CN102791260A - 低氧诱导因子抑制剂的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用低氧诱导因子(HIF抑制剂)治疗血液癌症。本发明还涉及用HIF抑制剂诱导急性髓细胞白血病缓解。本发明还涉及用HIF抑制剂抑制癌症干细胞(CSC)的维持或存活功能。

Description

低氧诱导因子抑制剂的用途
发明领域
本发明涉及治疗血液癌症(hematologic cancers)。
发明背景
据估计在2009年会报道12,800例急性髓细胞白血病(acute myeloidleukemia,AML)的新病例，有9000例死亡。尽管通过化疗大多数病例可以实现完全缓解(remission)，但是很少见长期缓解或治愈。因此，现有技术对AML缓解后(AML postremission)的治疗有需要。然而缓解后白血病通常会对化疗更具抗性。这背后的原因包括多药物抗性蛋白Pgp1的表达，以及可能位于药物不能到达的骨髓区域。
AML已被假定为与癌症干细胞(CSC)相关。这一设想得到如下支持：在AML细胞中表型可鉴别的CSC亚群、以及在体外集落形成单位(CFU)模型和异种移植模型二者的AML模型中对CSC进行测试的有效性。
除AML之外许多人类癌症也含有CSC，其被认为是推动和维持肿瘤生长以及对治疗抗性的原因。因此了解CSC的自我更新机制不仅对于了解癌症发展的基础机制是关键的，其也提供了长效癌症治疗的新途径。与正常干细胞很相似，CSC的自我更新涉及两种相关的过程。首先，干细胞必须经过增殖以产生未分化的细胞。正常干细胞和癌症干细胞已知的自我更新途径(包括Wnt和Hedgehog)调节增殖，这至少部分是通过控制Bmi-1的表达，Bmi-1是正常干细胞和癌症干细胞增殖的关键调节物。其次，CSC在肿瘤发生期间必须以未分化状态存活。CSC的存活可能是造成治疗血液癌症(如AML)时的困难的原因。此类癌症尤其对于缓解后治疗更不具妥协性(intransigent)。因此，现有技术中需要另外的靶向于CSC的血液癌症疗法，包括治疗AML的疗法。本发明通过公开了一种用HIF抑制剂治疗血液癌症的方法而满足了这一需要。
发明概述
本文提供了原因治疗血液癌症的方法，其可包括将HIF抑制剂施用于对其有需要的哺乳动物。HIF抑制剂可以是棘霉素、2-甲氧基雌二醇、或格尔德霉素。棘霉素可以以非毒性剂量施用，其可以是1-100mcg/m2。棘霉素可以与Hedgehog途径抑制剂共同施用，所述Hedgehog途径抑制剂可以是环杷明(cyclopamine)。HIF抑制剂还可以与第二种癌症疗法共同施用。
血液癌症可以是淋巴瘤或者白血病，其可以是急性髓细胞白血病。哺乳动物可以携带细胞遗传学改变，其可以是47,XY,+21;46,XY;45,XX,-7;46,XY,t(8;21)(q22;q22);           49,XX,+8,+8,inv(16)(p13.1q22),+21;46,XX,inv(16)(p13q22)/46,XX;      46,XY,inv(16)(p13q22);46,XX,t(2;13)(p23;q12)/46,XX;     45,XY,inv(3)(q21q26.2),-7/46,XY;47,XY,+4,inv(5)(p15q13)/47,sl,-4,+22;   46,XX,t(11;19)(q23;p13.1);46,XX,t(6;11)(q27;q23)/46,XX;或46,XX,t(1;17)(p13;q25),t(9;11)(p22;q23)。哺乳动物可以携带CD38-CD34+表型的白血病细胞。患者可携带癌症干细胞，其可以是多药物抗性的、化疗抗性的或者放疗抗性的。
本文还提供了用于诱导急性髓细胞白血病缓解的方法，其可以包括将棘霉素施用于对其有需要的患者。棘霉素可以以非毒性剂量施用，其可以是1-100mcg/m2。本文还提供了用于抑制癌症干细胞(CSC)的维持或存活功能的方法，其可包括将CSC与HIF抑制剂接触。
附图简述
图1.从自发小鼠淋巴瘤中分离CSC。a.分离自脾肿大TGB转基因小鼠(enlarged spleen TGB transgenic mice)的淋巴瘤细胞，经BD FACSAria而分选为c-Kit+Sca-1+或c-Kit-Sca-1-部分。左图显示了肿瘤表型而右图显示了分选后纯度。b.肿瘤细胞的集落形成活性位于c-Kit+Sca-1+亚群内。将c-Kit+Sca-1+或c-Kit-Sca-1-部分(103/孔)铺板于1%甲基纤维素培养基，在培养7天后于显微镜下对集落数进行计数。所显示的数据是一式三份平板中集落数的平均值和SD，并且代表三个独立的实验。插图显示了典型集落的形态。c.来自接受了c-Kit+Sca-1+或c-Kit-Sca-1-肿瘤细胞的小鼠的脾的照片。d.产生自c-Kit+Sca-1+细胞的淋巴瘤的表型保守性和进化。用抗CD8和Vβ8的抗体对淋巴瘤细胞染色。左图显示了具有突出的高Vβ8+转基因CD8+细胞的经培养的淋巴瘤细胞；而右图显示了来自Rag-2-/-小鼠的脾的淋巴瘤细胞，所述小鼠接受了纯化自培养的淋巴瘤细胞的c-Kit+Sca-1+细胞。注意Vb8-群体的增加。右图中放大的双阴性群体是定居的脾细胞(residentspleen cells)。
图2.CSC的HIF成瘾(addiction)。a.淋巴瘤CFU经棘霉素的选择性消融(ablation)。用给定剂量的药理学有效药物在培养基中将培养的淋巴瘤细胞处理24小时。洗掉药物后，在1%甲基纤维素的培养基中培养细胞，在6-7天后对集落数进行计数。所显示的数据是三份重复的平均值和SD并且经3个独立的实验所证实。b.用于TGB淋巴瘤中HIF活性的报道系统。用于HIF活性的慢病毒构建体的图解在顶部显示。Pause,消除慢病毒启动子作用的序列片段；HRE，低氧应答元件；TATA，TATA序列(TATATAAT)(顶部)。左下，报道分子的确认。用编码突变体HIF1α(P402A/P577A)的cDNA或者载体对照与HRE驱动的EGFP报道分子或者HER突变体报道分子一起瞬时转染HEK293细胞。用流式细胞术分析细胞以检测转导后36小时的EGFP表达。右下，淋巴瘤CSC中的HIF活性，这是由WT HRE中GFP表达细胞和c-Kit的共表达而非突变体HRE慢病毒报道分子所揭示的(下部中间图)。c.棘霉素在抑制淋巴瘤CSC中的HIF1α活性时的IC50。将HRE报道系统所转染的淋巴瘤细胞在不同浓度的棘霉素存在下培养12小时，将c-Kit+GFP+细胞的%针对未处理组(1.13%,其被定义为100%)而进行标准化。导致c-Kit+GFP+细胞的50%减少的剂量被定义为IC50。d.相对于来自造血祖细胞的CFU，HIF抑制剂对于淋巴瘤CSC的CFU的选择性。将来自TGB或正常骨髓的c-Kit+Sca-1+细胞用给定浓度的棘霉素处理过夜，之后铺板于含有1%甲基纤维素的培养基以用于CFU测定。所显示的数据是未经处理对照的%，并且是三份重复的平均值+/-S.D。e.低剂量棘霉素的治疗效果。将培养的淋巴瘤细胞(1X106/小鼠)i.p.注射进免疫感受态B10.BR小鼠。14天后，以两天间隔注射10μg/Kg/注射的棘霉素，总共5次。对照小鼠仅接受载剂(vehicle)。每天观察小鼠存活。
图3.在常氧条件下淋巴瘤CSC中的增加的HIF活性。a&b.基因表达。用BD FACSAria分选系统将培养的淋巴瘤细胞分选为c-Kit+Sca-1+或c-Kit-Sca-1-部分。通过RT-PCR来确定HIF1α、HIF-2α、HIF-3α、VHL及Glut1的转录物。a.RT-PCR产物的照片。b.由实时PCR测量的相对表达：与HPC相比。在来自TGB肿瘤(Spl肿瘤)或者骨髓(BM)的经FACS分选的c-Kit+Sca-1+细胞中的HIF1α和VHL的相对表达。表达水平表示为管家基因,β-肌动蛋白的分数。c.棘霉素选择性诱导CSC的凋亡。将培养的淋巴瘤细胞用20pM棘霉素或者培养基中的载剂处理16小时。将处理的细胞用c-Kit和Sca-1染色，随后用膜联蛋白V染色。用FACS分析来分析经染色的细胞。所显示的数据代表3个独立实验。d.AML样品中肿瘤细胞的4个亚群的分离。将来自AML患者MI-AML-36的骨髓细胞对CD3和CD38进行染色并分选成4种亚群用于RNA分离。分选前样品和用于分选的门控(gate)示于左图，分选后的群体示于中图和右图。每个门控中的细胞百分比提供在各图中。e.在亚群中的HIF1α(顶部)和GLUT1的表达。所显示的数据是基因的转录物水平的平均值+/-S.D.，表示为来自相同样品的β-肌动蛋白的%。在所测试的所有6个AML样品中均观测到CD34+CD38-样品中增强的表达。f.所有6个AML样品中的AML-CFU均对棘霉素高度敏感。将来自外周血(PB)或者骨髓(BM)的AML样品(2.5x105/ml)用2ml培养基中给定浓度的棘霉素预处理24小时。然后将存活的经处理细胞以105/孔铺板，用于一式三份进行CFU测定。7-10天后计数集落数。所显示的数据是未处理对照的%平均值+/-S.D.。
图4.ShRNA沉默揭示了HIF1α在CSC维持中的关键作用。a.沉默HIF1α消除c-Kit+Sca-1+CSC。用具有混杂的(scrambled)ShRNA(核心序列5'-tct cgt cat aac aag ttg a-3)的慢病毒载体对照或者表达两种独立ShRNA(sh-1或sh-2)的慢病毒载体来感染TGB肿瘤细胞。感染后3天，用流式细胞术分析这些大量的肿瘤细胞。对GFPhi和GFPlo细胞进行门控以及分析c-Kit和Sca-1的表达。b.HIF1αshRNA降低CFU。用慢病毒HIF1αshRNA或者具有混杂的ShRNA的载体通过离心接种(spinoculation)来感染培养的淋巴瘤细胞，并用5μg/ml杀稻瘟素对感染的细胞进行1周的选择。将感染的细胞以2X105/孔的密度接种于1%甲基纤维素培养基中。集落数是在显微镜下进行计数的。所显示的数据是一式三份重复的集落数的平均值和SD，并且代表3个独立的实验。c.HIF1αshRNA消除肿瘤起始活性。将TGB肿瘤细胞用表达混杂的ShRNA或HIF1αShRNA的慢病毒感染3次，然后注射至B 10.BR小鼠(9X 105/小鼠,i.p.)中。通过Kaplan-Meier分析来比较受体小鼠(n=5)的存活。尸检揭示所有死亡的(succumbed)小鼠均发展出淋巴瘤。此图中的所有数据均重复至少2次。
图5.Vhl基因的下调对于CSC的维持是关键的。a.c-Kit+Sca-1+细胞中Vhl转录物的下调。如图1所述将TGB胸腺瘤细胞分选成c-Kit+Sca-1+和c-Kit-Sca-1-亚群，用实时PCR确定Vhl转录物的水平。b.Vhl的异位表达消除CSC。用慢病毒载体对照、或表达两种Vhl cDNA的慢病毒载体来感染TGB肿瘤细胞。感染后3天，用流式细胞术来分析这大量的肿瘤细胞。将GFPhi和GFPlo细胞进行门控并分析c-Kit和Sca-1的表达。c.Vhl表达降低肿瘤CFU。用慢病毒Vhl cDNA或者载体通过离心接种来感染培养的淋巴瘤细胞，并用5μg/ml杀稻瘟素对感染的细胞进行1周的选择。将转导的细胞以2X105/孔的密度接种于1%甲基纤维素培养基中。集落数在显微镜下进行计数。所显示的数据是一式三份重复的集落数的平均值和SD，并且代表3个独立的实验。d.Vhl cDNA的异位表达抑制肿瘤起始活性。将TGB肿瘤细胞用慢病毒表达载体单独或者HIF1αShRNA感染3次，然后注射至B10.BR小鼠(9X105/小鼠,i.p.)中。通过Kaplan-Meier分析来比较受体小鼠(n=5)的存活。尸检揭示所有死亡的小鼠均发展出淋巴瘤。这个实验已重复2次。
图6.HIF与Notch途径协同作用以维持CSC。a.CSC的集落形成活性的抑制。用给定剂量的L685,458处理培养的淋巴瘤细胞24小时。之后，将细胞在含有1%甲基纤维素的培养基中培养，并在6-7天后计数集落数。所显示的数据是一式三份样品的平均值+/-SD并且代表至少3个独立实验的值。b.CSC中增强的Notch活性，由Hes1转录物水平所表示。将来自TGB转基因小鼠中具有肿瘤的脾的淋巴瘤细胞分选成c-kit+Sca-1+或c-kit-Sca-1-部分。通过实时PCR测定这两个部分中的Hes1αnd mRNA的表达。c.3种不同HIF抑制剂对Notch活性的抑制。将培养的TGB淋巴瘤细胞用APC缀合的抗c-Kit-抗体染色并根据厂商方案用抗APC包被的MACS珠富集2次(Militenyi Biotec)。将c-kit阳性细胞富集的样品(60.4%c-Kit+细胞)用HIF抑制剂处理16小时。提取来自经处理细胞的mRNA用于实时PCR定量。显示的数据是三份样品的平均值+/-SD并且代表至少3个独立实验的值。2ME2,2-甲氧基雌二醇;GA,格尔德霉素.d-g.Notch在维持CSC中的关键作用，由Notch I-C dRdA1-42dOP的异位表达所揭示。d.具有抑制Notch靶基因Hes表达的强显性阴性活性的截短的Notch基因。左上图显示Notch蛋白的胞内部分的示意图，其中RAM、7个锚蛋白重复序列(ANK1-7)、转录激活结构域(TAD)、C-末端OPA(O)及PEST(P)序列的位置被标出。左下图显示dRdA1-4dOP突变体的组成，其缺乏RAM、ANK1-4和C-末端O和P序列但是具有核定位序列(NLS)的插入。右图显示了Hes表达的显性抑制。在通过载体对照或者dRdA1-4dOP突变体的3次连续转导之后，分离RNA并且通过定量PCR测量Hes转录物。所显示的数据是一式三份样品的平均值并且已经通过2个独立实验进行重复。e.Notch I-CdeltaRAM消除c-Kit+Sca-1+亚群。用慢病毒载体对照或者表达dRdA1-4dOP的慢病毒载体感染TGB肿瘤细胞。感染后3天，通过流式细胞术分析这些大量的肿瘤细胞。将GFPhi和GFPlo细胞进行门控并分析c-Kit和Sca-1的表达。f.Notch IC-dRdA1-42dOP降低CSC的体外自我更新活性。用编码dRdA1-4dOP的慢病毒载体或者载体对照通过离心接种来感染培养的淋巴瘤细胞。将相同数目的感染细胞接种到1%甲基纤维素培养基中3天，在显微镜下计数具有GFP的集落数。进行相同程序用于第二轮集落形成测定。所显示的数据是三份平板中的集落数的平均值和SD并且代表至少3个独立实验的值。g.dRdA1-4dOP消除肿瘤起始活性。讲TGB肿瘤细胞用慢病毒表达载体单独或者HIF1αShRNA感染3次，然后注射进B10.BR小鼠(1X106/小鼠,i.p.)。通过Kaplan-Meier分析比较受体小鼠的存活，统计学显著性通过log-rank检验确定。尸检揭示所有死亡的小鼠均发展出淋巴瘤。这个实验已重复2次。h-l.HIF1α通过阻止Hes1结合至Hes1启动子中的N-盒而抑制Hes1的负反馈调节。h.Hes1启动子的示意图。详细序列在图16中提供。i.在激活Hes1启动子中HIF1α不与Notch直接合作。将Hes1启动子序列(-225至+65,TSS为+1)连接至GFP并与载体对照或者含有编码HIF1α(P402,577>A,称为HIF1α-PA)的cDNA、Notch-IC cDNA或Notch-IC+HIF1αPA的载体一起转染进293细胞。通过转染细胞的绿色荧光强度测量启动子活性。所显示的数据是相对强度。讲Hes1-GFP报道分子的强度定义为1.0。通过共转染的Renilla萤光素酶来将转染效率标准化。j.HIF1α部分抑制Hes1介导的Hes1启动子的阻抑。如在i中一样，除了使用Hes1或突变体HIF1αcDNA。k.HIF1α消除Notch信号传导中Hes1表达的阴性自身调节。如在i中一样，除了使用不同组合的cDNA。将不存在转染的Hes、HIF1α-PA和Notch时的Hes1报道分子的活性定义为1.0。l.HIF1α-PA和Hes1之间对Hes启动子的竞争抑制，如chIP所揭示。将编码Flag或Myc-标记的Hes1和HIF-1αPA的cDNA转染进293细胞。转染后36小时，转染子进行ChIP。将每组中的相等部分的细胞用于Western印迹以证实当Hes1和HIF1α-PA单独或者组合转染时基本上相同的蛋白质表达水平(数据未示出)。给出的数据是输入DNA的%的平均值+/-S.D.(n=3)，使用图16中标记的引物经实时PCR测定。i-l中所示出的数据是三份重复的平均值+/-S.D。该实验已重复至少3次。
图7.c-Kit+Sca-1+亚群的后代是异质的，其小部分保留c-Kit+Sca-1+表型。如图1a所述对离体肿瘤细胞进行分选并如图1b所述铺板。5天后，将来自集落的细胞再分析其c-Kit和Sca-1的表达。
图8.具有HIF活性的细胞表达c-Kit和Sca-1。用含有WT HRE序列的慢病毒载体感染TGB肿瘤细胞，如图2d所示。感染后3天，用抗c-Kit和抗Sca-1 mAb染色肿瘤细胞。分析GFP+和GFP-细胞的c-Kit和Sca-1表达。
图9.HIF-1α抑制剂对c-Kit+Sca-1+肿瘤细胞集落形成的抑制。所示的数据是三份培养物的平均值和S.D并且已重复至少3次。a.棘霉素的连续抑制。培养从TGB肿瘤细胞分选的c-Kit+Sca-1+细胞并且再分选c-Kit+Sca-1+细胞。将第一轮和第二轮分选的细胞(1000/孔)在存在或不存在不同剂量的棘霉素时培养24小时。洗掉药物并且将细胞铺板。培养5天后对集落进行计数。b.由其它类别HIF1α抑制剂2-甲氧基雌二醇(2ME2)和格尔德霉素(GA)进行的抑制，但是P38抑制剂SB203580不抑制。如a所述，除了使用额外的药物做对照。c.在低浓度(5-20pM)，棘霉素抑制集落起始细胞的自我更新但不影响集落形成。将相同等份的TGB肿瘤细胞在含有甲基纤维素的培养基中于存在给定浓度棘霉素的情况下培养5天，此时计数第一轮集落。洗掉药物后，将来自第一轮的相同等份的细胞再铺板。计数新形成的集落。相对于未处理组对集落数进行标准化。未处理培养物中的集落数：第一轮362；第二轮202。
图10.HPC活性对高剂量棘霉素的连续抗性。对于第一轮，用给定浓度的棘霉素将总骨髓细胞(106)处理24小时。洗掉药物后，将相应于0.25x106接种细胞/孔的等份铺板于含有甲基纤维素的培养基中用于CFU测定。在第5天计数集落。对于第二轮分析，将从第一轮中未处理组分离的0.5x106活细胞与给定浓度的棘霉素温育。将相应于5x104细胞/孔的等份再铺板并且在第5天计数集落。所显示的数据是三份重复的平均值和SD。
图11.肿瘤移植后4天施用的棘霉素的治疗效果。将培养的淋巴瘤细胞(1X106/小鼠)腹膜内移植至免疫感受态B10.BR小鼠中。4天后，以两天间隔注射10μg/Kg/注射的棘霉素，总共3次。对照小鼠仅接受载剂。
图12.多种HIF-1α抑制剂阻抑TGB肿瘤细胞的自我更新和肿瘤起始活性。a.2-甲氧基雌二醇(2ME2)和格尔德霉素对集落形成的剂量依赖性抑制。b.HIF抑制剂2ME2和格尔德霉素对肿瘤形成的抑制。将培养的淋巴瘤细胞(9X105/小鼠)腹膜内注射至免疫活性B10.BR小鼠中。8天后，以两天间隔注射给定剂量的2ME2和格尔德霉素，总共5次。对照小鼠仅接受载剂。每日观察小鼠存活。给出的P值是通过比较处理组和对照组经log-ran检验获得。
图13.在本研究所用的范围，棘霉素抑制HIF1α但不抑制cMyc活性。用Ebox或HRE报道分子(见图2b)与编码c-Myc或HIF1α–PA的载体共转染HEK293细胞。16小时后，用不同浓度的棘霉素处理细胞24小时。c-Myc和HIF1α的转录活性经流式细胞术进行定量。未处理组定义为100%。所显示的数据是三份重复的平均值+/-S.D.。该实验重复3次。
图14.HIF-1αshRNA功效的验证。用编码在常氧条件下稳定的HIF-1α突变体(P402A/P577A)的cDNA与对照载体V(核心混杂的序列：5'-cgcgtagcgaagctca taa-3')或HIF-1αshRNA-1和-2一起转染293T细胞。在转染后24小时用抗Flag mAb探查细胞裂解物。
图15.TGB肿瘤细胞表达Notch 1和Notch 2。将TGB肿瘤细胞分选成c-Kit+Sca-1+和c-Kit-Sca-1-亚群。Notch家族成员的表达经RT-PCR检测。
图16.小鼠和人Hes1启动子序列的序列。N-盒标记为红色，CBF1标记为蓝色，TSS标记为黄色，而HRE标记为绿色。用于报道分子构建和ChIP测定中的实时PCR的引物标记为粉红色。
图17.棘霉素消除NOD-SCID小鼠中的AML。A.受体小鼠血液中AML衍生的人类细胞的消除。所示的数据是平均值和S.D.(n=3)。B.棘霉素治疗的小鼠中缺乏人类细胞。所显示的数据是骨髓细胞中人类CD45表达的代表谱。用两个其它小鼠得到基本相同的谱。B.未治疗小鼠骨髓中的人类AML。左图显示骨髓细胞的人类CD45染色，而右图显示经门控的人类CD45+细胞的表型。所显示的数据代表每组3个小鼠。
图18.HIF1α是异种小鼠模型中人类AML的治疗性消除的靶。a.AML样品中4个肿瘤细胞亚群的分离。将来自AML患者MI-AML-71的骨髓细胞针对CD34和CD38染色并分选成4个亚群用于RNA分离。分选前样品和用于分选的门控示于左图，而分选后的群体示于中图和右图。每个门控中的细胞百分比提供在各图中。b.各个亚群中HIF1α(上部)和GLUT1的表达。所示的数据是基因的转录物水平的平均值+/-S.D.，表示为来自相同样品的β-肌动蛋白的%。在所测试的所有6个AML样品中均已观测到CD34+CD38-样品中增强的表达。c.在所有6个AML样品中的AML-CFU均对棘霉素高度敏感。用2ml培养基中给定浓度的棘霉素预处理来自外周血(PB)或者骨髓(BM)的AML样品(2.5x105/ml)24小时。然后将经处理的存活细胞以105/孔铺板，用于一式三份重复进行CFU测定。7-10天后计数集落数。所显示的数据是未经处理对照的%平均值+/-S.D.。d.棘霉素选择性消除AML细胞的CD34+CD38-亚群。将原代AML样品以5X105/ml密度与给定剂量的棘霉素或载剂对照在含有10%胎牛血清和人类细胞因子混合物(由CSF、GM-CSF和IL-3组成)的RPMI 1640中培养30小时。将细胞用抗CD34,CD38的抗体及膜联蛋白V和DAPI结合染色。所显示的数据是膜联蛋白V+DAPI-/+细胞的%。减去载剂处理组中的膜联蛋白V+细胞的%。实心符号显示CD34+CD38-亚群的数据，而空心符号显示大量白血病细胞的数据(对于AML9、AML32、AML60和AML71是CD34+CD38+；对于AML15和AML36是CD34-CD38+)。这些数据重复2次。e-h.棘霉素的治疗效果。e.NOD-SCID小鼠中的人类AML的治疗效果，数据是最后一次治疗后40天受体小鼠骨髓中的人类CD45(hCD45)+细胞的%。所述治疗效果重复2次。f.棘霉素不诱导体内AML细胞的分化，这是由治疗和未治疗组中大量人类细胞上的成熟骨髓标记的缺乏而揭示的。所显示的数据是人类CD45+细胞中的CD14和CD15谱。g.棘霉素对CD34+CD38-亚群的选择性耗竭。上图所显示的数据是小鼠骨髓中的CD34+CD38-亚群的丰度，而下图显示了人类白血病细胞中的所述丰度。h.尽管存在白血病细胞，来自棘霉素治疗小鼠的骨髓在新的NOD-SCID小鼠中未能重新起始白血病。代表性谱在上图中显示，而来自每组5个小鼠的总结数据在下图中显示。
发明详述
本发明人令人惊奇地发现HIF抑制剂棘霉素能够以非毒性剂量治疗血液癌症。这表明了淋巴瘤CSC对棘霉素的独特的易感性，并且低至30mcg/m2的棘霉素就足以在100%的接受者中消除淋巴瘤。例如，在体外所测试的所有6例人类AML样品的AML-CFU均高度易感于棘霉素。
基于棘霉素针对腹膜内(i.p.)移植鼠肿瘤B16黑素瘤和P388白血病的抗肿瘤活性，其在大约20年前就被用于进行临床试验。然而，对于一些实体肿瘤的II期临床试验的棘霉素功效的测试揭示了棘霉素有显著毒性并且功效很低或者无功效。棘霉素用于治疗血液癌症的功效未经测试。另外，先前人类临床试验中使用的身体表面调节的剂量比本发明人发现的有效治疗血液癌症的剂量的高大约100倍。先前的人类临床试验中观测到的毒性可能是由于使用的过量剂量，而缺乏效果可能是由于临床终点未反映淋巴瘤CSC中对HIF的独特需求。因此，棘霉素可以用于治疗与CSC相关的血液癌症，包括淋巴瘤，以及特别是以非毒性的剂量。
1.定义
本文使用的术语学仅用于描述特定的实施方案，而不是要用于限定。如说明书和权利要求书中所用，单数形式“一个”和“所述”(“a,”“an”和“the”)包括复数形式，除非上下文有相反含义。
对于本文数字范围的记述，介于其间的具有相同精度的每个数字都是清楚地涵盖在内的。例如，对于范围6-9，除了6和9还涵盖数字7和8，对于范围6.0-7.0，则清楚地涵盖数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、和7.0。
“肽”或“多肽”是氨基酸的连接序列，可以是天然的、合成的或者天然和合成的修饰或组合。
“治疗”当是指保护动物免于疾病时，是指预防、压制(suppressing)、阻抑或完全消除疾病。预防疾病包括在疾病发作之前将本发明的组合物施用于动物。压制疾病包括在诱导疾病之后但是在其临床表现之前将本发明的组合物施用于动物。阻抑疾病包括在疾病临床表现之后将本发明组合物施用于动物。
2.低氧诱导因子抑制剂
本文提供的是低氧诱导因子蛋白(HIF)的抑制剂。HIF抑制剂可以是棘霉素、2-甲氧基雌二醇或格尔德霉素。
a.棘霉素
棘霉素可以是肽抗生素如N,N'-(2,4,12,15,17,25-六甲基-11,24-双(1-甲基乙基)-27-(甲硫基)-3,6,10,13,16,19,23,26-八氧合-9,22-二氧杂-28-硫代-2,5,12,15,18,25-六氮杂双环(12.12.3)二十九碳烷-7,20-二基)双(2-喹喔啉甲酰胺)。棘霉素可以是微生物衍生的喹喔啉(quinoxaline)抗生素，其可以由多刺链霉菌(Streptomyces echinatus)所产生。棘霉素可以具有下述结构：
Figure BDA00001604768400111
棘霉素可以具有美国专利号5,643,871公开的结构，该内容援引加入本文。棘霉素也可以是棘霉素衍生物，其可以包括如Gauvreau et al.,Can JMicrobiol,1984;30(6):730-8;Baily et al.,Anticancer Drug Des1999;14(3):291-303;或Park and Kim,Bioorganic & Medicinal ChemistryLetters,1998;8(7):731-4中所述的修饰，所述文献的内容援引加入本文。棘霉素也可以是棘霉素的双喹喔啉(bis-quinoxaline)类似物。
b.HIF
HIF可以是功能性低氧诱导因子，其可以包含组成型b亚型和氧调节的a亚基。HIF可以在广泛的人类癌症类型中过表达，这些癌症可以是乳腺癌、前列腺癌、肺癌、膀胱癌、胰腺癌或卵巢癌。尽管不受理论束缚，增加的HIF表达可以是肿瘤实体内低氧的结果。遗传学和环境因素甚至在常氧条件下也均可以导致增加的HIF表达。von Hippel-Lindau基因(VHL)(其可以是肾癌的肿瘤抑制物)的种系突变可以在常氧条件下防止HIF的降解。可以通过HIF的上调和/或VHL的下调而在常氧条件下组成型地保持HIF活性。HIF可以是HIF1α或HIF2α。
c.药物组合物
还提供了包含HIF抑制剂的药物组合物。药物组合物可以是常规方式配制的片剂或锭剂形式。例如，用于口服施用的片剂和胶囊可以含有常规的赋形剂，可以是结合剂、填充剂、润滑剂、崩解剂和湿润剂。结合剂包括但不限于糖浆、阿拉伯树胶(accacia)、明胶、山梨糖醇、黄蓍胶、淀粉胶浆剂和聚乙烯吡咯烷酮。填充剂可以是乳糖、糖、微晶纤维素、玉米淀粉、磷酸钙和山梨糖醇。润滑剂包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸、滑石粉、聚乙二醇和二氧化硅。崩解剂可以是马铃薯淀粉和淀粉乙醇酸钠。湿润剂可以是月桂基硫酸钠。片剂可以根据本领域公知方法进行包衣。
药物组合物还可以是液体配制物，如水性或油性悬浮液、溶液、乳液、糖浆和酏剂。药物组合物还可以配制为干燥产品用于在使用前用水或者其它合适载剂配制。这种液体制剂可以含有添加剂如悬浮剂、乳化剂、非水性载剂和防腐剂。悬浮剂可以是山梨糖醇糖浆、甲基纤维素、葡萄糖/糖的糖浆、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶和氢化食用脂肪。乳化剂可以是卵磷脂、山梨聚糖单油酸酯和阿拉伯树胶。非水性载剂可以是食用油、杏仁油、分级分离的椰子油、油性酯、聚乙二醇和乙醇。防腐剂可以是甲基或丙基p-羟基苯甲酸酯和山梨酸。
药物组合物还可以配制为栓剂，其可以含有栓剂基础如可可脂或者甘油。药物组合物还可以配制用于吸入，其可以呈例如溶液、悬浮液或乳液的形式，其可以作为干粉施用，或者呈气雾剂形式，其中使用推进剂如二氯二氟甲烷或者三氯氟甲烷。本文提供的物质还可以配制为经皮配制物，其包含水性或非水性载剂如霜剂、软膏剂、洗剂、糊剂、医用橡皮膏、贴剂或者膜。
药物组合物还可以配制用于胃肠外施用，如经注射、肿瘤内注射或连续输注。用于注射的配制物可以呈在油性或水性载剂中的悬浮液、溶液或者乳液形式，并且可以含有配制剂，包括但不限于悬浮剂、稳定剂和分散剂。药物组合物还可以以粉末形式提供用于与合适的载剂(包括但不限于无菌无热原水)进行重配。
药物组合物还可以配制为缓释剂(depot preparation)，其可以通过植入或者通过肌肉内注射而施用。药物组合物可以与合适的聚合或疏水材料(例如，作为在可接受油中的乳液)、离子交换树脂配制，或者作为微溶衍生物(sparingly soluble derivatives)(例如，作为微溶盐)。
(1)施用
药物组合物的施用可以是口服、胃肠外、舌下、经皮、直肠、经粘膜、局部、经吸入、含服(via buccal)施用，或者其组合。胃肠外施用包括但不限于静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、鞘内和关节内。对于兽医使用，物质可以作为合适的可接受的配制品根据正常兽医实践施用。兽医可以容易地确定最适合特定动物的给药方案和途径。所述药物组合物可以施用于人类患者、猫、狗、大型动物或者禽类。
药物组合物可以与其它治疗同时或者有节律地(metronomically)施用。术语“同时”如本文所用是指药物组合物和其它治疗可以彼此在48小时、优选24小时、更优选12小时、更优选6小时、最优选3小时或更少时间之内施用。术语“有节律(metronomically)”如本文所用是指药剂的施用是在与其它治疗不同的时间并以相对于重复施用的一定频率施用。
药物组合物可以在另一治疗之前的任何时间点被施用，包括大约120hr、118hr、116hr、114hr、112hr、110hr、108hr、106hr、104hr、102hr、100hr、98hr、96hr、94hr、92hr、90hr、88hr、86hr、84hr、82hr、80hr、78hr、76hr、74hr、72hr、70hr、68hr、66hr、64hr、62hr、60hr、58hr、56hr、54hr、52hr、50hr、48hr、46hr、44hr、42hr、40hr、38hr、36hr、34hr、32hr、30hr、28hr、26hr、24hr、22hr、20hr、18hr、16hr、14hr、12hr、10hr、8hr、6hr、4hr、3hr、2hr、1hr、55min、50min、45min、40min、35min、30min、25min、20min、15min、10min、9min、8min、7min、6min、5min、4min、3min、2min和1min。药物组合物可以在药物组合物的第二个治疗之前任何时间点施用，包括大约120hr、118hr、116hr、114hr、112hr、110hr、108hr、106hr、104hr、102hr、100hr、98hr、96hr、94hr、92hr、90hr、88hr、86hr、84hr、82hr、80hr、78hr、76hr、74hr、72hr、70hr、68hr、66hr、64hr、62hr、60hr、58hr、56hr、54hr、52hr、50hr、48hr、46hr、44hr、42hr、40hr、38hr、36hr、34hr、32hr、30hr、28hr、26hr、24hr、22hr、20hr、18hr、16hr、14hr、12hr、10hr、8hr、6hr、4hr、3hr、2hr、1hr、55min、50min、45min、40min、35min、30min、25min、20min、15min、10min、9min、8min、7min、6min、5min、4min、3min、2min和1min。
药物组合物可以在另一个治疗之后任何时间点施用，包括大约1min、2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min、10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min、1hr、2hr、3hr、4hr、6hr、8hr、10hr、12hr、14hr、16hr、18hr、20hr、22hr、24hr、26hr、28hr、30hr、32hr、34hr、36hr、38hr、40hr、42hr、44hr、46hr、48hr、50hr、52hr、54hr、56hr、58hr、60hr、62hr、64hr、66hr、68hr、70hr、72hr、74hr、76hr、78hr、80hr、82hr、84hr、86hr、88hr、90hr、92hr、94hr、96hr、98hr、100hr、102hr、104hr、106hr、108hr、110hr、112hr、114hr、116hr、118hr和120hr。药物组合物可以在药剂的药物组合物治疗之后的任何时间点施用，包括大约120hr、118hr、116hr、114hr、112hr、110hr、108hr、106hr、104hr、102hr、100hr、98hr、96hr、94hr、92hr、90hr、88hr、86hr、84hr、82hr、80hr、78hr、76hr、74hr、72hr、70hr、68hr、66hr、64hr、62hr、60hr、58hr、56hr、54hr、52hr、50hr、48hr、46hr、44hr、42hr、40hr、38hr、36hr、34hr、32hr、30hr、28hr、26hr、24hr、22hr、20hr、18hr、16hr、14hr、12hr、10hr、8hr、6hr、4hr、3hr、2hr、1hr、55min、50min、45min、40min、35min、30min、25min、20min、15min、10min、9min、8min、7min、6min、5min、4min、3min、2min和1min。
d.剂量
药物组合物可以以治疗有效量的HIF抑制剂而施用给需要其的哺乳动物。用于治疗中所需的治疗有效量随着被治疗病症的性质、希望抑制HIF活性的时间长度、以及患者的年龄/状况而变化。
剂量可以是非毒性剂量。剂量还可以是HIF活性被抑制但是c-Myc活性不受影响的剂量。但是通常，用于成年人治疗所采用的剂量典型地可以在每天1-100mcg/m2的范围，或者在每天1-100mcg/m2的阈值量或更低，这是通过身体表面调节剂量所测定的。希望的剂量可以方便地以单剂量施用，或者作为多剂量以合适的间隔施用，例如作为每天2、3、4或更多个亚剂量。多剂量可以是希望的或者需要的。
剂量可以是这样的剂量，如大约1mcg/m2,2mcg/m2,3mcg/m2,4mcg/m2,5mcg/m2,6mcg/m2,7mcg/m2,8mcg/m2,9mcg/m2,10mcg/m2,15mcg/m2,20mcg/m2,25mcg/m2,30mcg/m2,35mcg/m2,40mcg/m2,45mcg/m2,50mcg/m2,55mcg/m2,60mcg/m2,70mcg/m2,80mcg/m2,90mcg/m2,100mcg/m2,200mcg/m2,300mcg/m2,400mcg/m2,500mcg/m2,600mcg/m2,700mcg/m2,800mcg/m2,900mcg/m2,1000mcg/m2,1100mcg/m2,或1200mcg/m2，及其范围。
剂量也可以是低于或等于大约1mcg/m2，2mcg/m2，3mcg/m2，4mcg/m2，5mcg/m2，6mcg/m2，7mcg/m2，8mcg/m2，9mcg/m2，10mcg/m2，15mcg/m2，20mcg/m2，25mcg/m2，30mcg/m2，35mcg/m2，40mcg/m2，45mcg/m2，50mcg/m2，55mcg/m2，60mcg/m2，70mcg/m2，80mcg/m2，90mcg/m2，100mcg/m2，200mcg/m2，300mcg/m2，400mcg/m2，500mcg/m2，600mcg/m2，700mcg/m2，800mcg/m2，900mcg/m2，1000mcg/m2，1100mcg/m2，或1200mcg/m2及其范围的剂量。
e.共施用
HIF抑制剂可以与另一种药理学物质共施用。所述物质可以是Hedgehog途径抑制剂，其可以是环杷明。所述物质也可以是第二种癌症疗法。所述癌症疗法可以是细胞毒性剂或者细胞抑制剂。细胞毒性剂可以选自由以下所组成的组：烷基化物质(包括但不限于氮芥、乙撑亚胺(ethylenimine)衍生物、烷基磺酸酯、亚硝基脲和三氮烯):尿嘧啶氮芥、甲川氯(chlormethine)、环磷酰胺(
Figure BDA00001604768400151
)，异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、哌泊溴烷(pipobroman)、三乙烯三聚氰胺、三乙烯硫代磷酸酰胺(triethylenethiophosphoramine)、白消安、卡莫司汀、洛莫司汀、链脲菌素、达卡巴嗪和替莫唑胺；抗代谢物(包括但不限于叶酸拮抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂):氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶、氟尿苷、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤、，6-硫鸟嘌呤、磷酸氟达拉滨、喷司他丁(pentostatine)和吉西他滨；天然产物及其衍生物(例如长春花生物碱类、抗肿瘤抗生素、酶、淋巴因子和表鬼臼毒素)；长春碱、长春新碱、长春地辛、博来霉素、更生霉素、柔红霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、ara-c、紫杉醇(紫杉醇作为
Figure BDA00001604768400152
商业销售)、光辉霉素、脱氧助间型霉素(deoxycoformycin)、丝裂霉素-c、l-天冬酰胺酶、干扰素(优选)、依托泊苷(etopside)和替尼泊苷。其它增殖性细胞毒性剂是诺维本(navelbene)、CPT-11、阿那曲唑(anastrazole)、来曲珠利(letrazole)、卡培他滨、雷洛昔芬(reloxafine)、环磷酰胺、异环磷酰胺(ifosamide)和屈洛昔芬(droloxafine)。
细胞毒性剂可以是微管影响剂(microtubule affecting agent)，其可以干扰细胞有丝分裂。微管影响剂可以选自由以下所组成的组：别秋水仙碱(allocolchicine)(NSC 406042)、软海绵素B(halichondrin B)(NSC 609395)、秋水仙碱(NSC 757)、秋水仙碱衍生物(例如NSC 33410)、多拉司他汀10(NSC 376128)、美坦辛(NSC 153858)、根霉素(NSC 332598)、紫杉醇(
Figure BDA00001604768400161
NSC 125973)、
Figure BDA00001604768400162
衍生物(例如衍生物(例如NSC 608832)、硫代秋水仙碱(NSC 361792)、三苯甲基半胱氨酸(NSC 83265)、硫酸长春碱(NSC49842)、硫酸长春新碱(NSC 67574)、天然和合成的埃博霉素(epothilones)包括但不限于埃博霉素A、埃博霉素B和盘皮海绵内酯(discodermolide)(参见Service,(1996)Science,274:2009)雌氮芥、诺考达唑和MAP4。微管影响剂还可以如Bulinski(1997)J.Cell Sci.110:3055 3064;Panda(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:10560-10564;Muhlradt(1997)Cancer Res.57:3344-3346;Nicolaou(1997)Nature 387:268-272;Vasquez(1997)Mol.Biol.Cell.8:973-985;和Panda(1996)J.Biol.Chem 271:29807-29812中所述,其内容援引加入本文。
细胞毒性剂还可以选自由以下组成的组：表叶毒素(epidophyllotoxin);抗肿瘤酶；拓扑异构酶抑制剂；丙卡巴肼；米托蒽醌；铂配位络合物如顺铂和卡铂；生物应答修饰剂；生长抑制剂；抗激素治疗剂；甲酰四氢叶酸；替加氟；及造血生长因子。
细胞抑制剂可以选自由以下组成的组：激素和类固醇(包括合成的类似物)：17α-炔雌醇、己烯雌酚、睾酮、强的松、氟甲睾酮、丙酸屈他雄酮、睾内酯、醋酸甲地孕酮、甲泼尼龙、甲基睾酮、泼尼松龙、曲安西龙、氯烯雌醚(hlorotrianisene)、羟孕酮、氨鲁米特、雌氮芥、醋酸甲孕酮、亮丙瑞林、氟他胺、托瑞米芬和诺雷德。细胞抑制剂还可以是抗血管生成剂如基质金属蛋白酶抑制剂或VEGF抑制剂，其可以是抗VEGF抗体或者小分子如ZD6474或SU6668。所述物质还可以是来自Genentech的抗Her2抗体，EGFR抑制剂如EKB-569(可逆抑制剂),或者免疫特异于EGFR的Imclone抗体C225,或者src抑制剂。
细胞抑制剂可以选自由以下组成的组：
Figure BDA00001604768400163
(比卡鲁胺,阿斯利康(Astra Zeneca))，其使得雄激素依赖性癌变成非增殖性的；抗雌激素
Figure BDA00001604768400164
其抑制雌激素依赖性乳腺癌的增殖或生长；以及细胞增殖信号的转导的抑制剂。细胞增殖信号的转导的抑制剂可以选自由以下组成的组：表皮生长因子抑制剂、Her-2抑制剂、MEK-1激酶抑制剂、MAPK激酶抑制剂、PI3抑制剂、Src激酶抑制剂和PDGF抑制剂。
3.方法
a.治疗血液癌症
本文提供了治疗血液癌症的方法。所述方法可以包括将HIF抑制剂施用于需要其的哺乳动物。哺乳动物可以是人类患者。血液癌症可以是淋巴瘤或者白血病。血液癌症可以通过抑制CSC的维持或存活功能而进行治疗。不受理论束缚，抑制HIF可以靶向于癌症干细胞和癌症抗性。
还不受理论束缚的是，血液癌症中的CSC可能需要自我更新，其可能类似于组织细胞中的需求。CSC可能需要低氧环境，而暴露于高水平氧可能降低CSC功能。CSC功能的自我更新可被靶向于HIF途径的药物强烈抑制。CSC可能对HIF成瘾(addicted to)，其可能与HIF的过表达及VHL的下调相关。HIF过表达及VHL下调可能对于CSC的维持是关键的。HIF可能与Notch途径协同作用以介导淋巴瘤CSC的自我更新。
(1)癌症干细胞
癌症干细胞可以是化疗抗性的或者放疗抗性的。CSC也可以是多药物抗性的。
(2)急性髓细胞白血病
白血病可以是急性髓细胞白血病(AML)。AML可以与特征为基因型CD38-CD34+的CSC相关。AML还可以与携带细胞遗传学改变的患者相关。所述细胞遗传学改变可以选自下组：47,XY,+21;46,XY;45,XX,-7;46,XY,t(8;21)(q22;q22);      49,XX,+8,+8,inv(16)(p13.1q22),+21;46,XX,inv(16)(p13q22)/46,XX; 46,XY,inv(16)(p13q22);46,XX,t(2;13)(p23;q12)/46,XX;45,XY,inv(3)(q21q26.2),-7/46,XY;47,XY,+4,inv(5)(p15q13)/47,sl,-4,+22;   46,XX,t(11;19)(q23;p13.1);46,XX,t(6;11)(q27;q23)/46,XX;和46,XX,t(1;17)(p13;q25),t(9;11)(p22;q23)。
AML的CSC可以对于HIF抑制剂是极度敏感的。AML的CFU可以高度易感于HIF抑制剂，其IC50在50-120pM之间。HIF抑制剂可以用于消除AML的CSC，作为缓解后治疗的一部分。
b.诱导急性髓细胞白血病缓解
本文还提供了用于诱导急性髓细胞白血病缓解的方法，其可以包括将HIF抑制剂施用于需要其的哺乳动物。HIF抑制剂可以在急性髓细胞白血病缓解期间施用于哺乳动物以防止未来复发。HIF抑制剂可以如本文其它部分所述那样施用。
c.抑制CSC的维持或者存活功能
本文还提供了抑制CSC的维持或者存活功能的方法。将CSC与HIF抑制剂接触可以抑制所述维持或者存活功能。所述接触可以包括将HIF抑制剂施用于需要抑制CSC的维持或者存活功能的哺乳动物。HIF抑制剂可以如本文其它部分所述那样施用。
本发明具有多个方面，由下述非限制性实施例进行例证。
实施例1
在同基因免疫感受态宿主中鉴别自我更新的淋巴瘤起始细胞
百分之百的具有Epm2a基因的插入突变的转基因小鼠(TGB)死于(succumb to)淋巴瘤。在搜索TGB淋巴瘤细胞中的潜在的干细胞标记的表达时，发现一个小亚群的细胞表达c-Kit和Sca-1，其部分地组成了HSC的标记(图1a)。为了测试这些细胞是否可具有CSC活性，基于c-Kit和Sca-1的表达对来自具有肿瘤的TGB转基因小鼠脾的淋巴瘤细胞进行分选(图1a右图)。如图1b所示，没有集落从103个c-Kit-Sca-1-细胞形成。恰恰相反的是，103个c-Kit+Sca-1+细胞大约产生800个集落，这提示该亚群中的每个细胞均是CFU。大多数集落是紧密填充的(图1b插图)，这与得自骨髓HSC的多样性集落相反。c-Kit+Sca-1+细胞的后代由c-Kit+Sca-1+亚群及c-Kit-Sca-1-亚群组成(图7)。因此，c-Kit+Sca-1+细胞是分离自TGB淋巴瘤的单细胞之中的自我更新群体。为了确定c-Kit+Sca-1+细胞是否也是体内淋巴瘤起始细胞，我们将c-Kit+Sca-1+细胞或者c-Kit-Sca-1-细胞腹膜内(i.p.)注射进同基因B10BR小鼠。如表1、expt 1所示，通常在注射后10周内，接受100c-Kit+Sca-1+细胞的3个小鼠全部发展出淋巴瘤，而104个c-Kit-Sca-1-细胞的接受者甚至在40周观测后也无一发展出淋巴瘤。通过静脉内注射的重复实验也获得了相似的结果(表1，expt 2)。所述淋巴瘤特征在于脾肿大(图1c)、淋巴结和转移至肝和肺而不转移至胸腺(数据未示出)，与先作为胸腺瘤出现然后转移至其它器官的自发发生的淋巴瘤不同。另外，从分离自肿瘤的c-Kit+Sca-1+亚群未实现其它细胞谱系，这表明c-Kit+Sca-1+细胞不是肿瘤浸润性HSC。在三轮系列移植中(表1，expt 5)，c-Kit+Sca-1+细胞而非c-Kit-Sca-1-以可观的效力产生淋巴瘤。肿瘤保持T细胞标记CD8的表达，但是逐渐丧失转基因TCR的细胞表面表达(图1d和表S1)。更重要地，c-Kit+Sca-1+细胞的频率保持在大约1%(表S1)。因此，自我更新肿瘤起始细胞在c-Kit+Sca-1+肿瘤细胞之中。
表1.用c-Kit和Sca-1标记鉴别CSC
供体细胞分离自离体淋巴瘤(expt 1和2)或者是已经体外培养超过30代。实验1、3和4注射途径是腹膜内(i.p.)，实验2是静脉内。当10c-Kit+Sca-1+细胞移植进B10.BR小鼠中时无肿瘤生长(0/3)。在实验5中，供体细胞分离自离体淋巴瘤并且腹膜内注射。第1轮获得的淋巴瘤细胞被分选并且注射用于第2轮，然后重复于第3轮。无肿瘤小鼠被观察22-40周以证实缺乏肿瘤生长。
表S1
Figure BDA00001604768400201
表S1.肿瘤细胞表型的保守和动态变化。来自自发肿瘤的c-Kit+Sca-1+细胞经FACS分选而分离并系列移植至同基因B10.BR小鼠中。每一轮中产生的单细胞悬浮液经流式细胞术使用特异于CD8、Vb8、c-Kit和Sca-1的抗体进行分析。脾细胞中细胞的%被示出。N.D.，未确定。
使用用于测定造血祖细胞的集落形成单位(CFU)的培养基，可以建立TGB淋巴瘤细胞的长期培养物。在超过30次传代中，c-Kit+Sca-1+细胞保持在大约总淋巴瘤细胞群的0.5-1.5%，并且以未削弱的效率维持体外的CFU(数据未示出)和体内的肿瘤起始作用(表1，expt 3和4)。c-Kit+Sca-1+细胞保持在低%这个事实说明这些标记在集落形成起始后发生的分化期间已经丧失。c-Kit+Sca-1-群体通常在体外培养期间消失。在培养期间Kit+Sca-1-细胞的损失不伴随肿瘤起始作用和CFU的丧失(数据未示出)。
实施例2
HIF1α表达的上调在CSC维持中的关键作用
已经确立了c-Kit+Sca-1+细胞是淋巴瘤模型中的CSC，使用CFU作为替代测定鉴别了负责CSC活性的自我更新的分子程序。如图2a所示，使用药理学有效剂量的Ly294002(PI-3激酶-AKT信号途径的抑制剂)、纳巴霉素(mTor-S6K蛋白合成途径)、SB216763(GSK3β-beta-连环蛋白途径)、
Figure BDA00001604768400202
(PKC抑制剂)、2-DG(己糖激酶抑制剂)、H89(PKA-CREB)、PDTC(NF-κB信号途径)、PD98059、SB203580和SP600126(分别为MAPK家族ERK,p38和JNK)进行的治疗对CFU没有作用。相反，低剂量的棘霉素消除了CFU。
为了监测CSC的HIF1α活性，产生了慢病毒报道分子，其由在最小TATA盒序列和EGFP序列上游的三个HIF1应答元件(HRE)组成，如图2b所示。引入中止序列(pause sequence)以消除LTR启动子对报道分子的作用。为了验证所述报道分子，将HEK293细胞用对照载体或者突变体HIF1α(P402A/P577A)cDNA与WT或者突变体HRE驱动的EGFP报道分子一起瞬时转染。突变使得HIF1α在常氧条件下通过抵抗脯氨酰羟基化介导的降解而发挥功能。如预期的，HER-EGFP报道分子被HIF1α特异性诱导，但是不被对照载体诱导。相反，突变体HRE EGFP报道分子不应答HIF1α(图2b，左下图)。使用这个慢病毒载体，确定了棘霉素对具有活性HIF活性的细胞的%的作用。如图2b右下图所示，发现了表达c-Kit和Sca-1标记的独特的GFP+群体(图2b和图8)GFP的表达反映了HIF活性，因为其可以被HRE的突变消除(图2b，下部中间图)这个亚群对棘霉素的敏感性被进一步测试。如图2c所示，棘霉素消除CSC的IC50为29.4pM，这比IC50在nM范围的其它细胞类型(Kong et al.,2005)显著更敏感。
为证实HIF1活性在CSC功能中的作用，测试了HIF抑制剂对体外CFU和体内肿瘤起始活性的作用。因为来自淋巴瘤CSC和正常造血祖细胞(HPC)的CFU可以在相似条件下进行测定，测试了棘霉素对HPC vs淋巴瘤CSC的选择性。如图2d所示，淋巴瘤CSC比HPC对棘霉素敏感大约100倍。在系列铺板实验中，测试了棘霉素在第一轮和第二轮CSC中的作用。如图9a所示，两轮中的CSC均同等地易感于棘霉素。特异性通过3种不同类别的HIF1α抑制剂的作用而非P38抑制剂而证实(图S9b)。值得注意的是，在对第一轮中的CFU作用很小的剂量(5-20pM)，第二轮集落形成中的CFU显著降低(图S9c)。这些数据提示CSC的体外自我更新比集落起始对于HIF1α更加成瘾。相反，第一轮和第二轮的HPC-CFU都未受显著更高剂量的棘霉素的影响(图10)。
基于这些观测，我们开发了HIF抑制剂的治疗潜力。将1X106个培养的淋巴瘤细胞腹膜内注射至免疫感受态B10BR小鼠中。4-14天后，接受淋巴瘤细胞的小鼠用载剂处理或者用2天间隔的3次(图11)或5次(图2e)200ng/小鼠的棘霉素注射处理。如图2e和图11所示，未处理的小鼠仅存活6-10周，而所有处理的小鼠均存活直至在肿瘤细胞注射后134天(图2e)或252天(图11)安乐死。两种其它的已知HIF抑制剂2-甲氧基雌二醇(Mabjeesh et al.,2003)和格尔德霉素(Minet et al.,1999)也降低CSC的CFU和肿瘤起始作用，尽管功效较低(图12)。功效的差异可能是由于不同的作用机制和生物利用度所致。这些HIF抑制剂的治疗功效证实HIF可以作为有效的治疗靶。
为确定CSC中高HIF1α活性的分子机制，将淋巴瘤细胞分选为-Kit+Sca-1+或c-Kit-Sca-1-亚群并经RT-PCR分析HIF1α、HIF-2α和HIF-3α的表达。如图3a所示及图3b所定量，c-Kit+Sca-1+细胞表达HIF1α的水平是c-Kit-Sca-1-细胞的4倍。在c-Kit+Sca-1+细胞中未检测到HIF2α或HIF3α的表达。与更高的HIF1α水平一致，HIF1α的已知靶基因葡萄糖转运蛋白Glut1的表达也在c-Kit+Sca-1+细胞中高度升高。相反，在c-Kit+Sca-1+骨髓细胞中未观测到HIF1α和Glut1的上调。为测试HIF活性是否是c-Kit+Sca-1+CSC存活选择性所需的，用低剂量棘霉素(20pM)处理肿瘤细胞培养物16小时，并分析凋亡性c-Kit+Sca-1+和c-Kit-Sca-1-肿瘤细胞的百分比。在载剂处理组，大约1.8%c-Kit+Sca-1+和c-Kit-Sca-1-肿瘤细胞结合膜联蛋白V。棘霉素使c-Kit+Sca-1+肿瘤细胞中的膜联蛋白V+细胞增加6倍，或者增加至大约10%。在c-Kit-Sca-1-肿瘤细胞中未观测到作用(图3c，下图)。在涉及10pM棘霉素的三个独立的实验中，c-Kit+Sca-1+肿瘤细胞的凋亡平均是在载剂对照中观测到的3.8+0.8倍。在同一培养物中，棘霉素处理组中的c-Kit-Sca-1-肿瘤细胞的凋亡与载剂组大致相同(1.2+/-0.3倍)。两组之间的差异是高度显著的(P=0.01)。
为测试HIF1α的总的显著性，我们分析了人急性髓细胞白血病(AML)起始细胞中HIF1α的表达和功能。AML的白血病起始细胞具有表型CD38-CD34+。为确定HIF1α基因是否在这一亚群中过表达，经FACS分选CD38-CD34+,CD38+CD34+,CD38-CD34-和CD38+CD34-亚群(图3d)，并且分析HIF1α及其靶GLUT1的表达。如图3e所示，CD38-CD34+亚群具有最高水平的HIF1α转录物。相应地，GLUT1转录物也在CD38-CD34+细胞中升高。所有6例测试的AML均显示在CD38-CD34+亚群中的增加的HIF1α和GLUT1表达(数据未示出)，其表明增加的HIF1α表达是携带AML起始细胞的标记的一般特征。
CD38-CD34+也已知形成体外AML集落，其为我们提供了测试HIF1α显著性的简单测定。如图6f所示，对于所测试的全部例子，棘霉素抑制集落形成的IC50在50-120pM之间。尽管棘霉素也已知抑制c-Myc活性，其IC50是在nM范围。如图13所示，在本研究中使用的范围中，棘霉素强烈抑制HIF1α但对于c-Myc功能无作用。鉴于所使用的AML病例具有多样的遗传学改变这个事实(表S2)，棘霉素的广泛抑制与HIF1α在包括CD38-CD34+AML起始细胞的AML-CFU中的重要功能一致。
表S2
a进行下列基因的遗传学分析并且发现是野生型的(WT)：Trp53，NPM1，K-RAS和N-RAS.
b括号中的数字是在所分析的总共20个细胞中发现相同核型的细胞数方法
为获得表S2中所示的数据，使用primer3程序(Steve Rozen and HelenJ.Skaletsky(2000)Primer3 on the WWW for general users and for biologistprogrammers.In:Krawetz S,Misener S(eds)Bioinformatics Methods andProtocols:Methods in Molecular Biology.Humana Press,Totowa,NJ,pp365-386)设计用于扩增p53的外显子5-9、Flt3的外显子13-15和外显子20、NPM1的外显子12及n-ras和K-ras的外显子2-3的引物。使用来自FACS分选的胚细胞的基因组DNA作为模板，使用PCR扩增感兴趣的外显子。制备DNA用于用嵌套式测序引物和Exo-SAP进行直接测序。用MutationSurveyor程序和目测检查序列追踪鉴别突变。
为确立c-Kit+Sca-1+细胞中HIF1α上调的显著性，表达HIF1αshRNA的慢病毒(shRNA的验证见图14)首先用于转导淋巴瘤细胞。使用GFP跟踪表达慢病毒载体的细胞。如图4a所示，在具有混杂ShRNA的载体对照组中，在GFPhi和GFPlow亚群中发现相等数目的c-Kit+Sca-1+细胞。相反，在两种shRNA转导的肿瘤中，GFPhi群体基本上没有c-Kit+Sca-1+细胞，这表明HIF1α的沉默消除c-Kit+Sca-1+亚群。因为在转导后第3天观测到CSC降低50倍以上，因此HIF活性是维持c-Kit+Sca-1+CSC所需的。
与这一认识一致，在药物选择以富集转导细胞后，集落形成测定揭示在HIF1αShRNA转导的细胞中降低70-80%(图4b)。为了测试HIF1α在肿瘤起始活性中的作用，对照载体(具有混杂的shRNA)或者HIF1αshRNA转导的肿瘤细胞在3轮转导后被移植进B 10.BR小鼠中。如图4c所示，用任一shRNA转导均显著降低肿瘤起始活性，如通过肿瘤相关死亡的显著延迟所判断。
实施例3
CSC中Vhl的下调对于CSC的维持是关键的
因为HIF1α在常氧条件下正常由VHL依赖性机制降解，所以还测试了CSC中Vhl的表达。数据证实c-Kit+Sca-1+细胞的Vhl转录物降低大约4倍(图5a)。为确定Vhl下调的显著性，用表达Vhl也表达GFP的慢病毒感染肿瘤细胞。比较了GFPhi和GFPlo亚群的c-Kit+Sca-1+亚群的丰度。GFPhi亚群不含c-Kit+Sca-1+细胞(图5b)。因此，高Vhl表达消除了c-Kit+Sca-1+细胞。与此一致，Vhl的异位表达显著降低肿瘤细胞的集落形成活性(图5c)。为测试降低的Vhl在肿瘤起始活性中的作用，将载体和VHL cDNA转导的肿瘤细胞移植进B10.BR小鼠。如图5d所示，用表达Vhl cDNA的慢病毒转导显著降低肿瘤起始活性，如以接受者肿瘤相关死亡的发作所判断的那样。总之，图4和图5的数据证实HIF1α的过表达和VHL的降低对于CSC活性均是关键的。
实施例4
在CSC的自我更新中HIF与Notch途径协同起作用
为了确定HIF1α活化促进CSC自我更新的背后的分子机制，检查了Wnt和Notch途径的潜在牵涉。尽管TGB肿瘤中Wnt信号传导的活化，数据证实显示抑制与Epm2a下调相关的肿瘤生长的显性阴性TCF-1不影响TGB CSC的CFU(数据未示出)。相反，g-分泌酶抑制剂L-685,458，一种Notch抑制剂，强烈阻断集落形成活性(图6a)。为确定Notch信号传导是否在CSC中过活化，c-Kit+Sca-1+细胞被分选并与大量的c-Kit-Sca-1-细胞比较Notch靶基因Hes1的表达。如图6b所示，分选的CSC具有大约3.5倍的Hes1表达的增加。为了测试增加的Notch活性是否依赖于HIF活性，使用3种不同的HIF抑制剂阻断总TGB淋巴瘤细胞和富含c-Kit+细胞的CSC中Notch靶的上调。图6c中的数据证实所有HIF抑制剂均阻断c-Kit+CSC中Hes1的表达。
在c-Kit+Sca-1+和c-Kit-Sca-1-肿瘤细胞中分析了Notch1-4的表达。如图15所示，Notch1和2而非Notch 3和4在TGB肿瘤细胞中表达。因为两种Notch基因的表达，搜索有效的抑制Notch信号传导的显性阴性突变体。通过反复试验，鉴别了Notch的强显性阴性突变体(AA1955-2370)，其包含N和C末端均截短的Notch1的胞内结构域。将来自SV40的核定位序列(NLS)插入到N末端以促进其转位进细胞核。基于NotchI-C/CSL/Mastermind/DNA复合物的结构，缺失除去了DNA结合RAM结构域和负责结合mastermind的N末端的4个锚蛋白重复序列，而返回了大部分CSL相互作用残基。由此，预测其通过防止形成mastermind-CSL-NotchIC-DNA复合物而作为Notch信号传导的显性阴性调节物起作用。所述突变体被称为dRdA1-4dOP (图6d，左图)。如图6d右图所示，显性突变体的转导导致Hes转录物降低大约30倍。为证实对于Notch信号传导的作用，TGB淋巴瘤用对照慢病毒载体或者表达dRdA1-4dOP的慢病毒载体转导。转导的细胞用GFP标记。如图6e所示，在载体对照组中，c-Kit+Sca-1+细胞百分比在GFPhi和GFPlo细胞中是可比的。相反，dRdA1-4dOP转导组，在GFPhi亚群中观测到%c-Kit+Sca-1+细胞降低5倍以上。这些数据证实Notch途径的失活防止c-Kit+Sca-1-细胞的存活。在系列铺板实验中，dRdA1-4dOP的转导降低了自我更新活性，如集落形成测定所揭示的那样(图6f)。另外，当dRdA1-4dOP或对照载体转导细胞被移植进同基因小鼠中时，清楚的是dRdA1-4dOP转导防止了淋巴瘤的发生，如存活分析所证实的那样(图6g)。
先前研究证实HIF1α可与Notch直接相互作用以在低氧条件下激活其靶基因Hey2。但是，使用针对Hes1启动活性的报道分子，未观测到Notch信号传导由氧抗性HIF1α突变体显著增强(图6h，i)。因此探索了HIF1α在Hes1表达中的功能的另外的解释。熟知的是，应答Notch信号传导，Hes1是自我限制的，并且阴性反馈由Hes1结合Hes1启动子区域的N-盒而介导。令人感兴趣地，紧接着两个关键N-盒中的每一个的后面鉴别了真正的HRE(bona fide HRE)(图6h和图16)。鉴于它们的相邻性，假想HIF1α可直接抑制Hes1的自身调节。确实，Hes1 cDNA的转染使Hes1启动子活性降低大约10倍。这一抑制作用由氧抗性HIF1α部分逆转(图6j)。类似地，在Notch IC cDNA存在下，Hes1还阻抑其自身启动子。HIF1α以剂量依赖方式逆转阻抑(图6k)。使用染色质免疫沉淀法(图6l)，观测到HIF1α与Hes1结合的区域的显著结合。令人感兴趣地，HIF1α和Hes1的结合看起来彼此竞争与该区域的结合。数据提示HIF1α可能通过拮抗Hes1的自身调节而增强Notch诱导的Hes1表达。
实施例5
HIF在CSC维持中的作用
CSC概念的重新出现依赖于鉴别自我更新肿瘤起始细胞的亚群的移植研究。因为大多数研究均涉及异种移植和同种异体移植至免疫缺陷宿主中，一些人建议CSC概念需要重新评价。目前研究的一个重要特征是使用同基因免疫感受态小鼠作为接受者。在这个研究中鉴别的CSC的自我更新能力已被3轮系列移植所证实，其中少至100个c-Kit+Sca-1+细胞就可以在接近100%的接受者中产生淋巴瘤。在这个过程中，c-Kit+Sca-1+细胞数保持为大约1%。在保持CD8共受体的表达的同时，大量淋巴瘤细胞看起来逐渐丧失T细胞受体的表达。除了产生淋巴瘤之外，几乎所有c-Kit+Sca-1+细胞均展示CFU活性。数据证实支持CSC概念的遗传学研究越来越多，尽管肿瘤模型中关于CSC存在的潜在变化不能被排除。
体外自我更新和体内肿瘤起始性质被用于鉴定CSC自我更新的分子机制。在两种测定中，HIF1α的作用被药物抑制、shRNA沉默及氧依赖性HIF抑制剂VHL的过表达而证实。因为转导载体的表达导致CSC群的几乎立即消失，并且因为棘霉素的短期处理(12小时)导致c-Kit+Sca-1+细胞由于凋亡增加而特异性降低，因此，HIF1α可能是CSC存活所需的。
小鼠淋巴瘤中HIF活性增加是由于HIF1α的过表达及Vhl的下调导致的。因为Vhl负责HIFa的氧介导的降解，因此HIFa活性的增加不再需要低氧环境。另外，应注意在所测试的6例AML样品中，我们未观测到VHL的表达增加(数据未示出)。但是基于其靶的表达及对棘霉素的敏感性，HIF是活性的。因此，可能存在额外的机制允许HIF在AML-CFU中的氧抗性功能。低剂量棘霉素对所有测试的AML样品的作用提示本文所述机制可能一般适用于在具有高水平血液供应的区域中的肿瘤，包括白血病和淋巴瘤。对于具有不良血液供应的实体肿瘤，所述机制可以是起作用的，即使没有HIF过表达或者VHL下调。
实施例6
用于CSC维持的分子途径
在研究负责CSC维持的分子途径中，观测到Notch途径的活性增强，如相比于在大量肿瘤细胞中，在CSC中Notch靶基因的表达增加所揭示。数据证实所测试的所有3种HIF抑制剂均阻断c-Kit+亚群中的Notch活化。令人感兴趣地，抑制看起来是对于TGB淋巴瘤的c-Kit+亚群特异性的，该亚群富含CSC，因为如果使用总TGB淋巴瘤细胞则药物对于Notch靶表达无作用。Notch在CSC维持和肿瘤发生中的显著性经有效的CSC消除及通过Notch信号传导的显性抑制剂dRdA1-4dOP在TGB肿瘤细胞中的异位表达导致的肿瘤发生而证实。同样，选择性消除证实Notch信号传导是CSC维持特别需要的，而大量肿瘤细胞的存活不依赖于Notch信号传导。总之，这些数据证实HIF通过调节Notch信号传导维持CSC。
Hes1是已知对于干细胞/祖细胞功能关键的重要Notch靶。本文所述数据表明HIF1α增强了Notch对Hes1的诱导。与使用Hey2启动子作为读出的先前研究相反，未观测到HIF1α和Notch IC之间在Hes1基因的诱导中的直接合作。而是，显示HIF1α通过抑制其与Hes1启动子的N-盒的结合而防止Hes1基因的阴性反馈自身调节。鉴于Notch在各种组织干细胞中的通用的但并非必然普遍的作用，数据表明CSC和组织干细胞之间的重要的功能保守。
实施例7
HIF途径在CSC功能中起作用
验证HIF途径在CSC功能中的作用的一种重要方式是测试HIF抑制剂棘霉素是否能用于治疗异种模型中的AML。进行了使用两个AML样品的研究。6x106个来自血液的AML细胞(AML71-PB,其基于细胞遗传学数据预后不良，或者AML-15-PB，其基于细胞遗传学具有中度的预后；见上表S2)移植进亚致死辐射的NOD-SCID小鼠中。转移后2周开始，一半的受体小鼠接受3次每次200ng/小鼠/注射的红霉素注射，隔天一次。间歇2周后，这些小鼠再接受3次注射。另一半小鼠不治疗作为对照。在移植后7周，两组中所有未治疗的小鼠(每组3个小鼠)变为垂死的，而所有棘霉素治疗小鼠均是健康的。AML-71PB接受者的外周血和骨髓分析示于图17。
如图17A所示，未治疗组在血液中具有平均12%的人类CD45+细胞。棘霉素治疗完全除去了人类CD45+细胞。在为治疗骨髓中观测到清楚限定的人类细胞群，但是棘霉素治疗骨髓中没有(图17B和C)。人类CD45+细胞的进一步分析表明它们是不成熟的，因为它们缺乏CD14和CD15标记(图17C右下图)。另外，高比例人类CD45+细胞展示AML干细胞的标记(CD34+CD38-)，如图17C所示(右上图)。这些数据证实异种模型的可行性及用棘霉素治疗血液癌症如AML的关键支持。这些数据帮助证实HIF1α活性是用于血液恶性的干细胞的维持所需的，并且HIF是癌症治疗的有价值的治疗靶。更重要地，数据证实相同原理适用于人类AML。
实施例8
用于AML的白血病干细胞的治疗消除
这个实施例证实HIF抑制剂对于人类血液恶性的治疗潜力。AML用作模型，因为AML白血病干细胞(AML-LSC)的表型是经良好鉴定的，并且因为体内AML-LSC功能可以用已建立的异种模型测定。AML-LSC具有CD34+CD38-的表型。为确定HIF1α基因是否在这个细胞亚群中过表达，经FACS分选CD34+CD38-,CD34+CD38+,CD34-CD38-和CD34-CD38+亚群(图18a)，分析HIF1α及其靶GLUT1的表达。如图18b所示，CD34+CD38-亚群具有最高水平的HIF1α转录物。相应地，GLUT1转录物也在CD38-CD34-细胞中升高。所有6例测试的AML均显示在CD38-CD34-亚群中的增加的HIF1α和GLUT1表达(数据未示出)，其表明增加的HIF1α表达是携带AML-LSC细胞的标记的一般特征。
CD34-CD38-细胞也已知形成体外AML集落，由此提供了测试HIF1α显著性的简单测定。如图18c所示，对于所测试的全部例子，棘霉素抑制集落形成的IC50在50-120pM之间。尽管棘霉素也已知抑制c-Myc活性，其对c-Myc的IC50是在nM范围。棘霉素的广泛抑制与HIF1α在包括CD34+CD38-AML-LSC的AML-CFU中的重要功能一致。
传统的癌症治疗看起来富集癌症干细胞。一种NFkB抑制剂，小白菊内酯(parthenolide)的二甲基氨基类似物，显示出对AML-LSC的一些选择性。因为HIF1α活性看起来在AML中是选择性激活的，因此AML-LSC可能是由棘霉素选择性靶向的。如图18d所示，与显性AML细胞(对于大多数，CD34+CD38+，但是对于两个AML病例，CD34-CD38+)相比，低剂量棘霉素选择性诱导CD34+CD38-群的凋亡。
使用人类AML样品的异种AML模型被建立以测试棘霉素是否可以用作AML的潜在治疗剂。用来自AML患者的原代临床样品重构了具有未成熟人类髓细胞的经辐射NOD.SCID小鼠特征是人类CD45、CD11b的表达，但不表达成熟的骨髓标记CD14和CD15。显著地，移植后15天开始用棘霉素短期治疗完全消除了来自样品AML 150的人类细胞并且显著降低了AML 71的人类白血病负荷(图18e)。由缺乏成熟骨髓标记CD14和CD15判断，棘霉素治疗小鼠中的残余细胞未分化(图18f)。
AML71的不完全缓解使得可以使用CD34+CD38-标记确定棘霉素是否选择性降低AML-LSC。棘霉素降低骨髓中的CD34+CD38-细胞的百分比10倍以上(图18g，上图)。甚至在人类CD45+区室中，AML-LSC的相对丰度也降低(图18g，下图)。为证实棘霉素对白血病起始细胞的作用，进行了系列移植研究以确定棘霉素是否降低AML-LSC的自我更新。如图18h所示，尽管来自未治疗小鼠的骨髓在所有新接受者中诱导白血病，但是来自棘霉素治疗小鼠的骨髓未能在任何接受者中这样做。因此，棘霉素治疗骨髓中的残余细胞不含AML-LSC。
实施例9
实验程序
实施例1-7中的材料和方法如下所述。
AML样品
在2005至2009年之间在密西根大学综合癌症中心(University ofMichigan Comprehensive Cancer Center)经诊断的AML患者被招募至本研究中。所述研究经University of Michigan Institutional Review Board批准。在招募前从所有患者获得了书面知情同意。使用相同的AML诊断标准(>=20%原粒细胞在骨髓或外周血中)，并且通过回顾诊断时血液病理学家解释的实验室和病理学报告确定FAB亚分类。细胞遗传学风险分层根据SWOG/ECOG标准确定。
抗体、流式细胞术及免疫荧光
特异于CD117(c-kit)和Ly-6A/E(Sca-1)的荧光染料缀合的抗体购自e-Bioscience(Ja Jolla,CA)，而特异于CD8和Vβ8的那些购自BectonDickinson-Pharmingen(Ja Jalla,CA)。细胞表面标记经流式细胞术用LSRII(Becton Dickinson,Mountain View,CA)分析。特异的亚群经FACSAria分选。
RT-PCR和实时PCR
HIF1α,HIF-2α,HIF-3α,VHL和Glut1的表达经RT-PCR和实时PCR确定。所用引物是HIF1α,正向,5’-agtctagagatgcagcaagatctc-3’;反向,5’-tcatatcgaggctgtgtcgactga-3’(PCR),5’-ttcctcatggtcacatggatgagt-3’(实时PCR);hif-2a,正向,5’-cgacaatgacagctgacaaggag-3’;反向,5’-ttggtgaccgtgcacttcatcctc-3’;hif-3a,正向,5’-atggactgggaccaagacaggtc-3’;反向,5’-agcttcttctttgacaggttcggc-3’;vhl,正向,5’-tctcaggtcatcttctgcaac-3’;反向,5’-aggctccgcacaacctgaag-3’;Glut1,正向5’-tgtgctgtgctcatgaccatc-3’和反向5’-acgaggagcaccgtgaagat-3’;mHes1F:gccagtgtc aacacgacaccgg,mHes1R:tcacctcgttcatgcactcg;HIF1αF,5’-ccatgtgaccatgaggaaatgagag-3’;HIF1αR,5’-tcatatccaggctgtgtcgactgag-3’;GLUT1F,5’-tcaatgctgatgatgaacctgct-3’;GLUT1R,5’-ggtgacacttcacccacataca-3’。
ShRNA介导的HIF1α的(敲低)及VHL和dRdA1,2dOP的异位表达
携带siRNA的慢病毒载体是现有技术已知的。HIF1α-ShRNA-1的核心序列是5’-ctagagatgcagcaagatc-3’,而HIF1α-ShRNA-2的核心序列是5’-gagagaaatgcttacacac-3’。使用相同载体表达全长VHL cDNA及显性阴性Notch突变体dRdA1-42dOP (AA1995-2370)。肿瘤细胞培养物用对照慢病毒或编码HIF1αshRNA,dRdA1-42dOP或VHL cDNA的慢病毒经离心接种感染。培养物用5μg/ml杀稻瘟素选择5天以除去未感染细胞。
用于肿瘤细胞和骨髓细胞的体外集落形成测定是本领域已知的。
体内肿瘤发生测定
给定数目的总肿瘤细胞或者分选的亚群被注射进免疫活性B10.BR小鼠或者RAG-2-/-BALB/c小鼠。垂死的小鼠被认为是到达实验终点并且被安乐死。治疗效果用Kaplan Meier存活分析而分析。

Claims (21)

1.用于治疗血液癌症的方法，包括将低氧诱导因子(HIF)抑制剂施用于需要其的哺乳动物。
2.权利要求1的方法，其中所述HIF抑制剂是HIF1α抑制剂。
3.权利要求1的方法，其中所述HIF抑制剂选自由棘霉素、2-甲氧基雌二醇和格尔德霉素所组成的组。
4.权利要求1的方法，其中以非毒性剂量施用所述棘霉素。
5.权利要求4的方法，其中所述剂量是1-100mcg/m2。
6.权利要求3的方法，其中所述棘霉素与Hedgehog途径抑制剂共同施用。
7.权利要求6的方法，其中所述Hedgehog途径抑制剂是环杷明。
8.权利要求1的方法，其中所述HIF抑制剂与第二种癌症疗法共同施用。
9.权利要求1的方法，其中所述血液癌症是白血病或淋巴瘤。
10.权利要求9的方法，其中所述白血病是急性髓细胞白血病。
11.权利要求10的方法，其中所述哺乳动物携带细胞遗传学改变。
12.权利要求11的方法，其中所述细胞遗传学改变选自由以下所组成的组：
47,XY，+21;46,XY；
45,XX,-7;
46,XY，t(8;21)(q22;q22);
49,XX,+8,+8,inv(16)(p13.1q22),+21;
46,XX,inv(16)(p13q22)/46,XX;
46,XY，inv(16)(p13q22);
46,XX,t(2;13)(p23;q12)/46,XX;
45,XY，inv(3)(q21q26.2),-7/46,XY；
47,XY，+4,inv(5)(p15q13)/47,sl,-4,+22;
46,XX,t(11;19)(q23;p13.1);
46,XX,t(6;11)(q27;q23)/46,XX;和
46,XX,t(1;17)(p13;q25),t(9;11)(p22;q23).
13.权利要求9的方法，其中所述哺乳动物携带表型CD38-CD34+的白血病细胞。
14.权利要求10的方法，其中所述哺乳动物携带癌症干细胞。
15.权利要求14的方法，其中所述癌症干细胞是多药物抗性的。
16.权利要求14的方法，其中所述癌症干细胞是化疗抗性或者放疗抗性的。
17.用于诱导急性髓细胞白血病缓解的方法，包括将棘霉素施用于需要其的患者。
18.权利要求17的方法，其中以非毒性剂量施用所述棘霉素。
19.权利要求18的方法，其中所述剂量是1-100mcg/m2。
20.用于抑制癌症干细胞(CSC)的维持或存活功能的方法，包括将CSC与HIF抑制剂接触。
21.用于防止急性髓细胞白血病未来复发的方法，包括在从急性髓细胞白血病缓解期间将HIF抑制剂施用于患者。
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