CN113041346A - 一种细菌毒素疫苗及其在预防细菌感染中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属生物技术领域，涉及细菌毒素疫苗，具体涉及一种高负载细菌成孔毒素的脂质体疫苗及其用途，该纳米疫苗通过将细菌成孔毒素嵌入脂质体表面完成毒素的高效负载，不仅消除毒素的毒性作用，同时完整保留抗原蛋白结构，而且接种后可引起免疫细胞对成孔毒素的高效提呈并产生高滴度的特异性抗体，有效预防细菌感染尤其耐药细菌感染。

Description

一种细菌毒素疫苗及其在预防细菌感染中的用途
技术领域
本发明属生物技术领域，涉及细菌毒素疫苗，具体涉及一种负载细菌成孔毒素的脂质体疫苗及其用途，该脂质体疫苗通过将细菌成孔毒素嵌入人工脂质体双层膜上完成毒素的负载，不仅消除毒素的毒性作用，具有很高的安全性，而且接种后产生高效免疫反应，有效预防细菌感染尤其是耐药细菌感染。
背景技术
据报道，细菌感染仍然是世界范围内的一类高发病率和高致死率的疾病，而耐药细菌尤其“超级细菌”的出现给抗细菌感染治疗带来了更大的挑战，严重威胁着人类的健康。目前全球新型抗生素研发匮乏，也缺乏针对“超级细菌”的疫苗上市，因此，亟需设计和开发新型药物改善耐药细菌感染的预防和治疗效果。
研究显示，细菌感染过程中，其释放的毒力因子(如外毒素、内毒素)能协助细菌的定殖、生长和传播，并且对宿主机体有较大的毒性作用，严重情况下可造成器官衰竭和死亡，因此，中和细菌毒素能够抑制细菌的存活与繁殖，同时避免其对宿主组织的直接破坏，而且不易产生耐药现象。近年来，抗细菌毒素策略逐渐成为耐药细菌感染治疗的研究热点之一。
抗毒素疫苗将抗毒素策略与疫苗治疗进行结合，能有效抵抗细菌感染，尽可能地减少细菌耐药现象的产生，如临床常采用的破伤风和白喉疫苗是抗毒素疫苗的典型成功案例。
传统的抗毒素疫苗(类毒素疫苗)的制备方法包括化学灭活和热灭活毒素，通过变性蛋白的方法来减少毒素抗原的毒性，其存在的主要问题是难以同时保证灭活毒素的安全性和免疫原性。实践显示，灭活毒素的安全性提高的同时往往导致免疫原性大幅度下降，免疫效果较差。成孔毒素(或称成孔蛋白)是细菌产生的最主要的毒力因子，具有很强的毒性，采用传统的制备方法虽然能降低其毒性，但其免疫原性和免疫效果很差，不具有抗毒素疫苗的价值。
近年来，随着成孔毒素结构和穿孔机制的研究，其与细胞膜的相互作用机制逐步得到阐明，研究表明，细胞的脂质膜结构是成孔毒素形成孔道的物质基础。受此启发，加州大学张良方课题组制备了红细胞膜包被聚合物纳米粒(也称为纳米海绵)用于成孔毒素的高亲和性吸附，并且将吸附了毒素的纳米海绵进一步开发为纳米类毒素疫苗。这种新型纳米类毒素疫苗不仅消除了毒素毒性，而且完整保留了毒素的蛋白质结构，实验结果显示，与传统热灭活疫苗比较，该纳米类毒素疫苗更安全，免疫激活能力更强。但该纳米类毒素疫苗仍存在一些明显不足，如对毒素负载量较低(以α溶血素为例，仅为22μg/mg)，抗原提呈效果较弱，免疫激活能力尚有待提高，而且细胞膜包被纳米粒的过程较为复杂，红细胞膜的活性难以保持，红细胞的资源有限，规模化生产困难，临床转化受到很大的限制。
基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种新型的高负载成孔毒素的纳米类毒素疫苗—脂质体类毒素疫苗。该纳米疫苗采用高胆固醇脂质体吸附细菌成孔毒素完成毒素的高效负载，不仅消除毒素的毒性作用，同时完整保留抗原蛋白结构，接种后能促进免疫细胞对成孔毒素的高效提呈并产生高滴度的特异性抗体，实现有效预防细菌感染尤其是耐药细菌感染的目的。
发明内容
本发明目的在于基于现有技术的现状，提供一种新型高效的脂质体类毒素疫苗，尤其涉及脂质材料和成孔毒素组合物及其用途。该脂质体疫苗能避免传统灭活方法对毒素结构可能造成的破坏，且具有高的抗原载量；皮下免疫接种后，可促进免疫细胞对成孔毒素的高效提呈并产生高滴度的特异性抗体，中和毒素，预防细菌感染。
本发明中，首先制备高胆固醇脂质体，再与成孔毒素孵育，通过脂质体上脂阀与成孔毒素的相互作用高效吸附成孔毒素，制备成高负载成孔毒素的脂质体疫苗。通过体内外实验分析其安全性，考察其抗原提呈效果及免疫激活能力，最后对其预防毒素侵害和耐药细菌感染的效果进行评价，结果显示，由于该纳米疫苗主要由人工脂质体和毒素构成，不涉及生物膜资源的使用，该纳米疫苗采用高胆固醇脂质体吸附细菌成孔毒素完成毒素的高效负载，不仅消除毒素的毒性作用，同时完整保留抗原蛋白结构，接种后能促进免疫细胞对成孔毒素的高效提呈并产生高滴度的特异性抗体，实现有效预防细菌感染尤其是耐药细菌感染的目的，且制备生产方法简单易行，具有临床转化前景。
本发明进一步提供了一种使用脂质体疫苗引发受试者对插入脂质体膜的毒素的免疫应答的方法，和使用脂质体疫苗用于保护受试者不受成孔毒素影响的方法。在本发明的实施例中，免疫应答是B细胞介导的免疫应答。
本发明还提供了有效量的脂质体用于制造脂质体疫苗的用途，和有效量的载毒素脂质体用于制造保护受试者不受成孔毒素影响的疫苗的用途。
本发明能治疗、预防与成孔毒素相关的疾病或病症，包括但不限于：细菌感染，传染病，寄生虫病，中毒，肿瘤。
本发明进一步提供了一种包含本发明的脂质体疫苗的药物组合物。在本发明的实施例中，所述的药物组合物进一步包含一种或多种免疫佐剂或免疫增强剂和/或药学上可接受的载体或赋形剂，其可以与本发明的脂质体疫苗一起或组合施用。
本发明进一步提供了一种用于使用本发明的脂质体疫苗在有需要的受试者中治疗和/或预防疾病或病状的方法。在某些实施例中，经由任何适合的施用途径施用脂质体疫苗或其药物组合物。例如，可以经由经鼻腔、口腔黏膜、口服、肺吸入、静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、或皮内途径施用脂质体疫苗或其药物组合物。
本发明中，脂质体疫苗包括人工脂质体和细菌成孔毒素，其中，脂质体由胆固醇、磷脂酰脂碱(简称磷脂)、聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG)和/或鞘磷脂构成。胆固醇是脂质膜脂阀的重要组成部分，对脂质体吸附毒素的效果影响较大。因此，胆固醇是脂质体的重要组成部分，占总脂质的质量比为20％～50％，优选40％～50％。DSPE-PEG对脂质体疫苗的稳定性有很重要的影响，其占总脂质的质量比为5％～15％，优选10％。DSPE-PEG中聚乙二醇分子量为1000～3000道尔顿，优选2000道尔顿。为了增强脂质体对毒素的吸附作用，脂质体可加入适量鞘磷脂，鞘磷脂和磷脂的质量和占总脂质质量比为35～75％。脂质体的粒径对毒素的吸附效果有一定的影响，其尺寸在80～1000nm，优选100～200nm。成孔毒素可以是细菌(例如，金黄色葡萄球菌(S.aureus))、植物、真菌或动物毒素。在本发明中，脂质体和成孔毒素的质量比为100:3～100:15，优选100:10～100:15。
进一步，本发明通过以下技术方案实现脂质体疫苗研究：
(1)薄膜分散法制备高胆固醇脂质体。再将细菌成孔毒素与脂质体孵育，制备脂质体疫苗。
(2)对脂质体疫苗的理化性质进行表征。采用动态光散射法测定其粒径，电位，多分散系数。采用透射电镜观察其形态和大小。
(3)对脂质体疫苗的安全性进行表征。采用溶血实验，体外细胞毒性实验考察其体外安全性。通过小鼠皮下注射脂质体疫苗，观察小鼠皮肤损害情况，考察其体内安全性。
(4)通过体外细胞实验，考察脂质体疫苗的抗原摄取及提呈效果。
(5)通过皮下注射脂质体疫苗免疫小鼠，测定其淋巴结中生发中心成熟B淋巴细胞比例，测定其血清抗体滴度及抗体中和毒素的效果，考察脂质体疫苗的免疫激活情况。
(6)通过皮下注射脂质体疫苗免疫小鼠，分别通过皮下注射毒素或静脉注射毒素试验，考察疫苗接种预防毒素侵害的效果。
(7)通过皮下注射脂质体疫苗免疫小鼠，皮下注射耐药细菌，考察疫苗接种预防耐药细菌感染的效果。
本发明提供了一种高负载成孔毒素的脂质体疫苗及其在预防细菌感染中的用途，该脂质体疫苗不仅具有较好的安全性，而且具有很高的抗原载量，可高效诱导产生免疫反应，可有效预防毒素侵害、细菌感染尤其耐药细菌感染。
表1是各种处方下脂质体疫苗粒径和电位(n＝3)。
表1
Figure BDA0002835132110000041
为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。
附图说明
图1，载成孔毒素脂质体(PLs(Hlα))的理化性质表征，其中，PLs为高胆固醇脂质体，图A为溶血试验考察PLs吸附毒素能力，图B为PLs(Hlα)负染后的透射电镜结果，图C为PLs(Hlα)的平均粒径，图D为PLs(Hlα)的Zeta电位。
图2，PLs(Hlα)的体内外安全性评价，其中，图A为PLs(Hlα)的体外溶血结果，图B为PLs(Hlα)体外细胞毒性实验结果，**P<0.01，与Hlα或Heated Hlα(30min)比较，图C为皮下注射PLs(Hlα)后的皮肤损伤面积，**P<0.01，与Hlα或Heated Hlα(30min)比较。
图3，PLs(Hlα)的抗原摄取及提呈效果评价，其中，图A为PLs(Hlα)的细胞摄取结果，图B为PLs(Hlα)诱导树状突细胞(DC)成熟的效果，**P<0.01，与RBC-NP(Hlα)或HeatedHlα比较。
图4，PLs(Hlα)接种后体内免疫效应评价，其中，图A为淋巴结中生发中心成熟B淋巴细胞的比例，**P<0.01，与Heated Hlα比较，图B为血清抗体滴度测定结果，**P<0.01，与Heated Hlαprime比较，##P<0.01，与Heated Hlαprime+boost比较，图C为血清抗毒素效果，**P<0.01，与Blank serum比较，##P<0.01，与Heated Hlαprime+boost比较。
图5，PLs(Hlα)免疫接种后，小鼠抵抗毒素侵害效果评价，其中，图A为动物静脉注射毒素后的生存曲线，图B为皮下注射毒素后皮肤损伤面积随时间变化曲线。
图6，PLs(Hlα)疫苗预防耐药细菌感染效果评价，其中，PLs(Hlα)免疫接种小鼠后，皮下注射耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，测定皮肤损伤面积-时间曲线，**P<0.01，与Saline或PLs比较，##P<0.01，与Heated Hlαprime+boost比较。
具体实施方式
本实施例选择耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)分泌的主要成孔毒素α-溶血素(Hla)为成孔毒素代表，探讨高负载毒素的脂质体疫苗的安全性、免疫激活作用及预防毒素侵害和细菌感染的效果。以下实施例采用的实验数据统计方法：多组比较采用一步ANOVA法，两组比较采用双侧t检验法。
实施例1：脂质体疫苗的构建
本实施例中首先采用薄膜水化挤出法制备高胆固醇脂质体。具体操作：称取胆固醇、磷脂酰胆碱(PC)、DSPE-PEG2000和或鞘磷脂(如表1)用二氯甲烷溶解，室温下旋蒸成脂质膜。加入适量去离子水室温搅拌水化1h，100W超声，可得脂质体(PLs)悬液。通过体外溶血试验测定PLs对毒素的负载量。具体操作：将3μgHlα与不同量的PLs室温下30min，然后与适量2.5％RBC在37℃下振荡孵育3小时，2000g离心5min，测定上清在540nm的吸光度值并按下述公式计算溶血百分数。其中阴性对照为生理盐水，阳性对照为1％TritonX-100。根据溶血百分数为0时PLs的用量计算PLs对毒素的负载量。
Figure BDA0002835132110000061
如表1所示，不同处方PLs(Hlα)粒径在100～200nm之间，电位在-30～-40mV之间。PLs(Hlα)的毒素载量为30～150μg/mg脂质体(以脂质质量计)。图1A为表1中处方2脂质体的溶血试验测定结果。参考文献(Hu CM,Fang RH,Copp J,Luk BT,Zhang L.A biomimeticnanosponge that absorbs pore-forming toxins.Nat Nanotechnol.2013；8:336-40)制备红细胞膜包聚乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)纳米粒(RBC-NP)，溶血试验法测定其对Hlα毒素的负载量约为22μg/mg纳米粒(以PLGA质量计)。
将适量Hlα与PLs在室温下孵育30min，即可得到脂质体疫苗(PLs(Hlα))。为了便于下一步进行体外表征、体内免疫效果和药效学的实验，未特别指定的情况下，PLs采用处方2进行制备，即采用1.6mg磷脂，2mg胆固醇，0.4mgDSPE-PEG2000制备PLs(终体积为2mL)，然后将20μg PLs与2μg Hlα孵育得到脂质体疫苗(PLs(Hlα))。
实施例2：脂质体疫苗的理化性质表征
以未载毒素的高胆固醇脂质体(PLs)为对照。醋酸铀负染后采用透射电镜观察PLs(Hlα)的形态和大小，结果显示(图1B)，融合脂质体为规则球形，大小均一，与PLs类似。采用动态光散射法测定PLs(Hlα)的平均粒径、粒径分布和多分散系数，并测定其Zeta电位。结果表明，PLs(Hlα)平均粒径为125nm，且粒径分布较窄，电位-35mV，与PLs类似(图1C，D)。以上结果表明，处方量毒素负载对融合脂质体的理化性质无显著影响。
实施例3：脂质体类毒素疫苗的安全性评价
本实施例中首先通过溶血实验考察PLs(Hlα)的体外安全性，并与Hlα和热灭活Hlα进行比较。具体操作：将Hlα、热灭活Hlα(70℃30min或60min)、PLs、PLs(Hlα)分别与2.5％RBC在37℃下振荡孵育3小时，然后2000g离心5min，测定上清在540nm的吸光度值并按实施例1公式计算溶血百分数。结果表明(图2A)，Hlα70℃灭活30min仍有一定的溶血作用，70℃灭活60min才能完全消除Hlα的溶血作用，而PLs(Hlα)无溶血作用，显示出较好的安全性。
接着，对PLs(Hlα)的体外细胞毒性进行考察。具体操作：提取小鼠骨髓，培养得到原代树突细胞。将其接种至96孔板，并分别与生理盐水，热灭活Hlα、PLs或PLs(Hlα)(Hlα浓度为2μg/mL或4μg/mL)孵育48h。CCK8法测定各组细胞活力。结果表明，Hlα能显著降低树突细胞细胞活力，而70℃灭活60min(完全灭活)的Hlα与PLs(Hlα)没有显著改变树突细胞细胞活力(图2B)。上述结果提示PLs(Hlα)具有较好的体外安全性。
为考察PLs(Hlα)的体内安全性，将Hlα、热灭活Hlα(70℃30min或60min)、PLs(Hlα)(3μg Hlα)分别接种至ICR小鼠颈部皮下，每周一次共三次。最后一次接种48h后拍照记录小鼠皮肤损伤面积。结果表明(图2C)，Hlα组注射部位附近皮肤损伤面积较大。与Hlα组相比，未完全灭活Hlα组(Heated Hlα(30min))注射部位附近皮肤损伤面积显著下降，但皮肤仍有明显的损伤，而PLs(Hlα)组与完全灭活Hlα组(Heated Hlα(60min))注射部位附近皮肤没有明显损伤。每次接种后采血50μL，红细胞计数，结果显示PLs(Hlα)组与正常小鼠的红细胞计数无显著性差异。上述结果提示PLs(Hlα)疫苗具有较好的体内安全性。
实施例4脂质体疫苗的抗原摄取及提呈效果评价
将Hlα采用荧光素Cy5.5活性酯标记(Hlα-Cy5.5)。按实施例1制备载Hlα的RBC-NP(RBC-NP(Hlα))和PLs(Hlα)。按实施例3制备热灭活Hlα(70℃60min)。将原代树突细胞接种至12孔板，并分别与热灭活Hlα(Heated Hlα)、PLs(Hlα)或RBC-NP(Hlα)(Hlα浓度为1μg/mL)37℃孵育2h。然后将细胞胰酶消化，离心收集细胞，流式细胞仪检测细胞的荧光强度。实验结果显示(图3A)，树突细胞对PLs(Hlα)的摄取显著高于RBC-NP(Hlα)(1.8倍)和热灭活Hlα(6.1倍)，表明PLs(Hlα)有助于抗原的摄取。
按实施例1制备RBC-NP(Hlα))和PLs(Hlα)。按实施例3制备热灭活Hlα(70℃60min)。将原代树突细胞接种至12孔板，并分别与热灭活Hlα(Heated Hlα)、PLs(Hlα)或RBC-NP(Hlα)(Hlα浓度为1μg/mL)37℃孵育24h。采用含0.1％牛血清白蛋白的PBS洗三次，然后细胞采用CD40抗体(PE荧光标记)或CD80抗体(APC荧光标记)4度下孵育结合2小时，收集细胞，流式细胞仪检测细胞的荧光强度。实验结果显示(图3B)，PLs(Hlα)组树突细胞的CD40荧光强度和CD80荧光强度均显著高于RBC-NP(Hlα)组和热灭活Hlα组(P<0.01)，表明PLs(Hlα)有助于抗原抗呈细胞的成熟，显著提高了毒素的抗原提呈效果。
实施例5：脂质体疫苗的体内免疫激活作用评价
本实施例中，将生理盐水、Hlα、热灭活Hlα(70℃60min)、PLs(Hlα)(3μg Hlα)分别接种至ICR小鼠颈部皮下，每周一次共三次。第一次接种21天后，取小鼠血清，采用ELISA法测定体内Hlα抗体的水平。结果表明，3次免疫接种后，PLs(Hlα)组的Hlα抗体表达水平是热灭活Hlα组的23倍，而生理盐水，PLs组检测不到Hlα抗体表达(图4A)。取PLs(Hlα)组血清与Hlα孵育后进行红细胞溶血实验，发现3次免疫接种后，PLs(Hlα)组的血清可完全中和Hlα的溶血毒性，显著优于热灭活Hlα组(图4B)。上述结果表明，PLs(Hlα)能诱导机体产生较强的免疫反应。
实施例6：脂质体疫苗体内抗毒素侵害的免疫保护作用评价
本实施例中，为考察PLs(Hlα)免疫后对全身毒素侵害的免疫保护作用，第一次接种28天后，取各组免疫后小鼠(n＝9)，静脉注射致死剂量成孔毒素溶液(5μg)，记录各组小鼠生存曲线。结果显示，PLs(Hlα)组的小鼠最终全部存活。生理盐水组和PLs组小鼠在5小时内全部死亡。热灭活Hlα组虽然能延缓死亡时间，但对生存率并没有改善(图5A)。上述结果表明，PLs(Hlα)免疫接种后能产生较好的抗全身性毒素侵害的免疫保护作用，显著优于热灭活毒素组。
考察PLs(Hlα)免疫后对局部皮下注射毒素的免疫保护作用。具体操作：将生理盐水、PLs、热灭活Hlα(70℃60min)、PLs(Hlα)(3μg Hlα)分别接种至ICR小鼠颈部皮下，每周一次共三次。第一次接种28天后，将适量成孔毒素(2μg)注射至各组小鼠后肢皮下(n＝6)，一段时间后观察各组小鼠皮肤损伤情况，评价PLs(Hlα)疫苗抗皮肤毒力因子侵害的效果。结果表明(图5B)，PLs(Hlα)免疫后小鼠皮肤外观无明显损伤。而热灭活Hlα组显示出少量皮肤外观损伤。生理盐水组和PLs组皮肤外观均有严重损伤。上述结果表明，PLs(Hlα)免疫接种后能产生较好的抗局部毒素侵害的免疫保护作用。
实施例7：脂质体疫苗预防耐药细菌感染的效果评价
本实施例中，为考察PLs(Hlα)免疫后对耐药细菌侵害的免疫保护作用，第一次免疫接种28天后，各组小鼠后肢皮下注射耐药细菌MRSA252(109CFU，100μl)。每天观察裸鼠皮肤外观并拍照，测定皮肤损伤的面积。结果显示(图8)，Saline和PLs组皮肤损伤面积随时间增加迅速增大，两组间无显著性差异。Heated Hlαprime+boost组皮肤损伤面积随时间缓慢增大，显著低于Saline或PLs组(P<0.01)，显示热灭活Hlα免疫接种具有一定的抗MRSA感染效果。PLs(Hlα)prime+boost组小鼠7天内皮肤仅有少量损伤，皮肤损伤面积显著低于其它各组(P<0.01)。上述结果表明，PLs(Hlα)免疫接种后能较好地抵抗局部耐药细菌感染。

Claims (12)

1.一种细菌毒素疫苗，其特征在于，所述的细菌毒素疫苗为高负载成孔毒素的脂质体疫苗；所述的脂质体由胆固醇、磷脂酰胆碱、聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和/或鞘磷脂构成；所述的脂质膜和成孔毒素的质量比为100:3～100:15。
2.按权利要求1所述的细菌毒素疫苗，其特征在于，所述的脂质膜和成孔毒素的质量比为100:10～100:15。
3.按权利要求1所述的细菌毒素疫苗，其特征在于，所述的胆固醇占总脂质的质量比为20％～50％。
4.按权利要求1所述的脂质体，其特征在于，所述的胆固醇占总脂质的质量比为40％～50％。
5.按权利要求1所述的细菌毒素疫苗，其特征在于，所述的鞘磷脂和磷脂酰胆碱的质量和占总脂质的质量比为35％～75％。
6.按权利要求1所述的细菌毒素疫苗，其特征在于，所述的聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺占总脂质的质量比为5％～15％。
7.按权利要求1所述的细菌毒素疫苗，其特征在于，所述的聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺占总脂质的质量比为10％。
8.按权利要求1所述的细菌毒素疫苗，其特征在于，所述的聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺中的聚乙二醇分子量为1000～3000道尔顿。
9.按权利要求1所述的细菌毒素疫苗，其特征在于，所述的聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺中的聚乙二醇分子量为2000道尔顿。
10.按权利要求1所述的细菌毒素疫苗，其特征在于，脂质体的粒径在80～1000nm，优选100～200nm。
11.按权利要求1所述的细菌毒素疫苗，其特征在于，脂质体的粒径为100～200nm。
12.权利要求1所述的细菌毒素疫苗在制备预防细菌感染药物中的应用。
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