CN102713606A - 用于鉴定、评估、预防和治疗癌症的组合物、试剂盒和方法 - Google Patents

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CN102713606A CN2010800613617A CN201080061361A CN102713606A CN 102713606 A CN102713606 A CN 102713606A CN 2010800613617 A CN2010800613617 A CN 2010800613617A CN 201080061361 A CN201080061361 A CN 201080061361A CN 102713606 A CN102713606 A CN 102713606A
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Abstract

本发明描述了用于确定罹患癌症的受试者是否可能对用HSP90抑制剂作为单一药剂或在联合疗法中的治疗响应的组合物、试剂盒和方法。还描述了用于在罹患这种癌症的受试者中预测疾病时程的方法。

Description

用于鉴定、评估、预防和治疗癌症的组合物、试剂盒和方法
【相关申请的交叉引用】
本申请要求2009年11月13日提交的美国临时申请No.61/261,064；2009年11月30日提交的美国临时申请No.61/283,150；2010年3月12日提交的美国临时申请No.61/313,364；2010年3月12日提交的美国临时申请No.61/313,594；2010年5月20日提交的美国临时申请No.61/346,873；2010年9月13日提交的美国临时申请No.61/382,447；2010年10月5日提交的美国临时申请No.61/390,136；和2010年10月19日提交的美国临时申请No.61/394,735的权益。前述全部申请的内容在此通过引用的方式完整并入。
【序列表】
本申请含有已经以ASCII格式经EFS-Web提交并且在此通过引用方式完整并入的序列表。在2010年11月12日创建的所述ASCII副本命名为I20417WO.txt并且大小是249,096字节。
【背景技术】
癌症代表多种遗传性病灶的表型终点，所述遗传性病灶赋予细胞全部肿瘤发生所需要的生物学特性。实际上，许多癌症(包括例如B细胞癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌和结肠癌)的标志性基因组特征是存在众多复合染色体结构性畸变—包括非相互易位、染色体内倒位、点突变、缺失、基因拷贝数变化、基因表达水平的变化和种系突变。
核型分析(Johansson,B.等(1992)Cancer 69,1674-81；Bardi,G.等(1993)Br J Cancer 67,1106-12；Griffin,C.A.等(1994)GenesChromosomes Cancer 9,93-100；Griffin,C.A.等(1995)Cancer Res 55,2394-9；Gorunova,L.等(1995)Genes Chromosomes Cancer 14,259-66；Gorunova,L.等(1998)Genes Chromosomes Cancer 23,81-99)、染色体CGH及阵列CGH(Wolf M等(2004)Neoplasia 6(3)240；Kimura Y等(2004)Mod.Pathol.21 May(epub)；Pinkel等(1998)Nature Genetics20:211；Solinas-Toldo,S.等(1996)Cancer Res 56,3803-7；Mahlamaki,E.H.等(1997)Genes Chromosomes Cancer 20,383-91；Mahlamaki,E.H.等(2002)Genes Chromosomes Cancer 35,353-8；Fukushige,S.等(1997)Genes Chromosomes Cancer 19:161-9；Curtis,L.J.等(1998)Genomics 53,42-55；Ghadimi,B.M.等(1999)Am J Pathol 154,525-36；Armengol,G.等(2000)Cancer Genet Cytogenet 116,133-41)、荧光原位杂交(FISH)分析(Nilsson M等(2004)Int J Cancer 109(3):363-9；Kawasaki K等(2003)Int J Mol Med.12(5):727-31)和杂合性丢失(LOH)作图(Wang ZC等(2004)Cancer Res 64(1):64-71；Seymour,A.B.等(1994)Cancer Res 54,2761-4；Hahn,S.A.等(1995)Cancer Res 55,4670-5；Kimura,M.等(1996)Genes Chromosomes Cancer 17,88-93)已经用来鉴定与各种癌症的病因学相关的生物标记(例如，染色体异常)。
已经发现细胞信号转导组分的表达水平可用作癌症治疗功效的生物标记和预测物。例如，信号转导组分(如蛋白激酶和受体酪氨酸激酶)的表达水平已经用作生物标记。
尽管鉴定了癌症生物标记，然而对此类生物标记的存在与癌症治疗功效的可能性之间、尤其对癌症的受试者是否可能或不可能对用HSP90抑制剂的治疗响应，缺少总体理解。
【发明概述】
本发明至少部分地提供用于鉴定、评估和/或治疗癌症或肿瘤(例如，癌基因相关癌症或肿瘤)的组合物、方法和试剂盒，其中所述癌症或肿瘤对包括HSP90抑制剂的治疗(例如，包括HSP90抑制剂作为单一药剂或例如与mTOR抑制剂、ALK抑制剂和/或其他化疗剂如多西他赛(docetaxel)或依立替康(irinotecan)组合的治疗)响应。
在一个实施方案中，申请人已经发现，间变性淋巴瘤激酶(ALK)基因或基因产物中改变(例如，ALK重排)的存在指示肺癌例如非小细胞肺癌(NSCLC)对包括HSP90抑制剂的治疗的响应性。在其他实施方案中，已经鉴定Ras(例如，K-Ras)基因或基因产物中的改变的存在任选地与p53中的改变组合指示肺癌例如NSCLC对HSP90抑制剂和mTOR抑制剂的组合的响应性。在其他实施方案中，已经鉴定EGFR基因或基因产物中(例如，事先用酪氨酸激酶抑制剂进行治疗的NSCLC中)的改变(例如，突变)的存在指示对HSP90抑制剂的响应性。在其他实施方案中，已经鉴定Ras(例如，K-Ras)基因或基因产物中的改变(例如，突变)的存在指示结直肠癌(CRC)对包括HSP90抑制剂的治疗的响应性。在另外的其他实施方案中，已经鉴定Raf(例如，B-Raf)基因或基因产物中的改变(例如，突变)的存在指示结直肠癌对包括HSP90抑制剂的治疗的响应性。
在其他实施方案中，本发明进一步提供一种通过评价以下一项或多项而用于鉴定或选择受试者为可能或不可能对包括HSP90抑制剂的治疗响应的方法：受试者的组织学(例如，检测NSCLC或鳞状细胞组织结构的存在)；受试者的吸烟状态；HSP90的水平或表达和/或如本文所述的改变(例如，ALK、MAPK途径和/或EGFR基因或基因产物中的一种或多种改变)。
在另外的其他实施方案中，本发明包括单独用HSP90抑制剂或例如与mTOR抑制剂、ALK抑制剂和/或其他化疗剂(例如，多西他赛或依立替康)的组合改善或治疗癌症或肿瘤的方法，其中所述癌症或肿瘤携带本文所述的改变(例如，ALK、MAPK途径和/或EGFR基因或基因产物中的一种或多种致瘤性改变)。在某些实施方案中，所述癌症或肿瘤存在于需要HSP90抑制剂疗法或针对HSP90抑制剂疗法(或联合疗法，例如与mTOR抑制剂、ALK抑制剂和/或其他化疗剂(例如，多西他赛或依立替康)组合)所考查或评估的受试者中。
因而，本发明提供诸多手段以评价对包括HSP90抑制的疗法(包括联合疗法)的响应性或监测所述疗法；将患者群体分级；鉴定可能从此类药剂获益的受试者、为此类受试者预测疾病的时程或显著事件在所述疾病中的概率和/或更有效地监测、治疗或预防癌症或肿瘤。
因此，在一个方面，本发明特征在于确定肿瘤或癌细胞(例如，体外、离体肿瘤或癌细胞)或具有所述肿瘤或癌细胞的受试者对包括HSP90抑制剂的治疗(例如，包括HSP90抑制剂作为单一药剂或例如与mTOR抑制剂、ALK抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂和/或其他化疗剂如多西他赛或依立替康组合的治疗)的响应性的方法。所述方法包括以下一项或多项：
(i)检测ALK、MAPK途径和/或EGFR基因或基因产物的改变(例如，一种或多种致瘤性改变)；和/或
(ii)评价以下一项或多项：a)受试者的组织学(例如，检测癌性组织结构的存在，例如，实体肿瘤、软组织肿瘤或转移病灶的存在(例如，检测NSCLC、SCC或CRC细胞或组织在受试者样本中的存在)；b)受试者的吸烟状态(例如，鉴定所述受试者为吸烟者或不吸烟者；确定所述受试者是否具有至少5、10、15或更长包年的吸烟史)；或c)HSP90的水平或表达，从而确定所述肿瘤、癌细胞或受试者对包括HSP90抑制剂的治疗的响应性。
在另一个方面，本发明特征在于鉴定或选择肿瘤、癌细胞或受试者(例如，罹患癌症或肿瘤或处于形成癌症或肿瘤风险的受试者)为具有对包括HSP90抑制剂的治疗(例如，包括HSP90抑制剂作为单一药剂或例如与mTOR抑制剂、ALK抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂和/或其他化疗剂如多西他赛或依立替康组合的治疗)响应的可能性(例如，增加或降低的可能性)的方法。所述方法包括以下一项、两项、三项或四项：
(i)评价来自所述肿瘤、癌细胞或受试者的样本，例如，检测如本文所述的改变的存在或不存在(例如，ALK、MAPK途径和/或EGFR基因或基因产物的一种或多种致瘤性改变)；
(ii)评价受试者的组织学(例如，检测癌性组织结构的存在或不存在，例如，实体肿瘤、软组织肿瘤或转移病灶的存在或不存在(例如，检测受试者样本中NSCLC、SCC或CRC细胞或组织的存在或不存在)；
iii)评价受试者的吸烟状态(例如，鉴定所述受试者为吸烟者或不吸烟者；确定所述受试者是否具有至少5、10、15或更长包年的吸烟史)；或
iv)确定样本中HSP90的水平或表达；和
(任选地)鉴定所述肿瘤、癌细胞或受试者可能或不可能对包括HSP90抑制剂的治疗响应。
在又一个方面，本发明特征在于一种监测或预测包括HSP90抑制剂的治疗(例如，包括HSP90抑制剂作为单一药剂或例如与mTOR抑制剂、ALK抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂和/或其他化疗剂如多西他赛或依立替康组合的治疗)对治疗癌症或肿瘤的功效的方法，其中所述癌症或肿瘤携带如本文所述的改变(例如，ALK、MAPK途径和/或EGFR基因或基因产物中的一种或多种致瘤性改变)。所述方法包括：
(i)检测从受试者获得的样本中的改变(例如，如本文所述的ALK、MAPK途径和/或EGFR基因或基因产物中的一种或多种致瘤性改变)；和/或
(ii)评价以下一项或多项：a)受试者的组织结构(例如，检测癌性组织结构的存在，例如实体肿瘤、软组织肿瘤或转移病灶的存在)(例如，检测NSCLC、SCC或CRC细胞或组织在受试者样本中的存在)；或b)HSP90的水平或表达；
(iii)比较在样本中检测到的改变与预定值，例如参考样本(例如，正常对照；血液匹配对照样本(例如，正常的相邻肿瘤；或以不同时间间隔，例如在用HSP90抑制剂和/或其他抗癌治疗之前、在此期间或在其后从受试者收集的样本)。在样本中检测到的改变相对于预定值的差异程度指示或预示所述治疗的功效。在一个实施方案中，该方法可以进一步包括对应于检测到的差异改变剂量或治疗方案(例如，单独或组合，例如与ALK抑制剂、mTOR抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂和/或化疗剂组合的HSP90抑制剂的剂量或剂量方案)。例如，在用HSP90抑制剂治疗期间或在治疗已经中止后，从受试者获得的样本中ALK、MAPK途径和/或EGFR基因或基因产物中的改变(例如，NSCLC和/或SCC样本中的ALK重排或EGFR突变，或结直肠癌样本中的突变K-Ras或B-Raf)的存在或癌细胞或组织的存在，表明需要增加作为单一药剂或组合的HSP90抑制剂的施用剂量或频率。
在本发明方法的某些实施方案中，ALK、MAPK途径和/或EGFR基因或基因产物中的改变的存在指示所述肿瘤或癌细胞具有对包括HSP90抑制剂的治疗响应的增加的可能性。在某些实施方案中，所述MAPK途径基因或基因产物包括以下一种或多种：Ras(例如，H-Ras、N-Ras或K-Ras中的一种或多种)、Raf(例如，A-Raf、B-Raf(BRAF)或C-Raf中的一种或多种)、Mek和/或Erk。本文所述的方法可以任选地还包括检测选自EGFR、PIK3CA、PTEN、AKT、TP53(p53)、CTNNB1(β-连环蛋白)、APC、KIT、JAK2、NOTCH、FLT3、RSK、ETS、ELK-1或SAP-1的一种或多种基因产物中的改变。
在其他实施方案中，以下一项或多项指示对包括HSP90抑制剂的治疗(例如，包括HSP90抑制剂和多西他赛或依立替康组合的治疗)响应的可能性增加：(i)检测存在NSCLC、CRC或鳞状细胞组织结构(例如，受试者的组织结构中的NSCLC、CRC和/或SCC细胞或组织)；(ii)鉴定所述受试者为吸烟者(例如，具有至少5、10、15或更长包年吸烟史的受试者)；或(iii)检测升高的HSP90水平或表达(例如，升高的HSP90基因或基因产物水平)。在一个实施方案中，该方法还包括检测受试者样本中NSCLC、SCC或结直肠癌(CRC)细胞或组织的存在，并且任选地比较NSCLC、CRC或SCC组织结构的存在与其他组织结构，如腺癌与肺肿瘤。
在一个实施方案中，检测到或存在ALK基因或基因产物中的改变(例如，ALK重排)表明对包括HSP90抑制剂例如作为单一药剂或组合以抑制、减少或治疗肺肿瘤或癌细胞(例如NSCLC(例如，复发和/或难治性NSCLC)或SCC肿瘤或癌细胞)的治疗响应的可能性增加。
在另外的其他实施方案中，检测到或存在Ras(例如，K-Ras)基因或基因产物中的改变，任选地与检测到p53基因或基因产物的改变组合，表明对包括HSP90抑制剂和mTOR抑制剂的组合以抑制、减少或治疗肺肿瘤或癌细胞(例如，NSCLC(例如，复发和/或难治性NSCLC)或SCC肿瘤或癌细胞)的治疗响应的可能性增加。
在另一个实施方案中，检测到或存在Ras(例如，K-Ras)基因或基因产物的中改变表明对包括HSP90抑制剂例如作为单一药剂或组合以抑制、减少或治疗结直肠肿瘤或癌细胞(例如，结直肠癌肿瘤或癌细胞)的疗法响应的可能性增加。
在又一个实施方案中，检测到或存在Raf(例如，B-Raf)基因或基因产物中的改变表明对包括HSP90抑制剂例如作为单一药剂或组合以抑制、减少或治疗结直肠肿瘤或癌细胞(例如，结直肠癌肿瘤或癌细胞)的疗法响应的可能性增加。
在另外的其他实施方案中，本发明的方法还包括治疗或预防携带本文所述的改变(例如，一个或多个ALK、MAPK途径或EGFR改变；癌性组织结构的存在；或升高的HSP90表达)的癌症或肿瘤。所述方法包括将HSP90抑制剂(例如，如本文所述的一种或多种HSP90抑制剂)作为单一药剂或例如与mTOR抑制剂、ALK抑制剂和/或其他化疗剂(例如，多西他赛或依立替康)组合以下述量施用至受试者，所述的量足以在受试者中减少或抑制肿瘤细胞生长和/或治疗或预防癌症。
可选地或与本文所述的方法组合时，本发明特征在于一种减少或抑制受试者中癌症或肿瘤(例如，一种或多种癌症或肿瘤)生长的方法。本发明特征还在于一种治疗罹患癌症或肿瘤(例如，一种或多种癌症或肿瘤)或处于罹患癌症或肿瘤的风险的受试者的方法。在某些实施方案中，所述肿瘤或癌症携带如本文所述的改变(例如，一种或多种ALK、MAPK途径、EGFR改变；癌组织结构的存在；或升高的HSP90表达)。所述方法包括将HSP90抑制剂(例如，如本文所述的一种或多种HSP90抑制剂)单独或与mTOR抑制剂、ALK抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂和/或其他化疗剂(例如，多西他赛或依立替康)组合以下述量施用至受试者，所述的量足以在受试者中减少或抑制肿瘤细胞生长和/或治疗或预防癌症。
在某些实施方案中，携带所述改变的癌症或肿瘤存在于下述受试者中，其中所述受试者需要HSP90抑制剂疗法(或例如与mTOR抑制剂、ALK抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂和/或化疗剂例如多西他赛或依立替康的联合疗法)、被鉴定为可能从所述疗法获益或正在针对该疗法进行考察或评价。例如，由本发明治疗方法治疗的受试者可以具有或被鉴定为具有以下一项或多项：吸烟史；升高的HSP90水平或表达；NSCLC(例如，复发和/或难治性NSCLC)或SCC细胞或肿瘤；或在接受至少一种先前化疗方案期间或之后正在经历病情进展；是在接受至少一种先前含铂化疗方案期间或之后经历病情进展的NSCLC患者。
在某些实施方案中，事先选出或鉴定所述受试者以用包括HSP90抑制剂的疗法治疗，例如先前评价所述受试为具有以下一项或多项：吸烟史；罹患NSCLC或SCC；具有升高的HSP90水平或表达。在其他实施方案中，通过评价从所述受试者获得的样本以检测如本文所述的一种或多种致瘤性改变(例如，突变ALK、MAPK途径(例如，K-Ras)、EGFR基因或基因产物)的存在，事先选出所述受试者以用包括HSP90抑制剂的疗法治疗。在另外的其他实施方案中，受试者具有EGFR突变(例如，T790M)并且已经事先用酪氨酸激酶抑制剂(例如，吉非替尼(gefitinib))进行治疗。
在某些实施方案中，治疗方法(任选地)还包括评价来自所述受试者的样本以检测如本文所述的基因或基因产物中的一种或多种改变，或鉴定所述受试者具有以下一项或多项：吸烟史；罹患NSCLC、SCC或CRC；具有升高的HSP90水平或表达。
治疗可以包括，但不限于抑制肿瘤生长、减少肿瘤质量、减少转移性病灶的大小或数目、抑制新的转移性病灶形成、延长的生存、延长的无进展生存、延长的至进展时间和/或增强的生活质量。
在某些实施方案中，由本发明方法评价和/或治疗的癌症或肿瘤包括，但不限于实体肿瘤、软组织肿瘤和转移性病灶(例如，如本文所述的癌症或肿瘤)。在一些实施方案中，所评价和/或治疗的癌症或肿瘤携带选自以下的一种或多种的基因或基因产物中的改变：ALK、RAS(例如，H-Ras、N-Ras或K-Ras中的一种或多种)、EGFR、PIK3CA、RAF(例如，A-Raf、B-Raf(BRAF)或C-Raf中的一种或多种)、PTEN、AKT、TP53(p53)、CTNNB1(β-连环蛋白)、APC、KIT、JAK2、NOTCH、FLT3、MEK、ERK、RSK、ETS、ELK-1或SAP-1。在一个实施方案中，所评价和/或治疗的癌症或肿瘤具有ALK基因或基因产物中的一种或多种改变，例如ALK重排。在另一个实施方案中，所评价和/或治疗的癌症或肿瘤具有MAPK途径(例如，K-Ras或B-Raf)基因或基因产物中的一种或多种改变。在某些实施方案中，所述癌症或肿瘤选自以下一种或多种：肺癌(例如，小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)或鳞状细胞癌(SCC))、结直肠癌、乳腺癌、髓母细胞瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、胰腺癌、卵巢癌、头与颈鳞状细胞癌(HNSCC)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、多发性骨髓瘤、前列腺癌、间变性大细胞淋巴瘤或成神经细胞瘤。
在一些实施方案中，所评价和/或治疗的癌症或肿瘤是非小细胞肺癌(NSCLC)(例如，复发和/或难治性NSCLC)、SCC或结直肠癌。在一个实施方案中，NSCLC携带在ALK基因或基因产物中的突变(例如，NSCLC具有ALK重排；NSCLC表达EML4-ALK融合物；NSCLC表达核磷酸蛋白-间变性淋巴瘤激酶融合物(NPM-ALK融合物))。在一个实施方案中，所述肿瘤或癌症抵抗(例如，部分或完全地抵抗)ALK抑制剂，但是保持对本文所述的HSP90抑制剂的敏感性。在其他实施方案中，NSCLC携带在K-Ras基因或基因产物中的突变。在另外的其他实施方案中，NSCLC携带在K-Ras基因或基因产物和p53基因或基因产物中的突变。在另外的其他实施方案中，NSCLC携带在K-Ras基因或基因产物和EGFR基因或基因产物中的突变。在另外的其他实施方案中，NSCLC具有在EGFR基因或基因产物中的突变。在另外的其他实施方案中，NSCLC具有在EGFR基因或基因产物中的突变并且已经事先用酪氨酸激酶抑制剂进行治疗。在一个实施方案中，所述肿瘤或癌症抵抗(例如，部分或完全地抵抗)酪氨酸激酶抑制剂(例如，吉非替尼)，但是保持对本文所述的HSP90抑制剂的敏感性。在另外的其他实施方案中，NSCLC具有野生型EGFR和/或K-Ras基因或基因产物。在另外的其他实施方案中，所评价或治疗的癌症或肿瘤是鳞状细胞癌(SCC)。在另外的其他实施方案中，所评价和/或治疗的癌症或肿瘤是大细胞癌或肺腺癌。在其他实施方案中，所评价或治疗的癌症或肿瘤具有至少20%、30%、50%、70%显示NSCLC或SCC组织结构的细胞。
在其他实施方案中，所评价和/或治疗的癌症或肿瘤是结直肠癌。在一个实施方案中，所述结直肠癌携带在MAPK途径基因或基因产物(例如，Ras(例如，H-Ras、N-Ras或K-Ras中的一种或多种)、Raf(例如，A-Raf、B-Raf(BRAF)或C-Raf中的一种或多种)、Mek和/或Erk)中的突变。在一个实施方案中，所述结直肠癌携带在Ras(例如，K-Ras)中的突变。在另一个实施方案中，所述结直肠癌携带在Raf(例如，B-Raf)中的突变。
在某些实施方案中，所鉴定或治疗的癌症或肿瘤是神经内分泌癌症或类癌肿瘤(例如，功能性或非功能性神经内分泌或类癌肿瘤)。
本发明的另外实施方案或特征如下：
在某些实施方案中，基因或基因产物的改变(例如，一种或多种致瘤性改变)包括，但不限于细胞遗传异常、非相互易位、重排、染色体内倒位、突变、点突变、缺失、基因拷贝数的变化、转录物中的突变和基因或基因产物表达的变化。在某些实施方案中，转录物中的突变是mRNA突变、rRNA突变或tRNA突变。在某些实施方案中，评价一种或多种致瘤多肽的表达水平、结构(例如，翻译后修饰，如磷酸化)和/或活性。在相关的实施方案中，检测了细胞例如过度增殖性细胞(例如，癌性或肿瘤细胞)中的多种原癌基因表达产物的一种或多种突变致瘤亚型(例如因可变剪接事件、移码事件、翻译事件和/或翻译后事件产生的亚型)的表达水平、结构和/或活性。
在一个实施方案中，所述方法包括检测ALK基因或基因产物中的改变。在其他实施方案中，检测到的改变包括MAPK途径基因或基因产物(包括Ras、Raf、Mek和/或Erk)中的一种或多种改变。在一个实施方案中，MAPK途径基因或基因产物中的改变包括Ras(例如，K-Ras)或Raf(例如，B-Raf)基因或基因产物的一种或多种改变。
在另一个实施方案中，所述方法包括检测MAPK(RAS-RAF-MEK-Erk)途径的异常活化(“MAPK途径活化”)，例如，通过检测该途径的基因(“MAPK途径基因”)或其转录物中的突变，通过检测该途径的蛋白质中的突变，或通过检测该途径的非磷酸化和/或磷酸化蛋白质(“途径蛋白”)的升高的水平。在某些实施方案中，MAPK途径活化的检测包括检测MAPK途径基因或其转录物中的突变、检测MAPK途径蛋白中的突变或检测MAPK途径蛋白的升高的水平。在某些实施方案中，MAPK途径基因是Ras基因、Raf基因、Mek基因或Erk基因。在某些实施方案中，Ras基因是H-Ras基因、N-Ras基因或K-Ras基因。在某些实施方案中，Raf基因是A-Raf基因、B-Raf基因或C-Raf基因。
在其他实施方案中，MAPK途径蛋白是Ras蛋白、Raf蛋白、Mek蛋白、Erk蛋白、Mk1蛋白、RSK蛋白、Ets蛋白、Elk-1蛋白或SAP-1蛋白。在某些实施方案中，Ras蛋白是H-Ras蛋白、N-Ras蛋白或K-Ras蛋白。在某些实施方案中，Raf蛋白是A-Raf蛋白、B-Raf蛋白或C-Raf蛋白。在某些实施方案中，Mek蛋白质是Mek-1或Mek-2。在某些实施方案中，Erk蛋白质是Erk-1或Erk-2。在某些实施方案中，MAPK途径蛋白是非磷酸化的MAPK途径蛋白。在某些实施方案中，MAPK途径蛋白是磷酸化的MAPK途径蛋白。在某些实施方案中，磷酸化的MAPK途径蛋白是磷酸化的Mek蛋白。
在其他实施方案中，所评价和/或治疗的基因或基因产物的改变选自以下中的一种或多种：ALK、RAS(例如，H-Ras、N-Ras或K-Ras中的一种或多种)、EGFR、PIK3CA、RAF(例如，A-Raf、B-Raf(BRAF)或C-Raf中的一种或多种)、PTEN、AKT、TP53(p53)、CTNNB1(β-连环蛋白)、APC、KIT、JAK2、NOTCH、FLT3、MEK、ERK、RSK、ETS、ELK-1或SAP-1。可以评价或治疗单一基因或基因产物，或前述基因或基因产物中两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个的任何组合。例如，可以评价任何前述基因或基因产物中两个的改变(例如，可以评价ALK和K-Ras、ALK和EGFR、K-Ras和EGFR、EGFR和BRAF、K-Ras和p53中的改变)。在其他实施方案中，可以评价任何前述基因或基因产物中任何三个的改变(例如，可以评价ALK、K-Ras及EGFR；或EGFR、K-Ras及p53中的改变)。
在一个实施方案中，评价和/或治疗ALK基因或基因产物中的改变(例如，一个或多个致瘤性改变)。在某些实施方案中，突变ALK基因或基因产物中的改变选自表1中所列的突变ALK多核苷酸分子或多肽(SEQ ID NO:1-13)。如本文所述，ALK基因或基因产物中的改变的非限制性实例包括EML4-ALK融合物、KIF5B-ALK融合物、TGF-ALK融合物、NPM-ALK融合物和ALK点突变，所述ALK点突变包括F1245I/L、L1204F、A1200V、L1196M、I1170S、T1151M、R1275Q、F1174V/C/L、T1087I和K1062M中的一种或多种。在一个实施方案中，所述改变包括在ELM4的N端和ALK的C端之间的染色体内倒位，从而产生EML4-ALK融合蛋白。
在其他实施方案中，评价和/或治疗Ras基因或基因产物中的改变(例如，一种或多种致瘤性改变)。在某些实施方案中，突变Ras基因或基因产物选自表5中所列的突变Ras多核苷酸分子或多肽(SEQ IDNO:14-16和SEQ ID NO:20-22)。在一个实施方案中，在K-Ras、H-Ras和/或N-Ras任一者中的一种或多种突变包括，例如在密码子12、13和/或61中的突变，包括但不限于、G12A、G12N、G12R、G12C、G12S、G12V、G13N和Q61R。在一个实施方案中，评价或治疗了K-Ras基因或基因产物的一个或多个改变。KRAS基因中的改变的非限制性实例选自KRAS_G12C、KRAS_G12R、KRAS_G12D、KRAS_G12A、KRAS_G12S、KRAS_G12V、KRAS_G13D、KRAS_G13S、KRAS_G13C、KRAS_G13V、KRAS_Q61H、KRAS_Q61R、KRAS_Q61P、KRAS_Q61L、KRAS_Q61K、KRAS_Q61E、KRAS_A59T和KRAS_G12F。
在另外的其他实施方案中，评价或治疗RAF(例如，A-Raf、B-Raf(BRAF)或C-Raf中的一个或多个)基因或基因产物中的改变(例如，一种或多种致瘤性改变)。在某些实施方案中，突变Raf基因或基因产物中的改变选自表5中所列的突变Raf多核苷酸分子或多肽(SEQ IDNO:17-19和SEQ ID NO:23-25)或B-Raf的密码子464、466、468、469、594、595、596、597、599、600或601中的突变。RAF基因或基因产物中的示例性改变包括，但不限于BRAF_D594G、BRAF_D594V、BRAF_F468C、BRAF_F595L、BRAF G464E、BRAF_G464R、BRAF_G464V、BRAF_G466A、BRAF_G466E、BRAF_G466R、BRAF_G466V、BRAF_G469A、BRAF_G469E、BRAF_G469R、BRAF_G469R、BRAF_G469S、BRAF_G469V、BRAF_G596R、BRAF_K601E、BRAF_K601N、BRAF L597Q、BRAF_L597R、BRAF_L597S、BRAF L597V、BRAF_T599I、BRAF_V600E、BRAF_V600K、BRAF_V600L和BRAF_V600R。
在其他实施方案中，评价或治疗EGFR基因或基因产物中的改变(例如，一种或多种致瘤性改变)。EGFR基因或基因产物中的示例性改变包括，但不限于EGFR外显子缺失(例如，EGFR外显子19缺失)和/或外显子突变(例如，L858R/T790M EGFR突变)。其他示例性改变包括，但不限于EGFR_D770_N771>AGG；EGFR_D770_N771insG；EGFR_D770_N771insG；EGFR_D770_N771insN:EGFR_E709A；EGFR_E709G:EGFR_709H；EGFR_E709K:EGFR_E709V；EGFR_E746_A750del:EGFR_E746_A750del，T751A；EGFR_E746_A750del，V ins；EGFR_E746_T751del，I ins；EGFR_E746_T751del，S752A；EGFR E746_T751del，S752D；EGFR_E746_T751_del，V ins；EGFR_G719A；EGFR_G719C；EGFR_G719S:EGFR_H773_V774insH；EGFR_H773_V774insNPH；EGFR_H773_V774insPH；EGFR_H773>NPY；EGFR_L747_E749del；EGFR_L747_E749del，A750P；EGFR_L747_S752del:EGFR_L747_S752del，P753S；EGFR_L747_S752del，Q ins；EGFR_L747_T750del，P ins；EGFR_L747_T751del；EGFR_L858R；EGFR_L861Q；EGFR_M766_A767insAI；EGFR_P772_H773insV；EGFR S752_1759del；EGFR_S768I；EGFR_T790M:EGFR_V769_D770insASV；EGFR_V769_D770insASV:和EGFR_V774_C775insHV。
在某些实施方案中，评价和/或治疗的受试者是哺乳动物，例如灵长类，通常是人(例如，罹患本文所述癌症或肿瘤或存在罹患癌症或肿瘤的风险的患者)。受试者可以是存在患病风险的受试者，例如具有罹患癌症的亲属的受试者，或具有与所述癌症风险相关的遗传性状的受试者。在一个实施方案中，受试者可以是有症状的或无症状的。在某些实施方案中，受试者是具有基因或基因产物中的致瘤性改变的患者。例如，所述受试者可以具有选自以下的基因或基因产物中的一种或多种改变：ALK、RAS(例如，H-Ras、N-Ras或K-Ras中的一种或多种)、EGFR、PIK3CA、RAF(例如，A-Raf、B-Raf(BRAF)或C-Raf中的一种或多种)、PTEN、AKT、TP53(p53)、CTNNB1(β-连环蛋白)、APC、KIT、JAK2、NOTCH、FLT3、MEK、ERK、RSK、ETS、ELK-1或SAP-1中的一种或多种。在一个实施方案中，受试者是具有ALK基因或基因产物中的改变的患者，所述ALK基因或基因产物的改变例如ALK基因重排(例如，EML4-ALK融合)；或MAPK途径基因或基因产物如Ras(例如，K-Ras)或Raf(例如，B-Raf)基因或基因产物中的改变(例如，K-Ras或B-Raf基因中的激活性突变)。在一个实施方案中，受试者罹患或诊断罹患NSCLC(例如，复发和/或难治性NSCLC)或SCC。在其他实施方案中，受试者罹患或诊断罹患结直肠癌。在某些实施方案中，鉴定或治疗的受试者已经或目前正在用作为单一药剂或组合例如单独或与mTOR抑制剂、ALK抑制剂和/或其他化疗剂组合的HSP90抑制剂治疗。在某些实施方案中，所述受试者需要HSP90抑制剂疗法(或与例如另一种化疗剂例如多西他赛或依立替康的联合疗法)、被鉴定为可能从所述疗法获益或正在针对该疗法进行考察。例如，受试者可以是具有以下一项或多项的患者：吸烟史；罹患NSCLC或SCC的患者；或具有升高的HSP90水平或表达的患者。在一个实施方案中，所述受试者抵抗(例如，部分或完全地抵抗)ALK激酶抑制剂。在另一个实施方案中，受试者是抵抗(例如，部分地或完全抵抗)先前的化疗方案(例如，含铂化疗方案)。在又一个实施方案中，受试者具有在EGFR基因或基因产物中的突变。在另外的其他实施方案中，受试者(例如，NSCLC患者)具有在EGFR基因或基因产物中的突变并且已经事先用酪氨酸激酶抑制剂进行治疗。在一个实施方案中，所述受试者抵抗(例如，部分或完全地抵抗)酪氨酸激酶抑制剂，例如吉非替尼。
在一个实施方案中，在本发明方法中的评价的样本从所述受试者收集或获得，或可选地，所述方法进一步包括从受试者获得或收集样本。该样本可以选自以下一项或多项：组织(例如，组织活检)、全血、血清、血浆、颊部刮片(buccal scrape)、痰、唾液、脑脊液、尿、粪便、循环的肿瘤细胞、循环的核酸或骨髓。
在其他实施方案中，所述改变通过本领域可获得任何检测方法检测，所述检测方法包括但不限于以下一种或多种：核酸杂交测定、基于扩增的测定、基于扩增的测定(例如，聚合酶链反应(PCR))、PCR-RFLP测定、实时PCR、测序、筛选分析(包括借助标准核型方法的分裂中期细胞遗传分析、FISH、光谱核型分析或MFISH、对比基因组杂交)、原位杂交、SSP、HPLC或质谱基因分型。
在另外的其他实施方案中，检测本文所述的一种或多种致瘤多肽(例如ALK、MAPK途径多肽或EGFR多肽)的表达水平。例如，所述多肽可以使用与ALK、MAPK途径多肽或EGFR多肽特异性结合的试剂检测。在另一个实施方案中，所述试剂选自抗体和抗体衍生物以及抗体片段。在又一个实施方案中，致瘤多肽(例如ALK、MAPK途径多肽或EGFR多肽)的量、结构和/或活性与预定值例如参考值(例如，对照样本)比较。
在一个实施方案中，所述方法包括：使从受试者获得的样本例如基因组DNA样本(例如，染色体样本或分级、富集或另外预处理的样本)或基因产物(mRNA、cDNA)与探针(例如，外显子特异性探针、对期望序列特异的探针)在适于杂交的条件下接触，并且确定基因或基因产物(例如，染色体区域中与细胞遗传异常(例如，本文所述的ALK、MAPK或EGFR途径突变中的一种或多种)相关的基因组DNA)中一种或多种异常的存在或不存在。所述方法可以任选地包括富集基因或基因产物的样本。
在又一个实施方案中，在预定间隔例如第一时间点和至少后续时间点评估改变，所述改变例如ALK、MAPK途径(例如，K-Ras或B-Raf)或EGFR、肿瘤组织结构或HSP90水平的一种或多种改变。在一个实施方案中，通过确定患者疾病过程中显著事件之间在的时间而测量时程，其中所述测量预示患者是否具有长时程。在另一个实施方案中，显著事件是从初步诊断至死亡的进展。在另一个实施方案中，显著事件是从初步诊断至转移性疾病的进展。在另一个实施方案中，显著事件是从初步诊断至复发的进展。在另一个实施方案中，显著事件是从转移性疾病至死亡的进展。在另一个实施方案中，显著事件是从转移性疾病至复发的进展。在另一个实施方案中，显著事件是从复发至死亡的进展。在某些实施方案中，相对于总存活率、至进展的时间和/或使用RECIST或其他响应标准中的一种或多种，测量时程。
在某些实施方案中，通过将患者样本分成至少两个患者亚组，产生预定值。在某些实施方案中，亚组的数目是两个，从而将患者样本分成具有致瘤性改变(例如ALK突变、MAPK途径突变或EGFR(例如，K-Ras)突变)；或阳性吸烟状态、肿瘤组织结构或升高的HSP90表达中一种或多种的第一患者亚组；和没有致瘤性异常、非吸烟者、具有良性肿瘤组织结构或对照HSP90表达水平的第二亚组。在某些实施方案中，将受试者中的ALK突变、MAPK途径(例如，K-Ras或B-Raf)或EGFR状态或吸烟状态、肿瘤组织结构、HSP90表达升高中的一种或多种与第一或第二亚组比较；如果患者具有以下一项或多项：ALK、MAPK途径(例如，K-Ras或B-Raf)或EGFR中突变、是吸烟者，具有升高的HSP90水平或癌组织结构，则该患者可能对作为单一药剂或组合的HSP90抑制剂(例如，IPI-493和/或IPI-504)响应。在某些实施方案中，响应者具有增加的可能性或可能具有长时程。在某些实施方案中，由于与本文所述的特定致瘤性改变、吸烟状态、组织结构和HSP90水平相关，亚组的数目大于两个，包括但不限于三个亚组、四个亚组、五个亚组和六个亚组，这取决于预测的HSP90和/或mTOR、ALK、酪氨酸激酶抑制剂功效的分级。在某些实施方案中，相对于总存活率、至进展的时间和/或使用Recist标准，测量响应的可能性。
在其他实施方案中，该方法还包括以下一项或多项：确定罹患癌症或肿瘤(其具有本文所述的改变)或本文所述吸烟状态、组织结构和HSP90水平的受试者是否可能对用作为单一药剂或组合例如单独或与ALK抑制剂、mTOR抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂或其他化疗剂(例如，多西他赛或依立替康)组合的HSP90抑制剂(例如，IPI-493和/或IPI-504)的治疗响应；确定治疗方案(例如，改变疗法的过程、给药、治疗计划或时程、联合疗法)。该方法可以用来预测所述癌症在受试者中的时程。在其他实施方案中，该方法用来预测癌症受试者中显著事件的概率。
在一个实施方案中，HSP90抑制剂是格尔德霉素(geldanamycin)衍生物，例如苯醌或氢醌安莎霉素(ansamycin)HSP90抑制剂(例如，IPI-493和/或IPI-504)。例如，HSP90抑制剂可以选自以下一种或多种：IPI-493、IPI-504、17-AAG(也称作坦螺旋霉素(tanespimycin)或CNF-1010)、BIIB-021(CNF-2024)、BIIB-028、AUY-922(也称作VER-49009)、SNX-5422、STA-9090、AT-13387、XL-888、MPC-3100、CU-0305、17-DMAG、CNF-1010、大贝霉素(Macbecin)(例如，大贝霉素I、大贝霉素II)、CCT-018159、CCT-129397、PU-H71或PF-04928473(SNX-2112)。
在一个实施方案中，Hsp90抑制剂是式1的化合物：
Figure BDA00001882655700181
或游其离碱；
其中对于每次出现而言独立地：
W是氧或硫；
Q是氧、NR、N(酰基)或键；
X-是药学上可接受酸的共轭碱；
R对于每次出现而言独立地选自氢、烷基、环烷基、杂环烷基、芳烷基、杂芳基和杂芳烷基；
R1是羟基、烷氧基、-OC(O)R8、-OC(O)OR9、-OC(O)NR10R11、-OSO2R12、-OC(O)NHSO2NR13R14、-NR13R14或卤化物；并且R2是氢、烷基或芳烷基；或者R1和R2与它们结合的碳一起代表-(C=O)-、-(C=N-OR)-、-(C=N-NHR)-或-(C=N-R)-；
R3和R4各自独立地选自氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、环烷基、杂环烷基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基和-[(CR2)p]-R16；或R3连同R4一起代表任选地取代的4-8元杂环；
R5选自H、烷基、芳烷基和具有式1a的基团：
其中R17独立地选自氢、卤化物、羟基、烷氧基、芳氧基、酰氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、酰基氨基、芳烷基氨基、硝基、硫代酰基、甲酰胺、羧基、腈基、-COR18、-CO2R18、-N(R18)CO2R19、-OC(O)N(R18)(R19)、-N(R18)SO2R19、-N(R18)C(O)N(R18)(R19)和-CH2O-杂环基；
R6和7均是氢；或R6和R7一起形成键；
R8是氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、环烷基、杂环烷基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基或-[(CR2)p]-R16；
R9是烷基、链烯基、炔基、芳基、环烷基、杂环烷基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基或-[(CR2)p]-R16；
R10和R11各自独立地选自氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、环烷基、杂环烷基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基和-[(CR2)p]-R16；或R10和R11连同与它们结合的氮一起代表任选地取代的4-8元杂环；
R12是烷基、链烯基、炔基、芳基、环烷基、杂环烷基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基或-[(CR2)p]-R16；
R13和R14各自独立地选自氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、环烷基、杂环烷基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基和-[(CR2)p]-R16；或R13和R14连同与它们结合的氮一起代表任选取代的4-8元杂环；
R16对于每次出现而言独立地选自氢、羟基、酰基氨基、-N(R18)COR19、-N(R18)C(O)OR19、-N(R18)SO2(R19)、-CON(R18)(R19)、-OC(O)N(R18)(R19)、-SO2N(R18)(R19)、-N(R18)(R19)、-OC(O)OR18、-COOR18、-C(O)N(OH)(R18)、-OS(O)2OR18、-S(O)2OR18、-OP(O)(OR18)(OR19)、-N(R18)P(O)(OR18)(OR19)和-P(O)(OR18)(OR19)；
p是1、2、3、4、5或6；
R18对于每次出现而言独立地选自氢、烷基、芳基、环烷基、杂环烷基、芳烷基、杂芳基和杂芳烷基；
R19对于每次出现而言独立地选自氢、烷基、芳基、环烷基、杂环烷基、芳烷基、杂芳基和杂芳烷基；或R18连同19一起代表任选地取代的4-8元环；
R20、R21、R22、R24、和R25对于每次出现而言独立地是烷基；
R23是烷基、-CH2OH、-CHO、-COOR18或-CH(OR18)2；
R26和R27对于每次出现而言独立地选自氢、烷基、芳基、环烷基、杂环烷基、芳烷基、杂芳基和杂芳烷基；
条件是当R1是羟基时，R2是氢，R6和R7一起形成双键，R20是甲基，R21是甲基，R22是甲基，R23是甲基，R24是甲基，R25是甲基，R26是氢，R27是氢，Q是键并且W是氧；R3和R4不都是氢或当一起时，也不代表未取代的氮杂环丁烷；并且
在式1的立体中心(stereogenic center)处的绝对立体化学可以是R或S或其混合物，并且双键的立体化学可以是E或Z或其混合物。
在其他实施方案中，Hsp90抑制剂是式3的化合物：
Figure BDA00001882655700201
或游其离碱；
其中X-是药学上可接受酸的共轭碱。在某些实施方案中，所述药学上可接受酸具有介于约-10和约3之间的pKa。X-可以选自氯化物、溴化物、碘化物、H2PO4 -、HSO4 -、甲基磺酸盐、苯基磺酸盐、对甲苯磺酸盐、三氟甲基磺酸盐、10-樟脑磺酸盐、萘-1-磺酸-5-磺酸盐、乙烷-1-磺酸-2-磺酸盐、环已氨基磺酸盐、硫氰酸盐、萘-2-磺酸盐和草酸盐。在一个实施方案中，X-是氯化物。
在某些实施方案中，Hsp90抑制剂是17-AG。在其他实施方案中，HSP90抑制剂是IPI-493。在其他实施方案中，HSP90抑制剂是IPI-504。
在某些实施方案中，一种或多种HSP90抑制剂作为单一疗法或作为例如存在于组合物(例如包含一种HSP90抑制剂的药物组合物中)中的单一药剂施用。
在其他实施方案中，HSP90抑制剂与第二治疗剂或不同治疗形式例如抗癌剂组合和/或与手术方法和/或辐射方法组合施用。
在其他实施方案中，HSP90抑制剂与另一种HSP抑制剂例如IPI-493和/或IPI-504组合施用、与以下一种或多种组合施用：17-AAG(也称作坦螺旋霉素或CNF-1010)、BIIB-021(CNF-2024)、BIIB-028、AUY-922(也称作VER-49009)、SNX-5422、STA-9090、AT-13387、XL-888、MPC-3100、CU-0305、17-DMAG、CNF-1010、大贝霉素(例如，大贝霉素I、大贝霉素II)、CCT-018159、CCT-129397、PU-H71或PF-04928473(SNX-2112)。
本文所述的HSP90抑制剂可以全身性(例如，口服、肠胃外、皮下、静脉内、直肠、肌内、腹内、鼻内、经皮或通过吸入或腔内安装)施用至受试者。一般，将HSP90抑制剂通过皮下、静脉内或口服施用。
在一个实施方案中，HSP90抑制剂是IPI-504。IPI-504可以单独或与如本文所述的第二药剂组合以每周约300至500mg/m2、一般约350至500mg/m2和更一般450mg/m2的剂量静脉内施用。
在一个实施方案中，与HSP90抑制剂组合使用的第二药剂或抗癌剂是细胞毒性剂或细胞抑制剂。示例性的细胞毒性剂包括抗微管剂、拓扑异构酶抑制剂(例如，依立替康)或紫杉烷(例如，多西他赛)、抗代谢物、有丝分裂抑制剂、烷基化剂、嵌入剂、能够干扰信号转导途径的药剂、促进凋亡的药剂和辐射。在另外的其他实施方案中，所述方法可以与免疫调节剂(例如IL-1、2、4、6或12)或干扰素α或γ或免疫细胞生长因子如GM-CSF组合使用。在一个实施方案中，抗癌剂是拓扑异构酶抑制剂，例如依立替康。
在其他实施方案中，与HSP90抑制剂组合使用的抗癌剂是酪氨酸激酶抑制剂(例如，受体酪氨酸激酶(RTK)抑制剂，例如吉非替尼)、拓扑异构酶抑制剂(例如，依立替康)或紫杉烷(例如，多西他赛)。在其他实施方案中，可以使用单独或与mTOR抑制剂组合的HSP90抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂(例如，受体酪氨酸激酶(RTK)抑制剂，例如吉非替尼)、拓扑异构酶抑制剂(例如，依立替康)和/或紫杉烷(例如，多西他赛)的组合。
可以使用单独或与mTOR抑制剂或ALK抑制剂组合的HSP90抑制剂和其他治疗形式的任何组合。例如，HSP90抑制剂和其他治疗形式可以在活动性病症的期间或在缓解或疾病活动性更小的期间施用。单独或与mTOR抑制剂或ALK抑制剂组合的HSP90抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂和其他治疗形式可以在治疗之前、与治疗同时、在治疗之后或在病症缓解期间施用。在一个实施方案中，将抗癌剂与HSP90抑制剂和/或mTOR抑制剂或ALK抑制剂同时或依次施用。
在其他实施方案中，HSP90抑制剂、mTOR抑制剂、ALK抑制剂和/或抗癌剂作为独立的组合物(例如，药物组合物)施用。在其他实施方案中，HSP90抑制剂、mTOR抑制剂、ALK抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂和/或抗癌剂分别施用，但是通过相同途径(例如，均通过口服或均静脉内)。仍在其他情况下，HSP90抑制剂、mTOR抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂和/或抗癌剂在相同的组合物例如相同的药物组合物中施用。
在一个实施方案中，HSP90抑制剂与mTOR抑制剂例如选自以下一种或多种的一种或多种mTOR抑制剂组合施用：雷帕霉素(rapamycin)、坦罗莫司(temsirolimus)
Figure BDA00001882655700221
依维莫司(everolimus)(RAD001、)、地磷莫司（ridaforolimus）、AP23573、AZD8055、BEZ235、BGT226、XL765、PF-4691502、GDC0980、SF1126、OSI-027、GSK1059615、KU-0063794、WYE-354、INK128、坦罗莫司(CCI-779)、Palomid 529(P529)、PF-04691502或PKI-587。在一个实施方案中，mTOR抑制剂抑制TORC1和TORC2。TORC1和TORC2双重抑制剂的实例包括例如OSI-027、XL765、Palomid 529和INK128。HSP90抑制剂可以通过与mTOR抑制剂相同或不同的途径施用。在一个实施方案中，将mTOR抑制剂全身性施用，例如口服、皮下或静脉内施用。
在又一个实施方案中，HSP90抑制剂与ALK激酶抑制剂组合施用。示例性的ALK抑制剂包括TAE-684(本文也称作“NVP-TAE694”)、PF02341066(本文也称作“克里唑蒂尼(crizotinib)”或“1066”)和AP26113。ALK激酶抑制剂的另外实例在Garcia-Echeverria C,等WO2005016894的实施例3-39中描述。
在一些实施方案中，HSP90抑制剂与folfirinox组合施用。Folfirinox包含奥沙利铂(oxaliplatin)85mg/m2和依立替康180mg/m2，外加甲酰四氢叶酸400mg/m2，随后在第1日施用大丸剂氟尿嘧啶(5-FU)400mg/m2，随后5-FU 2,400mg/m2作为46小时连续输注。
在一些实施方案中，HSP90抑制剂与酪氨酸激酶抑制剂例如吉非替尼组合施用。在一些实施方案中，HSP90抑制剂在用酪氨酸激酶抑制剂治疗后施用。
在一些实施方案中，HSP90抑制剂与PI3K抑制剂组合施用。在一个实施方案中，PI3K抑制剂是PI3K的δ和γ亚型的抑制剂。可以与HSP90抑制剂组合使用的示例性PI3K抑制剂包括但不限于GSK2126458、GDC-0980、GDC-0941、Sanofi XL147、XL756、XL147、PF-46915032、BKM 120、CAL-101、CAL 263、SF1126、PX-886和双重PI3K抑制剂(例如，Novartis BEZ235)。在一个实施方案中，PI3K抑制剂是异喹啉。在一个实施方案中，PI3K抑制剂是INK1197或其衍生物。在其他实施方案中，PI3K抑制剂是INK1117或其衍生物。
在一些实施方案中，HSP90抑制剂与BRAF抑制剂，例如GSK2118436、RG7204、PLX4032、GDC-0879、PLX4720和甲苯磺酸盐索拉非尼(sorafenib tosylate)(Bay43-9006)组合施用。
在一些实施方案中，HSP90抑制剂与MEK抑制剂例如ARRY-142886、GSK1120212、RDEA436、RDEA119/BAY 869766、AS703026、AZD6244(司美替尼(selumetinib))、BIX 02188、BIX 02189、CI-1040(PD184352)、PD0325901、PD98059和U0126组合施用。
在一些实施方案中，HSP90抑制剂与JAK2抑制剂例如CEP-701、INCB18424、CP-690550(tasocitinib)组合施用。
在其他实施方案中，HSP90抑制剂与血管阻断剂(vasculardisrupting agent)(例如，DMXAA、vadimezan)组合施用。
在一些实施方案中，HSP90抑制剂是用于癌症或肿瘤的第一线治疗，即，它用于事先未曾施用过意在治疗该癌症的另一种药物的受试者中。
在其他实施方案中，HSP90抑制剂是用于癌症的第二线治疗，即，它用于事先已经施用过意在治疗该癌症的另一种药物的受试者中。
在其他实施方案中，HSP90抑制剂是用于癌症的第三线或第四线治疗，即，它用于事先已经施用过意在治疗该癌症的两种或三种其他药物的受试者中。
在一些实施方案中，将HSP90抑制剂在手术切除/移除所述癌症之前或之后施用至受试者。
在一些实施方案中，将HSP90抑制剂在辐射治疗所述癌症之前、期间和/或之后施用至受试者。
在一些实施方案中，将HSP90抑制剂施用至受试者，例如正在经历或已经历过癌疗法(例如，化疗剂治疗、放射疗法和/或手术)的癌症患者。例如，HSP90抑制剂可以施用至正在经历用第二药剂例如mTOR抑制剂和/或酪氨酸激酶抑制剂、拓扑异构酶抑制剂(例如，依立替康)或紫杉烷(例如，多西他赛)的疗法的患者。在其他实施方案中，HSP90抑制剂与第二药剂同时施用。在同时施用的情况下，HSP90抑制剂可以在用第二药剂治疗已经停止后继续施用。在其他实施方案中，在用第二药剂治疗已经停止后，施用HSP90抑制剂(即，无与癌症治疗重叠的阶段)。
在一个实施方案中，与HSP90抑制剂组合使用的第二药剂是酪氨酸激酶抑制剂(例如，受体酪氨酸激酶(RTK)抑制剂)。
在另外的其他实施方案中，单独或与mTOR抑制剂、ALK抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂和/或抗癌剂(例如，拓扑异构酶抑制剂或RTK抑制剂、拓扑异构酶抑制剂(例如，依立替康)，或紫杉烷(例如，多西他赛))组合的HSP90抑制剂以治疗有效量例如以预定的剂量计划施用。
例如，对于治疗结直肠癌，HSP90抑制剂可以与拓扑异构酶抑制剂例如依立替康组合施用。
例如，对于治疗NSCLC或SCC癌，HSP90抑制剂可以与紫杉烷例如多西他赛(例如，作为多西他赛注射剂)组合施用。在一个实施方案中，HSP90抑制剂是IPI-504。IPI-504可以单独或与标准第二线剂量的多西他赛(75mg/m2)组合每周以450mg/m2的剂量施用。多西他赛
Figure BDA00001882655700252
可以每隔3周(每个21日循环的第1日)以75mg/m2的剂量在大约60分钟内通过静脉内(IV)输注施用。
在其他实施方案中，可以通过施用与HER2抑制剂例如抗HER2抗体如曲妥珠单抗(trastuzumab)
Figure BDA00001882655700253
组合的HSP90抑制剂至受试者(例如，罹患晚期或转移性乳腺癌的患者；罹患HER2阳性乳腺癌的患者)，实现乳腺癌的治疗。在一个实施方案中，每周(例如，以约300mg/m2的剂量)施用HSP-90抑制剂例如IPI-504至罹患转移性HER2阳性乳腺癌的患者，并且每隔3周施用HER2抑制剂(例如，曲妥珠单抗)。
在其他实施方案中，本文所述的方法和/或试剂盒还包括提供和/或传输信息(例如报告)至报告接收方或实体，例如患者，保健供应商、诊断供应商和/或管理机构例如FDA，或另外将关于本文中所公开方法和试剂盒的信息提交至另一方，其中所述信息例如是含有通过如本文所述的方法和/或试剂盒确定的评价或治疗参数的报告。该方法可能涉及服从管理要求，例如管理机构例如FDA的预先批准或批准后要求。
在一个实施方案中，报告接收方或实体可以决定数据是否满足预定的要求或参考值，和任选地决定来自报告接收实体或接收方的回应是否例如由医师、患者、诊断供应商接收。
在另一个方面，本发明特征在于用于确定癌症患者对用HSP90抑制剂治疗的化学敏感性的试剂盒，其包含与一种或多种致瘤性改变例如突变ALK、MAPK途径(例如，K-Ras)、EGFR多核苷酸分子或多肽特异性结合的试剂。在某些实施方案中，该试剂盒包含单独或与mTOR抑制剂、ALK抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂组合的HSP90抑制剂。在一个实施方案中，所述试剂包含一个或多个多核苷酸探针。在一个实施方案中，每个探针包含与表1或表5中所列核苷酸序列互补或本文中公开的序列互补的多核苷酸序列或其互补序列。在另一个实施方案中，所述探针包含长度为50至107个核苷酸的多核苷酸。在又一个实施方案中，所述探针包含长度约10至107个核苷酸的多核苷酸。在又一个实施方案中，所述探针选自包含核碱基的寡核苷酸、cDNA分子、RNA分子和合成基因探针。在其他实施方案中，所述探针包含外显子序列或与其互补的序列。在又一个实施方案中，所述试剂包含针对由表1或表5中所列的一个或多个多核苷酸序列或本文中公开的序列编码的多肽的抗体和抗体衍生物以及抗体片段。在实施方案中，将样本相对于参考值例如对照样本进行评价。试剂盒可以任选地包括用于检测致瘤性改变和/或评价结果的说明书。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料可以用于实施或测试本发明，下面描述合适的方法和材料。本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用方式完整地并入。此外，所述材料、方法和实例仅是说明性的并且不意在是限制性的。
本发明的其他特征和优点将从详细描述、附图和从权利要求书中显而易见。
【附图说明】
图1描述瀑布图，其显示根据ALK状态的目标病灶响应的大小的最佳百分数变化。y轴代表距离基线的肿瘤体积变化%。对于每位患者(每条柱)，在最好响应时可度量肿瘤的变化百分数由患者的基因型即ALK重排状态显示。黑色(还用箭头指示)：ALK突变体；深灰色(还用星号指示)：ALK野生型；浅灰色：ALK状态未知。
图2描述研究的天数。y轴代表从第一剂量的天数。每条柱代表一位患者。黑色(还用箭头指示)：ALK突变体；深灰色(还用星号指示)：ALK野生型；浅灰色：ALK状态未知。
图3A描述了根据EGFR状态显示响应的瀑布图。y轴代表距离基线的肿瘤体积变化%。每条柱代表一位患者。EGFR突变体由箭头指示。
图3B描述了根据KRAS状态显示响应的瀑布图。y轴代表距离基线的肿瘤体积变化%。每条柱代表一位患者。KRAS突变体由箭头指示。
图3C描述了根据ALK FISH状态显示响应的瀑布图。y轴代表距离基线的肿瘤体积变化%。每条柱代表一位患者。ALK重排由箭头指示。
图4描述对于检验ALK重排的患者而言目标病灶大小随时间的变化。y轴代表距离基线的肿瘤体积变化%；x轴代表研究时的月份。每个点代表一位患者。
图5描述了用IPI-504(空心圆圈)或Pf-02341066(实心圆圈)处理的H3122细胞中细胞生长抑制(%对照)的相对剂量响应曲线。
图6A是显示用或不用IPI-504处理的活H3122细胞百分数的柱状图。
图6B描述了用IPI-504或Pf-02341066处理的H3122细胞中细胞生存力的相对剂量响应曲线。
图7A-7C表明，EML4-ALK是对Hsp90抑制较Her2或mEGFR更敏感的Hsp90客户蛋白(client protein)。
图7A描述了用递增浓度的IPI-504处理72小时的H3122细胞中，使用ELISA监测的EML-ALK(空心圆圈)水平和磷酸-EML4-ALK(实心正方形)水平的相对剂量响应曲线。结果显示为未处理细胞的百分数。
图7B是免疫印迹图像的图，其显示在IPI-504(1uM)处理后在多个时间点上H3122细胞中ALK、磷酸ALK和裂解的PARP的水平、BT474细胞中HER2的水平和H1650细胞中EGFR的水平。蛋白质水平由免疫印迹法监测。
图7C显示不同细胞裂解物中EML4-ALK与Hsp90免疫共沉淀的结果。
图8A-8B显示，IPI-504处理引起EML4-ALK降解、下游途径抑制和细胞生长停滞。
图8A是免疫印迹图像，其显示在IPI-504(1uM)处理后在多个时间点上H3122细胞中ALK、磷酸ALK、AKT、磷酸-ERK1/2、ERK1/2、磷酸-STAT3和STAT3的水平。
图8B是线性图，其显示对于与递增浓度的IPI-504孵育72小时的H3122细胞生长的影响。使用Cell Titer Glo监测细胞生长。
图9A-9C显示，293FT中的EML4-ALK表达赋予针对IPI-504的体外和体内敏感性。
图9A是显示对IPI-504处理响应，裂解物中总EML4-ALK和磷酸-EML4-ALK的水平的免疫印迹图像，其中所述裂解物来自293FT亲本细胞(293FTwt)、过表达EML4-ALK的293FT细胞(293FTALK)和过表达无激酶活性的EML4-ALK的293FT(293FTALK-KD)。裂解物通过SDS-PAGE分离并且使用ALK或pALK抗体进行免疫印迹。
图9B是显示用IPI-504处理的活293FTALK-KD和293FTALK细胞百分数的柱状图。
图9C是柱状图，其显示在裸鼠和荷瘤动物的右侧腹部注射并且每周2次用媒介物或100mg/kg IPI-504治疗2周后，过表达EML4-ALK(293FTALK)或YFP(293FTYFP)的293FT细胞的肿瘤体积变化。结果呈现为平均数和SEM(n=8)。
图10A-10D显示IPI-504治疗在体内导致肿瘤消退。
图10A是线性图，其显示在用IPI-504,PF02341066治疗的样本或媒介物治疗的对照中，IPI-504治疗在H3122异种移植模型中在肿瘤消退方面的作用。H3122异种移植物(每组n=10)用75mg/kg IPI-504腹内每周两次(空心圆圈)、媒介物(空心正方形)或50mg/kg PF-1066口服每日一次(实心三角形)处理。
图10B是图10A中方框的放大图。结果呈现为平均数和SEM。
图10C是线性图，其描述IPI-504和PF-1066的组合在H3122异种移植模型中对肿瘤大小的影响。将肿瘤体积(以mm3计)显示为治疗日的函数。IPI-504和PF-1066的组合引起肿瘤大小消退66%。IPI-504和PF-1066的组合。H3122异种移植物(每组n=10)用IPI-50450mg/kg每周两次(空心圆圈)、PF-106637.5mg/kg每日一次(实心三角形)或二者组合(实心正方形)处理。
图10D是图10C中方框的放大图，其显示在组合组中肿瘤消退。
图11是显示在植入IPI-504处理后的293FTEML4ALKv1或293FT-YFP细胞的裸鼠中肿瘤大小的柱状图。
图12A-12B描述IPI-504治疗后的PD时程。在单次注射100mg/kgIPI-504后，在多个时间收集肿瘤，并且分别使用ELISA和免疫印迹法监测ALK水平(图12A)和裂解的PARP水平(图12B)。
图13A-13B描述了根据通过组织学所分析的癌症亚型显示对IPI-504响应的瀑布图。检查的癌症是腺癌(显示为#1)、细支气管肺泡癌(BAC)(显示为#2)、大细胞肺癌(显示为#3)、鳞状细胞癌(显示为#4)、未知(显示为#5)和对照(显示为#6)。每条柱代表一位患者。
图14描述了根据吸烟状态显示对IPI-504响应的瀑布图。将不吸烟者显示为#1并将吸烟者显示为#2。y轴代表距离基线的肿瘤体积变化%。每条棒代表一位患者。
图15描述这样的图，其显示在罹患NSCLC的患者中烟草暴露(由包年数评估)增加时由肿瘤体积下降%所确定的增加的IPI-504功效。y轴代表距离基线的肿瘤体积变化%。
图16描述这样的图，其显示在具有SCC和其他肺癌组织结构的患者中烟草暴露(由包年数评估)增加时由肿瘤体积下降%所确定的增加的IPI-504功效。y轴代表距离基线的肿瘤体积变化%。
图17是汇总IPI-504和多西他赛的组合在NSCLC患者中功效的柱状图。
图18A-18B是流程图，其汇总了评价评IPI-504和多西他赛的组合的两项临床试验的研究设计。
图19描述了MAPK(Ras-Raf-Mek-Erk)途径。
图20A-20D描述Hsp90抑制剂17-AG(本文也称作“IPI-493”)在突变体B-Raf结直肠癌模型中的功效：Colo205(图20A)、Colo201(图20B)、Colo741(图20C)和HT55(图20D)。
图21A-21C描述Hsp90抑制剂17-AG在突变体K-Ras结直肠癌模型中的功效：HCT-116(图21A)、SW480(图21B)和DuDu-1(图21C)。
图22A-22D描述Hsp90抑制剂17-AG(IPI-493)在结直肠癌模型野生型(wt)中对K-Ras和B-Raf缺乏功效：Colo320HSR(图22A)、NCI-H716(图22B)、SNU-C1(图22C)和C2BBe1(图22D)。
图23A显示一组免疫印迹，其描述单次剂量的IPI-493(100mpk)后突变体Colo 201和Colo 205异种移植物中磷酸化BRAF的时间依赖性减少。在KRAS突变体模型中观察到相似的变化。在野生型Colo320HSR中检测到磷酸化BRAF活性的最小变化。
图23B显示一组柱状图，其描述突变体Colo 201和Colo 205异种移植物中磷酸化MEK的时间依赖性减少。在KRAS突变体模型中观察到相似的变化。单次剂量的IPI-493(100mpk)后，在野生型Colo320HSR中检测到磷酸化BRAF活性的最小变化。
图23C显示一组柱状图，其描述突变体Colo 201和Colo 205异种移植物中裂解的半胱天蛋白酶3活性的时间依赖性增加(与磷酸MEK的减少相关)。单次剂量的IPI-493(100mpk)后，在野生型Colo320HSR中检测到最小变化。
图24A-24B描述Hsp90抑制剂17-AG在野生型(wt/wt)原始模型和突变体(mut)K-Ras模型中的功效：CXF-1729(图24A)和CXF-260(图24B)。
图25显示MAPK途径的活化预测对Hsp90抑制剂17-AG的敏感性。
图26A-26B描述Hsp90抑制剂17-AG和依立替康在突变体B-Raf结直肠癌模型(Colo-201)中的有效组合。图26B是图26A的放大截图。
图27A-27B描述Hsp90抑制剂17-AG和依立替康在突变体K-Ras结直肠癌模型(HCT-116)中的有效组合。图27B是图27A的放大截图。
图28A-28B描述Hsp90抑制剂17-AG和依立替康在突变体K-Ras结直肠癌模型(DuDu-1)中的有效组合。图21B是图21A的放大截图。
图29A是描述与多个浓度17-AG孵育的三个细胞系(BON-1、QGP-1和H-720)的生长抑制百分数的图。
图29B是描述与多个浓度IPI-504孵育的三个细胞系(BON-1、QGP-1和H-720)的生长抑制百分数的图。
图30是描述小鼠中BON-1异种移植肿瘤大小的变化的图，所述小鼠用每周2次腹内施用的IPI-504(15mg/kg)和媒介物治疗(每组n=10)。
图31是描述用IPI-504处理后BON-1细胞中磷酸IGF-1R降解的图。
图32是与1uM IPI-504、100nM雷帕霉素或二者的组合孵育6小时或24小时的BON-1细胞的蛋白质印迹。将50ug细胞裂解物进行免疫印迹以分析pAKT、总AKT、pS6、总S6、pERK 1/2、IGF-1Rb、Hsp70和b-肌动蛋白。
【表格简述】
表1描述多种野生型或突变体ALK或ALK融合物的核苷酸序列和氨基酸序列。
表2通过EGFR、KRAS和ALK基因型描述个人背景特征、基线特征和化疗治疗史。
表3描述最常报道的不良事件。
表4通过EGFR、KRAS和ALK基因型描述IPI-504的功效。
表5描述多种野生型或突变体MAPK途径基因和基因产物的核苷酸序列和氨基酸序列。
表6-7在所附实施例中陈述。
表8总结IPI-504和IPI-493在体外CRC细胞系中的活性。
附表1汇总来自EGFR、KRAS、BRAF、ALK、PIK3CA、TP53和CTNNB1中突变的snapshot、Oncomap、DxS和Sanger测序的遗传结果。
【发明详述】
本发明至少部分地提供用于鉴定、评估和/或治疗癌症或肿瘤(例如，癌基因相关癌症或肿瘤)的组合物、方法和试剂盒，其中所述癌症或肿瘤对包括HSP90抑制剂(例如，作为单一药剂或组合，例如单独或与mTOR抑制剂、ALK抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂和/或其他化疗剂(例如，多西他赛或依立替康)组合的HSP90抑制剂)的治疗响应。
在一个实施方案中，本发明提供了通过检测ALK、MAPK途径和/或EGFR基因或基因产物中的改变(例如，通过检测以下一项或多项：基因突变；ALK、MAPK途径和/或EGFR基因或基因产物如Ras、Raf、Mek和/或Erk的基因表达、转录物或蛋白质水平的变化)，用于评价肿瘤、癌细胞和/或具有所述肿瘤或癌细胞的受试者对包括HSP90抑制剂的治疗的响应性的方法。在一个实施方案中，ALK基因或基因产物中改变(例如ALK重排)的存在指示肺癌例如非小细胞肺癌(NSCLC)对包括HSP90抑制剂的治疗的响应性。在其他实施方案中，Ras(例如K-Ras)基因或基因产物中改变的存在，任选地与p53中的改变组合，指示肺癌例如NSCLC对HSP90抑制剂和mTOR抑制剂的组合的响应性。在其他实施方案中，Ras(例如，K-Ras)基因或基因产物中改变(例如，突变)的存在指示结直肠癌(CRC)对包括HSP90抑制剂的治疗的响应性。在另外的其他实施方案中，Raf(例如B-Raf)基因或基因产物中改变(例如，突变)的存在指示结直肠癌对包括HSP90抑制剂的治疗的响应性。
在另一个实施方案中，本发明进一步提供一种通过评价以下一项或多项，用于鉴定或选择受试者为可能或不可能对包括HSP90抑制剂的治疗响应的方法：受试者的组织结构(例如，检测NSCLC或鳞状细胞组织结构的存在(例如，检测来自所述受试者的样本中的NSCLC或SCC细胞或组织)；受试者的吸烟状态(例如，具有至少5、10、15或更长包年吸烟史的受试者)；HSP90基因或基因产物的水平或表达和/或本文所述的改变(例如，ALK、MAPK途径和/或EGFR基因或基因产物中的一种或多种改变)。
在另外的其他实施方案中，本发明包括用于用单独或与mTOR抑制剂、ALK抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂(例如，吉非替尼)和/或其他化疗剂(例如，多西他赛或依立替康)组合的HSP90抑制剂改善或治疗癌症或肿瘤的方法，其中所述癌症或肿瘤携带本文所述的致瘤性改变(例如，ALK、MAPK途径和/或EGFR基因或基因产物中的一种或多种致瘤性改变)。在某些实施方案中，所述癌症或肿瘤存在于下述受试者中，其中所述受试者需要HSP90抑制剂疗法(或采用mTOR抑制剂、ALK抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂和/或其他化疗剂(例如，多西他赛或依立替康)的联合疗法)、正在针对所述疗法进行考查或评价。
因而，本发明因此可以作为一种手段用来评价对包括HSP90抑制和/或TOR和/或ALK抑制的疗法的响应性或监测所述疗法；将患者群体分级；鉴定可能从此类药剂获益的患者、为此类患者预测疾病的时程或显著事件在所述疾病中的概率和/或更有效地监测、治疗或预防癌症或肿瘤。
下文总结在所附实施例中公开的本发明的某些实施方案。
在某些实施方案中，公开了用于鉴定特定基因组区域的方法。此类方法使用本领域已知的技术，包括，但不限于基于寡核苷酸的微阵列(Brennan等(2004)Cancer Res.64(14):4744-8；Lucito等(2003)Genome Res.13:2291-2305；Bignell等(2004)Genome Res.14:287-295；Zhao,等(2004)Cancer Research,64(9):3060-71)和如本文所述的其他方法，包括例如杂交方法(如，例如，FISH和FISH加光谱核型法(SKY))。另外，提供了用于实施本发明方法的组合物和试剂盒。
例如，本发明提供了用于评价ALK基因座中的基因组重排、评价ALK基因、本文所鉴定的突变和/或基因产物(例如，表1中所述的标记)的存在、不存在或拷贝数变化，或评价影响ALK基因产物(例如，表1中所述的标记)的活性的突变(例如，取代、缺失或添加突变)的拷贝数、表达水平、蛋白质水平、蛋白质活性、存在的方法。
在其他实施方案中，本发明提供了用于检测MAPK(RAS-RAF-MEK-Erk)途径异常活化(“MAPK途径活化”)的方法，例如，通过检测该途径的基因(“MAPK途径基因”)或其转录物中的突变，通过检测该途径的蛋白质中的突变，或通过检测该途径的非磷酸化和/或磷酸化蛋白质(“途径蛋白”)的升高的水平。
在其他实施方案中，申请人已经发现：1)EML4-ALK是高度敏感的Hsp90客户蛋白；2)EML4-ALK的表达可以使细胞对IPI-504治疗敏感；3)IPI-504和ALK激酶抑制剂的组合在人NSCLC的异种移植模型中引起明显的肿瘤消退；4)所选择的对ALK激酶抑制剂有抗性的细胞仍保持对IPI-504的敏感性；和5)在患者中，ALK基因座中的重排与对作为单一药剂的IPI-504响应相关。因而，本发明提供了用HSP-90抑制剂作为单一药剂或在联合疗法中例如与ALK激酶抑制剂组合来治疗罹患NSCLC及ALK重排的患者的方法和组合物。
在另一个实施方案中，申请人已经发现，检测到单独K-Ras或与p53组合的突变存在，指示对HSP90抑制剂和mTOR抑制剂的联合疗法的响应性，但是不预示对HSP90抑制剂疗法作为单一药剂的响应性。
在又一个实施方案中，申请人已经发现，Hsp90抑制剂17-AG在KRAS和BRAF突变体CRC的体外和体内模型中均展示明显的功效。相反，大部分的KRAS和BRAF wt/wt模型对Hsp90抑制显示低敏感或不敏感。还观察到，Hsp90抑制剂17-AG和依立替康(CRC中的SOC)的组合展示出优于单独施用的任何一种药剂的功效。另外，来自突变体K-Ras/B-Raf和wt/wt模型的肿瘤的途径分析表明，MAPK途径活性是Hsp90敏感性的良好预测物。因而，HSP90抑制与SOC相当，并且HSP90i与SOC的组合可能是用于治疗CRC的更有效方法。
本发明的多个方面在以下子部分中进一步详细描述。
【I.定义】
如本文所用，以下每个术语具有与其在这个部分中相关的含义。
【化学定义】
下文详细描述特定官能团和化学术语的定义。为本发明的目的，化学元素根据元素周期表,CAS版,Handbook of Chemistry andPhysics,第75版,封内页确定，并且特定官能团通常如其中所述定义。另外，有机化学的一般原理以及特殊的功能部分和反应性描述在例如，Organic Chemistry,Thomas Sorrell,University Science Books,Sausalito,1999；Smith和March March′s Advanced OrganicChemistry，第5版,John Wiley & Sons,Inc.,New York,2001；Larock,Comprehensive Organic Transformations,VCH Publishers,Inc.,NewYork,1989；和Carruthers,Some Modern Methods of OrganicSynthesis,第3版,Cambridge University Press,Cambridge,1987。
本发明的某些化合物可以包含一个或多个非对称中心，并且因而可以以多种异构体形式即立体异构体(对映异构体、非对映异构体、顺-反异构体、E/Z异构体等)存在。因而，本发明的化合物及其药物组合物可以是单独对映异构体、非对映异构体或其他几何异构体的形式，或可以是立体异构体混合物的形式。对映异构体、非对映异构体和其他几何异构体可以通过本领域技术人员已知的任何方法从混合物(包括消旋混合物)中分离或通过非对称合成制备，所述分离方法包括手性高压液相色谱(HPLC)和手性盐的形成和结晶；见例如，Jacques等,Enantiomers,Racemates and Resolutions(Wiley Interscience,NewYork,1981)；Wilen,S.H.等,Tetrahedron 33:2725(1977)；Eliel,E.L.Stereochemistry of Carbon Compounds(McGraw-Hill,NY,1962)；Wilen,S.H.Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions第268页(E.L.Eliel编著,Univ.of Notre Dame Press,Notre Dame,IN 1972)。
除非另外说明，碳原子可以任选地被一个或多个取代基取代。取代基的数目一般受碳原子上可用价的数目限制，并且可以通过替换会在未取代基团上可用的一个或多个氢原子进行取代。合适的取代基是本领域已知的，并且包括但不限于烷基、链烯基、炔基、烷氧基、烷氧基、芳基、芳氧基、芳硫基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基、环烷基、杂环基、卤素、叠氮基、羟基、硫氢基、烷硫氧基(alkthiooxy)、氨基、硝基、腈基、亚氨基、酰胺基、羧酸、醛、羰基、酯、甲硅烷基、烷硫基、卤代烷基(例如，全氟代烷基如-CF3)、=O、=S等。
当列出值的范围时，意在包括该范围内的每个值和子范围。例如，含有1-6个碳原子的烷基(C1-6烷基)意在包括C1、C2、C3、C4、C5、C6、C1-6、C2-6、C3-6、C4-6、C5-6、C1-5、C2-5、C3-5、C4-5、C1-4、C2-4、C3-4、C1-3、C2-3和C1-2烷基。
如本文所用，术语“烷基”指含有1至30个碳原子的饱和、直链或支链烃基。在某些实施方案中，烷基含有1-20个碳原子。除非另外说明，烷基可以任选地被一个或多个取代基取代。在某些实施方案中，烷基含有1-10个碳原子。在某些实施方案中，烷基含有1-6个碳原子。在某些实施方案中，烷基含有1-5个碳原子。在某些实施方案中，烷基含有1-4个碳原子。在某些实施方案中，烷基含有1-3个碳原子。在某些实施方案中，烷基含有1-2个碳原子。在某些实施方案中，烷基含有1个碳原子。烷基的实例包括，但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、仲戊基、异戊基、叔丁基、正戊基、新戊基、正己基、仲己基、正庚基、正辛基、正癸基、正十一烷基、十二烷基等。
如本文所用，术语“链烯基”指通过移去单个氢原子具有至少一个碳-碳双键并且含有2至30个碳原子的直链或支链烃基。除非另外说明，链烯基可以任选地被一个或多个取代基取代。在某些实施方案中，链烯基含有2-20个碳原子。在某些实施方案中，链烯基含有2-10个碳原子。在某些实施方案中，链烯基含有2-6个碳原子。在某些实施方案中，链烯基含有2-5个碳原子。在某些实施方案中，链烯基含有2-4个碳原子。在某些实施方案中，链烯基含有2-3个碳原子。在某些实施方案中，链烯基含有2个碳原子。链烯基包括，例如乙烯基、丙烯基、丁烯基、1-甲基-2-丁烯-1-基等。
如本文所用，术语“炔基”指通过移去单个氢原子具有至少一个碳-碳叁键并且含有2至30个碳原子的直链或支链烃基。除非另外说明，炔基可以任选地被一个或多个取代基取代。在某些实施方案中，炔基含有2-20个碳原子。在某些实施方案中，炔基含有2-10个碳原子。在某些实施方案中，炔基含有2-6个碳原子。在某些实施方案中，炔基含有2-5个碳原子。在某些实施方案中，炔基含有2-4个碳原子。在某些实施方案中，炔基含有2-3个碳原子。在某些实施方案中，炔基含有2个碳原子。代表性炔基包括，但不限于乙炔基、2-丙炔基(炔丙基)、1-丙炔基等。
单独或作为较大部分的组成部分使用时，术语“环烷基”指具有3-15个碳环元的饱和单环或双环烃环体系。除非另外说明，环烷基可以任选地被一个或多个取代基取代。在某些实施方案中，环烷基含有3-10个碳环元。在某些实施方案中，环烷基含有3-9个碳环元。在某些实施方案中，环烷基含有3-8个碳环元。在某些实施方案中，环烷基含有3-7个碳环元。在某些实施方案中，环烷基含有3-6个碳环元。在某些实施方案中，环烷基含有3-5个碳环元。环烷基包括，而不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。术语“环烷基”还包括与一个或多个芳基或杂芳基环稠合的饱和烃环体系，如十氢萘基或四氢萘基，其中接合点位于饱和烃环上。
单独或作为较大部分的组成部分(如在“芳烷基”中)使用时，术语“芳基”指具有总计6-10个碳环元的芳族单环和双环烃环体系。除非另外说明，芳基可以任选地被一个或多个取代基取代。在本发明的某些实施方案中，“芳基”指包括但不限于苯基、联苯基、萘基、蒽基等的芳环体系，其可以携带一个或多个取代基。另外，当如在本文使用，还包括在术语“芳基”的范围内的是其中芳基环与一个或多个非芳族环如茚满基、酞内酰胺基或四氢萘基等稠合的基团，其中接合点位于芳基环上。
术语“芳烷基”指被如本文定义的芳基取代的如本文定义的烷基，其中接合点位于烷基上。
术语“杂原子”指硼、磷、硒、氮、氧或硫，并且包括氮或硫的任何氧化形式和非碱性氮的任何季铵化形式。
单独或作为较大部分的组成部分(例如“杂芳烷基”)使用时，术语“杂芳基”指具有5-10个环原子的芳族单环和双环烃环体系，其中除碳原子之外，所述环原子还包括1至5个杂原子。除非另外说明，杂芳基可以任选地被一个或多个取代基取代。当指称杂芳基的环原子使用时，术语“氮”包括取代的氮。杂芳基包括，而不限于噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、吲嗪基、嘌呤基、萘啶基和蝶啶基。如本文所用，术语“杂芳基”和“杂芳基-”也包括其中杂芳基环与一个或多个芳基环、环烷基环或杂环烷基环稠合的基团，其中接合点位于杂芳基环上。非限制性实例包括吲哚基、异吲哚基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、二苯并呋喃基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、喹啉基、异喹啉基、噌嗪基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、4H-喹嗪基、咔唑基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、四氢喹啉基和四氢异喹啉基。
术语“杂芳烷基”指被如本文定义的杂芳基取代的如本文定义的烷基，其中接合点位于烷基上。
如本文所用，术语“杂环烷基”或“杂环基‘指稳定的非芳族5-7元单环烃或稳定的非芳族7-10元双环烃，其是饱和的或部分不饱和的并且除碳原子之外还具有一个或多个杂原子。除非另外说明，杂环烷基或杂环基可以任选地被一个或多个取代基取代。当指称杂环烷基的环原子使用时，术语“氮”包括取代的氮。杂环烷基的接合点可以在产生稳定结构的其任意杂原子或碳环原子处。杂环烷基的实例包括，而不限于四氢呋喃基、四氢噻吩基、吡咯烷基、吡咯烷酮基、哌啶基、吡咯啉基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、噁唑烷基、哌嗪基、二噁烷基、二氧戊环基、二氮杂卓基(diazepinyl)、噁氮杂卓基(azepinyl)、硫氮杂卓基(thiazepinyl)、吗啉基和奎宁环基。“杂环烷基”也包括其中杂环烷基环与一个或多个芳基环、杂芳基环或环烷基环如二氢吲哚基、苯并二氢吡喃基(chromanyl)、菲啶基或四氢喹啉基稠合的基团，其中接合点位于杂环烷基环上。
如本文所用，术语“不饱和”意指具有一个或多个双键或叁键的部分。
如本文所用，术语“部分不饱和的”指包括至少一个双键或叁键的环部分。术语“部分不饱和的”意在包括具有多个不饱和位点的环，但是不意在包括如本文定义的芳族基团，如芳基部分或杂芳基部分。
如本文所用的术语“双自由基”指其中移去2个氢原子以形成二价部分的如本文所述的烷基、链烯基、炔基、芳基、环烷基、杂环烷基、芳烷基、杂芳基和杂芳烷基。双自由基一般地以后缀“-ene”结尾。例如，烷基双自由基称作亚烷基(例如：和–(CR'2)x-，其中R'是氢或其他取代基，并且x是1、2、3、4、5或6)；链烯基双自由基称作“亚链烯基”；炔基双自由基称作“亚炔基”；芳基和芳烷基双自由基分别称作“亚芳基”和“亚芳烷基”(例如：
Figure BDA00001882655700392
)；杂芳基和杂芳烷基双自由基分别称作“亚杂芳基”和“亚杂芳烷基”(例如：
Figure BDA00001882655700393
)；环烷基双自由基称作“亚环烷基”；杂环烷基双自由基称作“亚杂环烷基”等。
如本文所用的术语“卤”、“卤素”和“卤化物”指选自氟(氟代，F)、氯(氯代，Cl)、溴(溴代，Br)和碘(碘代，I)的原子。
如本文所用，术语“卤代烷基”指如本文所述的烷基，其中该烷基的一个或多个氢原子被一个或多个卤原子替换。在某些实施方案中，卤代烷基是使烷基的全部氢原子被卤素取代的全卤代烷基(例如，如全氟代烷基CF3)。
如本文所用，术语“叠氮基”指基团-N3。
如本文所用，术语“腈基”指基团-CN。
如本文所用，术语“硝基”指基团-NO2。
如本文所用，术语“羟基(hydroxyl)”或“羟基(hydroxy)”指基团-OH。
如本文所用，术语“巯基”或“硫氢基”指基团-SH。
如本文所用，术语“羧酸”指基团-CO2H。
如本文所用，术语“醛”指基团-CHO。
如本文所用，术语“烷氧基”指基团-OR'，其中R'是如本文定义的烷基、链烯基或炔基。
如本文所用，术语“芳氧基”指基团-OR'，其中R'是如本文定义的芳基或杂芳基。
如本文所用，术语“烷硫氧基”指基团-SR'，其中每个R'独立地是如本文定义的碳部分，例如烷基、链烯基或炔基。
如本文所用，术语“芳硫基”指基团-SR'，其中每个R'是如本文定义的芳基或杂芳基。
如本文所用，术语“氨基”指基团-NR'2，其中每个R'独立地是如本文定义的氢、碳部分，例如烷基、链烯基、炔基、芳基或杂芳基，或两个R'基团连同与它们结合的氮原子一起形成一个5-8元环。
如本文所用，术语“羰基”指基团-C(=O)R'，其中R'独立地是如本文定义的碳部分，例如烷基、链烯基、炔基、芳基或杂芳基。
如本文所用，术语“酯”指基团-C(=O)OR'或-OC(=O)R'，其中每个R'独立地是如本文定义的碳部分，例如烷基、链烯基、炔基、芳基或杂芳基。
如本文所用，术语“酰胺”或“酰胺基”指基团-C(=O)N(R')2或-NR'C(=O)R'，其中每个R'独立地是如本文定义的氢或碳部分，例如烷基、链烯基、炔基、芳基或杂芳基，或两个R'基团连同与它们结合的氮原子一起形成一个5-8元环。
术语“磺酰氨基”或“磺酰胺”指基团-N(R')SO2R'或-SO2N(R')2，其中每个R'独立地是如本文定义的氢或碳部分，例如烷基、链烯基、炔基、芳基或杂芳基，或两个R'基团连同与它们结合的氮原子一起形成一个5-8元环。
术语“磺氨基(sulfamido)”或“硫酰胺”指基团-NR'SO2N(R')2，其中每个R'独立地是如本文定义的氢或碳部分，例如烷基、链烯基、炔基、芳基或杂芳基，或两个R'基团连同与它们结合的氮原子一起形成一个5-8元环。
如本文所用，术语“酰亚胺”或“亚胺基”指基团-C(=NR')N(R′)2或-NR'C(=NR')R'，其中每个R'独立地是如本文定义的氢或碳部分，例如烷基、链烯基、炔基、芳基或杂芳基，或其中两个R'基团连同与它们结合的氮原子一起形成一个5-8元环。
如本文所用，“甲硅烷基”指基团-SiR'，其中R'是碳部分，例如烷基、链烯基、炔基、芳基或杂芳基。
在一些情况下，HSP90抑制剂可以含有一个或多个碱性官能团(例如，如氨基)并且因而能够与药学上可接受酸形成药学上可接受的盐。术语“药学上可接受的盐”在这些情况下指相对无毒的无机酸和有机酸加成盐，这些盐可以在施用媒介物或剂型制造过程中原位制备或通过用合适的酸单独处理游离碱形式的化合物制备。来自无机酸的药学上可接受无毒酸加成盐的实例包括，但不限于氢氯酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、硝酸和高氯酸，或者来自有机酸的药学上可接受无毒酸加成盐的实例包括，但不限于于乙酸、己二酸、海藻酸、抗坏血酸、天冬氨酸、2-乙酰氧基苯甲酸、苯磺酸、苯甲酸、二磺酸、硼酸、丁酸、樟脑酸、樟脑磺酸、柠檬酸、环丙基丙酸、二葡萄糖酸、十二烷基磺酸、乙磺酸、1,2-乙二磺酸、甲酸、延胡索酸、葡庚糖酸、甘油磷酸、葡萄糖酸、半磺酸、庚酸、己酸、氢碘酸、2-羟基乙磺酸、羟基马来酸、羟乙磺酸、乳糖酸、乳酸、月桂酸、十二烷基磺酸、苹果酸、马来酸、丙二酸、甲磺酸、2-萘磺酸、萘酸、烟酸、油酸、草酸、棕榈酸、帕莫酸、果胶质酸、过磺基酸、3-苯基丙酸、苦味酸、新戊酸、丙酸、苯乙酸、硬脂酸、琥珀酸、水杨酸、对氨基苯磺酸、酒石酸、硫氰酸、对甲苯磺酸、十一酸、戊酸加成盐等。在其他情况下，HSP90抑制剂可以含有一个或多个酸性官能团并且因而能够与药学上可接受碱形成药学上可接受的盐。术语“药学上可接受的盐”在这些情况下指相对无毒的无机碱和有机碱加成盐。这些盐可以同样在施用媒介物或剂型制造过程中原位制备或通过用合适的碱单独处理游离酸形式的化合物制备。合适的碱的实例包括，但不限于金属氢氧化物、金属碳酸盐或金属碳酸氢盐，其中所述金属是碱金属或碱土金属如锂、钠、钾、钙、镁或铝。合适的碱也可以包括氨或有机伯胺、仲胺或季胺。用于形成碱加成盐的代表性有机胺包括例如乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪等(见，例如，Berge等，上文)。
术语“溶剂化物”指本发明化合物，其具有化学计量或非化学计量数量的与该化合物缔合的溶剂。溶剂可以是水(即，水合物)，并且每个抑制剂分子可以与一个或多个水分子缔合(例如，一水合物、二水合物、三水合物等)。溶剂也可以醇(例如，甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇等)、乙二醇(例如，丙二醇)、醚(例如，二乙醚)、酯(例如，乙酸乙酯)或任何其他合适的溶剂。HSP90抑制剂也可以作为混合的溶剂化物存在(即，与两种或多种不同的溶剂缔合)。
如本文所用的术语“糖”指包含一个或多个吡喃糖环或呋喃糖环的天然或非天然单糖、二糖或寡糖。糖可以经醚键或经烷基键与本发明的固醇类生物碱共价结合。在某些实施方案中，糖部分可以在糖环的异头中心与本发明的固醇类生物碱共价结合。糖可以包括，但不限于核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖、阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、塔罗糖、葡萄糖和海藻糖。
【非化学定义】
如本文所用，冠词“一个(a)”和“一种(an)”在本文中用来指该冠词的一个或多于一个(例如，至少一个)的语法对象。
除非上下文清楚到指明，否则术语“或”在本文中用来意指术语“和/或”，并且与术语“和/或”互换使用。
“约”和“大约”应当通常意指，给定测量的性质或精度，所度量的量的可接受误差度。示例性误差度在给定值或值范围的百分之20(%)以内，一般10%以内并且更一般5%以内。
术语标记基因或基因产物的“改变”或“改变的结构”指与正常或野生型基因或蛋白质相比，标记基因或标记蛋白内部存在突变或多个突变，例如影响所述标记表达或活性的突变。例如，突变包括，但不限于染色间和染色体内重排、取代、缺失和插入突变。突变可以是存在于标记的编码区或非编码区中。
术语标记的“改变的量”或标记的“改变的水平”指与对照样本中的标记的表达水平或拷贝数相比，癌症样本中标记或染色体区增加或减少的拷贝数(如本文所述的基因突变和/或基因产物(例如，表1或表5中所述的标记)或选自以下的一个或多个基因突变和/或基因产物：ALK、RAS(例如，H-Ras、N-Ras或K-Ras中的一种或多种)、EGFR、PIK3CA、RAF(例如，A-Raf、B-Raf(BRAF)或C-Raf中的一种或多种)、PTEN、AKT、TP53(p53)、CTNNB1(β-连环蛋白)、APC、KIT、JAK2、NOTCH、FLT3、MEK、ERK、RSK、ETS、ELK-1或SAP-1)，和/或特定标记基因或多个基因的增加或减少的表达水平。术语标记的“改变的量”还包括与正常、对照样本中标记的蛋白质水平相比，样本，例如癌症样本中标记的增加或减少的蛋白质水平。
术语致瘤性改变(例如本文所述的ALK基因突变和/或基因产物(例如，表1或表5中所述的标记)或选自以下的一种或多种基因突变和/或基因产物：ALK、RAS(例如，H-Ras、N-Ras或K-Ras中的一种或多种)、EGFR、PIK3CA、RAF(例如，A-Raf、B-Raf(BRAF)或C-Raf中的一种或多种)、PTEN、AKT、TP53(p53)、CTNNB1(β-连环蛋白)、APC、KIT、JAK2、NOTCH、FLT3、MEK、ERK、RSK、ETS、ELK-1或SAP-1))的“改变表达水平”指试样(如源自癌症患者的样本)中标记的表达水平或拷贝数，其大于或小于用来评估表达或拷贝数的测定的标准误。在实施方案中，该改变可以是对照样本(例如，来自未罹患相关疾病的健康受试者的样本)中所述改变(例如，本文所述的基因突变和/或基因产物)的表达水平或拷贝数或几份对照样本中所述改变(例如，本文所述的基因突变和/或基因产物)的平均表达水平或拷贝数的至少两倍、至少三倍、至少四倍、至少五倍或至少十倍或更多倍。改变的表达水平大于或小于用来评估表达或拷贝数的测定的标准误。在实施方案中，该改变是对照样本(例如，来自未罹患相关疾病的健康受试者的样本)中所述改变(例如，本文所述的基因突变和/或基因产物)的表达水平或拷贝数或几份对照样本中所述改变(例如本文所述的基因突变和/或基因产物)的平均表达水平或拷贝数的至少两倍、至少三倍、至少四倍、至少五倍或至少十倍或更多倍。
术语标记的“改变的活性”指与正常、对照样本中该标记的活性相比，在疾病状态中例如在癌症样本中增加或减少的标记的活性。标记的改变的活性可以是以下情况的结果：例如标记的改变的表达、标记的改变的蛋白质水平、标记的改变的结构或例如改变的与其他蛋白质的相互作用，其中所述其他蛋白质涉及与所述标记相同或不同的途径。
如本文所述，“间变性淋巴瘤激酶”和“ALK”在本文中互换地使用，并且指源自任何来源(例如，啮齿类、人和其他哺乳动物)的天然间变性淋巴瘤激酶及其某些突变。在一些实施方案中，ALK蛋白由NCBI Ref Seq识别号NP 004295代表。除非另外指出，否则该术语指人蛋白质。编码ALK的基因在本文中也可以称作“ALK”。在一些实施方案中，ALK核苷酸序列由NCBI Ref Seq识别号号NM 004304.3和GenBank登录号29029631代表，其中相关序列(例如，编码序列、5'UTR、3'UTR、转录起始序列、翻译起始序列、转录终止序列、翻译终止序列等)可以由技术人员容易地鉴定。相反，“ALK突变”指预测对用如本文所述的HSP90抑制剂(例如，IPI-493和/或IPI-504)治疗正响应的的突变和突变体。所筛选的细胞遗传异常的代表性、非限制性实例包括EML4-ALK融合物、KIF5B-ALK融合物、TGF-ALK融合物、NPM-ALK融合物和ALK点突变，所述ALK点突变包括F1245I/L、L1204F、A1200V、L1196M、I1170S、T1151M、R1275Q、F1174V/C/L、T1087I和K1062M中的一种或多种。
“结合化合物”应当指能够与靶蛋白或分子特异性结合或与目的分析物形成稳定复合物(如蛋白质复合物)的结合组合物，如小分子、抗体、肽、肽配体或非肽配体、蛋白质、寡核苷酸、寡核苷酸类似物如肽核酸、凝集素或任何其他分子实体。
“结合部分”意指可以与分子标签直接或间接连接的能够与分析物特异性结合的任何分子。结合部分包括，但不限于抗体、抗体结合性组合物、肽、蛋白质、核酸和具有分子量高达约1000道尔顿并且含有选自氢、碳、氧、氮、硫和磷的原子的有机分子。
“生物标记”或“标记”是可以发生改变的基因、mRNA或蛋白质，其中所述改变与癌症相关。所述改变可以是与正常或健康组织或细胞(例如，对照)中其量、结构和/或活性相比，在癌组织或癌细胞中的量、结构和/或活性方面的改变，并且与疾病状态(如癌症)相关。例如，与正常、健康组织或细胞相比，与癌症相关或预示对抗癌疗法的响应性的本发明标记可以在癌组织或癌细胞中具有改变的核苷酸序列、氨基酸序列、染色体易位、染色体内倒位、拷贝数、表达水平、蛋白质水平、蛋白质活性或甲基化状态。另外，“标记”包括这样的分子，其中在与疾病状态(如癌症)相关的组织或细胞中存在时，所述分子的结构被改变例如突变(含有突变)，例如因取代、缺失或插入而例如在核苷酸或氨基酸水平与野生型序列不同。
术语“癌症”或“肿瘤”指存在下述细胞，所述细胞拥有典型致癌细胞的特征，如失控增殖、永生性、转移性潜能、快速的生长和增殖速率和某些特征性形态学特点。癌细胞经常采取肿瘤的形式，但是此类细胞可以单独存在于动物内部或可以是非致瘤性癌细胞，如白血病细胞。如本文所用，术语“癌症”包括恶变前癌症以及恶性癌症。癌症包括，但不限于B细胞癌，例如多发性骨髓瘤、
Figure BDA00001882655700451
巨球蛋白血症、重链疾病例如α链疾病、γ链疾病、mu链疾病、良性单克隆丙种球蛋白病、免疫细胞淀粉样变性、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌(如非小细胞肺癌或NSCLC)、支气管癌、结直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、脑或中枢神经系统癌、外周神经系统癌、食管癌、宫颈癌、子宫或子宫内膜癌、口腔或咽部癌、肝癌、肾癌、睾丸癌、胆道癌、小肠或阑尾癌、唾液腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤、血液组织的癌、腺癌、炎性肌成纤维细胞肿瘤、胃肠间质肿瘤(GIST)、结肠癌、多发性骨髓瘤(MM)、骨髓增生异常综合征(MDS)、骨髓增殖性疾病(MPD)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性粒细胞性白血病(AML)、慢性粒细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、真性红细胞增多症、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、Waldenstrom′巨球蛋白血症、重链疾病、软组织肉瘤、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、成骨性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、Ewing瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、stadenocarcinoma、髓样癌、支气管原癌、肾细胞癌、肝瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、Wilms瘤、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、成神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤、滤泡淋巴瘤、弥漫性大B细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、肝细胞癌、甲状腺癌、胃癌、头颈癌、小细胞癌、原发性血小板增多症、原因不明性髓样化生、高嗜酸粒细胞综合征、全身性肥大细胞增多症、家族性嗜伊红细胞增多症、慢性嗜酸性粒细胞白血病、神经内分泌癌、类癌肿瘤等。
“化疗剂”意指用来治疗病状、尤其癌症的化学物质，如细胞毒剂或细胞抑制剂。
如本文所用，“癌症”和“肿瘤”是同义术语。
如本文所用，“癌症疗法”和“癌症治疗”是同义术语。
如本文所用，“化学疗法”和“化疗”和“化疗剂”是同义术语。
“互补的”指两条核酸链的各个区域之间或同一条核酸链的两个区域之间的序列互补性的广义概念。已知，第一核酸区域的腺嘌呤残基能够与反平行于第一区域的第二核酸区域的残基形成特异性氢键(“碱基配对”)，如果后一个残基是胸腺嘧啶或尿嘧啶。类似地，已知第一核酸链的胞嘧啶残基能够与反平行于第一链的第二核酸链的残基碱基配对，如果后一个残基是鸟嘌呤。核酸的第一区域与相同或不同核酸的第二区域互补，如果这两个区域以反平行方式排列时，第一区域的至少一个核苷酸残基能够与第二区域的残基碱基配对。在某些实施方案中，第一区域包含第一部分并且第二区域包含第二部分，因而当第一部分和第二部分以反平行方式排列时，第一部分的至少约50%、至少约75%、至少约90%或至少约95%的核苷酸残基能够与第二部分中的核苷酸残基碱基配对。在其他实施方案中，第一部分的全部核苷酸残基能够与第二部分中的核苷酸残基碱基配对。
“基因的拷贝数”或“标记的拷贝数”指细胞中编码特定基因产物的DNA序列的数目。通常，对于给定基因，哺乳动物具有每个基因的两个拷贝。然而，拷贝数可以因基因扩增或重复而增加或因缺失而减少。
如果标记共价或非共价地与基材结合，从而该基材可以用流体(例如，标准柠檬酸盐盐水，pH 7.4)冲洗，而大部分标记不从基材解离，则该标记被“固定”至所述基材。
如本文所用，“危险比率”指用来产生相对风险的估计值的统计方法。“危险比率”是一个组对另一个组的预测危害之间的比率。例如，可以评估用HSP90抑制剂治疗的患者群体相对于不用HSP90抑制剂治疗的患者群体，HSP90抑制剂是否有效增加至疾病(尤其关于ALK突变状态)远端复发的时间。例如，相对于在癌组织中不具有如本文所述的ALK突变的受试者，治疗癌性组织中携带ALK突变的受试者导致来自HSP90抑制剂的治疗益处增加。
如本文所用，“热休克蛋白(Hsp)90”或“HSP90”包括具有约90千道尔顿质量的热休克蛋白家族的每个成员。例如，在人中，高度保守的Hsp90家族包括胞质Hsp90α和Hsp90β亚型，以及存在于内质网中的GRP94，和存在于线粒体基质中的HSP75/TRAP1。Hsp90在蛋白质稳态方面发挥综合作用并且通过它作为蛋白伴侣的作用，调节参与肿瘤发生、癌细胞增殖和存活的关键蛋白的稳定性(Kanelakis K.C.等(2003)Methods Enzymol.364:159-173；Hanahan D.等(2000)Cell.100(1):57-70)。Hsp90可以相对于野生型癌蛋白优先地伴送突变体形式，这进一步增加其作为治疗靶的吸引力(Nathan D.F.等(1995)MolCell Biol.15(7):3917-3925；Rutherford S.L.等(1998)Nature396(6709):336-342；Grbovic O.M.等(2006)Proc Natl Acad Sci U S A.103(1):57-62；Shimamura T.等(2005)Cancer Res.65(14):6401-6408)。
如本文所用，“HSP90抑制剂”或“HSP90抑制剂”指可以抑制HSP90生物活性的化合物。生物活性也可以包括如本申请中所述的患者响应。示例性HSP90抑制剂包括，但不限于IPI-493(InfinityPharm.)、IPI-504(Infinity Pharm.)、17-AAG(也称作坦螺旋霉素或CNF-1010；BMS)、BIIB-021(也称作CNF-2024，Biogen IDEC)、BIIB-028(Biogen IDEC)、AUY-922(也称作VER-49009，Novartis)、SNX-5422(Pfizer)、STA-9090,AT-13387(Astex)、XL-888(Exelixis)、MPC-3100(Myriad)、CU-0305(Curis)、17-DMAG、CNF-1010、大贝霉素(例如，大贝霉素I，大贝霉素II)、CCT-018159、CCT-129397、PU-H71(Memorial Sloan Kettering Cancer Center)、PF-04928473(SNX-2112)、TAE684和PF-02341066。其他HSP90抑制剂在Zhang,M-Q.等,J.Med.Chem 51(18):5494-5497(2008)和Menzella,H.等,J.Med.Chem.,52(6):15128-1521(2009)中公开，所述文献的内容通过引用方式并入本文。
如本文中可互换使用，术语“同源性”或“同一性”指两个多核苷酸序列之间或在两个多肽序列之间的序列相似性，而同一性是更严格的比较。短语“同一性或同源性百分数”和“同一性或同源性%”指比较两个或更多个多核苷酸序列或两个或更多个多肽序列时发现的序列相似性百分数。“序列相似性”指两个或更多个多核苷酸序列之间碱基对序列的相似性百分数(如由任何适合的方法所确定)。两个或更多个序列可以具有0-100%或二者之间任何整数值的相似性。可以通过比较每个序列中可以出于比较目的而比对的位置，确定同一性或相似性。当所比较序列中的一个位置被相同的核苷酸碱基或氨基酸占据时，则所述分子在这个位置是相同的。多核苷酸序列之间相似性或同一性的程度是在所述多核苷酸序列所共有的位置处相同或匹配核苷酸的数目的函数。多肽序列的同一性的程度是在所述多肽序列所共有的位置处相同氨基酸的数目的函数。多肽序列的同源性或相似性的程度是在所述多肽序列所共有的位置处氨基酸的数目的函数。如本文所用，术语“实质同源性”指至少50%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或更大的同源性。
如果减轻、终止、减缓或阻止癌症的至少一种症状，则“抑制”该癌症。如本文所用，如果减少、减慢、延迟或防止癌症的复发或转移，则也“抑制”该癌症。
如本文所用，“可能会”或“增加的可能性”指事项、对象、事情或人将出现的概率增加。因而，在一个实例中，相对于参考受试者或受试者组，可能对用单独或与mTOR抑制剂组合的HSP90抑制剂治疗响应的受试者具有增加的对用单独或与mTOR抑制剂组合的HSP90抑制剂治疗响应的概率。
如本文所用，“长”指大于正常、大于标准如预定量度的时间量度或较另一个子群量度相对长的子群量度。例如，相对于患者寿命，长时间进展指比正常时间进展更长的时间进展。可以根据本领域技术人员可用的任何方法确定某时间进展是否为长。长可能包括，例如无进展。
“标记核酸”是由本发明标记编码或与之相对应的核酸(例如，DNA、mRNA、cDNA)。例如，此类标记核酸分子包括DNA(例如，基因组DNA和cDNA)，其包含本文(例如，在表1或表5中)所述的任意核酸序列的完整或部分序列或这种序列的互补序列或杂交片段。标记核酸分子还包括RNA，其包含本文(例如，在表1或表5中)所述的任意核酸序列的完整或部分序列或这种序列的互补序列或杂交片段，其中全部胸苷残基替换为尿苷残基。“标记蛋白”是由本发明标记编码或与之相对应的蛋白质。标记蛋白包括由本文(例如，在表1或表5中)所述的任意序列编码的蛋白质的完整或部分序列或其片段。术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换地使用。
如本文所用，“MAPK途径基因”指经由促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)而直接和/或间接参与胞内信号转导的基因。在一些实施方案中，这种直接和/或间接参与可以包含MAPK上游和/或下游的基因。本领域熟知MAP激酶包括癌相关疾病机制的重要介质(Chen等,Chem Rev(2001)101:2449-76；Pearson等,Endocr Rev(2001)22:153-83；English等,Trends Pharmacol Sci(2002)23:40-45；Kohno等,Prog Cell Cycle Res(2003)5:219-24；和Sebolt-Leopold,Oncogene(2000)19:6594-99)。MAPK途径之一能够传输来自胞外信号(如表皮生长因子(EGF)和血管内皮衍生生长因子(VEGF))的信号，所述EGF和VEGF分别与细胞膜中的相应受体EGFR、HER和VEGFR结合，这使得信号经由中间激酶和激酶靶传递至细胞胞核上。在一个实施方案中，MAPK途径包含RAS、RAF、MEK和ERK(MAPK)(例如，Ras、Raf-1、A-Raf、B-Raf(BRAF)、MEK1和/或MEK2，它们在本文统称为MEK1/2以及ERK1和/或ERK2，它们在本文统称为ERK1/2)。在一些实施方案中，此类MAPK途径还包括MAPK靶基因，如Mnk1、Rsk、Ets、Elk-1和Sap-1(见例如，图19)。后一类蛋白质最终支配例如控制关键细胞功能如增殖、生长、运动性和存活的基因的表达。MAPK途径基因的核酸序列和蛋白质序列是技术人员熟知的，并且特定MAPK途径基因的基因登录号和蛋白质登录号的代表性、非限制性实例包括：Kras(NM_033360.2；NP_203524.1)、Hras(NM_176795.3；NP_789765.1)、Nras(NM_002524.3；NP_002515.1)、Braf(BC101757.1；AAI01758)、Craf(X03484.1；CAA27204.1)、Araf(X04790.1；CAA28476.1)、Nk1(NM_003684.4；NP_003675.2)、Rsk(NM_002953.3；NP_002944.2；NM_021135.4；NP_066958.2；NM_004586.2；NP_004577.1；NM_003942.2和NP_003933.1)、Ets(NM_005238.3；NP_005229.1)、Elk1(NM_005229.3；NP_005220.2)和Sap-1(NM_002351.3；NP_002342.1)。在一些实施方案中，如本文所述，MAPK途径基因也可以指野生型或天然基因中任一者或这两者，以及或可选地，它们的某些突变，并且从任何来源(例如，啮齿类、人和其他哺乳动物)衍生的某些突变。在一些实施方案中，MAPK途径基因产物指编码性MAPK途径基因的多肽和/或其片段。表5提供了MAPK途径基因和/或基因产物的非限制性名单。在一些实施方案中，MAPK途径基因和/或基因产物由NCBI Ref Seq识别号代表，从所述NCBI Ref Seq识别号中，相关序列(例如，编码序列、5'UTR、3'UTR、转录起始序列、翻译起始序列、转录终止序列、翻译终止序列、突变位点序列等)可以由技术人员容易地鉴定。在一些实施方案中，“MAPK途径基因和或基因产物”特别指预测对用单独或与如本文所述的mTOR抑制剂组合的Hsp90抑制剂(例如，本发明化合物)治疗正响应的突变和突变体。在本说明书通篇范围内并且在表5中提供此类突变的代表性、非限制性实例。
如本文所用的“mTOR抑制剂”指直接或间接靶向、降低或抑制mTOR激酶(雷帕霉素的哺乳动物靶标)活性/功能的物质。示例性mTOR抑制剂包括，但不限于靶向mTOR激酶家族成员的化合物、蛋白质或抗体，例如，选自雷帕霉素(sirolimus)、坦罗莫司
Figure BDA00001882655700511
依维莫司(RAD001、
Figure BDA00001882655700512
)、地磷莫司(ridaforolimus)、AP23573、AP23841、AZD8055、BEZ235、BGT226、XL765、PF-4691502、GDC0980、SF1126、OSI-027、GSK1059615、KU-0063794、WYE-354、INK128、坦罗莫司(CCI-779)、Palomid529(P529)、PF-04691502、PKI-587、ABT578、SAR543和子囊霉素(ascomycin)的一种或多种mTOR抑制剂。在一个实施方案中，mTOR抑制剂抑制TORC1和TORC2。TORC1和TORC2双重抑制剂的实例包括例如OSI-027、XL765、Palomid 529和INK128。
标记的“正常”拷贝数或标记的“正常”表达水平是在来自未罹患癌症的受试者(例如人)的生物样本(例如含有组织、全血、血清、血浆、颊部刮片、唾液、脑脊液、尿、粪便和骨髓的样本)中该标记的表达水平、拷贝数。
基因(例如，ALK或MAPK途径基因)突变和/或基因产物(例如，表1和表5中所述的标记)的“过表达”或“显著较高的表达水平或拷贝数”指试样中这样的表达水平或拷贝数，其大于用来评估表达或拷贝数的测定的标准误。在实施方案中，过表达可以是对照样本(例如，来自未罹患癌症的健康受试者的样本)中所述基因(例如，ALK或MAPK途径基因)突变和/或基因产物(例如，表1和表5中所述的标记)的表达水平或拷贝数或几份对照样本中所述基因(例如，ALK或MAPK途径基因)突变和/或基因产物(例如，表1和表5中所述的标记)的平均表达水平或拷贝数的至少二倍、至少三倍、至少四倍、或至少五倍或至少十倍或更多倍。
术语“探针”指能够与特别期望的靶分子(例如本发明的标记)选择性结合的任何分子。探针可以由本领域技术人员合成或源自适当的生物制备物。为检测靶分子，如本文所述，探针可以特别设计成被标记的。可以用做探针的分子的实例包括，但不限于RNA、DNA、蛋白质、抗体和有机单体。
“RECIST”应当意指代表“实体肿瘤响应评价标准”的首字母缩略词，并且是一组公开的规定，其定义治疗期间癌症患者何时改善(“响应”)、保持不变(“稳定的”)或恶化(“进展”)。如RECIST标准所定义的响应已经公开，例如，在Journal of the National Cancer Institute，第92卷，第3期，2000年2月2日，并且RECIST标准可以包括其他相似的公开定义和规则集。本领域技术人员将理解如本文所用的符合Recist标准的定义，如“PR”、“CR”、“SD”和”PD”。
如本文所用，“响应性”或对治疗“响应”和这个动词的其他形式，指受试者对用单独或组合例如与mTOR、ALK抑制剂或化疗剂组合的HSP90抑制剂治疗的反应。作为实例，如果受试者中的肿瘤生长迟滞约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多，则该受试者对用HSP90抑制剂的治疗响应。在另一个实例中，如通过任何适当量度例如以质量计或体积计确定，如果受试者中的肿瘤收缩约5%、10%、20%、30%、40%、50%或更多，则该受试者对用单独或组合的HSP90抑制剂的治疗响应。在另一个实例中，如果受试者经历的预期寿命比如果不施用治疗的预期寿命延长约5%、10%、20%、30%、40%、50%或更多，则该受试者对用单独或组合的HSP90抑制剂的治疗响应。在另一个实例中，如果受试者具有增加的无病生存期、总生存期或增加至进展的时间，则该受试者对用单独或组合的HSP90抑制剂的治疗响应。几种方法可以用来确定患者是否对包括如上所述的RECIST标准的治疗响应。
“样本”、“组织样本”、“患者样本”、“患者细胞或组织样本”或“试样”各自指从受试者或患者的组织获得的相似细胞的总称。组织样本的来源可以是实体组织，如来自新鲜、冷冻和/或保存的器官、组织样本、活检或抽吸物；血液或任何血液组分；体液如脑脊液、羊膜液、腹膜液或间质液；或来自受试者妊娠或发育任何时间的细胞。组织样本可以含有不与自然界中的组织天然相互混合的化合物，如防腐剂、抗凝剂、缓冲液、固定剂、养分、抗生素等。
如本文所用，“短”指短于正常、短于标准如预定量度的时间量度或较另一个子群量度相对短的子群量度。例如，相对于患者寿命，短时间进展指比正常时间进展更短的时间进展。可以根据本领域技术人员可用的任何方法确定某时间进展是否为短。
受试者中标记的量，例如基因(例如，ALK或MAPK途径基因)突变和/或基因产物(例如，表1和表5中所述或本文所述的一个或多个标记)的表达或拷贝数“显著地”高于或低于标记的正常量，如果该标记的量分别大于或小于正常水平一定量，所述量大于用来评估数量的测定的标准误，或是所述量的至少两倍、三倍、四倍、五倍、十倍或更多倍。可选地，如果受试者中标记的量分别高于或低于该标记的正常量至少约两倍、至少约三倍、至少约四倍或至少约五倍，则该标记的量可以被认为“显著地”高于或低于所述正常量。
如本文所用，“显著事件”应当指患者疾病中如本领域技术人员所确定为重要的事件。显著事件的实例包括，例如而不限于初步诊断、死亡、复发、确定患者的疾病是转移的、患者疾病复发或患者疾病从任意一个上述明显阶段进展至另一个明显阶段。如本领域技术人员所确定，显著事件可以是使用来评估OS、TTP和/或使用RECIST或其他响应标准的任何重要事件。
如本文所用，“时程”应当指初始事件和后续事件之间的时间量。例如，就患者的癌症而言，时程可以与患者的疾病有关并且可以通过计量疾病过程中的显著事件来度量，其中第一事件例如可以是诊断并且后续事件可以例如是转移。
“至进展的时间”或“TTP”指如从治疗开始至癌症进展或终检(censor)所计量的时间。终检可以因研究结束或因治疗的改变所致。至进展的时间也可以表述为概率例如，在Kaplein-Meier图中，其中至进展的时间可以代表在特定时间范围内无进展的概率，所述时间是治疗开始至癌症进展或终检之间的时间。
“转录的多核苷酸”是与成熟RNA的全部或一部分互补或同源的多核苷酸(例如，RNA、cDNA或RNA或cDNA之一的类似物)，其中通过本发明标记的转录和(如果存在)该转录物的正常转录后加工(例如，剪接)和该转录物的逆转录，产生所述成熟RNA。
基因(例如，ALK或MAPK途径基因)突变和/或基因产物(例如，表1或表5中所述的标记)的“不足表达”或“显著较低水平的表达或拷贝数”指试样中这样的表达水平或拷贝数，其大于用来评估表达或拷贝数的测定的标准误，例如是对照样本(例如，来自未罹患癌症的健康受试者的样本)中所述基因(例如，ALK或MAPK途径基因)突变和/或基因产物(例如，表1或表5中所述的标记)的表达水平或拷贝数或几份对照样本中所述基因(例如，ALK或MAPK途径基因)突变和/或基因产物(例如，表1或表5中所述的标记)的平均表达水平或拷贝数的至多1/2、至多1/3、至多1/4、至多1/5或至多1/10或更少。
“不可能会”指相对于参考而言事件、事项、对象、事情或人将出现的概率减小。因而，相对于参考受试者或受试者组，不可能对用HSP90抑制剂的治疗响应的受试者具有减小的对用HSP90抑制剂的治疗响应的概率。
本发明的多个方面在以下文进一步详细描述。在本说明书通篇范围描述另外的定义。
【II.本发明的方法】
分析ALK和MAPK途径基因和/或基因产物激活突变、拷贝数和/或表达水平和/或活性已经导致鉴定本文所述的单个生物标记和生物标记的组合，所述生物标记和生物标记的组合与单独或组合例如与mTOR抑制剂组合的HSP90抑制剂在治疗受试者中癌症方面的功效相关。例如，本发明提供了这样的方法，所述方法用于评价本文中所鉴定的ALK或MAPK途径基因和/或基因产物(例如，表1和表5中所述的标记)、选自以下的一个或多个基因突变和/或基因产物：ALK、RAS(例如，H-Ras、N-Ras或K-Ras中的一种或多种)、EGFR、PIK3CA、RAF(例如，A-Raf、B-Raf(BRAF)或C-Raf中的一种或多种)、PTEN、AKT、TP53(p53)、CTNNB1(β-连环蛋白)、APC、KIT、JAK2、NOTCH、FLT3、MEK、ERK、RSK、ETS、ELK-1或SAP-1))的突变(例如，染色体间和染色体内重排、取代、缺失、插入或添加突变)的拷贝数、表达水平、蛋白质水平、蛋白质活性、存在。
在一些实施方案中，本发明的方法可以用来监测受试者中癌症的进展，其中如果受试者中的样本在癌症进展期间例如在第一时间点和后续时间点在本文中公开的标记(例如，表1或表5中所列)的量例如表达和/或活性方面具有显著增加，则所述癌症更可能对用单独或组合的HSP90抑制剂的治疗响应，并且反之亦然。在又一个实施方案中，在第一时间点和后续时间点之间，受试者已经历过治疗，例如化疗、放射疗法、手术，或用于抑制癌症的任何其他治疗性方法，已经完成治疗，或处于消退状态。
【III.分离的核酸分子】
本发明的一个方面涉及与本发明的标记相对应的分离的核酸分子，包括编码与本发明的标记相对应的多肽或这种多肽的一部分的核酸。本发明的核酸分子包括位于本文所鉴定的基因组区域内的那些核酸分子。本发明的分离核酸分子还包括核酸分子，其足以用作杂交探针以鉴定与本发明的标记相对应的核酸分子，包括编码与本发明的标记相对应的多肽的核酸分子和此类核酸分子的片段，例如适于用作PCR引物以扩增核酸分子或使其突变的那些片段。如本文中所用，术语“核酸分子”旨在包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如，mRNA)和使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。核酸分子可以是单链的或双链的；在某些实施方案中核酸分子是双链DNA。
“分离的”核酸分子是与该核酸分子的天然来源中存在的其他核酸分子分离的核酸分子。在某些实施方案中，“分离”的核酸分子不含在衍生该核酸的生物的基因组DNA中天然分布于该核酸侧翼(即，位于该核酸的5'端和3'端处的序列)的序列(如蛋白质编码序列)。例如，在多种实施方案中，分离的核酸分子可以含有在衍生该核酸的细胞的基因组DNA中天然分布于该核酸分子侧翼的小于约5kb、小于约4kb、小于约3kb、小于约2kb、小于约1kb、小于约0.5kb或0.1kb的核苷酸序列。另外，“分离”的核酸分子(如cDNA分子)可以在通过重组技术产生时基本上不含其他细胞物质或培养基，或被化学合成时基本上不含化学前体或其它化学品。
语言“基本上不含其他细胞物质或培养基”包括这样的核酸分子制备物，其中所述分子与从中分离或重组产生该分子的细胞的细胞组分分离。因而，基本上不含细胞物质的核酸分子包括(以干重计)具有小于约30%、小于约20%、小于约10%或小于约5%其他细胞物质或培养基的核酸分子制备物。
本发明的核酸分子，例如本文所鉴定的ALK或MAPK激活基因突变和/或基因产物(例如，表1或表5中所述的标记)，可以使用标准分子生物学技术和本文所述数据库记录中的序列信息予以分离。使用此类核酸序列的全部或一部分，可以使用标准杂交和克隆技术分离本发明的核酸分子(例如，如Sambrook等编著,Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989中所述)。
可以使用cDNA、mRNA或基因组DNA作为模板和适当的寡核苷酸引物，根据标准PCR扩增技术扩增本发明的核酸分子。可以将如此扩增的核酸分子克隆到适当的载体中并且通过DNA序列分析进行表征。此外，可以通过标准合成技术，例如使用自动化DNA合成仪，制备与本发明核酸分子的全部或一部分相对应的寡核苷酸。
在另一个实施方案中，本发明的分离的核酸分子包括具有下述核苷酸序列的核酸分子，其中所述核苷酸序列互补于与本发明的标记相对应的核酸的核苷酸序列或互补于编码与本发明的标记相对应的蛋白质的核酸的核苷酸序列。与给定的核苷酸序列互补的核酸分子是这样的核酸分子，其与给定的核苷酸序列充分互补，从而它可以与给定的核苷酸序列杂交，因而形成稳定双链体。
另外，本发明的核酸分子可以包含核酸序列的仅一部分，其中全长核酸序列包含本发明的标记或编码与本发明的标记相对应的多肽。此类核酸分子可以例如用作探针或引物。所述探针/引物一般作为一种或多种基本上纯化的寡核苷酸使用。所述寡核苷酸一般包含在严格条件下与本发明核酸的连续核苷酸杂交的核苷酸序列，所述连续核苷酸数量为至少约7、至少约15、至少约25、至少约50、至少约75、至少约100、至少约125、至少约150、至少约175、至少约200、至少约250、至少约300、至少约350、至少约400、至少约500、至少约600、至少约700、至少约800、至少约900、至少约1kb、至少约2kb、至少约3kb、至少约4kb、至少约5kb、至少约6kb、至少约7kb、至少约8kb、至少约9kb、至少约10kb、至少约15kb、至少约20kb、至少约25kb、至少约30kb、至少约35kb、至少约40kb、至少约45kb、至少约50kb、至少约60kb、至少约70kb、至少约80kb、至少约90kb、至少约100kb、至少约200kb、至少约300kb、至少约400kb、至少约500kb、至少约600kb、至少约700kb、至少约800kb、至少约900kb、至少约1mb、至少约2mb、至少约3mb、至少约4mb、至少约5mb、至少约6mb、至少约7mb、至少约8mb、至少约9mb、至少约10mb或更多。
基于本发明的核酸分子的序列的探针可以用来检测与本发明的一个或多个标记相对应的转录物或基因组序列。该探针包含与其结合的标记基团，例如，放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。此类探针可以作为诊断试验试剂盒的一部分用于鉴定错误表达蛋白质的细胞或组织，如通过测量来自受试者的细胞样本中编码该蛋白质的核酸分子的水平，例如检测mRNA水平或确定编码该蛋白质的基因是否已经突变或缺失。
本发明还包括这样的核酸分子，它们基本上与本文所述的基因突变和/或基因产物，例如本文所鉴定的ALK或MAPK激活基因突变和/或基因产物(例如，表1或表5中所述的标记)同源，从而它们是至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%或更多。在其他实施方案中，本发明还包括这样的核酸分子，它们基本上与本文所述的基因突变和/或基因产物，例如本文所鉴定的ALK或MAPK激活性基因突变和/或基因产物(例如，表1或表5中所述的标记)同源，从而它们相差仅仅或至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1kb、至少2kb、至少3kb、至少4kb、至少5kb、至少6kb、至少7kb、至少8kb、至少9kb、至少10kb、至少15kb、至少20kb、至少25kb、至少30kb、至少35kb、至少40kb、至少45kb、至少50kb个核苷酸或其之间的任何范围。
术语“单核苷酸多态性”(SNP)指由单核苷酸占据的多态性位点，所述多态性位点是等位序列之间变异的位点。该位点通常前接并尾随等位基因的高度保守序列(例如，在群体的小于1/100或1/1000成员中变化的序列)。SNP通常因在多态性位点处一个核苷酸取代另一个核苷酸而产生。SNP也可以因相对于参考等位基因缺失核苷酸或插入核苷酸产生。一般，多态性位点由除参考碱基之外的碱基占据。例如，在参考等位基因在多态性位点含有碱基“T”(胸腺嘧啶)的情况下，改变的等位基因可以在所述多态性位点含有“C”(胞嘧啶)、“G”(鸟嘌呤)或“A”(腺嘌呤)。SNP'可以出现在编码蛋白质的核酸序列中，在这种情况下它们可以导致缺陷型或变体蛋白或遗传疾病。这种SNP可以改变基因的编码序列并且因此指定另一种氨基酸(“错义”SNP)或SNP可以引入终止密码子(“无义”SNP)。当SNP不改变蛋白质的氨基酸序列时，该SNP称作是“沉默的”。SNP也可以出现在核苷酸序列的非编码区中，这可以导致缺陷型蛋白质表达，例如作为可变剪接的结果，或它可以对该蛋白质的功能没有影响。
在另一个实施方案中，本发明的分离核酸分子的长度为至少7个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个、至少60个、至少65个、至少70个、至少75个、至少80个、至少85个、至少90个、至少95个、至少100个、至少125个、至少150个、至少175、至少200个、至少250个、至少300个、至少350个、至少400个、至少450个、至少550个、至少650个、至少700个、至少800个、至少900个、至少1000个、至少1200个、至少1400个、至少1600个、至少1800个、至少2000个、至少2200个、至少2400个、至少2600个、至少2800个、至少3000个、至少3500个、至少4000个、至少4500个或更多个核苷酸并且在严格条件下和与本发明的标记相对应的核酸分子或编码与本发明的标记相对应的蛋白质的核酸分子杂交。如本文中所用，术语“在严格条件下杂交”旨在描述杂交和洗涤的条件，在所述条件下彼此至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%或至少85%相同的核苷酸序列一般保持彼此结杂交。此类严格条件是本领域技术人员已知的并且可以在Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley & Sons,N.Y.(1989)的6.3.1-6.3.6部分中找到。严格杂交条件的另一个非限制性实例是在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中在约45℃杂交，随后是在0.2xSSC/0.1%SDS中在约50-65℃的一次或多次洗涤。
本发明还也包括分子信标核酸分子，其具有至少一个与本发明的核酸分子互补的区域，从而所述分子信标用于量化本发明核酸分子在样本中的存在。“分子信标”核酸是包含一对互补区域并具有荧光团及与之结合的荧光猝灭剂的核酸分子。荧光团和猝灭剂以这样的取向与核酸的不同部分结合，从而当所述互补区域彼此复性时，荧光团的荧光被猝灭剂猝灭。当核酸分子的互补区域彼此不复性时，荧光团的荧光较少程度地猝灭。分子信标核酸分子例如在美国专利号5,876,930中描述。
【IV.分离的蛋白质和抗体】
本发明的一方面涉及与本发明的各个标记相对应的分离的蛋白质及其生物学活性部分。在一个实施方案中，与标记相对应的天然多肽可以通过适宜的纯化方案，使用标准蛋白质纯化技术从细胞或组织来源分离。在另一个实施方案中，与本发明标记相对应的多肽由重组DNA技术产生。作为重组表达的替代，与本发明标记相对应的多肽可以使用标准肽合成技术化学地合成。
“分离的”或“纯化的”蛋白质或其生物活性部分基本上不含来自该蛋白质的细胞或组织来源中的细胞物质或其他杂质蛋白，或被化学合成时基本上不含化学前体或其它化学品。语言“基本上不含细胞物质”包括这样的蛋白质制备物，其中所述蛋白质与从中分离或重组产生该蛋白质的细胞的细胞组分分离。因而，基本上不含细胞物质的蛋白质包括具有小于约30%、小于约20%、小于约10%或小于或5%(以干重计)的异种蛋白质(本文中也称作“杂质蛋白”)的蛋白质制备物。当所述蛋白质或其生物学活性部分通过重组产生时，它可以基本上不含培养基，即培养基占蛋白质制备物体积的小于约20%、小于约10%或小于约5%。当所述蛋白质通过化学合成产生时，它可以基本上不含化学前体或其他化学品，即，它与参与合成该蛋白质的化学前体或其他化学品分离。因而，除目的多肽之外，此类蛋白质制备物具有小于约30%、小于约20%、小于约10%或小于或5%(以干重计)的化学前体或化合物。
与本发明标记相对应的多肽的生物学活性部分包括保护下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与本文所述的基因突变和/或基因产物例如本文所鉴定的ALK或MAPK激活性基因突变和/或基因产物(例如，表1或表5中所述的标记)相对应的本发明蛋白质的氨基酸序列充分相同或从其中衍生，所述多肽包含较全长蛋白质更少的氨基酸并且显示出相应全长蛋白质的至少一种活性。一般而言，生物活性部分包含具有相应蛋白质的至少一种活性的结构域或基序。本发明蛋白质的生物学活性部分可以是长度例如是10、25、50、100个或更多个氨基酸的多肽。另外，可以通过重组技术制备其中缺失该蛋白质其他区域的其他生物活性部分并且对其评价本发明多肽的天然形式的一种或多种功能活性。
在某些实施方案中，所述多肽具有由本文中公开的核酸分子编码的蛋白质的氨基酸序列。其他的有用蛋白质是与这些序列之一基本上相同(例如，至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%或更多)并且仍保持相应全长蛋白质的蛋白质功能活性，然而在氨基酸序列方面不同。
为确定两个氨基酸序列或两种核酸的同一性百分数，出于优化比较目的比对所述序列(例如，可以在第一个氨基酸序列或核酸序列中导入空位以与第二个氨基酸序列或核酸序列最佳比对)。随后比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当在第一序列中的位置由第二序列中在对应位置处的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在这个位置处是相同的。这两个序列之间的同一性百分数是所述序列共有的相同位置的函数(即，％同一性=相同位置的数/位置的总数(例如，重叠位置)×100)。在一个实施方案中，这两个序列具有相同的长度。
使用数学算法，可以完成两个序列之间同一性百分数的确定。用于比较两个序列的数学算法的另一个非限制性实例是Karlin和Altschul,(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268的算法，该算法如Karlin和Altschul,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877中那样修改。将这种算法合并至Altschul等,(1990)J.Mol.Biol.215:403-410的NBLAST和XBLAST程序中。BLAST核苷酸检索可以在采用NBLAST程序，评分=100、字长度=12的情况下执行以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序、评分=50、字长度=3进行BLAST蛋白质检索以获得与本发明蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了出于比较目的获得空位比对结果，可以使用空位BLAST，如Altschul等,(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402中所述。可选地，PSI-Blast可以用来执行检测分子之间远缘关系的迭代检索。当使用BLAST、空位BLAST和PSI-Blast程序时，可以使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。用来比较序列的数学算法的另一个非限制性实例是是Myers和Miller,(1988)Comput Appl Biosci，4:11-7的算法。此种算法合并至ALIGN程序(版本2.0)，所述的ALIGN程序是GCG序列比对软件包的一部分。当使用ALIGN程序以比较氨基酸序列时，可以使用PAM120加权残基表、空位长度罚分12和空位罚分4。用于鉴定局部序列相似性和比对的区域的又一种有用的算法是如Pearson和Lipman(1988)Proc Natl Acad Sci USA 85:2444-2448中所述的FASTA算法。当使用FASTA算法比较核苷酸序列或氨基酸序列时，可以例如使用PAM120加权残基表，同时k-tuple值为2。
可以使用与上文所述那些技术相似的技术，在容许或不容许空位的情况下确定两个序列之间的同一性百分数。在计算同一性百分数时，仅计数精确匹配。
与本发明标记相对应的分离多肽或其片段可以用作免疫原以使用制备多克隆及单克隆抗体的标准技术产生抗体。可以使用全长多肽或蛋白，或可选地，本发明提供用作免疫原的抗原性肽片段。本发明蛋白质的抗原性肽包含本发明多肽之一的氨基酸序列的至少8个(或至少10个、至少15个、至少20个或至少30个或更多个)氨基酸残基，并且包括蛋白质的表位，从而针对该肽产生的抗体与对应于该蛋白质的本发明标记形成特异性免疫复合物。由抗原性肽包含的示例性表位是位于该蛋白质表面上的区域，例如，亲水区域。疏水性序列分析、亲水性序列分析或相似分析可以用来鉴定亲水区域。
通过免疫合适(即，有免疫能力)的受试者如兔、羊、小鼠或其他哺乳动物或脊椎动物，免疫原一般用来制备抗体。适当的免疫原制剂可以含有例如重组表达或化学合成的多肽。该制剂还可以包含佐剂，如弗氏完全佐剂或不完全佐剂，或相似的免疫调节剂。
因此，本发明的另一方面涉及针对本发明多肽的抗体。如本文中可互换使用的术语“抗体”和“抗体物质”指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即，含有特异性结合抗原(如本发明多肽)的抗原结合位点的分子。与本发明的给定多肽特异性结合的分子是在样本（例如天然含有所述多肽）的生物样本中结合所述多肽但基本上不结合其他分子的分子。免疫球蛋白分子的免疫活性部分的实例包括可以通过用酶如胃蛋白酶处理抗体而产生的F(ab)和F(ab')2片段。本发明提供多克隆抗体和单克隆抗体。如本文所用，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指仅含有能够与特定表位发生免疫反应的一种抗原结合位点的一群抗体分子。
多克隆抗体可以如上文所述通过用本发明多肽作为免疫原免疫合适的受试者来制备。抗体生成细胞可以从受试者获得并且用来通过标准技术制备单克隆抗体，所述标准技术如最初由Kohler和Milstein(1975)Nature 256:495-497描述的杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(见Kozbor等,1983,Immunol.Today 4:72)、EBV-杂交瘤技术(见Cole等,第77-96页,引自Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,AlanR.Liss,Inc.,1985)或三源杂交瘤(trioma)技术。用于产生杂交瘤的技术是熟知的(通常见Current Protocols in Immunology,Coligan等编著,John Wiley & Sons,New York,1994)。通过对杂交瘤培养上清液筛选结合目的多肽的抗体，例如使用标准ELISA测定，检测到产生本发明单克隆抗体的杂交瘤细胞。
作为制备分泌单克隆抗体的杂交瘤的替代，可以用目的多肽筛选重组组合免疫球蛋白文库(例如，抗体噬菌体展示文库)而鉴定并分离单克隆抗体。用于产生和筛选噬菌体展示文库的试剂盒是市售的(例如，Pharmacia重组噬菌体抗体系统，目录号27-9400-01；和StratageneSurfZAP噬菌体展示试剂盒，目录号240612)。另外，特别可用于产生和筛选抗体展示文库的方法和试剂的实例可以在例如以下文献中找到：美国专利号5,223,409；PCT公开号WO 92/18619；PCT公开号WO 91/17271；PCT公开号WO 92/20791；PCT公开号WO 92/15679；PCT公开号WO 93/01288；PCT公开号WO 92/01047；PCT公开号WO 92/09690；PCT公开号WO 90/02809；Fuchs等(1991)Bio/Technology9:1370-1372；Hay等(1992)Hum.Antibod.Hybridomas3:81-85；Huse等(1989)Science 246:1275-1281；Griffiths等(1993)EMBO J.12:725-734。
另外，可以使用标准重组DNA技术制备包含人部分和非人部分的重组抗体如嵌合及人源化单克隆抗体。此类嵌合及人源化单克隆抗体可以通过本领域已知的重组DNA技术，例如使用在以下文献中描述的方法产生：PCT公开号WO 87/02671；欧洲专利申请184,187；欧洲专利申请171,496；欧洲专利申请173,494；PCT公开号WO86/01533；美国专利号4,816,567；欧洲专利申请125,023；Better等(1988)Science 240:1041-1043；Liu等,(1987)Proc Natl Acad Sci USA84:3439-3443；Liu等,(1987)J.Immunol.139:3521-3526；Sun等(1987)Proc Natl Acad Sci USA 84:214-218；Nishimura等(1987)Cancer Res.47:999-1005；Wood等(1985)Nature 314:446-449；和Shaw等(1988)J.Natl.Cancer Inst.80:1553-1559；Morrison(1985)Science229:1202-1207；Oi等(1986)Bio/techniques 4:214；美国专利5,225,539；Jones等(1986)Nature 321:552-525；Verhoeyan等(1988)Science239:1534；和Beidler等(1988)J.Immunol.141:4053-4060。
可以使用不能表达内源免疫球蛋白重链和轻链基因,但是可以表达人重链和轻链的转基因小鼠产生完全的人抗体。对于产生人抗体的这项技术的综述，见Lonberg和Huszar(1995)Int.Rev.Immunol.13:65-93)。用于产生人抗体和人单克隆抗体的这项技术及用于产生此类抗体的操作方案的详细讨论，见，例如，美国专利5,625,126；美国专利5,633,425；美国专利5,569,825；美国专利5,661,016；和美国专利5,545,806。此外，诸多公司如Abgenix,Inc.(Freemont,CA)可以签约以使用与上述相似的技术提供针对所选择抗原的人抗体。
针对与本发明标记相对应的多肽的抗体(例如，单克隆抗体)可以用来通过标准技术如亲和层析或免疫沉淀法分离所述多肽。另外，这种抗体可以用来检测(例如，细胞裂解物或细胞上清液中的)所述标记，目的是评价该标记的水平和表达模式。所述抗体也可以例如作为临床检验程序的部分，在诊断上用来监测组织或体液中(例如，含肿瘤细胞的体液中)的蛋白质水平以例如确定给定治疗方案的功效。可以通过将抗体偶联于可检测物质而有利于检测。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质和放射性物质。合适酶的实例包括，但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适辅基复合物的实例包括，但不限于链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适荧光物质的实例包括，但不限于伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素(dichlorotriazinylamine fluorescein)、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质的例子包括，但不限于鲁米诺；生物发光物质的实例包括，但不限于萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白；以及合适放射性物质的实例包括，但不限于125I、131I、35S或3H。
【V.试剂盒】
试剂盒是任何制造物(例如，包装物或容器)，其包含用于特异性检测本发明标记的至少一种试剂，例如，探针，将所述制造物作为实行本发明方法的单元推广、分销或销售。当本发明的组合物、试剂盒和方法用于实施本发明的方法时，可以选出本发明的本文所述基因突变和/或基因产物，例如本文所鉴定的ALK或MAPK激活性基因突变和/或基因产物(例如，表1或表5中所述的标记)，从而在至少约20%、至少约40%、至少约60%、至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约99%或100%罹患具有相应阶段、等级、组织学类型或良性/恶变前/恶性本质的癌症的受试者中获得积极的结果。在某些实施方案中，可以选择本发明的标记或标记组，从而对一般群体获得大于约10%的PPV(积极预示值)(例如，与大于99.5%的分析特异性耦合)。
当本文所述的多个基因突变和/或基因产物，例如，本文所鉴定的ALK或MAPK激活性基因突变和/或基因产物(例如，表1或表5中所述的标记)用在本发明的组合物、试剂盒和方法中时，可以在单一反应混合物(即，使用针对每个标记的试剂，如不同的荧光探针)中或在与本文所述的一个或多个基因突变和/或基因产物，例如本文所鉴定的ALK或MAPK激活性基因突变和/或基因产物(例如，表1或表5中所述的标记)相对应的各个反应混合物中，将每个标记的量、结构和/或活性或表达水平或拷贝数与相同类型的非癌样本中多个标记的每一者的正常量、结构和/或活性或表达水平或拷贝数比较。如果使用多个基因(例如，ALK基因)突变和/或基因产物(例如，1中所述或本文所述的标记)，则可以使用或鉴定到2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个独立标记。
本发明包括用于分析某样本(例如，归档的组织样本或从受试者获得的样本)中癌细胞的组合物、试剂盒和方法。这些组合物、试剂盒和方法基本上与上述那些组合物、试剂盒和方法相同，例外在于根据需要，使所述组合物、试剂盒和方法适于使用某些类型的样本。例如，当样本是石蜡包埋的归档人组织样本时，有必要调整化合物在本发明组合物中、在本发明试剂盒或所用方法中的比率。此类方法是本领域熟知的并且在普通技术人员能力范围内。
本发明因而包括用于评估癌细胞(例如，在样本如受试者样本中)的存在的试剂盒。该试剂盒可以包含一种或多种试剂，所述试剂能够鉴定本文所述的基因突变和/或基因产物，例如，本文所鉴定的ALK或MAPK激活性基因突变和/或基因产物(例如，表1或表5中所述的标记)，例如，与核酸或多肽特异性结合，其中所述核酸或多肽与本文所述的基因突变和/或基因产物，例如，本文所鉴定的ALK或MAPK激活性基因突变和/或基因产物(例如，表1或表5中所述的标记)相对应。用于结合与本发明标记相对应的多肽的合适试剂包括抗体、抗体衍生物、抗体片段等。用于结合核酸(例如，基因组DNA、mRNA、剪接的mRNA、cDNA等)的合适试剂包括包括互补核酸。例如，核酸试剂可以包括固定至基材的(标记或未标记的)寡核苷酸、不与基材结合的标记的寡核苷酸、成对的PCR引物、分子信标探针等。
本发明的试剂盒可以任选地包含用于实施本发明方法的另外组分。例如，该试剂盒可以包含适于使互补性核酸复性或适于使抗体结合与该抗体特异性结合的蛋白质的流体(例如，SSC缓冲液)、一个或多个样本区室、描述本发明方法性能的说明材料、正常细胞样本、癌细胞样本等。
本发明的试剂盒可以包含用于确定标记的蛋白质水平或蛋白质活性的试剂。在另一个实施方案中，本发明的试剂盒可以包含用于确定标记的甲基化状态的试剂，或可以包含用于确定标记的结构改变(例如，存在突变)的试剂。
【VI.预测医学】
本发明还涉及预测医学领域，其中出于预测目的，使用诊断测定、药物基因组学和临床试验监测，从而预防性地治疗个体。因此，本发明的一个方面涉及这样的测定，其用于确定与本发明的一个或多个标记相对应的的多肽或核酸的量、结构和/或活性，以便确定罹患癌症或存在癌症形成风险的个体是否将更可能对HSP90抑制剂介导的疗法响应。
因此，在一个方面，本发明涉及用于确定罹患癌症的受试者是否可能对用单独或组合的HSP90抑制剂的治疗响应的方法。在另一个方面，本发明涉及用于预测疾病时程的方法。在仍然另一个方面，该方法涉及用于预测疾病时程中显著事件概率的方法。在某些实施方案中，所述方法包括检测与对用如本文所述的单独或组合的HSP90抑制剂的治疗的响应性相关的生物标记或生物标记组合，并且确定该受试者是否可能对用单独或组合的HSP90抑制剂的治疗响应。
在一些实施方案中，该方法包括评价，例如对来自受试者(例如，已经诊断罹患或疑似罹患癌症的患者(例如，表现癌症的症状的患者))的生物学组织样本进行细胞遗传筛选以检测一个或多个ALK改变，例如ALK突变。被筛选的细胞遗传异常的代表性非限制性实例包括如本文所述的以下一种或多种：EML4-ALK融合物、KIF5B-ALK融合物、TGF-ALK融合物、NPM-ALK融合物、ALK基因拷贝数的变化和ALK点突变，所述ALK点突变包括F1245I/L、L1204F、A1200V、L1196M、I1170S、T1151M、R1275Q、F1174V/C/L、T1087I和K1062M中的一种或多种。
在其他实施方案中，该方法包括评价，例如对来自受试者(例如，已经诊断罹患或疑似罹患癌症的患者(例如，表现癌症的症状的患者))的生物学组织样本进行细胞遗传筛选以检测在RAS(例如，H-Ras、N-Ras或K-Ras中的一种或多种)、EGFR、PIK3CA、RAF(例如，A-Raf、B-Raf(BRAF)或C-Raf中的一种或多种)、PTEN、AKT、TP53(p53)、CTNNB1(β-连环蛋白)、APC、KIT、JAK2、NOTCH、FLT3、MEK、ERK、RSK、ETS、ELK-1或SAP-1中的一种或多种改变。基因突变的实例在例如，The Catalogue of Somatic Mutations in Cancer(癌中体细胞突变名录)(COSMIC)(http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/)中描述。
EGFR突变的实例在例如以下文献中描述：Couzin J.,(2004)Science305:1222-1223；Fukuoka,M.等,(2003)J.Clin.Oncol.21:2237-46；Lynch等,(2004)NEJM 350(21):2129-2139；Paez等(2004)Science304:1497-1500；Pao,W.等Proc Natl Acad Sci USA.(2004)101(36):13306-11；Gazdar A.F.等,Trends Mol Med.(2004)10(10):481-6；Huang S.F.等(2004)Clin Cancer Res.10(24):8195-203；Couzin J.Science(2004)305(5688):1222-3；Sordella R.等(2004)305(5687):1163-7；Kosaka T.等(2004)Cancer Res.64(24):8919-23；Marchetti A.等J Clin Oncol.(2005)23(4):857-65；Tokumo M.等(2005)Clin Cancer Res.11(3):1167-1173；Han S.W.等(2005)J Clin Oncol.23(11):2493-501；Mitsudomi T.等(2005)J Clin Oncol.23(11):2513-20；Shigematsu H.等J Natl Cancer Inst.97(5):339-46；Kim K.S.等,(2005)Clin Cancer Res.11(6):2244-51；Cappuzzo F.等(2005)J Natl CancerInst.97(9):643-55；Cortes-Funes H.等Ann Oncol.(2005)16(7):1081-6；Sasaki H.等(2005)Clin Cancer Res.11(8):2924-9；Chou T.Y.等,(2005)Clin Cancer Res.11(10):3750-7；Pao W.等(2005)PLoS Med.2(3):e73；Sasaki H.等(2005)Int J Cancer.118(1):180-4；Eberhard D.A.等(2005)J Clin Oncol.23(25):5900-9；Takano T.等(2005)J Clin Oncol.23(28):6829-37；Tsao M.S.等,(2005)N Engl J Med.353(2):133-44；Mu X.L.等(2005)Clin Cancer Res.11(12):4289-94；Sonobe M.等(2005)Br J Cancer.93(3):355-63；Taron M.等(2005)Clin Cancer Res.11(16):5878-85；Mukohara T.等,(2005)J Natl Cancer Inst.97(16):1185-94；Zhang X.T.等(2005)Oncol.16(8):1334-42。EGFR基因或基因产物中的示例性改变包括，但不限于EGFR外显子缺失(例如，EGFR外显子19缺失)和/或外显子突变(例如，L858R/T790MEGFR  突变)。其他示例性改变包括，但不限于EGFR_D770_N771>AGG；EGFR_D770_N771insG；EGFR_D770_N771insG；EGFR_D770_N771insN；EGFR_E709A；EGFR_E709G；EGFR_709H；EGFR_E709K；EGFR_E709V；EGFR_E746_A750del；EGFR_E746_A750del,T751A；EGFR_E746_A750del,V ins；EGFR_E746_T751del,I ins；EGFR_E746_T751del,S752A；EGFR_E746_T751del,S752D；EGFR_E746_T751 del,V ins；EGFR_G719A；EGFR_G719C；EGFR_G719S:EGFR_H773_V774insH；EGFR_H773_V774insNPH；EGFR_H773_V774insPH；EGFR_H773>NPY；EGFR_L747_E749del；EGFR_L747_E749del,A750P；EGFR_L747_S752del；EGFR_L747_S752del,P753S；EGFR_L747_S752del,Q ins；EGFR_L747_T750del,P ins；EGFR_L747_T751del；EGFR_L858R；EGFR_L861Q；EGFR_M766_A767insAI；EGFR_P772_H773insV；EGFR S752_1759del；EGFR_S768I；EGFR_T790M；EGFR_V769_D770insASV；EGFR_V769_D770insASV和GFR_V774_C775insHV。
Ras突变的实例，包括但不限于在K-Ras、H-Ras和/或N-Ras任一者中的一个或多个突变，包括例如在密码子12、13和/或61中的突变，包括但不限于G12A、G12N、G12R、G12C、G12S、G12V、G13N和Q61R。NRAS突变的实例在例如，Bacher U.等(2006)Blood107:3847-53；Banerji U.等(2008)Mol Cancer Ther.7:737-9中描述。KRAS突变的实例在例如Tang W.Y.等(1999)Br J Cancer81(2):237-41；Burmer G.C.等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86(7)：2403-7；Almoguera C.等(1988)Cell 53(4)：549-54；Tam I.Y.等(2006),Clin.Cancer Res.12(5)：1647-53；和Ratner,E.等(2010)Cancer Res70(16)：OF1-OF7中描述。KRAS基因中改变的非限制性实例选自KRAS_G12C、KRAS_G12R、KRAS_G12D、KRAS_G12A、KRAS_G12S、KRAS_G12V、KRAS_G13D、KRAS_G13S、KRAS_G13C、KRAS_G13V、KRAS_Q61H、KRAS_Q61R、KRAS_Q61P、KRAS_Q61L、KRAS_Q61K、KRAS_Q61E、KRAS_A59T和KRAS_G12F。
PIK3CA突变的实例在例如Samuels Y.等(2004)Science304(5670):554；Kurtis E.等(2004)Cancer Biology &Therapy3(8):772-775；Stemke-Hale K.等(2008)Cancer Res.68(15):6084-91中描述。
RAF(例如，A-Raf、B-Raf(BRAF)或C-Raf中的一个或多个)基因或基因产物中的突变实例包括，但不限于在B-Raf的密码子600中的突变。BRAF突变的实例在Davies H.等(2002)Nature417：949-954中描述例如。BRAF基因或基因产物中的示例性改变包括，但不限于BRAF_D594G、BRAF_D594V、BRAF_F468C、BRAF_F595L、BRAFG464E、BRAF_G464R、BRAF_G464V、BRAF_G466A、BRAF_G466E、BRAF_G466R、BRAF_G466V、BRAF_G469A、BRAF_G469E、BRAF_G469R、BRAF_G469R、BRAF_G469S、BRAF_G469V、BRAF_G596R、BRAF_K601E、BRAF_K601N、BRAF_L597Q、BRAF_L597R、BRAF_L597S、BRAF_L597V、BRAF_T599I、BRAF_V600E、BRAF_V600K、BRAF_V600L和BRAF_V600R。
PTEN突变的实例在例如Minaguchi T.等(2001)Clin Cancer Res.7(9):2636-42；Latta E.等(2002)Curr Opin Obstet Gynecol.14(1):59-65；Eng C.(2003)Hum Mutat.22(3):183-98；Konopka B.等(2002)CancerLett.178(1):43-51；Stemke-Hale K.等(2008)Cancer Res.68(15):6084-91中描述。
AKT突变的实例在例如Stemke-Hale K.等(2008)Cancer Res.68(15):6084-91；Davies M.A.等(2008)Br J Cancer 99(8):1265-8；Askham J.M.(2010)Oncogene 29(1):150-5；Shoji K.等(2009)Br JCancer 101(1):145-8中描述。
TP53突变的实例在例如Soussi T.(2007)Cancer Cell12(4):303-12；Cheung K.J.(2009)Br J Haematol.146(3):257-69；Pfeifer G.P.等(2009)Hum Genet.125(5-6):493-506；Petitjean A.等(2007)Oncogene 26(15):2157-65中描述。
CTNNB1(β-连环蛋白)突变的实例在例如Polakis P.等(2000)Genes Dev.14(15):1837-51；Miyaki M.等(1999)Cancer Res.59(18):4506-9；Tejpar S.等(1999)Oncogene 18(47):6615-20；Garcia-Rostan G.等(1999)Cancer Res.59(8):1811-5；Chan E.F.等(1999)Nat Genet.21(4):410-3；Legoix P.等(1999)Oncogene18(27):4044-6；Mirabelli-Primdahl L.等(1999)Cancer Res.59(14):3346-51中描述。
NOTCH突变的实例在例如Collins B.J.等(2004)Semin CancerBiol.14(5):357-64；Callahan R.等(2001)J Mammary Gland BiolNeoplasia.6(1):23-36；Mansour M.R.等(2006)Leukemia 20:537-539；de Celis J.F.等(1993)Proc Natl Acad Sci U S A.90(9):4037-41中描述。
FLT3突变的实例在例如Kiyoi H.等(2006)Methods Mol Med.125:189-97；Small D.(2006)Hematology Am Soc Hematol EducProgram.2006:178-84；Kiyoi H.等(2006)Int J Hematol.2006年5月；83(4):301-8；Schnittger S.等(2004)Acta Haematol.112(1-2):68-78中描述。
ERBB2突变的实例在例如美国专利申请公开号2008/0206248；Lee J.W.等(2006)Clin Cancer Res.12(1)：57-61；Lee J.W.等(2006)Cancer Lett.237(1)：89-94；Cancer Genome Atlas Research Network(2008)Nature 455(7216)：1061-8中描述。
HSP90AA1突变的实例在例如Cancer Genome Atlas ResearchNetwork(2008)Nature 455(7216)：1061-8；Parsons D.W.等(2008)Science 321：1807-12：
Figure BDA00001882655700721
T.等(2006)Science314：268-74中描述。
HSP90AB1突变的实例在例如Dalgliesh G.L.等(2010)Nature463；360-3；Parsons D.W.等(2008)Science321；1807-12；
Figure BDA00001882655700722
T.等(2006)Science 314；268-74中描述。
NF1突变的实例在例如Thomson S.A.等(2002)J Child Neurel.17(8)：555-61；Bottillo I.等(2009)J Pathol.217(5)：693-701；Kluwe L.等(2003)J Med Genet.40(5)：368-71中描述。
STK11突变的实例在例如Resta N.等(1998)Cancer Res.58(21)：4799-801；Nishioka Y.等(1999)Jpn J Cancer Res.90(6)：629-32；Marignani P.A.(2005)J Clin Pathol.58(1)：15-9；Katajisto P.等(2007)Biochim Biophys Acta.1775(1)：63-75中描述。
使用本领域已知的本发明方法，可以评价或治疗本领域已知的任何致瘤性改变。
筛选方法的结果及其解释预示患者对用单独或组合的HSP90抑制剂(例如，IPI-493和/或IPI-504)的治疗响应。根据本发明，基因或基因产物中的一种或多种致瘤性改变(例如，ALK和/或MAPK途径突变)的存在表明，用单独或组合的HSP90抑制剂(例如，IPI-493和/或IPI-504)的治疗将相对于没有所述突变的患者的那些癌细胞，针对具有所述突变的癌细胞提供增强的治疗益处。
如本文进一步讨论，本领域熟知的多种方法和技术可以用于筛选分析，包括借助标准核型方法的分裂中期细胞遗传分析、FISH、光谱核型分析或MFISH和对比基因组杂交法。
在一个实施方案中，本发明的方法包括：使从细胞(其从患者分离)获得的DNA样本(例如，基因组DNA样本，如染色体样本)与对与细胞遗传异常(例如，本文所述的突变)相关的染色体区域中的基因组DNA特异并且在严格条件下与其杂交的多核苷酸探针接触，以确定一种或多种异常在患者的细胞中存在或不存在。分析的结果预示患者可能对用单独或与mTOR抑制剂组合的治疗剂，尤其抑制HSP90的药剂(例如，IPI-493和/或IPI-504)的治疗响应。
在又一个实施方案中，在预定间隔例如第一时间点和至少在后续时间点评估一种或多种改变，例如，在ALK或MAPK途径(例如，K-Ras)中的改变。在一个实施方案中，通过确定患者疾病过程中显著事件之间的时间而测量时程，其中所述测量预示患者是否具有长时程。在另一个实施方案中，显著事件是从初步诊断进展至死亡。在另一个实施方案中，显著事件是从初步诊断进展至转移性疾病。在另一个实施方案中，显著事件是从初步诊断进展至复发。在另一个实施方案中，显著事件是从转移性疾病进展至死亡。在另一个实施方案中，显著事件是从转移性疾病进展至复发。在另一个实施方案中，显著事件是从复发进展至死亡。在某些实施方案中，相对于总存活率、至进展时间和/或使用RECIST中的一种或多种或其他响应标准，测量时程。
在某些实施方案中，通过将患者样本分成至少两个患者亚组，产生预定的量度或值。在某些实施方案中，亚组的数目是两个，从而将患者样本分成具有一种或多种致瘤性异常(例如，ALK或MAPK途径(例如，K-Ras)突变)的患者亚组，和没有致瘤性异常的亚组。在某些实施方案中，将受试者中的ALK突变或MAPK途径(例如，K-Ras)状态与具有或没有ALK或MAPK途径(例如，K-Ras)突变的亚组比较；如果患者具有ALK或MAPK途径(例如，K-Ras)中的突变，则该患者可能对单独或组合的HSP90抑制剂(例如，IPI-493和/或IPI-504)响应，和/或该患者具有增加的长时程可能性或可能具有长时程。在某些实施方案中，由于与特定致瘤性异常，例如ALK或MAPK途径(例如，K-Ras)突变相关，亚组的数目大于二，包括而不限于三个亚组、四个亚组、五个亚组和六个亚组，这取决于预测的HSP90抑制剂功效的分级。在某些实施方案中，相对于总存活率、至进展时间和/或使用Recist标准，测量响应的可能性。
在其他实施方案中，该方法还包括以下一项或多项：确定罹患癌症或肿瘤(其具有本文所述的改变，例如ALK或MAPK途径中的改变(例如，K-Ras))的受试者是否可能对用单独或组合的HSP90抑制剂(例如，IPI-493和/或IPI-504)的治疗响应；确定治疗方案(例如，改变治疗过程、给药、治疗方案或时程、联合疗法)。该方法可以用来预测所述癌症在受试者中的时程。在其他实施方案中，该方法用来预测癌症受试者中显著事件的概率。
【1.用于检测基因突变的方法】
评价基因、突变和/或基因产物(例如，在表1、表5中所述或本文中公开的一个或多个标记)的方法是本领域技术人员熟知的，包括基于杂交的测定。例如，一种用于评价样本中编码核酸的拷贝数的方法包括DNA印迹法。在DNA印迹法中，基因组DNA(一般地，经片段化并且在电泳凝胶上分离)与对靶区域特异的探针杂交。比较来自针对靶区域的探针的杂交信号与来自正常基因组DNA(例如，相同或相关细胞、组织、器官等的非扩增部分)分析中的对照探针信号的强度，这提供对靶核酸存在/不存在和相对拷贝数的估计。可选地，RNA印迹法可以用于评价样本中编码核酸的拷贝数。在RNA印迹法中，mRNA与对靶区域特异的探针杂交。比较来自针对靶区域的探针的杂交信号与来自正常mRNA(例如，相同或相关细胞、组织、器官等的非扩增部分)分析中的对照探针信号的强度，这提供对靶核酸存在/不存在和相对拷贝数的估计。
用于确定拷贝数的替代手段是原位杂交法(例如，Angerer(1987)metH.Enzymol 152：649)。通常，原位杂交法包含以下步骤：(1)固定待分析的组织或生物结构；(2)预杂交处理所述生物结构以增加靶DNA的可及性并且减少非特异性结合；(3)将核酸混合物与生物结构或组织中的核酸杂交；(4)杂交后洗涤以除去杂交时不结合的核酸片段；和(5)检测杂交的核酸片段。在这些步骤的每一个步骤中所用的试剂和使用的条件根据具体的应用变动。
示例性的基于杂交的测定包括，但不限于传统的“直接探针”法如DNA印迹或原位杂交(例如，FISH和FISH加SKY)，和“对比探针”法如对比基因组杂交(CGH)，例如基于cDNA的或基于寡核苷酸的CGH。这些方法可以在多种模式下使用，包括，但不限于基材(例如，膜或玻璃)结合法或基于阵列的方法。
在一个方面，使用FISH分析。根据本领域熟知的方法从患者获得细胞样本，目的在于通过本领域已知的适当的细胞遗传检验方法例如FISH方法进行检验。在一个实施方案中，FISH可以根据VysisTM系统(Abbott Molecular)进行，该系统的制造商操作方案通过引用方式并入本文。
使用含有下述DNA区段的探针，所述DNA区段基本上与染色体的不同部分中存在的DNA碱基序列互补。根据本发明有用的探针的实例和探针的标记及其与样本的杂交在两个美国专利：授予Vysis,Inc.的美国专利号5,491,224和授予Bittner,等的美国专利号6,277,569中描述。
染色体探针长度一般地是约50至约105个核苷酸。较长的探针一般地包含长度约100至约500个核苷酸的较小片段。与着丝粒DNA和基因座特异性DNA杂交的探针是市售的，例如来自Vysis,Inc.(Downers Grove,Ill.)、Molecular Probes,Inc.(Eugene,Oreg.)或来自Cytocell(Oxfordshire,UK)。可选地，探针可以通过标准技术从染色体或基因组DNA非商业地制得。例如，可以使用的DNA源包括基因组DNA、克隆的DNA序列、含有一条染色体染色体(例如，人染色体)或一条染色体的部分连同宿主正常染色体互补物的体细胞细胞杂合体和通过流式细胞术或显微切割术纯化的染色体。目的区域可以通过克隆或通过借助聚合酶链反应(PCR)的位点特异性扩增来分离。见例如，Nath和Johnson,Biotechnic Histochem.,1998,73(1):6-22,Wheeless等,Cytometry 1994,17:319-326和美国专利号5,491,224.
待使用的探针与染色体的特定区域杂交以确定细胞遗传异常是否存在于该区域中。一种类型的细胞遗传异常是缺失。虽然缺失可以是一条或多条完整染色体缺失，但是缺失通常包括丢失一条或多条染色体的部分。如果染色体中包含于探针内的完整区域从细胞缺失，则该探针与来自所述细胞的DNA的杂交通常将不会发生并且该染色体上无信号存在。如果染色体中部分包含于探针内部的的区域从细胞缺失，则该探针与来自所述细胞的DNA的杂交仍可能发生，但是可能出现较少的信号。例如，将信号的丢失与探针杂交于来自对照细胞的DNA的结果比较，其中所述对照细胞不含有该探针意图检测的遗传异常。在一些实施方案中，对于细胞遗传异常的存在，列举至少1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200个或更多个细胞。
待检测的细胞遗传异常可以包括，但不限于非相互易位、染色体内倒位、点突变、缺失、基因拷贝数的变化、基因表达水平变化和种系突变。具体而言，一种类型的细胞遗传异常是重复。重复可以是完整染色体的重复，或小于完整染色体的区域的重复。如果染色体中包含于探针内的区域在细胞中重复，则与对照细胞中存在的信号数目相比，该探针与来自所述细胞的DNA的杂交通常产生至少一个另外信号，在所述对照细胞中，没有染色体区域的异常包含于所述探针中。不过，可以使用检测人染色体2p23或其直向同源物的任何探针或包含与2p23的ALK基因或其直向同源物易位的任何染色体区域。合适探针是本领域熟知的(例如，从Vysis,Inc.(Downers Grove,Ill.可获得)。
将染色体探针标记，从而可以检测到与它们杂交的染色体区域。探针一般地用荧光团(一种在吸收较低波长/较高能量的光后发射荧光的有机分子)直接标记。荧光团允许探针在没有第二检测分子的情况下可视化。在将荧光团共价连接至核苷酸后，该核苷酸可以采用标准技术如缺刻平移法、随机引发法和PCR标记法直接掺入探针中。可选地，可以将探针内部的脱氧胞苷核苷酸用接头转氨基。荧光团随后与转氨基的脱氧胞苷核苷酸共价连接。见美国专利号5,491,224。
美国专利号5,491,224将探针标记法描述为众多胞嘧啶残基使荧光标记物与其共价结合。荧光标记的胞嘧啶碱基的数目足以产生可检测的荧光信号，同时如此标记的DNA区段基本上保持它们针对待检测染色体或染色体区域的特异性互补结合(杂交)的特性。通过下述方式产生此类探针：取得未标记的DNA探针区段，用连接基团将该区段中的众多脱氧胞嘧啶核苷酸转氨基，将荧光标记物与至少一部分转氨基的脱氧胞苷核苷酸共价结合。
探针也可以由缺刻平移法、随机引物标记法或PCR标记法标记。使用荧光(直接)标记的或半抗原(间接)标记的核苷酸进行标记。标记物的代表性非限制性实例包括：AMCA-6-dUTP、瀑布蓝-4-dUTP、荧光素-12-dUTP、罗丹明-6-dUTP、得克萨斯红-6-dUTP、Cy3-6-dUTP、Cy5-dUTP、生物素(BIO)-11-dUTP、洋地黄毒苷(DIG)-11-dUTP或二硝苯基(DNP)-11-dUTP。
探针也可以用生物素或洋地黄毒苷间接标记，或用放射性同位素如32p和3H标记，不过随后需要第二检测分子或进一步加工以可视化该探针。例如，用生物素标记的探针可以用与可检测标记缀合的抗生物素蛋白检测到。例如，抗生物素蛋白可以与酶标记如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶缀合。可以使用该酶的底物和/或催化剂，在标准比色反应中检测酶标记。碱性磷酸酶的催化剂包括5-溴-4-氯-3吲哚基磷酸酯和硝基蓝四氮唑。二氨基苯甲酸酯可以用作辣根过氧化物酶的催化剂。
也可以制备探针，从而荧光标记物或其他标记物在杂交之前或期间不是DNA的部分，并且在杂交后添加以检测与染色体杂交的探针。例如，可以使用具有掺入DNA中的抗原性分子的探针。在杂交后，使用与这些抗原性分子反应的特异性抗体性检测所述抗原性分子。此类抗体本身可以掺入荧光染料，或可以使用具有结合的荧光染料的第二抗体予以检测。
然而由于处理或修饰，故在杂交中使用之前，通常将探针DNA纯化以除去未反应的残余产物(例如，未掺入DNA中的荧光染料分子)。
在杂交之前，根据本领域熟知的方法将染色体探针变性。通常，杂交步骤包括：添加过量的封闭DNA至标记的探针组合物，使封闭的探针组合物在杂交条件下与待检测的染色体区域例如在其中DNA已经变性的载片上接触，洗去未杂交的探针，并且检测该探针组合物与染色体或染色体区域的结合。
在杂交条件下使探针与染色体DNA杂交或复性。“杂交条件”是促进探针和靶染色体DNA之间复性的条件。由于不同探针的复性将根据探针长度、碱基含量等变动，因此，通过变动探针浓度、杂交温度、盐浓度和本领域熟知的其他因素促进复性。
通过改变探针的浓度、碱基组成、复杂度和长度以及孵育的盐浓度、温度和时长来促进杂交条件。例如，原位杂交一般在含有1-2xSSC、50-65%甲酰胺和封闭DNA的杂交缓冲液中进行以抑制非特异性杂交。通常，如上文所述的杂交条件包括约25℃至约55℃的温度和约0.5小时至约96小时的孵育时长。
可以通过一系列洗涤去除染色体探针与靶区域外部的DNA的非特异性结合。改变每次洗涤的温度和盐浓度以控制洗涤的严格性。例如，对于高严格性条件，可以使用0.2x至约2x SSC和约0.1%至约1%非离子去垢剂如Nonidet P-40(NP40)，在约65℃至约80℃下进行洗涤。可以通过减低洗涤温度或通过增加洗液中盐的浓度来降低严格性。在一些应用中，需要封闭重复序列的杂交能力。因而，在一些实施方案中，tRNA、人基因组DNA或Cot-I DNA用来封闭非特异性杂交。
在洗涤后，使载片沥干并晾干，随后将封装介质、复染剂如DAPI和盖片施加至载片。可以立即查看载片或在检验之前贮存在-20℃下。
对于荧光原位杂交(FISH)技术中所用的荧光探针，可以用配备有针对每种荧光团的适当滤光镜的荧光显微镜或通过使用观察多种荧光团的双重或三重带通滤光镜组查看荧光。见例如，美国专利号5,776,688。可选地，技术如流式细胞术可以用来检查染色体探针的杂交模式。FISH可以用来检测染色体区域的染色体拷贝数或重排。这些探针与互补DNA杂交或结合，并且因为它们用荧光标签标记，故而允许研究者使用荧光显微镜看到那些DNA序列的位置。不同于用来研究染色体的需要细胞应当活跃分裂的大部分其他技术，也可以对非分裂的细胞进行FISH，从而使FISH成为高度通用的方法。因此，可以使用间期细胞或处于细胞分裂循环的分裂中期的细胞进行FISH。在美国专利号5,447,841中由Gray和Pinkel描述了涉及FISH分析的多项技术。
FISH结果可以参考对照细胞进行解释，其中所述对照细胞已知不含有设计探针以检测的特定细胞遗传异常。将探针同来自对照细胞的DNA的FISH杂交模式与相同探针同来自正在检验或测定其特定细胞遗传异常的细胞的DNA的杂交比较。当探针设计成检测染色体或染色体区域的缺失时，探针与来自正在检验的细胞中的DNA的杂交通常少于与来自对照细胞中的DNA的杂交。通常，在所检验的细胞中不存在探针信号，这表明染色体中该探针正常与之杂交的区域丢失。当探针设计成检测染色体重复或添加时，探针与来自正在检验的细胞中的DNA的杂交通常多于与来自对照细胞中的DNA的杂交。通常，在所检验的细胞中存在探针信号的增加，这表明存在该探针正常与之杂交的另外染色体区域。
在CGH方法中，第一核酸收集物(例如，来自样本，例如可能的肿瘤)用第一标记物标记，而第二核酸收集物(例如，对照，例如来自健康细胞/组织)用第二标记物标记。核酸的杂交比率由结合至阵列中每根纤维(fiber)的两种(第一和第二)标记物的比率确定。在存在染色体缺失或倍增的情况下，将检测到来自这两种标记物的信号的比率的差异，并且所述比率将提供拷贝数的量度。基于阵列的CGH也可以用单色标记进行(如相对于用两种不同染料标记对照和可能的肿瘤样本并且将它们在杂交之前混合，这产生归因于阵列上探针竞争性杂交的比率)。在单色CGH中，将对照标记并且与一个阵列杂交并读取绝对信号，并且，将可能的肿瘤样本标记并且与第二阵列(具有相同内容物)杂交并读取绝对信号。拷贝数差异基于来自这两个阵列的绝对信号而计算。适于本发明方法使用的杂交方案例如在Albertson(1984)EMBO J.3：1227-1234；Pinkel(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：9138-9142；EPO Pub.No.430,402；Methods in Molecular Biology，第33卷：In situ Hybridization Protocols,Choo编著,Humana Press,Totowa,N.J.(1994)等中描述。在一个实施方案中，使用Pinkel等(1998)Nature Genetics 20：207-211或Kallioniemi(1992)Proc Natl Acad SciUSA 89:5321-5325(1992)的杂交方案。基于阵列的CGH在美国专利号6,455,258中描述，所述每一篇文献的内容通过引用方式并入本文。
在又一个实施方案中，基于扩增的测定可以用来度量存在/不存在和拷贝数。在此类基于扩增的测定中，核酸序列充当扩增反应(例如，聚合酶链反应(PCR))中的模板。在定量扩增中，扩增产物的量将与原始样本中模板的量成比例。与适当对照例如健康组织的比较提供了拷贝数的量度。
“定量”扩增的方法是本领域技术人员熟知的。例如，定量PCR包括使用相同的引物同时共扩增已知量的对照序列。这提供了可以用来校准所述PCR反应的内部标准。定量PCR的详细方案在Innis等(1990)PCR Protocols,A Guide to Methods and Applications,AcademicPress,Inc.N.Y.)中提供。在Ginzonger等(2000)Cancer Research60:5405-5409中描述了使用定量PCR分析测量微卫星基因座处的DNA拷贝数。基因的已知核酸序列足以使本领域技术人员能够常规地选择引物以扩增基因的任何部分。荧光定量PCR也可以用于本发明的方法中。在荧光定量PCR中，定量基于荧光信号(例如TaqMan和sybr绿)的量。
其他合适的扩增方法包括，但不限于连接酶链反应(LCR)(见Wu和Wallace(1989)Genomics 4：560,Landegren等(1988)Science241:1077和Barringer等(1990)Gene 89：117)、转录扩增法(Kwoh等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173)、自动维持序列复制(Guatelli等(1990)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 87：1874)、斑点PCR(dotPCR)和连接接头PCR（linker adapter PCR）等。
杂合性丧失(LOH)作图法(Wang,Z.C.等(2004)Cancer Res64(1):64-71；Seymour,A.B.等(1994)Cancer Res 54,2761-4；Hahn,S.A.等(1995)Cancer Res 55,4670-5；Kimura,M.等(1996)GenesChromosomes Cancer 17,88-93)也可以用来鉴定扩增或缺失的区域。
【2.用于检测基因表达的方法】
也可以测定标记表达水平。可以通过用于检测转录分子或蛋白质的表达的多种熟知方法中任一种评估本发明标记的表达。此类方法的非限制性实例包括用于检测分泌蛋白、细胞表面蛋白、胞质蛋白或核蛋白的免疫学方法、蛋白质纯化方法、蛋白质功能或活性测定、核酸杂交方法、核酸逆转录方法和核酸扩增方法。
在某些实施方案中，特定基因的活性通过测量基因转录物(例如，mRNA)、通过测量翻译的蛋白质的量或通过测量基因产物活性来表征。标记表达可以以多种方式监测，包括通过检测mRNA水平、蛋白质水平或蛋白质活性，其中可以使用标准技术测量前述任一种。检测可以包括基因表达(例如，基因组DNA、cDNA、mRNA、蛋白质或酶活性)的水平的量化，或可选地，可以是基因表达水平的定性评估，尤其与对照水平相比。所检测水平的类型将从上下文显而易见。
使用核酸杂交技术检测和/或定量基因转录物(mRNA或从中产生的cDNA)的方法是本领域技术人员已知的(见Sambrook等，上文)。例如，一种用于评价cDNA的存在、不存在或量的方法包括如上文所述的DNA印迹转移法。简而言之，将mRNA分离(例如，使用酸性胍-苯酚-氯仿提取方法，Sambrook等，上文)并且逆转录以产生cDNA。随后使cDNA任选地消化并且在缓冲液中的凝胶上分离并转移至膜。随后用对靶cDNA特异的核酸探针进行杂交。
此类诊断和预后测定的一般原理包括在适当条件下和持续下述时间制备可含有标记的样本或反应混合物以及探针，其中所述时间足以允许该标记和探针互作用和结合，因而形成可以在反应混合物中去除和/或检测到的复合物。这些测定可以以多种方式实施。
例如，一种实施这种测定的方法包括：将锚定标记或探针到固相支持物(也称作基材)上并在反应结束时检测锚定在固相上的靶标记/探针复合物。在这种方法的一个实施方案中，来自待分析标记存在和/或浓度的受试者中的样本可以被锚定到载体或固相支持物上。在另一个实施方案中，相反的情况是可能的，其中可以将探针锚定至固相并且可以允许来自受试者的样本作为测定的未锚定组分反应。
存在许多用于将分析组分锚定至固相的确定方法。这些确定方法包括，而不限于借助生物素及链霉亲和素的缀合作用而固定的标记或探针分子。此类生物化的分析组分可以使用本领域已知的技术(例如，生物素酰化试剂盒,Pierce Chemicals,Rockford,IL)从生物素-NHS(N-羟基-琥珀酰亚胺)制备并且固定于链霉亲和素涂覆的96孔板(Pierce Chemical)的孔内。在某些实施方案中，带有固定的分析组分的表面可以事先制备并贮存。
用于此类测定的其他合适载体或固相支持物包括能够结合标记或探针所属类型的分子。熟知的支持物或载体包括，但不限于玻璃、聚苯乙烯、尼龙、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、淀粉酶、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁石。
为了用上述方法实施测定，将未固定的组分添加上面锚定有第二组分的固相。在反应完成后，可以在一定条件下(例如，通过洗涤)去除未复合的组分，所述条件使得形成的任何复合物将保持固定在固相上。可以用本文概述的众多方法完成对锚定至固相的标记/探针复合物的检测。
在另一个实施方案中，当探针是未锚定的分析组分时，可以为测定的检测和读数的目的，将探针用本文中所讨论和本领域技术人员熟知的可检测标记物直接或间接标记。
也可能直接检测标记/探针复合物形式，而不用进一步操作或标记任一种组分(标记或探针)，例如通过使用荧光能量转移技术(见例如，Lakowicz等，美国专利号5,631,169；Stavrianopoulos等，美国专利号4,868,103)。选择在第一‘供体'分子上的荧光团标记物，从而，当以适当波长的入射光激发时，该荧光团标记物发射的荧光能量将被第二‘受体'分子上的荧光标记物吸收，这转而能够因吸收的能量而发射荧光。或者，‘供体'蛋白质分子可以仅仅利用色氨酸残基的天然荧光能量。选择发射不同光波长的标记物，从而使‘受体'分子标记物可以与‘供体'的分子标记物区分。由于标记物之间能量转移的效率与分隔所述分子的距离相关，故可以评估所述分子之间的空间关系。在分子之间出现结合的情况下，测定中‘受体‘分子标记物的荧光发射应当是最大的。可以通过本领域熟知的标准荧光定量检测手段(例如，使用荧光计)方便地度量FET结合事件。
在另一个实施方案中，确定探针识别标记的能力可以在不标记分析组分(探针或标记)的情况下通过使用技术如实时生物分子相互作用分析(BIA)而完成(见，例如，Sjolander,S.和Urbaniczky,C.,1991,Anal.Chem.63:2338-2345和Szabo等,1995,Curr.Opin.Struct.Biol.5:699-705)。如本文所用，“BIA”或“表面等离子体共振”是一项在不标记任何相互作用物的情况下实时研究生物特异性相互作用的技术(例如，BIAcore)。在结合表面处的质量变化(指示结合事件)导致该表面附近的光的折射率改变(表面等离子体共振(SPR)的光学现象)，从而产生可以用作生物分子之间实时反应的指示的可检测信号。
可选地，在另一个实施方案中，可以在标记和探针作为液相中溶质的情况下实施类似的诊断和预后测定。在这种测定中，将复合的标记和探针通过众多标准技术中的任一种与未复合的组分分离，所述标准技术包括但不限于：差速离心、色谱法、电泳和免疫沉淀。在差速离心中，标记/探针复合物可以经一系列离心步骤与未复合的分析组分分离，原因在于复合物的沉降平衡基于其不同大小和密度而不同(见例如，Rivas,G.,和Minton,A.P.,1993,Trends Biochem Sci.18(8):284-7)。标准色谱技术也可以用来将复合的分子与未复合的分子分离。例如，凝胶过滤层析基于大小，并且通过利用柱形式的适当凝胶过滤树脂分离分子，例如，相对较大的复合物可以与相对较小的未复合组分分离。类似地，与未复合的组分相比，标记/探针复合物的相对不同的电荷特性可以用来将该复合物与未复合的组分区分，例如，通过利用离子交换层析树脂。此类树脂和层析技术是本领域技术人员熟知的(见，例如，Heegaard,N.H.,1998,J.Mol. Recognit.Winter 11(1-6):141-8；Hage,D.S.,和Tweed,S.A.J Chromatogr B Biomed Sci Appl 1997 Oct 10；699(1-2):499-525)。凝胶电泳也可以用来将复合的分析组分与未结合的组分分离(见，例如，Ausubel等编著,Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley & Sons,New York,1987-1999)。在这种技术中，蛋白质或核酸复合物基于例如大小或电荷分离。为了维持电泳过程中的结合相互作用，非变性凝胶基质材料和不存在还原剂的条件是常见的。针对特定测定及其组分的适当条件将是本领域技术人员熟知的。
在特定的实施方案中，可以使用本领域已知的方法在生物学样本中通过原位和通过体外模式确定与标记相对应的mRNA的水平。术语“生物学样本”意在包括从受试者分离的组织、细胞、生物流体及其分离物以及存在于受试者体内的组织、细胞和流体。许多表达检测方法使用分离的RNA。对于体外方法，对于mRNA的分离不选择的任何RNA分离技术可以用于从细胞纯化RNA(见，例如，Ausubel等编著,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York1987-1999)。另外，可以使用本领域技术人员熟知的技术，例如，Chomczynski的单步RNA分离方法(1989,美国专利号4,843,155)容易地加工大量组织样本。
分离的核酸可以用于包括但不限于DNA印迹或RNA印迹分析、聚合酶链反应分析和探针阵列法的杂交或扩增分析中。一种用于检测mRNA水平的诊断方法包括使分离的mRNA与核酸分子(探针)接触，其中所述核酸分子可以与正在检测的基因所编码的mRNA杂交。该核酸探针可以是例如全长cDNA或其部分，如长度为至少7、15、30、50、100、250或500个核苷酸并且足以在严格条件下与编码本发明标记的mRNA或基因组DNA特异性杂交的寡核苷酸。本文描述了用于本发明诊断测定中的其他合适的探针。mRNA与该探针杂交表明所讨论的标记正在表达。
在一种模式下，将mRNA固定在固体表面上并且与探针接触，例如通过在琼脂糖凝胶上电泳运行分离的mRNA并且将所述mRNA从凝胶转移至一种膜，如硝酸纤维素膜。在替代模式下，将所述探针固定在固体表面上并且例如在Affymetrix基因芯片阵列中使所述mRNA与该探针接触。技术人员可以容易地改造已知的mRNA检测方法以用于检测由本发明标记编码的mRNA的水平。
探针可以是全长或小于编码蛋白质的核酸序列的全长。凭经验检验较短探针的特异性。示例性核酸探针长度是20个碱基或更长(对于选择用于核酸杂交中的核酸探针序列的方法，见，例如，Sambrook等)。已杂交部分的可视化允许定性确定cDNA的存在或不存在。
用于确定样本中与本发明标记相对应的转录物的水平的可选方法包括扩增核酸的过程，例如，通过rtPCR(Mullis,1987,美国专利号4,683,202中所述的实验实施方案)、连接酶链反应(Barany,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:189-193)、自动维持序列复制(Guatelli等,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1874-1878)、转录性扩增系统(Kwoh等,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1173-1177)、Q-Beta复制酶法(Lizardi等,1988,Bio/Technology 6:1197)、滚环复制法(Lizardi等，美国专利号5,854,033)或任何其他核酸扩增方法，随后使用本领域技术人员熟知的技术检测扩增的分子。荧光rtPCR也可以用于本发明的方法中。在荧光rtPCR中，定量基于荧光信号(例如TaqMan和sybr绿)的量。如果核酸分子以极低的数目存在，那么这些检测方案特别用于检测此类分子。如本文所用，扩增引物定义为可以与基因的5'或3'区域(分别地是正链和负链，或反之亦然)复性并且包含其之间短区域的一对核酸分子。通常，扩增引物的长度是约10至30个核苷酸并且在长度为约50至200个核苷酸的区域两侧分布。在适当条件下并且采用适当的试剂，此类引物允许扩增核酸分子，其包含由所述引物在两侧分布的核苷酸序列。
对于原位方法，mRNA不需要在检测之前从细胞分离。在此类方法中，使用已知的组织学方法制备/加工细胞或组织样本。随后将样本固定在支持物上，一般是玻璃载片，并且随后与探针接触，其中所述探针可以与编码所述标记的mRNA杂交。
作为基于绝对标记表达水平进行确定的替代，确定可以基于归一化的标记的表达水平。通过比较标记的表达与不作为标记的基因(例如组成型表达的持家基因)而校正其绝对表达水平，将表达水平归一化。用于归一化的合适基因包括持家基因如肌动蛋白基因或上皮细胞特异性基因。这种归一化允许比较一份样本(例如受试者样本)与另一份样本(例如非癌样本)或来自不同来源的样本之间的表达水平。
可选地，表达水平可以作为相对表达水平提供。为确定标记的相对表达水平，在确定所讨论样本的表达水平之前，相对于癌细胞分离物，对10份或更多份正常样本或对甚至50份或更多份样本确定标记的表达水平。确定在较大数目样本中所分析的每个基因的平均表达水平，并且使用这个平均表达水平作为所述标记的基线表达水平。对该试样所确定的标记表达水平(绝对表达水平)随后除以对该标记所获得的平均表达值。这产生相对表达水平。
在某些实施方案中，在基线确定时所用的样本将源自癌细胞或相同组织类型的正常细胞。细胞来源的选择取决于相对表达水平的用途。使用正常组织中存在的表达作为平均表达评分有助于验证所分析的标记是否对衍生该细胞的的组织为特异的(相对于正常细胞)。此外，随着更多数据积累，可以修改平均表达值，从而基于积累的数据提供改进的相对表达值。来自正常细胞的表达数据提供了用于对癌症状态的严重性分级的手段。
在另一个实施方案中，通过下述方式评估标记的表达：从受试者样本中的细胞制备基因组DNA或mRNA/cRNA(即，转录的多核苷酸)并且将所述基因组DNA或mRNA/cRNA与参考多核苷酸及其片段杂交，其中所述参考多核苷酸是包含所述标记的多核苷酸的互补物。在与参考多核苷酸杂交之前，cDNA可以任选地使用多种聚合酶链反应方法中的任一种进行扩增。使用评估标记表达水平的定量PCR(QPCR)，可以同样地检测一个或多个标记的表达。可选地，检测本发明标记的突变或变体(例如，单核苷酸多态性、缺失等)的许多已知方法中的任一种可以用来检测受试者中突变标记的存在。
在相关的实施方案中，使从样本获得的转录的多核苷酸的混合物与固定有多核苷酸的基材接触，其中所述多核苷酸基材与本发明标记的至少一部分(例如，至少7个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少40个、至少50个、至少100个、至少500个或更多个核苷酸残基)互补或同源。如果与本发明标记互补或同源的多核苷酸在该基材上可差异性检测的(例如，使用不同发色团或荧光团可检测的，或固定至不同的选择位置)，则使用单一基材(例如，在选择的位置处固定的多核苷酸的“基因芯片”微阵列)，可以同时评估多个标记的表达水平。当使用评估标记表达的包括一个核酸与另一个核酸杂交的方法时，所述杂交可以在严格杂交条件下进行。
在另一个实施方案中，使用评估标记表达的方法的组合。
因为本发明的组合物、试剂盒和方法依赖于检测本发明的一种或多种标记的表达水平或拷贝数的差异，因此在某些实施方案中，标记的表达水平或拷贝数显著地大于用来在正常细胞和癌细胞至少之一中评估表达或拷贝数的方法的最小检测限。
【3.用于检测表达的蛋白质的方法】
标记蛋白的活性或水平也可以通过检测或定量表达的多肽进行检测和/或定量。所述多肽可以通过本领域技术人员熟知的众多方法中的任一种进行检测和定量。这些方法可以包括分析生物化学方法如电泳、毛细管电泳、高效液相色谱(HPLC)、薄层层析(TLC)、超扩散色谱等或多种免疫学方法如液相或凝胶沉淀素反应、免疫扩散(单向或双向)、免疫电泳、放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光测定、蛋白质印迹和免疫组织化学等。技术人员可以容易地改造已知的蛋白质/抗体检测方法以用于确定细胞是否表达本发明的标记。
用于检测本发明多肽的另一种试剂是能够结合至与本发明标记相对应的多肽的抗体，例如，带有可检测标记物的抗体。抗体可以是多克隆或单克隆的。可以使用完整抗体或其片段(例如，Fab或F(ab')2)。就探针或抗体而言，术语“被标记”意在包括通过通过偶联(即，物理连接)一种可检测物质至探针或抗体而直接标记该探针或抗体，以及通过与直接标记的另一种试剂反应而间接标记该探针或抗体。间接标记的实例包括使用荧光标记的第二抗体检测第一抗体和用生物素末端标记DNA探针，从而可以用荧光标记的链霉亲和素检测到该探针。
在另一个实施方案中，抗体是标记的，例如，放射标记、发色团标记、荧光团标记或酶标记的抗体。在另一个实施方案中，使用与对应于所述标记的蛋白质(如由对应于所标记的开放阅读框编码的蛋白质或其全部或一部分已经经历正常翻译后修饰的蛋白质)特异性结合的抗体衍生物(例如，与底物或与蛋白质或与或蛋白质-配体对｛例如，生物素-链霉亲和素｝)的配体缀合的抗体)或抗体片段(例如，单链抗体、分离的抗体超变区等)。
免疫组织化学或IHC指利用抗体与生物组织中抗体特异性结合抗原的原理，定位组织切片的细胞中抗原(例如，蛋白质)的方法。免疫组织化学染色广泛地用于诊断异常细胞，如癌性肿瘤中存在的那些异常细胞。特定分子标记是特殊细胞事件如增殖或细胞死亡(凋亡)的特征。IHC还广泛地用于研究中以了解生物标记和差异性表达的蛋白质在生物组织不同部分中的分布及定位。可以以众多方式实现抗体-抗体相互作用可视化。在最常见的情况下，抗体与可以催化生色反应的酶如过氧化物酶缀合。可选地，抗体也可以与荧光团如荧光素、罗丹明、DyLight Fluor或Alexa Fluor连接。
可以使用本领域技术人员熟知的技术从细胞分离蛋白质。所用的蛋白质分离方法可以例如是在Harlow和Lane(Harlow和Lane,1988,Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,New York)中描述的那些方法。
在一个模式下，可以在如蛋白质印迹法或免疫荧光技术的方法中使用抗体或抗体片段以检测表达的蛋白质。在此类用途中，可以将所述抗体或蛋白质固定在固体支持物上。合适的固体支持物或载体包括能够结合抗原或抗体的任何支持物。熟知的支持物或载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁石。
本领域技术人员会知道用于结合抗体或抗原的许多其他合适载体并且将能够改造这种支持物用于本发明中。例如，从细胞分离的蛋白质可以在聚丙烯酰胺凝胶电泳上运行并且被固定到固相支持物如硝酸纤维素膜上。该支持物可以随后用合适的缓冲液洗涤，接着用可检测标记的抗体处理。这种固相支持物可以随后用缓冲液第二次洗涤以除去未结合的抗体。然后可通过常规手段检测在该固相支持物上结合的标记物的量。使用电泳技术检测蛋白质的手段是本领域技术人员熟知的(通常见，R.Scopes(1982)Protein Purification,Springer-Verlag,N.Y.；Deutscher,(1990)Methods in Enzymology第182卷：Guide toProtein Purification,Academic Press,Inc.,N.Y.)。
在另一个实施方案中，蛋白质印迹(免疫印迹)分析用来检测和定量多肽在样本中的存在。这项技术通常包括：基于分子量通过凝胶电泳分离样本蛋白质、将分离的蛋白质转移至合适的固相支持物(如硝酸纤维素滤膜、尼龙滤膜或衍生化尼龙滤膜)，并且将样本与特异性结合多肽的抗体孵育。抗多肽抗体与固相支持物上的多肽特异性结合。这些抗体可以是直接标记的或可选地可以随后使用与抗多肽特异性结合的标记抗体(例如，标记的羊抗人抗体)检测到。
在另一个实施方案中，使用免疫测定检测多肽。如本文所用，免疫测定是利用与分析物特异性结合的抗体的测定。免疫测定因而以检测多肽与抗-抗体的特异性结合为特征，这与利用其他物理或化学特性分离、靶向和定量分析物相反。
使用众多充分认可的免疫结合分析法中的任一种检测和/或定量多肽(见，例如，美国专利号4,366,241；4,376,110；4,517,288和4,837,168)。对于一般免疫测定的综述，还见Asai(1993)Methods inCell Biology第37卷：Antibodies in Cell Biology，Academic Press,Inc.New York；Stites & Terr(1991)Basic and Clinical Immunology第7版。
免疫结合分析法(或免疫测定)一般利用特异性结合至并且经常固定分析物(多肽或子序列)的“捕获物质”。捕获物质是与分析物特异性结合的部分。在另一个实施方案中，捕获物质是特异性结合多肽的抗体。抗体(抗肽)可以通过本领域技术人员熟知的众多方法中的任一种产生。
免疫测定还经常利用标记物质，其特异性结合于并且标记由捕获物质和分析物形成的结合复合物。标记物质本身可以是包含抗体/分析物复合物的诸多部分之一。因而，标记物质可以是标记的多肽或标记的抗-抗体。可选地，标记物质可以是与抗体/多肽复合物特异性结合的第三部分，如另一种抗体。
在一个实施方案中，标记物质是携带标记物的第二人抗体。可选地，第二抗体可以缺少标记物，但是它可以转而被标记的第三抗体结合，所述标记的第三抗体对衍生第二抗体的物种的抗体特异。第二抗体可以用可检测部分修饰，如生物素，其中标记的第三分子(如酶标记的链霉亲和素)可以特异性结合所述的可检测部分。
能够特异性结合免疫球蛋白恒定区的其他蛋白质如蛋白A或蛋白G也可以用作标记物质。这些蛋白质是链球菌细菌细胞壁的正常组分。它们显示强烈的与来自多种物种的免疫球蛋白恒定区的非免疫原性反应性(通常见，Kronval等(1973)J.Immunol.,111：1401-1406,和Akerstrom(1985)J.Immunol.,135：2589-2542)。
如上文所示，用于检测和/或定量多肽的免疫测定可以采取本领域技术人员熟知的多种形式。
用于检测多肽的示例性免疫测定可以是竞争性或非竞争性的。非竞争性免疫测定是其中直接测量捕获的分析物的量的测定。在一种“夹心”测定中，例如，捕获物质(抗肽抗体)可以与其被固定于其上的固体基材直接结合。这些固定的抗体随后捕获试样中存在的多肽。因此固定的多肽随后由标记物质例如携带标记物的第二人抗体结合。
在竞争性测定中，通过测量被样本中存在的分析物从捕获物质(抗肽抗体)中所替换(或竞争下来)的添加(外源)的分析物(多肽)的量，间接地测量样本中存在的分析物(多肽)的量。在竞争性测定中，在这种情况中，将已知量的多肽添加至样本，并且随后使样本与捕获物质接触。与抗体结合的多肽的量与样本中存在的多肽的浓度成反比。
在另一个实施方案中，将抗体固定在固体基材上。可以通过测量多肽/抗体复合物中存在的多肽的量或可选地通过测量剩余的未复合多肽的量来确定与抗体结合的多肽的量。可以通过提供标记的多肽来检测多肽的量。
对本文所述的测定根据本领域技术人员熟知的标准方法进行评定(评定为多肽的阳性或阴性或量)。特定的评定方法将取决于分析模式和标记物选择。例如，蛋白质印迹测定可以通过使由酶标记物产生的有色产物可视来进行评定。将在正确分子量处的清晰可见的有色条带或斑点评定为阳性结果，而将不存在清晰可见斑点或条带评定为阴性。条带或斑点的强度可以提供多肽的定量度量。
用于本文所述的多种免疫测定中的抗体可以如本文所述产生。
在另一个实施方案中，通过测量基因产物的酶活性分析水平(活性)。分析酶活性的方法是本领域技术人员熟知的。
用于检测标记蛋白的体内技术包括将针对所述蛋白质的标记抗体引入受试者中。例如，该抗体可以用放射性标记加以标记，其中可以通过标准成像技术检测所述放射性标记在受试者中的存在和位置。
本发明方法鉴定的某些标记可以是分泌蛋白。对于技术人员而言，确定任何特定的标记蛋白是否为分泌蛋白是简单的。为了进行这种决定，使标记蛋白在例如哺乳动物的细胞（例如，人细胞系）中表达，收集细胞外液，并且评估该蛋白质在细胞外液中的存在或不存在(例如，使用与该蛋白质特异性结合的标记抗体)。
下文是可以用来检测蛋白质分泌的方法的实例。将约8×105个293T细胞在37℃，在含有生长培养基(补充有10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基{DMEM})的孔中，在5%(v/v)CO2、95%空气下孵育至约60-70%汇合。随后使用每孔包含2微克DNA和10微升LipofectAMINETM(GIBCO/BRL目录号18342-012)的标准转染混合物转染细胞，其中所述DNA包含编码蛋白质的表达载体。将转染混合物维持约5小时，并且随后用新鲜的生长培养基更换并在空气中维持。每个孔用不含有甲硫氨酸或半胱氨酸的DMEM(DMEM-MC；ICN目录号16-424-54)温和冲洗2次。将约1毫升DMEM-MC和约50微居里反式-35STM试剂(ICN目录号51006)添加至每个孔。将所述孔在上述的5%CO2气氛下维持并且在37℃孵育所选的时间段。孵育后，去除150微升的条件培养基并离心以除去漂浮的细胞和残片。蛋白质在上清液中的存在表示该蛋白质是分泌的。
可以理解受试者样本，例如，包含组织、全血、血清、血浆、颊部刮片、唾液、脑脊液、尿、粪便和骨髓的样本，可以在其中含有细胞，尤其当时所述细胞是癌性的，并且更具体地当癌是转移性癌时，并且因而可以用于本发明方法中。当然，在评估样本中标记的表达水平之前，可以使细胞样本经历多种熟知的收集后制备和贮存技术(例如，核酸和/或蛋白质提取、固定、储存、冷冻、超滤、浓缩、蒸发、离心等)处理。因而，本发明的组合物、试剂盒和方法可以用来检测与蛋白质相对应的标记的表达，其中所述蛋白质具有在表达所述蛋白质的细胞的表面上展示的至少一个部分。对于技术人员而言，确定与任何特定标记相对应的蛋白质是否包含细胞表面蛋白是简单的。例如，免疫学方法可以用来检测完整细胞上的此类蛋白质，或熟知的基于计算机的序列分析方法(例如，SIGNALP程序；Nielsen等,1997,ProteinEngineering 10:1-6)可以用来预测至少一个胞外结构域(即，包括分泌蛋白和具有至少一个细胞表面结构域的蛋白质)的存在。可以在不需要裂解细胞情况下，检测到与蛋白质相对应的标记的表达(例如，使用与该蛋白质的细胞表面结构域特异性结合的标记抗体)，其中所述蛋白质具有在表达所述蛋白质的细胞的表面上展示的至少一个部分。
本发明还包括用于检测与本发明标记相对应的多肽或核酸在生物学样本(例如含有组织、全血、血清、血浆、颊部刮片、唾液、脑脊液、尿、粪便和骨髓的样本)中存在的试剂盒。此类试剂盒可以用来确定受试者是否正在罹患或存在增加的癌症的形成风险。例如，所述试剂盒可以包含能够检测生物学样本中多肽或编码与本发明标记相对应的多肽的mRNA的标记化合物或试剂，和用于确定该样本中所述多肽或mRNA的量的手段(例如，结合所述多肽的抗体或与编码所述多肽的DNA或mRNA结合的寡核苷酸探针)。试剂盒也可以包含解释使用该试剂盒获得的结果的说明书。
对于基于抗体的试剂盒，试剂盒可以包含，例如：(1)与对应于本发明标记的多肽结合的第一抗体(例如，与固相支持物接合)；和任选地(2)不同的第二抗体，其与所述多肽或第一抗体结合并且与可检测标记物缀合。
对于基于寡核苷酸的试剂盒，试剂盒可以包含，例如：(1)寡核苷酸，例如，以可检测方式标记的寡核苷酸，其与编码与本发明标记相对应的多肽的核酸序列杂交，或(2)用于扩增与本发明标记相对应的核酸分子的一对引物。该试剂盒也可以包含例如缓冲剂、防腐剂或蛋白质稳定剂。该试剂盒还可以包含检测可检测标记物需要的组分(例如，酶或基材)。该试剂盒也可以含有可以被分析并且与试样比较的对照样本或一系列对照样本。试剂盒的每种组分可以封闭于单独的容器内部，并且全部的各种容器，连同用于解释使用该试剂盒所实施的测定的结果说明书，可以在单一包装内。
【4.用于检测结构性改变的方法】
本发明也提供用于评估结构性改变例如(突变)存在的方法。
另一种检测方法是使用探针的等位基因特异性杂交法，其中所述探针与多态性位点重叠和具有多态性区域周围约5个、约10个、约20个、约25个或约30个核苷酸。在本发明的另一个实施方案中，将能够与突变特异性杂交的几种探针与固相支持物(例如，“芯片”)结合。寡核苷酸可以通过多种方法(包括光刻法)与固相支持物结合。例如，芯片可以容纳多达250,000个寡核苷酸(GeneChip,AffymetrixTM)。例如在Cronin等(1996)Human Mutation 7:244中描述了使用包含寡核苷酸的这些芯片的突变检测分析，也称作“DNA探针阵列”。在一个实施方案中，芯片包含某基因的至少一个多态性区域的全部突变。随后将固相支持物与检验核酸接触，并且检测与特异性探针的杂交。因而，可以在一个简单的杂交实验中鉴定一个或多个基因的众多突变的身份。例如，可以在单个杂交实验中确定5′上游调控元件中核苷酸多态性的突变的身份。
在其他检测方法中，在鉴定突变之前，需要首先扩增标记的至少一部分。扩增可以根据方法本领域已知，例如通过PCR和/或LCR进行(见Wu和Wallace(1989)Genomics 4：560)。在一个实施方案中，使细胞的基因组DNA与两个PCR引物接触，并且众多循环的扩增足以产生所需量的扩增的DNA。在某些实施方案中，引物相隔150和350个碱基对之间存在。
替代性扩增方法包括：自动维持序列复制(Guatelli，J.C.等，(1990)Proc Natl Acad Sci USA 87：1874-1878)、转录扩增系统(Kwoh，D.Y.等，(1989)Proc Natl Acad Sci USA 86：1173-1177)、Q-Beta复制酶法(Lizardi，P.M.等，(1988)Bio/Technology 6：1197)和自动维持序列复制法(Guatelli等，(1989)Proc.Nat.Acad.Sci.87：1874)和基于核酸的序列扩增法(NABSA)或任何其他核酸扩增方法，随后使用本领域技术人员熟知的技术检测扩增的分子。如果核酸分子以极低的数目存在，这些检测方案特别用于检测此类分子。
在一个实施方案中，本领域已知的多种测序反应的任一种可以用来对标记的至少一部分直接测序并且通过比较奥样本的序列与相应参考(对照)序列来检测突变。示例性的测序反应包括基于Maxam和Gilbert(Proc Natl Acad Sci USA(1977)74：560)或Sanger(Sanger等(1977)Proc.Nat.Acad.Sci 74：5463)所开发技术的那些测序反应。也还设想，当进行主题测定时，可以利用多种自动测序方法中的任一种(Biotechniques(1995)19：448)，包括通过质谱测序(见例如，H.
Figure BDA00001882655700941
的美国专利号5,547,835和国际专利申请公开号WO 94/16101，题为：DNA Sequencing by Mass Spectrometry(通过质谱法的DNA测序)；H.
Figure BDA00001882655700942
的美国专利号5,547,835和国际专利申请公开号WO 94/21822，题为：DNA Sequencing by Mass Spectrometry Via ExonucleaseDegradation(经核酸外切酶降解通过质谱法的DNA测序))和H.
Figure BDA00001882655700951
的美国专利号5,605,798和国际专利申请号PCT/US96/03651，题为：Diagnostics Based on Mass Spectrometry(基于质谱法的DNA诊断法)；Cohen等(1996)Adv Chromatogr 36:127-162；和Griffin等(1993)ApplBiochem Biotechnol 38:147-159)。本领域技术人员将显而易见，对于某些实施方案，在测序反应中需要确定仅1个、2个或3个核酸碱基的出现。例如，可以实施A-track等，例如，此时仅检测一个核苷酸。
然而，其他测序方法例如在题为“Method of DNA sequencingemploying a mixed DNA-polymer chain probe(使用混合DNA-聚合物链探针的DNA测序方法)”的美国专利号5,580,732和题为“Method formismatch-directed in vitro DNA sequencing(用于错配指导的体外DNA测序方法)”的美国专利号5,571,676中公开。
其他测序方法包括，但不限于体外克隆扩增(例如，如Margulies M.等(2005)Nature 437(7057):376-380；Shendure J.(2005)Science309:1728中所述)(也称作Polony测序)；SOLidTM测序(AppliedBiosystem http://www.appliedbiosystems.com/absite/us/en/home/applications-technologies/solid-next-generation-sequencing.html)；桥式扩增(Illuminahttp://www.illumina.com/technology/sequencing_technology.html)；Braslavsky I.等(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100(7):3960-3964)；平行测序(例如，如Margulies M.等(2005)Nature 437(7057):376-380；Ronaghi M.等(1996)Analytical Biochemistry 242(1):84-89中所述)；可逆终止子法(例如，由Illumina和Helicos使用)；焦磷酸测序法(例如，由454Life Sciences使用)、连接测序法(例如，如Shendure J.(2005)Science 309:1728中所述)；SOLidTM测序法(Applied Biosystemhttp://www.appliedbiosystems.com/absite/us/en/home/applications-technologies/solid-next-generation-sequencing.html)；题为“DNA sequencing by parallel oligonucleotide extentions(借助平行寡核苷酸延伸的DNA测序法)”的美国专利号5,750,341；微流体Sanger测序法；杂交测序法(例如，使用DNA微阵列的非酶促方法，如HannaG.J.等(2000)J.Clin.Microbiol.38(7):2715-2721)；基于显微镜术的技术(例如，如美国专利申请公开号2006/0029957中所述)。
在一些情况下，可以通过限制性酶分析显示标记的特定等位基因在来自受试者的DNA中的存在。例如，特定的核苷酸多态性可以产生包含从另一个突变的核苷酸序列中缺失的限制性位点的核苷酸序列。
在又一个实施方案中，保护免遭裂解剂(如核酸酶、羟胺或四氧化锇和哌啶)可以用来检测RNA/RNA、DNA/DNA或RNA/DNA异源双链体中的错配碱基(Myers等(1985)Science 230:1242)。通常，“错配裂解”技术始于提供异源双链体，其中所述异源双链体通过包含标记突变的核苷酸序列的对照核酸(例如RNA或DNA)与从组织样本获得的样本核酸(例如RNA或DNA)杂交形成，所述对照核酸任选地是标记的。双链的双链体用切割双链体(如基于对照和样本链之间碱基错配所形成的双链体)的单链区的试剂处理。例如，RNA/DNA双链体可以用RNA酶处理并且DNA/DNA杂合体用S1核酸酶处理以酶促消化错配的区域。在其他实施方案中，DNA/DNA或RNA/DNA双链体可以用羟胺或四氧化锇并用哌啶处理以消化错配的区域。在消化错配的区域后，所得到的材料随后在变性聚丙烯酰胺凝胶上通过大小进行分离，以确定对照和样本核酸是否具有相同的核苷酸序列或它们在哪个核苷酸上是不同的。见例如，Cotton等(1988)Proc.Natl Acad Sci USA85:4397；Saleeba等(1992)Methods Enzymol.217:286-295。在另一个实施方案中，对照或样本核酸为检测而标记。
在另一个实施方案中，可以通过变性高效液相色谱(DHPLC)鉴定突变(Oefner和Underhill,(1995)Am.J.Human Gen.57:Suppl.A266)。DHPLC使用反相离子配对色谱来检测从个体中扩增PCR片段期间产生的异源双链体，其中所述个体是在该片段内部的特定核苷酸基因座处杂合的(Oefner和Underhill,(1995)Am.J.Human Gen.57:Suppl.A266)。通常，使用在目的DNA侧翼分布的PCR引物产生PCR产物。进行DHPLC分析，并且分析所得到的色谱图以基于特定色谱图鉴定碱基对改变或缺失(见O'Donovan等(1998)Genomics52:44-49)。
在其他实施方案中，使用电泳迁移率的改变来鉴定标记突变的类型。例如，单链构象多态性(SSCP)可以用来检测突变体和野生型核酸之间电泳迁移率的差异(Orita等(1989)Proc Natl.Acad.Sci USA86:2766，也见Cotton(1993)Mutat Res 285:125-144；和Hayashi(1992)Genet Anal Tech Appl 9:73-799:73-79)。将样本和对照核酸的单链DNA片段变性并且允许复性。单链核酸的二级结构根据序列而变动，并且所产生的电泳迁移率的改变使检测甚至单碱基变化成为可能。DNA片段可以用标记的探针标记或检测。通过使用其中二级结构对序列变化更敏感的RNA(而非DNA)，可以增强本测定的灵敏度。在另一个实施方案中，主题方法利用异源双链体分析以基于电泳迁移率的变化分离双链异源双链体分子(Keen等.(1991)(1991)Trends Genet 7:5)。
在又一个实施方案中，通过使用变性梯度凝胶电泳(DGGE)，通过分析含有多态性区域的核酸在含有变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶中的运动，获得多态性区域的突变的身份(Myers等(1985)Nature313:495)。当使用DGGE作为分析方法时，将修饰DNA以确保DNA不会彻底变性，例如通过PCR添加大约40bp高解链温度富含GC的DNA的GC夹进行修饰。在又一个实施方案中，使用温度梯度代替变性剂梯度以鉴定对照和样本DNA的迁移率差异(Rosenbaum和Reissner(1987)Biophys Chem 265:1275)。
用于检测两个核酸之间至少一个核苷酸差异的的技术的实例包括，但不限于选择性寡核苷酸杂交、选择性扩增或选择性引物延伸。例如，可以制备在中央安置已知多态性核苷酸的寡核苷酸探针(等位基因特异性探针)并且随后在仅完全匹配存在时才允许杂交的条件下与靶DNA杂交(Saiki等(1986)Nature 324:163)；Saiki等(1989)Proc NatlAcad Sci USA 86:6230；和Wallace等(1979)Nucl.Acids Res.6:3543)。这种等位基因特异性寡核苷酸杂交技术可以用于在标记的不同多态性区域内同时检测几个核苷酸变化。例如，将具有特定突变的核苷酸序列的寡核苷酸与杂交膜结合并且这种膜随后与标记的样本核酸杂交。对杂交信号的分析随后将揭示样本核酸的核苷酸身份。
可选地，依赖于选择性PCR扩增的等位基因特异性扩增技术可以与本发明联合使用。作为特异扩增用引物使用的寡核苷酸可以在分子的中央携带目的突变(从而扩增依赖于差别杂交)(Gibbs等(1989)Nucleic Acids Res.17:2437-2448)或在一个引物的3'最末端处携带目的突变，因而在适宜的条件下，可以防止错配或减少聚合酶延伸(Prossner(1993)Tibtech 11:238；Newton等(1989)Nucl.Acids Res.17:2503)。这项技术也称作“PROBE”-探测寡碱基延伸(Probe OligoBase Extension)。此外，可能需要在突变的区域内导入新的限制性位点以形成基于裂解的检测(Gasparini等(1992)Mol.Cell Probes 6:1)。
在另一个实施方案中，使用如在例如美国专利号4,998,617和在Landegren,U.等,(1988)Science 241:1077-1080中所述的寡核苷酸连接测定(OLA)进行突变的鉴定。OLA方案使用两个寡核苷酸，它们设计成能够与靶的单链的邻接序列杂交。所述寡核苷酸之一与分离标记连接，例如经生物素酰化，并且将另一个寡核苷酸可检测地标记。如果精确的互补序列存在于靶分子中，则所述寡核苷酸将杂交，从而它们的末端靠近并且产生一个连接底物。连接作用随后允许使用抗生物素蛋白或另一种生物素配体回收标记的寡核苷酸。Nickerson,D.A.等已经描述了结合PCR和OLA的属性的核酸检测测定(Nickerson,D.A.等,(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)87:8923-8927。在这种方法中，PCR用来实现靶DNA的指数扩增，随使用OLA后检测所述靶DNA。
本发明还提供了用于检测标记中单核苷酸多态性的方法。因为单核苷酸多态性构成侧翼分布有不变序列的变异位点，所以对它们的分析仅仅要求确定在变异位点处存在的单核苷酸的身份，并且不需要对每个主题测定完整基因序列。已经开发了几种方法以促进此类单核苷酸多态性的分析。
在一个实施方案中，可以通过使用抗核酸外切酶的特化核苷酸检测单碱基多态性，如在例如Mundy,C.R.(美国专利号4,656,127)中所公开。根据该方法，使得与紧邻多态性位点3'的等位序列互补的引物与从特定动物或人获得的靶分子杂交。如果靶分子上的多态性位点含有与存在的抗核酸外切酶的特定核苷酸衍生物互补的核苷酸，则这种衍生物将被掺入杂交的引物的末端上。这种掺入使得该引物抵抗核酸外切酶，并且从而导致其检测。由于样本的抗核酸外切酶衍生物的身份是已知的，引物已经变得抵抗核酸外切酶的研究结果揭示，在靶分子的多态性位点中存在的核苷酸与该反应中所用的核苷酸衍生物的核苷酸互补。这种方法具有以下优点：它不需要测定大量无关的序列数据。
在本发明的另一个实施方案中，基于溶液的方法用于确定多态性位点的核苷酸身份(Cohen,D.等法国专利2,650,840；PCT申请号WO91/02087)。如美国专利号4,656,127的Mundy方法中那样，使用了与紧邻多态性位点3'的等位序列互补的引物。该方法使用标记的双脱氧核苷酸衍生物确定该位点的核苷酸身份，其中如果与多态性位点的核苷酸互补，则所述标记的双脱氧核苷酸衍生物将掺入该引物的末端上。
一种可选方法，称作遗传比特分析法(Genetic Bit Analysis)或GBA，由Goelet,P.等(PCT申请号92/15712)描述。Goelet,P.等的方法使用了标记终止子和引物的混合物，所述引物与多态性位点3'的序列互补。掺入的标记终止子因而通过正在评价的靶分子的多态性位点中存在的核苷酸来确定，并且与所述核苷酸互补。与Cohen等的方法(法国专利2,650,840；PCT申请号WO91/02087)相反，Goelet,P.等的方法是其中引物或靶分子固定至固相的异相测定。
已经描述了用于分析DNA中多态性位点的几种引物引导的核苷酸掺入方法(Komher,J.S.等,(1989)Nucl.Acids.Res.17:7779-7784；Sokolov,B.P.,(1990)Nucl.Acids Res.18:3671；Syvanen,A.-C.等,(1990)Genomics 8:684-692；Kuppuswamy,M.N.等,(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)88:1143-1147；Prezant,T.R.等,(1992)Hum.Mutat.1:159-164；Ugozzoli,L.等,(1992)GATA 9:107-112；Nyren,P.(1993)等,Anal.Biochem.208:171-175)。这些方法与GBA不同，在于它们均依赖于掺入标记的脱氧核苷酸以区分多态性位点处的碱基。在这种模式下，由于信号与掺入的脱氧核苷酸的数目成正比，成段相同核苷酸中出现的多态性可以产生与该段的程度成正比的信号(Syvanen,A.C.等,(1993)Amer.J.Hum.Genet.52:46-59)。
为确定位于某标记编码区内的多态性区域的突变的身份，还可以使用除上述那些方法之外的其他方法。例如，可以通过在例如免疫组织化学或免疫沉淀法中使用特别识别突变蛋白的抗体来鉴定编码突变型标记的突变。可以根据方法本领域已知的方法制备针对野生型标记或突变形式的标记的抗体。
可选地，也可以测量标记的活性，如与标记配体的结合。结合测定是本领域已知的，并且包括例如从受试者获得细胞，并用标记的配体进行结合实验以确定与突变形式的蛋白质的结合是否不同于与野生型蛋白质的结合。
【VII.抑制HSP90的治疗剂、组合物和施用】
本领域已知用于治疗目的的抑制HSP90的药剂。抑制HSP90的药剂包括具有约90千道尔顿质量的热休克蛋白家族的每个成员。例如，在人中，高度保守的Hsp90家族包括胞质Hsp90α和Hsp90β亚型，以及存在于内质网中的GRP94，和存在于线粒体基质中的HSP75/TRAP1。
代表性的非限制性实例包括选自以下的HSP90抑制剂：IPI-493(Infinity Pharm.)、IPI-504(Infinity Pharm.)、17-AAG(也称作坦螺旋霉素或CNF-1010；BMS)、BIIB-021(也称作CNF-2024，BiogenIDEC)、BIIB-028(Biogen IDEC)、AUY-922(也称作VER-49009，Novartis)、SNX-5422(Pfizer)、STA-9090,AT-13387(Astex)、XL-888(Exelixis)、MPC-3100(Myriad)、CU-0305(Curis)、17-DMAG、CNF-1010、大贝霉素(例如，大贝霉素I，大贝霉素II)、CCT-018159、CCT-129397、PU-H71(Memorial Sloan Kettering Cancer Center)和PF-04928473(SNX-2112)。其他HSP90抑制剂在Zhang,M-Q.等,J.Med.Chem 51(18):5494-5497(2008)和Menzella,H.等,J.Med.Chem.,52(6):15128-1521(2009)中公开，所述文献的内容通过引用方式并入本文。
【1.IPI-504】
IPI-504的组合物、合成方法、施用方法等可以在现有技术PCT申请WO2005/063714中找到，所述文献的完整内容通过引用方式并入。
本发明还提供含有苯醌的安莎霉素(ansamycin)的分离的类似物，其中将苯醌还原成氢醌并且通过氢醌与合适的有机酸或无机酸反应而收集为铵盐。
在一个实施方案中，本发明提供纯的和分离的式1化合物：
Figure BDA00001882655701011
或游其离碱；
其中对于每次出现而言独立地：
W是氧或硫；
Q是氧、NR、N(酰基)或键；
X-是药学上可接受酸的共轭碱；
R对于每次出现而言独立地选自氢、烷基、环烷基、杂环烷基、芳烷基、杂芳基和杂芳烷基；
R1是羟基、烷氧基、-OC(O)R8、-OC(O)OR9、-OC(O)NR10R11、-OSO2R12、-OC(O)NHSO2NR13R14、-NR13R14或卤化物；并且R2是氢、烷基或芳烷基；或者R1和R2连同与它们结合的碳一起代表-(C=O)-、-(C=N-OR)-、-(C=N-NHR)-或-(C=N-R)-；
R3和R4各自独立地选自氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、环烷基、杂环烷基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基和-[(CR2)p]-R16；或R3连同R4一起代表任选地取代的4-8元杂环；
R5选自H、烷基、芳烷基和具有式1a的基团：
Figure BDA00001882655701021
其中R17独立地选自氢、卤化物、羟基、烷氧基、芳氧基、酰氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、酰基氨基、芳烷基氨基、硝基、硫代酰基、甲酰胺、羧基、腈基、-COR18、-CO2R18、-N(R18)CO2R19、-OC(O)N(R18)(R19)、-N(R18)SO2R19、-N(R18)C(O)N(R18)(R19)和-CH2O-杂环基；
R6和7均是氢；或R6和R7一起形成键；
R8是氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、环烷基、杂环烷基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基或-[(CR2)p]-R16；
R9是烷基、链烯基、炔基、芳基、环烷基、杂环烷基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基或-[(CR2)p]-R16；
R10和R11各自独立地选自氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、环烷基、杂环烷基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基和-[(CR2)p]-R16；或R10和R11连同与它们结合的氮一起代表任选地取代的4-8元杂环；
R12是烷基、链烯基、炔基、芳基、环烷基、杂环烷基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基或-[(CR2)p]-R16；
R13和R14各自独立地选自氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、环烷基、杂环烷基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基和-[(CR2)p]-R16；或R13和R14连同与它们结合的氮一起代表任选取代的4-8元杂环；
R16对于每次出现而言独立地选自氢、羟基、酰基氨基、-N(R18)COR19、-N(R18)C(O)OR19、-N(R18)SO2(R19)、-CON(R18)(R19)、-OC(O)N(R18)(R19)、-SO2N(R18)(R19)、-N(R18)(R19)、-OC(O)OR18、-COOR18、-C(O)N(OH)(R18)、-OS(O)2OR18、-S(O)2OR18、-OP(O)(OR18)(OR19)、-N(R18)P(O)(OR18)(OR19)和-P(O)(OR18)(OR19)；
p是1、2、3、4、5或6；
R18对于每次出现而言是独立地选自氢、烷基、芳基、环烷基、杂环烷基、芳烷基、杂芳基和杂芳烷基；
R19对于每次出现而言是独立地选自氢、烷基、芳基、环烷基、杂环烷基、芳烷基、杂芳基和杂芳烷基；或R18连同19一起代表任选地取代的4-8元环；
R20、R21、R22、R24、和R25对于每次出现而言独立地是烷基；
R23是烷基、-CH2OH、-CHO、-COOR18或-CH(OR18)2；
R26和R27对于每次出现而言独立地选自氢、烷基、芳基、环烷基、杂环烷基、芳烷基、杂芳基和杂芳烷基；
前提是当R1是羟基时，R2是氢，R6和R7一起形成双键，R20是甲基，R21是甲基，R22是甲基，R23是甲基，R24是甲基，R25是甲基，R26是氢，R27是氢，Q是键并且W是氧；R3和R4不都是氢，当一起时，也不代表未取代的氮杂环丁烷；并且
在式1的立体中心处的绝对立体化学可以是R或S或其混合物，并且双键的立体化学可以是E或Z或其混合物。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，前提是当R1是羟基时，R2是氢，R5是氢，R6和R7一起形成双键，R20是甲基，R21是甲基，R22是甲基，R23是甲基，R24是甲基，R25是甲基，R26是氢，R27是氢，Q是键并且W是氧；R3和R4不都是氢，当一起时，也不代表未取代的氮杂环丁烷。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中R20、R21、R22、R23、R24和R25是甲基；R26是氢，Q是键；并且W是氧。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中所述的药学上可接受酸具有在水中约-10和约7之间的pKa。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中所述的药学上可接受酸具有在水中约-10和约4之间的pKa。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中所述的药学上可接受酸具有在水中约-10和约1之间的pKa。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中所述的药学上可接受酸具有在水中约-10和约-3之间的pKa。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，X-选自氯化物、溴化物、碘化物、H2PO4 -、HSO4 -、甲基磺酸盐、苯基磺酸盐、对甲苯磺酸盐、三氟甲基磺酸盐、10-樟脑磺酸盐、萘-1-磺酸-5-磺酸盐、乙烷-1-磺酸-2-磺酸盐、环已氨基磺酸盐、硫氰酸盐、萘-2-磺酸盐和草酸盐。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中R1是羟基或-OC(O)R8。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中R2是氢。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中R3和R4独立地是氢、烷基、链烯基、炔基、环烷基、芳烷基、杂芳烷基或-[(CR2)p]-R16。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中R5是氢或具有式1a：
Figure BDA00001882655701041
其中R17独立地选自氢、卤化物、羟基、烷氧基、芳氧基、酰氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、酰基氨基、芳烷基氨基、硝基、硫代酰基、甲酰胺、羧基、腈基、-COR18、-CO2R18、-N(R18)CO2R19、-OC(O)N(R18)(R19)、-N(R18)SO2R19、-N(R18)C(O)N(R18)(R19)和-CH2O-杂环基。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中R6和R7一起形成双键。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中R27是氢。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中R1是羟基或-OC(O)R8；并且R2是氢。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中R1是羟基或-OC(O)R8；R2是氢；并且R3和R4独立地是氢、烷基、链烯基、炔基、环烷基、芳烷基、杂芳烷基或(CR2)p]-R16。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中R1是羟基或-OC(O)R8；R2是氢；R3和R4独立地是氢、烷基、链烯基、炔基、环烷基、芳烷基、杂芳烷基，或-[(CR2)p]-R16；和R5是氢或具有式1a：
Figure BDA00001882655701051
其中R17独立地选自氢、卤化物、羟基、烷氧基、芳氧基、酰氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、酰基氨基、芳烷基氨基、硝基、硫代酰基、甲酰胺、羧基、腈基、-COR18、-CO2R18、-N(R18)CO2R19、-OC(O)N(R18)(R19)、-N(R18)SO2R19、-N(R18)C(O)N(R18)(R19)和-CH2O-杂环基。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中R1是羟基或-OC(O)R8；R2是氢；R3和R4独立地是氢、烷基、链烯基、炔基、环烷基、芳烷基、杂芳烷基，或-[(CR2)p]-R16；R5是氢或具有式1a：
Figure BDA00001882655701052
其中R17独立地选自氢、卤化物、羟基、烷氧基、芳氧基、酰氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、酰基氨基、芳烷基氨基、硝基、硫代酰基、甲酰胺、羧基、腈基、-COR18、-CO2R18、-N(R18)CO2R19、-OC(O)N(R18)(R19)、-N(R18)SO2R19、-N(R18)C(O)N(R18)(R19)和-CH2O-杂环基；并且R6和R7一起形成双键。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中R1是羟基或-OC(O)R8；R2是氢；R3和R4独立地是氢、烷基、链烯基、炔基、环烷基、芳烷基、杂芳烷基或-[(CR2)p]-R16；R5是氢或具有式1a：
Figure BDA00001882655701061
其中R17独立地选自氢、卤化物、羟基、烷氧基、芳氧基、酰氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、酰基氨基、芳烷基氨基、硝基、硫代酰基、甲酰胺、羧基、腈基、-COR18、-CO2R18、-N(R18)CO2R19、-OC(O)N(R18)(R19)、-N(R18)SO2R19、-N(R18)C(O)N(R18)(R19)和-CH2O-杂环基；并且R6和R7一起形成双键；并且R27是氢。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中R1是羟基或-OC(O)R8；R2是氢；R3和R4独立地是氢、烷基、链烯基、炔基、环烷基、芳烷基、杂芳烷基或-[(CR2)p]-R16；R5是氢或具有式1a：
Figure BDA00001882655701062
其中R17独立地选自氢、卤化物、羟基、烷氧基、芳氧基、酰氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、酰基氨基、芳烷基氨基、硝基、硫代酰基、甲酰胺、羧基、腈基、-COR18、-CO2R18、-N(R18)CO2R19、-OC(O)N(R18)(R19)、-N(R18)SO2R19、-N(R18)C(O)N(R18)(R19)和-CH2O-杂环基；并且R6和R7一起形成双键；R27是氢；并且X-选自氯化物、溴化物、碘化物、H2PO4 -、HSO4 -、甲基磺酸盐、苯基磺酸盐、对甲苯磺酸盐、三氟甲基磺酸盐、10-樟脑磺酸盐、萘-1-磺酸-5-磺酸盐、乙烷-1-磺酸-2-磺酸盐、环已氨基磺酸盐、硫氰酸盐、萘-2-磺酸盐和草酸盐。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中R1是羟基或-OC(O)R8；R2是氢；R3和R4独立地是氢、烷基、链烯基、炔基、环烷基、芳烷基、杂芳烷基或-[(CR2)p]-R16；R5是氢或具有式1a：
其中R17独立地选自氢、卤化物、羟基、烷氧基、芳氧基、酰氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、酰基氨基、芳烷基氨基、硝基、硫代酰基、甲酰胺、羧基、腈基、-COR18、-CO2R18、-N(R18)CO2R19、-OC(O)N(R18)(R19)、-N(R18)SO2R19、-N(R18)C(O)N(R18)(R19)和-CH2O-杂环基；并且R6和R7一起形成双键；R27是氢；并且X-选自氯化物和溴化物。
在一个实施方案中，本发明提供纯的和分离的具有如式2中所示的绝对立体化学的化合物：
Figure BDA00001882655701072
或游其离碱；
其中对于每次出现而言独立地：
X-选自氯化物、溴化物、碘化物、H2PO4 -、HSO4 -、甲基磺酸盐、苯基磺酸盐、对甲苯磺酸盐、三氟甲基磺酸盐、10-樟脑磺酸盐、萘-1-磺酸-5-磺酸盐、乙烷-1-磺酸-2-磺酸盐、环已烷氨基磺酸盐、硫氰酸盐、萘-2-磺酸盐和草酸盐。
R1是羟基或-OC(O)R8。
R3和R4是氢、烷基、链烯基、炔基、环烷基、芳烷基、杂芳烷基或-[(CR2)p]-R16；或R3连同R4一起代表任选地取代的4-8元杂环；
R5是氢或具有式1a：
Figure BDA00001882655701081
其中R17独立地选自氢、卤化物、羟基、烷氧基、芳氧基、酰氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、酰基氨基、芳烷基氨基、硝基、硫代酰基、甲酰胺、羧基、腈基、-COR18、-CO2R18、-N(R18)CO2R19、-OC(O)N(R18)(R19)、-N(R18)SO2R19、-N(R18)C(O)N(R18)(R19)和-CH2O-杂环基；
R6和7均是氢；或R6和R7一起形成键；
R8是氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、环烷基、杂环烷基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基或-[(CR2)p]-R16；
R16对于每次出现而言独立地选自氢、羟基、酰基氨基、-N(R18)COR19、-N(R18)C(O)OR19、-N(R18)SO2(R19)、-CON(R18)(R19)、-OC(O)N(R18)(R19)、-SO2N(R18)(R19)、-N(R18)(R19)、-OC(O)OR18、-COOR18、-C(O)N(OH)(R18)、-OS(O)2OR18、-S(O)2OR18、-OP(O)(OR18)(OR19)、-N(R18)P(O)(OR18)(OR19)和-P(O)(OR18)(OR19)；
p是1、2、3、4、5或6；
R18对于每次出现而言是独立地选自氢、烷基、芳基、环烷基、杂环烷基、芳烷基、杂芳基和杂芳烷基；
R19对于每次出现而言是独立地选自氢、烷基、芳基、环烷基、杂环烷基、芳烷基、杂芳基和杂芳烷基；或R18连同19一起代表任选地取代的4-8元环；
R27是氢、烷基、芳基、环烷基、杂环烷基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基；
前提是当R1是羟基时，R2是氢，R6和R7一起形成双键，R27是氢；R3和R4不都是氢，当一起时，也不代表未取代的氮杂环丁烷；并且
双键的立体化学可以是E或Z或其混合物。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，前提是当R1是羟基时，R5是氢，R6和R7一起形成双键，R27是氢；R3和R4不都是氢，当一起时，也不代表未取代的氮杂环丁烷。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中R1是羟基。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中R3是烯丙基。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中R3具有式9
Figure BDA00001882655701091
或其游离碱；
其中X1 -选自氯化物、溴化物、碘化物、H2PO4 -、HSO4 -、甲基磺酸盐、苯基磺酸盐、对甲苯磺酸盐、三氟甲基磺酸盐、10-樟脑磺酸盐、萘-1-磺酸-5-磺酸盐、乙烷-1-磺酸-2-磺酸盐、环已烷氨基磺酸盐、硫氰酸盐、萘-2-磺酸盐和草酸盐。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中R4是氢。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中R5是氢。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中R6和R7一起形成键。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中R27是氢。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中R1是羟基；R3是烯丙基；并且R4是氢。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中R1是羟基；R3具有式9
Figure BDA00001882655701101
或其游离碱；
其中X1 -选自氯化物、溴化物、碘化物、H2PO4 -、HSO4 -、甲基磺酸盐、苯基磺酸盐、对甲苯磺酸盐、三氟甲基磺酸盐、10-樟脑磺酸盐、萘-1-磺酸-5-磺酸盐、乙烷-1-磺酸-2-磺酸盐、环已烷氨基磺酸盐、硫氰酸盐、萘-2-磺酸盐和草酸盐；并且R4是氢。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中R1是羟基；R3是烯丙基；R4是氢；并且R5是氢。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中R1是羟基；R3具有式9
或其游离碱；
其中X1 -选自氯化物、溴化物、碘化物、H2PO4 -、HSO4 -、甲基磺酸盐、苯基磺酸盐、对甲苯磺酸、三氟甲基磺酸盐、10-樟脑磺酸盐、萘-1-磺酸-5-磺酸盐、乙烷-1-磺酸-2-磺酸盐、环已烷氨基磺酸盐、硫氰酸盐、萘-2-磺酸盐和草酸盐；R4是氢；并且R5是氢。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中R1是羟基；R3是烯丙基；R4是氢；R5是氢；并且R6和R7一起形成键。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中R1是羟基；R3具有式9
Figure BDA00001882655701103
或其游离碱；
其中X1 -选自氯化物、溴化物、碘化物、H2PO4 -、HSO4 -、甲基磺酸盐、苯基磺酸盐、对甲苯磺酸盐、三氟甲基磺酸盐和10-樟脑磺酸盐、萘-1-磺酸-5-磺酸盐、乙烷-1-磺酸-2-磺酸盐、环已烷氨基磺酸盐、硫氰酸盐、萘-2-磺酸盐和草酸盐；R4是氢；R5是氢；并且R6和R7一起形成键。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中R1是羟基；R3是烯丙基；R4是氢；R5是氢；并且R6和R7一起形成键；并且R27是氢。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中R1是羟基；R3具有式9
Figure BDA00001882655701112
或其游离碱；
其中X1 -选自氯化物、溴化物、碘化物、H2PO4 -、HSO4 -、甲基磺酸盐、苯基磺酸盐、对甲苯磺酸盐、三氟甲基磺酸盐、10-樟脑磺酸盐、萘-1-磺酸-5-磺酸盐、乙烷-1-磺酸-2-磺酸盐、环已烷氨基磺酸盐、硫氰酸盐、萘-2-磺酸盐和草酸盐；R4是氢；R5是氢；R6和R7一起形成键；并且R27是氢。
在一个实施方案中，本发明提供纯的和分离的具有如式3中所示的绝对立体化学的化合物：
其中X-选自氯化物、溴化物、碘化物、H2PO4 -、HSO4 -、甲基磺酸盐、苯基磺酸盐、对甲苯磺酸盐、三氟甲基磺酸盐和10-樟脑磺酸盐、萘-1-磺酸-5-磺酸盐、乙烷-1-磺酸-2-磺酸盐、环已烷氨基磺酸盐、硫氰酸盐、萘-2-磺酸盐和草酸盐。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中X-是氯化物。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中X-是溴化物。
在一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，其包含前述任一种化合物和氨基酸的复合物。
在某些实施方案中，本发明涉及前述组合物和相随的定义，其中所述氨基酸选自：
在一个实施方案中，本发明提供式4化合物：
Figure BDA00001882655701122
或其药学上可接受的盐；
其中对于每次出现而言独立地：
W是氧或硫；
Z是氧或硫；
Q是氧、NR、N(酰基)或键；
n是等于0、1或2；
m是等于0、1或2；
X和Y独立地是C(R30)2；其中R30对于每次出现而言独立地选自氢、烷基、环烷基、杂环烷基、芳烷基、杂芳基和杂芳烷基；或-[(CR2)p]-R16；
R对于每次出现而言独立地选自氢、烷基、环烷基、杂环烷基、芳烷基、杂芳基和杂芳烷基；
R1是羟基、烷氧基、-OC(O)R8、-OC(O)OR9、-OC(O)NR10R11、-OSO2R12、-OC(O)NHSO2NR13R14、N R13R14或卤化物；并且R2是氢、烷基或芳烷基；或者R1和R2与它们结合的碳一起代表-(C=O)-、-(C=N-OR)-、-(C=N-NHR)-或-(C=N-R)-；
R3各自独立地选自氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、环烷基、杂环烷基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基和-[(CR2)p]-R16；
R4选自H、烷基、芳烷基和具有式4a的基团：
Figure BDA00001882655701131
其中R17独立地选自氢、卤化物、羟基、烷氧基、芳氧基、酰氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、酰基氨基、芳烷基氨基、硝基、硫代酰基、甲酰胺、羧基、腈基、-COR18、-CO2R18、-N(R18)CO2R19、-OC(O)N(R18)(R19)、-N(R18)SO2R19、-N(R18)C(O)N(R18)(R19)和-CH2O-杂环基；
R5和6均是氢；或R5和R6一起形成键；
R8是氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、环烷基、杂环烷基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基或-[(CR2)p]-R16；
R9是烷基、链烯基、炔基、芳基、环烷基、杂环烷基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基或-[(CR2)p]-R16；
R10和R11各自独立地选自氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、环烷基、杂环烷基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基和-[(CR2)p]-R16；或R10和R11连同与它们结合的氮一起代表任选地取代的4-8元杂环；
R12是烷基、链烯基、炔基、芳基、环烷基、杂环烷基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基或-[(CR2)p]-R16；
R13和R14各自独立地选自氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、环烷基、杂环烷基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基和-[(CR2)p]-R16；或R13和R14连同与它们结合的氮一起代表任选取代的4-8元杂环；
R16对于每次出现而言独立地选自氢、羟基、酰基氨基、-N(R18)COR19、-N(R18)C(O)OR19、-N(R18)SO2(R19)、-CON(R18)(R19)、-OC(O)N(R18)(R19)、-SO2N(R18)(R19)、-N(R18)(R19)、-OC(O)OR18、-COOR18、-C(O)N(OH)(R18)、-OS(O)2OR18、-S(O)2OR18、-OP(O)(OR18)(OR19)、-N(R18)P(O)(OR18)(OR19)和-P(O)(OR18)(OR19)；
p是1、2、3、4、5或6；
R18对于每次出现而言是独立地选自氢、烷基、芳基、环烷基、杂环烷基、芳烷基、杂芳基和杂芳烷基；
R19对于每次出现而言是独立地选自氢、烷基、芳基、环烷基、杂环烷基、芳烷基、杂芳基和杂芳烷基；或R18连同R19一起代表任选地取代的4-8元环；
R20、R21、R22、R24、和R25对于每次出现而言独立地是烷基；
R23是烷基、-CH2OH、-CHO、-COOR18或-CH(OR18)2；
R26和R27对于每次出现而言独立地选自氢、烷基、芳基、环烷基、杂环烷基、芳烷基、杂芳基和杂芳烷基；并且
在式4的立体中心处的绝对立体化学可以是R或S或其混合物，并且双键的立体化学可以是E或Z或其混合物。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中R20、R21、R22、R23、R24和R25是甲基；R26是氢，Q是键；并且Z和W是氧。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中R1是羟基或-OC(O)R8。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中R2是氢。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中R3是氢、烷基、链烯基、环烷基、芳烷基、杂芳烷基或-[(CR2)p]-R16。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中R4是氢或具有式1a：
Figure BDA00001882655701151
其中R17独立地选自氢、卤化物、羟基、烷氧基、芳氧基、酰氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、酰基氨基、芳烷基氨基、硝基、硫代酰基、甲酰胺、羧基、腈基、-COR18、-CO2R18、-N(R18)CO2R19、-OC(O)N(R18)(R19)、-N(R18)SO2R19、-N(R18)C(O)N(R18)(R19)和-CH2O-杂环基。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中R5和R6一起形成键。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中X和Y是-CH2-。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中n等于0；并且m等于0或1。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中R1是羟基或-OC(O)R8；并且R2是氢。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中R1是羟基或-OC(O)R8；R2是氢；并且R3是氢、烷基、链烯基、环烷基、芳烷基、杂芳烷基或(CR2)p]-R16。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中R1是羟基或-OC(O)R8；R2是氢；R3是氢、烷基、链烯基、环烷基、芳烷基、杂芳烷基，或-[(CR2)p]-R16；和R4是氢或具有式1a：
Figure BDA00001882655701161
其中R17独立地选自氢、卤化物、羟基、烷氧基、芳氧基、酰氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、酰基氨基、芳烷基氨基、硝基、硫代酰基、甲酰胺、羧基、腈基、-COR18、-CO2R18、-N(R18)CO2R19、-OC(O)N(R18)(R19)、-N(R18)SO2R19、-N(R18)C(O)N(R18)(R19)和-CH2O-杂环基。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中R1是羟基或-OC(O)R8；R2是氢；R3是氢、烷基、链烯基、环烷基、芳烷基、杂芳烷基或-[(CR2)p]-R16；R4是氢或具有式1a：
Figure BDA00001882655701162
其中R17独立地选自氢、卤化物、羟基、烷氧基、芳氧基、酰氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、酰基氨基、芳烷基氨基、硝基、硫代酰基、甲酰胺、羧基、腈基、-COR18、-CO2R18、-N(R18)CO2R19、-OC(O)N(R18)(R19)、-N(R18)SO2R19、-N(R18)C(O)N(R18)(R19)和-CH2O-杂环基；并且R5和R6一起形成键。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中R1是羟基或-OC(O)R8；R2是氢；R3是氢、烷基、链烯基、环烷基、芳烷基、杂芳烷基或-[(CR2)p]-R16；R4是氢或具有式1a：
Figure BDA00001882655701163
其中R17独立地选自氢、卤化物、羟基、烷氧基、芳氧基、酰氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、酰基氨基、芳烷基氨基、硝基、硫代酰基、甲酰胺、羧基、腈基、-COR18、-CO2R18、-N(R18)CO2R19、-OC(O)N(R18)(R19)、-N(R18)SO2R19、-N(R18)C(O)N(R18)(R19)和-CH2O-杂环基；R5和R6一起形成键；并且X和Y是-CH2-。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中R1是羟基或-OC(O)R8；R2是氢；R3是氢、烷基、链烯基、环烷基、芳烷基、杂芳烷基或-[(CR2)p]-R16；R4是氢或具有式1a：
Figure BDA00001882655701171
其中R17独立地选自氢、卤化物、羟基、烷氧基、芳氧基、酰氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、酰基氨基、芳烷基氨基、硝基、硫代酰基、甲酰胺、羧基、腈基、-COR18、-CO2R18、-N(R18)CO2R19、-OC(O)N(R18)(R19)、-N(R18)SO2R19、-N(R18)C(O)N(R18)(R19)和-CH2O-杂环基；R5和R6一起形成键；X和Y是-CH2-；n等于0；并且m等于0或1。
在一个实施方案中，本发明提供具有如式5中所示的绝对立体化学的化合物：
其中对于每次出现而言独立地：
n是等于0、1或2；
m是等于0、1或2；
X和Y独立地是C(R30)2；其中R30对于每次出现而言独立地选自氢、烷基、环烷基、杂环烷基、芳烷基、杂芳基和杂芳烷基；或-[(CR2)p]-R16；
R1是羟基或-OC(O)R8。
R3是氢、烷基、链烯基、炔基、环烷基、芳烷基、杂芳烷基或-[(CR2)p]-R16；
R5和6均是氢；或R5和R6一起形成键；
R8是氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、环烷基、杂环烷基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基或-[(CR2)p]-R16；
R16对于每次出现而言独立地选自氢、羟基、酰基氨基、-N(R18)COR19、-N(R18)C(O)OR19、-N(R18)SO2(R19)、-CON(R18)(R19)、-OC(O)N(R18)(R19)、-SO2N(R18)(R19)、-N(R18)(R19)、-OC(O)OR18、-COOR18、-C(O)N(OH)(R18)、-OS(O)2OR18、-S(O)2OR18、-OP(O)(OR18)(OR19)、-N(R18)P(O)(OR18)(OR19)和-P(O)(OR18)(OR19)；
p是1、2、3、4、5或6；
R18对于每次出现而言是独立地选自氢、烷基、芳基、环烷基、杂环烷基、芳烷基、杂芳基和杂芳烷基；
R19对于每次出现而言是独立地选自氢、烷基、芳基、环烷基、杂环烷基、芳烷基、杂芳基和杂芳烷基；或R18连同19一起代表任选地取代的4-8元环；
R27是氢、烷基、芳基、环烷基、杂环烷基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基；并且
双键的立体化学可以是E或Z或其混合物。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中R1是羟基。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中R3是烯丙基。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中R5和R6一起形成键。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中R27是氢。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中X和Y是-CH2-。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中n等于0；并且m等于0或1。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中R1是羟基；并且R3是烯丙基。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中R1是羟基；R3是烯丙基；并且R5和R6一起形成键。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中R1是羟基；R3是烯丙基；R5和R6一起形成键；并且R27是氢。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中R1是羟基；R3是烯丙基；R5和R6一起形成键；R27是氢；并且X和Y是-CH2-。
在某些实施方案中，本发明涉及前述化合物和相随的定义，其中R1是羟基；R3是烯丙基；R5和R6一起形成键；R27是氢；并且X和Y是-CH2-；n等于0；并且m等于0或1。
在一个实施方案中，本发明提供选自以下的化合物：
Figure BDA00001882655701191
上文以及以下部分中所述的实施方案包括格尔德霉素家族分子的氢醌类似物。除17-AAG(17-烯丙基氨基-18,21-二氢-17-去甲氧基格尔德霉素)的还原形式之外，本发明的其他化合物还涉及18,21-二氢-格尔德霉素家族，其包括，但不限于17-氨基-4,5-二氢-17-去甲氧基-格尔德霉素；17-甲基氨基-4,5-二氢-17-去甲氧基格尔德霉素；17-环丙基氨基-4,5-二氢-17-去甲氧基格尔德霉素；17-(2'-羟基乙氨基)-4,5-二氢-17-去甲氧基格尔德霉素；17-(2-甲氧基乙氨基)-4,5-二氢-17-去甲氧基格尔德霉素；17-(2'-氟乙氨基)-4,5-二氢-17-去甲氧基格尔德霉素；17-(S)-(+)-2-羟丙基氨基-4,5-二氢-17-去甲氧基格尔德霉素；17-氮杂环丁烷-1-基-4,5-二氢-17-去甲氧基格尔德霉素；17-(3-羟基氮杂环丁烷-1-基)-4,5-二氢-17-去甲氧基格尔德霉素；17-氮杂环丁烷-1-基-4,5-二氢-11-α-氟-17-去甲氧基格尔德霉素；17-(2'-氰基乙氨基)-17-去甲氧基格尔德霉素；17-(2'-氟乙氨基)-17-去甲氧基格尔德霉素；17-氨基-22-(2'-甲氧基苯甲酰甲基)-17-去甲氧基格尔德霉素；17-氨基-22-(3'-甲氧基苯甲酰甲基)-17-去甲氧基格尔德霉素；17-氨基-22-(4'-氯苯甲酰甲基)-17-去甲氧基格尔德霉素；17-氨基-22-(3',4'-二氯苯甲酰甲基)-17-去甲氧基格尔德霉素；17-氨基-22-(4'-氨基-3'-碘苯甲酰甲基)-17-去甲氧基格尔德霉素；17-氨基-22-(4'-叠氮-3'-碘苯甲酰甲基)-17-去甲氧基格尔德霉素；17-氨基-11-α-氟-17-去甲氧基格尔德霉素；17-烯丙基氨基-11-α-氟-17-去甲氧基格尔德霉素；17-炔丙基氨基-11-α-氟-17-去甲氧基格尔德霉素；17-(2'-氟乙氨基)-11-α-氟-17-去甲氧基格尔德霉素；17-氮杂环丁烷-1-基-11-(4'-叠氮苯基)氨磺酰羰基-17-去甲氧基格尔德霉素；17-(2'-氟乙氨基)-11-酮-17-去甲氧基格尔德霉素；17-氮杂环丁烷-1-基-11-酮-17-去甲氧基格尔德霉素；和17-(3'-羟基氮杂环丁烷-1-基)-11-酮-17-去甲氧基格尔德霉素的18,21-二氢类似物。
本领域技术人员将理解本文所概述的方法学可以随任何氨基取代的苯醌安莎霉素使用。
本发明的组合物作为还原型安莎霉素的盐存在，例如HCl盐或H2SO4盐。在另一个实施方案中，该化合物与另一种盐(如氨基酸，例如甘氨酸)共结晶。通常，在这些实施方案中，氨基酸与安莎霉素的比率可以变动，但是经常是2:1至1:2氨基酸:安莎霉素。
【2.IPI-493】
IPI-493的组合物、合成方法、施用方法等可以在PCT申请WO2008/073424中找到，所述文献的完整内容通过引用方式并入。
在一些实施方案中，提供用于口服施用的药物组合，其包含结晶抑制剂和式1化合物：
Figure BDA00001882655701211
或其药学上可接受的盐；
其中；
R1是H、-OR8、-SR8-N(R8)(R9)、-N(R8)C(O)R9、-N(R8)C(O)OR9、-N(R8)C(O)N(R8)(R9)、-OC(O)R8、-OC(O)OR8、-OS(O)2R8、-OS(O)2OR8、-OP(O)2OR8、CN或羰基部分；
R2和R3的每一个独立地是H、烷基、链烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基、-C(=O)CH3或-[(C(R10)2)p]-R11；或者R2和R3连同与它们结合的氮一起代表任选取代的3-8元杂环，所述杂环含有1-3个选自O、N、S和P的杂原子；
对于每次出现而言，p独立地是0、1、2、3、4、5或6；
R4是H、烷基、链烯基或芳烷基；
R5和R6各自是氢；或R5和R6一起形成键；
R7是氢、烷基、链烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基或-[(C(R10)2)p]-R11；
对于每次出现而言，R8和R9的每一个独立地是H、烷基、链烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基或-[(C(R10)2)p]-R11；或者R8和R9一起代表任选取代的3-8元杂环，所述杂环含有1-3个选自O、N、S和P的杂原子；
R10对于每次出现而言独立地是H、烷基、链烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基；和
R11对于每次出现而言独立地是H、环烷基、芳基、杂芳基、杂环基、-OR8、-SR8、-N(R8)(R9)、-N(R8)C(O)R9、-N(R8)C(O)OR9、-N(R8)C(O)N(R8)(R9)、-OC(O)R8、-OC(O)OR8、-OS(O)2R8、-OS(O)2OR8、-OP(O)2OR8、-C(O)R8、-C(O)2R8、-C(O)N(R8)(R9)、卤化物或CN。
在一些实施方案中，R1是OH，R4是H，并且R5和R6一起形成键。
在一些实施方案中，提供用于口服施用的药物组合物，其包含结晶抑制剂和式1化合物：
Figure BDA00001882655701221
在某些实施方案中，提供用于口服施用的药物组合物，其包含结晶抑制剂和式1化合物：
Figure BDA00001882655701222
或其药学上可接受的盐；
其中；
R1是-OR8、-C(=O)CH3或羰基部分；
R2和R3的每一个独立地是H、烷基、链烯基或-[(C(R10)2)p]-R11；或者R2和R3连同与它们结合的氮一起代表任选取代的3-8元杂环，所述杂环含有1-3个选自O、N、S和P的杂原子；
对于每次出现而言，p独立地是0、1或2；
R4是H；
R5和R6各自是H；或R5和R6一起形成键；
R7是氢或[(C(R10)2)p]-R11；
R8和R9的每一个独立地是H；或者R8和R9一起代表任选取代的3-8元杂环，所述杂环含有1-3个选自O、N、S和P杂原子；
R10对于每次出现而言独立地是H；并且
R11对于每次出现而言独立地是H、-N(R8)(R9)或卤化物。
苯醌安莎霉素化合物的例子包括具有以下结构的那些：
Figure BDA00001882655701231
Figure BDA00001882655701241
在一些实施方案中，本文所提供的含有非晶性17-AG的组合物产生令人惊讶的研究结果：相对于晶状17-AG而言生物利用率提高，甚至当没有使用结晶抑制剂时也是如此；此类组合物因此用于施用，如口服施用。
在一些前述实施方案中，该化合物是以基本上非晶的形式存在。
类似地，在一些实施方案中，基于组合物的总重量，该组合物含有至少约10%、至少约25%、至少约50%、至少约75%(w/w)的量的结晶抑制剂。
在一些前述实施方案中，结晶抑制剂是PVP。在一些前述实施方案中，17-AG是基本上非晶的。
在某些实施方案中，药物组合物可以是膏剂、溶液、浆液剂、油膏剂剂、乳剂或分散剂的形式。在某些实施方案中，药物组合物是或包含分子分散剂。
在某些实施方案中，结晶抑制剂可以选自聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(包括聚乙烯吡咯烷酮的均聚物和共聚物以及N-乙烯基吡咯烷酮的均聚物或共聚物)；交联聚维酮；树胶类；纤维素衍生物(包括羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基甲基纤维素酞酸酯、羟丙基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠及其他)；葡聚糖；阿拉伯胶；乙烯基内酰胺的均聚物和共聚物及其混合物；环糊精；明胶；羟丙甲纤维素酞酸酯；糖；多元醇；聚乙二醇(PEG)；聚氧化乙烯；聚氧乙烯衍生物；聚乙烯醇；丙二醇衍生物等、SLS、Tween、Eudragit；及其组合。结晶抑制剂可以是水可溶性的或水不溶性的。
如例如在水中以2%(W/W)所测量，HPMC在纤维素主链的链长度方面变化并且因此它们的粘度变化。在本文提供的药物组合物中使用的HPMC可以具有在水(以2%w/w浓度))中约100至约100,000cP、约1000至约15,000cP(例如约4000cP)的粘度。在某些实施方案中，在本文提供的药物组合物中使用的HPMC的分子量可以具有大于约10,000、但是不大于约1,500,000、不大于约1,000,000、不大于约500,000或不大于约150,000cP。
HPMC也在被甲氧基和羟丙基取代的纤维素主链上的可用羟基的相对程度方面变化。随着羟丙基取代增加，所得到的HPMC变得在性质上更亲水。在某些实施方案中，HPMC具有约15%至约35%、约19%至约32%，或约22%至约30%甲氧基取代，并具有约3%至约15%、约4%至约12%，或约7%至约12%羟丙基取代。
可以在所述药物组合物中使用的HPMC示例性地以DowChemical Co.的商标名MethocelTM和Shin-Etsu Chemical Co.的商标名MetoloseTM可获得。具有中等粘度的合适HPMC的例子包括MethocelTME4M和MethocelTMK4M，二者均具有在水中2%(w/w)时约4000cP的粘度。具有更高粘度的HPMC的例子包括MethocelTME10M、MethocelTMK15M和MethocelTMK100M，它们分别具有在水中2%(w/w)时约10,000cP、15,000cP和100,000cP的粘度。HPMC的例子是HPMC-乙酸酯琥珀酸酯，即HPMC-AS。
在某些实施方案中，在本文提供的药物组合物中使用的PVP具有约2,500至约3,000,000道尔顿、约8,000至约1,000,000道尔顿、约10,000至约400,000道尔顿、约10,000至约300,000道尔顿、约10,000至约200,000道尔顿、约10,000至约100,000道尔顿、约10,000至约80,000道尔顿、约10,000至约70,000道尔顿、约10,000至约60,000道尔顿、约10,000至约50,000道尔顿或约20,000至约50,000道尔顿的分子量。在某些情况下，在本文提供的药物组合物中使用的PVP具有在20℃于水中10%时约1.3至约700、约1.5至约300或约3.5至约8.5mPas的动态粘度。
当使用PEG时，它们可以具有约5,000-20,000道尔顿、约5,000-15,000道尔顿或约5,000-10,000道尔顿的平均分子量。
另外，本文中提供了用于口服递送的药物组合物，其包含17-AG和至少一种药学上可接受的赋形剂，其中所述药物组合物基本上不含晶状17-AG。在某些情况下，这种药物组合物中的17-AG包含少于约15%(w/w)、少于约10%(w/w)、少于约5%(w/w)、少于约3%(w/w)或少于约1%(w/w)的晶状17-AG。可以将这种药物组合物配制为固体剂型(例如，片剂或胶囊)、膏剂、乳剂、浆液或油膏剂。
另外，本文中提供了用于口服递送的药物组合物，其包含17-AAG和至少一种药学上可接受的赋形剂，其中所述药物组合物基本上不含晶状17-AAG。在某些情况下，这种药物组合物中的17-AAG包含少于约15%(w/w)、少于约10%(w/w)、少于约5%(w/w)、少于约3%(w/w)或少于约1%(w/w)的晶状17-AAG。可以将这种药物组合物配制为固体剂型(例如，片剂或胶囊)、膏剂、乳剂、浆液或油膏剂。
如上文所述，本发明的苯醌安莎霉素和药物组合物可以根据常规的药物复合技术另外包含药学上可接受的载体和赋形剂以形成药物组合物或剂型。合适的药学上可接受载体和赋形剂包括，但不限于在Remington's,The Science and Practice of Pharmacy,(Gennaro,A.R.编著,第19版,1995,Mack Pub.Co.)中描述的那些，所述文献通过引用方式并入本文。短语“药学上可接受的”指当施用至动物如哺乳动物(例如，人)时是生理上可耐受的并且一般不产生过敏性或类似不利反应如胃部不适、头晕等的添加剂或组合物。对于口服液体药物组合物，药用载体和赋形剂可以包括，但不限于水、乙二醇、油、醇、调味剂、防腐剂、着色剂等。口服的固体药物组合物可以包括，但不限于淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、造粒剂、润滑剂、粘合剂和崩解剂。药物组合物和剂型也可以包括如上文讨论的苯醌安莎霉素化合物或其固体形式。
本文所述的固体形式可以用于制造适于口服施用的药物组合物。此类药物组合物可以含有本文所述的苯醌安莎霉素化合物的任一种，例如，非晶性形式和无结晶抑制剂或非晶性形式与结晶抑制剂组合的苯醌安莎霉素化合物。此类苯醌安莎霉素的例子在Schnur等,J.Med.Chem.1995,38：3806-12中描述。
【X.治疗方法】
可选地或与本文所述的方法组合时，本发明的特征在于一种用单独或组合(例如与一种或多种mTOR抑制剂；ALK抑制剂；酪氨酸激酶抑制剂和/或其他化疗剂组合)的一种或多种HSP90抑制剂治疗癌症或肿瘤的方法，其中所述癌症或肿瘤携带本文所述的致瘤性改变，例如，如本文所述的一个或多个ALK、MAPK途径(例如，K-Ras)和/或EGFR改变。所述方法包括将HSP抑制剂(例如，如本文所述的一种或多种HSP90抑制剂)单独或与mTOR抑制剂、ALK抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂和/或与其他化疗剂组合时以一定量施用至受试者，所述的量足以在所述受试者中减少或抑制肿瘤细胞生长和/或治疗或预防所述癌症。
“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”和这个单词的其他形式指施用单独或与第二药剂组合的HSP90抑制剂以阻碍癌生长，以造成癌以重量或体积计收缩，以延长受试者的预期存活时间和或肿瘤的至进展的时间等。在那些受试者中，治疗可以包括，但不限于抑制肿瘤生长、减少肿瘤质量、减少转移性病灶的大小或数目、抑制新的转移性病灶形成、延长生存期、延长无进展生存期、延长至进展的时间和/或增强生活质量。
如本文所用，除非另外说明，术语“预防”、“防止”和“阻止”意指在受试者开始遭受癌症的再生长之前出现的和/或抑制或减少癌症严重性的作用。
如本文所用并且除非另外说明，术语“控制”、“处置”和“处理”包括防止癌症在已经罹患癌症的患者中复发和/或延长已经罹患癌症的患者仍处于消退状态的时间。该术语包括调节癌的阈值、形成和/或持续期或改变患者对癌症的响应的方式。
如本文所用并且除非另外说明，化合物的“治疗有效量”是足以在治疗或处置癌症时提供治疗益处或足以延迟或最小化与该癌症相关的一种或多种症状的量。化合物的治疗有效量意指单独或与其他治疗剂组合的治疗剂的在治疗或处置癌症时提供治疗益处的量。术语“治疗有效量”可以包括改善总体治疗、减少或避免癌症的症状或病因或增强另一种治疗剂的治疗功效的量。
如本文所用并且除非另外说明，化合物的“预防有效量”是足以防止癌症再生长、或与该癌症相关的一种或多种症状、或防止其复发的量。化合物的预防有效量意指单独或与其他治疗剂组合的该化合物的在预防癌症时提供预防益处的量。术语“预防有效量”可以包括改善总体预防或增强另一种预防剂的预防功效的量。
如本文所用，术语“患者”或“受试者’指将成为或已经作为治疗、观察和/或实验的目标的动物，一般是人(即，任何年龄组的男性或女性，例如儿科患者(例如，婴儿、儿童、青少年))或成人患者(例如，年轻成人、中年成人或老年成人)或其他哺乳动物，如灵长类(例如，食蟹猴、猕猴)；有商业相关的哺乳动物如牛、猪、马、绵羊、山羊、猫和/或犬；和/或鸟类，包括有商业相关的鸟类如鸡、鸭、鹅和/或火鸡。当本术语与化合物或药物的施用联合使用时，则患者已经作为所述化合物或药物的治疗、观察和/或施用的目标。
在一些实施方案中，HSP90抑制剂是用于癌症的第一线治疗，即，它用于事先未曾施用过意在治疗该癌症的另一种药物的患者中。
在其他实施方案中，HSP90抑制剂是用于癌症的第二线治疗，即，它用于事先已经施用过意在治疗该癌症的另一种药物的患者中。
在其他实施方案中，HSP90抑制剂是用于癌症的第三线或第四线治疗，即，它用于事先已经施用过意在治疗该癌症的两种或三种其他药物的患者中。
在一些实施方案中，将HSP90抑制剂在手术切除/移除所述癌之后施用至患者。
在一些实施方案中，将HSP90抑制剂在辐射治疗所述癌症之前、期间或之后施用至患者。
在一个实施方案中，所评价和/或治疗的癌症具有在ALK基因或基因产物例如，ALK重排中的一种或多种改变。
在另一个实施方案中，所评价和/或治疗的癌症具有在MAPK途径(例如，K-Ras)基因或基因产物中的一种或多种改变。MAPK途径活化已经在多种癌症中检测到。例如，已经在癌症中检测到Ras和Raf突变，所述癌症包括，但不限于：
(i)膀胱癌(H-Ras突变：Malone等,Br.J.Urol.(1985)57:664-667,Fujita等,Gastroenterology(1987)6:1339-1345,VisVanathan等,Oncogene Res.(1988)3:77-86)；
(ii)脑癌(C-Raf突变：LaRocca等,J.Neurosci.Res.(1989)24:97-106；Fukui等,MMol.Cell.Biol.(1987)7:1776-1781)、
(iii)乳腺癌(C-Raf突变：Callans等,Ann.Surg.Oncol.(1995)2:38-42；McFarlin等,Carcinogenesis(2003)24:1149-1153；Ras突变：Miyakis等,Biochem Biophys Res Commun.(1998)251:609-612(K-Ras),Spandidos等,Anticancer Res.(1987)7:991-996(H-Ras))；
(iv)胆管癌(胆管癌中的B-Raf突变：Tannapfel等,Gut(2003)52:706-712；K-Ras突变：Hidaka等,Cancer Res.(2000)60:522-524,Laghi等,Oncogene(200221:4301-4306)；
(v)宫颈癌(H-Ras突变：Riou等,Oncogene(1988)3:329-333)；
(vi)结直肠癌(B-raf突变：Rajagopalan等,Nature(2002)418:934；B-Raf和K-Ras突变：Yuen等,Cancer Res.(2002)62:6451-6455；K-Ras突变：Vogelstein等,N.Engl.J.Med.(1988)319:525-532,Bos等,Nature(London)(1987)327:293-297,Forrester等,Nature(London)(1987)327:298-303,Farr等,Oncogene(1988)3:673-678)；
(vii)子宫内膜癌(K-Ras突变：Lagarda等,J.Pathol.(2001)193-199)；
(viii)食管癌(Barrett腺癌中的B-raf突变：Sommerer等,Oncogene(2004)23:554-558)；
(ix)室管膜瘤(C-Raf突变：Korshunov等,Am.J.Pathol.(2003)163:1721-1727)；
(x)白血病(AML中的B-raf突变：Lee等,Leukemia(2004)18:170-172；AML中的N-Ras突变：Needleman等,Blood(1986)67:753-757,Bos等,Blood(1987)69:1237-1241,Janssen等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1987)84:9228-9232,Toksoz等,Oncogene(1987)1:409-413,Farr等,Proc.Natl.Adac.Sci.USA(1988)1629-1633,Senn等,Int.J.Cancer(1988)41:59-64,Bos等,Nature(London)(1985)315:726-730,Bartram等,Leukemia(Baltimore)(1989)3:247-256,Hirai等,Biochim.Biophys.Res.Commun.(1987)147:108-114；CML中的N-Ras突变：Liu等Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85:1952-1956)；
(xi)淋巴瘤(NHL中的B-raf突变：Lee等,Br.J.Cancer(2003)89:1958-1960；NHL中的C-Raf突变：Storm等,Toxicol.Letters(1993)67:201-210)；
(xii)肝癌(C-Raf突变：Ting等,Xue.Za.Zhi.(1988)21:141-150；Jenke等,Xenobiotica(1994)24:569-580；Beer等,CancerRes.(1988)48:1610-1617；N-Ras突变：Gu等,J.Cell.Physiol.Suppl.(1986)4:13-20)；
(xiii)肺癌(NSCLC中的B-raf和K-Ras突变：Brose等,Cancer Res.(2002)62:6997-7000；NSCLC中的C-Raf突变：Kerkhoff等,Cell Growth Differ.(2000)11:185-190；SCLC中的C-Raf突变：Graziano等,Chromosomes Cancer(1991)3:283-293；K-Ras突变：Rodenhuis等,Cancer Res.(1988)48:5738-5741),
(xiv)头颈癌(B-raf突变：Cohen等,Surgery(2002)132:960-967；Weber等,Oncogene(2003)22:4757-4759；C-Raf突变：Patel等,Mol.Carcinog.(1997)18:1-6；Riva等,Eur.J.Cancer.B.Oral.Oncol.(1995)31B:384-391)；
(xv)肾癌(肾细胞癌中的C-Raf突变：Oka等,Cancer Res.(1995)55:4182-4187；H-Ras突变：Fujita等,Cancer Res.(1988)48:5251-5255)；
(xvi)胃癌(B-raf和K-Ras突变：Lee等,Oncogene(2003)22:6942-6945)；
(xvii)多发性骨髓瘤(N-Ras突变：Kalakonda等,Blood(2001)98:1555-1560)；
(xviii)骨髓增殖性疾病(特发性骨髓纤维化(IMF)中的N-Ras突变：Buschle等,Leukemia(Baltimore)(1988)2:658-660；CML中的N-Ras突变：Liu等Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85:1952-1956)；
(xix)骨髓增生异常综合征(N-Ras和/或K-Ras突变：Yunis等,Oncogene(1988)4:609-614,Hirai等,Nature(London)(1987)327:430-432,Paudua等,Leukemia(Baltimore)(1988)2:503-510,Lyons等,Blood(1988)71:1707-1712)；
(xx)卵巢癌(B-raf和K-Ras突变：Singer等,J.Natl.Cancer Inst.(2003)95:484-486；Gemignani等,Gynecol.Oncol.(2003)90:378-381),K-Ras 3'UTR变体:Ratner,E.等(2010)CancerRes.70(16):OF1-7；
(xxi)骨肉瘤(C-Raf突变：Ikeda等,Jpn.J.Cancer Res.(1989)80:6-9)；
(xxii)胰腺癌(C-Raf突变：Berger等,J.Surg.Res.(1997)69:199-204；K-Ras突变：Almoquera等,Cell(1988)53:549-554,Smith等,Nucleic Acids Res.(1988)16:7773-7782,Grunewald等,Int.J.Cancer(1989)43:1037-1041,Laghi等,Oncogene(200221:4301-4306)；
(xxiii)唾液腺癌(H-Ras突变：Yoo等,Arch Pathol Lab Med(2000)124:836-839)
(xxiv)皮肤癌(黑色素瘤中的B-raf突变：Davies等,Nature(2002)417:949-954；Pollock等,Cancer Cell(2002)2:5-7；黑色素瘤中B-raf和K-ras突变：Brose等,Cancer Res.(2002)62:6997-7000；角化棘皮瘤中的H-Ras突变：Leon等,Mol.Cell.Biol.(1988)8:786-793；黑色素瘤中的N-Ras突变：Van'tVeer等,Mol.Cell.Biol.(1989)9:3114-3116)；
(xxv)软组织肉瘤(C-Raf突变：Mitsunobu等,Oncogene(1989)4:437-442)；和
(xxvi)甲状腺癌(B-raf突变：Nikiforova等,J.Clin.Endocrinol.Metab.(2003)88:5399-5404；Kimura等,Cancer Res.(2003)63:1454-1457；Cohen等,J.Natl.CancerInst.(2003)95:625-627；C-Raf突变：Carson等,Cancer Res.(1995)555:2048-2052；H-Ras,K-Ras和N-Ras突变：Lemoine等,Cancer Res.(1988)48:4459-4463；Lemoine等,Oncogene(1989)4:159-164)。
在某些实施方案中，由本发明的方法鉴定或治疗的癌症或肿瘤包括，但不限于实体肿瘤、软组织肿瘤和转移性病灶(例如，如本文所述的癌症)。在一些实施方案中，所鉴定和/或治疗的癌症或肿瘤携带在选自以下的基因或基因产物中的一种或多种改变：ALK、RAS(例如，H-Ras、N-Ras或K-Ras中的一种或多种)、EGFR、PIK3CA、RAF(例如，A-Raf、B-Raf(BRAF)或C-Raf中的一种或多种)、PTEN、AKT、TP53(p53)、CTNNB1(β-连环蛋白)、APC、KIT、JAK2、NOTCH、FLT3、MEK、ERK、RSK、ETS、ELK-1或SAP-1中的一种或多种。
可以使用本文公开的方法治疗的增生性病症和癌症包括，例如肺癌(包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、肺系统的其他癌症、髓母细胞瘤和其他脑癌、胰腺癌、基底细胞癌、乳腺癌、前列腺癌和其他泌尿生殖系统癌、胃肠间质肿瘤(GIST)和其胃肠道的其他癌症、结肠癌、结直肠癌、卵巢癌和造血系统的癌症。
在某些实施方案中，癌症选自以下一种或多种：肺癌(例如，小细胞肺癌、非小细胞肺癌、SCC、肺腺癌、支气管癌)、膀胱癌、成神经细胞瘤、乳腺癌、结直肠癌、结肠癌、炎性肌成纤维细胞肿瘤、多发性骨髓瘤、白血病(例如，急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性粒细胞性白血病(AML)、慢性粒细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL))、淋巴瘤(例如，间变性大细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL))、胰腺癌(例如，胰腺腺癌、胰腺导管内乳头状黏液肿瘤(IPMN))、前列腺癌、髓母细胞瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、卵巢癌(例如，囊性腺癌、卵巢胚胎性癌、卵巢腺癌)、头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、脑癌(例如，脑膜瘤；胶质瘤、例如，星形细胞瘤、少突神经胶质瘤；髓母细胞瘤)、肾癌、肝癌、胃癌(例如，胃腺癌)、胃肠间质肿瘤(GIST)、皮肤癌(例如，鳞状细胞癌(SCC)、角化棘皮瘤(KA)、黑色素瘤、基底细胞癌)和神经内分泌癌。
在一个实施方案中，治疗的癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)(例如，复发和/或难治性NSCLC)或SCC。
在某些实施方案中，癌症是结直肠癌(例如，结直肠腺癌)。
在某些实施方案中，癌症是乳腺癌(例如，乳房的腺癌、乳房的乳头状癌、乳腺癌、乳房的髓样癌)。
在某些实施方案中，癌症是多发性骨髓瘤。
在某些实施方案中，癌症是神经内分泌癌(例如，胃肠胰神经内分泌肿瘤(GEP-NET)、类癌肿瘤)。
在某些实施方案中，癌症是肺癌。在某些实施方案中，肺癌是小细胞肺癌(SCLC)。在某些实施方案中，肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)。就2009年而言，非小细胞肺癌占所有肺癌的大约85%。每年诊断大约262,000个IIIB/IV期病例。在2009年，NSCLC患者%分布如下：大约18%的患者罹患大细胞癌，47%的患者罹患腺癌，并且35%的患者罹患鳞状细胞癌。就吸烟状态而言，大约70%的患者是具有大于15包年的吸烟者，13%的患者是具有小于或等于15包年的吸烟者，15%的患者是不吸烟者；并且2%的患者具有二手吸烟史。
其他示例性癌症包括、但不限于听神经瘤、腺癌、肾上腺癌症、血管肉瘤(例如，淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、血管肉瘤)、良性单克隆γ球蛋白病、胆管癌(例如，胆管癌)、支气管癌、宫颈癌(例如，宫颈的腺癌)、绒毛膜癌、脊索瘤、颅咽管瘤、上皮癌、室管膜瘤、内皮肉瘤(例如，Kaposi肉瘤、多发特发出血性肉瘤)、子宫内膜癌、食管癌(例如，食管腺癌、Barrett腺癌)、尤文氏肉瘤、家族性嗜伊红细胞增多症、重链疾病(例如，α链疾病、γ链疾病、mu链疾病)、血管母细胞瘤、炎性肌成纤维细胞肿瘤、免疫细胞淀粉样变性、肾癌(例如，肾母细胞瘤(又名Wilms瘤)、肾细胞癌)、肝癌(例如，肝细胞癌(HCC)、恶性肝瘤)、滤泡淋巴瘤、弥散大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL))、平滑肌肉瘤(LMS)、肥大细胞增多症(例如，系统性肥大细胞增多症)、多发性骨髓瘤(MM)、骨髓增生异常综合征(MDS)、间皮瘤、骨髓增殖性病症(MPD)(例如，真性红细胞增多症(PV)、特发性血小板增多症(ET)、原因不明性髓样化生(AMM)(又名骨髓纤维化(MF))、慢性特发性骨髓纤维化、高嗜酸粒细胞综合征(HES))、成神经细胞瘤、神经纤维瘤病(例如，1型或2型神经纤维瘤病(NF)、神经鞘瘤病)、骨肉瘤、口腔癌(例如，口腔鳞状细胞癌(OSCC))、外阴Paget病、阴茎Paget病、乳头状腺癌、松果体瘤、原始神经外胚层肿瘤(PNT)、前列腺癌(例如，前列腺腺癌)、横纹肌肉瘤、视网膜母细胞瘤、唾液腺癌、小肠癌症(例如，阑尾癌)、软组织肉瘤(例如，恶性纤维组织细胞瘤(MFH)、脂肪肉瘤、恶性周围神经鞘肿瘤(MPNST)、软骨肉瘤、纤维肉瘤、粘液肉瘤)、皮脂腺癌、汗腺癌、滑膜瘤、睾丸癌(例如，精细胞瘤、睾丸胚胎性癌)、甲状腺癌(例如，甲状腺乳头状癌、乳头状甲状腺癌(PTC)、髓样甲状腺癌)和巨球蛋白血症。
神经内分泌癌(也称作胃肠胰肿瘤或胃肠胰神经内分泌癌)是从内分泌(激素)系统和神经系统之间界面处的细胞衍生的癌。大部分神经内分泌癌归属两个类别：类癌和胰腺内分泌肿瘤(也称作内分泌胰腺肿瘤或小岛细胞肿瘤)。除这两个主要类别之外，存在其他形式的神经内分泌癌，包括神经内分泌肺肿瘤，它们源自呼吸系统而非胃肠胰系统。神经内分泌癌可能源自内分泌腺，如肾上腺髓质、垂体和副甲状腺以及甲状腺或胰腺内部的内分泌小岛和呼吸道及胃肠道中的散在内分泌细胞。神经内分泌癌在美国的总发病率是每年约9,000个新病例。
例如，治疗的癌症可以是神经内分泌癌，其选自胰腺、肺、阑尾、十二指肠、回肠、直肠或小肠的神经内分泌癌中的一种或多种。在其他实施方案中，神经内分泌癌选自以下一项或多项：胰腺内分泌肿瘤；神经内分泌肺肿瘤；或来自肾上腺髓质、垂体、副甲状腺、甲状腺内分泌小岛、胰腺内分泌小岛或呼吸道或胃肠道中的散在内分泌细胞的神经内分泌癌。
胰腺内分泌肿瘤可以分泌可在受试者中导致多种症状的生物学活性肽(例如，激素)。此类肿瘤称作功能性或分泌性肿瘤。功能性肿瘤可以按照分泌最强烈的激素分类。功能性胰腺内分泌肿瘤的例子包括胃泌素瘤(产生过多胃泌素并且导致Zollinger-Ellison综合征)、胰岛素瘤(产生过多胰岛素)、胰高血糖素瘤(产生过多胰高血糖素)、血管活性肠肽瘤(VIP瘤，产生过多血管活性肠肽)、PP瘤(产生过多胰腺多肽)、生长抑素瘤(产生过多生长抑素，引起水样腹泻低血钾-胃酸缺乏(WDHA))、CRH瘤(产生过多促肾上腺皮质激素释放激素)、降血钙素瘤(产生过多降钙素)、GHRH瘤(产生过多生长激素释放激素)、神经调压素瘤(产生过多神经调压素)、ACTH瘤(产生过多促肾上腺皮质激素)、GRF瘤(产生过多生长激素释放因子)和副甲状腺激素相关肽肿瘤。在一些情况下，胰腺内分泌肿瘤可以在罹患1型多发性内分泌瘤病(MEN1)的受试者中出现；此类肿瘤经常出现于垂体或胰岛细胞中。不分泌肽(例如，激素)的胰腺内分泌肿瘤称作非功能性(或无分泌性或非功能性)肿瘤。
在某些实施方案中，治疗的癌症是类癌肿瘤，例如类癌神经内分泌癌。类癌肿瘤倾向于比胰腺内分泌肿瘤生长得更缓慢。类癌肿瘤可以产生生物活性分子如血清素，所述血清素是一种引起特定症状群(称作类癌综合征)的生物源分子。产生生物活性分子的类癌肿瘤经常称作功能性类癌肿瘤，而不产生生物活性分子的类癌肿瘤称作非功能性类癌肿瘤。在一些实施方案中，神经内分泌癌是一种功能性类癌肿瘤(例如，可以产生生物活性分子如血清素的类癌肿瘤)。在其他实施方案中，神经内分泌癌是一种非功能性类癌肿瘤。在某些实施方案中，类癌肿瘤是来自胸腺、胃、小肠(十二指肠、空肠、回肠)、大肠(盲肠、结肠)的肿瘤、直肠、胰腺、阑尾、卵巢或睾丸类癌。
类癌肿瘤可以根据起源点如肺、胸腺、胃、小肠(十二指肠、空肠、回肠)、大肠(盲肠、结肠)、直肠、胰腺、阑尾、卵巢和睾丸进一步分类。
在一些实施方案中，神经内分泌癌是类癌肿瘤。在其他实施方案中，神经内分泌癌是胰腺内分泌肿瘤。仍在其他实施方案中，神经内分泌癌是神经内分泌肺肿瘤。在某些实施方案中，神经内分泌癌源自肾上腺髓质、垂体、副甲状腺、甲状腺内分泌小岛、胰腺内分泌小岛或呼吸道或胃肠道中的散在内分泌细胞。
可以治疗的神经内分泌癌的其他实例包括，但不限于甲状腺的髓样癌、Merkel细胞癌(小梁性癌)、小细胞肺癌(SCLC)、大细胞神经内分泌癌(肺的)、肺外小细胞癌(ESCC或EPSCC)、子宫颈的神经内分泌癌、1型多发性内分泌瘤病(MEN-1或MEN1)、2型多发性内分泌瘤病(MEN-2或MEN2)、1型神经纤维瘤病、结节性硬化、vonHippel-Lindau(VHL)病、成神经细胞瘤、肾上腺嗜铬细胞瘤(phaeochromocytoma)、副神经节瘤、垂体前叶的神经内分泌癌和/或Carney综合征。
在另外的其他实施方案中，评价和/或治疗的癌症或肿瘤是恶性血液病，例如，含有BCR-ABL融合基因的恶性肿瘤(Ph+如慢性骨髓性白血病(CML)和急性淋巴细胞性白血病(ALL)；含有Flt3突变或内部串联重复的恶性肿瘤(Flt3，如急性骨髓性白血病(AML)；含有JAK2突变的恶性肿瘤(JAK2+，如真性红细胞增多症、特发性血小板减少和骨髓纤维化(MF)。在一个实施方案中，罹患恶性血液病的受试者用IPI-493以每周约100-200mg(例如，100、125、150、175或200mg)的剂量治疗。在治疗后的受试者中评价的参数包括降低的血液计数和骨髓恢复而无原始细胞。在其他实施方案中，用IPI-493治疗的受试者罹患实体肿瘤。在此类受试者中，IPI-493以约100-200mg(例如，100、125、150、175或200mg)的剂量每周施用2次。
本发明还涉及了通过施用治疗有效量的HSP90抑制剂至癌症患者在该患者中延长无复发生存期的方法，其中所述癌症患者正在经历或已经历过癌症疗法(例如，用化疗剂(包括小分子和生物治疗药，例如抗体)治疗、放射疗法、手术、RNAi疗法和/或反义疗法)。如本领域技术人员所理解，“无复发生存期”是癌症治疗的特定时间点后的时间长度，在此期间不存在癌症的临床定义的复发。在一些实施方案中，HSP90抑制剂与癌症疗法同时施用。在同时施用的情况下，HSP90抑制剂可以在癌症疗法已经停止后继续施用。在其他实施方案中，在癌症疗法已经停止后，施用HSP90抑制剂(即，无癌症治疗的重叠阶段)。HSP90抑制剂可以在癌症疗法已经停止后立即施用，或可以在癌症疗法结束和施用HSP90抑制剂之间存在时间间隔(例如，至多到约1日、1周、1个月、6个月或1年)。用HSP90抑制剂治疗可以继续进行，只要无复发生存期得以维持(例如，至多到约1日、1周、1个月、6个月、1年、2年、3年、4年、5年或更长)。
在一个方面，本发明涉及通过在癌症疗法已经停止后施用治疗有效量的HSP90抑制剂至癌症患者来在该患者中延长无复发生存期的方法，其中所述癌症患者事先已经历过癌症疗法(例如，用化疗剂(包括小分子和生物治疗药，例如抗体)治疗、放射疗法、手术、RNAi疗法和/或反义疗法)。HSP90抑制剂可以在癌症疗法已经停止后立即施用，或可以在癌症疗法结束和施用HSP90抑制剂之间存在时间间隔(例如，至多到约1日、1周、1个月、6个月或1年)。
本发明的某些方法可能在治疗下述癌症方面是特别有效的，所述癌症对现存的化疗法响应良好，但是遭遇高复发率。在这些情况下，用HSP90抑制剂治疗可以增加患者的无复发生存时间或生存率。此类癌症的实例包括肺癌(例如，小细胞肺癌或非小细胞肺癌)、胰腺癌、膀胱癌症、卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、多发性骨髓瘤、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)和神经内分泌癌。
本发明也包括化疗剂和HSP90抑制剂用于制备一种或多种药物的用途，所述药物用于延长癌症患者中无复发生存期的方法中。本发明也涉及HSP90抑制剂在制备药物中的用途，所述药物用于延长事先已经用化疗剂进行治疗的癌症患者中无复发生存期的方法中。
【联合疗法】
可以理解，如上文和本文中所述的HSP90抑制剂可以与一种或多种另外疗法例如放射疗法、手术组合和/或与一种或多种治疗剂组合施用以治疗本文所述的癌症。
“组合”不意在暗示所述疗法或治疗剂必须同时施用和/或为一起递送而配制，不过这些递送方法处于本发明的范围内。药物组合物可以与一种或多种其他另外的疗法或治疗剂同时、在其之前或在其后施用。通常，每种药剂将按针对该药剂确定的剂量和/或时间表施用。将进一步理解，在这种组合中所用的另外治疗剂可以在单一组合物中一起施用或在不同组合物中分别施用。在某方案中采用的特定组合将考虑本发明药物组合物与另外的治疗活性物质的相容性和/或待实现的所需治疗效果。
通常，预期组合使用的另外治疗剂应当以这样的水平使用，所述水平不超过这些另外治疗剂单独使用时的水平。在一些实施方案中，组合使用的水平将低于单独使用的那些水平。
在某些实施方案中，通过本文所述方法治疗的癌症可以选自例如髓母细胞瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、胰腺癌、肺癌(例如，小细胞肺癌(SCLC)或非小细胞肺癌(NSCLC))、结直肠癌、卵巢癌、头与颈鳞状细胞癌(HNSCC)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、多发性骨髓瘤和前列腺癌。
与HSP90抑制剂组合使用以治疗小细胞肺癌的合适治疗剂的实例包括但不限于化疗剂，例如依托泊苷、卡铂、顺铂、依立替康、托泊替康、吉西他滨、脂质体SN-38、苯达莫司汀、替莫唑胺、贝洛替康、NK012、FR901228、黄酮吡多)；酪氨酸激酶抑制剂(例如，EGFR抑制剂(例如，厄洛替尼、吉非替尼、西妥昔单抗、帕尼单抗)；多激酶抑制剂(例如，索拉非尼、舒尼替尼)；VEGF抑制剂(例如，贝伐单抗、凡德他尼)；癌疫苗(例如，GVAX)；Bcl-2抑制剂(例如，奥利美生钠、ABT-263)；蛋白酶体抑制剂(例如，硼替佐米(Velcade)、NPI-0052)、紫杉醇或紫杉醇药剂；多西他赛；IGF-1受体抑制剂(例如，AMG479)；HGF/SF抑制剂(例如，AMG102、MK-0646)；氯喹；Aurora激酶抑制剂(例如，MLN8237)；放射免疫疗法(例如，TF2)；HSP90抑制剂(例如，IPI-493、IPI-504、坦螺旋霉素、STA-9090)；mTOR抑制剂(例如，依维莫司)；Ep-CAM-/CD3-双特异性抗体(例如，MT110)；CK-2抑制剂(例如，CX-4945)；HDAC抑制剂(例如，贝林司他)；SMO拮抗剂(例如，BMS833923)；癌肽疫苗和放射疗法(例如，强度调节放射疗法(IMRT)、低分割放射疗法、缺氧-引导的放疗法)、手术及其组合。
与HSP90抑制剂组合使用以治疗非小细胞肺癌的合适治疗药的实例包括但不限于化疗剂，例如长春瑞滨、顺铂、多西他赛、培美曲塞二钠、依托泊苷、吉西他滨、卡铂、脂质体的SN-38、TLK286、替莫唑胺、托泊替康、培美曲塞二钠、阿扎胞苷、依立替康、替加氟-吉莫斯特-吉美嘧啶-氧嗪酸钾、沙帕他滨(sapacitabine))；酪氨酸激酶抑制剂(例如，EGFR抑制剂(例如，厄洛替尼、吉非替尼、西妥昔单抗、帕尼单抗、奈昔木单抗、PF-00299804、尼妥珠单抗、RO5083945)、MET抑制剂(例如，PF-02341066、ARQ197)；PI3K激酶抑制剂(例如，XL147、GDC-0941)；Raf/MEK双激酶抑制剂(例如，RO5126766)、PI3K/mTOR双激酶抑制剂(例如，XL765)；SRC抑制剂(例如，达沙替尼)；双重抑制剂(例如，BIBW2992、GSK1363089、ZD6474、AZD0530、AG-013736、拉帕替尼、MEHD7945A、linifanib)；多激酶抑制剂(例如，索拉非尼、舒尼替尼、帕唑帕尼、AMG706、XL184、MGCD265、BMS-690514、R935788)、VEGF抑制剂(例如，恩度(endostar)、内皮他丁、贝伐单抗、西地尼布、BIBF1120、阿昔替尼、tivozanib、AZD2171)；癌症疫苗(例如，BLP25脂质体疫苗、GVAX、表达L523S蛋白的重组DNA和腺病毒)；Bcl-2抑制剂(例如，奥利美生钠)；蛋白酶体抑制剂(例如，硼替佐米、卡非佐米、NPI-0052、MLN9708)；紫杉醇或紫杉醇药物；多西他赛；IGF-1受体抑制剂(例如，西妥木单抗、MK-0646、OSI906、CP-751、871、BIIB022)；羟氯喹；HSP90抑制剂(例如，IPI-493、IPI-504、坦螺旋霉素、STA-9090、AUY922、XL888)、mTOR抑制剂(例如，依维莫司、坦罗莫司、地磷莫司)；Ep-CAM-/CD3-双特异性抗体(例如，MT110)；CK-2抑制剂(例如，CX-4945)；HDAC抑制剂(例如，MS275、LBH589、伏力诺他(vorinostat)、丙戊酸、FR901228)；DHFR抑制剂(例如，普拉曲沙)；维甲酸类(例如，贝沙罗汀、维甲酸)；抗体-药物缀合物(例如，SGN-15)；二膦酸盐(例如，唑来膦酸)；癌症疫苗(例如，belagenpumatucel-L)；低分子量肝素(LMWH)(例如，亭扎肝素、依诺肝素)；GSK1572932A；褪黑激素；乳铁蛋白；地美司钠；拓扑异构酶抑制剂(例如，氨柔比星、依托泊苷、karenitecin)；奈芬纳韦；西仑吉肽；ErbB3抑制剂(例如，MM-121、U3-1287)；存活素抑制剂(例如，YM155、LY2181308)；甲磺酸艾利布林；COX-2抑制剂(例如，塞来昔布)；聚乙二醇化非格司亭；Polo样激酶1抑制剂(例如，BI6727)；TRAIL受体2(TR-2)激动剂(例如，CS-1008)、CNGRC肽-TNFα缀合物；二氯乙酸盐(DCA)；HGF抑制剂(例如，SCH900105)、SAR240550；PPAR-γ激动剂(例如，CS-7017)；γ-分泌酶抑制剂(例如，RO4929097)；表观遗传学疗法(例如，5-阿扎胞苷)；硝酸甘油、MEK抑制剂(例如，AZD6244)；细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(例如，UCN-01)；胆固醇-Fus1；抗微管蛋白剂(例如，E7389)；法呢基-OH-转移酶抑制剂(例如，lonafarnib)；免疫毒素(例如，BB-10901、SS1(dsFv)PE38)；磺达肝素；血管阻断剂(例如，AVE8062)；PD-L1抑制剂(例如，MDX-1105、MDX-1106)；β-葡聚糖；NGR-hTNF；EMD521873；MEK抑制剂(例如，GSK1120212)；埃坡霉素类似物(例如，伊沙匹隆)；驱动蛋白-纺锤体抑制剂(例如，4SC-205)；端粒靶向剂(例如，KML-001)；P70途径抑制剂(例如，LY2584702)；AKT抑制剂(例如，MK-2206)；血管生成抑制剂(例如，来那度胺)；Notch信号转导抑制剂(例如，OMP-21M18)；放射疗法；手术及其组合。
与HSP90抑制剂组合使用以治疗结直肠癌的合适治疗剂的实例包括但不限于5-氟尿嘧啶(5FU-TS抑制剂)；依立替康(TopoI毒剂)；奥沙利铂(DNA加合物)、爱必妥(Erbitux)和维克替比(Vectabix)(针对EGFR的单克隆抗体)、FOLFOX：5-氟尿嘧啶+甲酰四氢叶酸+奥沙利铂；FOLFIRI：5-氟尿嘧啶+甲酰四氢叶酸+伊立替康，及其组合。
与HSP90抑制剂组合使用以治疗髓母细胞瘤的合适治疗剂的实例包括但不限于化疗剂(例如，罗莫司汀、顺铂、卡铂、长春新碱和环磷酰胺)、放射疗法、手术及其组合。
与HSP90抑制剂组合使用以治疗软骨肉瘤的合适治疗药的实例包括但不限于化疗剂(例如，曲贝替定)、放射疗法(例如，质子疗法)、手术及其组合。
与HSP90抑制剂组合使用以治疗骨肉瘤的合适治疗剂的实例包括但不限于化疗剂(例如，甲氨蝶呤(例如，单独或与甲酰四氢叶酸拯救组合)、顺铂、亚德里亚霉素、异环磷酰胺(例如，单独或与美司钠组合)、BCG(卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin）)、依托泊苷、胞壁酰三肽(MTP))、放射疗法、手术及其组合。
与HSP90抑制剂组合使用以治疗胰腺癌的合适治疗剂的实例包括但不限于化疗剂，例如，紫杉醇或紫杉醇药物(例如，紫杉醇制剂如TAXOL、白蛋白稳定化纳米粒子紫杉醇制剂(例如，ABRAXANE)或脂质体紫杉醇制剂)；吉西他滨(例如，单独或与AXP107-11组合的吉西他滨)；其他化疗剂如奥沙利铂、5-氟尿嘧啶、卡培他滨、鲁比替康、盐酸表柔比星、NC-6004、顺铂、多西他赛(例如，TAXOTERE)、丝裂霉素C、异环磷酰胺；干扰素；酪氨酸激酶抑制剂(例如，EGFR抑制剂(例如，厄洛替尼、帕尼单抗、西妥昔单抗、尼妥珠单抗)；HER2/neu受体抑制剂(例如，曲妥珠单抗)；双激酶抑制剂((例如，伯舒替尼、沙拉替尼、拉帕替尼、凡德他尼)；多激酶抑制剂(例如，索拉非尼、舒尼替尼、XL184、帕唑帕尼)；VEGF抑制剂(例如，贝伐单抗、AV-951、brivanib)；放射免疫疗法(例如，XR303)；癌疫苗(例如，GVAX、存活素肽)；COX-2抑制剂(例如，塞来昔布)；IGF-1受体抑制剂(例如，AMG479、MK-0646)；mTOR抑制剂(例如，依维莫司、坦罗莫司)；IL-6抑制剂(例如，CNTO328)；依赖细胞周期蛋白的激酶抑制剂(例如，P276-00、UCN-01)；改变的能量代谢(AEMD)引导的化合物(例如，CPI-613)；HDAC抑制剂(例如，伏力诺他(vorinostat))；试验受体2(TR-2)激动剂(例如，可那木单抗)；MEK抑制剂(例如，AS703026、司美替尼、GSK1120212)；Raf/MEK双激酶抑制剂((例如，RO5126766)；Notch信号转导抑制剂(例如，MK0752)；单克隆抗体-抗体融合蛋白(例如，L19IL2)；姜黄素；HSP90抑制剂(例如，IPI-493、IPI-504、坦螺旋霉素、STA-9090)；rIL-2；地尼白介素2；拓扑异构酶1抑制剂(例如，依立替康、PEP02)；抑制素(例如，辛伐他汀)；因子VIIa抑制剂(例如，PCI-27483)；AKT抑制剂(例如，RX-0201)；低氧活化的前药(例如，TH-302)；盐酸二甲双胍、γ-分泌酶抑制剂(例如，RO4929097)；核糖核苷酸还原酶抑制剂(例如，3-AP)；免疫毒素(例如，HuC242-DM4)；PARP抑制剂(例如，KU-0059436、veliparib)；CTLA-4抑制剂(例如，CP-675、206、伊匹木单抗)；AdV-tk疗法；蛋白酶体抑制剂(例如，硼替佐米(Velcade)、NPI-0052)；噻唑烷二酮(例如，吡格列酮)；NPC-1C；极光激酶抑制剂(例如，R763/AS703569)、CTGF抑制剂(例如，FG-3019)；siG12DLODER；和放射疗法(例如，断层放射治疗、立体定位照射、质子疗法)、手术及其组合。在某些实施方案中，紫杉醇或紫杉醇药剂和吉西他滨的组合可以与HSP90抑制剂一起使用。
与HSP90抑制剂组合使用以治疗卵巢癌的合适治疗剂的实例包括，但不限于化疗剂(例如，紫杉醇或紫杉醇药剂；多西他赛；卡铂；吉西他滨；多柔比星；托泊替康；顺铂；依立替康、TLK286、异环磷酰胺、奥拉帕利、奥沙利铂、美法仓、培美曲塞二钠、SJG-136、环磷酰胺、依托泊苷、地西他滨)；葛瑞林(ghrelin)拮抗剂(例如，AEZS-130)、免疫疗法(例如，APC8024、奥戈伏单抗、OPT-821)、酪氨酸激酶抑制剂(例如，EGFR抑制剂(例如，厄洛替尼)、双重抑制剂(例如，E7080)、多激酶抑制剂(例如，AZD0530、JI-101、索拉非尼、舒尼替尼、帕唑帕尼)、ON01910.Na)、VEGF抑制剂(例如，贝伐单抗、BIBF1120、西地尼布、AZD2171)、PDGFR抑制剂(例如，IMC-3G3)、紫杉醇、拓扑异构酶抑制剂(例如，karenitecin、依立替康)、HDAC抑制剂(例如，丙戊酸盐、伏力诺他(vorinostat))、叶酸盐受体抑制剂(例如，法利珠单抗)、血管生成素抑制剂(例如，AMG386)、埃坡霉素类似物(例如，伊沙匹隆)、蛋白酶体抑制剂(例如，卡非佐米)、IGF-1受体抑制剂(例如，OSI906、AMG479)、PARP抑制剂(例如，veliparib、AG014699、iniparib、MK-4827)、极光激酶抑制剂(例如，MLN8237、ENMD-2076)、管生成抑制剂(例如，来那度胺)、DHFR抑制剂(例如，普拉曲沙)、放射免疫治疗药(例如，Hu3S193)、抑制素(例如，洛伐他汀)、拓扑异构酶1抑制剂(例如，NKTR-102)、癌疫苗(例如，p53合成性长肽疫苗、自体OC-DC疫苗)、mTOR抑制剂(例如，坦罗莫司、依维莫司)、BCR/ABL抑制剂(例如，伊马替尼)、ET-A受体拮抗剂(例如，ZD4054)、TRAIL受体2(TR-2)激动剂(例如，CS-1008)、HGF/SF抑制剂(例如，AMG102)、EGEN-001、Polo样激酶1抑制剂(例如，BI6727)、γ-分泌酶抑制剂(例如，RO4929097)、Wee-1抑制剂(例如，MK-1775)、抗微管蛋白剂(例如，长春瑞滨、E7389)、免疫毒素(例如，地尼白介素2)、SB-485232、血管阻断剂(例如，AVE8062)、整联蛋白抑制剂(例如，EMD525797)、驱动蛋白-纺锤体抑制剂(例如，4SC-205)、来那度胺胶囊(revlimid)、HER2抑制剂(例如，MGAH22)、ErrB3抑制剂(例如，MM-121)、放射疗法；及其组合。
根据本发明与HSP90抑制剂组合使用以治疗慢性骨髓性白血病(AML)的合适治疗剂的实例包括，但不限于化疗剂(例如，阿糖胞苷、羟脲、氯法拉滨、美法仓、噻替派、氟达拉滨、白消安、依托泊苷、蛹虫草菌素、喷司他丁、卡培他滨、阿扎胞苷、环磷酰胺、克拉立滨、托泊替康)、酪氨酸激酶抑制剂(例如，BCR/ABL抑制剂(例如，伊马替尼、尼洛替尼)、ON01910.Na、双重抑制剂(例如，达沙替尼、波舒替尼)、多激酶抑制剂(例如，DCC-2036、ponatinib、索拉非尼、舒尼替尼、RGB-286638))、干扰素α、类固醇、凋亡剂(例如，美琥他辛)、免疫疗法(例如，同种异体CD4+记忆性Th1样T细胞/微粒结合的抗CD3/抗CD28、自体细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、AHN-12)、CD52靶向药物(例如，阿仑珠单抗)、HSP90抑制剂(例如，IPI-493、IPI-504、坦螺旋霉素、STA-9090、AUY922、XL888)、mTOR抑制剂(例如，依维莫司)、SMO拮抗剂(例如，BMS833923)、核糖核苷酸还原酶抑制剂(例如，3-AP)、JAK-2抑制剂(例如，INCB018424)、羟氯喹、维甲酸类(例如，芬维A胺)、依赖细胞周期蛋白的激酶抑制剂(例如，UCN-01)、HDAC抑制剂(例如，贝林司他、伏力诺他(vorinostat)、JNJ-26481585)、PARP抑制剂(例如，veliparib)、MDM2拮抗剂(例如，RO5045337)、Aurora B激酶抑制剂(例如，TAK-901)、放射免疫疗法(例如，锕-225标记的抗CD3抗体HuM195)、Hedgehog抑制剂(例如，PF-04449913)、STAT3抑制剂(例如，OPB-31121)、KB004、癌疫苗(例如，AG858)、骨髓移植、干细胞移植、放射疗法及其组合。
与HSP90抑制剂组合使用以治疗慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的合适治疗剂的实例包括，但不限于化疗剂(例如，氟达拉滨、环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、苯丁酸氮芥、苯达莫司汀、苯丁酸氮芥、白消安、吉西他滨、美法仓、喷司他丁、米托蒽醌、5-氮胞苷、培美曲塞二钠)、酪氨酸激酶抑制剂(例如，EGFR抑制剂(例如，厄洛替尼)、BTK抑制剂(例如，PCI-32765)、多激酶抑制剂(例如，MGCD265、RGB-286638)、CD-20靶向药物(例如，利妥昔单抗、ofatumumab、RO5072759、LFB-R603)、CD52靶向药物(例如，阿仑珠单抗)、泼尼松龙、达促红素α、来那度胺、Bcl-2抑制剂(例如，ABT-263)、免疫疗法(例如，同种异体CD4+记忆性Th1样T细胞/微粒结合的抗CD3/抗CD28、自体细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK))、HDAC抑制剂(例如，伏力诺他(vorinostat)、丙戊酸、LBH589、JNJ-26481585、AR-42)、XIAP抑制剂(例如，AEG35156)、CD-74靶向药物(例如，米拉珠单抗)、mTOR抑制剂(例如，依维莫司)、AT-101、免疫毒素(例如，CAT-8015、抗Tac(Fv)-PE38(LMB-2))、CD37靶向药物(例如，TRU-016)、放射免疫疗法(例如，131-托西莫单抗)、羟氯喹、哌立福新、SRC抑制剂(例如，达沙替尼)、沙立度胺、PI3Kδ抑制剂(例如，CAL-101)、维甲酸类(例如，芬维A胺)、MDM2拮抗剂(例如，RO5045337)、普乐沙福、极光(Aurora)激酶抑制剂(例如，MLN8237、TAK-901)、蛋白酶体抑制剂(例如，硼替佐米)、CD-19靶向药物(例如，MEDI-551、MOR208)、MEK抑制剂(例如，ABT-348)、JAK-2抑制剂(例如，INCB018424)、低氧活化的前药(例如，TH-302)、紫杉醇或紫杉醇药物、HSP90抑制剂、AKT抑制剂(例如，MK2206)、HMG-CoA抑制剂(例如，辛伐他汀)、GNKG186、放射疗法、骨髓移植、干细胞移植及其组合。
与HSP90抑制剂组合使用以治疗急性淋巴细胞性白血病(ALL)的合适治疗剂的实例包括，但不限于、化疗剂(例如，泼尼松龙、地塞米松、长春新碱、天冬酰胺酶、佐柔比星、环磷酰胺、阿糖胞苷、依托泊苷、硫鸟嘌呤、巯基嘌呤、氯法拉滨、脂质体安那霉素、白消安、依托泊苷、卡培他滨、地西他滨、阿扎胞苷、托泊替康、替莫唑胺)、酪氨酸激酶抑制剂(例如，BCR/ABL抑制剂(例如，伊马替尼、尼洛替尼)、ON01910.Na、多激酶抑制剂(例如，索拉非尼))、CD-20靶向药物(例如，利妥昔单抗)、CD52靶向药物(例如，阿仑珠单抗)、HSP90抑制剂(例如，STA-9090)、mTOR抑制剂(例如，依维莫司、雷帕霉素)、JAK-2抑制剂(例如，INCB018424)、HER2/neu受体抑制剂(例如，曲妥珠单抗)、蛋白酶体抑制剂(例如，硼替佐米)、甲氨蝶呤、天冬酰胺酶、CD-22靶向药物(例如，依帕珠单抗、伊珠单抗)、免疫疗法(例如，自体细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、AHN-12)、兰妥莫单抗、依赖细胞周期蛋白的激酶抑制剂(例如，UCN-01)、CD45靶向药物(例如，BC8)、MDM2拮抗剂(例如，RO5045337)、免疫毒素(例如，目录号、DT2219ARL)、HDAC抑制剂(例如，JNJ-26481585)、JVRS-100、紫杉醇或紫杉醇药物、STAT3抑制剂(例如，OPB-31121)、PARP抑制剂(例如，veliparib)、EZN-2285、放射疗法、类固醇、骨髓移植、干细胞移植或其组合。
与HSP90抑制剂组合使用以治疗急性髓样白血病(AML)的合适治疗剂的实例包括，但不限于化疗剂(例如，阿糖胞苷、佐柔比星、伊达比星、氯法拉滨、地西他滨、vosaroxin、阿扎胞苷、氯法拉滨、利巴韦林、CPX-351、曲奥舒凡、艾西拉滨、阿扎胞苷)、酪氨酸激酶抑制剂(例如，BCR/ABL抑制剂(例如，伊马替尼、尼洛替尼)、ON01910.Na、多激酶抑制剂(例如，米哚妥林、SU11248、quizartinib、索拉非尼(sorafinib))、免疫毒素(例如，吉姆单抗奥佐米星)、DT388IL3融合蛋白、HDAC抑制剂(例如，伏力诺他(vorinostat)、LBH589)、普乐沙福、mTOR抑制剂(例如，依维莫司)、SRC抑制剂(例如，达沙替尼)、HSP90抑制剂(例如，STA-9090)、维甲酸类(例如，贝沙罗汀、极光激酶抑制剂(例如，BI811283)、JAK-2抑制剂(例如，INCB018424)、Polo样激酶抑制剂(例如，BI6727)、塞那生、CD45靶向药物(例如，BC8)、依赖细胞周期蛋白的激酶抑制剂(例如，UCN-01)、MDM2拮抗剂(例如，RO5045337)、mTOR抑制剂(例如，依维莫司)、LY573636-钠、ZRx-101、MLN4924、来那度胺、免疫疗法(例如，AHN-12)、二盐酸组胺、放射疗法、骨髓移植、干细胞移植及其组合。
与HSP90抑制剂组合使用以治疗多发性骨髓瘤(MM)的合适治疗剂的实例包括，但不限于化疗剂(例如，美法仓、氨磷汀、环磷酰胺、多柔比星、氯法拉滨、苯达莫司汀、氟达拉滨、亚德里亚霉素、SyBL-0501)、沙立度胺、来那度胺、地塞米松、泼尼松、泊马度胺、蛋白酶体抑制剂(例如，硼替佐米、卡非佐米、MLN9708)、癌疫苗(例如，GVAX)、CD-40靶向药物(例如，SGN-40、CHIR-12.12)、哌立福新、唑来膦酸、免疫疗法(例如，MAGE-A3、NY-ESO-1、HuMax-CD38)、HDAC抑制剂(例如，伏力诺他(vorinostat)、LBH589、AR-42)、aplidin、依赖细胞周期蛋白的激酶抑制剂(例如，PD-0332991、dinaciclib)、三氧化二砷、CB3304、HSP90抑制剂(例如，KW-2478)、酪氨酸激酶抑制剂(例如，EGFR抑制剂(例如，西妥昔单抗)、多激酶抑制剂(例如，AT9283)、VEGF抑制剂(例如，贝伐单抗)、普乐沙福、MEK抑制剂(例如，AZD6244)、IPH2101、阿托伐他汀、免疫毒素(例如，BB-10901)、NPI-0052、放射免疫治疗药(例如，钇Y90替伊莫单抗)、STAT3抑制剂(例如，OPB-31121)、MLN4924、极光(Aurora)激酶抑制剂(例如，ENMD-2076)、IMGN901、ACE-041、CK-2抑制剂(例如，CX-4945)、放射疗法、骨髓移植、干细胞移植及其组合。
与HSP90抑制剂组合使用以治疗头颈癌的合适治疗剂的实例包括，但不限于化疗(例如，紫杉醇或紫杉醇药物、卡铂、多西他赛、氨磷汀、顺铂、奥沙利铂、多西他赛)、酪氨酸激酶抑制剂(例如，EGFR抑制剂(例如，厄洛替尼、吉非替尼、埃克替尼、西妥昔单抗、帕尼单抗、扎芦木单抗、尼妥珠单抗、奈昔木单抗、马妥珠单抗、西妥昔单抗)、双重抑制剂(例如，拉帕替尼、奈拉替尼、凡德他尼、BIBW2992、多激酶抑制剂(例如，XL-647))、VEGF抑制剂(例如，贝伐单抗)、呼肠孤病毒、放射疗法、手术及其组合。
与HSP90抑制剂组合使用以治疗前列腺癌的合适治疗剂的实例包括，但不限于化疗剂(例如，多西他赛、卡铂、氟达拉滨)、激素疗法(例如，氟他胺、比卡鲁胺、尼鲁米特、醋酸环丙特龙、酮康唑、氨鲁米特、阿巴瑞克、地加瑞克、亮丙瑞林、戈舍瑞林、曲普瑞林、布舍瑞林(buserelin))、酪氨酸激酶抑制剂(例如，双激酶抑制剂(例如，拉帕替尼)、多激酶抑制剂(例如，索拉非尼、舒尼替尼))、VEGF抑制剂(例如，贝伐单抗)、TAK-700、癌疫苗(例如，BPX-101、PEP223)、来那度胺、TOK-001、IGF-1受体抑制剂(例如，西妥木单抗)、TRC105、极光A激酶抑制剂(例如，MLN8237)、蛋白酶体抑制剂(例如，硼替佐米)、OGX-011、放射免疫疗法(例如，HuJ591-GS)、HDAC抑制剂(例如，丙戊酸、SB939、LBH589)、羟氯喹、mTOR抑制剂(例如，依维莫司)、乳酸度维替尼、二吲哚甲烷、依法韦仑、OGX-427、染料木黄酮、IMC-3G3、巴氟替尼、CP-675、206、放射疗法、手术或其组合。
在一些实施方案中，HSP90抑制剂与mTOR抑制剂组合施用。适于用于本发明中的mTOR抑制剂在众多参考文献中描述，包括但不限于：WO 94/02136(16-O-取代的衍生物)；美国专利号5,258,389(40-O-取代的衍生物)；WO 94/9010(O-芳基和O-烷基衍生物)；WO92/05179(羧酸酯)；美国专利号5,118,677和5,118,678(酰胺酯)；美国专利号5,118,678(氨基甲酸盐)；美国专利号5,100,883(氟化酯)；美国专利号5,151,413(乙缩醛类)；美国专利号5,120,842(甲硅烷基酯)；WO93,11130(亚甲基衍生物)；WO 94/02136(甲氧基衍生物)；WO 94/02385和WO 95/14023(链烯基衍生物)；美国专利号5,256,790(32-O-二氢或取代的衍生物)；EP 96/02441；美国2004/023562(碳水化合物衍生物)；美国专利号4,316,885(单酰化和二酰化衍生物)；美国专利号5,120,725(双环状衍生物)；美国专利号5,120,727(雷帕霉素二聚体)；EP 467606(雷帕霉素的27-肟)；美国专利号5,023,262(42-氧代类似物)；美国专利号5,177,203(芳基磺酸酯和氨基磺酸酯)；美国专利号5,177,203。此外，多种雷帕霉素前药已经在美国专利号4,650,803；5,672,605；5,583,189；5,527,906；5,457,111；5,995,100和6,146,658中描述。对于在治疗方法中使用，特别值得关注的是在Novartis拥有的专利(美国专利号5,665,772；5,912,253；5,985,890；5,912,253；6,200,985；6,384,046和6,440,990),Ariad(WO 96/41865)和Wyeth拥有的专利(美国专利号5,362,718；6,399,625；6,399,627；6,432,973；6,440,991；6,677,357和6,680,718)中描述的衍生物。示例性mTOR抑制剂包括但不限于雷帕霉素、坦罗莫司
Figure BDA00001882655701491
依维莫司(RAD001、
Figure BDA00001882655701492
)、地磷莫司、AP23573、AZD8055、BEZ235、BG T226、XL765、PF-4691502、GDC0980、SF1126、OSI-027、GSK1059615、KU-0063794、WYE-354、INK128、坦罗莫司(CCI-779)、Palomid 529(P529)、PF-04691502或PKI-587。在一个实施方案中，mTOR抑制剂抑制TORC1和TORC2。TORC1和TORC2双重抑制剂的例子包括例如OSI-027、XL765、Palomid 529和INK128。
在一些实施方案中，HSP90抑制剂与胰岛素样生长因子受体(IGF-1R)的抑制剂例如BMS-536924、GSK1904529A、AMG479、MK-0646、西妥木单抗、OSI906、figitumumab(CP-751,871)或BIIB022组合使用。
在一些实施方案中，HSP90抑制剂与酪氨酸激酶抑制剂(例如，受体酪氨酸激酶(RTK)抑制剂)组合使用。示例性酪氨酸激酶抑制剂包括，但不限于表皮生长因子(EGF)途径抑制剂(例如，表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂)、血管内皮生长因子(VEGF)途径抑制剂(例如，血管内皮生长因子受体(VEGFR)抑制剂(例如，VEGFR-1抑制剂、VEGFR-2抑制剂、VEGFR-3抑制剂))、血小板衍生生长因子(PDGF)途径抑制剂(例如，血小板衍生生长因子受体(PDGFR)抑制剂(例如，PDGFR-β抑制剂))、RAF-1抑制剂、KIT抑制剂和RET抑制剂。在一些实施方案中，与hedgehog抑制剂组合使用的抗癌药选自：阿昔替尼(AG013736)、伯舒替尼(SKI-606)、西地尼布(RECENTINTM、AZD2171)、达沙替尼(
Figure BDA00001882655701501
BMS-354825)、厄洛替尼
Figure BDA00001882655701502
吉非替尼
Figure BDA00001882655701503
伊马替尼(CGP57148B、STI-571)、拉帕替尼
Figure BDA00001882655701505
来妥替尼(CEP-701)、奈拉替尼(HKI-272)、尼洛替尼
Figure BDA00001882655701506
司马沙尼(semaxinib、SU5416)、舒尼替尼(马来酸舒尼替尼(Sutent)、SU11248)、托西尼布
Figure BDA00001882655701507
凡德他尼(ZD6474)、伐他拉尼(PTK787、PTK/ZK)、曲妥珠单抗(赫赛
Figure BDA00001882655701509
),贝伐单抗利妥昔单抗
Figure BDA000018826557015011
西妥昔单抗(爱必妥)、帕尼单抗(维克替比(Vectibix))、雷珠单抗
Figure BDA000018826557015012
尼洛替尼
Figure BDA000018826557015013
索拉非尼阿仑珠单抗
Figure BDA000018826557015015
吉姆单抗奥佐米星
Figure BDA000018826557015016
ENMD-2076、PCI-32765、AC220、乳酸度维替尼(TKI258、CHIR-258)、BIBW 2992(TOVOKTM)、SGX523、PF-04217903、PF-02341066、PF-299804、BMS-777607、ABT-869、MP470、BIBF 1120
Figure BDA000018826557015017
AP24534、JNJ-26483327、MGCD265、DCC-2036、BMS-690154、CEP-11981、tivozanib(AV-951)、OSI-930、MM-121、XL-184、XL-647、XL228、AEE788、AG-490、AST-6、BMS-599626、CUDC-101、PD153035、培利替尼(EKB-569)、凡德他尼(zactima)、WZ3146、WZ4002、WZ8040、ABT-869(linifanib)、AEE788、AP24534(ponatinib)、AV-951(tivozanib)、阿昔替尼、BAY 73-4506(瑞戈非尼)、丙氨酸布立尼布(BMS-582664)、brivanib(BMS-540215)、西地尼布(AZD2171)、CHIR-258(度维替尼)、CP 673451、CYC116、E7080、Ki8751、马赛替尼(AB1010)、MGCD-265、二磷酸莫替沙尼(AMG-706)、MP-470、OSI-930、盐酸帕唑帕尼、PD173074、甲苯磺酸索拉非尼(Bay 43-9006)、SU 5402、TSU-68(SU6668)、vatalanib、XL880(GSK1363089、EXEL-2880)。选择的酪氨酸激酶抑制剂选自舒尼替尼、厄洛替尼、吉非替尼或索拉非尼。在一个实施方案中，酪氨酸激酶抑制剂是舒尼替尼。
在一些实施方案中，HSP90抑制剂与folfirinox组合使用，所述folfirinox包含奥沙利铂85mg/m2和依立替康180mg/m2，外加甲酰四氢叶酸400mg/m2，随后在第1日大丸剂氟尿嘧啶(5-FU)400mg/m2，随后5-FU 2,400mg/m2作为46小时连续输注。
在一些实施方案中，HSP90抑制剂与PI3K抑制剂组合使用。在一个实施方案中，PI3K抑制剂是PI3K的δ和γ亚型的抑制剂。可以组合使用的示例性PI3K抑制剂在例如WO 2010/036380；WO2010/006086、WO 09/114870、WO 05/113556中描述。可以与药物组合物组合使用的另外PI3K抑制剂包括但不限于GSK 2126458、GDC-0980、GDC-0941、Sanofi XL147、XL756、XL147、PF-46915032、BKM 120、CAL-101、CAL 263、SF1126、PX-886和双重PI3K抑制剂(例如，Novartis BEZ235)。在一个实施方案中，PI3K抑制剂是异喹啉。在一个实施方案中，PI3K抑制剂是INK1197或其衍生物。在一个实施方案中，PI3K抑制剂是INK1117或其衍生物。
在一些实施方案中，HSP90抑制剂与BRAF抑制剂，例如GSK2118436、RG7204、PLX4032、GDC-0879、PLX4720和甲苯磺酸盐索拉非尼(Bay43-9006)组合施用。
在一些实施方案中，HSP90抑制剂与MEK抑制剂例如ARRY-142886、GSK1120212、RDEA436、RDEA119/BAY 869766、AS703026、AZD6244(司美替尼(selumetinib))、BIX 02188、BIX 02189、CI-1040(PD184352)、PD0325901、PD98059和U0126组合施用。
在一些实施方案中，HSP90抑制剂与JAK2抑制剂例如CEP-701、INCB18424、CP-690550(tasocitinib)组合施用。
在一些实施方案中，HSP90抑制剂与紫杉醇或紫杉醇药物例如
Figure BDA00001882655701511
蛋白质结合的紫杉醇(例如，
Figure BDA00001882655701512
)组合施用。如本文所用的“紫杉醇药物”指紫杉醇制剂(例如，TAXOL)或紫杉醇等同物(例如，紫杉醇的前药)。示例性紫杉醇等同物包括，但不限于纳米粒子白蛋白结合的紫杉醇(ABRAXANE，由Abraxis Bioscience销售)、二十二碳六烯酸结合的紫杉醇(DHA-紫杉醇，由Taxoprexin，Protarga销售)、聚谷氨酸结合的紫杉醇(PG-紫杉醇,聚谷氨酸紫杉醇,CT-2103,XYOTAX,由Cell Therapeutic销售)、肿瘤活化前药(TAP)、ANG105(与三个紫杉醇分子结合的Angiopep-2，由ImmunoGen销售)、紫杉醇EC-1(与erbB2识别肽EC-1结合的紫杉醇；见Li等,Biopolymers(2007)87:225-230)和葡萄糖缀合的紫杉醇(例如，2'-紫杉醇甲基2-吡喃葡糖基琥珀酸酯,见Liu等,Bioorganic & MedicinalChemistry Letters(2007)17:617-620)。在某些实施方案中，紫杉醇药剂是紫杉醇等同物。在某些实施方案中，紫杉醇等同物是注射用紫杉醇(Abraxane)。
在某些实施方案中，将HSP90抑制剂和第二药剂(例如mTOR抑制剂、ALK抑制剂和/或另外的抗癌药)同时(即，在相同的时间或相同日或在相同的治疗方案内施用两种药剂)或依次地(即，在一个时间段范围内施用一种药剂，接着施用另一种药剂持续第二个时间段，或在不同的治疗方案内部施用)施用。
在某些实施方案中，同时施用HSP90抑制剂和第二药剂(例如，mTOR抑制剂、ALK抑制剂和/或厉娜给我的抗癌药)。例如，在某些实施方案中，在相同的时间施用HSP90抑制剂和第二药剂。在某些实施方案中，在相同日施用HSP90抑制剂和第二药剂。在某些实施方案中，在相同日或在相同治疗方案内，HSP90抑制剂在第二药剂之后施用。在某些实施方案中，在相同日或在相同治疗方案内，HSP90抑制剂在第二药剂之前施用。
在某些实施方案中，将HSP90抑制剂与第二药物同时施用一段时间，在所述时间点后，采用另外抗癌剂的治疗停止并且采用HSP90抑制剂的治疗继续。
在某些实施方案中，将HSP90抑制剂与第二药剂同时施用一段时间，在所述时间点后，采用HSP90抑制剂的治疗停止并且采用另外抗癌剂的治疗继续。
在某些实施方案中，HSP90抑制剂和第二药剂依次施用。例如，在某些实施方案中，HSP90抑制剂在mTOR抑制剂和/或另外的抗癌剂的治疗方案已经停止后施用。在某些实施方案中，mTOR抑制剂和/或另外的抗癌剂在HSP90抑制剂的治疗方案已经停止后施用。
可以与本发明HSP90抑制剂组合的癌症疗法包括手术治疗、放射疗法和化疗剂如生物治疗剂。示例性的抗癌剂包括但不限于放射疗法、干扰素(例如，干扰素α、干扰素γ)、抗体(例如赫赛汀(曲妥珠单抗)、T-DM1、阿瓦斯汀(贝伐单抗)、爱必妥(西妥昔单抗)、维克替比(Vectibix)(帕尼单抗)、Rituxan(利妥昔单抗)、Bexxar(托西莫单抗))、抗雌激素药(例如，他莫西芬、雷洛昔芬和甲地孕酮)、LHRH激动剂(例如，戈舍瑞林和亮丙瑞林)、抗雄激素药(例如，氟他胺和比卡鲁胺)、光动力疗法(例如，苯并卟啉衍生物单酸(vertoporfin)(BPD-MA)、酞菁、光敏剂Pc4和去甲氧基-竹红菌素A(2BA-2-DMHA))、氮芥(例如，环磷酰胺、异环磷酰胺、曲磷胺、苯丁酸氮芥、雌氮芥和美法仓)、亚硝基脲类(例如，卡莫司汀(BCNU)和罗莫司汀(CCNU))、烷基磺酸盐类(例如，白消安和曲奥舒凡)、三氮烯类s(例如，达卡巴嗪、替莫唑胺)、含铂化合物(例如，顺铂、卡铂、奥沙利铂)、长春花生物碱(例如，长春新碱、长春碱、长春地辛和长春瑞滨)、紫杉烷(taxoid)类或紫杉烷(taxane)(例如，紫杉醇、白蛋白结合的紫杉醇(注射用紫杉醇(Abraxane))、nab-紫杉醇、多西他赛(例如，作为注射用多西他赛(Taxotere))、紫杉酚)、表鬼臼毒素类(例如，依托泊苷、依托泊苷磷酸盐酯、替尼泊苷、托泊替康、9-氨基喜树碱、开普拓伊立替康(camptoirinotecan)、依立替康、crisnatol、丝裂霉素C)、抗代谢物、DHFR抑制剂(例如，甲氨蝶呤、二氯甲氨蝶呤、三甲曲沙、依达曲沙)、IMP脱氢酶抑制剂(例如，霉酚酸、噻唑羧胺核苷、利巴韦林和EICAR)、核糖核苷酸还原酶抑制剂(例如，羟脲和去铁胺)、尿嘧啶类似物(例如，5-氟尿嘧啶(5-FU)、氟尿苷、去氧氟尿苷、雷替曲塞(ratitrexed)、替加氟-尿嘧啶、卡培他滨)、胞嘧啶类似物(例如，阿糖胞苷(araC)、胞嘧啶阿糖核苷和氟达拉滨)、嘌呤类似物(例如，巯基嘌呤和硫鸟嘌呤)、维生素D3类似物s(例如，EB1089、CB1093和KH1060)、异戊烯化抑制剂(例如，洛伐他汀)、多巴胺能神经毒素(例如，1-甲基-苯基吡啶鎓离子)、细胞周期抑制剂(例如，星形孢菌素)、放线菌素D(例如，放线菌素DD、更生霉素)、博来霉素(例如，博来霉素A2、博来霉素B2、培洛霉素)、蒽环类(例如，佐柔比星、多柔比星、PEG化脂质体多柔比星、伊达比星、表柔比星、吡柔比星、佐柔比星、米托蒽醌)、MDR抑制剂(例如，维拉帕米)、Ca2+ATP酶抑制剂(例如，毒胡萝卜内酯)、伊马替尼、沙立度胺、来那度胺、酪氨酸激酶抑制剂(例如，阿昔替尼(AG013736)、波舒替尼(SKI-606)、西地尼布(RECENTINTM、AZD2171)、达沙替尼(
Figure BDA00001882655701541
BMS-354825)、厄洛替尼
Figure BDA00001882655701542
吉非替尼
Figure BDA00001882655701543
伊马替尼(
Figure BDA00001882655701544
CGP57148B、STI-571)、拉帕替尼
Figure BDA00001882655701545
来妥替尼(CEP-701)、奈拉替尼(HKI-272)、尼洛替尼
Figure BDA00001882655701546
司马沙尼(semaxinib、SU5416)、舒尼替尼(马来酸舒尼替尼(Sutent)、SU11248)、托西尼布
Figure BDA00001882655701547
凡德他尼(
Figure BDA00001882655701548
ZD6474)、伐他拉尼(PTK787、PTK/ZK)、曲妥珠单抗(赫赛
Figure BDA00001882655701549
),贝伐单抗
Figure BDA000018826557015410
利妥昔单抗
Figure BDA000018826557015411
西妥昔单抗(爱必妥)、帕尼单抗(维克替比(Vectibix))、雷珠单抗
Figure BDA000018826557015412
尼洛替尼索拉非尼
Figure BDA000018826557015414
阿仑珠单抗
Figure BDA000018826557015415
吉姆单抗奥佐米星ENMD-2076、PCI-32765、AC220、乳酸度维替尼(TKI258、CHIR-258)、BIBW2992(TOVOKTM)、SGX523、PF-04217903、PF-02341066、PF-299804、BMS-777607、ABT-869、MP470、BIBF1120AP24534、JNJ-26483327、MGCD265、DCC-2036、BMS-690154、CEP-11981、tivozanib(AV-951)、OSI-930、MM-121、XL-184、XL-647和/或XL228)、蛋白酶体抑制剂(例如，硼替佐米(Velcade))、奥利美生、吉西他滨、洋红霉素、甲酰四氢叶酸、培美曲塞、环磷酰胺、达卡巴嗪、丙卡巴肼、泼尼松龙、地塞米松、喜树碱、普卡霉素、天冬酰胺酶、氨基蝶呤、甲蝶呤、泊非霉素、美法仓、异长春碱、环氧长春碱、苯丁酸氮芥、曲贝替定、丙卡巴肼(procarbazine)、园皮海绵内酯(discodermolide)、洋红霉素、氨基蝶呤和六甲蜜胺。
在其他实施方案中，HSP90抑制剂和第二药剂(例如mTOR抑制剂、ALK抑制剂，或化疗剂)可以与其他化疗剂、辐射或手术中的一项或多项组合使用。
【实施例】
本发明由不应当解释为起限制作用的以下实施例进一步说明。遍及本申请中引用的全部参考文献、图、序列表、专利和公布的专利申请的内容在此通过引用方式并入。
【实施例1：17-AAG的氢醌盐酸盐的制备】
将17-AAG(0.450g，0.768mmol，1.0当量)溶解于二氯甲烷(50mL)中并且随次硫酸钠的10%水溶液(50mL)搅拌。将溶液搅拌30分钟。收集有机层、在Na2SO4上干燥，过滤并且转移至圆底烧瓶。向这种溶液添加HCl在二噁烷中的溶液(4N，0.211mL，1.1当量)。使所得到的混合物在氮下搅拌30分钟。将黄色固体缓慢地从溶液中洗出。黄色固体通过从MeOH/EtOAc重结晶来纯化以产生0.386g氢醌HCl盐(2)。
化合物2在本文也称作IPI-504。IPI-504(盐酸瑞螺旋霉素)是Hsp90的水溶性强力抑制剂。
17-AAG的另外盐可以按照本文所述和/或本领域已知的方法制备(见，例如，US 2006/0019941、US 7,375,217和US 7,767,663，所述专利的内容在此通过引用方式并入)。例如，US 2006/0019941公开了17-AAG的氢溴酸盐、对甲苯磺酸盐、d-樟脑磺酸盐、磷酸氢盐、甲基磺酸盐、苯基磺酸盐。US 7,767,663公开了17-AAG盐的制备，包括二甲氨基乙酸共盐(在US 7,767,663的实施例3中公开)、α-氨基异丁酸共盐(实施例4)、β-丙氨酸共盐(实施例5)、N-甲基甘氨酸共盐(实施例6)、哌啶羧酸共盐(实施例7)、甘氨酸共盐(实施例8)、2-氨基-2-乙基-丁酸共盐(实施例9)、1-氨基-环丙烷羧酸共盐(实施例10)、1-氨基-环戊烷羧酸共盐(实施例12)、N-甲基哌啶羧酸共盐(实施例13)、N,N,N-三甲基铵基乙酸共盐(实施例14)。
IPI-504的示例性固体和液体制剂的制备在US 2006/0019941的实施例32-35中公开。
【实施例2：ALK突变预测HSP90抑制剂(包括IPI-504)治疗的响应和临床益处】
对来自下述患者的肿瘤样本进行回顾性分子表征，所述患者罹患复发和/或难治性IIIb期或IV期非小细胞肺癌(NSCLC)并且应募参与一项检验IPI-504(Infinity Pharm.)的安全性、耐受性和活性的1/2期研究。使用VysisTM开发的探针，按照制造商的操作方案，通过双色、断裂分离荧光原位杂交(FISH)确定ALK状态。当所述探针重叠(黄色)或彼此处于2个探针长度的范围内时，试验评定为阴性。当所述探针分离或它们之间距离在>15%的细胞或>8/50的胞核中大于2个探针长度时，试验评定为阳性。例如，在来自存在部分响应的患者的ALKFISH中，野生型ALK由两种(绿色和红色)荧光探针的共定位代表，并且ALK基因重排由分裂的FISH信号显示。
五位采用IPI-504时存在部分响应(如RECIST所定义(>30肿瘤收缩))的患者中，两位检验呈ALK FISH阳性(图1-2)。ALK FISH阳性的第三位患者具有延长的稳定病情。另外的分子研究，包括借助DxS的EGFR和KRAS基因分型和借助Oncomap的一般癌基因和肿瘤抑制基因基因分型，没有显示这些患者中的其他基因组改变。因此，结果显示，ALK突变鉴定了最可能从HSP90抑制剂(包括IPI-504)获益的患者。
【实施例3A：ALK重排(rALK)与IPI-504(盐酸瑞螺旋霉素)在非小细胞肺癌(NSCLC)患者中临床活性之间的联系】
【概述】
该实施例描述来自一项临床试验的结果，所述临床试验在罹患晚期、分子上界定为非小细胞肺癌(NSCLC)的患者中评估IPI-504(本文所述的强力Hsp90抑制剂)在EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)疗法后的功效。
罹患晚期NSCLC、先前用EGFR TKI进行治疗和可获得用于分子基因分型的肿瘤组织的患者应募参与这项IPI-504单药疗法的预期性、非随机、多中心、II期研究。主要结果是客观响应率。次要目的包括安全性、无进展生存期(PFS)和借助分子亚型分析活性。
来自十家美国癌症中心的76位患者在2007年12月和2009年5月之间应募。在总研究群体中观察到7%的整体响应率，在具有EGFR野生型的患者中观察到10%的整体响应率，在具有EGFR突变的患者中观察到4%的整体响应率，并且在KRAS野生型患者当中观察到12%的整体响应率。在3位具有ALK基因重排的患者当中，2位出现部分响应并且第3位具有延长的(7.2个月)稳定病情(肿瘤大小缩减24%)。常见的不良事件包括乏力、恶心和腹泻，它们大多为1级和2级。小于10%的患者中观察到3级或更高级别的肝脏功能异常。
结论是，IPI-504在NSCLC患者具有临床活性，并且尤其在具有ALK重排的患者中如此。具有ALK重排的患者可能偏好地对Hsp90抑制响应。
【背景和研究设计】
热休克蛋白(Hsp)90参与蛋白质稳态并且通过它作为蛋白伴侣的作用，调节参与肿瘤发生、癌细胞增殖和存活的关键蛋白的稳定性(Whitesell L.等,Nat Rev Cancer.(2005)5(10):761-772)。Hsp90因其同时抑制多条重要信号转导途径的能力而是新出现的癌症疗法关注焦点(Xu W.等Clin Cancer Res(2007)13(6):1625-1629；Workman P.等AnnN Y Acad Sci.(2007)1113:202-216)。另外，突变的癌蛋白质，包括表皮生长因子受体(EGFR)，可以较其野生型对应物优先地依赖于Hsp90伴侣，这进一步增加Hsp90作为由此类突变界定的癌症的治疗靶的要求(Nathan D.F.等Mol Cell Biol.(1995)15(7):3917-3925；Rutherford S.L.等Nature(1998)396(6709):336-342；Grbovic O.M.等Proc NatlAcad Sci USA.(2006)103(1):57-62；Shimamura T.等Cancer Res.(2005)65(14):6401-6408)。
非小细胞肺癌(NSCLC)是一种可以基于“驱动突变(drivermutation)”作亚分类的异质疾病，其中特定癌基因突变导致对驱动信号转导途径的依赖性或“癌基因成瘾性”。NSCLC中常见的驱动突变似乎涉及KRAS、表皮生长因子受体(EGFR)和间变性淋巴瘤激酶(ALK)的基因(Suda K.等(2010)Cancer Metastasis Rev.29(1):49-60；Sharma S.V.等(2007)Nat Rev Cancer.7(3):169-181；Shaw A.T.等(2009)27(26):4247-4253)。当强力和特异性抑制剂用来阻断来自驱动癌基因的信号时，治疗可以是有效的，如在EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)在EGFR突变的NSCLC中的情况中所显示(Mok T.S.等(2009)NEngl J Med.361(10):947-957；Kobayashi K.等(2009)J Clin Oncol.27(15s):suppl abst 8016；Mitsudomi T.等(2010)Lancet Oncol.11(2):121-128)。这种成功可以用在ALK重排的NSCLC中ALK TKI疗法来反映(Kwak E.L.等(2009)J Clin Oncol.27(15s):suppl;abstr3509)。
IPI-504(17-AAG的类似物)的潜在抗癌活性已经在临床前体外和体内模型中得到验证(Ge J.等(2006)J Med Chem.49(15):4606-4615；Sydor J.R.等(2006)Proc Natl Acad Sci USA.103(46):17408-17413)。具体而言，已经在癌症的多个人异种移植物和鼠原位模型中显示IPI-504的生物学作用和抗肿瘤作用。IPI-504的游离碱与17-AAG互变并且在人体中以pH和酶介导的动态氧化还原平衡存在(Ge J.等(2006)J MedChem.49(15):4606-4615；Demetri G.D.等(2007)J Clin Oncol.ASCOAnnual Meeting Proc.2007;25:10024)。此外，ALK是受IPI-504抑制的Hsp90伴侣的客户蛋白。
临床前研究表明，突变EGFR可以是较野生型EGFR更强的Hsp90的客户蛋白。一项在NSCLC患者中静脉内IPI-504单一疗法的I期剂量递增研究显示了有利的副作用谱和临床益处证据(Sequist L.V.等(2007)AACR-NCI-EORTC International Conference onMolecular Targets and Cancer Therapeutics,San Francisco,CA)。因此，实施这项多中心II期研究以前瞻性评估EGFR TKI疗法后IPI-504在晚期NSCLC患者中的功效。EGFR基因型是必需的，从而可以观察到因突变状态所致的活性差异。回顾性地评估其他生物标记以鉴定更可能对疗法响应的组。
【研究设计和患者选择】
这是一项非随机II期临床试验，目的是在晚期NSCLC患者中评估针对IPI-504单一疗法的客观响应率(ORR)，其中所述患者具有激活EGFR突变或具有EGFR野生型(Therasse,P.等(2000)J NatlCancer Inst 92,205-216)。试验的每个基因型界定组(突变EGFR群或野生型EGFR群)充当一个Simon两阶段研究，同时如果存在完全响应(CR)、部分响应(PR)或稳定疾病(SD)持续≥3月的至少一位患者，计划中期评价10位患者并扩大招募另外19位患者(总计29位患者)。由于预界定的EGFR基因型不是参与研究的要求，因此本试验保持开放直至两个群完全应募，这导致野生型组的过度招募。次要目标包括描述该方案的安全性和无进展生存期(PFS)和检查与响应相关的分子标记。
在2007年12月和2009年5月之间从十家美国癌症中心招募患者。为了有效，患者必需罹患IIIb期(具有胸腔积液)或IV期NSCLC，伴随在EGFR TKI疗法时在其病史的某些时间点处进展；充分的基线肾功能、肝功能和骨髓功能；东部肿瘤协作组体能状态(PS)为0-2；通过RECIST的可度量病情1.0；没有活动性或未治疗的中枢神经系统(脑)转移；没有明显的心脏传导异常；没有继续存在的角结膜炎；和具有先前界定的EGFR基因型或足够肿瘤组织以进行基因型评估例如EGFR突变分析(对于进入研究，不要求EGFR状态)(Therasse,P.等(2000)J Natl Cancer Inst 92,205-216；Oken,M.M.等(1982)Am JClin Oncol.5:649-655)。患者已经经历过先前EGFR TKI疗法并且对于先前疗法没有限制。全部患者均签署书面的知情同意书并且本研究均由当地伦理审查委员会监督。本试验的资助由InfinityPharmaceuticals,Inc.提供。
【治疗和评价】
治疗由一个21日循环的第1、4、8日和11日时静脉内IPI-504输注30分钟组成。疗法继续直至出现进展性病情(PD)、不可耐受的副作用或选择性推出。总计76患者应募。对于75位患者，起始剂量是400mg/m2。在2009年4月，用于正处于研究的患者(19位患者)的剂量降低至225mg/m2，原因在于400mg/m2的剂量时，IPI-504在胃肠间质肿瘤(GIST)患者的独立试验中观察到肝毒性(Demetri G.D.等)。一项在胃肠间质肿瘤(GIST)患者中来自IPI-504(盐酸瑞螺旋霉素)对安慰剂的II期研究的最终结果是激酶抑制剂疗法无效。论文发表在：Gastrointestinal Cancers Symposium；1月22-24日,2010年,2010；Orlando,FL)，并且最后应募的患者以225mg/m2的剂量开始。
在基线和在每次输注之前，均通过病史、体格检查、血液化学、肝功能检验和血液计数评估全部患者的安全性。如果存在胰腺炎的症状，则评估淀粉酶和脂酶。不良事件使用NCI常用毒性标准3.0版(NCI.常用不良事件术语标(CTCAE)3.0版，2006年8月9日)进行分级。在筛选期间进行裂隙灯眼检验(slit lamp eye examination)并且在筛选期间和在第一次输注之前及之后获得心电图，以分别评价角膜炎和QTc延长。每2个循环后，通过CT-扫描进行肿瘤响应的射线照相评价。全部胶片由中心放射学核心实验室审阅并独立评估。
【患者肿瘤分子分析】
使用标准方法，通过外显子18-21的直接测序，评估来自全部患者的肿瘤组织标本的EGFR突变。在参与研究机构的CLIA认证内部实验室或在Genzyme(Cambridge,MA)进行EGFR测序。患者的一个子集还在Infinity Pharmaceuticals,Inc(Cambridge,MA)接受采用等位基因特异性ARMS测定(DxS,英国)的EGFR(n=25)、KRAS(n=30)和BRAF(n=5)基因分型分析。经直接测序和等位基因特异性ARMS测定同时成功检验的患者使用更灵敏测定(等位基因特异性ARMS测定)的结果来分类。对可获得足够组织的全部患者进行其他目的分子标记的事后(Post-hoc)分析。主要的事后分析在CLIA认证实验室中进行，并且由适于检测EGFR、KRAS、PIK3CA、BRAF、PTEN、AKT、TP53、NRAS、CTNNB1(β-连环蛋白)、APC、KIT、JAK2、NOTCH1和FLT3(n=19)中关键致瘤性突变的SNaPshot测定(AppliedBiosystems、Foster City、CA)；和使用先前所述的方法检测ALK基因重排的荧光原位杂交(FISH)断裂分离测定(n=15)(Shaw A.T.等(2009)J Clin Oncol.27：4247-4253；Dias-Santagada D.等(2010)EMBMol Med.(待发表))组成。对一个样本子集进行其他事后分析，这包括通过覆盖114种癌症基因中的1155种突变的Oncomap分析法(Dana-Farber Cancer Institute；Boston,MA)进行基因分型(n=10)。此外，在Functional Biosciences Inc.(Madison,WI,n=12))和Genewiz(South Plainfield,NJ)，通过Sanger法对11个基因(ALK、BRAF、EGFR、ERBB2、HSP90AA1、HSP90AB1、KRAS、MET、NF1、PTEN和STK11)测序。用于ALK、BRAF、EGFR、ERBB2、HSP90AA1、HSP90AB1、KRAS、MET、NF1、PTEN和STK11的测序分析的核苷酸序列显示为SEQ ID NO:35-56(ALK)、SEQ IDNO:57-58(BRAF)、SEQ ID NO:59-112(EGFR)、SEQ ID NO:113-172(ERBB2)、SEQ ID NO:173-236(HSP90AB1)、SEQ ID NO:237-244(KRAS)、SEQ ID NO:245-252(MET)、SEQ ID NO:253-368(NF1)、SEQ ID NO:369-394(PTEN)和SEQ ID NO:395-414(SKT-11)。使用CGH和SNP阵列评价拷贝数。
【蛋白质印迹分析】
为了进一步探索临床分子观察结果的意义，衍生了评估EGFR及ALK突变的癌细胞系对变化浓度的17-AAG的敏感性的实验室模型。H1975(EGFR L858R/T790M)、HCC827(EGFR del 19)、H3122(EML4-ALK)和MGH006(EML4-ALK源自对PF-02341066敏感的患者)细胞用递增剂量的17-AAG处理24小时。使用先前描述的方法进行蛋白质印迹(Faber A.C.等Proc Natl Acad Sci U S A.(2009)106(46):19503-19508)。用针对P-ALK(Cell Signaling,Inc.)、ALK(CellSignaling,Inc.)、P-EGFR(Biosource)和EGFR(Santa Cruz)的抗体对膜进行探测。使用Syngene G:Box照相机(Synoptics)检测化学发光，并且使用Syngene Genetools软件(Synoptics)量化信号强度。全部测量在无饱和作用的线性范围内进行并且对ERK内参对照归一化。
【细胞存活测定】
细胞以96孔平板的每个孔2,000个细胞接种。在过夜孵育后，细胞用17-AAG的连续稀释物一式三份处理72小时。使用如先前描述的Syto60测定，相对于未处理细胞，确定活细胞滴度(Faber A.C.等ProcNatl Acad Sci U S A.(2009)106(46):19503-19508)。用针对P-ALK(CellSignaling,Inc.)的抗体对膜进行探测。
【统计学考虑】
本研究的主要终点是ORR，计算为具有经证实的完全响应或部分响应的患者总数除以受治疗的患者数目。独立地分析每个组(EGFR突变体和野生型)。假定无效ORR5%和目标ORR20%，推进本研究。
摘要统计法用来描述安全性和包括用IPI-504治疗的全部患者。PFS定义为从招募至进展性病情或死亡的时间，在最后已知的随访时终检，并且用Kaplan-Meier方法按照意向治疗原则计算。
【结果】
【患者】
76位患者在本研究中应募。EGFR基因型分析不需要在开始研究治疗之前完成，因此基因型不定的8(10%)位患者未分配至EGFR突变体组或野生型组中。中值年龄是64岁(范围从31-82岁)并且在基因型之间是相似的(表2)。整个研究群体具有女性(63%)和从不吸烟者(45%)的过多代表，这在EGFR突变体(71%女性和61%从不吸烟者)当中甚至是更明显的。研究群也用4个先前的全身性方案的中值大量预治疗，并且自诊断以来的中位数时间是27.5个月。先前的EGFR TKI疗法产生54%的响应率并且在EGFR突变阳性患者当中持续10.5个月中位数时间。
【毒性】
IPI-504良好耐受。大部分不良事件是1级或2级，并且9(12%)位患者因毒性减少剂量，而11(14%)位患者因不良事件中止治疗。最常报告的不良事件是乏力、恶心、腹泻、呕吐、咳嗽、厌食和关节/肌肉疼痛，表3。约三分之一患者因肾清除IPI-504有色代谢物而具有短暂的、无毒性紫色尿。就实验室异常而言，常见天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和碱性磷酸酶升高(分别是49%、41%和62%)，但是等级3或更高的升高罕见(分别是9%、7%和5%)。没有提到等级3或4的胆红素升高。三位患者在参与研究时死亡，认为全部这三位患者与研究药物相关。两位患者死于肺炎的并发症，包括败血症和呼吸衰竭或窘迫，并且死亡之前出现肾衰竭以及ALT和AST升高。第三位患者死于呼吸窘迫、乳酸酸中毒、恶心和呕吐后的并发症。
【响应和分子分析】
68位(89%)患者获得成功的EGFR基因型分析，其中28位(应募76患者的37%)患者分配至EGFR突变阳性组和40位患者(53%)分配至野生型组。对于EGFR突变体患者，16位(57%)具有外显子19缺失，6位(21%)具有外显子21L858R点突变，2位(7%)具有外显子20插入，并且4位(14%)各自具有两个突变，(2位患者具有外显子18G719S和外显子21L861Q突变；2位患者具有外显子19缺失和外显子20T790M突变)。EGFR基因型不定的原因包括缺少肿瘤组织或可获得组织的不良质量或量。38位(50%)患者接受KRAS突变检验，并且12位(16%)具有突变；15位(20%)患者接受ALK重排检验，并且3位(4%)为阳性。KRAS突变阳性的患者的个人背景特征因阳性吸烟史而引人注目，并且ALK重排患者的那些个人背景特征因低龄、男性占优和从不吸烟而引人注目(表2)。
IPI-504的ORR总体上是7%，在EGFR野生型患者中是10%，并且EGFR突变体中是4%。如果先前已经针对持续大约8个月并且直接从厄洛替尼转变成IPI-504的厄洛替尼和恩扎妥林联合疗法出现PR，则出现RECISTPR的EGFR突变阳性患者具有L858R突变。还在12%的KRAS野生型患者中和在67%具有ALK重排的患者中见到响应(表4，图3A-3C)。FISH断裂分开测定用来检测ALK重排阳性的患者。例如，野生型等位基因显示为一个黄色信号，并且ALK重排的等位基因显示为分开的红色和绿色探针信号。应当指出，3位KRAS野生型响应者中2位具有ALK重排，但是第三位经证实为ALK野生型。在分析时，35位(46%)患者具有PFS事件(进展或死亡)，并且41位(54%)终检。全部患者的中值无进展生存期是2.86个月(95%CI 2.43,4.18)，虽然3位具有ALK重排的患者接受IPI-504大约7月并且在研究时仍没有进展或死亡(图4)。来自ALK易位阳性的出现部分响应的患者中的图像显示与基线相比，在周期12后肺中肿瘤大小的部分缩减。附表1汇总来自微测序(snapshot)、Oncomap、DxS和Sanger测序的另外遗传学结果。
对携带EGFR突变和ALK重排的肺癌模型的实验室评估不仅证实，如先前所示那样，EGFR突变体模型对采用17-AAG的Hsp90抑制敏感，还揭示ALK重排的模型是高度敏感的。实际上，ALK-重排的蛋白质的稳定性和癌细胞的生存力均对Hsp90抑制高度敏感，例如，如免疫印迹(图7B)和细胞存活的相对剂量响应曲线所显示。因此，ALK是较EGFR更敏感的客户蛋白。在一个实施方案中，本发明公开了客户蛋白降解的敏感性和对用HSP90抑制剂治疗的临床响应之间的关系。
【讨论】
本试验是Hsp90抑制剂在分子定义的晚期NSCLC患者群中的首次试验。本研究已经显示IPI-504在NSCLC中有效，整体响应率在总研究群体中是7%，在具有EGFR野生型的患者是10%，在具有EGFR突变和获得性TKI耐受的患者中是4%，并且在KRAS野生型患者当中是12%的整体响应率。有趣的研究结果是，事后分析显示3位已知具有ALK重排的患者中有2位对IPI-504具有PR，并且第三位患者具有SD(24%缩减)持续7.2个月。这是Hsp90抑制剂在具有ALK重排的患者中具有临床活性的首次显示，表明具有rALK的NSCLC患者可优先对Hsp90抑制响应。
ALK是受体酪氨酸激酶的胰岛素超家族的成员并且最早与间变性大细胞淋巴瘤相关，所述间变性大细胞淋巴瘤通常具有由ALK激酶结构域和配偶体蛋白-核磷酸蛋白(NPM)之间融合所介导的ALK致瘤性信号转导(Morris S.W.等Science(1994)263(5151):1281-1284)。最近，EML4-ALK和涉及ALK基因座的其他重排已经在NSCLC中描述为赋予对用ALK TKI的疗法敏感性的转化驱动突变(Shaw A.T.等J Clin Oncol.(2009)27(26):4247-4253；Kwak E.L.等J Clin Oncol.(2009)27(15s):suppl;abstr 3509；Soda M.等Nature(2007)448(7153):561-566)。NSCLC中ALK易位的患病率是大约5%。患病率在没有EGFR突变的从未吸过烟或为轻度吸烟者的患者中是大约33%。在NSCLC中的ALK易位与腺癌、印戒细胞亚型相关。临床前模型已经显示，NPM-ALK是Hsp90的客户(Bonvini P.等Cancer Res.(2002)62(5):1559-1566)并且图7B表示EML4-ALK还是潜在客户。如7B图中所示，EML4-ALK是较突变EGFR或HER2更敏感的客户蛋白。
总之，本研究证实，由于其对于多种癌蛋白质的伴侣作用和对关键信号转导途径的普遍作用，Hsp90具有成为对抗多种类型癌基因成瘾性癌症(包括已经对受体特异性靶向疗法形成抗性的那些癌症)的有效癌症疗法的潜力。抑制此类癌症中“驱动突变”的TKI已经生效，包括伊马替尼在慢性髓细胞白血病和GIST中(分别靶向BCR-ABL和c-KIT)、吉非替尼和厄洛替尼在NSCLC中(靶向EGFR)和PF-02341066在NSCLC中(靶向ALK)(Mok T.S.等(2009)N Engl JMed.361:947-957；Kwak E.L.等(2009)J Clin Oncol.27(15s):suppl；abstr 3509；Druker B.J.等(2001)N Engl J Med.344:1038-1042；Demetri G.D.等(2002)N Engl J Med.347:472-480)。这项研究证实，为了高度有效，抑制驱动突变不需要借助受体特异性分子；抑制Hsp90，随后影响多条信号转导途径，现在是真正的癌症治疗方法。
引人注意的是，尽管存在广泛临床前证据，即Hsp90抑制并且特别是IPI-504治疗在EGFR突变阳性模型(包括具有对EGFR TKI获得性抗性的那些模型)中导致肿瘤生长的有效抑制，然而在具有EGFR突变的患者中观察很少响应(Shimamura T.等Cancer Res.(2008)68(14):5827-5838；Sawai A.等Cancer Res.(2008)68(2):589-596；BrainJ.等)。IPI-504，一种口服施用的新型Hsp90抑制剂，在EGFR突变、激酶抑制剂抗性的NSCLC中显示抗肿瘤作用。论文发表在：AmericanAssociation of Cancer Research Annual Meeting;April 14-18,2007;Los Angeles,CA)。这个观察结果可能存在几个原因。患者群体是非典型的，在于在具有EGFR突变的患者当中，距离诊断的中值时间是2年，并且56%的患者已经用至少两种现有EGFR TKI剂进行治疗。由于这些患者的癌症已经变得对EGFR TKI抗性，因此其肿瘤的生物学可能已经从依赖于单个癌基因变成更为异质的状态。IPI-504的剂量可能是EGFR突变体当中适中响应率方面的因素。癌细胞系的分析表明，与突变EGFR相比，可能需要较低浓度的Hsp90抑制剂以下调EML4-ALK的表达。与ALK-重排的癌症的剂量响应曲线相比，EGFR突变癌的剂量响应曲线适度地向右侧迁移。可能更宽的治疗窗口也可能对具有ALK重排的患者中观察的较高响应率有贡献。重要地，在具有ALK重排的患者当中不存在获得性ALK特异性疗法抗性可提示独立的分子生物学，其比具有EGFR突变的患者更易受Hsp90抑制影响，所述具有EGFR突变的患者均已经事先接受过EGFR TKI并且具有获得性EGFR TKI抗性。本实验中的患者(无论基因型是什么)没有一个先前曾用ALK-特异性疗法进行治疗。
在这项研究中，IPI-504总体上良好耐受，等级3或更高的不良事件率低。最常见的不良事件包括乏力、恶心和腹泻，并且这些大多为1级和2级。<10%的患者中观察3级或更高级别的肝脏功能异常，并且药物相关性死亡是罕见的并且并发患者的基础性肺癌。这与用IPI-504治疗的晚期GIST患者中的观察结果相反，其中观察到致命的肝毒性(Demetri G.D.等)。一项在胃肠间质肿瘤(GIST)患者中来自IPI-504(盐酸瑞螺旋霉素)对安慰剂的II期研究的最终结果是激酶抑制剂疗法无效。论文发表在：Gastrointestinal Cancers Symposium；1月22-24日,2010年,2010；Orlando,FL)。
EGFR突变阳性群和野生型群均具有自诊断以来的长间隔期、接受过大量的现有疗法并具有低比例的吸烟者。另外，可用于遗传分析的肿瘤组织主要来自任何靶向疗法或形成抗性之前的诊断活检，其可能具有改变的遗传标签。然而，以下事实为本研究增加可信度：从因合格性要求所产生的100%参与者中收集用于基因分型的肿瘤组织。这项研究不仅提供关于EGFR基因型响应的特定观察结果，还包括仔细检查具有稳健响应的少数患者，从而能够重点观察ALK重排的NSCLC中的活性。认为，全部的靶向疗法研究应当要求来自全部参与者的组织。对于新药物的研究而言，常见的是仅在少数患者中显示出活性，并且这项研究有效地说明，事后分子分析响应最好的患者如何可以为进一步研究的道路提供方向。注意的是，证实用目前标准的“断裂分开”FISH测定检测到患者中的ALK重排，其中所述的FISH测定检测到染色体2中的重排，但是未鉴定到存在的EML4-ALK特定变体(EML4具有多个它可以与ALK偶联的断点)(Horn L.等J ClinOncol.(2009)27(26):4232-4235)。因此，目前未知IPI-504是否具有一系列依赖于致瘤性EML4-ALK变体的预期活性。
总之，IPI-504是一种新的Hsp90抑制剂，其在NSCLC患者、尤其具有ALK重排的那些NSCLC患者有活性。值得注意的是，不同于在NSCLC患者中检测到ALK重排和IPI-504单药治疗的临床活性活性之间的正关联，在具有K-Ras或EGFR突变的患者中观察到很少针对IPI-504单一疗法的响应。可以实施进一步研究以预期评价Hsp90抑制在具有ALK重排和其他致瘤性驱动突变的患者中的功效。
【实施例3B：Hsp90抑制在非小细胞肺癌的新发EGFR TKI抗性模型中产生明显的肿瘤进展延迟】
热休克蛋白90(Hsp90)已经作为癌症中有吸引力的靶出现，原因在于它在维持多种癌蛋白质(包括HER2、BCR-ABL、EML4-ALK和突变EGFR)的活性和稳定性方面发挥作用。Infinity正在开发两种新型Hsp90抑制剂IPI-504(静脉内施用)和IPI-493(口服施用)。IPI-504目前正在多个II期临床试验中评价；IPI-493正在2个I期临床试验中评价。
EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)是EGFR中具有激活性突变的肺癌患者的有效治疗。然而，在明显的初始响应后，大部分患者变得对药物治疗有抗性并出现进展。在约一半的这些病例中，抗性归因于EGFR中的第二位点点突变(T790M)。认为在这些病例的至少一些，TKI抗性突变是预存的，并且用TKI治疗选择了抗性细胞。
在模拟对TKI抗性从预存突变中出现的工作中，我们开发了一种体内模型，其中吉非替尼治疗最初导致肿瘤消退，随后肿瘤生长反弹并且含有T790M突变的药物抗性克隆过度生长。在这个模型中，当与单独用吉非替尼治疗相比时，用单独IPI-493治疗或用IPI-493后随即用吉非替尼治疗，分别导致61和77%的肿瘤生长抑制。用单独的IPI-493治疗也导致至肿瘤进展时间的显著延迟，其中约40%的动物在第45日仍处于研究中；用媒介物或吉非替尼治疗的全部动物已经因肿瘤进展而移除。有趣地，用IPI-493后随即用吉非替尼治疗导致甚至更显著的至进展时间延迟，其中>50%的动物在第65日仍处于研究中。
这些研究显示，可以确保在已经事先用TKI进行治疗的EGFR突变NSCLC患者中采用Hsp90抑制剂的其他研究。
【实施例4：HSP90抑制剂在NSCLC中的临床前评价】
本实施例描述了显示用单独或与其他药剂组合的HSP90抑制剂治疗后肿瘤细胞生长抑制的体外和体内研究。更具体地，本实施例显示，Hsp90抑制剂IPI-504在ALK驱动的NSCLC模型快速降低EML4-ALK水平并诱导肿瘤消退。
【概述】
Hsp90是癌症疗法的新出现的靶，原因是它在维持重要致瘤性信号转导蛋白的活性和稳定性方面发挥重要作用。本实施例显示EML4-ALK融合蛋白，假定是约5%NSCLC患者中的“致瘤性驱动”，与细胞中的Hsp90结合并且在细胞暴露于IPI-504时快速降解。EML4-ALK显示比HER2或突变EGFR对Hsp90抑制更敏感，其中蛋白质降解的IC50处于低纳摩尔范围。这种降解导致下游信号转导途径的有力抑制和携带EML4-ALK融合物的细胞中生长停滞和凋亡的诱导。为产生EML4-ALK表达和对IPI-504敏感性之间的因果联系，将EML4-ALK cDNA引入HEK293细胞并且显示融合蛋白的表达使细胞在体外和体内均对IPI-504敏感。在含有ALK重排的人NSCLC细胞系异种移植模型中，在IPI-504的临床相关剂量观察到肿瘤消退。最后，已经针对对ALK激酶抑制剂的抗性而选择的细胞仍保持它们对IPI-504的敏感性。这项研究为实施例3中讨论的临床观察结果提供分子解释，所述临床观察结果显示NSCLC中、特别是携带ALK重排的患者中对IPI-504的部分响应。
【背景】
热休克蛋白90(Hsp90)是一种丰富的细胞伴侣蛋白，该蛋白质维持其蛋白质底物(也称作客户蛋白)的稳定性、活性和分选(Pearl等(2006)Annu.Rev.Biochem.75：271-294；Young JC等(2001)J Cell Biol154：267-73)。当抑制Hsp90时，客户蛋白通过蛋白酶体而快速降解(Connell P等(2001)Nat Cell Biol 3：93-6)。Hsp90最近成为癌治疗剂的新出现的靶(Neckers L.(2007)J.Biosci.32：517-530)，原因在于它的许多客户蛋白是癌蛋白质如HER2 Munster PN等(2001)Cancer Res.61：2945-2952、突变cKIT(Dewaele B等(2008)Clin.Cancer Res.14：5749-5758；Fumo G等(2004)Blood 103：1078-1084)、突变EGFR(Shimamura T等(2008)Cancer Res.68：5827-5838；ShimamuraT,Lowell AM,Engelman JA,Shapiro GI.(2005)。携带激酶结构域突变的表皮生长因子受体与热休克蛋白90伴侣结合并且在暴露于格尔德霉素后去稳定(Cancer Res.65：6401-6408 Shimamura T等(2005)Cancer Res.65：6401-6408)或BCR-ABL(An WG等(2000)Cell GrowthDiffer 11：355-60；Nimmanapalli R等(2001)Cancer Res.61：1799-1804；Peng C等(2007)Blood 110：678-685)。与一些癌症中在恶性转化和维持癌基因成瘾性方面的这个支持性角色相一致，Hsp90在癌细胞中过表达，并且，过表达与黑色素瘤中的病情进展相关(McCarthy MM等(2008)Ann Oncol 19：590-4)并且与乳腺肿瘤(Pick E等(2007)Cancer Res 67：2932-7)、肺肿瘤(Gallegos Ruiz MI等(2008)PLoS ONE 3：e0001722)和胃肠间质肿瘤(Li CF等(2008)Clin CancerRes 14：7822-31)中降低的存活相关。
间变性淋巴瘤激酶(ALK)的致瘤性活化在多种癌症类型中出现。在NSCLC中，染色体内重排导致棘皮动物微管相关蛋白质样4(EML4)的N末端与ALK的C端酪氨酸激酶结构域融合(Soda M等(2007)Nature 448：561-6)。迄今，已经鉴定到多种EML4-ALK变体(Choi YL等(2008)Cancer Res 68：4971-6；Takeuchi K等(2009)Clin Cancer Res15：3143-9)。全部融合癌蛋白质均包含ALK的完整酪氨酸激酶结构域和EML4蛋白的可变部分。融合蛋白借助EML4结构域的二聚化导致ALK激酶的组成型活化并导致细胞转化(Choi YL等(2008)CancerRes 68：4971-6；Koivunen JP等(2008)Clin Cancer Res 14：4275-83)。
IPI-504(盐酸瑞螺旋霉素)，17-AAG的一种水溶性衍生物，是Hsp90的一种新型的强力抑制剂(Ge J等(2006)J.Med.Chem.49：4606-4615；Sydor JR等(2006)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.103：17408-17413)。已经在体外和体内癌症模型中显示IPI-504的生物学作用和抗肿瘤作用(Bauer S等(2006)Cancer Res.66：9153-9161；DewaeleB等(2008)Clin.Cancer Res.14：5749-5758；Leow CC等(2009)MolCancer Ther 8：2131-41；Peng C等(2007)Blood 110：678-685；SongD等(2008)Mol.Cancer Ther.7：3275-3284)，导致其在多个II期研究中临床开发(＊Sequist等,2010)。尽管对于Hsp90抑制剂在癌症中使用存在良好的临床前比率，并且多种抑制剂处于临床开发中，但是所述抑制剂没有一个显示出临床概念证据。这个可能部分地归因于难以为这些抑制剂找到正确的临床适应症。不清楚Hsp90抑制剂在临床上是否最终通过也是癌蛋白质的敏感客户蛋白发挥作用，或细胞杀伤是否通过同时降解多种客户蛋白和更广泛地影响蛋白质稳态介导。在一项IPI-504于NSCLC中的II期试验内，我们最近已经在其肿瘤细胞含有ALK基因座重排的患者中观察到部分响应(2010)J Clin Oncol 28：abstr 7517；实施例3)。在本实施例中，检验EML4-ALK作为Hsp90客户蛋白的敏感性以确定EML4-ALK是否在表达EML4-ALK融合蛋白的异种移植模型中成因性地参与癌细胞对Hsp90抑制作用的敏感性和IPI-504的活性。
【结果】
【观察IPI-504疗法在ALK基因重排阳性的NSCLC患者中的临床益处】
在实施例3中所述的IPI-504于NSCLC中的II期试验内，观察到7%的总体响应率。当对患者肿瘤进行分子表征时，我们确定，响应率在具有突变EGFR的患者是4%，并且在具有野生型EGFR的患者中是10%(Sequist L等(2010)J Clin Oncol 28：abstr 7517；实施例3)。这项研究结果是令人惊讶的，在于突变EGFR预期是敏感的Hsp90客户蛋白，其介导这个群体中对Hsp90抑制作用的临床响应。当患者肿瘤进一步就遗传异常分析时，(可用于检验的15份样本中)3份样本评定为涉及ALK基因座的重排阳性。令人感兴趣的是，全部3位这些患者显示一些程度的肿瘤缩小。两个患者达到>30%肿瘤收缩(PR)并且一位患者具有24%肿瘤收缩和稳定病情持续大于7个月(图1)。
【EML4-ALK是Hsp90的敏感客户蛋白】
已经在约5%的NSCLC患者中报道了ALK基因座处的重排，其形成EML4的N端与ALK的C端激酶结构域的致瘤性融合物(Soda,M.等(2007)Nature 448：561-6)。为确定EML4-ALK融合蛋白是否为Hsp90的客户蛋白，我们将表达EML4-ALK的NSCLC细胞系H3122与递增浓度的IPI-504孵育并且通过ELISA测量总ALK蛋白和磷酸化ALK蛋白的丰度(图7a)。在该实验中，实际上全部ALK蛋白在50nM IPI-504以上的浓度均降解。测量的降解IC50(4nM)使得其成为我们已经遇到过的最敏感的Hsp90客户蛋白。为了与其他熟知的Hsp90客户蛋白直接比较EML4-ALK的敏感性，将H3122、BT-474和H1650细胞与1uM IPI-504孵育不同的时间，并探测相关细胞系中的EML4-ALK、HER2和突变EGFR。我们先前已经在Tillotson B.等(2010)J Biol Chem中显示，截至降解的时间是客户蛋白的Hsp90依赖性的最灵敏度量。在这项分析中，EML4-ALK至3小时彻底降解，而对于大部分HER2和mutEGFR而言，降解耗时约24小时(图7b)。为进一步证实EML4-ALK确实是Hsp90的客户，我们用针对Hsp90α的抗体进行免疫沉淀，并且在来自H3122细胞而不是来自对照细胞的Hsp90免疫沉淀物中用ALK抗体检测到在预测分子量(90kDa)处的蛋白质条带(图7c，泳道1和3)。
【IPI-504处理诱导EML4-ALK降解、抑制下游途径并抑制细胞生长】
为研究降解EML4-ALK的细胞后果，我们用针对ALK和不同下游信号转导蛋白的抗体探测来自已经与IPI-504孵育不同时间的H3122细胞的裂解物(图8a)。IPI-504处理和EML4-ALK降解后，ERK和STAT3的活性(磷酸化)形式快速地耗尽，而AKT和磷酸-AKT以不同的时间比例耗尽。这些结果支持，EML4-ALK在NSCLC细胞系H3122中经ERK和STAT途径发送信号，并且这个信号转导被HSP90抑制剂处理有效破坏。为研究EML4-ALK降解和下游信号转导途径抑制对细胞生长产生什么影响，将H3122细胞与递增浓度的IPI-504孵育72小时，并且通过测量细胞ATP水平监测细胞生长。IPI-504对细胞生长产生有力影响(图8b)，其中生长抑制的IC50值为22nM。这个值与ALK降解的IC50充分匹配，与ALK降解是观察到的细胞生长抑制的原因相一致。
【EML4-ALK的表达使细胞对Hsp90抑制作用敏感】
细胞内部如此多的蛋白质的稳定性依赖于Hsp90的事实造成难以机理性地确认负责Hsp90抑制后的细胞生长效果的客户蛋白。经常假定，当细胞含有也是据信驱动癌症亚型的癌蛋白质的敏感客户蛋白时(例如乳腺癌中的HER2)时，Hsp90抑制剂对此类细胞的生长抑制作用归因于这种癌蛋白质的降解。尽管这是一个合理的假设，但是细胞经常含有多种‘驱动‘突变和数百个Hsp90客户蛋白。因此，客户蛋白降解的IC50和细胞生长抑制的单纯匹配是相关的，但是没有提供机理证据。为获得EML4-ALK表达和对Hsp90抑制的敏感性之间的机理性关系，我们想知道转染EML4-ALK cDNA是否可能使细胞对Hsp90抑制敏感。构建了两个cDNA，其编码EML4-ALK融合蛋白和该融合物的突变形式，其中通过点突变使ALK的激酶结构域失活(ALK-KD)。将cDNA转染至HEK293细胞中，并且通过蛋白质印迹监测融合蛋白的表达(图9a，泳道1至3)和活性(图9a，泳道4至6)。从两种构建体中表达了大量的EML4-ALK融合蛋白，并且如所预期，尽管表达，但激酶死亡突变体(ALK-KD)没有酶活性。我们随后想知道活性或无活性融合蛋白的表达怎样调节针对IPI-504的敏感性。尽管用100或1000nM IPI-504处理对表达激酶死亡突变体的293FT细胞(293FTALK-KD)的生长具有十分小的影响，但是活性EML4-ALK融合蛋白(293FTALK)的表达明显使293FT细胞对用IPI-504处理敏感(图9b)。还可能在体内观察到这种致敏作用。当裸鼠中从表达EML4-ALK的293FT细胞形成的肿瘤或对照293FT肿瘤每周两次用100mg/kgIPI-504治疗2周时，该药物引起含有EML4-ALK的肿瘤的明显生长抑制，但是不引起对照肿瘤的明显生长抑制(图9c)。
【IPI-504治疗在含有EML4-ALK的NSCLC细胞的异种移植模型中引起消退】
在大部分异种移植模型中，Hsp90抑制剂引起肿瘤生长抑制，但是不引起肿瘤消退。与这种情况相一致，临床中对Hsp90抑制剂的响应迄今大多由引起稳定病情组成。为确定EML4-ALK融合蛋白对Hsp90抑制的极端敏感性是否可以在体内转换成ALK依赖性H3122细胞系的肿瘤消退。将H3122细胞注射至裸鼠的腹侧，并且动物用75mg/kg的IPI-504每周治疗两次。这种治疗导致肿瘤消退，其与用ALK激酶抑制剂PF-1066每日以50mg/kg治疗可比(图10a和10b)。我们还检验了IPI-504和PF-1066的组合，并且这种治疗导致甚至更明显的肿瘤消退(图10b和10d)。有趣地，一旦治疗停止，来自PF-1066组的肿瘤比IPI-504组的肿瘤更快地再生长；另外，采用IPI-504和PF-1066的组合时，观察到甚至更长的肿瘤生长延迟。为证实EML4-ALK在这些肿瘤内部降解，在本研究中包括一个独立组，其中在单次注射IPI-504后的不同时间点收获肿瘤，并且使用ALK特异性ELISA监测融合蛋白随时间推移的丰度(图12A)。结果显示，在单次注射IPI-504后，ALK融合蛋白耗尽持续超过48小时。EML4-ALK的耗尽与PARP裂解的出现(半胱天冬酶3活化和诱导凋亡的指示)同时发生(图12B)。
【所选择的对PF-1066有抗性的NSCLC细胞对IPI-504保持敏感】
尽管酪氨酸激酶抑制剂已经在选择的患者群体中在NSCLC方面显示出显著的响应率，但是对这些抑制剂的临床抗性常出现。为了探究对PF-1066有抗性的细胞是否仍将保持对IPI-504敏感，我们实施一项体外实验以通过将细胞与递增浓度的抑制剂孵育来选择对PF-1066有抗性的H3122细胞。这个处理产生对PF-1066的敏感性比亲本细胞低12倍的一组细胞(H3122R)。这些H3122R细胞还对结构不同的ALK抑制剂(TAE-684)有抗性，但仍保持对IPI-504敏感(表7)。对H3122R细胞中的EML4-ALK基因的测序没有揭示任何继发突变(数据未显示)，这表明抗性可能由活化保持对Hsp90保持敏感的替代信号转导途径引起。
表7汇总了体外研究结果，其显示所选择的对ALK激酶抑制剂有抗性的H3122NSCLC细胞保持对IPI-504的敏感性。更具体地，带有类型(wt)和抗性(res)的H3122细胞具有与下文所示HSP90抑制剂(IPI-504)相对应的所示的G150值变化。通过比较用ALK激酶抑制剂PF-1066和TAE-684处理的样本中的G150值变化，显示对ALK抑制剂的抗性。所选择的对ALK激酶抑制剂有抗性的NSCLC细胞保持对IPI-504的敏感性。
【表7】
Figure BDA00001882655701751
总之，在本实施例中描述的实验说明：
1)EML4-ALK是高度敏感的Hsp90客户蛋白。
2)EML4-ALK的表达可以使细胞对IPI-504处理敏感。
3)IPI-504和ALK激酶抑制剂的组合在人NSCLC的异种移植模型中导致明显的肿瘤消退。
4)所选择的对ALK激酶抑制剂有抗性的细胞保持对IPI-504的敏感性。
5)在患者中，ALK基因座中的重排与对作为单一药剂的IPI-504响应相关。
6)这些研究结果的进一步验证在IPI-504的前瞻性试验中在具有NSCLC和ALK重排的患者中继续。
【讨论】
个性化的抗癌药物依赖于将正确药物与正确患者匹配的能力。为此目的，将肿瘤中的体细胞遗传改变与对靶向疗法的响应联系已经变成癌症药物开发中的一个关键性和整合步骤。新遗传技术的进展，包括高通量癌基因基因分型(Oncomap(Thomas等，2007，上文和Snapshot)以及FISH，已经能够鉴定这些改变和因此鉴定最可能从新疗法获益的患者亚群。在回顾性分析来自NSCLC中IPI-504的研究中的肿瘤试样时使用这些策略，我们已经发现了ALK重排与对IPI-504的响应之间的关联(Sequist等，2010,上文)。这里，我们提供以下证据：这种临床相关性可能归因于用IPI-504治疗后致瘤性ALK融合物的敏感、快速和持久降解。本文的结果显示，就剂量响应和至降解的时间而言，EML4-ALK是比突变EGFR或HER2(之前据信是细胞中最敏感的Hsp90客户蛋白之一的一种蛋白质)更敏感的客户蛋白。由于细胞中存在超过200种Hsp90客户蛋白，已经难以缩小HSP90抑制剂治疗后癌细胞生长抑制的确切机制范围。不清楚Hsp90抑制的细胞作用是否由通过同时抑制多种客户蛋白而总体影响蛋白质稳态引起或它们是否可以是追溯至单一致瘤性驱动蛋白的降解。通过使用等基因细胞系，本文的结果显示至少在EML4-ALK的情况中，后一种情况似乎存在。这对于Hsp90抑制剂的未来临床开发具有意义，因为我们的结果表明，罹患下述癌症亚型的患者最可能从HSP90抑制剂治疗中受益，所述癌症亚型受对Hsp90客户蛋白十分敏感的癌蛋白质驱动。
EML4-ALK作为客户蛋白的敏锐敏感性还转换成体内设置。与大多数的其他体内模型不同，在每周给药IPI-504两次的情况下，我们在EML4-ALK阳性NSCLC异种移植模型中观察到肿瘤消退。这个可能归因于以下事实：在体内，单次注射导致凋亡诱导的IPI-504后，该融合蛋白耗尽持续超过48小时(图12A和12B)。我们还获得证据，变得对ALK激酶抑制剂有抗性的细胞仍对IPI-504敏感，从而提示一种用于在成功TKI治疗后复发的患者的可能治疗。
总之，这项研究表明EML4-ALK融合蛋白阳性的NSCLC患者可能从IPI-504疗法获得益处并且潜在地从其他HSP90抑制剂获得益处。此外，Lin和协作者最近报道在乳腺和结直肠癌中检测到EML4-ALK融合物(Lin E等(2009)Mol Cancer Res 7：1466-76)。因此，ALK致瘤性活化在这些肿瘤类型中的存在也可以预测乳腺癌和结直肠癌患者亚群体中对IPI-504的响应。
【实施例4的实验设计：材料与方法】
【细胞系和化合物】
H3122细胞从NIH(Rockville,MD)获得，H1650和BT-474细胞从ATCC(Manassas,VA)获得。对全部细胞系检验支原体并且将它们在补充有10%热灭活胎牛血清的RPMI 1640中培养。IPI-504在Infinity合成(Ge等,2006)。TAE-684和PF-02341066(称作PF-1066)从Chemietek购买(Indianapolis，IN)。
【293FTEML4-ALK细胞系的产生】
EML4-ALK变体1开放阅读框克隆和激酶结构域死亡形式(K589M)由GenScript基于GenBank登录号序列AB274722合成。通过Gateway LR克隆酶反应(Invitrogen,Carlsbad,CA)pLenti6.2/R4R2/DEST载体连同细胞巨化病毒启动子载体，根据制造商说明书进行重组。使用Virapower试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)，所得到的载体用来产生重组慢病毒粒子。借助聚凝胺(polybrene)介导作用，将293FT细胞用表达变体1EML4-ALK-的慢病毒粒子感染。使用杀稻瘟素选择细胞。相同的方案用来产生稳定表达激酶死亡(K589M)变体1EML4-ALK蛋白的293FT细胞。
【PF-1066抗性细胞的产生】
将H3122细胞用0.64mM N-乙基N-乙基脲(ENU)诱变过夜、洗涤和在500nM PF-1066中培养3周。短串联重复序列测序(RADIL,Columbia,MO)用来证实抗性细胞(H3122R)源自H3122细胞。
【细胞生长和生存力研究】
将H3122以4,000个细胞/孔接种在96孔平板中并且与递增浓度的IPI-504或PF-02341066孵育72小时。使用Cell Titer Glo(Promega,Madison,WI)进行生长抑制研究。生存力研究通过锥虫蓝排除法进行并且使用Countess细胞计数器(Invitrogen,Carlsbad,CA)定量。数据对DMSO对照归一化以产生生长抑制GI50值。
【免疫印迹、免疫沉淀和ELISA分析】
细胞用IPI-504处理所示的时间并且在含有蛋白酶抑制剂和HALT磷酸酶抑制剂(Pierce,Rockford,IL)的冰冷细胞裂解缓冲液(Cell Signaling,Beverly,MA)中裂解。通过在4℃以14,000g离心使裂解物澄清，并且通过BCA法确定蛋白质浓度(Pierce Rockford,IL)。将样本在样本缓冲液中煮沸5分钟，在4-12%BIS-TRIS凝胶上解析并且转移到PVDF膜上。印迹物用针对ALK、磷酸ALK(Tyr1604)、AKT、磷酸-AKT(Ser473)、ERK、磷酸-ERK(Thr202/Tyr204)、pSTAT3(Tyr705)、EGFR、切割型PARP(均来自Cell Signaling Beverly,MA)、HER2(Abcam,Cambridge MA)和GAPDH(Santa Cruz Biotech)的抗体探测。还使用ELISA(nD Systems,Minneapolis,MN)根据供应商的说明书监测ALK水平和pALK水平。对于免疫沉淀，将1mg预澄清的细胞裂解物与2ug Hsp90(9D2；Stressgen)在4℃孵育过夜。在转台上在4℃添加蛋白G珠持续4小时，并且将珠子用冷的裂解缓冲液充分洗涤。添加2x还原样本缓冲液，将样本煮沸并且在4-12%Bis-Tris SDS凝胶上运行。将蛋白质转移至PVDF并且用ALK抗体或Hsp90抗体在4℃探测过夜，随后用HRP连接的第二抗体检测。
【异种移植研究】
根据研究机构动物护理和使用委员会(IACUC)指南实施全部体内研究。PF-02341066以2.5mg/ml在pH 4-5的注射用无菌水制备并且贮存在-20℃。将IPI-504在5mM柠檬盐，20mM抗坏血酸盐，0.9%盐水中的0.244mM EDTA(pH 3.3)中制备并且贮存在-80℃。5至6(5-6)周龄的雄性NCR nu/nu无胸腺小鼠从Taconic Farms(Hudson,NY)购买。将无血清RPMI 1640中的五百万个(5×106)NCI-H3122细胞以皮下方式植入小鼠的右后腹侧中，并且当肿瘤达到170mm3的平均体积时，开始治疗。媒介物、IPI-50450mg/kg或75mg/kg腹内(IP)以体积8ml/kg每周施用两次。PF-0234106637.5mg/kg口服(PO)以体积15ml/kg一日一次施用X5(5日施用，2日停用)。每周一次用数字式卡尺测量肿瘤，并且使用下式确定肿瘤体积：(长度×宽度2)/2。将结果表述为单位为mm3的平均肿瘤体积±均数标准误(SEM)。为了进行293FTYFP或293FTEML4-ALK工程化细胞系的体内分析，如上文所述产生细胞系。将无血清DMEM中与基质胶(matrigel)(BD Biosciences)1:1混合的每个细胞系的一千万个(10×106)细胞植入5-6周龄雄性NCRnu/nu小鼠的右后腹侧中，并且一旦肿瘤已经达到~250-300mm3，则开始治疗。将IPI-504或媒介物以体积8ml/kg每周以75mg/kg腹内施用两次。肿瘤体积如上文所述评估。
【实施例5：IPI-504在鳞状细胞癌患者中的功效】
本实施例描述了来自一项在鳞状细胞癌(SCC)患者中评估IPI-504功效的临床试验的结果。
图13A-13B描述了根据通过组织学所分析的癌症亚型，显示对IPI-504响应的瀑布图。检查的癌症是腺癌(显示为#1)、细支气管肺泡癌(BAC)(显示为#2)、大细胞肺癌(显示为#3)、鳞状细胞癌(显示为#4)、未知(显示为#5)和对照(显示为#6)。每条柱代表一位患者。图13A的y轴代表距离基线的肿瘤体积变化%。SCC患者针对IPI-504显示43%的客观响应率(ORR)，而7位患者中有3位显示部分响应(PR)(图13A)。图26B显示在治疗循环开始后IPI-504在SCC患者中的功效。
【实施例6：单独或与多西他赛组合的IPI-504在吸烟者中的功效】
本实施例描述了来自一项在吸烟患者中评估单独或与多西他赛组合的IPI-504功效的临床试验的结果。
图27描述了根据吸烟状态显示对IPI-504响应的瀑布图。图27的y轴代表距离基线的肿瘤体积变化%。每条柱代表一位患者。吸烟患者针对IPI-504显示29%的客观响应率(ORR)，而21位患者中有6位显示部分响应(PR)(图14)。
接下来，评估烟草暴露与NSCLC和SCC中功效之间的关系。在28-29图中显示结果。
图15描述这样的图，其显示在具有NSCLC的患者中烟草暴露(由包年数评估)增加时由肿瘤体积下降%所确定的增加的IPI-504功效。y轴代表距离基线的肿瘤体积变化%。
图16描述这样的图，其显示在具有SCC和其他肺癌组织结构的患者中烟草暴露(由包年数评估)增加时由肿瘤体积下降%所确定的增加的IPI-504功效。y轴代表距离基线的肿瘤体积变化%。
图17是汇总IPI-504和多西他赛的组合在NSCLC患者中功效的柱状图。y-轴代表以下患者群体中响应率(ORR)的变化：
1)以多西他赛作为二线治疗的患者；
2)在这个试验中用IPI-504和多西他赛治疗的NSCLC患者；
3)在这个试验中用IPI-504和多西他赛治疗的NSCLC患者，其是吸烟者；
4)在这个试验中用IPI-504和多西他赛治疗的NSCLC患者，其为KRAS野生型；和
5)在这个试验中用IPI-504和多西他赛治疗的SCC/NSCLC患者。
这些结果显示了在吸烟状态和与单独或与多西他赛组合的IPI-504相对应的肿瘤收缩之间的有趣联系。IPI-504和多西他赛的组合在NSCLC中具有活性。这些结果因此能够在待用HSP90抑制剂如IPI-504治疗的患者中进行适宜的患者选择。在待考虑的因素当中包括以下一项或多项：肿瘤组织结构(例如，NSCLC或SCC)、吸烟状态、HSP90表达和/或ALK或KRAS状态。
图18A-18B中总结了流程图，其汇总了评价IPI-504和多西他赛的组合的两项临床试验的研究设计。
图18A总结了以下临床研究：在一个3周方案中300mg/m2的IPI-504和每周一次施用多西他赛组合。该组合良好耐受，没有出乎意料的安全性观察结果。对于NSCLC子集，26位NSCLC患者每周用ILI-504治疗(并且每周用多西他赛治疗或每隔3周用多西他赛治疗一次)。没有一位患者经历过先前多西他赛疗法。ORR是23%，而26位患者中有6位显示部分响应。
图18B总结了一项在NSCLC的二线至三线治疗中多西他赛加或不加IPI-504的随机化、安慰剂对照的II期临床试验的设计。
【实施例7：结直肠癌(CRC)中的B-Raf和K-Ras突变】
本实施例显示，IPI-493在携带kRAS或bRAF突变的CRC中显示出良好功效，并且进一步说明MAPK途径活性可能是IPI-493敏感性的有价值标记。另外，IPI-493与依立替康的组合优于单独的这两种药物中任一种。
【背景/概述】
结直肠癌(CRC)是美国和世界范围内第三位最常见形式的癌症，每年分别有大于50,000和700,000例癌症相关死亡。在2009年(美国)预计有大于110,000例新诊断和45,000例死亡；在世界范围预计有>300,000例新诊断和100,000例死亡。大体上，小于10%罹患mCRC的患者预期有5年存活率。
晚期CRC的标准护理(SOC)包括采用：
5-氟尿嘧啶(5FU-TS抑制剂)；依立替康(Topo I poison)；奥沙利铂(DNA加合物)的多药物联合疗法。
爱必妥和Vectabix(针对EGFR的单克隆抗体)也由FDA批准用于治疗转移性CRC
1线药物：
FOLFOX：5-氟尿嘧啶+甲酰四氢叶酸+奥沙利铂
FOLFIRI：5-氟尿嘧啶+甲酰四氢叶酸+依立替康
2线药物
Figure BDA00001882655701811
通常是1线疗法的替代
3+线药物
Figure BDA00001882655701812
依立替康+/-CTX或生物学
失败后依立替康包涵体连同CTX
爱必妥和Vectabix(针对EGFR的单克隆抗体)也由FDA批准用于治疗晚期转移性CRC(KRAS野生型)
爱必妥与依立替康组合用于依立替康难治性pts
Vectabix作为单一药剂
大约40%的病例可能在小GTP酶kRAS中含有突变，并且约10-25%的病例在其下游效应子即胞质激酶bRAF中含有突变，它们是互斥的。此外，在CRC中，突变bRAF代表与突变kRAS不同的患者子集。突变bRAF先前已经在黑色素瘤中证实是分子伴侣HSP90的非常敏感的“客户蛋白”。HSP90是维持本文中称作“HSP90客户”的不同细胞蛋白质的构象和活性的伴侣蛋白。众多HSP90客户是癌蛋白质。突变BRAF已经证实是黑色素瘤和CRC中敏感的HSP90客户。激活的c-RAF(认为它是KRAS突变体背景下的重要RAF家族成员)也是HSP90客户。
IPI-493是一种目前正处于I期剂量递增临床试验的口服HSP90抑制剂。为研究IPI-493在CRC中的功效，我们首先对CRC细胞系组进行生长抑制(GI)研究。IPI-493在携带kRAS或bRAF突变的细胞系中显示了10-100nM范围内的GI50。这些GI值还在集落形成测定中得到证实。为探究IPI-493的体内功效，发展了几种突变bRAF(Colo201、Colo205、Colo741、HT55)和kRAS(HCT-116、SW480、DuDu-1)以及野生型kRAS/bRAF(Colo320HSR、NCI-H716、SNU-C1、C2BBe1)异种移植模型。在功效方面，IPI-493作为单一药剂以100mg/kg(mpk)每周三次施用在所检验的全部突变模型中显示出明显作用，其中肿瘤生长抑制(TGI)值在70和90%之间并且在一个突变BRAF模型中出现消退。重要地，当评价与依立替康组合的IPI-493(晚期CRC中的标准治疗)时，这两种药物的组合显示相对于单独任一种单独的优越功效，引起肿瘤总体消退和在4/10动物中持续>70日的完全消退。
有趣地，在野生型kRAS/bRAF背景下探究IPI-493功效时，没有观察到对TGI的可检测影响。连同在突变kRAS/bRAF模型中观察到的显著作用一起，这些结果表明，MAPK途径的活化可以是HSP90抑制作用敏感性的重要标记。图19总结了MAPK(Ras-Raf-Mek-Erk)途径。
为进一步研究IPI-493对RAS-RAF-ERK途径的分子组分的影响与功效之间的潜在相关性，在单次100mpk给药后对突变bRAF(Colo205,Colo201)和野生型(Colo320HSR)异种移植模型进行药效分析。数据显示，IPI-493施用导致突变kRAS或bRAF模型中bRAF和MEK(bRAF的下游靶)的活性在给药后约24小时下调，如通过这两种蛋白质的降低的磷酸化(p-bRAF，p-MEK)所评估。此外，IPI-493还在相同的时间框内引起裂解的胱天蛋白酶3(一种凋亡标记)增加，这进一步说明这两个事件之间的相关性。相反，野生型kRAS/bRAFColo320HSR模型显示p-bRAF和p-MEK的低基线水平以及IPI-493施用的少量影响。另外，当评估全部异种移植物的p-MEK活性时，突变模型和野生型模型之间存在清晰界定，这进一步支持MAPK途径活性可以代表IPI-493功效的假设。综上所述，这些结果显示，IPI-493在携带kRAS或bRAF突变的CRC中显示出良好功效，并且进一步说明MAPK途径活性可能是IPI-493敏感性的有价值标记。另外，IPI-493与依立替康的组合优于单独的这两种药剂中任一种。总之，这些结果为这种疾病的临床途径提供逻辑依据。
【17-AG非晶性分子分散体的制备】
将HPMC-AS-HG(1g)以单一部分添加至丙酮(160mL)和乙醇190证据(proof)USP/NF级(40ml)的4:1混合物(作为丙酮:乙醇混合物的替代，丙酮可以用来溶解聚合物和17-AG)。将所述混合物在60℃搅拌直至聚合物的溶解完成(约30分钟)。将17-AG(1g)经10分钟时间逐份添加以提供不透明的紫色混合物。将所得到的溶液(1%w/v固体)在60℃搅拌30分钟。
随后浓缩均相紫色溶液，并且在高真空下在50℃移除溶剂以提供固态分散体。该分散体通过交叉偏振显微镜观察证实是基本上非晶性的。随后使用研钵和研槌将分散体碾碎成粉末并且在高真空下在30℃干燥24小时。
如下进行这种固态非晶性分散体的混悬剂的制备：将此固体与甘油用调拌刀搅拌均匀，随后在高速均化器中于1%羟乙基纤维素溶液中均化10分钟以溶解于媒介物中(1%羟乙基纤维素、5%甘油)。该混悬剂用来在下述体内实验中施用17-AG。
【实验1.表8和图20A-20D】
在第一组研究中，使用在胞质丝氨酸激酶BRAF中含有V600E或Y581F激活性突变的几种不同的结直肠腺癌细胞系模型：Colo205(V600E)(图20A)、Colo201(V600E)(图20B)、Colo741(V600E)(图20C)和HT55(Y581F)(图20D)。对于每个所用的细胞系，5-6周龄Nu/Nu小鼠以皮下方式植入10×106个细胞。在肿瘤已经达到大约150-200mm3后，给药开始。给药通过口服管饲进行，并且给药方案是，与媒介物对照相比，采用50%17-AG在媒介物(1%羟乙基纤维素、5%甘油)中HPMC-AS-HG分散体中的混悬剂以剂量水平100mg/kg 17-AG每周三次(周一、周三、周五)。给药实施约3周(9次给药)。在治疗方案结束时，比较17-AG治疗的动物与用媒介物对照治疗的动物，观察到范围在58和94%之间的最大肿瘤生长抑制(TGI)。
表8总结IPI-504和IPI-493在体外CRC细胞系中的活性。提供GI-50浓度为突变状态的函数。
【实验2.图21A-21C】
在第二组研究中，使用在小GTP酶RAS中含有激活性突变(分别是G13D、G12V和G12V)的HCT-116(图21A)和SW-480细胞系(图21B)和DuDu-1(源自原发肿瘤)(图21C)。如上文所述，对于每个所用的细胞系，5-6周龄Nu/Nu小鼠以皮下方式植入10×106个细胞。对于原发性DuDu-1模型，从Nu/Nu小鼠中增殖的肿瘤中收获细胞，并且将适当数目的所用细胞植入天然Nu/Nu小鼠用于17-AG研究。在植入的细胞达到约150-200mm3后开始给药并且通过口服管饲按以下给药方案进行：与媒介物对照相比，采用50%17-AG在媒介物(1%羟乙基纤维素、5%甘油)中HPMC-AS-HG分散体中的混悬剂以剂量水平100mg/kg 17-AG每周三次(周一、周三、周五)。在给药后，对于不同模型，与媒介物治疗的动物相比，在给药组见到肿瘤体积最大缩减65-86%。
【实验3.图22A-22D和23A-23C】
在第三组研究中，使用Colo320HSR(图22A)、NCI-H716(图22B)、SNU-C1(图22C)和C2BBe1(图22D)细胞系，它们均是KRAS和BRAF的野生型。对于每个所用的细胞系，5-6周龄Nu/Nu小鼠以皮下方式植入10×106个细胞，并且口服管饲给药在肿瘤已经达到约150-200mm3后通过按以下给药方案开始：与媒介物对照相比，采用50%17-AG在媒介物(1%羟乙基纤维素、5%甘油)中HPMC-AS-HG分散体中的混悬剂以剂量水平100mg/kg 17-AG每周三次(周一、周三、周五)。在治疗结束时，对于呈现KRAS和BRAF野生型的每个CRC细胞系，没有在17-AG(IPI-493)治疗和媒介物治疗的动物之间观察到肿瘤体积的可检测差异。
图23A显示一组免疫印迹物，其描述当IPI-493单次给药(100mpk)时突变Colo 201和Colo 205异种移植物中磷酸化BRAF的时间依赖性减少。在KRAS突变体模型中观察到相似的变化。在野生型Colo320HSR中检测到磷酸化BRAF活性的最少变化。
图23B显示一组柱状图，其描述突变Colo 201和Colo 205异种移植物中磷酸化MEK的时间依赖性减少。在KRAS突变体模型中观察到相似的变化。当IPI-493单次给药(100mpk)时，在野生型Colo320HSR中检测到磷酸化BRAF活性的最少变化。
图23C显示一组柱状图，其描述突变Colo 201和Colo 205异种移植物中裂解的半胱天冬酶3活性的时间依赖性增加(与磷酸MEK的减少相关)。当IPI-493单次给药(100mpk)时，在野生型Colo320HSR中检测到最少变化。
【实验4.图24A-24B】
在第四组研究中，进行异种移植研究(Oncotest GmbH,Freiberg,Germany)。简而言之，在裸鼠中培育通过在裸鼠中直接移植并增殖而源自原发性患者样本的两个异种移植模型CXF-1729(野生型BRAF，野生型KRAS)(图24A)和CXF-260(野生型BRAF，突变KRAS(G12V))(图24B)。一旦肿瘤体积已经达到大约150-200mm3，来自每个模型的小鼠随机分入治疗组中，即媒介物组或50%17-AG在媒介物(1%羟乙基纤维素、5%甘油)中HPMC-AS-HG分散体中的混悬剂组，并通过口服管饲按90mg/kg每周三次(周一、周三、周五)持续3周的方案给药，并且监测肿瘤体积。一旦三周给药时间已经结束，另外监测动物24-26日以跟踪肿瘤生长延迟。结果表明，即便正在采用药物，两个模型CXF-1729和CXF-260均类似地对17-AG治疗响应，显示>60%的肿瘤生长抑制(TGI)。在治疗期后，CXF-1729模型显示肿瘤生长延迟9日(治疗停止后肿瘤体积加倍的时间)，而CXF-260模型显示19日肿瘤生长延迟。
【实验5.图25】
在第五组研究中，选择建立的结直肠肿瘤模型；突变BRAF(Colo201、Colo205)、突变KRAS(HCT-116、CXF-260)和野生型BRAF/KRAS(CXF-1729、Colo320HSR、SNU-C1)(图25)。一旦肿瘤体积已经达到大约200mm3，将动物不做处理(T=0)或以100mg/kg施用单个口服剂量的50%17-AG在媒介物(1%羟乙基纤维素、5%甘油)中HPMC-AS-HG分散体中的混悬剂，并且随后在治疗后24小时(T=24)或48小时(T=48)后收获肿瘤并将其在液氮中速冻。从每份异种移植物样本的冷冻肿瘤组织中制备肿瘤细胞裂解物，并且通过ELISA测定来评估MEK1(MAP激酶途径的活性的代理标记)的活性(磷酸化)。这些研究的结果表明，对于所检验的肿瘤模型，MAPK途径的活性与如通过肿瘤生长抑制所评估的对17-AG治疗敏感性非常好地相关。
【实验6.图26A和26B】
在第六组研究中，通过将10×106个细胞植入裸鼠的右侧腹部，建立Colo201(突变BRAF)的皮下异种移植物。一旦肿瘤达到大约100-150mm3，将动物随机分入治疗组中并且施用媒介物或50%17-AG在媒介物(1%羟乙基纤维素、5%甘油)中HPMC-AS-HG分散体中的混悬剂(100mg/kg，周一、周三、周五，3周)、依立替康(100mg/kg，每隔7日，3周)或50%17-AG在媒介物(1%羟乙基纤维素、5%甘油)中HPMC-AS-HG分散体中的混悬剂(50mg/kg，周一、周三、周五)与依立替康(75mg/kg，每隔7日)的组合持续3周，并且肿瘤体积每周测量两次(图26A；图26B是图26A的放大部分)。在给药时间结束时，另外监测动物57日以跟踪肿瘤生长延迟。这些研究的结果表明，与17-AG或依立替康单一药物施用相比，17-AG加依立替康的组合显示明显增加的功效，在治疗期期间平均75%的肿瘤消退和4/10完全缓响应(明显肿瘤完全消失)，这在肿瘤生长延迟期自始至终维持(研究结束=治疗期+治疗后期总计78日)。相反，17-AG或依立替康的单一药物施用仅导致在采用药物时肿瘤生长抑制(对于两种药物治疗，TGI均约88%)，而在研究的任一个治疗组中没有完全响应。在两个独立的结直肠癌模型(HCT-116和DuDu1，均为G12V突变KRAS)中(实验7和8)也观察到与Colo201模型的上述那些结果相似的结果。
【实验7.图27A和27B】
在第七组研究中，通过将10×106个细胞植入裸鼠的右侧腹部，建立HCT-116(G13D突变KRAS)结直肠肿瘤模型的皮下异种移植物。一旦肿瘤达到大约100-150mm3，将动物随机分入治疗组中并且施用媒介物或50%17-AG在媒介物(1%羟乙基纤维素、5%甘油)中HPMC-AS-HG分散体中的混悬剂(100mg/kg，周一、周三、周五，3周)、依立替康(100mg/kg，每隔7日，3周)或50%17-AG在媒介物(1%羟乙基纤维素、5%甘油)中HPMC-AS-HG分散体中的混悬剂(50mg/kg，周一、周三、周五)与依立替康(75mg/kg，每隔7日)的组合持续3周，并且肿瘤体积每周测量两次(图27A；图27B是图27A的放大部分)。在给药时间结束时，另外监测动物21日以跟踪肿瘤生长延迟。这些研究的结果表明在采用药物时，与17-AG或依立替康单一药物施用相比，17-AG加依立替康的组合显示增加的约90%平均肿瘤生长抑制功效。此外，在研究的再生长阶段期间，17-AG加依立替康的组合导致肿瘤进展延迟大约17日。相反，17-AG或依立替康的单一药物施用仅导致在采用药物时约75%的肿瘤生长抑制，而在研究的任一个单一药物治疗组中没有导致肿瘤进展延迟。
【实验8.图28A和28B】
在第八组研究中，通过将10×106个细胞植入裸鼠的右侧腹部，建立DuDu-1(G12V突变KRAS)患者衍生的肿瘤结直肠模型的皮下异种移植物。一旦肿瘤达到大约100-150mm3，将动物随机分入治疗组中并且施用媒介物或50%17-AG在媒介物(1%羟乙基纤维素、5%甘油)中HPMC-AS-HG分散体中的混悬剂(100mg/kg，周一、周三、周五，3周)、依立替康(100mg/kg，每隔7日，3周)或17-AG(50mg/kg，周一、周三、周五)与依立替康(75mg/kg，每隔7日)的组合持续3周，并且肿瘤体积每周测量两次(图28A；图28B是图28A的放大部分)。在给药时间结束时，另外监测动物24日以跟踪肿瘤生长延迟。这些研究的结果表明在采用药物时，与17-AG或依立替康单一药物施用相比，17-AG加依立替康的组合显示增加的77%平均肿瘤生长抑制(TGI)功效。此外，在研究的再生长阶段期间，17-AG加依立替康的组合导致肿瘤进展延迟大约16日。相反，依立替康的单一药物施用是相对无效的，仅导致在采用药物时约35%的肿瘤生长抑制，而没有导致肿瘤生长延迟。有趣地，单独17-AG施用导致70%TGI和在药物施用停止时肿瘤进展延迟10日。
【实验9.新型Hsp90抑制剂IPI-493在结直肠癌模型中的活性与RAS途径活化相关】
热休克蛋白90(Hsp90)已经作为癌症中有吸引力的靶出现，原因在于它在维持多种癌蛋白质(包括HER2、BCR-ABL、EML4-ALK和突变EGFR)的活性和稳定性方面发挥作用。Infinity正在开发两种新型Hsp90抑制剂IPI-504(静脉内施用)和IPI-493(口服施用)。IPI-504目前正在多个II期临床试验中评价；IPI-493正在2个I期临床试验中评价。为研究IPI-493在结直肠癌(CRC)中的功效，我们对CRC细胞系组进行体外生长抑制(GI)研究。IPI-493在携带kRAS或bRAF突变的细胞系中显示了10-100nM范围内的GI50。为探究IPI-493的体内功效，发展了几种突变bRAF和突变kRAS以及野生型kRAS/bRAF异种移植模型。IPI-493以100mg/kg每周三次的施用在所检验的全部突变模型中显示出明显作用，肿瘤生长抑制(TGI)值在70和90%之间并且在一个突变bRAF模型中出现消退。重要地，当评价与依立替康组合的IPI-493时，该组合显示相对于单独任一种单独的优越功效，这导致肿瘤总体消退和/或在4/10动物中的完全消退。有趣地，在野生型kRAS/bRAF模型中，IPI-493施用不导致肿瘤生长抑制。这些结果表明，MAPK途径的活化可以预先使这些细胞对HSP90抑制敏感。为研究IPI-493对MAPK途径活性的影响，我们在RAF/RAS突变状态不同的多个异种移植模型中在单次给予IPI-493后进行药效分析。在突变bRAF模型中，途径活性高并且IPI-493施用导致bRAF和MEK的活性下调。在不含kRAS或bRAF突变的模型中，我们检测到p-bRAF和p-MEK的低基线水平以及IPI-493施用的少量影响。当全部CRC异种移植物中的Ras途径活性与IPI-493功效比较时，途径活化和IPI-493的肿瘤生长抑制作用之间存在清晰的关联。我们的研究结果，即Ras途径活化预先使CRC细胞对IPI-493敏感，和我们与依立替康组合的数据为结直肠癌中的Hsp90抑制剂提供清晰的逻辑依据。
【结论】
上述实验中观察到，Hsp90抑制剂17-AG在KRAS和BRAF突变体CRC的体外和体内模型中均显示明显的功效。相反，大部分的KRAS和BRAF wt/wt模型对Hsp90抑制作用显示低敏感或不敏感。还观察到，Hsp90抑制剂17-AG和依立替康(CRC中的SOC)的组合显示出胜过单独施用的二种药物中任一者的功效。
来自突变K-Ras/B-Raf和wt/wt模型的肿瘤的途径分析表明，MAPK途径活性是Hsp90敏感性的良好预测物。例如，全部“敏感”模型均显示出增加的基线MAPK途径活性，而在显示十分低MAPK途径活性的模型中没有观察到可检测的功效。MAPK途径(RAS-RAF-MEK)活性的分析可以提供预测IPI-493敏感性的临床策略。
因此，这些数据表明，HSP90抑制作用是与SOC可比的，并且HSP90与SOC的组合可能是用于治疗CRC的更有效方法。
【实施例8：HSP90抑制剂和mTOR激酶抑制剂的组合用于治疗Ras驱动型恶性肿瘤的有效性】
mTOR激酶在人癌症中因多种肿瘤阻抑基因和癌基因(包括PTEN、TSC1/2、LKB、NF1、PI3K和RAS)中的遗传改变而往往下调(Menon,S.等(2008)Oncogene 27 Suppl 2,S43-51；Sabatini,D.M.(2006)Nat Rev Cancer 6,729-734)。因此，mTOR抑制剂已经作为潜在的癌症疗法在临床上评价(Chiang,G.G.等(2007)Trends Mol Med 13,433-442)。尽管这些抑制剂在肿瘤类型子集中显示出功效，然而响应一般是抑制细胞和暂时的，这提示当与其他药剂组合时，mTOR抑制剂可能更有效(Dancey,J.(2010)Nat Rev Clin Oncol.7,209-219)。本文显示了mTOR抑制剂与诱导ER胁迫的药物例如HSP90抑制剂IPI-504的强烈治疗效果。雷帕霉素/IPI-504治疗在非小细胞肺癌(NSCLC)的KrasG12D/p53基因修饰模型中引起肿瘤消退(数据未显示)。这些研究结果揭示了基于HSP90抑制剂和mTOR抑制剂组合，针对Ras驱动的恶性肿瘤发展疗法的有前景策略。
为研究雷帕霉素/IPI-504联合疗法在受RAS中激活性突变驱动的肿瘤中的潜在治疗性功效，使用一种基因修饰的模型，其中NSCLC受KRAS和p53中的复合突变驱动(Jackson,E.L.等(2005)Cancer Res65,10280-10288)。在这个模型中，通过腺病毒Cre的鼻内施用诱导肺腺癌，所述鼻内施用导致单个KrasG12D等位基因的伴随表达和p53的丢失(本文称作LSLKrasG12D/+；p53fl/fl小鼠)。
雷帕霉素和IPI-504组合的施用引起肿瘤消退(数据未显示)。
值得注意地，尽管组合的MEK和PI3K抑制剂已经显示在携带单独KrasG12D突变的鼠NSCLC中促进肿瘤消退(Engelman,J.A.等(2008)Nat Med 14,1351-1356)，然而迄今没有显示靶向疗法促进更有侵入性的KrasG12D、p53缺陷肿瘤消退。这些结果突出了本项研究结果的意义和它对人的KRAS驱动型NSCLC中的治疗性开发的潜在影响。
未来的研究应当揭示这个组合的治疗效果是否可以扩展至其他Ras驱动型和/或mTOR驱动型癌症。尽管mTOR抑制剂在一些癌症中显示出抗肿瘤活性，但是已经存在齐心协力的工作以增强这些药剂的功效和用途(综述见Dancey,J.(2010)Nat Rev Clin Oncol.7,209-219)。一项策略是开发更有力的mTOR或双重(mTOR/PI3K)抑制剂。几种第二代化合物目前正处于开发中，并且临床试验最终将揭示它们是否更有效。然而，第二种方法已经是鉴定可以将mTOR抑制剂通常抑制细胞的作用转化成细胞毒响应的联合疗法。本文中公开了一项开发在KRAS驱动型肺癌中有力mTOR抑制剂联合疗法的有前景策略。
这些研究提供有力数据以支持雷帕霉素/IPI-504组合疗法的临床研究的同时，它们还充当开发与其他相关药物组合的基础。例如，一种更有力的mTOR抑制剂可以增强这个组合的治疗性功效。类似地，目前几种结构不相关的Hsp90抑制剂正处于临床开发中，它们应当提供一系列可能在功效方面和/或在毒性方面不同的化合物。然而，如果使用肿瘤消退作为终点，仅将这些药物作为单一疗法在遗传异质性肿瘤中评价，则可能忽视它们的潜在用途。
我们的研究结果表明，这些药物可以在组合时潜在地协同，汇集于基本细胞生物学过程(ER胁迫和自噬)，并且在抵抗单一靶向药剂的两个稳健动物肿瘤模型中选择性杀伤肿瘤细胞。
【实施例9：HSP90抑制剂体外抑制神经内分泌和类癌细胞系的增殖】
【材料与方法】
细胞系BON-1(源自胰的转移性细胞)、H-720(源自肺的类癌细胞)、QGP-1(源自胰岛细胞癌)和HC45(源自回肠的类癌细胞)在补充有10%胎牛血清、1μg/ml链霉素和1μg/ml青霉素的RPMI-1640培养基中培育。检验全部细胞系支原体并且在37℃在5%CO2气氛下维持。
将细胞以10,000细胞/孔接种在96孔平板中24小时并且随后与递增浓度的IPI-504孵育72小时，并且使用重要线粒体功能染色CellTiter Glow试剂盒(Promega,Madison,WI)进行生存力研究。数据相对于DMSO媒介物对照归一化以产生生长抑制GI50值。
【背景】
胃肠胰神经内分泌肿瘤(GEP-NET，也称作类癌)最著作为同质群体的肿瘤可见，但是GEP-NET的分子表征进展导致WHO在2000年公布的更复杂分类。鉴于报道的发病率是2-3：100,000，这些肿瘤是相对地罕见的，但是5年存活率仅是约67％。对于局限化的肿瘤，由于产生过量的生物源性胺和激素，全身症状受这些分子的快速肝清除限制。然而，转移肿瘤经常产生失能性症状，包括腹泻、潮红、喘息和皮肤皮疹。
针对局部肿瘤的治疗选项仍是手术切除。然而，当症状表现时，约80％的患者已经形成肝脏或淋巴结转移。在晚期阶段，医学治疗选项仍是不良的。虽然经常通过有时与干扰素组合的生长抑素类似物(即兰瑞肽(lanreotide)和奥曲肽(octreotide))良好控制肿瘤相关症状，但是目前没有肿瘤生长的有效抑制剂。化疗治疗中使用依托泊苷加顺铂或者链脲佐菌素加5-FU或多柔比星的组合，然而缓解率是令人失望的0-30％。因此，迫切需要有效的新治疗策略。
热休克蛋白90(Hsp90)，一种新出现的癌症治疗靶，是高度表达的蛋白质伴侣，其与涉及癌基因的许多“客户”蛋白质结合。实际上，众多Hsp90客户蛋白是参与细胞增殖、血管生成、侵入和转移的激酶或转录因子。已经显示Hsp90ed在广泛范围的肿瘤类型中过表达，所述肿瘤类型包括乳腺、子宫内膜、卵巢、结肠、肺和前列腺肿瘤(CioccaDR等(2005)Cell Stress Chaperones.10(2)：86-103)。值得注意地，已知在GEP-NET中过表达的几种蛋白质受Hsp90调节，它们包括EGFR、ERbB2、IGF1-R和AKT(M，等(2008)WJG.14(16)：2461；PittSC等(2009)Am J Transl Res.1(3)：291-299)。
Hsp90的抑制导致客户蛋白经泛素-蛋白酶体途径快速降解(McDonough H等(2003)Cell Stress Chaperones.8(4)：303-308)。研究已经在多种模型实体肿瘤(例如，肺、乳腺、前列腺、胰腺、黑色素瘤)和血液癌(例如，慢性骨髓性白血病、多发性骨髓瘤)中显示Hsp90抑制剂的活性。HSP90抑制剂如IPI-504对几个GEP-NET细胞系生长的体外作用及其作用机制。
【结果】
图29A和29B中的图显示对于多个浓度的17-AG(IPI-493)和IPI-504，三个细胞系(BON-1,QGP-1和H-720)的生长抑制百分数。用递增浓度的IPI-504处理72小时的4个神经内分泌细胞系显示细胞增殖的剂量依赖性下降。细胞系NCI-H720和HC-45的生长抑制达到最大100%，这显示IPI-504的细胞毒效应，而细胞系BON-1和QGP-1达到60%的生长抑制平台期，这表明该药物的细胞抑制作用(图29A)。
此外，表6中提供17-AG、IPI-504、SNX-2112和NVP-AUY922的GI50值(即，减少处理的细胞生长至未处理细胞的生长一半时所需要的化合物浓度)。检验的全部类癌细胞系对IPI-504敏感，GI50值在10nM和1μM之间(表6)。
Figure BDA00001882655701931
因此，IPI-504和IPI-493(17-AG)通过诱导凋亡和细胞周期停滞来抑制神经内分泌细胞系的增殖。
【实施例10：BON-1细胞的异种移植研究】
六至八周龄雄性NCr无胸腺(nu-/nu-)裸小鼠(Taconic Farms,Hudson,NY)根据研究机构动物护理和使用委员会指南维持饲养。通过注射5×106个BON-1细胞至40只小鼠腹侧，产生异体移植物。将IPI-504(本文也称作IPI-504)(15mg/kg)或媒介物每周2次腹内施用(每组n=10)，并且每周两次用卡尺监测肿瘤异种移植物的大小。结果呈现为均数和SEM。如30图中所示，在研究结束时，与采用媒介物治疗相比，用IPI-504治疗的小鼠显示出肿瘤大小缩减58%。
【实施例11：IPI-504抑制Hsp90客户蛋白IGF-1R】
【材料与方法】
将BON-1和H-720细胞裂解物根据制造商的说明书与R&DSystems人磷酸-受体酪氨酸激酶(RTK)阵列(目录号#ARY001)杂交。在所述阵列中，将每种RTK一式二份点样。在角落处的杂交信号充当对照。该阵列揭示，BON-1和H-720细胞显示IR和IGF1R受体的组成型磷酸化。用1μM IPI-504或17-AG过夜处理抑制这种组成型磷酸化。
【结果】
胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)在胃肠胰神经内分泌肿瘤(GEP-NET)细胞中过表达并且它还是Hsp90的客户蛋白。BON-1细胞与递增浓度的IPI-504孵育24小时，并且使用磷酸-IGF-1R ELISA，根据制造商的操作方案(目录号#7820,Tyr 1131)监测细胞裂解物中磷酸化IGF-1R的水平。如图31中所示，用IPI-504处理时，磷酸-IGF-1R在BON-1细胞中以剂量依赖性方式降解。IPI-504的蛋白质降解和体外生长抑制性活性的EC50是相似的(约50nM)，这表明IPI-504的抗肿瘤活性可能部分地归因于这种生长因子受体的失活。
因此，生长因子受体IGF-1R在BON-1细胞系中组成型活化。用IPI-504处理以剂量依赖性方式减少磷酸-IGF-1R的量。这个过程的IC50与BON-1细胞生长受IPI-504抑制匹配。因此，抑制IGF-1R磷酸化可能是IPI-504的可能作用机制。
【实施例12:组合的Hsp90抑制和mTOR或Akt抑制在神经内分泌细胞系中的加性效应】
【材料与方法】
将BON-1细胞与1uM IPI-504、100nM雷帕霉素(Sigma)或二者组合孵育6小时或24小时。将50ug细胞裂解物对pAKT、总AKT、pS6、总S6、pERK 1/2(Cell Signaling)、IGF-1Rb、Hsp70和b-肌动蛋白(Santa Cruz)进行免疫印迹。用Bio-Rad Versa Doc系统进行成像分析和条带定量。使用GADPH的表达作为蛋白质载量的对照。
【结果】
由于PI3K/Akt/mTOR途径在神经内分泌肿瘤中活化，所以GEP-NET细胞用IPI-504和抑制AKT/mTOR途径的药物处理以寻找联合效应。在一个实验中，将BON-1细胞与1uM IPI-504、100nM雷帕霉素或二者的组合孵育6小时或24小时。将50μg细胞裂解物针对pAKT、总AKT、pS6、IGF-1Rβ、Hsp70和β-肌动蛋白进行免疫印迹。雷帕霉素抑制导致AKT磷酸化的增加而，与IPI-504孵育导致AKT降解。IPI-504和雷帕霉素的组合显示加性效应(图32)。这些数据表明，IPI-504和雷帕霉素叠加性地发挥作用以抑制mTOR下游的S6激酶活化。
【讨论】
通过使用建立的药物如生长抑素类似物，已经在控制罹患转移性GEP-NET的患者中所遭遇的往往致衰弱性过度分泌综合征方面取得巨大进程(Panzuto F,等.(2006)Ann.Oncol.17(3):461-466)。然而，旨在减缓肿瘤进展或诱导消退的抑制细胞治疗方案获得有限的成功(Kouvaraki MA等(2004)J Clin Oncol.22(23):4762-4771)。下调的Hsp90已知对于肿瘤存活和进展是重要的(Mahalingam D等(2009)BrJ Cancer 100(10):1523-1529；Ciocca DR等(2005)Cell StressChaperones.10(2):86-103)，并且GEP-NET中下调的几种蛋白质至少部分地受Hsp90控制(
Figure BDA00001882655701951
M,等(2008)WJG.14(16):2461；Pitt SC等(2009)Am J Transl Res.1(3):291-299)。在本研究中，IPI-504抑制Hsp90证实抑制神经内分泌肿瘤细胞，并且因此为GEP-NET治疗的新选项提供有前景的方法。
由于GEP-NET是非常不均一的，并且包括缓慢生长和快速生长的侵入性肿瘤(
Figure BDA00001882655701952
G等(2004)Annals of the New York Academy ofSciences.1014(胃肠胰神经内分泌肿瘤：分子和细胞生物学方面(Gastroenteropancreatic Neuroendocrine Tumor Disease：Molecularand Cell Biological Aspects):13-27)，重要的是检验新治疗剂时评价这种肿瘤实体的不同代表。因此，检验了具有不同生长速率和来源的五个细胞系。IPI-504在不同细胞系中的IC50值没有显示与细胞倍增时间的清晰相关性，这表明除生长速率之外的特征可能在确定Hsp90抑制作用敏感性方面是更重要的。
用IPI-504处理GEP-NET细胞系因诱导细胞周期停滞和/或凋亡导致细胞生长的时间依赖性和剂量依赖性缩减。在BON-1和CM细胞中，IPI-504的抗增殖作用与IGF-1受体的蛋白质水平降低相关，与较早的出版物完全符合，在所述出版物中，我们报道IGF-1受体在GEP-NET的存活和增殖中发挥重要作用(M,等(2006)Endocr.Relat.Cancer.13(1):135-149)。另外，作为Hsp90抑制的结果，PI3K/AKT/mTOR途径中认为在神经内分泌肿瘤细胞中受IGF-1受体严格调节(von Wichert G等(2005)Oncogene 24(7):1284-1289)的几种蛋白质下调。这个最可能不仅是IGF-1R下调的结果，还是Hsp90抑制的直接影响。AKT已知与作为其伴侣的Hsp90结合以防止降解。用IPI-504处理GEP-NE不仅减少活性的磷酸化AKT的量，还导致总AKT的降低，从而表明这种蛋白质的遍在蛋白化的增加。另外，核糖体蛋白L3(rpS6)，其进一步位于PI3K-AKT途径的下游，也下调并且受Hsp90直接影响(Kim T等(2006)Mol.Biol.Cell.17(2):824-833)。
接下来，评价IPI-504与其他靶向性癌症治疗药的组合。蛋白质mTORC1是PI3K-AKT途径的部分并且与AKT密切相互作用(Sarbassov DD等(2005)Science 307(5712):1098-1101)。最近已经完成一项II期研究，其研究与或不与奥曲肽组合的mTORC1抑制剂在胰腺神经内分泌肿瘤患者的作用，产生了有前景的结果。显示mTORC1抑制导致AKT因反馈抑制丧失而上调的研究(O'Reilly KE等(2006)Cancer Res.66(3):1500-1508)使得mTORC1抑制剂作为靶向PI3K/AKT途径内部其他蛋白质的药物的配偶物组合更有吸引力。因此，正在研究几种新化合物作为双重PI3K/mTORC1抑制剂。我们因此将IPI-504与mTORC1抑制剂(雷帕霉素)组合并且发现强烈的加性抗增殖作用。这些结果因至少两个原因是重要的。首先，在癌症中使用靶向疗法化疗药的多项体外和体内研究仅显示适中的抗肿瘤作用，主要地导致减慢病情。据信这是因细胞逃逸机制所致，当靶向单个分子时，所述逃逸机制更明显。因此，通过在多个位点同时靶向生长途径，如我们的结果中所示，可能产生更好的体内肿瘤反应。第二，通过组合两种药物，可希望在临床背景下减少不良事件。
最近，几项研究表明，Hsp90可在细胞外水平方面是重要的，因此它可能影响细胞运动性(Sidera K等(2008)Cell Cycle.(11):1564-1568)。选择性靶向胞外Hsp90的单克隆抗体已经显示在不同类型的癌症中体外减少转移性病灶的形成(Stellas D等(2007)Clin.Cancer Res.13(6):1831-1838)。IPI-504潜在地抑制胃肠神经内分泌肿瘤细胞的迁移，因此支持它在转移性疾病中发挥作用的设想。
总之，Hsp90抑制是GEP-NET中有吸引力的靶。联合治疗在我们的研究中显示出有前景的加性效应，并且转移性疾病似乎至是这种新治疗选项的特别有前景的目标。
【通过引用并入】
本文中提到的全部出版物、专利及专利申请的全部内容在此通过引用的方式完整地并入，如同专门且个别地说明通过引用方式并入每份单独的出版物、专利或专利申请。在矛盾的情况下，以本申请，包括本文中的任何定义将为准。
另外，通过引用方式完整并入涉及与公共数据库(如那些由基因组研究所(TIGR)在互联网网址tigr.org处和/或国家生物技术信息中心(NCBI)在互联网网址ncbi.nlm.nih.gov处维护的公共数据库)中条目相关的登录号的任何多核苷酸和多肽序列。
【等同物】
利用不超出常规的实验，本领域的技术人员会认识到，或将能够确定与本文中所述的本发明具体实施方案的众多等同物。此类等同物将由以下权利要求所涵盖。
【表1】
ALK(间变性淋巴瘤激酶)序列
ALK野生型mRNA
Ref Seq：NM_004304.3GI:29029631
GGGGGCGGCA GCGGTGGTAG CAGCTGGTAC CTCCCGCCGC CTCTGTTCGG  50
AGGGTCGCGG GGCACCGAGG TGCTTTCCGG CCGCCCTCTG GTCGGCCACC  100
CAAAGCCGCG GGCGCTGATG ATGGGTGAGG AGGGGGCGGC AAGATTTCGG  150
GCGCCCCTGC CCTGAACGCC CTCAGCTGCT GCCGCCGGGG CCGCTCCAGT  200
GCCTGCGAAC TCTGAGGAGC CGAGGCGCCG GTGAGAGCAA GGACGCTGCA  250
AACTTGCGCA GCGCGGGGGC TGGGATTCAC GCCCAGAAGT TCAGCAGGCA  300
GACAGTCCGA AGCCTTCCCG CAGCGGAGAG ATAGCTTGAG GGTGCGCAAG  350
ACGGCAGCCT CCGCCCTCGG TTCCCGCCCA GACCGGGCAG AAGAGCTTGG  400
AGGAGCCAAA AGGAACGCAA AAGGCGGCCA GGACAGCGTG CAGCAGCTGG  450
GAGCCGCCGT TCTCAGCCTT AAAAGTTGCA GAGATTGGAG GCTGCCCCGA  500
GAGGGGACAG ACCCCAGCTC CGACTGCGGG GGGCAGGAGA GGACGGTACC  550
CAACTGCCAC CTCCCTTCAA CCATAGTAGT TCCTCTGTAC CGAGCGCAGC  600
GAGCTACAGA CGGGGGCGCG GCACTCGGCG CGGAGAGCGG GAGGCTCAAG  650
GTCCCAGCCA GTGAGCCCAG TGTGCTTGAG TGTCTCTGGA CTCGCCCCTG  700
AGCTTCCAGG TCTGTTTCAT TTAGACTCCT GCTCGCCTCC GTGCAGTTGG  750
GGGAAAGCAA GAGACTTGCG CGCACGCACA GTCCTCTGGA GATCAGGTGG  800
AAGGAGCCGC TGGGTACCAA GGACTGTTCA GAGCCTCTTC CCATCTCGGG  850
GAGAGCGAAG GGTGAGGCTG GGCCCGGAGA GCAGTGTAAA CGGCCTCCTC  900
CGGCGGGATG GGAGCCATCG GGCTCCTGTG GCTCCTGCCG CTGCTGCTTT  950
CCACGGCAGC TGTGGGCTCC GGGATGGGGA CCGGCCAGCG CGCGGGCTCC  1000
CCAGCTGCGG GGCCGCCGCT GCAGCCCCGG GAGCCACTCA GCTACTCGCG  1050
CCTGCAGAGG AAGAGTCTGG CAGTTGACTT CGTGGTGCCC TCGCTCTTCC  1100
GTGTCTACGC CCGGGACCTA CTGCTGCCAC CATCCTCCTC GGAGCTGAAG  1150
GCTGGCAGGC CCGAGGCCCG CGGCTCGCTA GCTCTGGACT GCGCCCCGCT  1200
GCTCAGGTTG CTGGGGCCGG CGCCGGGGGT CTCCTGGACC GCCGGTTCAC  1250
CAGCCCCGGC AGAGGCCCGG ACGCTGTCCA GGGTGCTGAA GGGCGGCTCC  1300
GTGCGCAAGC TCCGGCGTGC CAAGCAGTTG GTGCTGGAGC TGGGCGAGGA  1350
GGCGATCTTG GAGGGTTGCG TCGGGCCCCC CGGGGAGGCG GCTGTGGGGC  1400
TGCTCCAGTT CAATCTCAGC GAGCTGTTCA GTTGGTGGAT TCGCCAAGGC  1450
GAAGGGCGAC TGAGGATCCG CCTGATGCCC GAGAAGAAGG CGTCGGAAGT  1500
GGGCAGAGAG GGAAGGCTGT CCGCGGCAAT TCGCGCCTCC CAGCCCCGCC  1550
TTCTCTTCCA GATCTTCGGG ACTGGTCATA GCTCCTTGGA ATCACCAACA  1600
AACATGCCTT CTCCTTCTCC TGATTATTTT ACATGGAATC TCACCTGGAT  1650
AATGAAAGAC TCCTTCCCTT TCCTGTCTCA TCGCAGCCGA TATGGTCTGG  1700
AGTGCAGCTT TGACTTCCCC TGTGAGCTGG AGTATTCCCC TCCACTGCAT  1750
GACCTCAGGA ACCAGAGCTG GTCCTGGCGC CGCATCCCCT CCGAGGAGGC  1800
CTCCCAGATG GACTTGCTGG ATGGGCCTGG GGCAGAGCGT TCTAAGGAGA  1850
TGCCCAGAGG CTCCTTTCTC CTTCTCAACA CCTCAGCTGA CTCCAAGCAC  1900
ACCATCCTGA GTCCGTGGAT GAGGAGCAGC AGTGAGCACT GCACACTGGC  1950
CGTCTCGGTG CACAGGCACC TGCAGCCCTC TGGAAGGTAC ATTGCCCAGC  2000
TGCTGCCCCA CAACGAGGCT GCAAGAGAGA TCCTCCTGAT GCCCACTCCA  2050
GGGAAGCATG GTTGGACAGT GCTCCAGGGA AGAATCGGGC GTCCAGACAA  2100
CCCATTTCGA GTGGCCCTGG AATACATCTC CAGTGGAAAC CGCAGCTTGT  2150
CTGCAGTGGA CTTCTTTGCC CTGAAGAACT GCAGTGAAGG AACATCCCCA  2200
GGCTCCAAGA TGGCCCTGCA GAGCTCCTTC ACTTGTTGGA ATGGGACAGT  2250
CCTCCAGCTT GGGCAGGCCT GTGACTTCCA CCAGGACTGT GCCCAGGGAG  2300
AAGATGAGAG CCAGATGTGC CGGAAACTGC CTGTGGGTTT TTACTGCAAC  2350
TTTGAAGATG GCTTCTGTGG CTGGACCCAA GGCACACTGT CACCCCACAC  2400
TCCTCAATGG CAGGTCAGGA CCCTAAAGGA TGCCCGGTTC CAGGACCACC  2450
AAGACCATGC TCTATTGCTC AGTACCACTG ATGTCCCCGC TTCTGAAAGT  2500
GCTACAGTGA CCAGTGCTAC GTTTCCTGCA CCGATCAAGA GCTCTCCATG  2550
TGAGCTCCGA ATGTCCTGGC TCATTCGTGG AGTCTTGAGG GGAAACGTGT  2600
CCTTGGTGCT AGTGGAGAAC AAAACCGGGA AGGAGCAAGG CAGGATGGTC  2650
TGGCATGTCG CCGCCTATGA AGGCTTGAGC CTGTGGCAGT GGATGGTGTT  2700
GCCTCTCCTC GATGTGTCTG ACAGGTTCTG GCTGCAGATG GTCGCATGGT  2750
GGGGACAAGG ATCCAGAGCC ATCGTGGCTT TTGACAATAT CTCCATCAGC  2800
CTGGACTGCT ACCTCACCAT TAGCGGAGAG GACAAGATCC TGCAGAATAC  2850
AGCACCCAAA TCAAGAAACC TGTTTGAGAG AAACCCAAAC AAGGAGCTGA  2900
AACCCGGGGA AAATTCACCA AGACAGACCC CCATCTTTGA CCCTACAGTT  2950
CATTGGCTGT TCACCACATG TGGGGCCAGC GGGCCCCATG GCCCCACCCA  3000
GGCACAGTGC AACAACGCCT ACCAGAACTC CAACCTGAGC GTGGAGGTGG  3050
GGAGCGAGGG CCCCCTGAAA GGCATCCAGA TCTGGAAGGT GCCAGCCACC  3100
GACACCTACA GCATCTCGGG CTACGGAGCT GCTGGCGGGA AAGGCGGGAA  3150
GAACACCATG ATGCGGTCCC ACGGCGTGTC TGTGCTGGGC ATCTTCAACC  3200
TGGAGAAGGA TGACATGCTG TACATCCTGG TTGGGCAGCA GGGAGAGGAC  3250
GCCTGCCCCA GTACAAACCA GTTAATCCAG AAAGTCTGCA TTGGAGAGAA  3300
CAATGTGATA GAAGAAGAAA TCCGTGTGAA CAGAAGCGTG CATGAGTGGG  3350
CAGGAGGCGG AGGAGGAGGG GGTGGAGCCA CCTACGTATT TAAGATGAAG  3400
GATGGAGTGC CGGTGCCCCT GATCATTGCA GCCGGAGGTG GTGGCAGGGC  3450
CTACGGGGCC AAGACAGACA CGTTCCACCC AGAGAGACTG GAGAATAACT  3500
CCTCGGTTCT AGGGCTAAAC GGCAATTCCG GAGCCGCAGG TGGTGGAGGT  3550
GGCTGGAATG ATAACACTTC CTTGCTCTGG GCCGGAAAAT CTTTGCAGGA  3600
GGGTGCCACC GGAGGACATT CCTGCCCCCA GGCCATGAAG AAGTGGGGGT  3650
GGGAGACAAG AGGGGGTTTC GGAGGGGGTG GAGGGGGGTG CTCCTCAGGT  3700
GGAGGAGGCG GAGGATATAT AGGCGGCAAT GCAGCCTCAA ACAATGACCC  3750
CGAAATGGAT GGGGAAGATG GGGTTTCCTT CATCAGTCCA CTGGGCATCC  3800
TGTACACCCC AGCTTTAAAA GTGATGGAAG GCCACGGGGA AGTGAATATT  3850
AAGCATTATC TAAACTGCAG TCACTGTGAG GTAGACGAAT GTCACATGGA  3900
CCCTGAAAGC CACAAGGTCA TCTGCTTCTG TGACCACGGG ACGGTGCTGG  3950
CTGAGGATGG CGTCTCCTGC ATTGTGTCAC CCACCCCGGA GCCACACCTG  4000
CCACTCTCGC TGATCCTCTC TGTGGTGACC TCTGCCCTCG TGGCCGCCCT  4050
GGTCCTGGCT TTCTCCGGCA TCATGATTGT GTACCGCCGG AAGCACCAGG  4100
AGCTGCAAGC CATGCAGATG GAGCTGCAGA GCCCTGAGTA CAAGCTGAGC  4150
AAGCTCCGCA CCTCGACCAT CATGACCGAC TACAACCCCA ACTACTGCTT  4200
TGCTGGCAAG ACCTCCTCCA TCAGTGACCT GAAGGAGGTG CCGCGGAAAA  4250
ACATCACCCT CATTCGGGGT CTGGGCCATG GCGCCTTTGG GGAGGTGTAT  4300
GAAGGCCAGG TGTCCGGAAT GCCCAACGAC CCAAGCCCCC TGCAAGTGGC  4350
TGTGAAGACG CTGCCTGAAG TGTGCTCTGA ACAGGACGAA CTGGATTTCC  4400
TCATGGAAGC CCTGATCATC AGCAAATTCA ACCACCAGAA CATTGTTCGC  4450
TGCATTGGGG TGAGCCTGCA ATCCCTGCCC CGGTTCATCC TGCTGGAGCT  4500
CATGGCGGGG GGAGACCTCA AGTCCTTCCT CCGAGAGACC CGCCCTCGCC  4550
CGAGCCAGCC CTCCTCCCTG GCCATGCTGG ACCTTCTGCA CGTGGCTCGG  4600
GACATTGCCT GTGGCTGTCA GTATTTGGAG GAAAACCACT TCATCCACCG  4650
AGACATTGCT GCCAGAAACT GCCTCTTGAC CTGTCCAGGC CCTGGAAGAG  4700
TGGCCAAGAT TGGAGACTTC GGGATGGCCC GAGACATCTA CAGGGCGAGC  4750
TACTATAGAA AGGGAGGCTG TGCCATGCTG CCAGTTAAGT GGATGCCCCC  4800
AGAGGCCTTC ATGGAAGGAA TATTCACTTC TAAAACAGAC ACATGGTCCT  4850
TTGGAGTGCT GCTATGGGAA ATCTTTTCTC TTGGATATAT GCCATACCCC  4900
AGCAAAAGCA ACCAGGAAGT TCTGGAGTTT GTCACCAGTG GAGGCCGGAT  4950
GGACCCACCC AAGAACTGCC CTGGGCCTGT ATACCGGATA ATGACTCAGT  5000
GCTGGCAACA TCAGCCTGAA GACAGGCCCA ACTTTGCCAT CATTTTGGAG  5050
AGGATTGAAT ACTGCACCCA GGACCCGGAT GTAATCAACA CCGCTTTGCC  5100
GATAGAATAT GGTCCACTTG TGGAAGAGGA AGAGAAAGTG CCTGTGAGGC  5150
CCAAGGACCC TGAGGGGGTT CCTCCTCTCC TGGTCTCTCA ACAGGCAAAA  5200
CGGGAGGAGG AGCGCAGCCC AGCTGCCCCA CCACCTCTGC CTACCACCTC  5250
CTCTGGCAAG GCTGCAAAGA AACCCACAGC TGCAGAGATC TCTGTTCGAG  5300
TCCCTAGAGG GCCGGCCGTG GAAGGGGGAC ACGTGAATAT GGCATTCTCT  5350
CAGTCCAACC CTCCTTCGGA GTTGCACAAG GTCCACGGAT CCAGAAACAA  5400
GCCCACCAGC TTGTGGAACC CAACGTACGG CTCCTGGTTT ACAGAGAAAC  5450
CCACCAAAAA GAATAATCCT ATAGCAAAGA AGGAGCCACA CGACAGGGGT  5500
AACCTGGGGC TGGAGGGAAG CTGTACTGTC CCACCTAACG TTGCAACTGG  5550
GAGACTTCCG GGGGCCTCAC TGCTCCTAGA GCCCTCTTCG CTGACTGCCA  5600
ATATGAAGGA GGTACCTCTG TTCAGGCTAC GTCACTTCCC TTGTGGGAAT  5650
GTCAATTACG GCTACCAGCA ACAGGGCTTG CCCTTAGAAG CCGCTACTGC  5700
CCCTGGAGCT GGTCATTACG AGGATACCAT TCTGAAAAGC AAGAATAGCA  5750
TGAACCAGCC TGGGCCCTGA GCTCGGTCGC ACACTCACTT CTCTTCCTTG  5800
GGATCCCTAA GACCGTGGAG GAGAGAGAGG CAATGGCTCC TTCACAAACC  5850
AGAGACCAAA TGTCACGTTT TGTTTTGTGC CAACCTATTT TGAAGTACCA  5900
CCAAAAAAGC TGTATTTTGA AAATGCTTTA GAAAGGTTTT GAGCATGGGT  5950
TCATCCTATT CTTTCGAAAG AAGAAAATAT CATAAAAATG AGTGATAAAT  6000
ACAAGGCCCA GATGTGGTTG CATAAGGTTT TTATGCATGT TTGTTGTATA  6050
CTTCCTTATG CTTCTTTCAA ATTGTGTGTG CTCTGCTTCA ATGTAGTCAG  6100
AATTAGCTGC TTCTATGTTT CATAGTTGGG GTCATAGATG TTTCCTTGCC  6150
TTGTTGATGT GGACATGAGC CATTTGAGGG GAGAGGGAAC GGAAATAAAG  6200
GAGTTATTTG TAATGACTAA aa    (SEQ  ID NO：1)
ALK野生型蛋白序列
Ref seq NP_004295
   1 mgaigllwll plllstaavg sgmgtgqrag spaagpplqp replsysrlq rkslavdfvv
  61 pslfrvyard lllppsssel kagrpeargs laldcapllr llgpapgvsw tagspapaea
 121 rtlsrvlkgg svrklrrakq lvlelgeeai legcvgppge aavgllqfnl selfswwirq
 181 gegrlrirlm pekkasevgr egrlsaaira sqprllfqif gtghsslesp tnmpspspdy
 241 ftwnltwimk dsfpflshrs ryglecsfdf pceleysppl hdlrnqswsw rripseeasq
 301 mdlldgpgae rskemprgsf lllntsadsk htilspwmrs ssehctlavs vhrhlqpsgr
 361 yiaqllphne aareillmpt pgkhgwtvlq grigrpdnpf rvaleyissg nrslsavdff
 421 alkncsegts pgskmalqss ftcwngtvlq lgqacdfhqd caqgedesqm crklpvgfyc
 481 nfedgfcgwt qgtlsphtpq wqvrtlkdar fqdhqdhall lsttdvpase satvtsatfp
 541 apiksspcel rmswlirgvl rgnvslvlve nktgkeqgrm vwhvaayegl slwqwmvlpl
 601 ldvsdrfwlq mvawwgqgsr aivafdnisi sldcyltisg edkilqntap ksrnlfernp
 661 nkelkpgens prqtpifdpt vhwlfttcga sgphgptqaq cnnayqnsnl svevgsegpl
 721 kgiqiwkvpa tdtysisgyg aaggkggknt mmrshgvsvl gifnlekddm lyilvgqqge
 781 dacpstnqli qkvcigennv ieeeirvnrs vhewaggggg gggatyvfkm kdgvpvplii
 841 aaggggrayg aktdtfhper lennssvlgl ngnsgaaggg ggwndntsll wagkslqega
 901 tgghscpqam kkwgwetrgg fggggggcss ggggggyigg naasnndpem dgedgvsfis
 961 plgilytpal kvmeghgevn ikhylncshc evdechmdpe shkvicfcdh gtvlaedgvs
1021 civsptpeph lplslilsvv tsalvaalvl afsgimivyr rkhqelqamq melqspeykl
1081 sklrtstimt dynpnycfag ktssisdlke vprknitlir glghgafgev yegqvsgmpn
1141 dpsplqvavk tlpevcseqd eldflmeali iskfnhqniv rcigvslqsl prfillelma
1201 ggdlksflre trprpsqpss lamldllhva rdiacgcqyl eenhfihrdi aarnclltcp
1261 gpgrvakigd fgmardiyra syyrkggcam lpvkwmppea fmegiftskt dtwsfgvllw
1321 eifslgympy psksnqevle fvtsggrmdp pkncpgpvyr imtqcwqhqp edrpnfaiil
1381 erieyctqdp dvintalpie ygplveeeek vpvrpkdpeg vppllvsqqa kreeerspaa
1441 ppplpttssg kaakkptaae isvrvprgpa vegghvnmaf sqsnppselh kvhgsrnkpt
1501 slwnptygsw ftekptkknn piakkephdr gnlglegsct vppnvatgrl pgasllleps
1561 sltanmkevp lfrlrhfpcg nvnygyqqqg lpleaatapg aghyedtilk sknsmnqpgp
(SEQID NO：2)
融合蛋白EML4-ALK变体1的mRNA
ggcggcgcgg cgcggcgctc gcggctgctg cctgggaggg aggccgggca  50
ggcggctgag cggcgcggct ctcaacgtga cggggaagtg gttcgggcgg  100
ccgcggctta ctaccccagg gcgaacggac ggacgacgga ggcgggagcc  150
ggtagccgag ccgggcgacc tagagaacga gcgggtcagg ctcagcgtcg  200
gccactctgt cggtccgctg aatgaagtgc ccgcccctct gagcccggag  250
cccggcgctt tccccgcaag atggacggtt tcgccggcag tctcgatgat  300
agtatttctg ctgcaagtac ttctgatgtt caagatcgcc tgtcagctct  350
tgagtcacga gttcagcaac aagaagatga aatcactgtg ctaaaggcgg  400
ctttggctga tgttttgagg cgtcttgcaa tctctgaaga tcatgtggcc  450
tcagtgaaaa aatcagtctc aagtaaaggc caaccaagcc ctcgagcagt  500
tattcccatg tcctgtataa ccaatggaag tggtgcaaac agaaaaccaa  550
gtcataccag tgctgtctca attgcaggaa aagaaactct ttcatctgct  600
gctaaaagtg gtacagaaaa aaagaaagaa aaaccacaag gacagagaga  650
aaaaaaagag gaatctcatt ctaatgatca aagtccacaa attcgagcat  700
caccttctcc ccagccctct tcacaacctc tccaaataca cagacaaact  750
ccagaaagca agaatgctac tcccaccaaa agcataaaac gaccatcacc  800
agctgaaaag tcacataatt cttgggaaaa ttcagatgat agccgtaata  850
aattgtcgaa aataccttca acacccaaat taataccaaa agttaccaaa  900
actgcagaca agcataaaga tgtcatcatc aaccaagaag gagaatatat  950
taaaatgttt atgcgcggtc ggccaattac catgttcatt ccttccgatg  1000
ttgacaacta tgatgacatc agaacggaac tgcctcctga gaagctcaaa  1050
ctggagtggg catatggtta tcgaggaaag gactgtagag ctaatgttta  1100
ccttcttccg accggggaaa tagtttattt cattgcatca gtagtagtac  1150
tatttaatta tgaggagaga actcagcgac actacctggg ccatacagac  1200
tgtgtgaaat gccttgctat acatcctgac aaaattagga ttgcaactgg  1250
acagatagct ggcgtggata aagatggaag gcctctacaa ccccacgtca  1300
gagtgtggga ttctgttact ctatccacac tgcagattat tggacttggc  1350
acttttgagc gtggagtagg atgcctggat ttttcaaaag cagattcagg  1400
tgttcattta tgtgttattg atgactccaa tgagcatatg cttactgtat  1450
gggactggca gaagaaagca aaaggagcag aaataaagac aacaaatgaa  1500
gttgttttgg ctgtggagtt tcacccaaca gatgcaaata ccataattac  1550
atgcggtaaa tctcatattt tcttctggac ctggagcggc aattcactaa  1600
caagaaaaca gggaattttt gggaaatatg aaaagccaaa atttgtgcag  1650
tgtttagcat tcttggggaa tggagatgtt cttactggag actcaggtgg  1700
agtcatgctt atatggagca aaactactgt agagcccaca cctgggaaag  1750
gacctaaAGT GTACCGCCGG AAGCACCAGG AGCTGCAAGC CATGCAGATG  1800
GAGCTGCAGA GCCCTGAGTA CAAGCTGAGC AAGCTCCGCA CCTCGACCAT  1850
CATGACCGAC TACAACCCCA ACTACTGCTT TGCTGGCAAG ACCTCCTCCA  1900
TCAGTGACCT GAAGGAGGTG CCGCGGAAAA ACATCACCCT CATTCGGGGT  1950
CTGGGCCATG GaGCCTTTGG GGAGGTGTAT GAAGGCCAGG TGTCCGGAAT  2000
GCCCAACGAC CCAAGCCCCC TGCAAGTGGC TGTGAAGACG CTGCCTGAAG  2050
TGTGCTCTGA ACAGGACGAA CTGGATTTCC TCATGGAAGC CCTGATCATC  2100
AGCAAATTCA ACCACCAGAA CATTGTTCGC TGCATTGGGG TGAGCCTGCA  2150
ATCCCTGCCC CGGTTCATCC TGCTGGAGCT CATGGCGGGG GGAGACCTCA  2200
AGTCCTTCCT CCGAGAGACC CGCCCTCGCC CGAGCCAGCC CTCCTCCCTG  2250
GCCATGCTGG ACCTTCTGCA CGTGGCTCGG GACATTGCCT GTGGCTGTCA  2300
GTATTTGGAG GAAAACCACT TCATCCACCG AGACATTGCT GCCAGAAACT  2350
GCCTCTTGAC CTGTCCAGGC CCTGGAAGAG TGGCCAAGAT TGGAGACTTC  2400
GGGATGGCCC GAGACATCTA CAGGGCGAGC TACTATAGAA AGGGAGGCTG  2450
TGCCATGCTG CCAGTTAAGT GGATGCCCCC AGAGGCCTTC ATGGAAGGAA  2500
TATTCACTTC TAAAACAGAC ACATGGTCCT TTGGAGTGCT GCTATGGGAA  2550
ATCTTTTCTC TTGGATATAT GCCATACCCC AGCAAAAGCA ACCAGGAAGT  2600
TCTGGAGTTT GTCACCAGTG GAGGCCGGAT GGACCCACCC AAGAACTGCC  2650
CTGGGCCTGT ATACCGGATA ATGACTCAGT GCTGGCAACA TCAGCCTGAA  2700
GACAGGCCCA ACTTTGCCAT CATTTTGGAG AGGATTGAAT ACTGCACCCA  2750
GGACCCGGAT GTAATCAACA CCGCTTTGCC GATAGAATAT GGTCCACTTG  2800
TGGAAGAGGA AGAGAAAGTG CCTGTGAGGC CCAAGGACCC TGAGGGGGTT  2850
CCTCCTCTCC TGGTCTCTCA ACAGGCAAAA CGGGAGGAGG AGCGCAGCCC  2900
AGCTGCCCCA CCACCTCTGC CTACCACCTC CTCTGGCAAG GCTGCAAAGA  2950
AACCCACAGC TGCAGAGgTC TCTGTTCGAG TCCCTAGAGG GCCGGCCGTG  3000
GAAGGGGGAC ACGTGAATAT GGCATTCTCT CAGTCCAACC CTCCTTCGGA  3050
GTTGCACAgG GTCCACGGAT CCAGAAACAA GCCCACCAGC TTGTGGAACC  3100
CAACGTACGG CTCCTGGTTT ACAGAGAAAC CCACCAAAAA GAATAATCCT  3150
ATAGCAAAGA AGGAGCCACA CGAgAGGGGT AACCTGGGGC TGGAGGGAAG  3200
CTGTACTGTC CCACCTAACG TTGCAACTGG GAGACTTCCG GGGGCCTCAC  3250
TGCTCCTAGA GCCCTCTTCG CTGACTGCCA ATATGAAGGA GGTACCTCTG  3300
TTCAGGCTAC GTCACTTCCC TTGTGGGAAT GTCAATTACG GCTACCAGCA  3350
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GCTCGGTCaC ACACTCACTT CTCTTCCTTG GGATCCCTAA GACCGTGGAG  3500
GAGAGAGAGG CAATcaatGG CTCCTTCACA AACCAGAGAC CAAATGTCAC  3550
GTTTTGTTTT GTGCCAACCT ATTTTGAAGT ACCACCAAAA AAGCTGTATT  3600
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GTTGCATAAG GTTTTTATGC ATGTTTGTTG TATACTTCCT TATGCTTCTT  3750
TtAAATTGTG TGTGCTCTGC TTCAATGTAG TCAGAATTAG CTGCTTCTAT  3800
GTTTCATAGT TGGGGTCATA GATGTTTCCT TGCCTTGTTG ATGTGGACAT  3850
GAGCCATTTG AGGGGAGAGG GAACGGAAAT AAAGGAGTTA TTTGTAATGA  3900
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa    (SEQID NO：3)
融合蛋白EML4-ALK变体2的mRNA
gGCGGCGCGG CGCGGCGCTC GCGGCTGCTG CCTGGGAGGG AGGCCGGGCA  50
GGCGGCTGAG CGGCGCGGCT CTCAACGTGA CGGGGAAGTG GTTCGGGCGG  100
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GGTAGCCGAG CCGGGCGACC TAGAGAACGA GCGGGTCAGG CTCAGCGTCG  200
GCCACTCTGT CGGTCCGCTG AATGAAGTGC CCGCCCCTCT gAGCCCGGAG  250
CCCGGCGCTT TCCCCGCAAG ATGGACGGTT TCGCCGGCAG TCTCGATGAT  300
AGTATTTCTG CTGCAAGTAC TTCTGATGTT CAAGATCGCC TGTCAGCTCT  350
TGAGTCACGA GTTCAGCAAC AAGAAGATGA AATCACTGTG CTAAAGGCGG  400
CTTTGGCTGA TGTTTTGAGG CGTCTTGCAA TCTCTGAAGA TCATGTGGCC  450
TCAGTGAAAA AATCAGTCTC AAGTAAAGGC CAACCAAGCC CTCGAGCAGT  500
TATTCCCATG TCCTGTATAA CCAATGGAAG TGGTGCAAAC AGAAAACCAA  550
GTCATACCAG TGCTGTCTCA ATTGCAGGAA AAGAAACTCT TTCATCTGCT  600
GCTAAAAGTG GTACAGAAAA AAAGAAAGAA AAACCACAAG GACAGAGAGA  650
AAAAAAAGAG GAATCTCATT CTAATGATCA AAGTCCACAA ATTCGAGCAT  700
CACCTTCTCC CCAGCCCTCT TCACAACCTC TCCAAATACA CAGACAAACT  750
CCAGAAAGCA AGAATGCTAC TCCCACCAAA AGCATAAAAC GACCATCACC  800
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AATTGTCGAA AATACCTTCA ACACCCAAAT TAATACCAAA AGTTACCAAA  900
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TAAAATGTTT ATGCGCGGTC GGCCAATTAC CATGTTCATT CCTTCCGATG  1000
TTGACAACTA TGATGACATC AGAACGGAAC TGCCTCCTGA GAAGCTCAAA  1050
CTGGAGTGGG CATATGGTTA TCGAGGAAAG GACTGTAGAG CTAATGTTTA  1100
CCTTCTTCCG ACCGGGgAAA TAGTTTATTT CATTGCATCA GTAGTAGTAC  1150
TATTTAATTA TGAGGAGAGA ACTCAGCGAC ACTACCTGGG CCATACAGAC  1200
TGTGTGAAAT GCCTTGCTAT ACATCCTGAC AAAATTAGGA TTGCAACTGG  1250
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GAGTGTGGGA TTCTGTTACT CTATCCACAC TGCAGATTAT TGGACTTGGC  1350
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TGTTCATTTA TGTgTTATTG ATGACTCCAA TGAGCATATG CTTACTGTAT  1450
GGGACTGGCA GAAGAAAGCA AAAGGAGCAG AAATAAAGAC AACAAATGAA  1500
GTTGTTTTGG CTGTGGAGTT TCACCCAACA GATGCAAATA CCATAATTAC  1550
ATGCGGTAAA TCTCATATTT TCTTCTGGAC CTGGAGCGGC AATTCACTAA  1600
CAAGAAAACA GGGAATTTTT GGGAAATATG AAAAGCCAAA ATTTGTGCAG  1650
TGTTTAGCAT TCTTGGGGAA TGGAGATGTT CTTACTGGAG ACTCAGGTGG  1700
AGTCATGCTT ATATGGAGCA AAACTACTGT AGAGCCCACA CCTGGGAAAG  1750
GACCTAAAGG TGTATATCAA ATCAGCAAAC AAATCAAAGC TCATGATGGC  1800
AGTGTGTTCA CACTTTGTCA GATGAGAAAT GGGATGTTAT TAACTGGAGG  1850
AGGGAAAGAC AGAAAAATAA TTCTGTGGGA TCATGATCTG AATCCTGAAA  1900
GAGAAATAGA GGTTCCTGAT CAGTATGGCA CAATCAGAGC TGTAGCAGAA  1950
GGAAAGGCAG ATCAATTTTT AGTAGGCACA TCACGAAACT TTATTTTACG  2000
AGGAACATTT AATGATGGCT TCCAAATAGA AGTACAGGGT CATACAGATG  2050
AGCTTTGGGG TCTTGCCACA CATCCCTTCA AAGATTTGCT CTTGACATGT  2100
GCTCAGGACA GGCAGGTGTG CCTGTGGAAC TCAATGGAAC ACAGGCTGGA  2150
ATGGACCAGG CTGGTAGATG AACCAGGACA CTGTGCAGAT TTTCATCCAA  2200
GTGGCACAGT GGTGGCCATA GGAACGCACT CAGGCAGGTG GTTTGTTCTG  2250
GATGCAGAAA CCAGAGATCT AGTTTCTATC CACACAGACG GGAATGAACA  2300
GCTCTCTGTG ATGCGCTACT CAATAGATGG TACCTTCCTG GCTGTAGGAT  2350
CTCATGACAA CTTTATTTAC CTCTATGTAG TCTCTGAAAA TGGAAGAAAA  2400
TATAGCAGAT ATGGAAGGTG CACTGGACAT TCCAGCTACA TCACACACCT  2450
TGACTGGTCC CCAGACAACA AGTATATAAT GTCTAACTCG GGAGACTATG  2500
AAATATTGTA CTtgtaccgc cggaagcacc aggagctgca agccatgcag  2550
atggagctgc agagccctga gtacaagctg agcaagctcc gcacctcgac  2600
catcatgacc gactacaacc ccaactactg ctttgctggc aagacctcct  2650
ccatcagtga cctgaaggag gtgccgcgga aaaacatcac cctcattcgg  2700
ggtctgggcc atggagcctt tggggaggtg tatgaaggcc aggtgtccgg  2750
aatgcccaac gacccaagcc ccctgcaagt ggctgtgaag acgctgcctg  2800
aagtgtgctc tgaacaggac gaactggatt tcctcatgga agccctgatc  2850
atcagcaaat tcaaccacca gaacattgtt cgctgcattg gggtgagcct  2900
gcaatccctg ccccggttca tcctgctgga gctcatggcg gggggagacc  2950
tcaagtcctt cctccgagag acccgccctc gcccgagcca gccctcctcc  3000
ctggccatgc tggaccttct gcacgtggct cgggacattg cctgtggctg  3050
tcagtatttg gaggaaaacc acttcatcca ccgagacatt gctgccagaa  3100
actgcctctt gacctgtcca ggccctggaa gagtggccaa gattggagac  3150
ttcgggatgg cccgagacat ctacagggcg agctactata gaaagggagg  3200
ctgtgccatg ctgccagtta agtggatgcc cccagaggcc ttcatggaag  3250
gaatattcac ttctaaaaca gacacatggt cctttggagt gctgctatgg  3300
gaaatctttt ctcttggata tatgccatac cccagcaaaa gcaaccagga  3350
agttctggag tttgtcacca gtggaggccg gatggaccca cccaagaact  3400
gccctgggcc tgtataccgg ataatgactc agtgctggca acatcagcct  3450
gaagacaggc ccaactttgc catcattttg gagaggattg aatactgcac  3500
ccaggacccg gatgtaatca acaccgcttt gccgatagaa tatggtccac  3550
ttgtggaaga ggaagagaaa gtgcctgtga ggcccaagga ccctgagggg  3600
gttcctcctc tcctggtctc tcaacaggca aaacgggagg aggagcgcag  3650
cccagctgcc ccaccacctc tgcctaccac ctcctctggc aaggctgcaa  3700
agaaacccac agctgcagag gtctctgttc gagtccctag agggccggcc  3750
gtggaagggg gacacgtgaa tatggcattc tctcagtcca accctccttc  3800
ggagttgcac agggtccacg gatccagaaa caagcccacc agcttgtgga  3850
acccaacgta cggctcctgg tttacagaga aacccaccaa aaagaataat  3900
cctatagcaa agaaggagcc acacgagagg ggtaacctgg ggctggaggg  3950
aagctgtact gtcccaccta acgttgcaac tgggagactt ccgggggcct  4000
cactgctcct agagccctct tcgctgactg ccaatatgaa ggaggtacct  4050
ctgttcaggc tacgtcactt cccttgtggg aatgtcaatt acggctacca  4100
gcaacagggc ttgcccttag aagccgctac tgcccctgga gctggtcatt  4150
acgaggatac cattctgaaa agcaagaata gcatgaacca gcctgggccc  4200
tgagctcggt cacacactca cttctcttcc ttgggatccc taagaccgtg  4250
gaggagagag aggcaatcaa tggctccttc acaaaccaga gaccaaatgt  4300
cacgttttgt tttgtgccaa cctattttga agtaccacca aaaaagctgt  4350
attttgaaaa tgctttagaa aggttttgag catgggttca tcctattctt  4400
tcgaaagaag aaaatatcat aaaaatgagt gataaataca aggcccagat 4450
gtggttgcat aaggttttta tgcatgtttg ttgtatactt ccttatgctt  4500
cttttaaatt gtgtgtgctc tgcttcaatg tagtcagaat tagctgcttc  4550
tatgtttcat agttggggtc atagatgttt ccttgccttg ttgatgtgga  4600
catgagccat ttgaggggag agggaacgga aataaaggag ttatttgtaa  4650
tgaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa    (SEQID NO：4)
融合蛋白EML4-ALK变体3剪接亚型a的mRNA
actctgtcgg tccgctgaat gaagtgcccg cccctctaag cccggagccc  50
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atttctgctg caagtacttc tgatgttcaa gatcgcctgt cagctcttga  150
gtcacgagtt cagcaacaag aagatgaaat cactgtgcta aaggcggctt  200
tggctgatgt tttgaggcgt cttgcaatct ctgaagatca tgtggcctca  250
gtgaaaaaat cagtctcaag taaaggccaa ccaagccctc gagcagttat  300
tcccatgtcc tgtataacca atggaagtgg tgcaaacaga aaaccaagtc  350
ataccagtgc tgtctcaatt gcaggaaaag aaactctttc atctgctgct  400
aaaagtggta cagaaaaaaa gaaagaaaaa ccacaaggac agagagaaaa  450
aaaagaggaa tctcattcta atgatcaaag tccacaaatt cgagcatcac  500
cttctcccca gccctcttca caacctctcc aaatacacag acaaactcca  550
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tgaaaagtca cataattctt gggaaaattc agatgatagc cgtaataaat  650
tgtcgaaaat accttcaaca cccaaattaa taccaaaagt taccaaaact  700
gcagacaagc ataaagatgt catcatcaac caAGTGTACC GCCGGAAGCA  750
CCAGGAGCTG CAAGCCATGC AGATGGAGCT GCAGAGCCCT GAGTACAAGC  800
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TGCTTTGCTG GCAAGACCTC CTCCATCAGT GACCTGAAGG AGGTGCCGCG  900
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TGTATGAAGG CCAGGTGTCC GGAATGCCCA ACGACCCAAG CCCCCTGCAA  1000
GTGGCTGTGA AGACGCTGCC TGAAGTGTGC TCTGAACAGG ACGAACTGGA  1050
TTTCCTCATG GAAGCCCTGA TCATCAGCAA ATTCAACCAC CAGAACATTG  1100
TTCGCTGCAT TGGGGTGAGC CTGCAATCCC TGCCCCGGTT CATCCTGCTG  1150
GAGCTCATGG CGGGGGGAGA CCTCAAGTCC TTCCTCCGAG AGACCCGCCC  1200
TCGCCCGAGC CAGCCCTCCT CCCTGGCCAT GCTGGACCTT CTGCACGTGG  1250
CTCGGGACAT TGCCTGTGGC TGTCAGTATT TGGAGGAAAA CCACTTCATC  1300
CACCGAGACA TTGCTGCCAG AAACTGCCTC TTGACCTGTC CAGGCCCTGG  1350
AAGAGTGGCC AAGATTGGAG ACTTCGGGAT GGCCCGAGAC ATCTACAGGG  1400
CGAGCTACTA TAGAAAGGGA GGCTGTGCCA TGCTGCCAGT TAAGTGGATG  1450
CCCCCAGAGG CCTTCATGGA AGGAATATTC ACTTCTAAAA CAGACACATG  1500
GTCCTTTGGA GTGCTGCTAT GGGAAATCTT TTCTCTTGGA TATATGCCAT  1550
ACCCCAGCAA AAGCAACCAG GAAGTTCTGG AGTTTGTCAC CAGTGGAGGC  1600
CGGATGGACC CACCCAAGAA CTGCCCTGGG CCTGTATACC GGATAATGAC  1650
TCAGTGCTGG CAACATCAGC CTGAAGACAG GCCCAACTTT GCCATCATTT  1700
TGGAGAGGAT TGAATACTGC ACCCAGGACC CGGATGTAAT CAACACCGCT  1750
TTGCCGATAG AATATGGTCC ACTTGTGGAA GAGGAAGAGA AAGTGCCTGT  1800
GAGGCCCAAG GACCCTGAGG GGGTTCCTCC TCTCCTGGTC TCTCAACAGG  1850
CAAAACGGGA GGAGGAGCGC AGCCCAGCTG CCCCACCACC TCTGCCTACC  1900
ACCTCCTCTG GCAAGGCTGC AAAGAAACCC ACAGCTGCAG AGgTCTCTGT  1950
TCGAGTCCCT AGAGGGCCGG CCGTGGAAGG GGGACACGTG AATATGGCAT  2000
TCTCTCAGTC CAACCCTCCT TCGGAGTTGC ACAgGGTCCA CGGATCCAGA  2050
AACAAGCCCA CCAGCTTGTG GAACCCAACG TACGGCTCCT GGTTTACAGA  2100
GAAACCCACC AAAAAGAATA ATCCTATAGC AAAGAAGGAG CCACACGAgA  2150
GGGGTAACCT GGGGCTGGAG GGAAGCTGTA CTGTCCCACC TAACGTTGCA  2200
ACTGGGAGAC TTCCGGGGGC CTCACTGCTC CTAGAGCCCT CTTCGCTGAC  2250
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GGAATGTCAA TTACGGCTAC CAGCAACAGG GCTTGCCCTT AGAAGCCGCT  2350
ACTGCCCCTG GAGCTGGTCA TTACGAGGAT ACCATTCTGA AAAGCAAGAA  2400
TAGCATGAAC CAGCCTGGGC CCTGAGCTCG GTCGCACACT CACTTCTCTT  2450
CCTTGGGATC CCTAAGACCG TGG    (SEQ  ID NO：5)
融合蛋白EML4-ALK变体3剪接亚型b的mRNA
actctgtcgg tccgctgaat gaagtgcccg cccctctaag cccggagccc  50
ggcgctttcc ccgcaagatg gacggtttcg ccggcagtct cgatgatagt  100
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tggctgatgt tttgaggcgt cttgcaatct ctgaagatca tgtggcctca  250
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tcccatgtcc tgtataacca atggaagtgg tgcaaacaga aaaccaagtc  350
ataccagtgc tgtctcaatt gcaggaaaag aaactctttc atctgctgct  400
aaaagtggta cagaaaaaaa gaaagaaaaa ccacaaggac agagagaaaa  450
aaaagaggaa tctcattcta atgatcaaag tccacaaatt cgagcatcac  500
cttctcccca gccctcttca caacctctcc aaatacacag acaaactcca  550
gaaagcaaga atgctactcc caccaaaagc ataaaacgac catcaccagc  600
tgaaaagtca cataattctt gggaaaattc agatgatagc cgtaataaat  650
tgtcgaaaat accttcaaca cccaaattaa taccaaaagt taccaaaact  700
gcagacaagc ataaagatgt catcatcaac caagcaaaaa tgtcaactcg  750
cgaaaaaaac agccaAGTGT ACCGCCGGAA GCACCAGGAG CTGCAAGCCA  800
TGCAGATGGA GCTGCAGAGC CCTGAGTACA AGCTGAGCAA GCTCCGCACC  850
TCGACCATCA TGACCGACTA CAACCCCAAC TACTGCTTTG CTGGCAAGAC  900
CTCCTCCATC AGTGACCTGA AGGAGGTGCC GCGGAAAAAC ATCACCCTCA  950
TTCGGGGTCT GGGCCATGGa GCCTTTGGGG AGGTGTATGA AGGCCAGGTG  1000
TCCGGAATGC CCAACGACCC AAGCCCCCTG CAAGTGGCTG TGAAGACGCT  1050
GCCTGAAGTG TGCTCTGAAC AGGACGAACT GGATTTCCTC ATGGAAGCCC  1100
TGATCATCAG CAAATTCAAC CACCAGAACA TTGTTCGCTG CATTGGGGTG  1150
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GGCTGTCAGT ATTTGGAGGA AAACCACTTC ATCCACCGAG ACATTGCTGC  1350
CAGAAACTGC CTCTTGACCT GTCCAGGCCC TGGAAGAGTG GCCAAGATTG  1400
GAGACTTCGG GATGGCCCGA GACATCTACA GGGCGAGCTA CTATAGAAAG  1450
GGAGGCTGTG CCATGCTGCC AGTTAAGTGG ATGCCCCCAG AGGCCTTCAT  1500
GGAAGGAATA TTCACTTCTA AAACAGACAC ATGGTCCTTT GGAGTGCTGC  1550
TATGGGAAAT CTTTTCTCTT GGATATATGC CATACCCCAG CAAAAGCAAC  1600
CAGGAAGTTC TGGAGTTTGT CACCAGTGGA GGCCGGATGG ACCCACCCAA  1650
GAACTGCCCT GGGCCTGTAT ACCGGATAAT GACTCAGTGC TGGCAACATC  1700
AGCCTGAAGA CAGGCCCAAC TTTGCCATCA TTTTGGAGAG GATTGAATAC  1750
TGCACCCAGG ACCCGGATGT AATCAACACC GCTTTGCCGA TAGAATATGG  1800
TCCACTTGTG GAAGAGGAAG AGAAAGTGCC TGTGAGGCCC AAGGACCCTG  1850
AGGGGGTTCC TCCTCTCCTG GTCTCTCAAC AGGCAAAACG GGAGGAGGAG  1900
CGCAGCCCAG CTGCCCCACC ACCTCTGCCT ACCACCTCCT CTGGCAAGGC  1950
TGCAAAGAAA CCCACAGCTG CAGAGgTCTC TGTTCGAGTC CCTAGAGGGC  2000
CGGCCGTGGA AGGGGGACAC GTGAATATGG CATTCTCTCA GTCCAACCCT  2050
CCTTCGGAGT TGCACAgGGT CCACGGATCC AGAAACAAGC CCACCAGCTT  2100
GTGGAACCCA ACGTACGGCT CCTGGTTTAC AGAGAAACCC ACCAAAAAGA  2150
ATAATCCTAT AGCAAAGAAG GAGCCACACG AgAGGGGTAA CCTGGGGCTG  2200
GAGGGAAGCT GTACTGTCCC ACCTAACGTT GCAACTGGGA GACTTCCGGG  2250
GGCCTCACTG CTCCTAGAGC CCTCTTCGCT GACTGCCAAT ATGAAGGAGG  2300
TACCTCTGTT CAGGCTACGT CACTTCCCTT GTGGGAATGT CAATTACGGC  2350
TACCAGCAAC AGGGCTTGCC CTTAGAAGCC GCTACTGCCC CTGGAGCTGG  2400
TCATTACGAG GATACCATTC TGAAAAGCAA GAATAGCATG AACCAGCCTG  2450
GGCCCTGAGC TCGGTCGCAC ACTCACTTCT CTTCCTTGGG ATCCCTAAGA  2500
CCGTGG  (SEQID NO：6)
融合蛋白EML4-ALK变体4的mRNA
ACTCTGTCGG TCCGCTGAAT GAAGTGCCCG CCCCTCTAAG CCCGGAGCCC  50
GGCGCTTTCC CCGCAAGATG GACGGTTTCG CCGGCAGTCT CGATGATAGT  100
ATTTCTGCTG CAAGTACTTC TGATGTTCAA GATCGCCTGT CAGCTCTTGA  150
GTCACGAGTT CAGCAACAAG AAGATGAAAT CACTGTGCTA AAGGCGGCTT  200
TGGCTGATGT TTTGAGGCGT CTTGCAATCT CTGAAGATCA TGTGGCCTCA  250
GTGAAAAAAT CAGTCTCAAG TAAAGGCCAA CCAAGCCCTC GAGCAGTTAT  300
TCCCATGTCC TGTATAACCA ATGGAAGTGG TGCAAACAGA AAACCAAGTC  350
ATACCAGTGC TGTCTCAATT GCAGGAAAAG AAACTCTTTC ATCTGCTGCT  400
AAAAGTGGTA CAGAAAAAAA GAAAGAAAAA CCACAAGGAC AGAGAGAAAA  450
AAAAGAGGAA TCTCATTCTA ATGATCAAAG TCCACAAATT CGAGCATCAC  500
CTTCTCCCCA GCCCTCTTCA CAACCTCTCC AAATACACAG ACAAACTCCA  550
GAAAGCAAGA ATGCTACTCC CACCAAAAGC ATAAAACGAC CATCACCAGC  600
TGAAAAGTCA CATAATTCTT GGGAAAATTC AGATGATAGC CGTAATAAAT  650
TGTCGAAAAT ACCTTCAACA CCCAAATTAA TACCAAAAGT TACCAAAACT  700
GCAGACAAGC ATAAAGATGT CATCATCAAC CAAGAAGGAG AATATATTAA  750
AATGTTTATG CGCGGTCGGC CAATTACCAT GTTCATTCCT TCCGATGTTG  800
ACAACTATGA TGACATCAGA ACGGAACTGC CTCCTGAGAA GCTCAAACTG  850
GAGTGGGCAT ATGGTTATCG AGGAAAGGAC TGTAGAGCTA ATGTTTACCT  900
TCTTCCGACC GGGgAAATAG TTTATTTCAT TGCATCAGTA GTAGTACTAT  950
TTAATTATGA GGAGAGAACT CAGCGACACT ACCTGGGCCA TACAGACTGT  1000
GTGAAATGCC TTGCTATACA TCCTGACAAA ATTAGGATTG CAACTGGACA  1050
GATAGCTGGC GTGGATAAAG ATGGAAGGCC TCTACAACCC CACGTCAGAG  1100
TGTGGGATTC TGTTACTCTA TCCACACTGC AGATTATTGG ACTTGGCACT  1150
TTTGAGCGTG GAGTAGGATG CCTGGATTTT TCAAAAGCAG ATTCAGGTGT  1200
TCATTTATGT gTTATTGATG ACTCCAATGA GCATATGCTT ACTGTATGGG  1250
ACTGGCAGAg GAAAGCAAAA GGAGCAGAAA TAAAGACAAC AAATGAAGTT  1300
GTTTTGGCTG TGGAGTTTCA CCCAACAGAT GCAAATACCA TAATTACATG  1350
CGGTAAATCT CATATTTTCT TCTGGACCTG GAGCGGCAAT TCACTAACAA  1400
GAAAACAGGG AATTTTTGGG AAATATGAAA AGCCAAAATT TGTGCAGTGT  1450
TTAGCATTCT TGGGGAATGG AGATGTTCTT ACTGGAGACT CAGGTGGAGT  1500
CATGCTTATA TGGAGCAAAA CTACTGTAGA GCCCACACCT GGGAAAGGAC  1550
CTAAAGGTGT ATATCAAATC AGCAAACAAA TCAAAGCTCA TGATGGCAGT  1600
GTGTTCACAC TTTGTCAGAT GAGAAATGGG ATGTTATTAA CTGGAGGAGG  1650
GAAAGACAGA AAAATAATTC TGTGGGATCA TGATCTGAAT CCTGAAAGAG  1700
AAATAGAGat atgctggatg agccctgagt acaagctgag caagctccgc  1750
acctcgacca tcatgaccga ctacaacccc aactactgct ttgctggcaa  1800
gacctcctcc atcagtgacc tgaaggaggt gccgcggaaa aacatcaccc  1850
tcattcgggg tctgggccat ggagcctttg gggaggtgta tgaaggccag  1900
gtgtccggaa tgcccaacga cccaagcccc ctgcaagtgg ctgtgaagac  1950
gctgcctgaa gtgtgctctg aacaggacga actggatttc ctcatggaag  2000
ccctgatcat cagcaaattc aaccaccaga acattgttcg ctgcattggg  2050
gtgagcctgc aatccctgcc ccggttcatc ctgctggagc tcatggcggg  2100
gggagacctc aagtccttcc tccgagagac ccgccctcgc ccgagccagc  2150
cctcctccct ggccatgctg gaccttctgc acgtggctcg ggacattgcc  2200
tgtggctgtc agtatttgga ggaaaaccac ttcatccacc gagacattgc  2250
tgccagaaac tgcctcttga cctgtccagg ccctggaaga gtggccaaga  2300
ttggagactt cgggatggcc cgagacatct acagggcgag ctactataga  2350
aagggaggct gtgccatgct gccagttaag tggatgcccc cagaggcctt  2400
catggaagga atattcactt ctaaaacaga cacatggtcc tttggagtgc  2450
tgctatggga aatcttttct cttggatata tgccataccc cagcaaaagc  2500
aaccaagaag ttctggagtt tgtcaccagt ggaggccgga tggacccacc  2550
caagaactgc cctgggcctg tataccggat aatgactcag tgctggcaac  2600
atcagcctga agacaggccc aactttgcca tcattttgga gaggattgaa  2650
tactgcaccc aggacccgga tgtaatcaac accgctttgc cgatagaata  2700
tggtccactt gtggaagagg aagagaaagt gcctgtgagg cccaaggacc  2750
ctgagggggt tcctcctctc ctggtctctc aacaggcaaa acgggaggag  2800
gagcgcagcc cagctgcccc accacctctg cctaccacct cctctggcaa  2850
ggctgcaaag aaacccacag ctgcagaggt ctctgttcga gtccctagag  2900
ggccggccgt ggaaggggga cacgtgaata tggcattctc tcagtccaac  2950
cctccttcgg agttgcacag ggtccacgga tccagaaaca agcccaccag  3000
cttgtggaac ccaacgtacg gctcctggtt tacagagaaa cccaccaaaa  3050
agaataatcc tatagcaaag aaggagccac acgagagggg taacctgggg  3100
ctggagggaa gctgtactgt cccacctaac gttgcaactg ggagacttcc  3150
gggggcctca ctgctcctag agccctcttc gctgactgcc aatatgaagg  3200
aggtacctct gttcaggcta cgtcacttcc cttgtgggaa tgtcaattac  3250
ggctaccagc aacagggctt gcccttagaa gccgctactg cccctggagc  3300
tggtcattac gaggatacca ttctgaaaag caagaatagc atgaaccagc  3350
ctgggccctg agctcggtcg cacactcact tctcttcctt gggatcccta  3400
agaccgtgg  (SEQID NO：7)
融合蛋白EML4-ALK变体5剪接亚型a的mRNA
actctgtcgg tccgctgaat gaagtgcccg cccctctaag cccggagccc  50
ggcgctttcc ccgcaagatg gacggtttcg ccggcagtct cgatgatagt  100
atttctgctg caagtacttc tgatgttcaa gatcgcctgt cagctcttga  150
gtcacgagtt cagcaacaag aagatgaaat cactgtgcta aaggcggctt  200
tggctgatgt tttgaggcgt cttgcaatct ctgaagatca tgtggcctca  250
gtgaaaaaat cagtctcaag taaAGTGTAC CGCCGGAAGC ACCAGGAGCT  300
GCAAGCCATG CAGATGGAGC TGCAGAGCCC TGAGTACAAG CTGAGCAAGC  350
TCCGCACCTC GACCATCATG ACCGACTACA ACCCCAACTA CTGCTTTGCT  400
GGCAAGACCT CCTCCATCAG TGACCTGAAG GAGGTGCCGC GGAAAAACAT  450
CACCCTCATT CGGGGTCTGG GCCATGGaGC CTTTGGGGAG GTGTATGAAG  500
GCCAGGTGTC CGGAATGCCC AACGACCCAA GCCCCCTGCA AGTGGCTGTG  550
AAGACGCTGC CTGAAGTGTG CTCTGAACAG GACGAACTGG ATTTCCTCAT  600
GGAAGCCCTG ATCATCAGCA AATTCAACCA CCAGAACATT GTTCGCTGCA  650
TTGGGGTGAG CCTGCAATCC CTGCCCCGGT TCATCCTGCT GGAGCTCATG  700
GCGGGGGGAG ACCTCAAGTC CTTCCTCCGA GAGACCCGCC CTCGCCCGAG  750
CCAGCCCTCC TCCCTGGCCA TGCTGGACCT TCTGCACGTG GCTCGGGACA  800
TTGCCTGTGG CTGTCAGTAT TTGGAGGAAA ACCACTTCAT CCACCGAGAC  850
ATTGCTGCCA GAAACTGCCT CTTGACCTGT CCAGGCCCTG GAAGAGTGGC  900
CAAGATTGGA GACTTCGGGA TGGCCCGAGA CATCTACAGG GCGAGCTACT  950
ATAGAAAGGG AGGCTGTGCC ATGCTGCCAG TTAAGTGGAT GCCCCCAGAG  1000
GCCTTCATGG AAGGAATATT CACTTCTAAA ACAGACACAT GGTCCTTTGG  1050
AGTGCTGCTA TGGGAAATCT TTTCTCTTGG ATATATGCCA TACCCCAGCA  1100
AAAGCAACCA GGAAGTTCTG GAGTTTGTCA CCAGTGGAGG CCGGATGGAC  1150
CCACCCAAGA ACTGCCCTGG GCCTGTATAC CGGATAATGA CTCAGTGCTG  1200
GCAACATCAG CCTGAAGACA GGCCCAACTT TGCCATCATT TTGGAGAGGA  1250
TTGAATACTG CACCCAGGAC CCGGATGTAA TCAACACCGC TTTGCCGATA  1300
GAATATGGTC CACTTGTGGA AGAGGAAGAG AAAGTGCCTG TGAGGCCCAA  1350
GGACCCTGAG GGGGTTCCTC CTCTCCTGGT CTCTCAACAG GCAAAACGGG  1400
AGGAGGAGCG CAGCCCAGCT GCCCCACCAC CTCTGCCTAC CACCTCCTCT  1450
GGCAAGGCTG CAAAGAAACC CACAGCTGCA GAGgTCTCTG TTCGAGTCCC  1500
TAGAGGGCCG GCCGTGGAAG GGGGACACGT GAATATGGCA TTCTCTCAGT  1550
CCAACCCTCC TTCGGAGTTG CACAgGGTCC ACGGATCCAG AAACAAGCCC  1600
ACCAGCTTGT GGAACCCAAC GTACGGCTCC TGGTTTACAG AGAAACCCAC  1650
CAAAAAGAAT AATCCTATAG CAAAGAAGGA GCCACACGAg AGGGGTAACC  1700
TGGGGCTGGA GGGAAGCTGT ACTGTCCCAC CTAACGTTGC AACTGGGAGA  1750
CTTCCGGGGG CCTCACTGCT CCTAGAGCCC TCTTCGCTGA CTGCCAATAT  1800
GAAGGAGGTA CCTCTGTTCA GGCTACGTCA CTTCCCTTGT GGGAATGTCA  1850
ATTACGGCTA CCAGCAACAG GGCTTGCCCT TAGAAGCCGC TACTGCCCCT  1900
GGAGCTGGTC ATTACGAGGA TACCATTCTG AAAAGCAAGA ATAGCATGAA  1950
CCAGCCTGGG CCCTGAGCTC GGTCGCACAC TCACTTCTCT TCCTTGGGAT  2000
CCCTAAGACC GTGG  (SEQID NO：8)
融合蛋白EML4-ALK变体5剪接亚型b的mRNA
actctgtcgg tccgctgaat gaagtgcccg cccctctaag cccggagccc  50
ggcgctttcc ccgcaagatg gacggtttcg ccggcagtct cgatgatagt  100
atttctgctg caagtacttc tgatgttcaa gatcgcctgt cagctcttga  150
gtcacgagtt cagcaacaag aagatgaaat cactgtgcta aaggcggctt  200
tggctgatgt tttgaggcgt cttgcaatct ctgaagatca tgtggcctca  250
gtgaaaaaat cagtctcaag tAAAGGTTCA GAGCTCAGGG GAGGATATGG  300
AGATCCAGGG AGGCTTCCTG TAGGAAGTGG CCTGTGTAGT GCTTCAAGGG  350
CCAGGCTGCC AGGCCATGTT GCAGCTGACC ACCCACCTGC AGTGTACCGC  400
CGGAAGCACC AGGAGCTGCA AGCCATGCAG ATGGAGCTGC AGAGCCCTGA  450
GTACAAGCTG AGCAAGCTCC GCACCTCGAC CATCATGACC GACTACAACC  500
CCAACTACTG CTTTGCTGGC AAGACCTCCT CCATCAGTGA CCTGAAGGAG  550
GTGCCGCGGA AAAACATCAC CCTCATTCGG GGTCTGGGCC ATGGaGCCTT  600
TGGGGAGGTG TATGAAGGCC AGGTGTCCGG AATGCCCAAC GACCCAAGCC  650
CCCTGCAAGT GGCTGTGAAG ACGCTGCCTG AAGTGTGCTC TGAACAGGAC  700
GAACTGGATT TCCTCATGGA AGCCCTGATC ATCAGCAAAT TCAACCACCA  750
GAACATTGTT CGCTGCATTG GGGTGAGCCT GCAATCCCTG CCCCGGTTCA  800
TCCTGCTGGA GCTCATGGCG GGGGGAGACC TCAAGTCCTT CCTCCGAGAG  850
ACCCGCCCTC GCCCGAGCCA GCCCTCCTCC CTGGCCATGC TGGACCTTCT  900
GCACGTGGCT CGGGACATTG CCTGTGGCTG TCAGTATTTG GAGGAAAACC  950
ACTTCATCCA CCGAGACATT GCTGCCAGAA ACTGCCTCTT GACCTGTCCA  1000
GGCCCTGGAA GAGTGGCCAA GATTGGAGAC TTCGGGATGG CCCGAGACAT  1050
CTACAGGGCG AGCTACTATA GAAAGGGAGG CTGTGCCATG CTGCCAGTTA  1100
AGTGGATGCC CCCAGAGGCC TTCATGGAAG GAATATTCAC TTCTAAAACA  1150
GACACATGGT CCTTTGGAGT GCTGCTATGG GAAATCTTTT CTCTTGGATA  1200
TATGCCATAC CCCAGCAAAA GCAACCAGGA AGTTCTGGAG TTTGTCACCA  1250
GTGGAGGCCG GATGGACCCA CCCAAGAACT GCCCTGGGCC TGTATACCGG  1300
ATAATGACTC AGTGCTGGCA ACATCAGCCT GAAGACAGGC CCAACTTTGC  1350
CATCATTTTG GAGAGGATTG AATACTGCAC CCAGGACCCG GATGTAATCA  1400
ACACCGCTTT GCCGATAGAA TATGGTCCAC TTGTGGAAGA GGAAGAGAAA  1450
GTGCCTGTGA GGCCCAAGGA CCCTGAGGGG GTTCCTCCTC TCCTGGTCTC  1500
TCAACAGGCA AAACGGGAGG AGGAGCGCAG CCCAGCTGCC CCACCACCTC  1550
TGCCTACCAC CTCCTCTGGC AAGGCTGCAA AGAAACCCAC AGCTGCAGAG  1600
gTCTCTGTTC GAGTCCCTAG AGGGCCGGCC GTGGAAGGGG GACACGTGAA  1650
TATGGCATTC TCTCAGTCCA ACCCTCCTTC GGAGTTGCAC AgGGTCCACG  1700
GATCCAGAAA CAAGCCCACC AGCTTGTGGA ACCCAACGTA CGGCTCCTGG  1750
TTTACAGAGA AACCCACCAA AAAGAATAAT CCTATAGCAA AGAAGGAGCC  1800
ACACGAgAGG GGTAACCTGG GGCTGGAGGG AAGCTGTACT GTCCCACCTA  1850
ACGTTGCAAC TGGGAGACTT CCGGGGGCCT CACTGCTCCT AGAGCCCTCT  1900
TCGCTGACTG CCAATATGAA GGAGGTACCT CTGTTCAGGC TACGTCACTT  1950
CCCTTGTGGG AATGTCAATT ACGGCTACCA GCAACAGGGC TTGCCCTTAG  2000
AAGCCGCTAC TGCCCCTGGA GCTGGTCATT ACGAGGATAC CATTCTGAAA  2050
AGCAAGAATA GCATGAACCA GCCTGGGCCC TGAGCTCGGT CGCACACTCA  2100
CTTCTCTTCC TTGGGATCCC TAAGACCGTG G  (SEQ  ID NO：9)
融合蛋白EML4-ALK变体6的EML4-ALK变体6mRNA
tactctgtcg gtccgctgaa tgaagtgccc gcccctctaa gcccggagcc  50
cggcgctttc cccgcaagat ggacggtttc gccggcagtc tcgatgatag  100
tatttctgct gcaagtactt ctgatgttca agatcgcctg tcagctcttg  150
agtcacgagt tcagcaacaa gaagatgaaa tcactgtgct aaaggcggct  200
ttggctgatg ttttgaggcg tcttgcaatc tctgaagatc atgtggcctc  250
agtgaaaaaa tcagtctcaa gtaaaggcca accaagccct cgagcagtta  300
ttcccatgtc ctgtataacc aatggaagtg gtgcaaacag aaaaccaagt  350
cataccagtg ctgtctcaat tgcaggaaaa gaaactcttt catctgctgc  400
taaaagtggt acagaaaaaa agaaagaaaa accacaagga cagagagaaa 450
aaaaagagga atctcattct aatgatcaaa gtccacaaat tcgagcatca  500
ccttctcccc agccctcttc acaacctctc caaatacaca gacaaactcc  550
agaaagcaag aatgctactc ccaccaaaag cataaaacga ccatcaccag  600
ctgaaaagtc acataattct tgggaaaatt cagatgatag ccgtaataaa  650
ttgtcgaaaa taccttcaac acccaaatta ataccaaaag ttaccaaaac  700
tgcagacaag cataaagatg tcatcatcaa ccaagaagga gaatatatta  750
aaatgtttat gcgcggtcgg ccaattacca tgttcattcc ttccgatgtt  800
gacaactatg atgacatcag aacggaactg cctcctgaga agctcaaact  850
ggagtgggca tatggttatc gaggaaagga ctgtagagct aatgtttacc  900
ttcttccgac cggggaaata gtttatttca ttgcatcagt agtagtacta  950
tttaattatg aggagagaac tcagcgacac tacctgggcc atacagactg  1000
tgtgaaatgc cttgctatac atcctgacaa aattaggatt gcaactggac  1050
agatagctgg cgtggataaa gatggaaggc ctctacaacc ccacgtcaga  1100
gtgtgggatt ctgttactct atccacactg cagattattg gacttggcac  1150
ttttgagcgt ggagtaggat gcctggattt ttcaaaagca gattcaggtg  1200
ttcatttatg tgttattgat gactccaatg agcatatgct tactgtatgg  1250
gactggcaga ggaaagcaaa aggagcagaa ataaagacaa caaatgaagt  1300
tgttttggct gtggagtttc acccaacaga tgcaaatacc ataattacat  1350
gcggtaaatc tcatattttc ttctggacct ggagcggcaa ttcactaaca  1400
agaaaacagg gaatttttgg gaaatatgaa aagccaaaat ttgtgcagtg  1450
tttagcattc ttggggaatg gagatgttct tactggagac tcaggtggag  1500
tcatgcttat atggagcaaa actactgtag agcccacacc tgggaaagga  1550
cctaaAGGAA GTGGCCTGTG TAGTGCTTCA AGGGCCAGGC TGCCAGGCCA  1600
TGTTGCAGCT GACCACCCAC CTGCAGTGTA CCGCCGGAAG CACCAGGAGC  1650
TGCAAGCCAT GCAGATGGAG CTGCAGAGCC CTGAGTACAA GCTGAGCAAG  1700
CTCCGCACCT CGACCATCAT GACCGACTAC AACCCCAACT ACTGCTTTGC  1750
TGGCAAGACC TCCTCCATCA GTGACCTGAA GGAGGTGCCG CGGAAAAACA  1800
TCACCCTCAT TCGGGGTCTG GGCCATGGaG CCTTTGGGGA GGTGTATGAA  1850
GGCCAGGTGT CCGGAATGCC CAACGACCCA AGCCCCCTGC AAGTGGCTGT  1900
GAAGACGCTG CCTGAAGTGT GCTCTGAACA GGACGAACTG GATTTCCTCA  1950
TGGAAGCCCT GATCATCAGC AAATTCAACC ACCAGAACAT TGTTCGCTGC  2000
ATTGGGGTGA GCCTGCAATC CCTGCCCCGG TTCATCCTGC TGGAGCTCAT  2050
GGCGGGGGGA GACCTCAAGT CCTTCCTCCG AGAGACCCGC CCTCGCCCGA  2100
GCCAGCCCTC CTCCCTGGCC ATGCTGGACC TTCTGCACGT GGCTCGGGAC  2150
ATTGCCTGTG GCTGTCAGTA TTTGGAGGAA AACCACTTCA TCCACCGAGA  2200
CATTGCTGCC AGAAACTGCC TCTTGACCTG TCCAGGCCCT GGAAGAGTGG  2250
CCAAGATTGG AGACTTCGGG ATGGCCCGAG ACATCTACAG GGCGAGCTAC  2300
TATAGAAAGG GAGGCTGTGC CATGCTGCCA GTTAAGTGGA TGCCCCCAGA  2350
GGCCTTCATG GAAGGAATAT TCACTTCTAA AACAGACACA TGGTCCTTTG  2400
GAGTGCTGCT ATGGGAAATC TTTTCTCTTG GATATATGCC ATACCCCAGC  2450
AAAAGCAACC AGGAAGTTCT GGAGTTTGTC ACCAGTGGAG GCCGGATGGA  2500
CCCACCCAAG AACTGCCCTG GGCCTGTATA CCGGATAATG ACTCAGTGCT  2550
GGCAACATCA GCCTGAAGAC AGGCCCAACT TTGCCATCAT TTTGGAGAGG  2600
ATTGAATACT GCACCCAGGA CCCGGATGTA ATCAACACCG CTTTGCCGAT  2650
AGAATATGGT CCACTTGTGG AAGAGGAAGA GAAAGTGCCT GTGAGGCCCA  2700
AGGACCCTGA GGGGGTTCCT CCTCTCCTGG TCTCTCAACA GGCAAAACGG  2750
GAGGAGGAGC GCAGCCCAGC TGCCCCACCA CCTCTGCCTA CCACCTCCTC  2800
TGGCAAGGCT GCAAAGAAAC CCACAGCTGC AGAGgTCTCT GTTCGAGTCC  2850
CTAGAGGGCC GGCCGTGGAA GGGGGACACG TGAATATGGC ATTCTCTCAG  2900
TCCAACCCTC CTTCGGAGTT GCACAgGGTC CACGGATCCA GAAACAAGCC  2950
CACCAGCTTG TGGAACCCAA CGTACGGCTC CTGGTTTACA GAGAAACCCA  3000
CCAAAAAGAA TAATCCTATA GCAAAGAAGG AGCCACACGA gAGGGGTAAC  3050
CTGGGGCTGG AGGGAAGCTG TACTGTCCCA CCTAACGTTG CAACTGGGAG  3100
ACTTCCGGGG GCCTCACTGC TCCTAGAGCC  CTCTTCGCTG ACTGCCAATA  3150
TGAAGGAGGT ACCTCTGTTC AGGCTACGTC ACTTCCCTTG TGGGAATGTC  3200
AATTACGGCT ACCAGCAACA GGGCTTGCCC TTAGAAGCCG CTACTGCCCC  3250
TGGAGCTGGT CATTACGAGG ATACCATTCT GAAAAGCAAG AATAGCATGA  3300
ACCAGCCTGG GCCCTGAGCT CGGTCGCACA CTCACTTCTC TTCCTTGGGA  3350
TCCCTAAGAC CGTGG  (SEQID NO：10)
融合蛋白EML4-ALK变体7的mRNA
tACTCTGTCG GTCCGCTGAA TGAAGTGCCC GCCCCTCTAA GCCCGGAGCC  50
CGGCGCTTTC CCCGCAAGAT GGACGGTTTC GCCGGCAGTC TCGATGATAG  100
TATTTCTGCT GCAAGTACTT CTGATGTTCA AGATCGCCTG TCAGCTCTTG  150
AGTCACGAGT TCAGCAACAA GAAGATGAAA TCACTGTGCT AAAGGCGGCT  200
TTGGCTGATG TTTTGAGGCG TCTTGCAATC TCTGAAGATC ATGTGGCCTC  250
AGTGAAAAAA TCAGTCTCAA GTAAAGGCCA ACCAAGCCCT CGAGCAGTTA  300
TTCCCATGTC CTGTATAACC AATGGAAGTG GTGCAAACAG AAAACCAAGT  350
CATACCAGTG CTGTCTCAAT TGCAGGAAAA GAAACTCTTT CATCTGCTGC  400
TAAAAGTGGT ACAGAAAAAA AGAAAGAAAA ACCACAAGGA CAGAGAGAAA  450
AAAAAGAGGA ATCTCATTCT AATGATCAAA GTCCACAAAT TCGAGCATCA  500
CCTTCTCCCC AGCCCTCTTC ACAACCTCTC CAAATACACA GACAAACTCC  550
AGAAAGCAAG AATGCTACTC CCACCAAAAG CATAAAACGA CCATCACCAG  600
CTGAAAAGTC ACATAATTCT TGGGAAAATT CAGATGATAG CCGTAATAAA  650
TTGTCGAAAA TACCTTCAAC ACCCAAATTA ATACCAAAAG TTACCAAAAC  700
TGCAGACAAG CATAAAGATG TCATCATCAA CCAAGAAGGA GAATATATTA  750
AAATGTTTAT GCGCGGTCGG CCAATTACCA TGTTCATTCC TTCCGATGTT  800
GACAACTATG ATGACATCAG AACGGAACTG CCTCCTGAGA AGCTCAAACT  850
GGAGTGGGCA TATGGTTATC GAGGAAAGGA CTGTAGAGCT AATGTTTACC  900
TTCTTCCGAC CGGGgAAATA GTTTATTTCA TTGCATCAGT AGTAGTACTA  950
TTTAATTATG AGGAGAGAAC TCAGCGACAC TACCTGGGCC ATACAGACTG  1000
TGTGAAATGC CTTGCTATAC ATCCTGACAA AATTAGGATT GCAACTGGAC  1050
AGATAGCTGG CGTGGATAAA GATGGAAGGC CTCTACAACC CCACGTCAGA  1100
GTGTGGGATT CTGTTACTCT ATCCACACTG CAGATTATTG GACTTGGCAC  1150
TTTTGAGCGT GGAGTAGGAT GCCTGGATTT TTCAAAAGCA GATTCAGGTG  1200
TTCATTTATG TgTTATTGAT GACTCCAATG AGCATATGCT TACTGTATGG  1250
GACTGGCAGA gGAAAGCAAA AGGAGCAGAA ATAAAGACAA CAAATGAAGT  1300
TGTTTTGGCT GTGGAGTTTC ACCCAACAGA TGCAAATACC ATAATTACAT  1350
GCGGTAAATC TCATATTTTC TTCTGGACCT GGAGCGGCAA TTCACTAACA  1400
AGAAAACAGG GAATTTTTGG GAAATATGAA AAGCCAAAAT TTGTGCAGTG  1450
TTTAGCATTC TTGGGGAATG GAGATGTTCT TACTGGAGAC TCAGGTGGAG  1500
TCATGCTTAT ATGGAGCAAA ACTACTGTAG AGCCCACACC TGGGAAAGGA  1550
CCTAAAGGTG TATATCAAAT CAGCAAACAA ATCAAAGCTC ATGATGGCAG  1600
TGTGTTCACA CTTTGTCAGA TGAGAAATGG GATGTTATTA ACTGGAGGAG  1650
GGAAAGACAG AAAAATAATT CTGTGGGATC ATGATCTGAA TCCTGAAAGA  1700
GAAATAGAGc accaggagct gcaagccatg cagatggagc tgcagagccc  1750
tgagtacaag ctgagcaagc tccgcacctc gaccatcatg accgactaca  1800
accccaacta ctgctttgct ggcaagacct cctccatcag tgacctgaag  1850
gaggtgccgc ggaaaaacat caccctcatt cggggtctgg gccatggagc  1900
ctttggggag gtgtatgaag gccaggtgtc cggaatgccc aacgacccaa  1950
gccccctgca agtggctgtg aagacgctgc ctgaagtgtg ctctgaacag  2000
gacgaactgg atttcctcat ggaagccctg atcatcagca aattcaacca  2050
ccagaacatt gttcgctgca ttggggtgag cctgcaatcc ctgccccggt  2100
tcatcctgct ggagctcatg gcggggggag acctcaagtc cttcctccga  2150
gagacccgcc ctcgcccgag ccagccctcc tccctggcca tgctggacct  2200
tctgcacgtg gctcgggaca ttgcctgtgg ctgtcagtat ttggaggaaa  2250
accacttcat ccaccgagac attgctgcca gaaactgcct cttgacctgt  2300
ccaggccctg gaagagtggc caagattgga gacttcggga tggcccgaga  2350
catctacagg gcgagctact atagaaaggg aggctgtgcc atgctgccag  2400
ttaagtggat gcccccagag gccttcatgg aaggaatatt cacttctaaa  2450
acagacacat ggtcctttgg agtgctgcta tgggaaatct tttctcttgg  2500
atatatgcca taccccagca aaagcaacca ggaagttctg gagtttgtca  2550
ccagtggagg ccggatggac ccacccaaga actgccctgg gcctgtatac  2600
cggataatga ctcagtgctg gcaacatcag cctgaagaca ggcccaactt  2650
tgccatcatt ttggagagga ttgaatactg cacccaggac ccggatgtaa  2700
tcaacaccgc tttgccgata gaatatggtc cacttgtgga agaggaagag  2750
aaagtgcctg tgaggcccaa ggaccctgag ggggttcctc ctctcctggt  2800
ctctcaacag gcaaaacggg aggaggagcg cagcccagct gccccaccac  2850
ctctgcctac cacctcctct ggcaaggctg caaagaaacc cacagctgca  2900
gaggtctctg ttcgagtccc tagagggccg gccgtggaag ggggacacgt  2950
gaatatggca ttctctcagt ccaaccctcc ttcggagttg cacaaggtcc  3000
acggatccag aaacaagccc accagcttgt ggaacccaac gtacggctcc  3050
tggtttacag agaaacccac caaaaagaat aatcctatag caaagaagga  3100
gccacacgac aggggtaacc tggggctgga gggaagctgt actgtcccac  3150
ctaacgttgc aactgggaga cttccggggg cctcactgct cctagagccc  3200
tcttcgctga ctgccaatat gaaggaggta cctctgttca ggctacgtca  3250
cttcccttgt gggaatgtca attacggcta ccagcaacag ggcttgccct  3300
tagaagccgc tactgcccct ggagctggtc attacgagga taccattctg  3350
aaaagcaaga atagcatgaa ccagcctggg ccctgagctc ggtcgcacac  3400
tcacttctct tccttgggat ccctaagacc gtgga    (SEQ  ID NO：11)
融合蛋白KIF5B-ALK的mRNA
TGCGAGAAAG ATGGCGGACC TGGCCGAGTG CAACATCAAA GTGATGTGTC  50
GCTTCAGACC TCTCAACGAG TCTGAAGTGA ACCGCGGCGA CAAGTACATC  100
GCCAAGTTTC AGGGAGAAGA CACGGTCGTG ATCGCGTCCA AGCCTTATGC  150
ATTTGATCGG GTGTTCCAGT CAAGCACATC TCAAGAGCAA GTGTATAATG  200
ACTGTGCAAA GAAGATTGTT AAAGATGTAC TTGAAGGATA TAATGGAACA  250
ATATTTGCAT ATGGACAAAC ATCCTCTGGG AAGACACACA CAATGGAGGG  300
TAAACTTCAT GATCCAGAAG GCATGGGAAT TATTCCAAGA ATAGTGCAAG  350
ATATTTTTAA TTATATTTAC TCCATGGATG AAAATTTGGA ATTTCATATT  400
AAGGTTTCAT ATTTTGAAAT ATATTTGGAT AAGATAAGGG ACCTGTTAGA  450
TGTTTCAAAG ACCAACCTTT CAGTTCATGA AGACAAAAAC CGAGTTCCCT  500
ATGTAAAGGG GTGCACAGAG CGTTTTGTAT GTAGTCCAGA TGAAGTTATG  550
GATACCATAG ATGAAGGAAA ATCCAACAGA CATGTAGCAG TTACAAATAT  600
GAATGAACAT AGCTCTAGGA GTCACAGTAT ATTTCTTATT AATGTCAAAC  650
AAGAGAACAC ACAAACGGAA CAAAAGCTGA GTGGAAAACT TTATCTGGTT  700
GATTTAGCTG GTAGTGAAAA GGTTAGTAAA ACTGGAGCTG AAGGTGCTGT  750
GCTGGATGAA GCTAAAAACA TCAACAAGTC ACTTTCTGCT CTTGGAAATG  800
TTATTTCTGC TTTGGCTGAG GGTAGTACAT ATGTTCCATA TCGAGATAGT  850
AAAATGACAA GAATCCTTCA AGATTCATTA GGTGGCAACT GTAGAACCAC  900
TATTGTAATT TGCTGCTCTC CATCATCATA CAATGAGTCT GAAACAAAAT  950
CTACACTCTT ATTTGGCCAA AGGGCCAAAA CAATTAAGAA CACAGTTTGT  1000
GTCAATGTGG AGTTAACTGC AGAACAGTGG AAAAAGAAGT ATGAAAAAGA  1050
AAAAGAAAAA AATAAGATCC TGCGGAACAC TATTCAGTGG CTTGAAAATG  1100
AGCTCAACAG ATGGCGTAAT GGGGAGACGG TGCCTATTGA TGAACAGTTT  1150
GACAAAGAGA AAGCCAACTT GGAAGCTTTC ACAGTGGATA AAGATATTAC  1200
TCTTACCAAT GATAAACCAG CAACCGCAAT TGGAGTTATA GGAAATTTTA  1250
CTGATGCTGA AAGAAGAAAG TGTGAAGAAG AAATTGCTAA ATTATACAAA  1300
CAGCTTGATG ACAAGGATGA AGAAATTAAC CAGCAAAGTC AACTGGTAGA  1350
GAAACTGAAG ACGCAAATGT TGGATCAGGA GGAGCTTTTG GCATCTACCA  1400
GAAGGGATCA AGACAATATG CAAGCTGAGC TGAATCGCCT TCAAGCAGAA  1450
AATGATGCCT CTAAAGAAGA AGTGAAAGAA GTTTTACAGG CCCTAGAAGA  1500
ACTTGCTGTC AATTATGATC AGAAGTCTCA GGAAGTTGAA GACAAAACTA  1550
AGGAATATGA ATTGCTTAGT GATGAATTGA ATCAGAAATC GGCAACTTTA  1600
GCGAGTATAG ATGCTGAGCT TCAGAAACTT AAGGAAATGA CCAACCACCA  1650
GAAAAAACGA GCAGCTGAGA TGATGGCATC TTTACTAAAA GACCTTGCAG  1700
AAATAGGAAT TGCTGTGGGA AATAATGATG TAAAGCAGCC TGAGGGAACT  1750
GGCATGATAG ATGAAGAGTT CACTGTTGCA AGACTCTACA TTAGCAAAAT  1800
GAAGTCAGAA GTAAAAACCA TGGTGAAACG TTGCAAGCAG TTAGAAAGCA  1850
CACAAACTGA GAGCAACAAA AAAATGGAAG AAAATGAAAA GGAGTTAGCA  1900
GCATGTCAGC TTCGTATCTC TCAACATGAA GCCAAAATCA AGTCATTGAC  1950
TGAATACCTT CAAAATGTGG AACAAAAGAA AAGACAGTTG GAGGAATCTG  2000
TCGATGCCCT CAGTGAAGAA CTAGTCCAGC TTCGAGCACA AGAGAAAGTC  2050
CATGAAATGG AAAAGGAGCA CTTAAATAAG GTTCAGACTG CAAATGAAGT  2100
TAAGCAAGCT GTTGAACAGC AGATCCAGAG CCATAGAGAA ACTCATCAAA  2150
AACAGATCAG TAGTTTGAGA GATGAAGTAG AAGCAAAAGC AAAACTTATT  2200
ACTGATCTTC AAGACCAAAA CCAGAAAATG ATGTTAGAGC AGGAACGTCT  2250
AAGAGTAGAA CATGAGAAGT TGAAAGCCAC AGATCAGGAA AAGAGCAGAA  2300
AACTACATGA ACTTACGGTT ATGCAAGATA GACGAGAACA AGCAAGACAA  2350
GACTTGAAGG GTTTGGAAGA GACAGTGGCA AAAGAACTTC AGACTTTACA  2400
CAACCTGCGC AAACTCTTTG TTCAGGACCT GGCTACAAGA GTTAAAAAGA  2450
GTGCTGAGAT TGATTCTGAT GACACCGGAG GCAGCGCTGC TCAGAAGCAA  2500
AAAATCTCCT TTCTTGAAAA TAATCTTGAA CAGCTCACTA AAGTGCACAA  2550
ACAGTTGGTA CGTGATAATG CAGATCTCCG CTGTGAACTT CCTAAGTTGG  2600
AAAAGCGACT TCGAGCTACA GCTGAGAGAG TGAAAGCTTT GGAATCAGCA  2650
CTGAAAGAAG CTAAAGAAAA TGCATCTCGT GATCGCAAAC GCTATCAGCA  2700
AGAAGTAGAT CGCATAAAGG AAGCAGTCAG GTCAAAGAAT ATGGCCAGAA  2750
GAGGGCATTC TGCACAGATT Gtgtaccgcc ggaagcacca ggagctgcaa  2800
gccatgcaga tggagctgca gagccctgag tacaagctga gcaagctccg  2850
cacctcgacc atcatgaccg actacaaccc caactactgc tttgctggca  2900
agacctcctc catcagtgac ctgaaggagg tgccgcggaa aaacatcacc  2950
ctcattcggg gtctgggcca tggcgccttt ggggaggtgt atgaaggcca  3000
ggtgtccgga atgcccaacg acccaagccc cctgcaagtg gctgtgaaga  3050
cgctgcctga agtgtgctct gaacaggacg aactggattt cctcatggaa  3100
gccctgatca tcagcaaatt caaccaccag aacattgttc gctgcattgg  3150
ggtgagcctg caatccctgc cccggttcat cctgctggag ctcatggcgg  3200
ggggagacct caagtccttc ctccgagaga cccgccctcg cccgagccag  3250
ccctcctccc tggccatgct ggaccttctg cacgtggctc gggacattgc  3300
ctgtggctgt cagtatttgg aggaaaacca cttcatccac cgagacattg  3350
ctgccagaaa ctgcctcttg acctgtccag gccctggaag agtggccaag  3400
attggagact tcgggatggc ccgagacatc tacagggcga gctactatag  3450
aaagggaggc tgtgccatgc tgccagttaa gtggatgccc ccagaggcct  3500
tcatggaagg aatattcact tctaaaacag acacatggtc ctttggagtg  3550
ctgctatggg aaatcttttc tcttggatat atgccatacc ccagcaaaag  3600
caaccaggaa gttctggagt ttgtcaccag tggaggccgg atggacccac  3650
ccaagaactg ccctgggcct gtataccgga taatgactca gtgctggcaa  3700
catcagcctg aagacaggcc caactttgcc atcattttgg agaggattga  3750
atactgcacc caggacccgg atgtaatcaa caccgctttg ccgatagaat  3800
atggtccact tgtggaagag gaagagaaag tgcctgtgag gcccaaggac  3850
cctgaggggg ttcctcctct cctggtctct caacaggcaa aacgggagga  3900
ggagcgcagc ccagctgccc caccacctct gcctaccacc tcctctggca  3950
aggctgcaaa gaaacccaca gctgcagagg tctctgttcg agtccctaga  4000
gggccggccg tggaaggggg acacgtgaat atggcattct ctcagtccaa  4050
ccctccttcg gagttgcaca aggtccacgg atccagaaac aagcccacca  4100
gcttgtggaa cccaacgtac ggctcctggt ttacagagaa acccaccaaa  4150
aagaataatc ctatagcaaa gaaggagcca cacgacaggg gtaacctggg  4200
gctggaggga agctgtactg tcccacctaa cgttgcaact gggagacttc  4250
cgggggcctc actgctccta gagccctctt cgctgactgc caatatgaag  4300
gaggtacctc tgttcaggct acgtcacttc ccttgtggga atgtcaatta  4350
cggctaccag caacagggct tgcccttaga agccgctact gcccctggag  4400
ctggtcatta cgaggatacc attctgaaaa gcaagaatag catgaaccag  4450
cctgggccct gagctcggtc gcacactca    (SEQ  ID NO：12)
TRK融合基因/间变性大细胞淋巴瘤激酶(TFG/ALK融合物)超长形式的mRNA
atgaacggac agttggatct aagtgggaag ctaatcatca aagctcaact  50
tggggaggat attcggcgaa ttcctattca taatgaagat attacttatg  100
atgaattagt gctaatgatg caacgagttt tcagaggaaa acttctgagt  150
aatgatgaag taacaataaa gtataaagat gaagatggag atcttataac  200
aatttttgat agttctgacc tttcctttgc aattcagtgc agtaggatac  250
tgaaactgac attatttgtt aatggccagc caagacccct tgaatcaagt  300
caggtgaaat atctccgtcg agaactgata gaacttcgaa ataaagtgaa  350
tcgtttattg gatagcttgg aaccacctgg agaaccagga ccttccacca  400
atattcctga aaatgatact gtggatggta gggaagaaaa gtctgcttct  450
gattcttctg gaaaacagtc tactcaggtt atggcagcaa gtatgtctgc  500
ttttgatcct ttaaaaaacc aagatgaaat caataaaaat gttatgtcag  550
cgtttggctt aacagatgat caggtttcag ggccacccag tgctcctgca  600
gaagatcgtt caggaacacc cgacagcatt gcttcctcct cctcagcagc  650
tcacccacca ggcgttcagc cacagcagcc accatataca ggagctcaga  700
ctcaagcagg tcagattgaA GTGTACCGCC GGAAGCACCA GGAGCTGCAA  750
GCCATGCAGA TGGAGCTGCA GAGCCCTGAG TACAAGCTGA GCAAGCTCCG  800
CACCTCGACC ATCATGACCG ACTACAACCC CAACTACTGC TTTGCTGGCA  850
AGACCTCCTC CATCAGTGAC CTGAAGGAGG TGCCGCGGAA AAACATCACC  900
CTCATTCGGG GTCTGGGCCA TGGCGCCTTT GGGGAGGTGT ATGAAGGCCA  950
GGTGTCCGGA ATGCCCAACG ACCCAAGCCC CCTGCAAGTG GCTGTGAAGA  1000
CGCTGCCTGA AGTGTGCTCT GAACAGGACG AACTGGATTT CCTCATGGAA  1050
GCCCTGATCA TCAGCAAATT CAACCACCAG AACATTGTTC GCTGCATTGG  1100
GGTGAGCCTG CAATCCCTGC CCCGGTTCAT CCTGCTGGAG CTCATGGCGG  1150
GGGGAGACCT CAAGTCCTTC CTCCGAGAGA CCCGCCCTCG CCCGAGCCAG  1200
CCCTCCTCCC TGGCCATGCT GGACCTTCTG CACGTGGCTC GGGACATTGC  1250
CTGTGGCTGT CAGTATTTGG AGGAAAACCA CTTCATCCAC CGAGACATTG  1300
CTGCCAGAAA CTGCCTCTTG ACCTGTCCAG GCCCTGGAAG AGTGGCCAAG  1350
ATTGGAGACT TCGGGATGGC CCGAGACATC TACAGGGCGA GCTACTATAG  1400
AAAGGGAGGC TGTGCCATGC TGCCAGTTAA GTGGATGCCC CCAGAGGCCT  1450
TCATGGAAGG AATATTCACT TCTAAAACAG ACACATGGTC CTTTGGAGTG  1500
CTGCTATGGG AAATCTTTTC TCTTGGATAT ATGCCATACC CCAGCAAAAG  1550
CAACCAGGAA GTTCTGGAGT TTGTCACCAG TGGAGGCCGG ATGGACCCAC  1600
CCAAGAACTG CCCTGGGCCT GTATACCGGA TAATGACTCA GTGCTGGCAA  1650
CATCAGCCTG AAGACAGGCC CAACTTTGCC ATCATTTTGG AGAGGATTGA  1700
ATACTGCACC CAGGACCCGG ATGTAATCAA CACCGCTTTG CCGATAGAAT  1750
ATGGTCCACT TGTGGAAGAG GAAGAGAAAG TGCCTGTGAG GCCCAAGGAC  1800
CCTGAGGGGG TTCCTCCTCT CCTGGTCTCT CAACAGGCAA AACGGGAGGA  1850
GGAGCGCAGC CCAGCTGCCC CACCACCTCT GCCTACCACC TCCTCTGGCA  1900
AGGCTGCAAA GAAACCCACA GCTGCAGAGg TCTCTGTTCG AGTCCCTAGA  1950
GGGCCGGCCG TGGAAGGGGG ACACGTGAAT ATGGCATTCT CTCAGTCCAA  2000
CCCTCCTTCG GAGTTGCACA AGGTCCACGG ATCCAGAAAC AAGCCCACCA  2050
GCTTGTGGAA CCCAACGTAC GGCTCCTGGT TTACAGAGAA ACCCACCAAA  2100
AAGAATAATC CTATAGCAAA GAAGGAGCCA CACGACAGGG GTAACCTGGG  2150
GCTGGAGGGA AGCTGTACTG TCCCACCTAA CGTTGCAACT GGGAGACTTC  2200
CGGGGGCCTC ACTGCTCCTA GAGCCCTCTT CGCTGACTGC CAATATGAAG  2250
GAGGTACCTC TGTTCAGGCT ACGTCACTTC CCTTGTGGGA ATGTCAATTA  2300
CGGCTACCAG CAACAGGGCT TGCCCTTAGA AGCCGCTACT GCCCCTGGAG  2350
CTGGTCATTA CGAGGATACC ATTCTGAAAA GCAAGAATAG CATGAACCAG  2400
CCTGGGCCCT Ga  (SEQID NO：13)
核磷酸蛋白-间变性淋巴瘤激酶融合蛋白(NPM/ALK)的mRNA
atggaagatt cgatggacat ggacatgagc cccctgaggc cccagaacta  50
tcttttcggt tgtgaactaa aggccgacaa agattatcac tttaaggtgg  100
ataatgatga aaatgagcac cagttatctt taagaacggt cagtttaggg  150
gctggtgcaa aggatgagtt gcacattgtt gaagcagagg caatgaatta  200
cgaaggcagt ccaattaaag taacactggc aactttgaaa atgtctgtac  250
agccaacggt ttcccttggg ggctttgaaa taacaccacc agtggtctta  300
aggttgaagt gtggttcagg gccagtgcat attagtggac agcacttagt  350
AGTGTACCGC CGGAAGCACC AGGAGCTGCA AGCCATGCAG ATGGAGCTGC  400
AGAGCCCTGA GTACAAGCTG AGCAAGCTCC GCACCTCGAC CATCATGACC  450
GACTACAACC CCAACTACTG CTTTGCTGGC AAGACCTCCT CCATCAGTGA  500
CCTGAAGGAG GTGCCGCGGA AAAACATCAC CCTCATTCGG GGTCTGGGCC  550
ATGGCGCCTT TGGGGAGGTG TATGAAGGCC AGGTGTCCGG AATGCCCAAC  600
GACCCAAGCC CCCTGCAAGT GGCTGTGAAG ACGCTGCCTG AAGTGTGCTC  650
TGAACAGGAC GAACTGGATT TCCTCATGGA AGCCCTGATC ATCAGCAAAT  700
TCAACCACCA GAACATTGTT CGCTGCATTG GGGTGAGCCT GCAATCCCTG  750
CCCCGGTTCA TCCTGCTGGA GCTCATGGCG GGGGGAGACC TCAAGTCCTT  800
CCTCCGAGAG ACCCGCCCTC GCCCGAGCCA GCCCTCCTCC CTGGCCATGC  850
TGGACCTTCT GCACGTGGCT CGGGACATTG CCTGTGGCTG TCAGTATTTG  900
GAGGAAAACC ACTTCATCCA CCGAGACATT GCTGCCAGAA ACTGCCTCTT  950
GACCTGTCCA GGCCCTGGAA GAGTGGCCAA GATTGGAGAC TTCGGGATGG  1000
CCCGAGACAT CTACAGGGCG AGCTACTATA GAAAGGGAGG CTGTGCCATG  1050
CTGCCAGTTA AGTGGATGCC CCCAGAGGCC TTCATGGAAG GAATATTCAC  1100
TTCTAAAACA GACACATGGT CCTTTGGAGT GCTGCTATGG GAAATCTTTT  1150
CTCTTGGATA TATGCCATAC CCCAGCAAAA GCAACCAGGA AGTTCTGGAG  1200
TTTGTCACCA GTGGAGGCCG GATGGACCCA CCCAAGAACT GCCCTGGGCC  1250
TGTATACCGG ATAATGACTC AGTGCTGGCA ACATCAGCCT GAAGACAGGC  1300
CCAACTTTGC CATCATTTTG GAGAGGATTG AATACTGCAC CCAGGACCCG  1350
GATGTAATCA ACACCGCTTT GCCGATAGAA TATGGTCCAC TTGTGGAAGA  1400
GGAAGAGAAA GTGCCTGTGA GGCCCAAGGA CCCTGAGGGG GTTCCTCCTC  1450
TCCTGGTCTC TCAACAGGCA AAACGGGAGG AGGAGCGCAG CCCAGCTGCC  1500
CCACCACCTC TGCCTACCAC CTCCTCTGGC AAGGCTGCAA AGAAACCCAC  1550
AGCTGCAGAG gTCTCTGTTC GAGTCCCTAG AGGGCCGGCC GTGGAAGGGG  1600
GACACGTGAA TATGGCATTC TCTCAGTCCA ACCCTCCTTC GGAGTTGCAC  1650
AAGGTCCACG GATCCAGAAA CAAGCCCACC AGCTTGTGGA ACCCAACGTA  1700
CGGCTCCTGG TTTACAGAGA AACCCACCAA AAAGAATAAT CCTATAGCAA  1750
AGAAGGAGCC ACACGACAGG GGTAACCTGG GGCTGGAGGG AAGCTGTACT  1800
GTCCCACCTA ACGTTGCAAC TGGGAGACTT CCGGGGGCCT CACTGCTCCT  1850
AGAGCCCTCT TCGCTGACTG CCAATATGAA GGAGGTACCT CTGTTCAGGC  1900
TACGTCACTT CCCTTGTGGG AATGTCAATT ACGGCTACCA GCAACAGGGC  1950
TTGCCCTTAG AAGCCGCTAC TGCCCCTGGA GCTGGTCATT ACGAGGATAC  2000
CATTCTGAAA AGCAAGAATA GCATGAACCA GCCTGGGCCC TGa
ALK点突变：
F1245I/L;L1204F;A1200V;L1196M;I1170S;T1151M;R1275Q;F1174V/C/L;T1087I;K1062M
表2：借助EGFR、KRAS和ALK基因型描述个人背景特征、基线特征和化疗治疗史
Figure BDA00001882655702141
表3:最常见不良事件(≥15%具有任何不良事件的患者)
Figure BDA00001882655702151
a.基于实验室值的最大基线后等级
表4:IPI-504基于分子表征的临床功效
Figure BDA00001882655702152
＊3位KRAS野生型响应者中2位具有ALK重排，但是第三位经证实为ALK野生型。
表5.
KRAS Ref Seq mRNA
>NM_033360.2
ggccgcggcggcggaggcagcagcggcggcggcagtggcggcggcgaaggtggcggcggctcggccagtac
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gtatgtgctgtgaagtgatctaaaatttgtaatatttttgtcatgaactgtactactcctaattattgtaa
tgtaataaaaatagttacagtgacaaaaaaaaaaaaaaa    (SEQID NO：14)
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tgccctgcgcccgcaacccgagccgcacccgccgcggacggagcccatgcgcggggcgaaccgcgcgcccc
cgcccccgccccgccccggcctcggccccggccctggccccgggggcagtcgcgcctgtgaacggtggggc
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tgggcgccggcggtgtgggcaagagtgcgctgaccatccagctgatccagaaccattttgtggacgaatac
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gataccgccggccaggaggagtacagcgccatgcgggaccagtacatgcgcaccggggagggcttcctgtg
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cggcaggctcaggacctcgcccgaagctacggcatcccctacatcgagacctcggccaagacccggcaggg
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atgccaccggaaccccagcccttagctcccctcccaggcctctgtgggcccttgtcgggcacagatgggat
cacagtaaattattggatggtcttgaaaaaaaaaaaaaaaaaa    (SEQID NO：15)
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>NM_002524.3
gaaacgtcccgtgtgggaggggcgggtctgggtgcggcctgccgcatgactcgtggttcggaggcccacgt
ggccggggcggggactcaggcgcctggggcgccgactgattacgtagcgggcggggccggaagtgccgctc
cttggtgggggctgttcatggcggttccggggtctccaacatttttcccggctgtggtcctaaatctgtcc
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tcttatattca  (SEQID NO：16)
BRAF mRNA
>gi|75516779|gb|BC101757.1|智人v-raf鼠肉瘤病毒癌基因同源物B1,mRNA(cDNA克隆MGC:126806IMAGE:8069263)，完整编码区
GGCCCCGGCTCTCGGTTATAAGATGGCGGCGCTGAGCGGTGGCGGTGGTGGCGGCGCGGAGCCGGGCCAG
GCTCTGTTCAACGGGGACATGGAGCCCGAGGCCGGCGCCGGCGCCGGCGCCGCGGCCTCTTCGGCTGCGG
ACCCTGCCATTCCGGAGGAGGTGTGGAATATCAAACAAATGATTAAGTTGACACAGGAACATATAGAGGC
CCTATTGGACAAATTTGGTGGGGAGCATAATCCACCATCAATATATCTGGAGGCCTATGAAGAATACACC
AGCAAGCTAGATGCACTCCAACAAAGAGAACAACAGTTATTGGAATCTCTGGGGAACGGAACTGATTTTT
CTGTTTCTAGCTCTGCATCAATGGATACCGTTACATCTTCTTCCTCTTCTAGCCTTTCAGTGCTACCTTC
ATCTCTTTCAGTTTTTCAAAATCCCACAGATGTGGCACGGAGCAACCCCAAGTCACCACAAAAACCTATC
GTTAGAGTCTTCCTGCCCAACAAACAGAGGACAGTGGTACCTGCAAGGTGTGGAGTTACAGTCCGAGACA
GTCTAAAGAAAGCACTGATGATGAGAGGTCTAATCCCAGAGTGCTGTGCTGTTTACAGAATTCAGGATGG
AGAGAAGAAACCAATTGGTTGGGACACTGATATTTCCTGGCTTACTGGAGAAGAATTGCATGTGGAAGTG
TTGGAGAATGTTCCACTTACAACACACAACTTTGTACGAAAAACGTTTTTCACCTTAGCATTTTGTGACT
TTTGTCGAAAGCTGCTTTTCCAGGGTTTCCGCTGTCAAACATGTGGTTATAAATTTCACCAGCGTTGTAG
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CACCACCCAATACCACAGGAAGAGGCGTCCTTAGCAGAGACTGCCCTAACATCTGGATCATCCCCTTCCG
CACCCGCCTCGGACTCTATTGGGCCCCAAATTCTCACCAGTCCGTCTCCTTCAAAATCCATTCCAATTCC
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CCCAATGTGCATATAAACACAATAGAACCTGTCAATATTGATGACTTGATTAGAGACCAAGGATTTCGTG
GTGATGGAGGATCAACCACAGGTTTGTCTGCTACCCCCCCTGCCTCATTACCTGGCTCACTAACTAACGT
GAAAGCCTTACAGAAATCTCCAGGACCTCAGCGAGAAAGGAAGTCATCTTCATCCTCAGAAGACAGGAAT
CGAATGAAAACACTTGGTAGACGGGACTCGAGTGATGATTGGGAGATTCCTGATGGGCAGATTACAGTGG
GACAAAGAATTGGATCTGGATCATTTGGAACAGTCTACAAGGGAAAGTGGCATGGTGATGTGGCAGTGAA
AATGTTGAATGTGACAGCACCTACACCTCAGCAGTTACAAGCCTTCAAAAATGAAGTAGGAGTACTCAGG
AAAACACGACATGTGAATATCCTACTCTTCATGGGCTATTCCACAAAGCCACAACTGGCTATTGTTACCC
AGTGGTGTGAGGGCTCCAGCTTGTATCACCATCTCCATATCATTGAGACCAAATTTGAGATGATCAAACTT
ATAGATATTGCACGACAGACTGCACAGGGCATGGATTACTTACACGCCAAGTCAATCATCCACAGAGACCT
CAAGAGTAATAATATATTTCTTCATGAAGACCTCACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAGTGA
AATCTCGATGGAGTGGGTCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCTGGATCCATTTTGTGGATGGCACCAGAAGTC
ATCAGAATGCAAGATAAAAATCCATACAGCTTTCAGTCAGATGTATATGCATTTGGAATTGTTCTGTATGA
ATTGATGACTGGACAGTTACCTTATTCAAACATCAACAACAGGGACCAGATAATTTTTATGGTGGGACGAG
GATACCTGTCTCCAGATCTCAGTAAGGTACGGAGTAACTGTCCAAAAGCCATGAAGAGATTAATGGCAGAG
TGCCTCAAAAAGAAAAGAGATGGAGACCACTCTTTCCCCAAATTCTCGCCTCTATTGAGCTGCTGGCCCGC
TCATTGCCAAAAATTCACCGCAGTGCATCAGAACCCTCCTTGAATCGGGCTGGTTTCCAAACAGAGGATTT
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RAF1(CRAF)mRNA
>gi|35841|emb|X03484.1|raf癌基因的人mRNA
CCGAATGTGACCGCCTCCCGCTCCCTCACCCGCCGCGGGGAGGAGGAGCGGGCGAGAAGCTGCCGCCGAAC
GACAGGACGTTGGGGCGGCCTGGCTCCCTCAGGTTTAAGAATTGTTTAAGCTGCATCAATGGAGCACATAC
AGGGAGCTTGGAAGACGATCAGCAATGGTTTTGGATTCAAAGATGCCGTGTTTGATGGCTCCAGCTGCATC
TCTCCTACAATAGTTCAGCAGTTTGGCTATCAGCGCCGGGCATCAGATGATGGCAAACTCACAGATCCTTC
TAAGACAAGCAACACTATCCGTGTTTTCTTGCCGAACAAGCAAAGAACAGTGGTCAATGTGCGAAATGGAA
TGAGCTTGCATGACTGCCTTATGAAAGCACTCAAGGTGAGGGGCCTGCAACCAGAGTGCTGTGCAGTGTTC
AGACTTCTCCACGAACACAAAGGTAAAAAAGCACGCTTAGATTGGAATACTGATGCTGCGTCTTTGATTGG
AGAAGAACTTCAAGTAGATTTCCTGGATCATGTTCCCCTCACAACACACAACTTTGCTCGGAAGACGTTCC
TGAAGCTTGCCTTCTGTGACATCTGTCAGAAATTCCTGCTCAATGGATTTCGATGTCAGACTTGTGGCTAC
AAATTTCATGAGCACTGTAGCACCAAAGTACCTACTATGTGTGTGGACTGGAGTAACATCAGACAACTCTT
ATTGTTTCCAAATTCCACTATTGGTGATAGTGGAGTCCCAGCACTACCTTCTTTGACTATGCGTCGTATGC
GAGAGTCTGTTTCCAGGATGCCTGTTAGTTCTCAGCACAGATATTCTACACCTCACGCCTTCACCTTTAAC
ACCTCCAGTCCCTCATCTGAAGGTTCCCTCTCCCAGAGGCAGAGGTCGACATCCACAC
CTAATGTCCACATGGTCAGCACCACGCTGCCTGTGGACAGCAGGATGATTGAGGATGCAATTCGAAGTCAC
AGCGAATCAGCCTCACCTTCAGCCCTGTCCAGTAGCCCCAACAATCTGAGCCCAACAGGCTGGTCACAGCC
GAAAACCCCCGTGCCAGCACAAAGAGAGCGGGCACCAGTATCTGGGACCCAGGAGAAAAACAAAATTAGGC
CTCGTGGACAGAGAGATTCAAGCTATTATTGGGAAATAGAAGCCAGTGAAGTGATGCTGTCCACTCGGATT
GGGTCAGGCTCTTTTGGAACTGTTTATAAGGGTAAATGGCACGGAGATGTTGCAGTAAAGATCCTAAAGGT
TGTCGACCCAACCCCAGAGCAATTCCAGGCCTTCAGGAATGAGGTGGCTGTTCTGCGCAAAACACGGCATG
TGAACATTCTGCTTTTCATGGGGTACATGACAAAGGACAACCTGGCAATTGTGACCCAGTGGTGCGAGGGC
AGCAGCCTCTACAAACACCTGCATGTCCAGGAGACCAAGTTTCAGATGTTCCAGCTAATTGACATTGCCCG
GCAGACGGCTCAGGGAATGGACTATTTGCATGCAAAGAACATCATCCATAGAGACATGAAATCCAACAATA
TATTTCTCCATGAAGGCTTAACAGTGAAAATTGGAGATTTTGGTTTGGCAACAGTAAAGTCACGCTGGAGT
GGTTCTCAGCAGGTTGAACAACCTACTGGCTCTGTCCTCTGGATGGCCCCAGAGGTGATCCGAATGCAGGA
TAACAACCCATTCAGTTTCCAGTCGGATGTCTACTCCTATGGCATCGTATTGTATGAACTGATGACGGGGG
AGCTTCCTTATTCTCACATCAACAACCGAGATCAGATCATCTTCATGGTGGGCCGAGG
ATATGCCTCCCCAGATCTTAGTAAGCTATATAAGAACTGCCCCAAAGCAATGAAGAGGCTGGTAGCTGACT
GTGTGAAGAAAGTAAAGGAAGAGAGGCCTCTTTTTCCCCAGATCCTGTCTTCCATTGAGCTGCTCCAACAC
TCTCTACCGAAGATCAACCGGAGCGCTTCCGAGCCATCCTTGCATCGGGCAGCCCACACTGAGGATATCAA
TGCTTGCACGCTGACCACGTCCCCGAGGCTGCCTGTCTTCTAGTTGACTTTGCACCTGTCTTCAGGCTGCC
AGGGGAGGAGGAGAAGCCAGCAGGCACCACTTTTCTGCTCCCTTTCTCCAGAGGCAGAACACATGTTTTCA
GAGAAGCTCTGCTAAGGACCTTCTAGACTGCTCACAGGGCCTTAACTTCATGTTGCCTTCTTTTCTATCCC
TTTGGGCCCTGGGAGAAGGAAGCCATTTGCAGTGCTGGTGTGTCCTGCTCCCTCCCCACATTCCCCATGCT
CAAGGCCCAGCCTTCTGTAGATGCGCAAGTGGATGTTGATGGTAGTACAAAAAGCAGGGGCCCAGCCCCAG
CTGTTGGCTACATGAGTATTTAGAGGAAGTAAGGTAGCAGGCAGTCCAGCCCTGATGTGGAGACACATGGG
ATTTTGGAAATCAGCTTCTGGAGGAATGCATGTCACAGGCGGGACTTTCTTCAGAGAGTGGTGCAGCGCCA
GACATTTTGCACATAAGGCACCAAACAGCCCAGGACTGCCGAGACTCTGGCCGCCCGAAGGAGCCTGCTTT
GGTACTATGGAACTTTTCTTAGGGGACACGTCCTCCTTTCACAGCTTCTAAGGTGTCCAGTGCATTGGGAT
GGTTTTCCAGGCAAGGCACTCGGCCAATCCGCATCTCAGCCCTCTCAGGAGCAGTCTT
CCATCATGCTGAATTTTGTCTTCCAGGAGCTGCCCCTATGGGGCGGGCCGCAGGGCCAGCCTGTTTCTCTA
ACAAACAAACAAACAAACAGCCTTGTTTCTCTAGTCACATCATGTGTATACAAGGAAGCCAGGAATACAGG
TTTTCTTGATGATTTGGGTTTTAATTTTGTTTTTATTGCACCTGACAAAATACAGTTATCTGATGGTCCCT
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ARAF mRNA
>gi|28820|emb|X04790.1|A-raf-1癌基因的人mRNA
TGACCCAATAAGGGTGGAAGGCTGAGTCCCGCAGAGCCAATAACGAGAGTCCGAGAGGCGACGGAGGCGGA
CTCTGTGAGGAAACAAGAAGAGAGGCCCAAGATGGAGACGGCGGCGGCTGTAGCGGCGTGACAGGAGCCCC
ATGGCACCTGCCCAGCCCCACCTCAGCCCATCTTGACAAAATCTAAGGCTCCATGGAGCCACCACGGGGCC
CCCCTGCCAATGGGGCCGAGCCATCCCGGGCAGTGGGCACCGTCAAAGTATACCTGCCCAACAAGCAACGC
ACGGTGGTGACTGTCCGGGATGGCATGAGTGTCTACGACTCTCTAGACAAGGCCCTGAAGGTGCGGGGTCT
AAATCAGGACTGCTGTGTGGTCTACCGACTCATCAAGGGACGAAAGACGGTCACTGCCTGGGACACAGCCA
TTGCTCCCCTGGATGGCGAGGAGCTCATTGTCGAGGTCCTTGAAGATGTCCCGCTGACCATGCACAATTTT
GTACGGAAGACCTTCTTCAGCCTGGCGTTCTGTGACTTCTGCCTTAAGTTTCTGTTCCATGGCTTCCGTTG
CCAAACCTGTGGCTACAAGTTCCACCAGCATTGTTCCTCCAAGGTCCCCACAGTCTGTGTTGACATGAGTA
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AACCGCCCCCTGAATGAGTTGCTAACCCCCCAGGGTCCCAGCCCCCGCACCCAGCACTGTGACCCGGAGCA
CTTCCCCTTCCCTGCCCCAGCCAATGCCCCCCTACAGCGCATCCGCTCCACGTCCACTCCCAACGTCCATA
TGGTCAGCACCACGGCCCCCATGGACTCCAACCTCATCCAGCTCACTGGCCAGAGTTT
CAGCACTGATGCTGCCGGTAGTAGAGGAGGTAGTGATGGAACCCCCCGGGGGAGCCCCAGCCCAGCCAGCG
TGTCCTCGGGGAGGAAGTCCCCACATTCCAAGTCACCAGCAGAGCAGCGCGAGCGGAAGTCCTTGGCCGAT
GACAAGAAGAAAGTGAAGAACCTGGGGTACCGGGANTCAGGCTATTACTGGGAGGTACCACCCAGTGAGGT
GCAGCTGCTGAAGAGGATCGGGACGGGCTCGTTTGGCACCGTGTTTCGAGGGCGGTGGCATGGCGATGTGG
CCGTGAAGGTGCTCAAGGTGTCCCAGCCCACAGCTGAGCAGGCCCAGGCTTTCAAGAATGAGATGCAGGTG
CTCAGGAAGACGCGACATGTCAACATCTTGCTGTTTATGGGCTTCATGACCCGGCCGGGATTTGCCATCAT
CACACAGTGGTGTGAGGGCTCCAGCCTCTACCATCACCTGCATGTGGCCGACACACGCTTCGACATGGTCC
AGCTCATCGACGTGGCCCGGCAGACTGCCCAGGGCATGGACTACCTCCATGCCAAGAACATCATCCACCGA
GATCTCAAGTCTAACAACATCTTCCTACATGAGGGGCTCACGGTGAAGATCGGTGACTTTGGCTTGGCCAC
AGTGAAGACTCGATGGAGCGGGGCCCAGCCCTTGGAGCAGCCCTCAGGATCTGTGCTGTGGATGGCAGCTG
AGGTGATCCGTATGCAGGACCCGAACCCCTACAGCTTCCAGTCAGACGTCTATGCCTACGGGGTTGTGCTC
TACGAGCTTATGACTGGCTCACTGCCTTACAGCCACATTGGCTGCCGTGACCAGATTATCTTTATGGTGGG
CCGTGGCTATCTGTCCCCGGACCTCAGCAAAATCTCCAGCAACTGCCCCAAGGCCATG
CGGCGCCTGCTGTCTGACTGCCTCAAGTTCCAGCGGGAGGAGCGGCCCCTCTTCCCCCAGATCCTGGCCAC
AATTGAGCTGCTGCAACGGTCACTCCCCAAGATTGAGCGGAGTGCCTCGGAACCCTCCTTGCACCGCACCC
AGGCCGATGAGTTGCCTGCCTGCCTACTCAGCGCAGCCCGCCTTGTGCCTTAGGCCCCGCCCAAGCCACCA
GGGAGCCAATCTCAGCCCTCCACGCCAAGGAGCCTTGCCCACCAGCCAATCAATGTTCGTCTCTGCCCTGA
TGCTGCCTCAGGATCCCCCATTCCCCACCCTGGGAGATGAGGGGGTCCCCATGTGCTTTTCCAGTTCTTCT
GGAATTGGGGGACCCCCGCCAAAGACTGAGCCCCCTGTCTCCTCCATCATTTGGTTTCCTCTTGGCTTTGG
GGATACTTCTAAATTTTGGGAGCTCCTCCATCTCCAATGGCTGGGATTTGTGGCAGGGATTCCACTCAGAA
CCTCTCTGGAATTTGTGCCTGATGTGCCTTCCACTGGATTTTGGGGTTCCCAGCACCCCATGTGGATTTTG
GGGGGTCCCTTTTGTGTCTCCCCCGCCATTCAAGGACTCCTCTCTTTCTTCACCAAGAAGCACAGAATTC
(SEQID NO：19)
蛋白质序列
>KRAS
MTEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQY
MRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPMVLVGNKCDLPSRTVDTKQAQDLARSYGIPFI
ETSAKTRQGVDDAFYTLVREIRKHKEKMSKDGKKKKKKSKTKCVIM＊(SEQ  ID NO：20)
>HRAS
MTEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQY
MRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHQYREQIKRVKDSDDVPMVLVGNKCDLAARTVESRQAQDLARSYGIPYI
ETSAKTRQGVEDAFYTLVREIRQHKLRKLNPPDESGPGCMSCKCVLS＊(SEQ  ID NO：21)
>NRAS
MTEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQY
MRTGEGFLCVFAINNSKSFADINLYREQIKRVKDSDDVPMVLVGNKCDLPTRTVDTKQAHELAKSYGIPFI
ETSAKTRQGVEDAFYTLVREIRQYRMKKLNSSDDGTQGCMGLPCVVM＊(SEQID NO：22)
>BRAF
MAALSGGGGGGAEPGQALFNGDMEPEAGAGAGAAASSAADPAIPEEVWNIKQMIKLTQEHIEALLDKFGGE
HNPPSIYLEAYEEYTSKLDALQQREQQLLESLGNGTDFSVSSSASMDTVTSSSSSSLSVLPSSLSVFQNPT
DVARSNPKSPQKPIVRVFLPNKQRTVVPARCGVTVRDSLKKALMMRGLIPECCAVYRIQDGEKKPIGWDTD
ISWLTGEELHVEVLENVPLTTHNFVRKTFFTLAFCDFCRKLLFQGFRCQTCGYKFHQRCSTEVPLMCVNYD
QLDLLFVSKFFEHHPIPQEEASLAETALTSGSSPSAPASDSIGPQILTSPSPSKSIPIPQPFRPADEDHRN
QFGQRDRSSSAPNVHINTIEPVNIDDLIRDQGFRGDGGSTTGLSATPPASLPGSLTNVKALQKSPGPQRER
KSSSSSEDRNRMKTLGRRDSSDDWEIPDGQITVGQRIGSGSFGTVYKGKWHGDVAVKMLNVTAPTPQQLQA
FKNEVGVLRKTRHVNILLFMGYSTKPQLAIVTQWCEGSSLYHHLHIIETKFEMIKLIDIARQTAQGMDYLH
AKSIIHRDLKSNNIFLHEDLTVKIGDFGLATVKSRWSGSHQFEQLSGSILWMAPEVIRMQDKNPYSFQSDV
YAFGIVLYELMTGQLPYSNIN
NRDQIIFMVGRGYLSPDLSKVRSNCPKAMKRLMAECLKKKRDERPLFPQILASIELLARSLPKIHRSASEP
SLNRAGFQTEDFSLYACASPKTPIQAGGYGAFPVH＊(SEQID NO：23)
>ARAF
MEPPRGPPANGAEPSRAVGTVKVYLPNKQRTVVTVRDGMSVYDSLDKALKVRGLNQDCCVVYRLIKGRKTV
TAWDTAIAPLDGEELIVEVLEDVPLTMHNFVRKTFFSLAFCDFCLKFLFHGFRCQTCGYKFHQHCSSKVPT
VCVDMSTNRQQFYHSVQDLSGGSRQHEAPSNRPLNELLTPQGPSPRTQHCDPEHFPFPAPANAPLQRIRST
STPNVHMVSTTAPMDSNLIQLTGQSFSTDAAGSRGGSDGTPRGSPSPASVSSGRKSPHSKSPAEQRERKSL
ADDKKKVKNLGYRDSGYYWEVPPSEVQLLKRIGTGSFGTVFRGRWHGDVAVKVLKVSQPTAEQAQAFKNEM
QVLRKTRHVNILLFMGFMTRPGFAIITQWCEGSSLYHHLHVADTRFDMVQLIDVARQTAQGMDYLHAKNII
HRDLKSNNIFLHEGLTVKIGDFGLATVKTRWSGAQPLEQPSGSVLWMAAEVIRMQDPNPYSFQSDVYAYGV
VLYELMTGSLPYSHIGCRDQIIFMVGRGYLSPDLSKISSNCPKAMRRLLSDCLKFQREERPLFPQILATIE
LLQRSLPKIERSASEPSLHRTQADELPACLLSAARLVP＊(SEQID NO：24)
>RAF1
MEHIQGAWKTISNGFGFKDAVFDGSSCISPTIVQQFGYQRRASDDGKLTDPSKTSNTIRVFLPNKQRTVVN
VRNGMSLHDCLMKALKVRGLQPECCAVFRLLHEHKGKKARLDWNTDAASLIGEELQVDFLDHVPLTTHNFA
RKTFLKLAFCDICQKFLLNGFRCQTCGYKFHEHCSTKVPTMCVDWSNIRQLLLFPNSTIGDSGVPALPSLT
MRRMRESVSRMPVSSQHRYSTPHAFTFNTSSPSSEGSLSQRQRSTSTPNVHMVSTTLPVDSRMIEDAIRSH
SESASPSALSSSPNNLSPTGWSQPKTPVPAQRERAPVSGTQEKNIRPRGQRDSSYYWEIEASEVMLSTRIG
SGSFGTVYKGKWHGDVAVKILKVVDPTPQFQAFRNEVAVLRKTRHVNILLFMGYMTKDNLAIVTQWCEGSS
LYKHLHVQETFQMFQLIDIARQTAQGMDYLHAKNIIHRDMKSNNIFLHEGLTVKIGDFGLATVKSRWSGSQ
QVEQPTGSVLWMAPEVIRMQDNNPFSFQSDVYSYGIVLYELMTGELPYSHINNRDQIIFMVGRGYASPDLS
KLYKNCPKAMKRLVADCVKKVKEERPLFPQILSSIELLQHSLPKINRSASEPSLHRAAHTEDINACTLTTS
PRLPVF＊(SEQID NO：25)
>MKNK1
MVSSQKLEKPIEMGSSEPLPIADGDRRRKKKRRGRATDSLPGKFEDMYKLTSELLGEGAYAKVQGAVSLQN
GKEYAVKIIEKQAGHSRSRVFREVETLYQCQGNKNILELIEFFEDDTRFYLVFEKLQGGSILAHIQKQKHF
NEREASRVVRDVAAALDFLHTKDKVSLCHLGWSAMAPSGLTAAPTSLGSSDPPTSASQVAGTTGIAHRDLK
PENILCESPEKVSPVKICDFDLGSGMKLNNSCTPITTPELTTPCGSAEYMAPEVVEVFTDQATFYDKRCDL
WSLGVVLYIMLSGYPPFVGHCGADCGWDRGEVCRVCQNKLFEIQEGKYEFPDKDWAHISSEAKDLISKLLV
RDAKQRLSAAQVLQHPWVQGQAPEKGLPTPQVLQRNSSTMDLTLFAAEAIALNRQLSQHEENELAEEPEAL
ADGLCSMKLSPPCKSRLARRRALAQAGRGEDRSPPTAL＊(SEQ  ID NO：26)
四个RSK基因
>RPS6KA1
MPLAQLKEPWPLMELVPLDPENGQTSGEEAGLQPSKDEGVLKEISITHHVKAGSEKADPSHFELLKVLGQG
SFGKVFLVRKVTRPDSGHLYAMKVLKKATLKVRDRVRTKMERDILADVNHPFVVKLHYAFQTEGKLYLILD
FLRGGDLFTRLSKEVMFTEEDVKFYLAELALGLDHLHSLGIIYRDLKPENILLDEEGHIKLTDFGLSKEAI
DHEKKAYSFCGTVEYMAPEVVNRQGHSHSADWWSYGVLMFEMLTGSLPFQGKDRKEMTLILKAKLGMPQFL
STEAQSLLRALFKRNPANRLGSGPDGAEEIKRHVFYSTIDNKLYRREITPPFKPAVAQPDDTFYFDTEFTS
RTPKDSPGIPPSAGAHQLFRGFSFVATGLMEDDGKPRAPQAPLHSVVQQLHGKNLVFSDGYVVKETIGVGS
YSECKRCVHKATNMEYAVKVIDKSKRDPSEEIEILLRYGQHPNIITLKDVYDDGKHVYLVTELMRGGELLD
KILRQKFFSEREASFVLHTIGKTVEYLHSQGVVHRDLKPSNILYVDESGNPECLRICDFGFAKQLRAENGL
LMTPCYTANFVAPEVLKRQGYDEGCDIWSLGILLYTMLAGYTPFANGPSDTPEEILTRIGSGKFTLSGGNW
NTVSETAKDLVSKMLHVDPHQRLTAKQVLQHPWVTQKDKLPQSQLSHQDLQLVKGAMAATYSALNSSKPTP
QLKPIESSILAQRRVRKLPSTTL＊(SEQID NO：27)
>RPS6KA2
MDLSMKKFAVRRFFSVYLRRKSRSKSSSLSRLEEEGVVKEIDISHHVKEGFEKADPSQFELLKVLGQGSYG
KVFLVRKVKGSDAGQLYAMKVLKKATLKVRDRVRSKMERDILAEVNHPFIVKLHYAFQTEGKLYLILDFLR
GGDLFTRLSKEVMFTEEDVKFYLAELALALDHLHSLGIIYRDLKPENILLDEEGHIKITDFGLSKEAIDHD
KRAYSFCGTIEYMAPEVVNRRGHTQSADWWSFGVLMFEMLTGSLPFQGKDRKETMALILKAKLGMPQFLSG
EAQSLLRALFKRNPCNRLGAGIDGVEEIKRHPFFVTIDWNTLYRKEIKPPFKPAVGRPEDTFHFDPEFTAR
TPTDSPGVPPSANAHHLFRGFSFVASSLIQEPSQQDLHKVPVHPIVQQLHGNNIHFTDGYEIKEDIGVGSY
SVCKRCVHKATDTEYAVKIIDKSKRDPSEEIEILLRYGQHPNIITLKDVYDDGKFVYLVMELMRGGELLDR
ILRQRYFSEREASDVLCTITKTMDYLHSQGVVHRDLKPSNILYRDESGSPESIRVCDFGFAKQLRAGNGLL
MTPCYTANFVAPEVLKRQGYDAACDIWSLGILLYTMLAGFTPFANGPDDTPEEILARIGSGKYALSGGNWD
SISDAAKDVVSKMLHVDPHQRLTAMQVLKHPWVVNREYLSPNQLSRQDVHLVKGAMAATYFALNRTPQAPR
LEPVLSSNLAQRRGMKRLTSTRL＊(SEQ  ID NO：28)
>RPS6KA3
MPLAQLADPWQKMAVESPSDSAENGQQIMDEPMGEEEINPQTEEVSIKEIAITHHVKEGHEKADPSQFELL
KVLGQGSFGKVFLVKKISGSDARQLYAMKVLKKATLKVRDRVRTKMERDILVEVNHPFIVKLHYAFQTEGK
LYLILDFLRGGDLFTRLSKEVMFTEEDVKFYLAELALALDHLHSLGIIYRDLKPENILLDEEGHIKLTDFG
LSKESIDHEKKAYSFCGTVEYMAPEVVNRRGHTQSADWWSFGVLMFEMLTGTLPFQGKDRKETMTMILKAK
LGMPQFLSPEAQSLLRMLFKRNPANRLGAGPDGVEEIKRHSFFSTIDWNKLYRREIHPPFKPATGRPEDTF
YFDPEFTAKTPKDSPGIPPSANAHQLFRGFSFVAITSDDESQAMQTVGVHSIVQQLHRNSIQFTDGYEVKE
DIGVGSYSVCKRCIHKATNMEFAVKIIDKSKRDPTEEIEILLRYGQHPNIITLKDVYDDGKYVYVVTELMK
GGELLDKILRQKFFSEREASAVLFTITKTVEYLHAQGVVHRDLKPSNILYVDESGNPESIRICDFGFAKQL
RAENGLLMTPCYTANFVAPEVLKRQGYDAACDIWSLGVLLYTMLTGYTPFANGPDDTPEEILARIGSGKFS
LSGGYWNSVSDTAKDLVSKMLHVDPHQRLTAALVLRHPWIVHWDQLPQYQLNRQDAPHLVKGAMAATYSAL
NRNQSPVLEPVGRSTLAQRRGIKKITSTAL＊(SEQ  ID NO：29)
>RPS6KA4
MGDEDDDESCAVELRITEANLTGHEEKVSVENFELLKVLGTGAYGKVFLVRKAGGHDAGKLYAMKVLRKAA
LVQRAKTQEHTRTERSVLELVRQAPFLVTLHYAFQTDAKLHLILDYVSGGEMFTHLYQRQYFKEAEVRVYG
GEIVLALEHLHKLGIIYRDLKLENVLLDSEGHIVLTDFGLSKEFLTEEKERTFSFCGTIEYMAPEIIRSKT
GHGKAVDWWSLGILLFELLTGASPFTLEGERNTQAEVSRRILKCSPPFPPRIGPVAQDLLQRLLCKDPKKR
LGAGPQGAQEVRNHPFFQGLDWVALAARKIPAPFRPQIRSELDVGNFAEEFTRLEPVYSPPGSPPPGDPRI
FQGYSFVAPSILFDHNNAVMTDGLEAPGAGDRPGRAAVARSAMMQDSPFFQQYELDLREPALGQGSFSVCR
RCRQRQSGQEFAVKILSRRLEANTQREVAALRLCQSHPNVVNLHEVHHDQLHTYLVLELLRGGELLEHIRK
KRHFSESEASQILRSLVSAVSFMHEEAGVVHRDLKPENILYADDTPGAPVKIIDFGFARLRPQSPGVPMQT
PCFTLQYAAPELLAQQGYDESCDLWSLGVILYMMLSGQVPFQGASGQGGQSQAAEIMCKIREGRFSLDGEA
WQGVSEEAKELVRGLLTVDPAKRLKLEGLRGSSWLQDGSARSSPPLRTPDVLESSGPAVRSGLNATFMAFN
RGKREGFFLKSVENAPLAKRRKQKLRSATASRRGSPAPANPGRAPVASKGAPRRANGPLPPS＊(SEQIDNO：30)
>ETS1
MKAAVDLKPTLTIIKTEKVDLELFPSPDMECADVPLLTPSSKEMMSQALKATFSGFTKEQQRLGIPKDPRQ
WTETHVRDWVMWAVNEFSLKGVDFQKFCMNGAALCALGKDCFLELAPDFVGDILWEHLEILQKEDVKPYQV
NGVNPAYPESRYTSDYFISYGIEHAQCVPPSEFSEPSFITESYQTLHPISSEELLSLKYENDYPSVILRDP
LQTDTLQNDYFAIKQEVVTPDNMCMGRTSRGKLGGQDSFESIESYDSCDRLTQSWSSQSSFNSLQRVPSYD
SFDSEDYPAALPNHKPKGTFKDYVRDRADLNKDKPVIPAAALAGYTGSGPIQLWQFLLELLTDKSCQSFIS
WTGDGWEFKLSDPDEVARRWGKRKNKPKMNYEKLSRGLRYYYDKNIIHKTAGKRYVYRFVCDLQSLLGYTP
EELHAMLDVKPDADE＊(SEQ  ID NO：31)
>ELK1
MDPSVTLWQFLLQLLREQGNGHIISWTSRDGGEFKLVDAEEVARLWGLRKNKTNMNYDKLSRALRYYYDKN
IIRKVSGQKFVYKFVSYPEVAGCSTEDCPPQPEVSVTSTMPNVAPAAIHAAPGDTVSGKPGTPKGAGMAGP
GGLARSSRNEYMRSGLYSTFTIQSLQPQPPPHPRPAVVLPNAAPAGAAAPPSGSRSTSPSPLEACLEAEEA
GLPLQVILTPPEAPNLKSEELNVEPGLGRALPPEVKVEGPKEELEVAGERGFVPETTKAEPEVPPQEGVPA
RLPAVVMDTAGQAGGHAASSPEISQPQKGRKPRDLELPLSPSLLGGPGPERTPGSGSGSGLQAPGPALTPS
LLPTHTLTPVLLTPSSLPPSIHFWSTLSPIAPRSPAKLSFQFPSSGSAQVHIPSISVDGLSTPVVLSPGPQ
KP＊(SEQID NO：32)
>SH2D 1A(SAP)
MDAVAVYHGKISRETGEKLLLATGLDGSYLLRDSESVPGVYCLCVLYHGYIYTYRVSQTETGSWSAETAPG
VHKRYFRKIKNLISAFQKPDQGIVIPLQYPVEKKSSARSTQGTTGIREDPDVCLKAP＊(SEQ IDNO：33)
突变
RAS家族(KRAS、HRAS和NRAS)：在密码子12、13和61中
的突变，即G12A、G12N、G12R、G12C、G12S、G12V、G13N和Q61R。
BRAF：在密码子600中的突变，即V600E。
表8
附表1
Figure BDA00001882655702241
Figure BDA00001882655702251
Figure IDA00001882656600011
Figure IDA00001882656600021
Figure IDA00001882656600031
Figure IDA00001882656600041
Figure IDA00001882656600061
Figure IDA00001882656600081
Figure IDA00001882656600091
Figure IDA00001882656600101
Figure IDA00001882656600111
Figure IDA00001882656600121
Figure IDA00001882656600131
Figure IDA00001882656600141
Figure IDA00001882656600171
Figure IDA00001882656600181
Figure IDA00001882656600191
Figure IDA00001882656600201
Figure IDA00001882656600211
Figure IDA00001882656600221
Figure IDA00001882656600231
Figure IDA00001882656600251
Figure IDA00001882656600261
Figure IDA00001882656600271
Figure IDA00001882656600281
Figure IDA00001882656600291
Figure IDA00001882656600301
Figure IDA00001882656600311
Figure IDA00001882656600321
Figure IDA00001882656600331
Figure IDA00001882656600341
Figure IDA00001882656600351
Figure IDA00001882656600361
Figure IDA00001882656600371
Figure IDA00001882656600381
Figure IDA00001882656600391
Figure IDA00001882656600401
Figure IDA00001882656600411
Figure IDA00001882656600421
Figure IDA00001882656600431
Figure IDA00001882656600441
Figure IDA00001882656600451
Figure IDA00001882656600461
Figure IDA00001882656600471
Figure IDA00001882656600481
Figure IDA00001882656600491
Figure IDA00001882656600501
Figure IDA00001882656600511
Figure IDA00001882656600521
Figure IDA00001882656600541
Figure IDA00001882656600551
Figure IDA00001882656600561
Figure IDA00001882656600571
Figure IDA00001882656600591
Figure IDA00001882656600601
Figure IDA00001882656600611
Figure IDA00001882656600621
Figure IDA00001882656600631
Figure IDA00001882656600641
Figure IDA00001882656600651
Figure IDA00001882656600661
Figure IDA00001882656600671
Figure IDA00001882656600691
Figure IDA00001882656600701
Figure IDA00001882656600711
Figure IDA00001882656600721
Figure IDA00001882656600731
Figure IDA00001882656600751
Figure IDA00001882656600761
Figure IDA00001882656600771
Figure IDA00001882656600781
Figure IDA00001882656600791
Figure IDA00001882656600811
Figure IDA00001882656600831
Figure IDA00001882656600851
Figure IDA00001882656600861
Figure IDA00001882656600871
Figure IDA00001882656600881
Figure IDA00001882656600891
Figure IDA00001882656600901
Figure IDA00001882656600911
Figure IDA00001882656600921
Figure IDA00001882656600931
Figure IDA00001882656600941
Figure IDA00001882656600951
Figure IDA00001882656600961
Figure IDA00001882656600981
Figure IDA00001882656601001
Figure IDA00001882656601011
Figure IDA00001882656601021
Figure IDA00001882656601031
Figure IDA00001882656601041
Figure IDA00001882656601061
Figure IDA00001882656601071
Figure IDA00001882656601101
Figure IDA00001882656601131
Figure IDA00001882656601141
Figure IDA00001882656601151
Figure IDA00001882656601161
Figure IDA00001882656601171
Figure IDA00001882656601181
Figure IDA00001882656601191
Figure IDA00001882656601201
Figure IDA00001882656601211

Claims (56)

1.一种确定肿瘤或癌细胞或受试者对包括HSP90抑制剂的治疗的响应性的方法，所述受试者具有所述肿瘤或癌细胞或处于具有所述肿瘤或癌细胞的风险，所述方法包括：
(i)检测所述肿瘤或癌细胞中ALK、MAPK途径和/或EGFR基因或基因产物中的改变；和/或
(ii)评价以下一项或多项：a)所述肿瘤或癌细胞组织结构，b)所述受试者的吸烟状态，或c)HSP90在所述肿瘤或癌细胞中的水平或表达，从而确定所述肿瘤或癌细胞对包括HSP90抑制剂的治疗的响应性。
2.一种鉴定罹患癌症或肿瘤有或处于罹患癌症或肿瘤的风险的受试者具有对包括HSP90抑制剂的治疗响应的可能性的方法，所述方法包括以下一项、两项、三项或四项：
(i)检测来自所述受试者的样本中ALK、MAPK途径和/或EGF基因或基因中的改变的存在或不存在；
(ii)检测来自所述受试者的样本中癌性组织结构的存在或不存在；
(iii)确定所述受试者的吸烟状态；或
(iv)确定来自所述受试者的样本中HSP90的水平或表达，从而鉴定所述受试者可能或不可能对包括HSP90抑制剂的治疗响应。
3.一种监测或预测包括HSP90抑制剂的治疗在受试者中治疗癌症或肿瘤的功效的方法，所述方法包括
(i)检测从所述受试者获得的样本中ALK、MAPK途径和/或EGFR基因或基因产物中的改变的中存在或不存在；和/或
(ii)评价以下一项或多项：a)来自所述受试者的样本中癌性组织结构的存在或不存在；b)所述受试者的吸烟状态；或c)HSP90的水平或表达；并且
(iii)将在(i)和/或(ii)中检测到的改变或评价结果与参考样本比较，其中所述样本中检测到的改变或评价结果相对于所述参考样本的差异的程度指示或预示所述治疗的功效。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中以下一项或多项指示对包括HSP90抑制剂的治疗响应的可能性增加：(i)检测所述组织结构中非小细胞肺癌、鳞状细胞或结直肠癌细胞或组织的存在；(ii)鉴定所述受试者为例如具有至少5、10、15或更长包年吸烟史的吸烟者；或(iii)检测升高的HSP90水平或表达。
5.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中检测到或存在ALK基因或基因产物中的改变表明所述肿瘤、所述癌细胞或所述受试者对包括HSP90抑制剂的治疗响应的可能性增加。
6.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述MAPK途径基因或基因产物选自H-Ras、N-Ras、K-Ras、A-Raf、B-Raf(BRAF)、C-Raf、Mek或Erk中一种或多种。
7.如权利要求1-3中任一项所述的方法，还包括检测选自EGFR、PIK3CA、PTEN、AKT、TP53(p53)、CTNNB1(β-连环蛋白)、APC、KIT、JAK2、NOTCH、FLT3、RSK、ETS、ELK-1或SAP-1的一种或多种基因产物中的改变。
8.如权利要求6所述的方法，其中检测到或存在MAPK途径基因或基因产物中的改变表明所述肿瘤或癌细胞对包括HSP90抑制剂作为单一药剂的治疗响应的可能性增加。
9.如权利要求6所述的方法，其中检测到或存在MAPK途径基因或基因产物中的改变表明所述肿瘤或癌细胞对包括与第二药剂组合的HSP90抑制剂的治疗响应的可能性增加。
10.如权利要求5所述的方法，其中检测到或存在ALK基因或基因产物中的改变表明对包括HSP90抑制剂作为单一药剂或组合以抑制、减少或治疗NSCLC肿瘤或癌细胞的治疗响应的可能性增加。
11.如权利要求6所述的方法，其中检测到或存在K-Ras基因或基因产物中的改变表明对包括HSP90抑制剂作为单一药剂或组合以抑制、减少或治疗结直肠肿瘤或癌细胞的疗法响应的可能性增加。
12.如权利要求6所述的方法，其中检测到或存在B-Raf基因或基因产物中的改变表明对包括HSP90抑制剂作为单一药剂或组合以抑制、减少或治疗结直肠肿瘤或癌细胞的疗法响应的可能性增加。
13.如权利要求6所述的方法，其中检测到或存在K-Ras基因或基因产物中的改变任选地与检测到p53基因或基因产物中的改变组合，表明对包括HSP90抑制剂和mTOR抑制剂以抑制、减少或治疗NSCLC肿瘤或癌细胞的治疗响应的可能性增加。
14.如权利要求1-3中任一项所述的方法，还包括治疗或预防携带ALK和/或MAPK途径基因或基因产物中的改变的癌症或肿瘤，所述治疗包括将HSP90抑制剂作为单一药剂或组合施用至需要HSP90治疗的受试者。
15.一种治疗罹患癌症或肿瘤或处于罹患所述癌症或肿瘤的风险的受试者的方法，所述癌症或肿瘤携带ALK或MAPK途径改变，所述方法包括将HSP90抑制剂作为单一药剂或组合以下述量施用至鉴定为可能从HSP90抑制剂治疗中获益或针对HSP90抑制剂治疗所考查或评价的受试者，所述的量足以在所述受试者中减少或抑制所述肿瘤细胞生长和/或治疗或预防所述癌症。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述受试者被鉴定为具有以下一项或多项：吸烟史；升高的HSP90水平或表达；NSCLC(例如，复发和/或难治性NSCLC)；NSCLC或SCC细胞或肿瘤；或在接受至少一个先前化疗方案期间或之后正在经历病情进展；是在接受至少一个先前含铂化疗方案期间或之后经历病情进展的NSCLC患者。
17.如权利要求15所述的方法，其中通过评价从所述受试者获得的样本以检测ALK、MAPK途径和/或EGFR基因或基因产物的存在，选出所述受试者以用包括HSP90抑制剂的疗法治疗。
18.如权利要求3所述的方法，还包括对应于检测到的差异改变单独或组合的HSP90抑制剂的剂量或剂量方案。
19.如权利要求18所述的方法，其中，在用所述HSP90抑制剂治疗期间或在治疗已经中止后，从所述受试者获得的样本中存在ALK、MAPK途径和/或EGFR基因或基因产物中的改变或存在癌细胞或组织，表明需要增加作为单一药剂或组合的所述HSP90抑制剂的施用剂量或频率。
20.如权利要求2-3所述的方法，其中所述样本从所述受试者收集或获得。
21.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述基因或基因产物的改变包括以下至少一种：细胞遗传异常、非相互易位、重排、染色体内倒位、点突变、缺失、基因拷贝数的变化、基因或基因产物表达的变化。
22.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述基因或基因产物中的改变包括一种或多种致瘤多肽的表达水平或结构或活性变化中的至少一种。
23.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述基因或基因产物的改变包括突变致瘤亚型的表达水平、结构或活性的变化，所述突变致瘤亚型因可变剪接事件、移码事件、翻译事件或翻译后事件中一种或多种产生。
24.如权利要求5所述的方法，其中所述ALK基因或基因产物中的所述改变选自表1中所列的一种或多种突变ALK多核苷酸分子或多肽。
25.如权利要求5所述的方法，其中所述ALK基因或基因产物中的所述改变包括EML4-ALK融合物、KIF5B-ALK融合物、TGF-ALK融合物、NPM-ALK融合物或ALK点突变，所述ALK点突变包括F1245I/L、L1204F、A1200V、L1196M、I1170S、T1151M、R1275Q、F1174V/C/L、T1087I或K1062M中的一种或多种。
26.如权利要求5所述的方法，其中所述一种或多种改变是ALK基因重排。
27.如权利要求6所述的方法，其中所述MAPK途径基因或基因产物中的所述改变选自表5中所列的一种或多种突变K-Ras或B-Raf多核苷酸分子或所述多肽。
28.如权利要求6所述的方法，其中所述MAPK途径基因或基因产物中的所述改变选自在密码子12、13和/或61中的一种或多种K-Ras突变。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述一种或多种K-Ras突变选自G12A、G12N、G12R、G12C、G12S、G12V、G13N或Q61R中的一种或多种。
30.如权利要求28所述的方法，其中所述一种或多种K-Ras突变选自KRAS_G12C、KRAS_G12R、KRAS_G12D、KRAS_G12A、KRAS_G12S、KRAS_G12V、KRAS_G13D、KRAS_G13S、KRAS_G13C、KRAS_G13V、KRAS_Q61H、KRAS_Q61R、KRAS_Q61P、KRAS_Q61L、KRAS_Q61K、KRAS_Q61E、KRAS_A59T或KRAS_G12F中的一种或多种。
31.如权利要求6所述的方法，其中所述MAPK途径基因或基因产物中的所述改变选自在密码子464、466、468、469、594、595、596、597、599、600或601中的B-Raf突变。
32.如权利要求6所述的方法，其中所述MAPK途径基因或基因产物中的所述改变选自BRAF_D594G、BRAF_D594V、BRAF_F468C、BRAF_F595L、BRAF G464E、BRAF_G464R、BRAF_G464V、BRAF_G466A、BRAF_G466E、BRAF_G466R、BRAF_G466V、BRAF_G469A、BRAF_G469E、BRAF_G469R、BRAF_G469R、BRAF_G469S、BRAF_G469V、BRAF_G596R、BRAF_K601E、BRAF_K601N、BRAF_L597Q、BRAF_L597R、BRAF_L597S、BRAF_L597V、BRAF_T599I、BRAF_V600E、BRAF_V600K、BRAF_V600L或BRAF_V600R。
33.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中通过以下一种或多种检测所述改变：核酸杂交测定、基于扩增的测定、测序、筛选分析、借助标准核型方法的分裂中期细胞遗传分析、FISH、光谱核型分析或MFISH和/或对比基因组杂交或原位杂交。
34.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中以预定的间隔评估所述改变，其中所述的预定的间隔包括时程，所述时程相对于HSP90治疗之前、其期间、其停止之后的一种或多种情况或根据总存活率、至进展的时间或使用RECIST进行测量。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述方法还包括以下一项或多项：确定罹患ALK、MAPK途径和/或EGFR突变阳性癌症的所述受试者是否可能对包括HSP90抑制剂的治疗响应；改变所述疗法的过程、给药、治疗计划或时程、联合疗法；确定所述癌症在所述受试者中的时程；或确定所述受试者中显著事件的概率。
36.如权利要求1-3或15中任一项所述的方法，其中所鉴定或治疗的癌细胞或肿瘤选自以下一种或多种：肺癌(例如，小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)或鳞状细胞癌症(SCC))、结直肠癌(CRC)、乳腺癌、髓母细胞瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、胰腺癌、卵巢癌、头与颈鳞状细胞癌(HNSCC)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、多发性骨髓瘤、前列腺癌、间变性大细胞淋巴瘤、成神经细胞瘤、神经内分泌或类癌。
37.如权利要求36所述的方法，其中所鉴定或治疗的癌细胞或肿瘤是复发或难治性NSCLC、鳞状细胞癌或结直肠癌。
38.如权利要求1-3或15中任一项所述的方法，其中所述HSP90抑制剂选自以下一种或多种：IPI-493、IPI-504、17-AAG(也称作坦螺旋霉素或CNF-1010)、BIIB-021(CNF-2024)、BIIB-028、AUY-922(也称作VER-49009)、SNX-5422、STA-9090、AT-13387、XL-888、MPC-3100、CU-0305、17-DMAG、CNF-1010、大贝霉素(例如，大贝霉素I、大贝霉素II)、CCT-018159、CCT-129397、PU-H71或PF-04928473(SNX-2112)。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述HSP90抑制剂是IPI-493或IPI-504。
40.如权利要求15所述的方法，其中所述HSP90抑制剂与mTOR抑制剂组合施用，所述mTOR抑制剂选自以下一种或多种：雷帕霉素、坦罗莫司
Figure FDA00001882655600081
依维莫司(RAD001，
Figure FDA00001882655600082
)、地磷莫司、AP23573、AZD8055、BEZ235、BGT226、XL765、PF-4691502、GDC0980、SF1126或OSI-027。
41.如权利要求15所述的方法，其中所述HSP90抑制剂与ALK激酶抑制剂组合施用。
42.如权利要求15所述的方法，其中所述HSP90抑制剂与酪氨酸激酶抑制剂例如吉非替尼组合施用。
43.如权利要求15所述的方法，其中所述HSP90抑制剂与依立替康组合施用。
44.如权利要求15所述的方法，其中所述HSP90抑制剂与多西他赛组合施用。
45.如权利要求15所述的方法，其中所述HSP90抑制剂与选自抗癌剂、手术或辐射程序的一种或多种其他治疗形式组合施用。
46.如权利要求15所述的方法，其中所述HSP90抑制剂与酪氨酸激酶抑制剂或拓扑异构酶抑制剂组合施用。
47.如权利要求15所述的方法，其中所述HSP90抑制剂在活动性病症的期间、在缓解或疾病活动性较小的期间、在用另一种治疗形式治疗之前、与另一种治疗形式的治疗同时、用另一种治疗形式治疗之后或在病症缓解期间施用。
48.如权利要求15任一项所述的方法，其中将所述HSP90抑制剂施用至正在经历或已经历过用化疗剂、放射疗法和/或手术治疗的癌症患者。
49.一种治疗携带ALK、MAPK途径和/或EGFR基因或基因产物中的一种或多种改变的癌症或肿瘤的方法，包括将单独或与选自ALK抑制剂、mTOR抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、紫杉烷类或拓扑异构酶抑制剂的第二抑制剂组合的HSP90抑制剂以下述量施用至具有一种或多种所述改变或处于具有一种或多种所述改变的风险的受试者，所述的量足以在所述受试者中减少或抑制肿瘤细胞生长和/或治疗或预防所述癌症，其中通过检测ALK、MAPK途径和/或EGFR基因或基因产物中的所述一种或多种改变，已经评价或将要评价所述受试者。
50.一种治疗罹患功能性或非功能性神经内分泌肿瘤的受试者的方法，包括将Hsp90抑制剂以足以减少或抑制所述肿瘤生长的量施用至所述受试者，从而治疗所述神经内分泌肿瘤，其中所述神经内分泌肿瘤选自以下一种或多种：胰腺内分泌肿瘤；神经内分泌肺肿瘤；或来自肾上腺髓质、垂体、副甲状腺、甲状腺内分泌小岛、胰腺内分泌小岛或呼吸道的或胃肠道中分散的内分泌细胞的神经内分泌癌症。
51.一种用于确定癌症患者对用HSP90抑制剂的治疗的化学敏感性的试剂盒或测定，包含与任选地和PIK3CA、PTEN、AKT、TP53、CTNNB1(β-连环蛋白)、APC、KIT、JAK2、NOTCH或FLT3中一种或多种组合的ALK、MAPK途径和/或EGFR基因或基因产物的一种或多种改变特异性结合的试剂。
52.如权利要求51所述的试剂盒，还包含HSP90抑制剂。
53.如权利要求51所述的试剂盒，其中所述试剂包含一个或多个多核苷酸探针，所述多核苷酸探针包含长度从约50至107个核苷酸的多核苷酸。
54.如权利要求51所述的试剂盒，其中每个所述探针包含与表1或表5中所列核苷酸序列互补或与编码表1或表5中所列多肽的核苷酸序列互补的多核苷酸序列。
55.如权利要求51所述的试剂盒，其中所述探针选自包含核碱基的寡核苷酸、cDNA分子、RNA分子和合成基因探针。
56.如权利要求51所述的试剂盒，其中所述试剂包含针对由表1或表5中所列的一个或多个多核苷酸序列编码的多肽的抗体和抗体衍生物以及抗体片段。
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