CN106520805A - 急性淋巴细胞白血病小鼠模型及建模方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种急性淋巴细胞白血病小鼠模型及建模方法，涉及生物技术领域，制备方法如下：利用带有BCR－ABLP190的逆转录病毒感染经IL－7刺激的造血细胞；并将刺激后的造血细胞回输同系小鼠。具有建模过程简单易行、一步建立ph+ALL小鼠模型的优点。本发明提供的一种急性淋巴细胞白血病小鼠模型将其分选出的BCR－ABL+B细胞二次回输同系小鼠无需照射处理，且表现与首次发病小鼠一致，模型稳定性良好，且具有提高受鼠的均一性，减少照射引起的受鼠意外死亡等风险。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种急性淋巴细胞白血病小鼠模型及建模方法。
背景技术
急性淋巴细胞白血病(ALL)是一种起源于淋巴细胞的B系或T系细胞在骨髓内异常增生的恶性肿瘤性疾病。异常增生的原始细胞可在骨髓聚集并抑制正常造血功能，同时也可侵及骨髓外的组织，如脑膜、淋巴结、性腺、肝等。我国曾进行过白血病发病情况调查，ALL发病率约为0.67/10万。在油田、污染区发病率明显高于全国发病率。ALL儿童期(0～9岁)为发病高峰，可占儿童白血病的70％以上。ALL在成人中占成人白血病的20％左右。
ALL与其他白血病一样，白血病细胞的发生和发展起源在造血祖细胞或干细胞。目前，对于其病因及发病机制尚未完全清楚，但与一些危险因素有关：
大约5％ALL与遗传因素相关，特别是一些有遗传倾向综合征的患者白血病发病率增高；电离照射作为人类白血病诱因之一已被肯定，但机制未明，特别在遭受核照射后的人群ALL发病明显增多。化学物质如苯及苯同类物、烷化剂被认为与人类白血病密切相关；所有ALL细胞都有获得性基因改变，包括染色体数目和结构易位、倒位、缺失、点突变及重复等变化。
Ph染色体作为ALL最常见的染色体异常，已经成为ALL预后不良的标志。近年来随着酪氨酸激酶抑制剂的广泛应用，Ph染色体阳性急性淋巴细胞白血病(Ph+ALL)的疗效已经得到了明显改善，但复发仍然是Ph+ALL治疗失败的主要原因，严重影响患者的长期生存。
因此，积极探索抗Ph+ALL白血病干细胞、研发新型药物以及生物靶向治疗对治疗Ph+ALL具有重要意义，也将会使更多的Ph+ALL患者受益。
动物模型由于能够克服人体试验所导致的社会伦理道德和技术因素的制约，已经成为人类白血病发病机制研究以及新药研发和疗效评价的重要工具。小鼠在遗传学与造血系统等方面和人类十分相似，建立小鼠白血病模型以研究人类白血病的细胞分子生物学特性、生化免疫特征、病理生理改变、发病机制以及药物治疗和预后具有重要意义。因此，建立稳定均一的急性淋巴细胞白血病小鼠模型，是对白血病进行体内功能性研究的基础与关键。
目前采用的急性淋巴细胞白血病小鼠模型的建模方法为将含有BCR－ABLp 190融合基因的逆转录病毒感染经干细胞因子(SCF)、促血小板生成素(TPO)培养的造血干细胞，然后将其回输给同系小鼠，首次建模成慢性粒细胞性白血病(CML)表现，再通过分选CD19+细胞输注经7.5Gy的60Co照射后的同系小鼠，成立ph+ALL小鼠模型。但是该模型的建立需要经历两个阶段，首次成慢性粒细胞性白血病表现，只有通过流式分选出BCR－ABL+B细胞，二次回输经60Co照射的同系小鼠，才能发生Ph+ALL表现，其制备过程复杂。并且该模型建立过程中，二次回输BCR－ABL+B细胞的受鼠，必须接受7.5Gy的60Co照射的预处理，白血病细胞才能植入，受鼠才会发生Ph+ALL，致使受鼠的均一性得不到保证。
因此，开发一种建模过程简单，受鼠均一性良好的急性淋巴细胞白血病小鼠模型，也日益成为研发的重点。
发明内容
本发明的第一个的目的在于提供一种急性淋巴细胞白血病小鼠模型的建模方法，以克服现有技术中存在的制备过程复杂的技术问题。
本发明的第二个目的在于提供一种急性淋巴细胞白血病小鼠模型，以克服现有技术中存在的二次回输受鼠均一性得不到保证技术问题。
本发明提供的一种急性淋巴细胞白血病小鼠模型的建模方法，该方法包括：
利用带有BCR－ABL P190的逆转录病毒感染经IL－7刺激的造血细胞，并将刺激后的造血细胞回输同系小鼠建立所述急性淋巴细胞白血病小鼠模型。
进一步的，所述带有BCR－ABL P190的逆转录病毒为带有BCR－ABLP190的浓缩的逆转录病毒。
进一步的，所述造血细胞为：用生物素标记的抗体标记BABL/c小鼠骨髓细胞经磁性分选获得富含造血细胞的谱系抗原阴性(Lin－)细胞和B细胞。
进一步的，所述IL－7刺激的方法为：
将所述造血细胞置于含10ng/mL IL－7及10％FBS的Opti－MEM培养基中培养过夜。
进一步的，所述感染方法为：
将所述IL－7刺激后的未贴壁细胞接种于retronection包被的24孔板内，加入所述带有BCR－ABL P190的逆转录病毒，37℃1000g离心2h后，常规培养24h。
进一步的，所述同系小鼠为经60Co照射后的BABL/c小鼠。
进一步的，所述60Co照射剂量为7.5Gy。
进一步的，所述回输同系小鼠的方法为：
将所述经7.5Gy的60Co照射后的BABL/c小鼠经尾静脉输注所述带有BCR－ABL P190的逆转录病毒感染经IL－7刺激的造血细胞，同时输注正常BABL/c小鼠骨髓细胞。
进一步的，输注所述带有BCR－ABL P190的逆转录病毒感染后的造血细胞的数量为1×106－1.5×107个，输注所述正常BABL/c小鼠骨髓细胞的数量为5×106个；优选地，输注所述带有BCR－ABL P190的逆转录病毒感染后的造血细胞的数量为2×106个，输注所述正常BABL/c小鼠骨髓细胞的数量为5×106个。
进一步的，本发明还提供了前述建模方法建立的急性淋巴细胞白血病小鼠模型。
本发明提供的一种急性淋巴细胞白血病小鼠模型的建模方法，具有建模过程简单易行、一步建立ph+ALL小鼠模型的优点。
本发明提供的一种急性淋巴细胞白血病小鼠模型，模型稳定，且将其分选出的BCR－ABL+B细胞二次回输同系小鼠无需照射处理，表现与首次发病小鼠一致，具有提高受鼠的均一性，减少照射引起的受鼠意外死亡等风险的优点。
附图说明
图1为实施例1提供的Mig190组小鼠瑞－吉氏染色外周血涂片；
图2A为实施例1提供的Mig190组小鼠外周血白细胞计数的中位数以及对比例1提供的MigR1组小鼠外周血白细胞计数的中位数，对比例2提供的TBI组小鼠外周血白细胞计数的中位数和对比例3提供的未处理组小鼠外周血白细胞计数的中位数；
图2B为实施例1提供的Mig190组小鼠外周血血小板计数的中位数以及对比例1提供的MigR1组小鼠外周血血小板计数的中位数，对比例2提供的TBI组小鼠外周血血小板计数的中位数和对比例3提供的未处理组小鼠外周血血小板计数的中位数；
图2C为实施例1提供的Mig190组小鼠外周血血红蛋白计数的中位数以及对比例1提供的MigR1组小鼠外周血血红蛋白计数的中位数，对比例2提供的TBI组小鼠外周血血红蛋白计数的中位数和对比例3提供的未处理组小鼠外周血血红蛋白计数的中位数；
图3为实施例1提供的Mig190组小鼠的生存率以及对比例1提供的MigR1组小鼠的生存率，对比例2提供的TBI组小鼠的生存率和对比例3提供的未处理组小鼠的生存率；
图4A为对比例1提供的MigR1组小鼠的肝组织病理切片HE染色结果；
图4B为对比例1提供的MigR1组小鼠的脾组织病理切片HE染色结果；
图4C为实施例1提供的Mig190组小鼠的肝组织病理切片HE染色结果；
图4D为实施例1提供的Mig190组小鼠的脾组织病理切片HE染色结果；
图5为定性PCR检测GFP和BCR－ABL融合基因在实施例1提供的Mig190组小鼠外周血，骨髓，肝和脾组织中的扩增水平与对比例3提供的未处理组小鼠外周血，骨髓，肝和脾组织中的扩增水平；
图6为Western Blot检测BCR－ABL蛋白在实施例1提供的Mig190组小鼠外周血，骨髓，肝和脾中的表达水平与对比例3提供的未处理组小鼠外周血，骨髓，肝和脾中的表达水平；
图7为实施例1提供的Mig190组小鼠的免疫表型分析；
图8为BCR－ABL+组小鼠瑞－吉氏染色外周血涂片；
图9为BCR－ABL+组小鼠以及未处理组小鼠的生存率；
图10为BCR－ABL+组小鼠以及未处理组小鼠的脾外观；
图11为BCR－ABL+组小鼠的免疫表型分析。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明人发现，利用带有BCR－ABL P190的逆转录病毒感染经IL－7刺激的造血细胞，并将刺激后的造血细胞回输同系小鼠，能够一步建立所述急性淋巴细胞白血病小鼠模型，操作简单易行，模型稳定，且二次回输同系健康小鼠的受鼠均一性良好。
(1)利用带有BCR－ABL P190的逆转录病毒感染经IL－7刺激的造血细胞
本发明中，带有BCR－ABL P190的逆转录病毒为带有BCR－ABL P190的浓缩的逆转录病毒；
本发明中，所述造血细胞为造血干细胞和造血祖细胞；
造血干细胞为：用生物素标记的抗体标记BABL/c小鼠骨髓细胞经磁性分选获得富含造血干细胞的谱系抗原阴性(Lin－)细胞和B细胞；
造血祖细胞为：用生物素标记的抗体标记BABL/c小鼠骨髓细胞经磁性分选获得富含造血祖细胞的谱系抗原阴性(Lin－)细胞和B细胞；
本发明中，IL－7刺激的方法为：
将所述造血细胞置于含10ng/mL IL－7及10％FBS的Opti－MEM培养基中培养过夜；
本发明中，感染方法为：
将所述IL－7刺激后的未贴壁细胞接种于retronection包被的24孔板内，加入所述带有BCR－ABL P190的逆转录病毒，37℃1000g离心2h后，常规培养24h；
(2)将刺激后的造血细胞回输同系小鼠
本发明中，同系小鼠为经60Co照射后的BABL/c小鼠；
本发明中，60Co照射剂量为7.5Gy；
本发明中，回输同系小鼠的方法为：
将经所述7.5Gy的60Co照射后的BABL/c小鼠经尾静脉输注所述带有BCR－ABL P190的逆转录病毒感染后的造血细胞，同时输注正常BABL/c小鼠骨髓细胞；
本发明中，输注所述带有BCR－ABL P190的逆转录病毒感染后的造血细胞的数量为1×106－1.5×107个，优选数量为2×106个；输注所述正常BABL/c小鼠骨髓细胞的数量为5×106个。
在上述条件下，本发明的建模方法简单易行，应用本发明建模方法建立的急性淋巴细胞白血病小鼠模型二次回输受鼠均一性良好。
本发明的方法可以在传统的市售设备或装置中进行，本领域普通技术人员可以根据本发明方法的条件自行设计所用的设备或装置。所用试剂均为市售，也可以自制。
所用的实验试剂与仪器：
10周龄BABL/c雄鼠购自中国科学院上海实验动物中心；携带BCR－ABL P190融合基因和绿色荧光蛋白(GFP)的逆转录病毒穿梭质粒Mig190和空载体MigR1由宾夕法尼亚大学Pear WS教授惠赠；包装细胞293FT购自Invitrogen公司；细胞因子IL－7购自R&DSysterm公司；逆转录病毒包装系统Retrovirus Packaging Kit Eco(含PGP和P－Eco两种辅助质粒)和Retronectin购自CloneTech公司；生物素标记抗小鼠Ter119、CD11b、Gr－1、CD3ε和荧光素标记抗小鼠CD19、CD45均购自BD公司；逆转录病毒浓缩试剂盒Retro－concentin VirusPrecipitation Solution购自System Biosciences公司；流式细胞分析仪LSRFortessa和分选仪Influx为美国BD公司产品。
实施例1
带有BCR－ABL P190的逆转录病毒的包装：
将Mig190与辅助质粒PGP和P－Eco使用Lipofectamine 2000共转染293FT细胞，转染后72h候收集富含Mig190逆转录病毒颗粒的细胞上清液，0.45μm滤器过滤后按Retro－concentin VirusPrecipitation Solution的说明书进行Mig190病毒的浓缩，浓缩倍数为100倍，具体的Mig190病毒浓缩的方法如下：
经过滤后的上清加入50mL离心管，40mL/管，再加入Retro－concentin VirusPrecipitation Solution，10mL/管，充分混匀，4℃静置24h，1500g×2h×4℃离心，超净台内弃上清，加入2％灭活血清Opti－MEM培养基500μL/管，充分重悬。
将浓缩后的Mig190病毒300μL/管分装，－80℃保存。
小鼠造血细胞的制备：
BABL/c小鼠颈椎脱臼处死，取双侧股骨与胫骨，PBS充分冲洗骨髓腔获得骨髓细胞悬液。用生物素标记的CD3ε、Ter119、CD11b和Gr1抗体标记骨髓细胞，加入Streptavidin标记的磁珠经磁性分选获得富含造血干细胞的谱系抗原阴性(Lin－)细胞和B细胞，与富含造血祖细胞的谱系抗原阴性(Lin－)细胞和B细胞。
将获取的Lin－细胞和B细胞置于在含10ng/mL IL－7及10％FBS的Opti－MEM培养基中培养过夜，然后将未贴壁细胞接种于retronection包被的24孔板内，加入上述制得的浓缩的Mig190逆转录病毒300μL，37℃1000g离心2h后常规培养24h。
BABL/c小鼠经7.5Gy的60Co照射后，每只经尾静脉输注2×106个上述Mig190病毒感染后的Lin－细胞和B细胞，同时输注正常BABL/c小鼠骨髓细胞5×106个。
实施例2
带有BCR－ABL P190的逆转录病毒的包装：
将Mig190与辅助质粒PGP和P－Eco使用Lipofectamine 2000共转染293FT细胞，转染后72h候收集富含Mig190逆转录病毒颗粒的细胞上清液，0.45μm滤器过滤后按Retro－concentin VirusPrecipitation Solution的说明书进行Mig190病毒的浓缩，浓缩倍数为100倍，具体的Mig190病毒浓缩的方法如下：
经过滤后的上清加入50mL离心管，40mL/管，再加入Retro－concentin VirusPrecipitation Solution，10mL/管，充分混匀，4℃静置24h，1500g×2h×4℃离心，超净台内弃上清，加入2％灭活血清Opti－MEM培养基500μL/管，充分重悬。
将浓缩后的Mig190病毒300μL/管分装，－80℃保存。
小鼠造血细胞的制备：
BABL/c小鼠颈椎脱臼处死，取双侧股骨与胫骨，PBS充分冲洗骨髓腔获得骨髓细胞悬液。用生物素标记的CD3ε、Ter119、CD11b和Gr1抗体标记骨髓细胞，加入Streptavidin标记的磁珠经磁性分选获得富含造血干细胞的谱系抗原阴性(Lin－)细胞和B细胞，与富含造血祖细胞的谱系抗原阴性(Lin－)细胞和B细胞。
将获取的Lin－细胞和B细胞置于在含10ng/mL IL－7及10％FBS的Opti－MEM培养基中培养过夜，然后将未贴壁细胞接种于retronection包被的24孔板内，加入上述制得的浓缩的Mig190逆转录病毒300μL，37℃1000g离心2h后常规培养24h。
BABL/c小鼠经7.5Gy的60Co照射后，每只经尾静脉输注1×106个上述Mig190病毒感染后的Lin－细胞和B细胞，同时输注正常BABL/c小鼠骨髓细胞5×106个。
实施例3
带有BCR－ABL P190的逆转录病毒的包装：
将Mig190与辅助质粒PGP和P－Eco使用Lipofectamine 2000共转染293FT细胞，转染后72h候收集富含Mig190逆转录病毒颗粒的细胞上清液，0.45μm滤器过滤后按Retro－concentin VirusPrecipitation Solution的说明书进行Mig190病毒的浓缩，浓缩倍数为100倍，具体的Mig190病毒浓缩的方法如下：
经过滤后的上清加入50mL离心管，40mL/管，再加入Retro－concentin VirusPrecipitation Solution，10mL/管，充分混匀，4℃静置24h，1500g×2h×4℃离心，超净台内弃上清，加入2％灭活血清Opti－MEM培养基500μL/管，充分重悬。
将浓缩后的Mig190病毒300μL/管分装，－80℃保存。
小鼠造血细胞的制备：
BABL/c小鼠颈椎脱臼处死，取双侧股骨与胫骨，PBS充分冲洗骨髓腔获得骨髓细胞悬液。用生物素标记的CD3ε、Ter119、CD11b和Gr1抗体标记骨髓细胞，加入Streptavidin标记的磁珠经磁性分选获得富含造血干细胞的谱系抗原阴性(Lin－)细胞和B细胞，与富含造血祖细胞的谱系抗原阴性(Lin－)细胞和B细胞。
将获取的Lin－细胞和B细胞置于在含10ng/mL IL－7及10％FBS的Opti－MEM培养基中培养过夜，然后将未贴壁细胞接种于retronection包被的24孔板内，加入上述制得的浓缩的Mig190逆转录病毒300μL，37℃1000g离心2h后常规培养24h。
BABL/c小鼠经7.5Gy的60Co照射后，每只经尾静脉输注1.5×107个上述Mig190病毒感染后的Lin－细胞和B细胞，同时输注正常BABL/c小鼠骨髓细胞5×106个。
对比例1
空载体MigR1病毒的包装：
将MigR1与辅助质粒PGP和P－Eco使用Lipofectamine 2000共转染293FT细胞，转染后72h候收集富含MigR1逆转录病毒颗粒的细胞上清液，0.45μm滤器过滤后按Retro－concentin VirusPrecipitation Solution的说明书进行MigR1病毒的浓缩，具体的MigR1病毒浓缩的方法如下：
经过滤后的上清加入50mL离心管，40mL/管，再加入Retro－concentin VirusPrecipitation Solution，10mL/管，充分混匀，4℃静置24h，1500g×2h×4℃离心，超净台内弃上清，加入2％灭活血清Opti－MEM培养基500μL/管，充分重悬。
将浓缩后的空载体MigR1病毒300μL/管分装，－80℃保存。
取实施例1制备的小鼠造血细胞，置于在含10ng/mL IL－7及10％FBS的Opti－MEM培养基中培养过夜，然后将未贴壁细胞接种于retronection包被的24孔板内，加入上述制得的浓缩的空载体MigR1病毒300μL，37℃1000g离心2h后常规培养24h。
BABL/c小鼠经7.5Gy的60Co照射后，每只经尾静脉输注2×106个上述MigR1病毒感染后的Lin－细胞和B细胞，同时输注正常BABL/c小鼠骨髓细胞5×106个。
对比例2
BABL/c小鼠仅经7.5Gy的60Co照射(TBI)，不做其他处理。
对比例3
BABL/c小鼠为未经任何处理的健康BABL/c小鼠(No treated)。
实施例1所建立的小鼠模型的细胞形态
为了观察实施例1提供的Mig190组小鼠的细胞形态，取Mig190组小鼠尾静脉血行血涂片，血涂片瑞－吉氏染色后油镜下观察细胞形态。
结果如图所示，图1为Mig190组小鼠瑞－吉氏染色外周血涂片。
通过图1的外周血涂片可见大量原始和幼稚淋巴细胞。由此可知，Mig190组小鼠已发病，并且为急性淋巴细胞白血病。
实施例1所建立的小鼠模型的外周血白细胞、血小板和血红蛋白计数与对比例1、对比例2和对比例3所建立的小鼠模型的外周血白细胞、血小板和血红蛋白计数的比较
为了检测实施例1提供的Mig190组小鼠外周血白细胞计数、血小板计数和血红蛋白计数以及对比例1提供的MigR1组小鼠外周血白细胞计数、血小板计数和血红蛋白计数，对比例2提供的TBI组小鼠外周血白细胞计数、血小板计数和血红蛋白计数和对比例3提供的未处理组小鼠外周血白细胞计数、血小板计数和血红蛋白计数，分别取本发明实施例1提供的Mig190组小鼠7只、对比例1提供的MigR1组小鼠7只、对比例2提供的TBI组小鼠5只和对比例3提供的未处理组小鼠6只的尾部末梢血，经稀释后运用血液分析仪进行检测。采用SPSSl 16.0数据分析统计软件处理数据，外周血白细胞、血小板计数和血红蛋白值用中位数表示。
结果如图所示，图2A为实施例1提供的Mig190组小鼠外周血白细胞计数的中位数以及对比例1提供的MigR1组小鼠外周血白细胞计数的中位数，对比例2提供的TBI组小鼠外周血白细胞计数的中位数和对比例3提供的未处理组小鼠外周血白细胞计数的中位数；图2B为实施例1提供的Mig190组小鼠外周血血小板计数的中位数以及对比例1提供的MigR1组小鼠外周血血小板计数的中位数，对比例2提供的TBI组小鼠外周血血小板计数的中位数和对比例3提供的未处理组小鼠外周血血小板计数的中位数；图2C为实施例1提供的Mig190组小鼠外周血血红蛋白计数的中位数以及对比例1提供的MigR1组小鼠外周血血红蛋白计数的中位数，对比例2提供的TBI组小鼠外周血血红蛋白计数的中位数和对比例3提供的未处理组小鼠外周血血红蛋白计数的中位数。
通过各组小鼠的外周血临检结果可知，本发明实施例1提供的Mig190组小鼠，在Mig190转导经IL－7培养的Lin－细胞和B细胞输注经7.5Gy的60Co照射的小鼠后10天，小鼠外周血白细胞、血小板计数和血红蛋白值开始恢复，输注后36－44天(中位时间40天)外周血白细胞数增高至40×109/L左右，血小板数降低至100×109/L左右，血红蛋白值降低至50g/L左右。空载体MigR1组小鼠外周血象恢复时间与Mig190组小鼠无明显差异，但随后没有发现明显的血液学异常。TBI组小鼠白细胞数、血小板数和血红蛋白值逐渐降低，至14天左右几乎降为0，小鼠死亡。未处理组小鼠白细胞数、血小板数和血红蛋白值一直维持正常水平。由以上实验对比结果可明确，Mig190组小鼠外周血临检指标符合急性淋巴细胞白血病特点，为急性淋巴细胞白血病发病，而空载体组小鼠未发病，小鼠发病后出现贫血表现，血小板减少，白细胞数增加。
实施例1所建立的小鼠模型的生存率与对比例1、对比例2和对比例3所建立的小鼠模型的生存率的比较
为了统计各组小鼠的生存率，分别取实施例1提供的Mig190组小鼠7只、对比例1提供的MigR1组小鼠7只、对比例2提供的TBI组小鼠5只和对比例3提供的未处理组小鼠5只，观察各组小鼠的状态，并记录生存时间。小鼠生存时间用Kaplan－Meier法表示，生存率的比较采用Log－Rank检验。
结果如图所示，图3为实施例1提供的Mig190组小鼠的生存率以及对比例1提供的MigR1组小鼠的生存率，对比例2提供的TBI组小鼠的生存率和对比例3提供的未处理组小鼠的生存率。
通过实验观察可知，Mig190转导组小鼠移植42－55天(中位时间49天)后小鼠开始出现活动度明显减弱，及耳缘苍白等贫血表现，存活时间为输注Mig190感染的经IL－7培养的Lin－细胞和B细胞后44－77天(中位时间51天)，空载体MigR1组小鼠长期存活(＞100d，P＜0.05，vs Mig190组)，TBI组小鼠16天内全部死亡，未处理组小鼠长期存活。由以上实验对比结果可明确，Mig190组小鼠100％发病，且发病时间在42－55天(中位时间49天)，存活时间为44－77天(中位时间51天)；空载体组小鼠与未处理组小鼠未发病；TBI组小鼠接受7.5Gy的60Co照射后16天内全部死亡，说明受鼠的照射剂量已达致死量。
实施例1所建立的小鼠模型的肝、脾组织病理切片与对比例1所建立的小鼠模型的肝、脾组织病理切片的比较
为了对比实施例1提供的Mig190组小鼠的肝、脾组织病理切片HE染色结果与对比例1提供的MigR1组小鼠的肝、脾组织病理切片HE染色结果，将Mig190组小鼠的肝脾与MigR1组小鼠的肝脾分别用4％甲醛溶液固定，石蜡包埋切片，切片厚为5um，HE染色，光学显微镜下观察。
结果如图所示，图4A为对比例1提供的MigR1组小鼠的肝组织病理切片HE染色结果，图4B为对比例1提供的MigR1组小鼠的脾组织病理切片HE染色结果，图4C为实施例1提供的Mig190组小鼠的肝组织病理切片HE染色结果，图4D为实施例1提供的Mig190组小鼠的脾组织病理切片HE染色结果。
通过图4A、图4B、图4C与图4D的对比可知，Mig190组小鼠病理切片肝脏白血病细胞灶性浸润，肝窦内可见大量白血病细胞浸润，脾脏结构破坏，可见大量白血病细胞浸润；空载体MigR1组小鼠肝脾正常，未见白血病细胞浸润。由以上实验对比结果可明确，Mig190组小鼠发病，而空载体组小鼠未发病，小鼠发病后会发生肝脏、脾脏的白血病细胞浸润。
实施例1所建立的小鼠模型的GFP和BCR－ABL融合基因的扩增水平与对比例3所建立的小鼠模型的GFP和BCR－ABL融合基因的扩增水平的比较
为了检测GFP和BCR－ABL融合基因在实施例1提供的Mig190组小鼠与对比例3提供的未处理组小鼠外周血(PB)，骨髓(BM)，肝(Liver)和脾(Spleen)组织中的扩增水平，取Mig190组小鼠的外周血、骨髓、肝、脾单个核细胞，TRIzol法提取RNA后反转录合成cDNA，Taq酶扩增目的基因GFP、BCR－ABL和GADPH检测mRNA；取未处理组小鼠的外周血、骨髓、肝、脾单个核细胞，TRIzol法提取RNA后反转录合成cDNA，Taq酶扩增目的基因GFP、BCR－ABL和GADPH检测mRNA。其中，基因BCR－ABL所使用的上游引物为
5’－GACTGCAGCTCCAATGAGAAC－3’(SEQ ID NO 1)，下游引物为
5’－GTTTGGGCTTCACACCATTCC－3’(SEQ ID NO 2)；基因GFP所使用的上游引物为5’－CATGGCCACAACCATGGTGAG－3’(SEQ ID NO 3)，下游引物为5’－CTTGTACAGCTCGTCCATGC－3’(SEQ ID NO 4)；基因GAPDH所使用的上游引物为5’－GGTTGTCTCCTGCGACTTCA－3’(SEQ ID NO 5)，下游引物为5’－CCTGTTGCTGTAGCCGTAT－3’(SEQ ID NO 6)。
结果如图所示，图5为定性PCR检测GFP和BCR－ABL融合基因在实施例1提供的Mig190组小鼠外周血，骨髓，肝和脾组织中的扩增水平与对比例3提供的未处理组小鼠外周血，骨髓，肝和脾组织中的扩增水平。
通过图5可知，Mig190组小鼠外周血单个核细胞、骨髓细胞、肝、脾，PCR扩增出BCR－ABL融合基因、GFP基因，分别在200bp、750bp处可见特异性条带，其相对分子质量与预先设计的基因片段大小一致，而在对照组中则无此片段存在。由以上实验对比结果可明确，分子水平验证Mig190组小鼠已发病，为BCR－ABL阳性，而空载体组小鼠未发病。
实施例1所建立的小鼠模型的BCR－ABL蛋白和c－Abl蛋白的表达水平与对比例3所建立的小鼠模型的BCR－ABL蛋白和c－Abl蛋白的表达水平的比较
为了检测BCR－ABL蛋白和c－Abl蛋白和在实施例1提供的Mig190组小鼠与对比例3提供的未处理组小鼠外周血(PB)，骨髓(BM)，肝(Liver)和脾(Spleen)中的表达水平，收集Mig190组小鼠的外周血、骨髓、肝、脾单个核细胞，提取总蛋白并测定蛋白含量，经变性、电泳、湿转NC膜、封闭、一抗(兔抗BCR－ABL、兔抗c－abl和兔抗GFP)、二抗(兔抗)孵育后检测BCR－ABL、c－Abl和GFP的表达；收集未处理组小鼠的外周血、骨髓、肝、脾单个核细胞，提取总蛋白并测定蛋白含量，经变性、电泳、湿转NC膜、封闭、一抗(兔抗BCR－ABL、兔抗c－abl和兔抗GFP)、二抗(兔抗)孵育后检测BCR－ABL、c－Abl和GFP的表达。
结果如图所示，图6为Western Blot检测BCR－ABL蛋白在实施例1提供的Mig190组小鼠外周血，骨髓，肝和脾中的表达水平与对比例3提供的未处理组小鼠外周血，骨髓，肝和脾中的表达水平。
通过图6可知，Mig190组小鼠表达190KD大小的BCR－ABL融合蛋白，未处理组仅表达130KD大小的c－Abl蛋白。由以上实验对比结果可明确，Mig190组小鼠已发病，并为BCR－ABL阳性，而空载体组未发病。
实施例1所建立的小鼠模型的免疫表型分析
为了进一步明确实施例1提供的Mig190组小鼠发生的急性白血病免疫学分型，将Mig190组小鼠EDTA抗凝下尾静脉取血，外周血加入荧光标记的CD19和CD45抗体，裂解红细胞并洗涤后，使用GFP和CD45设门，在LSRFortessa流式细胞仪上用CellQuest Pro软件控制数据采集和分析，每个样本至少获取100000个细胞。
结果如图所示，图7为Mig190组小鼠的免疫表型分析。其中，第一张图(左上图)为所获细胞的结果图，第二张图(右上图)为以GFP射门的结果图，第三张图(左下图)为以CD45射门的结果图，第四张图(右下图)为GFP+CD45+群细胞为CD19强阳性的结果图。
通过图7的结果显示，Mig190组小鼠在44天后，外周血白血病细胞(GFP+CD45+)此群原始细胞为CD19强阳性，结合形态学符合B－ALL的特点。由以上结果可知，Mig190组小鼠发病，为Ph+B－ALL。
结合免疫表型、PCR检测结果以及上述各组实验所得实验结果可知，本发明实施例1提供的Mig190组小鼠白血病模型在表型、分子生物学特征以及病理特征上与Ph+ALL类似，能够作为Ph+ALL模型。
BCR－ABL+组小鼠模型的细胞形态
待实施例1提供的Mig190组小鼠出现外周血象明显异常后，取小鼠脾、骨髓和外周血制备单细胞悬液，Influx流式分选CD45+GFP+CD19+细胞，此细胞为BCR－ABL阳性B细胞，分选纯度＞99％。BCR－ABL+组小鼠为未经任何处理的BABL/c小鼠，尾静脉输注流式分选的5×106个CD45+GFP+CD19+细胞；未处理组小鼠为对比例3提供的未经任何处理的健康BABL/c小鼠。
为了观察BCR－ABL+组小鼠的细胞形态，取BCR－ABL+组小鼠尾静脉血行血涂片，血涂片瑞－吉氏染色后油镜下观察细胞形态。
结果如图所示，图8为BCR－ABL+组小鼠瑞－吉氏染色外周血涂片。
通过图8的外周血涂片可见大量原始和幼稚淋巴细胞，在BCR－ABL+组小鼠输注CD45+GFP+CD19+细胞的第十天均出现原幼淋巴细胞。由此可知，BCR－ABL+组小鼠已发病，并且为急性淋巴细胞白血病。
BCR－ABL+组小鼠模型的生存率与未处理组小鼠模型的生存率的比较
为了统计BCR－ABL+组小鼠以及未处理组小鼠的生存率，分别取BCR－ABL+组小鼠6只和未处理组小鼠5只，记录两组小鼠的生存时间。小鼠生存时间用Kaplan－Meier法表示，生存率的比较采用Log－Rank检验。
结果如图所示，图9为BCR－ABL+组小鼠的生存率以及未处理组小鼠的生存率。
通过实验观察可知，在20天内BCR－ABL+组小鼠全部死亡；未处理组小鼠长期存活(＞60d，P＜0.05，vs BCR－ABL+组)。由以上实验对比结果可明确，BCR－ABL+组小鼠100％发病，未处理组小鼠未发病。
BCR－ABL+组小鼠模型的脾外观与未处理组小鼠模型的脾外观的比较
为了对比BCR－ABL+组小鼠以及未处理组小鼠的脾外观，取BCR－ABL+组濒死小鼠的脾脏进行病理巨检。
结果如图所示，图10为BCR－ABL+组小鼠以及未处理组小鼠的脾外观。
通过实验观察可知，BCR－ABL+组小鼠的脾脏明显增大。由此可知，BCR－ABL+组小鼠已发病。
BCR－ABL+组小鼠模型的免疫表型分析
为了进一步明确BCR－ABL+组小鼠发生的急性白血病免疫学分型，将BCR－ABL+组小鼠EDTA抗凝下尾静脉取血，外周血加入荧光标记的CD19和CD45抗体，裂解红细胞并洗涤后，使用GFP和CD45设门，在LSRFortessa流式细胞仪上用CellQuest Pro软件控制数据采集和分析，每个样本至少获取100000个细胞。
结果如图所示，图11为BCR－ABL+组小鼠的免疫表型分析。其中，第一张图(左图)为所获细胞的结果图，第二张图(右图)为以GFP射门的结果图。
通过图11的结果显示，BCR－ABL+组小鼠在移植10天后，外周血白血病细胞(GFP+CD45+)此群原始细胞为CD19强阳性。由以上结果可知，BCR－ABL+组小鼠发病，为Ph+B－ALL。
结合BCR－ABL+组小鼠模型的细胞形态、生存率、脾外观以及免疫表型分析的各项结果显示，BCR－ABL+组小鼠符合B－ALL的特点，与首次建模表现一致，仍为原发病。由此可明确，实施例1提供的Mig190组模型小鼠稳定性高，且BCR－ABL+组小鼠发病无需照射，具有操作方便，受鼠均一性良好的优点，可用以更加精确的评估药物的疗效和使用剂量。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 徐州医科大学
<120> 急性淋巴细胞白血病小鼠模型及建模方法
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gactgcagct ccaatgagaa c 21
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cctgttgctg tagccgtat 19
Claims (10)
1.一种急性淋巴细胞白血病小鼠模型的建模方法，其特征在于：该方法包括：
利用带有BCR－ABL P190的逆转录病毒感染经IL－7刺激的造血细胞，并将刺激后的造血细胞回输同系小鼠建立所述急性淋巴细胞白血病小鼠模型。
2.根据权利要求1所述的建模方法，其特征在于，所述带有BCR－ABL P190的逆转录病毒为带有BCR－ABL P190的浓缩的逆转录病毒。
3.根据权利要求1所述的建模方法，其特征在于，所述造血细胞为：用生物素标记的抗体标记BABL/c小鼠骨髓细胞经磁性分选获得富含造血细胞的谱系抗原阴性(Lin－)细胞和B细胞。
4.根据权利要求1所述的建模方法，其特征在于，所述IL－7刺激的方法为：
将所述造血细胞置于含10ng/mL IL－7及10％FBS的Opti－MEM培养基中培养过夜。
5.根据权利要求1所述的建模方法，其特征在于，所述感染方法为：
将所述IL－7刺激后的未贴壁细胞接种于retronection包被的24孔板内，加入所述带有BCR－ABL P190的逆转录病毒，37℃1000g离心2h后，常规培养24h。
6.根据权利要求1所述的建模方法，其特征在于，所述同系小鼠为经60Co照射后的BABL/c小鼠。
7.根据权利要求6所述的建模方法，其特征在于，所述60Co照射剂量为7.5Gy。
8.根据权利要求1－7任一项所述的建模方法，其特征在于，所述回输同系小鼠的方法为：
将所述经7.5Gy的60Co照射后的BABL/c小鼠经尾静脉输注所述带有BCR－ABL P190的逆转录病毒感染经IL－7刺激的造血细胞，同时输注正常BABL/c小鼠骨髓细胞。
9.根据权利要求8所述的建模方法，其特征在于，输注所述带有BCR－ABL P190的逆转录病毒感染后的造血细胞的数量为1×106－1.5×107个，输注所述正常BABL/c小鼠骨髓细胞的数量为5×106个；优选地，输注所述带有BCR－ABL P190的逆转录病毒感染后的造血细胞的数量为2×106个，输注所述正常BABL/c小鼠骨髓细胞的数量为5×106个。
10.权利要求9所述的建模方法建立的急性淋巴细胞白血病小鼠模型。
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| CN109097334A (zh) * | 2018-08-01 | 2018-12-28 | 贵州师范学院 | Ph+急性B淋巴细胞白血病KQBL-84细胞株及其构建方法和应用 |
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| CN111713450B (zh) * | 2020-05-26 | 2022-07-12 | 上海交通大学医学院 | 一种慢性粒细胞白血病的pdx模型的建立方法 |
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