CZ20003206A3 - Prostředek pro ovlivnění imunitní odpovědi - Google Patents

Abstract

Předkládané řešení poskytuje prostředky pro indukci, stimulaci, blokování nebo inhibici imunitní odpovědi savce na antigen. Jde o použití implantovatelného prostředku, který umožňuje kontrolovaný kontakt antigenu a buněk imunitního systému. Prostředek se skládá z porózní matrice obsažené v perforovaném, nepropustném zásobníku. Ovlivněním biologické dostupnosti antigenu v prostředku a načasováním aplikace antigenu do prostředku vzhledem k době implantace prostředku savci může být indukována silná a dlouhodobá imunitní odpověď na antigen nebo může být existující nebo potenciální imunitní odpověď inhibována nebo blokována. Způsoby a prostředky mohou být použity pro terapeutickou vakcinaci nebo pro profylaktickou vakcinaci. Imunita může býtΕμη^ηύ, protilátková nebo slizniční. Potlačení imunitní odpovědi je užitečné při léčbě nebo profylaxi onemocnění jako jsou alergie, autoimunitní onemocnění a při navozování tolerance pro potlačení imunitní odpovědi na transplantační antigeny. prostředek může být také použit pro získání imunitních buněk pro pozdější opětovné podání savci a pro přípravu imunitního séra a hybridomů.

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se obecně týká prostředku pro ovlivnění imunitní odpovědi na.antigen u savců. Jde o použití implantovatelného prostředku, který uvolňuje antigen kontrolovaným způsobem a zpřístupňuje ho buňkám imunitního systému. Vytvořením umělého prostředí napodobujícího složení a

A úlohu lymfatické uzliny a ovlivněním biologické dostupnosti k * antigenu může být indukována silná odpověď na antigen nebo může být zmírněna existující imunitní odpověď.

Dosavadní stav techniky

Indukce imunitní odpovědi na antigen a velikost této odpovědi závisí na komplexní reakci mezi antigenem, různými typy imunitních buněk a ko-stimulačními molekulami včetně cytokinů a chemokinů. načasování a rozsah expozice imunitních buněk antigenu a ko-stimulační vlivy dále ovlivňují imunitní odpověď. V těle jsou tyto různé typy buněk a další faktory běžně přítomny v blízkosti lymfatické tkáně, jako jsou lymfatické uzliny. Z mnoha typů buněk účastnících se procesu transportují antigen-prezentující buňky, jako jsou makrofágy a dendritické buňky, antigen z periferii do lokální organizované ·· lymfatické tkáně, zpracovávají antigen a prezentují antigenní peptidy T lymfocytům, stejně jako secernují ko-stimulační molekuly. Proto je, pokud antigen dosáhne lokálních lymfatických orgánů, za optimálního koncentračního gradientu a za vhodného prostředí obsahujícího ko-stimulační molekuly, tak je indukována odpověď ve spádové lymfatické uzlině.

Tímto způsobem mohou, ale nemusí, cizorodé antigeny vnesené

odpovědi požadované síly. Mezi antigeny používané při vakcinaci patří atenuované a inaktivované bakterie a viry a jejich složky. Úspěch vakcinace závisí částečně na typu a množství antigenu, na lokalizaci místa imunizace a na stavu imunitního systému v době vakcinace. Ne všechny antigeny jsou stejně imunogenní a pro slabě imunogenní antigeny existuje několik alternativ pro zvýšení účinnosti imunizace. Zatímco u pokusných zvířat existuje mnoho technik pro zesílení vývoje imunitní odpovědi, včetně konjugace antigenu na více imunogenní proteinový nosič nebo biomolekulu (například přílipkový hemokyanin) nebo použití adjuvans jako je Freundovo adjuvans nebo kamenec, pro vakcinace u člověka nejsou takové techniky a adjuvans dostupné. Proto není dostupná vakcinace pro mnoho onemocnění, kterým by mohlo být předcházeno vakcinaci před expozicí infekčnímu agens, nebo - v případě terapeutických vakcín, které mohou indukovat účinnou imunitní odpověď proti existujícímu agens nebo buňce způsobující onemocnění, jak je tomu u nádorů.

Testování implantace houbovitého materiálu bylo provedeno na savcích pro hodnocení populace buněk navázaných na cizorodé těleso, které vyvolává vznik takzvaného sterilního abscesu, a houbovitá tělesa byly před nebo po implantaci potaženy antigenem pro další studium populace navázaných buněk. Vallera et al. (1982, Cancer Research 42: 397-404) implantovali houbovité materiály obsahující nádorové buňky myším pro vyšetřování složení buněk navázaných během 16 dnů a zjistili, že časně byly přítomny prekursory cytotoxických buněk a cytotoxicita dosáhla vrcholu v den 16. Houbovité materiály obsahující nádorové buňky implantované myším, které byly předem imunizované nádorovými buňkami, vykazovaly přítomnost cytotoxických buněk dříve. V žádném případě nevykazovaly cytotoxicitu buňky ze sleziny, lymfatických uzlin nebo • ·· · · · 4 4 • · · 4 · · 4 · · · 4 * · · · · · · • · 4 4 · · * 4 · • 4 4 4 4 4 4 ··· 444» 44 4·· 44 * peritonea, což ukazuje na vysoce lokalizovanou odpověď na antigen v houbovitém materiálu.

Jenski et al. (1985, J. Immunol. Methods 85: 153-161) použili podobné podmínky pro sledování zotavení buněčné imunity u myší po syngenní transplantaci kostní dřeně po subletálním ozáření pomocí houbovitých materiálů obsahujících antigen. Zotavení imunity bylo měřeno podle aktivity cytotoxických T lymfocytů v houbovitém materiálu za čas. Zangemeister-Wittke et al (1989, J. Immunol. 143: 379-385) injikovali nádorovou vakcínu do houbovitých materiálů implantovaných do myší imunních proti nádoru a sledovali tvorbu sekundární imunitní odpovědi v místě implantace. Žádné doprovodné účinky nebyly zřejmé v lymfatické uzlině v místě sousedícím s implantátem.

Chen et al. (1994, Cancer Research 54: 1065-1070) získávali

T-lymfocyty z implantátů obsahujících ozářené nádorové buňky, aby prokázali, že tyto buňky mohou být použity pro přenos protinádorové aktivity. Frekvence cytotoxických T lymfocytů reaktivních s nádorem získaných z implantátu a regionálních lymfatických uzlin a sleziny byla měřena u zvířat, kterým byly aplikovány houbovité implantáty obsahující nádorové buňky. Implantáty obsahovaly 4-krát vyšší frekvenci cytotoxických Tlymfocytů reaktivních s nádory než lymfatické uzliny a 50-krát vyšší frekvenci než slezina.

Ačkoliv probíhá intenzivní výzkum pro vyřešení těchto nedostatků v účinných a dostupných vakcínách, stále existují nevýhody spojené s terapeutickými technikami a materiály, je proto žádoucí vývoj techniky nebo způsobu, který by vyřešil problémy spojené se současnou imunoterapií a podobnými léčebnými protokoly, jako je profylaktická a terapeutická vakcinace, a který by tak usnadnil vývoj nový, účinných a • * ·· · ·· · • · · · »· · ··· * · · · · · ·

9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9

9999 99 999 99 999 efektivních strategií pro zlepšení účinnosti imunizace jak zdravých savců, tak těch, pro které může být přínosem imunoterapie. Dále, schopnost potlačit imunitní odpověď na určitý antigen nebo sérii antigenů je výhodná například pro léčbu alergií a prevenci rejekce transplantátů. Předkládaný vynález je proto zaměřen na vyřešení těchto problémů.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje způsob pro ovlivnění imunitní odpovědi na antigen u savců pomocí implantace prostředku obsahujícího porosní matrici v perforovaném, ale jinak nepropustném obalu, do těla savce. Antigen, který má vyvolat imunitní odpověď, je přítomen v porosní matrici prostředku.

Antigen může být přítomen v prostředku před implantací, nebo může být vložen po implantaci; antigen přítomný v matrici prostředku před implantací může být ve formě, která není biologicky dostupná a která se stane biologicky dostupnou po implantaci. Prostředek bude přitahovat buňky imunitního systému k antigenů v prostředku a kontakt buněk s antigenem bude ovlivňovat imunitní odpověď na antigen. Perforovaný obal účinkuje jako bariera pro difusi a udržuje v prostředku vysoké koncentrace cytokinů a jiných ko-stimulačních faktorů produkovaných buňkami imunitního systému v prostředku , které po kontaktu s dalšími imunitními buňkami v prostředku zesilují rozvoj požadované imunitní odpovědi. Perforace umožňuje vstup a výstup imunitních buněk. Požadovanou imunitní odpovědí může být buněčná, slizniční a protilátková imunita a způsob může být použit jak na zdravé savce, tak na jedince, pro které může být přínosem imunoterapie.

Například, při provádění vynálezu jsou malá množství antigenů vložena do prostředku podle předkládaného vynálezu před implantací savci. Výhodně je antigen vložen do - nebo se

stane biologicky dostupným v - porosní matrici prostředku během 3 dnů po implantaci prostředku savci. Tak je u savce indukována silná imunitní odpověď.

V dalším provedení se prostředek skládá z biodegradovatelných materiálů, které jsou případně degradovány v těle. Alternativně může být prostředek odstraněn z těla po dosažení požadovaného účinku.

V nej obecnějším aspektu se předkládaný vynález týká implantovatelného prostředku pro imunizaci savců, který má následující charakteristiky: obsahuje porosní matrici obsaženou v perforovaném, ale jinak nepropustném zásobníku, dále obsahuje,antigen, který je buď přítomen v matrici v biodegradovatelné formě před implantací, nebo který se stane biologicky dostupným po implantaci, nebo je antigen vložen do prostředku po implantaci. Biologická dostupnost antigenu v prostředku může být kontrolována tím, že antigen je připraven v biologicky nedostupné formě, jak je tomu v prostředku s oddáleným uvolňováním, například mikrosférách, mikrokapslích nebo liposomech, ze kterých se po degradaci uvolňuje antigen do matrice prostředku.

V dalším provedení může být způsob a prostředek podle předkládaného vynálezu použit pro snížení nebo inhibici imunitní odpovědi na antigen u savců, za použití vysoké koncentrace určitého antigenu v prostředku, která způsobuje potlačení imunitní odpovědi na určitý antigen a inhibici vývoje imunitní odpovědi k antigenu. Prostředek může také obsahovat cytokiny nebo jiné ko-stimulační molekuly.

Dalším využitím způsobu a prostředku podle předkládaného vynálezu je odběr imunitních buněk z prostředku pro následné opětovné vložení do těla za účelem dodání adoptivní • » · ·· imunoterapie, aktivní imunizace a obnovení imunitního systému. Dalším využitím je zlepšení přípravy polyklonálních protilátek (imunitního séra) a monoklonálních protilátek, včetně přípravy lidských monoklonálních protilátek u zvířat s lidskými imunitními buňkami.

Jak je uvedeno dále, pomocí předkládaného vynálezu je možno vytvořit artificiální prostředí napodobující složení a funkci lymfatické uzliny a pomocí úprav biologické dostupnosti antigenu v prostředku je dosaženo vzniku silné imunitní odpovědi na antigen. Za jiných podmínek pro určité antigeny může být dosaženo inhibice existující imunitní odpovědi.

Popis obrázků na připojených výkresech

Obr. 1 ukazuje vývoj populace buněk v prostředku podle předkládaného vynálezu během 9 dnů po implantaci pod kůži savce.

Obr. 2 ukazuje analýzu počtu a typů buněk přítomných v prostředku 4 dny po implantaci bez jakéhokoliv antigenu přítomného v prostředku.

Obr. 3 ukazuje změny populace různých typů buněk v prostředku v 4, 7, a 10 den po implantaci, za nepřítomnosti jakéhokoliv vloženého antigenu.

Obr. 4 ukazuje vliv vložení antigenu do prostředku na počet CD3-pozitivních buněk (T lymfocytů), CD80-pozitivních buněk (B lymfocytů) a CD14-pozitivních buněk (makrofágů jako representativní podskupiny buněk presentujících antigen) v prostředku ve dny 3, 7 a 10 po implantaci. Antigen byl vložen do prostředku v den 4 po implantaci.

Obr. 5 ukazuje analýzu změny v expresi CD4 (pomocných T lymfocytů) a CD8 (cytotoxických T lymfocytů) pozitivních buněk ve slezině myší v den 10 po implantaci prostředku obsahujícího buď žádné, nebo různá množství chřipkového antigenu, nebo po imunizaci antigenem plus adjuvans v oblasti tlapky.

Obr. 6 ukazuje test proliferativní odpovědi buněk sleziny na chřipkový antigen pro myši, který byl implantován prostředek obsahující antigen, s nebo bez adjuvans, nebo které byly imunizované v oblasti tlapky antigenem plus adjuvans. Proliferace T lymfocytů sleziny je měřena podle produkce interferonu γ.

Obr. 7 ukazuje úroveň sekrece γ-interferonu T lymfocyty izolovanými z popliteálních lymfatických uzlin myší, které byly imunizovány v oblasti tlapky chřipkovým antigenem plus adjuvans.

Obr. 8 ukazuje proliferativní odpověď buněk sleziny měřenou podle sekrece interferonu γ u myší, které byly imunizované chřipkovým antigenem, s nebo bez adjuvans, za použití prostředku podle předkládaného vynálezu.

Obr. 9 ukazuje úroveň aktivace T lymfocytů sleziny, jak je měřena podle sekrece interferonu γ, u myší imunizovaných různými dávkami antigenu ovalbuminu, bez adjuvans, za použití prostředku podle předkládaného vynálezu, ve srovnání s proliferativní odpovědí buněk sleziny od zvířat imunizovaných injekcí stejných dávek antigenu s adjuvans do tlapky.

Obr. 10 také ukazuje proliferativní odpověď T lymfocytů sleziny, jak je měřena podle sekrece interferonu γ, u myší imunizovaných 0, 50 μg, 50 ng nebo 50 pg ovalbuminu, s nebo bez • ·

BCG adjuvans, za použití prostředku podle předkládaného vynálezu, ve srovnání s proliferativní odpovědí buněk sleziny od zvířat imunizovaných injekcí stejných dávek antigenu s Ribi adjuvans do tlapky.

Obr. 11 ukazuje specifickou anti-antigenovou IgG2a protilátkovou odpověď u zvířat, kterým byl implantován prostředek obsahující různé dávky HIV gpl20 peptidového antigenu, ve srovnání se zvířaty imunizovanými injekcí stejných dávek antigenu s adjuvans do tlapky.

Obr. 12 ukazuje stejný pokus jako obr. 11, ale po dosycení - 3 týdny po první imunizaci - 10% dávky první imunizace, které bylo aplikováno stejným způsobem. Implantované prostředky byly opakovaně naplněny antigenem.

Obr. 13 srovnává vývoj specifických IgG2a protilátek proti HIV gpl20 peptidu u zvířat imunizovaných buď prostředek podle předkládaného vynálezu, s nebo bez Ribi nebo BCG adjuvans, nebo běžnou imunizací do tlapky za použití stejných adjuvans.

Obr. 14 znázorňuje koncentraci specifických IgG2a protilátek u zvířat imunizovaných různými dávkami cytochromu C, buď za použití prostředku podle předkládaného vynálezu bez adjuvans, nebo běžné imunizace do tlapky s Ribi adjuvans. Koncentrace cirkulujícího IgG2a byly měřeny za použití sériových ředění myšího séra.

Obr. 15 ukazuje hladinu celkových Ig specifických pro chřipkový virus, které vznikly po imunizaci myší buď 0,1 μρ, nebo 10 gg fragmentu chřipkového hemagglutininu (BHA) v prostředku podle předkládaného vynálezu, bez adjuvans, ve srovnání se stejnou dávkou antigenu podanou do tlapky s Ribi adjuvans.

Obr. 16 ukazuje výsledky testu aktivace T lymfocytů za použití γ-interferonu pro zjištění aktivace. Myši byly imunizované chřipkovým antigenem za použití prostředku podle předkládaného vynálezu, bez adjuvans, nebo imunizací do tlapky za použití antigenu a adjuvans, nebo imunizací antigenem v implantované porosní polymerové matrici (ale ne v perforovaném zásobníku, jak je tomu v prostředku podle předkládaného vynálezu).

Obr. 17 ukazuje výsledky výše uvedeného testu po in vitro kontaktu buněk sleziny od myší imunizovaných chřipkovým antigenem s nepříbuzným antigenem (EBV), kde tyto výsledky ukazují na specificitu odpovědi vzniklé po imunizaci za použití prostředku podle předkládaného vynálezu.

Obr. 18 ukazuje výsledky testu difuse proteinu (hovězího sérového albuminu) z houbovitého materiálu samotného ve srovnání s prostředkem podle předkládaného vynálezu.

Obr. 19 ukazuje fenotyp buněk extrahovaných z prostředku podle předkládaného vynálezu, s nebo bez chřipkového antigenu, 4 den po implantaci do myši. Jsou uvedeny hodnoty pro stejné typy buněk v lymfocytech periferní krve od naivních myší.

Obr. 20 ukazuje koncentrace stimulačních cytokinů v prostředku podle předkládaného vynálezu za nepřítomnosti antigenu, ve srovnání s koncentracemi v séru.

Obr. 21 znázorňuje rozsah aktivace cytotoxických T lymfocytů, jak je měřena lýzou cílových buněk infikovaných chřipkovým virem, která je způsobena implantovaným prostředkem podle předkládaného vynálezu obsahujícím vakcínu proti chřipkovému viru, ve srovnání se zvířaty, která byla podkožně imunizovaná vakcínou proti chřipkovému viru s adjuvans.

Obr. 22 srovnává protilátkovou odpověď, jak je měřena podle koncentrace IgGl specifických k chřipkovému viru, u myší imunizovaných prostředkem podle předkládaného vynálezu, s odpovědí u myší imunizovaných podkožní injekcí vakciny a adjuvans.

Obr. 23 ukazuje afinitu IgGl specifických pro chřipkový virus vzniklých u zvířat imunizovaných prostředkem podle předkládaného vynálezu obsahujícím vakcínu proti chřipkovému viru, ve srovnání s afinitou u myší imunizovaných podkožní injekcí vakciny a adjuvans.

Obr. 24 ukazuje přežívání myší infikovaných virem chřipky po imunizaci zvířat prostředkem podle předkládaného vynálezu obsahujícím vakcínu proti chřipkovému viru, ve srovnání s přežíváním myší imunizovaných podkožní injekcí vakciny a adjuvans.

Obr. 25 ukazuje titr lidských IgG protilátek specifických k chřipkovému viru indukovaných u SCID myší za použití prostředku podle předkládaného vynálezu, ve srovnání s intramuskulární imunizací.

Obr. 26 ukazuje afinitu sérových protilátek ke chřipkovému antigenu (jak jsou popsány na obr. 25) ve srovnání s afinitou protilátek indukovaných intramuskulárním podáním antigenu.

Obr. 27 ukazuje potlačení imunitní odpovědi vysokými dávkami antigenu přítomnými v prostředku podle předkládaného vynálezu.

Obr. 28 demonstruje využití prostředku podle předkládaného vynálezu pro imunizaci plasmidovou DNA.

Obr. 29-31 demonstrují použití prostředku podle předkládaného vynálezu pro vyvolání imunitní odpovědi k polysacharidovému antigenu.

Obr. 32 ukazuje použití prostředku podle předkládaného vynálezu pro vyvolání imunitní odpovědi k vysoce konzervovanému a proto slabě imunogennímu antigenu, cyklofilinu.

Obr. 33 ukazuje použití prostředku podle předkládaného vynálezu pro vyvolání imunitní odpovědi k parazitárnímu antigenu za použití celých zvířat.

Předkládaný vynález poskytuje způsob pro ovlivnění imunitní odpovědi na antigen u savce, za použití implantovatelného prostředku, který zpřístupňuje antigen buňkám imunitního systému řízeným způsobem. Pomocí vytvoření artificiálního prostředí napodobujícího složení a funkci lymfatické uzliny a pomocí úprav biologické dostupnosti antigenu v prostředku může být indukována silná imunitní odpověď na antigen nebo může být inhibována existující imunitní odpověď, prostředek obsahuje porosní matrici, například houbovitý materiál, který je obklopen nebo obsažen v perforovaném, ale jinak nepropustném potahu nebo obalu, který je zde označován jako zásobník. Perforovaný zásobník působí jako bariera pro difusi, která udržuje vysoké koncentrace sekrečních produktů imunitních buněk v prostředku. Antigen, vůči kterému má být indukována nebo inhibována imunitní odpověď, je přítomen v porosní matrici prostředku, buď před, nebo po vložení prostředku pod kůži. Pro indukci silné imunitní odpovědi se antigen obvykle stane biologicky dostupným v matrici prostředku během 3 dnů po implantaci prostředku. Tohoto může být dosaženo injekcí antigenu do prostředku v tuto dobu, nebo použitím prostředku,

ve kterém matrice obsahuje antigen ve formě s oddáleným uvolňováním, která po třech dnech uvolňuje antigen v biologicky dostupné formě. Pro snížení nebo inhibici imunitní odpovědi na určitý antigen, podle typu určitého antigenu, je plně biologicky dostupný antigen výhodně přítomen v prostředku před implantací savci. V případě, že antigen je vložen do prostředku po implantaci prostředku, může být antigen vložen do prostředku transdermálně pomocí injekční stříkačky a podkožní jehly, po identifikaci prostředku a zavedení jehly do prostředku. Prostředek může být ponechán v těle nebo může být z těla odstraněn. Může být vyroben z biodegradovatelných materiálů, které se mohou rozpadat v těle, nebo může být odstraněn po splnění jeho účelu. Antigen může být opětovně vnesen do prostředku později. Antigen může být použit v prostředku samostatně nebo s adjuvans nebo s kombinací adjuvans. Výhodně není použito adjuvans.

Předkládaný vynález nabízí zlepšení mnoha forem imunoterapie, při kterých je žádoucí vyvolání nebo zesílení imunitní odpovědi na antigen, nebo naopak, při kterých má být inhibována nebo blokována existující imunitní odpověď nebo potenciálně se rozvíjející imunitní odpověď. Mezi tyto formy imunoterapie patří vakcinace, jako je vakcinace zdravých savců proti určitým antigenům, a terapeutická vakcinace. Blokáda nebo inhibice imunitní odpovědi může být použita pro savce před kontaktem s určitým antigenem, jak je tomu u budoucích příjemců transplantátů, savců, u kterých se předpokládá kontakt s alergenem nebo kteří jsou predisponováni ke vzniku imunitní odpovědi na exogenní nebo endogenní antigeny, jak je tomu u autoimunitních onemocnění. Potlačení imunitní odpovědi může být užitečné po expozici antigenu, jak je tomu u savců s alergickou nebo anafylaktickou reakcí na antigen nebo při probíhající rejekci transplantátu. Způsoby a prostředky podle *

předkládaného vynálezu jsou zaměřeny na všechny formy imunity, včetně buněčné, protilátkové a sliznični imunity.

Složení prostředku a způsob jeho použití simulují strukturu a funkci savčí lymfoidní tkáně, zejména lymfatické uzliny. V těle jsou vložené cizorodé antigeny vychytávány a zpracovávány antigen-prezentujícími buňkami, makrofágy a dendritickými buňkami, které vstupují do lymfatické uzliny a prezentují imunogenní peptidy odvozené z antigenu v určité konformaci s MHC antigeny T lymfocytům. Speciální podsada T lymfocytů (CD4Th2) podporuje B lymfocyty a podporuje vznik vysoce afinitní protilátkové odpovědi. B lymfocyty mohou interagovat přímo s antigenem (zejména u mnohajednotkových antigenů nebo recall antígenů) a mohou se diferencovat do plasmatických buněk secernujících protilátky specifické k imunizujícímu antigenu. Buňky prezentující antigen také uvolňují cytokiny, lymfokiny a chemokiny, které se také účastní na vzniku imunitní odpovědi. Perforovaný zásobník prostředku účinkuje na bariera pro difusi, která udržuje hladiny antigenu a sekrečních produktů imunitních buněk, jako jsou cytokiny, v prostředku a v blízkosti imunitních buněk v prostředku. Perforace omezují difusi těchto molekul z prostředku, ale umožňují volný vstup a výstup imunitních a jiných buněk do a z prostředku. Bylo zjištěno, že velmi malá množství antigenu dostačují pro indukci silné imunitní odpovědi. Interakce mezi antigenem přítomným v prostředku a imunitními buňkami a ko-stimulačními molekulami v prostředku je takto optimalizována pro zesílení vzniku imunitní odpovědi na antigen, stejně jako pro indukci dlouhodobé imunity prostřednictvím produkce paměťových buněk.

Implantace prostředku podle předkládaného vynálezu do těla savce zahajuje proces, který se označuje jako sterilní absces, při kterém jsou některé buňky imunitního systému přitahovány k cizorodému tělesu a vstupují do něj omezeným počtem perforací.

Během prvních několika dnů se v prostředku akumuluje zvyšující se populace imunitních buněk, i za nepřítomnosti antigenu. S biologickou dostupností antigenu v prostředku přibližně 3. den a s kontaktem antigenu s buňkami imunitního systému v matrici dojde k vychytávání a zpracovávání antigenu buňkami prezentujícími antigen a antigen je prezentován T lymfocytům. Protože má prostředek omezený kontakt s okolím z důvodů perforovaného zásobníku, mohou imunitní buňky vstupovat do prostředku, ale antigen zůstává v prostředku ve vysoké koncentraci, stejně jako jsou vysoké koncentrace kostimulačních faktorů secernovaných populací buněk v prostředku, což napodobuje děje v lymfatické uzlině. Po kontaktu a aktivaci T lymfocytů mohou tyto buňky opouštět prostředek prostřednictvím omezeného počtu perforací a mohou vstupovat do cirkulace. Tak prostředek umožňuje kontrolování expozice antigenu buňkám imunitnímu systému a udržení takových koncentrací cytokinů a jiných faktorů, které jsou nezbytné pro vznik silné imunitní odpovědi. Jak bude zřejmé z následujících příkladů, umožňuje prostředek zlepšení síly imunitní odpovědi na určitý antigen o několik řádů.

V dalším teoretickém použití může implantace prostředku podle předkládaného vynálezu obsahujícího velké množství určitého antigenu účinkovat opačně, jak bylo popsáno výše, v tom, že může inhibovat nebo potlačovat existující nebo potenciální imunitní odpověď na antigen. Expozice T lymfocytů nadměrnému množství antigenu jasně iniciuje apoptosu antigenspecifických T lymfocytů, což eliminuje antigen-specifické T lymfocyty a jejich progenitory, účinně potlačuje imunitní odpověď a také protilátkovou odpověď proti antigenu. Hyperaktivace T lymfocytů zprostředkovaná přidáním cytokinů (jako je IL-2, IL-4, γ-IFN, IL-12) k antigennímu podnětu nebo vystavení T lymfocytů působení dalšího antigenního podnětu, když jsou v refraktorním stavu (t.j. před odezněním aktivace) • » • 4 4 4 4 • 4 4 spustí apoptosu buněk a způsobí ztrátu reaktivních klonů (B nebo T lymfocytů) z antigen-specifické populace. Výběr vhodné koncentrace určitého antigenu pro dosažení stimulace nebo inhibice imunitní odpovědi za použití prostředku podle předkládaného vynálezu je známý odborníkům v oboru nebo může být snadno určen. Imunogenicita určitého antigenu a proto rozmezí jeho imunosupresivních nebo imunostimulačních dávek může být určena in vitro nebo in vivo způsoby známými v oboru.

Dále, zlepšení imunitní odpovědi dosažené za použití prostředku podle předkládaného vynálezu přesahuje zlepšení, které je možno dosáhnout za použití tradičních způsobů imunizace, které využívají obvykle u zvířat použití adjuvans. Teoreticky se zdá, že řízená expozice samotného antigenu imunitním buňkám a jejich ko-stimulačním faktorům poskytuje optimální prostředí pro dosažení silní imunitní odpovědi, která je lepší, než odpověď dosažitelná za použití adjuvans.

Imunizace nabízí účinnou metodu pro profylaxi mnoha infekčních onemocnění, způsobených například viry, jako je chřipkový virus, HIV, papilomavirus, virus hepatitidy, cytomegalovirus, polio virus a virus vztekliny; bakteriemi, jako je například E. coli, Pseudomonas, Shigella, syphilis, mykobakterie, Chlamydie, Rickettsiae a Serratia marcescens; houbami, jako je například Aspergillus a Candida; a prvoky a mnohobuněčnými parazity, jako je například Schistosoma, Plasmodium, Onchocerca a Ameoba. Imunizace je také účinnou metodou při terapeutické vakcinaci jedinců již trpících infekčním onemocněním. Imunizací mohou být léčeny také neinfekční onemocnění, jako jsou nádory. Nicméně, mnoho antigenů má slabou imunogenicitu a imunizace se ukázala jako neuspokojivá strategie pro prevenci nebo léčbu takových onemocnění. Adjuvans, jak jsou běžně používána u imunizace zvířat, nejsou dostupná pro zvýšení imunitní odpovědi. Dále,

• » ·<· ···· imunitní systém jedince nebo pacienta nemusí být optimální pro to, aby byl schopen produkovat imunitní odpověď proti antigenu, který by u zdravého jedince vyvolal silnou imunitní odpověď. Tyto situace umožňují použití prostředku podle předkládaného vynálezu pro stimulaci silné imunitní odpovědi tehdy, když není možné takovou odpověď vyvolat běžnými imunizačními postupy.

Potlačení imunitní odpovědi může být také žádoucí pro léčbu určitých onemocnění, jako jsou alergie, nebo pro přípravu pacienta pro kontakt s cizorodými antigeny, jak je tomu při transplantacích. Předpokládá se, že nevhodná imunitní odpověď je příčinou mnoha autoimunitních a jiných onemocnění, jako je diabetes I. typu, revmatoidní artritida, roztroušená sklerosa, uveitida, systémový lupus erythematodes, myastenia gravis a Gravesova nemoc. Implantací prostředku podle předkládaného vynálezu obsahujícího suspektní antigen jedinci může být indukována apoptosa buněk vstupujících do prostředku připravených k rozpoznání antigenu a tyto buňky mohou být tak eliminovány z imunitního systému. Eliminace progenitorových buněk specifických pro antigen umožní pozdější transplantaci cizorodých antigenů bez rejekce.

Dalším použitím předkládaného vynálezu je zlepšení tvorby polyklonálních protilátek (imunitního séra) a monoklonálních protilátek v laboratorních zvířatech a získávání požadovaného izotypu takto připravených protilátek. V jednom provedení je postup pro přípravu polyklonálních (imunitního séra) a monoklonálních protilátek proti antigenu dostupného pouze v malých množství proveden za použití prostředku podle předkládaného vynálezu. Prostředek může obsahovat malé množství vzácného antigenu a je použit pro imunizaci zvířete, po které mohou být odebrány buňky sleziny. Tento postup je zlepšením vzhledem k současným únavným a nepředvídatelným

• · · _Λ · · · * • · · · «♦· «««· metodám vnášení vzácného antigenu přímo do sleziny. Dále, za použití prostředku podle předkládaného vynálezu může být vynechána dosycovací imunizace a imunitní odpověď vzniká rychleji. Kratší doba nutná pro imunizaci zvířat umožní rychlejší přípravu monoklonálních protilátek. V jiném provedení mohou být imunitní buňky pro přípravu hybridomů získány z prostředku po imunizaci zvířete antigenem obsaženým v prostředku. Tento postup může být také použit pro přípravu lidských monoklonálních protilátek, za použití implantace prostředku podle předkládaného vynálezu jedinci, naplnění prostředku antigenem a získání imunitních buněk z prostředku pro produkci hybridomů. Výše uvedené polyklonální protilátky (imunitní sérum) a monoklonální protilátky mohou být použity pro diagnostiku, základní výzkum, zobrazovací metody a/nebo terapii. V jiném provedení mohou být lidské monoklonální protilátky připraveny za použití prostředku podle předkládaného vynálezu implantovaného myším s těžkou kombinovanou imunodeficiencí (SCID), za použití následujícího postupu, nejprve se lidské lymfocyty periferní krve podají injekčně SCID myši, u které lidské lymfocyty nahradí imunitní systém myši. Po implantaci prostředku podle předkládaného vynálezu obsahujícího požadovaný antigen, který je biologicky dostupný přibližně 3. den po implantaci, se z prostředku získají buňky, ze kterých se získají lidské B lymfocyty, které mohou být potom použity pro přípravu hybridomů, které secernují lidské protilátky proti danému antigenu.

Dalším využitím prostředku podle předkládaného vynálezu je získávání imunitních buněk od savců pro následné opětovné podání savci. Buňky mohou být odebrány z prostředku, například, aspirací z implantovaného prostředku nebo odběrem z prostředku po odstranění z těla pomocí rozpuštění polymerové matrice, a potom jsou buňky uskladněny, například kryokonzervací, a podány savci později. Tento postup je

·· ·· • · · • · · * · · · • · · ··· zejména vhodný pro savce při celotělovém ozáření. Prostředek podle předkládaného vynálezu, neobsahující antigen, může být implantován a ponechán po dobu 7 až 10 dnů a potom může být prostředek nebo jeho obsah odstraněn a buňky obsažené v prostředku mohou být konzervovány zmrazením. Po ozáření jedince mohou být tyto buňky podány jedinci, kde obnoví imunitní systém. V jiném provedení tohoto použití může prostředek obsahovat ko-stimulační faktory jako jsou cytokiny, které indukují proliferaci imunitních buněk a zvyšují výtěžek buněk z prostředku při odběru. V dalším provedení mohou být imunitní buňky odebrané z prostředku obsahujícího antigen použity pro aktivní imunizaci, při které mohou být buňky uskladněny a potom znovu podány jedinci po, například, chemoterapii nebo jiné terapii. V ještě dalším provedení mohou být buňky odebrané z prostředku konzervovány zmrazením a později mohou být vystaveny antigenu (například nádorovému antigenu) pro ex vivo propagaci T lymfocytů před jejich aplikací do těla při adoptivní imunoterapii.

V jiném provedení předkládaného vynálezu může být prostředek použit pro přenos genů do imunitních buněk v prostředku. Transfektované imunitní buňky mohou potom podněcovat imunitní buňky v prostředku a/nebo po migraci z prostředku mohou podněcovat imunitní buňky ve vzdálených orgánech. V prostředku může být například umístěna DNA, RNA nebo cDNA kódující nádorově specifický antigen nebo virový, bakteriální nebo parazitární antigen, s nebo bez příslušného proteinového antigenu. Antigen-prezentující buňky vstupující do prostředku mohou být transfektovány genem a potom exprimují antigenní protein a migrují do periferie těla, kde stimulují imunitní buňky.

Prostředek podle předkládaného vynálezu může být vyroben způsoby známými v oboru a jeho velikost a tvar mohou být

• *♦ • · · • · • * · ·

·*· 4··· různé, pokud jeho skladba umožňuje jeho funkci popsaným způsobem. Jak bylo popsáno výše, prostředek poskytuje difusní barieru pro malé molekuly, jako je antigen vložený do prostředku a cytokiny a jiné faktory secernované imunitními buňkami v prostředku, ale umožňuje vstup a výstup imunitních buněk do a z prostředku. Tak je omezena pasivní difuse proteinů a jiných malých molekul, ale imunitní buňky se mohou aktivně pohybovat do a z prostředku. V jednom provedení může být prostředek pro snadnou inserci do malé incise na kůži a pozdější odstranění, pokud je žádoucí, navržen tak, že se skládá z krátkého segmentu duté, biologicky inertní plastové trubičky, jako je silikonová trubička. Porosní polymerová matrice, t.j. houbovitý materiál, je umístěn do dutiny trubičky. Otevřené konce mohou, ale nemusí být uzavřeny. Ve stěnách trubičky se vyrobí malý počet perforací. Variace v počtu, tvaru a velikosti perforací spadají do rozsahu předkládaného vynálezu. Antigen může být vložen ve formě roztoku nebo suspenze antigenu nebo biologicky nedostupné formy antigenu, které jsou zapracovány do matrice během výroby nebo injekcí, buď jedním koncem trubičky nebo přes stěnu trubičky.

Antigen může být přítomen v matrici prostředku přímo, což je zde označováno jako biologicky dostupná nebo plně biologicky dostupná forma, nebo v biologicky nedostupné formě, která se stane později biologicky dostupnou. Vhodné je zapracování antigenu do prostředku umožňující řízené uvolňování, zpomalené uvolňování nebo oddálené uvolňování; mezi způsoby přípravy a prostředky patří mikroenkapsulace, liposomy a mikrosféry. Výhodně se pro účely stimulace nebo zesílení imunitní odpovědi na antigen stanou připravené antigeny biologicky dostupnými v matrici prostředku přibližně 3 dny po implantaci. Prostředky s vhodným uvolňováním jsou v oboru známé.

• *

V jiném provedení může být prostředek připraven z polymerického materiálu ve tvaru žádoucím v konečném prostředku a nepropustný potah může být nanesen na povrch. Alternativně může být polymerová matrice určitého stupně porosity a zesítění formována do požadovaného tvaru a potom může být zevní povrch zpracován činidlem způsobujícím další zesítění polymeru na povrchu prostředku a tím vytvářejícím nepropustný potah nebo zásobník. Potah může být potom perforován a může být vložen antigen. Zvýšená polymerizace na povrchu prostředku může být také provedena ozářením povrchu ultrafialovým světlem, když je použit polymer reaktivní na ultrafialové světlo. Zde uvedené příklady nejsou limitující, protože odborníci v oboru jsou schopni navrhnout vhodný prostředek s výše uvedenými vlastnostmi.

Materiály tvořící prostředek mohou být vybrány z mnoha vhodných přirozených nebo syntetických materiálů. V jednom provedení může být polymerovou matricí biologicky kompatibilní materiál, jako je hydroxylovaný polyvinylacetat. Jinou matricí je polyurethan, který je snadno dostupný. Dalšími vhodnými materiály jsou kopolymer ethylenu/vinylacetatu, kyselina polymléčná, kyselina polyglykolová, kopolymer polylaktidupolyglykolidu, kolagen, zesítěný kolagen a želatina.

Jak bylo popsáno výše, vytvoření perforované, ale jinak nepropustné bariery nebo potahu okolo polymerové matrice může být provedeno mnoha způsoby. V jednom provedení jsou segmenty polymerové matrice umístěny do lumen krátkého segmentu biologicky kompatibilní plastové trubičky, jako je silikonová trubička. V jednom příkladu se 2,5 cm segment trubičky s vnitřním průměrem 0,12 cm a vnějším průměrem 0,20 cm naplní odpovídajícím 2,5 cm segmentem předem zvlhčené hydroxylované polyvinylacetatové matrice. V jiných příkladech může být

·· ·· • · · · • · · • · · · • · · ···· ·· bariera nebo potah vyroben z vhodného přirozeného nebo syntetického materiálu, jako je plastový nebo jiný polymer, jako je polyethylen, zesítěný kolagen, polyethylen, silikon, latexová pryskyřice, polystyren, akrylová pryskyřice, polyvinylpyrrolidon a jejich kombinace. Jedním komerčně dostupným materiálem je SILASTIC® silikonová trubička od Dow Corning. Tyto materiály jsou pouze příklady materiálů použitelných v předkládaném vynálezu.

Prostředek podle předkládaného vynálezu zachovávající si požadované charakteristiky omezení difuse malých molekul z prostředku za zachování vstupu a výstupu imunitních buněk může být připraven manuálně následujícím způsobem. Silikonová trubička délky 1,125 palce o vnějším průměru 0,047 palce a poloměru 0,0235 palce může být použita jako nepropustný zásobník prostředku podle předkládaného vynálezu. Otvory skrz stěnu prostředku mohou být vyrobena manuálně hypodermickou jehlou 20 gauge, kterou se vytvoří otvory o průměru přibližně 1/16 a 1/32 palce. V trubičce se udělá 20 otvorů. Tyto parametry slouží pouze jako návod pro charakterizování prostředku a odborníci v oboru mohou použít jiné parametry, které zajistí neomezený vstup a výstup buněk, ale které omezí difusi malých molekul, jako jsou cytokiny, v prostředku.

Biodegradovatelný prostředek podle předkládaného vynálezu může obsahovat matrici a zásobník z materiálů, o kterých je známo, že pomalu degradují v těle. Mezi takové materiály patří želatina, kolagen, zesítěný kolagen, kyselina polymléčná, kopolymer polylaktidu-polyglykolidu a jiné materiály známé odborníkům v oboru. Výhodný plně degradovatelný prostředek pro stimulaci imunitní odpovědi může obsahovat biodegradovatelný zásobník, biodegradovatelnou matrici a biodegradovatelný přípravek antigenů s oddáleným uvolňováním, který je obsažen v matrici. Tento přípravek uvolňuje antigen přibližně 3. den po implantaci; matrice a zásobník se začnou významně degradovat po vhodné době působení prostředku, přibližně 10 dnů po implantaci.

Perforace v zásobníku prostředku mohou být připraveny jakýmkoliv způsobem, včetně manuálního a automatizovaného, malý počet perforací je optimální, výhodně okolo 10 na cm trubičky, ačkoliv toto částečně závisí na velikosti a tvaru trubičky. V souladu s teoretickými úvahami uvedenými výše je úlohou perforací umožnit vstup buněk imunitního systému do prostředku, kde potom dochází k jejich kontaktu s antigenem a ko-stimulačními molekulami a tak se aktivují, a potom umožnit výstup těchto aktivovaných buněk. Tyto funkce musí být dosaženy a zároveň musí perforovaný prostředek obsahovat a udržovat požadované koncentrace antigenu a ko-stimulačních faktorů, jako jsou cytokiny produkované buňkami imunitního systému v prostředku. Vhodný počet a velikost perforací splňuje tyto potřeby, jak je uvedeno v následujících příkladech. V případě, že prostředek je připraven ze segmentu trubičky, mohou být konce trubičky ponechány otevřené a tak mohou účinkovat jako perforace stejně jako otvory pro vložení jehly nebo jiného prostředku pro vnesení antigenu, buď před implantací nebo po implantaci.

Prostředek může být implantován do vhodného místa těla, kde může být inserce, vnesení antigenu a odstranění provedeno s minimálním nepohodlím pro pacienta. Jedním vhodným místem je mediální povrch paže. V jiném provedení je prostředek vyroben z biodegradovatelných materiálů, takže degraduje po své době životnosti a nemusí být odstraněn.

Pro stimulaci imunitní odpovědi může být biologicky dostupný antigen přítomen v prostředku v době implantace nebo lépe po implantaci; nejlépe je přítomen v prostředku přibližně

• ·« ·· · * • · • · · • · ··· ···« dny po implantaci. Biologicky nedostupný přípravek antigenu s oddáleným uvolňováním může být přítomen v prostředku v době implantace a tento přípravek uvolňuje antigen do matrice prostředku přibližně 3. den po implantaci. Po přibližně třech dnech je dostatečný počet buněk a dostatečné množství typů buněk schopných odpovídat na přítomnost antigenu přítomno v prostředku, spolu s koncentracemi cytokinů a jiných kostimulačních molekul secernovaných z těchto buněk a udržovaných v prostředku v důsledku difusní bariery tvořené perforovaným zásobníkem, a následné uvolnění antigenu do prostředku iniciuje vznik optimální imunitní odpovědi.

Prostředek, pokud není vyroben z biologicky degradovatelných materiálů popsaných výše, může být odstraněn jednoduchým chirurgickým zákrokem poté, co splnil svůj účel. Obecně, po přibližně 10 dnech populace imunitních buněk vystoupí z prostředku a je dále nefunkční. Na druhou stranu, prostředek může být opakovaně naplněn antigenem později pro dosycení imunitní odpovědi.

Jak bylo popsáno výše, pro dosažení požadované stimulace nebo suprese imunitní odpovědi je významné načasování biologické dostupnosti antigenu v matrici prostředku a toto načasování je závislé na charakteristikách jednotlivých antigenů. Obecně, vysoké koncentrace plně biologicky dostupného antigenu přítomné v době implantace způsobují potlačení imunitní odpovědi na antigen. Také, obecně, nízké koncentrace plně biologicky dostupného antigenu přítomné v době implantace způsobují stimulaci imunitní odpovědi na antigen. Tyto podmínky se mohou lišit bez odchýlení se od použitelnosti vynálezu, v závislosti na charakteristikách určitých antigenů použitých v prostředku. Odborníci v oboru budou schopni zhodnotit imunogenicitu jednotlivých antigenů pomocí standardních metod in vitro nebo in vivo, a budou

• ·· schopni stanovit vhodné koncentrace antigenu pro dosažení požadovaného efektu.

Způsob použití prostředku podle předkládaného vynálezu pro zesílení nebo stimulaci imunitní odpovědi na antigen je zaměřen na zisk populace imunitních buněk, T a B lymfocytů, které udržují účinnou imunitní odpověď proti antigenu použitém v prostředku.

Jiným předmětem předkládaného vynálezu je inhibice imunitní odpovědi proti specifickému antigenu za použití výše uvedeného prostředku a způsobu. Pomocí použití vysokých dávek antigenu v prostředku může být indukována apoptosa imunitních buněk vstupujících do prostředku a přicházejících do kontaktu s antigenem. Stavy jako je rejekce štěpu nebo transplantátu mohou být terapeuticky nebo preventivně léčeny, pokud je příjemci před nebo po transplantaci podán prostředek podle předkládaného vynálezu obsahující dárcovský antigen. Mezi stavy, které jsou vhodné pro inhibici imunitní odpovědi patří: transplantace, při které je žádoucí dosažení tolerance příjemce pomocí krvinek dárce pro snížení imunitní odpovědi příjemce na štěp od dárce; autoimunitní onemocnění, při které je dosažení tolerance k autoantigenům žádoucí pro inhibici patogenních T lymfocytů a pro zmírnění tvorby imunitních komplexů s endogenními antigeny, jako je kolagen u revmatoidní artritidy; diabetes, při kterém je žádoucí dosažení tolerance pacienta k insulinu nebo GAD; a myastenia gravis, při které může být dosaženo tolerance u pacienta pro eliminaci imunitní odpovědi proti receptoru pro acetylcholin. Dále, imunitní odpovědi, které charakterizují alergie a alergické reakce, mohou být léčeny navozením tolerance nebo desenzibilizací pacienta vůči alergenu pomocí indukce apoptosy imunitních buněk odpovědných za imunitní odpověď. Příklady alergií a antigenů, které mohou být použity v prostředku podle

·· • · · • · • · · • · ·· · předkládaného vynálezu pro potlačení imunitní odpovědi, zahrnují alergen kočičí alergie DERP-1 a alergie na jed břečťanu/dubu způsobené urushiolem modifikovanými peptidy. ·

Následující příklady jsou uvedeny pro podrobnější dokreslení výhodných provedení vynálezu. Tyto příklady nijak neomezují rozsah vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Připraví se příklad prostředku podle předkládaného vynálezu za použití 2,5 cm dlouhé silikonové trubičky s vnitřním průměrem 0,15 cm a zevním průměrem 0,2 cm, do kterého se vsune 2,5 cm segment houbovitého hydroxylovaného polyvinylacetatu. Prostředek se ponoří do zásobníku obsahujícího fosfátem pufrovaný salinický roztok a autoklavuje se pro sterilizaci. Samice BALB/c myší (6-8 týdnů věku) se uvedou do anestesie Avertinem. Prostředek se vloží do 0,5 cm incise ve střední čáře na hřbetu v den 1. U některých zvířat se v den 2 po implantaci aplikuje do prostředku 50 μΐ 1 mg/ml chřipkového antigenu (FLUSHIELD® vakciny proti chřipkovému viru, trivalentní, typy A a B; získané od Henry Schein®, Mellville, NY), pomocí podkožní jehly skrz kůži, která se vpíchne poblíž prostředku a pohmatem se zavede do prostředku.

Hypodermickou jehlou se aspiruje kapalina z implantovaného prostředku od každého z pěti zvířat v den 2, 4,7 a 9 po implantaci a potom se buňky v kapalinách smísí, promyjí se a spočítají se. Jak je uvedeno na obr. 1, u zvířat s implantovaným prostředkem bez antigenu se populace buněk začne zvyšovat v den 4 a dosáhne vrcholu v den 7. V den 9 se počet buněk v prostředku snižuje, což ukazuje na to, že buňky • · · · · · • · · · ···· • · · · · • · · · ··· · · migrují z prostředku do periferie. Když se chřipkový antigen přidá do prostředku v den 2 po implantaci, je počet buněk v prostředku v den 4 po implantaci několikrát vyšší, 225000, ve srovnání s 60000 buňkami v prostředku bez antigenu. Přítomnost antigenu v prostředku tedy zvyšuje mobilizaci buněk do prostředku a/nebo spouští proliferaci buněk v prostředku.

Příklad 2

Počet a/nebo fenotypy buněk přítomných v prostředku bez přidání antigenu byly stanoveny v tomto pokusu za použití Balb/c myší. 4.den po implantaci prostředku , jak je popsáno v příkladu 1, byly buňky od každého z pěti zvířat aspirovány z prostředku, smíšeny, promyty a rozděleny do několika zkumavek. Přidaly se fluoresceinem isothiokyanatanem nebo fykoerythrinem značené monoklonální protilátky specifické k následujícím markérům (CD14, CD45/B220, CDllb, CD40, CDllc, CD80, CD86, CD62E, CD3 a I-Ad) a po inkubaci po dobu 30-45 minut při 4 °C se buňky promyly a geometrické průměry fluorescence se stanovily průtokovou cytometrií. Pro srovnání byla stanovena fluorescence lymfocytů periferní krve od naivních, syngenních myší za použití stejné sestavy specifických protilátek a výsledky pro každou protilátku byly vyjádřeny jako procento zvýšení fluorescence buněk z prostředku proti lymfocytům periferní krve.

Obr. 2 ukazuje fenotyp buněk extrahovaných z prostředku 4.den po jeho implantaci. Migrace a akumulace T lymfocytů (CD3, CD40), makrofágů (CD14, CDllb, třída II MHC, CD80), dendritických buněk (CD40, CDllc, třída II MHC, CD80) a B lymfocytů (třída II MHC, CD45/B220, CDllb) ve vysoké hustotě byla v prostředku zřetelně patrná.

Příklad 3

Změny v populaci buněk v prostředku popsané v příkladu 1 byly hodnoceny odběrem buněk z prostředku ve dny 3, 7 a 10 po implantaci. V prvním pokusu nebyl v prostředku přítomen žádný antigen. Buňky aspirované z prostředku implantovaného 5 myším byly pro každý čas odběru smíšeny a za použití stejného způsobu jako v příkladu 2 byla stanovena hustota buněk nesoucích CD3, CD8, CD80, CD44, CDllc, CD45R/B220 a CD14 markéry a výsledky byly vyjádřeny jako procentuální zvýšení vzhledem k lymfocytům periferní krve od naivních myší.

Obr. 3 ukazuje hustotu počítaných fenotypů buněk ve dny 3, a 10 po implantaci. Pro všechny markéry bylo zvýšení typu buněk patrné ve dny 3 a 7, a v den 10 populace buněk migrovala z prostředku.

Příklad 4

Ve druhém pokusu provedeném stejným způsobem jako v příkladu 3 byl do prostředku aplikován chřipkový antigen v den 2 po implantaci. Jak je uvedeno na obr. 4, hustota T lymfocytů a antigen-prezentujících buněk (CD3, CD80 nebo CD14) byla dále zvýšena aplikací antigenu do prostředku a vedla také k přetrvávání těchto tří typů buněk v den 10. Přidání antigenu zpomalilo migraci imunitních buněk z prostředku.

Příklad 5

Vzdálené účinky implantace prostředku s chřipkovým antigenem byly hodnoceny měřením změny exprese CD4 a CD8 T lymfocytů ev slezinách zvířat s implantovaným prostředkem. Postupovalo se způsobem popsaným výše a fenotypy T lymfocytů byly určeny způsobem podle příkladu 2. Do prostředků bylo • · • · · · • · • · · • · • · · · · · · aplikováno 0, 5, 10 nebo 50 gg chřipkové vakcíny 2. den po implantaci a sleziny byly odebrány od zvířat 10 dnů po imunizaci 12 dnů po implantaci). Buňky sleziny byly izolovány jemným třením slezin mezi hrubými stranami sklíček. Buňky se promyly PBS a červené krvinky se odstranily 5 minutovou inkubací v pufru pro lýzu erythrocytů (Sigma). CD4 a CD8 fluorescence se stanovila průtokovou cytometrií, jak je popsáno výše. Pro kontrolu byl proveden běžný, standardní imunizační protokol, ve kterém bylo myším injikováno stejné množství chřipkového antigenu do tlapky, spolu s Ribi adjuvans R-700, emulsí obsahující monofosforyl lipid A a syntetický trehalosadikrynomykolat (MPLA+TDM), které je vyráběno Ribi ImmunoChem Research, lne. Kontrolní myši byly také utraceny 10 dnů po imunizaci.

Jak je uvedeno na obr. 5, T lymfocyty z buněk sleziny od myší s implantovaným prostředkem vykazovaly zvyšující se hustotu CD4 a CD8 molekul po naplnění prostředku chřipkovým antigenem. Koncentrace cytotoxických T lymfocytů (CD8) ve slezinách od zvířat imunizovaných běžnými způsoby 50 μg antigenu s adjuvans byly ekvivalentní koncentracím indukovaným 10 gg antigenu v prostředku podle předkládaného vynálezu. Dále, prostředek ebz antigenu také způsoboval expansi CD8 buněk ve slezině, v důsledku sterilního zánětu indukovaného prostředkem. Je pozoruhodné, že u zvířat s implantovaným prostředek podle předkládaného vynálezu naplněným 50 μg antigenu (stejným množstvím, jako je injikováno do tlapky s adjuvans u kontrolních zvířat) došlo ke ztrátě exprese CD8 buněk ve slezině. Je dním vysvětlením je to, že podání vysoké dávky antigenu do prostředku vede k apoptose buněk specifických pro antigen. Působení extrémně silného podnětu může spustit inhibiční efekt a nakonec může vést k eliminaci všech CD4+CD8+ T lymfocytů ze sleziny léčených myší. Toto má využití v požadované inhibici imunitní odpovědi v případech,

• ·

ve kterých je imunitní odpověď škodlivá, například při rejekci transplantátu.

Vysvětlení lepší účinnosti imunizace za použití prostředku podle předkládaného vynálezu spočívá patrně v tom, že množství antigenu, které se skutečně dostane do lymfatické uzliny zvířete po injekci antigenu na periferii je o několik řádů nižší, než je množství podané při imunizaci. Proto se předpokládá, že optimální dávka pro imunizaci za použití prostředku podle předkládaného vynálezu pro vyvolání pozitivní imunitní odpovědi bude mnohem nižší (tj. o několik řádů nižší), než je dávka používaná při běžné imunizaci.

Příklad 6

Síla imunitní odpovědi na chřipkový antigen podaný v prostředku podle předkládaného vynálezu byla hodnocena za použití sekrece gamma-interferonu T lymfocyty sleziny jako markéru. Sekrece gamma interferonu je jedním ze základních atributů odpovědi Thl a CD8 cytotoxických T lymfocytů, která je obranou proti intracelulárním patogenům a nádorům. Myším byl implantován prostředek, jak bylo popsáno výše, a 5 μρ chřipkové vakcíny bylo aplikováno v den 3 po implantaci. Kontrolní skupina byla imunizována do tlapky 50 μρ antigenu + Ribi adjuvans. 10 dnů po imunizaci byly buňky sleziny izolovány způsobem popsaným v předešlém příkladu, byly umístěny na plotnu a produkce gamma-interferonu byla měřena za použití ELISA kitu (Endogen) po stimulaci různými koncentracemi antigenu (1,4 až 180 μρ/ml) .

Obr. 6 ukazuje, že imunizace zvířat 5 μρ antigenu v prostředku podle předkládaného vynálezu indukuje stejnou hladinu aktivace T lymfocytů jako imunizace 50 μρ s adjuvans do tlapky. Tak může být za použití prostředku podle předkládaného vynálezu vyvolána silná imunitní odpověď bez použití adjuvans a za použití významně nižšího množství antigenu.

Byla hodnocena sekrece gamma-interferonu z T lymfocytů z popliteálních lymfatických uzlin od stejných zvířat, po expozici izolovaných T lymfocytů podobnému rozsahu koncentrací antigenu. Jak je uvedeno na obr. 7, sekrece gamma-interferonu z T lymfocytů od zvířat imunizovaných antigenem s adjuvans do tlapky nebyla tak silná, jako sekrece z slezinných T lymfocytů od zvířat imunizovaných za použití prostředku podle předkládaného vynálezu (srovnej s obr. 6). Protože popliteální uzliny jsou ty uzliny, které drénují oblast tlapky a měly by tak být primed antigenem, ukazuje tento výsledek dále účinnost, se kterou může být prostředek s antigenem použit pro indukci silné imunitní odpovědi bez potřeby adjuvans. V dalším hodnocení byla sledována populace buněk zůstávajících v prostředku (do kterého byl dodán antigen v den 3) 10 dnů po implantaci, za použití sekrece γ-interferonu v odpovědi na působení antigenu. Obr. 8 ukazuje, že velmi nízké množství γinterferonu je secernováno v odpovědi na in vitro vystavení chřipkovému antigenu ve srovnání s úrovní odpovědi zjištěné pro buňky sleziny. Tyto výsledky implikují, že efektorové buňky aktivované imunizací v prostředku migrovali z prostředku a v den 10 (ve který byla provedena aspirace z prostředku) byla většina efektorové populace nepřítomná. Obr. 1 a 3 ukazují ztrátu buněk s fenotypem B a T lymfocytů z prostředku v den 9 a 10, což potvrzuje možnost jejich přesunu do periferních orgánů.

Příklad 7

V dalším pokusu, který měl za cíl stanovení síly imunitní odpovědi na antigen indukované prostředkem podle předkládaného vynálezu po implantaci a aplikaci antigenu do prostředku, se • · provedl test proliferace buněk sleziny. Postupovalo se podle stejného protokolu, jako je protokol použitý v předešlých příkladech. Antigenem v tomto pokusu byl ovalbumin; prostředky obsahovaly různá množství ovalbuminu v rozsahu od 10 pg do 50 pg; kontrolní zvířata byla imunizována injekcí stejného množství antigenu plus Ribi adjuvans do tlapky.

dnů po implantaci byly myši utraceny a byly odebrány jejich sleziny. Prolíferační test byl proveden v 96-jamkových plotnách. 200000 buněk sleziny na jamku bylo vystaveno působení 180 pg/ml antigenu na 72 hodin při 37 °C; jako kontroly byly použity stejné dávky antigenu viru EpsteinaBarrové. Po expozici antigenu nebo kontrole byly buňky pulsovány po dobu 6 hodin ³H-thymidinem a inkorporace značkovacího činidla byla měřena a vyjádřena jako stimulační index.

Obr. 9 ukazuje, že imunizace myší za použití prostředku obsahujícího ovalbumin vedla k indukci silné proliferativní odpovědi buněk sleziny specifických pro antigen. Odpověď byla detekována u zvířat imunizovaných již pikogramy antigenu.

Buňky sleziny od zvířat imunizovaných běžnými způsoby s adjuvans vykazovaly proliferativní odpověď pouze při asi 57-řádů vyšší koncentraci antigenu. Zanedbatelné úrovně stimulace pro kontrolní antigen (virus Epsteina-Barrové) (data nejsou uvedena) naznačují, že vyvolaná imunitní odpověď na ovalbumin byla vysoce specifická.

V dalším pokusu využívajícím ovalbumin jako antigen byly myši imunizované buď pomocí prostředku podle předkládaného vynálezu nebo do tlapky, dávkou 50 pg, 50 ng nebo 50 pg ovalbuminu, samotného v prostředku nebo s BCG adjuvans v prostředku nebo do tlapky s Ribi adjuvans. BCG (Bacille Calmette-Guerin) adjuvans použité v těchto pokusech, TheraCys® je lyofilizovaná suspenze atenuovaného kmenu Mycobacterium bovis, připravená Connaught Laboratories Limited pro léčbu karcinomu ín sítu v močovém měchýři. 10 dnů po imunizaci byly odebrány buňky sleziny a byly vystaveny působení různých koncentrací antigenu (1,4 až 180 gg/ml) nebo stejným dávkám kontrolního antigenu, viru Epsteina-Barrové, in vitro. Po 72 hodinové inkubaci byly buňky pulsovány ³H-thymidinem na dobu 6 hodin a inkorporace značkovacího činidla byla vyjádřena jako stimulační index a byla použita pro měření stimulace a proliferace T lymfocytů.

Obr. 10 ukazuje, že za použití prostředku podle předkládaného vynálezu může být dosaženo silné antigenně specifické odpovědi T lymfocytů za použití nízkých dávek antigenu. zanedbatelné úrovně stimulace byly detekovány po vystavení buněk sleziny kontrolnímu antigenu, což dále ukazuje, že odpověď byla specifická pro imunogen.

Příklad 8

Antigenně specifická protilátková odpověď proti HIV gpl20 peptidovému antigenu (zbytky 315-322, RIQRGPGRAFVTIGK) byla hodnocena po aplikaci velmi nízkých dávek tohoto antigenu do prostředku podle předkládaného vynálezu. BALB/c myši byly imunizované buď za použití prostředku nebo do tlapky, s Ribi adjuvans, za použití různých dávek HIV peptidu. Krev byla odebírána 10 dnů po imunizaci a byl stanoven titr protilátek proti peptidu. O čtyři dny později byla zvířata imunizována dosycovací dávkou rovnou 10% počáteční dávky imunogenu a druhý odběr krve byl proveden o 10 dnů později pro stanovení titru protilátek.

ELISA test byl použit pro měření protilátky podtřídy IgG2a specifické pro antigen a byl proveden běžným způsobem.

• · • · • · • · » » ······ · ·

Stručně, mikrotitrační plotny byly potaženy antigenem (1 g/ml) ve fosfátem pufrovaném salinickém roztoku, během 16 hodin při 4 °C. Plotny byly promyty (50 mM Tris + 0,2% Tween-20 v PBS, pH 7-7,5) a byly blokovány blokovacím pufrem (5% roztok BSA + 0,1% Tween-20 v PBS, pH 7,2-7,4) při 4 °C po dobu 16 hodin. Plotny se promyly a 100 μΐ vzorků séra se přidalo do každé jamky se začátkem při ředění 1:50 a dále po trojnásobném ředění. Vzorky se testovaly dvojmo. Po 1 hodinové inkubaci při teplotě okolí se plotny promyly způsobem popsaným výše a do jamek se přidal roztok biotinylované anti-myší IgG2a protilátky (1 μg/ml). Po 1 hodinové inkubaci a důkladném promytí uvedeném výše se do jamek přidal streptavidin konjugovaný s křenovou peroxidasou, ředěný na 1:4000 v blokovacím pufru. Po 30 minutové inkubaci při teplotě okolí se přidal substrát (100 μΐ/jamku tetramethylbenzidinu). Plotny se inkubovaly po dobu 30 minut. Přidáním 100 μΐ/jamku 2 N H2SO4 se reakce ukončila. Plotny se odečítaly za použití ELISA Plate Reader při vlnové délce 450 nm.

Obr. 11 ukazuje úroveň specifických IgG2a proti HIV gpl20 peptidu a ukazuje, že po jediné imunizaci za použití prostředku podle předkládaného vynálezu byla vyvolána silná antigenně specifická protilátková (IgG2a) odpověď, zatímco žádná odpověď nebyla vyvolána jedinou imunizací do tlapky podle běžného protokolu. Po druhé imunizaci (dosycení) do tlapky byla vyvolána protilátková odpověď u zvířat imunizovaných běžným způsobem, ale zvířata imunizovaná za použití prostředku podle předkládaného vynálezu a potom po dosycení (10% původní dávky podané pomocí prostředku) měla vyšší koncentrace IgG2a a stále významně silnější odpověď při nižších dávkách antigenu (Obr. 12).

» ·

Příklad 9

Byl hodnocen vliv různých adjuvans na konečnou imunitní odpověď vyvolanou pomocí prostředku podle předkládaného vynálezu a běžnou imunizací do tlapky. BALB(c myši byly imunizované buď pomocí prostředku enbo do tlapky, HIV gpl20 peptidem (z předchozího příkladu) v různých dávkách buď samostatně, nebo s Ribi adjuvans nebo BCG adjuvans, jak byly popsány výše. Prostředek byl naplněn imunogenem 3 dny po implantaci a titry protilátek byly stanoveny 10 dnů po imunizaci. ELISA test na IgG2a protilátku specifickou pro gpl20 peptidový antigen byl proveden způsobem popsaným v předešlém příkladu.

Běžná imunizace s Ribi nebo BCG adjuvans indukovala nízké hladiny IgG2a specifických pro peptid (obr. 13). Naopak, imunizace za použití prostředku podle předkládaného vynálezu bez adjuvans (50 ng peptidu) indukovala značně vysoké hladiny IgG2a specifických pro peptid. Peptid v kombinaci s jakýmkoliv adjuvans (Ribi nebo BCG) indukoval nízkou odpověď. Tato data naznačují, že přidání adjuvans k již tak silnému antigennímu podnětu vedou k potlačení imunitní odpovědi. Je možné, že pro demonstrování aditivního účinku nebo synergního účinku adjuvans a antigenů by imunizační protokoly měly být testovány při nižších dávkách (nižších než fentogramových dávkách) antigenů, stejně jako při nižších koncentracích adjuvans.

Podobné výsledky byly získány při testování 15-merového peptidu glykoproteinu B viru Herpes Simplex (zbytky 497-507; TSSIEFARLQF).

Příklad 10 «« · · · ·» • · · · · · · # · · · · · • · · · · · · · • · · · · · • · · ·· «·· · ·

V dalším testu na sílu protilátkové imunitní odpovědi indukované antigenem přítomným v prostředku podle předkládaného vynálezu byly BALB/c myším implantovány prostředky, do kterých byly o tři dny později implantovány různé dávky cytochromu C. Pro kontrolu byly různé dávky stejného antigenu podány do tlapky v kombinaci s Ribi adjuvans. 10 dnů po implantaci nebo 10 dnů po inokulaci do tlapky byla zvířatům odebrána krev a byl proveden ELISA test pro IgG2a, které specificky rozpoznávají antigen. Postupy byly podobné jako postupy provedené v předešlém příkladu s výjimkou toho, že ELISA test byl provede při sériovém ředění séra od 1:50 do 1:6400.

Obr. 14 ukazuje, že velmi silná specifická protilátková imunitní odpověď na antigen byla dosažena při velmi nízkých dávkách antigenu použitých v prostředku podle předkládaného vynálezu. Již 50 fentogramů antigenu v prostředku vedlo k vyvolání protilátkové odpovědi podobné odpovědi na běžnou imunizaci do tlapky pomocí adjuvans a 5 ng antigenu, což je zlepšení o 4 řády.

Příklad 11

Vývoj protilátkové odpovědi byl dále hodnocen za použití hemagglutininu jako antigenu, který byl štěpen a přečištěn z chřipkového viru A (destruovaný hemagglutininový antigen, neboli BHA).

BALB/c myši byly imunizované za použití prostředku podle předkládaného vynálezu s 0,1 gg a 10 qg antigenu, který byl dodán do prostředku v den 3 po implantaci. Kontrolní myši byly imunizované stejnými dávkami antigenu s Ribi adjuvans podkožně při kořeni ocasu. Myším byla odebírána krev v den 7, 14, 21 a • · · · · · ·· »· · · · · · · · * • · · · · · · • · · · · · · · · • ♦ · » 9 9 9

9999999 99 999 99 po imunizaci a sérum bylo testováno ELISA testem na přítomnost celkových IgG protilátek specifických pro antigen.

Jak je uvedeno na obr. 15, silná protilátková odpověď byla získána s 0,1 pg antigenu, který vedl k dosažení vysoké koncentrace HA-specifických protilátek již 2 týdny po imunizaci. Myši imunizované za použití běžného protokolu s adjuvans vykazovaly nízké úrovně protilátkové odpovědi specifické pro antigen ve druhém týdnu a tato se zvyšovala třetí a čtvrtý týden po imunizaci. Hladina BHA specifické protilátky v séru myší imunizovaných prostředkem byla o 75-80% vyšší než hladina dosažená po běžné imunizaci s vyššími dávkami antigenu a za přítomnosti adjuvans. V tomto pokusu vyvolaly nízké dávky imunogenu v prostředku lepší protilátkovou odpověď, než byla odpověď dosažená při použití vyšších dávek. Jak je vidět z předešlého pokusu, dávky vyšší než 5 pg mohou vést k potlačení imunitní odpovědi, pravděpodobně v důsledku vyvolání apoptosy jako reakce na nadměrnou stimulaci.

Příklad 12

Význam perforovaného, ale jinak nepropustného a biologicky inertního potahu nebo zásobníku okolo houbovité matrice prostředku podle předkládaného vynálezu byl hodnocen imunizací myší chřipkovým antigenem buď v intaktním prostředku popsaném výše nebo za použití houbovité matrice samotné implantované vedle segmentu perforované trubičky. Byly hodnoceny různé dávky antigenu (0, 50 pg, 500 pg, 5 pg a 50 pg) a tyto dávky byly aplikovány do prostředku nebo do houbovité matrice samotné tři dny po implantaci. Pro kontrolu byly stejné dávky antigenu použity pro imunizaci myší do tlapek, společně s Ribi adjuvans. 10 dnů po implantaci nebo imunizaci do tlapky byly od zvířat získány sleziny a způsobem popsaným výše byl provede

• · · • 4 · · • « · · ····«·« ·· test proliferace T lymfocytů, za použití koncentrace antigenu od 0,1 do 180 μg/ml. Pro kontrolu specificity byl in vitro použit virus Epsteina-Barrové. Inkorporace ³H-thymidinu byla vyjádřena jako stimulační index, který představuje stimulaci a proliferaci T-lymfocytů.

Jak je uvedeno na obr. 16, aktivace T lymfocytů u zvířat imunizovaných intaktním prostředkem byla významně vyšší než aktivace od zvířat, ve kterých byl antigen přítomen v houbovitém materiálu, který nebyl vložen do perforovaného, ale jinak nepropustného zásobníku. Odpověď na nepříbuzný antigen, obr. 18, byla minimální.

Příklad 13

Význam perforovaného, ale jinak nepropustného a biologicky inertního potahu nebo zásobníku okolo houbovité matrice prostředku podle předkládaného vynálezu byl hodnocen pomocí testu difuse. 200 μg hovězího sérového albuminu (BSA) bylo injikováno do prostředku nebo do houbovité matrice. Prostředek a houbovitá matrice byly umístěny do zkumavek obsahujících 1,5 ml PBS. V různé časy byly odebírány vzorky a byla měřena koncentrace BSA.

Jak je uvedeno na obr. 18, houbovitá matrice uvolnila veškerý svůj obsah během 5 minutové inkubace. Prostředek podle předkládaného vynálezu řídil uvolňování antigenu a více než 65% antigenu zůstávalo v prostředku po dobu více než 960 minut. Soudí se, že difusní bariera sloužící pro udržení vysokých koncentrací antigenu, cytokinů, chemokinů a jiných ko-stimulačních molekul v prostředku v kontaktu s buňkami imunitního systému je jedním z důležitých mechanismů, které významně zlepšují účinnost prostředku oproti běžným imunizačním postupům v indukci silné imunitní odpovědi.

· · · ·· • · » · · ··< · · * • · · · · · · ··· ···· ·· »·« ·· *

Příklady uvedené výše tedy demonstrují schopnost prostředku podle předkládaného vynálezu stimulovat lepší buněčnou a protilátkovou imunitní reakci k různým antigenům než běžná imunizace do tlapky a ve srovnání s prostým dodáním antigenu do implantované houbovité matrice.

Příklad 14

Po implantaci byly stanoveny fenotypy buněk přítomných v prostředku podle předkládaného vynálezu neobsahujícím antigen. Buňky extrahované z prostředku podle předkládaného vynálezu v den 4 po implantaci byly odebrány, promyty a barveny fluoresceinem isothiokyanatanem nebo fykoerythrinem značenými monoklonálními protilátkami specifickými k následujícím markérům CD14, CD45/B220, CDllb, CD40, CDllc, CD80, CD86, CD3 a I-Ad (PharMingen, CA). Geometrické průměry fluorescence se stanovily průtokovou cytometrií. Pro srovnání byla stanovena fluorescence lymfocytů periferní krve od naivních, syngenních myší, za použití stejné sestavy specifických protilátek a výsledky pro každou protilátku byly vyjádřeny jako průměr intenzity fluorescence (MFI).

Obr. 19 ukazuje fenotyp buněk extrahovaných z prostředku 4. den po implantaci. V prostředku je patrná migrace a akumulace T lymfocytů (CD3, CD40), makrofágů (CD14, CDllb, třída II MHC, CD80), dendritických buněk (CD40, CDllc, třída II MHC, CD80) a B lymfocytů (třída II MHC, CD45/B220, CDllb) ve značné hustotě. Imunitní buňky zásadní pro vývoj imunitní reakce jsou tedy přítomné v prostředku. Exprese ko-stimulačních (CD80 a CD86) a adhesních molekul (CD44) byla významně zvýšena na imunitních buňkách extrahovaných z prostředku podle předkládaného vynálezu ve srovnání s PBL (data nejsou uvedena). Zajímavé je, že elektronová mikroskopie řezů z prostředku podle předkládaného vynálezu ukázala přítomnost makrofágů s velkým počtem lysozomů, což ukazuje na jejich aktivaci.

Příklad 15

Po implantaci byly koncentrace cytokinů v prostředku podle předkládaného vynálezu neobsahujícím antigen srovnávány s koncentracemi cytokinů v přirozeném myším séru. Jak je uvedeno na obr. 20, prostředek obsahoval vyšší koncentrace stimulačních cytokinů IL-2, IL-4 a TNF-α a přibližně 1/7 koncentrace inhibičního cytokinů TGF-β (data nejsou uvedena). Tak je prostředek podle předkládaného vynálezu po vložení antigenu značně aktivovaným prostředím pro vyvolání imunitní odpovědi.

Příklad 16

Předpokládá se, že reakce cytotoxických T lymfocytů (CTL) je zásadní pro vznik imunity proti chřipkovému viru. Pro hodnocení schopnosti prostředku podle předkládaného vynálezu vyvolat vznik CTL specifických pro antigen byly myši imunizované 500 pg vakciny proti chřipkovému viru v prostředku podle předkládaného vynálezu. Pro kontrolu byly myši imunizované podkožně 500 pg vakciny s Ribi adjuvans. Lymfocyty byly získány od imunizovaných zvířat a jejich specificita pro chřipkový virus byla stanovena podle lýzy buněk infikovaných chřipkovým virem.

CTL byly připraveny následujícím způsobem. Myši byly utraceny a byly odebrány jejich sleziny. Byla připravena jednobuněčná suspenze a buňky byly promyty PBS. Erythrocyty byly odstraněny pomocí pufru pro lýzu erythrocytů (Sigma, MO). Buňky sleziny (5 x 10⁶) byly současně kultivovány in vitro s 5 x 10⁶ virem infikovanými (100 HAU/10⁷ buněk/ml po dobu 60 minut při 37 °C) a ozářenými syngenními buňkami sleziny a inkubace byla provedena podobu 5 dnů při 37 °C, 5% CO2.

PR8 infikované (500 HAU/10⁶ buněk) Pl.HTR buňky a neinfikované Pl.HTR buňky byly použity jaké cíle pro cytotoxicitu. Buňky byly značeny 100 mCi Na2⁵¹CrO4 po dobu 90 minut a potom byly třikrát promyty. Cílové buňky (10⁴/ml) ve 100 ml RPMI 1640 a 5% FCS mediu byly přidány k efektorovým buňkám v různých koncentracích od poměru 100:1 (E:T) a potom postupně při dvojnásobném ředění v 96-jamkových plotnách s oblým dnem. Po 5 hodinové inkubace se odebral supernatant. Výsledky jsou vyjádřeny jako procento specifického uvolnění ⁵¹Cr za použití vzorce: [(experimentální uvolnění)-(spontánní uvolnění)] x 100/[(maximální uvolnění)-(spontánní uvolnění)].

Jak je uvedeno na obr. 21, imunizace za použití prostředku podle předkládaného vynálezu s 500 pg vakciny proti chřipkovému viru spustila silnou reakci CTL specifických pro chřipkový virus, která byla významně lepší v lýze chřipkovým virem infikovaných cílových buněk než reakce CTL vzniklých v důsledku běžné podkožní imunizace s Ribi adjuvans. Vzniklé CTL neusmrcovaly neinfikované cílové buňky in vitro, což ukazuje na specificitu vyvolané odpovědi. S vyššími dávkami antigenu v prostředku podle předkládaného vynálezu nebyla pozorována žádná stimulace.

Příklad 17

Pro stanovení toho, zda může imunizace prostředkem podle předkládaného vynálezu také modulovat protilátkovou imunitní odpověď, byly myši imunizovány několika různými dávkami vakciny proti chřipkovému viru buď v prostředku podle předkládaného vynálezu, nebo podkožně s Ribi adjuvans. Vysoké koncentrace IgM, IgGl a IgG2a protilátek specifických proti chřipkovému viru byly prokázány v séru myší po imunizaci za použití prostředku podle předkládaného vynálezu s nižší dávkou vakciny, ve srovnání s podkožní imunizací vakcinou v kombinaci s Ribi (data nejsou uvedena). Vyšetření na IgGl protilátky specifické pro virus ukázalo vyšší vazbu při měření podle absorbance při eskalaci ředění séra (obr. 22). Podobné výsledky byly pozorovány pro IgG2a protilátky.

Příklad 8

Sérové protilátky vyvolané imunizací za použití prostředku podle předkládaného vynálezu a běžného protokolu s adjuvans byly zpracovány gradientem zvyšující se molarity KSCN (thiokyanatanu draselného) použitého pro eluci protilátek specifických pro antigen z komplexů vázaných na mikrotitrační plotny potažené antigenem, což bylo použito pro stanovení relativní afinity protilátek k chřipkovému antigenu. Byl použit standardní ELISA formát na bázi mikrotitrační plotny, jak byl popsán výše. před přidáním biotynylovaného anti-myšího IgG byly plotny promyty a do jamek byly přidány různé koncentrace KSCN. Plotny byly inkubovány při teplotě okolí po dobu 30 minut. Po promytí se do jamek přidal roztok (0,5 gg/ml) biotinylované anti-myší IgGl protilátky. Stoupající koncentrace KSCN jsou nutné pro rozrušení komplexů tvořených vazbou vysoce afinitních protilátek na antigen. Jak je uvedeno na obr. 23, mají vzniklé protilátky vysokou afinitu k virovým antigenům. Proto je velmi nízká dávka vakciny dostatečná pro stimulaci účinné protilátkové odpovědi, pokud je použita v prostředku podle předkládaného vynálezu.

Příklad 19

Kapacita imunizace za použití prostředku podle předkládaného vynálezu pro chránění zvířat před infekčními chorobami byla testována na myším modelu chřipky. Dvě dávky vakciny proti chřipkovému viru (5 pg a 500 pg) byly použity pro imunizaci myší bud' prostředkem podle předkládaného vynálezu nebo podkožní aplikací společně s Ribi adjuvans. Přibližně 12 týdnů po vakcinaci byla zvířata vystavena působení letální dávky chřipkového viru. Jak je uvedeno na obr. 24, vakcinace za použití prostředku podle předkládaného vynálezu s 5 pg i 500 pg chřipkové vakciny vedla k úplné ochraně, zatímco při podkožní imunizaci 500 pg chřipkové vakciny s Ribi adjuvans přežívalo pouze 60% myší. Všechna zvířata imunizovaná dávkou 5 pg s adjuvans podlehla onemocnění do 14 dne. Je třeba si uvědomit, že imunizace pomocí prostředku podle předkládaného vynálezu nezpůsobovala pouze úplnou ochranu, ale byla také provedena s 1/100 dávky antigenu a bez adjuvans. Myši imunizované prostředkem podle předkládaného vynálezu měly také stabilní hmotnost po virové infekci, což ukazuje na mírnější vývoj onemocnění odpovídající jejich relativní resistenci na akutní infekci.

Příklad 20

Použitelnost prostředku podle předkládaného vynálezu pro vyvolání tvorby specifických lidských IgG u myší s těžkou kombinovanou imunodeficiencí (SCID) osídlených lidskými imunitními buňkami byla hodnocena pomocí implantace prostředku obsahujícího vakcínu proti chřipkovému viru. SCID Beige CD17 (6-8 týdnů, samice) myším byla intraperitoneálně podána infuse 20 x 10⁶ PBMC od normálního lidského čárce. 0 tři dny později byly myši imunizovány buď intramuskulárně, nebo pomocí implantace prostředku podle předkládaného vynálezu předem • · naplněného 50 ng vakciny proti chřipkovému viru. Tři týdny po imunizaci byla myším odebrána krev a sérum bylo testováno na protilátkovou odpověď specifickou proti chřipkovému viru za použití běžného ELISA testu. Jak je uvedeno na obr. 25 imunizace vakcínou vyvolala tvorbu lidských IgG specifických pro chřipkový virus. Dále, jak bylo zjištěno za použití KSCN při stoupající molaritě pro měření relativní afinity sérových protilátek k chřipkovému antigenů (jak bylo popsáno v příkladu 18), produkoval prostředek podle předkládaného vynálezu vyšší titr lidských protilátek proti chřipkovému viru, než titr dosažený tradiční, intramuskulární imunizací (obr. 26). Tento způsob může být také použit pro přípravu lidských hybridomů schopných produkovat lidské monoklonální protilátky.

Příklad 21

Vyšší množství antigenů přítomné v prostředku podle předkládaného vynálezu mohou způsobit potlačení imunitní odpovědi. Balb/c myším byl implantován prostředek obsahující 5 až 50 gg vakciny proti chřipkovému viru nebo byly imunizované do tlapky antigenem ve směsi s Ribi adjuvans. Myši byly utraceny 10 dnů po imunizaci a byly izolovány buňky sleziny a byly umístěny v 96-jamkových plotnách (2 x 10⁵ buněk/jamku). Buňky byly vystaveny působení chřipkového antigenů po dobu 72 hodin při 37 °C. Po stimulaci antigenem byly z kultur odebrány supernatanty a produkce interferonu γ byla měřena za použití ELISA kitu (Endogen). Jak je uvedeno na obr. 27, myši imunizované kombinací antigenů a Ribi adjuvans vykazovaly imunitní reakci, která se přímo úměrně zvyšovala s dávkou antigenů. Naopak, myši imunizované antigenem v prostředku vykazovaly stimulaci imunitní odpovědi při nízkých dávkách antigenů (jak je uvedeno v předešlých příkladech), ale inhibici imunitní odpovědi při vyšších dávkách antigenů. Přítomnost vyšších dávek antigenů v implantovaném prostředku • · • · · • · · · • · « • · · · · · podle předkládaného vynálezu vede tedy k inhibici imunitní odpovědi. Tento způsob může být použit při léčebných strategiích, při kterých je žádoucí specifická imunosuprese, například při transplantacích, alergiích atd.

Příklad 22

Prostředek podle předkládaného vynálezu může být také použit pro vyvolání imunitní odpovědi k polysacharidovému antigenu. Jedna imunizace za použití prostředku naplněného pneumokokovou vakcinou (Pneumovax 23) vede k rozvoji specifické imunitní reakce. Pneumovax je polyvalentní pneumokoková vakcína skládající se z vysoce přečištěných kapsulárních polysacharidů z 23 nej častějších nebo invazivních typů pneumokoka. Myši byly imunizované 5 μg nebo 40 pg Pneumovax vakciny buď v prostředku implantovaném podkožně způsobem popsaným výše, nebo ve směsi s Ribi adjuvans při imunizaci do tlapky. Od všech myší byla v den 10 odebrána krev, která byla hodnocena ELISA na celkové IgG (obr. 29),

IgGl (obr. 30) a IgG2a (obr. 31) odpovědi. Tyto výsledky ukazují, že imunitní odpověď na polysacharidové antigeny může být dosažena za použití prostředku podle předkládaného vynálezu.

Příklad 23

Prostředek podle předkládaného vynálezu může být použit pro vyvolání imunitní odpovědi na vysoce konzervovaný antigen. Cyklofilin byl vybrán jako modelový protein pro tyto pokusy, protože vyvolání imunitní reakce na cyklofilin je obtížné, neboť tento protein je vysoce konzervován mezi savčími druhy. Myši byly imunizované 5 pg, 50 ng nebo 0,5 ng lidského prostředku buď v prostředku podle předkládaného vynálezu implantovaném podkožně, nebo ve směsi s Ribi adjuvans • · • · » · · *·· ·♦·· ·· ··· aplikované podkožně. Myším byla odebrána krev a sérum bylo testováno na IgG2a odpověď na lidský cyklofilin pomocí ELISA. Jak je uvedeno na obr. 32, myši imunizované dvěma nižšími dávkami antigenu pomocí prostředku podle předkládaného vynálezu vykazovaly lepší odpověď na antigen ve srovnání se zvířaty imunizovanými podkožně cyklofilinem s Ribi adjuvans. tyto výsledky ukazují, že prostředek může indukovat imunitní odpověď na vysoce konzervované antigeny, které jsou jinak neimunogenní. Imunizace vyšší dávkou antigenu v prostředku podle předkládaného vynálezu selhává v indukci imunitní odpovědi.

Příklad 24

Prostředek podle předkládaného vynálezu může být použit pro vyvolání imunitní odpovědi na celé, živé organismy. V tomto pokusu byly myši imunizované živými larvami měchovce za použití buď 5 larev v prostředku podle předkládaného vynálezu impnatovaném podkožně, nebo.za použití 1000 živých larev injikovaných podkožně s odstupem 2 týdnů. Jak je uvedeno na obr. 33, indukovaly oba protokoly L3-specifické celkové IgG, jak bylo zjištěno pomocí ELISA. Je možno provést imunizaci proti mnoha parazitům včetně měchovce a malárie za použití ozářených larev a sporozoitů, v příslušném pořadí; tento test ukazuje, že imunizace za použití prostředku podle předkládaného vynálezu může být provedena s nižším počtem organismů.

Předkládaný vynález může být proveden v jiných formách nebo jinými způsoby bez odchýlení se od jeho základních charakteristik. Předkládaný vynález by měl proto být považován ve všech ohledech za ilustrativní a ne restriktivní, jeho rozsah je definován v připojených patentových nárocích a < ·* 99

9 9 9 9 9 • 9 9 9 • 9 9 9 9

9 9 9

9 9999 99 9 ·

9 ekvivalentní změny spadají do rozsahu uvedených patentových nároků.

Jsou zde citovány různé publikace, jejichž úplné obsahy jsou zde uvedeny jako odkazy.

Claims (57)

1. Patentové nároky

   1. Prostředek pro ovlivnění imunitní odpovědi na antigen u savce, vyznačující se tím, že do těla savce se implantuje prostředek obsahující porósní matrici umístěnou v perforovaném, ale jinak nepropustném zásobníku, kde uvedená matrice obsahuje množství uvedeného antigenu, kde uvedený prostředek přitahuje buňky imunitního systému tak, že se setkávají s uvedeným antigenem a ovlivňují uvedenou imunitní odpověď.
2. 2. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že antigen je biologicky dostupný v uvedené porósní matrici v době implantace uvedeného prostředku do savce.
3. 3. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že antigen se stane biologicky dostupným v porósní matrici po implantaci uvedeného prostředku do savce.
4. 4. Prostředek podle nároku 3, vyznačující se tím, že antigen se stane biologicky dostupným přibližně 3 dny po implantaci uvedeného prostředku do savce.
5. 5. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedený antigen je vložen do uvedeného prostředku přibližně tři dny po implantaci.
6. 6. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že antigen je dodán v prostředku s oddáleným uvolňováním.

   • · * · · · //Λ · · · · · · ·
7. 7ο · · · · · · · · · ' ········ ···· · ·· ·· «·

   7. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedená porósní matrice obsahuje polymerický materiál.
8. 8. Prostředek podle nároku 7,vyznačující se tím, že uvedený polymerický materiál je vybrán z přirozených nebo syntetický zdrojů.
9. 9. Prostředek podle nároku 8, vyznačující se tím, že uvedená polymerická matrice je vybrána ze skupiny zahrnující hydroxylovaný polyvinylacetát, polyurethan, kopolymer ethylenu/vinylacetátu, kyselinu polymléčnou, kopolymer polylaktidu/polyglykolidu, želatinu, kolagen, zesítěný kolagen a jejich kombinace.
10. 10. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedený zásobník obsahuje polymerický materiál vybraný z přirozených nebo syntetických zdrojů.
11. 11. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že porósní polymerová matrice se skládá z hydroxylovaného polyvinylacetátu a zásobník se skládá se segmentu perforované trubičky.
12. 12. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedené množství antigenu a načasování biologické dostupnosti uvedeného antigenu v uvedeném prostředku vzhledem k době implantace uvedeného prostředku do savce způsobuje indukci nebo zesílení imunitní reakce na uvedený antigen.
13. 13. Prostředek podle nároku 12, vyznačující se tím, že antigen je biologicky dostupný v prostředku po implantaci uvedeného prostředku do savce.

    • ·

    4» · · · • · ·· · · ·
14. 14. Prostředek podle nároku 13, vyznačující se tím, že uvedený antigen je vložen do uvedeného prostředku přibližně 2-4 dny po implantaci uvedeného prostředku do savce.
15. 15. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedené množství antigenu a načasování biologické dostupnosti uvedeného antigenu v uvedeném prostředku vzhledem k době implantace uvedeného prostředku do savce způsobuje potlačení nebo oslabení imunitní reakce na uvedený antigen.
16. 16. Prostředek podle nároku 15, vyznačující se tím, že uvedený antigen je biologicky dostupný v uvedeném prostředku v době implantace uvedeného prostředku do savce.
17. 17. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedený prostředek je odstraněn z těla savce po období přibližně 10 dnů.
18. 18. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že druhá dávka uvedeného antigenu je dodána do uvedeného prostředku.
19. 19. Prostředek podle nároku 18, vyznačující se tím, že uvedená druhá dávka uvedeného antigenu je dodána do uvedeného prostředku pomocí oddáleného uvolnění uvedené druhé dávky uvedeného antigenu přítomné v prostředku v době implantace.
20. 20. Impnatovatelný prostředek pro ovlivnění imunitní odpovědi na antigen vyznačující se tím, že obsahuje porósní matrici obsaženou v perforovaném, ale jinak nepropustném zásobníku.

    • · · · · ·

    Π5 • * · · · · • · · · · · • · · · · · · · • · · · · · · • ·· ♦· ··
21. 21. Prostředek podle nároku 20 vyznačující se tím, že uvedený antigen je přítomný v uvedené porósní matrici.
22. 22. Prostředek podle nároku 20 vyznačující se tím, že dále obsahuje prostředky pro dodání uvedeného antigenu do uvedené porósní matrice, buď před, nebo po implantaci.
23. 23. Prostředek podle nároku 20 vyznačující se tím, že matrice se skládá z polymerického materiálu.
24. 24. Prostředek podle nároku 23 vyznačující se tím, že uvedený polymerický materiál je vybrán z přirozených nebo syntetický zdrojů.
25. 25. Prostředek podle nároku 24 vyznačující se tím, že uvedený polymerický materiál je vybrán ze skupiny zahrnující hydroxylovaný polyvinylacetat, polyurethan, kopolymer ethylenu/vinylacetatu, kyselinu polymléčnou, kopolymer polylaktidu/polyglykolidu, želatinu, kolagen, zesítšný kolagen a jejich kombinace.
26. 26. Prostředek podle nároku 20 vyznačující se tím, že uvedený zásobník se skládá ze segmentu perforované trubičky.
27. 27. Prostředek podle nároku 20 vyznačující se tím, žeuvedený zásobník obsahuje perforovaný, ale jinak nepropustný potah okolo uvedené porósní matrice.
28. 28. Prostředek podle nároku 27 vyznačující se ·· ··*· • * « · · · * · ··· · · · · * · · ♦ · . ♦ · · ····· ·· · · ·* tím, že uvedený potah se skládá z polymerického materiálu.
29. 29. Prostředek podle nároku 28 vyznačující se t i m, že uvedený polymerický materiál je vybrán z přirozených nebo syntetický zdrojů.
30. 30. Prostředek podle nároku 29 vyznačuj ící se tím, že uvedený polymerický materiál je vybrán ze skupiny zahrnující zesítěný kolagen, kyselinu polymléčnou, kopolymer polylaktidu/polyglykolidu, silikon, latexovou pryskyřici, polystyren, akrylovou pryskyřici, polyvinylpyrrolidon a jejich kombinace.
31. 31. Prostředek podle nároku 20 vyznačuj ící se tím, že porosní matrice se skládá z hydroxylovaného polyvinylacetatu a zásobník se skládá ze segmentu perforované trubičky.
32. 32. Způsob pro získání imunitních buněk od savce vyznačující se tím, že uvedené imunitní buňky jsou získány z prostředku implantovaného uvedenému savci obsahujícímu porosní matrici obsaženou v perforovaném, ale jinak nepropustném zásobníku.
33. 33. Způsob podle nároku 32 vyznačuj ící se tím, že uvedené odebrané buňky jsou znovu podány uvedenému savci.
34. 34. Způsob podle nároku 33 vyznačující se tím, že uvedené odebrané buňky kryokonzervovány před opětovným podáním uvedenému savci.
35. 35. Způsob podle nároku 32 vyznačující se tím, že antigen je přítomen v porosní matrici uvedeného prostředku.

    44 4444 •4 4444

    4444 • 4 · 4 4

    4 4 4 4

    4 4 4 4 4 • 4 4 4 4 •4 44 4
36. 36. Způsob podle nároku 35 vyznačující se tím, že uvedené imunitní buňky jsou znovu podány uvedenému savci.
37. 37. Způsob podle nároku 35 vyznačující se tím, že uvedené imunitní buňky jsou znovu podány uvedenému savci po expozici uvedenému antigenu in vitro.
38. 38. Prostředek podle nároku 32 vyznačující se tím, že uvedená matrice se skládá polymerického materiálu.
39. 39. Prostředek podle nároku 38 vyznačující se tím, že uvedený polymerický materiál je vybrán z přirozených nebo syntetický zdrojů.
40. 40. Prostředek podle nároku 39 vyznačující se tím, že uvedený polymerický materiál je vybrán ze skupiny zahrnující hydroxylovaný polyvinylacetat, polyurethan,. kopolymer ethylenu/vinylacetatu, kyselinu polymléčnou, kopolymer polylaktidu/polyglykolidu, želatinu, kolagen, zesítěný kolagen a jejich kombinace.
41. 41. Prostředek podle nároku 32 vyznačující se tím, že uvedený zásobník se skládá ze segmentu perforované trubičky.
42. 42. Prostředek podle nároku 32 vyznačující se tím, žeuvedený zásobník obsahuje perforovaný, ale jinak nepropustný potah okolo uvedené porósní matrice.
43. 43. Prostředek podle nároku 42 vyznačující se tím, že uvedený potah se skládá z polymerického materiálu.

    ·· ···· *· *·< ·
44. 44. Prostředek podle nároku 43 vyznačující se tím, že uvedený polymerický materiál je vybrán z přirozených nebo syntetický zdrojů.
45. 45. Prostředek podle nároku 44 vyznačující se t í m,. že uvedený polymerický materiál je vybrán ze skupiny zahrnující zesítěný kolagen, polyethylen, silikon, latexovou pryskyřici, polystyren, akrylovou pryskyřici, kyselinu polymléčnou, kopolymer polylaktidu/polyglykolidu, polyvinylpyrrolidon a jejich kombinace.
46. 46. Prostředek podle nároku 32 vyznačující se tím, že porosní matrice se skládá z hydroxylovaného polyvinylacetatu a zásobník se skládá ze segmentu perforované trubičky.
47. 47. Způsob podle nároku 35 vyznačující se tím, že uvedené imunitní buňky jsoou použity pro přípravu hybridomů pro produkci monoklonální protilátky proti uvedenému antigenu.
48. 48. Prostředek pro imunizaci savců antigenem pro přípravu hybridomů pro produkci monoklonální protilátky proti uvedenému antigenu, vyznačující se tím, že jde o prostředek podle nároku 12.
49. 49. Prostředek pro imunizaci savců antigenem pro přípravu hybridomů pro produkci monoklonální protilátky proti uvedenému antigenu, vyznačující se tím, že jde o prostředek podle nároku 21.
50. 50. Prostředek podle nároku 12 vyznačující se tím, že uvedená imunitní odpověď na uvedený antigen je vybrána ze skupiny skládající se z profylaktické vakcinace, »· ··«· #♦ »·*· « · • ♦ · · • · · • · · · • · · • · ·· · terapeutické vakcinace, buněčné imunity, protilátkové imunity, slizniční imunity, dlouhodobé imunity a jejich kombinací.
51. 51. Způsob přípravy hybridomů produkujících monoklonální protilátky proti předem vybranému antigenu vyznačující se tím, že obsahuje kroky:

    (a) vnesení lidských lymfocytů periferní krve do cirkulace myši s těžkou kombinovanou imunodeficiencí (SCID) a osídlení imunitního systému uvedené myši uvedenými lymfocyty;

    (b) implantaci prostředku podle nároku 21 do uvedené myši, kde uvedený prostředek obsahuje uvedený předem vybraný antigen;

    (c) získání imunitních buněk z uvedeného prostředku;

    (d) přípravu hybridomů z B lymfocytů přítomných mezi uvedenými získanými imunitními buňkami; a (e) identifikaci hybridomů produkujících monoklonální protilátky rozpoznávající uvedený předem vybraný antigen pomocí vyšetřovacích způsobů.
52. 52. Způsob pro transfekci imunitních buněk savce genetickým materiálem vyznačující se tím, že obsahuje vložení uvedeného genetického materiálu do matrice prostředku skládajícího se z porósní matrice obsažené v perforovaném, ale jinak nepropustném zásobníku, kde uvedený prostředek je implantován do těla uvedeného savce.
53. 53. Způsob podle nároku 52 vyznačující se tím, že uvedený genetický materiál je vybrán ze skupiny skládající se z DNA, RNA a cDNA.
54. 54. Způsob podle nároku 52,vyznačující se tím, že uvedený genetický materiál kóduje antigen.
55. 55. Prostředek pro léčbu nebo profylaxi onemocnění způsobených ·· ···· <7Γ ·« ···· • · ·· · · · • * · · 9 9 ·* ♦♦ 99 imunitní reakcí, vyznačující se tím, že jde o prostředek podle nároku 15.
56. 56. Prostředek podle nároku 55, vyznačující se tím, že uvedené onemocnění nebo stavy jsou vybrány ze skupiny zahrnující alergie, rejekce transplantátů a autoimunitní onemocnění.
57. 57. Prostředek pro ovlivnění imunitní odpovědi na antigen u savce pomocí implantace prostředku obsahujícího uvedený antigen do těla uvedeného savce vyznačující se tím, že dále obsahuje prostředky pro omezení pasivní difuse molekul z uvedeného prostředku bez omezení aktivního pohybu imunitních buněk z a do uvedeného prostředku.