CN1280611A - 结合造血干细胞的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及结合造血干细胞的方法和组合物。本文所述的方法利用与这种干细胞表面上的唾液酸化乳糖胺结构形成复合物的结合配对物。这种复合物的形成有利于如固定,纯化,鉴定和靶向造血干细胞。本发明的组合物一般含有结合配对物,该配对物可以是游离的,或与支持物结合或与标记物或治疗剂相连。

Description

结合造血干细胞的方法和组合物
技术领域
本发明一般涉及结合造血干细胞的方法和组合物。本发明更具体地涉及固定化，纯化或标记干细胞的方法。本发明还涉及将药剂，如治疗剂靶向干细胞的方法。
发明背景
基因疗法是预防和治疗多种疾病的理想方法。然而，在实践中，基因疗法的应用受到实际问题的限制，如不能将药剂特异性地靶向所需的细胞类型或基因有所变化的细胞寿命有限。
使用多效造血祖细胞作为基因疗法的载体可有效克服上述难题。可在体外基因修饰这些特征在于称为CD34的细胞表面标记的干细胞，然后使用常规技术将它们植入患者体内。植入后，转基因细胞可直接定居于骨髓，必要时使宿主的所有血细胞全面种群恢复，最后得以重建。在此方法中，可在体内组成型再生的细胞群体中产生所需的基因产物。
然而，以往利用造血干细胞上述特性的尝试受到与体外操作相关的困难的阻碍。在培养中，这些祖细胞失去其多能性并有所分化。为了避免这一问题，将干细胞与微管内皮饲养细胞(非人源脑的原代细胞)和某些细胞因子一起共培养。在这种条件下，干细胞扩展的群体可仍为CD34+和CD38-，同时与饲养细胞相互作用(见Davis等，血液85：1751-61，1995)。与这些内皮细胞的粘附似乎是维持多能的CD34表型所必需的。这种共培养技术似乎能稳定干细胞的去分化状态以便于基因操作。不幸的是，严重的缺点(如饲养细胞寿命有限，潜在的生物学危害和免疫应答的交叉-类型)使人无法考虑将此方法用于治疗目的。人们需要新的结合造血干细胞的方法来避免这些缺点。
与干细胞结合的药剂也有助于在例如骨髓移植前纯化该细胞。目前的亲和方法常涉及CD34抗原表位的识别。在此方法中，已碰到特异性问题和从亲和基质上释放的问题。
因此，本领域需要能克服现有技术中所存在缺点的固定和纯化造血干细胞的改良方法。本发明满足了此需求并提供了进一步相关的优点。
发明简述
简单地说，本发明提供了结合造血干细胞的方法和组合物。一方面，本发明提供了固定造血干细胞的方法，它包括将含有造血干细胞的生物样品与结合配对物接触，其中结合配对物与含有NeuAcα2-3Galβ1-4结构的唾液酸化糖链结合。在具体的实施方案中，在复合物形成之前或之后，结合配对物可与固体支持物结合。适当的结合配对物包括抗体及其抗原结合片断和凝集素。在进一步优选的实施方案中，唾液酸化的糖链含有NeuAcα2-3(Galβ1-4GlcNAcβ1-3)n结构，其中n是1至100的整数，更优选为2至50。
在相关的方面，提供了纯化造血干细胞的方法。所述方法包括：(a)将含有造血干细胞的生物样品与结合配对物接触以形成干细胞-结合配对物复合物，其中结合配对物与含有NeuAcα2-3Galβ1-4结构的唾液酸化的糖链结合；和(b)从未结合的生物样品中分离干细胞-结合配对物复合物。为了便于分离，在复合物形成之前或之后，结合配对物可与固体支持物结合。适当的结合配对物包括抗体及其抗原结合片断和凝集素。在进一步优选的实施方案中，唾液酸化的糖含有NeuAcα2-3(Galβ1-4GlcNAcβ1-3)n结构，其中n是1至100的整数，更优选为2至50。
在其它方面，本发明提供了将药剂靶向造血干细胞的方法，所述方法包括将含有造血干细胞的生物样品与结合配对物接触，其中结合配对物与含有NeuAcα2-3Galβ1-4结构的唾液酸化的糖链结合，其中结合配对物与药剂有关。适当的结合配对物包括抗体及其抗原结合片断和凝集素。在进一步优选的实施方案中，唾液酸化的糖链含有NeuAcα2-3(Galβ1-4GlcNAcβ1-3)n结构，其中n是1至100的整数，更优选为2至50。适当的药剂包括毒性化合物，治疗化合物和可测标记物。
本发明还提供了用于上述方法的试剂盒。用于固定造血干细胞的试剂盒含有：(a)干细胞的结合配对物，其中结合配对物与含有NeuAcα2-3Galβ1-4结构的唾液酸化的糖链结合；和(b)洗涤溶液，其中结合配对物和洗涤溶液放在分开的区室或容器中。结合配对物可以但不必与如组织培养皿的支持物结合。在另一个实施方案中，提供了用于分离和／或纯化干细胞的试剂盒，它包括：(a)干细胞的结合配对物，其中结合配对物与含有NeuAcα2-3Galβ1-4结构的唾液酸化的糖链结合；和(b)固体支持物。在另一个实施方案中，本发明提供了用于标记或分选造血干细胞的试剂盒，它包括：(a)与可测标记物相连的干细胞结合配对物，其中结合配对物与含有NeuAcα2-3Galβ1-4结构的唾液酸化的糖链结合；和(b)检测试剂，其中结合配对物和检测试剂放在分开的区室或容器中。
在其它实施方案中，本发明提供了药物组合物，它们含有：(a)与干细胞结合配对物相连的药剂，其中结合配对物与含有NeuAcα2-3Galβ1-4结构的唾液酸化的糖链结合；和(b)药物可接受的载体。
本发明的组合物(及其中的药剂)还被提供用作药物和用于制备例如通过基因疗法治疗疾病的药物。
参照下列详细描述和附图，本发明的这些和其它方面将是显而易见的。本文所公开的所有参考文献都全文列入本文作为参考，就好象每篇都单独列出一样。
附图简述
图1图示说明了ELISA中单克隆抗体NUH2与新糖蛋白的结合。使用了4种不同的糖蛋白：“O”3′SL-APEA-BSA；“□”3′SL-APD-BSA；“◇”3′SL-BSA；和“×”M6-BSA。3种含有直接或经由2-(4-氨基苯基)乙胺(APEA)或氨基苯二胺(APD)与牛血清白蛋白(BSA)相连的3′唾液酸乳糖(3′SL)。第4种是直接与BSA相连的M6。结果表示为作为新糖蛋白浓度函数的OD450。
图2是阐明使用代表性的结合配对物固定造血干细胞的直方图。结果表示为所示各个结合配对物的荧光单位。
图3是阐明使用代表性的结合配对物固定造血干细胞的直方图。结果表示为所示各个结合配对物的荧光单位。
图4描述了将代表性的结合配对物NUH2与人脐带血细胞上存在的表面标记物的结合同与抗-CD34抗体HPCA2-PE的结合相比较的两色FACS分析结果。数据被表示为等值线图，其描述了绿色和红色荧光的二元分布。绘制出等值线以表示特定数目处的细胞计数。
图5描述了将对照IgM抗体与人脐带血细胞上存在的表面标记物的结合同与抗-CD34抗体HPCA2-PE的结合相比较的两色FACS分析结果。数据被表示为等值线图，其描述了绿色和红色荧光的二元分布。绘制出等值线以表示特定数目处的细胞计数。
发明详述
如上所述，本发明涉及结合造血干细胞的方法和组合物。本文所述的方法利用与这种干细胞表面的唾液酸化乳糖胺结构结合的结合配对物以形成结合配对物-干细胞复合物。这种复合物的形成有利于多种操作，如固定，纯化，鉴定和靶向造血干细胞。本发明的组合物一般含有结合配对物，根据所需用途，该配对物可以是游离的，或与支持物结合或与标记物或治疗剂相连。
在详细描述本发明之前，提供本文所用某些术语的定义将有助于理解本发明。本文所用术语“结合”指的是两个独立分子(各自可以是游离的(即在溶液中)或存在于细胞或固体支持物的表面)之间能形成“复合物”的非共价结合。该复合物可以是游离的，或(共价或非共价)固定于支持物上。一般可通过测定复合物形成的结合常数来评价一个分子与另一个分子结合的能力。结合常数是复合物浓度除以产物组分浓度得到的值。一般说来，在本发明中，当复合物形成的结合常数超过约102L／mol时，即可认为两个化合物已“结合”。
使用本领域技术人员众所周知的方法可测定结合常数。例如，使用平衡透析法可测定相对小的糖类和大分子结合配对物之间复合物形成的结合常数。简单地说，用透析膜将两个已知体积的槽分开，使小分子量的糖类而不是大分子的结合配对物(如抗体)发生转移。用报道基团(如氚)标记糖类，将其加入槽1溶液中，而结合配对物被置于槽2溶液中。然后使糖类分子扩散至槽2中直至糖类转移达到平衡(一般约为1至3天)。然后，通过测定每个槽中糖类的量(使用报道基团易于测定)并使用等式Ⅰ可测定结合常数：其中[C]是未复合的糖类的浓度，[B]是未复合的结合配对物的浓度，[CB]是复合物的浓度。由于[C]是槽1中糖类的浓度(即[C1])；[B]是结合配对物原始浓度(即[B0])和[CB]之间的差值；[CB]是槽2中糖类的浓度和槽1中糖类的浓度的差值(即[C2]-[C1])，所以可以可测项重写等式Ⅰ为等式Ⅱ：
在本发明中，已发现造血干细胞上选择性表达唾液酸化的乳糖胺结构。换句话说，相对于T细胞而言，唾液酸化的乳糖胺结构以较高浓度或以有利于与结合配对物结合的构象存在于造血干细胞表面。还发现可使用这些唾液酸化2型链的结合配对物选择和固定造血干细胞。因此，本发明中的“结合配对物”是任何药剂，如化合物或细胞，它能与含有NeuAcα2-3Galβ1-4R结构的唾液酸化的糖链结合和／或与含有NeuAcα2-3(Galβ1-4GlcNAcβ1-3)n-R结构的唾液酸化的线性或分支乳糖胺结合，其中n是1至100的整数，优选为1至50，更优选为2至50，其中R表示分子的其余部分(如果有的话)。例如，R可以是糖类或非糖类组成成分，如蛋白质或脂质。这种组成成分可被包括以有助于例如纯化，检测或固定糖类。其中R是脂质的代表性的糖类结构包括：
NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-1神经酰胺和：其中R是蛋白质的代表性结构是：
Figure 9881148300112
和：
NcuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-3GalNAcαl-Ser-蛋白质
满足上述需求的任何药剂(如细胞或分子)都可以是结合配对物。在一个优选的实施方案中，结合配对物包括针对适当免疫原产生的抗体或其结合片断。适当免疫原包括吸附和包被于经酸处理的明尼苏达沙门氏菌上的神经节苷脂，得自脐带血的人胎红细胞或人结肠腺癌细胞。
可通过本领域技术人员已知的多种技术中的任一种制备抗体。例如见Harlow和Lane，抗体：实验室手册，冷泉港实验室，1988。在一种技术中，先将免疫原注射到多种哺乳动物(如小鼠，大鼠，兔，绵羊或山羊)中的任一种中。一次或多次注射之后，周期性地取动物血。然后使用与适当固体支持物偶联的免疫原，通过例如亲和层析从这种抗血清中纯化特异于免疫原的多克隆抗体。
使用例如Kohler和Milstein，欧洲免疫学杂志，6：511-519，1976的技术及其改良方法可制备特异于所需糖结构的单克隆抗体。简单地说，这些方法包括由得自按上述方法免疫了动物的脾细胞制备无限增殖的细胞系，该细胞系能产生具有所需特异性的抗体。通过例如与骨髓瘤细胞融合配对物融合可使脾细胞无限增殖，优选骨髓瘤细胞与经免疫的动物同系。选择单个集落，检测其培养物上清液对本文所述唾液酸化的糖类的结合活性。优选分泌具有高反应性和特异性抗体的杂交瘤。
使用或不用本领域已知的多种技术从培养的杂交瘤集落的上清液中分离单克隆抗体以增加产量。通过常规技术，例如层析，凝胶过滤，沉淀和提取从抗体中除去污染物。一般根据其在免疫测定法中与一种或多种适当的新糖蛋白结合的能力来鉴定具有所需活性的抗体。适当的新糖蛋白包括含有下列结构之一的那些糖蛋白：
NeuAcα2-3Galβ1-4(Glc)-APD-HSA；或
NeuAcα2-3(Galβ1-4GlcNAcβ1-3)nGalβ1-4(Glc)-APD-HSA其中n如上文所定义；或上述糖蛋白是糖类结构与人或牛血清白蛋白(分别为HSA或BSA)的缀合物。由于白蛋白是非糖基化的，所得的新糖蛋白仅含有与分子化学相连的糖类结构。上文提及的第一种新糖蛋白可从几个商家购得，本领域技术人员可合成这两种分子。一般说来，糖类通过糖链还原末端的还原氨基化而与间隔物乙酰基苯二胺(APD)连接。在这些情况下，葡萄糖被还原，环被打开，产生了氨基糖醇。因此圆括号中显示出葡萄糖单位。
通过对得自脐带的人血进行两色荧光激活细胞分选分析(FACS分析)可进一步鉴定抗体。一个抗体可针对造血干细胞标记物CD34。这种抗体可购自Becton Dickinson，San Jose，CA(HPCA-2PE)，它被红色的荧光标记物藻红蛋白所标记。可直接(使用例如得自MolecularProbes，Inc．，Eugene，OR的标记物)或间接(如使用荧光素标记的山羊抗小鼠IgM，可得自KPL，Gaithersburg，MD)使用绿色荧光标记物(荧光素)标记受试抗体。导致所有红色荧光细胞被绿色荧光所标记的抗体是优选的。
一个适当的结合配对物是抗体NUH2(见美国专利5，227，160)。此抗体是IgM，是由经二唾液酸神经节苷脂免疫的小鼠产生的杂交瘤生成的，所述二唾液酸神经节苷脂得自人结肠腺癌细胞并被包被于经酸处理的明尼苏达沙门氏菌上(见Nudelman，生物化学杂志，264：18719-25，1989)。已发现抗体NUH2可与上述两个新糖蛋白结合，也能与含有唾液酸化乳糖胺结构的分支二唾液酸神经节苷脂结合。在两色FACS分析中，抗体NUH2也标记通过商购抗体HPCA-2-PE鉴定的所有CD34+细胞。
在另一个优选的实施方案中，结合配对物包括凝集素或其衍生物，如保留结合特性的变化或截短形式，和凝集素和／或衍生物的组合。一个适当的截短形式是互补决定区(CDR)域(见Saragovic等，科学，253：792-95，1991)。适当的凝集素结合配对物包括但不限于植物凝集素，如番茄凝集素，朝鲜槐(Maackia amurensis)凝集素，西洋接骨木(Sambucus nigra)凝集素，普通小麦(Triticum vulgaris)凝集素和鸡冠刺桐(Erytheina cristagalli)凝集素；哺乳动物凝集素，如唾液酸粘附素(见Kelm等，糖缀合物杂志，13：913-26，1996)和galectins；和细菌凝集素，如幽门螺杆菌的糖类受体(见Teneberg等，生物化学杂志，272：19067-71，1997)。
如上所述，一般可通过评价推定结合配对物与含有NeuAcα2-3Galβ1-4R结构的受试唾液酸化糖链结合的能力来鉴定结合配对物。可使用多种众所周知的结合试验中的任一种来筛选推定的结合配对物，其中包括免疫测定法。可如上所述测定结合配对物与受试糖类之间相互作用的结合常数。
一般可使用本领域技术人员已知的方法，由商购材料制备受试的唾液酸化的糖链。例如，一般可根据Srivastava等，糖化学杂志，10：927-933(1991)的方法制备多种长度的乳糖胺链。使用唾液酸转移酶或转唾液酸酶可使该链唾液酸化。唾液酸转移酶将糖核苷酸CMP-NeuAc上的唾液酸(NeuAc)酶促转移至受体糖链上。转唾液酸酶在唾液酸化和非唾液酸化的糖链之间转移唾液酸。一个例子是将3′唾液酸乳糖的NeuAc转移至lacto-N-neotetraose上以产生上文新糖蛋白中所示的3′sialylacto-N-neotetraose。
本文所用的“生物样品”指的是含有造血干细胞的任何组织样品或细胞制品，包括血液，骨髓，浅黄层细胞(buffy coat cell)，脐带血和体外生长和／或扩展的细胞。在本发明方法中，该制品在使用前可以但不必经处理和／或分级分离。例如，生物样品可以是经或未经细胞因子处理的血液制品。
下文更详细讨论的是，可使用结合配对物固定干细胞。本文所用术语“固定”指的是干细胞和结合配对物之间可导致干细胞-结合配对物复合物形成的非共价相互作用，其中结合配对物或复合物与固体支持物结合。在一个优选的实施方案中，在固定复合物之前，结合配对物与干细胞结合。在另一个优选的实施方案中，在与干细胞接触之前，结合配对物与固体支持物结合。本文所用术语“结合”指的是结合配对物或干细胞-结合配对物复合物和固体支持物之间的共价或非共价相互作用，所述相互作用的结合常数至少为103L／mol。
可使用本领域已知的，且在专利和科技文献中有大量描述的多种与固体支持物结合的技术中的任一种。一般可通过非共价结合，如吸附或亲和，或经由共价结合达到结合的目的。通过在适当缓冲液中与固体支持物接触适当一段时间即可完成通过吸附法给合结合配对物或复合物。接触时间随温度而变化，但一般为约5秒至1天，典型地约为10秒至2小时。使用含有与结合配对物和／或复合物结合的化合物的支持物一般可实现亲和结合(如可使用结合有亲和素的支持物结合与生物素相连的结合配对物)。这种化合物自身可被吸附或共价结合。
化合物与固体支持物的共价结合可以是结合配对物或复合物与支持物上功能基团之间的直接连接，也可以是利用交联剂的连接。使用交联剂的结合一般可通过首先将支持物与双功能试剂反应来实现，所述试剂可与支持物和化合物上的功能基团，如羟基或氨基反应。例如，通过支持物上的醛基与结合配对物上的胺和活性氢缩合(例见Pierce免疫技术目录和手册(1991)，A12-A13)或通过支持物上的氨基与结合配对物上的羧酸缩合，结合配对物可与使用苯醌，具有适当聚合物包被的支持物结合。
在下文讨论的本发明的一些实施方案中，药剂可与结合配对物结合以使药剂能靶向造血干细胞。“药剂”可以是化合物或细胞，可以是治疗化合物，细胞毒性化合物或适于标记造血干细胞的标记物或可测标记物(例如，用于细胞分选或体内成像)。这种结合可以是非共价的(如利用疏水相互作用或掺入脂质体)，但优选为共价的，通过标准的重组或化学方法可实现此目的。本发明中的“靶向”指的是体外或体内将药剂特异性地导向造血干细胞以使药剂能更有效地传递至造血干细胞而不是其它细胞类型。例如，可使用标准技术(如FACS)，用与可测标记物结合的结合剂来鉴定细胞混合物中的造血干细胞。然而，为了成功地进行骨髓移植，造血干细胞群体仅需要被富集几倍，其中的T细胞和其它促使移植物抗宿主疾病的污染细胞被耗尽。
在本发明的一个方面，提供了固定造血干细胞的方法。首先将含有这种干细胞的生物样品与结合配对物接触。结合配对物可与固体支持物结合，或在形成复合物之后进行结合。优选的用于扩展和基因转导的固体支持物包括组织培养皿，中空纤维生物反应器和袋，如血液和细胞收集袋。为了进行纯化，层析基质是优选的支持物。一般说来，使用过量于干细胞数目的结合配对物以便于干细胞-结合配对物复合物的形成。
结合配对物与生物样品接触的适当条件一般是利于复合物形成并维持细胞存活的条件。本领域技术人员通过在一系列不同条件下评价复合物形成的结合常数易于确定这种条件。适当条件包括室温下的生理条件，如pH 7．4等渗盐水(如0．15M NaCl)。本领域技术人员清楚地知道：给定生物样品中干细胞的充分复合所必需的结合配对物的量取决于样品中干细胞的浓度，给定结合配对物的结合常数和生物样品中存在的其它物质。一般说来，结合配对物的浓度约为0．1μg／mL至10mg／mL，典型地约为1μg／mL至1mg／mL就足够了。
复合物形成之后，必要时可将干细胞-结合配对物复合物与固体支持物结合。然后利用多种已知技术中的任一种，如过滤和／或用适当缓冲液洗涤，从固定的干细胞中除去其余生物样品。
按本文所述固定的造血干细胞一般可用于多种体外操作，包括扩展和基因转导。本发明的固定方法一般具有允许扩展去分化状态的干细胞的优点。
在相关的方面，本发明提供了纯化造血干细胞的方法。“纯化”指的是从至少部分生物样品组分中分离干细胞，纯化的干细胞可存在于干细胞-结合配对物复合物中。在此方面，按上述将生物样品与结合配对物接触。如果与生物样品接触之前，结合配对物不与支持物结合，即在接触之后结合复合物并从未结合的生物样品部分中分离该复合物。然后使用任何适当的技术从结合配对物中释放细胞。优选地，通过与高浓度的糖类半抗原一起保温以竞争与结合配对物的结合，从而达到释放的目的。或者，通过在降低或消除结合配对物活性的条件下(如改变pH和／或阳离子浓度)保温可洗脱细胞。在适当情况下，通过机械搅拌可从固定的结合配对物上洗脱细胞。任选地，可使用其它亲和物质进行进一步的纯化步骤。
在其它方面，可使用本文所述的结合配对物在体外或体内将药剂靶向造血干细胞。如上所述，可将多种与结合配对物结合的药剂中的任一种特异性地导向造血干细胞。例如，药剂可以是适于细胞鉴定和体外分选或体内成像的可测标记物。所述标记物是本领域技术人员众所周知的，包括放射性核素，发光基团，荧光基团，酶(如辣根过氧化物酶)，底物，辅因子，抑制剂，染料，免疫球蛋白恒定区和生物素。或者，药剂可以是治疗或细胞毒性化合物。其它药剂包括编码可测标记物，治疗剂或细胞毒性化合物的多核苷酸。
为了在体外或来自体内传递药剂，按上述将生物样品与同结合配对物结合的药剂接触。然后通过标准技术，如过滤，离心，沉淀，洗脱或其它适当方法除去未结合的结合配对物。对可测标记物而言，然后可通过本领域技术人员已知的任何适当方法检测药剂，方法的选择部分取决于所用药剂。例如，使用众所周知的技术可将与结合配对物结合的荧光剂，如荧光素用于FACS分析。
对体内应用而言，一般给受试者施用药物组合物形式的与结合配对物相连的药剂。药物组合物可以是无菌的含水或不含水悬浮液或乳剂，它还含有药物可接受的载体(即不干扰活性成分活性的无毒物)。本发明的药物组合物中可使用本领域技术人员已知的任何适当载体。代表性的载体包括生理盐水溶液，明胶，水，乙醇，天然或合成油，糖类溶液，二元醇，可注射的有机酯，如油酸乙酯或上述物质的组合。任选地，药物组合物还可含有防腐剂和／或其它添加剂，如抗微生物剂，抗氧化剂，螯合剂和／或惰性气体，和／或其它活性成分。为了进行成像，在以足够的时间定位可测标记物之后，结合配对物与造血干细胞结合，使用常规的成像技术，如X-射线技术可以检测到这种结合。
在本发明的其它方面，提供了可用于本文所述的任何方法的试剂盒。用于固定造血干细胞的试剂盒一般含有结合配对物，该配对物可与组织培养皿结合。为了分离和纯化干细胞，试剂盒可含有结合配对物以及滤器或层析支持物。用于标记，细胞分选或体内成像的试剂盒一般含有与可测标记物结合的结合配对物。为了治疗用途，试剂盒可含有与治疗剂结合的结合配对物。除了上述组分外，试剂盒中一个或多个额外的区室或容器一般圈起组成元件，如试剂，缓冲液和／或洗涤溶液以用于方法中。
提供下列实施例是为了阐明而不是限制本发明。
实施例
实施例1：
鉴定造血干细胞上唾液酸化的乳糖胺结构
本实施例阐明了使用特异于CD34+细胞的抗体鉴定造血干细胞表面上的唾液酸化的乳糖胺结构。
在酶联免疫测定法(ELISAs)中使用单克隆抗体NUH2(ATCC保藏号为HB 9762)结合糖结构。单克隆抗体NUH2是由经二唾液酸神经节苷脂免疫的小鼠产生的IgM同种型，所述神经节苷脂分离自结肠腺癌并吸附于经酸处理的明尼苏达沙门氏菌上(见美国专利5，227，160)。
为了产生新糖蛋白文库，将纯化的寡糖与人血清白蛋白化学偶联。每个新糖蛋白分子含有一个特异性纯化的寡糖的大约10至15条链。为了进行筛选，于4℃将充满了经磷酸缓冲盐水，pH 7．4(PBS)稀释的新糖蛋白(100μl)的孔保温过夜，从而将新糖蛋白文库包被于微滴板孔的表面。然后加入含2％牛血清白蛋白的PBS并于室温下保温2小时以封闭孔。用PBS洗涤孔之后，在所有孔中加入用PBS稀释至10μg／ml的单克隆抗体(100μl)。室温下保温微滴板2小时，然后洗涤板，用浓度为1μg／ml的经过氧化物酶-标记的山羊抗小鼠IgM(KPLlabs，Gaithersburg，MD)充满孔(100μl)，室温下保温1小时。然后洗涤板，加入100μl／孔TMB试剂(KPL labs，Gaithersburg，MD)。5分钟之后，在每孔中加入100μl 1M磷酸以终止颜色反应。然后通过使用Titertek Multiskan MCC／340(Flow Laboratories，Inc．，McLean，VA)测定450 nm下的光吸收来测定每孔中的颜色强度。
如图1所示，单克隆抗体NUH2结合含有3′唾液酸乳糖的结构。
实施例2：
使用结合配对物固定干细胞
本实施例阐明了使用抗体结合配对物固定造血干细胞。
通过静置细胞粘附测定法检测包被有抗体和凝集素的表面固定CD34+细胞的情况。在96孔微滴板的孔中加入用含有10mM Tris，0．15M NaCl，1mM CaCl2的pH 7．4缓冲液稀释的抗体和凝集素并于4℃保温过夜。在每孔中加入牛血清白蛋白(2％，溶于TrisCa缓冲液)，室温下至少保温2小时以降低非特异性结合。37℃，将购自PoeticTechnologies公司(Gaithersburg，MD)的CD34+细胞(106个细胞／ml)与用Dulbecco′s PBS(DPBS)稀释至浓度为2μg／ml的calcein AN(Molecular Probes，Eugene OR)保温20分钟。用DPBS洗涤微滴板5次之后，在每孔中加入100μl细胞。室温下将微滴板置于固定位置保温25分钟。保温之后，在洗涤槽(GlycoTech公司，Rockville MD)中将微滴板翻转达6分钟。然后从槽中取出微滴板，分别以485和530的激发和发射波长(Cytofluor 2350，PerSeptive Biosystems)测定每孔中的荧光。
结果示于图2和3。CD34+细胞与结合抗体NUH2，朝鲜槐凝集素，番茄凝集素和唾液酸粘附素结合，但不与阴性对照蛋白质(BSA和IgM)结合。这些结果表明抗体和凝集素结合配对物可固定造血干细胞。
实施例3：
使用抗-糖类抗体鉴定造血干细胞
本实施例阐明了通过荧光激活细胞分选(FACS)，使用代表性的抗体结合配对物鉴定造血干细胞。
使用红色和绿色荧光，通过荧光激活细胞分选仪分析造血干细胞表面上标记物的表达。用含有0．1％叠氮化钠的Dulbecco′s PBS，pH7．4将人脐带血洗涤2次。然后将细胞分开放在不同的管中。在不同的管中各加入10ug／ml单克隆抗体NUH2和对照IgM。4℃保温1小时之后，洗涤细胞并分别与FITC-标记的山羊抗小鼠IgM和FITC标记的链霉亲和素(1μg／ml)(KPL Iabs，Gaithersburg，MD)保温。4℃保温1小时之后，用DPBS+叠氮化物将细胞洗涤2次，在每管中加入商购的PE-标记的(红色荧光)抗-CD34抗体HPCA2-PE(BectonDickinson，San Jose，CA)。4℃保温30分钟之后，洗涤细胞，通过试剂ACK裂解缓冲液(Biofluids，Rockville，MD)裂解红细胞。然后加入福尔马林固定每管中的细胞。
结果示于图4和5，图中显示出由人脐带血中的淋巴细胞光散射得到的数据。数据被表示为等值线图，其描述了绿色和红色荧光的二元分布。绘制出等值线以表示特定数目处的细胞计数。X轴是细胞表面标记的绿色荧光的对数值，而Y轴是细胞表面标记的红色荧光的对数值。象限2所含数据统计学阐明：各经红色或绿色荧光标记抗体测定，表达两种表面标记物的细胞的存在。
如图4所示，绿色荧光抗体NUH2几乎与所有经红色荧光抗体HPCA2-PE鉴定的CD34+细胞结合。对照IgM抗体未标记这些细胞(图5)。
实施例4：
鉴定植物凝集素结合配对物
本实施例阐明对代表性凝集素结合配对物的评价。
也通过两色FACS分析鉴定了结合CD34+细胞的植物凝集素。使用上述方法，先用绿色荧光标记的植物凝集素，接着用红色荧光标记的抗-CD34抗体HPCA2-PE标记人脐带血中的细胞。散射图表的结果简述于下表1。凝集素与CD34+细胞的结合与CD-34+细胞上唾液酸化乳糖胺结构的表达一致。
表1植物凝集素与造血干细胞的反应性
凝集素 特异性     反应性
朝鲜槐 NeuAcα2-3Gal     +
西洋接骨木 NeuAcα2-6Gal     +
普通小麦(WGA) NeuAc，GlcNAcβ1-4GlcNAc     +
蕃茄(蕃茄) (Galβ1-4GlcNAc)n，多聚乳糖胺     +
鸡冠刺桐(ECA)  Galβ1-4GlcNAc     +
荆豆(UEA) α-岩藻糖
翅荚豌豆 α-岩藻糖
花生(PNA) Galβ1-3GalNAc
阳性结果表明这些凝集素结合配对物结合唾液酸化乳糖胺结构。
实施例5：通过免疫荧光染色和荧光激活细胞分选(FACS)检测培养细胞上的细胞
表面抗原
本实施例阐明通过免疫荧光染色，接着通过荧光激活细胞分选(FACS)，使用抗体检测多种培养细胞系的细胞表面结构。
通过用特异性单克隆抗体对细胞系进行间接免疫荧光染色，接着进行荧光激活细胞分选来分析培养细胞系表面标记物的表达。下列细胞系得自ATCC(美国典型培养物保藏中心，Manassas，VA)。以下为细胞类型缩写后紧接着ATCC保藏号：KGla，CCL246．1；HL60，CCL240；NCI-H446，HTB171；NCI-H82，HTB175；MCF7，HTB22和Molt4，CRL1582。从组织培养表面除去粘附细胞系，通过用1X Versene(PBS-EDTA溶液，Gibco，Life Technologies，Grand Island，NY)移液去凝集。用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤细胞，重新悬浮于含有0．1％叠氮化钠和1％牛血清白蛋白(BSA)的Dulbecco’s PBS(DPBS)中。然后将细胞分成3管。在每管中各加入终浓度为10μg／ml的单克隆抗体NUH2，抗-Lex和对照小鼠IgM。4℃保温1小时之后，用DPBS+叠氮化物洗涤每管中的细胞，并与终浓度为1μg／ml的FITC-标记的山羊抗小鼠IgM(KPL Labs，Gaithersburg，MD)保温。4℃保温45分钟之后，用DPBS+叠氮化物将细胞洗涤2次，重新悬浮于DPBS+叠氮化物和1％BSA中。将经标记的细胞维持在4℃，立即通过装有荧光门的荧光激活细胞分选仪进行分析。
分别使用荧光标记的抗体抗-HPCA2-FITC和抗-Thy-1-PF直接免疫染色细胞中的抗原CD34和Thy-1。对这两种抗体而言，于4℃在含有0．1％叠氮化钠，1％BSA和10μg／ml CD34(抗-HPCA2-FITC，Becton-Dickenson，San Jose，CA)或Thy-1(抗-CDw90-PE，Serotec，U．K．)染色抗体的DPBS中将按上述制备的细胞保温1小时。保温之后，用DPBS+叠氮化物将细胞洗涤2次，重新悬浮于DPBS+叠氮化物和1％BSA中。将经标记的细胞维持在4℃，立即通过分别装有荧光或藻红蛋白门的荧光激活细胞分选仪进行分析。
结果示于下表2。每种抗体检测出不同细胞系中抗原呈递有很大差异。与抗一糖类抗体NUH2[NeuAcα2-3Galβ1-R]相比，Thy1和抗一糖类抗体抗-Lex[Galβ1-4(Fucα1-2)GlcNAcβ1-3Galβ1-R]都能不同程度地结合细胞系。尤其是，经抗体NUH2测定，在其表面表达高水平CD34的KGla细胞显然缺乏造血干细胞的糖类标记物NeuAcα2-3Galβ1-4-R。因此，造血干细胞糖类标记物NeuAcα2-3Galβ1-4-R显然不同于造血干细胞的典型抗原CD34。
表2
用多种抗体对细胞系进行FACS分析(％阳性)
抗体     KGla     HL-60  NCI-H446  NCI-H82     MCF7  Molt4
 CD34     99     ＜5     ＜5     ＜5     ＜5     23
抗-Lex     17     65     75     ＜5     60     31
 NUH2     ＜5     ＜5     25     ＜5     ＜5     ＜5
 Thy-1     ＜5     ＜5     39     35     ＜5     ＜5
由上文的描述可以看出，尽管本文为了阐明的目的描述了本发明具体的实施方案，但在不违背本发明精神和范围的前提下也可对本发明进行多种修饰。因此，本发明只受所附权利要求书的限制。

Claims (34)

1．固定或纯化造血干细胞或将药剂靶向该细胞的方法，所述方法包括将含有造血干细胞的生物样品与结合配对物接触的步骤，其中所述结合配对物与含有NeuAcα2-3Galβ1-4结构的唾液酸化糖链结合。
2．权利要求1的方法，还包括将第一步中形成的干细胞-结合配对物复合物与未结合的生物样品分开的步骤。
3．权利要求2的方法，还包括将所述造血干细胞与所述结合配对物分开的步骤。
4．权利要求1，2或3中任一项的方法，其中所述结合配对物在结合配对物-干细胞复合物形成之后与固体支持物结合。
5．权利要求1，2或3中任一项的方法，其中所述结合配对物在结合配对物-干细胞复合物形成之前与固体支持物结合。
6．权利要求4或5的方法，其中所述固体支持物是组织培养皿。
7．权利要求4或5的方法，其中所述固体支持物是层析支持物。
8．权利要求4或5的方法，其中所述固体支持物是中空纤维生物反应器。
9．权利要求4或5的方法，其中所述固体支持物是袋。
10．权利要求1的方法，其中所述结合配对物与药剂结合。
11．权利要求10的方法，其中所述药剂包括毒性化合物。
12．权利要求10的方法，其中所述药剂包括治疗化合物。
13．权利要求10的方法，其中所述药剂包括可测标记物。
14．权利要求10的方法，其中所述药剂包括多核苷酸。
15．权利要求1至14中任一项的方法，其中所述唾液酸化糖链含有结构：
NeuAcα2-3(Galβ1-4GlcNAcβ1-3)n，其中n是1至100的整数。
16．权利要求15的方法，其中n是1至50。
17．权利要求1至16中任一项的方法，其中所述生物样品选自血液，骨髓，浅黄层细胞，脐带血和体外生长或扩展的细胞。
18．权利要求1至17中任一项的方法，其中所述结合配对物包括抗体或其抗原结合片断。
19．权利要求18的方法，其中所述抗体或其片断是单克隆抗体或其抗原结合片断。
20．权利要求1至17中任一项的方法，其中所述结合配对物包括凝集素。
21．权利要求20的方法，其中所述凝集素是植物凝集素或其衍生物。
22．权利要求21的方法，其中所述植物凝集素选自番茄凝集素，朝鲜槐凝集素，西洋接骨木凝集素，普通小麦凝集素，鸡冠刺桐凝集素及其组合。
23．权利要求20的方法，其中所述凝集素是哺乳动物凝集素或其衍生物。
24．权利要求23的方法，其中所述哺乳动物凝集素选自唾液酸粘附素，galectins及其组合。
25．权利要求20的方法，其中所述凝集素是细菌凝集素或其衍生物。
26．权利要求25的方法，其中所述细菌凝集素是幽门螺杆菌糖类受体。
27．药物组合物，它含有：
(a)与干细胞的结合配对物相连的药剂，其中所述结合配对物与含有NeuAcα2-3Galβ1-4结构的唾液酸化糖链结合；和
(b)药物可接受的载体。
28．权利要求27的药物组合物，其中所述药剂包括治疗化合物。
29．权利要求27的药物组合物，其中所述药剂包括可测标记物。
30．权利要求27的药物组合物，其中所述药剂包括多核苷酸。
31．用于固定造血干细胞的试剂盒，它含有：
(a)干细胞的结合配对物，其中所述结合配对物与含有NeuAcα2-3Galβ1-4结构的唾液酸化糖链结合；和
(b)洗涤溶液，
其中所述结合配对物和所述洗涤溶液放在分开的区室或容器中。
32．权利要求31的试剂盒，其中所述结合配对物与组织培养皿结合。
33．用于分离或纯化干细胞的试剂盒，它含有：
(a)干细胞的结合配对物，其中所述结合配对物与含有NeuAcα2-3Galβ1-4结构的唾液酸化糖链结合；和
(b)固体支持物。
34．用于标记或分选造血干细胞的试剂盒，它含有：
(a)与可测标记物相连的干细胞结合配对物，其中所述结合配对物与含有NeuAcα2-3Galβ1-4结构的唾液酸化糖链结合；和
(b)检测试剂，
其中所述结合配对物和所述检测试剂放在分开的区室或容器中。
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