WO2013060282A1

WO2013060282A1 - 用于富集、提纯干细胞的方法、试剂盒及其应用方法

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Publication number: WO2013060282A1
Application number: PCT/CN2012/083545
Authority: WO
Inventors: 卢磊磊; 李福生; 卢淼淼; 卢晶晶
Original assignee: Lu Leilei; Li Fusheng; Lu Miaomiao; Lu Jingjing
Priority date: 2011-10-28
Filing date: 2012-10-26
Publication date: 2013-05-02
Also published as: CN103087979A; CN103087978A; CN203333672U; CN203333673U

Abstract

提供了一种用于富集、提纯干细胞的方法、试剂盒及其应用方法。该方法、试剂盒可直接用于啮齿动物、人类或其他哺乳动物来源的干细胞富集提纯，采用该方法、试剂盒可有效且精准地从所述细胞群中富集、提纯出干细胞；此外，根据该方法、试剂盒获得的干细胞还可以不带任何外来标记，该试剂盒具有使用简捷、可工业化生产、实用有效的优点。还提供了获得的干细胞及其在诸如研究、诊断、药物筛选或治疗中的用途。

Description

，用于富集、提纯干细胞的方法、试剂盒及其应用方法技术领域

本发明涉及富集、提纯干细胞的方法、试剂盒及其应用方法，具体而言，涉及从啮齿动物、人类或其他哺乳动物来源的细胞群中富集提纯干细胞的方法、试剂盒，所提纯的干细胞在诸如诊断、药物筛选、基础研究、组织工程、修复受损及病变组织中的应用。背景技术

众所周知，干细胞具有下述特征： 1 ) 长期的自我更新能力； 2 ) 能够产生高度分化的其它种类细胞； 3 ) 本身处于未分化状态； 4 ) 一般处于慢周期或静息状态； 5 ) 组织中处于相应的小生境（niches ) 内。

基于它们的潜能，干细胞可被细分和分类为下面三个类型：第一种是，可生长为任意类型的全能性干细胞，他们由卵细胞和精细胞融合产生；第二种是，可以分化为除全能性干细胞以外所有类型的细胞，它们被称为多能性干细胞；而第三种是仅可以产生一种细胞类型的细胞，这些细胞被称为专能干细胞或祖细胞，它们仍具有自我更新的特性，这个特性使得他们可与非干细胞区分开（Krause DS等， Cell, 2001.105： 369-377； Reya T等， Nature, 2001.414： 105-111 )。

根据它们的来源，干细胞被分为胚胎干细胞（Embryonic stem cells, ESCs ) 和成体干细胞（Adult Stem Cells, ASCs), 胚胎干细胞是全能性的，在理论上于体内可以再生身体内几乎任意组织，然而，其目前主要的难题在于如何能够获得高纯度的胚胎干细胞群。当其应用于细胞治疗时，残留的未分化的胚胎干细胞具有潜在的致瘤性，因此未分化的胚胎干细胞必须在治疗前移除。另外，不纯的胚胎干细胞将会导致药物筛选在有效性、毒理学、分化潜能或其它方面的评价方面有偏差，因此需要开发一种可靠的方法用于识别和纯化胚胎干细胞。随着研究的进展，研究者发现了可用于识别干细胞的抗体（Andrews PW 等, Hybridoma.1984; 3:347-361; Kannagi R等， EMBO J 1983; 2:2355-2361; Kannagi R等， J Biol Chem. 1983; 258:8934-8942; Kolle G等， Stem Cells. 2009; 27:2446-2456)，但目前获得典型的胚胎干细胞特异性表面分子标志仍是极具挑战性的任务。这阻碍了胚胎干细胞的广泛应用。

成体干细胞是另外一类具有修复、再生、替代能力的未分化细胞类型，通常位于特定的小生境内，在受到外界损伤后，其会动员或者产生新的干细胞，通过增殖、分化的方式形成新的功能细胞，从而调节组织和器官细胞数量保持动态平衡。成体干细胞的多能性特点首先在骨髓中得到的成体干细胞得以发现。造血干细胞是目前研究的最为详尽的成体干细胞之一，在过去近 40年里一直是干细胞领域研究的主题，它们在体内进行自我更新的细胞分裂，在单细胞水平分化为所有的造血成份，并在机能上使得重度骨髓抑制的动物和人的骨髓得以恢复。

成体干细胞研究的基础和其在临床上的应用先决条件和最关键条件之一是对干 /祖细胞的有效识别、筛选分离。最近越来越多的证据表明成体干细胞可见于多种成熟组织（Moore KA， Science, 2006.311 ( 5769)： 1880-1885 )。

例如 Thy-l¹™或 FLK2— Lineage— Sea- l+c-Kit+分选造血干细胞群（ Christemsen JL 等， PNAS， 2001.98: 14541-14546； Uchida N等， Experimental hematology, 1996.24： 649-659 ), 用 CD14+免疫磁性分离的方法从外周血筛选新的干细胞群（PCT/055950 干细胞的提纯、识别及用途）用 a₆ ^bri10G7^dim (Li A等， PNAS, 1998. 95 ( 7)： 3902-3907； Tani H等， PNAS， 2000.97 (20)： 10960-10965； Lavker RM等， PNAS, 2000.97 (25)： 13473-13475 ) 识别人类、啮齿动物来源的上皮干细胞，但其有效性还有待进一步证实；通过小鼠遗传学标志谱系试验等实验，结合所发现的分子标志物，例如 M_USaShi-l、 Lgr5等提供了鉴定干细胞的可能（Barker N等， Nature, 2007.449 (7165 )： 1003-1007； HaegebarthA等， Am J Pathol, 2009.174 ( 3 )： 715-721 )，然而它们的有效性还有待进一步证实。

公开号为 CN108677A提供一种干细胞靶向定位富集的方法，其技术方案是采用针对干细胞表面标志性抗原的特异性抗体与干细胞结合，再标记上免疫磁珠，移植后通过两个异性磁极将干细胞富集于靶组织内。

分化程度较低的干 /祖细胞通常表达一些 ATP结合转运蛋白（ATP-binding cassette, ABC), 细胞常利用 ATP能量把外来的有毒物质从细胞内排出，以达到保护自身的目的，被称为侧群筛选法（side population, SP)。早期 Goodell等（Goodell等， J Exp Med, 1996.183 (4)： 1796-1806 )研究发现，当用 Hoechst33342 对骨髓细胞进行染色后，造血干细胞具有很强的排出染液的能力。最近， Wulff等（Wulff等， Haematologica, 2003.88 (4)： 368-378 )从小鼠肝内分离到一群 SP细胞， CD45+或 CD45—细胞亚群，其所占的百分比为 1%，体外培养均可产生肝系和造血系起源的克隆，类似的研究结果在人类的成体肝组织内也分离到类似的 SP 细胞。此方法已被用于从其他器官和组织中筛选潜在的干 /祖细胞群，不足之处是，当从实体组织中筛选出 SP细胞后，由于获得活细胞的能力有限，当此类细胞进行移植后可能影响他们的重塑能力。

根据核形态进行干细胞的鉴别，例如， PCT/021504专利公开了一种根据细胞核形态鉴定干细胞的方法，通过观察经处理后的组织样品中分布的细胞核形态，核形态型的类型选自：钟形、雪茄形、凝聚球形、球形、卵形、香肠形、肾形和子弹形，从而允许显微组织学 /病理学技术人员根据核形态，将细胞区分为干细胞 /非干细胞。

其他如公开号 CN101768570的专利公开了一种富集和提取成体干细胞的方法，它采用一种多孔的三维组织工程材料埋植到人或动物体内，使得成体干细胞在材料中富集，从而分离得到干细胞。

虽然上述所公开描述的方法取得了一定的进展，但从成体中分离干细胞仍是极具挑战性的任务，一方面在于其数量较少且更难于定位、筛选分离各种组织特异性干细胞，另外一个不足方面在于缺少可靠的特异性分子标记物对其进行识别。这些分离的细胞群并不是同质类型的，而是由许多不同分化状态或增殖能力的混合细胞群组成，非常不纯。

化疗药物：

化疗药物作用的机理是它们在细胞分裂途径中干扰或抑制关键步骤，主要的靶标是 DNA的复制、 DNA 的修复，染色体分离或胞质分裂。例如氟尿嘧啶，该药物是常用的细胞毒性药物，可干扰 DNA的合成和复制，其作用机理是在体内先转变为氟尿嘧啶核苷及氟尿嘧啶脱氧核苷，它们进一步转变为相应的一、二、三磷酸核苷和脱氧核苷（FUdRP)。 FUdRP可抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶（Thmidylate synthetase, TS ) 活力，从而阻断尿嘧啶脱氧核苷酸（dUMP) 甲基化，形成胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTMP)，产生"无胸腺嘧啶死亡（thamihe-less death) "，使细胞增殖停止于 S期（DNA合成期）而死亡。另外一种主要的细胞毒性药物是直接诱导 DNA链断裂的药物或者抑制 DNA断裂修复的药物，例如环磷酰胺，它是一种直接裂解 DNA 链的药物（Sparano JA等， Journal of Infosional Chemistry, 1994.4:28-32)。第三种主要的药物是破坏微管蛋白装配和解离，如紫杉烷类化合物紫杉醇，它作用于微管蛋白，将微管蛋白聚合成稳定的微管束，使其不能解离，干扰细胞的生长；在比如作用于纺锤体的药物长春花碱，相反，它是通过抑制微管蛋白，使其无法组装成微管，达到干扰细胞的目的（ Dieras V等， Journal of Infusional Chemistry, 1995.5: 191-2)。

肿瘤 /癌症

肿瘤是机体细胞失去对其生长的正常调控而形成的新生物，是细胞自身调控和其所处的微环境相互作用的结果，其治疗仍是一个世界难题。目前肿瘤研究领域的一个研究热点是癌干细胞（Cancer Stem Cells, CSCs)。早期由多伦多大学的分子生物学家 John Dick研究者提出 "癌干细胞"理论（John Dick等， Nature, 1994. 17： 645-648)，这一新理论表明，癌症的发生及难于根治的在于其内癌干细胞（CSCs ) 的存在，随后的多个癌症研究中的研究结果支持此理论（Reya T等， Nature, 2001.414： 105-111 )，源自其他组织的进一步研究证实了癌干细胞是存在的，它们在例如血液、乳腺、脑组织、肺组织和肠组织中存在（Ai-Hajj M 等， PNAS, 2003.100:3938-3988 )； He等， Nat Genet, 2007.39: 189-198； Kim CF等， Cell, 2005.121 :823-835； Lapidot T 等， Nature , 1994.367:645-648； Ricci-Vitiani L 等， Nature , 2006； Singh SK 等， Nature , 2004.432:396-401； Yilmaz OH等， Nature, 2006.441 :475-482； Zhang J等， Nature, 2006.441 :518-522; )。 "癌干细胞" 的提出给肿瘤的治疗带来曙光，因而，如果能够识别癌干细胞将具有及其重要的临床意义，例如通过靶向癌干细胞从而治愈肿瘤等，将产生重大的应用价值和经济效益。然而，遗憾的是，现在尚没有很有效的方法从肿瘤组织中识别、分离出癌干细胞，这也意味着在治疗中，不可能准确而彻底地清除掉癌干细胞。这大大阻碍了针对肿瘤的有效治疗。研究发现，肿瘤细胞表面和其所处的微环境中大量糖链修饰改变以及凝集素受体功能异常在肿瘤发生发展和转移过程中发挥极其重要的作用。其中，糖链合成的调控以及糖链与凝集素的相互作用参与了肿瘤生物学行为的各个方面。凝集素已广泛应用于肿瘤细胞表面糖连接物的研究，其在肿瘤的生物学行为研究、诊断、治疗及其预后方面起着十分重要的作用。

凝集素：

"凝集素"这一术语最早在 1888年出现，人们发现其具有凝集红细胞的特性。简单来说，凝集素也是一种蛋白质，广泛从植物、动物、真菌、细菌等中分离，具有结合糖脂或糖肽末端特异性碳水化合物的特性（Sharon N等， Science, 1972.177 ( 53 ) :949-59; Pusztai A, 植物凝集素， 1991. 剑桥：剑桥大学出版社），且其唯一的特异性在于，它们是一组结构上有区别的蛋白质，且可特异性结合细胞膜上的碳水化合物，并进一步通过细胞膜表面寡糖基之间的交联实现对细胞的凝集（Pusztai A, 植物凝集素， 1991. 剑桥：剑桥大学出版社； Sharon N, Trends Biochemistry Sci, 1993. 18(6):221-226)。

众所周知，糖基化是在酶的作用下，实现对蛋白质或脂质附加上糖类的过程。此过程为共转移 ( co-translational ) 与后转移修饰的步骤之一，发生于内质网，细胞表面蛋白发生糖基化的几率几乎超过 50%。早在二十世纪的八十年代，有研究者发现，凝集素具有结合或杀死胚胎性的细胞癌和生殖系肿瘤细胞的能力，后来又发现，多潜能干细胞表面上的抗原常常显示为糖蛋白或糖脂（Andrews PW等, Hybridoma, 1984.3(4):347-61； Pera MF等， Differentiation , 1988. 39(2): 139-49 ), 这提示蛋白质特异性糖基化可能是细胞具有多潜能性的标志。

上述研究结果表明凝集素可能具有与多能性的细胞相互作用的特征（Draber P等， Somat Cell Mol Genet, 1984.10:435-443; Kosmehl H等， Neoplasma 1989.36:29-39)。而且，膜结合蛋白和对应配体的低聚糖化修饰常常介导细胞外分子或信号启动的胞内信号传导（Haltiwanger RS. Curr Opin Struct Biol 2002.12(5):593-8; Xia L等， Blood, 2004.104(10):3091-6)。人们发现，在许多细胞相关的事件，例如细胞分化（Moody AM等， Cell, 2001. 107(4):501-12)，细胞粘附（Fogel AI 等， J Biol Chem, 2010. 285(45):34864-74 ) 以及肿瘤（Reis CA等, J Clin Pathol, 2010. 63(4):322-9 ) 发生中，均可观察到蛋白糖基化的动态变化。在胚胎水平，例如，小鼠胚胎多个组织器官的上皮细胞膜上，研究者发现其上有结合特异性凝集素的位点（Carter WG等， J. Biol. Chem, 1975. 250(7):2756-62; Noguchi M等， J. Embryol. Exp. Morphol, 1982. 72:39-52)，进一步观察发现，不同类型的凝集素在识别胚胎不同组织上皮方面具有差异性，有趣的是，当用低剂量放射性射线照射小鼠胚胎后（0.25、 0.50和 0.75Gy)，细胞膜上结合 SBA、 PNA和 DBA三种凝集素的表达量增加（Mevergelt-Egido MC等， Radiat Environ Biophys, 1993. 32(2): 119-28 ), 而且在胚胎不同区域，三种凝集素的结合强度不同。随后在胚胎期发育的胰腺上皮和管状细胞膜上，其他研究者进一步发现，上述细胞膜上有可特异性结合凝集素的位点，这表明识别细胞膜上特异性糖表位的凝集素可能作为一个指示细胞具有多能性的标志，可用于表征胰腺前体细胞（Kobayashi等, BBRC, 2002. 293(2):691-7)。近期研究发现，路易斯寡糖（Lewis X antigen) 在小鼠的胚胎干细胞、多潜能细胞和胚胎癌性细胞的细胞膜上均有表达，而不在人类相应的胚胎干细胞、内细胞团或胚胎癌性细胞上表达（Muramatstu TA等， Glycoconjugate Journal, 2004.21 :41-45 )，未来还需要进一步研究这一不一致性。

采用细胞生物学和生物化学方法，来自多个研究者的实验研究发现，人类胚胎干细胞与其蛋白的糖基化密切相关（Xia L等， Blood, 2004. 104:3091-6； Satomaa T等， BMC Cell Biol, 2009. 10:42; Venable A等， BMC Dev Biol 2005; 5: 15 )。细胞膜上的特异性糖原表位可作为一个新的、特异性标志，用于反映小鼠胚胎的早期分化状态，其表达早于目前所发现的胚胎特异性抗原，如 SSEAl , CD9和 FA，而且，随着胚胎分化进程的发展，其膜上特异性糖原表位的表达逐渐降低并消失 (Nash Rodney等， 2006, stem cell.25(4):974-82)。 Wang 等采用培养的胚胎干细胞或诱导多能干细胞为研究对象，当用凝集素芯片分析细胞抽提物后发现，特异性的凝集素可用来识别和分离胚胎干细胞（Wang YC等, Cell Research, 2011.1-13 )。但是该项技术研究所使用的是培养的胚胎干细胞系，其在培养期间，由于所使用的培养基中的动物成份被胚胎干细胞通过直接纳入和胞饮作用而吸收，吸收后导致其代谢产物出现在胚胎干细胞表面，产生了一个糖原表位（glycan epitope ) (Lanctot PM, Curr Opin Chem Biol, 2007.11(4):373-80 ), 最终引起 "糖污染"。因此 Wang YC等人的研究需要谨慎分析与应用。

在成体水平，例如，识别 D-半乳糖的刀豆凝集素（PNA) 可用来对啮齿动物的造血干细胞进行进一步分群（Salner AL等， 1982, J Natl Cancer Inst. 68(4):639-41 ), 甚至可用来从神经组织中识别和分离出 PNA阳性的细胞群（Rietze RL等， Nature, 2001. 412(6848):736-9)，分选的细胞是否是干细胞需要进一步分析。最近的研究发现， CD133+的人造血干细胞和祖细胞的 N-糖基化模式与 N-glycan结构和基因表达密切相关 (Hemmoranta H等， Exp Hematol, 2007.35(8): 1279-92)。上述研究结果提示，细胞的多潜能与糖基化密切相关。发明内容

本领域需要克服现有技术中所存在的缺点，为了克服上述方法上的不足及提供进一步相关的优点，本发明的目的在于公开一种富集提纯干细胞的方法、试剂盒及其应用方法。本发明所提供的方法、试剂盒可广泛用于从啮齿动物、人类或其他哺乳动物的正常离体或活检组织、正常 /肿瘤 /癌细胞系、肿瘤 /癌前组织、癌 /肿瘤性组织、转移瘤 /癌组织中，以及来源于上述组织的原代、传代细胞群中富集提纯干细胞。另外，本发明提供的试剂盒具有使用简捷、可用于精准且有效的富集提纯干细胞，可大规模工业化生产、实用性强的优点，应用前景广泛。本发明的一个方面在于公开一种用于富集、提纯干细胞的方法，采用联合化疗药物与凝集素用于从细胞群体中富集、提纯干细胞，所述方法包括：

( 1 ) 使所述细胞群与至少一种化疗药物进行接触，其可诱导处于细胞周期的细胞凋亡；

(2 ) 再使所述细胞群与凝集素结合物进行接触，后者含有：至少一种凝集素，其可与所述细胞上的受体结合，随后将凝集素结合的细胞群与剩余细胞样品分离；

通过上述负向和正向选择，从而实现从所述细胞群体中富集、提纯出干细胞，获得富含干细胞的细胞样品的目的，构成了本发明的核心。

本发明还进一步包括在所述细胞群与化疗药物接触之前进行细胞预处理所述细胞群体。

细胞预处理过程选择采用沉淀或裂解法沉淀或裂解细胞群中的红细胞的试剂，所述试剂可选择为质量浓度为 0.1~20%的羟乙基淀粉、明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、羧甲基淀粉的任一一种；或可选择为氯化铵红细胞裂解液、质量浓度小于 0.9%的生理盐水溶液的任一一种；或选择泛影酸钠 -葡聚糖、 HITOPAQUE、 Ficoll的任一一种，其中，所述试剂至少重复接触所述细胞群一次。

本发明所述的化疗药物包括但不限于抗生素化疗药物、抗代谢化疗药物、烷化剂化疗药物、激素及内分泌化疗药物、植物化疗药物、亚硝脲类化疗药物、抗体阻断剂化疗药物、门冬酰胺酶、甲基苄肼、草酸铂、铂类、丙亚胺、羟基脲和氨烯咪胺及其衍生物的一种或两种以上的组合，所述化疗药物接触所述细胞群的时间小于或等于 168小时。

其中，本发明所述凝集素结合物中的凝集素包括天然的或化学合成的植物凝集素、动物凝集素或其衍生物的一种或两种以上的组合，其中，所述凝集素的浓度为 0.001~50mg/ml，与所述细胞群接触的时间为小于或等于 150分钟，孵育温度为小于或等于 38°C。

进一步，所述凝集素结合物中的结合物可选择预先与荧光染料、磁性微球或高分子量的生物大分子的任一一种进行结合，或选择具有对凝集素有亲和力抗体或抗体衍生物或抗体片段的一种。

其中，所述与凝集素结合的高分子量的生物大分子的分子量在一万道尔顿（Mw)至五十万道尔顿 (Mw) 之间，其中所述高分子量的生物大分子可选择为牛血清白蛋白、羟乙基淀粉、明胶、甲基纤维素、羧甲基淀粉、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮的任一一种。

其中，所述含干细胞的细胞群来源于啮齿动物、人类或其他哺乳动物的胚胎组织、成体组织、肿瘤 / 癌前组织、肿瘤 /癌性组织、转移瘤 /癌组织或其他潜在包含干细胞的一种或两种以上组织的组合，也可来源于所述组织的原代、传代细胞群的一种或两种以上的组合。

进一步，所述富集提纯的干细胞包括全能干细胞、多能干细胞、专能干细胞、肿瘤干细胞、癌干细胞，进一步其与已知干细胞标志接触。

本发明的另一个方面在于提供一种联合化疗药物与凝集素用于富集、提纯干细胞的试剂盒及其应用方法，其在用于从所述细胞群中富集、提纯干细胞的用途。

本发明所述的用于富集、提纯干细胞的试剂盒，所述试剂盒包括：

( 1 ) 细胞负向选择试剂 A；

(2 ) 细胞正向选择试剂 B; (3 ) 以及任选的容器。

其中，细胞负向选择试剂 A为化疗药物，包含但不限于抗生素化疗药物、抗代谢化疗药物、烷化剂化疗药物、激素及内分泌化疗药物、植物化疗药物、亚硝脲类化疗药物、抗体阻断剂化疗药物、门冬酰胺酶、甲基苄肼、草酸铂、铂类、丙亚胺、羟基脲和氨烯咪胺及其衍生物的一种或两种以上的组合，所述化疗药物接触所述细胞群的时间小于或等于 168小时；

其中，细胞正向选择试剂 B为凝集素和或凝集素结合物，包括但不限于天然的或人工合成的植物凝集素、动物凝集素或其衍生物的一种或两种以上的组合，其中所述凝集素结合物中的结合物可选择预先与荧光染料、磁性微球或高分子量的生物大分子的任一一种进行结合，或选择具有对凝集素有亲和力抗体或抗体衍生物或抗体片段的一种，所述凝集素的浓度为 0.001~50mg/ml，与所述细胞群接触的时间为小于或等于 150分钟，孵育温度为小于或等于 38°C。

进一步，本发明的所述的试剂盒，其还包括细胞预处理试剂 C，用于沉淀或裂解所述细胞群中的红细胞。进一步，所述细胞预处理试剂还可选择为泛影酸钠-葡聚糖或 HITOPAQUE或 Ficoll的任一一种。

其中，所述含干细胞的细胞群是啮齿动物、人类或其他哺乳动物来源的正常成体、胚胎组织和或病变、肿瘤、癌前、癌性、癌转移组织，或来自所述组织的原代、传代细胞群的一种或两种以上的组合。

根据本发明试剂盒所述，随后可选择采用荧光活化细胞分选法用于鉴定和分选结合凝集素结合化合物的细胞群或选择沉淀法分离结合凝集素的所述细胞群，进一步，分离的所述干细胞，其包含细胞膜上的可与凝集素结合的受体。

进一步，本发明试剂盒还可包括洗脱糖试剂，根据本发明试剂盒获得的提纯的干细胞，其随后可通过加入洗脱糖的方法把所述凝集素结合物从所述细胞上洗脱，从而使得获得的干细胞不带任何外来标记物。

进一步，本发明所述富集提纯的干细胞和或其子代源自介于正常组织与癌 /肿瘤性组织之间的啮齿动物、人类及其他哺乳动物来源的肿瘤 /癌前任意病变组织，或来自所述组织的原代、传代细胞群。

其中，所述试剂盒富集提纯的干细胞包括全能干细胞、多能干细胞、专能干细胞、成体干细胞、肿瘤干细胞、癌干细胞，进一步，其与已知干细胞标志物接触。

根据本发明试剂盒获得的干细胞还可加入生理盐水、 PBS缓冲液、 HBSS缓冲液以调整干细胞的浓度和体积。

本发明提供一种进行所述的试剂盒应用方法，其应用方法包括以下步骤：

( 1 ) 所述细胞样本与细胞预处理试剂 C接触：如加入红细胞沉淀剂，选择取上清；如加入红细胞裂解液，选择离心后丢弃上清取细胞沉淀；

(2) 使经过步骤（1 ) 的所述细胞群与所述细胞负向选择试剂 A接触，接触时间小于或等于 168 小时；

(3 ) 将步骤（2) 所得的液体离心，丢弃上清取下层细胞沉淀，之后，用常规缓冲液洗涤细胞；

(4) 重复步骤（3 ) 两到三次；

(5 ) 使经过步骤（4 ) 的所述细胞群与所述细胞正向选择试剂 B 接触，所述凝集素的浓度为 0.001~30mg/ml, 与所述细胞群接触的时间为小于或等于 150分钟，孵育温度为小于或等于 38°C； ( 6 ) 分离获得凝集素阳性的细胞群：可选择采用荧光活化细胞分选法或静置沉淀法；

( 7 ) 加入洗脱糖把所述凝集素结合物从所述细胞上洗脱，从而使得获得的干细胞不带任何外来标记物。

根据本发明所述的方法、试剂盒富集提纯的干细胞有益于基础、临床与应用研究、组织工程、治疗、药物筛选、修复和再生受损或患病组织等领域的应用。附图说明

图 1 胚胎干细胞的富集提纯及显微镜观察结果图，具体如实施例 1。

A图是实验结果，其中峰 1部分为预先加入同型对照与细胞群孵育，再加入结合牛血清白蛋白的凝集素 SBA富集提纯细胞后，经 FITC-SBA凝集素鉴定分析所述细胞的结果； B图是荧光免疫组化染色结果，富集提纯的小鼠胚胎干细胞（mESCs )细胞膜表面出现 FITC-SBA绿色荧光，核内出现 OCT-4红色荧光（星号），其中细胞核用 DAPI染色。图片的放大倍数为 100倍。

图 2肺干细胞的富集提纯及显微镜观察结果图，具体如实施例 2。

A和 B图是流式结果，其中， A图是同型对照流式图，对照组细胞数量为 0.16 % (n=2 ) ; B图是凝集素阳性流式图，表示采用 TRITC标记的凝集素 UEA (T-UEA) 作为分子标记从肺脏细胞群中富集纯化干细胞的结果， PI染色排除死细胞，凝集素阳性细胞数量为 6.1% (n=2 ) ; C图表示新分离的 T-UEA凝集素阳性的细胞群，采用激光共聚焦显微镜进行观察，箭头指 T-UEA+ (红色） /c-Kit+ (绿色）肺脏干细胞。细胞核用 DAPI染色，图片的放大倍数为 100倍。图 3 肝癌干细胞的提纯及显微镜观察结果图，具体如实施例 3。

A图是实验结果，表示同型对照组，对照组细胞数量为 0.15% (n=2 ) ; B图表示采用 TRITC标记的凝集素 DBA (T-DBA)作为分子标记鉴定分析从肝癌组织中提纯干细胞的结果，凝集素阳性细胞数量为 5.8% (n=2 ) _; C图表示新分离的凝集素阳性的肝癌干细胞群，采用激光共聚焦显微镜进行观察，其中细胞核用 DAPI染色，星号指 CD90+ (绿色）细胞，图片的放大倍数为 100倍。

图 4从骨髓、脐带血中富集提纯干细胞结果图，具体如实施例 4。

A图表示采用 PE标记的凝集素 DBA (PE-DBA) 从骨髓细胞群中富集提纯干细胞的结果，阳性细胞数量为 3.9% (n=2)， B图表示细胞纯度为 93.8%; C图表示采用 PE标记的凝集素 UEA (PE-UEA) 从脐带血细胞群中富集提纯干细胞的结果，阳性细胞数量为 4.3% (n=2)， D图表示细胞纯度为 95.6%。

图 5 采用试剂盒富集提纯心脏干细胞及显微镜观察结果图，具体如实施例 5。

A图表示同型对照组，对照组细胞数量为 0.12%(n=2 ); B图表示采用 FITC标记的槐凝集素 SJA(F-SJA) 作为分子标记从心脏细胞群中纯化干细胞的结果，凝集素阳性细胞数量为 5.6% (n=2 ) _; C图表示新分离的 F-SJA凝集素阳性的细胞群，采用激光共聚焦显微镜进行观察，其中细胞核用 DAPI染色，短箭头指 F-SJA 阳性心脏干细胞，长箭头指 F-SJA +/Nkx2.5+心脏干细胞，图片的放大倍数为 100倍。具体实施方式

以下对本发明的具体实施例进行说明，但本领域的技术人员应当理解，本发明的实施例目的是为了清楚的说明本发明的优点，不是用于限制本发明，任何基于本发明的修改、替换均落在本发明的精神范畴和保护范围之内。

如本发明所述，除非上下文另有明确指示，否则没有限定对象的含义。

如本领域技术人员所理解的，本发明文中"一种"指"至少一种"。术语"包含"、 "包括"、 "含有"是同义词，是具有包容性的或者开放性的，并且不排除额外的未详述的成员、要素或方法步骤。如本发明所述，术语"细胞群 "是指一个或一个以上的细胞的组合，通常是指一组细胞，除非另有说明，否则该术语是指由本发明所述提纯的细胞组成或包含此处提纯细胞的细胞群体。

细胞群包括从啮齿动物、人类或其他哺乳动物正常组织、肿瘤 /癌前组织、肿瘤 /癌组织、转移瘤 /癌组织、建立的细胞系、原代细胞群、传代细胞群中获得，其可由具有共同表型的细胞组成或包含至少部分具有共同表型的细胞组成，当细胞在一个或多个显著特征上基本相似或一致时，可以认为细胞具有共同表型，其特征包括但不限于形态外观，某细胞成分或产物（R A、蛋白质或其它物质）的表达的有无或水平、某生化途径的活力、增殖能力和或动力学行为、分化潜能和或对分化信号的响应或体外培养行为。因此这种显著特征可以定为一个细胞群或其部分。

如本发明文中所使用的，术语"含干细胞的细胞群"在本发明中指含有至少一种干细胞或祖细胞，或者包含部分祖细胞或干细胞的细胞群。通常，所述部分的干细胞或祖细胞可以具有共同表型，也可具有不同表型。

如本发明所述，术语"干细胞 "是指能够长期自我更新（即不分化而能够增殖）的全能干细胞、多能干细胞、专能干细胞或祖细胞、肿瘤干细胞、癌干细胞，处于静息或增殖，其中干细胞的后代或至少其一部分基本保持了亲代干细胞未特化的或者相对较少特化的表型、分化潜能、以及增殖能力。该术语包括能够基本上无限自我更新的干细胞，即：和亲代相比，后代或其部分进一步增殖的能力没有显著降低，以及表现出有限的自我更新的干细胞，即：和母细胞相比，后代或其部分进一步增殖的能力显著降低。基于其产生细胞的类型，所述干细胞或祖细胞可以是多能的、全能的、专能的、或单能的一种或以上的组合。

如本文所用的，本发明文中术语"啮齿动物"指大鼠、小鼠等； "哺乳动物"指人类、牛、马、狗、兔、猴等。如本文所用的，术语 "胚胎"指出生前任何时间，术语"成体"指出生后任何时间，优选任何时期。术语"离体"包括离开动物或人类的组织或细胞且在体外保存或增殖，例如保存在培养容器中。术语"活检" 包括采用本领域普遍了解的方法从动物或人类组织或器官中获得组织。

本发明源于本发明人的深入研究，本发明的目的在于公开一种用于富集、提纯干细胞的方法，联合化疗药物与凝集素用于从细胞群体中富集、提纯干细胞，所述方法包括：

通过上述负向和正向选择，从而实现从所述细胞群体中富集、提纯出干细胞，获得富含干细胞的细胞样品。

其中，进一步包括在所述细胞群与化疗药物接触之前进行细胞预处理所述细胞群体。

其中，细胞预处理过程选择采用沉淀或裂解法沉淀或裂解细胞群中的红细胞的试剂，所述试剂可选择为质量浓度为 0.1~20%的羟乙基淀粉、明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、羧甲基淀粉的任一一种；或可选择为氯化铵红细胞裂解液、质量浓度小于 0.9%的生理盐水溶液的任一一种；或选择泛影酸钠-葡聚糖、 HITOPAQUE、 Ficoll的任一一种；其中，所述试剂至少重复接触所述细胞群一次。

其中，所述化疗药物包括但不限于抗生素化疗药物、抗代谢化疗药物、烷化剂化疗药物、激素及内分泌化疗药物、植物化疗药物、亚硝脲类化疗药物、抗体阻断剂化疗药物、门冬酰胺酶、甲基苄肼、草酸铂、铂类、丙亚胺、羟基脲和氨烯咪胺及其衍生物的一种或两种以上的组合。进一步，所述化疗药物接触所述细胞群的时间小于或等于 168小时。

其中，所述凝集素结合物中的凝集素包括天然的或化学合成的植物凝集素、动物凝集素或其衍生物的一种或两种以上的组合。所述凝集素的浓度为 0.001~50mg/ml，与所述细胞群接触的时间为小于或等于 150 分钟，孵育温度为小于或等于 38°C。进一步，优选植物凝集素的一种或两种以上的组合。

其中，所述凝集素结合物中的结合物可选择预先与荧光染料、磁性微球或高分子量的生物大分子的任一一种进行结合，或选择具有对凝集素有亲和力抗体或抗体衍生物或抗体片段的一种。

其中，所述与凝集素结合的高分子量的生物大分子的分子量在一万道尔顿（Mw)至五十万道尔顿 (Mw) 之间，进一步，所述高分子量的生物大分子可选择为牛血清白蛋白、羟乙基淀粉、明胶、甲基纤维素、羧甲基淀粉、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮的任一一种。

其中，所述富集提纯的干细胞包括全能干细胞、多能干细胞、专能干细胞、肿瘤干细胞、癌干细胞，进一步与已知干细胞标志接触，例如 0CT-4、 Sca-K CD90、 c-Kit等。

其中，所述含干细胞的细胞群来源于啮齿动物、人类或其他哺乳动物的胚胎组织、成体组织、肿瘤 / 癌前组织、肿瘤 /癌性组织、转移瘤 /癌组织或其他潜在包含干细胞的一种或两种以上组织的组合。进一步，所述细胞群也可来源于上述组织的原代细胞群、传代细胞群的一种或两种以上的组合。

本发明的另一个方面在于公开一种联合化疗药物与凝集素用于富集、提纯干细胞的试剂盒及其应用方法，其在用于从所述细胞群中富集、提纯干细胞的用途。

本发明所述的富集、提纯干细胞的试剂盒，所述试剂盒包括：

( 1 ) 细胞负向选择试剂 A；

(2 ) 细胞正向选择试剂 B;

(3 ) 以及任选的容器。

其中，细胞负向选择试剂 A为化疗药物，包含但不限于抗生素化疗药物、抗代谢化疗药物、烷化剂化疗药物、激素及内分泌化疗药物、植物化疗药物、亚硝脲类化疗药物、抗体阻断剂化疗药物、门冬酰胺酶、甲基苄肼、草酸铂、铂类、丙亚胺、羟基脲和氨烯咪胺及其衍生物的一种或两种以上的组合，所述化疗药物接触所述细胞群的时间至多为 168小时，至多为 120小时，至多为 96小时，至多为 80小时，至多为 48 小时，至多为 24小时，至多为 12小时，至多为 60min，至多为 30min，至多为 10min，至多为 5min，至多为 lmin，至多为 30second; 应当理解，本发明所述的化疗药物类型及其与所述细胞的接触时间不是用于限制本发明，而是为了更清晰的阐述本发明，本发明所述化疗药物包括多种已知的细胞毒性试剂，可将一种或多种化疗药物及其衍生物联用。其中，细胞正向选择试剂 B为凝集素和或凝集素结合物，包括但不限于天然的或人工合成的植物凝集素、动物凝集素或其衍生物的一种或两种以上的组合，其中所述凝集素结合物中的结合物可选择预先与荧光染料、磁性微球或高分子量的生物大分子的任一一种进行结合，或选择具有对凝集素有亲和力抗体或抗体衍生物或抗体片段的一种，所述凝集素的浓度为 0.001~50mg/ml，与所述细胞群接触的时间为小于或等于 150分钟，孵育温度为小于或等于 38°C，优选小于或等于 37°C，优选小于或等于 18°C，优选小于或等于 4°C。

其中，所述试剂盒还包括细胞预处理试剂 C，用于沉淀或裂解所述细胞群中的红细胞。

进一步，所述细胞预处理试剂还可选择为泛影酸钠-葡聚糖、 HITOPAQUE、 Ficoll的任一一种。

其中，所述含干细胞的细胞群是啮齿动物、人类或其他哺乳动物来源的正常成体、胚胎组织和或病变、肿瘤、癌前、癌性、癌转移组织，或来自上述组织的原代、传代细胞群的一种或两种以上的组合。

其中，凝集素阳性细胞群的提纯（纯化）可采用流式细胞仪（与荧光素结合的凝集素）、磁珠筛选（包被了凝集素的磁珠）、吸附柱或其它已知的手段进行鉴定、分析及提纯，例如，免疫亲和提纯，结合化合物与固体支持物结合，再比如，淘选，结合化合物与组织培养皿结合。

其中，凝集素阳性细胞群的提纯也可选择沉淀法（与生物大分子结合）分离结合凝集素的所述细胞群，静置一定时间后，吸取下层沉淀细胞群。

进一步，如果用荧光素标记凝集素，利用流式细胞仪的方法从细胞群中纯化目标细胞是优选的，更优选荧光激活细胞分类仪（FACS ) 分离所述细胞，通过使用该装置，可以自动分离、回收目标细胞。

进一步，根据本发明的方法、试剂盒富集提纯的干细胞至少为一个，进一步，根据本发明的方法、试剂盒富集提纯干细胞的纯度至少 99%、至少 95%、至少 90%、至少 85%、至少 80%、至少 75%、至少 70%、至少 65%、至少 60%、至少 55%、至少 50%、至少 45%、至少 40%、至少 35%、至少 30%、至少 25%、至少 20%、至少 15%、至少 10%、至少 5%或至少 1%。

应当理解，许多凝集素都是本领域已知的信息，根据本发明，可以使用任何凝集素。术语"凝集素 "是指共有结合糖脂或糖蛋白特异性的碳水化合物基团特性的蛋白质组。所述凝集素包括从天然来源纯化凝集素，例如从植物、动物、真菌、藻类和细菌，或者选择修饰的凝集素或其衍生物（天然的或合成的），或者通过化学合成它。凝集素衍生物包括多 -亚单位凝集素中的一个或多个亚单位。在一个优选的实施方案中，凝集素可选择植物凝集素，其可以是，但不限于本发明所述。凝集素可以商业上从许多商业供应商那里获得，例如 Sigma 公司、 Vector lab公司。

进一步，分离的所述干细胞，其包含细胞膜上的可与凝集素结合的受体。

根据所述方法、试剂盒所获得的提纯的干细胞，其进一步可通过加入洗脱糖的方法把所述凝集素结合物从所述细胞上洗脱，从而使得获得的干细胞不带任何外来标记物。

其中，所述富集提纯的干细胞包括全能干细胞、多能干细胞、专能干细胞、成体干细胞、肿瘤干细胞、癌干细胞，进一步，所述分离的干细胞其细胞表面有可与凝集素结合物中的凝集素结合的受体，进一步与已知干细胞标志物接触，例如 0CT-4、 Sca-K Alb、 c-Kit、 CD90等分子。

进一步，根据本发明所述方法、试剂盒获得的干细胞还可加入生理盐水、 PBS缓冲液、 HBSS缓冲液以调整干细胞的浓度和体积。根据本发明所述的方法、试剂盒获得的提纯的干细胞，本领域技术人员应当理解，所述干细胞属于本发明的保护范围，任何基于本发明所述干细胞的修饰均属于本发明的精神范畴与保护范围。

本发明还提供所述试剂盒的应用方法，其应用方法包括以下步骤：

(2 ) 使经过步骤（1 ) 的所述细胞群与所述细胞负向选择试剂 A接触，接触时间小于或等于 168小时；

(3 ) 将步骤（2 ) 所得的液体离心，丢弃上清取下层细胞沉淀，之后，用常规缓冲液洗涤细胞；

(4 ) 重复步骤（3 ) 两到三次；

(5 ) 使经过步骤（4 ) 的所述细胞群与所述细胞正向选择试剂 B接触，所述凝集素的浓度为 0.001~50mg/ml,与所述细胞群接触的时间为小于或等于 150分钟，孵育温度为小于或等于 38 °C ;

(6 ) 分离获得凝集素阳性的细胞群：可选择采用荧光活化细胞分选法或静置沉淀法；

(7 ) 加入洗脱糖把所述凝集素结合物从经步骤（6 ) 获得的所述细胞上洗脱，从而使得获得的干细胞不带任何外来标记物，进一步，所述获得的干细胞获得的干细胞还可加入生理盐水、 PBS缓冲液、 HBSS缓冲液以调整干细胞的浓度和体积。

本发明的试剂盒的瓶中的化疗药物、凝集素结合物、洗脱糖可以是药学上可接受的溶液的形式，例如与无菌盐水、 PBS缓冲液或其它药学上可接受的无菌液体组合。或者，可以冻干或干燥的化疗药物、凝集素组合物，在此类情况下，试剂盒还任选的包含装在容器中的药学上可接受的溶液，例如生理盐水、 PBS 缓冲液等，优选无菌的，以溶解所述冻干或干燥化疗药物、凝集素结合物。

根据本发明所述的方法、试剂盒富集提纯的干细胞有益于基础、临床与应用研究、组织工程、治疗、药物筛选、修复和再生受损或患病组织等领域的应用。

实施例

实施例 1、胚胎干细胞的富集提纯及显微镜观察

材料： DAPI、 FITC标记的 SBA凝集素（F-SBA) 购自 Vector lab、羟乙基淀粉（Sigma), 抗 -OCT-4 抗体购自 Santa Cruz, 胶原酶、胰蛋白酶（Sigma)、胎盘蓝、乙二胺四乙酸（GBICO)、胎牛血清、 DMEM 培养基、血球计数板、氯化铵（I X )。牛血清白蛋白与凝集素 SBA预先结合，形成牛血清白蛋白 -SBA结合物。洗涤缓冲液： PBS (pH值为 7.4士0.1 ) ；封闭缓冲液：在洗涤缓冲液（PBS ) 中加入 3% BSA; 抗原修复液：柠檬酸缓冲液；透膜缓冲液： TBS (0.1%Triton+PBS )。

方法：

a) 麻醉后无菌条件下取孕鼠子宫，用含 0.1%FBS的 DMEM培养基冲洗胚胎，转移至无菌培养皿中，再用上述培养基清洗 1次（lmin ~3min)，随后，加入 acid tyrode's solution去除胚胎的透明带，作用时间为 30second~lmin，收获胚胎之后用无菌眼科剪剪切为小碎块，转入盛有胶原酶 +0.5 g/L胰蛋白酶 -0.2 g/L 乙二胺四乙酸消化液的无菌培养皿中，消化 3mi_n~10min，随后，用毛细玻璃针轻轻吹打细胞团，之后，在 4°C，以 lOOg 离心 2~3min，弃上清后加入 4°C预冷的含 1%FBS的 PBS，轻轻混匀，再加入 NH₄C1裂解液混匀，室温放置 30second~lmin，在 4°C，以 lOOg离心 2~3min，弃上清后加入 4°C预冷含 1%FBS的 PBS混匀，用血球计数仪计数细胞数量，再加入 5-氟尿嘧啶接触细胞 30mi_n~45min，在 4°C，以 lOOg离心 2~3min, 弃上清后加入 4°C预冷含 1%FBS的 PBS混匀，离心丢弃上清后加入牛血清白蛋白结合的凝集素 SBA, 其中，所述凝集素的浓度为 3mg/ml，在 37°C条件下静置 30min后，吸取下层细胞沉淀，随后加入洗脱糖半乳糖把凝集素结合物从细胞膜上洗脱下来，在 4°C，以 lOOg离心 2~3min，弃上清后加入 4°C预冷含 1%FBS的 PBS混匀，胎盘蓝染色细胞存活率大于等于 97%。随后，吸取一份细胞与 FITC-SBA凝集素避光孵育 30~60min，之后，在 4°C，以 lOOg 离心 3~5min后，丢弃上清，加入 4°C预冷的含 1%FBS的 PBS 重悬细胞，流式细胞仪鉴定分析 F-SBA+细胞群的数量，结果表明纯化的干细胞纯度为 98%。在分析前，添加碘化丙碇（PI) 来排除分析中的死细胞。

b) 4%多聚甲醛溶液固定细胞 15~30mim，室温放置 30min~60min后，再依次经抗原修复（55°C~75°C， 30min~80min)、室温冷却（30min~60min)后加入透膜缓冲液与固定细胞孵育，孵育时间为 30~60min，之后 BSA封闭（室温， 30min~60min)， PBS洗去剩余未结合 BSA之后，用抗 OCT-4抗体与固定细胞进行孵育，在 4°C孵育过夜后，再用 PBS洗去未结合的抗 OCT-4抗体，之后加入 TRITC-二抗、 FITC-SBA及 DAPI 室温孵育 30ηώ ~60ηώ，洗去上述未结合抗体，室温干燥后封片。荧光显微镜或激光共聚焦显微镜检测，检测到阳性细胞的数量为一个以上。

结果：采用本发明的方法能够富集、提纯胚胎干细胞（图 1 )。

实施例 2、肺干细胞的富集提纯

制备了来自成体动物的肺脏组织，组织经 PBS缓冲液清洗，清洗 3次，每次 3~5min。

材料： DAPI、 TRITC标记的 UEA (T-UEA)购自 Sigma、抗 -c-Kit抗体（GBICO)、胶原酶、胰蛋白酶 ( Sigma),胎牛血清、 DMEM/F-12K培养基、血球计数板、 0.2%NaCl,胎盘蓝染液。洗涤缓冲液： PBS (pH 值为 7.4±0.1 ) ；封闭缓冲液：在洗涤缓冲液（PBS) 中加入 3% BSA; 抗原修复液：柠檬酸缓冲液；透膜缓冲液： TBS (0.1%Triton+PBS) o

方法：

a)肺组织转入无菌培养皿中后，用无菌眼科剪剪切组织为小碎块，转入盛有胶原酶 /胰蛋白酶消化液的 50ml离心管中，在 37°C， 500rpm消化 30min~45min后，加入 4°C预冷的含 10% 胎牛血清的 DMEM/F12K 培养基终止反应，再用一次性注射器将经消化的组织块吹打成单细胞悬液，之后，在 4°C，以 200g 离心 3~5min，弃上清后加入 4°C预冷的含 2%FBS的 PBS，轻轻混匀，经 180目筛网过滤入另一个 50ml离心管中，加入 0.2%NaCl裂解红细胞，接触时间为 3~5min，之后加入 1.6%NaCl恢复溶液至等渗条件，在 4°C，以 200g离心 3~5min，弃上清后加入 4°C预冷含 2%FBS的 PBS混匀，用血球计数仪计数细胞数量，再加入紫杉醇、 5-氟尿嘧啶、卡铂接触细胞，时间为 24h~36h，之后在 4°C，以 200g离心 3~5min，弃上清后加入 4°C预冷含 2%FBS的 PBS混匀，细胞被等分为两份，一份加入 15~40μ1 的 TRITC-UEA, —份加入等体积过量的同型对照，两份细胞均在 4°C条件下避光孵育 30~60min，之后，在 4°C，以 200g 离心 3~5min后，丢弃上清，加入 4°C预冷的含 2%FBS的 PBS重悬细胞，胎盘蓝染色细胞存活率为 98%，流式细胞仪分选 T-UEA+细胞群，纯化的干细胞纯度为 94%。在分析前，添加碘化丙碇（PI) 来排除分析其中的死细胞。

b) 4%多聚甲醛溶液固定细胞 20~40mim，室温放置 30min~60min后，再依次经抗原修复（55°C~75°C， 30min~80min)、室温冷却（30min~60min)后加入透膜缓冲液与固定细胞孵育，孵育时间为 20~40min，之后加入 BSA封闭（室温， 30min~60min)， PBS洗去剩余未结合 BSA之后，用抗 -c-Kit抗体与固定细胞进行孵育， 4°C孵育过夜后，用 PBS缓冲液洗去未结合抗体，加入 FITC-二抗及 DAPI,室温孵育 30mi_n~120min 后，再用 PBS洗去未结合抗体及 DAPI, 室温干燥后封片。荧光显微镜或激光共聚焦显微镜检测，检测到阳性细胞的数量为一个以上。

结果：采用本发明所述方法能够从肺组织中富集、提纯干细胞（图 2)。

实施例 3、肝癌组织中肝癌干细胞的富集提纯

制备了来自成体动物的肝癌组织，组织经 PBS缓冲液清洗，清洗 3次，每次 3~5min。

材料：同实施例 2，其中明胶（Amersco)、甲基纤维素（Sigma)、 SBA、 DBA、 TRITC标记的 DBA(T-DBA) 购自 Vector。

方法：

a) 肝癌组织转入无菌培养皿中后，用无菌眼科剪剪切组织为小碎块，转入盛有胶原酶消化液的 50ml 离心管中，在 37°C， 800rpm消化 45min~60min后，加入 4°C预冷的含 10% 胎牛血清 (Fetal bovine serum, FBS) 的 DMEM/F12K培养基终止反应，再用一次性注射器将经消化的组织块吹打成单细胞悬液，之后，在 4°C，以 250g 离心 3~5min，弃上清后加入 4°C预冷的含 2%FBS的 PBS，轻轻混匀，经 200 目筛网过滤入另一个 50ml离心管中，加入 1~10%质量浓度的明胶沉淀红细胞，接触时间为 45mi_n~90min，之后吸取上清，加入 4°C预冷的含 2%FBS的 PBS后离心 3~5min，弃上清后加入 4°C预冷含 2%FBS的 PBS混匀，用血球计数仪计数细胞数量，再加入环磷酰胺、氨甲喋呤、 5氟尿嘧啶接触细胞，时间为 48h~96h，之后在 4°C，以 250g离心 3~5min，弃上清后加入 4°C预冷含 2%FBS的 PBS混匀，离心丢弃上清后加入甲基纤维素结合的凝集素 SBA和凝集素 DBA, 其中，凝集素的浓度为 0.85mg/ml，在 37°C条件下静置 60min后，吸取下层细胞沉淀，加入洗脱糖 N-乙酰半乳糖胺、半乳糖把凝集素结合物从细胞膜上洗脱下来，在 4°C，以 250g 离心 2~3min，弃上清后加入 4°C预冷含 1%FBS的 PBS混匀，胎盘蓝染色细胞存活率 97%。随后，吸取一份细胞与 TRITC-DBA凝集素避光孵育 30~60min，之后，在 4°C，以 250g 离心 3~5min后，丢弃上清，加入 4°C预冷的含 1%FBS的 PBS重悬细胞，流式细胞仪鉴定分析 TRITC-DBA +细胞群的数量，结果表明纯化的干细胞纯度为 98%。在分析前，添加碘化丙碇（PI ) 来排除分析中的死细胞。

b) 4%多聚甲醛溶液固定细胞 30~40mim，室温放置 40min~60min后，再依次经抗原修复（55°C~75°C， 30min~80min)、室温冷却（30min~60min)后加入透膜缓冲液与固定细胞孵育，孵育时间为 20~40min，之后加入 BSA封闭（室温， 30min~60min)， PBS洗去剩余未结合 BSA之后，用抗 CD90抗体与固定细胞进行孵育， 4°C过夜孵育，再用 PBS洗去未结合抗体，之后加入 TRITC-凝集素、 FITC-二抗及 DAPI, 室温孵育 30ηώ ~120ηώ 后，再用 PBS洗去未结合抗体及 DAPI, 室温干燥后封片。荧光显微镜或激光共聚焦显微镜检测，检测到阳性细胞的数量为一个以上。

结果：采用本发明所述方法能够从肝癌组织中富集、提纯干细胞（图 3 )。

实施例 4、从骨髓、脐带血中富集提纯干细胞

分别制备骨髓、脐带血。

材料：同实施例 2，其中 DBA、 UEA购自 Vector, 凝集素的结合物为 PE荧光染料。

方法：

a): 加入 6~15%质量浓度的右旋糖酐于骨髓细胞悬液中，接触细胞的时间为 30min从而沉淀红细胞，随后吸取上清在 4°C，以 230g 离心 3~5min，弃上清后加入 4°C预冷的含 2%FBS的 PBS，轻轻混勾，经 200 目筛网过滤入另一个离心管中用血球计数仪计数细胞数量，再加入丝裂霉素、 5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷接触细胞，时间为 24h~48h，之后在 4°C，以 230g离心 3~5min，弃上清后加入 4°C预冷含 2%FBS的 PBS 混匀，胎盘蓝染色细胞存活率 98%，离心丢弃上清后加入 PE结合的凝集素 DBA, 其中，凝集素的浓度为 1.8mg/ml，在 35°C条件下接触 60min后，在 4°C，以 230g离心 2~3min，弃上清后加入 4°C预冷含 1%FBS 的 PBS混匀，。随后，在 4°C，以 230g离心 3~5min后，丢弃上清，加入 4°C预冷的含 1%FBS的 PBS重悬细胞，流式细胞仪鉴定分析阳性细胞群的数量，结果表明阳性细胞的百分比为 3.9% (图 4.A)，富集提纯的干细胞纯度为 93.8% (图 4.B)。在分析前，添加碘化丙碇（PI) 来排除分析中的死细胞。分选的细胞群可进一步用洗脱糖 N-乙酰半乳糖胺把凝集素结合物从细胞膜上洗脱下来，从而获得不含任何外来标记的细胞群，进一步可加入生理盐水调节干细胞的浓度和体积。

b) 加入 6~15%质量浓度的右旋糖酐于脐带血细胞悬液中，接触细胞的时间为 40min从而沉淀红细胞，随后吸取上清在 4°C，以 220g 离心 3~5min，弃上清后加入 4°C预冷的含 2%FBS的 PBS，轻轻混匀，经 160 目筛网过滤入另一个离心管中用血球计数仪计数细胞数量，再加入丝裂霉素、 5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷接触细胞，时间为 24h~48h，之后在 4°C，以 220g离心 3~5min，弃上清后加入 4°C预冷含 2%FBS的 PBS 混匀，胎盘蓝染色细胞存活率 98%，离心丢弃上清后加入 PE结合的凝集素 UEA, 其中，凝集素的浓度为 2.3mg/ml, 在 37°C条件下接触 45min后，在 4°C，以 220g离心 2~3min，弃上清后加入 4°C预冷含 1%FBS 的 PBS混匀，。随后，在 4°C，以 220g离心 3~5min后，丢弃上清，加入 4°C预冷的含 1%FBS的 PBS重悬细胞，流式细胞仪鉴定分析阳性细胞群的数量，结果表明阳性细胞数量为 4.3% (图 4.C)，富集提纯的干细胞纯度为 95.6% (图 4.D)。在分析前，添加碘化丙碇（PI) 来排除分析中的死细胞。分选的细胞群可进一步用洗脱糖海藻糖把凝集素结合物从细胞膜上洗脱下来，从而获得不含任何外来标记的细胞群，进一步可加入生理盐水调节干细胞的浓度和体积。

结果：采用本发明所述方法能够从骨髓、脐带血中富集、提纯干细胞（图 4)。

实施例 5、采用试剂盒富集、提纯心脏干细胞及其应用方法

本发明的试剂盒组成：

( 1 ) 细胞负向选择试剂 A: 化疗药物环磷酰胺、卡铂、 5-氟尿嘧啶；

(2 ) 细胞正向选择试剂 B : 凝集素结合物 FITC-HP;

( 3 ) 细胞预处理试剂 C: 羧甲基淀粉；

(4 ) 洗脱缓冲液：洗脱糖；

(5 ) 容器：用于盛放 a)、 b)、 c)、 d)三种溶液的方形试剂瓶；

实验材料：同实施例 2。

应用方法：

a)加入羧甲基淀粉（细胞预处理试剂 C) 与分离的心脏细胞群混匀，室温静置 20~30min，吸取上清后在 4°C，以 200g离心 3~5min，弃上清后加入 4°C预冷含 2%FBS的 PBS重悬细胞沉淀，之后用血球计数仪计数细胞数量，加入细胞负向选择试剂 A，接触细胞的时间为 60min~120min，在 4°C，以 200g离心 3~5min，弃上清后加入 4°C预冷含 2%FBS的 PBS重悬细胞沉淀，细胞被等分为两份，一份加入细胞正向选择试剂 B，其中，凝集素的浓度为 10mg/ml，接触细胞的温度和时间分别为 32°C和 45min，一份加入等体积的过量同型对照，之后，在 4°C，以 200g 离心 3~5 min后，丢弃上清，加入 4°C预冷含 2%FBS的 PBS重悬细胞沉淀，流式细胞仪分选阳性细胞群，纯化的干细胞纯度为 92。/。。在分析前，添加碘化丙碇（PI ) 来排除分析中的死细胞。

b) 4%多聚甲醛溶液固定细胞 15~30mim，室温放置 30min~60min后，再依次经抗原修复（55°C~75°C， 30min~80min)、室温冷却（30min~60min)后加入透膜缓冲液与固定细胞孵育，孵育时间为 30~60min，之后 BSA封闭（室温， 30min~60min)， PBS洗去剩余未结合 BSA之后，用抗 Nkx2.5抗体与固定细胞进行孵育， 4°C过夜孵育后，再用 PBS 洗去未结合的抗体，之后，加入 TRITC-二抗及 DAPI 在室温孵育 60ηώ ~120ηώ后，再用 PBS洗去未结合抗体及 DAPI, 室温干燥后封片。荧光显微镜或激光共聚焦显微镜检测，检测到阳性细胞的数量为一个以上。

结果：采用本发明的试剂盒能够从混合细胞群中富集、提纯心脏干细胞（图 4)。

进一步，根据需要，可加入洗脱糖 Ν-乙酰半乳糖胺把凝集素结合物从细胞膜上洗脱下来，从而获得不带任何外来标记的细胞悬液，其中，可通过加入 PBS缓冲液调节所述细胞悬液的体积和浓度。

工业实用性

如上所述，依照本发明的方法、试剂盒，可以用一种简单、快速且经济的方法，一方面准确且有效地富集提纯干细胞，而由此得到的含细胞液体无需随后繁琐的细胞悬液制备过程，可直接进行深低温保藏，由本发明方法、试剂盒获得的干细胞，其不携带外来标记，以便其用于基础研究和医疗应用相关的产业，如干细胞自我更新机理及相关技术研究、干细胞用于治疗、修复受损或病变组织、干细胞移植技术领域、免疫治疗领域以及药物筛选等。

Claims

用于富集、提纯干细胞的方法，其特征在于：联合化疗药物与凝集素用于从细胞群体中富集、提纯干细胞，所述方法包括：

(2) 再使所述细胞群与凝集素结合物进行接触，后者含有：至少一种凝集素，其可与所述细胞上的受体结合，随后将凝集素结合的细胞群与剩余细胞样品分离；

根据权利要求 1所述的方法，其特征在于，进一步包括在所述细胞群与化疗药物接触之前进行细胞预处理所述细胞群体。

根据权利要求 2所述的方法，其特征在于，细胞预处理过程选择采用沉淀或裂解法沉淀或裂解细胞群中的红细胞的试剂，所述试剂可选择为质量浓度为 0.1~20%的羟乙基淀粉、明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、羧甲基淀粉的任一一种；或可选择为氯化铵红细胞裂解液、质量浓度小于 0.9% 的生理盐水溶液的任一一种；或选择泛影酸钠-葡聚糖、 HITOPAQUE、 Ficoll的任一一种，所述试剂至少重复接触所述细胞群一次。

根据权利要求 1所述的方法，其特征在于，所述化疗药物包括但不限于抗生素化疗药物、抗代谢化疗药物、烷化剂化疗药物、激素及内分泌化疗药物、植物化疗药物、亚硝脲类化疗药物、抗体阻断剂化疗药物、门冬酰胺酶、甲基苄肼、草酸铂、铂类、丙亚胺、羟基脲和氨烯咪胺及其衍生物的一种或两种以上的组合，所述化疗药物接触所述细胞群的时间小于或等于 168小时。

根据权利要求 1所述的方法，其特征在于，所述凝集素和或凝集素结合物中的凝集素包括天然的或化学合成的植物凝集素、动物凝集素或其衍生物的一种或两种以上的组合，所述凝集素的浓度为 0.001~50mg/ml, 与所述细胞群接触的时间为小于或等于 150分钟，孵育温度为小于或等于 38°C。根据权利要求 1或 5所述的方法，其特征在于，所述凝集素结合物中的结合物可选择预先与荧光染料、磁性微球或高分子量的生物大分子的任一一种进行结合，或选择具有对凝集素有亲和力抗体或抗体衍生物或抗体片段的一种。

根据权利要求 6所述的方法，其特征在于，所述与凝集素结合的高分子量的生物大分子的分子量在一万道尔顿（Mw) 至五十万道尔顿（Mw ) 之间，其中所述高分子量的生物大分子可选择为牛血清白蛋白、羟乙基淀粉、明胶、甲基纤维素、羧甲基淀粉、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮的任一一种。

根据权利要求 1所述的方法，其特征在于，所述含干细胞的细胞群来源于啮齿动物、人类或其他哺乳动物的胚胎组织、成体组织、肿瘤 /癌前组织、肿瘤 /癌性组织、转移瘤 /癌组织或其他潜在包含干细胞的一种或两种以上组织的组合，或选择来自所述组织的原代、传代细胞群的一种或两种以上的组合。

9. 联合化疗药物与凝集素用于富集、提纯干细胞的试剂盒及其应用方法，其在用于从所述细胞群中富集、提纯干细胞的用途。

10.根据权利要求 9所述的用于富集、提纯干细胞的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括：

1 ) 细胞负向选择试剂 A;

2) 细胞正向选择试剂 B;

3 ) 以及任选的容器；

11.根据权利要求 10所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括细胞预处理试剂 c，用于沉淀或裂解所述细胞群中的红细胞。

12.根据权利要求 10所述的试剂盒，其特征在于，所述含干细胞的细胞群是啮齿动物、人类或其他哺乳动物来源的正常成体、胚胎组织和或病变、肿瘤、癌前、癌性、癌转移组织，或来自所述组织的原代、传代细胞群的一种或两种以上的组合。

13.根据权利要求 1、 9或 10中任一权利要求所述，其中，随后可选择采用荧光活化细胞分选法用于鉴定和分选结合凝集素结合化合物的细胞群或选择沉淀法分离结合凝集素的所述细胞群，进一步，分离的所述干细胞，其包含细胞膜上的可与凝集素结合的受体。

14.根据权利要求 1、 9或 10中任一权利要求的方法、试剂盒获得的提纯的干细胞，其特征在于，通过加入洗脱糖的方法把所述凝集素结合物从所述细胞上洗脱，从而使得获得的干细胞不带任何外来标记物。

15.根据权利要求 1、 9或 10中任一权利要求所述，其中所述富集提纯的干细胞包括全能干细胞、多能干细胞、专能干细胞、成体干细胞、肿瘤干细胞、癌干细胞，进一步，其与已知干细胞标志物接触。根据权利要求 1、 9或 10任一权利要求所述，获得的干细胞还可加入生理盐水、 PBS缓冲液、 HBSS 缓冲液以调整干细胞的浓度和体积。

根据权利要求 9所述的试剂盒应用方法，其特征在于，其应用方法包括以下步骤：

(4) 重复步骤（3 ) 两到三次；

(5 ) 使经过步骤（4 ) 的所述细胞群与所述细胞正向选择试剂 B 接触，所述凝集素的浓度为 0.001~50mg/ml, 与所述细胞群接触的时间为小于或等于 150分钟，孵育温度为小于或等于 38°C；

(6) 分离获得凝集素阳性的细胞群：可选择采用荧光活化细胞分选、磁珠分选法或静置沉淀法；

(7) 加入洗脱糖把所述凝集素结合物从经步骤（6) 获得的所述细胞上洗脱，从而使得获得的干细胞不带任何外来标记物，进一步，获得的干细胞还可加入生理盐水、 PBS缓冲液、 HBSS缓冲液以调整干细胞的浓度和体积。