CN111713450A - 一种慢性粒细胞白血病的pdx模型的建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开慢性粒细胞白血病的PDX模型的建立方法，涉及动物模型技术领域。具体包括：筛选慢性期和急变期的CML临床患者，分离骨髓中单个核细胞，移植入半致死剂量辐照的NSG小鼠，针对急变期在移植前还需要进行CD34标记筛选干/祖细胞。通过在移植后4‑16周外周血中人来源的细胞植入比率，判断模型是否建立成功。本发明建立的系列CML PDX小鼠模型的肿瘤生长特征和细胞遗传学异常与来源患者相同，对于研究CML发病和急变的机制，以及筛选针对不同阶段CML的靶点和小分子药物提供了重要的临床前研究模型，具有较好的推广应用价值。
Description
技术领域
本发明属于动物模型技术领域，具体涉及一种慢性粒细胞白血病的PDX 模型的建立方法。
背景技术
慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是一种起源于造血干细胞、以原始粒细胞极度增生为特征的造血系统恶性肿瘤，约占白血病患者总数的15％。临床表现以贫血、原始粒细胞极度增多和肝脾肿大为主。CML 具有鲜明的细胞遗传学特征，90％的病例骨髓细胞含有费城(Ph)染色体，即t：(9，22)(q34.1；q11)染色体易位。该易位使位于9号染色体上的ABL基因和位于22号染色上的BCR基因发生融合，表达BCR-ABL融合蛋白。该融合蛋白BCR-ABL具有持续活化的酪氨酸激酶活性，通过进一步活化RAS、 PI3K等下游信号通路，促进细胞的增殖和存活。
CML发病率随着年龄增长而增长，从小于20岁的年轻人群的0.2/10万到80岁人群的10.0/10万。随着我国人口老龄化进程加速，我国CML发病率逐年增加，已成为影响我国老年人健康的恶性肿瘤之一。自从2001年针对BCR-ABL的小分子酪氨酸激酶抑制剂(tyrosinekinase inhibitor，TKI)伊马替尼被美国FDA正式批准上市以来，CML的预后得到了显著提高，多数可以获得长期缓解。然而，伊马替尼的原发和继发耐药一直是困扰CML治疗的难题，虽然已有第二代TKI(达莎替尼和尼洛替尼)和第三代TKI的开发和使用，新的耐药病例仍然不断出现。
另外，部分新诊断的CML慢性期患者会进展成一个疾病性质更具侵袭性，临床症状更为复杂，病情更加危险的阶段，并对先前控制慢性期的治疗方案包括伊马替尼反应不佳，称为CML的加速期和急变期。其中，约75％的CML急变患者表达髓系白血病表型(急髓变)，约25％的患者表达淋系白血病表型(急淋变)。遗憾的是，由于缺乏针对急变期的有效治疗手段，髓系急变患者中位生存期仅为6个月，淋系急变患者约12个月。因此，探究CML 尤其是急变CML的机制以及开发新型靶向治疗途径的有其必要性和重要临床意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种慢性粒细胞白血病的PDX模型的建立方法，针对不同发病阶段的慢性粒细胞白血病(CML)PDX模型发病明确，并能稳定传代，细胞遗传学改变与病人一致，基本覆盖了CML从慢性期到急变期整个过程，是研究CML发病机制和筛选靶向药物的理想平台，可以满足各个血液学实验基地和制药公司的需求，将会产生巨大的经济效益和社会效益。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种慢性粒细胞白血病的PDX模型的建立方法，所述 PDX模型包括慢性期模型和急变期模型；
所述慢性期模型的建立方法，包括以下步骤：(1)采集慢性期的慢性粒细胞白血病患者骨髓样本，分离所述骨髓样本中的单个核细胞；
(2)将所述单个核细胞接种于NSG小鼠中，所述NSG小鼠在所述接种前经X-ray放射线辐照；
所述急变期模型的建立方法，包括以下步骤：(a)采集急变期的慢性粒细胞白血病患者骨髓样本，分离所述骨髓样本中的单个核细胞后，标记CD34 抗体；
(b)将标记CD34后的阳性细胞分选后接种于NSG小鼠中，所述NSG 小鼠在所述接种前经X-ray放射线辐照。
优选的，步骤(1)或步骤(a)中采用Ficoll分离所述单个核细胞。
优选的，步骤(2)或步骤(b)所述接种的方式为小鼠尾静脉注射。
优选的，步骤(2)所述接种的量为1×107细胞/只。
优选的，步骤(b)所述接种的量为1×106细胞/只。
优选的，在步骤(2)或步骤(b)所述接种后，还包括对建立的慢性期模型进行检测，所述检测的方法包括：在所述接种后4、8、12和16周依次采血通过流式细胞术进行检测；对所述流式细胞术检测阳性样本再进行脾脏和肝脏病理切片检测、荧光原位杂交检测和定量PCR检测BCR-ABL表达。
优选的，在建立所述PDX模型后，还包括对所述PDX模型的传代。
优选的，所述传代包括：以建立的所述PDX模型为P1代，将Pn代模型小鼠的骨髓和脾脏细胞接种到新的NSG小鼠体内，得Pn+1代模型小鼠，其中n为1～5的整数。
相比于现有技术，本发明技术方案具有以下有益效果：本发明针对CML 不同发病阶段建立CML PDX模型，各阶段模型发病明确，覆盖了CML从慢性期到急变期整个过程，并能稳定从P1代传代至P3。尤其是P2-P3代小鼠发病均一，可用于大规模药物筛选实验，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为慢性期CML的PDX模型建立及传代P2示意图；
图2为慢性期CML的PDX建模成功的检测指标，其中A表示脾脏显著增大，B表示流式细胞观察脾脏(SP)和骨髓(BM)中hCD45+hCD34+细胞比例超过90％；C表示骨髓(BM)中hCD45+hCD33+细胞比例超过90％；
图3为急变期CML的PDX模型建立及传代P2示意图；
图4为急淋变CML的PDX建模成功的检测指标，其中A表示脾脏显著增大；B表示流式细胞术观察脾脏(SP)和骨髓(BM)中hCD45+细胞比例超过90％(并且主要为hCD33-的淋系细胞)；C表示FISH检测BCR-ABL 信号强阳性；
图5为急髓变的P1和P2代CML的PDX建模成功的检测指标。
具体实施方式
本发明提供了一种慢性粒细胞白血病的PDX模型的建立方法，所述 PDX模型包括慢性期模型和急变期模型；
所述慢性期模型的建立方法，包括以下步骤：(1)采集慢性期的慢性粒细胞白血病患者骨髓样本，分离所述骨髓样本中的单个核细胞；
(2)将所述单个核细胞接种于NSG小鼠中，所述NSG小鼠在所述接种前经X-ray放射线辐照；
所述急变期模型的建立方法，包括以下步骤：(a)采集急变期的慢性粒细胞白血病患者骨髓样本，分离所述骨髓样本中的单个核细胞后，标记CD34 抗体；
(b)将标记CD34后的阳性细胞接种于NSG小鼠中，所述NSG小鼠在所述接种前经X-ray放射线辐照。
利用本发明所述建立方法建立的PDX模型包括慢性期模型和急变期模型；所述慢性期模型的建立方法，优选如图1所示，包括以下步骤：(1)采集慢性期的慢性粒细胞白血病患者骨髓样本，分离所述骨髓样本中的单个核细胞；(2)将所述单个核细胞接种于NSG小鼠中，所述NSG小鼠在所述接种前经X-ray放射线辐照。
在本发明中，步骤(1)所述骨髓样本优选通过穿刺得到，所述骨髓样本的量优选为10～20mL。本发明分离所述骨髓样本中的单个核细胞，所述分离的方式优选为Ficoll法。本发明对所述Ficoll法分离单个核细胞的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规技术即可。本发明在分离得到所述单个核细胞后，优选还包括采用生理盐水洗涤，然后以0.5～2mL生理盐水重悬。
本发明将所述单个核细胞进行接种前，优选还包括将利用生理盐水重悬后的细胞计数(细胞数大于1×107)后，再重悬于0.2～1mLPBS缓冲溶液中，接种于用X-ray放射线辐照的NSG小鼠小鼠体内，此为Passage 1(P1)代鼠。本发明所述接种的方式优选为小鼠尾静脉注射，所述接种的量优选为1 ×107细胞/只。
本发明在所述接种后，优选还包括对建立的慢性期模型(P1)进行检测，所述检测的方法优选包括：在所述接种后4、8、12和16周依次采血通过流式细胞术进行检测；对所述流式细胞术检测阳性样本再进行脾脏和肝脏病理切片检测、荧光原位杂交检测和定量PCR检测BCR-ABL表达。
本发明所述流式细胞术优选的包括在所述接种后4～16周每隔一周取小鼠尾静脉血300-500μL，裂解红细胞后用PBS重悬制成有核细胞悬液，标记 humanCD45(hCD45)，mouseCD45(mCD45)、hCD34、hCD33共4个抗体组合，流式检测人细胞比率，以动态监测细胞植入情况。
本发明建立完成的PDX模型在4～16周之间，P1代小鼠会出现突然活动度明显下降或死亡。死亡小鼠立即取肝脏脾脏、肝脏和骨髓组织，肝脏脾脏送病理切片进行HE染色检测白血病细胞浸润情况；脾脏和骨髓组织裂解红细胞后制成单细胞悬液，标记humanCD45(hCD45)，mouse CD45(mCD45)、 hCD34、hCD33共4个抗体组合，流式检测以明确小鼠是否发生白血病。
本发明所述荧光原位杂交检测优选的包括将上述骨髓单细胞悬液用荧光原位杂交(Fluorescence In Situ Hybridization，FISH)和定量PCR检测，以明确细胞是否表达BCR-ABL融合基因。
经过上述检测后，本发明将所述PDX模型进行传代，所述传代优选包括将明确已发病的P1小鼠的骨髓或者脾脏制成单细胞悬液，注射于用X-ray 放射线辐照的NSG小鼠体内，接种量为2×106/只，接种方式为经鼠尾静脉注射。此为P2代小鼠。
本发明在所述P2代小鼠注射后4～16周优选每隔一周取小鼠尾静脉血 300-500μL，裂解红细胞后用PBS重悬制成有核细胞悬液，标记 humanCD45(hCD45)，mouse CD45(mCD45)、hCD34、hCD33共4个抗体组合，流式检测人细胞比率，以动态监测细胞植入情况。
本发明所述P2代小鼠在注射后4-16周之间，P2代小鼠会出现突然活动度明显下降或死亡。死亡小鼠立即取肝脏脾脏、肝脏和骨髓组织，肝脏脾脏送病理切片进行HE染色检测白血病细胞浸润情况；脾脏和骨髓组织裂解红细胞后制成单细胞悬液，标记hCD45，mCD45、hCD34、hCD33共4个抗体组合，流式检测以明确小鼠是否发生白血病。
本发明优选将明确已发病的P2小鼠的骨髓或者脾脏制成单细胞悬液，注射于用X-ray放射线辐照的NSG小鼠体内，接种量为2×106/只，接种方式为经鼠尾静脉注射。此为P3代小鼠。
本发明所述急变期模型的建立方法，优选如图3所示，包括以下步骤： (a)采集急变期的慢性粒细胞白血病患者骨髓样本，分离所述骨髓样本中的单个核细胞后，标记CD34抗体；(b)将标记CD34后的阳性细胞接种于NSG小鼠中，所述NSG小鼠在所述接种前经X-ray放射线辐照。
本发明所述急变期优选的包括急淋变和/或急髓变，所述采集的骨髓样本的量优选为10～20mL。本发明在得到所述样本后，优选利用Ficoll液分离出单个核细胞，再采用生理盐水洗涤，然后以0.5～2mL PBS缓冲液重悬。本发明所述标记CD34抗体优选的包括向上述重悬后的细胞中加入兔抗人CD34 抗体，冰上孵育20分钟后PBS洗涤，然后用流式细胞仪分选出CD34+造血干/祖细胞。本发明所述接种前优选还包括将所述CD34+造血干/祖细胞计数后重悬于0.2～1mL PBS中，注射于小鼠体内；接种量为1×106/只，接种方式为经鼠尾静脉注射。
本发明所述接种后，优选还包括对建立的慢性期模型进行检测，所述检测的方法包括：在所述接种后4、8、12和16周依次采血通过流式细胞术进行检测；对所述流式细胞术检测阳性样本再进行脾脏和肝脏病理切片检测、荧光原位杂交检测和定量PCR检测BCR-ABL表达。
本发明所述流式细胞术优选的包括在所述接种后4～16周每一周取小鼠尾静脉血300～500μL，裂解红细胞后用PBS重悬制成有核细胞悬液，标记 humanCD45(hCD45)，mouseCD45(mCD45)、hCD34、hCD33共4个抗体组合，流式检测人细胞比率，以动态监测细胞植入情况。
本发明在所述接种后4～16周之间，P1代小鼠会出现突然活动度明显下降或死亡。死亡小鼠立即取肝脏脾脏、肝脏和骨髓组织，肝脏脾脏送病理切片进行HE染色检测白血病细胞浸润情况；脾脏和骨髓组织裂解红细胞后制成单细胞悬液，标记humanCD45(hCD45)，mouse CD45(mCD45)、hCD34、 hCD33共4个抗体组合，流式检测以明确小鼠是否发生白血病。
本发明优选将明确已发病的P1小鼠的骨髓或者脾脏制成单细胞悬液，注射于用X-ray放射线辐照的NSG小鼠体内，接种量为2×106/只，接种方式为经鼠尾静脉注射。此为P2代小鼠。
本发明在所述P2代小鼠注射后4～12周每隔一周取小鼠尾静脉血 300-500μL，裂解红细胞后用PBS重悬制成有核细胞悬液，标记 humanCD45(hCD45)，mouse CD45(mCD45)、hCD34、hCD33共4个抗体组合，流式检测人细胞比率，以动态监测细胞植入情况。
本发明在所述P2代小鼠注射后4～12周之间，P2代小鼠会出现突然活动度明显下降或死亡。死亡小鼠立即取肝脏脾脏、肝脏和骨髓组织，肝脏脾脏送病理切片进行HE染色检测白血病细胞浸润情况；脾脏和骨髓组织裂解红细胞后制成单细胞悬液，标记hCD45、mCD45、hCD34、hCD33共4个抗体组合，流式检测以明确小鼠是否发生白血病。
本发明优选将明确已发病的P2小鼠的骨髓或者脾脏制成单细胞悬液，注射于用X-ray放射线辐照的NSG小鼠体内，接种量为2×106/只，接种方式为经鼠尾静脉注射。此为P3代小鼠。
下面结合实施例对本发明提供的一种慢性粒细胞白血病的PDX模型的建立方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一、CML患者样本处理：
1.采集患者10～25mL骨髓，利用Ficoll分离液进行离心，分离患者单个核细胞，用生理盐水洗涤两遍单个核细胞后，以0.5mL体积生理盐水重悬，细胞计数。
2.针对急变期患者，进行CD34+分选：(2)取步骤(1)细胞中加入兔抗人 CD34抗体，冰上孵育20分钟后PBS洗涤多余抗体，用0.5mL PBS重悬后用流式细胞仪分选出CD34+造血干/祖细胞；分选所得细胞计数后重悬于 0.2～1mL PBS中，经尾静脉注射于小鼠体内，接种细胞数为1×106/只。
二、NSG小鼠饲养及接种：
1.小鼠饲养条件：8周龄雌性NSG小鼠，SPF级条件下饲养。室温 18～25℃，相对湿度40％-60％，饲料及饮水经高压灭菌。每周至少更换2次垫料。
2.NSG小鼠接种前辐照：取5只小鼠进行称重，记录，用半致死剂量 (1.25Gy)X光辐照。
3.NSG小鼠接种：辐照后6～12h尾静脉注射上述细胞，数量为1×107个单个核(慢性期)或1×106个CD34+干/祖细胞(急变期)。注射细胞前细胞先用0.2μm滤膜过滤，重悬于PBS中，注射体积为200μL。
三、造模成功评判指标：
1.一般指标：接种后，观察小鼠有无活动减少、消瘦、弓背、腹泻、脱毛、偏瘫等表现。每周给小鼠称重并记录。
2.尾静脉采血：注射后4-16周每一周取小鼠尾静脉血300～500μL，用红细胞裂解液裂解20分钟，PBS洗一遍，加入500μL PBS重悬制成有核细胞悬液。标记hCD45，mCD45、hCD34、hCD33共4个抗体组合，流式检测人细胞比率，以判断是否移植接种成功。
3.发病小鼠各组织器官检查：小鼠于活动度明显下降立即处死或死亡后立即解剖，采集小鼠的外周血、骨髓、脾脏、肝脏，拍照记录脏器尺寸。脾脏和骨髓细胞悬液标记hCD45，mCD45、hCD34、hCD33共4个抗体组合，用流式细胞术分析免疫表型，明确植入细胞比例。脾脏和肝脏组织采用常规固定、石蜡包埋、切片，然后用苏木素-伊红染色法(HE染色)进行染色，观察白血病细胞浸润情况。植入成功的判定为P1代小鼠。
慢性期CML的PDX建模成功的检测指标如图2所示，其中A表示脾脏显著增大，B表示流式细胞观察脾脏(SP)和骨髓(BM)中hCD45+hCD34+细胞比例超过90％；C表示骨髓(BM)中hCD45+hCD33+细胞比例超过90％；表明建模成功。
急淋变CML的PDX建模成功的检测指标如图4所示，其中A表示脾脏显著增大；B表示流式细胞术观察脾脏(SP)和骨髓(BM)中hCD45+细胞比例超过90％(并且主要为hCD33-的淋系细胞)；C表示FISH检测BCR-ABL 信号强阳性；表明建模成功。
三、CML细胞连续接种传代及遗传学检测：
1.P1代CML细胞的保种冻存：将P1代NSG小鼠的骨髓和脾脏制成单细胞悬液，用胎牛血清+10％DMSO长期冻存保存于液氮中。
2.CML细胞连续接种传代：传代前将P1代NSG小鼠的骨髓和脾脏迅速于42℃水浴中解冻，PBS洗涤，经鼠尾静脉注射于用X-ray放射线辐照过的NSG小鼠体内，细胞数为2×106/只。
3.P2代发病的评判：观察指标同P1代，包括接种后动态尾静脉取血和发病后的各脏器的病理和流式指标。
4.P2代基因检测：采集P2代发病小鼠骨髓，制成单细胞悬液，进行FISH 和定量PCR检测，以明确细胞是否表达CML诊断的金指标BCR-ABL。具体步骤包括：
(1)RNA抽提分析
细胞按照Invitrogen公司TRIzol试剂盒提供的方法提取细胞的总RNA，使用RT-PCR试剂盒(Promega，Madison，WI，USA)反转录成cDNA。实时定量PCR在ABI PRISM 7900实时定量PCR仪(Perkin-Elmer，Torrance，CA) 中进行，10μL反应体系如下：2×SYBR Green PCRMaster Mixture(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)5μL，β-actin或者目的基因产物正反向引物各0.05μL，cDNA 1μL，ddH2O 3.8μL。反应程序如下：50℃ 2分钟(UNG 孵育)，95℃ 10分钟(热启动PCR)，重复如下循环40次：95℃ 30秒，60℃ 60秒，最后在60℃建立溶解曲线。以上所有的反应和检测都在覆盖了透明封口膜的MicroAmp optical 96孔反应板上进行。所有PCR反应都采用3个样本，并计算反应实验误差的标准偏差。所有的数据都采用ABI PRISM SDS 2.0软件分析。这种仪器配套的软件计算出的阈值threshold cycle(Ct)表示达到一定数值的荧光强度(florescence intensity)所需的循环数。应用“ΔCt法”，β-actin用以矫正不同反应中所有的RNA的量。
(2)FISH检测BCR-ABL融合基因按照吉玛公司FISH试剂盒说明书步骤进行。
5.P2代PDX的传代：将P2代小鼠脾脏和骨髓细胞液氮冻存，接种步骤同2，将P2代细胞传至P3-P5代。从P2代开始，造模所需细胞数量明显减少，均为2×106/只以下；同时，发病时间明显缩短，表现为P1-P2平均为 2个月，P3-P5平均为1个月。同批次小鼠发病时间相差小于2天，脾脏和肝脏浸润情况高度一致。
急髓变的P1和P2代CML的PDX建模成功的检测指标如图5所示，包括脾脏显著增大和流式细胞术观察骨髓(BM)中hCD45+细胞比例超过90％，表明造模成功。
本发明提供了一组慢性粒细胞白血病不同发病阶段的PDX模型的建立方法，可用于CML发病及急变机制研究和大规模药物筛选实验，具有良好的应用前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种慢性粒细胞白血病的PDX模型的建立方法，其特征在于，所述PDX模型包括慢性期模型和急变期模型；
所述慢性期模型的建立方法，包括以下步骤：(1)采集慢性期的慢性粒细胞白血病患者骨髓样本，分离所述骨髓样本中的单个核细胞；
(2)将所述单个核细胞接种于NSG小鼠中，所述NSG小鼠在所述接种前经X-ray放射线辐照；
所述急变期模型的建立方法，包括以下步骤：(a)采集急变期的慢性粒细胞白血病患者骨髓样本，分离所述骨髓样本中的单个核细胞后，标记CD34抗体；
(b)将标记CD34后的阳性细胞分选后接种于NSG小鼠中，所述NSG小鼠在所述接种前经X-ray放射线辐照。
2.根据权利要求1所述建立方法，其特征在于，步骤(1)或步骤(a)中采用Ficoll分离所述单个核细胞。
3.根据权利要求1所述建立方法，其特征在于，步骤(2)或步骤(b)所述接种的方式为小鼠尾静脉注射。
4.根据权利要求3所述建立方法，其特征在于，步骤(2)所述接种的量为1×107细胞/只。
5.根据权利要求3所述建立方法，其特征在于，步骤(b)所述接种的量为1×106细胞/只。
6.根据权利要求1所述建立方法，其特征在于，在步骤(2)或步骤(b)所述接种后，还包括对建立的慢性期模型进行检测，所述检测的方法包括：在所述接种后4-16周每周依次采血通过流式细胞术进行检测；对所述流式细胞术检测阳性样本再进行脾脏和肝脏病理切片检测、荧光原位杂交检测和定量PCR检测BCR-ABL表达。
7.根据权利要求1所述建立方法，其特征在于，在建立所述PDX模型后，还包括对所述PDX模型的传代。
8.根据权利要求7所述建立方法，其特征在于，所述传代包括：以建立的所述PDX模型为P1代，将Pn代模型小鼠的骨髓和脾脏细胞接种到新的NSG小鼠体内，得Pn+1代模型小鼠，其中n为1～5的整数。
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