KR20130027547A

KR20130027547A - 리포솜으로 캡슐화된 스티코리신에 따른 백신 조성물

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Publication number: KR20130027547A
Application number: KR1020137000208A
Authority: KR
Inventors: 루이스 엔리케 페르난데스 몰리나; 마리아 엘리아나 라니오 루이즈; 레디 주디스 라보르드 킨타나로오; 욜리스 크루즈 라엘; 마리아 델 카멘 루사르도 로렌조; 키르케 메사 파들리오; 카를로스 매뉴얼 알바레즈 베카셀; 이스라벨 파비올라 파조스 산토스; 메이라 테주카 마티너스; 아이셀 발레 갈레이; 마리아 유게니아 알론소 비오스카; 리엠 카네 산토스
Original assignee: 센트로 데 인무노로지아 몰레큘라
Priority date: 2010-07-06
Filing date: 2011-07-05
Publication date: 2013-03-15
Also published as: ZA201300059B; CA2802443A1; ES2576851T3; TW201217000A; EP2591802A1; SG186931A1; AR081661A1; BR112012033284A2; EA025333B1; TN2012000592A1; AU2011276812A1; CU20100144A7; JP5685646B2; AU2011276812B2; WO2012003814A1; CO6640312A2; BR112012033284B1; CN102971011A; US20130149376A1; EP2591802B1

Abstract

본 발명은 인간의 건강에 적용되는 생명 공학 분야에 관한 것이다. 본 바명에서는 백신 전파체(vaccine vehicle)에 대해 설명하고 있으며, 진핵생물(eukaryotic organisms)로부터의 독소는 지질 조성물(lipidic composition)이 피하(subcutaneous) 또는 근육내(intramuscular)에 투여하기 위해 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC):콜레스테롤(cho)의 분자비(molar ratio)가 1:1인 탈수-복원(dehydration-rehydration) 처리과정에 의해 얻어지는 다중층상 전파체(multilamellar vesicles)로 캡슐화된다. 이러한 조성물은 다른 보강제의 사용을 필요로 하지 않는다.
게시되는 조성물은 독소를 함유한 리포솜(liposomes)으로 공동 캡슐화된 하나 또는 여러 항원에 대한 CTL 특정 면역 반응의 변조가 가능 하다. 본 발명의 백신 전파체는 유도 면역 반응(CTL-specific immune response)의 기능성(functionality) 및 강건성(robustness)뿐만 아니라 면역 반응 특성의 견고성과 기능으로 인해 이전 기술에 의해 공개된 다른 기술에 비해 장점이 있음을 보여준다.

Description

리포솜으로 캡슐화된 스티코리신에 따른 백신 조성물 {VACCINE COMPOSITION BASED ON STICHOLYSIN ENCAPSULATED INTO LIPOSOMES}

세포내 병원체(intracellular pathogens)로 인한 질병의 치료 및 암 면역 요법(cancer immunotherapy)에 도움이 되는 특이 항원 면역세포반응 (antigen-specific immune cellular responses)을 높이고 스티코리신(sticholysin)을 함유하는 리포솜을 토대로 한 피하(subcutaneous) 및 근육조직 내(intramuscular) 모두에 사용되는 백신 전파체(vaccine vehicle)에 관련한 것이다.

리포솜의 전파체(liposomal vesicles)의 면역보조물질 능력(immunoadjuvant capacity)은 오랫동안 알려져있다. 면역(immunization)에 있어서 리포솜(liposomes)을 사용하는 것으로 존재하고, 백신 설계(vaccine design)는 면역반응을 자극하고 항원표출세포(antigen presenting cells, APC)에 항원 분자(antigenic molecule)를 표출하는 그들의 능력에 기반을 두고 있다. 상기 면역보조물질(immunoadjuvants)로 리포솜(liposomes)의 가장 중요한 장점은 (i) 항원표출세포(APC)에 항원의 많은 양을 가진 미믹 병원체(mimic pathogens)에 대한 능력(ability), (ii) 면역자극 분자(immunostimulatory molecule)와 함께 공동 캡슐화되는 항원의 가능성, (iii) 보다 효과적인 목적달성을 위해 물리화학적 속성(physicochemical properties)의 변형에 대한 유연성(Leserman in Journal of Liposome Research, 2004, 14 (3 & 4), 175-189)으로 요약된다.

백신학(vaccinology) 분야의 과제는 세포내 병원체와 종양세포에 의해 유도된 질병에 대한 예방 및 치료를 위하여 관련되는 특이항원 독성 T 림프구 CD8+(CTL, Cytotoxic T Lymphocyte)에 의해 영향을 주는 세포 면역 반응의 향상성을 갖는 것이다. 리포솜의 전파체(liposomal vehicles)는 CTL(Cytotoxic T Lymphocyte) 반응을 향상시킬 수 있지만 항상 효율적이지 않다. 리포솜(liposomes)의 전파체(vehicles)를 기반으로 한 서로 다른 전략들은 기능을 능률화하는 목적으로 설계되었다; 예를 들면 산성(acidic) pH의 민감한 리포솜(liposomes), 양이온 리포솜(cationic liposomes), CpG 및 포어 포밍(pore-forming) 독소형 박테리아와 같은 면역조절인자(immunomodulators)인 봉입체(inclusion)가 있다. 다양한 간행물에서 공개되었음에도 불구하고, 이러한 전략 중 일부는 효과적인 세포 면역 반응의 유도를 제한하여 성공을 거두었거나 불이익을 감수해야만 했다. 따라서 이행하기 전 더 나은 설계가 필요하였다.

산(acid) pH 또는 단백질분해 처리(proteolytic processing)의 조건에 있어서 막(membrane) 융합을 촉진하기 위해서는 리포솜 막(liposomal membrane)에서 바이러스의 막 단백질(viral membrane proteins)의 통합은 백신 전파체(vaccine vehicle)의 개발을 위해 또 다른 대안이 된다. 비로솜(virosomes)으로 알려진 이 전파체는 부모 바이러스 백신으로 사용될 뿐만 아니라 비로솜에 결합(binding)하거나 캡슐화 또는 백신 항원을 위한 전파체로 이용되었다 (Zurbriggen en Vaccine, 2003 14; 21(9-10): 921-4). 인플루엔자 바이러스(influenza virus)의 막(envelope)에서 단백질과 지질(lipids)을 함유하는 약어 IRIV (면역강화 재구성 인플루엔자 비로솜 - immunopotentiating reconstituted influenza virosomes)로 알려진 비로솜(virosome) 입자는 이 전략의 좋은 한 예이며, A형 간염(hepatitis A)에 대한 백신관련 특허(미국 등록특허번호 제 5,565,203호)를 토대로 하여 형성된다. 그러나, 이러한 백신 표본(vaccine preparation)은 A형 간염에 대항하여 중화 항체 반응(neutralizing antibody response)을 향상시키도록 설계된다. A형 간염 바이러스의 결합(binding)은 APC에서 비로솜(virosome) 및 엔도솜(endosomal) 막의 융합과정의 결과로서, 고전경로(classical pathway) MHCII에 의해 파생된 펩티드(derived peptides)의 처리(processing) 및 표출(presentation)이 타고난 비로솜 막에서 아주 순수하고 비활성화 되었다 (Gluck y Walti in Dev Biol (Basel), 2000, 103, 189-97). 설명된 증거는 항원 비로솜 물리적 동반(physical association)은 면역보조물질(immunoadjuvant)에 중요하다 (Zurbriggen 외, Progr., in Lipid Res., 2000, 39(1), 3-18; Amacker 외, in Int Immunol., 2005, 17(6), 695-704).

슈마허(Schumacher) 외 발명자는 2004년 백신(vaccine) 22: 714-723에서 IRIVs가 세포성 면역 반응을 향상시킬 수 있다는 것이 보고하였다. 특히, 슈마허(Schumacher) 외 발명자는 생체외(in vitro)에서 CTL의 유도에 있어서 보강 활성도(adjuvant activity)를 입증하였다. 이러한 능력(ability)은 주로 바이러스 단백질에 특정한 CD4 + T세포의 반응성의 자극에 달려있다. 그러나, 보강제(adjuvants)로서 비로솜(virosomes)의 사용이 낮은 독성과 높은 면역원성(immunogenicity)과 같은 많은 장점이 있더라도, 현재 비로솜의 기술에 있어서 문제점 중 하나는 CTL 반응의 유도에 필요한 단백질과 같은 용질의 효율적인 캡슐화를 위한 절차의 부재이다. 비로솜(virosomes)이 생산되는 지질 농도 (지질의 약 1mM), 그리고 직경(약 200 nm)을 고려하고, 수성 단계의 1% 미만이 비로솜 내에서 캡슐화된다 (Schoen 외, en J. Liposome Res., 3: 767-792, 1993). 이러한 특징은 크게 셀에 항원 또는 유전자를 표출하도록 비로솜의 효율성을 줄일 수 있다. 이러한 한계를 극복하고 CD8 + T세포에 대한 면역원 표본(immunogenic preparation)을 생산하는 하나의 전략은 최근에 미국특허출원번호제 20100015214호에 공개되었고, 항원을 캡슐화하는 전파체(vehicles), 바람직하게는 리포솜(liposomes)과 함께 빈(empty) 리포솜의 조합에 기반을 두고 있다. 미국특허출원번호 제 20100015214호는 이러한 입자(particles)와 리포솜 사이에 물리적 상호작용을 보이지 않더라도 리포솜의 트랜스-보조제 효과(trans-adjuvant effect)를 개시하고 있다.

라니오(Lanio) 외 발명자에 의해 2008년도에 발표된 18(1), 1-19, 제이 리포솜 연구(J Liposome Res.)에 대한 학술지(the article by Lanio et al. published in the J Liposome Res., 2008, 18(1), 1-19)에서 인상피세포성장인자(rhEGF)에 대해 불포화된 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine, PC) 및 콜레스테롤(cholesterol, Cho)을 함유하는 이들과 비교하여 분자비(molar ratio)가 1:1인 콜레스테롤(Cho) 및 포화된 포스파티딜콜린(PC) (디팔미토일포스파티딜콜린 (dipalmitoylphosphatidylcholine, DPPC))을 포함하였고, 탈수반응-수분공급 처리(DRVs - dehydration-rehydration procedure)에 의해 획득된 리포솜의 높은 캡슐화 보존 효율성(encapsulation-retention efficiency)을 게시하고 있다. 사실, DRVs를 얻기 위한 절차는 매우 다양한 수용성 용질에 대해 높은 캡슐화/보존 효율성을 갖는 멀티 이중층 전파체(multi-bilayer vesicles)를 생산한다. 라니오(Lanio) 외 발명자는 인상피세포성장인자(rhEGF)에 대해 양적 및 질적으로 우수한 항체 반응을 향상시키도록 이러한 전파체의 면역보조물질 특성(immunoadjuvant propierties)을 보여 주었다.

알바레쯔(Alvarez) 외 발명자에 의해 2009년도에 발표된 54(8): 1135-47, 톡시콘(Toxicon) 학술지(published by Alvarez et al. in Toxicon, 2009, 54(8): 1135-47)에서 저자 스틱코리신(Sticholysins, Sts) I 및 II에 의해, 카리브 해 말미잘(caribbean sea anemone) 스틱코닥틸라 헬리안투스(Stichodactyla helianthus) 및 해양 무척추동물(marine invertebrate)에 의해 생산되는 두 가지 단백질의 구조와 기능적인 특성에 대해 요약하였다. 이러한 단백질은 오직 카리브 해(Caribbean Sea)에서만 발견되는 진핵생물 기원(eukaryotic origin)의 포어 포밍 독성(PFTs - pore-forming toxins) 중 유일한 류(classes)인 단백질 패밀리 안티노포린(Actinoporins)에 속하는 포어 포밍 독성(PFTs - pore-forming toxins)이다. 이러한 패밀리의 다른 구성원과 마찬가지로, 스틱코리신(STS)은 스핑고마이엘린(SM - Sphingomyelin)을 포함하는 막(membranes)에 대한 선호도를 보이고 그들의 아미노산 서열에서 시스테인 잔기가 전혀 없는, 대략 20kDa 분자량과 높은 아이솔렉트릭 점(isolelectric point) (>9.5)를 가진 기본 단백질이다. 스틱코리신(STS)는 수용성 형태로 생산되지만 아마도 네 개의 단량체에서 N-말단(terminal)의 알파(α) 나선(helices)의 상호작용 때문에 쉽게 다른 세포 및 지름 2nm를 갖는 포어(pores)를 형성하는 모델 막 시스템(model membrane systems)과 관련할 수 있다. 제휴와 포어 포밍(pore-forming) 모두는 막(membranes)의 물리적 특성에 따라 달라진다.

마르티네즈 외 발명자는 2007년도에 발표한 49: 68-81, 톡시콘(Toxicon) 학술지(the article published in Toxicon, 2007, 49: 68-81, Martinez et al.)에서 StII 에 의한 막(membranes)에서 포어(pore) 형성 및 연관(association)을 위한 스핑고마이엘린(SM - Sphingomyelin) 및 콜레스테롤(Cho - cholesterol)의 존재에 대한 관련성을 보고하였다. 막(membrane)의 위상 상태(phase state)는 이러한 구조로 StII 연관성에 영향을 미친다. 마르티네즈(Martinez) 외 발명자에 의해 2002년도에 발표된 생물학 잡지(Martinez et al., in the journal Biology, 2002, 16, 2: 85-93)에서 이 독소(toxin)는 퍼메어빌라이제이션(permeabilization)의 매우 낮은 용량 (low capacity)으로 디팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC) 및 스핑고마이엘린(SM)의 막 (membranes)에 가역적으로(reversibly) 관련이 있다.

항원 특정 CTL 반응의 유도에 대한 박테리아의 포어 포밍 독소(pore-forming toxins)의 면역 중재 특성(immunomodulatory properties)이 폭넓게 보고되었다 할지라도, 리포솜에 그들의 캡슐화(encapsulation)를 포함하여 서로 다른 전략을 사용한다는 것은 다이어트리치(Dietrich) 외 발명자에 의해 2001년도에 미생물학에서 트랜드(TRENDS)에 의해 검토된 (by Dietrich et al. and Moron et al., in TRENDS in Microbiology, 2001, Vol.9 No.1, 23-28) 및 모론(Moron) 외 발명자에 의해 2004년도에 발표된 트랜드(TRENDS), 면역학(reviews by Moron et al., in TRENDS in Immunology, 2004, Vol.25 No.2, 92-97)에 의한 평가에서 해양 진핵생물(marine eukaryotic organisms)의 상동 독소(homologous toxins)에 대해서는 기능적으로 아무런 언급도 하지 않았다.

종양 질환의 면역 치료에 있어서 작용(applications)의 관점에서, 항원에 특정한 세포 면역 반응을 일으킬 수 있는 새로운 백신제제(vaccine formulations)를 갖는 세균독소(bacterial toxins)를 포함하는 조성물(compositions)보다 공격성이 낮은 것이 바람직하다.

놀랍게도, 본 발명의 저자는 항원(antigen)이 포어 포밍(pore-forming) 또는 용균 활동(lytic activity)을 드러내지 않도록 형성된 어떠한 독소의 변형을 갖는 백신 제제 리포솜-St(vaccine formulation Liposome-St)에 캡슐화되어 피하(sc - intramuscularly) 또는 근육 내에서(im - intramuscularly) 투여될 때, 표적 세포(target cells) 중 훨씬 더 높은 용해율(lysis percentage)이 리포솜의 항원에 의해 유도되어 변형되지 않는 항체 수준(unmodified antibody levels) 및 혼합 Th1/Th2 반응, CTL 반응의 본질적인 증폭자 (quintessential enhancer)로서 종래의 상태로 간주되는 폴리이노신산(polyinosinic acid)과 폴리시티딜산(polycytidylic acid) (poly I:C, PIC)을 사용하여 양성 조절 그룹(positive control group)에서 관찰되는 것보다 더욱 유도하게 된다. 이는 예방 접종의 목적을 위해 이러한 제제의 사용과 관련되는 단백질 항원에 대하여 세포와 체액성 반응(humoral response) 모두를 생성하는 리포좀-St 시스템의 가능성을 나타낸다.

본 발명의 목적은 단백질 항원과 함께 스틱코리신(Sts)로 알려진 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC) 및 콜레스테롤(Cho) 공동 캡슐화 독소의 리포솜 제조에 따른 백신 전파체(vaccine vehicle)이다. 단백질 항원과 함께 스틱코리신(Sts) (예: StIW111C 및 StIW111Cirrev)로 알려진 독소(toxins)의 캡슐화된 돌연변이(encapsulated mutants)인 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC) 및 콜레스테롤(Cho)의 리포솜의 제조 또한 본 발명의 목적이다.

또 다른 측면에서 강력한 항원의 특정 CTL 반응의 유도를 위해 피하(intramuscularly, sc) 또는 근육 내에서(intramuscularly, im) 투여된 항원과 함께 독소를 함유하는 백신 전파체(vaccine vehicle) 백신 조성물을 제공하는 것이 본 발명의 또 다른 목적이다.

본 발명의 또 다른 목적으로, 세포내 병원체로 인한 암 및 감염 질환으로 구성하는 그룹에서 선택된 질병으로부터의 환자의 고통에 대한 면역 반응 강화를 위한 피하(intramuscularly, sc) 또는 근육 내에서(intramuscularly, im)의 투여도이고, 항원과 함께 독소를 함유하는 백신 전파체에 따라 설명되는 백신 조성물의 용도이다.

또 다른 측면에서 본 발명의 목적은 또한 면역 반응의 강화를 필요로 하는 환자를 치료하는 방법이며, 상기 환자는 세포내 병원체로 인한 암과 감염증(infectious diseases)으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 질병을 앓고 있는 환자를 말하며, 상기 방법은 질병에 대한 관련하는 항원과 함께 돌연변이 또는 독소 스틱코리신(Sts)을 함유하는 백신 전파체(vaccine vehicle)를 기초로 한 백신 조성물을 피하(sc) 또는 근육내(im)에 투여하는 단계를 포함한다.

추가로, 본 발명은 또한 종양을 가진 시험체의 생존율을 증가시키고 종양의 크기를 줄여 항원을 표출하는 종양세포의 과제에 대한 백신 조성물(vaccinal composition) 등에 의해 제공되는 예방법에 관한 것이다. 따라서, 항원과 관련된 질환의 발병 예방법 또한 본 발명의 목적이다.

도 1은 OVA-면역 펩티드(immunodominat peptide)(SIINFEKL)에 로드하고(loaded) 생체내(in vivo)의 사이토토시티 분석(cytotocity assay)에서 서로 다른 백신 치료를 받게 한 실험 동물에 있어서 CFSE로 표시된 표적 세포(target cells)의 용해율(lysis percentage)을 보여주는 그래프를 나타낸 것이다. 각 점은 단일 동물로부터의 데이터와 일치하며 적어도 두 개의 독립적인 실험에 대한 평균값을 선(line)으로 나타낸 것이다. 서로 다른 문자는 던네트(Dunnett)의 T3 테스트 (p <0.05)에 따라 예방 접종된 그룹간에 중요한 통계 차이를 나타낸 것이다.
도 2a는 OVA-발현 종양세포(expressing tumor cells)와 주입된(challenged) 서로 다른 백신 치료를 받은 실험 동물의 세 그룹에서 종양이 없는 동물의 비율을 나타낸 것이다.
도2b는 OVA-발현 종양세포(expressing tumor cells)의 접종(inoculation) 후 상기에서 언급한 세 그룹에서 생존한 매개체(survival parameter)를 시각화한 것을 그래프로 나타낸 것이다. 서로 다른 문자는 로그순위 테스트(Log-Rank test)(p <0.05)에 따른 서로 다른 중요한 통계 차이를 나타낸 것이다.
도 3은 감소하는 조건(2-ME 의 존재에 있어서) 및 감소하지 않는 조건하에서 StI (StIW111C 또는 StIW111Cirrev)의 2합체 변이균(dimeric variant)의 활동으로 인해 적혈구 현탁액의 탁도(turbidity)의 변화를 나타낸 것이다.
도 4는 천연 StII(활성 단백질)의 활성도 또는 열처리(by thermal treatment)에 의한 비활성도로 인한 적혈구 현탁액(erythrocyte suspension)의 탁도에 대한 손실을 나타낸 것이다.
도 5a, 5b 및 5c는 내독소 중화제(endotoxin neutralizing agent - pmxB)의 존재여부에서의 활성 및 열-불화성 변이체(thermal-inactivated variant)의 St II에 대한 그들의 생체외(in vitro) 설명으로 인한 수지상 세포(dendritic cells)에 대한 분자 표지(molecular marker) 발현의 변화를 나타낸 것으로;
도 5a는 CD80의 비율을 그래프로 나타낸 것이다.
도 5b는 CD86 의 비율을 그래프로 나타낸 것이다.
도 5c는 CD40 의 비율을 그래프로 나타낸 것이다.
도 6a 및 6b는 OVA-면역 펩티드(immunodominat peptide)(SIINFEKL)에 로드하고 생체내(in vivo)의 사이토토시티 분석(cytotocity assay)에서 서로 다른 백신 치료를 받게 한 실험 동물에 있어서 CFSE로 표시된 표적 세포(target cells)의 용해율(lysis percentage)을 보여주는 두 가지 그래프를 나타낸 것이다. 각 점은 단일 동물로부터의 데이터와 일치하며 평균값을 선(line)으로 나타낸 것이다. 서로 다른 문자는 터키(Tukey) 테스트(p<0.05)에 따라 예방 접종된 그룹간에 중요한 통계 차이를 나타낸 것으로;
도 6a는 리포솜 공동 캡슐화 OVA, 천연 StII 또는 가역적으로(StIW111C) 비활성 또는 비가역적으로 (StIW111Cirrev) 비활성의 StI 의 2합체 변이체(dimeric variants)를 면역처리하여 수득 된 반응한 것을 나타낸 것이다.
도 6b는 리포솜 공동 캡슐화 OVA 및 열처리에 의해 비활성화된 StII와 함께 면역처리하여 수득 된 반응한 것을 나타낸 것이다.

본 발명의 백신 전파체(vaccine vehicle)는 항원과 함께 스티코리신(St)을 캡슐화하고, 결국 물과 다른 공동 용매 미시블(co-solvents miscible), 무자극(non-irritating)을 포함할 수 있으며, 예를 들어 설탕, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol) 등과 같은 일반적으로 주사 가능한 약제학적 조성물(injectable pharmaceutical compositions)에 사용되는 것과 같은 전파체(vehicle)의 불안성(destabilization)을 일으키지 않는 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC):콜레스테롤(Cho)의 몰비(molar ratio)가 1:1인 DRV 리포솜(liposomes)의 수용성 산포(aqueous dispersions)를 기반으로 한다.

본 발명의 리포솜의 표본(liposomal preparations)은 탈수반응-수분공급 처리(dehydration-rehydration procedure)와 DPPC:Cho의 몰비(molar ratio)가 1:1로 구성되며, 몇 가지 스티코리신 변이체(Sts variants) 또는 가역적으로 비활성 돌연변이체(mutants)를 공동 캡슐화하여 수득 되며, 상기 백신 조성물(vaccinal compositions)은 종양 세포의 공격에 대항하여 보호하고 특정 항원 CTL 면역 반응을 향상시킬 수 있다.

본 발명의 실시 예에서 백신 조성물(vaccine composition)은 단백질 OVA 항원으로 포함되어 있지만, 상기 항원은 약제학적 관점에서 볼 때 질병에 관련한 단백질 또는 폴리펩티드(polypeptide)가 될 수 있으며, 이러한 단백질 항원에 대하여 특정 CTL 면역 반응을 유도하는 것과 관련이 있다. 예를 들어, 상기 항원은 암(cancer), 후천성면역결핍증(AIDS)나 결핵(tuberculosis)과 관련된 단백질 또는 폴리펩티드가 될 수 있다.

여기에서 설명하는 리포솜(liposomes)은 1984년도에 생명공학지에서 커비와 그레고리아디스에 의해 보고된(reported by Kirby and Gregoriadis in Biotechnology, 1984, 2, 979-984) 탈수반응-수분공급 기술(dehydration-rehydration technology)로 얻을 수 있으며, 이들은 항원(antigen) 및 면역조절 단백질(immunomodulator proteins)과 같은 가변적 분자(labile molecules)의 잔류(retention) 및 캡슐화(encapsulation)의 높은 효율성을 특징으로 하는 여러 지질 이중층(lipid bilayers)로 둘러싸인 내부 수용액(internal aqueous)을 갖는 소포(vesicles)이다. DPPC: Cho의 몰비(molar ratio)가 1:1인 클로로포롬 용액(chloroform solution)은 30분 동안 진공을 유지하고 증발된다. 상기 지질(lipids)은 DPPC(T>45°C)의 위상 전이 온도(Tc) 이상의 온도에서 탈 이온수(deionized water)와 수화시키게(hydrated) 된다. 다중층상 전파체의 현탁액 결과물(Suspensions of multilamellar vesicles resulting, MLVs)은 포어(pore) 사이즈 100nm의 폴리카보네이트 막(polycarbonate membranes)을 통해 압출(extrusion)되거나 초음파(ultrasound) 및 휴식 사이클(rest cycles)로 SUV(Small Unilamellar Vesicles) 또는 LUV(Large Unilamellar Vesicles)에서 형질전환(transformed)된다.

획득된 소포(vesicles)은 다음과 같은 지질(lipid)의 관계에 따라 단백질 용액(protein solution)과 혼합하였다: 지질(lipids)의 16-64 mmol: 항원(antigen)의 1.8-7 nmol 및 Stdml 0.5-2 nmol, 그리고 20-24시간 동안 동결 건조(lyophilized) 하였다. 재수화(rehydration)는 45°C 보다 낮은 온도에서 30분 동안 탈 이온수(deionized water)와 교반하여(stirring) 수행하였다. 리포솜에서 캡슐화되지 않은 물질(material)은 15분 동안 10000g 에서 원심분리법에 따라 인산완충액(燐酸緩衝液, phosphate buffered saline, PBS) pH 7.4 (NaCl 136 mmol/L, KH₂PO₄ 1.47 mmol/L, Na2HPO4 9.55 mmol/L, KCl 2.68 mmol/L)와 함께 세정하여 제거하였다. 이러한 표본(preparations)은 PBS에 현탁되어 4°C 에서 한 달 동안 저장한 후에 70%의 잔류(retention)로 50% 정도에 이르는 Sts의 서로 다른 변이체(variants)에 대해 효율적인 캡슐화에 도달하였다.

StI 및 StII 독소(toxins)는 2011년, 톡시콘(Toxicon)에서 라니오(Lanio) 외 발명자에 의해(by Lanio et al . in Toxicon. 2001, 39, 187-9) 설명된 처리과정을 이용하여 말미잘(caribbean sea anemone) 스틱코닥틸라 헬리안투스(Stichodactyla helianthus)에서 정제(purified)하고 분리(isolated)하였다. 재조합체 스티코리신(recombinant Sticholysin) I(rStI)와 rStI 돌연변이체(mutant), StI W111C는 각각 2006년도 톡시콘에서 파조스(Pazos 외. in Toxicon, 2006, 48, 1083-1094) 및 2011년도 펜톤(Penton 외. in Protein Eng Des Sel. 2011, 24, 485-493)에 의한 처리과정에 따라 수득하였다.

본 발명의 백신 전파체(vaccine vehicle)에 사용되는 Sts의 농도는 16에서 64 nM의 총 지질 농도(total lipid concentration)의 범위를 갖는 리포솜의 현탁액(suspension)에서 1 내지 3.5mM 농도 범위에서 항원(antigen)을 갖는 공동 캡슐화된 0.25 내지 1mM 범위 이내이다.

바람직하게는, 본 발명의 백신 전파체(vaccine vehicle)는 200mL부피에서 총 지질(total lipids) 20mmol의 리포솜 현탁액에 항원의 1 내지 2 mol을 갖는 공동 캡슐화된 0.3 내지 0.4 nmol의 Sts의 양을 포함한다.

본 발명에 언급된 백신에 사용되는 피하(sc) 또는 근육내(im)로 투여되는 선량 범위(dose range)는 항원의 1 내지 2 nmol (50 내지 100 MG)이다.

본 발명의 백신 조성물(vaccine compositions)의 주요한 특징은 여기서 설명하는 것 이외의 면역학적 보조제(immunological adjuvants)의 결핍이다.

이미 위에서 설명한 바와 같이, 리포솜 소포(liposomal vesicles)로 캡슐화된 세균 포어-포밍 독소(bacterial pore-forming toxins)가 CTL 반응을 향상시킬 수 있다는 것이 종래에 알려져 있지만, 세균 독소에 따라 백신 조성물의 용도가 인간에게 역효과(adverse effects)을 미칠 것으로 알려져 있다. 그러나, 본 발명의 저자는 비 세균 독소가 동일한 면역조절 효과(immunostimulator effect)를 가질 수 있다는 것을 예기치 않게 발견하였다. 또한, 본 발명의 저자는 이러한 백신 전파체(vaccine vehicle)에 인간에게 진단용(for clinical use)으로 큰 이점을 제공하는 CTL 반응의 자극 효과(stimulator effects)에서 독소의 포어 포밍 활성을 분리시켜(decouple) 관리하였다. 본 발명의 백신 전파체(vaccine vehicle)에서 사용하여 얻어진 결과, 리포솜(liposomes)으로 항원과 함께 공동 캡슐화되는 분자 입자(molecular entities) StIW111C_irrev 또는 열-비활성(heat-inactivated) StII는 리포솜 제제에 의한 특정 항원 CTL 면역 반응의 향상 및 막(membranes)에서 포어(pores)를 형성하도록 그들의 단백질 기능 사이에서 절대적인 상관성이 없음을 입증하였다. C57BL/6 쥐(mice)의 골수(bone marrow)에서 분리하고 생체외(in vitro)에서 StII에 노출된 수지상 세포(dendritic cells, DCs)의 성숙 테스트는 활성 변형에서뿐만 아니라 열 비활성(heat-inactivated)에서도 유사한 조건 하에서 지질다당체(lipopolysaccharide, LPS) (양성 조절, positive control)으로 본 것과 유사한 CDs의 활성화를 유도하는 단백질의 기능(ability)을 보여주었다.

막(membranes)에 포어(pores)를 형성하는 Sts의 기능(ability)은 2001년 마르티네즈 외 발명자에 의해 톡시콘(Martinez 외. in Toxicon, 2001, 39,1547-1560) 잡지에서 설명된 바와 같이 카르복시플루오레신(carboxyfluorescein, CF)와 로드된(loaded) LUVs의 투과성(permeability) 및 용혈성 활성도(hemolytic activity) 를 테스트하여 평가하였다. Sts는 계란 노른자의 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine)과 SM (1:1) (양성 조절)로 구성된 소포(vesicles)에서 관찰된 것에 비해, CF를 캡슐화하는 것은 DPPC:Cho (1:1)의 리포솜 소포(liposomal vesicles)의 투과성(permeability)을 분석하여 투과하는 활성도(permeabilizing activity)을 표출하지 않는 것을 보여주었다 .

이것은 2011년도 단백질 공학지에서 펜톤에 의해 (by Penton et al . in Protein Eng Des Sel. 2011, 24, 485-493) 설명된 바와 같이 돌연변이 StIW111C이 물질(agent)를 감소시킴으로서 2-메르캅토에탄올 (2-mercaptoethanol)의 존재여부(in the presence and absence)와 용혈성 활성 분석(hemolytic activity assay) 및 에스디에스 페이지(SDS-PAGE)에 의해 이황화 결합에 의해 안정화된 비활성 이량체를 형성한다는 사실이 확인되었다. 적혈구(erythrocytes)에 포어(pores)를 형성하도록 2합체 구조(dimeric structure)의 무기능(inability)은 모델 세포로서 막(membrane)과 관련성이 없다는 결과이다.

주상부(column) PD-10에서 여과(filtration)하여 물질(agent)를 감소시키는 것을 제거(elimination)하고 2-ME (0.1 mol/L)과 배양하여 StIW111C의 감소시키고, 4°C에서 2시간 동안 StIW111C_monomer:BMH에 대해 1:1 또는 2:1 몰비에서 호모이작용기시약 비스(homobifunctional reagent bis)(maleimide) 헥산 (BMH)과 StIW111C_monomer의 즉시형 배양에 따라 StIW111C (StIW111C_irrev)의 가역할 수 없는 이합종(irreversible dimeric specie)를 얻기 위한 처리과정이 수립되었다. StIW111C_irrev은 환원제(reducing agent)가 있는데서 주상부 슈퍼덱스(column Superdex) 75 HR 10/300에 겔 여과 크로마토그래피(gel filtration chromatography)에 의해 정제하였다. 가역할 수 없는 2합체(irreversible dimeric)와 순도(purity degree)를 얻는다는 것이 감소하는 조건 하에 에스디에스 페이지(SDS-PAGE)에 의해 입증되었다. 가역할 수 없는 이량체는 순도 94%와 가역할 수 없는 이량체의 오염물질 6%만을 수득하였다. 기능성 활동(functional activity)의 결핍(absence)은 용혈성 활동 분석(hemolytic activity assay)에 의해 확인되었다.

열처리(heat treatment)에 의한 StII의 가역할 수 없는 비활성화(StII irreversible inactivation)는 2001년 톡시콘에서 마르티네즈 외 발명자에 의해(by Martinez et al . in Toxicon, 2001, 39,1547-1560) 기술된 절차에 따라 수행되었고 막에 포어(pores)를 형성할 수 있는 기능(ability)의 총 손실은 용혈성 활동 분석(hemolytic activity assay)에 의해 확인되었다.

생체내 특정 항원 세포독성 면역 반응(antigen-specific cytotoxic immune response in vivo) 및 예방 시나리(preventive scenary)에 항종양 면역(antitumor immunity)을 향상시키는 기능에 관련한 리포솜(liposome)-St 시스템에서 서로 다른 분자종(molecular species) Sts를 면역조절하는 속성은 항원 OVA 및 종양 세포주 E.G7을 사용하는 쥐 균주C57BL/6, 발진 EL-4 티푸스(murine EL-4 thymoma)의 서브클론(subclone)의 쥐 실험 모델에서 측정 할 수 있고(Kusmartsev y Gabrilovich, in J Leukoc Biol., 2003, 74: 186-96), OVA pAc-네오(neo)-OVA의 상보적(complementary) DNA와 형질주입되며(Moore, et al . in Cell, 1988, 54: 777-85), ´미국 형 문화 콜렉션´(ATCC, VA)에서 수득하였다.

본 발명의 저자는 또한 항원을 함유하는 백신 전파체 리포솜-St과 함께 예방 접종(preventive inoculation)이 StII를 함유하지 않는 리포솜에 의해 생성되는 것보다 더 항종양 예방을 높다는 것으로 확인되었다.

이러한 결과는 시스템 리포좀-St가 다른 보조제(adjuvants) 필요없이, 단백질 항원을 사용할 때, 기능적으로 보호하고 강력한 항종양 반응(antitumor response)을 유도하는 것에 효과적인 것을 입증하였다. 결국, 통합 치료에 있어서 이러한 표본(preparation )의 사용은 항종양 효과를 더욱 향상시킬 수 있다.

다음 실시 예에서는 비-리포솜 제제(non-liposomal formulations)에 관해서는 본 발명의 목적인 백신 조성물의 예방 시나리(preventive scenary)에 생체내 특정 항원 세포독성 면역 반응(antigen-specific cytotoxic immune response in vivo) 및 예방 시나리(preventive scenary)에 항종양 면역(antitumor immunity)을 유도하는 것의 면역학적 효험(immunological efficacy)을 입증하도록 구체적인 비교 예를 포함한다.

실시 예

실시 예1. 단백질 항원으로 OVA 및 천연 STI 또는 StII 를 사용하여 백신 전파체( vaccine vehicle )의 CTL 반응 및 세포 독성 평가

리포솜을 기반으로한 백신 전파체는 이전에 설명된 바대로 준비되었다.

DPPC와 Cho (몰비 1:1), 모델 항원으로 OVA 및 Sts (StI 또는 StII)로 구성된 DRVs에서 총 지질의 10㎛ol: 인산완충액(燐酸緩衝液, phosphate buffered saline, PBS) pH 7.4에서 St 분자비(molar ratio)의 0.3nm 및 1.1 nmol OVA에 공동 캡슐화하였다. 다음과 같은 절차를 따라 두 가지 백신 조성물이 수득하였다:

백신 조성물A: OVA의 6.6 nmol (50 ㎍)를 캡슐화한 DPPC:Cho의 DRVs 리포솜 (총 지질의 60 ㎛ol)

백신 조성물B: StI 또는 StIIdml 1.88 nmol 및 OVA의 6.6 nmol (50 ㎍)를 공동 캡슐화한 DPPC:Cho의 DRVs 리포솜 (총 지질의 60 ㎛ol)

몸무게의 범위가 18-20인 열 다섯마리의 C57BL/6 암컷 쥐가 각각 세 마리씩 5 실험그룹으로 선택하여 분리되었다.

그룹 1 (음성 조절)은 0, 12, 13및 14일 째에 0.2 mL 인산완충액(phosphate buffered saline, PBS)를 피하경로(subcutaneous(sc) route)로 접종(inoculate)하였다.

그룹 2 (양성 조절)은 12일째에 폴리이노신산-폴리시티딜산(polyinosinoic-polycitidilic acid, PIC), TLR3 합성 리간드(TLR3 synthetic ligand) 및 CTL 반응의 고전 인덕터(classical inductor) 의 100 ㎍과 혼합하고 OVA의 22.2 nmol (1 mg) 을 피하경로(subcutaneous(sc) route)로 접종(inoculate)하였고(Hamilton-Williams 외. in J. Immunol., 2005, 174: 1159-63), 13일, 14일째에 폴리이노신산-폴리시티딜산(PIC)를 동물에게 추가 접종하였다.

그룹 3은 백신 조성물 A (1.1 nmol 또는 OVA의 50 ㎍와 동일)의 0.2 mL를 0일 및 12일째에 피하경로(subcutaneous(sc) route)로 접종(inoculate)하였다.

그룹 4는 백신 조성물 B (1.1 nmol 또는 OVA의 50 ㎍ 및 StI의 0.3 nmol 또는 6.25 ㎍와 동일)의 0.2 mL를 0일 및 12일째에 피하경로(subcutaneous(sc) route)로 접종(inoculate)하였다.

그룹 5는 백신 조성물 B (1.1 nmol 또는 OVA의 50 ㎍ 및 StII의 0.3 nmol 또는 6.25 ㎍와 동일)의 0.2 mL를 0일 및 12일째에 피하경로(subcutaneous(sc) route)로 접종(inoculate)하였다.

실험 20일째에, C57BL/6 면역되지 않은 쥐로부터의 지라 세포(spleen cells)는 카르복시- 플루오레세인 이초산염 석신미딜 에스테르 (carboxy-fluorescein diacetate succinimidyl ester, CFSE)(각각 0.33 y 5 ㎛ol/L)의 두 농도로 배양하였고; 가장 높은 형광강도(highest fluorescence intensity)를 갖는 표지세포(labeled cell)는 또한 C57BL/6 쥐 균주(mice strain)에 대한 MHC I 단산형(haplotype)의 육질(context)에 면역이 우세한 펩티드(immunodominant peptide) OVA의 1 ㎛ol/L (257-SIINFEKL-264)과 함께 배양하였다. 그 후, 표지세포(labeled cells)의 두 개체수는 1:1 비율로 혼합되었으며, 실험 그룹은 1-5는 0.2 mL 총 볼륨(volume)의 혼합물을 30 x10⁶ 세포와 꼬리 정맥(tail vein )에 접종하였다. 쥐들은 16 시간 후 희생되었고, 대상 세포의 용해율은 유동 세포 계수법 (flow cytometry, FACS)으로 면역 사이트(immunization site)에 가까이 세혜부 림프절(inguinal lymph node)로 결정하였다.

도 1은 OVA와 Sts공동 캡슐화 리포솜(liposomes)을 갖는 쥐의 예방 접종(immunization)에 의해 생체내에서 생산된 세포 독성을 나타낸 것이다. Sts(StI 또는 StII) 공동 캡슐화 리포솜을 갖는 면역된 동물은 양성 조절 그룹보다 통계적으로 더 높게 OVA에 특정한 CD8 + T 세포독성 림프구 반응(CTL)을 보였다.

실시 예2. OVA 단백질 모델에 있어서 백신 전파체(vaccinal vehicle)의 항종양 보호의 유도

항종양 보호를 유도하는 리포솜을 기반으로한 백신 기능(ability)이 연구가 이루어졌다. 이를 위해 18-20g 사이 범위의 체중을 갖는 육십 마리의 C57BL/6 쥐 암컷이 각각 20 마리씩 3가지 측정 그룹으로 선택하여 구분하였다.

그룹 1 (음성 조절)은 0일 및 12일 째에 인산완충액(phosphate buffered saline, PBS) 0.2 mL를 근육내(im - intramuscularly)에 접종(inoculate)하였다.

그룹 2는 실시 예 1에서 설명한 백신 조성물 A (1.1 nmol 또는 OVA의 50 ㎍와 동일)의 0.2 mL를 0일 및 12일째에 근육내(im - intramuscularly)에 접종(inoculate)하였다.

그룹 3는 백신 조성물 B (1.1 nmol 또는 OVA의 50 ㎍ 및 StI의 0.3 nmol 또는 6.25 ㎍와 동일)의 0.2 mL를 0일 및 12일째에 근육내(im - intramuscularly)에 접종(inoculate)하였다.

모든 그룹 1-3는 피하경로 (0.2 mL)에 의한 종양주(tumor line) E.G7에서 3x10⁵ 세포와 19일째에 도전하였다.

동물들은 0일에서 독립화 되었고 다음과 같은 매개 변수(parameters)는 주당 3회 결정되었고: 종양 볼륨, 진행과 생존 시간.

수득 된 결과는 이하와 같다:

진행 시간(Time to progression):

진행 시간은 종양이 그 출현까지 접종되는 순간부터 각 동물에 대한 경과 시간을 특징으로 하는 매개 변수(parameters)이다. 실험의 끝에서 종양을 커지지 않은 쥐에 대해서 말하자면, 진행에 시간이 60일로 간주하였다. 진행 시간의 연장에 미치는 영향은 암에 대한 백신에 대해 매우 바람직한 매개 변수이다. 도 2a에서 관찰될 수 있는 바와 같이, 그룹 3에서의 동물들은 본 발명의 목적과 실시 예 1에서 설명된 본 발명의 개체에 설명된 백신 조성물 B제제와 함께 예방 접종하였고 가장 뛰어난 결과를 보여 주었다.

생존율(Survival)

이러한 매개 변수(parameter)는 면역된 동물이 OVA-발현 종양 세포(E.G7)과 함께 시험하는 예방 접종하여 생존하는 시간이 증가하도록 예방접종 능력을 평가한다. 이러한 매개 변수(parameter)는 치료되지 않은 동물의 생존율과 비교되기 때문에 몇 일에 걸쳐 측정하였고 치료되지 않은 형질(character)을 가진다. 통계적 중요한 차이(differences)를 증명하기 위해서 로그 순위 테스트(Log-Rank test) 그룹 중 생존 결과에 따른다는 것을 찾나 냈다.

생존율 결과에서 따라 순위 시험이 사용된 그룹 간의 생존 결과에 있는 차이의 통계적 중요성을 증명하기 위해 사용되었다.

도 2b는 그룹 3으로부터의 동물, 그리고 실시 예 1에서 설명된 바와 같이 백신 조성물 B와 함께 예방접종하였고, 본 발명의 목적은 종양 주입(tumor inoculation) 후에 더 길게 종양 생존하였다.

실시 예 3. Sts 돌연변이의 용혈성 활동 ( Hemolytic Activity of Sts mutants ).

적혈구 막(erythrocyte membrane)에 포어 포밍(pore-formation)은 세포 용해(cell lysis)를 유발하는 콜로이드 삼투 충격(colloid osmotic shock)을 생산한다. 이른바 포린(porins)의 포어 포밍 능력은 실험적으로 세포 용해에 의해 적혈구 현탁액(erythrocyte suspension)의 명백한 흡광도 손실(λ= 600 nm)의 측정에 의해 결정될 수 있는 용혈성 활동 (Hemolytic Activity, HA)이 따를 수 있다.

측정법(assay)에 있어서, 알바레즈 외 발명자에 의해 보고된 StI/StII의 용혈성 활동(HA)과 비교하면(by Alvarez et al. in Toxicon, 2009, 54(8): 1135-47), StIW111C 가역할 수 없는 비활성 2합체(STI W111Cirrev)의 용혈성 활동(HA)은 측정(0.15 ㎛ol/l)에서 2009년 톡시칸(Toxicon)에서 상대적으로 높은 단백질 농도에서 감소 (2-ME 0.1 mol/L) 및 비-감소(non-reducing) 조건으로 가역 2합체(reversible dimer) StIW111C의 용혈성 활동과 비교되었다. 도 3에 표시된 용혈성의 시간 코스는 StIW111C_irrev가 비감소 조건(non-reducing conditions) 하에서 비활성(inactive)되는 것으로 나타났다. 감소조건 하에서는, StIW111C_irrev는 완전히 감소(reduced) 또는 비감소(non-reduced) 모두 StIW111C보다 활동성이 적은 것을 보여 주었다.

실시 예 4. 비활동성의 StII 의 포어 포밍 능력 평가 ( Assessment of the pore -forming ability of inactivated StII ).

두 시간 동안 80℃에서 가열에 의해 가역적으로 비활성화된 StII로 인해 막(membranes)에 포어(poers)를 형성할 수 있는 능력(ability)의 손실은 용혈성 활동 테스트를 사용하여 등록하였다. 도 4는 활성 단백질(active protein)에 비교할 때 열 비활성된(thermal-inactivated) StII에 대한 용혈성 활동(hemolytic activity)의 부족을 나타낸 것이다.

실시 예 5. 수지상 세포 성숙에서 백신 전파체의 효과( Effect of the vaccinal vehicle on DCs maturation ).

StII에 의해 유도된 수지상 세포(DCs)의 성숙(maturation)은 5% CO₂ 챔버(chamber)에서 37℃에서 24 시간 동안 폴리믹신(polymyxin) B (pmxB, 지질다당체(lipopolysaccharide, LPS)의 지질 A분획(fraction)에 결합(binding)하여 내독소의 생물학적 활동(endotoxin's biological activity)의 중화 제)의 20 ㎍의 존재 여부에 따라 열 치료(thermal treatment)(4 ㎍)에 의해 활성화 StII (0.1 nmol 또는 2 ㎍) 또는 비활성화에 노출된 C57BL/6 쥐의 골수(bone marrow)로부터 얻은 세포로 평가하였다.

양성 조절(positive control)는 지질다당체(LPS)(2 ㎍)를 사용하였고, 음성 조절(negative control)은 RPMI(Roswell Park Memorial Institute) 배지 플러스(plus) 30 pmxB를 사용하였다. 쥐 골수에서 추출한 세포가 6 웰즈 플레이트(wells plates)를 사용하여 웰(well)당 RPMI에 600000개의 DCs 전구체(precursors) 를 배양하였다. GMCSF 및 RPMI의 400μL, 10%에서 소태아 혈청(bovine fetal serum, BFS)이 웰(well) 당 3mL를 완료하도록 추가되었다.

도 5는 활동성(active) 및 열-비활동성 St II 변이체(variants) 모두에 생체외(in vitro)에 이들 세포의 엑스포지션(exposition)의 결과로서 DCs활성화를 나타내는 분자 표지(markers) (CD80, CD86 y CD40)에서 증가율(%)를 나타낸 것이며, 그것들에 맞먹는 결과로 양성 조절(positive control)과 함께 수득 된 것과 비교할 만한 결과를 보여준다.

실시 예 6. 항원 단백질과 같은, 스틱코리신 ( Sts ) 돌연변이와 OVA 를 사용하여 백신 전파체의 CTL 반응 및 세포 독성 평가( Assessment of cytotoxicity and CTL reponse of the vaccinal vehicle using St mutants and OVA , as antigen protein ).

가역적(StIW111C) 또는 비가역적(StIW111C_irrev) 으로 낮은 포어 포밍 활성(pore-forming activity) 및 열 비활성된(thermal inactivated) StII 변이체의 StI 2합체 변이체(StI dimeric variants)는 DPPC:Cho (1:1)의 리포솜으로 OVA와 함께 공동 캡슐화되었고, 총 지질의 10 ㎛ol 비율로: 1:1 nmol OVA: StIW111C, StIW111Cirrev 또는 열 비활성화된(heat-inactivated) StII의 0.3 nmol, 생체내(in vivo)에 특정 OVA 세포독성 활성을 유도하는 백신 표본(vaccine preparations)의 능력 및 PBS pH 7.4에서 평가되었다.

이러한 측정법에 있어서, 본질적으로 동일한 백신 조성물은 실시 예 1에서 설명된 바와 같이 사용되었고, 조성물 B의 경우, St의 서로 다른 변이체(variants)가 채택되었다.

백신 조성물 A: OVA의 6.6 nmol을 캡슐화한 DPPC:Cho의 DRVs 리포솜(liposomes) (총 지질(lipids)의 60 ㎛ol).

백신 조성물 B: OVA의 6.6 nmol과 St의 1.875 nmol (StIW111C, StIW111C_irrev, 천연(native) StII 또는 열 비활성화된 StII)를 공동 캡슐화하는 DPPC:Cho의 DRVs 리포솜 (총 지질의 60 ㎛ol).

첫 번째 측정법으로, 열두마리의 암컷 쥐 C57BL/6가 18-20g 사이의 체중으로 선정하였고, 각각 3 마리씩 4개의 실험 그룹으로 구분하였다.

그룹 1(양성 조절)은 인산완충액(PBS)의 0.2 mL와 함께 0 일째와 12 일째에 피하 경로(subcutaneous route)로 접종하였다.

그룹 2(양성 조절)는 백신 조성물 B (1.1 nmol 또는 OVA의 50 ㎍ 및 천연(native) StII의 0.3 nmol 또는 6.25 ㎍와 동일)의 0.2 mL를 0일 및 12일째에 피하경로(subcutaneous(sc) route)로 접종(inoculated)하였다.

그룹 3은 백신 조성물 B (1.1 nmol 또는 OVA의 50 ㎍ 및 StIW111C 의 0.3 nmol 또는 6.25 ㎍와 동일)의 0.2 mL를 0일 및 12일째에 피하경로(subcutaneous route)로 접종(inoculate)하였다.

그룹 4는 백신 조성물 B (1.1 nmol 또는 OVA의 50 ㎍ 및 StIW111C_irrev 의 0.3 nmol 또는 6.25 ㎍와 동일)의 0.2 mL를 0일 및 12일째에 피하경로(subcutaneous route)로 접종(inoculate)하였다.

도 6A은 낮은 포어 포밍(pore-forming) 활동의 St 변이체 (LP/OVA+StIW111C 또는 LP/OVA+StIW111Cirrev)를 함유하는 리포솜(liposomes)과 함께 예방 접종된 동물들이 리포솜(LP/OVA+StII)로 공동으로 캡슐화 할 때 StII으로 얻어진 것과 통계학적으로 유사한 독소세포 반응을 나타낸 것이다.

다른 측정법으로, 아홉 마리의 암컷 쥐 C57BL/6가 18-20g 사이의 체중으로 선정하였고, 각각 3 마리씩 3개의 실험 그룹으로 구분하였다.

그룹 1(음성 조절)은 인산완충액(PBS)의 0.2 mL와 함께 0 일째와 12 일째에 피하 경로(subcutaneous route )로 접종하였다.

그룹 2는 백신 조성물 A (1.1 nmol 또는 OVA의 50 ㎍과 동일)의 0.2 mL를 0일 및 12일째에 피하경로(subcutaneous(sc) route)로 접종(inoculated)하였다.

그룹 3은 백신 조성물 B (1.1 nmol 또는 OVA의 50 ㎍ 및 천연(native) StII 의 0.3 nmol 또는 6.25 ㎍와 동일)의 0.2 mL를 0일 및 12일째에 피하경로(subcutaneous route)로 접종(inoculate)하였다.

도 6B는 리포솜 공동 캡슐화 OVA 및 열처리에 의해 비활성화된 StII를 갖는 면역(immunization)이 항원 및 천연(native) StI/StII를 함유하는 리포솜 제제(liposomal formulation)와 함께 관찰된 것과 유사한 항원만을 함유하는 리포솜으로 인해 유도되는 것보다 중요하게 더 높은 특정 OVA 세포독성 활성을 유도하였다는 것이 입증되었음을 보여준다.

실험 결과는 포어 포밍 활성(pore-forming activity)을 디스플레이 하지 않고, 심지어 생체내(in vivo) CTL 분석에서 사용된 클래식 양성 조절(classical positive control, PIC)에 의해 유도되는 것보다 더 강력하고(potent), 왕성하고(robust), 특정 CTL 반응의 기능성 항원을 유도하는 어떤 스티코리신 변이체(sticholysin variant)를 갖는 항원을 공동 캡슐화하는 본 발명의 리포솜(liposomal) 백신 개체를 입증하였다. 예방 시나리오의 St 리포솜 제제(formulation liposome-St)는 종양 착상(tumor implantation )의 시간 코스(time-course)를 크게 시켰고, PBS만을 받는 것에 관하여 평가된 그룹의 생존을 크게 향상시킬 수 있다. 요약하면, 리포솜 St(liposomes-St)를 갖는 백신은 항원을 함유하는 리포솜 전파체(liposomal vesicles)만을 갖는 것과 관찰된 것보다 더 나은 결과를 보였다.

Claims

말미잘 스틱코닥틸라 헬리안투스(sea anemone Stichodactyla helianthus) 및 항원(antigen)으로부터 수득되는 단백질의 리포솜 전파체(liposomal vesicles)로 공동 캡슐화를 포함하는 세포 면역 반응을 유도하는 것을 특징으로 하는 백신 전파체(vaccinal vehicle).
제 1항에 있어서, 상기 리포솜 전파체는 몰비(equimolar ratio)로 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC) 및 콜레스테롤(Cho)를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 전파체(vaccinal vehicle).
제 1항에 있어서, 상기 말미잘 스틱코닥틸라 헬리안투스(Stichodactyla helianthus)로부터의 상기 단백질은 StI, StII 및 그들의 변이체(variants)를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 백신 전파체(vaccinal vehicle).
제 3항에 있어서, St 독소(toxins)의 상기 변이체(variants)는 StIW111C, StIW111Cirrev 또는 열-불활성(heat- inactivated) StII를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 백신 전파체(vaccinal vehicle).
제 1항에 있어서, 상기 항원(antigen)은 세포내 병원체(intracellular pathogens)로 인한 감염증(infectious disease) 및 암(cancer)을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 병리학(pathology)과 관련된 폴리펩티드 또는 단백질인 것을 특징으로 하는 백신 전파체(vaccinal vehicle).
제 5항에 있어서, 상기 항원(antigen)은 암과 관련된 폴리펩티드(polypeptide) 또는 단백질(protein)인 것을 특징으로 하는 백신 전파체(vaccinal vehicle).
제 5항에 있어서, 상기 항원(antigen)은 후천성면역결핍증(AIDS) 과 관련된 폴리펩티드(polypeptide) 또는 단백질(protein)인 것을 특징으로 하는 백신 전파체(vaccinal vehicle).
제 5항에 있어서, 상기 항원(antigen)은 결핵(tuberculosis) 과 관련된 폴리펩티드(polypeptide) 또는 단백질(protein)인 것을 특징으로 하는 백신 전파체(vaccinal vehicle).
제 1항 내지 제 9항 및 에 따른 백신 전파체 중 어느 한 한항 및 결핍된 면역학적 보조제(lacking immunological adjuvants)를 포함하는 백신 조성물(vaccinal composition).
세포내(intracellular)로 인한 감염증(infectious diseases) 및 암(cancer)을 포함하는 그룹으로부터 선택된 질병(desease)로부터 고통 받는 환자의 면역반응(immune response)을 강화하기 위해 유용한 제 9항에 따른 백신 조성물 (vaccinal composition)의 용도.