CN112243954B - 一种粒细胞肿瘤的pdx模型建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种粒细胞肿瘤的PDX模型建立方法，涉及动物模型技术领域。本发明针对不同FAB分型的AML建立的PDX模型，发病明确，并能稳定传代，细胞遗传学改变与病人一致，是研究AML发病机制和筛选靶向药物的理想平台，可以满足各个血液学实验基地和制药公司的需求，将会产生巨大的经济效益和社会效益。利用本发明所述方法建立了M2a、M4和M5三种AML的PDX模型，且发病明确，并能稳定传代，均一性好，可用于大规模药物筛选实验，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于动物模型技术领域，具体涉及一种粒细胞肿瘤的PDX模型建立方法。
背景技术
急性粒细胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一种由于造血细胞分化受阻导致的幼稚粒细胞极度增生的血液系统恶性肿瘤，占全部急性白血病的80％左右。AML随年龄增加而发病率增高，诊断时中位年龄67岁，30岁以下发病率为1/10万、75岁以上则高达17/10万。随着我国人口老龄化进程加速，AML正成为影响我国成年人尤其是老年人健康的恶性肿瘤之一。
AML根据细胞形态学和组织化学特征可分为M0-M7几种不同的亚型。除M3型以外，AML的临床治疗一直以阿糖胞苷等细胞毒化疗药物为主，但化疗的远期效果不理想，复发率高，长期无病生存率低于30％。近年来，随着对AML发病机制研究的深入，一些新型靶向疗法已成功应用于临床，比如2018年获得FDA批准的针对FLT3激酶的抑制剂Xospata(gilteritinib)使FLT3突变阳性复发性或难治性AML成人患者显著获益。但是，仍有相当一部分AML患者缓解后短期内复发并对这些药物发生耐药。因此，深入研究AML发病机制并开发新型靶向治疗途径有其必要性和临床意义。
PDX是将患者的原位肿瘤接种到免疫缺陷小鼠体内的一种临床前研究模型。与传统的皮下接种肿瘤细胞株成瘤的小鼠模型相比,PDX模型能更好地反映原发病人的病理特性以及基因表达，更准确地预测临床疗效，因此已成为近年来研究疾病发病机制及新的抗肿瘤药物筛选中不可或缺的工具。大量研究表明以PDX模型开展临床II期试验，能够极大的提高新药的临床通过率，缩短研发周期，减少研发费用。因此，2016年美国FDA停止肿瘤细胞系作为抗肿瘤药物的药效评价，将PDX模型列为药物反应检测的必备环节，使得PDX模型在肿瘤及药物研究中的作用日益凸显。目前，小鼠PDX模型技术主要集中在肠癌、胰腺癌、乳腺癌等实体瘤，商品化的PDX小鼠模型大大推进了实体瘤研究靶向新药物的研发进程。然而，血液系统恶性肿瘤PDX小鼠模型的构建，受限于细胞数少、植入率低等原因，尚未有系统的PDX模型应用。虽然国内外部分实验室已经构建了包括AML、急性淋巴细胞白血病等PDX小鼠模型，并且已有极个别商品化，但大多肿瘤类型单一，不能代表AML复杂的遗传学和生物学表型；并且价格昂贵，大大增加了新药研发的成本，阻碍我国抗血液肿瘤药物研发的进程。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种粒细胞肿瘤的PDX模型建立方法，针对不同FAB分型的AML建立的PDX模型发病明确，并能稳定传代，细胞遗传学改变与病人一致，是研究AML发病机制和筛选靶向药物的理想平台，可以满足各个血液学实验基地和制药公司的需求，将会产生巨大的经济效益和社会效益。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种粒细胞肿瘤的PDX模型建立方法，包括以下步骤：(1)分离急性粒细胞白血病患者骨髓的单个核细胞，将分离得到的单个核细胞标记CD34抗体后，筛选CD34阳性细胞CD34+造血干/祖细胞；所述急性粒细胞白血病包括M2a、M4和M5型；
(2)将所述CD34+造血干/祖细胞注射入经X-ray放射线辐照的小鼠尾静脉内，得P1代PDX小鼠；
(3)将所述P1代PDX小鼠的骨髓和脾脏细胞移植入新的NSG小鼠体内，得P2代PDX小鼠；将P2代PDX小鼠的骨髓或脾脏细胞继续传代至P5代，得急性粒细胞白血病的PDX模型。
优选的，步骤(1)所述CD34抗体包括兔抗人CD34抗体。
优选的，步骤(2)中利用半致死辐照剂量辐照NSG小鼠。
优选的，向所述小鼠的尾静脉内注射所述CD34+造血干/祖细胞的量为2×106个细胞/只。
优选的，在步骤(2)所述注射后8～32周每隔一周取血进行流式细胞术检测，将检测CD45+阳性率大于5％的个体命名为P1代PDX小鼠。
优选的，在得所述P1代PDX小鼠后，还包括对脾脏和肝脏进行病理切片以及基因检测。
优选的，步骤(3)所述移植和传代时，骨髓和脾脏细胞的注射量均为1×106个细胞/只。
优选的，在步骤(3)所述传代过程中，还包括流式细胞术检测、脾脏和肝脏的病理切片和基因检测。
相比于现有技术，本发明至少具有以下有益效果：利用本发明所述方法建立了M2a、M4和M5三种AML PDX模型，且发病明确，并能稳定传代，均一性好，可用于大规模药物筛选实验，具有良好的应用前景。经过本发明实施例的验证，得到的AML PDX模型从P2代开始，造模所需细胞数量明显减少，均未分选单个核1×106/只；同时，发病时间明显缩短，表现为P1～P2代平均为2个月，P3～P5代平均为1个月，同批次小鼠发病时间相差小于2天，脾脏和肝脏浸润情况高度一致。
附图说明
图1为AML的PDX模型建立示意图，患者骨髓细胞经Ficoll分离后取单个核细胞，标记CD34抗体后用流式细胞仪分选CD34+白血病干/组细胞，然后经过尾静脉注射入经半致死剂量辐照的NSG小鼠体内，鉴定发病小鼠的表型，成功建立P1代PDX小鼠模型后，传代建立P2代PDX；
图2为M2a型AML的PDX模型P1-P2代建模成功的检测指标，包括脾脏显著增大(A)、流式细胞观察骨髓中hCD45+细胞比例超过40％(B)，表明造模和传代成功；
图3为M4型AML的PDX模型P1代建模成功的检测指标，包括脾脏照片(A)、流式细胞术(B)观察骨髓中hCD45+hCD33+细胞比例为19.15％，表明造模成功；
图4为M4型AML的PDX模型P2代建模成功的检测指标，包括脾脏显著增大(A)、流式细胞术(B)观察骨髓中hCD45+细胞比例超过25％，并且超过90％为hCD33+的髓系细胞，表明传代成功；
图5为M5型AML的PDX模型P1代建模成功的检测指标，包括脾脏显著增大(A)、流式细胞观察骨髓中hCD45+细胞比例(B)，表明造模和传代成功。
具体实施方式
本发明提供了一种粒细胞肿瘤的PDX模型建立方法，包括以下步骤：(1)分离急性粒细胞白血病患者骨髓的单个核细胞，将分离得到的单个核细胞标记CD34抗体后，筛选CD34阳性细胞CD34+造血干/祖细胞；所述急性粒细胞白血病包括M2a型、M4型和M5型；
(2)将所述CD34+造血干/祖细胞注射入经X-ray放射线辐照的小鼠尾静脉内，得P1代PDX小鼠；
(3)将所述P1代PDX小鼠的骨髓和脾脏细胞移植入新的NSG小鼠体内，得P2代PDX小鼠；将P2代PDX小鼠的骨髓或脾脏细胞继续传代至P5代，得急性粒细胞白血病的PDX模型。
本发明优选按照图1所示流程建立所述模型，分离急性粒细胞白血病患者骨髓的单个核细胞，将分离得到的单个核细胞标记CD34抗体后，筛选CD34阳性细胞CD34+造血干/祖细胞；所述急性粒细胞白血病包括M2a型、M4型和M5型。本发明优选采集急性粒细胞白血病患者骨髓，更优选通过骨髓穿刺的方式采集。本发明将搜书采集得到的骨髓样品进行分离，获得单个核细胞，所述分离优选采用Ficoll液分离。本发明对所述Ficoll液分离的具体方法并没有特殊限定。本发明优选将分离得到的单个核细胞利用PBS重悬后再进行CD34抗体标记，所述CD34抗体优选包括兔抗人CD34抗体。本发明优选将标记CD34抗体的单个核细胞在冰上孵育20分钟后PBS洗涤，然后用流式细胞仪分选出CD34+造血干/祖细胞。
得CD34+造血干/祖细胞后，本发明将所述CD34+造血干/祖细胞注射入经X-ray放射线辐照的小鼠尾静脉内，得P1代PDX小鼠。本发明优选将分选所得的CD34+造血干/祖细胞计数后重悬于PBS中，注射于小鼠体内。本发明所述小鼠优选为8周龄雌性NSG小鼠，在所述注射前对所述小鼠进行X-ray放射线辐照，所述X-ray放射线辐照的剂量优选为半致死辐照剂量，更优选为1.25Gy。本发明优选在所述X-ray放射线辐照后6～12h，尾静脉注射所述CD34+干/祖细胞，且注射量优选为2×106个细胞/只。
本发明在所述注射后8～32周优选还包括每隔一周取血进行流式细胞术检测，将检测CD45+阳性率大于5％的个体命名为P1代PDX小鼠，在得所述P1代PDX小鼠后，优选还包括对脾脏和肝脏进行病理切片以及基因检测，本发明对所述具体的检测方法并没有特殊限定，利用本领域的常规技术手段进行检测即可。本发明在进行所述流式细胞术检测时，优选的每次提取小鼠尾静脉血300～500μL，裂解红细胞后用PBS重悬制成有核细胞悬液，标记humanCD45(hCD45)，mouse CD45(mCD45)、hCD34、hCD33共4个抗体组合，流式检测人细胞比率，以动态监测细胞植入情况，如图2、3、5所示。
本发明在所述注射后16～24周之间，P1代小鼠会出现突然活动度明显下降或死亡，死亡小鼠立即取肝脏脾脏、肝脏和骨髓组织，肝脏脾脏送病理切片进行HE染色检测白血病细胞浸润情况；脾脏和骨髓组织裂解红细胞后制成单细胞悬液，标记humanCD45(hCD45)，mouse CD45(mCD45)、hCD34、hCD33共4个抗体组合，流式检测以明确小鼠是否发生白血病。本发明所述基因检测优选为将骨髓单细胞悬液去除小鼠细胞后送基因检测，以明确植入细胞是否表达和来源病人同样的基因变异。
得P1代PDX小鼠后，本发明将所述P1代PDX小鼠的骨髓和脾脏细胞移植入新的NSG小鼠体内，得P2代PDX小鼠；将P2代PDX小鼠的骨髓或脾脏细胞继续传代至P5代，得急性粒细胞白血病的PDX模型。本发明优选将明确已发病的P1代PDX小鼠的骨髓或者脾脏制成单细胞悬液，注射于用X-ray放射线辐照的NSG小鼠体内，接种量优选为2×106个细胞/只，接种方式优选为经鼠尾静脉注射。本发明在所述鼠尾静脉注射注射后4～12周每隔一周进行流式细胞术检测，所述流式细胞术检测的方法优选与上述方案相同，在此不再赘述。
本发明优选将明确已发病的P2代PDX小鼠的骨髓或者脾脏制成单细胞悬液，注射于用X ray放射线辐照的NSG小鼠体内，接种量为2×106/只，接种方式为经鼠尾静脉注射，此为P3代PDX小鼠，而后重复上述操作，一直到得到P5代PDX小鼠。
下面结合实施例对本发明提供的一种粒细胞肿瘤的PDX模型建立方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
AML-M2a小鼠PDX模型的建立
一、AML患者样本处理：
1.采集患者20mL骨髓，利用Ficoll分离液进行离心，分离患者单个核细胞，用生理盐水洗涤两遍单个核细胞后，以0.5mL生理盐水重悬，细胞计数。
2.CD34+分选：向步骤1细胞中加入兔抗人CD34抗体，冰上孵育20分钟后PBS洗涤多余抗体，用0.5mL PBS重悬后用流式细胞仪分选出CD34+造血干/祖细胞；分选所得细胞计数后重悬于1mL PBS中，经尾静脉注射于小鼠体内，接种细胞数为2×106/只。
二、NSG小鼠饲养及接种：
1.小鼠饲养条件：8周龄雌性NSG小鼠，SPF级条件下饲养。室温20℃，相对湿度50％，饲料及饮水经高压灭菌。每周至少更换2次垫料。
2.NSG小鼠接种前辐照：取5只小鼠进行称重，记录，用半致死剂量(1.25Gy)X光辐照。
3.NSG小鼠接种：辐照后12h尾静脉注射上述细胞，数量为2×106个CD34+干/祖细胞。注射细胞前细胞先用0.2μm滤膜过滤，重悬于PBS中，注射体积为200μL。
三、造模成功评判指标：
1.一般指标：接种后，观察小鼠有无活动减少、消瘦、弓背、腹泻、脱毛、偏瘫等表现。每周给小鼠称重并记录。
2.尾静脉采血：注射后8～32周每隔一周取小鼠尾静脉血200μL，用红细胞裂解液裂解20分钟，PBS洗一遍，加入500μLPBS重悬制成有核细胞悬液。标记hCD45，mCD45、hCD34、hCD33共4个抗体组合，流式检测人细胞比率，以判断是否移植接种成功。
3.发病小鼠各组织器官检查：小鼠于活动度明显下降立即处死或死亡后立即解剖，采集小鼠的外周血、骨髓、脾脏、肝脏，拍照记录脏器尺寸。脾脏和骨髓细胞悬液标记hCD45，mCD45、hCD34、hCD33共4个抗体组合，用流式细胞术分析免疫表型，明确植入细胞比例。脾脏和肝脏组织采用常规固定、石蜡包埋、切片，然后用苏木素-伊红染色法(HE染色)进行染色，观察白血病细胞浸润情况。植入成功的判定为P1代小鼠，如图2所示，脾脏显著增大(图2中A)、流式细胞观察骨髓中hCD45+细胞比例超过40％(图2中B)，表明造模和传代成功。
实施例2
AML-M4小鼠PDX模型的建立
P1代M4小鼠PDX模型构建步骤一、二同“实施例1”，采用骨髓细胞来源于M4患者。后续增加以下步骤：
三、AML细胞连续接种传代及遗传学检测：
1.P1代AML细胞的保种冻存：将P1代NSG小鼠的骨髓和脾脏制成单细胞悬液，用胎牛血清+10％DMSO长期冻存保存于液氮中。
2.AML细胞连续接种传代：传代前将P1代NSG小鼠的骨髓和脾脏迅速于42℃水浴中解冻，PBS洗涤，经鼠尾静脉注射于用X-ray放射线辐照过的NSG小鼠体内，细胞数为2×106/只。
3.P2代发病的评判：观察指标同P1代，包括接种后动态尾静脉取血和发病后的各脏器的病理和流式指标。
4.P2代基因检测：采集P2代发病小鼠骨髓，制成单细胞悬液，用美天妮Mouse CellDepletionKit去除小鼠细胞，富集CD45+的人细胞后进行基因检测。具体步骤包括，将分离的人细胞用天根生化的TIANamp Genomic DNA Kit血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒进行DNA抽提，定量后送武汉思泰得医学检验所进行基因检测，检测结果与病人诊断结果进行比对，确定变异基因是否一致。
5.P2代PDX的传代：将P2代小鼠脾脏和骨髓细胞液氮冻存，接种步骤同2，将P2代细胞传至P3-P5代。从P2代开始，造模所需细胞数量明显减少，均为2×106/只以下；同时，发病时间明显缩短，表现为P1-P2平均为2个月，P3-P5平均为1个月。同批次小鼠发病时间相差小于2天，脾脏和肝脏浸润情况高度一致。
结果如图3和图4所示，其中图3为M4型AML的PDX模型P1代建模成功的检测指标，包括脾脏照片(A)、流式细胞术(B)观察骨髓中hCD45+hCD33+细胞比例为19.15％，表明造模成功；图4为M4型AML的PDX模型P2代建模成功的检测指标，包括脾脏显著增大(A)、流式细胞术(B)观察骨髓中hCD45+细胞比例超过25％，并且超过90％为hCD33+的髓系细胞，表明传代成功。
实施例3
AML-M5小鼠PDX模型的建立
M5小鼠PDX模型构建步骤一、二、三同“实施例2”，采用骨髓细胞来源于M5患者。M5型AML的PDX模型P1代建模成功的检测指标如图5所示，脾脏显著增大(图5中A)、流式细胞观察骨髓中hCD45+细胞比例(图5中B)，表明造模和传代成功。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种粒细胞肿瘤的PDX模型建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)分离急性粒细胞白血病患者骨髓的单个核细胞，将分离得到的单个核细胞标记CD34抗体后，筛选CD34阳性细胞CD34+造血干/祖细胞；所述急性粒细胞白血病包括M2a、M4和M5型；
(2)将所述CD34+造血干/祖细胞注射入经X-ray放射线辐照的NSG小鼠尾静脉内，得P1代PDX小鼠；向所述小鼠的尾静脉内注射所述CD34+造血干/祖细胞的量为2×106个细胞/只；所述注射后8～32周每隔一周取血进行流式细胞术检测，将检测CD45+阳性率大于5％的个体命名为P1代PDX小鼠；
(3)将所述P1代PDX小鼠的骨髓和脾脏细胞移植入新的NSG小鼠体内，得P2代PDX小鼠；将P2代PDX小鼠的骨髓或脾脏细胞继续传代至P5代，得急性粒细胞白血病的PDX模型；所述移植和传代时，骨髓和脾脏单个核细胞的注射量均为1×106个细胞/只。
2.根据权利要求1所述建立方法，其特征在于，步骤(1)所述CD34抗体包括兔抗人CD34抗体。
3.根据权利要求1所述建立方法，其特征在于，步骤(2)中利用半致死辐照剂量辐照NSG小鼠。
4.根据权利要求1所述建立方法，其特征在于，在得所述P1代PDX小鼠后，还包括对脾脏和肝脏进行病理切片以及基因检测。
5.根据权利要求1所述建立方法，其特征在于，在步骤(3)所述传代过程中，还包括流式细胞术检测、脾脏和肝脏的病理切片和基因检测。
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