KR20180101340A - 에키노마이신 제제, 이의 제조방법 및 사용방법 - Google Patents

에키노마이신 제제, 이의 제조방법 및 사용방법 Download PDF

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KR20180101340A
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얀 리유
크리스토퍼 베일리
팬 쟁
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칠드런스 내셔널 메디컬 센터
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Abstract

HIF-1α 및/또는 HIF-2α의 과발현을 특징으로 하는 환자 내의 질병을 치료하기 위한 리포솜 약물 제제는 약학적으로 허용가능한 담체 내의 복수개의 리포솜을 포함한다. 상기 리포솜은 에키노마이신을 캡슐화하고 PEG화 인지질, 중성 포스포글리세라이드, 및 스테롤로 만들어진다. PEG화 리포솜은 증식성 질환, 백혈병, 암, 자가면역질환 및 이식편대숙주병을 치료하는데 사용될 수 있다.

Description

에키노마이신 제제, 이의 제조방법 및 사용방법
본 출원은 2015년 11월 10일에 출원된 미국 가출원 62/253,257에 대한 우선권을 주장한다. 상기 출원의 모든 내용은 본 명세서에 참고자료로 병합된다.
본 출원은 일반적으로 증식성 질환, 자가면역질환 및 동종면역반응의 치료를 위한 리포솜 에키노마이신 제제의 조성물, 및 제조 및 전달 방법에 관한 것이다.
저산소증 유발 인자(Hypoxia-inducible factors, HIF)는 전사 인자이며 저산소증에 대한 세포 반응을 매개한다. HIF는 많은 암, 자가면역질환 및 동종면역반응에서 상향 조절되는 것으로 알려져있다. 특히, HIF는 종양 대사, 혈관 신생 및 전이에 관여한다(Semenza, G.L. et al., Nature Rev. Cancer. 2003;3(10):721-32).
에키노마이신(NSC526417)은 원래 1957년 스트렙토마이세스 에키나투스(Streptomyces echinatus)로부터 분리된 퀴녹살린(quinoxaline)계통의 일원이다. 에키노마이신은 HIF1α의 DNA-결합 활성을 저해하는 작은 분자이다. 에키노마이신은 생체 외 및 생체 내에서 B16 흑색종 및 P338 백혈병이 이식된 마우스의 종양에 대하여 및 인간 종양세포의 성장에 대하여 항종양 활성을 보이는 것으로 나타났다. 또한 에키노마이신은 백혈병 줄기세포를 우선적으로 제거함으로써 이종 모델 내의 마우스의 급성 림프구성 백혈병(acute lymphoblastic leukemia)과 인간 급성 골수성 백혈병 (acute myeloid leukemia)을 효과적으로 근절시키는 것으로 나타났다(Wang et al., Cell Stem Cell. 2011;8(4):399-411).
에키노마이신은 국립 암 연구소에 의해 임상 시험에 들어갔다. 그러나 이러한 연구들에서 사용된 에키노마이신은 이전에 치료받은 환자에게 유의미한 항종양 활성을 입증하지 않았다. 고형 종양에 대한 여러 제1상(7-11) 및 제2상(12-19)의 임상 시험이 수년에 걸쳐 수행되었다. 그러나, 모든 존재하는 치료법에 대해 난치성인 고형 종양을 가진 환자에게 상기 약물이 지속적으로 효과적이지 않았기 때문에, 에키노마이신의 임상 개발은 중단되었다. 에키노마이신이 HIF 억제제라는 사실이 밝혀지기 훨씬 전에 연구가 진행되었기 때문에(Kong D. et al., Cancer Res.2005;65(19):9047-55), 효능 연구는 HIF 억제의 가능한 이점을 평가하도록 고안되지 않았다. 비록 에키노마이신은 수차례 제2상 시험에서 사람에게 1200 μg/m2의 1회 투여량으로 사용되었지만, 1985 내지 19995년 사이에 약물농도 측정을 위한 방법이 없었기 때문에 약물 동역학(Pharmacokinetics, PK) 데이터가 나타나지 않았다. 그러나 최근 새로운 방법이 등장하여, 에키노마이신이 생체 내 짧은 반감기를 가지고, 그에 따라 임상적 사용이 제한적이라는 점이 드러났다.
에키노마이신은 물에 고도로 불용성이므로, 약물을 적절한 복용 형태로 제제화할 수 있는 수단을 복잡하게 한다. 물에 용해되었을 때, 에키노마이신은 빠르게 용액 밖으로 침전되고 따라서 유리 약물과 수성 용매의 혼합물에 의존하는 모든 제제는 그의 수용자에서 상당한 생물학적 이용가능성을 생산할 수 없다. 또한, 에키노마이신이 DMSO와 같이 용해될 수 있는 이용가능한 용매는 환자에게 이러한 용매들의 가혹한 성질 때문에 임상적으로 받아들여질 수 없다. 에키노마이신의 임상 시험에서도 심한 오심 및 구토와 같은 심각하게 보고된 부작용이 드러났으며, 임상적 유용성이 더욱 제한적이었다.
상기 설명된 한계점을 감안하여, 증식성 질환, 자가면역질환. 이식편대숙주병(graft-versus-host disease) 또는 HIF-1 억제가 필요한 임의의 다른 질병에 대한 비독성이고 효과적이며 새롭고 효율적인 에키노마이신 제제가 필요하다.
요약
본 출원의 일 측면은 HIF-1α 및/또는 HIF-2α의 과발현을 특징으로 하는 환자의 질병을 치료하는 리포솜 약물 제제에 관한 것이다. 리포솜 약물 제제는 약학적으로 허용가능한 담체 내에 복수개의 리포솜을 함유한다. 상기 리포솜은 에키노마이신을 캡슐화하고, PEG화 인지질, 중성 포스포글리세라이드, 및 스테롤로부터 만들어진다.
일 구체예에서, 상기 PEG화 인지질은 디스테아로일포스파티딜에탄올아민-폴리에틸렌글리콜(DSPE-PEG), 디미리스토일포스파티딜에탄올아민-폴리에틸렌글리콜(DMPE-PEG), 디팔미토일글리세로석시네이트 폴리에틸렌글리콜(DPGS-PEG), 콜레스테릴-폴리에틸렌글리콜, 또는 세라마이드-계열 PEG화 지질이다.
다른 구체예에서, 상기 중성 포스포글리세라이드는 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜글리세롤 및 포스파티딜이노시톨로 이루어진 군에서 선택된다.
다른 구체예에서, 제제 내의 총 지질에 대한 PEG화 인지질의 몰비는 3 내지 6%이고; 상기 제제 내의 총 지질에 대한 중성 포스포글리세라이드의 몰비는 45 내지 60%이고; 상기 제제 내의 총 지질에 대한 스테롤의 몰비는 30 내지 50%인 제제이다.
일 구체예에서, 상기 PEG화 인지질은 디스테아로일포스파티딜에탄올아민-폴리에틸렌글리콜(DSPE-PEG)이고, 상기 중성 포스포글리세라이드는 포스파티딜콜린이고, 상기 스테롤은 콜레스테롤이다.
특정 구체예에서, 상기 리포솜은 5.3% DSPE-PEG-2000, 56.3% 수소화된 대두 포스파티딜콜린(HSPC) 및 38.4% 콜레스테롤이다.
특정 구체예에서, 총 지질에 대한 상기 에키노마이신의 질량비는 2 내지 10% 사이이다. 특정 구체예에서, 총 지질에 대한 상기 에키노마이신의 질량비는 5%이다.
몇몇 구체예에서, 상기 제제 내의 리포솜의 90% 이상은 80 내지 120nm 사이의 직경을 갖는다.
몇몇 구체예에서, 상기 리포솜의 평균 다분산지수(polydispersity index)는 0.1 미만이고 상기 리포솜은 4℃에서 적어도 12개월의 저장 수명을 달성하기에 충분히 안정하다.
다른 구체예에서, 상기 리포솜은 동결 건조 분말로서 제제화된다.
다른 측면에서, 본 출원에 따른 PEG화 리포솜 제제와 HIF-1α 및/또는 HIF-2α의 과발현이 특징인 환자의 질병 치료방법은 이를 필요로 하는 환자에게 PEG화 제제를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 리포솜 제제는 질병을 치료하는데 충분한 양의 에키노마이신을 포함한다.
일 구체예에서, 상기 질병은 증식성 질환이다. 특정 구체예에서, 상기 증식성 질환은 백혈병이다. 다른 구체예에서, 상기 증식성 질환은 유방암이다.
다른 구체예에서, 상기 질병은 자가면역질환이다.
다른 구체예에서, 상기 질병은 이식편대숙주병이다.
추가의 측면에서, 본 출원에 따른 PEG화 리포솜 제제의 제조 방법은 극성 용매 내에서 에키노마이신, 및 PEG화 인지질, 중성 인지질 및 스테롤을 포함하는 지질 성분들을 포함하는 혼합물을 형성 시키는 것; 상기 극성 용매를 제거하기 위해 상기 혼합물을 건조시켜 건조 지질 필름을 형성시키는 것; 상기 건조 지질 필름을 완충용액 내에서 가용화하여 지질 현탁액을 형성시키는 것; 상기 지질 현탁액을 폴리카보네이트 필터를 통해 압출하여 원하는 크기 범위의 리포솜을 수득하는 것; 및 상기 리포솜을 여과에 의해 멸균하는 것을 포함한다.
도 1. 리포솜 에키노마이신의 물리적 특성. (A) 멜버른 제타사이저(Malvern Zetasizer) 소프트웨어 상의 동적 광 산란(dynamic light scattering, DLS)으로 측정된 통상의 제제에 대한 크기 분포. (B) 리포솜 에키노마이신의 평균 크기와 제타 전위의 요약. 데이터는 6개의 독립적 제제 +/- s.d. 의 요약이다. 측정은 멜버른 제타사이저 소프트웨어를 사용하여 수행되었다.
도 2. 리포솜 에키노마이신으로부터의 에키노마이신의 생체 외 방출. (패널 A) 21℃에서 ddH2O에 대한 투석된 리포솜 에키노마이신의 약물 방출 곡선. 측정점은 HPLC에 의한 3회 측정값의 평균 +/- s.d.를 나타낸다. (패널 B) (패널 A)에 도시된 대응 시점에서 에키노마이신 피크를 가리키는 대표적인 HPLC 크로마토그램.
도 3. 생체 외 리포솜 에키노마이신 저장 및 안정성. (패널 A 및 패널 B) 리포솜 에키노마이신은 4℃에서 저장되었고 1개월 및 3개월간 저장한 후에 안정성 파라미터를 위해 시료를 취하였다. 0개월은 제조 직후 측정을 나타낸다. 평균 크기 및 제타 전위(패널 A) 및 4℃에서 저장하는 동안의 리포솜 에키노마이신의 평균 다분산지수(PdI)(패널 B) 측정. 데이터는 멜버른 제타사이저 소프트웨어를 사용하여 생성되었고, 오차 막대는 3회 측정한 s.d.에 해당한다. (패널 C) 4℃에서 저장 중 에키노마이신 함량 손실의 HPLC 분석은 초기 측정(0개월)의 백분율로서 표시된다. 오차 막대는 3회 측정한 s.d.에 해당한다.
도 4. 리포솜 vs 유리 에키노마이신의 독성 및 효능의 비교. (패널 A) 리포솜 에키노마이신, PBS 에키노마이신(PBS 내의 20% DMSO), 또는 동일 투여량의 빈 리포솜 운반체의 처치 사이클을 받는 암컷 NSG 마우스들의 체중 변화. 마우스는 총 3회 투여량을 격일로 한번 정맥내의 리포솜(n=7) 또는 유리(n=7) 에키노마이신 또는 운반체 당량(vehicle equivalent)(n=4) 250 μg/kg으로 처치되었다. (패널 B) 1 mg/kg 리포솜 또는 유리 에키노마이신, 또는 빈 리포솜 운반체의 동일한 투여량의 단일 정맥 내 주사가 투여된 NSG 마우스의 생존.
도 5. 리포솜 vs 유리 에키노마이신의 약물 동역학의 비교. 0.1 mg/kg 리포솜 에키노마이신 또는 유리 에키노마이신의 단일 투여량 정맥주사 투여에 따른 MS에 의해 검출된 에키노마이신의 혈청 혈장 수준.
도 6. 종양 내의 에키노마이신의 축적. 리포솜 및 종래의 제제화된 에키노마이신(0.1 mg/kg)의 단일 투여량 정맥 내 주사에 따른 유방 종양 SUM 159 내의 에키노마이신의 농도. n=3/시점.
도 7. ETP-ALL 내의 HIF-1α의 축적. (패널 A) ETP ALL 이종이식 모델의 비장(spleen) 내의 HIF-1α 단백질 수준이 웨스턴 블롯(Western blot)에 의해 측정되었다. (패널 B) 이종이식 마우스의 비장으로부터의 ETP-ALL-1 세포는 항 hCD45 및 CD117 표면 표지로 착색되었고 FACS 분석에 따른, APC-접합된(conjugated) HIF-1α 항체에 의해 세포 내적으로 착색되었다.
도 8. 리포솜 에키노마이신은 이종이식 마우스 모델 내의 인간 ETP-ALL 세포를 제거한다. (패널 A) 패널 B의 데이터에 대한 ETP-ALL 인간화 마우스에 대한 리포솜 에키노마이신 치료의 투약 요법. 0일째는 인간 ETP-ALL-1 세포로 이식한 날을 나타낸다. 녹색 화살표는 하나의 개별 리포솜 에키노마이신 주사(0.35 mg/kg/정맥 내 주사)를 나타낸다. 빨간색 화살표는 혈액 검사를 나타낸다. (패널 B) 1.3Gys로 조사된 NSG 마우스에 1x106 인간 ETP-ALL-1 세포가 정맥 내로 주사되었다. 수용자의 PBMC 내 인간CD45+ 세포는 이식 후 34일 째 FACS 분석에 의해 검출되었다. 처치 전(34일) 수용자 마우스와 처치 후(42, 48, 56 및 64일) 마우스(운반체 및 리포솜 에키노마이신 처치)의 PBMC 내 인간CD45+ 세포의 백분율이 FACS 분석에 의해 분석되었다. 운반체 또는 리포솜 에키노마이신(각각의 그룹에 대해 n=10)으로 처치된 모든 수용자 마우스의 PBMC 내 인간 CD45+의 백분율 요약. (패널 C) 내약성이 좋은 투여량에서, 리포솜 에키노마이신은 최대 유리 에키노마이신보다 더 효과적이다. NSG 마우스에게 1.3 Gys를 조사하였고 1x106 인간 ETP-ALL-1 세포를 정맥 내 주사하였다. FACS 분석이 처치 21일 전에 수행되었다. 22일 째에, 마우스는 치료의 첫 번째 용량을 받았다. 수용자 마우스(PBS-EM, n=5)의 한 그룹은 PBS(총 15회 투여량)내 에키노마이신의 3 사이클을 받았다. 각각의 사이클 내에서, 마우스는 PBS 내 에키노마이신을, 총 5회 투여를 매일 한번, 0.1 mg/kg의 용량으로 정맥내 주사로 받았고, 다음 사이클을 시작하기 전에 5일간 쉬었다. 또 다른 수용자(Lipo-EM, n=5) 그룹에서, 마우스는 정맥 내 주사에 의해 리포솜 에키노마이신 0.35 mg/kg를 받았다. 리포솜 에키노마이신은 22일부터 시작한 첫 2회 투여 후 매 4일에 한번씩 투여하였고, 7일간 휴식을 취했다. 그 후 마우스에게 4회 투여를 격일로 주사하였고, 7일간 휴식을 취했고, 격일로 4회 추가 투여량(총 10회 투여량)을 주사하여 완료하였다. 마우스의 추가적 그룹은 리포솜 에키노마이신이 투여된 것과 동일한 계획에 따라 빈 리포솜 운반체(n=5)를 받았다. 마우스의 에키노마이신 치료(34, 50 및 65일) 후 수용자의 PBMC 내 인간 CD45+의 백분율이 FACS 분석에 의해 분석되었다.
도 9. 에키노마이신은 생체 외 살아있는 유방 암 세포의 수를 감소시켰다. HIF-1α의 높은(SUM 159) 또는 낮은(MCF7) 수준을 갖는 유방암 세포가 생체 외에서 다양한 에키노마이신 농도로 처치되었다. 에키노마이신과의 공배양 후 에키노마이신 농도 및 생존 세포의 상대 비율과의 관계를 나타낸다. 높은 HIF-1α를 갖는 SUM 159 세포는 HIF-1α를 적게 발현하는 MCF7보다 에키노마이신에 더 민감하다.
도 10. 이종이식된 유방암 세포 내 에키노마이신의 축적. 인간 유방암 세포계 SUM-159는 루시페라아제(luciferase)로 감염시켰고 암컷 NSG 마우스의 유방의 지방 패드에 동위적으로 이종이식(orthotopically xenografted)하였다. DiR-표지된 리포솜 또는 수중의 유리 DiR은 도면의 하단에 있는 키(key)에 따라 이종이식 마우스에 투여되었다. 생물발광 이미징(Bioluminescence imaging)은 이종이식된 세포(상단 패널) 내의 루시페라아제 발현과 생물발광 이미징(하단 패널)에 의한 리포솜 에키노마이신의 존재를 평가하는데 사용되었다.
도 11. 생체 내 유방암에 대한 리포솜 에키노마이신의 치료 효과. (패널 A) 암컷 NSG 마우스는 인간 SUM159 유방암 세포로 이종이식되었고 유리 에키노마이신 또는 운반체(n=그룹 당 10)로 처치되었다. 마우스는 유리 에키노마이신 또는 운반체 0.1 mg/kg를 총 6회 투여량에 대해 28일에 시작하여 매 3일에 한번 정맥내 주사를 통해 받았다. SUM159의 성장 역학이 표시된다. (패널 B) 암컷 NSG 마우스는 SUM159 유방암 세포로 이종이식되었고 리포솜 에키노마이신 또는 운반체(n=그룹 당 5)로 처치되었다. 운반체 및 리포솜 에키노마이신으로 처치된 수용자 마우스 내의 SUM159의 성장 역학이 나타난다. 마우스는 9, 11, 13, 25 및 27일에 정맥 내 주사에 의해 리포솜 에키노마이신 또는 운반체 0.35mg/kg를 받는다. 평균 종양 부피는 실험을 통해 기록된다. 오차 막대는 ± SEM을 나타낸다. 개별 처치법 및 투여량은 별표로 표시된다. (패널 C) 마우스를 안락사시키고 종양을 해부하고 사진을 찍었다. (패널 D) 운반체 및 리포솜 에키노마이신으로 처치된 마우스로부터의 유방암의 종양 무게 요약. 체중은 평균 체중 ± s.d.로 표시되며, P 값은 t 검사로 계산된다.
발명의 상세한 설명
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 개시된 방법 및 조성물이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원 및 첨부된 청구항에서 사용될 때, 단수 형태 “하나”, “한” 및 “상기” 는 문맥상 명백히 다르게 지시하지 않는 한 복수의 참조를 포함한다는 것을 알아야만 한다. 따라서, 예를 들어, “펩티드”에 대한 언급은 복수개의 이러한 펩티드를 포함하고, “상기 펩티드”에 대한 언급은 하나 이상의 펩티드 및 통상의 기술자에게 공지된 그의 등가물 등등에 대한 언급이다.
본원에서 사용될 때, 용어 “세포 증식성 질환”은 세포의 비정상적 증식을 특징으로 하는 질환을 의미한다. 증식성 질환은 세포 성장 속도에 대한 어떠한 제한도 의미하지 않지만, 성장과 세포 분열에 영향을 미치는 정상 대조군의 손실만을 나타낸다. 따라서, 어떤 구체예에서, 증식성 질환의 세포는 정상 세포처럼 동일한 분열 속도를 가질 수 있으나 그러한 성장을 제한하는 신호에는 반응하지 않는다. “세포 증식성 질환”의 범위 내에서 조직의 비정상적 성장인 신생물 또는 종양이다. “암”은 주변 조직으로 침투 및/또는 새로운 군집 위치로 전이할 수 있는 가능성을 갖는 세포의 증식을 특징으로 하는 다양한 악성 종양 중 임의의 하나를 지칭하며, 백혈병, 림프종, 암종, 흑색종, 육종, 생식세포종양 및 모세포종을 포함한다. 본원의 방법으로 치료하기 위한 예시적인 암은 뇌, 방광, 유방, 자궁경부, 결장, 두부 및 목, 신장, 비-소(non-small)세포 폐, 중피종, 난소, 전립선, 위 및 자궁의 암, 백혈병 및 수모세포종(medulloblastoma)을 포함한다.
용어 “백혈병”은 혈액 생성 기관의 진행성, 악성 질환을 지칭하며 일반적으로 혈액과 골수에서 백혈구와 그 전구체의 왜곡된 증식 및 발달을 특징으로 한다. 예시적인 백혈병은, 예를 들어, 급성 비림프성 백혈병(acute nonlymphocytic leukemia), 만성 림프성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia), 급성 과립구백혈병(acute granulocytic leukemia), 만성 과립구백혈병(chronic granulocytic leukemia), 급성 전골수구성 백혈병(acute promyelocytic leukemia), 성인 T세포 백혈병(adult T-cell leukemia), 무백혈성 백혈병(aleukemic leukemia), 백혈구병성 백혈병(leukocythemic leukemia), 호염기성 백혈병(basophylic leukemia), 모세포 백혈병(blast cell leukemia), 소 백혈병(bovine leukemia), 만성 골수성 백혈병(chronic myelocytic leukemia), 피부 백혈병(leukemia cutis), 배아 세포 백혈병(embryonal leukemia), 호산구성 백혈병(eosinophilic leukemia), 그로스 백혈병(Gross' leukemia), 털세포 백혈병(hairy-cell leukemia), 성혈세포성 백혈병(hemoblastic leukemia), 혈구아세포성 백혈병(hemocytoblastic leukemia), 조직구성 백혈병(histiocytic leukemia), 줄기 세포 백혈병(stem cell leukemia), 급성 단핵구성 백혈병(acute monocytic leukemia), 백혈구 감소 백혈병(leukopenic leukemia), 림프구성 백혈병(lymphatic leukemia), 림프모구 백혈병(lymphoblastic leukemia), 림프성 백혈병(lymphocytic leukemia), 림프형성 백혈병(lymphogenous leukemia), 림프구성 백혈병(lymphoid leukemia), 림프육종세포백혈병(lymphosarcoma cell leukemia), 비만세포 백혈병(mast cell leukemia), 거핵구성 백혈병(megakaryocytic leukemia), 소골수아구성 백혈병(micromyeloblastic leukemia), 단핵구 백혈병(monocytic leukemia), 골수모구 백혈병(myeloblastic leukemia), 골수세포 백혈병(myelocytic leukemia), 골수성 백혈병(myeloid granulocytic leukemia), 골수단핵구 백혈병(myelomonocytic leukemia), 네겔리 백혈병(Naegeli leukemia), 형질세포성 백혈병(plasma cell leukemia), 형질구성 백혈병(plasmacytic leukemia), 전골수구 백혈병(promyelocytic leukemia), 리이더세포성 백혈병(Rieder cell leukemia), 실링 백혈병(Schilling’s leukemia), 줄기 세포 백혈병(stem cell leukemia), 아백혈성 백혈병(subleukemic leukemia), 및 미분화세포 백혈병(undifferentiated cell leukemia)를 포함한다.
용어 “암종”은 주변 조직에 침투하고 전이를 일으키는 경향이 있는 상피 세포의 악성 성장을 나타낸다. 예시적은 암종은, 예를 들어, 소엽암종(acinar carcinoma), 포도상 암종(acinous carcinoma), 선낭암종(adenocystic carcinoma), 선낭암종(adenoid cystic carcinoma), 선암종(carcinoma adenomatosum), 부신피질 암종(carcinoma of adrenal cortex), 폐포암(alveolar carcinoma), 폐포상피암(alveolar cell carcinoma), 기저세포암(basal cell carcinoma), 기저세포암종(carcinoma basocellulare), 기저 암종(basaloid carcinoma), 기저편평세포암종(basosquamous cell carcinoma), 세기관지폐포 암종(bronchioalveolar carcinoma), 세기관지성 암종(bronchiolar carcinoma), 기관지유래 암종(bronchogenic carcinoma), 대뇌양 암종(cerebriform carcinoma), 담관세포암(cholangiocellular carcinoma), 융모암(chorionic carcinoma), 콜로이드암(colloid carcinoma), 면포암종(comedo carcinoma), 자궁체부암종(corpus carcinoma), 소공질 암종(cribriform carcinoma), 흉부 갑옷 암종(carcinoma en cuirasse), 내피종 암종(carcinoma cutaneum), 원통형 암종(cylindrical carcinoma), 원통형 세포 암종(cylindrical cell carcinoma), 관 암종(duct carcinoma), 경성 암종(carcinoma durum), 배아 암종(embryonal carcinoma), 대뇌 수질성 암종(encephaloid carcinoma), 에피에노이드 암종(epiennoid carcinoma), 선양상피 암종(carcinoma epitheliale adenoides), 외장성 암종(exophytic carcinoma), 궤양외 암종(carcinoma ex ulcere), 섬유구조 암종 (carcinoma fibrosum), 젤라틴형 암종(gelatiniform carcinoma), 젤라틴 암종(gelatinous carcinoma), 거대 세포 암종(giant cell carcinoma), 거대 세포 암종(carcinoma gigantocellulare), 선암종(glandular carcinoma), 과립 세포 암종(granulosa cell carcinoma), 모기질(毛基質)암종(hair-matrix carcinoma), 혈액모양 암종(haematoid carcinoma), 간세포 암종(hepatocellular carcinoma), 허틀세포 암종(Hurthle cell carcinoma), 유리질 암종(hyaline carcinoma), 부신모양 암종(hypemephroid carcinoma), 영아 배아세포성 암종(infantile embryonal carcinoma), 상피내 암종(carcinoma in situ), 표피내 암종(intraepidermal carcinoma), 상피내 암종(intraepithelial carcinoma), 크로라피처 암종(Krorapecher’s carcinoma), 쿨치츠키세포 암종(Kulchitzky-cell carcinoma), 대세포 암종(large-cell carcinoma), 수정체 암종(lenticular carcinoma), 수정체성 암종(carcinoma lenticulare), 지방종성 암종(lipomatous carcinoma), 림프상피성 암종(lymphoepithelial carcinoma), 수질 암종(carcinoma medullare), 수질성 암종(medullary carcinoma), 멜라닌 암종(melanotic carcinoma), 연성 암종(carcinoma molle), 뮤신 암종(mucinous carcinoma), 뮤시파룸 암종(carcinoma muciparum), 점액 세포 암종(carcinoma mucocellulare), 점액 표피 모양 암종(mucoepidermoid carcinoma), 점막층 암종(carcinoma mucosum), 점액성 암종(mucous carcinoma), 점액종성 암종(carcinoma myxomatodes), 비인두(鼻咽頭)암종(naspharyngeal carcinoma), 귀리 세포 암종(oat cell carcinoma), 골화성(骨化性)암종(carcinoma ossificans), 뼈모양 암종(osteoid carcinoma), 유두상 암종(papillary carcinoma), 문맥주위 암종(periportal carcinoma), 침투전 암종(preinvasive carcinoma), 가시세포 암종(prickle cell carcinoma), 펄프형 암종(pultaceous carcinoma), 신장 세포 암종(renal cell carcinoma of kidney), 예비 세포 암종(reserve cell carcinoma), 육종성 암종(carcinoma sarcomatodes), 슈나이더 암종(schneiderian carcinoma), 경화 암종(scirrhous carcinoma), 음낭 암종(carcinoma scroti), 반지 세포 암종(signet-ring cell carcioma), 단순 암종(carcinoma simplex), 소세포 암종(small-cell carcinoma), 감자 모양 암종(solanoid carcinoma), 구형 세포 암종(spheroidal cell carcinoma), 방추 세포 암종(spindle cell carcinoma), 해면체모양 암종(carcinoma spongiosum), 편평 암종(squamous carcinoma), 편평 세포 암종(squamous cell carcinoma), 현 암종(string carcinoma), 모세혈관확장성 암종(carcinoma telangiectaticum), 모세혈관확장 암종(carcinoma telangiectodes), 이행 세포 암종(transitional cell carcinoma), 결절성 암종(arcinoma tuberosum), 결절 암종(tuberous carcinoma), 사마귀모양 암종(verrucous carcinoma)및 융모 암종(carcinoma villosum)이 포함된다.
용어 "육종(sarcoma)"은 일반적으로 배아 결합 조직과 같은 물질로 이루어지는 종양을 지칭하며, 일반적으로 섬유질 또는 균질한 물질을 조밀하게 채우고 있는 세포로 이루어진다. 예시적인 육종은, 예를 들어, 연골육종(chondrosarcoma), 섬유육종(fibrosarcoma), 림프육종(lymphosarcoma), 멜라닌육종(melanosarcoma), 점액육종(myxosarcoma), 골육종(osteosarcoma), 아베메시 육종(Abemethy’s sarcoma), 지방 육종(adipose sarcoma), 지질육종(liposarcoma), 폐포 연부(軟部)육종(alveolar soft part sarcoma), 에나멜모세포 육종(ameloblastic sarcoma), 포도 육종(botryoid sarcoma), 녹색 육종(chloroma sarcoma), 융모막 암종(chorio carcinoma), 배아세포성 육종(embryonal sarcoma), 윌름 종양 육종(Wilns' tumor sarcoma), 자궁내막 육종(endometrial sarcoma), 기질 육종(stromal sarcoma), 유잉 육종(Ewing’s sarcoma), 근막 육종(fascial sarcoma), 섬유모세포 육종(fibroblastic sarcoma), 거대 세포 육종(giant cell sarcoma), 과립구성 육종(granulocytic sarcoma), 호지킨 육종(Hodgkin’s sarcoma), 특발성 다색소출혈 육종(idiopathic multiple pigmented hemorrhagic sarcoma), B 세포의 면역모세포 육종(immunoblastic sarcoma of B cells), 림프종(lymphomas)(예를 들어, 비(非)-호지킨 림프종(Non-Hodgkin Lymphoma)), T-세포의 면역모세포 육종(immunoblastic sarcoma of T-cells), 옌센 육종(Jensen’s sarcoma), 카포시 육종(Kaposi’s sarcoma), 쿠퍼 세포 육종(Kupffer cell sarcoma), 혈관육종(angiosarcoma), 백색육종(leukosarcoma), 악성 간엽세포 육종(malignant mesenchymoma sarcoma), 방골성(傍骨性)육종(parosteal sarcoma), 그물적 혈구성 육종(reticulocytic sarcoma), 루스 육종(Rous sarcoma), 혈청세포 육종(serocystic sarcoma), 윤활막 육종(synovial sarcoma)및 모세혈관확장 육종(telangiectaltic sarcoma)이 포함된다.
용어 "흑색종(melanoma)"은 피부 및 기타 기관의 멜라닌세포계로부터 유발되는 종양을 지칭한다. 흑색종은, 예를 들어, 말단 흑자성 흑색종(acral-lentiginous melanoma), 멜라닌 결핍 흑색종(amelanotic melanoma), 양성 연소성(良性 年少性) 흑색종(benign juvenile melanoma), 클라우드맨 흑색종(Cloudman’s melanoma), S91 흑색종(S91 melanoma), 하딩-패시 흑색종(Harding-Passey melanoma), 연소성(年少性)흑색종(juvenile melanoma), 악성 흑점 흑색종(lentigo maligna melanoma), 악성 흑색종(malignant melanoma), 손발톱밑 흑색종(nodular melanoma subungual melanoma)및 표층 확산성 흑색종(superficial spreading melanoma)이 포함된다.
추가적인 암은, 예를 들어, 호지킨병(Hodgkin’s Disease), 다발골수종(multiple myeloma), 신경모세포종(neuroblastoma), 유방암(breast cancer), 난소암(ovarian cancer), 폐암(lung cancer), 가로무늬근육종(rhabdomyosarcoma), 원발 혈소판 증가증(primary thrombocytosis), 원발 거대글로불린혈증(primary macroglobulinemia), 작은 세포 폐종양(small-cell lung tumors), 원발 뇌종양(primary brain tumor), 위암, 결장암(colon cancer), 악성 이자 인슐린종(malignant pancreatic insulanoma), 악성 카르시노이드(malignant carcinoid), 악성 피부병변(premalignant skin lesions), 고환암(testicular cance), 갑상선암(thyroid cancer), 신경모세포종(neuroblastoma,), 식도암(esophageal cancer), 비뇨생식관암(genitourinary tract cancer), 악성 고칼슘혈증(malignant hypercalcemia), 자궁경부암(cervical cancer), 자궁내막암(endometrial cancer), 부신피질암(adrenal cortical cancer)이 포함된다.
본원에서 사용될 때, 용어 “자가면역질환(autoimmnune disease)”은 개체의 면역 시스템(예: 활성화된 T 세포)이 개체 스스로의 조직과 세포를 공격하는 상태를 지칭한다. 용어 “동종면역반응(alloimmune response)”은 개체의 면역 시스템이 (그래프트 또는 이식에서와 같은) 이식된 조직 또는 세포를 공격하는 조건을 지칭한다.
본 발명의 방법에 따른 치료를 위한 예시적인 자가면역질환은 관절염(arthritis), 알로페시아 그레아타(alopecia greata), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 자가면역 용혈성 빈혈(autoimmune hemolytic anemia), 자가면역 간염(autoimmune hepatitis), 베체트병(Behcet’s disease), 크론병(Crohn’s disease), 피부근염(dermatomyositis), 당뇨병(유형 I), 사구체 신염(glomerulonephritis), 그레이브스 질환(Grave’s disease), 귈레인-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 염증성장질환(inflammatory bowel disorder(IBD)), 홍반성 신염(lupus nephritis), 다발성경화증(multiple sclerosis), 중증근무력증(myasthenia gravis), 심근염(myocarditis), 수포창(pemphigus)/유사천포창(pemphigoid), 악성 빈혈(pernicious anemia), 결절성 다발동맥염(polyarteritis nodosa), 다발성 근염(polymyositis), 일차성 담즙성 간경화증(primary biliary cirrhosis), 건선(psoriasis), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 류마티즘 열(rheumatic fever), 사르코이드증(sarcoidosis), 피부경화증(scleroderma), 쇼그렌 증후근(Sjogren’s syndrome), 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus(SLE)), 갑상선염(하시모토 갑상선염(Hashimoto’s thyroiditis) 및 오드 갑상선염(Ord’s thyroiditis)과 같은), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), uveitis(포도막염), 백반증(vitiligo) 및 베게너 육아종증(Wegener’s granulomatosis)을 포함한다. 본 발명의 방법에 따른 치료를 위한 예시적인 동종면역반응은 이식편대숙주병(graft-versus-host disease(GVHD)) 및 이식 거부를 포함한다.
본원에서 사용될 때, “치료”는 증식성 질환, 자가면역질환, 또는 동종면역반응의 임의의 개선을 의미한다.
용어 “치료하다” 및 “치료”는 세포 증식성 질환, 자가면역질환 또는 동종면역질환과 연관된 하나 이상의 증상의 개선; 세포 증식성 질환, 자가면역질환 또는 동종면역반응의 하나 이상의 증상 발병의 예방 또는 지연; 및/또는 세포 증식성 질환, 자가면역질환 또는 동종면역반응의 하나 이상의 증상의 중증도 또는 빈도 감소를 지칭한다.
본 문맥에 사용된, 용어 “개선하다", “증가하다” 또는 “감소하다”는 본원에 기재된 치료를 시작하기 전에 동일한 개체의 측정, 또는 본원에 기재된 치료가 없는 대조 개체(또는 다수 대조 개체)에서의 측정과 같은, 기준 측정값에 대해 상대적인 값 또는 파라미터를 나타낸다.
“대조 개체”는 치료받는 개체와 동일한 질병 또는 질환으로 고생하는 개체로서, 치료받는 개체와 거의 동일한 연령의 개체이다(치료받는 개체와 대조 개체의 단계가 비교 가능함을 보장하기 위해). 치료받는 개체(“환자” 또는 “객체”)는 포유 동물 객체, 바람직하게는 태아, 유아, 아동, 청년, 또는 성인과 같은 인간 객체일 수 있다.
마이크로에멀젼 에키노마이신 약물 전달 시스템
본 출원은 HIF-1α or HIF-2α가 상승된 증식성 질환, 자가면역질환, 및 동종면역반응의 치료를 위한 마이크로에멀젼 에키노마이신 약물 전달 시스템을 제공한다. 에멀젼은 둘 이상의 일반적으로 비혼화성(섞을 수 없거나 또는 조합될 수 없는) 액체의 혼합물이다. 상기 마이크로에멀젼 에키노마이신 약물 전달 시스템은 리포솜, 마이셀, 또는 리포솜과 마이셀의 혼합물을 포함할 수 있다. 리포솜은 지질 이중층의 형태로, 소수성 막에 의해 둘러싸인 수용액 중심부를 갖는 구형의 소포이다. 리포솜은 주로 인지질, 특히 포스파티딜콜린으로 종종 구성되나, 지질 이중층 구조와 양립가능하기만 하면 다른 지질을 포함할 수 있다. 일반적인 마이셀(micelle)은 주변 용매와 접촉하는 양친매성 분자의 친수성 “헤드” 영역의 양친매성 분자의 단일층에 의해 형성된 구형 소포이며, 마이셀의 중심에서 소수성 단일-꼬리 영역을 격리시킨다.
본 출원은 에키노마이신 또는 에키노마이신 유사체를 캡슐화하는 리포솜 조성물 및 HIF-1α 또는 HIF-2α가 상승된 증식성 질환, 자가면역질환, 및 동종면역반응의 치료를 위한 그러한 조성물의 사용 방법을 제공한다. 상기 에키노마이신 또는 에키노마이신 유사체 제제는 바람직하게는 마이크로에멀젼 약물-전달 시스템을 사용하여 환자에게 투여된다. 달리 언급하지 않는 한, “에키노마이신 제제”라는 문구는 에키노마이신 또는 에키노마이신 유사체를 포함하는 마이크로에멀젼 제제를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
바람직한 구체예에서, 상기 사용된 마이크로에멀젼 약물-전달 시스템은 리포솜 약물 전달 시스템이다. 다른 구체예에서, 상기 사용된 마이크로에멀젼 약물 전달 시스템은 마이크로입자(또는 마이크로구체), 나노입자(또는 나노 구체), 나노캡슐, 블록 공중합체 마이셀 또는 다른 중합체성 약물 전달 시스템으로 구성된다. 추가의 구체예에서, 상기 사용된 약물 전달 시스템은 중합체 계열의, 하이드로겔, 필름 또는 다른 유형의 중합체성 약물 전달 시스템과 같은 비(非)-마이크로에멀젼 약물 전달 시스템이다. 또 다른 구체 예에서, 상기 에키노마이신 또는 에키노마이신 유사체는 지질-계열의 용매 내에서 비경구적으로 투여된다.
본 발명의 방법은 모든 포유 동물 객체, 특히 인간 환자 내의 증식성 질환, 자가면역질환 및 동종면역반응의 치료에 유용하다. 본원에서 사용될 때, “환자”는 인간 환자이다.
에키노마이신(NSC526417)은 원래 스트렙토마이세스 에키나투스(Streptomyces echinatus)로부터 분리된 퀴녹살린(quinoxaline) 계통의 일원이다. 에키노마이신은 HIF1α의 DNA-결합 활성을 저해하는 작은 분자이다. 에키노마이신은 에탄올, 알칼리, 케톤, 아세트산 및 클로로포름에 녹을 수 있다. 물에는 녹지 않는다. 에키노마이신은 그러므로 친유성이며 일반적으로 지질, 예를 들어 본 발명의 마이크로에멀젼 약물-전달 시스템에 사용되는 많은 지질들과 쉽게 접합한다. 특정 구체예에서, 에키노마이신은 또한 금속 킬레이트로 제제화될 수 있다.
에키노마이신 유사체는 에키노마이신과의 구조적 및 기능적 유사성으로 인해, 에키노마이신의 것과 유사한, HIF-1α 또는 HIF-2α 활성의 감소에 대한 효과를 나타내는 화합물을 포함한다. 예시적인 에키노마이신 유사체는 YK2000 및 YK2005(Kim, J.B. et al., Int. J. Antimicrob. Agents, 2004 Dec; 24(6):613-615); 퀴노마이신 G(Quinomycin G )(ZZhen X. et al., Mar. Drugs, 2015 Nov. 18; 13(11):6947-61); 2QN(Bailly, C. et al., Anticancer Drug. Des., 1999 June; 14(3):291-303); 및 퀴나조마이신(quinazomycin)(Khan, A.W. et al., Indian J. Biochem., 1969 Dec; 6(4):220-1)을 포함한다.
리포솜을 포함하는 마이크로에멀젼 약물 전달 운반체는 증식성 질환 또는 자가면역질환이 있는 세포 내 또는 환자 내, 또는 예를 들어 GVHD 에서 동종면역반응을 나타내는 환자 내에서 에키노마이신 또는 에키노마이신 유사체를 전달하는데 사용될 수 있다. 에키노마이신 또는 에키노마이신 유사체는 생체 외 또는 생채 내 표적 세포에 약물을 전달할 수 있는 임의의 적합한 마이크로에멀젼 약물 전달 운반체 내에 캡슐화될 수 있다.
본원에서 사용될 때, 마이크로에멀젼 약물 전달 운반체는 입자의 크기 범위가 직경이 수 나노미터에서 수 마이크로미터에 이르는 약학적으로 허용가능한 액체 매질 내에 현탁될 수 있는 입자를 포함하는 것이다. 본 출원에 의해 고려되는 마이크로에멀젼 약물 전달 시스템은 생체 내에 투여될 때 마이크로에멀젼 성질을 실질적으로 유지하는 것들을 포함한다. 마이크로에멀젼 약물 전달 시스템은 지질 계열 및 중합체 계열의 입자를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 마이크로에멀젼 약물전달 시스템의 예는 리포솜, 나노입자(또는 나노구체), 나노캡슐, 마이크로입자(마이크로 구체) 및 블록 공중합체 마이셀을 포함한다.
리포솜은 세포막과 많은 유사성을 품고 있으며, 에키노마이신 및 에키노마이신 유사체에 대한 담체로서 본 발명과 관련하여 사용하기 위해 고려된다. 이들은 즉, 수성 공간 내 및 이중층 자체 내로 각각 수용성 및 지용성 물질이 캡슐화될 수 있기 때문에 광범위하게 적합하다. 리포솜의 리포솜 제제는 에키노마이신 또는 이들의 소수성 상에 기초한 그의 유사체의 용해도를 최대화하기 위해 통상의 기술자에 의해 개질될 수 있다.
에키노마이신 또는 에키노마이신 유사체의 전달에 적합한 리포솜은 주로 소포-형성 지질로 구성된 것들을 포함한다. 본 발명에 사용하기 위한 적절한 소포-형성 지질은 수중에서 이중층 소포로 자연적으로 형성될 수 있는 지질을 포함하며, 이는 인지질에 의해 예시된다.
리포솜에 대한 적절한 지질의 선택은 (1) 리포솜 안정성, (2) 상 전이 온도, (3) 전하, (4) 포유 동물에 대한 무독성, (5) 캡슐화 효율, (6) 지질 혼합물 특성의 요인에 의해 지배된다. 본 개시의 이점을 갖는 통상의 기술자는 이들 인자를 최적화 할 수 있는 본 발명에 따른 리포솜을 제형화할 수 있을 것으로 기대한다. 이 유형의 소포-형성 지질은 바람직하게는 2개의 탄화수소 사슬, 통상적으로 아실 사슬, 및 극성 또는 비극성의 헤드 말단을 갖는다. 탄화수소 사슬은 포화되거나 또는 다양한 불포화도를 가질 수 있다. 인지질, 포스포글리세라이드, 당지질, 예컨대 세레브로사이드(cerebrosides) 및 갱글리오사이드(gangliosides), 스핑고리피드(sphingolipds), 에테르 지질, 스테롤, 및 포획된 인지질을 포함하는 다양한 합성 소포-형성 지질 및 천연-발생 소포-형성 지질이 있다.
상기 리포솜은 하나 이상의 중심이 같은 지질 단일층 또는 지질 이중층으로 구성되어 있는 리포솜 껍질을 포함한다. 따라서, 상기 지질 껍질은 단일 지질 이중층(즉, 상기 껍질은 단일 박막일 수 있다) 또는 몇몇의 중심이 같은 지질 이중층(즉, 상기 껍질은 다중 층일 수 있다)으로부터 형성될 수 있다. 상기 지질은 인지질, 토코페롤, 스테로이드, 지방산, 당단백질, 예컨대 알부민, 음이온성 지질 및 양이온성 지질을 포함하는 합성, 반-합성 또는 자연-발생 지질일 수 있다. 상기 지질은 음이온성, 양이온성 또는 양쪽 이온성 친수성 헤드 그룹을 가질 수 있고, 생리학적 pH에서 음이온성, 양이온성 지질 또는 중성일 수 있다.
리포솜 제제는 지질의 혼합물을 포함할 수 있다. 상기 혼합물은 (a) 중성 및/또는 양쪽성 지질의 혼합물; (b) 음이온성 지질의 혼합물; (c) 양이온성 지질의 혼합물; (d) 음이온성 및 양이온성 지질의 혼합물; (e) 중성 또는 양쪽성 지질 및 하나 이상의 음이온성 지질의 혼합물; (f) 중성 또는 양쪽성 지질 및 하나 이상의 양이온성 지질의 혼합물; 또는 (g) 중성 또는 양쪽성 지질, 음이온성 지질, 및 양이온성 지질의 혼합물을 포함할 수 있다. 또한, 만약 불포화 지질이 2개의 꼬리를 갖고, 꼬리 모두가 불포화될 수 있거나, 또는 만약 하나의 포화 꼬리 및 하나의 불포화 꼬리를 가질 수 있다면, 상기 혼합물은 포화 지질, 불포화 지질 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 어떤 구체예에서, 상기 혼합물은 어떠한 불포화 지질도 포함하지 않는다.
일 구체예에서, 상기 지질 제제는 실질적으로 음이온성 지질이 없거나, 실질적으로 양이온성 지질이 없거나, 양쪽 모두 없다. 다른 구체예에서, 상기 지질 제제는 음이온성 지질 또는 양이온성 지질이 없거나, 양쪽 모두 없다. 일 구체예에서, 상기 지질 제제는 중성 지질만을 포함한다. 통상적으로, 중성 지질 성분은 2개의 아실기(즉, 디아실포스파티딜콜린 및 디아실포스파티딜에탄올아민)를 갖는 지질이다. 다양한 사슬 길이 및 포화도를 갖는 다양한 아실 사슬기를 갖는 지질은 상업적으로 입수 가능하거나 잘 알려진 기술에 의해 분리되거나 합성될 수 있다.
예시적인 중성 또는 양쪽성 인지질은 계란 포스파티딜콜린(EPC), 계란 포스파티딜글리세롤(EPG), 계란 포스파티딜이노시톨(EPI), 계란 포스파티딜세린(EPS), 포스파티딜에탄올아민(EPE), 계란 포스파티딜콜린(EPC), 계란 포스파티딜글리세롤(EPG), 계란 포스파티딜이노시톨(EPI), 계란 포스파티딜세린(EPS), 포스파티딜에탄올아민(EPE), 포스파티드 산(EPA), 대두 포스파티딜콜린(SPC), 대두 포스파티딜글리세롤(SPG), 대두 포스파티딜세린(SPS), 대두 포스파티딜이노시톨(SPI), 대두 포스파티딜에탄올아민(SPE), 대두 포스파티드 산(SPA), 수소화된 계란 포스파티딜 콜린(HEPC), 수소화된 계란 포스파티딜글리세롤(HEPG), 수소화된 계란 포스파티딜이노시톨(HEPI), 수소화된 계란 포스파티딜세린(HEPS), 수소화된 포스파티딜에탄올아민(HEPE), 수소화된 포스파티드 산(HEPA), 수소화된 대두 포스파티딜콜린(HSPC), 수소화된 대두 포스파티딜글리세롤(HSPG), 수소화된 대두 포스파티딜세린(HSPS), 수소화된 대두 포스파티딜이노시톨(HSPI), 수소화된 대두 포스파티딜에탄올아민(HSPE), 수소화된 대두 포스파티드 산(HSPA), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 1-팔미토일-2-미리스토일 포스파티딜콜린(PMPC),1-미리스토일-2-팔미토일 포스파티딜콜린(MPPC), 디올레일포스파티딜콜린(DOPC), 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 1-팔미토일-2-스테아로일 포스파티딜콜린(PSPC), 1,2-디아라키도일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DBPC), 1-스테아로일-2-팔미토일 포스파티딜콜린(SPPC), 1,2-디에이코세노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DEPC), 팔미토일올레오일 포스파티딜콜린(POPC), 디라우릴로일포스파티딜콜린(DLPC), 팔미토일스테아로일포스파티딜콜린(PSPC), 리소포스파티딜콜린(LPC), 디리놀레오일포스파티딜콜린(DLPC), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민 (DSPE), 디미리스토일포스파티딜에탄올아민(DMPE), 디팔미토일 포스파티딜에탄올아민(DPPE), 디올레일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜에탄올아민(POPE), 및 팔미토일스테아로일포스파티딜글리세롤(PSPG), 콜레스테롤 및 에르고스테롤과 같은 스테롤; 콜레스테롤 에스터, 세라마이드, 세레브로사이드, 디아실글리세롤, 스핑고신, 뇌 스핑고마이엘린, 계란 스핑고마이엘린, 디팔미토일 스핑고마이엘린 및 디스테아로일 스핑고마이엘린 디하이드로스핑고마이엘린과 같은 스핑고마이엘린; 및 모노-올레오일-포스파티딜에탄올아민(MOPE)을 닮은 것과 같은 단일 아실화 인지질을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
양쪽성 지질은 아실 양쪽성 지질 및 에테르 양쪽성 지질을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 유용한 양쪽성 지질의 예는 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜에탄올아민(DOPE), 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPyPE)및 도데실포스포콜린이다.
예시적인 음이온성 지질은 디헥사데실포스페이트(DhP), 포스파티딜이노시톨, 디미리스토일포스파티딜세린, 디팔미토일포스파티딜세린과 같은 디아실포스파티딜세린을 포함하는 포스파티딜세린; 디미리스토일포스파티딜글리세롤(DMPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 디스테아릴로일포스파티딜글리세롤(DSPG), 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 디라우릴로일포스파티딜글리세롤(DLPG), 디스테아로일포스파티딜글리세롤(DSPG), 및 리실포스파티딜글리세롤(LPG)과 같은 포스파티딜글리세롤; N-도데카노일 포스파티딜 에탄올로아민, N-석시닐 포스파티딜에탄올아민, N-글루타릴 포스파티딜에탄올아민과 같은 포스파티딜에탄올아민; 디미리스토일 포스파티드 산 및 디팔미토일 포스파티드 산과 같은, 디포스파티딜 글리세롤 및 디아실포스파티드산을 포함하는, 포스파티드 산; 카르디올리핀, 및 콜레스테롤 헤미석시네이트(CHEMS)를 포함한다. 양이온성 지질은 통상적으로 스테롤, 아실 또는 디아실 사슬과 같은 친유성 잔기를 가지며, 여기서 지질은 전체적으로 순 양 전하를 갖는다. 바람직하게는, 상기 지질의 헤드 그룹은 양전하를 가진다. 예시적인 양이온성 지질은 TAP 지질, 예를 들어 메틸설페이트 염으로도 지칭되는, N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸 암모늄 염을 포함한다. 적합한 TAP 지질은 DOTAP(디올레오일-), DMTAP(디미리스토일-), DPTAP(디팔미토일-), 및 DSTAP(디스테아로일-)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 다른 적합한 양이온성 지질은 디메틸디옥타데실 암모니아 브로마이드(DDAB), 1,2-디아실옥시-3-트리메틸암모늄 프로판, N-[1-(2,3-디올로일옥시)프로필]-N,N-디메틸 아민(DODAP), 1,2-디아실옥시-3-디메틸암모늄 프로판, N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA), 1,2-디알킬옥시-3-디메틸암모늄 프로판, 디옥타데실아미도글라이실스페르민(DOGS)3-[N-(N',N'-디메틸아미노-에탄)카바모일]콜레스테롤(DC-Chol); 2,3-디올레오일옥시-N-(2-(스페르민카르복사미도)-에틸)-N,N-디메틸-1-프로판아미니움 트리플루오로-아세테이트(DOSPA), .β-알리닐 콜레스테롤, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB), 디C14-아미딘, N-터트-부틸-N'-테트라데실-3-테트라데실아미노프로파이오아미딘, N-(알파-트리메틸암모니오아세틸)디도데실-D-글루타메이트 클로라이드(TMAG), 디테트라데카노일-N-트리메틸암모니오-아세틸)디에탄올아민 클로라이드, 1,3-디올레오일옥시-2-(6-카르복시-스페르밀)-프로필아마이드(DOSPER), 및 N,N,N',N'-(테트라메틸)-, N'-비스(2-하이드록시에틸)-2,3-디올레오일옥시-1,4-부탄디암모늄 아이오다이드, 1-[2-(아실옥시)에틸]2-알킬(알케닐)-3-(2-하이드록시에틸)-이미다올리늄 클로라이드 유도체, 예컨대 1-[2-(9(Z)-옥타데세노일옥시)에틸]-2-(8(Z)-헵타데세닐-3-(2-하이드록시에틸)- 이미다졸리늄 클로라이드(DOTIM)및 1-[2-(헥사데카노일옥시)에틸]-2-펜타데실-3-(2-하이드록시에틸)이미다졸리늄 클로라이드(DPTIM), 및 4차 아민 상에 하이드록시알킬 잔기를 포함하는 2,3-디알킬옥시프로필 4차 암모늄 유도체, 예를 들어, 1,2-디올레오일-3-디메틸- 하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(DORI), 1,2-디올레일옥시프로필-3-디메틸-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(DORIE), 1,2-디올레일옥시프로필-3-디메틸-하이드록시프로필 암모늄 브로마이드(DORIC-HP), 디올레일-옥시-프로필-3-디메틸-하이드록시부틸 암모늄 브로마이드(DORIE-HB), 디올레일옥시프로필-3-디메틸-하이드록시펜틸 암모늄 브로마이드(DORIE-Hpe), 1,2-디미리스틸옥시프로필-3--디메틸-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(DMRIE), 1,2-디팔미토일옥시프로필-3-디메틸-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(DPRIE), 1,2-디스테릴옥시프로필-3-디메틸-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(DMRIE), 1,2-디스테아릴옥시-N.N-디메틸-3-아미노프로판(DSDMA), 1,2-디올레일옥시-N,N디메틸-3-아미노프로판(DODMA), 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판(DLinDMA), 1,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판(DLenDMA)을 포함한다.
통상적으로, 본 출원에 따른 리포솜 제제는 PEG화 리포솜 내의 지질을 하나 이상 포함하며, 즉, 상기 지질은 폴리에틸렌글리콜 잔기를 포함한다. PEG화 지질을 포함하는 리포솜은 그것이 적어도 리포솜의 외부에 존재하도록 PEG가 배향될 것이다(그러나 어떤 PEG는 또한 리포솜의 내부, 즉 수성 중심부에 노출될 수 있다). 상기 배향은 PEG를 지질의 적절한 부분에 부착시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 양친매성 지질 내에서 PEG는 친수성 헤드에 부착될 것인데, 이 헤드는 그 자체가 지질 이중층의 수성과 맞닿는 외면에 배향하기 때문이다. 이러한 방식으로 PEG화는 당업계에 알려진 기술을 사용하여 PEG를 지질에 공유 부착함으로써 달성될 수 있다.
예시적인 PEG화 지질은 DSPE-PEG(1000 MW), DSPE PEG(2000 MW)및 DSPE PEG(5000 MW)를 포함하는 디스테아로일포스파티딜에탄올아민-폴리에틸렌글리콜(DSPE-PEG); DMPE PEG(1000MW), DMPE PEG(2000MW) 및 DMPE PEG(5000MW)를 포함하는 디미리스토일 포스파티딜에탄올아민-폴리에틸렌글리콜(DMPE-PEG); DPGS-PEG(1000 MW), DPGS(2000 MW) 및 DPGS(5000 MW)를 포함하는 디팔미토일글리세로석시네이트 폴리에틸렌글리콜(DPGS-PEG); 스테아릴-폴리에틸렌글리콜, 콜레스테릴-폴리에틸렌글리콜, 및 세라마이드-계열 PEG화 지질 예컨대, N-옥타노일-스핑고신-1-{석시닐[메톡시(폴리에틸렌글리콜)MW]}, 지정된 C8 PEG(MW)세라마이드, 여기서 MW는 750, 2000, or 5000, 또는 N- 팔미토일-스핑고신-1-{석시닐[메톡시(폴리에틸렌글리콜)MW]} 또는 지정된 C16 PEG(MW)세라마이드, 여기서 MW는 750, 2000, 또는 5000을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 추가의 PEG화 지질은 Avanti Polar Lipids, Inc.(Alabaster, AL)로부터 얻어질 수 있다.
본 발명의 리포솜은 통상적으로 동일하거나 상이할 수 있는 다수의 PEG 잔기를 포함할 것이다. 본 발명의 리포솜 내의 PEG의 평균 분자량은 350 Da 이상이지만 5kDa 미만, 예를 들어 0.35-5kDa 사이, 1-3 kDa 사이, 1-2-6 kDa 사이, 2-3 kDa 사이, 또는 4-5 kDa, 또는 바람직하게는 2kDa(PEG 2000)이다. 상기 PEG는 대개 직선형 중합체 사슬을 포함하나, 어떤 구체예에서, 상기 PEG는 분지형 중합체 사슬을 포함할 수 있다.
어떤 구체예에서 상기 PEG는 치환된 PEG, 예를 들어 중합체 내의 하나 이상의 탄소 원자가 하나 이상의 알킬, 알콕시, 아실 또는 아릴기로 치환될 수 있다. 다른 구체예에서 상기 PEG는 공중합체기, 예를 들어 하나 이상의 프로필렌 단량체를 포함하여 PEG 폴리프로필렌 중합체를 형성할 수 있다.
특정 구체예에서, 상기 리포솜은 하나 이상의 PEG화 인지질 및 하나 이상의 추가적인 중성 지질의 혼합물로부터 형성될 수 있다. 상기 PEG화 지방의 몰 백분율은 0.1-20% 사이일 수 있다. 어떤 구체예에서, 상기 PEG화 지방의 몰 백분율은 조성물 내의 총 지질의 1-9% 사이, 2-8% 사이, 및 바람직하게는 5-6% 사이이다.
본원에서 사용될 때, 지질 A,B,C를 함유하는 혼합물 내의 지질 A의 “몰 백분율”은 다음과 같이 정의된다.
Figure pct00001
다른 구체예에서, 상기 리포솜은 PEG화 인지질, 중성 포스포글리세라이드, 예컨대 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜글리세롤, 또는 포스파티딜이노시톨; 및 중성 스테롤, 예컨대 콜레스테롤 또는 에르고스테롤을 포함하는 지질 혼합물로부터 형성된다. 이 구체예에서, 상기 PEG화 인지질의 몰 백분율은 총 지질의 1 내지 10% 또는 3 내지 6%에 이를 수 있다; 중성 포스포글리세라이드의 양(총 지질에 대하여)은 20-60% 또는 30-50% 또는 33-43%에 이를 수 있다; 및 중성 스테롤의 몰비는 35-75% 또는 45-65% 또는 50-60%에 이를 수 있다.
특정 구체예에서, 상기 리포솜은 DSPE- PEG(2000), HSPC, 및 콜레스테롤의 혼합물로부터 형성될 수 있다. 이 구체예에서, DSPE-PEG(2000)의 몰 백분율은 약 5.3%이고, HSPC의 몰 백분율은 약 56.3%이고, 콜레스테롤의 몰 백분율은 약 38.4%이다.
PEG화의 대안으로서, 지질은 PEG와 다른 잔기의 공유 부착에 의해 개질될 수 있다. 예를 들어, 어떤 구체예에서 지질은 폴리포스파젠을 포함할 수 있다. 어떤 구체예에서 지질은 폴리(비닐 피롤리돈)을 포함한다. 어떤 구체예에서 지질은 폴리(아크릴 아마이드)를 포함한다. 어떤 구체예에서 지질은 폴리(2-메틸-2옥사졸린)을 포함한다. 어떤 구체예에서 지질은 폴리(2-에틸-2-옥사졸린)을 포함할 수 있다. 어떤 구체예에서 지질은 포스파티딜 폴리글리세롤을 포함할 수 있다. 어떤 구체예에서 지질은 폴리[N-(2-하이드록실프로필)메타크릴아마이드]를 포함할 수 있다. 어떤 구체예에서 지질은 PEG외에, 폴리알킬렌 에테르 중합체를 포함할 수 있다.
정맥 내 주사된 리포솜의 운명과 배치는 크기, 유동성 및 표면 전하와 같은 그들의 물리적 특성에 의존한다. 그들은 그들의 조성에 따라, 몇 시간 또는 며칠 동안 조직 내에 머물러 있을 수 있고, 혈액 내 반감기는 수분에서 수 시간까지 이른다. 리포솜은 대개 세 그룹으로 나뉘어진다: 다층 소포(Multilamellar Vesicle, MLV); 소단층소포(Small Unilamellar Vesicle, SUV); 및 대단층소포(large unilamellar vesicles, LUV). MLV는 각각의 소포마다 다수의 이중층을 가지며, 몇 개의 분리된 수성 구획을 형성한다. SUV 및 LUV는 수성 핵을 캡슐화하는 단일 이중층을 갖는다. MLV는 통상적으로 0.5 내지 4 μm의 직경을 갖는다. MLV의 음파처리는 중심부 내에 수용액을 포함하는 50-500 nm 범위의 직경을 갖는 대단층소포(large unilamellar vesicles, LUV) 또는 직경이 50nm이하, 통상적으로 200 내지 500 Å 내인 소단층소포(Small Unilamellar Vesicle, SUV)의 형성을 초래한다.
MLV 및 LUV와 같은 더 큰 리포솜은 세망내피계(reticuloendothelial system)의 식세포에 의해 빠르게 흡수될 수 있으나, 순환계의 생리학은 대부분의 자리에서 그러한 큰 종의 배출을 억제한다. 간이나 비장의 동양혈관(sinusoid)과 같은, 모세혈관 내피 내에 큰 구멍이나 구멍이 존재하는 장소 내에서만 출구를 열 수 있다. 따라서, 이러한 기관들은 흡수의 주된 자리이다. 반면, SUV는 더 넓은 조직 분포를 나타내지만 간과 비장 내에서 여전히 매우 격리되어 있다. 일반적으로, 이러한 생체 내 행동은 그들의 큰 크기로 접근할 수 있는 장기 및 조직으로만 리포솜의 잠재적 표적을 제한한다. 이는 혈액, 간, 비장, 골수 및 림프계 기관을 포함한다.
본 출원의 리포솜은 바람직하게는 60-180 nm, 80-160 nm 또는 90-120 nm의 범위 내의 직경을 갖는 SUV이다. 본 출원의 리포솜은 복수개의 리포솜을 포함하는 리포솜 제제의 일부일 수 있으며 여기서 상기 복수개 내의 리포솜은 다양한 직경을 가질 수 있다. 어떤 구체예에서, 리포솜 제제는 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상의 리포솜을 포함하며 리포솜은 60-180 nm, 80-160 nm 또는 90-120 nm의 범위 내의 평균 직경을 갖는다. 또한, 복수개 내의 상기 직경은 0.2 미만, 0.1 미만 또는 0.05 미만의 다분산지수를 가질 수 있고, 상기 리포솜의 평균 직경은 멜버른 제타사이저 방법을 사용하여 결정된다.
리포솜의 순환 시간을 증가시키는 한 방법은 친수성 중합체 사슬 또는 폴리알킬에테르, 예컨대 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 유도된 리포솜을 사용하는 것이다(예를 들어 미국 특허 제 5,013,556, 5,213,804, 5,225,212 및 5,395,619 호 참조). 중합체 코팅은 대식세포에 의한 리포솜의 흡수 속도를 감소시키고 이에 따라 혈류에서 리포솜의 존재를 연장시킨다. 이것은 또한 리포솜에 의해 운반되는 약물에 대한 장기간의 방출 메커니즘으로 사용될 수 있다. 따라서, 본 출원에 따른 리포솜 에키노마이신 제제는 바람직하게는 하나 이상의 PEG화 지질이다.
통상의 기술자는 특정 정도의 유동성 또는 강도를 달성하는 소포-형성 지질을 선택할 수 있다. 상기 리포솜의 유동성 또는 강도는 혈청 내 리포솜의 안정성 또는 리포솜 내 포획된 약물의 방출 속도와 같은 인자를 제어하는데 사용될 수 있다. 더 단단한 지질 이중층 또는 액정 이중층을 갖는 리포솜은 비교적 단단한 지질의 혼합에 의해 달성된다. 지질 이중층의 강도는 이중층에 존재하는 지질의 상전이 온도와 관련된다. 상전이 온도는 지질이 물리적 상태를 변화시키고 규칙적인 겔 상태에서 무질서한 액정 상으로 이동하는 온도이다. 지질의 탄화수소 사슬 길이 및 불포화도, 전하 및 헤드 그룹 종을 포함하는 몇 가지 요인은 지질의 상전이 온도에 영향을 미친다. 상대적으로 높은 상전이 온도를 갖는 지질은 더 단단한 이중층을 생성할 것이다. 콜레스테롤과 같은 다른 지질 성분은 또한 지질 이중층 구조의 막 강도에 기여하는 것으로 알려져 있다. 콜레스테롤은 지질 이중층의 유동성, 탄성 및 투과도를 조작하는데 사용될 수 있다. 이는 지질 이중층의 틈을 채움으로써 기능하는 것으로 생각된다. 대조적으로, 지질 유동성은 상대적으로 유동적인 지질, 통상적으로 낮은 상전이 온도를 갖는 지질의 혼합에 의해 달성된다. 많은 지질의 상전이 온도는 마틴 카프리(Martin carffrey), CRC Press에 의한 Avanti Polar Lipids catalogue 와 Lipidat과 같은 다양한 출처에서 표로 작성되었다.
인지질은 다양한 지질과 물의 몰비에 따라 물에 분산될 때 리포솜 이외의 다양한 구조를 형성할 수 있다. 낮은 비율 리포솜이 바람직한 구조이다. 상기 리포솜의 물리적 특성은 pH, 이온 강도, 및 2가 양이온의 존재에 의존한다. 리포솜은 이온성 및 극성 물질에 대한 낮은 투과성을 나타낼 수 있지만, 고온에서 이들의 투과성을 현저하게 변화시키는 상전이를 겪는다. 상전이는 겔 상태로 알려진 밀집되고 정렬된 구조에서 유동 상태로 알려진 느슨하게 밀집되고 덜 정렬된 구조로의 변화를 포함한다. 이는 특유의 상-전이 온도에서 발생하며 이온, 당류 및 약물에 대한 투과성을 증가시킨다.
본 출원의 리포솜은 선택된 크기 범위 내에서 실질적으로 균일한 크기를 갖도록 제조될 수 있다. REV 및 MLV에 대한 하나의 효과적인 사이징(sizing) 방법은 0.03 내지 0.2 마이크론, 통상적으로 0.05, 0.08, 0.1, 또는 0.2 마이크론의 범위 내에서 선택된 균일한 공극 크기를 갖는 일련의 폴리카보네이트 막을 통해 리포솜의 수성 현탁액을 압출시키는 것을 포함한다. 막의 공극 크기는 막을 통과하는 압출에 의해, 특히 제제가 동일한 막을 통해 2회 이상 압출되는 경우 생성된 리포솜의 가장 큰 크기와 대략적으로 일치한다. 균질화 방법은 또한 리포솜을 100 nm 이하의 크기로 소형화하는데 유용하다(Martin, F. J., in Specialized Drug Delivery Systems-Manufacturing and Production Technology,(P. Tyle, Ed.) Marcel Dekker, New York, pp. 267-316(1990)). 균질화는 큰 리포솜을 작은 것들로 파편화하는 전단 에너지에 의존한다. 리포솜을 소형화하는 다른 적합한 방법은 디옥시콜레이트와 같은 적합한 가용화 세제의 존재 하에 리포솜의 격렬한 교반에 의해 리포솜 크기를 감소시키는 것을 포함한다.
약 0.2-0.4 마이크론의 범위 크기인 리포솜은 고처리량 기준으로 통상적으로 0.22 마이크론 필터인 종래의 살균 필터를 통해 리포솜을 여과시킴으로써 멸균될 수 있다. 다른 적절한 멸균 방법은 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
지질의 무독성은 또한 본 출원에서 중요한 고려사항이다. 임상 적용에서 사용이 승인된 지질은 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 합성 지질은 원천 생물체로부터의 바이러스 또는 단백질 오염의 감소된 위험으로 인해 생물학적 원천으로부터 유래된 지질보다 바람직할 수 있다.
리포솜을 형성하는 본래의 방법은 먼저 유기 용매 내에 현탁 인지질을 포함시킨 후 건조 지질 케이크 또는 필름이 형성될 때까지 증발하여 건조시키는 것이다. 적절한 양의 수성 매질이 첨가되고 상기 지질은 자발적으로 다층 동심 이중층 소포(multilamellar concentric bilayer vesicles)(또한 다층 소포(multilamellar vesicles, MLV)로도 불리는)을 형성한다. 이러한 MLV는 그 후 기계적 수단에 의해 분산되고 크기가 축소될 수 있다.
에키노마이신의 수불용성 본질에도 불구하고, 본 출원의 발명자들은 에탄올과 같은 극성 용매 내에 에키노마이신과 지질을 혼합하고, 이러한 성분들을 건조시킴으로써 필름을 형성한 후 수성 매질 내에 리포솜을 분산시킴으로써 안정한 리포솜을 형성할 수 있음을 발견하였다. 따라서 일 구체예에서, 에키노마이신 및 지질이 유기 용매 내에 완전히 혼합된 후, 용매는 예를 들어 회전식 증발기를 사용하여 제거되어, 그에 따라 건조 지질 필름이 된다. 상기 건조 지질 필름은 적합한 완충제(예를 들어, PBS, pH 7.4)에 수화되고 용해되어 그에 따라 지질 현탁액을 얻는다. 상기 지질 현탁액은 Avanti 소형-압출기를 사용하여 폴리카보네이트 필터를 통해 반복적으로 압출되어 원하는 크기 범위의 리포솜을 얻는다. 그 후, 리포솜은 여과(0.45- 또는 0.2-μm 멸균 필터)에 의해 멸균된다. 수용성 에키노마이신 유사체는 수용성 에키노마이신 유사체를 함유하는 수용액과 함께 지질 필름으로 수화됨으로써 수동적으로 포획될 수 있다.
에키노마이신은 지질 이중층 내에, 지질 이중층 내의 두 리플릿( leaflet), 내부 중심 공간 내에, 이중층의 어느 한 면 위에, 리포솜의 PEG 잔기 내에 또는 위에, 또는 이들의 조합에 존재할 수 있다. 대단층소포(LUV)를 생성하기 위한 대안의 방법은 예를 들어 미국 특허 제 4,235,871 호에 기재된 역상(reverse-phase) 증발 공정이다. 이 과정은 역상 증발 소포(reverse-phase evaporation vesicles, REV)을 생성하는데, 이는 대부분 단일층이지만 또한 통상적으로 일부 올리고층(oligolamellar) 소포를 포함한다. 이 과정에서, 유기 용매 내의 극성 지질의 혼합물을 적절한 수성 매질과 혼합한다. 균일한 유중수 형태의 에멀젼이 형성되고 겔이 형성될 때까지 유기 용매가 증발된다. 그 후 상기 겔은 수성 매질 내의 겔-유사 혼합물을 분산시킴으로써 현탁액으로 전환된다.
대안적인 구체예에서, 에키노마이신 또는 에키노마이신 유사체는 리포솜 이중층의 표면에 접합될 수 있다. 일 구체예에서, 에키노마이신은 아마이드 결합에 의해 리포솜에 공유적으로 부착될 수 있다. 예를 들어, 하이드록실 작용기를 갖는 인지질은 에키노마이신 또는 그 유사체의 하나에 존재하는 아민 그룹의 하나에 접합될 수 있다.
본 발명에 따른 리포솜 제제는 실온 또는 냉장 온도(예를 들어 4℃)에서 3개월 이상, 6개월 이상, 12개월 이상, 24개월 이상 또는 48개월 이상의 저장 수명을 달성하기에 충분한 장기 안정성을 가질 것이다.
어떤 대안적인 구체예에서, 상기 에키노마이신 또는 에키노마이신 유사체는 지질 계열이 아닌 사실상 중합체성인 보호벽 물질 내에 캡슐화 될 수 있다. 생물 활성제를 캡슐화하는 데에 사용되는 중합체는 통상적으로 단일 공중합체 또는 단일중합체(homopolymer)이다. 중합체성 약물 전달 시스템은 사실상 마이크로에멀젼 또는 비(非)-마이크로에멀젼일 수 있다.
마이크로에멀젼 중합체성 캡슐화 구조는 마이크로입자, 마이크로캡슐, 마이크로구체, 나노입자, 나노캡슐, 나노구체, 블록 공중합체 마이셀 등을 포함한다. 인간에 의해 만들어진 합성 고분자, 및 단백질 및 다당류를 포함하는 생체 고분자 모두 본 발명에 사용될 수 있다. 상기 중합체성 약물 전달 시스템은 생물학적으로 분해될 수 있거나, 생물학적으로 분해될 수 없는 고분자 재료, 또는 이들의 임의의 조합으로 구성될 수 있다.
본원에서 사용될 때, “마이크로에멀젼”은 약 10 nm 내지 500 ㎛의 직경을 갖는 규칙적인 또는 반-규칙적인 형상을 갖는 마이크로구체를 포함하는 에멀젼을 지칭한다. 본 출원의 마이크로에멀젼은 20-400 nm, 30-300 nm, 50-200 nm, 60-150 nm 또는 80-120 nm 의 범위 내의 직경을 갖는 리포솜을 함유한다.
어떤 구체예에서, 본 출원의 상기 마이크로에멀젼은 단일 층의 양친매성 분자로 구성된 껍질을 갖는 마이셀을 포함한다. 마이셀의 내부 중심은 비극성 약물에 대해 소수성 미세 환경(microenvironment)을 생성하는 반면, 친수성 껍질은 마이셀 중심과 수성 매질 사이의 안정화 계면을 제공한다. 친수성 껍질의 특성은 생체 양립가능성을 최대화하고 세망내피계 흡수 및 신장 여과를 피하도록 조정될 수 있다. 마이셀의 크기는 보통 10 nm에서 100 nm 사이이다.
필름, 하이드로겔 및 “데포(depot)” 유형 약물 전달 시스템을 포함하는 비(非)-마이크로에멀젼 중합체성 약물-전달 시스템은 또한 본 발명에서 고려된다. 이러한 비(非)-마이크로에멀젼 중합체성 시스템은 비경구 투여, 특히 비(非)-마이크로에멀젼 약물 전달 시스템이 표적 암 조직에 근접한 곳에 놓여지는 경우와 함께 본 발명에서 또한 사용될 수 있다. 본원에서 사용될 때, “하이드로겔”은 때때로 졸(sol)로 지칭되는 중합체의 용액을 의미하며, 작은 이온들 또는 반대 전하의 중합체에 의해 또는 화학적 가교결합에 의해 겔 상태로 전환된다. “중합체 필름”은 일반적으로 약 0.5 내지 5 mm 두께의 중합체-계열 필름을 지칭하며 때때로 코팅으로서 사용된다.
특정 구체예에서 상기 리포솜, 마이크로입자, 나노입자, 마이크로캡슐, 블록 공중합체 마이셀 또는 에키노마이신 또는 에키노마이신 유사체를 포함하는 다른 중합체성 약물 전달 운반체는 세포 특이적 표적화 리간드로 코팅되거나, 접합되거나, 개질될 수 있다. 세포-표적화 리간드에 전달 운반체를 연결시킴으로써, 에키노마이신의 전달은 세포-표적화 리간드 또는 표적화 리간드에 결합하는 표적 세포 집단으로 유도될 수 있다. 본원에서 사용될 때, “표적화 리간드”는 리포솜이 비-표적 조직에 비해 표적 세포-유형과 강화된 정도로 접합되도록 야기하는 임의의 리간드를 포함한다.
항체 또는 항체 단편과 같은 표적화 리간드는 리포솜 표면에 결합되고 특정 세포 유형 표면에 위치한 특이적 항원 수용체에 항체 및 그의 약물 내용물을 유도하는데 사용될 수 있다(Mastrobattista et al., 1999를 참조하라). 탄수화물 결정인자(determinant)(세포-세포 인식, 상호 작용 및 접착 역할을 하는 당단백질, 렉틴 및 당지질 세포 표면 구성요소)는 리포솜을 특정 세포 유형으로 유도할 잠재력이 있는 것으로서 표적화 리간드로서 사용될 수도 있다. 특정 단백질은 보통 표적 조직의 자가-표면 수용체에 의해 인식되는 표적화 리간드로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 특정 암 세포 내에 과발현되는 세포 표면 수용체에 결합하는 리간드는 표적 조직에 의한 리포솜 흡수를 증가시키는데 사용될 수 있다. 세포 내 흡수된(endocytosed) 세포 표면 수용체는 특정 구체예에서 선호될 것이다. PEG화 리포솜과 결합될 때, 상기 표적화 리간드는 종종 수성 매질에 노출된 친수성 중합체의 말단에 부착된다. 대안적으로, 리포솜은 세포막을 갖는 리포솜의 융합을 유발하는 융합 단백질, 예를 들어 바이러스로부터 유래된 융합 단백질을 포함할 수 있다.
특정 구체예에서, 상기 표적화 리간드는 상기 표적 세포에 의해 세포내 흡수되는 세포 표면 수용체이다. 본 발명에서 사용하기 위한 적절한 표적화 리간드는 비-표적 세포를 통해 표적 세포의 세포 표면과 리포솜의 증가된 결합 또는 접합을 야기하는 임의의 리간드를 포함한다. 표적화 리간드는 작은 분자, 펩티드, 리간드, 항체 단편, 앱타머(aptamer)또는 합성체(synbody)일 수 있다. 합성체는 표적 단백질과의 결합을 위해 스크리닝된 임의의 펩티드 끈으로 구성된 라이브러리로부터 생성된 합성 항체이며 US 제2011/0143953호에 기재되어 있다. 앱타머는 다양한 종류의 세포 표면 분자, 단백질 및/또는 거대 분자 구조에 높은 친화성 결합을 나타내는 특이적 3차원 구조를 형성할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 부류를 포함하는 항체의 핵산 버전이다. 예시적인 세포 표적화 리간드는 하기에 추가적으로 기재된 것처럼 표피 수상 세포(epidermal dendritic cells)에 결합하는 작은 분자(예를 들어, 엽산, 아데노신, 퓨린) 및 큰 분자(예를 들어, 단백질 또는 항체)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
예시적인 항체 또는 항체 유도 단편은 IgG, 항체 가변 영역; 격리된 CDR 영역; 항원 결합 자리를 형성하기 위해 두 도메인 사이 결합을 가능하게 하는 펩티드 링커에 의해 연결된 VH 및 VL 도메인을 포함하는 단일 사슬 Fv 분자(scFv); 이중 특이성 scFV 이량체; CH3 도메인에 결합된 scFv를 포함하는 소형체; 디아바디(diabody, dAb) 단편; VH 또는 VL 도메인으로 이루어진 단일 사슬 dAb 단편; VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fab 단편; Fab 단편으로부터, 항체 경첩 영역으로부터의 하나 이상의 시스템을 포함하는, 중쇄 CH1 도메인의 카르복실 말단에서의 약간의 잔기의 첨가에 의한 차이를 보이는 Fab` 단편; Fab` 단편의 불변 도메인의 시스테인 잔기가 유리 티올 그룹을 갖는 Fab`-SH 단편; 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편, F(ab`)2; VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; 이들의 유도체; 및 항원-결합 기능을 보유하는 임의의 다른 항체 단편으로 이루어진 그룹의 임의의 일원을 포함할 수 있다. Fv, scFv 또는 디아바디 분자는 VH 및 VL 도메인을 연결하는 디설파이드 브릿지(disulphide bridges) 연결의 혼입에 의해 안정화될 수 있다. 항체-유래 단편을 사용할 때, 그 안의 임의의 또는 모든 표적 도메인 및/또는 Fc 영역을 당업계의 숙련자들에게 널리 알려진 방법론을 사용하여 “인간화”시킬 수 있다. 어떤 구체예에서, 상기 항체는 Fc 영역이 제거되도록 개질될 수 있다.
항체-에키노마이신 약물 접합체
다른 측면에서, 에키노마이신 또는 그의 유사체의 하나는 앞에서 기술한 항암 항체와 같은, 세포 결합제 또는 항체에 결합될 수 있다. 본원에서 사용될 때, 문구 “항체 접합체” 또는 “항체 약물 접합체(ADC)”는 링커(linker) 또는 이관능성 가교제를 통해 에키노마이신 또는 그의 유사체에 접합된 항체를 지칭한다. 에키노마이신/에키노마이신 유사체-항체 접합체의 사용은 종양-관련 항원에 대한 단일클론 항체의 높은 특이성을 에키노마이신 또는 그 유사체의 약리학적 효능과 결합한다. ADCs의 예는 겜투주마브 오조가마이신(gemtuzumab ozogamicin),(마일로타그, 칼리케아미신(calicheamycin)에 접합된 항-CD33 mAb, Pfizer/Wyeth); 브렌툭시맙 베도틴(brentuximab vedotin)(SGN-35, 애드세트리스(Adcetris), 브렌툭시맙으로 이루어지는 CD30-표적 ADC, MMAE(모노메틸아우리스타틴, monomethylauristatin)에 공유적으로 연결된, 시애틀 제네틱스); 및 트라스투주맙-DM1 접합체(T-DM1)를 포함한다.
다수의 링커 기술이 미국 특허 제 9,090,629호에 기재된 바와 같이 항체-약물 접합체의 제조를 위해 사용되어 왔다. 여기에 기재된 방법 및 시약 중 어느 하나가 본 출원의 항체-에키노마이신 접합체의 제조에 사용될 수 있다. 본원에서 사용될 때, “이관능성 가교제”는 2개의 반응성 기를 소유하는 시약을 지칭한다. 그 중 하나는 세포-결합제 또는 항체와 반응할 수 있고, 다른 하나는 세포-결합제 또는 에키노마이신을 갖는 항체를 연결시키기 위해 에키노마이신을 반응시킬 수 있어, 그에 따라 접합체를 형성할 수 있다.
링커 시약이 과도한 독성 없이, 각자, 치료 활성, 예를 들어 HIF-1α 억제 및 항체의 표적 특징의 보유를 제공하는 한, 임의의 적합한 이관능성 가교제는 본원과 관련하여 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 링커 분자는 에키노마이신 및/또는 에키노마이신 유사체와 세포-결합제 또는 항체를 화학결합을 통하여 결합시켜, 에키노마이신과 세포 결합제가 서로 화학적으로 결합(예: 공유 결합) 되도록 한다. 본 발명의 약물-링커 화합물을 제조하는데 사용될 수 있는 이관능성 가교제 Thermo Scientific Pierce Crosslinking Technical Handbook에 기재된 것들을 포함한다.
링커는 “절단 가능한” 링커 또는 “절단 불가능한” 링커 일 수 있다. 절단 가능한 링커는 특정 환경 인자에 노출될 때, 예를 들어 표적 세포내로 내부화될 때, 약물을 방출하도록 고안된다. 절단 가능한 링커는 산에 불안정한 링커, 프로테아제 민감성 링커, 광 불안정 링커, 디메틸 링커 또는 디설파이드-함유 링커를 포함한다. 절단 불가능한 링커는 내부화 및 표적세포 내 분해에 있어 항체 및 약물의 하나 이상의 아미노산과의 공유결합성을 유지하려는 경향이 있다.
일 구체예에서, 상기 이관능성 가교제는 절단 불가능한 링커를 포함한다. 절단 불가능한 링커는 에키노마이신을 세포-결합제 또는 항체에 안정하고, 공유 방식으로 결합시킬 수 있는 임의의 화학적 잔기이다. 따라서, 절단 불가능한 링커는 세포독성제 또는 세포-결합제가 활성으로 유지되는 조건 하에서 산-유발 절단, 광-유발 절단, 펩티다아제-유발 절단, 에스터라아제-유발 절단, 및 디설파이드 결합 절단에 실질적으로 내성이다.
에키노마이신 및 세포-결합제 또는 항체 사이의 절단 불가능한 링커를 형성하는 적합한 가교제는 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다. 일 구체예에서, 에키노마이신 및/또는 에키노마이신 유사체는 세포-결합제 또는 항체와 티오에테르(THIOETHER) 결합을 통해 연결된다. 절단-불가능한 링커의 예는 세포독성제와 함께 하는 반응에 대해 말레이미도-(maleimido-) 또는 할로아세틸-(haloacetyl-) 계열의 잔기를 갖는 링커를 포함한다. 이러한 이관능성 가교제는 당해 분야에 잘 알려져 있고(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2010/0129314를 참조하라), 이것들은 Pierce Biotechnology Inc.로부터 이용가능하며, N-석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산카복실레이트(SMCC), SMCC의 “긴 사슬” 유사체인 N-석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카르복시-(6-아미도카프로에이트)(LC-SMCC), κ-말레이미도운데칸산 N-석신이미딜 에스터(KMUA), γ-말레이미도부티르 산 N-석신이미딜 에스터(GMBS), δ-말레이미도카프로 산 N-하이드록시석신 에스터(EMCS), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스터(MBS), N-(α-말레이미도아세톡시)-석신이미드 에스터(AMAS), 석신이미딜-6-(β-말레이미도프로피온아마이도)헥사노에이트(SMPH), N-석신이미딜 4-(p- 말레이미도페닐)-부티레이트(SMPB), 및 N-(p-말레이미도페닐)이소사이아네이트(PMPI)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 할로아세틸-계열의 잔기를 포함하는 가교제는 N-석신이미딜-4-(아이오도아세틸)-아미노벤조에이트(SIAB), N-석신이미딜 아이오도아세테이트(SIA), N-석신이미딜 브로모아세테이트(SBA), 및 N-석신이미딜 3-(브로모아세트아미도)프로피오네이트(SBAP), 비스-말레이미도폴리에틸렌글리콜(BMPEO), BM(PEO)2, BM(PEO)3, N-(β-말레이미도프로필옥시)석신이미드 에스터(BMPS), 5-말레이미도발레르 산 NHS, HBVS, 4-(4-N-말레이미도페닐)-부티르 산 하이드라지드.HCl(MPBH), 석신이미딜-(4-비닐설포닐)벤조에이트(SVSB), 디티오비스-말레이미도에탄(DTME), 1,4-비스-말레이미도부탄(BMB), 1,4-비스말레이미딜-2,3-디하이드록시부탄(BMDB), 비스-말레이미도헥산(BMH), 비스-말레이미도에탄(BMOE), 설포석신이미딜 4-(N-말레이미도-메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트(설포-SMCC), 설포석신이미딜(4-아이오도-아세틸)아미노벤조에이트(설포-SIAB), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시설포석신이미드 에스터(설포-MBS), N-(δ-말레이미도부트릴옥시)설포석신이미드 에스터(설포-GMBS), N-(δ-말레이미도카프릴옥시)설포석시이미도 에스터(설포-EMCS), N-(κ-말레이미도운데카노일옥시)설포석신이미드 에스터(설포-KMUS), 설포석신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)부티레이트(설포-SMPB), CX1-1, 설포-Mal 및 PEG화-Mal을 포함한다. 바람직하게는, 상기 이관능성 가교제는 SMCC이다.
수성 완충제 내의 항체의 용액은 말레이미도기를 도입하기 위해 N-석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC)와 같은 항체-개질제의 몰 과량과 함께 배양될 수 있거나, 또는 아이오도아세틸기를 도입하기 위해 N-석신이미딜-4-(아이오도아세틸)-아미노벤조에이트(SIAB)와 함께 배양될 수 있다. 그 후 개질된 항체를 티올-함유 에키노마이신 유도체와 반응시켜 티오에테르-연결 항체-에키노마이신 접합체를 생성한다. 그 후 항체-세포 독성 접합체는 겔-여과 또는 이전에 언급된 방법에 의해 또는 통상의 기술자에게 알려진 방법에 의해 정제된다. 말레이미도기 또는 할로아세틸기를 세포 접합제 상에 도입시키는 다른 가교-링커는 당 업계에 잘 알려져 있으며, 이전에 기재된 상기 링커를 포함한다.
항체 접합체는 항체 당 평균 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20개의 에키노마이신 분자(및/또는 유사체)를 포함할 수 있다.
조합 치료. 특정 구체예에서, 본 출원의 에키노마이신 제제를 이용한 HIF-1α 억제는 표준 암치료(예를 들어, 수술, 방사선, 및 화학요법)와 조합될 수 있다. 이러한 접근은 HIF가 방사선 치료 및 화학요법에 대한 내성을 매개하는 것으로 알려져 있는 사실에 근거를 둔다. (Semenza, Trends Pharmacol Sci. 2012 Apr; 33(4): 207-214). 예를 들어, HIF-1 활성이 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia)의 이마티닙(imatinib) 치료와 같은 신규 표적 치료에 대한 내성의 발달에 매개할 수 있다는 증거가 있다. 특히, HIF-1은 트랜스케토라아제(transketolase)의 발현을 활성화하고, 이로 인해 5탄당 포스페이트 경로의 비-산화성 암(arm)을 통해 포도당 유동을 증가시킴으로써, 대사 재프로그래밍을 통해 이마티닙에 대한 내성을 매개하는 것으로 보인다. HIF-1에 의해 매개되는 산화적 대사로부터 환원적 대사로의 전환은, 세포의 ROS 수준을 감소시키는 효과가 있어, 세포독성 화학 요법에 대한 내성을 증가시킬 수 있다(Semenza, 2012).
특정 구체예에서, 에키노마이신 또는 그 유사체는 하나 이상의 다른 화학요법제 또는 항암제와 함께 상승적 조합으로 투여될 수 있다. 이러한 경우, 투여되는 화학요법제 또는 항암제의 투여량을 감소시키는 것이 가능할 수 있다. 그러한 조합의 예는 백혈병 치료를 위한 이마티닙과 조합된 에키노마이신 또는 유방암의 치료를 위한 허셉틴과 조합된 에키노마이신의 조합이다. HIF-1α 억제와 화학 요법의 조합된 사용은 방사선 치료, 화학 요법, 및/또는 세포 자살(apoptosis)뿐만 아니라, 혈관 신생, 줄기 세포 유지, 대사 재프로그래밍, 자가분비 성장 인자 신호 전달(autocrine growth factor signaling), 중간엽 전이(epithelial-mesenchymal transition), 침습 및 전이(metastasis)에 대한 내성의 역효과를 역전시킬 수 있다고 믿어진다.
본원에서 사용될 때, 문구 “항암제”는 암세포 성장 속도를 감소시킬 수 있거나 또는 객체(예를 들어, 사람) 내의 암 세포에 죽음(괴사 또는 세포 사멸)을 유발시키거나 또는 매개하는 “작은 분자 약물” 또는 단백질 또는 항체를 지칭한다. 문구 “작은 분자 약물”은 종종 금속 또는 유기금속이고, 중합체가 아니며, 약효가 있고, 약 2kDa 미만, 약 1kDa 미만, 약 900Da 미만, 약 800Da 미만, 약 700Da 미만의 분자량을 갖는 분자 물질을 지칭한다. 비록 작은 펩티드 또는 핵산 유사체가 작은 분자 약물로 고려될 수 있지만, 상기 용어는 단백질 또는 핵산 이외의 “약물”로 불리는 대부분의 의약 화합물을 포함한다. 예는 화학 요법적 항암제 및 효소 억제제를 포함한다. 작은 분자 약물은 합성적으로, 반-합성적으로(즉, 천연 전구체), 또는 생물학적으로 유래될 수 있다.
상기 항암제는 알킬화제; 안트라사이클린 항생제; 항대사산물; 해독제; 인터페론; 다클론 또는 단일 클론 항체; EGFP 억제제; HER2 억제제; 히스톤 디아세틸라아제(histone deacetylase) 억제제; 호르몬제 또는 항호르몬제; 유사분열(mitotic) 억제제; 포스파티딜이노시톨-3-키나아제(PI3K) 억제제; Akt 억제제; 포유 동물 표적인 라파마이신(rapamycin) (mTOR) 억제제; 프로테아솜 억제제; 폴리(ADP-리보오스) 중합효소(PARP) 억제제; Ras/MAPK 경로 억제제; 중심체 디클러스터제(centrosome declustering agent); 멀티-키나아제 억제제; 세린/트레오닌 키나아제 억제제; 티로신 키나아제 억제제; VEGF/VEGFR 억제제; 탁산(taxane)또는 탁산 유도체, 아로마타제(aromatase) 억제제, 안트라사이클린, 미세소관 표적 약물, 국소이성화효소(topoisomerase) 독약, 분자 표적 또는 효소(예를 들어, 키나아제 또는 단백질 메틸전이효소)의 억제제, 시티딘 유사체 또는 이들의 조합 일 수 있다.
예시적인 알킬화제는 사이클로포스파미드(cyclophosphamide)(시톡산; 네오사르(Cytoxan; Neosar)); 클로람부실(chlorambucil)(류케란(Leukeran)); 멜팔란(melphalan)(알케란(Alkeran)); 카르무스틴(carmustine)(비아이시엔유(BiCNU)); 부설판(busulfan)(부설펙스(Busulfex)); 로무스틴(lomustine)(씨앤유(CeeNU)); 다카르바진(dacarbazine)(DTIC-돔(DTIC-Dome)); 옥살리플라틴(oxaliplatin)(엘록사틴(Eloxatin)); 카르무스틴(carmustine)(글리아델(Gliadel)); 이포스파미드(ifosfamide)(아이펙스(Ifex)); 메클로르에타민(mechlorethamine)(머스타젠(Mustargen)); 부설판(busulfan)(밀레란(Myleran)); 카보플라틴(carboplatin)(파라플라틴(Paraplatin)); 시스플라틴(cisplatin)(CDDP; 플라티놀(Platinol)); 테모졸로마이드(temozolomide)(테모다(Temodar)); 티오테파(thiotepa)(티오플렉스(Thioplex)); 벤다무스틴(bendamustine)(트레안다(Treanda)); 또는 스트렙토조신(streptozocin)(자노사(Zanosar))를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
예시적인 안트라사이클린 항생제는 독소루비신(doxorubicin)(아드리아마이신(Adriamycin)); 리포솜 독소루비신(doxorubicin liposomal)(독실(Doxil)); 미톡산트론(mitoxantrone)(노반트론(Novantrone)); 블레오마이신(bleomycin)(블레녹산(Blenoxane)); 다우노루비신(daunorubicin)(세루비딘(Cerubidine)); 리포솜 다우노루비신(daunorubicin liposomal)(다우노좀(DaunoXome)); 닥티노마이신(dactinomycin)(코스메겐(Cosmegen)); 에피루비신(epirubicin)(엘렌스(Ellence)); 이다루비신(idarubicin)(이다마이신(Idamycin)); 플리카마이신(plicamycin)(미트라마이신(Mithracin)); 미토마이신(mitomycin)(뮤타마이신(Mutamycin)); 펜토스타틴(pentostatin)(니펜트(Nipent)); 또는 발루비신(valrubicin)(발스타(Valstar))를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
예시적인 항 대사 산물은 플루오로우라실(fluorouracil)(아드루실(Adrucil)); 카페시타빈(capecitabine)(젤로다(Xeloda)); 히드록시우레아(hydroxyurea)(히드레아(Hydrea)); 메르캅토푸린(mercaptopurine)(퓨리네톨(Purinethol)); 페메트렉시드(pemetrexed)(알림타(Alimta)); 플루다라빈(fludarabine)(플루다라(Fludara)); 넬라라빈(nelarabine)(아라논(Arranon)); 클라드리빈(cladribine)(클라드리빈 노바플러스(Cladribine Novaplus)); 클로파라빈(clofarabine)(클로라(Clolar)); 시타라빈(cytarabine)(싸이토사유(Cytosar-U)); 데시타빈(decitabine)(다코젠(Dacogen)); 리포솜 시타라빈(cytarabine liposomal)(데포사이트(DepoCyt)); 히드록시우레아(hydroxyurea)(드록시아(Droxia)); 프랄라트렉세이트(pralatrexate)(폴로틴(Folotyn)); 플록스우리딘(floxuridine)(FUDR); 젬시타빈(gemcitabine)(젬자(Gemzar)); 클라드리빈(cladribine)(류스타틴(Leustatin)); 플루다라빈(fludarabine)(오포타(Oforta)); 메토트렉세이트(methotrexate)(MTX; 류마트렉스(Rheumatrex)); 메토트렉세이트(트렉슬(Trexall)); 티오구아닌(thioguanine)(타블로이드); TS-1 또는 시타라빈(타라빈(Tarabine) PFS)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
예시적인 해독제는 아미포스틴(amifostine)(에치올(Ethyol)) 또는 메스나(mesna)(메스넥스(Mesnex))를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
예시적인 인터페론은 인터페론 알파(alfa)-2b(인트론 A) 또는 인터페론 알파-2a(로페론-A)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
예시적인 다클론 또는 단일 클론 항체는 트라스투주맙(trastuzumab)(허셉틴(Herceptin)); 오파투무맙(ofatumumab)(아제라(Arzerra)); 베바시주맙(bevacizumab)(아바스틴(Avastin)); 리툭시맙(rituximab)(리툭산(Rituxan)); 세툭시맙(cetuximab)(얼비툭스(Erbitux)); 파니투무맙(panitumumab)(벡티빅스(Vectibix)); 토시투모맙(tositumomab)/아이오딘131 토시투모맙(벡사(Bexxar)); 알렘투주맙(alemtuzumab)(캄파스(Campath)); 이브리투모맙(ibritumomab)(제발린(Zevalin); In-111; Y-90 제발린); 젬투주맙(gemtuzumab)(마일로타그(Mylotarg)); 에쿨리주맙(eculizumab)(솔리리스(Soliris)) 및 오르데노수맙(ordenosumab)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
예시적인 EGFR 억제제는 게피티니브(gefitinib)(이레사(Iressa)); 라파티닙(lapatinib)(티케브(Tykerb)); 세툭시맙(Erbitux); 얼로티니브(erlotinib)(타쎄바(Tarceva)); 파니투무맙(벡티빅스); PKI-166; 캐너티니브(canertinib)(CI-1033); 마투주맙(matuzumab)(Emd7200) 또는 EKB-569을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
예시적인 HER2 억제제는 트라스투주맙(trastuzumab)(허셉틴(Herceptin)); 라파티니브(lapatinib)(티케브(Tykerb))또는 AC-480을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
예시적인 히스톤 디아세틸라아제 억제제는 보리노스타트(vorinostat)(졸린자(Zolinza)), 밸프로산(valproic acid), 로미뎁신(romidepsin), 엔티노스타트(entinostat) 아벡시노스타트(abexinostat), 기비노스타트(givinostat), 및 모체티노스타트(mocetinostat)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.티니브(lapatinib)(티케브(Tykerb))또는 AC-480을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
예시적인 히스톤 디아세틸라아제 억제제는 보리노스타트(vorinostat)(졸린자(Zolinza)), 밸프로산(valproic acid), 로미뎁신(romidepsin), 엔티노스타트(entinostat) 아벡시노스타트(abexinostat), 기비노스타트(givinostat), 및 모체티노스타트(mocetinostat)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
예시적인 호르몬제 또는 항호르몬제는 타목시펜(tamoxifen)(썰타목스(Soltamox); 놀바덱스(Nolvadex)); 랄록시펜(raloxifene)(에비스타(Evista)); 메게스트롤(megestrol)(메게이스(Megace)); 류프롤리드(leuprolide)(루프론(Lupron); 루프론 데포(Lupron Depot); 엘리가드(Eligard); 비아두(Viadur)); 풀베스트란트(fulvestrant)(파슬로덱스(Faslodex)); (레트로졸(letrozole)(페마라(Femara)); 트리프토렐린(triptorelin)(트렐스타(Trelstar) LA; 트렐스타 데포(Trelstar Depot)); 엑세메스탄(exemestane)(아로마신(Aromasin)); 고세렐린(goserelin)(졸라덱스(Zoladex)); 비칼루타미드(bicalutamide)(카소덱스(Casodex)); 아나스트로졸(anastrozole)(아리미덱스(Arimidex)); 플루옥시메스테론(fluoxymesterone)(안드록시(Androxy); 할로테스틴(Halotestin)); 메드록시프로게스테론(medroxyprogesterone)(프로베라(Provera); 데포-프로베라(Depo-Provera)); 아비라테론 아세트산(abiraterone acetate)(자이티가(Zytiga)); 류프로렐린(leuprorelin)(루프론(Lupron)); 에스트라머스틴(estramustine)(Emcyt); 플루타미드(flutamide)(유렉신(Eulexin)); 토레미펜(toremifene)(화레스톤(Fareston)); 데가렐릭스(degarelix)(퍼마곤(Firmagon)); 닐루타미드(nilutamide)(닐란드론(Nilandron)); 아바렐릭스(abarelix)(플레낙시스(Plenaxis)); 또는 테스토락톤(testolactone)(테슬락(Teslac))을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
예시적인 유사분열 억제제는 파클리탁셀(paclitaxel)(택솔(Taxol); 온솔(Onxol); 아브락산(Abraxane)); 도세탁셀(docetaxel)(탁소티어(Taxotere)); 빈크리스틴(vincristine)(온코빈(Oncovin); 빈카사르(Vincasar)PFS); 빈블라스틴(vinblastine)(벨반(Velban)); 에토포시드(etoposide)(토포사르(Toposar); 에토포포스(Etopophos); 베페시드(VePesid)); 테니포사이드(teniposide)(부몬(Vumon)); 익사베필론(ixabepilone)(익셈프라(Ixempra)); 노코다졸(nocodazole); 에포틸론(epothilone); 비노렐빈(vinorelbine)(나벨빈(Navelbine)); 캠프토세킨(camptothecin)(CPT); 이리노테칸(irinotecan)(캠토사(Camptosar)); 토포테칸(topotecan)(하이캄틴(Hycamtin)); 암사크린(amsacrine)또는 라멜라린(lamellarin)D (LAM-D)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
예시적인 포스파티딜-이노시톨-3-키나아제(PI3K) 억제제는 PI3K의 비가역적 억제제 워트만닌(wortmannin), 워트만닌의 유도체 데메톡시비리딘(demethoxyviridin), PI3K의 가역적 억제제 LY294002; BKM120(부파리십(Buparlisib)); 이데랄리시브(Idelalisib)(PI3K 델타 억제제); 두벨리시브(duvelisib)(IPI-145, PI3K 델타 및 감마의 억제제); 알파-특이적 PI3K 억제제 알페리시브(alpelisib)(BYL719); 경구 PI3K 델타 억제제 TGR 1202(종래 RP5264로 알려진); 및 PI3Kα,δ 지배적 동형(isoforms) 억제제 코판리십(copanlisib)(BAY 80-6946)을 포함한다.
예시적인 Akt 억제제는 밀테포신(miltefosine), AZD5363, GDC-0068, MK2206, 페리포신(Perifosine), RX-0201, PBI-05204, GSK2141795, 및 SR13668를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
예시적인 MTOR 억제제는 에베로리무스(everolimus)(아피니토(Afinitor)) 또는 템시롤리무스(temsirolimus)(토리셀(Torisel)); 라파뮨(rapamune), 리다포롤리무스(ridaforolimus); 데포롤리무스(deforolimus)(AP23573), AZD8055(아스트라제네카(AstraZeneca)), OSI-027(OSI), INK-128, BEZ235, PI-103, 토린1(Torin1), PP242, PP30, Ku-0063794, WAY-600, WYE-687, WYE-354, 및 CC-223를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
예시적인 프로테아솜 억제제는 아스트라제네카(AstraZeneca)(PS-341), 익사조밉(ixazomib)(MLN 2238), MLN 9708, 델란조밉(delanzomib)(CEP-18770), 카르필조밉(carfilzomib)(PR-171), YU101, 오프로조밉(oprozomib)(ONX-0912), 마리조밉(marizomib)(NPI-0052), 및 디설피람(disufiram)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
예시적인 PARP 억제제는 올라파립(olaparib), 이니파립(iniparib), 벨리파립(velaparib), BMN-673, BSI-201, AG014699, ABT-888, GPI21016, MK4827, INO-1001, CEP-9722, PJ-34, Tiq-A, Phen, PF-01367338 및 이들의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
예시적인 Ras/MAPK 경로 억제제는 트라메티닙(trametinib), 셀루메티닙(selumetinib), 코비메티닙(cobimetinib), CI-1040, PD0325901, AS703026, RO4987655, RO5068760, AZD6244, GSK1120212, TAK-733, U0126, MEK162, and GDC-0973를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
예시적인 중심체 디클러스터제는 그리세오풀빈(griseofulvin); 브롬화 노스카핀(예를 들어, 9-브로모노스카핀), 환원된 노스카핀(RBN), N-(3-브로모벤질)노스카핀, 아미노노스카핀과 같은 노스카핀(noscapine), 노스카핀 유도체, 및 이들의 수용성 유도; CW069; 페난트리딘-유래 폴리(ADP-리보오스)폴리머 저해제, PJ-34; N2-(3-피리딜메틸)-5-니트로-2-퓨라마이드, N2-(2-티에닐메틸)-5-니트로-2-퓨라마이드, 및 N2-벤질-5-니트로-2-퓨라마이드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
예시적인 멀티-키나아제 억제제는 레고라페닙(regorafenib); 소라페닙(sorafenib)(넥사바르(Nexavar)); 수니티닙(sunitinib)(수텐트(Sutent)); BIBW 2992; E7080; Zd6474; PKC-412; 모테사니브(motesanib); 또는 AP24534를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
예시적인 세린/트레오닌 키나아제 억제제는 루복시스타우린(ruboxistaurin); 에릴(eril)/이수딜(easudil)하이드로클로라이드; 플라보피리돌(flavopiridol); 셀리시클립(seliciclib)(CYC202; 로스코비트린(Roscovitrine)); SNS-032(BMS-387032); Pkc412; 브라이오스태틴(bryostatin); KAI-9803; SF1126; VX-680; Azd1152; Arry-142886(AZD-6244); SCIO-469; GW681323; CC-401; CEP-1347 또는 PD 332991를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
예시적인 티로신 키나아제 억제제는 얼로티니브(타쎄바); 게피니티브(이레사); 이마티닙(글리벡); 소라페닙(넥사바르); 수니티닙(수텐트); 트라스투주맙(허셉틴); 베바시주맙(아바스틴); 리툭시맙(리툭산); 라파티닙(티케브); 세툭시맙(얼비툭스); 파니투무맙(벡티빅스); 에베로리무스(아피니토); 알렘투주맙(캄파스); 젬투주맙(마일로타그); 템시롤리무스(temsirolimus)(토리셀(Torisel)); 파조파닙(pazopanib)(보트리엔트(Votrient)); 다사티닙(dasatinib)(스프라이셀(Sprycel)); 닐로티닙(nilotinib)(타시그나(Tasigna)); 바탈라닙(vatalanib)(Ptk787; ZK222584); CEP-701; SU5614; MLN518; XL999; VX-322; Azd0530; BMS-354825; SKI-606 CP-690; AG-490; WHI-P154; WHI-P131; AC-220; 또는 AMG888를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
예시적인 VEGF/VEGFR 억제제는, 베바시주맙(아바스틴); 소라페닙(넥사바르); 수니티닙(수텐트); 라니비주맙(ranibizumab); 페갑타닙(pegaptanib); 또는 반데타닙(vandetinib)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
예시적인 미세소관 표적 약물은 파클리탁셀, 도세탁셀, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 노코다졸, 에포틸론(epothilones)및 나벨빈을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
예시적인 국소이성화효소 독약은 테니포사이드, 에토포시드, 아드리아마이신, 캠프토세킨, 다우노루비신, 닥티노마이신, 미톡산트론, 암사크린, 에피루비신 및 이다루비신을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
탁산 또는 탁산 유도체는 파클리탁셀 및 도세탁셀을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
예시적인 일반적 화학요법제, 항-신생물제, 항증식제는 알트레타마인(altretamine)(헥살렌(Hexalen)); 이소트레티노인(isotretinoin)(아큐탄(Accutane); 암네스팀(Amnesteem); 클라라비스(Claravis); 소트렛(Sotret)); 트레티노인(tretinoin)(베사노이드(Vesanoid)); 아자시티딘(azacitidine)(비다자(Vidaza)); 보테조미브(bortezomib)(벨케이드(Velcade)) 아스파라기나제(asparaginase)(엘스파(Elspar)); 레바미솔(levamisole)(에르가미솔(Ergamisol)); 미토테인(mitotane)(리소드렌(Lysodren)); 프로카바진(procarbazine)(마툴란(Matulane)); 페가스파가제(pegaspargase)(온카스파(Oncaspar)); 데니류킨 디프티톡스(denileukin diftitox)(온탁(Ontak)); 포르피머(porfimer)(포토프린(Photofrin)); 알데스류킨(aldesleukin)(프로류킨(Proleukin)); 레날리도마이드(lenalidomide)(레블리미드(Revlimid)); 벡사로텐(bexarotene)(타그레틴(Targretin)); 탈리도마이드(thalidomide)(탈로미드(Thalomid); 템시롤리무스(토리셀); 삼산화비소(arsenic trioxide)(트리세녹스(Trisenox)); 베르테포핀(verteporfin)(비쥬다인(Visudyne)); 및 미모신(mimosine)(류세놀(Leucenol))을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
어떤 구체예에서, 에키노마이신 또는 에키노마이신 유사체는 GVHD 치료를 위해 하나 이상의 SOC MTX / 칼시뉴린(calcineurin)억제제와 함께 상승적인 조합으로 투여된다.
이러한 추가적인 화학요법제는 본 출원의 리포솜 제제와 함께 투여되는 별도의 리포솜 제제 내에, 또는 달리 적용되는 투여 방식(예를 들어, 주사 등)에 의해, 에키노마이신 또는 그 유사체와 함께 리포좀 내에 적재될 수 있다.
약학적 제제. 에키노마이신 또는 에키노마이신 유사체 및 리포솜과 같은 마이크로에멀젼 약물 전달 담체를 포함하는 본 발명의 약학 조성물은 표준 기술에 따라 제조된다. 이들은 약학적으로 허용가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 본원에서 사용될 때, 용어 “약학적으로 허용가능한”은 동물 또는 사람에게 적절하게 투여될 때 역반응, 알레르기 또는 기타 부작용을 일으키지 않는 분자 실체 또는 조성물을 지칭한다. 본원에서 사용될 때, 용어 “약학적으로 허용가능한 담체”는 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항박테리아 및/또는 항진균제, 등장제(isotonic agent) 및 흡수 지연제, 완충제, 부형제(excipient), 접합제, 윤활제, 겔, 계면활성제 등을 포함하고, 약학적으로 허용가능한 물질을 위한 매질로서 사용될 수 있는 것이다.
예시적인 담체 또는 부형제는 탄산칼슘, 인산칼슘, 각종 당류, 전분, 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 및 폴리에틸렌글리콜과 같은 중합체를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 예시적인 약학적으로 허용가능한 담체는 물, 식염수, 등장 수용액, 인산 완충 식염수, 덱스트로스, 0.3% 수성 글리신, 글리세롤, 에탄올 등의 하나 이상은 물론, 이들의 조합을 포함한다. 많은 경우, 등장제, 예를 들어 당류, 만니톨, 솔비톨과 같은 폴리알콜 또는 조성물 내의 염화나트륨, 또는 알부민, 지질단백질 및 글로불린과 같은 강화된 안정성을 위한 당단백질을 포함한다. 약학적으로 허용가능한 담체는 치료제의 저장 수명 또는 유효성을 향상시키는, 습윤제, 유화제, 보존제 또는 완충제와 같은 소량의 보조물질을 추가로 포함할 수 있다.
이러한 조성물은 통상의 기술자에게 잘 알려진 종래의 살균 기술에 의해 살균될 수 있다. 예를 들어, 충분히 작은 리포솜은 무균 여과 기술을 사용하여 멸균될 수 있다.
개질될 수 있는 제제 특성은, 예를 들어 pH 및 삼투압을 포함한다. 예를 들어, 비경구적으로 투여될 때 제제의 유효성을 도모하기 위해 인간 혈액 또는 조직의 pH 및 삼투압과 유사한 pH 및 삼투압을 갖는 제제를 달성하는 것이 바람직하다. 대안적으로, 다른 투여 경로를 통해 투여될 때 개시된 조성물의 효과를 증진시키기 위해, 대안적 특성을 개질시킬 수 있다.
완충제는 다른 목적들 중에서, 약학 제제(특히 비경구 투여에 바람직함)의 총 pH의 조작을 위해 본 제제에서 유용하다. 본 발명 분야에 알려진 다양한 완충제, 예컨대 유기 또는 무기 산, 염기, 또는 아미노산의 다양한 염이 본 제제 내에 사용될 수 있으며, 다양한 형태의 시트레이트, 포스페이트, 타르트레이트, 석시네이트, 아디페이트, 말리에이트(maleate), 락테이트, 아세테이트, 비카보네이트, 카보네이트 이온을 포함한다. 본 발명에서 현재 개시된 조성물의 비경구 투여 형태에 사용하기에 특히 유리한 완충제는 인산나트륨, 인산칼륨, 석신산나트륨 및 시트르산나트륨을 포함하는 나트륨 또는 칼륨 완충제를 포함한다.
염화나트륨은 0-300 mM의 농도(액체 투여형의 경우 최적으로 150mM)에서 용액의 독성을 개질시키는데 사용될 수 있다. 동결보호제(Cryoprotectants)는 동결건조된 복용형의 경우, 주로 0-10% 수크로오스(최적으로 0.5-10%)가 포함될 수 있다. 다른 적합한 동결보호제는 트레할로오스 및 락토오스를 포함한다. 증량제는 동결건조된 투여형의 경우, 주로 1-10%의 만니톨(최적으로 2-4%)이 포함될 수 있다. 안정화제는 주로 1-50mM L-메티오닌(최적으로 5-10 mM)이 액체형 및 동결건조 투여형 내 모두에서 사용될 수 있다. 글리신, 아르기닌을 포함하는 다른 적합한 증량제는 0-0.05% 폴리소르베이트-80(최적으로 0.005-0.01%)으로서 포함될 수 있다.
일 구체예에서, 인산나트륨은 약 7.0의 pH를 달성하기 위해 20mM에 가까운 농도로 사용된다. 특히 효과적인 인산 나트륨 완충 용액 시스템은 인산 나트륨 1염기성 1수화물 및 인산 나트륨 2염기성 7수화물을 포함한다. 1염기성 및 2염기성 인산 나트륨의 이러한 조합이 사용될 때, 각각의 유리한 농도는 약 0.5 내지 약 1.5 mg/ml 1염기성 및 약 2.0 내지 약 4.0 mg/ml 2염기성, 바람직한 농도의 약 0.9 mg/ml 1염기성 및 약 3.4 mg/ml 이염기성 인산염으로 사용된다. 제제의 pH는 사용된 완충제의 양에 따라 변한다.
투여 형 및 의도된 투여 경로에 따라, 대안적으로 다른 농도에서 완충제를 사용하거나 다른 첨가제를 사용하여 다른 범위를 포함하도록 조성물의 pH를 조절하는 것이 유리할 수 있다. 본 발명의 조성물에 유용한 pH 범위는 약 2.0 내지 약 12.0의 pH를 포함한다.
어떤 구체예에서, 계면활성제가, 사용되는 약물 전달 시스템을 파괴하지 않는 한, 현재 개시된 제제에서 계면활성제를 사용하는 것이 또한 유리할 것이다. 유용한 것으로 입증된 계면활성제 또는 항-흡착제는 폴리옥시에틸렌소르비탄, 폴리옥시에틸렌소르비탄 모노라우레이트, 폴리소르베이트-20, 예컨대 Tween-20TM, 폴리소르베이트-80, 폴리소르베이트-20, 하이드록시셀룰로오스, 제나폴(genapol) 및 BRIJ 계면활성제를 포함한다. 예로서, 비경구적으로 투여가능한 조성물을 제조하기 위해 본 발명 내에서 임의의 계면활성제가 사용될 때, 약 0.01 내지 약 0.5 mg/ml의 농도가 사용하는데 유리하다.
추가의 유용한 첨가제는 조성물 및 제제기(formulator)의 특별한 필요성 또는 의도된 용도에 따라 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정된다. 특히 유용한 추가의 물질 중 하나는 염화나트륨으로, 원하는 삼투압 결과를 달성하기 위해 제제의 삼투압 조절에 유용하다. 개시된 조성물의 비경구 투여에 대한 특히 바람직한 삼투질 농도는 약 270 내지 약 330 mOsm/kg 내에 있다. 비경구적으로 투여되는, 특히 주사가능한 조성물에 대한 최적의 삼투질 농도는 약 3000 sm/kg이고, 약 6.5 내지 약 7.5 mg/ml의 농도의 염화나트륨, 약 7.0 mg/ml의 특히 효과적으로 되는 염화나트륨 농도의 사용에 의해 달성될 수 있다.
에키노마이신-함유 리포솜 또는 에키노마이신-함유 마이크로에멀젼 약물-전달 운반체는 무균 조건 하에 동결건조된 분말로서 저장될 수 있고 투여전 멸균 수용액과 혼합될 수 있다. 리포솜을 재현탁하기 위해 사용되는 수용액은 이전에 논한 바와 같이 pH 조절제 및 완충제, 긴장성(tonicity) 조절제 등과 같은 물리적 조건을 근사하는데 필요한 약학적으로 허용가능한 보조 물질을 함유할 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 에키노마이신-함유 리포솜 또는 에키노마이신-함유 마이크로에멀젼 약물-전달 운반체는 투여 이전에 현탁액, 바람직하게는 수성 현탁액으로 저장될 수 있다. 리포솜 또는 마이크로에멀젼 담체 현탁액의 저장에 사용되는 상기 용액은 저장시 자유-라디칼 및 지질-과산화 손상으로부터 지질을 보호하는 지질-보호제를 포함할 것이다. 적합한 보호 화합물은 알파-토코페롤과 같은 자유-라디칼 제어물질(quencher) 및 페리옥사민(ferrioxamine)과 같은 수용성 철-특이적 킬레이터를 포함한다.
에키노마이신/에키노마이신 유사체는 하기에 추가적으로 기재된 적합한 동물 모델에서 시험될 수 있다. 일반적인 제안으로서, 에키노마이신, 에키노마이신 유사체 또는 다른 항암제의 치료적으로 효과적인 양은 약 한 번 이상의 투여 여부에 상관 없이 10 ng/kg 체중/일 내지 약 100 mg/kg 체중/일의 범위로 투여될 것이다. 특정 구체예에서, 각각의 융합 단백질 또는 발현 벡터는 약 10 ng/kg 체중/일 내지 약 10 mg/kg 체중/일, 약 10 ng/kg 체중/일 내지 약 1 mg/kg 체중/일, 약 10 ng/kg 체중/일 내지 약 100 μg/kg 체중/일, 약 10 ng/kg 체중/일 내지 약 10 μg/kg 체중/일, 약 10 ng/kg 체중/일 내지 약 1 μg/kg 체중/일, 10 ng/kg 체중/일 내지 약 100 ng/kg 체중/일, 약 100 ng/kg 체중/일 내지 약 100 mg/kg 체중/일, 약 100 ng/kg 체중/일 내지 약 10 mg/kg 체중/일, 약 100 ng/kg 체중/일 내지 약 1 mg/kg 체중/일, 약 100 ng/kg 체중/일 내지 약 100 μg/kg 체중/일, 약 100 ng/kg 체중/일 내지 약 10 μg/kg 체중/일, 약 100 ng/kg 체중/일 내지 약 1 μg/kg 체중/일, 약 1 μg/kg 체중/일 내지 약 100 mg/kg 체중/일, 약 1 μg/kg 체중/일 내지 약 10 mg/kg 체중/일, 약 1 μg/kg 체중/일 내지 약 1 mg/kg 체중/일, 약 1 μg/kg 체중/일 내지 약 100 μg/kg 체중/일, 약 1 μg/kg 체중/일 내지 약 10 μg/kg 체중/일, 약 10 μg/kg 체중/일 내지 약 100 mg/kg 체중/일, 약 10 μg/kg 체중/일 내지 약 10 mg/kg 체중/일, 약 10 μg/kg 체중/일 내지 약 1 mg/kg 체중/일, 약 10 μg/kg 체중/일 내지 약 100 μg/kg 체중/일, 약 100 μg/kg 체중/일 내지 약 100 mg/kg 체중/일, 약 100 μg/kg 체중/일 내지 약 10 mg/kg 체중/일, 약 100 μg/kg 체중/일 내지 약 1 mg/kg 체중/일, 약 1 mg/kg 체중/일 내지 약 100 mg/kg 체중/일, 약 1 mg/kg 체중/일 내지 약 10 mg/kg 체중/일, 약 10 mg/kg 체중/일 내지 약 100 mg/kg 체중/일의 범위 내에서 투여될 것이다.
어떤 구체예에서, 에키노마이신은 10-30,000 μg/m2, 100-30,000 μg/m2, 500-30,000 μg/m2, 1000-30,000μg/m2, 1500-30, 000 μg/m2, 2000-30,000 μg/m2, 2500-30,000 μg/m2, 3000-30,000 μg/m2, 3500-30,000 μg/m2, 4000-30,000 μg/m2, 100-20,000 μg/m2, 500-20,000 μg/m2, 1000-20,000 μg/m2, 1500-20,000 μg/m2, 2000-20,000 μg/m2, 2500-20,000 μg/m2, 3000-20,000 μg/m2, 3500-20,000 μg/m2, 100-10,000 μg/m2, 500-10,000 μg/m2, 1000-10,000 μg/m2, 1500-10,000 μg/m2, 2000-10,000 μg/m2, 또는 2500-10,000 μg/m2의 체표면적(body surface area BSA)-기준 투여량으로 투여되었다.
다른 구체예에서, 에키노마이신은 개별 투여당 약 10 ng 내지 약 100 ng, 개별 투여당 약 10 ng 내지 약 1 μg, 개별 투여당 약 10 ng 내지 약 10 μg, 개별 투여당 약 10 ng 내지 약 100 μg, 개별 투여당 약 10 ng 내지 약 1 mg, 개별 투여당 약 10 ng 내지 약 10 mg, 개별 투여당 약 10 ng 내지 약 100 mg, 주사당 약 10 ng 내지 약 1000 mg , 개별 투여당 약 10 ng 내지 약 10,000 mg, 개별 투여당 약 100 ng 내지 약 1 μg, 개별 투여당 약 100 ng 내지 약 10 μg, 개별 투여당 약 100 ng 내지 약 100 μg, 개별 투여당 약 100 ng 내지 약 1 mg, 개별 투여당 약 100 ng 내지 약 10 mg, 개별 투여당 약 100 ng 내지 약 100 mg, 주사당 약 100 ng 내지 약 1000 mg, 개별 투여당 약 100 ng 내지 약 10,000 mg, 개별 투여당 약 1 μg 내지 약 10 μg, 개별 투여당 약 1 μg 내지 약 100 μg, 개별 투여당 약 1 μg 내지 약 1 mg, 개별 투여당 약 1 μg 내지 약 10 mg, 개별 투여당 약 1 μg 내지 약 100 mg, 주사당 약 1 μg 내지 약 1000 mg, 개별 투여당 약 1 μg 내지 약 10,000 mg, 개별 투여당 약 10 μg 내지 약 100 μg, 개별 투여당 약 10 μg 내지 약 1 mg, 개별 투여당 약 10 μg 내지 약 10 mg, 개별 투여당 약 10 μg 내지 약 100 mg, 주사당 약 10 μg 내지 약 1000 mg, 개별 투여당 약 10 μg 내지 약 10,000 mg, 개별 투여당 약 100 μg 내지 약 1 mg, 개별 투여당 약 100 μg 내지 약 10 mg, 개별 투여당 약 100 μg 내지 약 100 mg, 주사당 약 100 μg 내지 약 1000 mg, 개별 투여당 약 100 μg 내지 약 10,000 mg, 개별 투여당 약 1 mg 내지 약 10 mg, 개별 투여당 약 1 mg 내지 약 100 mg, 주사당 약 1 mg 내지 약 1000 mg , 개별 투여당 약 1 mg 내지 약 10,000 mg, 개별 투여당 약 10 mg 내지 약 100 mg, 주사당 약 10 mg 내지 약 1000 mg, 개별 투여당 약 10 mg 내지 약 10,000 mg, 주사당 약 100 mg 내지 약 1000 mg, 개별 투여당 약 100 mg 내지 약 10,000 mg 및 개별 투여당 약 1000 mg 내지 약 10,000 mg의 범위 내에서 투여되었다. 상기 융합 단백질 또는 발현 벡터는 매 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일, 또는 매 1, 2, 3 또는 4 주간 매일 투여될 수 있다.
다른 특정 구체예에서, 에키노마이신의 양은 약 0.0006 mg/일, 0.001 mg/일, 0.003 mg/일, 0.006 mg/일, 0.01 mg/일, 0.03 mg/일, 0.06 mg/일, 0.1 mg/일, 0.3 mg/일, 0.6 mg/일, 1 mg/일, 3 mg/일, 6 mg/일, 10 mg/일, 30 mg/일, 60 mg/일, 100 mg/일, 300 mg/일, 600 mg/일, 1000 mg/일, 2000 mg/일, 5000 mg/일 또는 10,000 mg/일의 투여량으로 투여될 수 있다. 기대된 것처럼 상기 투여량은 환자의 크기, 연령 및 조건에 의존적일 것이다.
투여량은 특정 증식성 질환, 자가면역질환 또는 동종면역반응에 적합한 몇몇 분야에서 허용된 동물 모델에서 시험될 수 있다.
약학 조성물 내의 치료제는 “치료적 유효량”으로 제제화될 수 있다. “치료적 유효랑”은 요구되는 치료 효과를 달성하기 위해, 필요한 투여량 및 필요한 투여기간 동안의 효과적인 양을 지칭한다. 리포솜 제제 또는 다른 마이크로 에멀젼 약물-전달 운반체의 치료적으로 효과적인 양은 치료되는 상태, 상태의 중증도 및 경로, 투여 방식, 특정 작용제의 생체 이용률, 개체에게서 원하는 응답을 이끌어내는 전달 운반체의 능력, 이전치료, 환자의 연령, 환자의 체중 및 성별, 환자의 임상 경력 및 항체에 대한 반응, 사용된 융합 단백질 또는 발현 벡터의 유형, 주치의의 재량 등에 의존하여 다양하게 변할 수 있다. 치료적 유효량은 또한 전달 운반체의 임의의 독성 또는 유해한 효과가 치료적으로 이로운 효과보다 중요하다.
에키노마이신 또는 에키노마이신 유사체를 투여하는 방법
일 측면에서, 본 발명의 상기 마이크로에멀젼 약물-전달 시스템은 증식성 질환, 자가면역질환, 또는 동종면역반응을 보이는 포유 동물 객체를 치료하기 위한 방법 내에 사용된다.
일 구체예에서, 포유 동물 객체에서 증식성 질환의 중증도를 치료 및/또는 감소시키는 방법은 객체 내의 증식성 질환의 중증도를 치료 및/또는 감소시키는 유효량으로 에키노마이신 또는 에키노마이신 유사체를 포함하는 마이크로에멀젼 약물 전달 운반체를 포함하는 약학 조성물을 객체에 투여하는 것을 포함한다.
다른 구체예에서, 포유 동물 객체에서 자가면역질환의 중증도를 치료 및/또는 감소시키는 방법은 객체 내의 자가면역질환의 중증도를 치료 및/또는 감소시키는 유효량으로 에키노마이신 또는 에키노마이신 유사체를 포함하는 마이크로에멀젼 약물 전달 운반체를 포함하는 약학 조성물을 객체에 투여하는 것을 포함한다.
추가의 구체예에서, 동종이계 조혈 줄기 세포(allogeneic hematopoietic stem cell, HSC) 이식을 받는 포유 동물 객체에서 GvHD의 발전을 예방하거나 또는 GvHD의 중증도를 감소시키는 방법은 객체 내의 GvHD의 중증도를 예방 및/또는 감소시키는 유효량으로 에키노마이신을 포함하는 마이크로에멀젼 약물 전달 운반체를 포함하는 약학 조성물과 함께 조합하여, 객체, 이식된 HSC 각각 또는 이들 모두에 투여하는 것을 포함한다.
에키노마이신 또는 에키노마이신 유사체가 리포솜 또는 다른 마이크로에멀젼 약물-전달 운반체 내에 캡슐화될 때, 에키노마이신 또는 에키노마이신의 임의의 유효량이 투여될 수 있다. 바람직하게는, 에키노마이신 또는 에키노마이신 유사체를 함유하는 리포솜 제제 또는 다른 마이크로에멀젼 약물-전달 운반체는 정맥 내, 동맥 내, 근육 내, 피하, 조직 내, 비강 내, 진피 내, 점안, 대뇌 내, 직장 내, 질 내, 복강 내, 종양 내를 포함하는 비경구적 주사에 의해 투여된다.
리포솜 에키노마이신의 정맥 내 투여는 약 1 mg/kg 체중의 투여량에서 마우스에 의해 용인되었고, LD50 값에 도달하지 못했다. 대조적으로, 유리 에키노마이신은 0.629 mg/kg의 LD50 값을 갖는다.
다른 투여 경로는 경구, 국소(비강, 경피(transdermal), 피내(intradermal)또는 안구 내), 점막(예를 들어 비강, 혀 및, 구강, 직장, 질), 흡입(inhalation), 림프 내(intralymphatic), 척추 내(intraspinal), 두개 내(intracranial), 복강 내(intraperitoneal), 기관 내, 방광 내(intravesical), 척수강 내(intrathecal), 창자(enteral), 폐 내(intrapulmonary), 림프 내, 강내(intracavital), 안와 내(intraorbital), 피막 내(intracapsular), 요도 경유(transurethral) 뿐만 아니라 카테타 또는 스텐트에 의한 국소적 전달을 포함한다.
특정 구체예에서, 상기 조성물은 데포 제제로서 제제화될 수 있다. 이러한 장시간 작용 제제는 적절한 자리에서의 이식 또는 비경구 주사, 특히 종양 내 주사 또는 암 조직의 인접한 영역에서의 주사에 의해 투여될 수 있다.
리포솜 제제 또는 다른 마이크로에멀젼 전달 운반체는 동결건조되고 멸균 분말로, 바람직하게는 진공 하에 저장한 후 주사 직전 정균수(bacteriostatic water)(예를 들어, 벤질 알코올 방부제를 함유하는) 또는 멸균수 내에서 재구성 될 수 있다. 약학 조성물은 주사에 의해, 예를 들어 볼러스(bolus) 주사 또는 연속 주입에 의해 비경구 투여를 위해 제제화될 수 있다.
상기 전달 운반체는 한 번에 또는 일련의 치료를 통해 환자에게 투여될 수 있고 진단 이후부터 언제든지 환자에게 투여될 수 있다. 상기 전달 운반체는 유일한 치료로서 또는 문제의 증상을 치료하는데 유용한 다른 약물과 함께 투여될 수 있다.
본 발명은 하기의 실시예에 의해 추가로 설명되며, 하기의 실시예는 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 이 출원 전반에 걸쳐 모든 참고 문헌, 특허 및 공개된 특허 출원의 내용 뿐만 아니라 도면 및 표들은 본원에 참고로서 인용된다. 통상의 기술자는 본 개시물을 고려하여, 개시된 특정 구체예 내에서 많은 변화가 이루어질 수 있으며, 여전히 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 유사하거나 닮은 결과를 얻을 수 있음을 인식해야 한다.
실시예
실시예 1. 리포솜 에키노마아신 제제의 제조. 지질 성분과 에키노마이신을 화학 천칭에서 칭량하고 클로로포름/메탄올 2:1(v/v)과 같은, 적당한 비율로 유리 신틸레이션(scintillation) 바이알 내에 적합한 용매 내에 용해시키고 볼텍스(vortex)에 의해 혼합했다. 질소 가스의 느린 흐름은 유기 용매를 증발시키고 유리 바이알의 벽 상에 균일한 지질막을 생성시키는데 사용되었다. 겔화를 방지하기 위해, 건조 공정을 65℃에서 수행하였다. 상기 지질 필름을 65℃에서 예열된 이중 증류수(ddH2O) 내에 10% 수크로오스(w/v)를 첨가하여 수화시키고, 그러한 총 지질의 최종 농도는 7.1 mg/mL가 되었다. 수화된 혼합물을 65℃ 이상으로 유지했고 모든 필름이 용해될 때까지 볼텍스로 격렬하게 혼합하였다. 대다층소포(Large Multilamellar Vesicles, LMV)의 수화된 용액을 압출 후 쌓인 혼합물 내 리포솜의 평균 크기가 동적 광 산란에 의해 0,05미만의 다분산지수(PdI)와 함께, 94-99 nm 내의 범위내로 결정될 때까지, 1mL 증가분으로 Avanti-소형 압출기를 사용하여 200nm, 100nm 및 50nm의 적층 폴리카보네이트(PC) 필터를 통해 압출시켰다. 막 오염을 방지하기 위해 압출 공정을 65℃에서 수행하였고, PC 막을 각 1mL 증가분 사이에서 변경했다. 1mL 증가분 당 압출 패스(pass)의 최소 개수는 21x였지만, DLS 품질 기준 측정 값이 압출-후 혼합물의 하기의 분석을 충족하지 못했다면, 50nm 막에 대한 추가의 패스가 사용되었다. 소단층소포(SUV)의 생성된 현탁액을 실온(21℃)에서 밤새 안정화시켰다. 그 후 생성물을 33nm 직경의 0.22 μm PES 막(밀리포아(Millipore))으로 1회 멸균 여과하여 포획되지 않은 에키노마이신을 제거했고, HPLC 및 DLS 분석을 위해 여과물을 채취하여 2-8℃에서 멸균 유리 바이알 내에 사용할 때까지 보관한다.
1.1 DSPC-에키노마이신 제제의 제조. 클로로포름 내에 용해된 에키노마이신 0.2mg/mL 1.25mL에 클로로포름 내 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC) 13.75 mg/mL 1.25 mL를 둥근 바닥 플라스크 내에 넣는다. 다음으로, 클로로포름 내에 용해된 콜레스테롤 9.8 mg/mL 1.25 mL을 첨가하고 손으로 빙빙 돌게 하여 5-10초 동안 부드럽게 섞는다. 다음으로, 에키노마이신이 함유된 지질 필름이 플라스크 벽에 형성될 때까지 최대 회전 속도에서 45분 동안 회전 증발기 내에 진공하에 클로로포름을 증발시켜 모든 용매를 완전히 증발시킨다. 상기 필름을 지질 완충제 5mL로 재수화시키고 45분 동안 격렬히 교반하여 리포솜의 이종혼합물을 생성시킨다. 혼합물을 0.2 마이크론 필터를 통해 압출시키고, 결과 혼합물을 캡슐화 효율에 대해 HPLC를 통해 분석한다.
1.2 mPEG-DSPE-DOPC-에키노마이신 제제의 제조. DSPC는 캡슐화 효율을 높이기 위해 DOPC로 치환될 수 있는 반면, mPEG-DSPE는 망막내피 시스템(reticuloendothelial system, RES)에 의한 제거를 감소시키고 생체 내 순환 시간을 증가시키기 위해 첨가될 수 있다. 한 실시예에서, 에키노마이신 0.2mg/mL 1.25mL를 클로로포름 내에 용해시키고, 클로로포름 내의 13.75 mg/mL 1.25mL 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC)을 둥근 바닥 플라스크 내에 첨가한다. 다음으로, 클로로포름 내에 용해된 9.8mg/mL의 1.25mL 콜레스테롤 및 클로로포름 내의 1.25mL 1.25 mg/mL 폴리(에틸렌글리콜)-a-디스테아로일 포스파티딜에탄올아민(mPEG-DSPE)-2000을 첨가하고 손으로 빙빙 돌게 하여 5-10초 동안 부드럽게 섞는다. 다음으로, 에키노마이신을 함유하는 지질 필름이 플라스크 벽 상에 형성될 때까지 최대 회전 속도에서 45분 동안 회전 증발기 내에 진공하에 클로로포름을 증발시키고 모든 용매를 완전히 증발시킨다. 상기 필름을 지질 완충제 5mL로 재수화시키고 45분 동안 격렬히 교반하여 리포솜의 이종혼합물을 생성시킨다. 혼합물을 0.2 마이크론 필터를 통해 압출시키고, 결과 혼합물을 캡슐화 효율에 대해 HPLC를 통해 분석한다.
1.3 mPEG-DSPE-EPC-HEPC-에키노마이신 제제의 제조. 0.25 mg 에키노마이신을 둥근 플라스크 1.25 ml 클로로포름 및 클로로포름/메탄올 1.25ml 내 12.2 mg/ml 계란 포스파티딜콜린(EPC), 2.28 mg/ml 수화된 계란 포스파티딜콜린(HEPC), 2.28 mg/ml 콜레스테롤 및 내 5.4 mg/ml 메톡시 폴리에틸렌 글리세롤-디스테아릴로일 포스파티딜에탄올아민(mPEG-DSPE)의 혼합물에 용해시켰다. 일단 지질이 용매에서 완전히 혼합되면, 용매를 진공하에 증발시켜 용매를 제거하고 둥근 바닥 플라스크의 벽 상에 지질막을 형성시킨다. 상기 필름을 지질 완충제 5mL로 재수화시키고 45분 동안 격렬히 교반하여 리포솜의 이종혼합물을 생성시킨다. 혼합물을 0.2 마이크론 필터를 통해 압출시키고, 결과 혼합물을 캡슐화 효율에 대해 HPLC를 통해 분석한다.
1.4 mPEG-DSPE-HSPC-에키노마이신 제제의 제조. 다른 실시예에서, 리포솜 에키노마이신 14mL를 하기와 같이 제조하였다: HSPC 60mg, DSPE-PEG(2000) 20mg 및 양털 콜레스테롤 20mg을 클로로포름/메탄올 2:1(v/v) 4mL가 있는 가스 신틸레이션 바이알에 용해시켰다. 클로로포름/메탄올 2:1(v/v) 내의 에키노마이신 10mg/mL의 0.5mL를 혼합물에 첨가하고 상기 혼합물을 볼텍스에 의해 30초 동안 혼합하였다. 그 후 상기 혼합물을 수조에 65℃로 가열하고 유기 용매를 질소 가스의 느린 흐름을 이용하고 에키노마이신 및 지질을 함유하는 균질한 필름이 바이알 표면 상에 형성될 때까지 손으로 빙빙 돌게하여 증발시킨다. 유기 용매를 증발시키는 과정에서, 겔화를 피하기 위해 혼합물을 65℃에서 유지시키는 것이 중요했다. 대안으로, 둥근 바닥 플라스크는 회전된 가열 수조 내에 놓인 자동 증발기 시스템에 사용될 수 있다; 그러나 작은 실험실 규모의 생산 로트의 경우, 손으로 바이알을 돌게 하여 매끄러운 필름 층을 생산하기에 충분했다. 작은 오븐 내에서 충분한 부피의 수화 용액을 65℃로 예열했다. 이러한 실시예에서, 수화 용액은 탈이온 증류수(sucDDW) 내에 10% 수크로오스(w/v)였지만, 일반적인 DDW, DDW 내 0.9% 살린 또는 1xPBS와 같은 다른 수화 용액도 허용 가능하다는 점에 유의한다. 그 후 지질-에키노마이신 필름은 모든 막이 완전 용해되어 대다층소포(LMV)의 하얀 현탁액을 생성할 때까지 볼텍스에 의해 격렬하게 혼합하면서 65℃에서 sucDDW 14mL로 수화되었다. 그 후 대다층소포(Large Multilamellar Vesicles, LMV)의 수화된 용액을 압출 후 쌓인 혼합물 내 리포솜의 평균 유체역학적 크기가 동적 광 산란(DLS)에 의해 0,05미만의 다분산지수(PdI)와 함께, 94-99 nm 내의 범위내로 결정될 때까지, 1mL 증가분으로 Avanti-소형 압출기를 사용하여 200nm, 100nm 및 50nm의 적층 폴리카보네이트(PC) 필터를 통해 압출시켰다. 막 오염을 방지하기 위해 압출 공정을 65℃에서 수행하였고, PC 막을 각 1mL 증가분 사이에서 변경했다. 1mL 증가분 당 압출 패스(pass)의 최소 개수는 21x였지만, DLS 품질 기준 측정 값이 압출-후 혼합물의 하기의 분석을 충족하지 못했다면, 50nm 막에 대한 추가의 패스가 사용되었다. 소단층소포(SUV)의 생성된 현탁액을 실온(21℃)에서 밤새 안정화시켰다. 그 후 생성물을 33nm 직경의 0.22 μm PES 막(밀리포아(Millipore))으로 1회 멸균 여과하여 포획되지 않은 에키노마이신을 제거했고, HPLC 및 DLS 분석을 위해 여과물을 채취하여 2-8℃에서 멸균 유리 바이알 내에 사용할 때까지 보관한다.
실시예 2. 리포솜 에키노마이신의 크기 분포 및 물리적 특성. 평균 크기와 제타 전위를 결정하기 위해 멜버른 제타사이저 프로그램을 이용하여 리포솜 에키노마이신 제제를 특징화했다. 크기 분포는 도 1, 패널 A에 동적 광 산란(DLS) 프로필에 나타난 것처럼, 0.1 미만의 다분산지수를 갖는 매우 좁은 범위 내에 있음을 일관적으로 확인하였다. 향상된 투과가능성 및 유지(enhanced permeability and retention, EPR) 및 망막내피 시스템(RES)에 의한 급속한 흡수로부터의 PEG화 스텔스 리포솜의 최대 면역침투 특성에 의한 종양 조직 내의 리포솜의 축적은 100nm 미만의 크기인 리포솜에 대해 보고되어 왔다. 리포솜 에키노마이신의 평균 유체역학적 직경은 약 98 d.nm으로 확인되었다; 이는 배치 사이에서 쉽게 재현되었다(도 1, 패널 B).
리포솜 제제의 제타 전위 측정은 입자 안정성 및 응집 경향을 예측하는 신뢰할 수 있는 방법을 제공할 수 있다. 리포솜 에키노마이신의 평균 제타 전위는 약 -30mV 인 것으로 확인되었는데, 이는 생성물이 안정적이고 응집되지 않았을 것 같음을 암시한다(도 1, 패널 B). PdI, 평균, 및 표준 편차를 포함하는 6개의 독립적인 리포솜 에키노마이신 제제의 추가적인 물리적 특성의 요약이 표 1에 나타난다. 모든 데이터는 멜버른 제타사이저 소프트웨어를 사용하여 생성되었다.
로트 번호 유체역학적 직경 (d.nm) 다분산지수 제타 전위 (mV) 유동성 (μmcm/Vs) 전도성 (mS/cm)
42316 97.33 0.03 -31.8 -2.496 0.00294
50416 97.54 0.063 -31.3 -2.45 0.01030
51016 98.28 0.063 -29.2 -2.288 0.00295
51116 96.88 0.034 -29.6 -2.322 0.00918
60516 99.11 0.049 -30.8 -2.414 0.00306
62216 97.05 0.042 -27.2 -2.135 0.00789
평균 97.75 0.047 -30.0 -2.351 0.00605
표준편차 ±0.83 ±0.014 ±1.7 ±0.131 ±0.00344
실시예 3. 리포솜 에키노마이신으로부터의 에키노마이신의 생체 외 방출. 리포솜 에키노마이신으로부터 생체 외 약물 방출 평가는 수중에 상온에서 각각의 시점마다 HPLC에 의해 240시간의 기간 동안 에키노마이신의 방출 속도를 측정함으로서 투석을 통해 이루어졌다. 에키노마이신 농도를 에키노마이신 표준 곡선에 따라 각각의 시점에서 계산하였다. 방출 퍼센트 계산은 투석을 시작하기 전에 리포솜 에키노마이신 샘플에서 검출된 초기 에키노마이신 농도의 함수로 유도되었다. 리포솜의 생체 외 방출 특성은 도 2, 패널 A에 나타난 누적 백분율 방출로 요약된다. 대응하는 시점에서 에키노마이신 피크를 나타내는 대표적인 HPLC 크로마토그램을 도 2, 패널 B 내에 도시되었다.
실시예 4. 리포솜 에키노마이신의 생체 외 저장 및 안정성. 저장 조건하에서 리포솜 에키노마이신의 안정성을 시험하기 위해, 리포솜 에키노마이신의 물리적 특성을 4℃에서 4개월 과정에 걸쳐 감시하였다. 리포솜 에키노마이신의 크기, PdI, 및 제타전위는 저장 중 1개월 및 3개월에 멜버른 제타사이저 소프트웨어를 사용하여 평가되었다. 초기 측정으로부터 이들 파라미터 중 어느 것도 상당한 변화가 발견되지 않았다(도 3, 패널 A 및 패널 B). 리포솜 에키노마이신의 약물 함량 손실은 1개월 및 3개월 시점에서 0.22μm PES막을 통한 여과에 의해 축적된 약물 침전물의 제거에 의해 시험되었다. 여과물의 HPLC 분석 상에서, 저장 조건 하에서 리포솜으로부터 어떠한 약물 누출 또는 침전의 증거가 발견되지 않았다.
실시예 5. 마우스 내에서의 리포솜 에키노마이신 독성. 마우스 내의 리포솜 에키노마이신의 독성을 시험하기 위해, 에키노마이신의 치료 사이클을 정맥 내 주사에 의해, 하루걸러 총 3회 용량으로, 일회량이 250 μg/kg(리포솜으로 제제화된, 비(非)-리포솜으로 제형화된, 또는 빈 리포솜 운반체의 동등한 투여량)으로 투여하였다. 이 기간 동안 마우스의 체중을 감시하였다. 이 분석 결과는 리포솜 에키노마이신을 받은 마우스가 유리 에키노마이신의 동일한 투여량과 일정을 받은 마우스보다 체중이 덜 감소하고 손실된 체중을 더 빠르게 회복함을 나타냈다(도 4, 패널 A). 더 많은 약물을 투여한, 모든 유리 에키노마이신-치료 마우스는 1주 이내로 죽었으나, 반면 리포솜을 채운 에키노마이신을 받은 마우스의 70%는 3개월 이상 전체 관찰 기간에 걸쳐 생존했다(도 4, 패널 B).
실시예 6. 마우스 내의 리포솜 에키노마이신 vs 유리 에키노마이신의 약물 동역학.
“스텔스” 리포솜은 리포솜 표면 상에 PEG 잔기가 존재하기 때문에, 유리 약물의 순환 시간에 비해 혈류 내에서 연장된 순환 시간을 보이는 것으로 알려져 있다. PEG는 RES에 의한 신속한 흡수로부터 리포솜을 보호하고 리포솜 입자에 입체적 안정화를 제공한다. 유리 에키노마이신에 비한 혈류 내에서 리포솜 에키노마이신의 장기 순환을 측정하기 위해, 양 제제의 약물 동역학이 마우스 내에서 리포솜 에키노마이신 또는 유리 에키노마이신의 0.1 mg/kg의 단일 정맥내 주사에 뒤이은 질량 분석법(mass spectrometry)에 의해 혈장의 에키노마이신의 수준을 검출함으로써 평가되었다(도 5). 이 분석 결과는 혈액 내의 에키노마이신의 농도와 순환시간은 유리 에키노마이신의 동등한 용량의 것에 비해 리포솜 에키노마이신을 받은 마우스 내에서 상당히 증가한다는 것을 나타냈다. 특히, 1 ng/ml 초과의 혈장 농도는 유리 에키노마이신 0.1 mg/kg 투여 후 15분에만 달성되었지만 동일한 용량의 리포솜 에키노마이신은 투여 후 이 농도를 8시간 초과하여 유지된다(도 5).
추가적으로, NSG 마우스의 유방암 조직 내에서 종래의 및 리포솜으로 제제화된 에키노마이신의 약물동역학이 평가되었고 상당히 증가하는 것으로 나타났다. 도 6에 나타나는 것처럼, 5 ng/g 초과 종양 농도는 종래의 에키노마이신의 투여 후 2시간에서만 달성될 수 있었다. 대조적으로, 0.1 mg/kg의 동일 투여량에서 리포솜 에키노마이신(Lipo-EM) 투여는 5 ng/g 초과의 조직 농도를 달성하였으며, 이는 투여 후 10시간 이상 연장되었다(도 6). 더 중요한 것은, 리포솜 에키노마이신 치료 그룹 내에서의 최고 약물 농도는 유리 에키노마이신으로 치료된 그룹보다 약 6배 더 높았다.
실시예 7. 에키노마이신으로 ALL 치료를 위한 근거. 초기 T세포 전구체 급성림프모구 백혈병(Early T-cell precursor acute lymphoblastic leukemia, ETP-ALL)은 최근 예후가 나쁜 T세포 ALL(T-ALL)의 한 형태로 인식되어왔다(Coustan-Smith et al., Lancet Oncol., 2009 Feb;10(2):147-156). ETP ALL은 극 초기 분화 정지(differentiation arrest)및 조혈(hematopoietic) 줄기 세포 및 골수성 전구체와 가장 관련된 독특한 유전적 및 전사 특성을 특징으로 한다. 비록 ETP ALL에 대한 면역 표현형(immunophenotype), 유전자 발현 프로파일(gene expression profile) 및 유전자 돌연변이 스펙트럼이 밝혀졌지만, ETP ALL 병리생물학을 위한 분자 메커니즘은 잘 알려져 있지 않으며 효과적인 치료적 표적은 아직 규명되지 않은 상태로 남아 있다.
이전에, 백혈병 줄기 세포를 규명하기 위해 사용된 T-ALL의 자발적인 마우스 모델은, 정상 산소 상태(normoxia)에서도, HIF1α 신호전달은 마우스 T-ALL 및 인간 AML의 줄기 세포 내에서 선택적으로 활성화 되었다 (Wang Y. et al., Cell Stem Cell. 2011;8(4):399-411). 최근 연구는 이 경로는 만성 골수성 백혈병 줄기 세포의 유지에도 중요하다는 것을 확인하였다. 중요하게도, HIF1α 억제제 에키노마이신은 마우스 백혈병을 효과적으로 제거하고 AML 줄기 세포를 생체 내 및 생체 외 양쪽 모두에서 제거하는데 있어 매우 효과적이었고 선택적이었다(Wang Y. et al). 이러한 연구는 HIF1α가 정상 산소 상태 하에서 ETP ALL 세포 내에 존재하는 세포의 부분집합을 활성화시켰고, 에키노마이신 치료가 이종이식된 NSG 마우스 내에서 ETP ALL 세포를 현저하게 감소시켰다는 것을 나타낸다(Wang et al., 2011, 도 1, 2 및 3을 참조하라). 이러한 관찰은 정상 산소 환경 내의 H1F1α의 비정상적 활성화가 etp all의 독특한 특징임을 나타낸다. ETP ALL이 줄기 세포 및 골수성 전구체와 가장 관련이 있고 H1F-1α 와 그 표적 유전자의 발현을 증가시킨 전사 특징을 갖는 한, 이러한 특징들은 ETP ALL의 치료를 위해 리포솜 에키노마이신으로 H1F-1를 표적으로 삼는 것을 지원한다.
실시예 8. 이종이식된 ETP-ALL NSG 마우스 내에서의 리포솜 에키노마이신 투여의 치료적 효과. 실시예 7의 결과로부터 예상되는 것처럼 H1F-1α 단백질은 ETP-ALL을 가진 환자로부터의 PBMC 대조 샘플과 비교하여 ETAP ALL 세포에서 과잉 생산되는 것으로 밝혀졌다(도 7, 패널 A 및 패널 B). 웨스턴 블롯 분석(도 7, 패널 A) 또는 H1F-1α의 세포 내 염색 후 FACS 분석(도 7, 패널 B)에 의해 3개의 ETP-ALL 샘플에서 높은 H1F-1α 축적이 검출되었다. 이러한 결과는 H1F1α의 비정상적인 활성화가 정상 산소 상태 하에서 인간 일차 ETP ALL 세포 내에 존재함을 확인시켜준다.
리포솜 에키노마이신(Lipo-EM)의 투여가 생체 내에서 인간 ETP-ALL 세포를 제거할 수 있는지 여부를 시험하기 위해, 도 8, 패널 A에 개략적으로 나타낸 투여 계획에 따라 Lipo-EM을 이종이식된 ETP-ALL NSG 마우스에 투여하였다. 간략하게, 1x106 ETP ALL-1 세포는 1.3 Gys 조사된 NSG 마우스에 정맥 내 주사를 통해 이식되었다. 인간 ETP-ALL 세포의 재구성은 수용자 마우스의 말초 혈액(peripheral blood)내에서 hCD45의 검출에 의해 감시되었다. 이 분석의 결과는 이식 후 34일 WO에 수용자 마우스의 혈액 내에서 약 10 내지 20%의 인간 CD45+ 세포가 검출되었음을 나타냈다. 1회 사이클로서 하루 걸러 4회 연속적인 치료인 2 사이클로 이루어진 20일간의 Lipo-EM 치료 요법은 35일째 시작된 사이클 사이에 8일간의 휴식으로 구분되었다. 인간 ETP ALL-1 세포의 백분율이 치료 후 감시되었다. 이 분석의 결과는 Lipo-EM이 이종이식 마우스의 혈액 내에서 ETP-ALL 세포를 상당히 감소시켰다는 것을 나타낸다(도 8, 패널 B). 특히, 투여 전의 및 Lipo-EM 치료 후 3개의 시점에서 인간 ETP ALL 세포의 백분율을 묘사한 FACS 플롯은 운반체 마우스 내에서 인간 CD45의 평균 백분율은 혈액 내에서 34일 째에 10.73%, 42일째에 22.35%로 증가하였고, 48일째에는 45.61%, 56일 째에는 57.44%, 64일째에는 80.18%인 것으로 드러났다. 그러나, Lipo-EM-치료 마우스 내에서, ETP-ALL-1 세포는 이 치료 요법에 의해 거의 완전히 제거되어, 수용자 마우스의 혈액내에서 인간 CD45 세포의 백분율은 치료 전 17.47%에서 치료 후 64일 째에 1.19%로 감소하는 것과 같았다. 이러한 결과는 이종이식된 마우스 내에서 ETP-ALL 세포를 효과적으로 제거하기 위한 리포솜 에키노마이신의 능력을 입증한다.
ETP-ALL 대한 이 마우스의 이종이식 모델 내에서 리포솜 에키노마이신의 효능과 유리 에키노마이신을 비교하기 위해, 1x106 ETP ALL-1 세포가 Gys 조사된 NSG 마우스에 정맥 내 주사를 통해 이식되었다. 21일째에 FACS 분석에 따라 말초신경 내의 %hCD45+ 세포가 약 1%에 도달했을 때, Lipo-EM 처리가 22일 째에서 시작되었다. 마우스는 그룹 당 5마리의 마우스로 3 그룹으로 나뉘었다. 모든 치료는 정맥 내 주입으로 수행하였다. 첫 번째 그룹은 PBS 내의 에키노마이신 15회를 3회의 동일한 사이클로 나누어 받았다. 각각의 사이클마다, PBS 내의 에키노마이신의 0.1 mg/kg을 1일 1회 총 5회 투여받고, 뒤이어 다음 사이클을 시작하기 전에 5일간 휴식을 취했다. 두 번째 그룹은 총 10회 투여량의 Lipo-EM을 받았으며, 첫 번째 2회 투여량은 매 4일에 한번씩 투여되었고, 뒤어어 7일간 쉬었고, 그 후 뒤이어 격일로 4회 투여량, 뒤이어 7일간 쉬었고, 그 후 추가의 4회 투여량이 하루 걸러 한번에 투여되었다. Lipo-EM이 투여된 동일한 스케쥴에 따라 추가적인 마우스 그룹은 빈 리포솜 운반체(n=5)를 받았다. 말초 혈액을 FACS 분석에 의해 34일, 50일, 65일 째에 검사하여 치료 과정에 걸쳐 수용자 내에서 ETP-ALL-1 세포의 성장을 비교하였다(도. 8, 패널 C). 이 분석 결과는 PBS 내의 에키노마이신으로 치료는 ETP-ALL-1 세포의 성장 속도를 억제하는 반면, Lipo-EM으로 치료하면 전자에 비해 우수한 효능을 제공한다는 것을 나타냈다(도 8, 패널 C).
실시예 9. 생체 외 유방암 세포내에서의 에키노마이신의 효과. 유방암 세포 내에서의 높은 HIF-1α 발현의 중요성을 더 잘 이해하기 위해, 유방암 세포의 생존을 감소시키는 에키노마이신의 능력을 2개의 유방암 세포주(cell line), MCF7 및 SUM 159 내에서 시험하였다. 더 구체적으로, MCF7 및 SUM 159를 상이한 농도의 에키노마이신으로 48시간 동안 치료한 후 MTT 분석에 의해 세포 생존력을 측정하였다. 이 분석 결과 에키노마이신이 살아있는 SUM159 세포(IC50=1 nM)의 수를 감소시켰다는 것을 나타낸다. 대조적으로, MCF7 세포는 에키노마이신에 덜 민감하다(도 9). 이 데이터는 HIF 단백질을 과발현하는 암이 에키노마이신에 더 민감하다는 것을 암시한다.
실시예 10. 생체 내 유방암 세포 내의 리포솜 에키노마이신의 치료적 효과. Lipo-EM이 유방암 종양 자리에 에키노마이신의 효과적인 전달을 허용하는지를 결정하기 위해, 루시페라아제-발현 SUM159 종양 이종이식을 갖는 마우스에 생체발광에 의해 종양 덩어리를 시각화하기 위해 D-루시페린을 투여하였다. 또한, Lipo-EM은 형광 염료인, 1,1’-디옥타데실테트라메틸 인도트리카르보사이아닌 아이오다이드(1,1’-dioctadecyltetramethyl indotricarbocyanine iodide, DiR)로 표지 되어 생체 내 리포솜의 추적 및 축적을 가능하게 한다. 종양 성장은 내생적으로 발현된 루시페라아제 활성에 의해 추적된다. 이 분석의 결과는 형광 표지된 리포솜 에키노마이신의 투여 24시간 후 영상화했을 때 인간 유방암 SUM159 종양 내에서 Lipo-EM의 선택적인 축적을 나타낸다. 대조적으로, 수중의 유리 DiR 염료의 동일량 투여는 형광 채널 내에서 상당한 축적 또는 형광 신호를 생성하지 않았다. 중요하게는, 종양이 없는 마우스는 다른 장기 내에 상당한 리포솜 축적을 갖지 않았다(도 10). 이러한 데이터는 Lipo-EM이 마우스 내에서 인간 유방암의 이종이식 종양 내에 선택적으로 축적될 수 있음을 입증한다.
생체 내 유방암 세포내에서 유리 에키노마이신(PBS 내), Lipo-EM, 및 운반체의 치료적 효능을 시험하기 위해, SUM159 세포가 NOD-SCID 마우스의 유방의 지방 패드 내에 이종이식되었다. 0.1 mg/kg의 유리 에키노마이신을 투여했을 때, 에키노마이신 치료 및 운반체 대조군 사이에 종양 크기의 중요한 차이는 관찰되지 않았다(도 11, 패널 A). 생체 내 인간 유방 종양 내의 Lipo-EM의 효능을 시험하기 위해, SUM159 세포를 10마리의 NSG 마우스에 이식하였고, 5마리의 마우스에 9, 11, 13, 25, 및 27일 째에 0.35 mg/kg의 투여량으로 정맥내로 Lipo-EM을 투여하였고 5마리의 마우스에 동일한 시점에서 부형체 대조군(리포솜만)을 투여하였다. 또한, 이식된 종양의 성장 역학을 부피(도 11, 패널 B) 및 중량(도 11, 패널 C 및 패널 D)으로 측정하였다. 운반체 마우스의 종양 크기가 조기 제거 기준에 도달한 후, 10마리의 마우스를 희생시켜 종양의 무게를 측정하였다(도 11, 패널 C 및 패널 D). 이 분석의 결과는 단지 총 5회 주사를 받는 Lipo-EM으로 치료된 마우스 내에 종양의 성장이 운반체로 처치된 마우스와 비교하여 상당하게 감소되었음을 나타내다.
이 분석의 결과는 리포솜 에키노마이신은 자유 에키노마이신 또는 운반체 대조군과 비교했을 때, 감소된 독성, 혈류 내에서 증가된 순환 시간, 및 마우스 내의 인간 고형 종양의 이종이식물 내에 축적되어 증가된 용량을 보여주는 안정한 제형임을 입증한다. 리포솜 에키노마이신은 HIF-1α의 높은 수준을 발현시키는 조혈 및 고형 악성 종양인 인간 이종이식물을 보유한 마우스에 투여될 때 엄청난 항 종양 효과를 나타낸다.
이전의 설명은 이 분야의 통상의 기술자에게 본 발명을 실행하는 방법을 교시하기 위한 목적을 위한 것이며, 설명을 읽을 때 숙련된 기술자에게 명백해질 모든 수정 몇 변형을 상세하게 나타내려는 의도는 아니다. 그러나, 그러한 모든 명백한 수정 및 변형은 하기의 청구범위에 의해 한정되는 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 의도된다. 청구항은 청구된 구성요소 및 문맥이 구체적으로 반대의 것을 가리키지 않는 한, 의도된 목적을 달성하는데 효과적인 임의의 순서 내의 단계를 다루도록 의도된다.

Claims (19)

  1. 에키노마이신, PEG화 인지질, 중성 포스포글리세라이드 및 스테롤을 포함하는, 환자의 질환을 치료하기 위한 PEG화 리포솜 약물제제로서, 상기 조성물은 에키노마이신을 캡슐화하는 복수개의 PEG화 리포솜을 포함하는 것이고, 상기 리포솜은 약학적으로 허용가능한 담체에 현탁된 것인, 환자의 질환을 치료하기 위한 PEG화 리포솜 약물 제제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 PEG화 인지질은 디스테아로일포스파티딜에탄올아민-폴리에틸렌글리콜 (DSPE-PEG), 디미리스토일포스파티딜에탄올아민-폴리에틸렌글리콜 (DMPE-PEG), 디팔미토일글리세로석시네이트 폴리에틸렌글리콜(DPGS-PEG), 콜레스테릴-폴리에틸렌글리콜, 또는 세라마이드-계열 PEG화 지질인 제제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 중성 포스포글리세라이드는 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜글리세롤 및 포스파티딜이노시톨로 이루어진 군에서 선택되는 것인 제제.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제 내의 총 지질에 대한 PEG화 인지질의 몰비는 3 내지 6%이고, 상기 제제 내의 총 지질에 대한 중성 포스포글리세라이드의 몰비는 45 내지 65%이고, 상기 제제 내의 총 지질에 대한 스테롤의 몰비는 30 내지 50%인 제제.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG화 인지질은 디스테아로일포스파티딜에탄올아민-폴리에틸렌글리콜 (DSPE-PEG)이고, 상기 중성 포스포글리세라이드는 포스파티딜콜린이고, 상기 스테롤은 콜레스테롤인 제제.
  6. 제5항에 있어서, DSPE-PEG-20000, 수소화된 대두 포스파티딜콜린 (HSPC), 및 콜레스테롤을 포함하는 제제.
  7. 제6항에 있어서, 총 지질에 대한 상기 DSPE-PEG-2000, HSPC, 및 콜레스테롤의 몰비는 각각 5.3%, 56.3%, 및 38.4%인 제제.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 총 지질에 대한 상기 에키노마이신의 질량비는 2 내지 10% 사이인 제제.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 총 지질에 대한 상기 에키노마이신의 질량비는 5%인 제제.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제 내의 리포솜의 90% 이상이 80 내지 120 nm 사이의 직경을 갖는 것인 제제.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리포솜의 평균 다분산지수는 0.1 미만이고, 상기 리포솜은 4°C에서 적어도 12개월의 저장 수명을 달성하기에 충분히 안정한 것인 제제.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리포솜은 동결 건조 분말로서 제제화된 것인 제제.
  13. 제 1항의 제제를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자의 질병 치료 방법으로서, 상기 리포솜 제제는 증식성 질환, 자가면역질환, 또는 이식편대숙주병 (graft-versus- host disease)을 치료하는 데에 충분한 양의 에키노마이신 또는 에키노마이신 유사체를 포함하는 것이고, 상기 질병은 HIF-1α 또는 HIF-2α의 과발현을 특징으로 하는 것인, 환자의 질병 치료 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 질병은 증식성 질환인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 증식성 질환은 백혈병인 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 증식성 질환은 유방암인 방법.
  17. 제13항에 있어서, 상기 질병은 자가면역질환인 방법.
  18. 제13항에 있어서, 상기 질병은 이식편대숙주병인 방법.
  19. 극성 용매 내에서 에키노마이신, 및 PEG화 인지질, 중성 인지질 및 스테롤을 포함하는 지질 성분들을 포함하는 혼합물을 형성시키는 것;
    상기 극성 용매를 제거하기 위해 상기 혼합물을 건조시켜, 건조 지질 필름을 형성시키는 것;
    상기 건조 지질 필름을 완충용액 내에서 가용화하여, 지질 현탁액을 형성시키는 것;
    상기 지질 현탁액을 폴리카보네이트 필터를 통해 압출하여 원하는 크기 범위의 리포솜을 수득하는 것; 및
    상기 리포솜을 여과에 의해 멸균하는 것을 포함하는, 제1항의 약학 조성물의 제조방법.





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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108135941B (zh) * 2015-08-19 2021-07-27 儿研所儿童医学中心 用于治疗移植物抗宿主病的组合物和方法
CA3009119A1 (en) 2015-12-28 2017-07-06 Mb Biotech Ltd. Liposomes for treatment of an autoimmune disease
CN108926533B (zh) * 2017-05-24 2022-03-25 江苏天士力帝益药业有限公司 一种替西罗莫司脂质体及其制备方法
DK3646854T3 (da) * 2018-10-30 2022-09-26 Polyplus Transfection Sammensætninger til transfektion af mRNA i en celle og anvendelser deraf
JP7378929B2 (ja) * 2018-12-27 2023-11-14 花王株式会社 リポソームの製造方法
WO2021163466A1 (en) * 2020-02-14 2021-08-19 Children's National Medical Center Uses of hypoxia-inducible factor inhibtors for treating tp53-mutated acute myeloid leukemia
CN114432328A (zh) * 2020-11-05 2022-05-06 广州中医药大学第一附属医院 一种用于治疗肝细胞癌的药物组合物及其应用
WO2022221431A1 (en) * 2021-04-14 2022-10-20 OncoC4, Inc. Use of hif-1-alpha inhibitors in cancer immunotherapy
WO2024002385A1 (zh) * 2022-08-05 2024-01-04 成都华昊中天药业有限公司 棘霉素类抗生素胶束及其制备方法和用途

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4873088A (en) * 1983-09-06 1989-10-10 Liposome Technology, Inc. Liposome drug delivery method and composition
US5139803A (en) * 1989-02-09 1992-08-18 Nabisco, Inc. Method and liposome composition for the stabilization of oxidizable substances
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5225212A (en) 1989-10-20 1993-07-06 Liposome Technology, Inc. Microreservoir liposome composition and method
US5395619A (en) 1993-03-03 1995-03-07 Liposome Technology, Inc. Lipid-polymer conjugates and liposomes
DE69828615T2 (de) * 1997-10-31 2005-12-01 Walter Reed Army Institute Of Research Verwendung von inhibitoren der komplementaktivierung zur herstellung eines medikaments zur inhibierung von nebenwirkungen von pharmazeutischen zusammensetzungen, die amphiphile träger oder wirkstoffträger moleküle enthalten
US6153217A (en) 1999-01-22 2000-11-28 Biodelivery Sciences, Inc. Nanocochleate formulations, process of preparation and method of delivery of pharmaceutical agents
US20160058793A1 (en) * 1999-08-30 2016-03-03 David S. Terman Tumor Targeted Sickle Erythroid Precursors, Progenitors and Hematopoietic Stem Cells, Induced Pluripotent Stem Cells, Microparticles and Liposomes for Treatment of Cancer
WO2003085122A2 (en) * 2002-04-03 2003-10-16 Montana State University-Bozeman Endophytic streptomycetes from higher plants with biological activity
GB2395097B (en) * 2002-11-07 2005-11-09 Motorola Inc A decoder apparatus and method of decoding therefor
WO2004047802A2 (en) * 2002-11-26 2004-06-10 Gilead Sciences, Inc. Liposomal formulations
EP1631669A2 (en) * 2003-04-09 2006-03-08 Biodelivery Sciences International, Inc. Cochleate compositions directed against expression of proteins
US20050129753A1 (en) 2003-11-14 2005-06-16 Gabizon Alberto A. Method for drug loading in liposomes
US20080103213A1 (en) * 2004-03-05 2008-05-01 Board Of Regents, The University Of Texas System Liposomal curcumin for treatment of neurofibromatosis
DK1746976T3 (en) 2004-05-03 2017-04-10 Merrimack Pharmaceuticals Inc LIPOSOMES SUITABLE FOR PHARMACEUTICAL SUPPLY
US20070105757A1 (en) * 2005-10-31 2007-05-10 May Thomas B Vancomycin formulations having reduced amount of histamine
EP2076614A4 (en) 2006-10-16 2012-07-04 Univ Arizona SYNTHETIC ANTIBODIES
US20090053769A1 (en) * 2007-06-18 2009-02-26 University Of Southern California Heterologous production of natural products in bacteria
AU2008316841B2 (en) * 2007-10-23 2014-04-17 Insmed Incorporated Liposomal vancomycin formulations
AU2009243009B2 (en) 2008-04-30 2014-09-11 Immunogen, Inc Potent conjugates and hydrophilic linkers
US20100008978A1 (en) * 2008-05-09 2010-01-14 The Regents Of The University Of California Nanoparticles effective for internalization into cells
CN102791260A (zh) 2009-12-04 2012-11-21 生维医药科技有限公司 低氧诱导因子抑制剂的用途
WO2011160110A1 (en) 2010-06-19 2011-12-22 Western University Of Health Sciences Novel formulation of pegylated-liposome encapsulated glycopeptide antibiotics
WO2012061590A1 (en) 2010-11-03 2012-05-10 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents comprising new ansamitocin derivatives
PL2773325T3 (pl) * 2011-11-04 2019-03-29 Enceladus Pharmaceuticals B.V. Liposomalne kortykosteroidy w leczeniu chorób zapalnych u istot ludzkich
WO2013070872A1 (en) * 2011-11-08 2013-05-16 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Methods and compositions for x-ray induced release from ph sensitive liposomes
CN103157112B (zh) * 2011-12-19 2014-12-17 沈阳药科大学 唾液酸衍生物在制备peg脂质衍生物修饰制剂中的应用
WO2014059031A2 (en) * 2012-10-09 2014-04-17 President And Fellows Of Harvard College Nad biosynthesis and precursors in the prevention and treatment of inflammation
WO2014159760A1 (en) 2013-03-13 2014-10-02 Mallinckrodt Llc Liposome oxaliplatin compositions for cancer therapy
WO2015017807A1 (en) 2013-08-01 2015-02-05 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Liposomal formulations for the treatment of bacterial infections
TWI656887B (zh) * 2013-12-24 2019-04-21 國邑藥品科技股份有限公司 脂質體懸浮液及其製備方法與應用

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