ES2208973T3 - Celulas encapsuladas productoras de anticuerpos. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UNAS CAPSULAS QUE ENCAPSULAN CELULAS PRODUCTORAS DE ANTICUERPOS Y AL USO DE DICHAS CAPSULAS Y CELULAS ENCAPSULADAS, RESPECTIVAMENTE, PARA LA IMPLANTACION IN VIVO CON VISTAS A UNA ADMINISTRACION A LARGO PLAZO O PROLONGADA DE ANTICUERPOS QUE TIENEN UN INTERES TERAPEUTICO.

Description

Células encapsuladas productoras de anticuerpos.

La presente invención se refiere a células encapsuladas productoras de anticuerpos, especialmente anticuerpos pertenecientes a las diversas clases de inmunoglobulinas; IgM, IgD, IgGs, IgE e IgA, y el uso de dichas células encapsuladas para implantación in vivo destinada al suministro a largo plazo o suministro prolongado de anticuerpos de interés terapéutico.

Antecedentes

El suministro sistémico de anticuerpos citostáticos o citotóxicos específicos de tumores por células transformadas por ingeniería genética injertadas a pacientes puede ser muy valioso para tratamientos de vigilancia anti-cáncer a largo plazo a fin de prevenir la recidiva después de un tratamiento primario tal como cirugía, quimio- o radioterapia. Dicho enfoque podía utilizarse también para tratamiento de enfermedades víricas graves, tales como el SIDA, si se suministran anticuerpos neutralizantes del virus o anticuerpos tóxicos para las células productoras del virus. Adicionalmente, el suministro sistémico a largo plazo de anticuerpos puede ser útil también para propósitos más fundamentales tales como el desarrollo de nuevos modelos animales de enfermedades autoinmunes en las cuales la respuesta humoral contribuye al desarrollo de la enfermedad (Rose, N.R. y Bona, C., Immunol. Today, Vol. 14, 426-430 (1993)). Otra posible aplicación implica el desarrollo de una nueva técnica de ablación celular útil para estudiar in vivo diversos caminos de diferenciación y/o la importancia biológica de subconjuntos específicos de células mediante la liberación en el torrente sanguíneo de anticuerpos citotóxicos que reconocen marcadores de membrana específicos de tipos de células. En esta situación, los anticuerpos podrían destruir células diana, por ejemplo después de un paso específico de diferenciación, inmediatamente subsiguiente a la aparición de antígenos cognatos en la superficie de las células que se diferencian.

Se ha demostrado recientemente que - por la utilización de transferencia de genes retrovíricos - varios tipos de células (con inclusión de los fibroblastos de la piel, células miogénicas, hepatocitos y queratinocitos), susceptibles de modificación genética y de ser injertadas a pacientes, pueden producir anticuerpos que retienen la especificidad y la afinidad del anticuerpo originario (Noel, D. et al., Hum. Gene Ther., Vol. 8, 1219-1229 (1997)). Adicionalmente, el injerto de células miogénicas transformadas por ingeniería genética permite el suministro sistémico de anticuerpos clonados en el ratón durante al menos varios meses. Aunque estas observaciones prestan apoyo a la idea de que la transformación por ingeniería genética de células de los pacientes puede ser útil para terapias génicas a largo plazo basadas en anticuerpos, varias cuestiones limitan potencialmente la aplicación clínica de una tecnología de este tipo. En primer lugar, dicho enfoque terapéutico exigiría mucho trabajo y consumiría mucho tiempo. En segundo lugar, la modificación genética estable de células de los pacientes utiliza actualmente infección retrovírica ex vivo seguida por injerto autólogo a fin de evitar el rechazo de las células no coincidentes en MHC (MHC = complejo principal de histocompatibilidad) por el sistema inmune. Esto reduce la versatilidad del método dado que las células transformadas por ingeniería genética procedentes de un individuo no pueden ser utilizadas para otro. En tercer lugar, la transferencia génica eficiente y la expresión a largo plazo de transgenes en células que pueden utilizarse en protocolos de terapia génica son cuestiones que no han sido resueltas todavía por completo (Crystal, R.G., Science, Vol. 270, 404-410 (1995); Harris, J.D. y Lemoine, N.R., Trends Genet., Vol. 12, 400-405 (1996); Vile, R.G. et al., Mol. Biotechnol., Vol. 5, 139-158 (1996)).

En este contexto, la implantación de células transformadas por ingeniería genética encapsuladas en dispositivos inmunoprotectores en pacientes puede representar un enfoque más versátil y eficaz en costes. Por una parte, dicho método permitiría la utilización del mismo lote de células no coincidentes en MHC (seleccionadas posiblemente
in vitro para expresión óptima de anticuerpos) para varios pacientes y, por otra parte, la implantación de cápsulas es una operación quirúrgica muy simple. Adicionalmente, una técnica de este tipo podría ofrecer también la posibilidad de extirpación quirúrgica fácil de las células productoras de anticuerpos en caso de que el tratamiento precise ser terminado.

Para funcionamiento óptimo, los poros de las cápsulas deben satisfacer dos criterios. En primer lugar, tienen que ser suficientemente grandes para permitir que las moléculas de interés, tales como anticuerpos, salgan y permitir la entrada y difusión eficiente de los nutrientes necesarios para la supervivencia celular. En segundo lugar, aquéllos tienen que ser lo bastante pequeños para prevenir que las células encapsuladas abandonen las cápsulas e impedir la entrada de células del sistema inmune del hospedador.

La encapsulación de células en estructuras permeables que permitan la liberación de ciertas moléculas biológicamente activas pero proteja las células productoras de estas moléculas del sistema inmune del hospedador ha tenido cierto éxito (para una revisión, véase Chang, P.L. en Somatic Gene Therapy, P.L. Chang, ed. (CRC Press, Boca Ratón), p. 203-223 (1995)). Células que se han modificado genéticamente para producir la hormona del crecimiento humano (hGH) (Tai, I.T. y Sun, A.M., FASEB J. 7, 1061-1069 (1993)) o una forma secretada de adenosina-desaminasa humana (Hughes et al., Hum. Gene Ther. 5, 1445-1455 (1994)) han sido encapsuladas. En estos dos estudios citados, se encapsularon células en microcápsulas de poli-L-lisina-alginato y se demostró que las células sobrevivían durante largos periodos en cultivo. Esto fue acompañado por la producción a largo plazo de la enzima u hormona. Ulteriormente, se demostró que después del transplante de las microcápsulas en ratones, las células se mantenían viables durante un año y continuaban produciendo hGH, lo que demuestra que las cápsulas protegen las células transfectadas contra la destrucción por el sistema inmune del hospedador. No obstante, se comunicó también que las cápsulas de polilisina-alginato inducen una respuesta inflamatoria (Pueyo, M.E. et al., J. Biomater. Sci. Polym. Ed., Vol. 5, 197-203 (1993); Vanden-bossche, G.M. et al., J. Pharm. Pharmacol., Vol. 45, 115-120 (1993)).

La encapsulación de células ha sido consignada también utilizando otros materiales. Células de riñón de cría de hámster modificadas genéticamente para producir el factor de crecimiento de los nervios han sido encapsuladas en poliacrilonitrilo/cloruro de vinilo e implantadas en cerebro de rata. Las células encapsuladas sobrevivieron durante al menos 6 meses y continuaron produciendo NGF (Winn et al., Proc. Acad. Sci. USA 91, 2324-2328 (1994) y Deglon et al., Gene Ther., 2, 563 (1995)).

Células de hibridoma de rata que secretan un mAb dirigido contra IL-4 murino han sido encapsuladas en alginato e implantadas, intraperitoneal y subcutáneamente, en ratones (Savelkoul, H.F. et al., J. Immunol. Methods, Vol. 170, 185-196 (1994)). Sin embargo, los niveles de anticuerpos suministrados en el torrente sanguíneo disminuyeron al cabo de 14 días como consecuencia del deterioro de las cápsulas. Además, en este sistema se observó un 100% de incidencia de desarrollo de ascitis 30 días después de la implantación como resultado de la liberación de células procedentes de las cápsulas a la cavidad intraperitoneal.

Han sido encapsulados con éxito hepatocitos en un complejo polielectrolítico de sulfato de celulosa y poli(dimetildialilamonio) (Stange et al., Biomat. Art. Cells & Immob. Biotech. 21, 3443-352 (1993)). Más del 90% de los hepatocitos encapsulados retenían su viabilidad, y en contraste con los hepatocitos desarrollados como monocapas, las células encapsuladas exhibían una actividad metabólica incrementada.

Los mismos materiales de encapsulación se han utilizado para encapsulación de células de hibridoma productoras de anticuerpos (Merten et al., Cytotechnology 7:121-130, (1991). Las cápsulas se prepararon a partir de una solución de celulosa-sulfato de sodio (1,5%) y cloruro de poli(dimetil-dialilamonio (solución al 2%). Se ensayó la influencia de parámetros variables del proceso de encapsulación sobre las características de las cápsulas, el crecimiento de las células, y la producción de anticuerpos monoclonales, y se demostró que la encapsulación utilizando celulosa-sulfato de sodio como polianión y cloruro de poli-dimetil-dialilamonio, como policatión, es una herramienta adecuada para la preparación de cápsulas útiles para el cultivo de células de mamífero a densidades elevadas.

Como resumen de lo que se conoce de la técnica anterior, o bien la implantación in vivo de las células encapsuladas productoras de anticuerpos para suministro a largo plazo y/o la liberación prolongada de anticuerpos para terapia no se describen, ni siquiera se sugieren, o la implantación de cápsulas ha dado como resultado efectos secundarios graves tales como, v.g., respuestas inflamatorias.

Objeto de la invención

Así pues, es un objeto de la presente invención proporcionar cápsulas que contienen células productoras de anticuerpos, que permiten la liberación de los anticuerpos de las cápsulas, y que no provocan respuesta inflamatoria después de su implantación en un hospedador.

Sumario de la presente invención

La presente invención comprende, entre otras cosas, lo siguiente, aisladamente o en combinación:

Cápsulas que encapsulan células productoras de anticuerpos para uso en el tratamiento de enfermedades o trastornos sensibles a los anticuerpos producidos por dichas células, comprendiendo dichas cápsulas un núcleo que contiene dichas células y una pared porosa de cápsula que rodea dicho núcleo que es permeable a los anticuerpos producidos por dichas células, y estando formada dicha cápsula por un polisacárido o derivado de polisacárido que contiene grupo sulfato, o por un polímero sintético que contiene grupo sulfonato, y un policatión;

cápsulas como las indicadas anteriormente en las cuales dicho polisacárido o derivado de polisacárido que contiene grupo sulfato se selecciona del grupo que comprende sulfato de celulosa, acetato-sulfato de celulosa, sulfato de carboximetil-celulosa, sulfato de dextrano o sulfato de almidón;

cápsulas como las indicadas anteriormente en las cuales dicho polímero sintético que contiene grupo sulfonato es una sal poliestireno-sulfonato;

cápsulas como las indicadas anteriormente en las cuales dicho policatión es un polímero con grupos amonio cuaternario;

cápsulas como las indicadas anteriormente en las cuales dicho polímero con dichos grupos amonio cuaternario se selecciona de polidimetildialilamonio o polivinilbencil-trimetilamonio;

cápsulas como las indicadas anteriormente en las cuales dicho polisacárido que contiene grupo sulfato es sulfato de celulosa y dicho policatión es polidimetildialilamonio;

cápsulas como las indicadas en cualquiera de los párrafos anteriores en las cuales dichas células productoras de anticuerpos han sido modificadas genéticamente para producir anticuerpos clonados;

cápsulas como las indicadas en cualquiera de los párrafos anteriores en las cuales dichos anticuerpos pertenecen a las clases de inmunoglobulinas IgA, IgM, IgG, IgD o IgE;

cápsulas como las indicadas en cualquiera de los párrafos anteriores en las cuales dichos anticuerpos se seleccionan de anticuerpos que se fijan a un marcador de la superficie vírica, una célula de cáncer, un linfocito T o B implicado en los efectos patológicos de una enfermedad autoinmune, un marcador de superficie de un parásito o un antígeno deletéreo circulante;

cápsulas como las indicadas anteriormente en las cuales dicho anticuerpo tiene un efecto neutralizante;

cápsulas como las indicadas anteriormente para implantación en un cuerpo animal, con inclusión de un humano;

cápsulas como las indicadas anteriormente para implantación intraperitoneal o subcutánea;

uso de las cápsulas como las indicadas en cualquiera de los párrafos anteriores para producir una composición farmacéutica;

una composición farmacéutica que comprende cápsulas como las indicadas en cualquiera de los párrafos anteriores.

La invención

De acuerdo con la presente invención, se proporcionan cápsulas que contienen células productoras de anticuerpos, que permiten la liberación de los anticuerpos de las cápsulas, y que no provocan respuesta inflamatoria después de implantación en un hospedador.

Las células encapsuladas de acuerdo con la invención pueden prepararse por suspensión de las células productoras de anticuerpos en una solución acuosa de un polielectrólito (v.g. seleccionado de polisacáridos o derivados de polisacáridos que contienen grupo sulfato o de polímeros sintéticos que contienen grupo sulfonato), después de lo cual la solución en forma de partículas preformadas se introduce en un baño de precipitación que contiene una solución acuosa de un polielectrólito con carga opuesta (tal como por ejemplo un polímero con grupos amonio cuaternario).

Polisacáridos o derivados de polisacáridos que contienen grupo sulfato incluyen sulfato de celulosa, acetato-sulfato de celulosa, sulfato de carboximetilcelulosa, sulfato de dextrano o sulfato de almidón en forma de una sal, especialmente una sal de sodio. El polímero sintético que contiene grupo sulfonato puede ser una sal poliestireno-sulfonato, preferiblemente una sal de sodio.

Los polímeros con grupos amonio cuaternario incluyen polidimetildialilamonio o polivinilbencil-trimetilamonio, en la forma de una sal del mismo, preferiblemente una sal cloruro.

En una realización preferida de la invención, las células productoras de anticuerpos están encapsuladas en un complejo constituido por un complejo formado a partir de sulfato de celulosa y polidimetildialilamonio.

Métodos para la preparación de las cápsulas de sulfato de celulosa utilizadas para la preparación de las cápsulas de acuerdo con la invención han sido descritos detalladamente en el documento DE A1 40 21 050. Asimismo, la síntesis del sulfato de celulosa ha sido descrita en esta solicitud de patente. Métodos para una caracterización exhaustiva de las cápsulas de sulfato de celulosa han sido abordados en profundidad por H. Dautzenberg et al., Biomat., Art. Cells & Immob. Biotech., Vol. 21, 399-405 (1993). Cápsulas de sulfato de celulosa y su preparación han sido descritas también en el documento GB 2 135 954. Las propiedades de las cápsulas de celulosa, a saber, su tamaño, el tamaño de sus poros, el espesor de pared y las propiedades mecánicas dependen de varios factores tales como por ejemplo las circunstancias físicas en las cuales se han preparado las cápsulas, la viscosidad del baño de precipitación, su concentración iónica, la temperatura, la rapidez de adición de la suspensión células/sulfato de celulosa, la constitución del sulfato de celulosa, y otros parámetros descritos por el grupo de Dautzenberg.

Las cápsulas de acuerdo con la invención se pueden preparar suspendiendo las células productoras de anticuerpos en una solución que contiene 0,5-50%, preferiblemente 0,5-5%, de celulosa-sulfato de sodio y 5% de suero de ternero fetal en una solución acuosa, preferiblemente un tampón. Esta resuspensión se vierte luego gota a gota por medio de un sistema de dosificación (v.g. sistema de chorro de aire o sistema piezoeléctrico) en un baño de precipitación que contiene una solución agitada de 0,5-50%, preferiblemente 0,5-10% de cloruro de polidimetil-dialilamonio en una solución acuosa, preferiblemente un tampón. La formación de las cápsulas tiene lugar en cuestión de milisegundos y las cápsulas que contienen las células se mantienen en el baño de precipitación durante 30 segundos a 5 minutos, y se lavan después. La rapidez de este método asegura que las células no se someten indebidamente a estrés durante el procedimiento total (Stange et al., Biomat. Art. Cells & Immob. Biotech. 21, 343-352 (1993)).

Las cápsulas de acuerdo con la invención tienen un diámetro variable entre 0,01 y 5 mm, pero preferiblemente están comprendidas entre 0,1 y 3 mm. En consecuencia, pueden prepararse cápsulas que contengan un número variable de células. Utilizando el proceso de encapsulación de acuerdo con la invención, hasta 10^{10}, pero preferiblemente 10^{3}-10^{7} células productoras de anticuerpos pueden encapsularse en el complejo polielectrolítico.

Las cápsulas compuestas de sulfato de celulosa y polidimetildialilamonio tienen propiedades mecánicas excelentes y pueden fabricarse con un diámetro y tamaño de poro consistentes.

Las células encapsuladas pueden cultivarse en un medio de cultivo de células normal (cuya naturaleza depende de las células encapsuladas) en condiciones estándar de humedad, temperatura y concentración de CO_{2}. Durante este periodo de cultivo, la producción de anticuerpos por las cápsulas en el medio de cultivo de células puede demostrarse con tecnología de Transferencia Western o Elisa, utilizando antígenos específicos, y puede cuantificarse ulteriormente empleando segundos anticuerpos conjugados a colorantes fluorógenos.

Después de un periodo adecuado en cultivo (normalmente no inferior a 1 hora y que no excede de 30 días), las cápsulas que contienen las células pueden implantarse por medios quirúrgicos, sea directamente, o por inyección utilizando una jeringuilla en diversas áreas del cuerpo.

Los anticuerpos producidos por las células encapsuladas de acuerdo con la invención pueden estar basados en cualquier clase de inmunoglobulina útil para terapia, con inclusión, pero sin limitación, de anticuerpos modificados genéticamente.

Las células encapsuladas de acuerdo con la invención pueden ser células obtenidas de pacientes o de cualquier otra fuente, con inclusión de células humanas y animales, que han sido modificadas genéticamente para la producción de anticuerpos clonados.

Las células encapsuladas y las cápsulas, respectivamente, se utilizan especialmente para la implantación en un cuerpo animal vivo, con inclusión de un humano, para el tratamiento de enfermedades o trastornos sensibles a los anticuerpos liberados de dichas cápsulas. Después de la implantación de las cápsulas en un cuerpo animal por vía intraperitoneal y subcutánea, se ha encontrado que las cápsulas, especialmente las cápsulas de sulfato de celulosa, ofrecen una ventaja obvia con respecto a resistencia mecánica en comparación, por ejemplo, con cápsulas de alginato, dado que se han encontrado intactas tanto como 10 meses después de la implantación con indiferencia de si se implantan por vía subcutánea o por vía intraperitoneal.

Adicionalmente, se ha observado que los implantes subcutáneos e intraperitoneales de cápsulas de sulfato de celulosa que contienen células revelaban diferencias al menos con respecto a dos puntos. En primer lugar, la cantidad de anticuerpos liberada en el torrente sanguíneo era notablemente mayor en la primera situación. Una explicación muy verosímil de esta diferencia reside en el hecho de que las cápsulas se vascularizan rápidamente cuando se implantaban por vía subcutánea y no se vascularizan en absoluto cuando se implantan por vía intraperitoneal. El efecto beneficioso de la vascularización podría ser doble, facilitando en primer lugar la absorción del anticuerpo por la sangre y asegurando en segundo lugar un mejor suministro de nutrientes que favorece la supervivencia celular, dado que se observó reproduciblemente que la viabilidad de las células dentro de las cápsulas implantadas por vía intraperitoneal era menor. Además de una vascularización extensa, que demostraba la ausencia total de alteraciones significativas durante los 10 meses del seguimiento, la aglomeración de células dentro de una bolsa de tejido conectivo después de la implantación subcutánea permitiría la extirpación de las cápsulas por una ablación quirúrgica fácil en un solo paso del neo-órgano total en caso de que esto resultara necesario. Por último, es importante subrayar que el desarrollo de fibrosis aislante alrededor de las cápsulas de sulfato de celulosa implantadas no es sistemático. Esta observación contrasta con lo que ha sido consignado en el caso de las microcápsulas de alginato-poli(L)-alginato, alrededor de las cuales se desarrollaba una reacción del hospedador con fibrosis, probablemente como resultado de la potente activación de los macrófagos por el polímero encapsulante (Pueyo, M.E. et al., J. Biomater. Sci. Polym. Ed., Vol. 5, 197-203 (1993)).

A menudo se observan respuestas anti-idiotípicas en pacientes tratados repetidamente con dosis altas de anticuerpos monoclonales purificados, y en ocasiones pueden neutralizar los efectos del tratamiento (Isaacs, J.D., Semin. Immunol., Vol. 2, 449-456 (1990)). Además, se ha demostrado también que el modo de administración de los anticuerpos es un parámetro crucial con relación a la inducción de respuestas anti-idiotípicas. Por ejemplo, se ha consignado que las inyecciones subcutáneas e intradérmicas son mucho más inmunógenas que la inyección intravenosa (Durrant, L.G. et al., Cancer Inmunol. Immunother., Vol. 28, 37-42 (1989)). Así pues, es importante subrayar que no se ha observado ninguna respuesta anti-idiotípica detectable contra los anticuerpos monoclonales desarrollados en cuerpos animales implantados con células encapsuladas en sulfato de celulosa que liberen dichos anticuerpos.

Para resumir, los datos arriba expuestos demuestran con claridad que la implantación de células encapsuladas que liberan anticuerpos es adecuada para métodos de terapia génico/celular a largo plazo basada en anticuerpos, dirigida especialmente contra cánceres y enfermedades víricas.

De acuerdo con ello, en una realización preferida de la invención, las células encapsuladas productoras de anticuerpos se utilizan en terapia en casos en que es necesaria una liberación sostenida de anticuerpos en un tratamiento a largo plazo.

Situaciones de este tipo son por ejemplo enfermedades causadas por infección crónica por virus, tal como HIV, Hepatitis B, Herpes símplex, y Herpes genitalis.

Ciertas infecciones víricas dan como resultado la exposición de marcadores o antígenos específicos en la superficie celular. Tales marcadores de superficie pueden ser reconocidos selectivamente por anticuerpos específicos que pueden modularse de modo que sean tóxicos para las células infectadas por el virus. Células encapsuladas productoras de tales anticuerpos pueden aplicarse para tratamientos de infecciones víricas a largo plazo.

En otra realización de la invención, se proporcionan células encapsuladas productoras de anticuerpos neutralizantes que reconocen y se fijan a marcadores o receptores víricos en la superficie celular que interaccionan con los virus en las fases iniciales de la infección vírica, proporcionando un efecto de neutralización directo o indirecto de la infección vírica.

Los efectos neutralizantes pueden estar basados en este caso en un bloqueo directo de la fijación y/o entrada del virus en la célula y prevenir con ello la infección ulterior de cualquier célula diana, o indirectamente en la lisis por el sistema del complemento propio de los pacientes o en la presentación del virus por los anticuerpos a las células del sistema inmune tales como monocitos o macrófagos.

En una realización especial, la invención se refiere al uso de las células encapsuladas de acuerdo con la invención en el tratamiento de tumores.

En cualquier situación en la cual un tipo específico de célula o un subconjunto específico de células capaz de auto-renovación se vuelve tóxico o amenazante para la vida de los seres humanos, pueden utilizarse para eliminación de las células tumorales anticuerpos tóxicos específicos de las células, modificados normal o genéticamente mejorando su toxicidad, producidos por células encapsuladas para la destrucción selectiva de células.

Otra aplicación de las cápsulas de acuerdo con la invención es en el tratamiento de enfermedades autoinmunes graves tales como la Esclerosis Múltiple y la Artritis Reumática, en las cuales células T y B específicas responsables del efecto patológico pueden ser eliminadas constantemente en tratamientos a largo plazo por los anticuerpos tóxicos con especificidad celular producidos por células encapsuladas.

En una realización adicional de la invención, se proporcionan células encapsuladas productoras de anticuerpos contra marcadores de superficie de parásitos tales como Plasmodium falciparum, P. vivax o P. malariae.

La malaria es una de las tres enfermedades que causan más muertes al año, además de TBC y HepB. La aplicación de anticuerpos contra Plasmodium con la consecuencia de marcación de los parásitos y atracción con ello de células del sistema inmune para destruir los parásitos podría utilizarse como una profilaxis no tóxica y no perjudicial para quienes viajan a países con alto riesgo de infección por malaria.

Las células encapsuladas liberadoras de anticuerpos pueden utilizarse también para producir una composición farmacéutica que contenga una cantidad terapéuticamente eficaz de las células junto con al menos un vehículo o diluyente farmacéutico.

Los ejemplos siguientes ilustrarán la invención adicionalmente, pero no deben interpretarse como limitantes:

Ejemplo Células y condiciones de cultivo celular

Se utilizó para encapsulación la línea de células de hibridoma, Tg10, preparada por fusión de células de mieloma de ratón (P3-X63-Ag8.653) con células del bazo procedentes de ratones inmunizados con hTg (Piechaczyk, M. Chardes, T., Cot, M.C., Pau, B., y Bastide, J.M., Hybridoma, Vol. 4, No. 4, 361-367 (1985)). Las células Tg10 producen un anticuerpo monoclonal (mAb), denominado también Tg10, contra la tiroglobulina humana. Las células se dejaron crecer en RPMI 1640 (Gibco/BRL) complementado con 10% de FCS en presencia de 100 u. (= Unidades)/ml de estreptomicina, 100 u./ml de penicilina y L-glutamina 2 mM. Células Tg10 encapsuladas en la matriz de sulfato de celulosa (CSM) se cultivaron en las mismas condiciones que las células libres.

Purificación del anticuerpo y de los fragmentos F(ab)'2

Se purificó Tg10 mAb para sobrenadante de cultivo de células Tg10 por cromatografía de afinidad (Durrant, LG et al., Cancer Immunol. Immunother., Vol. 28, 37-41 (1989)). Se produjo anticuerpo anti-idiotípico de conejo contra el Tg10 mAb como ha sido descrito (Del Río, M. et al., Immunol. Invest., Vol. 24, 655-667 (1995)). Se preparó el fragmento F(ab)'2 de Tg10 por electroforesis después de escisión de Tg10 mAb con pepsina, y la pureza de las preparaciones se controló por análisis SDS-PAGE (Del Río, M. et al., Immunol. Invest., Vol. 24, 655-667 (1995)).

Encapsulación de las células

Se suspendieron 10^{7} células en 1 ml de una solución salina tamponada que contenía 3,8% de celulosa-sulfato de sodio y 5% de suero de ternero fetal. La suspensión se vertió gota a gota en un baño de precipitación que contenía 2,5% de poli-dimetil-dialilamonio (PDDMDAAC) en solución salina tamponada utilizando un sistema de dispensación (sistema de chorro de aire). La formación de cápsulas tuvo lugar en cuestión de milisegundos, seguida por constitución ulterior de una capa interna para soporte mecánico, más porosa, constituida esencialmente por sulfato de celulosa. Las cápsulas que contenían las células se mantuvieron en el baño de precipitación durante 30 segundos a 5 minutos y se lavaron luego en DMEM (Stange et al., Biomat. Art. Cells & Immob. Biotech. 21, 3443-352 (1993)).

Se utilizaron para los estudios biológicos lotes obtenidos para diferentes parámetros como se ha descrito arriba, es decir, concentración de celulosa-sulfato de sodio, flujo del sistema de chorro de aire y tiempo en el baño de precipitación. Ejemplos representativos de las condiciones son, por ejemplo: 2,5% de celulosa-sulfato de sodio, 2% de polidimetil-dialilamonio, y 1 minuto en el baño de precipitación, o 1,5% de celulosa-sulfato de sodio, 2% de polidimetil-dialilamonio, y 0,5 minutos en el baño de precipitación, o 3% de celulosa-sulfato de sodio, 3% de polidimetil-dialilamonio, y 2 minutos en el baño de precipitación. Los parámetros exactos pueden seleccionarse también teniendo en cuenta el tamaño exacto de las cápsulas deseadas, el espesor de la pared capsular y otras propiedades.

Implantación de las cápsulas

Se anestesiaron ratones C3H de 4 a 6 semanas (IFFA-CREDO) utilizando 0,01 ml por gramo de peso corporal de una solución que contenía 0,1% de xilazina (Rompun, Bayer) y 10 mg/ml de cetamina (Imalgene, Rhone Merieux). Las cápsulas se lavaron en solución salina tamponada con fosfato (NaCl 0,15 M, fosfato de Na 0,01 M, pH 7) antes de la implantación. Se implantaron seis o veinte cápsulas CSM-Tg10 en los ratones por vía intraperitoneal o subcutánea (zona abdominal). En el último caso, las cápsulas se implantaron en uno o tres sitios en agrupaciones de seis o siete cápsulas por sitio.

Inmunización de los ratones

Para la generación de anticuerpos anti-idiotípicos Tg10, se inyectaron hembras B6D2F1 de seis semanas (IFFA-CREDO) por vía intradérmica en sitios múltiples utilizando 20 \mug por ratón de Tg10 mAb purificado emulsionado en una relación volumétrica 1:1 de adyuvante completo de Freund (Sigma). Se administraron dos inyecciones de refuerzo de 20 \mug de Tg10 mAb purificado (10 \mug por vía intraperitoneal y 10 \mug por vía intramuscular) en adyuvante incompleto de Freund (Sigma) tres y cuatro semanas después de la primera inmunización, respectivamente. Se sangraron los ratones antes de cada inmunización y una semana después de la última. Después de la coagulación, las muestras de sangre se centrifugaron a 6000 rpm durante 15 minutos y se guardaron partes alícuotas de suero a -20ºC hasta su utilización. Cada muestra se suero se ensayó en cuanto a la presencia de anticuerpo anti-idiotípico contra Tg10 como se describe a continuación.

Inmunoensayo de los anticuerpos Tg10. Análisis de la respuesta inmune anti-idiotípica

Los anticuerpos Tg10 en los sobrenadantes de cultivo de células y en los sueros de ratón se ensayaron por ELISA utilizando tiroglobulina humana (hTg) (UCB-Bioproducts) para el recubrimiento de placas de microtitulación (Maxisorb, Nunc) como ha sido descrito (Piechaczyk, M. et al., Hybridoma, Vol. 4, 361-367 (1985); Noel, D. et al., J. Immunol. Meth., Vol. 193, 177-187 (1996)) y se midió la absorbancia a 450 nm utilizando el lector de placas automático MR 5000 de Dynatech. Se utilizó Tg10 mAb purificado por Proteína A Sepharose como estándar para la determinación de la concentración. Los anticuerpos anti-idiotípicos contra el Tg10 mAb se ensayaron por ELISA utilizando Tg10 F(ab)'2 para el recubrimiento de las placas de microtitulación (Del Río, M. et al., Immunol. Invest., Vol. 24, 655-667 (1995)). Se incluyó en los experimentos un antisuero anti-idiotípico de conejo (Del Río, M. et al., Immunol. Invest., Vol. 24, 655- 667 (1995)) contra el Tg10 mAb como control positivo.

Producción de anticuerpos in vitro por las células Tg10 encapsuladas en sulfato de celulosa (CS)

En primer lugar, se determinó si el proceso de encapsulación y la matriz CS podrían ser tóxicos para las células de hibridoma Tg10 o podrían afectar a la producción de anticuerpos. Las células encapsuladas, puestas en condiciones de cultivo celular, se sometieron a recuento en diversos momentos posteriores a la encapsulación y después de la trituración de las cápsulas. La viabilidad celular se controló utilizando el método de exclusión con azul tripán. En paralelo, se ensayó la producción de Tg10 mAb por ELISA. El medio de cultivo se reemplazó cada 24 horas.

Las principales observaciones fueron las siguientes:

(i) cada cápsula, cuyo diámetro variaba de 0,5 a 2 mm con un valor medio de 1 mm, contenía un promedio de 2 x 10^{4} células Tg10 en el momento de la encapsulación,

(ii) se estimó que la viabilidad de las células encapsuladas 4 días después de la encapsulación era al menos 80%,

(iii) la producción del Tg10 mAb era detectable durante un periodo de 50 días,

(iv) se observó un aumento inicial en la producción de anticuerpos que duraba 10 días y estaba en correlación con la proliferación limitada de las células Tg10 dentro de las cápsulas (que no puede exceder de una o dos tandas de división debido a las limitaciones de espacio),

(v) entre el día 10 y el día 20 comenzó una disminución acusada en la producción de anticuerpos, que estaba en correlación con el comienzo de la muerte celular.

Considerados en su conjunto, estos datos indican que el proceso de encapsulación per se no es tóxico para las células Tg10. En lugar de ello, la supervivencia de las células dentro de la matriz CS parece verse favorecida, dado que las células Tg10 cultivadas en paralelo en condiciones estándar de cultivo pero sin sometimiento a pasos murieron dentro de 1 a 2 semanas.

Suministro in vivo de Tg10 mAb después de implantación en ratones de cápsulas CS que contienen células Tg10

A continuación, se abordó la cuestión de si el suministro sistémico de Tg10 mAb podría conseguirse después de la implantación de cápsulas en ratones. Se ensayaron implantes tanto subcutáneos (zona abdominal) como intraperitoneales para determinar qué localización permitiría un mejor suministro de anticuerpos al torrente sanguíneo. Tres ratones C3H se implantaron intraperitonealmente con seis cápsulas, y un solo ratón con 20 cápsulas. Análogamente, se implantaron tres ratones por vía subcutánea con seis cápsulas y tres ratones con 20 cápsulas. La concentración de anticuerpos Tg10 en el torrente sanguíneo se observó subsiguientemente por ELISA.

Pudo observarse que la producción de anticuerpos

(i) estaba correlacionada directamente con el número de cápsulas implantadas,

(ii) alcanzaba un valor pico entre la segunda y tercera semanas después de la implantación,

(iii) era reproduciblemente mayor cuando las cápsulas se implantaban subcutáneamente, dado que podía alcanzar un valor tan alto como 12,5 \mug/ml en comparación con 2,5 \mug/ml en el caso de la implantación intraperitoneal,

(iv) podía detectarse durante tanto como 4 meses, aunque la concentración de anticuerpos Tg10 en la sangre disminuía progresivamente hasta solo varias decenas de ng/ml.

Por último, la disminución en la producción de anticuerpos parece estar relacionada con la muerte progresiva de las células encapsuladas. Se estimó que la viabilidad de las células encapsuladas en cápsulas extirpadas de los ratones 2 meses después del implante subcutáneo, era 20-30%, valor que estaba en correlación con la reducción de la concentración de anticuerpos.

Seguimiento de la vascularización de las cápsulas

Las cápsulas implantadas por vías intraperitoneal y subcutánea se comportaban de modo diferente en lo referente a su vascularización. Así, 2 meses después de la implantación, las cápsulas implantadas por vía subcutánea aparecían envueltas en una bolsa vascularizada constituida por tejido conectivo laxo. La formación de tales neo-órganos tenía lugar con indiferencia de si las cápsulas contenían o no células de hibridoma. En contraste, cuando las cápsulas se implantaron por vía intraperitoneal, no formaban agrupaciones sino que se mantenían móviles y no se observó vascularización alguna.

A continuación, se ha investigado el comienzo de la vascularización, y se ha examinado si el tratamiento de las cápsulas con factores angiogénicos podría acelerar y/o aumentar la vascularización de las cápsulas implantadas por vía subcutánea. Las cápsulas se trataron con bFGF, un factor de crecimiento conocido desde hace mucho tiempo por tener actividad angiogénica (Montesano, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 83, 7297-7301 (1986);

Thompson, J.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 86, 7928-7832 (1989)) y/o colágeno de rata tipo I (Sigma), como se ha descrito arriba, se implantaron y se siguieron con respecto a su vascularización. No se observó diferencia evidente alguna entre las diversas condiciones experimentales ensayadas. Eran fácilmente visibles vasos sanguíneos que se desarrollaban alrededor de las cápsulas tres días después de la implantación, y la vascularización completa se alcanzó después de 2 a 3 semanas, cuando estaba presente una red de vasos sanguíneos tanto alrededor como en el interior del neo-órgano, manteniéndose estable durante al menos 10 meses.

No se desarrollaba respuesta inflamatoria alguna detectable al nivel de las cápsulas CS que contenían células Tg10 implantadas

Se examinaron ratones en cuanto al desarrollo de posibles respuestas inflamatorias desencadenadas por las cápsulas implantadas. No se observó respuesta inflamatoria alguna, inmediata o retardada, detectable macroscópicamente en la proximidad de las cápsulas después de la implantación intraperitoneal ni de la subcutánea. Era también digna de mención la ausencia de cambios en la vascularización de las cápsulas incluso 10 meses después de la implantación subcutánea.

No era detectable respuesta anti-idiotípica humoral contra el anticuerpo Tg10 liberado por las células encapsuladas

Se investigó también la posibilidad de que se hubiera desarrollado una respuesta humoral contra el anticuerpo Tg10 en los ratones implantados con células de hibridoma encapsuladas. Como control positivo para estos experimentos se utilizó un suero de conejo caracterizado previamente que contenía anticuerpos anti-Tg10 (Del Río, M. et al., Immunol. Invest., Vol. 24, 655-667 (1995)). Adicionalmente, se inmunizó una serie de ratones con el anticuerpo monoclonal purificado en presencia de adyuvante de Freund, como se ha descrito arriba. De trece ratones inyectados, seis desarrollaron una respuesta anti-idiotípica clara que indicaba que los ratones no son intrínsecamente refractarios a la inducción de una respuesta de este tipo. En contraste, no se detectó respuesta anti-idiotípica alguna en ninguno de los ratones implantados con cápsulas, con indiferencia de la concentración de anticuerpo en sangre y del sitio de implantación. Estos datos indican que la matriz de sulfato de celulosa no ejerce efecto adyuvante evidente alguno que pudiera haber favorecido la inducción de una respuesta neutralizante humoral contra el anticuerpo Tg10.

Para resumir, se ha observado que pueden utilizarse cápsulas de sulfato de celulosa que contienen células de hibridoma para suministrar anticuerpos monoclonales al torrente sanguíneo de ratones inmunocompetentes durante al menos varios meses cuando se implantan subcutáneamente o en la cavidad intra-peritoneal. Los datos arriba presentados indican que la implantación de cápsulas que contienen células productoras de anticuerpos en pacientes puede permitir potencialmente un suministro sistémico de anticuerpos a largo plazo y puede ser útil por tanto en el desarrollo de tratamientos de vigilancia para cánceres y enfermedades víricas graves. Adicionalmente, la encapsulación de las células productoras de anticuerpos en sulfato de celulosa es útil en métodos de terapia génico/celular basados en anticuerpos.

Claims (14)

1. Una cápsula encapsulante de células productoras de anticuerpos para uso en el tratamiento de enfermedades o trastornos sensibles a los anticuerpos producidos por dichas células, comprendiendo dicha cápsula un núcleo que contiene dichas células y una pared capsular porosa que rodea dicho núcleo, que es permeable a los anticuerpos producidos por dichas células, estando formada dicha cápsula por un polisacárido o derivado de polisacárido que contiene grupo sulfato o por un polímero sintético que contiene grupo sulfonato, y un policatión.

2. La cápsula de acuerdo con la reivindicación 1, en la cual dicho polisacárido o derivado de polisacárido que contiene grupo sulfato se selecciona del grupo que comprende sulfato de celulosa, acetato-sulfato de celulosa, sulfato de carboximetil-celulosa, sulfato de dextrano o sulfato de almidón.

3. La cápsula de acuerdo con la reivindicación 1, en la cual dicho polímero sintético que contiene grupo sulfonato es una sal poliestireno-sulfonato.

4. La cápsula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 anteriores, en la cual dicho policatión es un polímero con grupos amonio cuaternario.

5. La cápsula de acuerdo con la reivindicación 4, en la cual dicho polímero con grupos amonio cuaternario se selecciona de polidimetildialilamonio o polivinilbencil-trimetilamonio.

6. La cápsula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 y 4 a 5 anteriores, en la cual dicho polisacárido que contiene grupo sulfato es sulfato de celulosa, y dicho policatión es polidimetildialilamonio.

7. La cápsula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 anteriores, en la cual dichas células productoras de anticuerpos se han modificado genéticamente para producir anticuerpos clonados.

8. La cápsula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 anteriores, en la cual dichos anticuerpos pertenecen a las clases de inmunoglobulinas IgA, IgM, IgG, IgD o IgE.

9. La cápsula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 anteriores, en la cual dichos anticuerpos se seleccionan de anticuerpos que se fijan a un marcador de la superficie vírica, una célula de cáncer, un linfocito T o B implicado en los elementos patológicos de una enfermedad autoinmune, un marcador de superficie de un parásito o un antígeno deletéreo circulante.

10. La cápsula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la cual dicho anticuerpo tiene un efecto neutralizante.

11. La cápsula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 anteriores, para implantación en un cuerpo animal, con inclusión de un humano.

12. La cápsula de acuerdo con la reivindicación 11 para implantación intraperitoneal o subcutánea.

13. Uso de la cápsula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 anteriores para producir una composición farmacéutica.

14. Una composición farmacéutica que comprende la cápsula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 anteriores.