CN105050603A - 生物标记物 - Google Patents

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Abstract

本发明部分地针对选择性癌症治疗方案，其基于对编码MLL1的核酸中是否存在突变或对是否出现MLL1水平下降的检测。

Description

生物标记物
技术领域
本公开针对用于治疗癌症患者的新型个性化疗法、试剂盒、可传送形式信息和方法。
背景技术
热激蛋白90(HSP90)被公认是抗癌靶标。Hsp90是高丰度和必需蛋白质，担任分子伴侣以确保客户蛋白的构象稳定性、形状和功能。伴侣的Hsp90家族由4个成员组成：位于细胞溶质的Hsp90α和Hsp90β，位于内质网的GRP94，以及位于线粒体的TRAP1。Hsp90是构成约1％-2％全部蛋白的丰富细胞伴侣。
Hsp90在应激蛋白中是独特的，因为它对大部分多肽的生物发生是不必要的。Hsp90与称为“客户蛋白”的癌蛋白形成复合体，所述蛋白是在生长控制、细胞存活和组织发育中起关键作用的构象不稳定信号转导因子。这类结合防止这些客户蛋白降解。Hsp90客户蛋白子集如Raf、AKT、磷酸AKT、CDK4和包括ErbB2在内的EGFR家族，是在参与细胞生长、分化和凋亡中起关键作用的致癌信号分子，所述过程都是对癌细胞重要的过程。抑制Hsp90的内源性ATP酶活性会破坏Hsp90-客户蛋白相互作用,导致其经泛素蛋白酶体通路降解。
Hsp90伴侣在其N末端结构域具有保守的ATP结合位点，属于小ATP酶亚家族，称为DNA旋转酶、Hsp90、组氨酸激酶和MutL(GHKL)亚家族。Hsp90的陪伴(折叠)活性取决于其就分离酶而言较弱的ATP酶活性。然而，显示Hsp90的ATP酶活性在其与称为伴侣分子的蛋白相联后增强。因此，Hsp90蛋白在体内作为大的动态蛋白复合体的亚基。Hsp90对真核细胞存活是必需的且在许多肿瘤中过表达。
Hsp90抑制剂妨碍HSP90协助新生多肽折叠和蛋白复合体正确组装或分解的功能并抑制癌细胞生长、分化和生存。AUY922和HSP990是新型非格尔德霉素衍生Hsp90抑制剂且在广泛突变和野生型人类癌症中显示显著抗肿瘤活性。
然而，Hsp90抑制剂的功效通过癌细胞响应Hsp90抑制而减少。先前研究显示热激转录因子1(HSF1)依赖性热激反应对调节限制Hsp90抑制剂功效的正反馈回路重要。HSF1敲减(knockdown)与Hsp90抑制剂的组合对体外增殖和体内肿瘤生长产生显著抑制效果。HSF1敲减还提高Hsp90抑制剂降解癌蛋白、诱导癌细胞凋亡、减少ERK通路活性的能力。HSF1表达还在HCC中显著上调。
HSF1转录活性由Hsp90抑制剂诱导且通过上调保护性“热激”反应和其它转录程序提供抗性机制。然而，HSF1是转录因子且在当前阶段无法成药。这促使我们鉴定HSF1的关键可成药转录因子，其对Hsp90抑制剂诱导的HSF1转录活性重要。这些新鉴定的HSF1-调节因子有助于理解HSF1转录功能如何调节。
大量证据表明患者基因图谱能决定患者对治疗性疗法的响应。考虑到有大量治疗可用于患癌对象，确定可影响例如对特定药物反应的遗传因子能用于向患者提供个性化治疗方案。这种个性化治疗方案向患者提供使治疗益处最大化的可能性，同时尽可能减少与替代的或不太有效的治疗方案关联的相关副作用。因此，需要鉴定能用于预测患者是否可能响应特定疗法的因子。
发明内容
本发明基于以下发现：H3K4甲基转移酶MLL1在癌细胞中的表达水平能用于选择可能响应使用治疗有效量的至少一种化合物进行治疗的患癌对象，所述至少一种化合物靶向、减少或抑制Hsp90的内源性ATP酶活性和/或经泛素蛋白酶体通路降解、靶向、减少或抑制Hsp90客户蛋白。这类化合物称为“热激蛋白90抑制剂”或“Hsp90抑制剂”。适用于本发明的Hsp90抑制剂示例包括但不限于格尔德霉素衍生物、坦螺旋霉素(Tanespimycin)(17-烯丙氨基-17-去甲氧基格尔德霉素)(也称为KOS-953和17-AAG)；根赤壳菌素；6-氯-9-(4-甲氧基-3,5-二甲基吡啶-2-基甲基)-9H-嘌呤-2-胺甲磺酸盐(也称为CNF2024)；IPI504；SNX5422；5-(2,4-二羟基-5-异丙基-苯基)-4-(4-吗啉-4-基甲基-苯基)-异噁唑-3-羧酸乙基酰胺(AUY922)；和(R)-2-氨基-7-[4-氟-2-(6-甲氧基-吡啶-2-基)-苯基]-4-甲基-7,8-二氢-6H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-5-酮(HSP990)；或其药学上可接受盐。
特别地，发现患癌个体的样品中降低的MLL1水平能用于选择该个体是否响应Hsp90抑制剂化合物5-(2,4-二羟基-5-异丙基-苯基)-4-(4-吗啉-4-基甲基-苯基)-异噁唑-3-羧酸乙基酰胺(AUY922)或其药学上可接受盐的治疗。通过直接测定个体生物样品中感兴趣的特定物质(如mRNA、cDNA、蛋白等)，可完成确定步骤。
一方面，本发明包括选择性治疗患癌对象的方法，所述方法包括基于对象的MLL1水平降低，向对象选择性施用治疗有效量的5-(2,4-二羟基-5-异丙基-苯基)-4-(4-吗啉-4-基甲基-苯基)-异噁唑-3-羧酸乙基酰胺(AUY922)或其药学上可接受盐。
另一方面，本发明包括选择性治疗患癌对象的方法，所述方法包括：
a)测定对象的生物样品的MLL1水平；和
b)基于样品的MLL1水平降低，向对象选择性施用治疗有效量的5-(2,4-二羟基-5-异丙基-苯基)-4-(4-吗啉-4-基甲基-苯基)-异噁唑-3-羧酸乙基酰胺(AUY922)或其药学上可接受盐。
另一方面，本发明包括选择性治疗患癌对象的方法，所述方法包括：
a)基于样品的MLL1水平降低，向对象选择性施用治疗有效量的5-(2,4-二羟基-5-异丙基-苯基)-4-(4-吗啉-4-基甲基-苯基)-异噁唑-3-羧酸乙基酰胺(AUY922)或其药学上可接受盐。
另一方面，本发明包括选择性治疗患癌对象的方法，所述方法包括：
a)测定对象生物样品的MLL1水平；
b)之后基于对象的MLL1水平降低，选择对象用于5-(2,4-二羟基-5-异丙基-苯基)-4-(4-吗啉-4-基甲基-苯基)-异噁唑-3-羧酸乙基酰胺(AUY922)或其药学上可接受盐的治疗；和
c)之后基于对象的MLL1水平降低，向对象施用治疗有效量的5-(2,4-二羟基-5-异丙基-苯基)-4-(4-吗啉-4-基甲基-苯基)-异噁唑-3-羧酸乙基酰胺(AUY922)或其药学上可接受盐。
另一方面，本发明包括选择性治疗患癌对象的方法，所述方法包括：
a)测定对象生物样品的MLL1水平，其中出现MLL1水平降低表明对象响应Hsp90抑制剂化合物5-(2,4-二羟基-5-异丙基-苯基)-4-(4-吗啉-4-基甲基-苯基)-异噁唑-3-羧酸乙基酰胺(AUY922)或其药学上可接受盐治疗的可能性增加；和
b)之后基于对象样品的MLL1水平降低，选择对象用于Hsp90抑制剂化合物5-(2,4-二羟基-5-异丙基-苯基)-4-(4-吗啉-4-基甲基-苯基)-异噁唑-3-羧酸乙基酰胺(AUY922)治疗。
另一方面，本发明包括选择患癌对象用于治疗的方法，所述方法包括测定对象的生物样品的MLL1水平，其中出现MLL1水平降低表明对象响应Hsp90抑制剂化合物5-(2,4-二羟基-5-异丙基-苯基)-4-(4-吗啉-4-基甲基-苯基)-异噁唑-3-羧酸乙基酰胺(AUY922)或其药学上可接受盐治疗的可能性增加。
另一方面，本发明包括选择患癌对象用于治疗的方法，所述方法包括测定获自患癌对象的核酸样品中的MLL1水平，其中出现MLL1水平降低表明对象响应Hsp90抑制剂化合物5-(2,4-二羟基-5-异丙基-苯基)-4-(4-吗啉-4-基甲基-苯基)-异噁唑-3-羧酸乙基酰胺(AUY922)或其药学上可接受盐治疗的可能性增加。
另外一方面，本发明包括对个体基因分型的方法，所述方法包括检测遗传变体，所述变体导致PI3K的编码催化p110α亚基的859位上出现氨基酸变体，其中859位缺乏变体表明5-(2,4-二羟基-5-异丙基-苯基)-4-(4-吗啉-4-基甲基-苯基)-异噁唑-3-羧酸乙基酰胺(AUY922)应施用于个体。
另一方面，本发明包括对个体基因分型的方法，所述方法包括检测获自所述个体的PI3K基因催化p110α亚基的2575-2577位是否存在CAA，其中存在CAA表明该个体响应5-(2,4-二羟基-5-异丙基-苯基)-4-(4-吗啉-4-基甲基-苯基)-异噁唑-3-羧酸乙基酰胺(AUY922)的可能性增加。
另一方面，本发明包括Hsp90抑制剂化合物5-(2,4-二羟基-5-异丙基-苯基)-4-(4-吗啉-4-基甲基-苯基)-异噁唑-3-羧酸乙基酰胺(AUY922)或其药学上可接受盐用于治疗癌症，其特征在于基于所述个体在一个或多个下列位置的MLL1水平相较对照下降，向个体施用治疗有效量的所述化合物或其药学上可接受盐：
(a)FMR1基因座的染色体X上的146982000-146984500；
(b)FMR1基因座的染色体X上的146991500-146993600；
(c)FMR1基因座的染色体X上的146994300-147005500；或
(d)FMR1基因座的染色体X上的147023800-147027400。
另一方面，本发明包括Hsp90抑制剂化合物5-(2,4-二羟基-5-异丙基-苯基)-4-(4-吗啉-4-基甲基-苯基)-异噁唑-3-羧酸乙基酰胺(AUY922)或其药学上可接受盐用于治疗癌症，其特征在于基于个体样品经测定在一个或多个下列位置的MLL1水平相较对照下降，向个体施用治疗有效量的所述化合物或其药学上可接受盐：
(a)FMR1基因座的染色体X上的146982000-146984500；
(b)FMR1基因座的染色体X上的146991500-146993600；
(c)FMR1基因座的染色体X上的146994300-147005500；或
(d)FMR1基因座的染色体X上的147023800-147027400。
在本文所述的发明方法中，癌症也可以是任何癌症，包括成胶质细胞瘤、黑素瘤、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、子宫内膜癌、前列腺癌、结肠癌和骨髓瘤。通常，所述样品是肿瘤样品且可以是新鲜冷冻样品或石蜡包埋组织样品。
在本文所述的发明方法中，检测谷氨酸盐或变异氨基酸的方法可用本领域已知的任何方法进行，如免疫测定、免疫组化、ELISA、流式细胞术、蛋白质印迹、HPLC和质谱。另外，在本文所述的发明方法中，检测编码PI3K催化p110α亚基的核酸分子内突变的方法包括聚合酶链反应(PCR)、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、基于TaqMan的测定、直接测序、动态等位基因特异杂交、高密度寡核苷酸SNP阵列、限制性片段长度多态性(RFLP)分析、引物延伸试验、寡核苷酸连接酶测定、单链构象多态性分析、温度梯度凝胶电泳(TGGE)、变性高效液相色谱、高分辨率熔解曲线分析、DNA错配结合蛋白试验、或毛细管电泳。
本发明还包括生成可传送形式信息的方法以预测癌症患者对5-(2,4-二羟基-5-异丙基-苯基)-4-(4-吗啉-4-基甲基-苯基)-异噁唑-3-羧酸乙基酰胺(AUY922)的响应性，所述方法包括：
a)测定对象的以下可能性是否增加，即患者响应5-(2,4-二羟基-5-异丙基-苯基)-4-(4-吗啉-4-基甲基-苯基)-异噁唑-3-羧酸乙基酰胺(AUY922)治疗，其中对象的可能性增加是基于MLL1水平降低，和
b)以用于传播的有形或无形媒介形式记录确定步骤的结果。
另一方面，本发明包括确定肿瘤是否响应Hsp90抑制剂化合物5-(2,4-二羟基-5-异丙基-苯基)-4-(4-吗啉-4-基甲基-苯基)-异噁唑-3-羧酸乙基酰胺(AUY922)或其药学上可接受盐治疗的试剂盒，所述试剂盒包括提供一个或多个探针或引物以检测PI3K基因座(SEQIDNO:2的核酸2575-2577)是否存在突变以及使用说明书。
另一方面，本发明包括预测癌症对象是否受益于Hsp90抑制剂化合物5-(2,4-二羟基-5-异丙基-苯基)-4-(4-吗啉-4-基甲基-苯基)-异噁唑-3-羧酸乙基酰胺(AUY922)或其药学上可接受盐治疗的试剂盒，所述试剂盒包括：
a)多种试剂，用于测定是否存在编码PI3K催化p110α亚基中859位处的变体的突变；和
b)使用说明书。
在本文所述的发明方法中，Hsp90抑制剂是靶向、减少或抑制Hsp90的内源性ATP酶活性和/或经泛素蛋白酶体通路降解、靶向、减少或抑制Hsp90客户蛋白的任何已知化合物。这类化合物称为“热激蛋白90抑制剂”或“Hsp90抑制剂”。适用于本发明的Hsp90抑制剂示例包括但不限于格尔德霉素衍生物、坦螺旋霉素(17-烯丙氨基-17-去甲氧基格尔德霉素)(也称为KOS-953和17-AAG)；根赤壳菌素；6-氯-9-(4-甲氧基-3,5-二甲基吡啶-2-基甲基)-9H-嘌呤-2-胺甲磺酸盐(也称为CNF2024)；IPI504；SNX5422；5-(2,4-二羟基-5-异丙基-苯基)-4-(4-吗啉-4-基甲基-苯基)-异噁唑-3-羧酸乙基酰胺(AUY922)；和(R)-2-氨基-7-[4-氟-2-(6-甲氧基-吡啶-2-基)-苯基]-4-甲基-7,8-二氢-6H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-5-酮(HSP990)。具体地，所述化合物可以是5-(2,4-二羟基-5-异丙基-苯基)-4-(4-吗啉-4-基甲基-苯基)-异噁唑-3-羧酸乙基酰胺(AUY922)或其药学上可接受盐；且如下式(A)所示
或其药学上可接受盐。
另一方面，本发明包括确定肿瘤是否响应Hsp90抑制剂化合物5-(2,4-二羟基-5-异丙基-苯基)-4-(4-吗啉-4-基甲基-苯基)-异噁唑-3-羧酸乙基酰胺(AUY922)或其药学上可接受盐治疗的试剂盒，所述试剂盒包括提供一个或多个探针或引物以检测是否存在编码PI3K基因的催化p110α亚基859位处的变体的突变。
附图说明
图1：通过siRNA筛选鉴定MLL1在响应HSP90抑制中作为HSF1的新型共调节因子
A.siRNA筛选实验设计示意图。B.各siRNA命中读数的散点图，来自用100nMAUY922处理的样品或对照二甲亚砜(DMSO)样品。图中各点代表一个单独siRNA命中。截止线是基于HSP90抑制剂和siRNA处理后大于70％的荧光素酶活性减少和小于30％的细胞活力减少。C.转染有HSP70启动子或HSP70(mHSF1)启动子驱动萤光素酶报告基因的A375细胞用siRNA处理3天，然后AUY922处理1小时，随后收获细胞进行萤光素酶测定。D.转染有HSP70启动子驱动萤光素酶报告基因的A375细胞用siRNA处理3天，然后细胞进行热激(42℃持续30min)并回到37℃持续1小时，随后收获细胞进行萤光素酶测定。E.MLL1与HSF1在HSF1过表达的A375细胞中相互作用。转导有HSF1-HA过表达诱导型慢病毒的A375细胞用强力霉素处理3天，然后用或不用AUY922处理6小时。来自A375细胞的核细胞提取物用MLL1-C抗体或抗HA偶联珠免疫沉淀。沉淀的免疫复合体通过PAGE和蛋白质印迹用针对HSF1或MLL1-C的抗体分开。F.MLL1复合体的组分与HSF1相互作用。G.MLL1与HSF1在A375细胞中相互作用。A375细胞用或不用AUY922处理6小时。来自A375细胞的核细胞提取物用MLL1-C或HSF1抗体免疫沉淀。沉淀的免疫复合体通过PAGE和蛋白质印迹用针对HSF1或MLL1-C的抗体分开。
图2：MLL1在HSP70抑制下调节HSF1依赖性转录活性并结合HSF1靶基因启动子
A.热图显示基因通过AUY922上调，但所述上调由于MLL1敲减而受损。shMLL1转导的A375细胞用或不用强力霉素处理3天并进一步用AUY922100nM处理3小时。收集总RNA并进行微阵列。B.实时PCR分析HSP90抑制剂处理下有或没有MLL1敲减的细胞中的HSP70和BAG3表达。在AUY922处理的细胞中用MLL1抗体进行ChIP。shMLL1转导的A375细胞用或不用强力霉素处理3天并进一步用AUY922100nM处理1小时。染色质用抗MLL1抗体免疫沉淀并通过定量实时PCR扩增，使用HSP70(C)或BAG3(D)基因启动子HSE元件和MESI1(E)启动子MLL1结合位点周围的引物。染色质还用抗H3K4me2(F)、抗H3K4me3(F)和抗H4K16ac(G)抗体免疫沉淀并通过定量实时PCR扩增，使用BAG3基因启动子HSE元件周围的引物。
图3：MLL1缺乏削弱HSF1介导的细胞对HSP90抑制反应
A.热图显示基因通过AUY922上调，但所述上调由于MLL1敲除而受损。MLL1+/+或MLL1-/-MEF用或不用AUY922100nM处理3小时。收集总RNA并进行微阵列。B.实时PCR分析HSP90抑制剂处理下MLL1+/+和MLL1-/-MEF之间细胞中的HSP70和BAG3表达。MLL1+/+或MLL1-/-MEF用或不用AUY922100nM处理3小时。收集总RNA并进行微阵列。C.蛋白质印迹分析MLL1+/+或MLL1-/-MEF，用不同剂量的AUY922。MLL1+/+或MLL1-/-MEF用或不用不同剂量的AUY922处理。收集总蛋白并通过所示抗体进行蛋白质印迹。D.细胞对HSP90抑制反应期间MLL1调节转录活性作为HSF1辅因子的模型。MLL1和其复合体结合HSF1且有助于HSP90抑制下的转录。
图4：MLL1敲减或敲除使细胞对HSP90抑制敏感
A.A375细胞中MLL1敲减的细胞集落形成实验，采用AUY922处理。5000shNTC或shMLL1A375细胞接种于六孔板并用或不用强力霉素处理5天，然后化合物处理6天。B.A2058细胞中MLL1敲减的细胞集落形成实验，采用AUY922处理。5000shNTC或shMLL1A2058细胞接种于六孔板并用或不用强力霉素处理5天，然后化合物处理6天。C.蛋白质印迹分析肿瘤样品。在研究结束时收集肿瘤样品并进行MLL1和GAPDH的蛋白质印迹分析。D.实时PCR分析肿瘤样品。在研究结束时收集肿瘤样品，收集总mRNA并进行实时PCR。E.MLL1敲减和HSP90抑制剂在A375异种移植小鼠模型中的组合效果。比较表达诱导型对照shRNA或shRNA的A375细胞在强力霉素和/或HSP990处理下于不同时间点对抗MLL1的肿瘤生长速率。F.有MLL1敲减和AUY922处理的A375细胞的细胞周期分析。shMLL1转导的A375细胞用或不用强力霉素处理3天，并进一步用AUY922100nM处理48小时。S+G2M细胞百分比通过PI染色确定。G.用MLL1敲减和AUY922处理的A375细胞的细胞凋亡分析。shMLL1转导的A375细胞用或不用强力霉素处理3天，并进一步用AUY922100nM处理48小时。由7AAD+膜联蛋白V+显示的凋亡细胞通过FACS确定。H.用或不用AUY922(25nM或100nM)处理48小时的MLL1+/+和MLL1-/-MEF的显微分析。I.MLL1+/+或MLL1-/-MEF中AUY922的剂量反应。MLL1+/+或MLL1-/-MEF用DMSO或连续稀释的AUY922处理24小时和48小时。相对细胞生长通过CTG测量。J.用AUY922处理的MLL1+/+或MLL1-/-MEF的细胞凋亡分析。MLL1+/+或MLL1-/-MEF用或不用AUY922100nM处理48小时。由7AAD+膜联蛋白V+显示的凋亡细胞通过FACS确定。
图5：MLL1低表达人白血病细胞对HSP90抑制敏感
A.实时PCR分析HSP990抑制剂处理下的不同人白血病细胞系。培养人白血病细胞用或不用AUY922处理48小时。然后，收集总mRNA并进行实时PCR。B.用AUY922处理的MLL1低表达或MLL1高表达人白血病细胞的细胞凋亡分析。人白血病细胞用或不用AUY922100nM处理48小时。由7AAD+膜联蛋白V+显示的凋亡细胞通过FACS确定。C.HSP90抑制剂在SEM和MOLM13异种移植小鼠模型中的效果。比较HSP990处理下的SEM和MOLM13在不同时间点的肿瘤生长速率。D.热图显示SEM细胞中的基因通过AUY922上调，但MOLM13细胞不是。SEM和MOLM13细胞用或不用AUY922100nM处理3小时。收集总RNA并进行微阵列。E.维恩图显示三个基因图谱数据集共有HSF1活化通路和其它4个信号通路，包括人白血病细胞、黑素瘤和MEF。
图6：具有低MLL1表达的人原发性B系急性淋巴细胞白血病细胞对HSP90抑制敏感
A.移植有人原发性白血病细胞的受体小鼠骨髓中的人白血病细胞百分比。B.实时PCR分析不同人原发性白血病细胞中的MLL1表达。C.AUY922在人原发性BALL细胞中的剂量反应。人原发性BALL细胞用DMSO或连续稀释的AUY922处理48小时。相对细胞生长通过CellTiter-Glo测量。D.JURKAT、SEM、RS(4,11)和MOLM13用不同剂量的AUY922和/或NVP-JAE067处理72小时，细胞活力抑制用CellTiter-Glo试验测量。E.采用Chalice软件就各AUY922与NVP-JAE067剂量组合计算相较Loewe相加模型的过量抑制。
补充图1：实时PCR和蛋白质印迹分析有诱导型MLL1敲减的A375细胞中的MLL1表达
shNTC或shMLL1转导的稳定细胞系用强力霉素处理3天，收集细胞团，进行实时PCR和蛋白质印迹。
补充图2：MLL1敲减不影响mRNA水平和蛋白水平的HSF1表达
补充图3：在经AUY922处理的细胞中用HSF1抗体进行ChIP
shHSF11转导的A375细胞用或不用强力霉素处理3天，并进一步用AUY922100nM处理1小时。染色质用抗MLL1抗体免疫沉淀并通过定量实时PCR扩增，使用HSP70(A)或BAG3(B)基因启动子HSE元件和MESI1(C)启动子MLL1结合位点周围的引物。
补充图4：HCT116细胞中MLL1敲减的细胞集落形成实验，采用AUY922处理
5000shNTC或shMLL1HCT116细胞接种于六孔板并用或不用强力霉素处理5天，然后化合物处理6天。
补充图5：A375细胞中HSF1敲减或MLL1敲减的细胞集落形成实验，采用NVP-LGX818处理
5000shNTC、shHSF1或shMLL1A375细胞接种于六孔板并用或不用强力霉素处理5天，然后化合物处理6天。
补充图6：表达诱导型shMLL1的A375细胞的蛋白质印迹分析，采用不同剂量的AUY922处理
shNTC或shMLL1转导的A375细胞用或不用强力霉素处理3天，并进一步用不同剂量的AUY922处理48小时。
补充图7：实时PCR分析人白血病细胞中的MLL1表达
具体实施方式
“治疗”包括疾病或紊乱的预防性(防止)和治疗性处理以及进展延迟。术语“预防性”指防止涉及增殖性疾病的疾病发生或复发。本文所用的术语“进展延迟”指将所述组合施用于处于待治疗增殖性疾病前期或早期的患者，其中患者被诊断出例如对应疾病的预形式或者患者处于某一情况下如治疗期间或在对应疾病可能会发展的意外所导致的情况下。
“对象”意在包括动物。对象示例包括哺乳动物，如人、狗、牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔、大鼠和转基因非人动物。在某些实施方式中，所述对象是人，如患有、有风险患有或潜在能患有脑肿瘤疾病的人。尤其优选所述对象是人。
“药物制品”或“药物组合物”指含至少一种治疗化合物的混合物或溶液，其待施用于温血动物如人以防止、治疗或控制影响温血动物的特定疾病或病症。
“共施用”、“共同施用”或“联合施用”等意在涵盖向单一患者施用选定治疗剂，且意在包括其中药剂不必定通过相同施用途径或同时施用的治疗方案。
“药学上可接受”指在合理医学判断范围内适于接触哺乳动物，尤其是人组织的那些化合物、材料、组合物和/或剂型，而没有过度毒性、刺激、过敏反应和其它问题并发症，并具有合理的效益/风险比。
“治疗有效”优选涉及有疗效的一定量，或在更广意义上，还预防性地有效抵御增殖性疾病进展。
“单一药物组合物”指配制成向患者递送有效量的2种治疗剂的单一载体或载剂。所述单一载剂设计成递送有效量的各药剂，以及任何药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方式中，所述载剂是片剂、胶囊剂、丸剂或贴剂。在其它实施方式中，所述载剂是溶液或悬液。
“剂量范围”指特定药物剂量的可接受的变化的上和下限。通常，量在指定范围内的试剂剂量能施用于接受治疗的患者。
术语“约”或“大致”通常表示在给定值或范围的20％以内，更优选10％以内，最优选5％以内。或者，尤其是在生物系统中，术语“约”表示在给定值的大约一对数(即一个数量级)范围内，优选给定值的两倍因子内。
在此，建立有完整HSP70启动子驱动萤光素酶报告基因的人黑素瘤细胞衍生物并进行全基因组可成药的siRNA筛选以寻找HSF1的共调节因子。已确定H3K4甲基转移酶MLL1在细胞响应HSP90抑制中充当HSF1的辅因子。MLL1在HSP90抑制下与HSF1相互作用，结合HSF1-靶基因的启动子并调节HSF1依赖性转录活化。MLL1敲减或敲除与HSP90抑制联合时，在多种细胞系和肿瘤小鼠模型中观察到显著组合效应。数据表明MLL1是HSF1的辅因子且确立MLL1在细胞响应HSP90抑制中起关键作用。
破坏混合谱系白血病蛋白基因(MLL1,ALL1,HRX,Htrx)的染色体易位与独特的急性淋巴细胞或骨髓性白血病子集相关[1–4]。MLL1基因产物是用作血细胞生成和发育期间维持Hox基因表达模式所需的转录共激活因子[5–8]的大蛋白。MLL1的转录共激活因子活性部分由其组蛋白H3赖氨酸4(H3K4)甲基转移酶活性调节[6]，这是与染色质转录活性形式相关的表观遗传学标记[9,10]。MLL1复合体催化H3K4的单、二和三甲基化，其调节可产生独特的功能结果。
本发明包括至少一种化合物靶向、减少或抑制Hsp90的内源性ATP酶活性和/或经泛素蛋白酶体通路降解、靶向、减少或抑制Hsp90客户蛋白。这类化合物称为“热激蛋白90抑制剂”或“Hsp90抑制剂”。适用于本发明的Hsp90抑制剂示例包括但不限于格尔德霉素衍生物、坦螺旋霉素(17-烯丙氨基-17-去甲氧基格尔德霉素)(也称为KOS-953和17-AAG)；根赤壳菌素；6-氯-9-(4-甲氧基-3,5-二甲基吡啶-2-基甲基)-9H-嘌呤-2-胺甲磺酸盐(也称为CNF2024)；IPI504；SNX5422；5-(2,4-二羟基-5-异丙基-苯基)-4-(4-吗啉-4-基甲基-苯基)-异噁唑-3-羧酸乙基酰胺(AUY922)；和(R)-2-氨基-7-[4-氟-2-(6-甲氧基-吡啶-2-基)-苯基]-4-甲基-7,8-二氢-6H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-5-酮(HSP990)。
结果：
通过siRNA筛选鉴定MLL1在细胞响应HSP90抑制中作为HSF1的共调节因子
为鉴定在HSP90抑制响应中HSF1的新型共调节因子，建立了有完整HSP70启动子驱动萤光素酶报告基因的A375细胞衍生物并进行2轮siRNA筛选(图1A)，所述报告基因通过HSP90抑制剂处理而活化。为实施高通量全基因组可药化的靶siRNA筛选，含7000个基因的全siRNA库以及HSF1siRNA和负对照在384孔板中成型。进行2轮siRNA筛选。采用萤光素酶活性以选择用于第二轮筛选的基因。从第一轮筛选选择264个基因的前1000siRNA以进行第二轮筛选。对于第二轮筛选，测量萤光素酶活性和细胞活力。还进行反筛选试验，例如在上述筛选选定的潜在HSF1调节因子敲减后检测内源HSP70基因表达以及检测潜在HSF1调节基因敲减。截止线是基于HSP90抑制剂和siRNA处理后大于70％的荧光素酶活性减少和小于30％的细胞活力减少。发现35个基因符合标准(补充表1)，这些基因中，MLL1、MED6、MED19、MED21和SMARCD3称为染色质重塑因子。MLL1是已知的H3K4甲基转移酶并参与基因转录活性。HSF1敲减不影响细胞增殖，但抑制100％萤光素酶活性。MLL1敲减抑制了小于30％的细胞增殖，但降低超过90％的萤光素酶活性(图1B)。为验证MLL1能参与调节细胞响应HSP90抑制，用不同序列小干扰RNA(siRNA)敲减A375细胞中的MLL1，所述细胞有HSP70启动子报告质粒。(序列如何不同？)这通过siRNA试剂处理来减少MLL1基因表达，所述试剂具有与MLL1基因mRNA转录物互补的序列。此siRNA与活性MLL1基因转录物的结合通过mRNA转录物降解导致表达减少。MLL1敲减抑制了大于40％的HSP90抑制所引起萤光素酶活性，而HSF1敲减抑制了约90％萤光素酶活性(图1C)。通过突变HSP70启动子中的HSF1结合位点来进一步确定MLL1是否经HSF1调节细胞响应HSP90抑制。如所预期，一旦HSP70启动子中的一个HSF1结合位点突变，观察到HSP90抑制所诱导的活性减少大于70％。有趣的是，带有HSF1结合位点突变的MLL1敲减抑制大于80％的萤光素酶活性(图1C)。这些结果表明MLL1参与调节细胞响应HSP90抑制。还在热激条件下测试MLL1能调节热激反应的观点。与HSP90抑制类似，热激诱导HSP70启动子萤光素酶活性。HSF1敲减抑制热激反应，而MLL1敲减减少大于40％的热激所诱导萤光素酶活性(图1D)。为研究MLL1和其复合体是否在HSP90抑制下结合HSF1，用转导有对照或HSF1-HA构建体的细胞进行免疫共沉淀实验。蛋白质印迹显示HSP90抑制下存在有HSF1的MLL1。反向免疫共沉淀实验显示HSF1表位也沉淀MLL1蛋白(图1E)。另外，蛋白质印迹显示MLL1复合体组分：ASH2L和WDR5也沉淀HSF1或MLL1(图1F)。为测试内源HSF1和MLL1之间的体内相互作用，来自A375细胞的核蛋白提取物用HSF1或MLL1抗体免疫沉淀，所述细胞用或不用HSP90抑制剂处理。蛋白质印迹显示抗HSF1或抗MLL1免疫沉淀物中存在MLL1或HSF1(图1G)。
MLL1在HSP70抑制下调节HSF1依赖性转录活性并结合HSF1-靶基因启动子
进一步检测MLL1敲减是否影响HSF1依赖性转录活性。将shMLL1引入A375细胞，随后使细胞暴露于HSP90抑制。基因图谱分析显示HSP90抑制诱导了38个基因转录活性。22个基因/38个基因的转录活性诱导受到MLL1敲减不同程度的遏制(图2A)。22个基因中的一部分属于HSF1调节的细胞应激通路，如HSPA1A、HSPA1L、HSPB8、DEDD2和DNAJB1(图2A)。为验证基因图谱结果，通过靶向独特MLL1序列向A375癌细胞稳定引入2个MLL1诱导型shRNA结构，并确认MLL1敲减(补充图1)。HSP90抑制剂处理下的MLL1调节HSP70和BAG3转录活性通过实时PCR进一步验证。MLL1敲减不影响mRNA水平和蛋白水平的HSF1表达(补充图2)，但抑制HSP90抑制剂处理下的HSF1-靶基因HSP70和BAG3mRNA水平(图2B)。
为检测MLL1向HSF1所调节基因启动子的聚集，用A375细胞进行染色质免疫沉淀(ChIP)，所述细胞转导有对照或shMLL1并用或不用AUY922处理1小时。来自这些细胞的染色质进行超声处理获得小于500bp的片段，用针对HSF1和MLL1的多克隆抗体进行免疫沉淀。完成定量实时PCR分析，所用引物特异于涵盖HSE元件的HSP70和BAG3。MESI1的MLL1结合位点用作对照。观察到HSF1与HSP70或BAG3启动子(但不是MESI1)的结合在AUY922处理1小时时增加约10倍(补充图3)。相反，在有诱导型HSF1敲减的A375细胞中未检测到所述结合(补充图3)。在AUY922处理1小时时还观察到大量MLL1占据HSP70和BAG3基因启动子(图2C和D)。相反，未检测到MLL1与MESI启动子的结合(图2E)。MLL1敲减显著减少MLL1结合(图2C、D和E)。由于MLL1介导组蛋白H3的二和三甲基化(H3K4me)以及组蛋白H4的乙酰化(H4K16ac)，下一步检测H3K4me2、H3K4me3和H4K16ac在HSP90抑制下是否向HSF1所调节基因启动子聚集。观察到H3K4me2和H3K4me3结合BAG3启动子且这些结合通过AUY922处理进一步显著增强，但被MLL1敲减削弱(图2F)。类似地，H4K16ac也结合BAG3启动子且这些结合通过AUY922处理进一步显著增强，但被MLL1敲减削弱(图2G)。总之，这些数据表明MLL1在HSP70抑制下调节HSF1依赖性转录活性并结合HSF1-靶基因启动子。
MLL1缺乏削弱HSF1介导的细胞响应HSP90抑制
为进一步验证shRNA结果，接下来检测MLL1-/-小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)对HSP90抑制的反应。基因图谱分析显示HSP90抑制诱导了68个基因的转录活性且这些基因上调受到MLL1缺乏不同程度的削弱(图3A)。所述基因中的一部分属于HSF1调节的细胞应激通路，如Dnaja1、Dnajb4、DnaJ2和Bag3。通过HSP90抑制剂在MEF中调节2个HSF1-靶基因：Hspa1b和Bag3由定量实时PCR进一步验证，MLL1损失在AUY922处理下导致约50％的Hspa1b或Bag3表达减少(图3B)。另外，蛋白质印迹显示HSP90抑制诱导了MEF中的热激通路。令人惊讶的是MLL1-/-MEF中的HSP70蛋白水平受到极大抑制，而HSC70蛋白水平显著提高(图3C)。与MLL1缺失一致，MLL1-/-MEF中的H3K4me3(但不是H3K4me2)总体水平减少(图3C)。这些结果表明MLL1是HSF1的辅因子，在HSP70抑制下结合HSF1调节的基因启动子、介导H3K4me的二和三甲基化并调节HSF1依赖性转录活性(图3D)。
MLL1敲减或敲除使细胞对HSP90抑制敏感
先前的工作确定了HSF1在人类癌症中是HSP90抑制剂的关键敏化剂。下一步检测MLL1是否也是HSP90抑制剂的敏化剂。为验证MLL1是否确实是HSP90抑制的敏化剂，在3个癌细胞系(A375、A2058和HCT116)中检测MLL1敲减与AUY922的组合效应。通过靶向独特MLL1序列向不同癌细胞系稳定引入2个MLL1诱导型shRNA构建体。集落形成试验显示这3个癌细胞系中，诱导MLL1shRNA以及HSF1shRNA(但不是NTCshRNA)引起对AUY922的显著敏感性(图4A、B和补充图4)。相反，MLL1敲减与BRAF抑制剂NVP-LGX818没有产生组合效应(补充图5)，表明MLL1敲减与HSP90抑制剂有选择效应。这些发现指示MLL1作为癌细胞中HSP90抑制的有效敏化剂。为进一步验证MLL1作为HSP90抑制剂的敏化剂，检测MLL1敲减与HSP90抑制剂在A375异种移植小鼠模型中的组合效应。单独的MLL1shRNA轻微抑制肿瘤生长，在蛋白水平和mRNA水平确认敲减(图4C和D)。耐受剂量(10mg/kgPO,qw)的单独HSP990使肿瘤生长抑制50％T/C(图4E)。更突出地，HSF1敲减&HSP990的组合导致肿瘤停滞(图4E)。这些结果表明细胞应激反应调节物MLL1对限制人癌细胞中HSP90抑制剂功效也关键，MLL1敲减与HSP90抑制剂的组合足以引起黑素瘤生长停滞。
为理解MLL1敲减与HSP90抑制组合效应的机制，进一步检测：1)MLL1敲减是否可能促进HSP90客户蛋白降解，如BRAF；2)MLL1敲减是否可能减弱MAPK信号传递，这是基于近期发现HSF1缺乏减弱了小鼠中的MAPK信号传递。在经MLL1shRNA和HSP90抑制剂处理的细胞中进行蛋白质印迹。MLL1敲减与HSP90抑制剂的组合在A375细胞中引起p-ERK水平下降，但不是BRAF降解(补充图6)。为理解HSF1敲减在HSP90抑制剂处理下如何影响细胞增殖，进行DNA含量分析以检测MLL1敲减在HSP90抑制剂处理下对细胞周期进程的影响。与HSF1敲减类似，MLL1敲减不影响细胞周期中癌细胞的百分比，而HSP90抑制剂导致更多癌细胞进入S+G2M期(图4F)。相反，在HSP90抑制剂处理下，MLL1敲减组中S+G2M期的癌细胞百分数显著低于对照组(图4F)，表明MLL1敲减阻断癌细胞进入细胞周期，从而减少癌细胞增殖。此外，通过用7AAD和膜联蛋白V染色细胞来检测MLL1敲减在HSP90抑制剂处理下是否增加癌细胞凋亡。类似地，MLL1敲减不影响癌细胞凋亡，而HSP90抑制剂诱导癌细胞凋亡(图4G)。MLL1敲减进一步提高HSP90抑制剂处理下的癌细胞凋亡比例(图4G)。因此，MLL1敲减在HSP90抑制剂处理下减弱MAPK生长信号传递，导致细胞周期阻滞并诱导细胞凋亡。为进一步验证shRNA结果，接下来检测MLL1损失是否使细胞对HSP90抑制敏感。MLL1+/+MEF中，AUY922抑制MEF增殖率，但不杀死这些细胞。相反，大于90％的MLL1-/-MEF在48小时处理后被AUY922杀死(图4H和I)。细胞凋亡分析显示大于80％MLL1-/-MEF与仅30％MLL1+/+在AUY922处理下诱发凋亡(图4J)。这些数据表明MLL1是使人癌细胞对HSP90抑制敏感的潜在靶标。
MLL1低表达人白血病细胞对HSP90抑制敏感
由于MLL1敲减或损失使得HSP90抑制剂对细胞增殖的功效增加，进一步验证以下想法：具有MLL1低表达水平的人癌细胞应对HSP90抑制更敏感。人白血病细胞中，MLL1转位产生包括MLL-AF4、MLL-AF9和MLL-ENL在内的一些融合基因。首先检测9个有或没有MLL1转位的不同人白血病细胞中的MLL1mRNA水平。JURKAT、697和REH是有高MLL1表达的野生型白血病细胞，携带MLL1-AF4的SEM细胞也有高MLL1表达。携带FLT3ITD突变的PL21细胞、携带MLL1-AF4的RS(4,11)细胞具有相对较低的MLL1表达。携带MLL1-AF9的NOMO1细胞和携带MLL1-AF9的NOMO1具有最低MLL1表达(补充图7)。下一步检测MLL1表达是否与细胞响应HSP90抑制相关。还检测这些白血病细胞中的HSP70和BAG3表达，所述表达代表细胞对HSP90抑制剂的应激反应。细胞对HSP90抑制的应激反应在RS(4,11)和MOLM13细胞中显著减少(图5A)。具有MLL1低表达的NOMO1未显示细胞对HSP90抑制的应激反应降低(图5A)。接下来测试各白血病细胞系对HSP90抑制剂的敏感性。NOMO、MOLM13和RS(4,11)中AUY922的IC95为约100nM，而其它白血病细胞系中AUY922的IC95为1000nM(表1)。这些结果指示MLL1表达可能与细胞对HSP90抑制剂的敏感性相关，但与细胞对HSP90抑制的反应无关，这表明存在一些MLL1介导机制，所述机制独立于HSF1活化的细胞响应HSP90抑制。细胞凋亡分析显示RS(4,11)和MOLM13细胞中诱导的细胞凋亡率高于JURKAT和PL21细胞(图5B)。此外，检测HSP90抑制剂在SEM和MOLM13异种移植小鼠模型中的效果。耐受剂量(10mg/kgPO,qw)的HSP990使SEM肿瘤生长抑制30％T/C，同时使MOLM13肿瘤生长抑制60％T/C(图5C)。为验证以下观点即具有低MLL1表达的白血病细胞可能呈现对HSP90抑制的HSF1调节转录活性减少，比较SEM和MOLM13白血病细胞响应HSP90抑制的基因图谱。基因图谱测定显示32个基因表达在SEM中通过HSP90抑制而高度诱导，但在MOLM13中程度不一(图5D)。对不同细胞响应HSP90抑制中的所有3个基因图谱数据集进行路径分析，包括有或没有MLL1敲减的黑素瘤、有高或低MLL表达的人黑素瘤细胞以及MLL1+/+或MLL1-/-MEF。HSF1通路激活是3个基因图谱数据集的最明显共有通路。3个基因图谱数据集还共有PRDM2活化、BACH2抑制、BLVRA活化和PES1活化。这些结果指示MLL1可能是在HSP90抑制剂治疗中对患者分级的潜在生物标记物。
具有低MLL1表达的人原发性B系急性淋巴细胞白血病细胞对HSP90抑制敏感
为研究MLL1表达是否在原发性人癌细胞中不同，检测人B系急性淋巴细胞白血病样品中的MLL1表达。向免疫缺陷小鼠植入原发性人BALL细胞，从受体小鼠中收集骨髓细胞，直到FACS分析显示血液肿瘤负荷大于70％。培养骨髓细胞且FACS分析显示大于90％的细胞是人白血病细胞(图6A)。实时PCR显示P1患者中的MLL1表达比P4患者高3倍(图6B)。接下来评估AUY922对这些人白血病细胞的功效。如所预期，有高MLL1表达的P1白血病细胞不响应AUY922处理，而有低MLL1表达的P4白血病细胞显示对AUY922处理的良好反应。其它2个人白血病细胞样品还显示对AUY922的特定反应(图6C)。已知MLL1融合癌蛋白会聚集DOT1L以活化下游信号通路，由于失去一个野生型MLL1等位基因，携带MLL1转位的白血病细胞可能具有较低野生型MLL1表达，这表明这类白血病细胞可能对HSP90抑制剂与DOT1L抑制剂的组合敏感。下一步检测AUY922和DOT1L抑制剂NVP-JAE067对人白血病细胞的组合效应。AUY922和NVP-JAE067显示对携带MLL1转位的白血病细胞有显著组合效应，所述细胞包括SEM、RS(4,11)和MOLM13细胞，但不是MLL1野生型白血病细胞：JURKAT细胞(图6D)。总之，这些结果表明具有MLL1低表达的人白血病细胞可能对HSP90抑制更敏感且HSP90抑制剂与DOT1L抑制剂的组合就携带MLL1转位的人白血病细胞而言可能是好策略。
材料和方法
细胞培养
A375、A2058、HCT116、SEM、697、JURKAT、REH、PL21、NOMO1、RS(4,11)和MOLM13细胞获自美国模式培养物保藏所(AmericanTypecultureCollection)。MLL1+/+andMLL1-/-小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)来自密歇根大学JayL.Hess实验室。所有细胞系维持于DMEM培养基、McCoy's5a培养基或有10％FBS(英杰(Invitrogen))的高级RPMI培养基1640(英杰)。感染的细胞系在1μg/mL嘌呤霉素(MP生物医学公司(MPBiomedicals))下维持以用于选择。
siRNA筛选
建立了有完整HSP70启动子驱动萤光素酶报告基因的A375细胞系，所述报告基因通过HSP90抑制剂处理而活化。为实施高通量全基因组siRNA筛选，全siRNA库以及HSF1siRNA和负对照在384孔板中成型。向各孔加入RNAiMAX并进一步孵育。然后，接种有HSP70启动子驱动萤光素酶报告基因的癌细胞并孵育72小时，随后加入HSP990并孵育6小时。最后，加入Bright-Glo(BG)以测量HSP70报告基因的荧光。在第二轮筛选中，通过BG和CellTiter-Glo(CTG)试验分析siRNA筛选数据；后者会测量总细胞活力。1)对数据进行标准化并输出到spotfire文件以观察。2)就各试验计算siRNA复制品的平均数。3)之后，就各siRNA平均数取BG与CTG分数之间的差异。4)这些差异就各基因ID取平均且随后根据δ分类(随后BG与CTG之间的最大差异应该是最强的命中，因为搜索影响BG信号而不影响CTG的最高命中)。还进行反向筛选实验，如在选自上述筛选的潜在HSF1调节因子敲减后检测内源HSP70基因表达并检测潜在HSF1调节因子基因敲减。
短发夹RNA构建体
将对照短发夹RNA(shRNA),GGATAATGGTGATTGAGATGG,MLL1shRNA#1,GCACTGTTAAACATTCCACTT,和MLL1shRNA#2,CGCCTAAAGCAGCTCTCATTT，克隆到诱导型pLKO-Tet-On嘌呤霉素载体内。
慢病毒和感染
根据先前确定的操作生成慢病毒上清。总共100μL慢病毒用于在六孔板中于8μg/mL聚凝胺(凯米康公司(Chemicon))内感染300,000个癌细胞。替换培养基，24小时后，通过嘌呤霉素(MP生物医学公司)选择细胞并扩增。通过向培养基加入100ng/mL强力霉素(克隆泰克(Clontech))来获得shRNA诱导。
RNA提取和定量反转录PCR
总RNA用RNeasyMini试剂盒(凯杰公司(Qiagen))分离。ABItaqman基因表达试验包括HSP70、BAG3、HSC70、HSP27、HSF1和MLL1。VICMGB引物/探针组(应用生物系统公司(AppliedBiosystems))用于各反应以共扩增B2M转录物。所有实验重复两次或重复三次进行，并如所示根据B2M水平标准化。
染色质免疫沉淀(ChIP)试验
ChIP试验根据厂商操作指南(染色质免疫沉淀实验试剂盒，货号17-295，纽约普莱西德湖的Upstate生物技术公司(UpstateBiotechnologyInc.))完成。制备免疫复合体，使用抗HSF1(细胞信号技术有限公司(CellSignaling)，4356)抗体、抗MLL1(Bethyl实验室(BethylLaboratories)，A300-086A)抗体、抗H3K4Me2(赛默飞世尔(Thermoscientific)、MA511196)抗体、抗H3K4Me3(赛默飞世尔，MA511199)抗体和抗H4K16Ac(密理博(Millipore)，07-329)抗体。没有抗体情况下完成的免疫沉淀反应的上清用作总输入DNA对照。PCR用10μl各样品完成，采用以下引物：HSP70启动子、5’-GGCGAAACCCCTGGAATATTCCCGA-3′和5’-AGCCTTGGGACAACGGGAG-3’；BAG3启动子，5′-GTCCCCTCCTTACAAGGAAA-3′和5′-CAATTGCACTTGTAACCTG-3′；MEIS1启动子，5′-CGGCGTTGATTCCCAATTTATTTCA-3′和5′-CACACAAACGCAGGCAGTAG-3′。之后通过2％琼脂糖胶分析。
基因图谱
RNA用凯杰RNeasy迷你试剂盒分离。如前所述(45)生成标记cDNA并与HG-U133Plus2阵列(昂飞公司(Affymetrix))杂交。
蛋白质印迹
蛋白质印迹如下进行：总肿瘤裂解物通过SDS/PAGE分离并电转至硝化纤维膜(英杰公司)。膜在PBS和0.1％(vol/vol)吐温(Tween)-20(PBS-T)及4％(wt/vol)脱脂奶粉(伯乐公司(Bio-Rad))中用摇床室温封闭1小时。向封闭溶液加入1:1,000(HSF1；细胞信号技术有限公司,4356)、1:1,000(HSP70；细胞信号技术有限公司,4876)、1:1,000(p-ERK；细胞信号技术有限公司,4370)、1:1,000(ERK；细胞信号技术有限公司,4695)、1:1,000(HER2；细胞信号技术有限公司,4290)、1:1,000(BRAF；细胞信号技术有限公司,9433)、1:1,000(经切割PARP；细胞信号技术有限公司,5625)和1:10,000(GAPDH；细胞信号技术有限公司,2118S)稀释的一抗，在振荡器上4℃孵育过夜。免疫印迹用PBS-T洗3次，每次5分钟，二抗以1:10,000稀释度加入PBS-T牛奶，在振荡器上室温1小时。数次洗涤后，增强化学发光(ECL)反应根据厂商推荐(SuperSignalWestDura持久性底物；赛默飞世尔)进行。
肿瘤异种移植
小鼠根据诺华生物医学研究所(NovartisBiomedicalResearch)动物护理和使用委员会操作和规则来维护并处理。有针对MLL1的Tet诱导型shRNA的A375在补充有10％Tet-批准FBS的DMEM中培养。小鼠(6-8周龄，n＝8)在右背腋区皮下接种1×106细胞。肿瘤体积如下测量：用卡尺双向测量并计算为(长度×宽度2)/2。平均肿瘤体积为200mm3时，药物治疗在移植后11d开始。整个研究期间，动物接受载剂(5％右旋糖,10mL/kg,口服,每周一次)或HSP990(10mg/kg,口服,每周一次)。研究结束时，切下肿瘤组织并液氮速冻以用于免疫印迹分析生物标记。数据表示为均值±SEM，学生t检验下P<0.05时，认为差异是统计上显著。
作者贡献
YC和WZ设计实验。YC、JC、AL、LB、DR、RG和MM实施实验。SJ、JY和JK分析数据。FC、PZ、FS、RP和DP对实验有帮助。YC和WZ写文章。
图例：
表1：8个人白血病细胞中AUY922的IC95
8个有或没有MLL1转位的人白血病细胞用AUY922处理72小时，通过CellTiter-Glo测量细胞增殖率。采用IC95估计细胞对HSP90抑制的反应。
补充表S1：35个基因通过siRNA筛选鉴定为细胞响应HSP90抑制的调节因子。

Claims (21)

1.一种选择性治疗患癌对象的方法，所述方法包括基于对象的MLL1水平降低，向对象选择性施用治疗有效量的5-(2,4-二羟基-5-异丙基-苯基)-4-(4-吗啉-4-基甲基-苯基)-异噁唑-3-羧酸乙基酰胺(AUY922)或其药学上可接受盐。
2.一种选择性治疗患癌对象的方法，所述方法包括：
a)测定所述对象的生物样品的MLL1水平；和
b)基于该样品的MLL1水平降低，向对象选择性施用治疗有效量的5-(2,4-二羟基-5-异丙基-苯基)-4-(4-吗啉-4-基甲基-苯基)-异噁唑-3-羧酸乙基酰胺(AUY922)或其药学上可接受盐。
3.一种选择性治疗患癌对象的方法，所述方法包括：
a)基于样品的MLL1水平降低，向对象选择性施用治疗有效量的5-(2,4-二羟基-5-异丙基-苯基)-4-(4-吗啉-4-基甲基-苯基)-异噁唑-3-羧酸乙基酰胺(AUY922)或其药学上可接受盐。
4.一种选择性治疗患癌对象的方法，所述方法包括：
a)测定对象生物样品的MLL1水平；
b)之后基于该对象的MLL1水平降低，选择该对象进行5-(2,4-二羟基-5-异丙基-苯基)-4-(4-吗啉-4-基甲基-苯基)-异噁唑-3-羧酸乙基酰胺(AUY922)或其药学上可接受盐的治疗；和
c)之后基于该对象的MLL1水平降低，向该对象选择性施用5-(2,4-二羟基-5-异丙基-苯基)-4-(4-吗啉-4-基甲基-苯基)-异噁唑-3-羧酸乙基酰胺(AUY922)或其药学上可接受盐。
5.一种选择性治疗患癌对象的方法，所述方法包括：
a)测定该对象中生物样品的MLL1水平，其中出现MLL1水平降低表明该对象响应Hsp90抑制剂化合物5-(2,4-二羟基-5-异丙基-苯基)-4-(4-吗啉-4-基甲基-苯基)-异噁唑-3-羧酸乙基酰胺(AUY922)或其药学上可接受盐治疗的可能性增加；和
d)之后基于该对象样品的MLL1水平降低，选择该对象进行Hsp90抑制剂化合物5-(2,4-二羟基-5-异丙基-苯基)-4-(4-吗啉-4-基甲基-苯基)-异噁唑-3-羧酸乙基酰胺(AUY922)的治疗。
6.一种选择患癌对象用于治疗的方法，所述方法包括测定对象生物样品的MLL1水平，其中出现MLL1水平降低表明对象响应Hsp90抑制剂化合物5-(2,4-二羟基-5-异丙基-苯基)-4-(4-吗啉-4-基甲基-苯基)-异噁唑-3-羧酸乙基酰胺(AUY922)或其药学上可接受盐治疗的可能性增加。
7.一种选择患癌对象用于治疗的方法，所述方法包括测定获自患癌对象的核酸样品中的MLL1水平，其中出现MLL1水平降低表明对象响应Hsp90抑制剂化合物5-(2,4-二羟基-5-异丙基-苯基)-4-(4-吗啉-4-基甲基-苯基)-异噁唑-3-羧酸乙基酰胺(AUY922)或其药学上可接受盐治疗的可能性增加。
8.一种对个体基因分型的方法，所述方法包括检测遗传变体，所述变体导致PI3K的编码催化p110α亚基的859位上出现氨基酸变体，其中859位变体缺乏表明5-(2,4-二羟基-5-异丙基-苯基)-4-(4-吗啉-4-基甲基-苯基)-异噁唑-3-羧酸乙基酰胺(AUY922)应被施用于该个体。
9.一种对个体基因分型的方法，所述方法包括检测获自所述个体的PI3K基因催化p110α亚基的2575-2577位是否存在CAA，其中存在CAA表明该个体响应5-(2,4-二羟基-5-异丙基-苯基)-4-(4-吗啉-4-基甲基-苯基)-异噁唑-3-羧酸乙基酰胺(AUY922)的可能性增加。
10.一种Hsp90抑制剂化合物5-(2,4-二羟基-5-异丙基-苯基)-4-(4-吗啉-4-基甲基-苯基)-异噁唑-3-羧酸乙基酰胺(AUY922)或其药学上可接受盐，其用于治疗癌症，其特征在于基于所述个体在一个或多个下列位置的MLL1水平相较对照下降，向个体施用治疗有效量的所述化合物或其药学上可接受盐：
(a)FMR1基因座的染色体X上的146982000-146984500；
(b)FMR1基因座的染色体X上的146991500-146993600；
(c)FMR1基因座的染色体X上的146994300-147005500；或
(d)FMR1基因座的染色体X上的147023800-147027400。
11.一种Hsp90抑制剂化合物5-(2,4-二羟基-5-异丙基-苯基)-4-(4-吗啉-4-基甲基-苯基)-异噁唑-3-羧酸乙基酰胺(AUY922)或其药学上可接受盐，其用于治疗癌症，其特征在于基于个体样品经测定在一个或多个下列位置的MLL1水平相较对照下降，向个体施用治疗有效量的所述化合物或其药学上可接受盐：
(a)FMR1基因座的染色体X上的146982000-146984500；
(b)FMR1基因座的染色体X上的146991500-146993600；
(c)FMR1基因座的染色体X上的146994300-147005500；或
(d)FMR1基因座的染色体X上的147023800-147027400。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述癌症选自成胶质细胞瘤、黑素瘤、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、子宫内膜癌、前列腺癌、结肠癌和骨髓瘤。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述样品是肿瘤样品。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述肿瘤样品是新鲜冷冻样品或石蜡包埋组织样品。
15.如权利要求1-6和14中任一项所述的方法，其特征在于，所述检测能通过免疫测定、免疫组化、ELISA、流式细胞术、蛋白质印迹、HPLC和质谱进行。
16.如权利要求7-13和15中任一项所述的方法，其特征在于，所述编码PI3K催化p110α亚基的核酸分子内突变的存在或缺失能通过选自下组的技术检测：Northern印迹分析、聚合酶链反应(PCR)、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、基于TaqMan的测定、直接测序、动态等位基因特异杂交、高密度寡核苷酸SNP阵列、限制性片段长度多态性(RFLP)分析、引物延伸试验、寡核苷酸连接酶测定、单链构象多态性分析、温度梯度凝胶电泳(TGGE)、变性高效液相色谱、高分辨率熔解曲线分析、DNA错配结合蛋白试验、毛细管电泳、Southern印迹。
17.如权利要求7-12或15中任一项所述的方法，其特征在于，所述检测步骤包括测序PI3K的催化p110α亚基基因或其部分。
18.一种生成可传送形式信息以预测癌症患者对5-(2,4-二羟基-5-异丙基-苯基)-4-(4-吗啉-4-基甲基-苯基)-异噁唑-3-羧酸乙基酰胺(AUY922)的治疗的响应性的方法，所述方法包括：
a)测定对象是否增加的响应5-(2,4-二羟基-5-异丙基-苯基)-4-(4-吗啉-4-基甲基-苯基)-异噁唑-3-羧酸乙基酰胺(AUY922)治疗的可能性，其中对象的可能性增加是基于MLL1水平降低，和
b)以用于传播的有形或无形媒介形式记录确定步骤的结果。
19.一种确定肿瘤是否响应Hsp90抑制剂化合物5-(2,4-二羟基-5-异丙基-苯基)-4-(4-吗啉-4-基甲基-苯基)-异噁唑-3-羧酸乙基酰胺(AUY922)或其药学上可接受盐治疗的试剂盒，所述试剂盒包括提供一个或多个探针或引物以检测PI3K基因座(SEQIDNO:2的核酸2575-2577)是否存在突变以及使用说明书。
20.一种预测癌症对象是否受益于Hsp90抑制剂化合物5-(2,4-二羟基-5-异丙基-苯基)-4-(4-吗啉-4-基甲基-苯基)-异噁唑-3-羧酸乙基酰胺(AUY922)或其药学上可接受盐治疗的试剂盒，所述试剂盒包括：
a)多种试剂，用于测定是否存在突变，所述突变编码PI3K催化p110α亚基中859位处的变体；和
b)使用说明书。
21.一种确定肿瘤是否响应Hsp90抑制剂化合物5-(2,4-二羟基-5-异丙基-苯基)-4-(4-吗啉-4-基甲基-苯基)-异噁唑-3-羧酸乙基酰胺(AUY922)或其药学上可接受盐治疗的试剂盒，所述试剂盒包括提供一个或多个探针或引物以检测是否存在突变，所述突变编码PI3K基因的催化p110α亚基859位处的变体。
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