porcinas libres y aumentó significativamente en ratones que recibieron células endoteliales aórticas porcinas adyacentes a implantes Gelfoam vacíos pero permaneció inalterado en ratones que recibieron células endoteliales aórticas porcinas incluidas en matrices. El mismo modelo fue evidente para células T efectoras de CD8+.

La estimulación in vitro de esplenocitos de ratones sin inmunizar con PAE puso de manifiesto una respuesta proliferativa significativamente mutada de esplenocitos cuando se incubaron células endoteliales incluidas en matrices estimuladas con INF-\gamma en comparación con células endoteliales libres. La presencia de anticuerpo MHC II bloqueó la proliferación de esplenocitos en respuesta a PAE tratadas con INF-\gamma en un 79% hast6a un nivel comparable a PAE incluidas en matrices.

Globalmente, el tamaño del bazo en ratones que recibieron células endoteliales aórticas porcinas incluidas en matrices parecía ser más pequeño que en los otros grupos al final del período de estudio (62,9 \pm 9,6, 112,7 \pm 16,9, 102,5 \pm 18,8 mm^{3}; p < 0,05.

Por tanto, las interacciones a fines entre células T vírgenes y las restantes células endoteliales puede conducir a una tolerancia in vitro e in vivo. Estos datos documentan la formación de una memoria inmunológica después de la implantación del tejido xenogeneico no vascularizado. La memoria inmunológica se caracterizó por un aumento significativo en los niveles de IgG_{1} e IgM específicos de antígenos, la actividad lítica de esplenocitos y una tendencia hacia una diferenciación aumentada en células T efectoras. Por el contrario, los ratones con una nueva estimulación con inclusión en matriz de células endoteliales condujo a una capacidad lítica reducida de esplenocitos, y la frecuencia de células T CD4+ y CD8+ efectoras quedó inalterada. Aunque la nueva estimulación con células endoteliales aórticas porcinas incluidas en matrices no tuvo ninguna influencia sobre la generación de IgG_{1} e IgM anti-PAE, los niveles de IgG_{2a} aumentaron significativamente.

Modulación de la expresión de fractalquinas

Las quimoquinas y las moléculas de adhesión son críticas en el reclutamiento de células inmunes en circulación en la pared del vaso sanguíneo. La fractalquina tiene funciones tanto quimioatractoras como adhesivas y está involucrada en la patogénesis de la aterosclerosis, rechazo de aloinjertos cardíacos, glomuronefritis y artritis reumatoide. Se comparó la expresión y la secreción de fractalquina entre células endoteliales aórticas humanas incluidas en matrices (HAE) a través de RT-PCR, transferencia Western, citometría de flujo y ensayo ELISA. Los ensayos de adhesión se realizaron con HAE estimuladas con citoquinas y células asesinas naturales (NK) marcadas con ^{51}Cr.

Las HAE fueron estimuladas con 100 U de TNF\alpha/ml (Sigma) y 100 U de IFN-\gamma/ml (Roche) a 37ºC en una atmósfera de aire humidificado que contenía 5% de CO_{2}, condiciones que se demostró que daban lugar a niveles máximos de fractalquina en células endoteliales cultivadas.

Citometría de flujo: Se recolectaron monocapas de células endoteliales o células endoteliales incluidas en matrices en Gelfoam con TNF\alpha y IFN-\gamma durante los períodos de tiempo indicados. Los medios fueron aspirados y las células se lavaron con PBS. Las monocapas se incubaron con PBS/EDTA 1 m durante 5 minutos y se deshicieron mediante agitación suave. Las células hechas crecer en Gelfoam fueron digeridas con colagenasa de tipo I (Worthington Biochemical, NJ) que mostró seguidamente que no tenía ningún efecto sobre la expresión de CDX3CL1. Las suspensiones celulares se lavaron y se fijaron 3 x 10^{5} células en paraformaldehído al 4% durante 10 minutos. Después de dos etapas de lavado, las células se volvieron a poner en suspensión en tampón de saponina (0,1% de saponina, 0,05% de NaN_{3} en solución salina equilibrada de Hanks), se centrifugaron y la materia sobrenadante se separó por decantación. Las HAE fueron seguidamente incubadas con CX3CL1 anti-humano de ratón conjugado a FITC (IgG_{1}, clon 51637, R&D Systems, Minneapolis, MN) o un testigo de isotipo coincidente (clon MOPC-31C, Pharmingen) durante 45 minutos a 4ºC. Seguidamente las células se lavaron y se analizaron 10^{4} células mediante citometría de flujo usando un instrumento FACScalibur y un programa de ordenador CellQuest.

Análisis de transferencia Western: Las monocapas celulares o células digeridas a parir de matrices Gelfoam mediante tratamiento con colagenasa fueron lavadas en tampón PBS y se prepararon lisados celulares mediante incubación con tampón de lisis (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5, 1% de Triton X-100, 1% de desoxicolato, 0,1% de SDS e inhibidor de proteasa; Roche). Las muestras se separaron en geles de Tris-HCl Ready al 4-20% (BioRad Laboratories, Hercules, CA). Se usó un testigo positivo de detección de fractalquina, que consistía en una forma de 85 a 90 kDa de fractalquina humana recombinante que carecía de 57 aminoácidos carboxi-terminales (R&D Systems). Las proteínas fueron seguidamente transferidas sobre membrana de PVDF (Millipore, Billerica, MA)usando tampón de transferencia de glicina-Tris. Las membranas de transferencia fueron bloqueadas en tampón bloqueante Starting Block (Pierce, Rockford, IL) durante 1 hora. Para la detección de fractalquina, las membranas bloqueadas fueron incubadas con anticuerpo policlonal de fractalquina anti-humano de cabra (R&D Systems) a una dilución de 1:200 en tampón bloqueante durante una noche a 4ºC. Las membranas se lavaron seguidamente 3 veces a temperatura ambiente con un tampón de lavado que consistía en PBS con 0,05% de Tween 20 y seguidamente se incubaron con anticuerpo secundario, un IgG anti-cabra de conejo conjugado a peroxidasa de rabanillo (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) a una dilución de 1:3.000 en tampón bloqueante durante 2 horas a temperatura ambiente, seguido de lavado en cinco cambios de tampón de lavado. Para la detección de las bandas de fractalquina, la transferencia fue incubada con sustrato quimioluminiscente (Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus kit, Perkin-Elmer, Boston, MA) según las instrucciones del fabricante seguido de una exposición a película de rayos X (Kodak X-Omat Blue XB-1).

Ensayo ELISA: Se recolectó medio acondicionado para monocapas de células endoteliales o células endoteliales incluidas en Gelfoam después de una estimulación con citoquina durante períodos de tiempo indicados. La fractalquina secretada fue detectada con un estuche de ensayo de detección inmunoabsorbente asociado a enzimas (ELISA) disponible en el comercio (R&D Systems). En resumen, las placas Immulon de 96 pocillos (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) fueron revestidas durante una noche a temperatura ambiente con 100 \mul de 4 \mug/ml de anticuerpo de captura de fractalquina anti-humano de ratón en PBS. Después de tres lavados con tampón de lavado (PBS-0,05% de Tween-20) las placas fueron bloqueadas durante 3 h en albumina de 1% de suero bovino - 5% de sacarosa en PBS. Se añadieron 100 \mul de patrones (se usaron 420 mg/ml de fractalquina humana recombinante (proporcionada con el estuche de ensayo) diluida en diluciones en serie de dos veces en tampón diluyente) o medio acondicionado, seguido de incubación durante una noche a temperatura ambiente. Después de tres etapas de lavado, la placa se incubó con 100 \mul de 500 ng/ml de anticuerpo de detección de fractalquina anti-humano de ratón en PBS durante 2 horas a temperatura ambiente, seguido de incubación con 100 \mul de estreptavilina conjugada a peroxidasa de rabanillo durante 30 minutos a temperatura ambiente. El color se reveló seguidamente añadiendo 100 \mul de solución de peróxidos de hidrógeno mezclado con tetraetilbencidina (R&D Systems). Seguidamente se leyó la densidad óptica a una longitud de onda de 450 nm.

Ensayos de unión de células NK-células endoteliales: Se hicieron crecer HAE hasta confluencia en placas de 96 pocillos (6 x 10^{5} células/pocillo) o se incluyeron en matrices Gelfoam y se activaron con 100 U de TNF\alpha/ml y 100 U IFN-\gamma/ml durante 20 horas a 37ºC en atmósfera de aire humidificado que contenía 5% de CO_{2} y se lavaron una vez con PBS. Las matrices Gelfoam fueron digeridas con colagenasa tipo I, se hizo un recuento de las células y se dispusieron en placas a una concentración de 6 x 10^{5} células/pocillo en placas de 6 pocillos durante 1 hora para permitir la adherencia. Las células NK aisladas fueron incubadas con 10 \muCi de ^{51}Cr/10^{6} células NK, se lavaron en PBS y seguidamente se volvieron a poner en suspensión (5 x 10^{5}/pocillo) en 400 \mul de medio solo o medio que contenía anticuerpo anti-CX3CR1 a 20 \mug/ml durante minutos. La suspensión de células NK se añadió a la monocapa endotelial bajo condiciones de centrifugación suave (10 ciclos/minuto). Después de 30 minutos, el medio se separó por decantación y los pocillos se lavaron suavemente. Las células adherentes fueron lisadas tratando con Triton al 1% en PBS. La unión total se determinó midiendo los recuentos asociados a los pocillos por minuto usando un contador Gamma. Los análisis ilustrados eran representativos de al menos tres experimentos independientes.

La inclusión en matrices retrajo la inducción de mRNA de fractalquina. Aunque las células endoteliales restantes hechas crecer en placas de poliestireno de cultivo de tejidos o en una matriz tridimensional no expresaron fractalquina, la estimulación de HAE hechas crecer en placas de poliestireno de cultivo de tejidos con TNF\alpha y de IFN-\gamma indujo la expresión de mRNA de fractalquina en una manera dependiente del tiempo. El mRNA de fractalquina en HAE hechas crecer en placas de poliestireno de cultivo de tejidos llevó la expresión a valores pico a las 12 horas de estimulación con células que expresaban cantidades significativas de mRNA después de una estimulación durante 24 horas. Por el contrario, la inducción de la expresión de mRNA de fractalquina se redujo significativamente en células endoteliales incluidas en matrices para todos los valores de tiempo estudiados. El valor máximo se alcanzó también después de 12 horas de estimulación con citoquinas pero era solamente \sim10% de los niveles de expresión en células endoteliales hechas crecer hasta la confluencia en placas de poliestireno de cultivo de tejidos (p < 0,0001).

La inclusión en matrices inhibió la expresión de proteínas de fractalquina en HAE. Un análisis de transferencia Western puso de manifiesto niveles inferiores de expresión de proteínas de fractalquina en HAE incluidas en matrices Gelfoam en comparación con células endoteliales hechas crecer en placas de poliestireno en cultivo de tejidos. No hubo una banda detectable de proteínas específicas de fractalquina en células endoteliales sin estimular y en células endoteliales estimuladas durante 4 horas. Las células endoteliales hechas crecer en placas de poliestireno de cultivo de tejidos expresaron fractalquina después de 8 horas de estimulación y exhibieron una expresión máxima de 16 a 24 horas de estimulación con TNF\alpha y IFN-\gamma. La expresión de proteínas en HAE incluidas en matrices fue detectable con posterioridad (12 horas), más débil y desapareció en 24 horas de estimulación de citoquinas.

De forma análoga a los resultados de la transferencia Western, un análisis de citometría de flujo puso de manifiesto un nivel significativamente superior de expresión de proteínas de fractalquina en HAE hechas crecer en placas de poliestireno de cultivo de tejidos. Aunque la expresión máxima de células endoteliales incluidas en matrices se alcanzó después de 16 horas de estimulación de citoquinas (22,8 \pm 5,7%), las células endoteliales hechas crecer en placas de poliestireno de cultivo de tejidos alcanzaron una expresión de fractalquina máxima y significativamente aumentada después de 20 horas de estimulación con TNF\alpha y IFN-\gamma (76,5 \pm 8,6%; p < 0,0001).

Los datos experimentales indican una secreción reducida de fractalquina a partir de células endoteliales incluidas en matrices estimuladas con citoquinas. Los niveles de fractalquina fueron medidos también como niveles acumulativos de fractalquina soluble liberada en las materias sobrenadantes de cultivos endoteliales mediante un ensayo ELISA. Los niveles de fractalquina solubles fueron paralelos a los de los análisis por transferencia Western y citometría de flujo: la fractalquina secretada a partir del crecimiento de HAE en placas de poliestireno de cultivo de tejidos sobrepasó significativamente los niveles secretados por HAE incluidas en matrices (32,2 \pm 2,4 frente a 13,8 \pm 1,7 pg/ml después de 24 horas de cultivo; p < 0,0002).

Los datos experimentales indican una adhesión reducida de células NK a células endoteliales incluidas en matrices. Para estudiar relevancia funcional del descubrimiento de la presente invención, se realizó seguidamente un ensayo de adhesión con células NK arcadas con ^{51}Cr y HAE estimuladas con citoquinas hechas crecer en placas de poliestireno de cultivo de tejidos o incluidas en matrices. Como se pudo de manifiesto mediante un recuento Gamma, crecieron significativamente más células NK adheridas a HAE alogeneicas hechas crecer en placas de poliestireno de cultivo de tejidos que las incluidas en Gelfoam (6335 \pm 420 frente a 1735 \pm 135 cpm; p < 0,0002; Fig. 5). La importancia de la expresión de fractalquina para la adhesión de células NK a células endoteliales activadas pudo ser demostrada porque la adición de 20 \mug/ml de anti-CX3CL1 aumentó significativamente la adhesión de células NK a HAE estimuladas con citoquinas en \sim74% (p < 0,005 frente a la ausencia de anti-CX3CL1). Las células NK no se adhirieron a placas de poliestireno de cultivo de tejidos ni a Gelfoam solamente.

Modulación de la respuesta inmune en ratones de reactividad inmune realzada

Las inyecciones de células endoteliales indujeron la formación de anticuerpos en ratones. En ratones B6 sin inmunizar, tres inyecciones subcutáneas en serie de 5 x 10^{5} PAE elevaron los anticuerpos IgG_{1} específicos de células endoteliales en circulación (2210 \pm 341 frente a una intensidad de fluorescencia media (MFI) de 53 \pm 12; p < 0,0001) y de IgM, en comparación con inyecciones de solución salina (136 \pm 39 frente a 49 \pm 14 MFI; p < 0,02). No hubo anticuerpos IgG_{2a} específicos de PAE en el suero de otros grupos de ratones (datos no mostrados) 42 días después de la primera inyección de PAE.

Las células endoteliales incluidas en matrices evitaron la reactividad inmune humoral. La implantación de células endoteliales xenogeneicas incluidas en matrices, en un contraste considerable con la implantación de células libres, no consiguieron inducir una respuesta inmune humoral significativa en ratones sin inmunizar (d 42, IgG_{1}: 210 \pm 102 frente a 735 \pm 327 MFI; p < 0,001; IgM: 60 \pm 11 frente a 299 \pm 51 MFI; p < 0,001; Figuras 7A y 7B). La inyección de PAE libres en ratones estimulados en serie previamente sensibilizados dio lugar a una respuesta inmune humoral elevada con un aumento pronunciado de los niveles de anticuerpos IgG_{1} (3795 \pm 448 MFI; p < 0,0002 frente a ratones sin inmunizar) y un aumento ligero en IgM específico de PAE (164 \pm 28 MFI). En un contraste considerable, la implantación de PAE incluidas en matrices en ratones estimulados en serie previamente sensibilizados no aumentó los anticuerpos específicos de PAE: Además de ello, los niveles de anticuerpos específicos para las PAE inyectadas aumentaron lentamente con el tiempo (IgG_{1}: 1578 \pm 334 MFI; p < 0,0005 frente a PAE libre; IgM: 69 \pm 5 MFI; p < 0,01 frente a PAE libre; Figures 7A y 7B).No hubo ningún aumento de anticuerpo IgG_{2a} específicos de PAE en los cuatro grupos de tratamiento (datos no mostrados) apoyando los informes previos de una respuesta de Th2 dominante en el xenoinjerto.

Las Figura 7A y 7B representan gráficamente los valores de IgG_{1} (Figura 7A) y de IgM (Figura 7B) específicos de PAE en circulación en ratones estimulados en serie sin inmunizar y previamente sensibilizados después de una implantación subcutánea de PAE no incluidas o incluidas en matrices. La representación gráfica de los resultados de todos los ratones (n= 12/grupo hasta el día 70, n=6/grupo los días 71-132 posteriores a la implantación) demuestra diferencias significativas entre la implantación de PAE incluidas en matrices libres. Los niveles de anticuerpos después de la implantación de PAE incluidas en matrices disminuyen lentamente. Los datos son expresados como valores medio \pm CD.

Las células endoteliales incluidas en matrices son inductores escasos de la inmunidad celular. Los análisis ELISPOT pusieron de manifiesto una frecuencia elevada de esplenocitos productores de citoquinas (IL-4, IL-10) (Th)2 de células HELPER T xenogeneicas en ratones estimulados en serie sin inmunizar y previamente sensibilizados 90 días después de la implantación de PAE libres pero no después de la implantación de PAE incluidas en matrices. La frecuencia de esplenocitos xenorreactivos en ratones estimulados en serie previamente sensibilizados sobrepasó la activación y diferenciación de esplenocitos xenorreactivos en ratones sin inmunizar que recibieron PAE libres (IL-4: 907 \pm 59 frente a 680 \pm 129; p < 0,02; IL-10: 1096 \pm 94 frente a 888 \pm 151 número de manchas; p < 0,02; Figuras 8A y 8B). Sin embargo, en comparación con la implantación de PAE incluidas en matrices en ratones sin inmunizar, la implantación de PAE incluidas en matrices en ratones estimulados en serie previamente sensibilizados provocó un aumento ligero en IL-4 (322 \pm 75 frente a 199 \pm 99 número de manchas; p < 0,05; p < 0,0005 frente a PAE libres; Figura 8A) pero no en esplenocitos xenorreactivos productores de IL-10 (403 \pm 142 frente a 451 \pm 135 número de manchas; p = 0,27; p < 0,001 frente a PAE libres; Figura 8B). Estaban presentes significativamente menos esplenocitos productores de citoquinas Th2 en ratones estimulados en serie previamente sensibilizados que recibieron PAE incluidas en matrices en comparación con ratones sin inmunizar que recibieron PAE libres (p < 0,001). La frecuencia de esplenocitos productores de citoquinas Th1 (IFN-\gamma e IL-2) no difirió significativamente entre los cuatro grupos de tratamiento, apoyando nuevamente una función predominante de Th2 en la xenorreactividad (datos no mostrados).

Las Figuras 8A y 8B representan gráficamente las frecuencias de células productoras de citoquinas xenorreactivas en receptores después de la implantación de PAE libres o PAE incluidas en matrices en ratones sin inmunizar y estimulados en serie previamente sensibilizados. Los datos se expresan como valores medios \pm ECD. Los receptores sin inmunizar y estimulados en serie previamente sensibilizados de PAE libres exhibieron frecuencias aumentadas de esplenocitos productores IL-4 (Figura 8A) e Il-10 (Figura 8B) en comparación con los receptores de PAE incluidas en matrices.

El aumento de esplenocitos productores de citoquinas en ratones que recibieron PAE no incluidas fue paralelo a un aumento de células T efectoras CD4+ y CD8+ a lo largo del tiempo (CD4+: 44 \pm 2 ratones sin inmunizar, 54 \pm 4% ratones previamente sensibilizados, p < 0,05; CD8+: 20 \pm 2; 21 \pm 2%; Figuras 9A y 9B). Consecuentemente la diferenciación de células T en células CD44^{alto}/CD62L^{bajo} fue significativamente mutada en ratones estimulados en serie sin inmunizar y previamente sensibilizados expuestos PAE incluidas en matrices (CD4+: 22 \pm 2 ratones sin inmunizar, 21 \pm 3% ratones previamente sensibilizados; p < 0,01 frente a PAE libres; CD8+: 12 \pm 2; 14 \pm 3%; p < 0,02 frente a PAE libres; Figuras 9A y 9B). Las células T efectoras CD4+ sobrepasaron las CD8+ 1,7-2,6 en todos los grupos de tratamiento. Se apreció una considerable correlación entre la frecuencia de esplenocitos productores de citoquinas Th2 y el alcance de células de diferenciación de células T en forma de CD4+ CD44^{alto}/CD62L^{bajo} (IL-4: r = 0,81; p < 0,0001; IL-10 r = 0,88; < 0,0001; Figura 10) y CD8+ CD44^{alto}/CD62L^{bajo} (IL-4: r= 0,79; p < 0,0001; IL-10 r = 0,86; p < 0,0001) a través de todos los grupos de tratamiento en el día 132.

Las Figura 9A y 9B representan gráficamente células efectoras CD4+ (Figura 9A) y CD8+ (Figura 9B) significativamente aumentadas en ratones que recibieron PAE libres. Los esplenocitos recuperados de las ratones fueron analizados mediante citometría de flujo usando CD62L y CD44 como marcadores de células T efectoras. No hubo diferencia entre ratones sin inmunizar y estimulados en serie previamente sensibilizados cuando las células endoteliales fueron incluidas en matrices. Los datos se expresan como valores medios \pm CD.

Las Figuras 10A y 10B son correlaciones de Spearman de las frecuencias de esplenocitos productores de citoquinas Th2 y el alcance de la diferenciación de células T en células efectoras. La figura 10A representa gráficamente la frecuencia de citoquinas IL-2. La Figura 10B representa gráficamente la frecuencia de citoquinas IL-10. Las correlaciones sugieren que los niveles de citoquinas se correlacionan linealmente con la inducción de Células T efectoras. El área de la elipse de densidad representa el intervalo de confienaza de 95%.

Las células endoteliales incluidas en matrices están protegidas de un deterioro lítico. La capacidad de los linfocitos del hospedante para deteriorar células endoteliales xenogeneicas fue caracterizada en el día 70 y el día 132. Plataforma de liberación de calceína ha relaciones de células efectoras: dianas de 25:1. Para esta relación, el deterioro de células endoteliales era 1,6 veces mayor en ratones sin inmunizar y 1,7 veces mayor en ratones previamente sensibilizados cuando recibieron PAE no incluidas en lugar de las incluidas en matrices en d 70 (p < 0,001). Estas relaciones aumentaron a 1,9 y 2,3, respectivamente después de 132 días (p < 0,0005; Figura 11). Debe apreciarse que el deterioro endotelial en ratones previamente sensibilizados que recibieron PAE incluidas en matrices fue significativamente inferior si se compara con ratones sin inmunizar que recibieron PAE libres (20,9 \pm 2,3 frente a 37,1 \pm 3,4% AFU; p < 0,001; Figura 11).

La capacidad de los linfocitos del hospedante para deteriorar células endoteliales xenogeneicas fue caracterizada en el día 70 y el día 132. La Figura 11 representa gráficamente el grado de deterioro de células endoteliales en ratones sin inmunizar y previamente sensibilizados cuando las células endoteliales son libres o incluidas en matrices. El deterioro endotelial a través de una lisis se reduce significativamente en ratones sin inmunizar y previamente sensibilizados que recibieron PAE incluidas en matrices en comparación con las libres. Fueron marcadas 2 x 10^{4} PAE con calceína y se incubaron con 5 x 10^{5} esplenocitos aislados después de 70 y 132 días respectivamente.

Plataforma de liberación de calceína a relaciones de efectoras: dianas de 25:1. Para esta relación, el deterioro de células endoteliales fue 1,6 veces mayor en ratones sin inmunizar y 1,7 veces mayor en ratones previamente sensibilizados cuando recibieron PAE no incluidas en lugar de las incluidas en matrices en el día 70 (p < 0,001). Estas relaciones aumentaron hasta 1,9 y 2,3, respectivamente, después de 132 días (p < 0,0005; Figura 11). Debe apreciarse que el alcance de deterior endotelial en ratones previamente sensibilizados que recibieron PAE incluidas en matrices fue significativamente inferior si se compara con ratones sin inmunizar que recibieron PAE libres (20,9 \pm 2,3 frente a 37,1 \pm 3,4% AFU; p < 0,001; Figura 11).

Modulación de la maduración de células dendríticas

Las células dendríticas son células presentadas a antígenos que tienen la capacidad única tanto de iniciar como de regular respuestas inmune. Las células dendríticas maduras favorecen la diferenciación de células T en células efectora y de memoria, mientras que las células dendríticas inmaduras presentan (auto)-antígenos de una forma tolerogénica. Las células dendríticas están implicadas en una diversidad de enfermedades mediadas por células endoteliales y las células endoteliales activadas inducen su maduración. Como las células dendríticas son críticas en la reactividad inmune, se deduce que la maduración de células dendríticas accionada por células endoteliales es dependiente del contacto células endoteliales-matriz.

Preparación, cultivo y maduración de células dendríticas: Se recogió sangre periférica de voluntarios sanos y se fraccionó sobre Ficoll-Paque (Sigma Chemicals, St. Louis, MO) mediante un procedimiento estándar. Para derivar las células dendríticas, se cultivaron células monocíticas de sangre periférica total (PB-MC a 2 x 10^{6} células/ml en medios completos (RPMI 1640, suero de ternera inactivado con calor al 10%, piruvato de sodio 0,1 mM (Life Technologies)) durante 1,5 horas en matraces de cultivos de tejidos. A continuación de la incubación, las células no adherentes fueron separadas mediante un lavado intensivo con una solución de HBSS (Life Technologies). Las células adherentes restantes fueron seguidamente cultivadas en medios completos que contenían 20 mg/ml de interleucina (IL)-4 y 20 ng/ml de GM-CSF (Peprotech, Rocky Hill, NJ) durante 5 días en un incubador de CO_{2} a 37ºC. Las células restantes eran semi- o no adherentes y MHC II^{bajo}/CD14^{alto}/CD83^{-} (datos no mostrados).

Para una maduración adicional, se recolectaron células dendríticas adherentes y no adherentes, se lavaron intensivamente, se sometieron a recuento y se estimularon 5 x 10^{5} células dendríticas con un combinado de citoquinas (10 ng/ml de IL-1\beta, 1.000 U/ml de IL-6, 20 ng/ml de IL-4, GM-CSF y TNF-\alpha; todos ellos de la empresa Peprotech), 1,5 x 10^{5} HAE o 1,5 x 10^{5} PAE durante 48 horas. Las células endoteliales fueron presentadas en forma de suspensiones después de haberlas hecho crecer hasta confluencia sobre placas de cultivo de tejidos o bien incluidas adherentes en superficies con matrices Gelfoam. Cada ensayo se repitió al menos cuatro veces. Después de la maduración, las células dendríticas fueron aisladas de cualesquiera células endoteliales contaminantes con anticuerpos CD1a marcados con gránulos magnéticos (Miltenyi, Bergisch-Gladbach, Alemania). Un análisis por citometría de flujo puso de manifiesto una pureza de 98% de las DC aisladas (datos no mostrados).

PCR en tiempo real: se extrajo RNA total de células dendríticas aisladas y las restantes células endoteliales usando un estuche de ensayo Rneasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) Según las instrucciones del fabricante. Se sintetizó DNA complementario usando reactivos de transcripción inversa TaqMan de la empresa Applied Biosystems (Foster City, CA). El análisis PCR en tiempo real se realizó con un dispositivo Opticon Real Time PCR Machine (MJ Research, Waltham, MA) usando una mezcla SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) y cebadores seleccionados. Los datos de la reacción se recogieron y se analizaron mediante el programa de ordenador Opticon complementario. La cuantificación relativa de la expresión génica se calculó con curvas estándar y se normalizó respecto a GAPDH.

Citometría de flujo: Las suspensiones de células dendríticas o células endoteliales se lavaron y se volvieron a poner es suspensión 3 x 10^{5} células en tampón FACS (PBS que contiene 0,1% de BSA y 0,1% de azida de sodio; Sigma Chemicals). Un análisis citométrico de flujo estándar valoró la expresión superficial de diversos marcadores. Los anticuerpos monoclonales directamente conjugados con ficoeritrina (PE) o isotiocianato de fluoresceína (FITC) fueron usados en una análisis citométrico de flujo de color único: PE-CD1a (clon HI149, IgG_{1}), FITC-CD3 (clon UCHT1, IgG1), PE-CD14 (clon TÜK4, IgG_{2a}), PE-CD31 (clon WM59, IgG_{1}), FITC-CD40 (clon 5C3, IgG_{1}), FITC-CD54 (clon 15.2, IgG_{1}), FITC-CD80 (clon BB1, IgM), FITC-CD83 (clon HB15e, IgG_{1}), FITC-CD86 (clon 2331, IgG_{1}), FITC-CD106 (clon 51-10C9, IgG_{1}), FITC-HLA-DP,DQ,DR (clon CR3/43, IgG_{1}), receptor de tipo FITC-Toll (TLR)2 (clon TL2.3, IgG_{2a}), y FITC-TLR4 (clon HTA125, IgG_{2a}). Se usaron, respectivamente, anticuerpos testigos de isotipos apropiados (PE-IgG_{1} de ratón, PE-IgG_{2a}, FITC-IgG_{1}, FITC-IgG_{2a}, FITC-IgM). Los anticuerpos fueron adquiridos de la empresa DakoCytomation (Carpintería, CA), Serotec (Raleigh, NC) o PharMingen (San Diego, CA). Después de teñir, las células se lavaron y se fijaron en paraformaldehído al 1% antes de un análisis en un instrumento FACScalibur y programa de ordenador CellQuest (Becton Dickinson, Mountain View, CA).

Actividad endocítica: La actividad endocítica de las células dendríticas se midió mediante absorción de dextrano conjugado a FITC (PM 40.000; Molecular Probes, Eugene, OR) como se describió anteriormente. En resumen, las células dendríticas en diversos estados de maduración fueron incubadas en medios completos con 1 mg/ml de dextrano conjugado a FITC durante 1 hora a 37ºC para medir la absorción específica o a 4ºC para medir la unió no específica. Las células seguidamente se lavaron intensivamente y se analizaron mediante citometría de flujo como se describió anteriormente.

Ensayo de reacción de linfocitos mixtos: Se prepararon células T CD3+ de un donante no relacionado a partir de PBMC total mediante selección negativa usando agotamiento de anticuerpos y gránulos magnéticos según las instrucciones del fabricante (Dynal Biotech, Lake Success, NY). La fracción no magnética contenía más de 95% de células T CD3+, según se valoró mediante citometría de flujo. Se sembraron 2 x 10^{5} células T CD3+/pocillo en placas de fondo redondo de 96 pocillos. Las células de citoquinas purificadas o dendríticas maduradas con células endoteliales fueron irradiadas con radiación \gamma (3.000 rad a partir de una fuente de ^{137}Cs) y se añadieron a células T a 1 x 10^{4}, 4 x 10^{3} o 2 x 10^{3} células/pocillo para proporcionar relaciones finales de 1:20 1:50 o 1:100 CD: células T. En el día 5, se añadieron 5,1 \muCi de ^{3}H-timidina (Perkin-Elmer, Boston, MA) a cada pocillo. Las células se recolectaron 18 horas después y la absorción de ^{3}H-timidina se cuantificó usando un contador \gamma Packard TopCount (GMI, Ramsey MI).

Transferencia Western: Después de la separación de células dendríticas, las células endoteliales se lavaron en tampón PBS y se prepararon lisados celulares mediante incubación con tampón de lisis (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, Ph 7,5, 1% de Triton x-100, 1% de desoxicolato, 0,1% de SDS e inhibidor de proteasa; Roche, Indianapolis, IN). Las muestras Se separaron en geles 4-20% Ready Tris-HCl (BioRad Laboratories, Hercules, CA). Las proteínas se transfirieron seguidamente sobre membranas PVDF (Millipore, Billerica, MA) usando tampón de transferencia de glicina-Tris. Unos lisados de células completas Ju rkat (TLR2) o HL-60 (TLR4, ambos de la empresa Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA) sirvieron como testigos. Las membranas fueron bloqueadas en Tampón bloqueante Starting Block (Pierce, Rockford, IL) durante 1 hora. Las membranas bloqueadas se incubaron con anticuerpos anti-humanos TLR2 (dilución 1:250 en tampón bloqueante) de conejo o TLR4 (dilución 1:200, ambos de la empresa Santa Cruz Biotechnologies) durante una noche a 4ºC. Las membranas se lavaron seguidamente tres veces a temperatura ambiente con tampón de lavado que consistía en PBS con 0,05% de Tween 80 seguidamente se incubaron con anticuerpo secundario, un IgG anti-conejo de cabra conjugado a peroxidasa de rabanillo (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz CA) a una dilución de 1:1.000 en tampón bloqueante durante 2 horas a temperatura ambiente, seguido de lavado en cinco cambios de tampón de lavado. Para una detección de las bandas TLR, la transferencia se incubó con sustrato quimioluminiscente (Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus kit; Perkin-Elmer) según las instrucciones del fabricante seguido de exposición y análisis en un dispositivo FluorChem SP (Alpha Innotech, San Leandro, CA).

Unas células endoteliales no adherentes dirigieron la maduración de las células dendríticas derivadas de monocitos. En concordancia con las observaciones anteriores, los monocitos se diferenciaron en forma de células dendríticas inmaduras después de cinco días de cultivo en GM-CSF y de IL-4 (datos no mostrados). Una estimulación de citoquinas prologada con IL-1\beta, TNF-\alpha e IL-6 durante 48 horas sobrereguló las moléculas co-estimuladoras (CD40: 2,3 veces en comparación con células dendríticas inmaduras, CD8: 1,9 veces, CD86: 1,6 veces) y HLA-DR (1,5 veces) junto con la expresión de CD83 (2,2 veces) como un marcador de maduración de células dendríticas establecidas. La exposición a suspensiones de solución salina de células endoteliales alo- y xeno-geneicas después de un crecimiento hasta confluencia en placas de cultivo de tejidos indujo la maduración completa de células dendríticas derivadas de monocitos hasta un grado similar al de un tratamiento prolongado con un combinado de citoquinas. Las HAE o PAE solas indujeron la expresión de moléculas co-estimuladoras de células dendríticas con aumentos en CD40 (HAE: 2,1 veces, PAE:2,5 veces en comparación con células dendríticas inmaduras), CD80 (2,1 veces, 2,3 veces; p < 0,05 frente a estimulación de citoquinas), CD86 (1,6 veces, 1,7), HLA-DR (1,7 veces, 2,2 veces; p < 0,05 frente a HAE, p < 0,002 frente a estimulación de citoquinas) y CD83 (2,6 veces; p < 0,05 frente a estimulación de citoquinas, 3,2 veces; p < 0,02 frente a HAE, p < 0,001 frente a estimulación de citoquinas).

De una forma similar, la expresión de TDR2 y 4 de células dendríticas fue sobre-regulada tras una exposición a suspensiones salinas de HAE (1,5 y 2,5 veces, respectivamente) hasta un alcance similar o mayor a la estimulación de citoquinas (1,5 veces para ambas TLR en comparación con células dendríticas inmaduras. Este efecto fue incluso más pronunciado después de una incubación conjunta de células dendríticas con PAE xenogeneicas no adherentes (TLR2: 2,4 veces; p < 0,05 frente a estimuladas con citoquinas y HAE, TLR4: 3,0 veces; p < 0,05 frente a HAE, p < 0,001 frente a estimulación de citoquinas). Se pudieron obtener resultados análogos a partir de niveles de transcriptos de mRNA. Adicionalmente, las células dendríticas maduradas con citoquinas o células endoteliales no adherentes mostraron una sobre-regulación significativa de IL 12 p40 mRNA (inmaduras: 0,03 \pm 0,02 unidades relativas (RU, estimuladas con citoquinas: 0,23 \pm 0,03 RU, p < 0,002, estimuladas con HAE: 0,31 \pm 0,05 RU, p < 0,001, estimuladas con PAE: 0,28 \pm 0,03, p < 0,002).

La incubación con células endoteliales adherentes a sustratos dio lugar a una maduración incompleta de células dendríticas y sostiene la actividad endocítica. En un considerable contraste con el cultivo conjunto con células endoteliales no adherentes, el cultivo conjunto de células dendríticas con HAE adherentes a sustratos incluidas en una matriz tridimensional restringió la maduración de células dendríticas: estas células dendríticas mostraron solamente una sobre-regulación débil de CD40 (HAE adherente a sustrato: 1,5 veces en comparación con DC inmaduras, p < 0,02 frente a HAE no adherentes, PAE adherentes a sustratos: 1,3 veces, p < 0,002 frente a PAE no adherente), CD80 (HAE y PAE adherentes a sustratos: 1,3 veces, p < 0,005 frente a EC no adherente), CD86 (HAE adherentes a sustratos: 1,1 veces, PAE: 1,2 veces, ambas p < 0,005 frente a EC no adherente), CD83 (HAE adherentes a sustratos: 1,5 veces, p < 0,001 frente a HAE no adherentes, PAE:1,4 veces, p < 0,0002 frente a PAE no adherente) y TLR4 (HAE adherentes a sustratos: 1,5 veces, TAE: 1,3 veces, ambos p < 0,005 frente a células endoteliales no adherentes). La incubación conjunta con células endoteliales adherentes a sustrato no consiguió inducir la expresión de HLA-DR y TLR2 en células dendríticas en absoluto (p < 0,005). La incubación con matrices Gelfoam vacías solamente no tuvo ningún efecto sobre la maduración de células dendríticas derivadas de monocitos (datos no mostrados). Un análisis PCR en tiempo real puso de manifiesto el mismo modelo de maduración incompleta cuando las células dendríticas fueron expuestas a células endoteliales alo- y xeno-geneicas adherentes a sustratos. La inducción de IL12 p40 fue de forma análoga significativamente más débil cuando las células dendríticas habían sido maduradas con células endoteliales adherentes a sustratos (estimuladas con HAE: 0,06 \pm 0,01, p < 0,005, estimuladas con PAE 0,07 \pm 0,02, p < 0,02).

Las células dendríticas inmaduras capturaron ineficazmente antígeno y exhibieron un nivel elevado de endocitosis. La absorción de dextrano conjugada a FITC aumentó cuando los monocitos fueron cultivados durante 3 y 5 días en GM-CSF e IL-4 (423,3 \pm 121,8 de intensidad media de fluorescencia (MFI), 239,8 \pm 42,8 MFI, p < 0,0001). La maduración está acompañada normalmente de un aumento simultáneo de la función de presentación de antígenos y una capacidad reducida para la captura de antígenos a través de la actividad endocítica. La absorción de dextrano disminuye normalmente con una estimulación de citoquinas continuada (89,7 \pm 14,7 MFI, p < 0,0001 frente a d5) y con una incubación conjunta con HAE no adherentes (92 \pm 20,3 MFI) o PAE (82,4 \pm 16,5 MFI). En un contraste considerable, las células dendríticas retuvieron su actividad endocítica cuando las células endoteliales fueron presentadas en un estado tridimensional adherente a sustratos y la absorción de dextrano aumentó considerablemente (HAE adherentes a sustratos: 203,2 \pm 11,3 MFI, p < 0,05 frente a d5, p < 0,0001 frente a HAE no adherentes; PAE adherentes a sustratos: 254,3 \pm 32 MFI, p < 0,0001 frente a PAE no adherente).

Las células dendríticas exhibían una actividad de proliferación de células T reducida después de un cultivo con células endoteliales adherentes a sustratos. La capacidad de favorecer la diferenciación de células T en forma de células efectoras y de memoria es un marcador funcional importante para el grado de maduración de células dendríticas. Aunque las células dendríticas expuestas a células endoteliales tratadas con citoquinas y no adherentes indujeron la proliferación de células T sobre el espectro completo de relaciones ensayadas de células dendríticas: células T (74789 \pm 1777, HAE: 97522 \pm 1630 y PAE: 101616 \pm 4302 cpm), esta capacidad fue significativamente mutada en células dendríticas conjuntamente incubadas con HAE adherentes a sustratos (18320 \pm 1000 cpm, p < 0,002) y PAE (20080 \pm 683 cpm, p <
0,0001).

La activación de células endoteliales adherentes a sustratos se redujo cuando fueron conjuntamente cultivadas con células dendríticas. Una PC en tiempo real, citometría de flujo y análisis por transferencia Western puso de manifiesto una activación reducida de HAE y PAE después de un cultivo conjunto durante 2 días con células dendríticas. Después de un aislamiento basado en gránulos magnéticos de las células dendríticas, las células restantes eran más de un 95% puras para el marcador específico de células endoteliales CD31 (datos no mostrados). Un análisis PCR en tiempo real demostró niveles reducidos de expresión de mRNA para moléculas de adhesión, CD58, HLA-DR y moléculas TRL sobre HAE adherentes a sustratos en comparación con sus correspondientes no adherentes. Los niveles reducidos de expresión de mRNA se plasmaron en una expresión de superficie reducida e intracelular con expresión 3,6 veces inferior de ICAM-1 sobre células adherentes a sustratos en comparación con HAE no adherentes (disminución de 1,3 veces para PAE), disminución de 4,9 veces de VCAM-1 para HAE (PAE:2,7 veces) y disminución de 16 veces de HLA-DR para HAE (PAE: disminución de 23 veces). Un análisis de densitometría de las transferencias Western puso de manifiesto una expresión aumentada de TLR2 (HAE: aumento de 1,5 veces, PAE: aumento de 1,6 veces; p < 0,05) y TLR4 (HAE: aumento de 2,3 veces, PAE: aumento de 2 veces; p < 0,01) en células endoteliales no adherentes en comparación con células endoteliales adherentes a sustratos después de una incubación conjunta con células dendríticas durante 48
horas.

Por tanto, aunque las células endoteliales no adherentes aumentaron la maduración de células dendríticas derivadas de monocitos hasta un alcance similar al observado con un combinado de citoquinas, la incubación conjunta con células endoteliales adherentes a sustratos indujo solamente una sobre-regulación menor de niveles de transcriptos y proteínas de mRNA en moléculas de adhesión, co-estimuladoras y HLA-DR sobre células dendríticas. Las células dendríticas conjuntamente incubadas con células endoteliales adherentes a sustratos carecían también de sobre-regulación de expresión de IL12 mRNA y CD83 que sirve como marcadores de maduración directa. El estado inmaduro de las células dendríticas después de un cultivo conjunto con células endoteliales adherentes a sustratos fue reflejado por una capacidad sostenida para absorber dextrano. Funcionalmente, aunque las células dendríticas expuesta a células endoteliales no adherentes mostraban una actividad estimuladora aumentada de células T en reacciones mixtas de linfocitos, la proliferación de células T después de una exposición a células dendríticas maduradas con células endoteliales adherentes a sustratos era significativamente más débil.

Experimentos adicionales: efectos sobre la respuesta inmune

Tratamiento del rechazo de trasplantes: Se identificó una población de receptores de órganos normales (sin dificultades inmunes). La población se dividirá en tres grupos, uno de los cuales recibirá una cantidad eficaz del material implantable de la presente invención antes de recibir un órgano trasplantado. Un segundo grupo recibirá una cantidad eficaz de material implantable de la presente invención coincidente con la recepción de un órgano trasplantado. Un tercer grupo no recibirá ningún material implantable de la presente invención, pero recibirá un órgano trasplantado. La reducción y/o mejora de una respuesta inmune y/o una respuesta inflamatoria será verificada a lo largo del tiempo evaluando la proliferación de linfocitos de células T y linfocitos de células B en muestras de suero y verificando la duración de la aceptación del órgano trasplantado. Es de esperar que los candidatos que reciben una cantidad eficaz del material implantable de la presente invención mostrarán una reducción en la proliferación de linfocitos y/o un aumento en la duración de la aceptación del órgano trasplantado.

Tratamiento de una enfermedad autoinmune: Se identificó una población de pacientes diagnosticados con una enfermedad autoinmune. La población se dividirá en dos grupos, uno de los cuales recibirá una cantidad eficaz del material implantable de la presente invención. La reducción y/o la mejora de una respuesta autoinmune y/o una respuesta inflamatoria se verificará a lo largo del tiempo evaluando la proliferación de linfocitos de células T y linfocitos de células B en muestras de suero y verificando la intensidad y la duración de los síntomas asociados con la enfermedad autoinmune. Es de esperar que los candidatos que reciben una cantidad eficaz del material de la presente invención muestren una reducción en la proliferación de linfocitos y/o una reducción en la frecuencia y/o la intensidad de los síntomas.

Claims (28)

1. Un material implantable, que comprende una matriz biocompatible y células endoteliales ancladas o incluidas, células de tipo endotelial o sus análogos para ser usado en la reducción de una respuesta inmune o una reacción inflamatoria en un método que comprende la etapa de proporcionar dicho material implantable a un receptor en una cantidad suficiente para reducir la respuesta inmune o la reacción inflamatoria en dicho receptor, en que la matriz tiene una configuración tridimensional de forma que las células ancladas y/o incluidas pueden crear y ocupar un hábitat multi-dimensional.

2. El material de la reivindicación 1, en el que la etapa de provisión es anterior, coincidente o posterior a la administración a dicho receptor de una o más dosis de una célula, tejido u órgano de un donante singeneico o no singeneico.

3. El material de la reivindicación 1, en el que la etapa de provisión es anterior, coincidente o posterior a la existencia de la respuesta inmune o reacción inflamatoria.

4. Un material implantable, que comprende una matriz biocompatible y células endoteliales, células de tipo endotelial o sus análogos ancladas o incluidas para ser usado en la inducción de aceptación o tolerancia en un paciente en un método que comprende la etapa de proporcionar dicho material implantable de forma anterior, coincidente o posterior al trasplante de células, tejidos u órganos de de autoinjertos, xenoinjertos o aloinjertos, en dicho paciente en una cantidad eficaz para inducir aceptación o tolerancia en dicho paciente, en que la matriz tiene una configuración tridimensional de forma que las células ancladas y/o incluidas pueden crear y ocupar un hábitat multi-dimensional.

5. El material de la reivindicación 4, en el que las células, tejidos u órganos del autoinjerto, xenoinjerto o aloinjerto comprenden células no endoteliales.

6. Un material implantable, que comprende una matriz biocompatible y células endoteliales, células de tipo endotelial o sus análogos ancladas o incluidas, para ser usado en la reducción de la inmunogenicidad de antígenos del donante en un método que comprende la etapa de proporcionar dicho material implantable de forma anterior, coincidente o posterior a la introducción de dicho antígeno del donante en un receptor en una cantidad eficaz para reducir la inmunogenicidad de antígenos del donante, en que la matriz tiene una configuración tridimensional de forma que las células ancladas y/o incluidas pueden crear y ocupar un hábitat multidimensional.

7. El material de la reivindicación 6, en el que la inmunogenicidad de los antígenos del donante es una inmunogenicidad de antígenos de células del donante no endoteliales.

8. El material de la reivindicación 6 o la reivindicación 7, en el dicho donante y receptor son el mismo.

9. Un material implantable, que comprende una matriz biocompatible y células endoteliales ancladas o incluidas, células de tipo endotelial o sus análogos para ser usado en un método para trasplantar a un receptor un trasplante de células, tejidos u órganos singeneicos o no sigeneicos de forma anterior, coincidente o posterior al trasplante, de forma que dicha célula, tejido u órgano singeneico o no singeneico trasplantado no sea rechazado por dicho receptor, en el que la matriz tiene una configuración tridimensional de forma que las células ancladas y/o incluidas pueden crear y ocupar un hábitat multi-dimensio-
nal.

10. El material de la reivindicación 9, que comprende células no endoteliales.

11. Un material implantable, que comprende una matriz biocompatible y células endoteliales, células de tipo endotelial o sus análogos ancladas o incluidas, para ser usado en la reducción de una respuesta inmune o una reacción inflamatoria que resulta de la exposición a un inmunógeno exógeno en un método que comprende la etapa de proporcionar dicho material implantable a un receptor en una cantidad suficiente para reducir la respuesta inmune o la reacción inflamatoria en dicho receptor que resulta de la exposición a dicho inmunógeno exógeno, en que la matriz tiene una configuración tridimensional de forma que las células ancladas y/o incluidas pueden crear y ocupar un hábitat multi-dimensional.

12. El material de la reivindicación 1, reivindicación 4 o reivindicación 6, en que dicha etapa de provisión se produce de forma anterior, coincidente o posterior a la administración a dicho paciente de un agente inmunosupresor.

13. El material de la reivindicación 12, en el que dicho agente inmunosupresor reside en dicho material implantable durante la administración coincidente.

14. El material de la reivindicación 9, en el que el método comprende adicionalmente la etapa de administrar un agente inmunosupresor de forma anterior, coincidente o posterior al trasplante.

15. El material para ser usado de la reivindicación 1, reivindicación 4 o reivindicación 6, en que dicho receptor tiene una enfermedad autoinmune.

16. Un material implantable, para ser usado en un método para reducir una respuesta inmune a una célula, tejido u órgano no singeneico, en que dicho material implantable comprende una matriz biocompatible y ancladas o incluidas al mismo, células endoteliales, células de tipo endotelial o sus análogos, en que una cantidad eficaz de dicho material implantable reduce la respuesta inmune del receptor a dicha célula, tejido u órgano no singeneico y en que la matriz tiene una configuración tridimensional de forma que las células ancladas y/o incluidas pueden crear y ocupar un hábitat multi-dimensional.

17. El material de la reivindicación 16, en el que dicha célula, tejido u órgano no singeneico es el del receptor que padece una enfermedad autoinmune.

18. El material de la reivindicación 11, en el que la etapa de provisión es anterior, coincidente o posterior a la existencia de la respuesta inmune o reacción inflamatoria.

19. El material de la reivindicación 11, en el que dicho inmunógeno exógeno se produce de forma natural.

20. El material de la reivindicación 11, en el que dicho inmunógeno exógeno se selecciona entre el grupo que consiste en agentes farmacéuticos, toxinas, implantes quirúrgicos, agentes infecciosos y productos químicos.

21. El material de la reivindicación 11, en el que dicho inmunógeno exógeno es un estímulo exógeno seleccionado entre el grupo que consiste en estrés medioambiental, lesión y exposición.

22. El material de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las células endoteliales, células de tipo endotelial o análogos de las mismas (a) son células no endoteliales o (b) son análogos no naturales.

23. El material de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en el que las células endoteliales, células de tipo endotelial o sus análogos, cuando están anclados o incluidos en una matriz biocompatible, reducen una respuesta inmune humoral o celular del receptor respecto a una célula, tejido u órgano de un donante no singeneico.

24. El material de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en el que las células endoteliales, células de tipo endotelial o sus análogos, cuando están ancladas o incluidas en una matriz biocompatible exhiben una inmunogenicidad disminuida.

25. El material la reivindicación 24, en el que dicha inmunogenicidad disminuida es una expresión reducida de MHC o una capacidad reducida de unirse, activar o favorecer la maduración de células inmunes innatas, cuando están ancladas o incluidas en una matriz biocompatible, en que dichas células inmunes innatas se seleccionan entre el grupo que consiste en células NK, células dendríticas, monocitos y macrófagos.

26. El material de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en el que las células endoteliales, células de tipo endotelial o sus análogos, cuando están ancladas incluidas en una matriz biocompatible, exhiben una expresión reducida de MHC, moléculas co-estimuladoras o moléculas de adhesión.

27. El material de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en el que las células endoteliales, células de tipo endotelial o sus análogos, cuando están ancladas o incluidas en una matriz biocompatible y son conjuntamente cultivados con una célula dendrítica, inhiben la expresión mediante dicha célula dendrítica de HLA-DR, IL12, receptor de tipo Toll o CD83, favorecen la absorción de dextrano por dichas célula dendrítica o bloquean la proliferación de linfocitos inducidos por células dendríticas.

28. El material de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en el que las células endoteliales, células de tipo endotelial o sus análogos, cuando son conjuntamente cultivadas con células inmunes adaptativas, inhiben la proliferación, activación o diferenciación de dichas células, en que dichas células inmunes adaptativas se seleccionan entre el grupo que consiste en linfocitos B y linfocitos T.