JPH04501853A

JPH04501853A - 大型多価免疫原

Info

Publication number: JPH04501853A
Application number: JP2505845A
Authority: JP
Inventors: メシャー，マシュー・エフ
Original assignee: メディカル・バイオロジー・インスティチュート
Priority date: 1989-03-23
Filing date: 1990-03-19
Publication date: 1992-04-02
Anticipated expiration: 2015-07-04
Also published as: EP0422164A1; US5045320A; WO1990011085A1; EP0422164B1; JP3059482B2; DE69014543D1; DE69014543T2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】大型多価免疫原政府の権利この発明が着想された研究はＮＩＨ認定ＲＯＩＣ４３０６２のもとに合衆国政府の援助を受けがっ政府はこの発明およびこの特許に対しかつこれに基づくある権利を有する。

受容体の複合体単独かまたは他の分子と組合わせたものにより結束されたリガンドが約０．　２μより大きい直径を有する固相支持体上に配列され、先ｕｒｑ” ｒ細胞の媒介による応答反応を誘発しかつこれを増大させることが知られている。

読者の便宜を図るため、この発明の背景およびこの発明を記載する上で使用される次の略語を以下のとおり定義する。

！ムクラスｌタンパク質　たとえばＨ−２Ｋ’　またはＨ−２等の、ネズミのＭＨＣのに１ＤまたはＬ遺伝子座の生産物（Ｈ−２タンパク質はクラスＩタンパク質と同じである）ＣｏｎＡ　コンカナバリンＡ（タチナタマメ、カナバリアエンシフオルミスの抽出物、マイトジェンレフチン）ＣＴＬ　細胞溶解性１９２８球ＣＹ　シクロホスファミドＤＭＳ　ＯジメチルスルホキシドＥ　エフェクター細胞ＥＬ４　ネズミの胸腺層！、ｐ、　腹腔内１、ｖ、　静脈内ＬＭＩ　大型多価免疫原（以前の公報では（色性細胞（シュードサイト）と呼ばれていたもの）ＭＨＣ主要組織適合複合体Ｐ８１５　ネズミの肥満細胞腫ＰＢＬ　末梢血リンパ球ＰＢＳ　リン酸緩衝塩水ｐＣＴＬ　前駆細胞溶解性Ｔリンパ球ＰＥＬ　腹腔浸出リンパ球ＲＤＭ４　ネズミのリンパ腫Ｓ、ｃ、　皮下Ｔ　標的細胞ＴＣＲＴ細胞受容体ＴＨＴヘルパー細胞ヘルパーおよび細胞障害性Ｔ細胞の活性化は、外来の抗原に対する体液性および細胞性双方の生体内免疫応答を誘発する上で重要な役割を果たし、ここでの外来抗原とは細菌、寄生虫、ウィルス、形質転換された細胞または移植された細胞である。外来抗原を含むワクチンによる免疫処置は体液性の（抗体）応答を誘発する場合には効果的であるが、細胞性免疫を活性化させる上では一般的に効果がない。

したがって、現行の処方では外来生物による侵入に対して、免疫系防御の主要な武器を活性化させる上で効果がない。

Ｔ細胞は通常もう１つの細胞の表面上に提示された抗原への結合の結果として活性化され、この結合および活性化は抗原に特異的な主要組織適合複合体（ＭＨＣ）−制限Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）により媒介される。生体外の研究では、ＭＨＣ分子単独かまたは外来抗原と合わせたものは人工の膜上に組込まれたとき、Ｔ細胞を活性化できることが立証されてきた。（Ｂｕｒａｋｏｆ　ｆ、Ｓ、Ｊ、およびＭ。

Ｆ、Ｍｅｓｃｈｅｒ　１９８２年。リンパ球の相互作用の研究における再構築された膜およびリポソーム。Ｐｏ５ｔｅ、Ｇ１．Ｎ１ｃｈｏｌｓｏｎ、Ｂ、、編集によるセルサーフイス　リビューに掲載。Ｎｏｒｔｈ　Ｈｏ１ｌａｎｄ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、Ｓ、Ａ、Ｎ。

およびＭ、Ｆ、Ｍｅｓｃｈｅｒ　１９８６年。細胞サイズの、支持された人工膜（偽細胞）、クラスＩ　ＭＭＣタンパク質に対する前駆細胞障害性Ｔリンパ球の応答。Ｊ、１ちまた、Ｔ細胞と抗原を保持する膜との間に可能な表面相互作用の領域が抗原の表面密度と同様に効率的な活性化において重要であることを示唆していた（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、Ｓ、　Ａ、　Ｎ、　、およびＭ、Ｆ、Ｍｅｓｃｈｅｒ　１９８７年。細胞サイズの人工膜上でのクラスＩタンパク質による細胞障害性Ｔ細胞の活性化；抗、原密度およびＬｙｔ−２／３機能、Ｊ、１ｍｍｕｎｏ１．１３８；２０３４．Ｈｅｒｒｍａｎｎ、Ｓ、Ｈ：　およびＭ、Ｆ、Ｍｅｓｃｈｅｒ１９８６年。クラスＩ抗原認識における抗原の多価性および刺激された前駆細胞溶解性リンパ球の誘発のための要件。Ｊ、Ｊｒｎｍｕｎｏｌ、１３６；２８１６．）。生体外の刺激は起こり得るが、細胞障害性Ｔ細胞の応答を生体内で刺激および増大するのために、既知のＴ細胞抗原の細胞に似た形態のものを効果的に使用することについては知ら疫原の開発はかなり長い間にわたって強い関心が寄せられた課題であり、かつ数々の処方が動物のモデルおよび人間において試験されてきた。多くのものが体液性応答を誘発することについては大変効果的であったが、多くは細胞性免疫を活性化する上では効果がない。多くの処方が今日報告されている１４１’（実験により立証されたＰＣＴＬ活性化のための決定的な要件を満たしていない。効果的免疫原を作り出す上での多価性の重要性はある程度まで評価されていた。最近の事例はイスコム（ｉｓｃｏｍ−ｓ）（免疫刺激複合体）、両親媒性の抗原およびアジュバント特性を有する疎水性マトリクス・（ＱｕｉＬ　Ａ）からなる粒子、（Ｍｏｒｅｉｎ、８．１９８８年イスコム抗原提示システム。Ｎａｔｕｒｅ　３Ｂ２；２８７）およびリポソーム様の物理的形態にある抗原を有するプロテオソーム（Ｌ　ｏｗｅｌｌ、　Ｇ、Ｈ，、Ｌ、Ｆ、Ｓｍｉ　ｔｈ、　Ｒ，Ｄ、５ｅｉｄおよびＷ、　Ｄ、Ｚｏ　ｌ″ｌｉｎｇｅｒ　１９８８年）とを含んでいる。疎水性の脚部を介してプロテオソームに結合されたペプチドは、アジュバントを伴わないでかなり免疫原性になり得る。（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１６７　；６５８゜）。それらは多価性ではあるが、それでもなお細胞に対しては小さく、イスコムは約０．０３５μの直径を有し、プロテオソームは約０．　１μの直径を存する。したがって、それらはマクロファージによるＢ細胞との相互作用の取込みを最大にするかもしれないがかもしれないが、ＰＣＴＬの活性化のために決定的な大きさをかなり下回る。その上、最近処方された免疫原は、Ｈ−２−制限ＣＴＬによる認識に含まれるクラス１ＭＭＣタンパク質を保有していない。

前駆体（ＰＣＴＬ）およびエフェクタ細胞溶解性Ｔリンパ球（ｅＣＴＬ）の抗原特異的な生体外活性化のための細胞表面分子の研究にはかなりの研究努力が集中的になされてきた。これに対する主な方法は、適切なアフィニティ精製された抗原を保持するはっきりした人工膜を使用することであった。細胞サイズの（＞０．２μ、たとえば５μの直径）のビーズ上に支持された人工膜を準備するための新規な方法が開発され１．かつここに開示するように、これら人工の膜が小さい免疫原の注入に起因しない生体内の免疫原応答を作り出すことが現在発見されている。これらの支持された膜は、我々の以前の刊行物では偽細胞と呼ばれていたもので、大型多価免疫原（ＬＭ　１　）と名付けられる。

・発明の要約この発明は、大型多価免疫原（ＬＭＩ）［０，２μ（直径または最大直径で）より大きい物理的支持体上の安定した配列にあるリガンド］の生産、および予防または治療目的でそれらを生体内に導入することを特徴とする。リガンドが含むものは、ｉ）抗原に特有の態様で、Ｔ細胞受容体を含む表面受容体により結合された分子、およびｉｉ）非−抗原特異的な態様で細胞表面成分と相互作用して抗原特異的な相互作用または細胞活性化を促進する分子である。

ＬＭＩの生産は安定した表面配列を結果としてもたらす様々な方法のいずれかにより行なわれ、これらの方法は膜内への組込みもしくは表面への吸着または共有結合を含み、重要なパラメータはその物理的支持体の大きさである。

生体外の結果に基づき、細胞サイズの、大型多価免疫原（ＬＭ　Ｉ　）　と呼ばれる抗原保有人工膜を投与することの生体内の効果を探求するために実験が行なわれてきた。ＬＭｌ保有アロ抗原は、ｉ、ｐ、投与されたとき、ＣＴＬ応答の形成を刺激しない。しかしながら、それらは同種異系間の腫瘍細胞とともに投与されたときアロ抗原特異的な応答を劇的に増大させる。同系の動物で成長する腫瘍細胞に対する溶解性の応答を検査する場合にも同様の結果が得られた。同系のマウスへのＥＬ４、ＲＤＭ４またはＰ８１５腫瘍細胞の１．　ｐ、接種は結果として腫瘍を成長させ、かつ最終的にマウスの死をもたらした。腫瘍細胞から分離されたプラズマ膜の形でのＬＭＩ保有ｎ瘍抗原が注入の際に投与されると、強い溶解性の応答が１０日ないし１２日以内に進展する。その上、ＬＭＩ治療による動物における腹腔の腫瘍重量は、対照に比べた場合劇的に減少する（または消失する：〉９９％の減少）。

腫瘍保有宿主を治療するためにＬＭＩとシクロホスファミド（ＣＹ）が組合されて使用されるとき、独自かつ顕著な相乗効果が得られる。したがって、この発明の一面は、腫瘍の治療にＬＭＩおよびＣＹを併せて使用する上で実施される。

この発明は、細胞の応答を活性化させるために腫瘍を有する哺乳類を治療する方法で実施される。この方法は、０゜２μより大きい主要直径を自゛する大型粒子上に支持された多価リガンド配列から本質的になる大型多価免疫原の先庄内投与により実行される。好ましい方法では、大型多価免疫原は約５．　０μの直径を有する。大型多価免疫原は、はるかに人きい直径を有してもよいが、より大きい直径による顕著な利点は知られていない。細胞の活性化は、抗原特異的Ｔ細胞、マクロファージ、単球またはナチュラルキラー細胞の活性化を形成し得る。

この発明は、細胞の応答を活性化させかつそれにより哺乳類における腫瘍の成長を抑止または妨げるために、腫瘍を自′することが知られていないかまたは有すると疑われる哺乳類を治療する方法で実施される。この方法は、０．２μより大きい主要な直径を有する大型の粒子上に支持され、た多価リガンドの配列から本質的になる大型多価免疫原の生体内投与により実行される。好ましい方法では、大型多価免疫原は約５．０μの直径を有する。細胞の活性化は抗原特異的Ｔ細胞、マクロファージ、単球またはナチュラルキラー細胞の活性化をなすかもしれない。

個々のＴ細胞はそれらの抗原特異的受容体（Ｔ　ＣＲ）の特異性に関しては異なるが、それ以外は共通の活性化要件を提示している。同種異系（移植）および腫瘍モデルに関するＬＭＩの生体内効力を示すデータが提示される。これらの発見において示唆されることは、ウィルス、細菌、寄生虫、移植片対宿主および自己免疫による疾患を含む、Ｔ細胞応答を含む他の疾患の免疫化または治療にＬＭＩを適用することである。すべての場合において本質的方法は同してあり、かつ使用はＬＭＩに組込まれる抗原（リガンド）の選択に関してのみ異なると考えられる。

哺乳類の疾患の治療または予防のいずれかのために、上記の材料を組合せて、大型多価免疫原とは異なる物理的形態のリガンドを付加するかまたはこれを付加せずにこの方法は実行され得る。ワ、ガントの成分は、細胞表面、抗原、ハプテンもしくは他の免疫原種、または種々のリガンドの混合物に特異的な抗体から本質的に形成され得る。ここで使用される「リガンド」という用語は一般的な免疫化学的意味の用語であり、すなわちもう１つの分子とともに複合体を形成し、または細胞の表面または分子上などに特異的な決定基に結合するかまたはこれを含むいかなる分子をも意味し、そのより一般的な例としては抗体および抗原がある（たとえば５ｔｉｔｅｓ、Ｄ、Ｐ、、５ｔｏｂｏ、Ｊ。

Ｄ５　およびＷｅ　１１　ｓ、Ｊ、　Ｖ、の「基本的かつ臨床的な疫学Ｊ　（ＢＡＳＩＣ＆ＣＬＩＮＣＡＬ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ）Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ。

ＣＴ、、１９８７年を参照）。

的なものであることを示すデータを図示する。

ＣＤ２Ｆ１のマウスは示された刺激因子をｉ、ｐ、注入された。腫瘍の細胞およびビーズは１０７のビーズで使用された。Ｈ−２ＫｂはＥＬ４腫瘍細胞からｖ４製されかつＨ−２にゞはＲＤＭ４腫瘍の細胞から精製された。注入の後１０口１に、腹腔の細胞は取除かれ、かつ示されたエフェクタ：標的の割合で４時間の検定で５１Ｃ「ラベルＲＤＭ４およびＥＬ４標的を使用して、細胞溶解活性のために検定された。結果はパーセンテージでの特異的なりロム解離として示される。

ＲＤＭ４刺激因子（単独またはビーズで）を受けとったマウスからの細胞はＥＬ４標的を死滅させず、かつＥＬ４刺激因子（単独またはビーズで）を受けとった細胞はＲＤＭ４標的（グラフには図示せず）を死滅させな面上の抗原の密度に依存していることを示すデータを図示する。

Ｃ５７Ｂ　Ｌ／６マウスは示された刺激因子をｔ、ｐ、注入された。ＲＤＭ４腫瘍細胞およびＬＭＩが１動物当たりｌＯ７で使用された。高密度の抗原を保持するＬＭＩが１０７ビーズ当たり１０μｇのＨ−２を使用して作られかつ低密度のＬＭＩが１０７当たり３μｇを使用して作られた。

Ｈ−２ＫＫの抗原はＲＤＭ４細胞から精製されかつＨ−２′抗原はＰ８１５腫瘍細胞から精製されている。注入の後１０日後、腹腔細胞は取除かれ、かつ５１Ｃ「−ラベルのＲＤＭ４　（Ｈ−２）およびＰ８１５　（Ｈ−２４）標的を使用して、細胞溶解活性のために検定される。１群当たり２匹のマウスからのＰＥＬが検定のためにプールされた。

第３図はＬＭＩの投与により腹腔腫瘍の重量が減少することを示すデータを図示する。

治療を受けたマウス（＋）は同時に腫瘍抗原（プラズマ膜）を保持する１０’のＬＭＩを受けている。９日（ＥＬ４およびＲＤＭ４）または１１日（Ｐ８１５）の後、腹腔の細胞が採取されかつ数えられた。示された値は各グループにおける２匹のマウスに対して得られた平均値である。

治療を受けていない（−）対照に対する治療を受けた動物の腫瘍の重量のパーセントでの減少が示される。

第４図は、腫瘍の減少のためには、腫瘍の抗原（プラズマ膜）が遊離したプラズヤ膜の小胞としてではな（ＬＭＩ上で投与される必要があることを示すデータを示す。

Ｃ５７Ｂ　Ｌ／６マウスは１０Ｇの生きたＥＬ４細胞をｉ。

ｐ、接種された。同時にＥＬ４プラズマ膜を保持する１０１０７Ｌまたは懸濁液でのＥＬ４プラズマ膜が投与された。

膜はＬＭＩ上のもの（ＩＸプラズマ膜）に等しい量または１０倍多い投与ｆｉｔ（ＩＯＸプラズマ膜）で使用された。腹腔細胞は１３日１に採取されかつ数えられた。値は各グループの２匹のマウスに関して得られた平均値であり、かつその対に対して得られた範囲が示される。

第５図は、腫瘍の成長を低減させるためのＬＭＩ投与の３つの経路の効果を比較するデータを示す。

ＣＤ２Ｆ１のマウスは１０ｓのＰ８１５細胞をｔ、Ｉ）。

接種された。同時にＰ８１５プラズマ膜または正常なマウスの血清タンパク質（ＭＮＳ）のいずれかを有するＬＭｒがすべての場合について１匹のマウス当たり１０’ＬＭＩを使用して、示された経路により投与された。腹腔膜は接種の後１１目後に採取されかつ数えられた。ＬＭＩを保有する腫瘍抗原で治−療されたグループは４匹のマウスから各々構成され、かつ示された値は示された標準偏差での平均値である。対照群（腫瘍のみおよびＮＭＳ−ＬＭＩ治療による）は各々２匹のマウスからなりかつ平均値が示される。

腫瘍の接種またはＬＭＩのいずれをも受けていない正常なマウスからの腹腔のウォッシュアウト細胞の回収が６匹のマウス（底部のバー）に関してＩＩ定され、かつその標準偏差が示される。

第６図は、ＬＭＩで治療されたマウスからの腹腔の浸出されたリンパ球の腫瘍特異的細胞溶解活性を示すデータを示す。

ＬＭＩで治療を受けたマウスからの腹腔の浸出されたリンパ球の腫瘍特異的細胞溶解活性では、Ｃ５７Ｂ　Ｌ／６のマウスが１０６の生きたＥＬ４細胞を接種された。治療を受けたマウスは同時にＥＬ４膜を保有する１０’ＬＭＩを受けた（ＥＬ４＋ＬＭＩ）。生きた腫瘍を持たない対照マウスもまたＥＬ４膜を保有する１０’ＬＭＩを注入された（ＬＭＩのみ）。１２日後、腹腔細胞が採取され、１時間プラスチックに付着されかつ付着しない細胞はＥＬ４およびＲＤＭ４標的を使用して４時間のＣｒ解離検定で溶解活性に関して検定された。ＬＭＩで治療されたマウスは、腫瘍の重量がＬＭＩ冶療治療り〉９９％減少した第４図に示されたものと同じであった。個々のマウスからの細胞が検定されかつ結果が各グループの双方の動物に関して示された。死滅はパーセンテージでの特異的解離として示される。

自然に起こる解離はＥＬ４に関しては１９５ｃｐｍでありかつ２４８ｃｐｍであり、全体的に解離可能なものはＥＬ４に関しては２５４９でありかつＲＤＭ４に関しては２９３８であった。

第７図はＬＭＩで治療を受けたマウスからの牌臓の細胞による腫瘍特異的ＣＴＬ応答の再刺激を示すデータを示す。

第７Ａ図にグラフ化されたデータを得るために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスは１０６の生きたＥＬ４細胞をｉ、ｐ、接種され、同時に１０７のＬＭＩ保［ＥＬ４抗原が投与された。１２０の後、牌臓（２匹のマウス）が取出され、プールされ、かつ放射線照射されたＥＬ４細胞とともにまたはその細胞なしで培養中に置かれた。生体外での６［］間の培養の後、細胞は、ＥＬ４およびＲＤＭ４標的を用いる４時間のＣｒ解離検定によって溶解活性を検定された。放射線照射されたＥＬ４とともに培養された細胞に対する結果が示されている。刺激因子なしで培養された細胞は、どちらの標的に対しても溶解活性を示さなかった。

第７Ｂ図にグラフとして示されるデータを得るために、ＣＤ２Ｆ１マウスは１０６の生きたＰ８１５細胞を接種され、同時に、何もなしく無）か、１０７のＬＭＩ保有Ｐ８１５抗原（ＬＭＩ−Ｐ８１５）または１０７のＬＭＩ保有正常マウスの血清（ＬＭＩ−ＮＭＳ）を用いて治療された。

７１１の後、牌臓が取出され（１群につき２匹のマウス）単独かまたは放射線照射されたＰ８１５細胞とともに培養中に移された。裏体外での６０間の培養の後、Ｐ８１５およびＲＤＭ４標的に対する溶解活性が検定された。Ｐ８１５標的に対して再刺激された細胞について得られた結果が示されている。ＲＤＭ４標的の殺生は見られなかった。耕第８図は、ＬＭ１１Ｆ独、ＣＹ　ｌｌｔ独、オヨびＬＭＩとＣＹの併用で治療されたマウスの生存期間をデータとして示しており、＠瘍接種の日から始める治療は、ＬＭＩとＣＹを併用した場合、両者の間に相乗性を示している。

第９Ａ図は、ＬＭＩＱｉ独、ＣＹ単独、およびＬＭＩとＣＹの併用で治療されたマウスにおける腫瘍の範囲の相対的平均をデータとして図示している。腫瘍の接種の口より１０１」の後、マウス中に腫瘍が確立したとき、始められる治療は、ＬＭＩとＣＹを併用した場合、腫瘍の治療において両者の間に相乗性が示される。

第９Ｂ図はＬＭＩ単独、ＣＹ単独、およびＬＭＩとＣＹの併用で治療されたマウスの生存期間をデータとして図示しており、腫瘍の接種の日より１０日の後、マウス中に腫瘍が確立されるときに始められる治療は、ＬＭＩおよびＣＹを併用した場ＱＳ腫瘍の治療において両者の間の相乗性があることを示している。

好ましい具体例の記載び膜間のシグナル発生が、ＣＴＬ表面の測定できる範囲を越えて高度に多価な相互作用を必要とするということである。ＬＭＩはこれらの必須の要件を満たしており、しかちり、しかも免疫治療におけるＬＭＩの潜在的な適用は、３つのネズミ腫瘍モデル系を用いることにより評価されてきた。

ＬＭＩを保有し、アフィニティ精製されたアロ抗原は、ｉ、ｐ、投与された場合、ＣＴＬ応答の形成を刺激しない。

しかし、ＬＭＩも投与された場合、放射線照射された同種異系の細胞に対する生体内での応答は、大きく増大させられる（１０ないし５０倍）。この予期せずかつ劇的な増大は、抗原特異的であり、かつＬＭＩ上のアロ抗原密度に依存している。

同系の腫瘍に対するＣＴＬ応答は、腫瘍細胞から分離された、ＬＭＩ保有精製プラズマ膜を用いることにより試験されてきた。試験された腫瘍細胞は、Ｐ８１５（肥満細胞ｆｉ）、ＥＬ４（胸腺腫）およびＲＤＭ４　（リンパ！ｆｉ）を含んでいた。そのすべては、同系のマウスの腹腔において速やかに増殖し、かつ２ないし４週間のうちにマウスを殺した。ＬＭＩ保肴腫瘍膜の先Ｋｌ’ｉへの投与は、いくつかの場合、１２日口の対照に比較して、腹腔の腫瘍重量が９９％以上と劇的に減少した。同種異系の応答の場合のように、単独で投与された場合には、ＬＭＩ保有腫瘍抗原は、ＣＴＬ応答を誘発しない。しかしながら、腫瘍を接種されかつＬＭＩで治療された動物からの腹腔リンパ球は、高いレベルでＭ瘍−特異的細胞溶解活性を発現する。さらにまた、その腫＠重量が減少させられたか、または消失させられた動物からの膵臓細胞は、生体外で再刺激された場合、強く腫瘍特異的応答を開始する。一方、治療されず、腫瘍を保有する動物からの膵臓細胞は、応答があっても僅かしか示さない。このように、適切な形態での腫瘍抗原の投与が、腫瘍の増殖を劇的に減少させ得る。この効果は、見たところ、少なくとも部分的には、腫瘍−特異的ＣＴＬに、よりよく媒介されているように見える。

これらの発見および方法の動物およびヒトのがんの免疫治療への適用は、ただちに明らかであり、また、その他の疾患に対する適用も、この発明の残りの部分が一般的でありかつ腫瘍およびそれと同様のものに対して唯一のものでないような免疫化学的竹垣のちとにある限りは、当業者において明らかである。

この発明は、０．２ミクロン以上の主要な直径を有する大きな粒子上に支持された多価リガンド配列から本質的に活性化する哺乳動物において、上述した特定のクラスの疾患のみならず、ウィルス、細菌、寄生虫、移植片体宿主および自己免疫による疾患を予防または治療するために哺乳動物を治療する方法を包含し、好ましくは、大型多価免疫原が約５ミクロンまたはそれ以上の主要な直径を有し、また、注入可能な溶液の形態でありかつ大型多価免疫原と異なる物理的形態のリガンドを任意に含むことができる成分を用いている。　・材料および方法ＭＩ（ＣクラスＩおよびクラス■抗原をアフィニティクロマトグラフィにより精製した。デオキシコール酸緩衝液中のタンパク質をスフェリソルブ（Ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ）ＯＤＳＩ　（５ミクロン）ビーズ（Ｐｈａｓｅ　Ｓｅｐ、Ｎｏ　ｒｗａ　ｌｋ、ＣＴ）および添加された脂質の懸濁液に混合した。使用された成分の典型的な比率は、Ｈ−２タンパク質６μｇ１脂質５ｎｍｏ　ｌ　ｅ、ビーズ１０７であった。

その後、懸濁液は、デオキシコール酸を除去するために、４８時間、透析された。この期間の最終時点において、すべてのタンパク質および脂質はビーズに結合された。そしてタンパク質の約５０％がビーズの表面に露出していた。

（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、Ｓ、Ａ、Ｎ、および　Ｍ、　Ｆ。

Ｍｅｓｃｈｅｒ、１９８６．細胞サイズの支持された人工膜（偽細胞）、前駆細胞障害性１９２８球のクラス１ＭＭＣタンパク質への応答。Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３７．３３８３、）透析の後、ビーズは、低速の遠心分離によってベレットにされたビーズとともに、適切な緩衝液中で、数回洗浄されることにより、使用のために調製された。

ＣＴＬ表面の構成成分に特異的な抗体は、希釈工程によりビーズ上に組込まれた。スフェリゾルブ０ＤＳＩ　（５ミクロン）ビーズ（Ｐｈａｓｅ　Ｓｅｐ、Ｎｏｒｗａｌｋ。

ＣＴ）を、ジメチルスルホキシド（典型的には、ジメチルスルホキシド０．０２ｍ−１中に乾燥ビーズ１．５ｍｇ）中に懸濁した。次に、ジメチルスルホキシドの大量希釈となった条件のもとで、この懸濁物を抗体の溶液に添加した。

その後、タンパク質ビーズの懸濁液を１時間、４段階で攪拌し、次にビーズを採集した後、緩衝液によって３回洗浄した。

腫瘍細胞から分離されたプラズマ膜は、腫瘍に特異的な抗原を保Ｈしていた。分離されたプラズマ膜を上述したと同様の方法によって、スフエリゾルブ０ＤＳＩビーズ上に被覆した。ジメチルスルホキシド中に懸濁されたビーズは、硫酸緩衝塩水中の腫瘍細胞プラズマ膜の懸濁液に添加され、４℃で１時間インキュベートされた。そして、ビーズは結合しなかった膜の小片を除去するために、低速遠心分離によって２回洗浄された。

生体外において、ＣＴＬ活性を２つの方法のうち１つによって評価した。まず最初に、培養中のマウス膵臓細胞による細胞溶解応答の誘導についてＭ」定した。

この方法の詳細は公表されている。（Ｂｕｒａｋｏｆ　ｆ、Ｓ、Ｊ、および　Ｍ、Ｆ、Ｍｅｓｃｈｅｒ　１９ｇ２．　リンパ球相互作用の研究における再構築された膜およびリポソーム。Ｐｏ５ｔｅ、Ｇ、、Ｎ１ｃｈｏｌｓｏｎ、Ｂ、、編集によるセル　サーフイス　レビュー（Ｃｅｌｌ　ＳｕｒｆａｃｅＲｅｖｉｅｗｓ、）Ｎｏｒｔｈ　Ｈｏ１ｌａｎｄ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、Ｓ、Ａ、Ｎ、およびＭ、Ｆ、Ｍｅｓｃｈｅｒ　１９８６．　細胞サイズの支持された人工膜（偽細胞）：前駆細胞障害性１９２８球のクラス１ＭＭＣタンパク質への応答。Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ。

１３７．３３８３．）第２に、クローン化されたエフェクタＣＴＬ活性化を刺激によって培養中に放出されるセリンエステラーゼ活性の測定により確定した。（Ｐａｓｔｅｒｎａｋ、Ｍ、、Ｃ，Ｒ，Ｖｅｒｒｅｔ、Ｍ、Ａ、Ｌｉｕおよび　Ｈ，Ｎ、Ｅｉｓｅｎ　１９８６．　細胞溶解性１９２８球におけるセリンエステラーゼ。Ｎａｔｕｒｅ３２２．７４０．）Ｃ５７Ｂ　Ｌ／６および（ＣＢＡｘＤＢＡ／２）Ｆｌ　（ＣＤ２Ｆ１）マウスをジャクソン研究室、Ｂａｒ　Ｈａｒｂトｏｒ、ＭＡより購入した。Ｈ−２Ｋ　、Ｈ−２Ｋ　およびに−２１クラスＩネズミＭＭＣ抗原を上述したようにして精製した。　（Ｍｅｓｃｈｅｒ、Ｍ、Ｆ、、に、Ｃ，５ｔａ１１ｃｕｐ、Ｃ，Ｐ、Ｓｕｌ　Ｉｊｖａｎ、Ａ、Ｐ、Ｔｕｒｋｅｗｉｔｚ　および　Ｓ、ＨｌＨｅｒｒｍａｎｎ　１９８３、モノクロナル抗体アフェニティクロマトグラフィによるネズミＭＨＣ抗原の精製。Ｌａｎｇｏｎｅ、Ｊ、Ｊ。

、Ｖａｎ　Ｖｕｎａｋｉｓ、Ｈ，、編集による。　酵素学の方法。Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、９２：８６．）抗原を上述した透析方法を用いて、５ミクロンビーズ上に組込んだ。得られたＬＭＩをリン酸緩衝塩水中に懸濁し、１０７ビーズ／マウスで、単独または１０７の同種異系の腫瘍細胞とともにマウスへｔ、ｐ、注入した。使用した腫瘍の細胞系は、ＡＫＲマウス由来のＲＤＭ４　（Ｈ−２）リンパ腫およびＣ５７Ｂ　Ｌ／６由来のＥＬ−４（Ｈ− ２ｂ）胸腺腫であった。注入後、１０日ｌ０マウスを殺し、腹腔の細胞を採取して洗浄した後、数えた。いくつかの場合においては、樹脂器への付着の１周目で、付着細胞を取除いた。腹腔細胞群の細胞溶解活性は、いくつかの異なるエフェクタ（Ｅ）対標的（Ｄ）の比率で、標準的な４時間クロム解離検定において、Ｃ，Ｉ＋ラベル標的細胞を使用して、同種異系の腫瘍細胞の標的を殺生する能力を測定することによって検定した。結果は、それぞれのＦＡＴ比率に対する特異的な溶解の１００分率または溶解ユニット数として表している。１溶解ユニツトは、４時間の検定において、標的細胞の５０％を溶解するために必要なエフェクタ（腹腔の）細胞の数として定義している。

Ｍｌが細胞性の応答を誘導することができ、かつ腫瘍の増殖を減少させることができることを示してきた。決定的な発見についてここにまとめて議論し、データの詳細および対照実験について次の章で述べる。

使用された最初のモデルは、同種異系のＣＴＬ誘導のもので、そのモデルにおいて、外来細胞上のクラス１ＭＭＣ抗原に特異的なＣＴＬは活性化される。動物への同種異系腫瘍の誘導は、特異的なＣＴＬ応答の誘導と腫瘍の排除をもたらす。

生体内でこの応答を誘導するため、リポソーム上の抗原を用いる我々の研究室での以前の試みは、体液性らず、細胞性免疫の誘導のための証拠は何も得られなかった。リポソームは粒子状でありかつ多価性の形態の抗原を提供しているが、それは小さく、０．１ミクロン以下の直径を有している。

ＬＭＩ上のＭＭＣ抗原の生体内投与は生きた腫瘍細胞とともに投与されるとき、同種異系のＣＴＬ応答の劇的な増大をもたらす。

標的ＥＬ４　１　１９ＲＤＭ４　６　１ＫｋＬＭＩ　０　０ＥＬ４＋ＫｋＬＭＩ　０　２６ＲＤＭ４＋ＫｋＬＭＩ　６２５　８ＬＭＩ上のアロ抗原は、生体内において、アロ抗原保有腫瘍細胞に対するＣＴＬ応答の活性化を特異的に増大させる。腫瘍細胞および／またはＬＭＩは、ＣＤ２Ｆ１マウス中にｉ、ｐ、注入された。細胞およびＬＭＩは、動物１個体当たり１０７で用いた。ＬＭＩは、ビーズ１０７個当たりＨ−２Ｋ　１０Ｉｇを使用して調製した。注入してから１０Ｉ」間の後、腹腔細胞を取出し、３つのＥ：Ｔ比率において、クロムでラベルされたＲＤＭ４およびＥＬ４標的細胞を使用することによって、細胞溶解活性を検定した。細胞溶解活性は、方法の項で記載したと同様に算出された溶解ユニットとして示している。

表１に示されるように、ＲＤＭ４　（Ｈ−２）細胞は、６溶解ユニツトの応答を刺激した。Ｈ−２Ｋ　を保有するＬＭＩは、単独で投与された場合、何も応答を刺激しなかったが、腫瘍細胞と一緒に投与された場合、応答は６２５溶解ユニツトまで約１００倍に増大された。この増大された応答は特異性を維持しており、エフェクタ細胞はＨ−２８抗原を保Ｈする標的を効果的に殺す一方、異なる抗原を保ａするＥＬ−４（Ｈ−２）標的に対してはわずかな殺生の活性しか有さなかった。

さらなる実験は、ＬＭＩ治療によって、２０ないし１００倍の増大を一貫してもたらし、さらに効果の抗原特異性が確かめられた（第１図）。増大の倍率は、ＬＭＩ上の抗原の表面密度に依存している（第２図）。この増大は、抗原を保有する粒子の大きさにも依存している一方、リポソーム（直径０．２μ〉）上に同じ精製された抗原を付着して注入しても応答を増大させなかった。

ＬＭＩによる同種異系の細胞溶解活性の誘導の増大は、防御性のＣＴＬ応答を増大させ、その結果、ウィルスの感染およびがんを含む種々の疾患の治療を提供するためのしＭｌ使用の可能性を示している。適切な抗原を運ぶＬＭＩによる弱い細胞溶解性応答の増大は、病気を引起こすようなライスルの感染またはがん性の細胞を効果的に排除することができるＣＴＬ群の生産をもたらすことができた。

このことをテストするために、３つの異なるネズミの腫瘍モデルが試験された。

ＲＤＭ４、Ｐ８１５およびＥＬ４腫瘍細胞から分離されたプラズマ膜の小片を用いてビーズをコーティングすることによりＬＭＩが調製された。ＲＤＭ４はＡＫＲマウスに由来するリンパ腫であり、Ｔ８１５は、ＤＢＡ２マウスに由来する肥満細胞腫であり、ＥＬ４はＣ５７Ｂ　Ｌ／６に由来する胸腺腫である。腫瘍は、同系のマウス（すなわち起源となる血統のマウス）中にｉ、ｐ。

注入された場合、急速に増殖し、かつ１０ないし２０日間の間にマウスを殺す。

プラズマ膜は、腫瘍細胞から精製されて、ジメチルスルホキシドからの希釈を含む方法を用いることによって、ＬＭＩ上に組込まれた膜小片とともに抗原として用いられた。３つの腫瘍のすべてに対して、適切な抗原保有ＬＭＩの投与は、接種の後、９日間で、腫瘍細胞数の劇的な減少をもたらした（第３図）。腫瘍の重量におけるこの劇的な減少は、多くの実験において再現性よく認められ、かつ多くの場合、ＬＭＩで治療された動物から回収された細胞の数は、腫瘍を接種していない対照の動物から回収された細胞の数とほとんど変わらなかった。すなわち、ＬＭＩ治療は、完全に腫瘍を排除したと考えられる。

腫瘍重量の減少は、主に抗原保有粒子の物理的大きさに依存している。０．２μ 以下の直径を有する分離されたプラズマ膜小片の投与は、腫瘍の増殖に対して顕著な効果を示さなかった一方、ＬＭＩ上に組込まれた同じ小片は、腫瘍の増殖を効果的に減少（または消失）させた（第４図）。

以上の実験においてＬＭＩは、腹腔内すなわち腫瘍の増殖部位に投与された。ＬＭＩは、皮下または静脈内に投与された場合でも、腹腔内の腫瘍の増殖を減少させるのに効果がある（第５図）。最近のデータは、ｉ、ｖ、投与が最も効果的な経路となり得ることを示しているが、この発明は、ｉ、ｖ、投与に依存しない。

これらの結果は、免疫治療においてＬＭＩ使用のための可能性を広げており、その中でこれらは効果的であるために、ＬＭＩは腫瘍増殖部位において投与されるべきではないことを示している。

マウスは、ここに採用された同系の腫瘍の接種に対して、少ししかまたはまったく腫瘍特異的なＣＴＬの応答を示さない。そして、腫瘍は増殖しその動物を殺す。対照的に、腫瘍を接種されかつＬＭＩで治療されたマウスにおいては、強い腫瘍特異的な細胞溶解活性が見られた。腫瘍が接種され、ＬＭＩで治療された動物から（接種の７ないし１０日後）腹腔に浸出されたりシバ球は、接種に使用された腫瘍に対して強い溶解活性を示したが、関係のない腫瘍の標的に対してはまったく溶解活性を示さなかった（第６図）。

治療された動物における腫瘍特異的な細胞溶解活性は、こして強く、腫瘍特異的な応答を示した実験からも示された（第７Ａ図およびＢ図）。対照的に、腫瘍を有し、ＬＭＩによる治療を受けなかった動物からの膵臓細胞は、応答をまったく示さなかった（第７Ｂ図）。

したがって、同種異系間の応答の場合のように、ＬＭＩを保有する抗原は、腫瘍特異的な細胞溶解活性を（検出不可能なレベルから）増大させる。この溶解応答の活性化に付随した効果は、動物における腫瘍の増殖の劇的な減少または消失である。未だに立証はされていないが、活性化された細胞溶解性Ｔリンパ球が腫瘍の増殖の消失を媒介していることがかなり確からしい。ＬＭＩ治療の作用機構に関係なく、はっきり得られた結果は、哺乳類のがんの免疫治療におけるこの発明の価値を示している。さらに、別々の２つのモデル系で同時に得られた発見は、適切な抗原を有するＬＭＩを用いた治療が、ウィルス、細菌および寄生虫の感染、移植片対宿主の疾患ならびに自己免疫疾患を含む、Ｔリンパ球が防御的な役割を果たし得るような疾患に対する免疫処置および／または治療において有用であろうという結論を強く支持している。

いることを示していた。このことに基づいて、’４ＥＣＩＬのさらなる実験が、先住前の活性を促進するようなＬＭＩの構築に対して、いくつかの可能性があり便利な方法を示してきた。たとえば、わずかな抗原のみ（すなわちＭＨＣクラスＩまたはクラス■タンパク質がないもの）を有するＬＭＩは、生体外においてＣＴＬ応答を活性化する。そのようなわずかな抗原の例は、ウィルスのタンパク質または腫瘍に特異的な抗原に存在する配列に相当するペプチドを含む。

適当なウィルスのペプチドは、クローン化されたウィルス特異的ＣＴＬによりセリンエステラーゼの放出を活性化し得、しかも、このわずかな抗原がＬＭＩ上に組込まれるならば、クローン化されたハブテン特異的ＣＴＬを刺激し得る。

ＬＭＩの保白゛抗原とＴ細胞表面上の成分と結合する付加的分子は、特異的な相互作用を促進する。アロ抗原および付加的なリガンドの協力的な相互作用は、ＬＭＩ上のアロ抗原のみを用いて得られたものに比べ、ｉ（１’Ｌのより大きなＣＴＬ応答をもたらす。抗原特異的な誘発の促進が見られる付加的なＬＭＩリガンドは、ＣＴＬ表面タンパク質（Ｈ−２、ｔｈｅｔａおよびＬｙｔ−２を含む）に特異的な抗体および無関係なりラスＩ　（Ｌかしクラス■でない）タンパク質を含む。４．ＫＭで得られた効果に基づいて、これらの方法は、特異的な応答を誘発するための最適な里庄内活性を有するＬＭＩのデザインに適用されるであろう。

要約すれば、先生点でのリポソーム上のアロ抗原の投与が、生体内のＣＴＬ応答を刺激または増大させることができるかどうかを決定するための以前の努力では、アロ抗原に対する良好な抗体応答は得られたが、ＣＴＬ応答の形成に関してまったく効果は見られなかった。

同じアロ抗原が、大型多価免疫原を生産するために５μビーズ上に組込まれたとき、抗原保有細胞に対する先棒点のＣＴＬ応答が劇的に増大させられることがここに見いだされてきた。この方法の医療へのｉｉｌ能性は、適切な腫瘍抗原保有ＬＭＩがマウスにおいて、腫瘍の１ｌＥ（、に貞増殖を抑制するか（または完全に抑える）という発見により立証されてきた。効果的なＬＭＩの生産に対して重要なパラメータは、粒子の大きさく＞０．　２μたとえば直径５μ）および粒子上の抗原の密度である。２つの別々のモデル系におけるＬＭＩ処置の効果の立証により、この方法が、Ｔ細胞応答を含む他の疾患における免疫処置および／または治療のために潜在的な有用性を有しているということが結論づけ同種異系の腫瘍細胞の１．　ｐ、注入は、アロ抗原特異的ＣＴＬ活性を有するリンパ球群の腹腔内への浸出を結果としてもたらしかつ、１０７刺激細胞を用いることにより、液適応答が得られる。１・０７のアロ抗原保有ＬＭＩが刺激細胞とともにｉ、ｐ、注入された場合、１０日後に採集されたＰＥＬの細胞溶解活性は、刺激細胞のみを注入された動物からのＰＥＬの活性を越えて、劇的に増大される。第１図は、ＬＭＩが、もし刺激細胞と、同じアロ抗原を保有する場合には応答を増大させ、単独で注入された場合には応答を刺激しないことを示す２連の相互的な実験の結果を示している。ＣＤ２　（Ｈ−２’）応答体は、ＲＤＭ４　（Ｈ−２ｋ）またはＥＬ４　（Ｈ−２”　）細胞ならびにＬＭＩ−レ保有Ｈ−２Ｋ　またはＨ−２Ｋ　とともに種々の組合せでｉ、ｐ、注入された。

Ｋ”−ＬＭＩはＥＬ４刺激細胞とともに投与された場合、ＥＬ４−特異的応答の生成が増大され、一方、Ｋ−ＬＭＩは増大させなかった（左のパネル）。

単独で投与されたＫ　−ＬＭＩは、まったく応答がなかった。この相互的な結果（右のパネル）は、ＲＤＭ４刺激細胞を用いることにより得られた。Ｋ−ＬＩＭは、ＲＤＭ４とともに注入された場合、応答を増大させ、Ｋ”−ＬＭＩは応答を増大させなかった。単独で注入されたＫ　−ＬＭＩは応答をもたらさなかった。

この実験においてエフェクタ群のすべては、ＥＬ４およびＲＤＭ４の双方の標的を殺すかどうか試験された。

第１図に示すように、生体内ＣＴＬ応答の増大は、ＬＭＩ表面上の抗原に対して特異的である。ＣＤ２Ｆ１マウスは、表示された刺激因子とともにｉ、ｐ、注入された。腫瘍細胞およびビーズは、動物１個体当たり１０７で使用された。ＬＭＩは、ビーズ１０７個当たりＨ−２タンパク質１０μｇを用いることにより調製された。Ｈ−２ＫｂはＥＬ４腫瘍細胞からＭ製され、Ｈ−２ＫｋはＲＤＭ４腫瘍細胞より精製された。注入から１０日間の後、腹腔細胞は取出され、図に示されたエフェクタ対標的の比率において、４時間の検定においてＣ「５１ラベルされたＲＤＭ４およびＥＬ４標的を用いることにより細胞溶解活性が検定された。結果は特異的クロム解離パーセントとして示される。

ＲＤＭ４刺激因子（単独またはビーズとともに）を接種したマウスからの細胞は、ＥＬ４標的を殺さなかった。また、ＥＬ４刺激因子（単独またはビーズとともに）を接種した細胞はＲＤＭ４標的を殺さなかった。

増大された応答は、刺激している抗原に対して完全に特異的なままであり、第３の共通する効果は見られなかった。

トすなわち、ＲＤＭ４刺激因子とともにＫ　−ＬＭＩを注入した結果より得られる効果は、ＥＬ４標的に対する溶解活性を何も示さなかった。

増大の特異性は、複合的で独立した抗原およびＬＭＩの調製よりＨ−２Ｋ”　、　Ｈ−２に１１′　およびＨ−２試を用いることによって立証されてきた。与えられたレベルまで標的を溶解するのに必要なＥ対Ｔの比率または溶解ユニットの値を比較することに基づいて、これらの実験における増大は、刺激細胞のみが注入された場合に得られる応答の１０から１００倍の範囲にあうた。ＣＴＬ応答に対して予期されたように、付着細胞の除去（樹脂への付着の１サイクルごと）は、同種異系細胞のみて刺激された動物およびＬＭＩ−治療された動物からのＰＥＬ群において溶解活性の増加をもたらした。ＬＭＪ増大ＰＥＬ群に存在するエフェクタ細胞は、Ｔ細胞であることが、標的細胞の添加に先立って抗−ｔｈｙｌ抗体および補体によって細胞を処理するならば溶解活性が消失するという実証により確かめられた。

指摘されたように、精製されたアロ抗原が投与されるときの物理的形態は重要である。ＬＭＩ上の抗原は応答を増大させるが、リポソームに組込まれ、かつ同じかまたは高い投’５１１で投与された抗原は増大効果をまったく示さない。

ＬＭＩ上の密度もまた、それが生体外でのＣＴＬ活性のためである場合、重要である。第２図に示すように、１４１’ＨＣＴＬ活性化の特異的な増大は、ＬＭＩ表面上の抗原の密度に依存している。Ｃ５７Ｂ　Ｌ／６マウスは、図に示された刺激因子とともにｉ、ｐ、注入された。ＲＤＭ４腫瘍細胞およびＬＭＩは、動物側体当たり１０７で用いられた。

高い密度で抗原を保持するＬＭＩは、ビーズ１０７個当たりＨ−２を１０μｇ使用して形成され、低い密度のＬＭＩは１０７個当たり３μｇ使用することにより調製された。

Ｈ−２Ｋ”抗原は、ＲＤＭ４細胞から精製され、Ｈ−２１抗原はＰ８１５１ｎ瘍細胞から精製された。注入から１０日間の後、腹腔細胞を取出し、（ｒ　ｌ　＋でラベルされたＲＤＭ４（Ｈ−２）およびＰ８１５　（Ｈ−２ス）標的を用いて細胞溶解活性を検定した。２マウス／群からのＰＥＬは検定のためにプールされた。低い密度のＬＭＩによって治療された動物に比べ、高い密度のＬＭＩによって治療された動物において、より大きな溶解活性が認められた（第２図）。

このように、ＬＭＩ上のアロ抗原は、無傷で同種異系の刺激因子に対する生体内応答が最適となるまで増大され、しかも結果としてもたらされたエフェクタＣＴＬは刺激するアロ抗原に対してその特異性を維持している。先棒点のＬＭＩは、応答の援助兵器に基づいてよりのむしろ、明らかにＰＣＴＬ活性化の水準において作用している。生体外においては、ＬＭＩはＰＣＴＬを誘発するに当たって非常に効果的であるが、取込み、加工およびＴＨ細胞への提示のための抗原を提供することにおいては効果的でない。尖±座で増大させないリポソーム上のアロ抗原は、生体外においてＴＨ細胞活性化のための抗原を提供するが、ＰＣＴＬを直接活性化することにおいてはあまり効果的ではない。

ＬＭＩは、もしかすると自己分泌機能に依存するＩＬ−２により、ＰＣＴＬ群の拡張を刺激するかもしれない。ＴＨ細胞の活性化がない場合（すなわち全体の細胞共同刺激因子なしで）、増殖する前駆体は遅れて作用する分化因子が存在しないため、エフェクタとならないかもしれない。

このため、ＬＭＩ単独では溶解応答を生成しないであろう（しかし＊ｆＱはするであ・ろう）。なぜＬＭＩは、無傷の抗原保有細胞よりもより効果的にＰＣＴＬの拡張を刺激するであろうかは知られていない。このことは、たとえば、より長い時間でのＰＣＴＬとのそれらの相互作用から結果としてもたらされるであろうし、したがってＩ　Ｌ−２生産の持続された刺激をもたらすであろう。

同種異系のＣＴＬ形成に関するＬＭＩの効果を試験して得られた結果に基づき、まず、同系の腫瘍特異的応答に関する抗原保有ＬＭＩの効果について試験するため実験を行なった。我々は、ＥＬ４、Ｃ５７Ｂ　Ｌ／６血統の胸腺腫、ＲＤＭ４、ＡＫＲ血統のリンパ腫およびＰ８１５、ＤＢＡ−２血統の肥満細胞腫について試験を行なった。これらはすべて、同系マウスの腹膜中で増殖し、最終的にその宿主を殺した。ＣＴＬの認識に関連した腫瘍抗原は明らかにされていない。しかしながら、プラズマ膜は腫瘍細胞から分離することができ、しかもおそらく無傷の腫瘍細胞と同じ配列の表面タンパク質を有しているであろう。これが腫瘍特異的なＣＴＬにより認識される抗原を含むことは、腫瘍細胞から分離された膜が、生体外での２次的な腫瘍特異的応答の誘導を特異的に刺激することができるということを立証している研究により示されている。

膜の形態中のＬＭＩ保有腫瘍抗原は、ＰＢＳにおいて精製されたプラズマ膜小片の懸濁液中にビーズ（ＤＭＳＯ中に懸濁された）を単に希釈するだけで速やかに調製することができる。抗原保有しＭＩを同系のマウス中に腫瘍細胞とともにｉ、ｐ、注入した場合、９０ないし１１日で腫瘍の重量が劇的に減少することが見いだされた。このことは試験された３つのすべての腫瘍に対する場合であって、しかも腫瘍の重量における減少は、腫瘍接種の範囲が１０５ないし１０’細胞にわたって起こった（第３図）。さらに実質的とはいえ、重量の減少はＲＤＭ４の場合において最も少なく、接種レベルが１０７のＲＤＭ４のＬＭ！治療では減少があまりなかったかまたはまったく効果がなかった。

ＲＤＭ４は試験された３つの腫瘍のうち増殖が最も早いものである。ＬＭＩが腫瘍プラズマ膜を有していないならば、腫瘍の減少は起こらない。正常なマウスの血清タンパク質でおおわれたＬＭＩは、試験された腫瘍のどれに対しても腫瘍重量に関する効果はない（図示せず）。

同種異系の応答に関する限りでは、抗原の物理的形態は腫瘍の重量の効果的な減少に対して重要である。懸濁液中に遊離した膜の小片（直径＜０．２μ）としてプラズマ膜を注入した場合、腫瘍の重量に対してあまり効果を示さないかまたはまったく効果を示さない一方、ＬＭＩ上の同じ膜の注入は非常に効果的である。

第４図に示すように、腫瘍の減少は、腫瘍の抗原（プラズマ膜）が、遊離したプラズマ膜としてではなく、ＬＭＩ上で投与されることを必要とする。Ｃ５７Ｂ　Ｌ／６マウスは、１０６の生きたＥＬ４細胞とともにｉ、ｐ、接種された。同時に、１０７のＬＭ！保育ＥＬ４プラズマ膜またはＥＬ４プラズマ膜が懸濁液中で投与された。膜はＬＭＩ上のそれを等ｆｆ１（１×プラズマ膜）または１０倍の投与ｆｆ１（ＩＯＸプラズマ膜）で使用された。腹腔細胞は１３日で採集されかつ数えられた。その値は、それぞれのグループにおいて２匹のマウスで得られた値の平均であり、かつその２匹で得られた範囲を示している。

第４図に示す実験は２匹のマウスのグループで試験されたものであり、見いだされた範囲を示している。ここに示されるＴ−Ｒ実験のほとんどは、第４図に示されるものと同様の値の範囲にある２匹のマウス群を用いたものである。

そのデータは、ここに示されるＬＭＩの治療の劇的な効果を立証するために適切であると考えられる。

このようにして得られた制限された投与量の応答に関する情報は、少なくとも１０６／マウス（図示せず）、すなわちここに示される実験よりも１０分の１の投与量まで下げても、ＬＭＩは腫瘍を減少させる効果を維持していることを示している。Ｐ８１５Ｂ瘍の増殖の動態およびＬＭＩの効果を１つの実験で試験した。

マウスは、ＬＭＩの投与または無投与のもとで、１０５個の腫瘍細胞が接種された。

５日間で、両方の対照において腫瘍の増殖が起こり、マウスは治療され約２０Ｘ１０’／マウスの腹腔細胞が回収された。このときを過ぎて、対照のマウスでは増殖が続いたが、治療されたマウスにおいては、腫瘍の重量は減少した。

９０間で、対照は１６１．Ｘ１０’／マウスの細胞を有していたが、治療されたマウスは１．４Ｘ１０６であった。

いくつかの実験において、抗原保有ＬＭＩを単に投与したものは、対照に比べて回収された腹腔内細胞の数が、９９％以上減少した（第４図および上述した動態実験）。この水準では、治療された動物から回収される細胞の数は、腫瘍を接種していない正常な動物から回収されたものとそれほど大きく異なっていない。

ＬＭＩ投与の効果的な経路が満足のいく程度に試験された結果、効果的な投与経路が確立された。マウスは１０’のＰ８１５をｉ、ｐ、接種され、かつＬＭＩをｉ、ｐ、、ｉ、ｖ、（尻尾の静脈）または皮下より投与された。９日の後、マウスは殺され、腹腔細胞が流出させられ、カウントされた。ＬＭＩ保有Ｐ８１５膜抗原は、１．ｐ９　または皮下より投与されたとき、６０ないし７０％で腫瘍の重量を減少させた。相当するデータは第５図のグラフに示されている。ＣＤ２Ｆ１７ウスは１０５のＰ８１５ｖ細胞を１゜ｐ、接種された。同時に、Ｐ８１５プラズマ膜または正常なマウスの血清タンパク質（ＮＭＳ）を有するＬＭＩが、すべての場合において１０’　ＬＭ！／マウスで、図示された経路により投与された。接種から１１日の後、腹腔細胞は採集され数えられた。腫瘍−抗原保有ＬＭＩで治療された群は、それぞれ４匹のマウスからなり、値は標準偏差とともに平均値で示されている。対照群（腫瘍のみおよびＮＭＳ−ＬＭＩで処置）は、それぞれ２匹のマウスで構成され、その平均値が示されている。腫瘍およびＬＭＩをともに接種していない正常なマウスから流出させられた腹腔細胞の回収は、６匹のマウスで確定され（底のバー）、その標準偏差が示されている。

１、ｖ、投与は、ｉ、ｐ、およびｓ、ｃ、投与よりもより効果的であり、かつこれらのマウスから回収された細胞の数は、腫瘍を接種しなかった正常のマウスより回収された数よりも大きくなかった。投与のすべての経路において、正常なマウスの血清タンパク質で被覆された対照ＬＭＩは、腫瘍重量の顕著な減少が起こらなかった。最近のデータは、ｉ、ｖ、投与が最も効果的な経路であり得ることを示しているが、この発明はｉ、ｖ、投与に依存しない。これらの結果もまた、免疫治療におけるＬＭＩの使用の可能性を広げるものであり、そのことにおいて、ＬＭＩが効果的であるために必ずしも腫瘍の成長部位に投与される必要がないことを立証している。

同種異系のＣＴＬ応答に関して抗原保有ＬＭＩの効果が与えられ、腫瘍特異的ＣＴＬ応答の活性化の結果として、ＬＭＩの投与は生体内で腫瘍に作用することが考えられる。

マウスからの付着していないＰＥＬ細胞がＥＬ４腫瘍細胞とともに注入され、かつＬＭ！保有ＥＬ４プラズマ膜が４時間のＣｒ　Ｇ　Ｉ解離検定において試験された場合、ＥＬ４標的に対する細胞溶解活性が第６図に示すように存在した。

第６図のデータは、ＬＭＩで治療されたマウスから腹腔に浸出したリンパ球の腫瘍特異的な細胞溶解活性を示している。Ｃ５７Ｂ　Ｌ／６マウスは１０６の生きたＥＬ４細胞を接種された。同時に治療されたマウスは、１０７のＬＭＩ保有ＥＬ４Ｊｌｌが注入された（ＥＬ４＋ＬＭＩ）。生きた腫瘍のない対照マウスもまた、１０７のＬＭＩ保有ＥＬ４膜を注入された（ＬＭＩのみ）。１２日の後、腹腔細胞は採集され、１時間、樹脂に付着させられたのち、付着しない細胞はＥＬ４およびＲＴＭ４標的を用いる４時間のＣｒ解離検定において、溶解活性が検定された。ＬＭＩで治療されたマウスは第４図に示されるものと同じものであり、その腫瘍重量は、ＬＭＩ処置により９９％く減少させられた。

それぞれのマウスからの細胞は検定され、それぞれの群の両方のマウスに対して結果が示された。死亡率は、特異的解離％として表されている。自発的な解離はＥＬ４に対して１９５ｃｐｍであり、ＲＤＭ４に対しては２４８ｃｐｍであった。また、解離し得る全体は、ＥＬ４に対し２５４９であり、ＲＤＭ４に対し２９３８であった。

データは、活性が特異的であり、それにおいてＲＤＭ４標的に対しては活性がまったく検出されなかったことを示している。ＬＭＩを注入される一方、生きた腫瘍細胞を注入されなかったマウスからのＰＥＬは、どの標的に対しても溶解活性を示さなかった。腫瘍を注入される一方、ＬＭＩで治療されなかったマウスからのＰＥＬもまた、殺生活性を有さなかった（図示せず）。しかし、この群に存在する多大な数の腫瘍細胞は、これらが関連標的ブロッカ−として作用し得るという限定的な解釈を排除する。

腫瘍保有動物は、さらに細胞溶解活性を試験するために、６日間の培養において放射線照射された細胞を用いる生体外での再刺激が引き続いて行なわれる膵臓細胞群における細胞溶解活性のために、ＬＭＩ治療動物と比較された。それらのデータは第７図に示されている。第７Ａ図は、ＬＭ■処置されたＥＬ４−腫瘍保有Ｃ５７Ｂ　Ｌ／６マウスの再刺激された膵臓細胞からのＣＴＬの特異性を示し、第７Ｂ図は、Ｐ８１５−腫瘍保有ＣＤ２Ｆ１マウスからの膵臓細胞の再刺激に関して、治療の効果を示している。

Ｃ５７Ｂ　Ｌ／６マウスは、１０６の生きたＥＬ４細胞がｉ、ｐ、接種され、かつ同時に１０７のＬＭＩ保有ＥＬ４抗原が投与された（第７Ａ図）。１２日の後、膵臓（２匹のマウス）が取出され、プールされかつ放射線照射されたＥＬ４細胞とともにまたはその細胞なしで培養中に置かれた。生体外培養の６日の後、細胞は、ＥＬ４およびＲＤＭ４標的を用いる４時間Ｃｒ解離検定において溶解活性が検定された。放射線照射されたＥＬ４とともに培養された細胞に対する結果が示されている。刺激因子なしで培養された細胞は、どちらの標的に対しても溶解活性がなかった。

ＣＤ２Ｆ１マウスは、１０６の生きたＰ８１５細胞を接種され、同時に、何もなしか、１０７のＬＭＩ保有Ｐ８１５抗原（ＬＭＩ−Ｐ８１５）または１０７のＬＭ！保有正常マウス血清（ＬＭＩ−ＮＭＳ）で治療された（第７Ｂ図入７日の後、膵臓は取出され（１グループに対し２匹のマウス）、かつ単独または放射線照射されたＰ８１５細胞とともに培養中に置かれた。６１」間の生体外培養の後、溶解活性がＰ８１５およびＲＤＭ４標的に対して検定された。再刺激された細胞のＰ８１５標的に対して得られた結果が示されている。ＲＤＭ４標的の殺生は見られなかった。生体外で再刺激されなかった細胞は、Ｐ８１５およびＲＤＭ４標的とも溶解しなかった。

第７Ａ図は、ＥＬ４腫瘍およびＬＭＩを注入されたマウスから１２日間の後、取出された膵臓細胞が、ＥＬ４標的に対しては強い細胞溶解応答を生成することができ、しかし、ＲＤＭ４標的に対しては生成することができなかったことを示している。この応答は、放射線照射されたＥＬ４刺激因子が添加された培養中のみにおいて起こった。その他に何も添加しないか、抗原保［ＬＭＩまたは正常なマウスの血清で被覆されたＬＭＩとともにＰ８１５１に！癌細胞が注入されたマウスからの肺臓細胞が試験された場合、同様の結果が得られた。放射線照射されたＰ８１５による再刺激は、腫瘍および抗原−保有ＬＭＩで治療されたマウスから、強い抗−Ｐ８１５応答の形成を結果としてもたらした（第７Ｂ図）。対照的に、腫瘍のみ、または腫瘍および正常なマウスの血清で被覆されたＬＭＩを接種したマウスの細胞からは、応答があまり得られなかったかまたはまったく得られなかった。すべての場合において、放射線照射されたＰ８１５刺激細胞なしでは、何も応答が得られなかった。

ＡＫＲマウスでＲＤＭ４腫瘍を試験する同種の実験において、本質的に同一な結果が慢られた。ＲＤＭ４および抗原−保有ＬＭＩを用いた注入の後、１２０間経たマウスから取出された肺臓細胞は、放射線照射された刺激因子による再刺激に依存し、かつＲＤＭ４標的に対して特異的な強い応答（Ｅ対Ｔが２対１において６１％溶解）を生成した。

腫瘍のみ与えられたマウスからの細胞は、腫瘍細胞およびＬＭＩをともに接種しなかった正常なマウスからの肺臓細胞と同様に、再刺激に対して余り応答を形成しなかった（２対１において８％）。したがって、ＰＥＬ活性または生体外での１１４刺激に対する活性をもたらすＬＭＩ治療もまた、対照と比較して、腹腔の腫瘍重量の減少を結果としてもたらす。

ＬＭＩと化学療法が組合された治療を用いる腫瘍の治療腫瘍を保有する宿主を治療するために、組合せで用いられた場合、ＬＭＩおよびシクロホスファミド（ＣＹ）は、腫瘍の増殖および宿主の生存に対して、高い相乗効果を有する。腫瘍の増殖は同系のＰ８１５１！瘍細胞を１０″／マウスで注入することによりマウス中に誘導される。腹腔内に増殖する同系のＰ８１５腫瘍を保有するマウスは、０Ｂ１（腫瘍接種の日）　、Ｌ　Ｍ　Ｉ　ｓ　ｌ　Ｑ　’　ｉ、ｙ、で、かつ３Ｂ１にＣＹ３ｍｇＳ　ｉ、ｐ、で治療された。ＣＹ単独またはＬＭＩ単独では、宿主の生存を顕著に延ばすことはなかった。しかしながら、ＬＭＩおよびＣＹの両方で治療されたマウスは、非常に顕著に生存期間が長くなり、第８図に示すように、４０％のマウスが１８０日以上生存している。

Ｐ８１５肥満細胞腫細胞が、同系の宿主中に皮下より注入された場合、それらは固い皮下腫瘍として増殖する。また、その腫瘍はリンパ節、膵臓および肺に転移し、宿主を殺す。ＬＭＩおよびＣＹｌが形成された腫瘍の増殖に作用し得るかどうか決定するために、マウスは皮下より１０’のＰ８１５細胞が接種され、さらに１０日間細胞は増殖させられた。このとき、すべてのマウスは目に見えはっきりとした固い腫瘍を有していた。次に、マウスの群はＣＹ３ｍｇをｉ、　ｐ、で（１０日１）　、ＬＭ１１０’をｔ、　Ｖ。

で（１３日日日または両方で治療された。腫瘍の増殖は、その範囲をＭ１定することにより決められ、かつ生存期間が確定された。第９Ｂ図に示すように、ＣＹおよびＬＭＩが併用された治療は、宿主の生存期間を非常に顕著に延ばした（治療されないもの対ＣＹ＋ＬＭＩで治療されたものにおいてｐ　＜　０．　００２）。一方、単独で治療したものはともに、顕著な効果を有さなかった。固い腫瘍の成長は、第９Ａ図においてグラフ化されたデータにより示されるように、ＣＹ＋ＬＭＩ治療によって劇的に減少させられた。ＣＹ　７１１独による治療では生存期間に効果がなかったが、腫瘍の増殖を確かに減少させた。この結果は、化学療法単独では最初の腫瘍の量を減少させることができるが、転移に対してはあまり効果がないかまたはまったく効果がないことを示唆している。

上述した結果は、次に示す２つの事項において、ＬＭＩ治療の効果を証明している。

ｌ）ＬＭＩおよび化学療法を用いる治療は、腫瘍の増殖および宿主の生存に対して高い相乗効果を有することができる。

２）ＬＭＩと化学療法が組合された治療は、腫瘍が確立されるようになってから後にのみ治療が開始された場合、宿主の生存を顕著に引き延ばすことができる。

製衿このように、腫瘍−保有動物のＬＭＩ治療は、腫瘍重量の劇的な減少および強い腫瘍特異的な細胞溶解活性の発現をともにもたらす。溶解活性および肺臓細胞による応答の抗原−依存性再刺激の強さおよび特異性は、すべてが、このことが細胞溶解性Ｔリンパ球により媒介されていることを非常に強く立証している。ＬＭＩ治療の作用機構に関係なく、このようにして得られた結果は、哺乳動物におけるがんの免疫治療においてこの発明が価値あることを示している。

ＬＭＩの治療への利用は、疾患に対抗する免疫化または進行する疾患に対する治療として、先代貞へのｌＪｊ独投与またはその他の試薬と組合せた投与を含む。

ＬＭＩが意図した効果を生じるような疾患は、ウィルス、細菌および寄生虫による疾患、がん、移植片体宿主の疾患ならびに自己免疫疾患を含む。ＬＭＩ上に使用されるリガンドは、限定されるものではないが、ＭＨＣ分子、天然または合成のペプチド抗原、タンパク質抗原、分離されたプラズマ膜、抗体ならびに細胞表面の構成物により結合されるその他のリガンドを含む。

ＬＭＩおよび化学療法を用いた治療は、腫瘍の増殖および宿主の生存に関して、高い相乗的な効果を有し得、しかもＬＭＩと化学療法が組合された治療は、腫瘍が確立されてから後にのみ治療が開始された場合、宿主の寿命を顕著に引延ばし得る。

ＬＭＩが生体内てＣＴＬ応答の生成を増大し得るような作用機構の完全な特定化において重要な仕事が残っており、しかもＬＭＩの免疫治療が開始される前に充分に成長した腫瘍の劇的な減少または排除を細胞溶解性応答が媒介しているかどうかは未だに知られていない。しかし、ここに示されるデータおよび結果は、疾患の治療および予防において、重要な進歩を示唆している。

産業への利用この発明は、研究および免疫処置および／または腫瘍および哺乳類のその他の細胞が媒介された疾患に対する免疫治療、たとえば家畜の治療および人のがんへの免疫治療処置において、その利用が見出だされる。

ＦＩＣ−、ＩＡ　ＦＩＣ−、ＩＢ１％４徊帖（Ｘ１０−６）ＦＩＧ、４Ｆｌに、７Ａ日Ｆｉｇｕｒｅ　８Ｆｉｇｕｒｅ　９Ａ　Ｆｉｇｕｒｅ　９Ｂ国際調査報告１＋ｎｅ＋＊ｍ＋ｍｓ＋＋＾師ｈｔａｍ＊軸−、ＰＣＴ／ＵＳ　９０１０１４７４

Claims

【特許請求の範囲】

１．０．２ミクロン以上の主要直径を有する大型粒子上に支持された多価リガンド配列から本質的になる大型多価免疫原の生体内投与を含む細胞応答を活性化することにより、腫瘍の増殖を予防するかまたは減じるための、哺乳動物を治療する方法。
２．大型多価免疫原が約５μの直径を有する、請求項１に記載の方法。
３．大型多価免疫原の投与が、結果として抗原特異的Ｔ細胞の活性化をもたらす、請求項２に記載の方法。
４．大型多価免疫原の投与が、マクロファージ、単球またはナチュラルキラー細胞の活性化を結果としてもたらす、請求項１に記載の方法。
５．大型多価免疫原が、化学治療剤とともに一般に皮下より投与される、請求項１に記載の方法。
６．化学治療剤がシクロホスフアミドである、請求項５に記載の方法。
７．大型多価免疫原と異なる物理的形態でのリガンドを任意に併用して、０．２ミクロン以上の主要直径を有する大型粒子上に支持された多価りかンド配列から本質的になる大型多価免疫原を含む材料成分の生体内投与を備える細胞応答を活性化するための哺乳動物を治療する方法。
８．大型多価免疫原が、約５μの直径を有する、請求項７に記載の方法。
９．大型多価免疫原の投与が、抗原特異的Ｔ細胞の活性化を結果としてもたらす、請求項８に記載の方法。
１０．大型多価免疫原の投与が、マクロファージ、単球またはナチュラルキラー細胞の活性化を結果としてもたらす、請求項７に記載の方法。
１１．大型多価免疫原が、化学治療剤とともに一般に皮下より投与される、請求項７に記載の方法。
１２．化学治療剤がシクロホスフアミドである、請求項１１に記載の方法。
１３．大型多価免疫原が、０．２μ以上の直径を有し、かつリガンドがリンフォカイン、リボソーム内に組込まれた抗原またはリンフォカインとリボソーム内に組込まれた抗原との混合物である、請求項７に記載の方法。
１４．哺乳動物の腫瘍の治療のためまたは哺乳動物における腫瘍の成長を予防しもしくは抑制するために、注入可能な溶液で大型多価免疫原と異なる物理的形態でのリガンドを任意に併用して、０．２ミクロン以上の主要直径を有する大型粒子に支持される多価リガンド配列から本質的になる大型多価免疫原を備える材料の成分。
１５．注入可能な溶液の形態である成分であって、大型多価免疫原と異なる物理的形態でのリガンドを備える、請求項１４に記載の成分。
１６．０．２ミクロン以上の主要直径を有する大型粒子上に支持された多価リガンド配列から本質的になる大型多価免疫原成分の生体内投与を備える細胞応答を活性化することにより、哺乳動物におけるウイルス、細菌、自己免疫、寄生虫もしくは移植片対宿主またはその他の疾患を予防または治療するための哺乳動物を治療する方法。
１７．大型多価免疫原が、約５ミクロンの主要直径を有する、請求項１６に記載の方法。
１８．成分が、大型多価免疫原と異なる物理的形態でのリガンドを含み、かつ注入可能な溶液の形態である、請求項１６に記載の方法。
１９．成分が化学治療剤をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
２０．化学治療剤がシクロホスフアミドである、請求項１９に記載の方法。