CN113041345B

CN113041345B - 一种纳米类毒素疫苗及其用途

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Publication number: CN113041345B
Application number: CN202011475368.5A
Authority: CN
Inventors: 庞志清; 王建新; 何雨薇; 陈星�; 阮双蓉; 李海春
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2019-12-26
Filing date: 2020-12-14
Publication date: 2023-09-01
Anticipated expiration: 2040-12-14
Also published as: CN113041345A

Abstract

本发明属生物技术领域，涉及一种纳米类毒素疫苗及其用途，该纳米类毒素疫苗为高负载成孔毒素的红细胞膜融合脂质体，所述的红细胞膜融合脂质体由天然红细胞膜和人工脂质膜构成。本发明所述纳米类毒素疫苗通过将细菌成孔毒素嵌入纳米粒子表面完成毒素的高效负载，不仅消除毒素的毒性作用，同时完整保留抗原蛋白结构，而且接种后可引起免疫细胞对成孔毒素的高效提呈并产生高滴度的特异性抗体，有效预防细菌感染尤其耐药细菌感染。

Description

一种纳米类毒素疫苗及其用途

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及纳米类毒素疫苗，具体涉及一种高负载细菌成孔毒素的纳米类毒素疫苗及其用途，该纳米类毒素疫苗通过将成孔毒素嵌入纳米粒子表面完成毒素的高效负载，不仅消除毒素的毒性作用，同时完整保留抗原蛋白结构，接种后可引起免疫细胞对成孔毒素的高效提呈并产生高滴度的特异性抗体，有效预防细菌感染尤其是耐药细菌感染。

背景技术

据报道，细菌感染现仍然是世界范围内的一类高发病率和高致死率的疾病，而耐药细菌尤其是“超级细菌”的出现给抗细菌感染治疗带来了更大的挑战，严重威胁着人类的健康且带来极大社会经济负担，研究预测，截至2050年耐药细菌感染或导致全球上千万人死亡，全球累计花费上百万亿美元。而目前全球新型抗生素研发停步不前，新型抗生素匮乏，也没有任何针对“超级细菌”的疫苗上市。因此，亟需设计和开发新型的给药策略以改善耐药细菌感染的预防和治疗效果。

研究显示，细菌感染过程中，其释放的毒力因子(如外毒素、内毒素)能辅助细菌的定殖、生长和传播，并且对宿主机体有较大的毒性作用，严重情况下可造成器官衰竭和死亡。因此，中和细菌毒素能够抑制细菌的存活与繁殖，同时避免其对宿主组织的直接破坏。由于抗毒毒素治疗针对细菌分泌的毒力因子，不直接对细菌产生杀伤作用，因而不易产生耐药现象。近年来，抗细菌毒素策略逐渐成为耐药细菌感染治疗的研究热点。

业内知悉，疫苗能帮助宿主的免疫系统识别病原体，为消除感染类疾病的最有效的公共健康干预方法。机体产生的快速免疫反应能有效抵抗细菌感染，极大减少抗生素的使用，因此疫苗也是减少耐药现象产生的重要工具。抗毒素疫苗是指将抗毒素策略与疫苗治疗进行结合，能尽可能地减少细菌耐药现象的产生。临床常用的破伤风和白喉疫苗即是抗毒素疫苗的成功案例。传统的抗毒素疫苗(类毒素疫苗)的制备方法包括化学灭活和热灭活，通过变性蛋白的方法来减少毒素抗原的毒性。其存在的主要问题是难以同时保证灭活毒素的安全性和免疫原性。灭活毒素的安全性提高的同时同免疫原性大幅度下降，免疫效果较差。

成孔毒素也称为成孔蛋白，是细菌产生的最主要的毒力因子。近年来，随着成孔毒素结构和穿孔机制的研究不断深入，其与细胞膜的相互作用机制逐步得到阐明。研究表明，细胞的脂质膜结构是成孔毒素形成孔道的物质基础。受此启发，加州大学张良方等人制备了红细胞膜包被聚合物纳米粒(也被称为纳米海绵)用于成孔毒素的高亲和性吸附，并且将吸附了毒素的纳米海绵进一步开发为纳米类毒素疫苗。这种新型纳米类毒素疫苗不仅消除了毒素毒性，而且完整保留了毒素的蛋白质结构，实验结果显示，与传统热灭活疫苗比较，该纳米类毒素疫苗更安全，免疫激活能力更强(Hu,C.M.；Fang,R.H.；Luk,B.T.；Zhang,L.,Nanoparticle-detained toxins for safe and effective vaccination.NatNanotechnol2013,8(12),933-8.)。但该纳米类毒素疫苗仍存在一些不足，如对毒素负载量较低(以α 溶血素为例，仅为22μg/mg)，抗原提呈效果较弱，免疫激活能力尚有待提高，而且细胞膜包被纳米粒的过程较为复杂，对红细胞膜的资源利用效率较低，难以大规模生产。

基于现有技术的现状，本发明拟构建一种新型的高负载成孔毒素的纳米类毒素疫苗— 红细胞膜融合脂质体类毒素疫苗。该纳米类毒素疫苗采用红细胞膜融合脂质体吸附细菌成孔毒素完成毒素的高效负载，不仅消除毒素的毒性作用，同时完整保留抗原蛋白结构，接种后可促进免疫细胞对成孔毒素的高效提呈并产生高滴度的特异性抗体，实现有效预防细菌感染尤其是耐药细菌感染的目的。

发明内容

本发明目的在于提供一种纳米类毒素疫苗，具体涉及红细胞膜，人工脂质材料和成孔毒素的组合物及其用途；该纳米类毒素疫苗不仅避免了传统灭活方法对毒素结构可能造成的破坏，而且具有很高的抗原载量(或表面抗原密度)。免疫接种后，可促进免疫细胞对成孔毒素的高效提呈并产生高滴度的特异性抗体，中和毒素，预防细菌感染。

具体地，本发明首先将红细胞膜与PEG化的人工脂质膜进行融合，制得红细胞膜融合脂质体，再与成孔毒素孵育，制备成高负载成孔毒素的类毒素疫苗。通过体内外实验分析其安全性，考察其抗原提呈效果及免疫激活能力，最后对其预防毒素侵害和耐药细菌感染的效果进行评价。结果显示，该纳米类毒素疫苗采用红细胞膜融合脂质体吸附细菌成孔毒素完成毒素的高效负载，不仅消除毒素的毒性作用，同时完整保留抗原蛋白结构，接种后可促进免疫细胞对成孔毒素的高效提呈并产生高滴度的特异性抗体，实现有效预防细菌感染尤其是耐药细菌感染的目的。

本发明所述纳米类毒素疫苗为高负载成孔毒素的红细胞膜融合脂质体；

所述的红细胞膜融合脂质体由天然红细胞膜和人工脂质膜构成；

所述的天然红细胞膜的膜蛋白和人工脂质膜的质量比3:80～3:10，优选3:40～3:20；

所述的人工脂质膜由磷脂酰胆碱、聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，和/或胆固醇构成；其中，

所述聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺其占人工脂质的质量比为5％～15％，优选10％；

所述磷脂和胆固醇的质量和占总脂质的质量比为85％～95％，优选90％；

所述聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇分子量为1000～3000道尔顿，优选 2000道尔顿；

所述红细胞膜融合脂质体的粒径在80～200nm，优选100～130nm；

本发明所述的人工脂质膜和成孔毒素的质量比为10:1～10:6，优选10:2～10:4。

所述的纳米类毒素疫苗可用于制备预防细菌感染药物。

本发明进一步提供了一种使用纳米类毒素疫苗引发受试者对成孔毒素免疫应答的方法，和使用纳米类毒素疫苗保护受试者不受成孔毒素影响的方法。在本发明的实施例中，免疫应答是B细胞介导的免疫应答。

本发明还提供了有效量的红细胞膜融合脂质体用于制造纳米类毒素疫苗的用途，和有效量的载毒素红细胞膜融合脂质体用于制造保护受试者不受成孔毒素影响的疫苗的用途。本发明包括治疗、预防与成孔毒素相关的疾病或病症，包括但不限于：细菌感染，传染病，寄生虫病，中毒，肿瘤。

本发明进一步提供了一种包含本发明的纳米类毒素疫苗的药物组合物。在某些实施例中，本发明的药物组合物进一步包含一种或多种免疫佐剂或免疫增强剂和/或药学上可接受的载体或赋形剂，其可以与本发明的脂质体疫苗一起或组合施用。

本发明进一步提供了一种用于使用本发明的纳米类毒素疫苗在有需要的受试者中治疗和/或预防疾病或病状的方法。在某些实施例中，经由任何适合的施用途径施用纳米类毒素疫苗或其药物组合物。例如，可以经由经鼻腔、口腔黏膜、口服、肺吸入、静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、或皮内途径施用纳米类毒素疫苗或其药物组合物。

本发明中，成孔毒素可以是细菌(例如，金黄色葡萄球菌(S.aureus))、植物、真菌或动物毒素。

本发明中，纳米类毒素疫苗包括红细胞膜融合脂质体和成孔毒素。其中，红细胞膜融合脂质体由天然红细胞膜和人工脂质膜构成。人工脂质膜由磷脂酰胆碱(简称磷脂)、聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG)和/或胆固醇构成。红细胞膜含有成孔毒素的受体，可以识别成孔毒素并协助其折叠、组装和打孔。在本发明中，天然红细胞膜的膜蛋白和人工脂质膜的质量比3:80～3:10，优选3:40～3:20。DSPE-PEG对脂质体疫苗的稳定性有重要的影响，其占总脂质的质量比为5％～15％，优选10％。DSPE-PEG中聚乙二醇分子量为1000～3000道尔顿，优选2000道尔顿。胆固醇和磷脂是人工脂质膜的重要组成部分，磷脂和胆固醇的质量和占总脂质的质量比为85％～95％，优选90％。红细胞膜融合脂质体的粒径在80～200nm，优选100～130nm。红细胞膜融合脂质体的制备方法为挤压过膜法，高压均质法或微射流法中的一种。通过研究发现，本发明的纳米类毒素疫苗表面抗原的载量(或密度)对其抗原提呈、体内免疫激活效果具有非常重要的影响，本发明中纳米类毒素疫苗中脂质膜和成孔毒素的质量比为10:1～10:6，优选10:2～10:4。

本发明通过以下技术方案实现纳米类毒素疫苗研究：

(1)从全血中提取红细胞，进而分离提纯红细胞膜。将适量红细胞膜和人工脂质膜融合制备红细胞膜融合脂质体。再将细菌成孔毒素与红细胞膜融合脂质体孵育，制备纳米类毒素疫苗。

(2)对纳米类毒素疫苗的理化性质进行表征。采用动态光散射法测定其粒径，电位，多分散系数。采用透射电镜观察其形态和大小。

(3)对纳米类毒素疫苗的安全性进行表征。采用溶血实验，体外细胞毒性实验考察其体外安全性。通过小鼠皮下注射纳米类毒素疫苗，观察小鼠皮肤损害及血中红细胞计数情况，考察其体内安全性。

(4)通过体外细胞实验，考察纳米类毒素疫苗的抗原摄取及提呈效果。

(5)通过皮下注射纳米类毒素疫苗免疫小鼠，测定其血清抗体滴度及抗体中和毒素的效果，考察免疫激活情况。

(6)通过皮下注射纳米类毒素疫苗免疫小鼠，分析淋巴结生发中心，考察免疫激活情况。

(7)通过皮下注射纳米类毒素疫苗免疫小鼠，分别皮下注射毒素或静脉注射毒素，考察疫苗接种预防毒素侵害的效果。

(8)通过皮下注射纳米类毒素疫苗免疫小鼠，皮下注射耐药细菌，考察疫苗接种预防耐药细菌感染的效果。

本发明提供了一种高负载成孔毒素的纳米类毒素疫苗及其在预防细菌感染中的用途，该纳米类毒素疫苗不仅具有较好的安全性，而且具有很高的抗原载量(或表面抗原密度)，可高效诱导产生免疫反应，可有效预防毒素侵害、细菌感染尤其耐药细菌感染。

为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。

附图说明

图1，高负载成孔毒素的纳米类毒素疫苗结构及其免疫过程示意图：成孔毒素高效插入红细胞膜融合脂质体膜结构中形成纳米类毒素疫苗。纳米类毒素疫苗皮下接种小鼠后，活化B细胞产生大量抗体，可特异性中和该成孔毒素，从而实现预防细菌感染作用。

图2，载成孔毒素红细胞膜融合脂质体的理化性质表征。RM-PLs为红细胞膜融合脂质体，RM-PLs(-)表示空白(或未载毒素)RM-PLs。图A为溶血试验考察RM-PLs吸附毒素能力。图B为载毒素红细胞膜融合脂质体(RM-PLs(Hlα))平均粒径和Zeta电位。图C 为RM-PLs(Hlα)粒径分布，图D为RM-PLs(Hlα)负染后的透射电镜结果。图E为RM- PLs(Hlα)免疫电镜结果。

图3，RM-PLs(Hlα)的体内外安全性评价。图A为RM-PLs(Hlα)的体外溶血结果。图 B为RM-PLs(Hlα)体外细胞毒性实验结果。图C为皮下注射RM-PLs(Hlα)后的皮肤损伤情况，包括皮肤损伤外观和皮肤和临近肌肉组织样品切片的H&E染色和TUNEL染色照片。

图4，RM-PLs(Hlα)的抗原摄取及抗原提呈效果评价。图A为RM-PLs(Hlα)的细胞摄取。图B为RM-PLs(Hlα)的抗原提呈效果。

图5，RM-PLs(Hlα)接种后血清特异性抗体分析。图A为血清抗体滴度测定。图B为血清抗毒素效果。

图6，RM-PLs(Hlα)体内免疫激活作用评价。图A为淋巴结生发中心免疫荧光照片。图B为淋巴结生发中心B细胞流式分析图。图C为图B的定量结果。

图7，RM-PLs(Hlα)多次免疫接种后，小鼠抵抗毒素侵害效果评价。图A为动物静脉注射毒素后的生存曲线。图B为皮下注射毒素后皮肤损伤面积。图C为图B的代表性皮肤损伤图。

图8，RM-PLs(Hlα)多次免疫接种后，小鼠预防耐药细菌感染效果。图A为皮下注射耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)后皮肤损伤面积-时间图。图B为感染部位皮肤内细菌数量。

具体实施方式

本实施例选择耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)分泌的主要成孔毒素α-溶血素(Hla)为成孔毒素代表，探讨高负载毒素的纳米类毒素疫苗的安全性、免疫激活作用及预防毒素侵害和细菌感染的效果。以下实施例采用的实验数据统计方法：多组比较采用一步ANOVA法，两组比较采用双侧t检验法。

实施例1：纳米类毒素疫苗的构建

本实施例中首先从全血中提取红细胞，并利用低渗法和离心法分离纯化出红细胞膜。具体操作：六周龄雄性ICR小鼠摘眼球取血，全血用肝素钠抗凝，4℃条件下，700g离心10分钟，弃去上层血浆和白膜层(白细胞和血小板)，再用含有1mM EDTA的PBS 溶液重悬底部红细胞，重复洗涤三次。收集底部红细胞并加入等体积含1mM EDTA的 PBS溶液，配成红细胞悬液，每250μL加至1.5mL EP管中，再加入950μL 0.2mM EDTA水溶液，混合均匀后涡旋破碎红细胞，而后加入50μL 20×PBS调节至等渗。4℃条件下，20000g离心10分钟，弃去上清。重复上述步骤，得到类白色红细胞膜，用0.25 mM EDTA水溶液重悬，定容至与前述红细胞悬液等体积，分装后-80℃保存待用。

采用薄膜水化挤出法制备红细胞膜融合脂质体。具体操作：称取适量的磷脂酰胆碱 (PC)、DSPE-PEG2000和或胆固醇(如表1)用二氯甲烷溶解，室温下旋蒸成脂质膜。加入适量红细胞膜溶液室温搅拌水化1h，用脂质体挤出器挤出，依次过400nm,200nm 和100nm膜，可得红细胞膜融合脂质体(RM-PLs)悬液。

表1各种处方下纳米类毒素疫苗粒径和电位(n＝3)

通过体外溶血试验测定RM-PLs对毒素的负载量。具体操作：将4μg Hlα与不同质量的RM-PLs(以生理盐水、1％TritonX-100为对照)室温下30min，然后与适量2.5％ RBC在37℃下振荡孵育3小时，2000g离心5min，测定上清在540nm的吸光度值并按下述公式计算溶血百分数。其中阴性对照为生理盐水，阳性对照为1％TritonX-100。根据溶血百分数为0时RM-PLs的用量计算RM-PLs对毒素的负载量。

将适量Hlα与RM-PLs在室温下孵育30min，即可得到纳米类毒素疫苗(RM- PLs(Hlα))。如表1所示，不同处方RM-PLs(Hlα)的毒素载量为200～600μg/mg脂质体(以脂质质量计)。RM-PLs(Hlα))粒径在100～130nm之间，电位在-36～-41mV之间。图1为表1中处方2脂质体的溶血试验测定结果，显示其对毒素的负载量为400μg/mg，相当于每个脂质体表面负载了961个Hlα毒素分子。

参考文献(Hu CM,Fang RH,Copp J,Luk BT,Zhang L.A biomimetic nanospongethat absorbs pore-forming toxins.Nat Nanotechnol.2013；8:336-40)制备红细胞膜包聚乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)纳米粒(RBC-NP)，溶血试验法测定其对Hlα毒素的负载量约为22 μg/mg纳米粒(以PLGA质量计)，相当于每个NP表面负载了85个Hlα毒素分子。

为了便于下一步进行体外表征、体内免疫效果和药效学的实验，未特别指定的情况下，RM-PLs采用处方2进行制备，即采用3.6mg PC，0.4mg DSPE-PEG2000和150μl RBC膜(相当于0.3mg膜蛋白)制备RM-PLs(终体积为2mL)，然后将10μg RM-PLs与2μg Hlα孵育得到纳米类毒素疫苗(RM-PLs(Hlα))，相当于每个脂质体表面负载了480 个Hlα毒素分子。与RBC-NP相比，RM-PLs(Hlα)表面毒素分子密度提高了5.6倍。

实施例2：纳米类毒素疫苗的理化性质表征

以未载毒素的红细胞膜融合脂质体(RM-PLs(-))为对照。采用动态光散射法测定RM-PLs(Hlα)的平均粒径、粒径分布和多分散系数，并测定其Zeta电位。结果表明，RM- PLs(Hlα)平均粒径为120nm，且粒径分布较窄，电位-36.5mV，与RM-PLs(-)类似。醋酸铀负染后采用透射电镜观察RM-PLs(Hlα)的形态和大小，结果显示(图2B-D)，RM- PLs(Hlα)为规则球形，大小均一，与RM-PLs(-)类似。以上结果表明，处方量毒素负载对红细胞膜融合脂质体的理化性质无显著影响。采用胶体金免疫电镜表征Hlα的荷载情况，结果表明毒素成功负载于RM-PLs(Hlα)的表面(图2E)。

实施例3：纳米类毒素疫苗的体外安全性评价

本实施例中首先通过溶血实验考察RM-PLs(Hlα)的体外安全性，并与Hlα和热灭活Hlα 进行比较。具体操作：将Hlα、热灭活Hlα(70℃ 30min或60min)、RM-PLs(-)、RM- PLs(Hlα)分别与2.5％RBC在37℃下振荡孵育，一定时间后，2000g离心5min，测定上清在 540nm的吸光度值并按实施例1公式计算溶血百分数。结果表明(图3A)，Hlα70℃灭活30min(70℃30min Hlα)仍有一定的溶血作用，70℃灭活60min(70℃ 60min Hlα)才能完全消除溶血作用，而RM-PLs(Hlα)无溶血作用，显示出较好的安全性。

接着，对RM-PLs(Hlα)的体外细胞毒性进行考察。具体操作：提取小鼠骨髓，培养得到原代树突细胞。将其接种至96孔板，并分别与生理盐水，热灭活Hlα、RM-PLs(-)或RM- PLs(Hlα)(Hlα浓度为2μg/mL、4μg/mL)孵育48h。CCK8法测定各组细胞活力。结果表明，与对照组相比，Hlα、70℃ 30min Hlα(未完全灭活Hlα)能显著降低树突细胞细胞活力(P<0.01)，而70℃ 60min Hlα(完全灭活Hlα)与RM-PLs(Hlα)没有显著改变树突细胞细胞活力(图3B)。上述结果提示RM-PLs(Hlα)具有较好的体外安全性。

实施例4：纳米类毒素疫苗的体外安全性评价

为考察RM-PLs(Hlα)的体内安全性，将Hlα、热灭活Hlα(70℃ 30min或60min)、 RM-PLs(Hlα)(3μg Hlα)分别接种至ICR小鼠颈部皮下，每周一次共三次。最后一次接种48h后拍照记录小鼠皮肤损伤面积，取注射部位附近皮肤及连接肌肉组织，进行组织切片，对切片进行H&E染色和TUNEL染色。结果表明(图3C)，Hlα注射部位附近皮肤及连接肌肉组织严重坏死，细胞广泛凋亡。未完全灭活Hlα组(70℃ 30min Hlα)注射部位附近皮肤及连接肌肉组织部分坏死，细胞大量凋亡。而RM-PLs(Hlα)组的皮肤组织无明显损伤，组织结构规则完整，未见细胞凋亡，与完全灭活Hlα组(70℃ 60min Hlα)一致。每次接种后采血50μL，红细胞计数，结果显示RM-PLs(Hlα)组与正常小鼠的红细胞计数无显著性差异，表明RM-PLs(Hlα)免疫接种后没有产生红细胞抗体。上述结果提示类毒素疫苗具有较好的体内安全性。

实施例5纳米类毒素疫苗的抗原摄取及提呈效果评价

将Hlα采用HiLyte Fluor^TM647SE微量蛋白标记试剂盒标记(Hlα-Fluor)。按实施例1制备载Hlα的RBC-NP(RBC-NP(Hlα))。按实施例1方法通过改变Hlα的投量分别制备表面Hlα密度分别为85、480、961的RM-PLs(Hlα)(简写为RM-PLs(Hlα)-85，RM-PLs(Hlα)-480，RM-PLs(Hlα)-961)。按实施例3制备热灭活Hlα(70℃ 60min)。将原代树突细胞接种至12孔板，并分别与热灭活Hlα(heat Hlα)、各种RM-PLs(Hlα)或 RBC-NP(Hlα)(Hlα浓度为1μg/mL)37℃孵育2h。然后将细胞胰酶消化，离心收集细胞，流式细胞仪检测细胞的荧光强度。实验结果显示(图4A)，树突细胞对各种RM- PLs(Hlα)的摄取显著高于RBC-NP(Hlα)和heat Hlα(P<0.01)，而且RM-PLs(Hlα)表面 Hlα密度越高，树突细胞摄取越高。树突细胞对RM-PLs(Hlα)-961的摄取分别为RM- PLs(Hlα)-85、RBC-NP(Hlα)和Heated Hlα的3.1、4.8倍和11.2倍。RM-PLs(Hlα)表面高密度Hlα有助于抗原被抗原提呈细胞摄取。

按实施例1方法制备RBC-NP(Hlα))，RM-PLs(Hlα)-85，RM-PLs(Hlα)-480，RM- PLs(Hlα)-961。按实施例3制备热灭活Hlα(70℃ 60min)。将原代树突细胞接种至12 孔板，并分别与热灭活Hlα(heat Hlα)、各种RM-PLs(Hlα)或RBC-NP(Hlα)(Hlα浓度为1μg/mL)37℃孵育24h。采用含0.1％牛血清白蛋白的PBS洗三次，然后细胞采用 CD40抗体(PE荧光标记)或CD80抗体(APC荧光标记)4℃下孵育结合2小时，收集细胞，流式细胞仪检测细胞的荧光强度。实验结果显示(图4B)，RM-PLs(Hlα)-480， RM-PLs(Hlα)-961组树突细胞的CD40荧光强度和CD80荧光强度均显著高于RM- PLs(Hlα)-85，RBC-NP(Hlα)组和heat Hlα组(P<0.01)，表明RM-PLs(Hlα)表面高密度 Hlα有助于抗原抗呈细胞的成熟，显著提高了毒素的抗原提呈效果。

实施例6：红细胞膜融合脂质体类毒素疫苗的体内免疫激活作用评价

本实施例中，将生理盐水、Hlα、热灭活Hlα(70℃ 60min)、RM-PLs(Hlα)(3μg Hlα)分别接种至ICR小鼠颈部皮下，每周一次共三次。第一次接种21天后，取小鼠血清，采用ELISA法测定体内Hlα抗体的水平。结果表明，3次免疫接种后，RM-PLs(Hlα) 组的Hlα抗体表达水平是热灭活Hlα组的120倍以上，而生理盐水，RM-PLs(-)组检测不到Hlα抗体表达(图5A)。取RM-PLs(Hlα)组血清与Hlα孵育后进行红细胞溶血实验，发现3次免疫接种后，RM-PLs(Hlα)组的血清可完全中和Hlα的溶血毒性(图5B)，表明 RM-PLs(Hlα)多次免疫接种后产生的抗体具有强大的中和Hlα毒性的能力。

取免疫后小鼠淋巴结，用于生发中心检测。制备冰冻切片，采用荧光标记抗体(B220抗体(绿色)、IgD抗体(蓝色)和GL7抗体(红色))免疫染色B细胞、未成熟B细胞和生发中心B细胞，激光共聚焦显微镜观察切片(图6A)。结果显示，RM-PLs(Hlα)组的生发中心B细胞(B220⁺IgD^-GL7⁺)数量显著高于热灭活Hlα组。取淋巴结消化后，采用荧光标记抗体进行上述各种类B细胞染色，流式细胞仪分选可得生发中心B细胞百分比 (图6B)。结果显示，RM-PLs(Hlα)组的生发中心B细胞百分比是热灭活Hlα组的2.6 倍。上述结果表明，RM-PLs(Hlα)能诱导机体产生较强的免疫反应。

实施例7：纳米类毒素疫苗体内抗毒力因子侵害的免疫保护作用评价

本实施例中，为考察RM-PLs(Hlα)免疫后对全身毒素侵害的免疫保护作用，第一次接种28天后，取各组免疫后小鼠(n＝9)，静脉注射致死剂量成孔毒素溶液(5μg)，记录各组小鼠生存曲线。结果显示，RM-PLs(Hlα)组的小鼠最终全部存活。生理盐水组和RM- PLs(-)组小鼠在5小时内全部死亡。热灭活Hlα组虽然能延缓死亡时间，但对生存率并没有改善(图7A)。上述结果表明，RM-PLs(Hlα)能产生较好的抗全身毒力因子侵害的免疫保护作用，显著优于热灭活毒素组。

考察RM-PLs(Hlα)免疫后对局部皮下注射毒素的免疫保护作用。具体操作：将生理盐水、RM-PLs(-)、热灭活Hlα(70℃ 60min)、RM-PLs(Hlα)(3μg Hlα)分别接种至ICR 小鼠颈部皮下，每周一次共三次。第一次接种28天后，将适量成孔毒素(2μg)注射至各组小鼠后肢皮下(n＝6)，一段时间后观察各组小鼠皮肤损伤情况，并取注射部位附近皮肤及连接肌肉组织，进行组织切片，并进行H&E染色和TUNEL染色，观察皮肤和肌肉组织结构损伤和细胞凋亡情况，评价类毒素疫苗抗皮肤毒力因子侵害的效果。结果表明(图7B)，RM-PLs(Hlα)免疫后小鼠皮肤外观无明显损伤，组织结构规则完整，未见细胞凋亡。而热灭活Hlα组显示出少量皮肤外观损伤，皮肤和肌肉组织结构也有少量破坏，可见部分细胞凋亡。而生理盐水组和RM-PLs(-)组皮肤外观均有严重损伤，皮肤及肌肉组织严重坏死，细胞广泛凋亡(图7C)。上述结果表明，RM-PLs(Hlα)能产生较好的抗局部毒力因子侵害的免疫保护作用，显著优于热灭活毒素组。

实施例8：纳米类毒素疫苗预防耐药细菌感染的效果评价

本实施例中，为考察RM-PLs(Hlα)免疫后对耐药细菌侵害的免疫保护作用，第一次免疫接种28天后，各组小鼠后肢皮下注射耐药细菌MRSA252(10⁹CFU，100μl)。每天观察裸鼠皮肤外观并拍照，测定皮肤损伤的面积。结果显示(图8A)，Saline和RM-PLs(-) 组皮肤损伤面积随时间增加迅速增大，两组间无显著性差异。Heat-treated Hlα组皮肤损伤面积随时间缓慢增大，显著低于Saline或RM-PLs(-)组(P<0.01)，显示热灭活Hlα免疫接种具有一定的抗MRSA感染效果。RM-PLs(Hlα)组小鼠7天内皮肤仅有少量损伤，皮肤损伤面积显著低于其它各组(P<0.01)。实验结束后处死动物，取细菌注射部位皮肤，匀浆稀释后接种到培养板培养，分析皮肤内细菌数量。实验结果表明(图8B)，RM- PLs(Hlα)组小鼠皮肤内耐药菌数量显著低于其它各组(P<0.01)。上述结果表明，RM- PLs(Hlα)免疫接种后能较好地抵抗体内耐药细菌感染。

Claims

1.一种纳米类毒素疫苗，其特征在于，所述的纳米类毒素疫苗为高负载成孔毒素的红细胞膜融合脂质体；

所述的红细胞膜融合脂质体由天然红细胞膜和人工脂质膜采用薄膜水化挤出法制成，其中，天然红细胞膜的膜蛋白和人工脂质膜的质量比3:80~3:10，

所述的人工脂质膜由磷脂酰胆碱、聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺构成，其中，聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺占人工脂质膜的质量比为5%~15%，磷脂占人工脂质膜的质量比为85%~95%，

所述的聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇分子量为1000~3000道尔顿，

所述的红细胞膜融合脂质体的粒径为100~130 nm，毒素载量为200~600 μg/mg脂质体，电位为-36~-41 mV；

所述的人工脂质膜和成孔毒素的质量比为10:1~10:6。

2.按权利要求1所述的纳米类毒素疫苗，其特征在于，所述的天然红细胞膜的膜蛋白和人工脂质膜的质量比为3:40~3:20。

3.按权利要求1所述的纳米类毒素疫苗，其特征在于，所述的聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺其占人工脂质膜的质量比为10%。

4.按权利要求1所述的纳米类毒素疫苗，其特征在于，所述的人工脂质膜中磷脂的质量占人工脂质膜的质量比为90%。

5.按权利要求1所述的纳米类毒素疫苗，其特征在于，所述的人工脂质膜中聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇分子量为2000道尔顿。

6.按权利要求1所述的纳米类毒素疫苗，其特征在于，所述的人工脂质膜和成孔毒素的质量比为10:2~10:4。

7.权利要求1所述的纳米类毒素疫苗在制备预防细菌感染药物中的用途。