CN108135941A - 用于治疗移植物抗宿主病的组合物和方法 - Google Patents
用于治疗移植物抗宿主病的组合物和方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108135941A CN108135941A CN201680061243.3A CN201680061243A CN108135941A CN 108135941 A CN108135941 A CN 108135941A CN 201680061243 A CN201680061243 A CN 201680061243A CN 108135941 A CN108135941 A CN 108135941A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- hif
- gvhd
- mouse
- subject
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/164—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Marine Sciences & Fisheries (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
一种在接受同种异体造血干细胞(HSC)移植物的哺乳动物受试者中预防GvHD发展或降低GvHD严重性的方法,所述方法包括向受所述试者施用包含活性剂的药物组合物,所述活性剂抑制缺氧诱导因子‑1α(HIF‑1α)或缺氧诱导因子‑2α(HIF‑2α)的生物活性或表达,其中所述活性剂以有效预防或降低所述受试者的严重GvHD的量施用。
Description
本申请要求于2015年8月19日提交的序列号为No.62/207,000的美国专利申请的优先权。前述申请的全部内容在此通过参引方式引入本文。
技术领域
本申请主要涉及移植物抗宿主病(“GvHD”)的医学治疗。更具体地说,本申请涉及HIF-α-抑制性组合物用于在接受同种异体造血干细胞(HSC)移植物的哺乳动物受试者中预防GvHD发展或减轻GvHD严重性的应用。
背景技术
同种异体造血干细胞移植(HSCT)是血液恶性肿瘤的潜在治疗疗法。尽管供体骨髓(BM)中的淋巴细胞在预防肿瘤复发中起关键作用,但它们也造成了移植物抗宿主病(GvHD)的发展(Ferrara,JL等,Lancet,373(9674):1550-1561(2009)。GvHD引起多器官损伤,是造成患者HSCT有关的发病率和死亡率的主要原因之一。尽管有采用非特异性免疫抑制药物预防人类GvHD方面的进展,但是GVHD仍是HSCT后发病率和死亡率的重要原因,目前对已确定的GVHD尚无有效治疗的方法。
临床上,移植物抗宿主病分为急性形式和慢性形式。急性或暴发形式的疾病(aGvHD)通常在移植后的第一个100天内观察到,并且由于相关的发病率和死亡率的缘故,是对移植物的有效性的重大挑战。慢性形式的移植物抗宿主病(cGvHD)通常在100天后发生。中度至重度cGvHD病例的出现对长期存活产生不利影响。骨髓移植后,存在于移植物中的T细胞(作为污染物或被有意引入宿主)在感知宿主组织为抗原性外来物后攻击移植物受体的组织。T细胞产生过量的细胞因子,包括TNFα和干扰素-γ(IFNγ)。广泛的宿主抗原可引发移植物抗宿主病,其中包括人类白细胞抗原(HLA)。然而,即使HLA相同的兄弟姐妹是供体,也会发生移植物抗宿主病。传统上,急性移植物抗宿主病的特征在于对肝脏、皮肤和粘膜以及胃肠道的选择性损伤。另有研究表明,其他移植物抗宿主病靶器官包括免疫系统(如骨髓和胸腺)本身,以及肺部(以特发性肺炎的形式)。慢性移植物抗宿主病也会攻击上述器官,但是在其长期病程中也会对结缔组织和外分泌腺造成损伤。
临床上相关的人源化动物模型对于开发用于治疗GvHD的新策略而言是至关重要的。在为人源化小鼠的GvHD产生的稳健模型方面取得了重大进展,尽管这些模型并非没有缺点。迄今为止,最佳模型利用了免疫缺陷小鼠,特别是非肥胖糖尿病(NOD)鼠伤寒沙门氏菌IL2rγ0(NSG)株(non-obese diabetic(NOD).scid IL2rγ0),其中至少5×106人PBMC被静脉内移植到成年小鼠中(Ito,R.等,Transplantation,87(11):1654-1658(2009);King,MA等,Clin.Exp.Immunol.,157(1):104-118(2009))。虽然这些模型表现出致命的GvHD,但它们并不完全再现人类疾病的发病机制。例如,免疫损伤显然在肺部中最为严重,但是皮肤和肝脏仅出现轻微浸润(Id.),后者是人类GvHD中最常见的靶器官(Jacobsohn DA等,Orphanet J Rare Dis.,2:35(2007)。此外,目前所有依赖人类PBMC或T细胞纯化脐带血来诱导异种GvHD的模型事实上均未解决人类GvHD在HSCT后发生的问题,其中BM(而不是外周血)是HSC的主要来源。目前尚不清楚BM和外周血中的T细胞是否对治疗产生类似的反应。
鉴于上述情况,需要用于解决GvHD的改进治疗,包括鉴定更好的可药用分子靶标,以及开发更好地反映人GvHD病理特征的动物模型以促进对GvHD药物的发现。
发明内容
本申请的一个方面涉及在接受同种异体造血干细胞(HSC)移植物的哺乳动物受试者中预防GvHD发展或降低GvHD严重性的方法。所述方法包括向所述受试者施用药物组合物的步骤,所述药物组合物包含抑制缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和/或缺氧诱导因子-2α(HIF-2α)的生物学活性或表达的活性剂,其中所述药物组合物以有效预防或降低所述受试者的严重GvHD(severity GvHD)的量施用。
本申请的另一个方面涉及一种治疗接受同种异体造血干细胞(HSC)移植物的哺乳动物受试者中的GvHD的方法。所述方法包括向受试者施用有效量的包含抑制HIF-1α和/或HIF-2α的生物学活性或表达的活性剂的药物组合物的步骤。
本申请的另一个方面涉及一种用于在接受同种异体造血干细胞(HSC)移植物的哺乳动物受试者中预防GvHD发展或降低GvHD严重性的药物组合物。所述药物组合物包含抑制HIF-1α和/或HIF-2α的生物活性或表达的第一试剂、增强Treg活性的第二试剂和药学上可接受的载体。
本申请的另一方面涉及一种鉴定用于治疗GvHD的候选药物的方法。所述方法包括以下步骤:将测试试剂施用到具有人源化系统性GvHD的小鼠中;监测小鼠的存活和GvHD临床表现;以及如果与接受对照试剂的具有人源化系统性GvHD的小鼠相比所述测试试剂预防或降低了所述小鼠的严重GvHD,则将所述测试试剂鉴定为GvHD的候选药物;其中具有人源化系统性GvHD的所述小鼠是通过将人骨髓细胞移植到新生NSG小鼠中来产生的。
附图说明
结合以下附图和段落的详细描述一起考虑,本申请的上述和其他目的和优点将变得显而易见。
图1:将人BM细胞移植到新生NSG小鼠中导致急性GvHD。向经用1.3Gy照射的新生NSG幼崽肝内注射0.5×106人BM细胞。图A是展示移植后第17天受体PBMC中的人CD45+、CD4+、CD8+和CD4+CD8+分布的代表性FACS图谱。图B总结了移植后第17天受体PBMC中人CD45+、CD45+CD4+、CD45+CD8+和CD45+CD4+CD8+的百分比。图C是NSG小鼠中人细胞扩增的纵向分析。所示数据是在第21、31和41天通过FACS分析测量的每个受体的PBL中人CD45+细胞的百分比。图D显示了被照射(1.3Gy)的正常NSG小鼠(n=25)和接受照射并在出生时肝内注射0.5×106人BM细胞(GvHD,n=30)的小鼠的体重。显示的数据是平均值和SEM。图E为移植有BM细胞的人类BM NSG受体(n=24)和正常NSG小鼠(n=10)的Kaplan-Meier存活曲线。每天观察小鼠的存活情况。对照小鼠(绿色曲线)仅接受照射。图F为移植有人BM细胞或来自人BM细胞的分选CD3+和CD3-细胞的人BM NSG受体的Kaplan-Meier存活曲线。每天观察小鼠的存活情况。
图2.对异种NSG受体器官中人CD3+细胞浸润进行的组织病理学和免疫组织化学分析。图A为从GvHD小鼠的皮肤、肝、肾、舌、肺、胰腺、胃和肠获得的组织切片的苏木精和伊红(H&E)染色图示。图B为用抗人CD3染色的免疫组织化学图示,该图示显示了高比例的CD3+细胞已经侵入了人BM NSG受体的各种器官。所述免疫组织化学评估在20只小鼠中进行。组织使用福尔马林固定并用石蜡包埋。
图3.通过免疫荧光显示人类细胞在异种NSG受体的器官中的分布。图A为人类CD4+和CD8+细胞在异种NSG受体器官中的分布。用抗人CD4和CD8染色的免疫荧光图示显示CD4+和CD8+T细胞在人类BM NSG受体的各种器官中的分布。该免疫荧光评估在15只小鼠中进行。图B为人类CD3+和CD45+细胞在异种NSG受体器官中的分布。用抗人CD3和CD45染色的免疫荧光图示显示CD3+和人CD45+细胞在异种NSG受体的各种器官中的分布。该免疫荧光评估在15只小鼠中进行。组织使用福尔马林固定并用石蜡包埋。数据来自三次代表性独立实验。
图4.HIF-1α在大部分来源于人BMC受体的脾和BM的人类T细胞中累积:棘霉素的影响。图A为FACS图示,该图示显示HIF-1α在来自GvHD小鼠的脾和BM的T细胞中的累积。从GvHD小鼠的脾和BM中分离出脾和BM细胞,用抗人CD45、CD4、CD8染色,然后用抗人HIF-1α进行细胞内染色。图B为FACS图示,该图示显示HIF-1α在来自GvHD小鼠的脾脏的所有人类细胞中的累积。从GvHD小鼠的脾中分离出脾细胞,用抗人CD45、CD4、CD8染色,然后用抗人HIF-1α进行细胞内染色。进行FACS分析以确定CD45+CD4+CD8-、CD45+CD4-D8+和CD45+CD4-D8-亚群中HIF-1α阳性细胞的百分比。图C为FACS图示,该图示显示棘霉素处理后在GvHD小鼠的脾脏中HIF-1α阳性T细胞的百分比。脾细胞从用一个剂量(100μg/kg)的棘霉素或媒剂(vehicle)处理的GvHD小鼠的脾中分离,用抗人CD45、CD4、CD8染色,然后用抗人HIF-1α进行细胞内染色。数据来自于三次代表性的独立实验。图D为棘霉素处理后来自GvHD受体的脾细胞中HIF-1α的蛋白质印迹(Western blot)分析。分离来自GvHD小鼠的脾细胞,并用抗人HIF-1a将蛋白裂解物进行免疫印迹。通过蛋白质印迹检测来自两种媒剂和棘霉素处理的GvHD小鼠的脾细胞和人BM(hBM)中HIF-1α的蛋白质水平。GAPDH用作加载对照。数据显示为3只小鼠的代表性图像并且来自于三次代表性的独立实验。图E和图F显示棘霉素处理没有扩增hBM的NSG受体中的人Treg。脾细胞和BM细胞分离自用一个剂量(100μg/kg)的棘霉素或媒剂处理的GvHD小鼠的脾和后股骨,用抗人CD45、CD4、CD8染色,然后用抗人FoxP3进行细胞内染色。数据来自于三次代表性的独立实验。FACS曲线的图示显示在图E中,而总结的数据(平均值和SEM)显示在图F中。
图5.棘霉素的持续治疗使小鼠受到抗GvHD保护并消除扩增的人类白细胞和炎症。图A为用于人源化GvHD小鼠的棘霉素治疗的施用方案。将以人BM细胞对小鼠进行移植的那天定义为第0天。每个箭头表示一次棘霉素处理。通过腹膜内注射进行的每次治疗的剂量为10μg/kg。图B为棘霉素处理的小鼠的临床表现的纵向分析。图C为FACS图示,该图示显示棘霉素治疗前后GvHD小鼠的PBL中人CD45+细胞的百分比。数据显示为3只小鼠的图示并且来自于三次代表性的独立实验。图D为用抗人CD3染色的免疫组织化学图示,该图示显示在棘霉素治疗后第75天(下图)与图5的图B相同的小鼠和在用人BM的移植后第55天死亡的未处理的同窝仔(littermate)(上图)中CD3+细胞的显著减少。数据来自三次代表性的独立实验。
图6.棘霉素使小鼠受到抗致命性GvHD保护。图A为以人类5×105BM细胞对新生NSG幼崽进行移植。用图5的图A列出的棘霉素施用方案治疗小鼠。图B为向新生NSG幼崽移植人类3×105BM细胞。用图5的图A列出的棘霉素施用方案治疗小鼠,不同的是,在第17天而非第27天开始治疗。Kaplan-Meier存活曲线显示,与用媒剂处理的受体相比,用棘霉素治疗的受体显示显著延长的寿命。数据来自于三次代表性的独立实验。
纵观所述附图,除非另有说明,否则相同的附图标记和字符用于表示所示实施方式的相似特征、元素、部件或部分。此外,尽管本公开内容现在将参照附图进行详细描述,但这是结合说明性实施方式这样做的,并且本公开内容不受到图中所示的特定实施方式所限制。
具体实施方式
用于实施本发明的一些模式以其示例性实施方式的方式呈现,这将在下文中进行讨论。然而,本发明不限于所描述的实施方式,并且本领域技术人员应认识到的是,在不偏离本发明的基本概念的情况下,本发明的许多其他实施例是可能的,并且任何这类可行的解决方法也将处于本申请的范围内。可以想象的是,本发明的其他类型和形式可以容易地结合到本发明的教导中,但是为了清楚和公开的目的而不是为了限制范围目的,仅示出和描述一个特定的形式。
这里使用的标题仅用于组织目的,并不是要用于限制说明书或所附段落的范围。如在整个申请中所使用的那样,词语“可以”用于可以意思(即,意味着有可能),而不是强制性意义(即,意思是必须)。这里的术语“一种”和“一个”不表示数量的限制,而是表示存在至少一个所提及的项目。
除非另外定义,否则本文使用的所有技术和科学术语具有与所公开的方法和组合物所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。必须注意的是,除非上下文另有明确规定,否则如本文和所附权利要求书中所使用的,单数形式“一种”,“一个”和“所述”包括复数形式。因此,例如,提及“一种肽”包括“一种或多种”肽或“多种”这样的肽。关于本申请的教导,本申请中描述的任何已授权专利或专利申请明确地通过参引并入本文。
如本文所用,术语“治疗”是指缓解、改善或医治疾病、病症、或者疾病或病症的症状。如本文所用,短语“预防或降低GvHD的严重性”是指反映GvHD严重性的减轻、GvHD发作的延迟、GvHD发展的减缓或同种异体抗体驱动的GvHD持续时间缩短的任何症状,无论这是永久的或暂时的,持续的或瞬时的,只要这样的症状可归因于施用缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)或缺氧诱导因子-2α(HIF-2α)抑制组合物。用于评估抗GvHD活性的其他参数可包括嗜中性粒细胞和血小板达到恢复的时间,嗜中性粒细胞达到完全供体嵌合体的时间,具有移植物衰竭、复发或恶性肿瘤的受试者的比例,感染(细菌、病毒和真菌)的发生率,在第45天,第100天和/或第180天具有总体存活的受试者的比例,在第180天具有无急性GvHD存活的受试者的比例,施用HIF-α抑制剂后的急性GvHD的比率和等级,发展急性GvHD的受试者的比例,以及达到急性GvHD发病的时间。额外的次要终点包括植入时间和从医院出院的时间。
短语“小分子抑制剂”是指这样的分子实体(通常为有机或有机金属的),其不是聚合物,具有医药活性,并且具有小于约2kDa、小于约1kDa、小于约900Da、小于约800Da或小于约700Da的分子量。除了蛋白质或核酸之外,该术语还包括大多数被称为“药物”的医药化合物,不过小肽或核酸类似物可以被认为是小分子药物。小分子抑制剂可以合成的,半合成的(即从天然存在的前体合成)或通过生物学方式获得的。
术语“干细胞”是指这样的细胞,该细胞为能够(1)长期自我再生或具有产生原始细胞的至少一个相同拷贝的能力,(2)在单细胞水平分化为多个(并且在一些情况下仅有一个)特化的细胞类型,和(3)组织的体内功能性再生的未分化细胞。根据它们的发育潜力,干细胞被分为全能的、多能的、专能的和寡能的/单能的干细胞。“祖细胞”也具有自我再生和分化成更成熟细胞的能力,但定向为一个谱系(例如,造血祖细胞定向为血液谱系;髓样祖细胞定向为髓系;淋巴祖细胞定向为淋巴系),而干细胞不一定如此限定。“自我再生”是指具有独特能力的细胞产生未改变的子细胞,因此补充并维持其群体数量,并产生特化细胞类型(效力)。自我再生可以通过两种方式实现。不对称的细胞分裂产生与亲本细胞相同的一个子代细胞和一个与亲本细胞不同的子代细胞,并且是更具有定向性的祖细胞或分化细胞。对称细胞分裂产生两个相同的子细胞。细胞的“增殖”或“扩增”是指对称分裂的细胞。
预防或降低GvHD的方法
本申请的一个方面涉及在接受同种异体造血干细胞(HSC)移植物的哺乳动物受试者中预防GvHD发展或降低GvHD严重性的方法,所述方法包括:向所述受试者、移植的HSC或两者施用包含抑制缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)或缺氧诱导因子-2α(HIF-2α)的生物活性或表达的活性剂的药物组合物,其中所述活性剂以可有效预防或降低受试者的GvHD严重性的量施用。
HIF-α抑制剂组合物
药物组合物包含抑制缺氧诱导因子-1α(HIF-1α),缺氧诱导因子-2α(HIF-2α)或两者的生物学活性或表达的活性剂。如本文所用,术语“HIF-α”参照HIF-1α、HIF-2α或两者使用。HIF-1和HIF-2是在低氧压力下培养的哺乳动物细胞中发现的转录因子,其在细胞和系统内稳态响应缺氧中发挥重要作用。HIF-1和HIF-2各自由120-kD HIF-1α或HIF-2α亚基与共同的91-至94-kD HIF-1β亚基复合而成的异二聚体组成。
1.小分子HIF-α抑制剂。在一个实施方式中,活性剂是HIF-1α或HIF-2α的小分子抑制剂。HIF-1α或HIF-2α的示例性小分子抑制剂包括但不限于:抑制HIF和DNA之间相互作用的聚酰亚胺,如棘霉素;如Wilkins等人(ChemMedChem,11:773-786(2016))所述的HIF-α和p300之间相互作用的抑制剂,如黑毛霉素(chetomin)、优地司叮A(eudistidine A)、KCN1、HBS1、醌1(Quinone 1)、化合物3(Compound 3)和OHM1。HIF二聚化的抑制剂和调节剂,如吖啶黄、盐酸吖啶黄(trypaflavine)和原黄素的组合,环-CLLFVY和0X3(也在Wilkins中描述);YC-1(3-(5'-羟甲基-2'-呋喃基)-1-苄基吲唑);醌霉素(Quinocarmycin)单硝酸盐(KW2152)及其氢氰化产物DX-52-1(NSC-607097)、NSC-259968、NSC-259969、NCGC00043898、NCGC00044926、NCGC00049606和NCGC00056044,如Xia等人在Mol.Cancer,8:117(2009)所述;拓扑异构酶I抑制剂如喜树碱(NSC-606985)和喜树碱类似物如托泊替康(NSC-609699)、NSC-639174、喜树碱-11(CPT-11;依利替康(Camptosar)、伊立替康),其产生活性部分,通过羧酸酯酶2水解的SN38(10-羟基-7-乙基-喜树碱)和聚乙二醇化SN38药物偶联物EZN-2208;拓扑异构酶II抑制剂,如柔红霉素和米托蒽醌;热休克蛋白90抑制剂,例如格尔德霉素,17-烯丙基氨基-17-去甲氧基格尔德霉素(17-AAG)和17-二甲基氨基乙基氨基-17-去甲氧基-格尔德霉素(17-DMAG),以及根赤壳菌素的肟衍生物如KF58333;微管破坏剂如泰索帝、2-甲氧基雌二醇(2-MeOE2)、长春新碱、圆皮海绵内酯(discodermolide)和埃坡霉素B;硫氧还蛋白抑制剂,例如PX-12(1-甲基丙基2-咪唑基二硫化物)和灰侧耳菌素(Pleurotin);mTOR抑制剂,如雷帕霉素、CCI-779和Rad001;组蛋白去乙酰化酶抑制剂,如罗米地辛(FK228、FR901228、NSC 630176);和PI3-激酶抑制剂,如渥曼青霉素和LY294002;地高辛及其类似物PX-478(S-2-氨基-3-[4V-N,N-双(2-氯乙基)氨基]苯基丙酸N-氧化物二盐酸盐)、PX-4782HCl;Manonantin A及其类似物MA04、MA07和MA11,如Kwon等人在J.Med.Chem。,58(19):7659-7671(2015);和BAY87-2243。
2.HIF-α的RNA抑制剂。在一些实施方式中,活性剂是旨在抗HIF-1α或HIF-2α的反义RNA或siRNA。EZN-2968是HIF-1α的示例性反义寡核苷酸抑制剂。
在一个实施方式中,反义寡核苷酸或多核苷酸包含靶向降解的单链反义寡核苷酸或多核苷酸。在某些实施方式中,HIF-1α抑制剂是与HIF-1α或HIF-2αmRNA序列互补的单链反义寡核苷酸。单链反义寡核苷酸或多核苷酸可以合成产生,或者其可以从合适的表达载体表达。反义核酸被设计为通过与mRNA正义链的互补结合进行结合以促进RNA酶H活性,这导致mRNA的降解。优选地,反义寡核苷酸进行化学修饰或结构修饰以促进核酸酶稳定性和/或增加结合。
在某些实施方式中,可以修饰反义寡核苷酸以产生具有非常规化学或主链添加或取代的寡核苷酸,包括但不限于肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、吗啉代主链核酸、甲基膦酸酯、双链稳定芪或芘基帽、硫代磷酸酯、磷酰胺酯、磷酸三酯等。举例来说,修饰的寡核苷酸可以引入或以类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸;例如,引入非带电连接(例如,膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酸酰胺、氨基甲酸酯等)或带电连接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的核苷酸间修饰;引入嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)、螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化金属等)或烷化剂和/或修饰的连接(例如α异头核酸等)的修饰。
siRNA是双链RNA,其可以被改造以诱导mRNA的序列特异性转录后基因沉默。合成产生的siRNA在结构上模拟通过Dicer酶在细胞中正常加工的siRNA类型。当从表达载体表达时,表达载体被改造以转录在细胞内被加工成靶向siRNA的短双链发夹样RNA(shRNA)。可以使用众所周知的算法设计合成的siRNA和shRNA,并使用常规的DNA/RNA合成仪合成。用于生产包含shRNA的载体的试剂盒是可以得到的,例如Imgenex的GENESUPPRESSORTM构建试剂盒和Invitrogen的BLOCK-ITTM诱导型RNAi质粒和慢病毒载体。
在一些情况下,siRNA可以被合成为锁核酸(LNA)修饰的siRNA。LNA是核苷酸类似物,其含有连接核糖的2'-氧与4'碳的亚甲基桥。双环结构将LNA分子的呋喃糖环锁定在3'-内构象中,从而在结构上模拟标准RNA单体。
3.基因编辑组合物。在其他实施方式中,活性剂包括编码基因编辑系统的一种或多种载体,所述基因编辑系统经改造以减少、预防或以其他方式破坏HIF-1α或HIF-2α的内源性表达。在一个实施方式中,基因编辑系统包括用于促进受体宿主中稳定的位点特异性重组的核酸酶。根据这些实施方式的示例性核酸酶包括成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)相关(Cas)蛋白、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)或兆级核酸酶。
在一些实施方式中,利用CRISPR/Cas系统诱导靶细胞基因组中的单链或双链断裂。CRISPR(成簇规则间隔短回文重复序列)是DNA基因座的首字母缩写,其含有多个短的、定向重复的碱基序列。原核生物CRISPR/Cas系统已经改成作为基因编辑而用于真核生物中(沉默、增强或改变特定基因)(参见例如Cong,Science,15:339(6121):819-823(2013)和Jinek等,Science,337(6096):816-821(2012))。通过转染具有所需组件(包括Cas基因)和特别设计的CRISPR的细胞,可以在任何希望的位置切割和修饰生物体的基因组。在US 8,697,359和US 2014-0068797中描述了使用CRISPR/Cas系统制备用于基因组编辑的组合物的方法。
通常,“CRISPR系统”总体上指涉及CRISPR相关(“Cas”)基因的表达或指导其活性的转录物和其他组件,包括编码Cas基因的序列、tracr(反式-激活CRISPR)序列(例如tracrRNA或活性部分tracrRNA)、tracr-匹配序列(包括“定向重复”和在内源性CRISPR系统的上下文中tracrRNA加工的部分定向重复)、引导序列(在内源性CRISPR系统的上下文中也被称为“间隔子”)、或来自CRISPR基因座的其他序列和转录物。与引导序列(例如,定向重复-间隔子-定向重复)可操作地连接的一个或多个tracr匹配序列在通过核酸酶剪切前也可称为pre-crRNA(pre-CRISPR RNA)或在通过核酸酶剪切后也称为crRNA。
在一些实施方式中,tracrRNA和crRNA连接并形成嵌合crRNA-tracrRNA杂合体,其中成熟crRNA通过合成茎环与部分tracrRNA融合以模拟天然crRNA:tracrRNA双链体,如上文Cong等人和Jinek等人所述。单个融合的crRNA-tracrRNA构建体也可以被称为引导RNA或gRNA(或单引导RNA(sgRNA))。在sgRNA中,crRNA部分可以被鉴定为“靶序列”并且tracrRNA通常被称为“支架”。
一旦鉴定出期望的DNA靶序列,就有许多资源可用于帮助从业人员确定合适的靶位点。例如,许多公共资源(包括生物信息学生成的约190,000个潜在sgRNA列表,靶向超过40%的人类外显子)可用于帮助从业人员选择靶位并设计相关sgRNA以在该位点实现切口或双链断裂。另外请参阅crispr.u-psud.fr/,一个旨在帮助科学家在广泛的物种中找到CRISPR靶向位点并生成适当的crRNA序列的工具。
在一些实施方式中,驱动CRISPR系统的一种或多种组件的表达的一种或多种载体被导入靶细胞中,使得CRISPR系统的所述组件的表达指导在一个或多个靶位点处形成CRISPR复合物。虽然具体细节可能在不同的改造CRISPR系统中有所不同,但整体方法是类似的。在某些优选实施方式中,CRISPR系统用于通过将含有靶序列的短DNA片段插入到引导RNA表达质粒中来靶向DNA序列。合适的sgRNA表达质粒可含有靶序列(约20个核苷酸),一种tracrRNA序列形式(支架)以及合适的启动子和用于在真核细胞中正确加工的必需组件。这样的载体是可商购获得(参见例如Addgene,在马萨诸塞州剑桥(Cambridge,MA)的质粒库)。许多系统依靠定制的互补寡核苷酸,该互补寡核苷酸退火形成双链DNA,然后克隆到sgRNA表达质粒中。在转染的细胞中来自相同或不同质粒的适当的Cas酶和sgRNA的共表达在期望的靶位点导致单链或双链断裂(取决于Cas酶的活性)。
在一些实施方式中,锌指核酸酶(ZFN)可用于诱导靶细胞基因组中的单链或双链断裂,是编码锌指核酸酶(ZFN)的一个或多个核酸构建体。ZFN通常是融合蛋白,其包含衍生自连接于切割结构域的锌指蛋白的DNA结合结构域。
原则上可以设计成靶向任何感兴趣的基因组位置的DNA结合结构域可以是Cys2His2锌指的串联阵列,其中的每一个通常识别靶DNA序列中的3至4个核苷酸。Cys2His2结构域具有如下通式结构:Phe(有时为Tyr)-Cys-(2至4个氨基酸)-Cys-(3个氨基酸)-Phe(有时为Tyr)-(5个氨基酸)-Leu-(2个氨基酸)-His-(3个氨基酸)-His。通过将多指连接在一起(数量各不相同:在已发表的研究中每个单体使用了3至6个指),ZFN对可以设计成与18至36个核苷酸长的基因组序列结合。
最常见的切割结构域是IIS型酶Fok1。Fok1在一条链上距离其识别位点9个核苷酸且在另一条链上距离识别位点13个核苷酸处催化DNA的双链切割。这些酶中的一种或多种(或其酶促功能片段)可以用作切割结构域的来源。
在其他实施方式中,将转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)用于诱导靶细胞基因组中单链或双链断裂的组件。TALEN具有与ZFN相似的总体结构,主要区别在于DNA结合结构域来自TAL效应因子蛋白,该TAL效应因子蛋白为来自植物致病细菌的转录因子。TALEN的DNA结合结构域是氨基酸重复的串联阵列,每个长约34个残基。这些重复序列彼此是非常相似的;通常它们主要在两个位置(氨基酸12和13,称为重复可变双残基或RVD)存在差异。每个RVD指定优先结合四种可能的核苷酸中的一种,这意味着每个TALEN重复序列结合单个碱基对,不过已知NN RVD除鸟嘌呤之外还结合腺嘌呤。TAL效应因子DNA结合在机理上不如锌指蛋白那样了解得那么多,但它们似乎更简单的代码可证明对于改造核酸酶设计是非常有利的。TALENs也作为二聚体切割,具有相对较长的靶序列(至今报道的最短的是每个单体结合13个核苷酸),并且对于结合位点之间的间隔子长度,似乎要求不如ZFN严格。单体和二聚体TALEN可以包括超过10个、超过14个、超过20个或超过24个重复序列。将TAL改造以结合特异性核酸的方法描述于US 8,586,363中。
本文描述的基因组编辑系统的核酸酶活性切割靶DNA以在靶DNA中产生单链或双链断裂。双链断裂可以由细胞通过两种方式之一修复:非同源末端连接和同源性定向修复。在非同源末端连接(NHEJ)中,通过将断裂端彼此直接连接来修复双链断裂。如此,没有新的核酸材料被插入到该位点中,尽管一些核酸材料可能会丢失而导致缺失。在同源性定向修复中,将与切割的靶DNA序列具有同源性的供体多核苷酸用作修复切割的靶DNA序列的模板,导致将来自供体多核苷酸的遗传信息转移至靶DNA。如此,可以将新的核酸材料插入/复制到该位点中。
通常,基因组编辑组合物包含供体多核苷酸。由于NHEJ和/或同源性定向修复引起的靶DNA的修饰可用于诱导基因修正、基因置换、基因标记、转基因插入、核苷酸缺失、基因破坏、基因突变等。因此,通过基因组编辑组合物进行的DNA切割可用于通过切割靶DNA序列而从靶DNA序列中删除核酸材料,并在不存在外源提供的供体多核苷酸的情况下允许细胞修复该序列。或者,如果基因组编辑组合物包含供体多核苷酸序列(该供体多核苷酸序列至少包含与靶DNA序列具有同源性的区段),则所述方法可用于将核酸材料添加(即插入或取代)至靶DNA序列(例如,以“敲入”编码蛋白质、siRNA、miRNA等的核酸)、添加标签(例如,6xHis、荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白;黄色荧光蛋白等)、血凝素(HA)、FLAG等)、向基因添加常规序列(例如,启动子、聚腺苷酸化信号、内部核糖体进入序列(IRES)、2A肽、起始密码子、终止密码子、剪接信号、定位信号等)、修饰核酸序列(例如,引入突变)等。如此,所述组合物可用于以位点特异性,即“靶向”方式,修饰DNA,例如基因敲除、基因敲入、基因编辑、基因标记等。
用于位点特异性重组的多核苷酸包括合适的供体序列。“供体序列”或“供体多核苷酸”或“供体寡核苷酸”是指待插入切割位点的核酸序列。供体多核苷酸通常与切割位点处的基因组序列具有足够的同源性,例如与切割位点侧翼(例如在切割位点的约50个碱基内或更少,例如在切割位点的约30个碱基内、在约15个碱基内、在约10个碱基内、在约5个碱基内或直接在切割位点侧翼处)的核苷酸序列具有90%、95%或100%的同源性,以支持其与其具有同源性的基因组序列之间的同源性定向修复。供体序列通常与其取代的基因组序列不相同。相反,只要存在足够的同源性来支持同源性定向修复,供体序列可以包含至少一个或多个相对于基因组序列而言的单碱基改变、插入、缺失、倒位或重排。在一些实施方式中,供体序列包括侧翼为两个同源区域的非同源序列,使得靶DNA区域和两个侧翼序列之间的同源性定向修复导致非同源序列在目标区域处插入。
用于表达siRNA、CRISPR-cas或其他基因编辑组分的表达载体可以是病毒载体或非病毒载体。病毒载体可以来源于逆转录病毒(包括慢病毒,如HIV-1和HIV-2)、腺病毒相关病毒(AAV)、腺病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、脊髓灰质炎病毒、痘病毒、辛德毕斯病毒、其他RNA病毒(包括甲病毒、星状病毒、冠状病毒、副粘病毒、正粘病毒、小核糖核酸病毒和披散病毒);其他DNA病毒,包括乳多空病毒和细小病毒等。非病毒载体仅仅是未与病毒衍生组分(例如衣壳和/或包膜)一起包装的“裸”表达载体。
在某些情况下,可以通过利用病毒载体固有的靶向特征或通过将靶向特征设计到病毒载体中来将这些载体改造以靶向特异性细胞群,诸如CD34+细胞。特异性细胞可以“被靶向”用于多核苷酸的递送以及表达。因此,在这种情况下,术语“靶向”可以基于衣壳、包膜蛋白、递送至特异性细胞的抗体的形式的内源或异源结合剂的使用;用于将表达限制于细胞的特异性亚群的组织特异性调节组件的使用;或两者。
非病毒表达载体可以通过直接注射裸DNA或通过将多核苷酸或表达载体包封在脂质体、微粒、微胶囊、病毒样颗粒或红细胞血影中而用于非病毒基因转移。这种组合物可以通过化学偶联与靶向结构域进一步连接,以促进将核酸靶向递送和/或使核酸进入期望的目的细胞。另外,可以将质粒载体与合成的基因转移分子如聚合DNA结合阳离子如多聚赖氨酸、鱼精蛋白和白蛋白一起温育,并与细胞靶向配体如脱唾液酸血清类粘蛋白(asialoorosomucoid)、胰岛素、半乳糖、乳糖或转铁蛋白连接。
或者,可以使用裸DNA。裸DNA的摄取效率可以通过压实或通过使用可生物降解的乳胶珠来改善。这种递送可以通过处理小珠以增加疏水性并由此促进内涵体的破坏和DNA向细胞质中的释放而进一步改善。
同种异体干细胞的来源
在一个实施方式中,同种异体造血干细胞(HSC)的来源选自由骨髓、外周血和脐带血组成的组。在另一个实施方式中,HSCs来源包含胚胎干细胞(ESC)或诱导性多能干细胞(iPSC)。在一些实施方式中,将间充质基质细胞与HSC共移植到受体中。
用于本发明方法的干细胞或干细胞来源包括骨髓、外周血、脐带血、造血干细胞(HSC)、间充质干细胞(MSC)、胚胎干细胞(ESC)和诱导性多能干细胞(iPSC)。提取、分离和纯化HSC的方法在本领域是公知的。
造血干细胞(HSC)产生定向(committed)造血祖细胞(HPC),其能够在生物体的一生中产生完整的一套成熟血细胞库。术语“造血干细胞”或“HSC”是指产生生物体的所有血细胞类型的多能干细胞,包括骨髓(例如单核细胞和巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突细胞)和淋巴谱系(例如T细胞、B细胞、NK细胞)以及本本领域已知的其他细胞。当移植到致死照射的动物或人类时,造血干细胞可以重新繁殖红细胞、嗜中性粒细胞-巨噬细胞、巨核细胞和和淋巴造血细胞池。
HSC可以根据某些表型或基因型标记来鉴定。例如,HSC可以根据它们的小尺寸、缺乏谱系(lin)标记、具有活体染料如罗丹明123(罗丹明DULL,也称为rholo)或Hoechst33342)的低染色(侧群)以及它们的表面上存在的各种抗原标记(它们中的许多属于分化系列簇(例如,CD34、CD38、CD90、CD133、CD105、CD45和c-kit、干细胞因子的受体)进行鉴定。HSC对于通常用于检测谱系定向的标志物主要是阴性的,因此通常称为Lin(-)细胞。大多数人类HSC可表征为CD34+、CD59+、Thy1/CD90+、CD38lo/-、C-kit/CD117+和Lin(-)。然而,并非所有的干细胞都被这些组合所涵盖,因为某些HSC是CD34-/CD38-。还有一些研究表明,最早的干细胞可能缺乏在细胞表面上的c-kit。对于人类HSC,CD133可能是早期标记,因为已显示CD34+和CD34-HSC都是CD133+。本领域已知CD34+和Lin(-)细胞也包括造血祖细胞。
用于本申请方法的造血干细胞和祖细胞的合适来源包括但不限于从含有造血起源细胞的身体器官分离或获得的细胞。“分离”是指从其原始环境中移取的材料。例如,如果细胞与通常以其天然状态伴随它的某些或全部组分分离,则该细胞是分离的。例如,本文所用的“分离的细胞群”、“分离的细胞来源”或“分离的造血干细胞和祖细胞”等是指一种或多种细胞与它们的天然细胞环境以及从组织或器官的其他组分的关联(即它与体内物质没有显著关联)的体外(in vitro)或离体(ex vivo)分离。
用于本申请方法的造血干细胞和祖细胞可能耗尽(deplete)成熟造血细胞例如T细胞、B细胞、NK细胞、树突细胞、单核细胞、粒细胞、红系细胞及其来自骨髓抽吸物、脐带血或动员的外周血(动员的白细胞分离术产品)的定向前体。例如,通过用结合一系列所谓的“谱系”抗原CD2、CD3、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD19、CD56、CD123和CD235a的抗体标记固体底物,通过免疫耗竭将成熟的谱系定向细胞耗尽。可以进行随后的步骤以进一步纯化细胞群,其中用结合CD34+抗原的抗体标记的底物用于分离原始造血干细胞和祖细胞。试剂盒可商购获得用于纯化来自各种细胞来源的造血干细胞和祖细胞,并且在一些具体的实施方式中,这些试剂盒适用于本申请的方法。用于纯化造血干细胞和祖细胞的示例性市售试剂盒包括但不限于Lineage(Lin)耗尽试剂盒(Miltenyi Biotec);CD34+富集试剂盒(MiltenyiBiotec);和RosettaSep(Stem Cell Technologies)。
胚胎干(ES)细胞用于研究早期发育事件并提供可能用于再生疗法的有希望的组织来源。最近在产生iPSC方面的突破提供了另一种在不破坏胚胎的情况下获得ES样细胞的方法。已知iPS细胞与ES细胞共有许多性状,例如菌落形态、转录组、自我再生能力和多能性。
可以通过将多种重编程因子(Oct3/4、Sox2和Klf4/c-Myc或Nanog/Lin28)导入体细胞中来产生iPSC。特别地,可以使用一种或多种核重编程因子来诱导分化细胞如体细胞的重编程,而不使用卵、胚胎或ES细胞。诱导过程的效率通过利用拮抗细胞特异性基因的试剂或在诱导过程中上调核重编程基因的表达或活性来增强。分化细胞的重编程为建立具有与ES细胞类似的多能性和生长能力的iPSC群提供了方便且高度可重复的手段。
在一些实施方式中,通过用包含编码核重编程因子的基因的重组载体连同试剂一起转导细胞,可以将细胞核重编程因子导入细胞。因此,细胞可表达作为重组载体中所含基因的产物表达的细胞核重编程因子。该试剂在诱导过程中拮抗细胞特异性基因或上调细胞核重编程基因的表达或活性,从而与单独使用细胞核重编程因子相比,诱导分化细胞的重编程的效率增加了。该试剂还可以替代特定的细胞核重编程因子例如Sox2。
用于产生iPSC的体细胞可以是原代细胞或永生化细胞。这样的细胞可以是原代细胞(非永生化细胞),例如刚分离自动物的细胞,或者可以源自细胞系(永生化细胞)。在优选的实施方式中,体细胞是哺乳动物细胞,例如人类细胞或小鼠细胞。它们可以通过熟知方法从不同器官获得,所述器官例如但不限于:皮肤、肺部、胰脏、肝脏、胃部、肠、心脏、生殖器官、膀胱、肾脏、尿道和其他泌尿器官,或通常从含有活的体细胞的任何器官或组织获得。哺乳动物体细胞包括例如:成体干细胞、支持细胞、内皮细胞、颗粒上皮细胞、神经元、胰岛细胞、表皮细胞、上皮细胞、肝细胞、毛囊细胞、角质形成细胞、造血细胞、黑素细胞、软骨细胞、淋巴细胞(B和T淋巴细胞)、红细胞、巨噬细胞、单核细胞(monocytes)、单个核细胞(mononuclear cells)、成纤维细胞、心肌细胞、其他已知的肌细胞、以及通常任何活的体细胞。在一些具体的实施方式中,使用成纤维细胞。如本文所用,术语“体细胞”还旨在包括成体干细胞。成体干细胞是能够产生特定组织的所有细胞类型的细胞。成体干细胞包括如造血干细胞、神经干细胞和间充质干细胞等细胞。
核重编程因子是这样的基因,例如核重编程基因,其诱导多能性并用于将分化或半分化细胞重编程为比初始细胞更原始的表型,例如PSC表型。这些基因与确定拮抗体细胞特异性基因或上调细胞核重编程基因的表达或活性以增加诱导效率的试剂一起使用。这样的基因和试剂能够在已经整合到体细胞基因组中的一种或多种此类基因的表达后从体细胞产生PSC。如本文所用,诱导多能性的基因旨在表示与多能性相关并且能够在整合和表达基因后从体细胞产生较少分化的细胞(例如PSC)的基因。多能性基因的表达通常限于PSC,并且对于PSC的功能同一性至关重要。
能够拮抗细胞特异性基因或上调核重编程基因的表达或活性的试剂可以包括多种不同类型的分子。用于本申请的任何方法中的试剂或候选试剂可以是任何类型的分子,例如多核苷酸、肽、肽模拟物、拟肽(例如乙烯基类拟肽)、化合物(例如有机分子或小有机分子),或其类似分子。拮抗剂可以是多核苷酸,诸如反义寡核苷酸或RNA分子,诸如microRNA、dsRNA、siRNA、stRNA或shRNA。
已经发现若干种基因与多能性有关并且可以被认为是细胞核重编程基因或因子,因此适合于建立用于本文所述方法中的iPSC群。这些基因是本领域已知的并且包括例如SOX家族基因(SOX1、SOX2、SOX3、SOX15、SOX18),KLF家族基因(KLF1、KLF2、KLF4、KLF5),MYC家族基因(C-MYC、L-MYC、N-MYC),SALL4,OCT4,NANOG,LIN28,STELLA,NOBOX或STAT家族基因。STAT家族成员可以包括例如STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5(STAT5A和STAT5B)和STAT6。虽然在某些情况下,仅使用一种基因诱导多能性可能是可行的,但通常需要多于一种基因的表达来诱导多能性。预期所需多能性基因的数目还取决于与细胞核重编程基因组合使用的一种或多种试剂,因为某些试剂已被确定为重编程基因的替代物。例如,Sox2可以被替换为OHTM和/或萘丁美酮。如此,一个、两个、三个、四个或更多个基因可作为多顺反子构建体同时整合到体细胞基因组中以允许此类基因的同时表达。在某些实施方式中,利用多达四种基因来诱导多能性,包括OCT3/4、Sox2、Klf4和c-MYC的任何组合。另外的适用于诱导干细胞多能性的重编程因子和方法公开于美国专利No.7,682,828、8,278,104和美国专利公布No.US2009/0227032、US2012/0213746、US2013/0259842、US2013/0323782、US 2014/0093486、US 2014/0356455和US 2016-0145642。
在一些实施方式中,在移植入受试者之前用一种或多种试剂处理HSC。在一些实施方式中,所述一种或多种试剂包含抑制HIF-1α或HIF-2α的生物学活性或表达的试剂。
在一些实施方式中,受试者可以移植通用iPSC供体细胞系,诸如经改造以沉默HLAI类基因和/或HIF-α表达的HLA-通用诱导多能干细胞(iPSC)系。用于产生通用iPSC供体细胞的基因的沉默可以使用合适的核酸酶进行,包括上文进一步描述的CRISPR-Cas系统。
在一些实施方式中,受试者还与上文所述的HSCT一起另外接受间充质基质细胞(MSC)移植。MSCs表现出免疫抑制、再生和HSC支持特性。特别是,MSCs可以为进入骨髓中和骨髓中存在的造血干细胞和祖细胞(HSPCs)提供存活信号,并为补充骨内骨髓生态位空间提供成骨祖细胞。在这方面似乎没有任何关于该方法的任何内容,即您将提取细胞,根据需要进行纯化,用适当的试剂进行处理并在认为合理的时间段内施用于受试者。
治疗的疾病
本文所述的HIF-α抑制组合物可以单独使用或与HSCs来源组合使用以治疗哺乳动物受试者中的各种疾病。如本文所用,术语“哺乳动物受试者”是指归类为哺乳动物的任何动物,包括人类,家养动物和农场动物,以及动物园动物,运动动物或宠物动物,例如狗、猫、牛、马、绵羊、猪、大鼠、小鼠、兔子等。优选地,哺乳动物是人类。
在一个实施方式中,受试者患有白血病并且用本文所述的HSC和HIF-α抑制组合物治疗。如本文所用,术语“白血病”是指血液形成器官的进行性恶性疾病,并且通常以血液和骨髓中白细胞及其前体的不正常增殖和发育为特征。用于治疗的示例性白血病包括例如急性非淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、急性早幼粒细胞性白血病、大颗粒淋巴细胞性白血病、成体T细胞性白血病、白细胞不增多性白血病(aleukemic leukemia)、白细胞增多性白血病(leukocythemic leukemia)、嗜碱性粒细胞性白血病、母细胞性白血病、牛白血病、慢性髓细胞性白血病、皮肤白血病、胚胎性白血病、嗜酸性粒细胞性白血病、格罗斯白血病、毛细胞性白血病、成血细胞性白血病、血胚细胞性白血病、组织细胞性白血病、干细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、白细胞减少性白血病、淋巴性白血病、成淋巴细胞性白血病、淋巴细胞性白血病、淋巴性白血病、淋巴样白血病、淋巴肉瘤细胞性白血病、肥大细胞性白血病、兆级细胞性白血病、微成髓细胞性白血病、单核细胞性白血病、成髓细胞性白血病、髓细胞性白血病、髓样粒细胞性白血病、髓单核细胞性白血病、内格利型白血病、浆细胞性白血病(plasma cell leukemia)、原生质细胞性白血病(plasmacytic leukemia)、早幼粒细胞性白血病、里德尔细胞白血病(Riedercell leukemia)、希林氏白血病(Schilling's leukemia)、干细胞性白血病、亚白血性白血病和未分化细胞性白血病。
在一些实施方式中,受试者患有骨髓增生异常综合征(MDS)和/或任何其它相关疾病。
在其他一些实施方式中,受试者患有非造血疾病并且是胚胎干细胞(ESC)或诱导性多能干细胞(iPSC)的受体。与HSC类似,这些细胞包括可诱导GvHD的T细胞的祖细胞。在一些实施方式中,移植的ESC或iPSC被遗传修饰以减少或消除来自它们的HIF-α的表达。用ESC或iPSC与HIF-α抑制药物组合物组合治疗的示例性疾病包括但不限于:癌症,包括血癌、脑癌、膀胱癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、头颈癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、间皮瘤、卵巢癌、前列腺癌、胃癌和子宫癌;肝脏疾病,如肝纤维化、肝细胞癌、肝硬化和肝炎;糖尿病;退行性疾病如帕金森病、阿尔茨海默氏痴呆、亨廷顿氏舞蹈病、肌萎缩性侧索硬化症、脊髓性肌萎缩症、黄斑变性、视网膜缺血和肌营养不良症;缺血性心脏病;中风;骨骼/骨头疾病,例如骨关节炎、骨软骨疾病、类风湿性关节炎、骨质疏松症、青少年骨质疏松症、类风湿性关节炎引起的骨损失、炎症性关节炎、骨髓炎、皮质类固醇治疗、骨丢失、退行性关节病、软骨退化、疝、椎间盘破裂和/或退行性疾病、韧带、肌腱、滑膜囊、滑膜和半月板组织损伤和疾病、骨折和骨缺损。
HSC的施用
与HIF-α抑制剂一起用于预防或降低GvHD严重性的每次注射HSC的有效剂量可以在1个细胞/kg体重和1×106个细胞/kg体重之间;在2个细胞/kg体重和1×106个细胞/kg体重之间;在2.5个细胞/kg体重和1×106个细胞/kg体重之间;在2个细胞/kg体重和1×105个细胞/kg体重之间;在2.5/kg体重和1×105个细胞/kg体重之间;在2个细胞/kg体重和3×104个细胞/kg体重之间;在2.5个细胞/kg体重和3×104个细胞/kg体重之间;在2×104个细胞/kg体重和2×106个细胞/kg体重之间;在2.5×细胞/kg体重和2×104个细胞/kg体重之间;在2.5个细胞/kg体重和1×104个细胞/kg体重之间;在2个细胞/kg体重和1×103个细胞/kg体重之间;或2.5个细胞/kg体重和1×103个细胞/kg体重之间。
可以通过静脉内注射、动脉注射、可选择性动脉注射、肌内注射、腹膜内注射、脑内注射、皮内注射或骨髓注射施用HSC。
优选地,在施用HSC之前对受试者进行“调理”。如本文所使用的,在HSCT之前患者预处理的背景下的术语“调理”或“调理的”通常表示通过合适的程序例如降低强度调理(reduced intensity conditioning,RIC)或清髓调理来基本上破坏骨髓和免疫系统。RIC包括例如使用化学治疗剂如氟达拉滨治疗,通常以30mg/m2/天的剂量治疗3天,然后通常以1×200cGy/天的全身照射(total body irradiation,TBI)进行治疗。清髓调理涉及高剂量化疗和全身照射(TBI),通常根据适合于机构实践的国家指导方针进行,并且包括施用合适的化学治疗剂。TBI可以用0.5-10Gy的照射剂量进行。用于调理的合适的化学治疗剂包括但不限于氟达拉滨、白消安(busulphan)、环磷酰胺、甲氨蝶呤、环孢菌素及其组合。TBI通常会发生在大约第8天至第10天(相对于HSCT为第-8天和第-1天)。在一个实施方式中,TBI剂量为200cGy,每天两次,总剂量为1200cGy。
示例性的施用方案调理包括例如:(1)25mg/m2/天的氟达拉宾静脉注射x3天(约2-3天),总剂量为75mg/m2;(2)0.8mg/kg/6小时的白消安(约2至4天);(3)60mg/kg/x 2天(大约2天)的环磷酰胺,总剂量为120mg/kg。为了降低CYC诱导的出血性膀胱炎的风险,患者也可能接受高体积流体冲洗和美司钠(mesna)。
HIF-α抑制剂的施用
与接受移植的同种异体干细胞但不用一种或多种HIF-α抑制剂的对照受试者相比,HIF-α抑制剂可以以有效预防或减少已接受移植的同种异体干细胞的受试者中的GvHD的一种或多种症状的浓度施用。为了预防,应该在GVHD发作之前注射药物,例如在HSC移植之前两周到HSC移植之后两个月之间,优选在HSC移植之前一周到HSC移植之后一个月之间注射。为了治疗,应在GVHD诊断后或GVHD发作后的任何时间尽快施用。频率可以是每日两次,每日一次,每2至7天一次或甚至每月一次,这取决于棘霉素制剂、GVHD患者耐受的剂量和持续时间或直到GVHD得以有效控制。
在一些实施方式中,将HIF-α的一种或多种抑制剂与另一种GvHD治疗组合施用于受试者,例如钙调磷酸酶抑制剂(例如环孢素或他克莫司)和氨甲喋呤施用。在一些实施方式中,他克莫司通过静脉内或口服给药在HSC移植的第-3天开始施用。对于静脉内施用,推荐的起始剂量为0.03mg/kg/天,连续输注时根据体重进行调节。对于口服施用,推荐的起始剂量是0.045mg/kg/剂量,每天两次。对于不能耐受他克莫司的患者,推荐然后以100x静脉内他克莫司剂量(例如,3mg/kg/天起始剂量)的剂量施用环孢菌素。对于口服施用,推荐改为静脉内剂量的3倍。当使用Neoral品牌时,由于其具有更大的生物利用度,改为IV剂量的2倍。
在一些实施方式中,甲氨蝶呤与他克莫司联合用于GvHD预防。在一些实施方式中,在HSC移植后的第1天以15mg/m2/剂量的剂量,每日一次,并在HSC移植后的第3、6和11天以10mg/m2/剂量的剂量静脉内给予甲氨蝶呤。
GVHD的其他治疗包括非选择性或选择性抑制或耗竭T细胞以限制介导组织损伤的同种异体反应性T细胞的扩增。非选择性T细胞耗竭策略包括但不限于施用抗胸腺细胞球蛋白。选择性T细胞耗竭/抑制策略包括但不限于靶向一种或多种促炎细胞因子如TNFα、IL-1、Il-6、IL-10和趋化因子。
在一些实施方式中,将HIF-α的一种或多种抑制剂与有效量的一种或多种免疫抑制剂联合施用于受试者。在一些实施方式中,所述一种或多种免疫抑制剂包含增强调节性T细胞(Treg)活性的试剂。增强调节性T细胞(Treg)活性的试剂的实例包括但不限于:雷帕霉素、氢化青蒿素(Ihydroartemisinin)、体内增强IL-2功能的抗IL2单克隆抗体、IL-2、抗-TNF试剂、JAK抑制剂(例如托法替尼)、抗IL17/IL17R试剂(例如Brodalumab)、靶向IL-2受体(Basiliximab/Simulect;Daclizumab/Zinbryta)的α链(CD25)的抗体和抗CD3试剂。
GvHD的症状包括硬化皮肤、口服摄入量的限制、眼睛干燥、胃肠(GI)道症状如吞咽困难、厌食、恶心、呕吐、腹痛或腹泻、表现为胆红素升高、碱性磷酸酶升高、丙氨酸氨基磺酸盐(ALT)/天门冬氨酸氨基转移酶(AST)(AST/ALT)比率升高的肝脏症状、呼吸短促和/或手臂或腿部的发紧。受试者可能表现出多种症状,这取决于受GvHD影响的组织。有些患者可能会出现4至5种症状,而其他患者可能会出现1至2种症状。
HIF-α抑制剂的合适剂量(“治疗有效量”)将取决于例如待治疗的病症,病症的严重性和病程,施用方式,是否为了预防或治疗目的而施用抑制剂,抑制剂的生物利用度,先前的疗法,患者的年龄和体重,患者的临床病史和对抗体的反应,所用HIF-α抑制剂的类型及其IC50浓度和/或EC50浓度,主治医生的判断力等。如本文所用,术语“IC50浓度”是指体外50%抑制所需的抑制剂浓度。术语“EC50浓度”是指体内50%抑制所需的血浆中的抑制剂浓度。
HIF-α抑制剂剂量可以在合适的免疫缺陷动物模型中进行测试,如下面进一步描述的那样。作为一般建议,无论是通过一次或多次施用,HIF-α抑制剂的治疗有效量将在约1ng/kg体重/天至约10mg/kg体重/天的范围内。在具体的实施方式中,每种HIF-α抑制剂以约1ng/kg体重/天至约1mg/kg体重/天、约1ng/kg体重/天至约0.1mg/kg体重/天、约1ng/kg体重/天至约10μg/kg体重/天、约1ng/kg体重/天至约1μg/kg体重/天、约1ng/kg体重/天至约0.1μg/kg体重/天、约1ng/kg体重/天至约10ng/kg体重/天、约10ng/kg体重/天至约10mgkg体重/天、约10ng/kg体重/天至约1mg/kg体重/天、约10ng/kg体重/天至约0.1mg/kg体重/天、约10ng/kg体重/天至约10μg/kg体重/天、约10ng/kg体重/天至约1μg/kg体重/天、约10ng/kg体重/天至约0.1μg/kg体重/天、约100ng/kg体重/天至约10mg/kg体重/天、约100ng/kg体重/天至约1mg/kg体重/天、约100ng/kg体重/天至约0.1mg/kg体重/天、约100ng/kg体重/天至约10μg/kg体重/天、约100ng/kg体重/天至约1μg/kg体重/天、约1μg/kg体重/天至约10mg/kg体重/天、约1μg/kg体重/天至约1mg/kg体重/天、约1μg/kg体重/天至约0.1mg/kg体重/天、约1μg/kg体重/天至约10μg/kg体重/天、约10μg/kg体重/天至约10mg/kg体重/天、约10μg/kg体重/天至约1mg/kg体重/天、约10μg/kg体重/天至约0.1mg/kg体重/天、约100μg/kg体重/天至约10mg/kg体重/天、约100μg/kg体重/天至约1mg/kg体重/天、约1mg/千克体重/天至约10毫克/千克体重/天施用。
在其他一些实施方式中,每种HIF-α抑制剂以每次单次施用约10ng至约100ng、每次单次施用约10ng至约1μg、每次单次施用约10ng至约10μg、每次单次施用约10ng至约100μg、每次单次施用约10ng至约1mg、每次单次施用约10ng至约10mg、每次单次施用约10ng至约100mg、每次注射约10ng至约1000mg、每次单次施用约100ng至约1μg、每次单次施用约100ng至约10μg、每次单次施用约100ng至约100μg、每次单次施用约100ng至约1mg、每次单次施用约100ng至约10mg、每次单次施用约100ng至约100mg、每次注射约100ng至约1000mg、每次单次施用约1μg至约10μg、每次单次施用约1μg至约100μg、每次单次施用约1μg至约1mg、每次单次施用约1μg至约10mg、每次单次施用约1μg至约100mg、每次注射约1μg至约1000mg、每次单次施用约10μg至约100μg、每次单次施用约10μg至约1mg、每次单次施用约10μg至约10mg、每次单次施用约10μg至约100mg、每次注射10μg至约1000mg、每次单次施用约100μg至约1mg、每次单次施用约100μg至约10mg、每次单次施用约100μg至约100mg、每次注射约100μg至约1000mg、每次单次施用约1mg至约10mg、每次单次施用约1mg至约100mg、每次注射约1mg至约1000mg、每次单次施用约10mg至约100mg、每次注射约10mg至约1000mg、每次注射约100mg至约1000mg。HIF-α抑制剂可以每天两次、每天一次或每2、3、4、5、6或7天一次或每1、2、3或4周一次进行施用。
在一个实施方式中,HIF-α抑制剂以0.1mg至1000mg的剂量每天或每隔一天施用于人受试者,持续治愈GVHD所需的时间或GVHD患者最大可耐受的时间。在其他一些具体的实施方式中,HIF-α抑制剂的量以约0.0006mg/天、0.001mg/天、0.003mg/天、0.006mg/天、0.01mg/天、0.03mg/天、0.06mg/天、0.1mg/天、0.3mg/天、0.6mg/天、1mg/天、3mg/天、6mg/天、10mg/天、30mg/天、60mg/天、100mg/天、300mg/天、600mg/天、1000mg/天、2000mg/天、5000mg/天或10,000mg/天施用于人类受试者。如预期的那样,剂量将取决于患者的状况、体重、年龄和病状。
在HIF-α抑制剂为棘霉素的情况下,剂量范围为至少约1μg/kg,通常至少约10μg/kg、至少约50μg/kg,且不超过约10mg/kg,通常不超过约1mg/kg。当HIF-α抑制剂不是棘霉素时,抑制剂可以以提供当量的HIF-α抑制活性的浓度施用。
监测HIF-1α和/或HIF-2α的表达
在一些实施方式中,该方法还包括监测受试者中HIF-1α和/或HIF-2α表达的步骤。HIF-1α和/或HIF-2α的表达水平可以为确定是否施用HIF-α抑制剂以及施用的剂量和频率提供有用的标记。在一些实施方式中,监测受试者的CD4+和/或CD8+T细胞中HIF-1α的表达。在一些实施方式中,监测受试者骨髓中的CD4+和/或CD8+T细胞中HIF-1α的表达。在一些实施方式中,监测受试者外周血中CD4+和/或CD8+T细胞中HIF-1α的表达。用于确定或测量T细胞上的HIF-1α和/或HIF-2α表达的方法在本领域中是公知的。在一些实施方式中,预防GvHD的方法或治疗GvHD的方法包括监测受试者的CD4+和/或CD8+T细胞上的HIF-1α和/或HIF-2α表达的步骤。在一些实施方式中,治疗方案(例如治疗的剂量和持续时间)可基于受试者的CD4+和/或CD8+T细胞上的HIF-1α和/或HIF-2α的表达水平进行调整。
人源化GvHD动物模型
另一方面涉及人源化GvHD动物模型和产生人源化GvHD动物模型的方法。在一个实施方式中,用于产生人源化GvHD动物模型的方法包括通过全身照射或药物诱导的骨髓消融调理免疫缺陷小鼠,以及用足够数量的人骨髓细胞移植经调理的小鼠以引起GvHD。另一个实施方式涉及根据这些方法步骤生成的人源化GvHD小鼠模型。
如本文所用,术语“免疫缺陷的”是指动物的受损的或不具有完全功能的免疫系统,例如不能产生正常量的B细胞、T细胞、NK细胞等。免疫缺陷可以通过例如但不限于突变、照射、化学或药物或病毒来产生。免疫缺陷小鼠的实例包括但不限于:NSG小鼠(NOD/SCID/γc-/-或NOD/scidIL2rγnull)、NOG小鼠(NOD/γc-/-或NOD/scid/IL2rγTrunc)、NOD小鼠(非肥胖性糖尿病)、SCID小鼠(严重联合免疫缺陷小鼠)、NOD/SCID小鼠、裸鼠、BRG小鼠(BALB/c-Rag2null/IL2rγnull)、Rag1-/-小鼠、Rag1-/-/γc-/-小鼠、Rag2-/-小鼠和Rag2-/-/γc-/-小鼠。
在一些实例中,已经与任何上述小鼠杂交且具有免疫受损背景的小鼠可用于如本文所述的植入HSC。在一些实例中,免疫缺陷可能是重组遗传缺陷、遗传缺陷胸腺、缺陷T细胞受体区域、NK细胞缺陷、Toll受体缺陷、Fc受体缺陷、免疫球蛋白重排缺陷、代谢缺陷或其任何组合。在一些实例中,通过施用免疫抑制剂(例如环孢菌素、NK-506、去除胸腺或照射)使小鼠免疫缺陷。
用于本发明方法的示例性免疫缺陷小鼠品系包括但不限于NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wj1(NSG)、NOD.Cg-PRdcscidIL2rgtm1Sug(NOG)和C.Cg-Rag2tm1Fwa Il2rgtm1Sug(BRG)。免疫缺陷小鼠品系可从The Jackson Laboratory(http://www.jax.org/)和TaconicBiosciences,Inc.(www.taconic.com)获得。
根据上述说明完成调理步骤之后,向哺乳动物受试者移植适量的骨髓细胞(如上面进一步描述的那样),从而导致GvHD。在一个具体的实施方式中,将包含0.01至10x106个单核细胞的骨髓移植到经调理的小鼠中。细胞可以通过肝内、腹膜内或皮下注射到受体免疫缺陷小鼠中。
如以下实施例中进一步描述的那样,骨髓细胞作为移植细胞的来源的使用允许GvHD模型系统的可再现产生,这样的GvHD模型系统忠实地重现人类GvHD的病理学特征。
本申请的另一方面涉及鉴定用于治疗GvHD的候选药物的方法,所述方法包括以下步骤:将测试试剂施用至具有使用本申请的方法产生的人源化系统性GvHD的免疫缺陷小鼠,监测小鼠中存活和GvHD临床表现,以及如果测试药物与具有人源化系统性GvHD的接受对照试剂的小鼠相比,预防或减轻小鼠GvHD的严重性,则将测试药物鉴定为GvHD的候选药物。在一些实施方式中,通过将人骨髓细胞移植到新生NSG小鼠中来产生具有人源化系统性GvHD的小鼠。
实施例
实施例1:材料和方法
1.小鼠。涉及实验动物的所有程序均由儿童研究所(Children’s ResearchInstitute)的执行此项工作的研究所动物护理和使用委员会(Institutional AnimalCare and Use Committees)批准。Nod.Scid.Il2rg0(NSG)小鼠购自杰克逊实验室(JacksonLaboratory),并且在儿童研究所的研究动物设施中饲养并维持在特定的无病原体条件下。
2.将人BM细胞异种移植到新生NSG幼崽中。使用从Stemcell Technologies(Vancouver,Canada)和Lonza(Walkersville,MD,USA)购买的密度梯度分离,从健康人成人骨髓中分离人骨髓单核细胞。使用BD Influx(BD Biosciences)从人BM细胞中分选出来自BM的人类CD3+细胞。将细胞解冻,计数并以0.1至0.5x106/30μl的浓度重悬于1XPBS中。通过肝内注射将0.1至0.5×106个细胞移植到经照射的(1.30Gy)新生NSG幼崽中。在移植后第17天至第20天,通过FACS分析检测受体PBMC中的人CD45+细胞。
3.流式细胞术。在人BM细胞移植后的不同时间通过下颌采血收集外周血。荧光染料标记的抗体直接加入全血中。染色30分钟后,洗去未结合的抗体,用BD FACSTM裂解红细胞。用BD FACS Canto II流式细胞术分析染色的细胞。
用霜冻的载玻片轻轻研磨脾脏,用注射器分离骨髓以获得单细胞悬浮液并通过尼龙细胞过滤器,用RPMI-1640洗涤3次,用抗体标记并分析不同人类细胞群的存在。
所使用的抗体是藻红蛋白(PE)偶联的抗人CD45、抗人FoxP3、PE-Cy7偶联的抗人CD4、别藻蓝蛋白(allophycocyanin,APC)偶联的抗人CD11c、抗人FoxP3、抗小鼠CD45、eFluor 450偶联的抗人CD3、eFluor 780偶联的抗人CD19(eBioscience,San Diego,CA),多甲藻黄素叶绿素(peridinin chlorophyll)蛋白偶联的(PerCP)抗人CD14、异硫氰酸荧光素(FITC)偶联的抗人CD8、V500偶联的抗人CD14(BD Bioscience,San Jose,CA)和PE-Cy 7偶联的抗人CD11b(BioLegend)。PE、PerCP和APC偶联的抗人HIF-1α从RD Systems(Minneapolis,NM)获得。
4.免疫荧光。对来自人源化NSG小鼠的皮肤、肝脏、肺部、脾脏和肾脏的组织切片进行免疫组织化学。切片用4%多聚甲醛固定并用分级醇(graded alcohol)脱水。用加热的柠檬酸盐缓冲液处理以恢复抗原后,针对内源性过氧化物酶活性而封闭切片。然后将切片在10%山羊血清中温育,然后在一次抗体中于4℃下温育过夜。用以下抗体对经固定的样品进行染色:抗人CD45(MEM-28)和CD3(ab828,Abcam PLC,Cambridge,MA),以检测浸润的人细胞。用二次抗体温育30分钟后,通过DAB处理使样本可视化。切片用苏木精轻微复染以使细胞核能够可视化。
5.病理评分。濒死小鼠的器官在福尔马林中固定并切片以进行苏木素和曙红(H&E)染色。所有切片都根据以下标准评分。0级,无病变;1级,最小血管周围白细胞浸润;2级,轻度血管周围白细胞浸润;3级,中度血管周围白细胞浸润,伴有白细胞浸润入实质,组织细胞坏死;4级,中度至重度血管周围白细胞浸润,伴有实质内白细胞和组织细胞坏死。
6.用棘霉素治疗GvHD小鼠。新生NSG幼仔肝内接受0.3至0.5x106个人BM细胞。从第17天或第27天开始,受体接受5次腹膜内注射棘霉素,每天10μg/kg。休息2天后,以相同的剂量施用另外5次腹膜内注射棘霉素,每天一次。第二轮治疗在上一轮治疗5天后进行,每隔一天使用相同剂量一次,共10次治疗。
实施例2:将人BM细胞移植到新生NSG幼崽中导致GvHD
为了开发用于人GvHD的稳健小鼠模型,将0.5×106个人BM细胞移植到新生NSG小鼠中,并追踪人白细胞的植入和扩增以及嵌合体小鼠的存活。其中一个受体的示例性数据在图1中给出。
如图1的图A所示以及图1的图B所总结的那样。在第17天,在受体小鼠的血液中观察到人类白细胞的稳健植入和扩增,因为在PBL中观察到平均40%的人类白细胞。其中绝大多数表达T细胞标志物CD4和/或CD8。正如其他人所报道的那样,大约10%的人类T细胞表达CD4+和CD8+,不过这个亚群(subset)的功能尚不清楚。纵向研究显示人类细胞逐渐扩增直至它们超过小鼠白细胞(图1的图C)。根据迟发性生长(图1的图D)以及皮肤损伤和毛发生长不足(数据未显示)判断,GvHD的第一个征兆可在两周内观察到。从第3周开始观察到发病和/或死亡,并且基本上所有小鼠在6周内死亡(图1的图E)。在另外三个供体中观察到类似的植入和死亡(数据未显示)。
为了测试人类CD3+是否在受体小鼠中引起GvHD,将人类BM细胞分选为CD3+群和CD3-群,随后将同等数量的CD3+、CD3-或未分选的骨髓细胞(BMC)移植到受体小鼠中。如图1的图F所示,CD3+细胞受体以及未分选的BMC受体发生严重的GvHD并在30天内死亡。由于在这些受体中GvHD发病较快,因此T细胞可能导致GvHD。这通过在246天的观察期间CD3-细胞受体不发生GvHD的事实得到证实(图1的图F)。因此,将非常少量的人BM细胞移植到新生NSG幼崽中会引起严重的异种GvHD,并且在该人源化小鼠模型中CD3+细胞有助于发生GvHD。
实施例3:人T细胞浸润到外周组织中
根据H&E染色,BMT受体在多个器官中表现出广泛的炎症(图2的图A和表1)。对发生异种GvHD临床症状的小鼠的脾脏、皮肤、肝脏、肾脏、肺部、胰脏、胃部和肠的免疫组织化学检查显示在这些组织中检测到人类CD3+T细胞(图2的图B)。脾脏和肺部中人T细胞浸润最高,不过在其他组织中高度浸润也是明显的。在肺部中,有人体细胞的多病灶聚集体扩增到肺泡隔膜中。另外,观察到皮肤显著增厚,伴随着沿真皮-表皮连接处的人类T细胞浸润。表1显示在不同组织中反映人类T细胞浸润的浸润分数,分数为4代表最高程度浸润,伴随中度至重度血管周围白细胞浸润,实质内白细胞和组织细胞坏死。在所有受检的组织中都观察到高水平浸润。
表1.异种GvHD小鼠器官中的浸润评分总结。
肺 | 肝 | 肠 | 皮肤 | 肾 | 胃 | |
没有人BM(n=3) | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
BM(供体1)(n=3) | 3.3±0.7 | 2.7±0.3 | 2.7±0.3 | 2.7±0.3 | 2.5±0.5 | 2.5±0.5 |
BM(供体2)(n=5) | 3.6±0.4 | 3.3±0.6 | 3.3±0.6 | 3.0±0 | 3.3±0.6 | 3.3±0.6 |
BM(供体3)(n=7) | 3.7±0.6 | 3.7±0.6 | 3.7±0.6 | 3.7±0.6 | 3.7±0.6 | 3.7±0.6 |
BM(供体4)(n=5) | 3.8±0.2 | 3.6±0.4 | 3.6±0.4 | 3.8±0.2 | 3.8±0.2 | 3.8±0.2 |
为了进一步检查T细胞的分布模式,使用免疫荧光染色来研究人类CD4+和CD8+T细胞亚群在异种GvHD小鼠的各种器官中的定位。如图3的图A所示,CD8+T细胞占肝脏、肺部、皮肤、肾脏和肠等器官中的人淋巴细胞的80%以上。这些数据表明,CD4+和CD8+T细胞亚群各自对表型都有贡献,并且CD8+T细胞可能起主导作用。为了测试其他人细胞类型对器官的浸润,用抗人CD3和CD45抗体进行免疫荧光染色(图3的图B)。几乎100%浸润器官的人类细胞(CD45+)是T细胞(CD3+);发现在组织中CD45+CD3-细胞很少。总之,这些数据表明T细胞造成这些BMT-GvHD模型中观察到的表型。
实施例4:HIF-1α的累积对维持GvHD小鼠中活化的T细胞至关重要
HIF-1α在驱动T细胞分化、代谢和细胞毒性活性方面起着关键作用(Palazon,A.等,Immunity,41(4):518-528(2014))。然而,以前没有研究过HIF-1α在GvHD中的作用。因此,通过从GvHD受体的脾脏和BM中分离的细胞的细胞内染色来检测HIF-1α的表达。为了检查哪些T细胞亚群累积了高水平的HIF-1α,用抗人CD45、CD4、CD8和HIF-1α对分离的BM和脾脏细胞进行染色并进行FACS分析。在CD4+和CD8+T细胞亚群中检测到高水平HIF-1α(图4的图A)。令人惊讶的是,虽然来自受体小鼠的BM中约40%的CD8T细胞是HIF-1α+,但脾脏中超过70%的CD8T细胞表达HIF-1α(图2的图A)。由于脾脏通常给氧充足,因此HIF-1α蛋白质必须耐受氧介导的降解。这种在正常含氧量条件下的累积类似于白血病干细胞中报道的那样(Wang,Y.等,Cell Stem Cell,8(4):399-411(2011))。相反,在脾脏中仅有10%的CD4-CD8-细胞表达HIF-1α(图2的图B)。
为了测试HIF-1α累积的重要性,使用作为HIF-1α的选择性抑制剂的棘霉素治疗GvHD受体小鼠。令人惊讶的是,HIF-1α+细胞在单剂量棘霉素治疗后过夜就失去了HIF-1α蛋白(图4的图C)。由于T细胞频率在很大程度上不受影响,棘霉素必然降低HIF-1α的表达,而不是消除表达HIF-1α的细胞。此外,分离来自GvHD小鼠的脾细胞,并通过Western印迹分析测量来自棘霉素治疗的小鼠和媒剂对照的人HIF-1α蛋白水平。与媒剂对照相比,棘霉素治疗的小鼠的脾脏细胞中的HIF-1α蛋白质水平显著降低。由于HIF-1α在用于GvHD诱导的人BM细胞中和不接受BMT的NSG受体中不存在(图4的图D),所以HIF-1α蛋白的累积必定发生在GvHD诱导后。
据报道,HIF-1α通过调节FoxP3并与其相互作用来拮抗FoxP3,从而调节T细胞活化17,18。为了评估这种异种GvHD模型系统是否受到Treg细胞通过FoxP3-HIF-1α介导的调节回路的影响,检查了HIF-1α抑制对源自棘霉素处理的或媒剂对照小鼠的脾脏和BM的CD4T细胞亚群内FoxP3+细胞百分比的影响。棘霉素处理组或媒剂对照小鼠之间的Treg比例没有明显差异(图4的图E和图F)。这些结果表明,HIF-1α对NSG小鼠中FoxP3+人类T细胞的维持作用不大。然而,由于NSG小鼠中FoxP3+T细胞的频率远低于BM供体细胞,因此NSG环境可能不适合人类Treg细胞的扩增。
实施例5:棘霉素治疗为小鼠提供抗致死GvHD保护
为了更好地理解HIF-1α在GvHD治疗中的重要性,检查了HIF-1α抑制的作用。通过肝内注射向新生幼仔移植0.5×106个人BM细胞。移植后27天,用10μg/kg棘霉素治疗小鼠,总共进行20次治疗。治疗方案在图5的图A中示出。经治疗的小鼠的后续情况示例在图5的图B中示出。如图5的图B所示,在BMT后第26天,小鼠表现出严重的皮肤缺陷,包括无毛、炎症和皮肤变厚和干燥。经过两周的治疗后,小鼠恢复光滑的皮肤,毛发再生明显。尽管毛发恢复不完整,但是小鼠还是显示出随着时间推移的正常生长。对应于临床症状的改善,外周血中人类白细胞的数量在5周内减少了10倍以上(图5的图C)。IHC分析显示T细胞从所有主要器官(包括皮肤、肠、肝脏和肺部)消除了(图5的图D)。值得注意的是,虽然所有媒剂治疗的小鼠在治疗期间死亡,但是棘霉素治疗的小鼠都存活了。
随着药物的停止,小鼠逐渐死于GvHD。媒剂治疗组的中位存活期为51天,而棘霉素治疗组的为99天(图6的图A)。因此,棘霉素甚至在停止治疗后还延长了小鼠寿命。为了检查棘霉素在早期GvHD的治疗效果,将0.3x106个BM细胞移植到新生受试者中,然后在移植后第17天进行治疗。媒剂治疗组的中位存活期为50天,而棘霉素治疗组的中位存活期为119天。寿命比从第27天开始用棘霉素治疗的小鼠的寿命长20天(图6的图B)。数据表示三次独立实验。
与目前使用的由人类PBL引起的异种移植物GvHD模型相比,本发明的动物模型提供了若干优点。首先,尽管PBL诱导的GvHD引起肺部炎症损伤,但该模型重现了人类病理,因为在所有临床相关器官(包括皮肤、肠道和肝脏)中都发现了严重的炎症。其次,该模型中的GvHD由来自人BM的T细胞引起,其是临床实践中HSCT供体细胞的主要来源。第三,由于大部分研究可以在断奶前完成,所以使用小鼠幼仔而不是成年小鼠降低了动物护理的成本。
最近的研究显示,HIF-1α在驱动T细胞分化、代谢和细胞毒活性方面起着关键作用(Palazon,A.等,Immunity,41(4):518-528(2014))。T细胞活化均诱导HIF-1α并使其稳定,导致CD8+T细胞的溶细胞活性增加(Doedens,A.L等,Nat Immunol.,14(11):1173-1182(2013)。本申请的结果表明,HIF-1α在GvHD期间显著升高,因为人类T细胞表达高水平的HIF-1α,这可以通过用棘霉素短期治疗来消除。重要的是,持续棘霉素治疗可在接近100%的小鼠中提供抗致死GvHD保护。治疗效果进一步得到证实,因为基本上所有的小鼠在药物停止后死亡。虽然HIF的生物学影响已经在自身免疫疾病、癌症生物学、癌症免疫和病毒免疫的模型中得到充分证明(Peng,G.等,Trends Pharmacol Sci.,36(6):374-83(2015)),这些结果首次将HIF的作用扩展到GvHD的发病机制中。
GvHD是白血病患者对HSCT的主要障碍。本文提供的数据将HIF-1α鉴定为治疗靶标,并将棘霉素和其他HIFα抑制剂鉴定为该疾病的潜在治疗剂。棘霉素(NSC526417)是1957年最初分离自多刺链霉菌(Streptomyces echinatus)的喹喔啉家族抗生素的成员。棘霉素是阻断HIF1α与HIF响应元件(HRE)结合的DNA插入环状肽。先前显示棘霉素通过靶向HIF-1α并消除白血病干细胞而对治疗实验性白血病和淋巴瘤是有效的,而对造血干细胞没有不良反应(Wang,Y.等,Cell Stem Cell,8(4):399-411(2011);Wang,Y.等,Blood,124(7):1127-1135(2014))。由于当白血病患者接受HSCT时观察到大部分GvHD,棘霉素和其他HIF抑制剂可能独特地适用于治疗GvHD并减少白血病的复发。
以上描述的目的是教导本领域的普通技术人员如何实施本发明,并且不打算详细描述对于在阅读本说明书后的本领域技术人员来说显而易见的所有这些明显的修改和变化。但是,所有这些明显的修改和变化都意图包括在由随后权利要求书所限定的本发明的范围内。权利要求书旨在涵盖所请求保护的有效地满足其预期的目标的任何顺序的组分和步骤,除非上下文有相反的特别指示。
Claims (29)
1.一种在接受同种异体造血干细胞(HSC)移植物的哺乳动物受试者中预防GvHD发展或降低GvHD严重性的方法,所述方法包括:
向所述受试者施用包含抑制缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和/或缺氧诱导因子-2α(HIF-2α)的表达或生物活性的活性剂的药物组合物,
其中所述药物组合物以有效预防或降低所述受试者的GvHD严重性的量施用。
2.根据权利要求1所述的方法,其中在移植所述HSC之前将所述药物组合物施用于所述受试者。
3.根据权利要求1所述的方法,其中在移植所述HSC之后将所述药物组合物施用于所述受试者。
4.根据权利要求1所述的方法,其中在移植所述HSC之前和之后将所述药物组合物施用于所述受试者。
5.根据权利要求1所述的方法,其中在移植所述HSC之前14天至移植所述HSC之后2个月的时间段内将所述药物组合物施用于所述受试者。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法,其中移植的所述HSC包含所述活性剂。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法,其中所述移植物包含来自骨髓、外周血或脐带血的HSC。
8.根据权利要求1-6中任一项所述的方法,其中所述移植物包含胚胎干细胞或诱导性多能干细胞。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法,其中所述受试者还接受间充质基质细胞的移植物。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法,其中所述受试者患有白血病。
11.根据权利要求10所述的方法,其中所述白血病选自由急性淋巴母细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性髓性白血病、毛细胞性白血病、T细胞幼淋巴细胞性白血病、大颗粒淋巴细胞性白血病和成人T细胞性白血病组成的组。
12.根据权利要求1-9中任一项所述的方法,其中所述受试者患有非造血系统疾病。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法,其中所述活性剂包含HIF-1α或HIF-2α的小分子抑制剂。
14.根据权利要求13所述的方法,其中所述小分子抑制剂选自由HIF与DNA之间相互作用的抑制剂、HIF-α与p300之间相互作用的抑制剂、HIF二聚化抑制剂、拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、热休克蛋白-90抑制剂、微管破坏剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂、PI3-激酶抑制剂及其组合组成的组。
15.根据权利要求13所述的方法,其中所述小分子抑制剂是棘霉素。
16.根据权利要求1-12中任一项所述的方法,其中所述活性剂包含抗HIF-1α或HIF-2α的siRNA。
17.根据权利要求1-12中任一项所述的方法,其中所述活性剂包含编码基因编辑系统的一种或多种载体,所述基因编辑系统经改造以减少、预防或以其他方式破坏HIF-1α或HIF-2α的内源性表达;
其中所述一种或多种载体被导入到所述HSC中。
18.根据权利要求17所述的方法,其中所述基因编辑系统包含核酸酶,所述核酸酶包含成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)相关(Cas)蛋白、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)或兆级核酸酶。
19.根据权利要求17所述的方法,其中所述基因编辑系统包含Cas9蛋白和引导RNA(gRNA)。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法,所述方法还包括监测所述受试者中的CD4+和/或CD8+T细胞中HIF-1α和/或HIF-2α表达的步骤。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法,其中所述药物组合物与用于治疗GvHD的另一种试剂组合施用。
22.根据权利要求21所述的方法,其中所述其他试剂是增强Treg活性的试剂。
23.一种治疗接受同种异体造血干细胞(HSC)移植物的哺乳动物受试者的GvHD的方法,所述方法包括:
向所述受试者施用有效量的包含抑制HIF-1α和/或HIF-2α的生物学活性或表达的活性剂的药物组合物。
24.根据权利要求23所述的方法,所述方法还包括监测所述受试者中CD4+和/或CD8+T细胞中的HIF-1α和/或HIF-2α表达的步骤。
25.根据权利要求23或24所述的方法,其中所述药物组合物与用于治疗GvHD的另一种试剂组合施用。
26.根据权利要求25所述的方法,其中所述其他试剂是增强Treg活性的试剂。
27.一种用于在接受同种异体造血干细胞(HSC)移植物的哺乳动物受试者中预防GvHD发展或降低GvHD严重性的药物组合物,所述药物组合物包含:
抑制HIF-1α和/或HIF-2α的生物活性或表达的第一试剂;
增强Treg活性的第二试剂;和
药学上可接受的载体。
28.根据权利要求27所述的药物组合物,其中所述第一试剂是棘霉素。
29.一种鉴定用于治疗GvHD的候选药物的方法,所述方法包括:
将测试试剂施用至具有人源化系统性GvHD的小鼠中;
监测小鼠的存活和GvHD临床表现;并且
如果与接受对照试剂的具有人源化系统性GvHD的小鼠相比所述测试试剂预防或降低了所述小鼠的严重GvHD,则将所述测试试剂鉴定为GvHD的候选药物;
其中具有人源化系统性GvHD的所述小鼠是通过将人骨髓细胞移植到新生NSG小鼠中来产生的。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201562207000P | 2015-08-19 | 2015-08-19 | |
US62/207,000 | 2015-08-19 | ||
PCT/US2016/047595 WO2017031341A1 (en) | 2015-08-19 | 2016-08-18 | Compositions and methods for treating graft versus host disease |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN108135941A true CN108135941A (zh) | 2018-06-08 |
CN108135941B CN108135941B (zh) | 2021-07-27 |
Family
ID=58052028
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201680061243.3A Active CN108135941B (zh) | 2015-08-19 | 2016-08-18 | 用于治疗移植物抗宿主病的组合物和方法 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10898522B2 (zh) |
EP (1) | EP3337491A4 (zh) |
CN (1) | CN108135941B (zh) |
CA (1) | CA2995582A1 (zh) |
HK (1) | HK1256099A1 (zh) |
WO (1) | WO2017031341A1 (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108103027A (zh) * | 2018-02-02 | 2018-06-01 | 中国医学科学院血液病医院(血液学研究所) | 高效率血细胞重编程同时实现基因编辑的方法 |
WO2023184818A1 (zh) * | 2022-03-27 | 2023-10-05 | 苏州大学 | 米托蒽醌在制备预防或治疗急性移植物抗宿主病药物中的应用 |
Citations (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1270630A (zh) * | 1997-07-21 | 2000-10-18 | 塞鲁斯公司 | 处理白细胞的方法、白细胞组合物及其应用方法 |
WO2006084210A2 (en) * | 2005-02-04 | 2006-08-10 | Regents Of The University Of California, San Diego | Hif modulating compounds and methods of use thereof |
US20070212360A1 (en) * | 2006-01-17 | 2007-09-13 | Denko Nicholas C | Modulation of mitochondrial oxygen consumption for therapeutic purposes |
CN101269088A (zh) * | 2007-03-23 | 2008-09-24 | 中山大学 | 用于预防与治疗慢性移植物抗宿主病的干细胞制剂 |
CN101687019A (zh) * | 2007-04-24 | 2010-03-31 | 迪亚米德治疗股份公司 | 用于治疗自身免疫性疾病和癌症的药物和方法 |
CN101743473A (zh) * | 2007-06-22 | 2010-06-16 | 北海道公立大学法人札幌医科大学 | 移植物抗宿主疾病的检查及治疗方法 |
US20110113496A1 (en) * | 2009-11-09 | 2011-05-12 | Shultz Leonard D | Transgenic non-human animal and methods for stem cell engraftment |
CN102159243A (zh) * | 2008-07-21 | 2011-08-17 | 免疫医疗公司 | 用于改良的治疗特征的抗体的结构变体 |
US20120128703A1 (en) * | 2005-03-11 | 2012-05-24 | Kamen Barton A | Aminopterin Dosage Forms and Methods for Inflammatory Disorders |
CN102791260A (zh) * | 2009-12-04 | 2012-11-21 | 生维医药科技有限公司 | 低氧诱导因子抑制剂的用途 |
CN103146646A (zh) * | 2013-02-22 | 2013-06-12 | 浙江大学 | 一种动员间充质干细胞的制剂及分离方法 |
US20130236453A1 (en) * | 2012-03-12 | 2013-09-12 | The Ohio State University | Methods and Compositions for Modulating Acute Graft-versus-Host Disease using miR-155 Specific Inhibitors |
EP2691515A2 (en) * | 2011-03-31 | 2014-02-05 | President and Fellows of Harvard College | A unique population of regulatory t cells that regulate tissue regeneration and wound healing |
CN104363924A (zh) * | 2012-03-16 | 2015-02-18 | 约翰霍普金斯大学 | 用于递送hif-1抑制剂的控制释放调配物 |
CN108495619A (zh) * | 2015-11-10 | 2018-09-04 | 儿研所儿童医学中心 | 棘霉素制剂及其制备方法和使用方法 |
Family Cites Families (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7521431B2 (en) * | 2002-11-01 | 2009-04-21 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions and methods for siRNA inhibition of HIF-1 alpha |
US20040241856A1 (en) * | 2003-02-12 | 2004-12-02 | Irm Llc, A Delaware Limited Liability Company | Methods and compositions for modulating stem cells |
US7682828B2 (en) | 2003-11-26 | 2010-03-23 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Methods for reprogramming somatic cells |
US7629128B2 (en) * | 2004-08-30 | 2009-12-08 | Prolx Pharmaceuticals Corp. | Methods of identifying respondents to hypoxia inducible factor 1-α inhibitors |
US20090227032A1 (en) | 2005-12-13 | 2009-09-10 | Kyoto University | Nuclear reprogramming factor and induced pluripotent stem cells |
US8278104B2 (en) | 2005-12-13 | 2012-10-02 | Kyoto University | Induced pluripotent stem cells produced with Oct3/4, Klf4 and Sox2 |
WO2010008486A2 (en) | 2008-06-24 | 2010-01-21 | Parkinsons Institute | Pluripotent cell lines and methods of use thereof |
AU2010327998B2 (en) | 2009-12-10 | 2015-11-12 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | TAL effector-mediated DNA modification |
WO2011146607A2 (en) | 2010-05-18 | 2011-11-24 | President And Fellows Of Harvard College | Stable reprogrammed cells |
ES2575605T3 (es) | 2010-12-31 | 2016-06-29 | Universität Für Bodenkultur Wien | Método de generación de células madre pluripotentes inducidas y células diferenciadas |
WO2012116111A1 (en) | 2011-02-22 | 2012-08-30 | Sanford-Burnham Medical Research Institute | METHOD AND COMPOUNDS FOR GENERATION OF iPSCs |
DK2800811T3 (en) | 2012-05-25 | 2017-07-17 | Univ Vienna | METHODS AND COMPOSITIONS FOR RNA DIRECTIVE TARGET DNA MODIFICATION AND FOR RNA DIRECTIVE MODULATION OF TRANSCRIPTION |
EP2904103B8 (en) | 2012-10-01 | 2020-03-11 | Taipei Veterans General Hospital | Method for preparing induced pluripotent stem cells and its applications |
US8697359B1 (en) | 2012-12-12 | 2014-04-15 | The Broad Institute, Inc. | CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products |
WO2015006725A2 (en) | 2013-07-12 | 2015-01-15 | Cedars-Sinai Medical Center | Generation of induced pluripotent stem cells from normal human mammary epithelial cells |
EP3083684A1 (en) * | 2013-12-06 | 2016-10-26 | NovImmune SA | Anti-tlr4 antibodies and methods of use thereof |
-
2016
- 2016-08-18 US US15/753,901 patent/US10898522B2/en active Active
- 2016-08-18 CN CN201680061243.3A patent/CN108135941B/zh active Active
- 2016-08-18 WO PCT/US2016/047595 patent/WO2017031341A1/en active Application Filing
- 2016-08-18 CA CA2995582A patent/CA2995582A1/en active Pending
- 2016-08-18 EP EP16837853.7A patent/EP3337491A4/en active Pending
-
2018
- 2018-11-27 HK HK18115164.8A patent/HK1256099A1/zh unknown
Patent Citations (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1270630A (zh) * | 1997-07-21 | 2000-10-18 | 塞鲁斯公司 | 处理白细胞的方法、白细胞组合物及其应用方法 |
WO2006084210A2 (en) * | 2005-02-04 | 2006-08-10 | Regents Of The University Of California, San Diego | Hif modulating compounds and methods of use thereof |
US20120128703A1 (en) * | 2005-03-11 | 2012-05-24 | Kamen Barton A | Aminopterin Dosage Forms and Methods for Inflammatory Disorders |
US20070212360A1 (en) * | 2006-01-17 | 2007-09-13 | Denko Nicholas C | Modulation of mitochondrial oxygen consumption for therapeutic purposes |
CN101269088A (zh) * | 2007-03-23 | 2008-09-24 | 中山大学 | 用于预防与治疗慢性移植物抗宿主病的干细胞制剂 |
CN101687019A (zh) * | 2007-04-24 | 2010-03-31 | 迪亚米德治疗股份公司 | 用于治疗自身免疫性疾病和癌症的药物和方法 |
CN101743473A (zh) * | 2007-06-22 | 2010-06-16 | 北海道公立大学法人札幌医科大学 | 移植物抗宿主疾病的检查及治疗方法 |
CN102159243A (zh) * | 2008-07-21 | 2011-08-17 | 免疫医疗公司 | 用于改良的治疗特征的抗体的结构变体 |
US20110113496A1 (en) * | 2009-11-09 | 2011-05-12 | Shultz Leonard D | Transgenic non-human animal and methods for stem cell engraftment |
CN102791260A (zh) * | 2009-12-04 | 2012-11-21 | 生维医药科技有限公司 | 低氧诱导因子抑制剂的用途 |
EP2691515A2 (en) * | 2011-03-31 | 2014-02-05 | President and Fellows of Harvard College | A unique population of regulatory t cells that regulate tissue regeneration and wound healing |
US20130236453A1 (en) * | 2012-03-12 | 2013-09-12 | The Ohio State University | Methods and Compositions for Modulating Acute Graft-versus-Host Disease using miR-155 Specific Inhibitors |
CN104363924A (zh) * | 2012-03-16 | 2015-02-18 | 约翰霍普金斯大学 | 用于递送hif-1抑制剂的控制释放调配物 |
CN103146646A (zh) * | 2013-02-22 | 2013-06-12 | 浙江大学 | 一种动员间充质干细胞的制剂及分离方法 |
CN108495619A (zh) * | 2015-11-10 | 2018-09-04 | 儿研所儿童医学中心 | 棘霉素制剂及其制备方法和使用方法 |
Non-Patent Citations (6)
Title |
---|
DEHE KONG等: "Echinomycin, a Small-Molecule Inhibitor of Hypoxia-Inducible Factor-1 DNA-Binding Activity", 《CANCER RES》 * |
MATTHEW B. GREENBLATT等: "Graft versus Host Disease in the Bone Marrow, Liver and Thymus Humanized Mouse Model", 《PLOS ONE》 * |
YAN LIU等: "Treatment of Graft-versus-Host Disease by Echinomycin in a New Humanized Mouse Model", 《BIORXIV》 * |
YUSHI YAO等: "HIF-1α inhibitor echinomycin reduces acute graft-versus-host disease and preserves graft-versus-leukemia effect", 《JOURNAL OF TRANSLATIONAL MEDICINE》 * |
王敬俭等: "靶向缺氧诱导因子-1的抗肿瘤药物研究进展", 《药学学报》 * |
王栋等: "移植物抗宿主病和移植物抗肿瘤效应分离的研究进展 ", 《中国实验血液学杂志》 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108103027A (zh) * | 2018-02-02 | 2018-06-01 | 中国医学科学院血液病医院(血液学研究所) | 高效率血细胞重编程同时实现基因编辑的方法 |
WO2023184818A1 (zh) * | 2022-03-27 | 2023-10-05 | 苏州大学 | 米托蒽醌在制备预防或治疗急性移植物抗宿主病药物中的应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US10898522B2 (en) | 2021-01-26 |
EP3337491A1 (en) | 2018-06-27 |
EP3337491A4 (en) | 2019-04-10 |
CA2995582A1 (en) | 2017-02-23 |
US20180236002A1 (en) | 2018-08-23 |
HK1256099A1 (zh) | 2019-09-13 |
CN108135941B (zh) | 2021-07-27 |
WO2017031341A1 (en) | 2017-02-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Grünewald et al. | Sarcoma treatment in the era of molecular medicine | |
CN108135935A (zh) | 表达pd-l1的造血干细胞及其用途 | |
WO2014190035A2 (en) | Compositions and methods for identification, assessment, prevention, and treatment of cancer using histone h3k27me2 biomarkers and modulators | |
Peng et al. | Tumor‐associated macrophages infiltrate plasmacytomas and can serve as cell carriers for oncolytic measles virotherapy of disseminated myeloma | |
Coronas et al. | Calcium channels in adult brain neural stem cells and in glioblastoma stem cells | |
Yin et al. | Protective effects of CXCR3/HO‑1 gene‑modified BMMSCs on damaged intestinal epithelial cells: Role of the p38‑MAPK signaling pathway | |
WO2013130499A1 (en) | Compositions and methods for cxcr4 signaling and umbilical cord blood stem cell engraftment | |
CN108135941A (zh) | 用于治疗移植物抗宿主病的组合物和方法 | |
CN109152799A (zh) | 胰腺干细胞及其用途 | |
Chen et al. | Allogeneic stem cell transplantation in the treatment of acute myeloid leukemia: An overview of obstacles and opportunities | |
Oguzoglu | A review of border disease virus infection in ruminants: molecular characterization, pathogenesis, diagnosis and control | |
CN106520805A (zh) | 急性淋巴细胞白血病小鼠模型及建模方法 | |
JP2023548106A (ja) | 修飾された免疫細胞およびその用途 | |
Beltz et al. | Adult neurogenesis: lessons from Crayfish and the Elephant in the Room | |
Mammadli et al. | Inhibition of ITK differentiates GVT and GVHD in allo-HSCT | |
WO2008001379A2 (en) | Activated myeloid cells for promoting tissue repair and detecting damaged tissue | |
Shao et al. | Human muscle stem/progenitor cells are bi-potential adult stem cells | |
Han | Repopulation of a Microglia-Depleted Central Nervous System: Molecular Characterization During Homeostasis and Disease | |
Turk | Tumour pericyte infections potentiate anticancer immunity after viral therapy | |
Johnson | Optimization Of Human Organotypic Brain Slice Cultures for Use as a Novel Model Of Neurohiv | |
Guo et al. | Notch signaling regulates macrophage-mediated inflammation in metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease | |
Pelisenco et al. | EFFECTS OF miR-23b-3p, miR-126-3p, AND GAS5 DELIVERED BY EVs ON BREAST CANCER XENOGRAFTS DEVELOPED IN ZEBRAFISH. | |
Renou et al. | Humanized in vivo bone marrow models orchestrate multi-lineage human hematopoietic cell development | |
Jain | Ubiquitin Specific Protease 6 (USP6): A Novel Hot TME Agonist Inhibits Ewing Sarcoma through Natural Killer Cell Activation | |
Lin et al. | Age-related dysregulation of CXCL9/10 in monocytes is linked to impaired innate immune responses in a mouse model of Staphylococcus aureus osteomyelitis |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 1256099 Country of ref document: HK |
|
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |