ES2576851T3 - Composiciones vacunales a base de sticholisina encapsuladas en llposomas - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con el campo de Biotecnología aplicada a la salud humana. En la misma se describe un vehículo vacunal donde se encapsula toxinas provenientes de organismos eucariontes en liposomas de múltiples capas lipídicas obtenidos por el procedimiento de deshidratación-rehidratación cuya composición lipídica es dipalmitoilfosfatidilcolina: colesterol en una relación molar 1:1, destinadas a la administración subcutánea o intramuscular. Estas composiciones no requieren del empleo de otros adyuvantes.Las composiciones descritas posibilitan la modulación de la respuesta inmune CTL específica contra uno o varios antígenos co-encapasulados en liposomas que contienen la toxina. El vehículo vacunal de la presente invención presenta ventajas frente a otros descritos por el arte previo debido a la robustez y funcionalidad de la respuesta inmune que induce así como a sus propiedades inmumoduladoras

Description

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DESCRIPCION

Composiciones vacunales a base de sticholisina encapsuladas en llposomas Campo tecnico:

La presente invencion esta relacionada con el campo de la biotecnologfa aplicada a la salud humana. De modo particular, la presente invencion se refiere a un vehmulo vacunal para uso tanto subcutaneo como intramuscular a base de liposomas, que contienen sticholisina y que mejoran las respuestas inmunes celulares, espedficas a antigenos, lo cual es util en inmunoterapia del cancer y en el tratamiento de enfermedades causadas por patogenos intracelulares.

Tecnica anterior

Desde hace tiempo se conoce la capacidad inmunoadyuvante de las vesmulas liposomales.

La racionalidad que existe en el uso de liposomas en inmunizaciones y en el diseno de vacunas se basa en su capacidad para liberar la molecula antigenica en las celulas que presentan antfgeno (APC) y para estimular una respuesta inmune. Las ventajas mas importantes de los liposomas como inmunoadyuvantes se resumen en: (i) la capacidad de imitar patogenos que transportan grandes cantidades de antigeno a las APC, (ii) la posibilidad de co-encapsular antigenos con moleculas inmuno-estimuladoras, (iii) la flexibilidad de modificar sus propiedades ffsico-qmmicas para el proposito de una mayor efectividad, y (iv) el hecho de ser biodegradables y no toxicas (Leserman en Journal of Liposome Research, 2004, 14 (3 & 4); 175-189).

Un reto en el campo de la vacunologfa es el aumento de respuesta inmune celular, mediada por linfocitos T citotoxicos CD8+ (CTL), espedficos de antfgeno, con relevancia para la prevencion y el tratamiento de enfermedades inducidas por patogenos intracelulares y celulas tumorales. Las vesmulas liposomales pueden potenciar una respuesta de CTL pero no siempre de manera efectiva.

Han sido disenadas diferentes estrategias con base en vesmulas liposomales con la intencion de modernizar esta funcion; los ejemplos son liposomas acidos, sensibles al pH, liposomas cationicos, la inclusion de inmuno-moduladores tales como CpG y toxinas formadoras de poros de origen bacteriano. A pesar de la diversidad de publicaciones, algunas de estas estrategias han tenido exito limitado en la induccion de respuestas inmunes celulares efectivas o son desventajosas y, por lo tanto, requieren un mejor diseno antes de implementacion.

La integracion de protemas de membrana viral en la membrana liposomal a fin de promover la fusion de membrana en condiciones de pH acido o de tratamiento proteolftico, ha sido otra alternativa para el desarrollo de vehmulos vacunales. Estas vesmulas conocidas como virosomas han sido usadas no solamente como vacunas del virus parental, sino que tambien han sido explotadas como vehmulos para antfgenos vacunales, enlazados o encapsulados al virosoma (Zurbriggen en Vaccine, 2003 14; 21(9-10):92l-4). Las partmulas virosomales, conocidas por las siglas IRIV (immunopotentiating reconstituted influenza virosomes o virosomas de influenza reconstituidas por inmunopotenciacion), que contienen protemas y lfpidos de la envoltura del virus de influenza, son el mejor ejemplo de esta estrategia y forman la base de la patente de la vacuna contra la hepatitis A (patente de los Estados Unidos de America No. 5565203). Sin embargo, este preparado vacunal se diseno para potenciar la respuesta de anticuerpos neutralizantes contra la hepatitis A. La inmovilizacion del virus de hepatitis A desactivado y altamente puro en la membrana del virosoma favorecio el tratamiento y la presentacion de peptidos derivados por la ruta clasica MHCII, como resultado del procedimiento de fusion de las membranas de virosoma y de endosoma en las APCs (Gluck y Walti en Dev Biol (Basilea), 2000, 103,189-97). La evidencia descrita sugiere que la asociacion ffsica de antigeno-virosomas es importante en el inmuno-adyuvante (Zurbriggen et al., Progr., en Lipid Res., 2000, 39(1), 3-18; Amacker et al., in Int Immunol., 2005, 17(6), 695-704).

Schumacher et al., en Vaccine 22:714-723, 2004, informaron que los IRIVs son capaces de potenciar respuestas inmunes mediadas por celulas. En particular, Schumacher et al. demostraron su actividad adyuvante en la induccion de CTL in vitro. Esta capacidad dependio principalmente de la estimulacion de la reactividad de las celulas T CD4 + de manera espedfica para las protemas virales.

Sin embargo, aunque el uso de virosomas como adyuvantes tiene muchas ventajas tales como baja toxicidad y alta inmunogenicidad, uno de los problemas en la tecnologfa virosomal actual es la ausencia de procedimientos para el encapsulamiento eficiente de solutos, tales como protemas, que se requieren para la induccion de una respuesta CTL. Una concentracion de lfpido a la cual se producen virosomas (1 mM de lfpido, aproximadamente), y considerando su diametro (aproximadamente 200 nm), de menos de 1% de la fase acuosa, se encapsula dentro de los virosomas (Schoen et al., en J. Liposome Res., 3: 767-792, 1993). Estas caractensticas reducen significativamente la eficiencia de virosomas para liberar antfgenos o genes hacia las celulas.

Una estrategia para superar esta limitacion y para producir un preparado inmunogenico para celulas T CD8 +, recientemente publicada en la solicitud de patente estadounidense numero 20100015214, se basa en una combinacion de virosomas vados con vehmulos, preferiblemente liposomas, que encapsulan antfgenos. U.S. 20100015214 divulga un

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efecto trans-adyuvante de virosomas, aunque estas partmulas y los liposomas no exhiben una interaccion ffsica entre ellos.

En el artmulo de Lanio. et al., publicado en J Liposome Res.,2008,18(1),1-19, se describe para el rhEGF una eficiencia superior de encapsulamiento-retencion de liposoma que se obtiene mediante el procedimiento de deshidratacion- rehidratacion (DRVs) y comprende fosfatidilcolina (PC) saturada (dipalmitoilfosphatidilcolina (DPPC) y colesterol (Cho) en una proporcion molar de 1:1 en comparacion con aquellos que contienen PC insaturada y Cho. En realidad, el procedimiento para obtener DRVs produce vesmulas de bi-capas multiples con una alta eficiencia de encapsulamiento/retencion para una amplia variedad de solutos solubles. Lanio et al. demostraron las propiedades inmuno-adyuvantes de estas vesmulas para potenciar una respuesta de anticuerpo, de manera cuantitativa y cualitativa superior contra rhEGF.

La resena publicada por Alvarez et al, en Toxicon, 2009, 54(8):1135-47, recopila las caractensticas estructurales y funcionales de dos protemas producidas por un invertebrado marino, La anemona del mar Caribe Stichodactila helianthus, que los autores llamaron Sticholisinas (Sts) I y II (StI/II). Estas protemas son toxinas formadoras de poros (PFTs) que pertenecen a la familia de protemas Actinoporins, clase unica de PFTs de origen eucariota encontrada exclusivamente en anemonas marinas. Similares a otros miembros de esta familia, las Sts son protemas basicas con un punto isoelectrico alto (>9.5), con una masa molecular de aproximadamente 20 kDa, carentes de residuos de cistema en su secuencia de aminoacidos y que exhibe una preferencia por membranas que contienen esfingomielina (SM). Las Sts se producen en forma soluble pero pueden asociarse facilmente con diferentes sistemas de membranas celulares y de modelo, y forman poros con un diametro de 2 nm, probablemente debido a la interaccion de las helices a del N-terminal proveniente de cuatro monomeros. Ambos eventos, la asociacion y la formacion de poro, dependen de las propiedades ffsico-qmmicas de las membranas.

En el artmulo publicado en Toxicon, 2007, 49: 68-81, Martinez et al. informan sobre la relevancia de la presencia de SM y Cho para la asociacion y formacion de poros en las membranas por parte de Stll. El estado de fase de la membrana influye la asociacion de StII con estas estructuras. Segun lo informado por Martinez et al., en la revista Biology, 2002, 16, 2: 8593, esta toxina se asocia de modo reversible con membranas de DPPC y SM, con una capacidad muy baja de permeabilizacion.

Aunque se han informado ampliamente las propiedades inmuno-moduladoras de las toxinas formadoras de poros que provienen de bacterias para la induccion de una respuesta CTL espedfica de antigeno, usando diferentes estrategias que incluyen su encapsulamiento en liposomas, tal como se recopila en las resenas de Dietrich et al. y Moron et al., en TRENDS in Microbiology, 2001, Vol.9 No.1,23-28 y TRENDS in Immunology, 2004, Vol.25 No.2, 92-97, respectivamente, no se ha hecho ninguna referencia a las toxinas funcionalmente homologas provenientes de organismos eucariotas marinos. Desde el punto de vista de sus aplicaciones en la inmuno-terapia de enfermedades tumorales, es deseable tener nuevas formulaciones vacunales capaces de inducir una respuesta inmune celular espedfica para antfgenos y menos agresivas que aquellas composiciones que contienen toxinas bacterianas.

Breve descripcion de la invencion

De manera sorprendente, los autores de la presente invencion han encontrado que cuando se administra un antfgeno por via subcutanea (sc) o intramuscular (im), encapsulado en la formulacion vacunal Liposoma-St, con cualquiera de las variantes de toxinas descritas que incluyen aquellas que no presentan actividad formadora de poros o de lisis, se inducen porcentajes de lisis de las celulas diana muy superiores a las que se observan en el grupo de control positivo que usa acido polinosinoico:policitidflico (poli I:C, PIC) el cual se considera en la tecnica anterior el potenciador fundamental de la respuesta CTL, respuesta no modificada de los niveles de anticuerpo y mixta de Th1/Th2, inducida por el antfgeno liposomal. Esto indica el potencial del sistema liposoma-St para generar una respuesta tanto celular como humoral contra un antfgeno proteico lo cual es relevante para el uso de esta formulacion para propositos de vacunacion.

El objeto de esta invencion es un vehmulo vacunal, tal como se describe en la reivindicacion 1. Las preparaciones liposomales de DPPC y Cho en las cuales estan los mutantes encapsulados de toxinas conocidas como Sts (por ejemplo, StIW111C y StIW111Cirrev) conjuntamente con el antfgeno proteico, tambien son objeto de la presente invencion.

En otro aspecto, las composiciones vacunales con base en este vehmulo vacunal que contiene las toxinas conjuntamente con un antfgeno administrado por via sc o im para induccion de una fuerte respuesta de CTL espedfica de antfgeno tambien son objeto de la presente invencion.

Ademas, en la presente se describe el uso de las composiciones vacunales descritas con base en este vehmulo vacunal que contiene las toxinas conjuntamente con un antfgeno y se administra por via sc o im para fortalecer la respuesta inmune de un paciente que sufre de una enfermedad seleccionada del grupo consistente en cancer y enfermedades infecciosas causadas por patogenos intracelulares.

En la presente tambien se describe un metodo para tratar pacientes que requieren un refuerzo de su respuesta inmune, en cuyo caso el paciente sufre de una enfermedad seleccionada del grupo consistente en cancer y enfermedades infecciosas causadas por patogenos intracelulares y el metodo comprende administrar por via sc o im las composiciones

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vacunales con base en este vehmulo vacunal que contiene las toxinas Sts o sus mutantes, conjuntamente con un antigeno relevante para la enfermedad.

En la presente tambien se describe la proteccion suministrada por composiciones vacunales de este tipo ante el reto con celulas tumorales que expresan el antigeno, por lo que se reduce el porcentaje de tumores y se incrementa la supervivencia de sujetos con tumores. Por lo tanto, en la presente tambien se describe un metodo profilactico ante el inicio de enfermedad relacionada con el antigeno.

Descripcion detallada de la invencion

El vehmulo vacunal de la invencion se basa en dispersiones acuosas de liposomas DRV de DPPC:Cho en una proporcion molar de 1:1 que encapsulan St conjuntamente con el antigeno y eventualmente pueden contener otros co-solventes miscibles con agua, no toxicos, no irritantes y que no causan desestabilizacion de las vesmulas, tales como aquellos usados comunmente en composiciones farmaceuticas inyectables, por ejemplo azucar, polietilenglicol, etcetera.

Los preparados liposomales de la presente invencion se obtienen mediante un procedimiento de deshidratacion- rehidratacion y estan compuestos por DPPC y Cho en una proporcion molar de 1:1 y co-encapsulan un antigeno con algunas de las variantes de Sts o sus mutantes reversiblemente inactivos, en cuyo caso dichas composiciones vacunales son capaces de promover una respuesta inmune CTL espedfica de antigeno y protectora contra el reto con celulas tumorales.

En una modalidad de la invencion, la composicion vacunal contiene como antfgeno la protema OVA, pero en tal caso el antigeno puede ser cualquier protema o polipeptido, asociados con una enfermedad para la cual, desde un punto de vista terapeutico, es relevante inducir una respuesta inmune CTL espedfica contra este antigeno proteico. Por ejemplo, el antigeno puede ser una protema o polipeptido asociados con cancer, una protema o polipeptido asociados con SIDA o una protema o polipeptido asociados con tuberculosis.

Los liposomas descritos en la presente se obtienen mediante tecnologfa de deshidratacion-rehidratacion informada por Kirby y Gregoriadis en Biotechnology, 1984, 2, 979-984; estos son vesmulas con una fase acuosa interna rodeada por varias bi-capas lipfdicas, caracterizadas por alta eficiencia de encapsulamiento y retencion de moleculas labiles tales como protemas de antigeno e inmunomoduladoras. Las soluciones en cloroformo de DPPC y Cho en una proporcion molar de 1:1 se evaporaron y se mantuvieron al vado durante 30 minutos. Los lfpidos se hidrataron con agua desionizada a una temperatura por encima de la temperatura de transicion de fase (Tc) de DPPC (T> 45 °C). Las suspensiones resultantes de vesmulas multi-lamelares (MLVs) se transformaron en SUV o LUV (por Small Unilamellar Vesicles o vesmulas uni-lamelares pequenas y por Large Unilamellar Vesicles o vesmulas uni-lamelares grandes, respectivamente) mediante ultrasonido y ciclos de reposo o extrusion a traves de membranas de policarbonato con un tamano de poro de 100 nm. Las vesmulas obtenidas se mezclaron con soluciones proteicas, siguiendo una proporcion lfpido: protema de 16 - 64 |jmol de lfpidos: 1.8 -7 nmol de antfgeno y 0.5 - 2 nmol de St, y se liofilizaron durante 20-24 horas. La rehidratacion se efectuo con agua desionizada y agitado durante 30 minutos a una temperatura de menos de 45 °C. El material des- encapsulado en liposomas se retiro mediante lavado con solucion salina de fosfato con pH regulado (PBS) pH 7.4 (NaCl de 136 mmol/L, KH2PO4 de 1.47 mmol/L, Na2HPO4 de 9.55 mmol/L, KCI de 2.68 mmol/L) seguido de centrifugacion a 10 000 g durante 15 minutos. Tales preparados alcanzan una eficiencia de encapsulamiento para las diferentes variantes de Sts que se encuentra en un intervalo alrededor de 50% con retencion de 70% despues de un mes de almacenamiento a 4 ° C suspendidos en PBS.

Las toxinas de Stl y Stll se afslan y se purifican a partir de la anemona marina Stichodactila helianthus, usando el procedimiento descrito por Lanio et al. en Toxicon. 2001, 39, 187-94. La Sticholisina I (rStl) recombinante y rStl mutante, Stl W111C, se obtienen de acuerdo con los procedimientos descritos por Pazos et al. en Toxicon, 2006, 48, 1083-1094 y Penton et al. en Protein Eng Des Sel. 2011, 24, 485-493, respectivamente.

La concentracion de Sts utilizada en el vehmulo vacunal de la presente invencion se encuentra en el intervalo de 0.25 a 1 jM co-encapsulada con antfgeno en un intervalo de concentracion de 1 - 3.5 jM en una suspension liposomal con un intervalo de concentracion total de lfpidos de 16 a 64 mM.

Preferiblemente, el vehmulo vacunal de la presente invencion contiene una cantidad de Sts de 0.3 a 0.4 nmol co- encapsulada con 1 a 2 nmol de antfgeno en una suspension liposomal de 20 jmo) de lfpidos totales en un volumen de 200 jL.

El intervalo de dosis utilizado para las vacunas referidas en la presente invencion, por via sc o im, es de 1 - 2 nmol (50100 mg) de antfgeno.

Una caractenstica clave de las composiciones vacunales de la invencion es que carecen de adyuvantes inmunologicos distintos de aquellos descritos.

Como ya se ha explicado antes, del estado de la tecnica se conoce que las toxinas bacterianas formadoras de poros, encapsuladas en vesmulas liposomales, son capaces de potenciar una respuesta de CTL, pero se sabe que el uso de

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composiciones vacunales a base de toxinas bacterianas tienen efectos adversos en los humanos; sin embargo, los autores de la presente invencion han encontrado de manera inesperada que las toxinas no bacterianas son capaces de tener el mismo efecto inmuno-estimulante. Mas aun, los autores de esta invencion han logrado desacoplar la actividad formadora de poros de las toxinas de sus efectos estimulantes de la respuesta de CTL, lo cual ofrece grandes ventajas para uso clrnico en humanos de este veldculo vacunal. Los resultados obtenidos usando las entidades moleculares StIW111Cirrev o Stll desactivada por calor, co-encapsuladas con antfgeno en liposomas, en el veldculo vacunal de la presente invencion demuestra que no existe una dependencia absoluta entre el potenciamiento de una respuesta inmune de CTL espedfica de antigeno por las formulaciones de liposomas-St y la capacidad de estas protemas de formar poros en membranas. La prueba de maduracion de celulas dendrfticas (DCs) aisladas de medula osea de ratones C57BL/6 y expuestas a Stll in vitro, muestra la capacidad de esta protema no solo en su variante activa, sino tambien en la desactivada por calor, de inducir la activacion de CDs, de manera similar a la observada con LPS (control positivo) en condiciones similares.

La capacidad de Sts para formar poros en membranas fue evaluada ensayando la actividad hemolftica y permeabilidad de LUVs cargados de carboxifluorescema (CF) tal como se describe por Martinez et al. en Toxicon, 2001, 39,1547-1560. Se ha mostrado que Sts no exhibe actividad permeabilizante cuando se analiza la permeabilizacion de vesfculas liposomales de DPPC:Cho (1:1) que encapsulan CF, en comparacion con lo observado en vesfculas compuestas por yema de huevo y SM (1:1) (control positivo).

Se verifico que StIW111C mutante forma un dfmero inactivo estabilizado por un enlace de disulfuro mediante un ensayo de actividad hemolftica y SDS-PAGE en presencia y en ausencia de 2-mercaptoetanol (2-ME) en calidad de agente reductor, tal como esta descrito por Penton et al. en Protein Eng Des Sel. 2011, 24, 485-493. La incapacidad de la estructura dimerica para formar poros en eritrocitos, como celulas modelo, fue resultado de su no asociacion con membrana.

Se establecio un procedimiento para obtener una especie dimerica irreversible de StIW111C (StIW111Cirrev) con base en la reduccion de StlW111C mediante incubacion con 2-ME (0.1 mol/L), eliminacion de agente reductor por filtracion en una columna PD-10, e incubacion inmediata de StIW111Cmonomero con el reactivo homo-bifuncional bis (maleimida) hexano (BMH) en una proporcion molar de StIW111Cmonomero:BMH de 1:1 o 2:1 por 2 horas a 4 ° C. StIW111Cirrev se purifico mediante cromatograffa de filtracion en gel en una columna Superdex 75 HR 10/300 en presencia de un agente reductor. La obtencion del dfmero irreversible y su grado de pureza se verificaron mediante SDS-PAGE en condiciones de reduccion. El dfmero reversible fue obtenido con 94% de pureza y solamente 6% contaminante del dfmero reversible. La ausencia de actividad funcional se verifico mediante ensayos de actividad hemolftica.

La desactivacion irreversible de Stll se realizo mediante tratamiento termico de acuerdo con el procedimiento descrito por Martinez et al. en Toxicon, 2001, 39,1547-1560 y la perdida total de la capacidad para formar poros en la membrana fue verificado mediante ensayo de actividad hemolftica.

Las propiedades inmuno-moduladoras de las diferentes especies moleculares Sts en el sistema liposoma-St relacionadas con su capacidad de potenciar una respuesta inmune citotoxica espedfica de antfgeno in vivo y una inmunidad antitumoral en un escenario preventivo, pueden medirse en el modelo experimental de la cepa de ratones C57BL/6 utilizando el antfgeno OVA y la lrnea celular tumoral E.G7, un subclon de timoma EL-4 de murino (Kusmartsev y Gabrilovich, en J Leukoc Biol., 2003, 74: 186-96), transfectado con ADN complementario de OVA pAc-neo-OVA (Moore, et al. in Cell, 1988, 54: 777-85) y obtenidos de la "American Type Cultures Collection" (ATCC, VA).

Los autores de la presente invencion tambien han encontrado que la inoculacion preventiva con el vehfculo vacunal liposomas-St que contiene antfgeno induce proteccion antitumoral superior a la generada por liposomas que no contienen StII.

Estos resultados demuestran que el sistema liposoma-St es efectivo para inducir una respuesta antitumoral funcionalmente robusta y protectora cuando se usa un antfgeno proteico sin la necesidad de otros adyuvantes. A su vez, el uso de este preparado en terapias combinadas puede potenciar aun mas su efecto antitumoral.

En los siguientes ejemplos se incluyen detalles experimentales comparativos que permiten verificar la eficacia inmunologica de inducir una respuesta inmune citotoxica, espedfica de antfgeno, in vivo, e inmunidad antitumoral en un escenario preventivo de las composiciones vacunales que son objeto de la invencion con respecto a las otras formulaciones no liposomales y no contienen Sts.

Ejemplos:

Ejemplo 1: Evaluacion de citotoxicidad y respuesta CTL del vehfculo vacunal usando Stl o StII nativas y OVA como antfgeno proteico.

El vehfculo vacunal con base en liposomas fue preparado tal como se ha descrito previamente.

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En vesfculas DRVs compuestas por DPPC y Cho (proporcion molar 1:1), OVA como antigeno modelo y Sts (Stl o Stll) se co-encapsulo en 10 jmol de Kpidos totales: 1.1 nmol de OVA y 0.3 nmol de St proporcion molar en solucion salina reguladora de pH de fosfato (PBS) pH 7.4. Despues de este procedimiento se obtuvieron dos composiciones vacunales:

Composicion vacunal A: liposomas DRVs de DPPC: Cho (60 jmol de lfpidos totales) que encapsulan 6.6 nmol (50 |jg) of OVA.

Composicion vacunal B: liposomas DRVs de DPPC: Cho (60 jmol de lfpidos totales) que co-encapsulan 6.6 nmol (50 jg) de OVA y 1.88 nmol de StI o StII.

Quince ratones hembras C57BL/6 con un peso corporal en el intervalo de 18-20 g fueron seleccionados y separados en grupos experimentales de tres animales cada uno.

El grupo 1 (control negativo) fue inoculado por via sc los dfas 0, 12, 13 y 14, con 0.2 mL de solucion salina con pH regulado con fosfato (PBS).

El grupo 2 (control positivo) fue inoculado por via sc, el dfa 12, con 22.2 nmol (1 mg) de OVA y se mezclo con 100 jg de acido poliinosinoico- policitidflico (PIC), un ligando sintetico TLR3 y un inductor clasico de respuesta CTL (Hamilton- Williams et al. in J. Immunol., 2005, 174: 1159-63), los dfas 13 y 14 los animales recibieron nuevamente 100 jg de PIC.

El grupo 3 fue inoculado por via sc los dfas 0 y 12, con 0.2 mL de composicion vacunal A (equivalente a 1.1 nmol o 50 jg de OVA).

El grupo 4 fue inoculado por via subcutanea los dfas 0 y 12, con 0.2 mL de composicion vacunal B (equivalente a 1.1 nmol o 50 mg of OVA y 0.3 nmol o 6.25 mg de Stl).

El grupo 5 fue inoculado por via sc los dfas 0 y 12, con 0.2 mL edicion vacunal B (equivalente a 1.1 nmol o 50 jg de OVA y 0.3 nmol o 6,25 jg de StII). El dfa 20 del experimento, se incubaron celulas de bazo de ratones C57BU6 sin inmunizar. Con dos concentraciones de diacetato carboxi-fluorescema ester de succinimidilo (CFSE) (0.33 y 5 mmol/L, respectivamente); las celulas etiquetadas con la mas alta intensidad de fluorescencia tambien se incubaron con 1 jmol/L del peptido de OVA (257-SIINFEKL-264) inmunodominante en el contexto del haplootipo MHC I para la cepa de ratones C57BL/6. Despues, ambas poblaciones de celulas etiquetadas se mezclaron 1:1 y los grupos experimentales 1-5 fueron inoculados por la vena de la cola con 30 x106 celulas de la mezcla en un volumen total de 0.2 mL. Los ratones fueron sacrificados despues de 16 horas y se determino la lisis (%) de las celulas diana en el ganglio inguinal linfatico mas cercano al sitio de inmunizacion mediante citometna de flujo (FACS).

La figura 1 muestra la citotoxicidad producida in vivo mediante inmunizacion de ratones con liposomas que co-encapsulan OVA y Sts. Los animales inmunizados con liposomas que co-encapsulan Sts (StI o Stll) mostraron una respuesta citotoxica de linfocitos T CD8+ (CTL) espedfica a OVA estadfsticamente mas alta que el grupo de control positivo. Adicionalmente, los liposomas que solo conteman OVA tambien indujeron una respuesta CTL estadfsticamente similar al control positivo clasico para este ensayo (PIC).

Ejemplo 2: Induccion de proteccion antitumoral del vehfculo vacunal en el modelo de protema OVA.

Se estudio la capacidad de las vacunas a base de liposomas para inducir proteccion antitumoral. Para este proposito se seleccionaron 60 ratones hembras C57BL/6 con un peso corporal en un intervalo entre 18-20 g y se separaron en 3 grupos de ensayo de 20 animales cada uno.

El grupo 1 (control negativo) fue inoculado por via im, los dfas 0 y 12, con 0.2 mL de solucion salina de fosfato reguladora de pH (PBS).

El grupo 2 fue inoculado por via im, los dfas 0 y 12, con 0.2 mL de la composicion vacunal A descrita en el ejemplo 1 (equivalente a 1.1 nmol o 50 jg de OVA).

El grupo 3 fue inoculado por via im, los dfas 0 y 12, con 0.2 mL de la composicion vacunal B, descrita en el ejemplo 1 (equivalente a 1.1 nmol o 50 jg de OVA y 0.3 nmol o 6.25 jg de StII).

Todos los grupos 1 a 3 fueron retados el dfa 19 con 3x105 celulas de la lmea tumoral E.G7 por via subcutanea (0.2 mL).

Los animales fueron individualizados desde el dfa 0 y se determinaron los siguientes parametros tres veces por semana: volumen del tumor, tiempo a la progresion y supervivencia.

Los resultados obtenidos se describen a continuacion:

Tiempo a la progresion

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El tiempo a la progresion es un parametro que caracteriza el tiempo transcurrido para cada animal desde el momento que se inocula el tumor hasta su aparicion. Para los ratones que no hadan desarrollado un tumor al final del experimento, se considero que el tiempo a la progresion fue de 60 dfas. El impacto en la extension del tiempo a la progresion es un parametro altamente deseable para una vacuna contra el cancer. Como puede observarse en la figura 2A, los animales del grupo 3, vacunados con la composicion vacunal B de formulacion descrita en el ejemplo 1 y objeto de la invencion, mostraron los resultados mas sobresalientes.

Supervivencia

Este parametro evalua la capacidad de la vacunacion para incrementar el tiempo que los animales inmunizados viven despues de haber sido retados con las celulas tumorales que expresan OVA (E.G7). Este parametro se mide en dfas y tiene un caracter relativo puesto que se compara con la supervivencia de animales no tratados. A fin de demostrar el significado estadfstico de las diferencias encontradas en resultados de supervivencia entre grupos, se utilizo el ensayo de Log-Rank.

La figura 2B muestra claramente que los animales del grupo 3, vacunados con la composicion vacunal B descrita en el ejemplo 1 y objeto de la presente invencion son aquellos que sobreviven mas tiempo despues de la inoculacion del tumor.

Ejemplo 3: Actividad hemolttica de mutantes Sts.

La formacion de poros en la membrana del eritrocito produce un choque coloide-osmotico que provoca la lisis de las celulas. La capacidad de formar poros de las llamadas porinas puede seguirse por su actividad hemolttica (HA) la cual puede determinarse experimentalmente midiendo la perdida de absorbancia aparente (A = 600 nm) de una suspension de eritrocitos debido a la lisis celular.

En el ensayo, la HA del dfmero inactivo irreversiblemente de StIW111C (StI W111Cirrev) fue comparada con la del dfmero reversible de StIW111C, en condiciones reductoras (2-ME 0.1 mol/l) y no reductoras, a una concentracion de protema relativamente alta en el ensayo (0.15 mmol/l), si se compara con la HA de Stl/Stll reportada por Alvarez et al. en Toxicon, 2009, 54(8):1135-47. Las cineticas de hemolisis mostradas en la figura 3 indican que StlW111Cirrev estaba inactiva en condiciones no reductoras. En condiciones reductoras, StIW111Cirrev presento menos actividad que StIW111C completamente reducido o no reducido.

Ejemplo 4: Evaluacion de la capacidad formadora de poros de StII desactivada.

La perdida de la capacidad para formar poros en membranas por StII irreversiblemente desactivada por calentamiento a 80 °C durante dos horas fue registrada usando el ensayo de actividad hemolttica. La figura 4 muestra la falta de actividad hemolftica para Stll termicamente desactivada al comparar con la protema activa.

Ejemplo 5. Efecto del vedculo vacunal en la maduracion de DCs.

La maduracion de DCs inducida por StII fue evaluada en celulas obtenidas de la medula osea de ratones C57BL/6 expuestos a StII activa (0.1 nmol o 2 |jg) o desactivada mediante tratamiento termico (4 |jg) en presencia o no de 20 |jg de polimixina B (pmxB, un agente neutralizante de actividad biologica de endotoxina mediante enlazamiento a la fraccion de ifpido A de LpS), durante 24 horas a 37 ° C en una camara de CO2 al 5%.

Como control positivo se uso LPS (2 jig) y el control negativo fue medio de RPMI mas 30 pmxB. Las celulas extrafdas de la medula osea de los ratones se cultivo en un cantidad de 600 000 precursores de DCs en RPMI por pocillo usando placas de 6 pocillos. Se adiciono suero fetal bovino (BFS) al 10%, 400 jl de GMCSF y RPMI para completar 3mL por pocillo. La figura 5 muestra el incremento (%) en los marcadores moleculares (CD80, CD86 y CD40) indicadores de la activacion de DCs como un resultado de la exposicion de estas celulas in vitro a StII, tanto en su variante activa como desactivada termicamente, y los resultados son comparables a aquellos obtenidos con el control positivo.

Ejemplo 6. Evaluacion de citotoxicidad y respuesta CTL del vedculo vacunal usando mutantes de St y OVA como protemas de antfgeno.

Las variantes dimerica de StI de baja actividad reversible (StIW111C) o irreversible (StIW111Cirrev) para formar poros y la variante de Stll termicamente desactivada fueron co-encapsuladas con OVA en liposomas de DPPC: Cho (1:1), en una proporcion de 10 jmol lfpido total: OVA de 1.1 nmol: 0.3 nmol de StIW111C, StIW111Cirrev o Stll desactivada termicamente, en PBS de pH 7.4 y fue evaluada la capacidad de estos preparados vacunales para inducir una actividad citotoxica, espedfica de OVA. En estos ensayos, se utilizaron esencialmente las mismas composiciones vacunales que aquellas descritas en el ejemplo 1; en el caso de la composicion B, fueron empleadas las diferentes variantes de St.

La composicion vacunal A: liposomas de DRVs de DPPC:Cho (60 jmol de lfpidos totales) que encapsulan 6.6 nmol de OVA.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

La composicion vacunal B: liposomas de DRVs de DPPC:Cho (60 jmol de Kpidos totales) que co-encapsulan 6.6 nmol de OVA y 1.875 nmol de St (StIW111C, StIW111Cirrev, St II nativa o Stll desactivada termicamente)

En un primer ensayo se seleccionaron 12 ratones hembras C57BL/6 con un peso corporal entre 18-20 g y se separaron en 4 grupos experimentales de tres animales cada uno.

El grupo 1 (control negativo) fue inoculado por via subcutanea los dfas 0 y 12, con 0.2 mL de PBS.

El grupo 2 (control positivo) fue inoculado por via subcutanea los dfas 0 y 12, con 0.2 mL de la composicion vacunal B (equivalente a 1.1 nmol o 50 |jg de OVA y 0.3 nmol o 6.25 |jg de StII nativa).

El grupo 3 fue inoculado por via subcutanea, los dfas 0 y 12 con 0.2 mL de la composicion vacunal B (equivalente a 1.1 nmol o 50 jg de OVA y 0.3 nmol o 6.25 jg de StIW111C).

El grupo 4 fue inoculado por via subcutanea los dfas 0 y 12 con 0.2 mL de la composicion vacunal B (equivalente a 1.1 nmol o 50 jg de OVA y 0.3 nmol o 6.25 jg de StIW111Cirrev).

La figura 6A muestra que los animales inmunizados con liposomas, que contienen variantes de St de baja actividad formadora de poros (LP/OVA+StIW111C o LP/OVA+StIW111Cirrev) exhiben una respuesta citotoxica estadfsticamente similar a la obtenida con StII cuando esta co-encapsulada con OVA en liposomas (LP/OVA+Stll).

En otro ensayo, se seleccionaron nueve ratones hembras C57BL/6 con un peso corporal entre 18-20 g y se separaron en 3 grupos de 3 animales cada uno.

El grupo 1 (control negativo) fue inoculado por via subcutanea los dfas 0 y 12 con 0.2 mL de regulador de pH de solucion salina de fosfato (PBS).

El grupo 2 fue inoculado por via subcutanea los dfas 0 y 12 con 0.2 mL de composicion vacunal A (equivalente a 1.1 nmol o 50 jg de OVA).

El grupo 3 fue inoculado por via subcutanea los dfas 0 y 12 con 0.2 mL de composicion vacunal B (equivalente a 1.1 nmol o 50 jg de OVA y 0.3 nmol o 6.25 jg de Stll inactiva).

La figura 6B evidencia que la inmunizacion con liposomas que co-encapsulan OVA y la variante de Stll desactivada termicamente de manera completa genero una actividad citotoxica espedfica de OVA significativamente mas alta que la inducida por liposomas que conteman solamente el antfgeno y similar a la observada con la formulacion liposomal que contema Stl/Stll nativa.

Los resultados experimentales demostraron que la vacuna liposomal, objeto de esta invencion, que co-encapsula un antfgeno con cualquier variante de sticholisina, incluso con aquellas que no presentan actividad formadora de poros, indujo una respuesta CTL espedfica de antfgeno, potente, robusta y funcional, incluso mayor que la obtenida mediante el control positivo clasico (PIC) usado en un ensayo de CTL in vivo. La formulacion liposomal-St en un escenario preventivo incremento significativamente la cinetica de implantacion tumoral e incremento significativamente la supervivencia de los grupos evaluados en relacion con aquellos que recibieron solamente PBS. En resumen, la vacunacion con liposomas-St exhibio mejores resultados que aquellos observados con vesfculas liposomales que conteman solamente el antfgeno.

Descripcion breve de las figuras

La figura 1 representa una grafica que muestra el porcentaje de lisis de las celulas diana cargadas con el peptido inmunodominante de OVA (SIINFEKL) y etiquetadas con cFsE en animales experimentales sometidos a diferentes tratamientos vacunales en un ensayo de citotoxicidad in vivo y la lmea al valor medio de al menos dos experimentos independientes. Las diferentes letras indican diferencias estadfsticas significativas entre grupos inmunizados de acuerdo con el ensayo de Dunnett T3 (p< 0.05).

La figura 2A representa el porcentaje de animales libres de tumor en tres grupos de animales experimentales sometidos a diferentes tratamientos vacunales y retados con celulas tumorales que expresan OVA.

La figura 2B: representa una grafica que permite visualizar el parametro de supervivencia en los tres grupos mencionados despues de inocular celulas tumorales que expresan OVA. Las letras diferentes indican diferencias estadfsticas significativas de acuerdo con el ensayo de Log-Rank (p< 0.05).

La figura 3 muestra variacion en turbidez de una suspension de eritrocitos debido a la accion de variantes dimericas de Stl (StIW111C o StIW111Cirrev) en condiciones de reduccion (en presencia de 2-ME) y no reduccion.

La figura 4 representa perdida de turbidez de una suspension de eritrocitos debido a la actividad de StII nativa (protema activa) o desactivada por tratamiento termico.

La figura 5 muestra cambios en la expresion de marcadores moleculares de celulas dendnticas (DCs) debido a su exposicion in vitro a StII tanto en su variante activa como en su variante desactivada termicamente en presencia o ausencia de un agente de neutralizacion de endotoxina (pmxB).

Grafica A: Porcentaje de CD80

5 Grafica B: Porcentaje de CD86

Grafica C: Porcentaje de CD40

La figura 6 representa dos graficas que muestran porcentajes de lisis de las celulas diana cargadas con peptido inmuno dominante de OVA (SIINFEKL) y etiquetadas con CFSE en animales experimentales sometidos a diferentes tratamientos vacunales en un ensayo de citotoxicidad in vivo. Cada punto corresponde a datos de un animal individual y la lmea 10 corresponde al valor medio. Las letras diferentes indican diferencias estadfsticas significativas entre los grupos inmunizados de acuerdo con el ensayo de Tukey (p< 0.05).

Grafica A: Respuesta obtenida despues de inmunizar con liposomas que co-encapsulan OVA, Stll nativa o variantes dimericas de Stl inactiva reversiblemente (StIW111C) o irreversiblemente (StIW111Cirrev).

Grafica B: Respuesta obtenida despues de inmunizar con liposomas que co-encapsulan OVA y StII desactivada mediante 15 tratamiento termico.

Claims (10)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   Reivindicaciones

   1. Un vehroulo vacunal que comprende un co-encapsulamiento en vesroulas liposomales de protemas obtenidas de la anemona Stichodactila helianthus conjuntamente con un antfgeno, en cuyo caso las protemas son Sticholisinas, y el vehroulo vacunal induce una respuesta immune celular.
2. 2. El vehroulo vacunal de acuerdo con la reivindicacion 1, en cuyo caso el vehroulo liposomal contiene dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) y Cho en una proporcion equimolar.
3. 3. El vehroulo vacunal de acuerdo con la reivindicacion 1, en cuyo caso las protemas de la anemona Stichodactila helianthus se seleccionan del grupo que comprende Sticholisina II (StII), Sticholisina I (StI), Sticholisina I mutante W111C (StIW111C), StIW111C dfmero inactivo irreversiblemente (StIW111Cirrev) o StII desactivada termicamente.
4. 4. El vehroulo vacunal de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el cual el antfgeno es una protema o un polipeptido, asociados con una patologfa seleccionada del grupo que comprende cancer y enfermedades infecciosas causadas por patogenos intracelulares.
5. 5. El vehroulo vacunal de acuerdo con la reivindicacion 4, en el cual el antfgeno es una protema o polipeptido, asociados con cancer.
6. 6. El vehroulo vacunal de acuerdo con la reivindicacion 4, en el cual el antfgeno es una protema o un polipeptido, asociados con SIDA.
7. 7. El vehroulo vacunal de acuerdo con la reivindicacion 4, en el cual el antfgeno es una protema o un polipeptido, asociados con tuberculosis.
8. 8. Una composicion vacunal que comprende el vehroulo vacunal de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, y dicha composicion carece de otros adyuvantes inmunologicos.
9. 9. El vehroulo vacunal de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, para usar en la induccion de una respuesta inmune celular.
10. 10. La composicion vacunal de acuerdo con la reivindicacion 8, para usar en el potenciamiento de la respuesta inmune de un paciente que sufre de una enfermedad seleccionada del grupo que comprende cancer y enfermedades infecciosas, causadas por patogenos intracelulares.