CN103087978A - 从造血器官、血液中获得干细胞的试剂盒及其应用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种从造血器官、血液中获得干细胞的试剂盒及其应用方法，包括试剂瓶、试剂、盛放试剂瓶的盒体及使用说明书，本发明的试剂盒(1)包括细胞前处理试剂A、细胞负向选择试剂B、细胞正向选择试剂C，分别盛放于细胞前处理试剂瓶(2)、细胞负向选择试剂瓶(3)、细胞正向选择试剂瓶(4)内。本发明的试剂盒还可包括洗脱糖细胞洗涤剂D，盛放于细胞洗涤试剂瓶(5)内，根据本发明获得的干细胞可不带任何外来标记，不仅可应用于实验室研究，也可以直接用于临床使用。本发明的试剂盒使用简便、易操作、可工业化生产，实用有效，可直接用于人类及其他哺乳动物的来源的造血器官、血液标本中的干细胞获得，应用前景广泛。

Description

从造血器官、血液中获得干细胞的试剂盒及其应用方法
技术领域
本发明涉及一种用于从造血器官、血液标本中获得干细胞的细胞处理试剂盒及其应用方法。
背景技术
成体干细胞是另外一类具有修复、再生、替代能力的未分化细胞类型，通常位于特定的小生境内，在受到外界损伤后，其会动员或者产生新的干细胞，通过增殖、分化的方式形成新的功能细胞，从而调节组织和器官细胞数量保持动态平衡。成体干细胞的多能性特点首先在骨髓中得到的成体干细胞得以发现。造血干细胞是目前研究的最为详尽的成体干细胞之一，在过去近40年里一直是干细胞领域研究的主题，它们在体内进行自我更新的细胞分裂，在单细胞水平分化为所有的造血成份，并在机能上使得重度骨髓抑制的动物和人的骨髓得以恢复。
目前，人们的研究发现造血干细胞主要来自于骨髓、脐带血、外周血、经血，造血干细胞已被用于移植治疗多种血液病、糖尿病及并发症、某些恶性实体肿瘤、免疫缺陷等疾病的有效措施之一。动物实验及临床应用方面已证明造血干细胞移植对重建或改善骨髓造血功能有较好疗效。干细胞在脐带血的比例相对比较高，约1.5％左右，骨髓中的比例非常低，约0.1～0.5％，而造血干细胞在外周血中的比例更低，研究者采用多个分子表面标志，如使用Thy-1low或FLK2-Lineage-Sca-l+c-Kit+可用于分选出造血干细胞群(Christemsen JL等，PNAS，2001.98：14541-14546；Uchida N等，Experimental hematology，1996.24：649-659)，用CD14+免疫磁性分离的方法从外周血筛选新的干细胞群(PCT/055950干细胞的提纯、识别及用途)；采用CD34、CD133作为造血干细胞的标志物用于识别及分选造血干细胞或祖细胞(Civin等，J Immunol 1984；133：157-165；Kobari L等，J Hematother Stem Cell Res.2001；10：273-281)。又有研究者发现分化程度较低的干/祖细胞通常表达一些ATP结合转运蛋白(ATP-binding cassette，ABC)，细胞常利用ATP能量把外来的有毒物质从细胞内排出，以达到保护自身的目的，被称为侧群筛选法(side population，SP)。早期Goodell等(Goodell等，J Exp Med，1996.183(4)：1796-1806)研究发现，当用Hoechst33342对骨髓细胞进行染色后，造血干细胞具有很强的排出染液的能力。
然而，最近的证据表明，CD34在细胞膜上的表达不总是与干细胞活性相关，已有研究发现在人中获得的干细胞缺乏CD34表达，但具有完全的重建能力的高度静止的干细胞群体(Dao等，Leukemia 2000；14：773-776)，进一步显示，与缺乏这些表型标志物的成体骨髓和脐带血来源的干细胞相比，造血祖细胞的多能分化潜能有限(Jiang YY等，Nat Cell Bio1.2004；6：532-539)，而侧群筛选法虽然有其价值，但不足之处是，实验重复性比较差，当从实体组织中筛选出SP细胞后，由于获得活细胞的能力有限，当此类细胞进行移植后可能影响他们的重塑能力。
因此，人们一直关注发现其他方法，以替代或补充现有的分离富集干细胞和原始祖细胞的群体。
如申请号为CN200610114475.9的中国专利，提供了一种用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒，虽然该试剂盒使用方便，成本低廉的优点，但其缺点在于：分离的干细胞其数量极少不足以临床有效治疗使用。申请号为CN200610106875.5的中国专利，提供了一种有核细胞体外分离试剂盒及其应用方法及申请号为200810089682.2的中国专利，提供了一种分离单个核细胞的方法和装置，但经此分离后的细胞绝大多数为淋巴细胞，这样导致细胞中实际能用于治疗的干细胞占少数，极大的影响临床疗效，增加患者的经济负担。再如申请号为CN200710137781.9的中国专利，提供了一种骨髓脐带血干细胞体外分离试剂盒及其应用方法，其缺点在于使用鸡尾酒lin抗体，导致成本大幅度增加，一方面增加患者的经济负担，使其难于接受细胞治疗，且lin抗体给随后的细胞洗涤带来了困难，很难确定其治疗后在人体内发生的变化。
上述分离方法得到包括所有谱系和阶段的造血干和祖细胞和一些晚期前体细胞的干和祖细胞的混合细胞群体，我们定义为“一锅粥”分选法，且干细胞的有效数量很低，这是不利的，因为已显示仅分离CD34+细胞群体中最原始的细胞是有价值的(Askenasy N.等，Current Stem Cell Research and Therapy2006；1：85-94)。另外一个不足方面在于缺少可靠的特异性分子标记物对其进行识别。这些分离的细胞群并不是同质类型的，而是由许多不同分化状态或增殖能力的混合细胞群组成，非常不纯。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中所存在的缺点，为了克服上述方法上的不足及提供进一步相关的优点，本发明所提供的一种用于从啮齿动物、人类或其他哺乳动物来源的造血器官、血液标本中获得干细胞的细胞处理试剂盒及其应用方法，具有使用方便、易操作、可工业化生产、实用有效的优点，应用前景广泛。
本发明提供一种用于从造血器官、血液中获得干细胞的试剂盒及其应用方法，包括盒体、试剂及使用说明书，其中，所述试剂盒(1)包括细胞前处理试剂A、细胞负向选择试剂B、细胞正向选择试剂C，分别盛放于细胞前处理试剂瓶(2)、细胞负向选择试剂瓶(3)、细胞正向选择试剂瓶(4)内，所述细胞负向选择试剂瓶(3)中包含的试剂为化疗药物，细胞正向选择试剂瓶(4)中包含的试剂为凝集素结合物。
其中，所述细胞前处理试剂瓶(2)包含的试剂为红细胞沉淀剂或红细胞裂解液；红细胞沉淀剂为质量浓度为0.1～20％的羟乙基淀粉、明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、羧甲基淀粉的任一一种；红细胞裂解液可选择为氯化铵红细胞裂解液、质量浓度小于0.9％的生理盐水溶液的任一一种；细胞前处理试剂A或可选择泛影酸钠-葡聚糖、HITOPAQUE、Ficoll的任一一种，所述细胞前处理试剂A作用细胞的次数至少为一次。
其中，细胞负向选择试剂瓶(3)中的化疗药物可选择为包括抗生素化疗药物、抗代谢化疗药物、烷化剂化疗药物、激素及内分泌化疗药物、植物化疗药物、亚硝脲类化疗药物、抗体阻断剂化疗药物、门冬酰胺酶、甲基苄肼、草酸铂、铂类、丙亚胺、羟基脲和氨烯咪胺的一种或两种以上的组合。
其中，所述细胞负向选择试剂瓶(3)中试剂接触细胞的时间为小于或等于120小时。
其中，细胞正向选择试剂瓶(4)中所述凝集素可选择为天然的或人工合成的植物凝集素、动物凝集素及其衍生物的一种或两种以上的组合，进一步，所述凝集素的浓度为0.001～30mg/ml。
其中，所述细胞正向选择试剂瓶中所述凝集素的结合物可选择预先与荧光染料、磁性微球或高分子量的生物大分子的任一一种进行结合，形成凝集素结合物。
其中，所述荧光染料可选择为异硫氰酸荧光素(FITC)、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)、藻红蛋白(PE)、Cy系列花菁染料、eflour系列、FL系列、Alexa Flour系列、Alexa、多甲藻黄素叶绿素蛋白(PerCP)及别藻青蛋白(APC)系列的任一一种。
其中，所述与凝集素结合的高分子量的生物大分子的分子量在10000道尔顿(Mw)以上。
其中，所述高分子量的生物大分子可选择为牛血清白蛋白、羟乙基淀粉、明胶、甲基纤维素、羧甲基淀粉、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮的任一一种。
其中，所述细胞正向选择试剂瓶中试剂接触细胞的时间小于或等于120分钟，与细胞孵育的温度选择为小于或等于38℃。
本发明还提供一种试剂盒的应用方法，其包括以下步骤：
(a)所述细胞样本与细胞前处理试剂A接触：如加入红细胞沉淀剂，选择取上清；如加入红细胞裂解液，选择离心后丢弃上清取细胞沉淀；
(b)使经过步骤(a)的所述细胞群与所述细胞负向选择试剂B接触，接触时间小于或等于120小时；
(c)将步骤(b)所得的液体离心，丢弃上清取下层细胞沉淀，之后，用常规缓冲液洗涤细胞；
(d)重复步骤(c)两到三次；
(e)使经过步骤(d)的所述细胞群与所述细胞正向选择试剂C接触，所述凝集素的浓度为0.001～30mg/ml，与所述细胞群接触的时间为小于或等于120分钟，孵育温度为小于或等于38℃；
(f)分离获得凝集素阳性的细胞群：可选择采用荧光活化细胞分选、磁珠分选法或静置沉淀法；
其中，根据本发明的方法或试剂盒获得的所述细胞群随后加入盛放于细胞洗涤试剂瓶(5)内的洗脱糖细胞洗涤剂D用于把所述凝集素结合物从所述获得的细胞上洗脱，从而使得获得的干细胞不带任何外来标记物。
其中，所述细胞来源于啮齿动物、人类或其他哺乳动物的造血器官、血液标本，进一步，所述造血器官、血液选自啮齿动物、人类或其他哺乳动物的骨髓、脾脏、胸腺、胎肝、外周血、脐带血、卵黄囊、胸腺、淋巴结、胸膜及其渗出液样品。
进一步，根据本发明的试剂收集获得的干细胞作为基础、临床与应用研究、组织工程、治疗、药物筛选、修复失去功能的病变组织或器官中的应用。
附图说明
图1用于从造血器官、血液标本中获得干细胞的细胞处理试剂盒组成
该图表明了从造血器官、血液标本中获得干细胞的细胞处理试剂盒的组成，它由试剂瓶、试剂、盒体组成。
所述试剂盒(1)包括细胞前处理试剂A、细胞负向选择试剂B、细胞正向选择试剂C，分别盛放于细胞前处理试剂瓶(2)、细胞负向选择试剂瓶(3)、细胞正向选择试剂瓶(4)内，所述细胞负向选择试剂瓶(3)中包含的试剂为化疗药物，细胞正向选择试剂瓶(4)中包含的试剂为凝集素结合物。进一步，试剂盒还可包括洗脱糖细胞洗涤试剂D，盛放于细胞洗涤试剂瓶(5)内。试剂瓶的封闭盖分别为(6)、(7)、(8)、(9)，可选择为压力、螺丝或其他。
具体实施方式
实施例1
本发明的用于从骨髓标本中获得干细胞的细胞处理试剂盒，它由试剂瓶、试剂、盒体组成。
所述试剂盒(1)包括细胞前处理试剂A、细胞负向选择试剂B、细胞正向选择试剂C，所述细胞前处理试剂A为质量浓度为1～6％的明胶，细胞负向选择试剂B为氟尿嘧啶、阿糖胞苷、卡铂，细胞正向选择试剂C为植物凝集素及其结合物，分别盛放于细胞前处理试剂瓶(2)、细胞负向选择试剂瓶(3)、细胞正向选择试剂(4)内，进一步，所述凝集素为双花扁豆凝集素(DBA)和花生凝集素(PNA)，所述结合物为牛血清白蛋白(BSA)。其中，所述试剂盒(1)还可包括洗脱糖细胞洗涤试剂D，盛放于细胞洗涤试剂瓶(5)内，所述洗脱糖为N-乙酰半乳糖胺、半乳糖。
进一步，所述试剂瓶的封闭盖(6)、(7)选择为压力，试剂瓶的封闭盖(8)和(9)选择为螺丝。
其中，细胞负向选择试剂瓶(3)中化疗药物接触骨髓细胞的时间为96小时。
其中，所述细胞正向选择试剂瓶(4)中所述凝集素的浓度为5mg/ml。进一步，与所述细胞接触的时间为20分钟，孵育的温度为37℃。
进一步，吸取下层沉淀的细胞群，所述细胞再用生理盐水进行洗涤。之后，加入细胞洗涤试剂瓶(5)中的试剂D，孵育30分钟后，4℃条件下离心丢弃上清，再用生理盐水进行重悬。所述获得的细胞群不含任何外来标记。
进一步，所述细胞群随后加入半乳糖、N-乙酰半乳糖胺两种洗脱糖细胞洗涤剂D用于把所述凝集素结合物从所述获得的细胞上洗脱，从而使得获得的造血干细胞不带任何外来标记物。
进一步，所述试剂盒可作用的对象为啮齿动物、人或其他哺乳动物的骨髓细胞群。
其中，所述使用说明书用于说明从骨髓中收集获得干细胞的使用方法。
其中，整个操作过程保持在无菌工作环境中进行操作，其中，内毒素检测含量≤0.5EU/mL表示试剂盒合格。
实施例2
本发明的用于从脐带血标本中获得干细胞的细胞处理试剂盒，它由试剂瓶、试剂、盒体组成。
所述试剂盒(1)包括细胞前处理试剂A、细胞负向选择试剂B、细胞正向选择试剂C，所述细胞前处理试剂A为质量浓度为4～8％的羟乙基淀粉，细胞负向选择试剂B为氟尿嘧啶、紫杉醇、卡铂，细胞正向选择试剂C为植物凝集素及其结合物，分别盛放于细胞前处理试剂瓶(2)、细胞负向选择试剂瓶(3)、细胞正向选择试剂(4)内，进一步，所述凝集素为大豆凝集素(SBA)和荆豆凝集素(UEA)，所述结合物为荧光染料TRITC。
进一步，所述试剂瓶的封闭盖(6)和(7)选择为压力，试剂瓶的封闭盖(8)、(9)选择为螺丝。
其中，细胞负向选择试剂瓶(3)中化疗药物接触脐带血细胞的时间为36小时。
其中，所述细胞正向选择试剂瓶(4)中所述凝集素的浓度为0.95mg/ml。进一步，与所述细胞作用的时间为90分钟，孵育的温度为4℃。
其中，所述细胞用PBS缓冲液进行洗涤。
进一步，所述细胞洗涤后离心丢弃上清后用PBS缓冲液重悬细胞，之后，通过流式细胞仪进行分选。
进一步，所述细胞群随后加入半乳糖、海藻糖两种洗脱糖细胞洗涤剂D用于把所述凝集素结合物从所述获得的细胞上洗脱，从而使得获得的干细胞不带任何外来标记物。
进一步，所述试剂盒作用的对象为人源脐带血细胞群。
其中，所述使用说明书用于说明从脐带血中收集获得干细胞的使用方法。
其中，整个操作过程保持在无菌工作环境中进行操作，其中，内毒素检测含量≤0.5EU/mL表示试剂盒合格。
实施例3
本发明的用于从脾脏标本中获得造血干细胞的细胞处理试剂盒，它由试剂瓶、试剂、盒体组成。
所述试剂盒(1)包括细胞前处理试剂A、细胞负向选择试剂B、细胞正向选择试剂C，所述细胞前处理试剂A为质量浓度为3～12％的聚乙烯吡咯烷酮，细胞负向选择试剂B为氮芥、门冬酰胺酶、甲基苄肼，细胞正向选择试剂C为植物凝集素及其结合物，分别盛放于细胞前处理试剂瓶(2)、细胞负向选择试剂瓶(3)、细胞正向选择试剂(4)内，进一步，所述凝集素为荆豆凝集素(UEA)，所述结合物为荧光染料为磁珠。
进一步，所述试剂瓶的封闭盖(7)、(9)选择为压力，试剂瓶的封闭盖(6)和(8)选择为螺丝。
其中，细胞负向选择试剂瓶(3)中化疗药物接触脾脏细胞的时间为12小时。
其中，所述细胞正向选择试剂瓶(4)中所述凝集素的浓度为12mg/ml。进一步，与所述细胞接触的时间为45分钟，孵育的温度为4℃。
其中，所述细胞用PBS缓冲液进行洗涤。
进一步，所述细胞洗涤后离心丢弃上清后用PBS缓冲液重悬细胞，之后，通过专用磁柱进行分选。
进一步，所述细胞群随后加入海藻糖这种洗脱糖细胞洗涤剂D用于把所述凝集素结合物从所述获得的细胞上洗脱，从而使得获得的干细胞不带任何外来标记物。
进一步，所述试剂盒作用的对象为人类、啮齿动物或其他哺乳动物的脾脏细胞群。
其中，所述使用说明书用于说明从脾脏中收集获得干细胞的使用方法。
其中，整个操作过程保持在无菌工作环境中进行操作，其中，内毒素检测含量≤0.5EU/mL表示试剂盒合格。
实施例4
本发明所述的试剂盒的应用方法，具体步骤如下：
(a)所述骨髓细胞样本与细胞前处理试剂A接触：细胞前处理试剂A为质量浓度为1～6％的明胶，之后吸取上清；
(b)使经过步骤(a)的所述细胞群与所述细胞负向选择试剂B接触：其中，所述细胞负向选择试剂B为氟尿嘧啶、阿糖胞苷、卡铂，接触所述细胞的时间为96小时；
(c)将步骤(b)所得的液体离心，丢弃上清取下层细胞沉淀，之后，用生理盐水洗涤细胞；
(d)重复步骤(c)两到三次；
(e)使经过步骤(d)的所述细胞群与所述细胞正向选择试剂C接触：所述试剂为双花扁豆凝集素(DBA)和花生凝集素(PNA)，所述结合物为牛血清白蛋白(BSA)，所述凝集素的浓度为5mg/ml，与所述细胞群接触的时间为20分钟，孵育温度为37℃；
(f)分离获得凝集素阳性的细胞群：选择采用静置沉淀法；
最后，加入半乳糖、N-乙酰半乳糖胺两种洗脱糖细胞洗涤剂D把所述凝集素结合物从所述获得的细胞上洗脱，从而使得获得的干细胞不带任何外来标记物。
进一步，所述试剂盒应用的对象为人类、啮齿动物或其他哺乳动物的骨髓标本来源的细胞群。
其中，所述使用说明书用于说明从所述骨髓标本中收集获得干细胞的使用方法。
实施例5
本发明所述的试剂盒的应用方法，具体步骤如下：
(a)所述脐带血细胞样本与细胞前处理试剂A接触：细胞前处理试剂A为质量浓度为4～8％的羟乙基淀粉，之后吸取上清；
(b)使经过步骤(a)的所述细胞群与所述细胞负向选择试剂B接触：其中，所述细胞负向选择试剂B为氟尿嘧啶、紫杉醇、卡铂，接触所述细胞的时间为36小时；
(c)将步骤(b)所得的液体离心，丢弃上清取下层细胞沉淀，之后，用PBS缓冲液洗涤细胞；
(d)重复步骤(c)两到三次；
(e)使经过步骤(d)的所述细胞群与所述细胞正向选择试剂C接触：所述试剂为大豆凝集素(SBA)和荆豆凝集素(UEA)，所述结合物为荧光染料TRITC，所述凝集素的浓度为0.95mg/ml，与所述细胞群接触的时间为90分钟，孵育温度为4℃；
(f)分离获得凝集素阳性的细胞群：选择采用流式细胞仪分选法；
最后，加入半乳糖、海藻糖两种洗脱糖细胞洗涤剂D用于把所述凝集素结合物从所述获得的细胞上洗脱，从而使得获得的干细胞不带任何外来标记物。
进一步，所述试剂盒应用的对象为人类脐带血标本来源的细胞群。
其中，所述使用说明书用于说明从所述脐带血标本中收集获得干细胞的使用方法。
其中，整个操作过程保持在无菌工作环境中进行操作。
显然在不违反本发明的领域及范畴下，可以对上述用于从造血器官、血液标本中获得干细胞的细胞处理试剂盒进行成分的修饰及或增加，本发明是以上述实施例进行试剂盒的说明，并不是用于限制试剂盒的使用，对此进行的任何等同替换、修改、增加均落在本发明的试剂盒的保护范畴内。

Claims (12)

1.从造血器官、血液中获得干细胞的试剂盒及其应用方法，包括盒体、试剂、试剂瓶及使用说明书，其特征在于，该试剂盒(1)包括细胞前处理试剂A、细胞负向选择试剂B、细胞正向选择试剂C，分别盛放于细胞前处理试剂瓶(2)、细胞负向选择试剂瓶(3)、细胞正向选择试剂瓶(4)内，所述细胞负向选择试剂瓶(3)中包含的试剂为化疗药物，细胞正向选择试剂瓶(4)中包含的试剂为凝集素结合物。 
2.根据权利要求1所述的从造血器官、血液中获得干细胞的试剂盒及其应用方法，其特征在于，细胞前处理试剂瓶(2)包含的试剂为红细胞沉淀剂或红细胞裂解液；红细胞沉淀剂为质量浓度为0.1～20％的羟乙基淀粉、明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、羧甲基淀粉的任一一种；红细胞裂解液可选择为氯化铵红细胞裂解液、质量浓度小于0.9％的生理盐水溶液的任一一种；细胞前处理试剂或可选择泛影酸钠-葡聚糖、HITOPAQUE、Ficoll的任一一种，所述细胞前处理试剂A作用细胞的次数至少为一次。 
3.根据权利要求1所述的从造血器官、血液中获得干细胞的试剂盒及其应用方法，其特征在于，细胞负向选择试剂瓶(3)中的化疗药物可选择为包括抗生素化疗药物、抗代谢化疗药物、烷化剂化疗药物、激素及内分泌化疗药物、植物化疗药物、亚硝脲类化疗药物、抗体阻断剂化疗药物、门冬酰胺酶、甲基苄肼、草酸铂、铂类、丙亚胺、羟基脲和氨烯咪胺的一种或两种以上的组合。 
4.根据权利要求1所述的从造血器官、血液中获得干细胞的试剂盒及其应用方法，其特征在于，细胞负向选择试剂瓶(3)中试剂接触细胞的时间为小于或等于120小时。 
5.根据权利要求1所述的从造血器官、血液中获得干细胞的试剂盒及其应用方法，其特征在于，细胞正向选择试剂瓶(4)中所述凝集素可选择为天然的或人工合成的植物凝集素、动物凝集素及其衍生物的一种或两种以上的组合，所述凝集素的浓度为0.001～30mg/ml。 
6.根据权利要求1所述的从造血器官、血液中获得干细胞的试剂盒及其应用方法，其特征在于，细胞提纯试剂瓶中所述凝集素的结合物可选择预先与荧光素、磁性微球或高分子量的生物大分子的任一一种进行结合。 
7.根据权利要求6所述的从造血器官、血液中获得干细胞的试剂盒及其应用方法，其特征在于，所述与凝集素结合的高分子量的生物大分子的分子量在10000道尔顿(Mw)以上。 
8.根据权利要求7所述的从造血器官、血液中获得干细胞的试剂盒及其应用方法，其特征在于，高分子量的生物大分子可选择为牛血清白蛋白、羟乙基淀粉、明胶、甲基纤维素、羧甲基淀粉、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮的任一一种。 
9.根据权利要求1所述的从造血器官、血液中获得干细胞的试剂盒及其应用方法，其特征在于，所述细胞提纯试剂瓶中试剂接触细胞的时间小于或等于120分钟，与细胞孵育的温度选择为小于或等于38℃。 
10.根据权利要求1所述的试剂盒的应用方法，其特征在于，其应用方法包括以下步骤： 
(a)所述细胞样本与细胞前处理试剂A接触：如加入红细胞沉淀剂，选择取上清；如加入红细胞裂解液，选择离心后丢弃上清取细胞沉淀； 
(b)使经过步骤(a)的所述细胞群与所述细胞负向选择试剂B接触，接触时间小于或等于120小时； 
(c)将步骤(b)所得的液体离心，丢弃上清取下层细胞沉淀，之后，用常规缓冲液洗涤细胞； 
(d)重复步骤(c)两到三次； 
(e)使经过步骤(d)的所述细胞群与所述细胞正向选择试剂C接触，所述凝集素的浓度为0.001～30mg/ml，与所述细胞群接触的时间为小于或等于120分钟，孵育温度为小于或等于38℃； 
(f)分离获得凝集素阳性的细胞群：可选择采用荧光活化细胞分选、磁珠分选法或静置沉淀法。 
11.根据权利要求l所述的从造血器官、血液中获得干细胞的试剂盒及其应用方法，其特征在于，加入盛放于细胞洗涤试剂瓶(5)内的洗脱糖细胞洗涤剂D把所述凝集素结合物从所述获得的细胞上洗脱，从而使得获得的干细胞不带任何外来标记物。 
12.根据权利要求1所述的从造血器官、血液中获得干细胞的试剂盒及其应用方法，其特征在于，所述造血器官、血液选自啮齿动物、人类或其他哺乳动物的骨髓、脾脏、胸腺、胎肝、外周血、脐带血、卵黄、胸腺、淋巴结、胸膜及其渗出液样品，进一步，根据本发明的试剂收集获得的干细胞作为基础、临床与应用研究、组织工程、治疗、药物筛选、修复失去功能的病变组织或器官中的应用。 
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