BR112012033284B1 - veículo vacinal para induzir resposta imune celular, e, composição vacinal - Google Patents

Abstract

VEÍCULO VACINAL PARA INDUZIR RESPOSTA IMUNE CELULAR, COMPOSIÇÃO VACINAL, E, USO DA COMPOSIÇÃO VACINAL. A presente invenção diz respeito ao campo da biotecnologia aplicada à saúde humana. A invenção descreve um veículo de vacina, em que as toxinas de organismos eucariótivos são encapsuladas em lipossomos com múltiplas camadas lipídicas, obtidas por meio do processo de desidratação/reidratação, cuja composição lipídica é dipalmitoifosfatidilcolina : colesterol em uma razão molar de 1;1, as quais são determinadas para administração subcutânea ou intramuscular. Estas composições não exigem o uso de outros adjuvantes. As composições descritas permitem a modulação da resposta imune CTL específica para um ou mais antígenos coencapsulados nos lipossomos que contêm a toxina. O veículo da vacina da presente invenção apresenta vantagens quando comparadas a outros descritos na técnica anterior, devido à natureza forte e funcional da resposta imune induzida e também às propriedades de imunomodução destes.

Description

CAMPO TÉCNICO

[001] A presente invenção diz respeito ao campo da biotecnologia aplicado à saúde humana. Particularmente, a presente invenção diz respeito a um veículo de vacina tanto para uso subcutâneo quanto intramuscular, baseado em lipossomas contendo esticolisina e que melhoram as respostas celulares imunes específicas de antígeno, usados em imunoterapia do câncer e tratamento de doenças causadas por patógenos intracelulares.

TÉCNICA PRÉVIA

[002] A capacidade imunoadjuvante das vesículas lipídicas é conhecida há muito tempo. A racionalidade que existe no uso de lipossomas em imunização e projeto de vacina baseia-se na sua capacidade de liberar molécula antigênica em células apresentadoras de antígeno (APC) e estimular uma resposta imune. As vantagens mais importantes dos lipossomas como imunoadjuvantes são resumidas em: (i) a capacidade de mimetizar patógenos que carregam grandes quantidades de antígeno para APC, (ii) a possibilidade de co-encapsular antígenos com moléculas imunoestimulatórias, (iii) a flexibilidade para modificar suas propriedades físico-químicas com propósitos mais eficientes, e (iv) o fato de serem biodegradáveis e não tóxicos (Leserman em Journal of Lipossoma Research, 2004, 14 (3 & 4), 175-189).

[003] Um desafio no campo da vacinação é a melhoria de resposta imune celular mediada por linfócitos T citotóxicos específicos de antígeno CD8+ (CTL), com relevância para a prevenção e tratamento de doenças induzidas por patógenos intracelulares e células tumorais. As vesículas lipídicas podem melhorar uma resposta CTL, mas em geral não eficientemente. As diferentes estratégias baseadas em vesículas lipídicas foram determinadas com a intenção de simplificar esta função; exemplos são lipossomas sensíveis ao pH acídico, lipossomas catiônicos, a inclusão de imunomoduladores tais como CpG e toxinas formadoras de poros de bactérias. Apesar da variedade das publicações, algumas destas estratégias apresentam sucesso limitado na indução de respostas imunes celulares eficientes, ou são desvantajosas e, portanto, exigem um melhor projeto antes da implementação.

[004] A integração de proteínas da membrana viral na membrana lipossomal, a fim de promover a fusão de membrana em condições de pH ácido ou processamento proteolítico, foi uma outra alternativa para o desenvolvimento de veículos de vacina. Estas vesículas conhecidas como virossomas não apenas foram usadas como vacinas de vírus parental, mas também foram exploradas como veículos para antígenos de vacina, ligados ou encapsulados ao virossoma (Zurbriggen en Vaccine, 2003 14; 21(9-10):921- 4). As partículas de virossoma conhecidas com a abreviação IRIV (virossomas de influenza imunopotencialmente reconstituídos), contendo proteínas e lipídeos do envelope de vírus influenza, são o melhor exemplo desta estratégia e formam a base da patente de vacina contra hepatite A (patente dos Estados Unidos 5565203). Entretanto, esta preparação de vacina foi determinada para melhorar a neutralização da resposta ao anticorpo contra hepatite A. A ligação ao vírus de hepatite A inativado e muito puro na membrana do virossoma favoreceu o processamento e apresentação de peptídeos derivados pela via clássica MHCII, como um resultado do processo de fusão das membranas do virossoma e endossoma em APCs (Glück y Walti em Dev Biol (Basel), 2000, 103,189-97). A evidência descrita sugere que a associação física antígeno-virossomas é importante no imunoadjuvante (Zurbriggen et al., Progr., em Lipid Res., 2000, 39(1), 3-18; Amacker et al., em Int Imunol., 2005, 17(6), 695-704).

[005] Schumacher et al., em Vaccine 22:714-723, 2004, relataram que IRIVs são capazes de melhorar a resposta imune mediada por célula. Particularmente, Schumacher et al. demonstraram sua atividade adjuvante na indução de CTL in vitro. Esta capacidade depende principalmente do estímulo da reatividade de células CD4 + T, específicas paras as proteínas virais. Entretanto, embora o uso de virossomas como adjuvantes apresente muitas vantagens, tais como baixa toxicidade e alta imunogenicidade, um dos problemas na tecnologia virossomal atual é a ausência de procedimentos para a encapsulação eficiente de solutos, tais como proteínas, exigidos para a indução de uma resposta CTL. Uma concentração de lipídeo na qual os virossomas são produzidos (1 mM de lipídeo, aproximadamente), e considerando seu diâmetro (cerca de 200 nm), menos de 1 % da fase aquosa é encapsulada nos virossomas (Schoen et al., en J. Liposome Res., 3: 767-792, 1993). Estas características reduzem significativamente a eficiência dos virossomas liberarem antígenos ou genes das células. Uma estratégia para superar esta limitação e produzir a preparação imunogênica para células T CD8 +, recentemente publicada no pedido de patente U.S. número 20100015214, baseia-se em uma combinação de virossomas sem veículos, preferivelmente lipossomas, que encapsulam antígenos. U.S. 20100015214 revela um efeito trans-adjuvante de virossomas, embora estas partículas e os lipossomas não exibam nenhuma interação física entre eles.

[006] No artigo de Lanio. et al., publicado no J Liposome Res.,2008,18(1),1-19, é descrito para rhEGF maior eficiência de encapsulação-retenção de lipossoma obtido pelo procedimento de desidratação-reidratação (DRVs), e compreendido de fosfatidilcolina (PC) saturada (dipalmitoilfosfatidilcolina, DPPC) e colesterol (Cho) em razão molar 1:1, comparado com aqueles que contêm PC e Cho insaturados. De fato, o procedimento para obter DRVs rende vesículas de multi-bicamadas com muita eficiência de encapsulação/retenção para uma ampla variedade de solutos solúveis. Lanio et al. demonstraram as propriedades imunoadjuvantes destas vesículas para melhorar uma resposta ao anticorpo quantitativa e qualitativamente superior contra rhEGF.

[007] A revisão publicada por Alvarez et al. em Toxicon, 2009, 54(8):1135-47, resume as características estruturais e funcionais de duas proteínas produzidas por um invertebrado marinho, a anêmona do mar do Caribe Stichodactyla helianthus, e denominadas pelos autores como esticolisinas (Sts) I e II (StI/II). Estas proteínas são toxinas formadoras de poro (PFTs) que pertencem à família de proteína Actinoporins, classes exclusivas de PFTs de origem eucariota encontradas exclusivamente em anêmonas do mar. Similares a outros elementos desta família, as Sts são proteínas básicas com ponto isolelétrico elevado (>9,5), com massa molecular de aproximadamente 20 kDa, desprovidas de resíduos cisteína em suas sequências de aminoácido e exibem uma preferência por membranas contendo esfingomielina (SM). As sts são produzidas na forma solúvel, mas podem se associar facilmente com diferentes sistemas de membrana celular e modelo, formando poros com um diâmetro de 2 nm, provavelmente em virtude da interação das α hélices N-terminais dos quatro monômeros. Ambos os eventos, a associação e a formação do poro, dependem das propriedades físico-químicas das membranas.

[008] No artigo publicado em Toxicon, 2007, 49: 68-81, Martinez et al. relaram a relevância da presença de SM e Cho para a associação e formação de poro nas membranas por StII. O estado de fase da membrana influencia a associação de StII com estas estruturas. Da maneira relatada por Martinez et al. no Journal Biology, 2002, 16, 2: 85-93, esta toxina é associada reversivelmente às membranas de DPPC e SM, com uma capacidade muito baixa de permeabilização.

[009] Embora amplamente relatadas, as propriedades imunomodulatórias das toxinas formadoras de poro de bactérias para a indução de resposta CTL específica de antígeno usando diferentes estratégias, incluindo sua encapsulação em lipossomas, da maneira resumida em revisões de Dietrich et al. e Morón et al., em TRENDS in Microbiology, 2001, Vol.9 No.1, 23-28 e TRENDS in Imunology, 2004, Vol.25 No.2, 92-97, respectivamente; não estão relacionadas com as toxinas funcionalmente homólogas de organismos eucarióticos marinhos.

[0010] A partir do ponto de vista de suas aplicações na terapia imune de doenças tumorais, é desejável ter novas formulações de vacina capazes de induzir resposta imune celular específica aos antígenos, e de ser menos agressivas que aquelas composições contendo toxinas bacterianas.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[0011] Surpreendentemente, os autores da presente invenção observaram que quando um antígeno é administrado subcutaneamente (sc) ou intramuscularmente (im), encapsulado na formulação de vacina Lipossoma-St com qualquer dos variantes de toxinas descritos, incluindo aqueles que não exibem atividade formadora de poro ou lítica, percentuais muito maiores de lise das células alvo são induzidos do que aqueles observados no grupo de controle positivo, que usa o ácido polinosínico:policitidílico (poli I:C, PIC), o qual é considerado no estado campo da técnica como o melhorador quintessencial de resposta CTL, níveis de anticorpo não modificado e resposta Th1/Th2 mista induzida pelo antígeno lipossomal. Isto indica o potencial do sistema lipossoma-St em gerar tanto resposta celular quanto humoral contra um antígeno proteico, que é relevante para o uso desta formulação com propósitos de vacinação.

[0012] O objetivo desta invenção é um veículo de vacina baseado em preparações lipossomais de toxinas que coencapsulam DPPC e Cho, conhecidas como Sts, junto com um antígeno proteico. As preparações lipossomais de DPPC e Cho, nas quais são encapsuladas mutantes de toxinas conhecidas como Sts (por exemplo, StIW111C e StIW111Cirrev) junto com o antígeno proteico, também são o assunto da presente invenção.

[0013] Em um outro aspecto, as composições de vacina a base deste veículo vacinal, contendo as toxinas junto com um antígeno administrado sc ou im para a indução de uma resposta CTL específica de antígeno forte, também são o assunto da presente invenção.

[0014] Um outro objetivo desta invenção é o uso das composições vacinais descritas, baseadas neste veículo de vacina contendo as toxinas junto com um antígeno, e administradas sc ou im para fortalecer a resposta imune de um paciente que sofre de uma doença selecionada do grupo que consiste em câncer e doenças infecciosas causadas por patógenos intracelulares.

[0015] Em um outro aspecto, o assunto da presente invenção também é um método para tratar pacientes que exigem um fortalecimento de sua resposta imune, em que o paciente sofre de uma doença selecionada do grupo que consiste em câncer e doenças infecciosas causadas por patógenos intracelulares, e em que o método compreende administrar sc ou im as composições vacinais a base deste veículo de vacina contendo as toxinas Sts, ou seus mutantes, junto com um antígeno relevante para a doença.

[0016] Adicionalmente, a presente invenção também diz respeito à proteção fornecida por tais composições de vacina para o desafio com células tumorais que expressam o antígeno, reduzindo o percentual de tumores e aumentando a sobrevivência de sujeitos com tumores. Portanto, um método profilático do início de doenças relacionadas ao antígeno também é um objetivo desta invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0017] O veículo de vacina da invenção baseia-se em dispersões aquosas de lipossomas DRV de DPPC:Cho, em uma razão molar de 1:1 que encapsula St junto com antígeno, e eventualmente pode conter outros cossolventes miscíveis em água, não tóxicos, não irritantes e que não causam a desestabilização das vesículas, tais como aquelas comumente usadas em composições farmacêuticas injetáveis, por exemplo, açúcares, polietileno glicol, etc.

[0018] As preparações lipossomais da presente invenção são obtidas pelo procedimento de desidratação-reidratação e constituídas por DPPC e Cho em uma razão molar 1:1, e coencapsulando um antígeno com alguns dos variantes de Sts ou seus mutantes reversivelmente inativos, em que as ditas composições vacinais são capazes de promover uma resposta imune CTL específica de antígeno e protetora contra o desafio com células tumorais.

[0019] Em uma modalidade da invenção, a composição de vacina contém como antígeno a proteína OVA, mas em que o antígeno pode ser qualquer proteína ou polipeptídeo associado a uma doença para a qual, de um ponto de vista terapêutico, induz de maneira relevante uma resposta imune CTL específica contra este antígeno proteico. Por exemplo, o antígeno pode ser uma proteína ou polipeptídeo associado ao câncer, uma proteína ou polipeptídeo associado à AIDS ou uma proteína ou polipeptídeo associado à tuberculose.

[0020] Os lipossomas aqui descritos são obtidos por tecnologia de desidratação-reidratação relatada por Kirby e Gregoriadis em Biotechnology, 1984, 2, 979-984, estes são vesículas com uma fase aquosa interna circundada por várias bicamadas lipídicas, caracterizado por eficiência elevada de encapsulação e retenção de moléculas lábeis, tais como proteínas antigênicas e imunomoduladoras. As soluções de clorofórmio de DPPC e Cho em uma razão molar de 1:1 são evaporadas e mantidas a vácuo por 30 minutos. Os lipídeos foram hidratados com água deionizada em uma temperatura acima da temperatura de transição de fase (Tc) de DPPC (T> 45 °C). As suspensões de vesículas multilamelares resultantes (MLVs) são transformadas em SUV ou LUV (vesículas unilamelares pequenas e vesículas unilamelares grandes, respectivamente) por ultrassom e ciclos de descanso, ou extrusão por meio de membranas de policarbonato com tamanho de poro de 100 nm. As vesículas obtidas foram misturadas com soluções de proteína, após uma relação lipídeo:proteína de 16 - 64 μmol de lipídeos: 1,8 -7 nmol de antígeno e 0,5 - 2 nmol de St, e liofilizadas por 20-24 horas. A reidratação foi realizada com água deionizada e agitando por 30 minutos em uma temperatura abaixo de 45°C. O material não encapsulado nos lipossomas é removido por lavagem com salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7,4 (NaCl 136 mmol/L, KH2PO4 1,47 mmol/L, Na2HPO4 9,55 mmol/L, KCl 2,68 mmol/L), seguido por centrifugação a 10.000 g por 15 minutos. Tais preparações atingem a eficiência de encapsulação para os diferentes variantes de Sts variando em torno de 50 %, com retenção de 70 % após um mês de armazenamento a 4 °C, suspenso em PBS.

[0021] As toxinas StI e StII, descritas nas SEQ ID Nos: 1 e 2, respectivamente, são isoladas e purificadas a partir da anêmona marinha, Stichodactyla helianthus, usando o procedimento descrito por Lanio et al. em Toxicon. 2001, 39, 187-94. A esticolisina I recombinante (rStI) e rStI mutante, StI W111C, descrita na SEQ ID NO: 3, são obtidos de acordo com os procedimentos descritos por Pazos et al. em Toxicon, 2006, 48, 1083-1094 e Pentón et al. em Protein Eng Des Sel. 2011, 24, 485-493, respectivamente.

[0022] A concentração de Sts usadas no veículo de vacina da presente invenção está na faixa de 0,25 a 1 μM, coencapsuladas com antígeno em uma concentração que varia de 1 - 3,5 μM em uma suspensão lipossomal com uma faixa de concentração total de lipídeo de 16 a 64 mM.

[0023] Preferivelmente, o veículo de vacina da presente invenção contém uma quantidade de Sts de 0,3 a 0.4 nmol coencapuladas com 1 a 2 nmol de antígeno, em uma suspensão lipossomal de 20 μmol de lipídeos totais em um volume de 200 μL.

[0024] A faixa de dose usada para as vacinas referidas na presente invenção, por sc ou im, é 1 - 2 nmol (50-100 mg) de antígeno.

[0025] Uma característica chave das composições de vacina da invenção é que elas não apresentam adjuvantes imunológicos além daqueles descritos.

[0026] Como já explicado anteriormente, sabe-se a partir da técnica anterior que as toxinas bacterianas formadoras de poro encapsuladas em vesículas lipídicas são capazes de melhorar uma resposta CTL, mas sabe-se que o uso das composições de vacina a base de toxinas bacterianas apresenta efeitos adversos em humanos; entretanto, os autores da presente invenção observaram inesperadamente que as toxinas não bacterianas são capazes de apresentar o mesmo efeito imunoestimulador. Além do mais, os autores desta invenção conseguiram dissociar a atividade de formação de poro das toxinas de sues efeitos estimuladores da resposta CTL, o que oferece uma boa vantagem para o uso clínico em humanos com este veículo de vacina. Os resultados obtidos usando no veículo de vacina da presente invenção as entidades moleculares StIW111Cirrev, ou StII inativada pelo calor coencapsulada com antígeno nos lipossomas, demonstram que não existe nenhuma dependência absoluta entre a melhoria de uma resposta imune CTL específica de antígeno para as formulações de lipossoma-St e a capacidade destas proteínas formarem poros em membranas. O teste de maturação de células dendríticas (DCs), isoladas da medula óssea de camundongos C57BL/6 e expostas em StII in vitro, mostra a capacidade desta proteína não apenas em seu variante ativo, mas também naquela inativada pelo calor, de induzir a ativação de CDs, similar ao observado com LPS (controle positivo) em condições similares.

[0027] A capacidade de Sts formarem poros em membranas foi avaliada testando a atividade hemolítica e a permeabilidade de LUVs carregadas com carboxifluoresceína (CF), da maneira descrita por Martínez et al. em Toxicon, 2001, 39,1547-1560. Observa-se que as Sts não exibem a atividade permeabilizante analisando a permeabilidade das vesículas lipídicas de DPPC:Cho (1:1) que encapsula CF, comparadas com aquelas observadas em vesículas compostas de fosfatidilcolina de gema de ovo e SM (1:1) (controle positivo).

[0028] Verifica-se que o mutante StIW111C forma um dímero inativo estabilizado por uma ligação dissulfeto, pelo ensaio de atividade hemolítica e SDS-PAGE, na presença e ausência de 2-mercaptoetanol (2-ME) como agente de redução, da maneira descrita por Pentón et al. em Protein Eng Des Sel. 2011, 24, 485-493. A incapacidade da estrutura dimérica formar poros em eritrócitos, como células modelo, foi resultado de sua não associação com a membrana.

[0029] Um procedimento para obter uma espécie dimérica irreversível de StIW111C (StIW111Cirrev) foi estabelecido, com base na redução de StIW111C por incubação com 2-ME (0,1 mol/L), eliminação de agente de redução por filtração em coluna PD-10, e incubação imediata de StIW111Cmonômero com o reagente homobifuncional bis (maleimida) hexano (BMH) em uma razão molar StIW111Cmonômero:BMH 1:1 ou 2:1 por 2 horas a 4 °C. StlWlllCirrev foi purificada por cromatografia de filtração em gel, em coluna Superdex 75 HR 10/300, na presença de um agente de redução. A obtenção do dímero irreversível e seu grau de pureza foram verificados por SDS-PAGE em condições de redução. O dímero irreversível foi obtido com 94 % de pureza e apenas 6 % de contaminante do dímero reversível. A ausência de atividade funcional foi verificada por ensaio de atividade hemolítica.

[0030] A inativação irreversível de StII por tratamento térmico foi realizada de acordo com o procedimento descrito por Martínez et al. em Toxicon, 2001, 39,1547-1560, e a perda total da capacidade de formar poros na membrana foi verificada por ensaio de atividade hemolítica.

[0031] As propriedades imunomoduladoras das diferentes espécies moleculares de Sts no sistema lipossoma-St, relacionadas à sua capacidade de melhorar uma resposta imune citotóxica específica de antígeno in vivo e de imunidade antitumor em um cenário preventivo, podem ser medidas no modelo experimental da cepa de camundongos C57BL/6 usando o antígeno OVA e a linhagem celular tumoral E.G7, um subclone de timoma EL-4 de murino (Kusmartsev y Gabrilovich, em J Leukoc Biol., 2003, 74: 186-96), transfectado com DNA complementar de OVA pAc-neo-OVA (Moore, et al. em Cell, 1988, 54: 777-85) e obtidas de “American Type Cultures Collection” (ATCC, VA).

[0032] Os autores da presente invenção também observaram que a inoculação preventiva com o veículo vacinal de lipossomas-St contendo o antígeno induz a proteção antitumor mais que aquele gerado por lipossomas que não contêm nenhuma StII.

[0033] Estes resultados demonstram que o sistema lipossoma-St é eficiente para induzir uma resposta antitumor funcionalmente forte e protetora durante o uso de um antígeno proteico, sem a necessidade de outros adjuvantes. Em sequência, o uso desta preparação em terapias de combinação pode melhorar adicionalmente seu efeito antitumor.

[0034] Nos exemplos a seguir, estão incluídos detalhes experimentais comparativos que permitem verificar a eficiência imunológica de induzir uma resposta imune citotóxica específica de antígeno in vivo, e a imunidade antitumor em um cenário preventivo das composições vacinais em questão da invenção, com relação a outras formulações não lipossomais e que não contêm Sts.

EXEMPLOS: Exemplo 1: Avaliação da citotoxicidade e resposta CTL do veículo vacinal usando StI ou StII natural e OVA como antígeno proteico.

[0035] O veículo vacinal baseado em lipossomas foi preparado da maneira previamente descrita.

[0036] Nas vesículas DRVs compreendidas de DPPC e Cho (razão molar 1:1), OVA como antígeno modelo e Sts (StI ou StII) foram coencapsuladas em uma razão moçar de 10 μmol de lipídeos totais: 1,1 nmol OVA e 0,3 nmol de St, em salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7,4. Após este procedimento, duas composições vacinais foram obtidas: Composição vacinal A: lipossomas DRVs de DPPC:Cho (60 μmol de lipídeos totais) que encapsulam 6,6 nmol (50 μg) de OVA. Composição vacinal B: lipossomas DRVs de DPPC:Cho (60 μmol de lipídeos totais) que coencapsulam 6,6 nmol (50 μg) de OVA e 1,88 nmol de StI ou StII.

[0037] Quinze camundongos fêmeas C57BL/6 com um peso corporal que varia de 18-20 g foram selecionados e separados em 5 grupos experimentais de três animais cada.

[0038] O grupo 1 (controle negativo) foi inoculado por via sc nos dias 0, 12, 13 e 14, com 0,2 mL de salina tamponada com fosfato (PBS).

[0039] O grupo 2 (controle positivo) foi inoculado por via sc, no dia 12, com 22,2 nmol (1 mg) de OVA e misturado com 100 μg de ácido polinosinoico-policitidílico (PIC), um ligante sintético TLR3 e um indutor clássico de resposta CTL (Hamilton-Williams et al. em J. Imunol., 2005, 174: 1159-63), nos dias 13 e 14 os animais receberam novamente 100 μg de PIC.

[0040] O grupo 3 foi inoculado por via sc nos dias 0 e 12, com 0,2 mL de composição vacinal A (equivalente a 1,1 nmol ou 50 μg de OVA).

[0041] O grupo 4 foi inoculado por via subcutânea nos dias 0 e 12, com 0,2 mL de composição vacinal B (equivalente a 1,1 nmol ou 50 μg de OVA, e 0,3 nmol ou 6,25 μg de StI).

[0042] O grupo 5 foi inoculado por via sc nos dias 0 e 12, com 0,2 mL de composição vacinal B (equivalente a 1,1 nmol ou 50 μg de OVA, e 0,3 nmol ou 6,25 μg de StII).

[0043] No dia 20 do experimento, as células do baço de camundongos C57BL/6 não imunizados foram incubadas com duas concentrações de carboxifluoresceína diacetato succinimidil éster (CFSE) (0,33 e 5 μmol/L, respectivamente); as células marcadas com a intensidade de fluorescência mais elevada também foram incubadas com 1 μmol/L do peptídeo imunodominante OVA (257-SIINFEKL-264), no contexto do haplótipo MHC I para a cepa de camundongos C57BL/6. Em seguir, ambas as populações de células marcadas foram misturadas 1:1 e os grupos experimentais 1-5 foram inoculados pela veia caudal, com 30 x 106células da mistura em 0,2 mL do volume total. Os camundongos foram sacrificados após 16 horas e a lise (%) das células alvo foi determinada no linfonodo inguinal mais próximo do sítio de imunização por citometria de fluxo (FACS).

[0044] A figura 1 mostra a citotoxicidade produzida in vivo por imunização de camundongos com lipossomas que coencapsulam OVA e Sts. Os animais imunizados com lipossomas que coencapsulam Sts (StI ou StII) mostraram uma resposta de linfócito citotóxico T CD8+ (CTL) específica para OVA estatisticamente maior que o grupo do controle positivo. Adicionalmente, os lipossomas que continham apenas OVA também induziram uma resposta CTL estatisticamente similar ao controle positivo clássico para este ensaio (PIC).

Exemplo 2: Indução de proteção antitumoral do veículo vacinal no modelo de proteína OVA.

[0045] A capacidade das vacinas a base de lipossoma induzirem proteção antitumoral foi estudada. Com esta finalidade, sessenta camundongos fêmea C57BL/6 com um peso corporal que varia entre 18-20 g foram selecionados e separados em 3 grupos de ensaio de 20 animais cada.

[0046] O grupo 1 (controle negativo) foi inoculado por via im, nos dias 0 e 12, com 0,2 mL de salina tamponada com fosfato (PBS).

[0047] O grupo 2 foi inoculado por via im, nos dias 0 e 12, com 0,2 mL da composição vacinal A descrita no exemplo 1 (equivalente a 1,1 nmol ou 50 μg de OVA).

[0048] O grupo 3 foi inoculado por via im, nos dias 0 e 12, com 0,2 mL da composição vacinal B descrita no exemplo 1 (equivalente a 1,1 nmol ou 50 μg de OVA e 0,3 nmol ou 6,25 μg de StII).

[0049] Todos os grupos 1 a 3 foram desafiados no dia 19 com 3x105 células da linhagem tumoral E.G7 por via subcutânea (0,2 mL).

[0050] Os animais foram individualizados a partir do dia 0 e os seguintes parâmetros foram determinados três vezes por semana: volume do tumor, tempo para progressão e sobrevivência.

[0051] Os resultados obtidos são descritos a seguir:

Tempo para progressão

[0052] O tempo para progressão é um parâmetro que caracteriza o tempo decorrido para cada animal a partir do momento que o tumor é inoculado até que este aparece. Quanto aos camundongos que não desenvolveram um tumor no final do experimento, considera-se que o tempo para progressão foi de 60 dias. O impacto na extensão do tempo para progressão é um parâmetro altamente desejável para uma vacina contra o câncer. Como pode ser observado na figura 2A, os animais do grupo 3, vacinados com a formulação de composição vacinal B descrita no exemplo 1, e objetivo da invenção, mostraram os resultados mais marcantes.

Sobrevivência

[0053] Este parâmetro avalia a capacidade da vacinação aumentar o tempo que os animais imunizados vivem mediante o desafio com as células tumorais que expressam OVA (E.G7). Este parâmetro é medido em dias e apresenta uma característica relacionada, uma vez que é comparado com a sobrevivência de animais não tratados. A fim de provar a significância estatística das diferenças encontradas nos resultados de sobrevivência entre os grupos, o teste Log-Rank foi usado.

[0054] A figura 2B mostra claramente que os animais do grupo 3, vacinados com a composição vacinal B descrita no exemplo 1, e objetivo da presente invenção, são aqueles que sobrevivem mais tempo após a inoculação do tumor.

Exemplo 3: Atividade hemolítica de mutantes Sts.

[0055] A formação de poro na membrana de eritrócitos produz um choque osmótico coloidal que acarreta na lise celular. A capacidade de formação de poro das porinas assim denominadas pode ser seguida por sua atividade hemolítica (HA), que pode ser determinada experimentalmente medindo a perda de absorbância aparente (X = 600 nm) de uma suspensão de eritrócito, em virtude da lise celular.

[0056] No ensaio, a HA do dímero irreversivelmente inativo StIW111C (StI W111Cirrev) foi comparada com aquele do dímero reversível StIW111C, em condições de redução (2-ME 0,1 mol/L) e de não redução, em uma concentração proteica relativamente alta no ensaio (0.15 μmol/l), se comparar com a HA de StI/StII relatada por Álvarez et al. em Toxicon, 2009, 54(8):1135-47. Os cursos de tempo de hemólise mostrados na figura 3 indicam que StIW111Cirrev foi inativo em condições de não redução. Em condições de redução, StIW111Cirrev mostrou menos atividade que StIW111C, tanto completamente reduzido quanto não reduzido.

Exemplo 4: Avaliação da capacidade de formação de poro de StII inativada.

[0057] A perda da capacidade de formar poros nas membranas por StII inativada irreversivelmente, por aquecimento a 80 °C por duas horas, foi registrada usando o teste de atividade hemolítica. A figura 4 mostra a ausência de atividade hemolítica para a StII inativada termicamente com a proteína ativa.

Exemplo 5. Efeito do veículo vacinal na maturação de DCs.

[0058] A maturação de DCs induzida por StII foi avaliada em células obtidas da medula óssea de camundongos C57BL/6, expostos a StII ativa (0,1 nmol ou 2 μg) ou inativada por tratamento térmico (4 μg), na presença ou não de 20 μg de polimixina B (pmxB, um agente de neutralização da atividade biológica da endotoxina pela ligação na fração do lipídeo A do LPS), por 24 horas a 37 °C em uma câmara de 5 % de CO2.

[0059] Como controle positivo, usou-se LPS (2 μg) e o controle negativo foi o meio RPMI adicionado de 30 pmxB. As células extraídas da medula óssea de camundongos foram cultivadas em um número de 600.000 precursores de DCs em RPMI por poço, usando placas de 6 poços. O soro fetal bovino (BFS) a 10 %, 400 μL de GMCSF e RPMI foram adicionados para completar 3mL por poço.

[0060] A figura 5 mostra o aumento (%) nos marcadores moleculares (CD80, CD86 e CD40), indicativos da ativação de DCs, como um resultado da exposição destas células in vitro, tanto aos variantes de StII ativos quanto inativados pelo calor, resultados comparáveis àqueles obtidos com o controle positivo.

Exemplo 6. Avaliação de citotoxicidade e resposta CTL do veículo vacinal usando mutantes St e OVA como antígeno proteico.

[0061] Os variantes diméricos StI de baixa atividade de formação de poro, reversivelmente (StIW111C) ou irreversivelmente (StIW111Cirrev), e o variante StII inativado termicamente foram coencapsulados com OVA em lipossomas de DPPC:Cho (1:1), em uma razão de 10 μmol de lipídeo total: 1,1 nmol de OVA: 0,3 nmol de StIW111C, StIW111Cirrev ou StII inativada pelo calor, em PBS pH 7,4, e a capacidade destas preparações de vacina induzirem uma atividade citotóxica específica para OVA in vivo foi avaliada. Nestes ensaios, essencialmente as mesmas composições vacinais foram usadas como aquela descrita no exemplo 1, no caso da composição B, os diferentes variantes de St foram empregados.

[0062] Composição de vacina A: lipossomas DRVs de DPPC:Cho (60 μmol de lipídeos totais) que encapsulam 6,6 nmol de OVA.

[0063] Composição de vacina B: lipossomas DRVs de DPPC:Cho (60 μmol de lipídeos totais) que coencapsulam 6,6 nmol de OVA e 1,875 nmol de St (StIW111C, StIW111Cirrev, St II natural ou StII inativada pelo calor).

[0064] Em um primeiro ensaio, doze camundongos fêmeas C57BL/6 foram selecionados com um peso corporal entre 18-20 g, e separados em 4 grupos experimentais de três animais cada.

[0065] O grupo 1 (controle negativo) foi inoculado por via subcutânea, nos dias 0 e 12, com 0,2 mL de PBS.

[0066] O grupo 2 (controle positivo) foi inoculado por via subcutânea, nos dias 0 e 12, com 0,2 mL da composição vacinal B (equivalente a 1,1 nmol ou 50 μg de OVA e 0,3 nmol ou 6,25 μg de StII natural).

[0067] O grupo 3 foi inoculado por via subcutânea, nos dias 0 e 12, com 0,2 mL da composição vacinal B (equivalente a 1,1 nmol ou 50 μg de OVA e 0,3 nmol ou 6,25 μg de StIW111C).

[0068] O grupo 4 foi inoculado por via subcutânea, nos dias 0 e 12, com 0,2 mL da composição vacinal B (equivalente a 1,1 nmol ou 50 μg de OVA e 0,3 nmol ou 6,25 μg de StIW111Cirrev).

[0069] A figura 6A mostra que os animais imunizados com os lipossomas contendo variantes de St com pouca atividade de formação de poro (LP/OVA+StIW111C ou LP/OVA+StIW111Cirrev) exibem uma resposta citotóxica estatisticamente similar àquela obtida com StII, quando coencapsulada com OVA em lipossomas (LP/OVA+StII).

[0070] Em outros ensaios, nove camundongos fêmeas C57BL/6 com um peso corporal entre 18-20 g foram selecionados e separados em 3 grupos de 3 animais cada.

[0071] O grupo 1 (controle negativo) foi inoculado por via subcutânea, nos dias 0 e 12, com 0,2 mL de salina tamponada com fosfato (PBS).

[0072] O grupo 2 foi inoculado por via subcutânea, nos dias 0 e 12, com 0,2 mL de composição vacinal A (equivalente a 1,1 nmol ou 50 μg de OVA).

[0073] O grupo 3 foi inoculado por via subcutânea, nos dias 0 e 12, com 0,2 mL de composição vacinal B (equivalente a 1,1 nmol ou 50 μg de OVA e 0,3 nmol ou 6,25 μg de StII inativa).

[0074] A figura 6B evidencia que a imunização com lipossomas que coencapsulam OVA, o variante de StII completamente inativado pelo calor, elicitou uma atividade citotóxica específica de OVA significativamente maior que aquela induzida por lipossomas contendo apenas o antígeno, e similar àquela observada com a formulação lipossomal contendo StI/StII natural.

[0075] Os resultados experimentais demonstraram que a vacina lipossomal, objetivo desta invenção, que coencapsula um antígeno com qualquer variante de esticolisina, mesmo com aqueles que não exibem atividade de formação de poro, induziu uma resposta CTL específica de antígeno potente, forte e funcional, ainda maior que aquela elicitada pelo controle positivo clássico (PIC) usado em um ensaio CTL in vivo. A formulação lipossoma-St em um cenário preventivo aumentou significativamente o curso de tempo da implantação de tumor, e aumentou significativamente a sobrevivência nos grupos avaliados com relação àqueles que receberam apenas PBS. Em resumo, a vacinação com lipossomas-St exibiu melhores resultados do que aqueles observados com as vesículas lipídicas que contém apenas o antígeno.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS

[0076] A figura 1 representa um gráfico que mostra o percentual de lise das células alvo carregadas com OVA-peptídeo imunodominante (SIINFEKL), e marcadas com CFSE em animais experimentais submetidos a diferentes tratamentos com vacina, em um ensaio de citotoxicidade in vivo. Cada ponto corresponde aos dados de um único animal e a linha ao valor médio de pelo menos dois experimentos independentes. As diferentes letras indicam diferenças estatísticas significativas entre os grupos imunizados, de acordo com o teste de Dunnett T3 (p< 0,05).

[0077] A figura 2A representa o percentual de animais livres de tumor em três grupos de animais experimentais submetidos a diferentes tratamentos com vacina, e desafiados com células tumorais que expressam OVA.

[0078] A figura 2B representa um gráfico que permite a visualização do parâmetro de sobrevivência nos três grupos mencionados após a inoculação das células tumorais que expressam OVA. As diferentes letras indicam diferenças estatísticas significativas, de acordo com o teste de LogRank (p< 0,05).

[0079] A figura 3 mostra a variação na turbidez de uma suspensão de eritrócito em virtude da ação de variantes diméricos de StI (StIW111C ou StIW111Cirrev), em condições de redução (na presença de 2-ME) e não redução.

[0080] A figura 4 representa a perda de turbidez de uma suspensão de eritrócito, em virtude da atividade de StII natural (proteína ativa) ou inativada por tratamento térmico.

[0081] A figura 5 mostra mudanças na expressão de marcadores moleculares de células dendríticas (DCs), em virtude de sua exposição in vitro a St II, tanto em seu variante ativo quanto inativado termicamente, na presença ou não de um agente que neutraliza a endotoxina (pmxB).

[0082] Gráfico A: Percentual de CD80.

[0083] Gráfico B: Percentual de CD86.

[0084] Gráfico C: Percentual de CD40.

[0085] A figura 6 representa dois gráficos que mostram o percentual de lise de células alvo carregadas com OVA-peptídeo imunodominante (SIINFEKL), e marcadas com CFSE em animais experimentais submetidos a diferentes tratamentos com vacina em um ensaio de citotoxicidade in vivo. Cada ponto corresponde aos dados de um único animal e a linha o valor médio. As diferentes letras indicam diferenças estatísticas significativas entre os grupos imunizados, de acordo com o teste de Tukey (p< 0,05).

[0086] O gráfico A representa a resposta obtida mediante imunização com lipossomas que coencapsulam OVA, StII natural ou variantes diméricos de StI inativa reversivelmente (StIW111C) ou irreversivelmente (StIW111Cirrev).

[0087] O gráfico B representa a resposta obtida mediante imunização com lipossomas que coencapsulam OVA e StII inativada por tratamento térmico.

Claims (2)

1. Veículo vacinal para induzir resposta imune celular, caracterizadopelo fato de que compreende uma co-encapsulação em vesículas lipídicas contendo dipalmitoilfosfatidilcolina e colesterol em uma razão equimolar, de proteínas obtidas da anêmona Stichodactyla helianthus selecionadas do grupo consistindo de (i) proteína com a sequência de SEQ ID NO: 1; (ii) proteína com a sequência de SEQ ID NO: 2 e (iii) proteína com a sequência de SEQ ID NO: 3.

2. Composição vacinal, caracterizadapelo fato de que compreende o veículo vacinal como definido na reivindicação 1 e que carece de adjuvantes imunológicos.

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