CN108350077A - 产生单克隆抗体、造血干细胞的方法和组合物以及利用所述抗体和造血干细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

发现和产生可以用于鉴定和/或分离造血干细胞(HSC)，例如具有高重建潜能的HSC的抗体的方法和组合物。还提供利用HSC或遗传修饰的HSC，例如具有高重建潜能的HSC和/或遗传修饰的HSC治疗患有血液病症或遗传病症的患者、患有心血管病症的患者、从伤口恢复的患者或者从化疗或辐射暴露恢复的患者的方法和组合物。

Description

产生单克隆抗体、造血干细胞的方法和组合物以及利用所述 抗体和造血干细胞的方法
根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求于2015年11月3日提交的美国临时申请第62/250,424号的权益，将所述申请通过引用整体并入本文。
本公开总体上涉及生物化学、分子生物学、细胞生物学和再生医学领域。本公开提供发现和制备可用于鉴定和分离造血干细胞(HSC)，例如具有高重建潜能的HSC的抗体的方法和组合物。本公开还提供利用造血干细胞，例如具有高重建潜能的HSC治疗患有血液疾病、病症或病况的患者或者从化疗或放疗恢复的患者的方法和组合物。本公开还提供利用HSC治疗心血管病症的方法和组合物。本公开还提供利用HSC治疗伤口并促进伤口愈合的方法和组合物。本公开还提供在基因疗法中使用HSC的方法和组合物。
以下仅作为背景信息提供，并且不应被视为承认所讨论的任何主题或所提及的任何参考文献是本公开的现有技术。将本文提及的所有出版物和专利申请通过引用并入，其程度如同将各单独的出版物或专利申请具体地且单独地指示为通过引用并入一样。
造血干细胞(HSC)是具有终生自我更新和产生所有血细胞谱系能力的单细胞。利用自体和同种异体造血细胞移植物，HSC在成功造血重建中发挥重要作用。Weissman IL，Shizuru JA(2008)The origin of the identification and isolation ofhematopoietic stem cells，and their ability to induce donor-specifictransplantation tolerance and treat autoimune diseases，Blood 112(9)：3543-53，在此将其通过引用并入。造血细胞移植是治疗血液疾病、病症或病况(例如地中海贫血、镰状细胞病、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤)以及使之从化疗和高剂量辐射中解脱的有前景的治疗方法。造血细胞移植物的潜在缺点是它们含有造血细胞的混合物，包括具有不同重建潜能的HSC和其他非HSC。这可能导致由该过程产生的并发症和副作用。例如，由于不能从患者其他可能的患病细胞中分离具有高重建潜能的HSC，因此自体造血细胞移植通常不是治疗选择。代替的是使用同种异体捐献。通过使用同种异体细胞，患者可以避免将其自己自体捐献的患病细胞重新引入其系统中，但是存在诸如移植物抗宿主疾病的并发症的风险。即使在同种异体捐献中，可以通过识别和仅移植最有可能重建患者的健康血细胞群的细胞来减少并发症。因此，需要鉴定和分离用于诸如造血细胞移植的治疗中的HSC-特别是具有高重建潜能的HSC。
遗传修饰的HSC还可以在遗传疾病、病症或病况，特别是血液遗传疾病、病症或病况的治疗中提供有希望的治疗方法。由于HSC的独特特性(例如自我更新和分化成多种细胞的能力)，它们是将遗传修复引入患者的理想候选者。在基因疗法中，利用已知技术对获自罹患遗传疾病、病症或病况的患者的细胞进行遗传修饰以插入治疗性基因(整合进宿主细胞的基因组中或者作为外部附加体或质粒)。例如，治疗性基因可以使细胞表达蛋白质、干扰蛋白质表达或者校正基因突变。基因疗法的常用方法涉及利用载体将聚合物(如DNA)插入基因组中，从而用功能性的治疗性基因替换突变的或其他功能失调的基因。然后可以将具有遗传修饰的细胞移植回患者中，并且所述遗传修饰的细胞将表达治疗性基因，从而治疗疾病、病症或病况。此类基因疗法的有效性与遗传修饰的细胞的原始性有关。当前方法的缺点可能与多种细胞快速分裂的性质和短的寿命有关，这阻碍了基因疗法获得长期益处和/或需要患者经受多种治疗。
HSC，例如具有高重建潜能的HSC可以分化为内皮祖细胞(EPC)。一些研究报道EPC促进与心血管病症的康复和伤口恢复相关的新血管形成和再内皮化。参见例如Krankel，N等人，“‘Endothelial progenitor cells’as a therapeutic strategy incardiovascular disease,”Curr.Vasc.Pharmacol.,Jan,2012,Vol.10(1):107-24，在此将其通过引用并入。例如，可将来源于HSC的EPC施用于患者以治疗心血管病症或治疗伤口(例如促进伤口愈合)和/或施用于患者以体内分化为EPC。来源于HSC的EPC还可以例如用于调节血清或其他介质，以使调节的介质可以施用于患者。但是，如上面所指出的那样，为了获得EPC，在不在体内分析中直接测试HSC的重建能力的情况下，鉴定HSC，例如具有高重建潜能的HSC的方法先前是未知的。
HSC，例如具有高重建潜能的HSC是基因疗法的更优候选者，因为它们更有可能产生治疗结果和/或产生更有利(更快、更持久、更稳健)的治疗结果。因此，需要鉴定和分离HSC-特别是具有高重建潜能的HSC-以用于基因疗法。可以从多种来源分离HSC，包括骨髓、动员的外周血和脐带血。从细胞混合物中鉴定和分离HSC群的过程可以包括使用HSC的特异性标志物(如CD34)以及体内测定，如用限制剂量的候选HSC挽救经致死性辐射的小鼠。然而，HSC重建血细胞系的能力有所不同，并且HSC的特异性标志物只能识别HSC而不能识别具有高重建潜能的HSC亚群。在不在体内分析中直接测试具有高重建潜能的HSC的重建能力的情况下而鉴定它们的方法先前是未知的。
此外，先前认为所有HSC均表达CD34标志物。但有证据表明某些HSC不表达CD34。例如，Nakauchi，Hirmitsu，Hematopoietic stem cells：Are they CD34-positive or CD34-negative，Nature medicine 4：1009-1010(1998)，在此将其通过引用并入。因此，需要鉴定CD34阴性的HSC。
出于临床目的充分利用HSC的潜能的努力受到了关于特异且有效地允许HSC分离和扩增的标志物的有限知识的阻碍。具体地，先前不知道如何在不进行体内分析的情况下鉴定具有高重建潜能的HSC。
提供以下内容作为解决这些需求中的一项或多项的手段。
为了帮助检测和分离HSC，在这些细胞的表面鉴定出了新的标志物。这些标志物包含2-3唾液酸化乳糖-新乳糖型结构(例如sialyl I、sialyl i、唾液酸乳糖、唾液酸乳糖-N-四糖、唾液酸乳糖-N-新四糖、N-乙酰基唾液酸乳糖胺)。这些结构存在于原始早期造血干细胞(例如具有高重建潜能的HSC)的表面，例如人干细胞标志物CD133中。它们主要在干细胞上表达并在祖细胞上被岩藻糖基化。
根据本公开，提供发现和制备可用于鉴定和分离原始早期造血干细胞(例如具有高重建潜能的HSC)的抗体的方法和组合物。在一些情况下，所述抗体能与本文鉴定的一种或多种新标志物结合。还提供通过此类方法分离的细胞和由其产生的抗体在再生医学中的许多应用。
在一个实施方案中，本文公开的技术为快速开发用于检测和分离原始早期HSC(例如具有高重建潜能的HSC)的诊断性和治疗性抗体以及为通过移植治疗血液疾病、病症或病况(包括地中海贫血、镰状细胞病、白血病、淋巴瘤和骨髓瘤)提供了新的策略。在一个实施方案中，HSC或抗体用于治疗晚期滤泡性淋巴瘤。在另一个实施方案中，HSC或抗体用于治疗儿科血液疾病。在一个实施方案中，HSC或抗体用于治疗成人血液疾病。在另一个实施方案中，HSC或抗体用于治疗急性髓性白血病。在一个实施方案中，HSC来自不同于患者的捐献者(即同种异体捐献)。在一个实施方案中，HSC的捐献者和患者是同一个人(即自体捐献)。
在一个实施方案中，本文公开的技术为快速开发用于检测和分离原始早期HSC(例如具有高重建潜能的HSC)的诊断性和治疗性抗体，以及为通过施用HSC、来源于HSC的EPC或通过来源于HSC的EPC调节的介质来治疗心血管疾病或者治疗伤口(例如促进伤口愈合)提供了新的策略。在一个实施方案中，HSC来自不同于患者的捐献者(即同种异体捐献)。在一个实施方案中，HSC的捐献者和患者是同一个人(即自体捐献)。
在一个实施方案中，本文公开的技术为快速开发用于检测和分离原始早期HSC(例如具有高重建潜能的HSC)的诊断性和治疗性抗体，为遗传修饰，以及为通过移植遗传修饰的HSC来治疗遗传疾病、病症或病况，例如血液遗传疾病、病症或病况提供了新的策略。在一个实施方案中，遗传修饰的HSC用于治疗血液疾病或病症，例如镰状细胞、地中海贫血或严重联合免疫缺陷。
在一个实施方案中，提供发现和产生可用于鉴定和分离具有高重建潜能的原始早期造血干细胞的抗体的新方法，所述方法包括用HSC免疫动物，然后针对能结合2-3唾液酸化乳糖-新乳糖型结构(例如sialyl I、sialyl i、唾液酸乳糖、唾液酸乳糖-N-四糖、唾液酸乳糖-N-新四糖、N-乙酰基唾液酸乳糖胺)的抗体的存在或产生选择那些动物或者来自那些动物的细胞。在一些实施方案中，用CD34-阳性的HSC免疫动物。在另一实施方案中，选择能结合CD133表面上的2-3唾液酸化乳糖-新乳糖型结构(例如sialyl I、sialyl i、唾液酸乳糖、唾液酸乳糖-N-四糖、唾液酸乳糖-N-新四糖、N-乙酰基唾液酸乳糖胺)的抗体。
在另一实施方案中，所述方法包括用分离自HSC的CD133免疫动物，然后针对能结合2-3唾液酸化乳糖-新乳糖型结构(例如sialyl I(大I)、sialyl i(小i)、唾液酸乳糖)的抗体的存在和产生选择那些动物或来自那些动物的细胞。在一些实施方案中，CD133来自CD34阳性(CD34+)的HSC。在另一实施方案中，选择能结合CD133表面上的2-3唾液酸化乳糖-新乳糖型结构(例如sialyl I(大I)、sialyl i(小i)、唾液酸乳糖)的抗体。
在一个实施方案中，可将能够产生或提供一组抗体的任何其它方法(例如噬菌体展示)用作抗体来源，所述一组抗体可针对能结合2-3唾液酸化乳糖-新乳糖型结构(例如sialyl I(大I)、sialyl i(小i)、唾液酸乳糖)的那些抗体进行筛选。
在一个实施方案中，免疫的动物是小鼠、大鼠、兔子或另一种哺乳动物。在其他实施方案中，此类抗体可以在非人的转基因动物中产生，例如如PCT申请公开第WO 01/14424号和WO 00/37504号中所述，在此将其通过引用并入。
在一个实施方案中，抗体是单克隆抗体(mAb)，其是针对特定抗原的基本同质的抗体群。MAb可以通过本领域技术人员已知的方法获得。参见，例如Kohler等人(1975)；美国专利4,376,110；Ausubel等人(1987-1999)；Harlow等人(1988)；以及Colligan等人(1993)，在此将其通过引用并入。本文设想的mAb可以是任何免疫球蛋白类别，包括IgG、IgM、IgE、IgA及其任何亚类。产生mAb的杂交瘤可以在体外或在体内培养。通过体内生产可以获得高效价的mAb，其中将来自单个杂交瘤的细胞经腹膜内注射进原始触发(pristine-primed)的Balb/c小鼠中以产生含有高浓度期望的mAb的腹水。例如，可以利用柱层析法或本领域技术人员众所周知的任何其他方法从此类腹水或从培养上清液中纯化同种型IgM或IgG的MAb。
在一个实施方案中，抗体是嵌合抗体。嵌合抗体是分子，其不同部分来源于不同的动物物种，如具有来源于鼠mAb的可变区和人免疫球蛋白恒定区的那些抗体。含有基本上来自人抗体(称为受体抗体)的可变区框架残基和基本上来自小鼠抗体(称为供体抗体)的互补决定区的抗体也称为人源化抗体。嵌合抗体主要用于降低应用中的免疫原性并提高生产中的产量，例如，当鼠mAb从杂交瘤中具有较高的产量但在人中具有较高的免疫原性时，使用人/鼠嵌合mAb。嵌合抗体及其生产方法在本领域是已知的(参见，例如Better等人，1988；Cabilly等人，1984；Harlow等人，1988；Liu等人1987；Morrison等人1984；Boulianne等人1984；Neuberger等人1985；Sahagan等人1986；Sun等人1987；Cabilly等人，欧洲专利申请125023、171496、173494、184187、173494；PCT专利申请WO86/01533、WO 97/02671、WO 90/07861、WO 92/22653以及美国专利5,693,762、5,693,761、5,585,089、5,530,101和5,225,539)。
在一个实施方案中，抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，人源化抗体包含人重链和轻链恒定结构域。在一些实施方案中，人源化抗体保留亲本抗体很大一部分的结合特性，所述亲本抗体可以是例如小鼠单克隆抗体。本文所述的人源化抗体通过人的干预产生。因此，它们预期不会天然存在。在一个实施方案中，通过本领域众所周知的技术制备人源化抗体，例如Roland Kontermann和StefanDübel编辑的Antibody Engineering，第二版以及其中引用的参考文献中所描述的那些技术。
在一个实施方案中，提供发现和产生可用于鉴定和分离造血干细胞，例如具有高重建潜能的HSC的抗体的细胞群。在一个实施方案中，HSC用于产生能结合2-3唾液酸化乳糖-新乳糖型结构(例如sialyl I(大I)、sialyl i(小i)，唾液酸乳糖)的重组抗体。在一个实施方案中，重组抗体能结合CD133表面上的2-3唾液酸化乳糖-新乳糖型结构(例如sialylI(大I)、sialyl i(小i)、唾液酸乳糖)。
在一个实施方案中，根据本文所述方法之一产生的抗体对2-3唾液酸化乳糖-新乳糖型结构(例如sialyl I(大I)、sialyl i(小I)、唾液酸乳糖)具有特异性。在一个实施方案中，根据本文所述方法之一产生的抗体能结合3’唾液酸乳糖胺化的CD133但不结合唾液酸苷酶处理的3’唾液酸乳糖胺化的CD133。在一个实施方案中，抗体能结合CD133和人岩藻糖苷酶处理的CD133但不结合唾液酸苷酶处理的CD133。
在一个实施方案中，提供产生干细胞的方法，所述方法包括分离造血干细胞，例如具有高重建潜能的HSC，然后在体外对其进行扩增。
在一个实施方案中，提供产生遗传修饰的干细胞的方法，所述方法包括分离造血干细胞(例如具有高重建潜能的HSC)，对所述HSC进行遗传修饰，然后体外扩增遗传修饰的HSC。
在一个实施方案中，提供组合物，其包含根据本公开方法之一鉴定的HSC，根据本公开的方法之一的来源于HSC的干细胞和/或根据本公开的方法之一的从HSC繁殖的部分或完全分化的细胞。在一个实施方案中，提供包含从HSC繁殖的EPC的组合物。在一个实施方案中，提供包含通过从HSC繁殖的EPC调节的介质的组合物。
在一个实施方案中，提供组合物，其包含根据本公开的方法之一鉴定的并被遗传修饰以用于基因疗法的HSC、根据本公开的方法之一的来源于遗传修饰的HSC的遗传修饰的干细胞和/或根据本公开的方法之一的从遗传修饰的HSC繁殖的部分或完全分化的遗传修饰的细胞。
在另一实施方案中，根据本公开的方法之一鉴定的HSC，根据本公开的方法之一产生的干细胞和/或根据本公开的方法之一的从HSC繁殖的部分或完全分化的细胞可以直接用于治疗多种疾病状态和病况的治疗策略，包括治疗血液疾病、病症或病症(例如地中海贫血、镰状细胞病、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤)以及使之从化疗和高剂量辐射中解脱。在一个实施方案中，HSC可以直接用于治疗心血管病症的治疗策略。在一个实施方案中，HSC可以直接用于治疗伤口(例如促进伤口愈合)的治疗策略。在一个实施方案中，从HSC繁殖的EPC可以直接用于治疗心血管病症的治疗策略。在一个实施方案中，从HSC繁殖的EPC可以直接用于治疗伤口(例如促进伤口愈合)的治疗策略。在一个实施方案中，从HSC繁殖的EPC可以用于调节介质，所述介质可用于治疗心血管病症、治疗伤口或促进伤口愈合的治疗策略。
在另一实施方案中，根据本公开的方法之一鉴定和遗传修饰的HSC、根据本公开的方法之一产生的遗传修饰的干细胞和/或根据本公开的方法之一的从遗传修饰的HSC繁殖的部分或完全分化的遗传修饰的细胞可以直接用于治疗多种疾病状态和病况的治疗策略，包括治疗遗传疾病、病症或病症(例如镰状细胞、地中海贫血或严重联合免疫缺陷)。
在另一实施方案中，根据本公开的方法之一产生的干细胞可以部分或完全分化为期望谱系的细胞，并且那些分化的细胞可以用于治疗多种疾病状态和病况的治疗策略，包括治疗血液疾病、病症或病况(例如地中海贫血、镰状细胞病、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤)以及使之从化疗和高剂量辐射中解脱。在另一实施方案中，根据本公开的方法之一产生的干细胞可以部分或完全分化为EPC，其可用于治疗心血管病症、治疗伤口或促进伤口愈合的治疗策略。
在另一实施方案中，根据本公开的方法之一产生的遗传修饰的干细胞可以部分或完全分化为所需谱系的遗传修饰的细胞，并且那些分化的细胞可以用于治疗多种疾病状态和病况的治疗策略，包括治疗遗传疾病、病症或病况(例如镰状细胞，地中海贫血或严重联合免疫缺陷)
本公开的其他目的和优势将在下面的描述中部分阐述，并且部分将从所述描述中显而易见，或者可以通过本公开的实施而了解。借助所附权利要求中具体指出的元件和组合，本公开的一些目的和优势将被认识到和获得。
应当理解的是，前面的一般性描述和下面的详细描述仅是示例性和解释性的，并不限制所要求保护的本公开。
附图简要描述
图1a描述了sialyl I(大I)的化学结构。
图1b描述了sialyl i(小i)的化学结构。
图2a描述了N-乙酰基唾液酸乳糖胺的化学结构。
图2b描述了唾液酸乳糖-N-四糖的化学结构。
图2c描述了唾液酸乳糖-N-新四糖的化学结构。
图3描述了唾液酸乳糖的化学结构。
现在将详细参考本公开的当前实施方案(示例性实施方案)，其示例在附图中示出。在可能的情况下，在整个附图中将使用相同的参考编号来表示相同或相似的部分。
本文使用的缩写通常具有其在化学和生物学领域的常规含义。
术语“抗体(antibody)”、“抗体(anibodies)”、“ab”或“免疫球蛋白”以最广泛的含义可互换使用，并且包括单克隆抗体，其包括分离的抗体、工程化的抗体、化学合成的抗体或重组抗体(例如全长或完整的单克隆抗体)以及抗体片段，只要它们表现出期望的生物学活性。在一个实施方案中，本公开涉及单克隆抗体。
抗体分子由包含通过二硫键相互连接的至少两条重链(H)和两条轻链(L)的糖蛋白组成。每条重链包含重链可变区(或结构域)(本文缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个或四个结构域，CH1、CH2、CH3和CH4。每条轻链包含轻链可变区(本文缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域CL。VH和VL区可以进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，其中散布着称为框架区(FR)的更加保守的区域。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，其从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。
根据本公开，抗体的“抗原结合片段”意指保留结合抗体的靶标的能力的任何肽、多肽或蛋白质。在一个实施方案中，所述靶标选自2-3唾液酸化乳糖-新乳糖型结构，如sialyl I(大I、参见图1a)、sialyl i(小i、参见图1b)、N-乙酰基唾液酸乳糖胺(参见图2a)、唾液酸乳糖-N-四糖(参见图2b)、唾液酸乳糖-N-新四糖(参见图2c)以及唾液酸乳糖(参见图3)。在某些实施方案中，通过重组DNA技术产生抗原结合片段。在其它实施方案中，通过酶切或化学切割完整抗体产生结合片段。结合片段包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv和单链抗体。
本文所用的术语“单克隆抗体”或“Mab”指获自基本同质的抗体群(即群体的各个抗体除了可能少量存在的天然存在的突变之外是相同的)的抗体。通常，单克隆抗体是高度特异性的，其针对单一表位。此类单克隆抗体可以通过B细胞或杂交瘤的单个克隆产生。单克隆抗体也可以是重组的，即通过蛋白质工程产生。单克隆抗体也可以从噬菌体抗体文库中分离。此外，与通常包含针对多种决定簇或表位的多种抗体的多克隆抗体的制备物相反，每种单克隆抗体针对单一抗原表位。本公开涉及通过从细胞纯化分离或获得的抗体或者通过基因重组或化学合成获得的抗体。
术语“抗原”是指能够与选择性结合剂例如抗体结合，并且还能够用于动物以产生能够结合该抗原的表位的抗体的分子或分子的一部分。抗原可含有一个或多个表位。抗原的实例包括CD133分子表面上的2-3唾液酸化乳糖-新乳糖型结构(例如3’SL-CD133)，如sialyl I(大I，参见图1a)、sialyl i(小i，参见图1b)、N-乙酰基唾液酸乳糖胺(参见图2a)、唾液酸乳糖-N-四糖(参见图2b)、唾液酸乳糖-N-新四糖(参见图2c)和唾液酸乳糖(参见图3)。
术语“表位”包括能够与免疫球蛋白或T细胞受体特异性结合的任何决定簇，如例如多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包含分子的化学活性表面基团，如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施方案中，其可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。表位是抗原的被抗体结合的区域。在某些实施方案中，当抗体优先识别其蛋白质和/或大分子复杂混合物中的靶抗原时，认为抗体特异性结合抗原。在一个实施方案中，当解离常数小于或等于约1μM时，例如当解离常数小于或等于约100nM时，如例如当解离常数小于或等于约1nM时，以及如进一步示例当解离常数小于或等于约100pM时，认为抗体特异性结合抗原。本文使用的术语“对....具有特异性的”和“特异性结合”是可互换的，并且指抗体与预定的抗原结合，所述抗原例如2-3唾液酸化乳糖-新乳糖型结构，如sialyl I(大I，参见图1a)、sialyl i(小i，参见图1b)、N-乙酰基唾液酸乳糖胺(参见图2a)、唾液酸乳糖-N-四糖(参见图2b)、唾液酸乳糖-N-新四糖(参见图2c)、唾液酰乳糖-N-四糖(参见图2c)以及唾液酸乳糖(参见图3)。通常，抗体以10-6M或更低的解离常数(KD)结合预定抗原，并且以比其与预定抗原之外的非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白或任何其他指定的多肽)结合的KD低至少两倍的KD与预定抗原结合。短语“识别抗原的抗体”和“对抗原具有特异性的抗体”在本文中与术语“特异性结合抗原的抗体”可互换使用。
本文使用的术语“干细胞”指能够分化为其他细胞类型的细胞，所述其它细胞类型包括具有具体的特化功能的细胞(即终末分化细胞，如红细胞和巨噬细胞)。干细胞可根据其来源(成人/成体干细胞、胚胎干细胞)或者根据其效力(全能(totipotent)，多能(pluripotent)，专能(multipotent)和单能(unipotent))来定义。
术语“造血干细胞”或“HSC”是指具有自我更新和分化为数种类型的血细胞中的任何类型(包括红血细胞和白血细胞)的能力的动物细胞，例如哺乳动物(包括人)的细胞，包括淋巴样细胞和髓样细胞。HSC也可以分化为EPC。HSC可以包括具有体内长期植入潜能的造血细胞。可以利用动物模型或体外模型来确定长期植入潜能(例如长期造血干细胞)。用于候选人造血干细胞群的长期植入潜能的动物模型包括SCID-hu骨模型(Kyoizumi等人，(1992)Blood 79：1704；Murray等人，(1995)Blood 85(2)368-378)和子宫内绵羊模型(Zanjani等人，(1992)J.Clin.Invest.89：1179)。对于人造血作用动物模型的综述，参见Srour等人(1992)J.Hematother.1：143-153以及其中引用的参考文献。干细胞的体外模型是基于5-8周后在基质共培养物中产生的克隆原细胞的数目的有限稀释分析的长期培养起始细胞(LTCIC)分析(Sutherland等人,(1990)Proc.Nat'l Acad.Sci.87：3584-3588)。已显示LTCIC分析与另一种常用的干细胞分析鹅卵石区域形成细胞(CAFC)分析(cobblestonearea forming cell assay)以及与体内长期植入潜能相关(Breems等人,(1994)Leukemia8：1095)。对于造血干细胞的综述和数据库参见Montrone C，Kokkaliaris KD，Loeffler D，Lechner M，Kastenmüller G，Schroeder T，Ruepp A.HSC-explorer:a curated databasefor hematopoietic stem cell.PLoS One.2013年7月30日；8(7):e70348.doi:10.1371/journal.pone.0070348.Print 2013。
本文使用的术语“具有高重建潜能的造血干细胞”或“具有高重建潜能的HSC”是指动物细胞，例如哺乳动物(包括人)的细胞，其(1)比一般的CD34+HSC群更有可能能够自我更新；(2)比一般的CD34+HSC群具有更强的自我更新能力(例如与一般的CD34+HSC群相比，能够更快地，更有效地，更多数目地和/或在更长的时间段内自我更新)；(3)与一般的CD34+HSC群相比，更有可能能够分化为数种类型的血细胞(包括红血细胞和白血细胞)中的任何类型；(4)与一般的CD34+HSC群相比，具有更强的分化为数种类型的血细胞(包括红血细胞和白血细胞)中的任何类型的能力(例如与一般的CD34+HSC群相比，能够分化为更多类型的血细胞，能够分化为优选比例的血细胞类型和/或能够更快地、更有效地、更多数目地和/或在更长的时间段内分化)；(5)比一般的CD34+HSC群更有可能体内长期植入；(6)比一般的CD34+HSC群具有更强的体内长期植入能力(例如与一般的CD34+HSC群相比，能够更快地植入，能够在更多类型的宿主中植入，能够在更多的宿主位置植入，能够植入更长时间和/或能够以更少的宿主排斥和/或并发症植入)；(7)如以下实施例5中更加详细说明的，当植入NOD/SCID IL2Ry无小鼠时，小鼠的CD45+细胞表现出至少10％的嵌合状态；(8)如以下实施例5中更加详细说明的，当植入初次和二次NOD/SCID IL2Ry无小鼠接受者中时，在初次接受者中细胞仅在12周或更久之后显示出明显的植入，但在二次接受者中显示多谱系重建；和/或(9)在动物或体外干细胞分析中在其它方面优于一般的CD34+HSC群，所述分析如利用NOD/SCID IL2Ry无小鼠测试植入潜能的分析。这些细胞通过本文公开的方法获自动物，并且至少由于它们在非天然环境中的存在而不同于自然界中存在的HSC群。相对于自然界中存在的HSC群，这些差异可以包括不同的标志物、更长的寿命、不同的分化潜能和/或富集。
本文使用的“扩增”包括细胞数目的任何增加。扩增包括例如造血干细胞的数目相对于用于起始培养的细胞群中存在的HSC的数目的增加。
本文使用的术语“单能”是指细胞仅可以产生一种细胞类型，但是具有自我更新的特性，这将其与非干细胞区分开来。
本文使用的术语“专能”与术语“祖先”同义使用，并且指可以产生数种不同的终末分化细胞类型中的任何一种的细胞。这些不同的细胞类型通常密切相关(例如血细胞，如红血细胞、白血细胞和血小板)。例如，间充质干细胞(也称为骨髓基质细胞)是专能细胞，并且能够形成成骨细胞，软骨细胞，肌细胞，脂肪细胞，神经元细胞和β-胰岛细胞。
本文使用的术语“多能”指产生生物体的一些或许多但并非全部细胞类型的细胞。多能干细胞能够分化为成熟生物体内的任何细胞类型，尽管在不进行重编程的情况下，它们不能去分化为它们所来源的细胞。将会理解，“专能”祖细胞(例如神经干细胞)比多能干细胞具有更窄的分化潜能。
本文所用的术语“全能”是指受精的卵母细胞以及由受精卵细胞的前几次分裂产生的细胞(例如处于发育的二细胞和四细胞期的胚胎)。全能细胞具有分化为特定物种的任何类型的细胞的能力。例如，单个全能干细胞可以产生完整的动物以及具体物种(例如人)中发现的无数种细胞类型中的任何类型。
术语“CD34”是指在来源于人骨髓、血液和胎儿肝脏的某些造血干细胞和祖细胞上选择性表达的造血干细胞抗原。Yin等人，Blood 90：5002-5012(1997)；Miaglia，S.等人，Blood 90：5013-21(1997)。表达CD34的细胞被称为CD34+。基质细胞不表达CD34，因此被称为CD34-。从人血液中分离的CD34+细胞也可能能够在体内分化为例如心肌细胞、内皮细胞和平滑肌细胞。参见Yeh等人，Circulation 108：2070-73(2003)。CD34+细胞代表约1％的骨髓衍生的有核细胞；未成熟的内皮细胞前体也表达CD34抗原；成熟的内皮细胞不表达CD34+。Peichev，M.等人，Blood95：952-58(2000)。在体外，来源于成人骨髓的CD34+细胞产生大部分的粒细胞/巨噬细胞祖细胞(CFU-GM)、一些混合集落形成单位(CFU-Mix)和一小群原始红系祖细胞(爆发集落形成单位，红细胞或BFU-E)。Yeh等人，Circulation 108：2070-73(2003)。CD34+细胞也可以具有分化为新心肌或促进新心肌的发育的潜能，尽管频率较低。
可以利用抗CD34抗体富集造血细胞中的CD34+干细胞。例如，已经开发了利用免疫磁珠分离从骨髓单核细胞中分离高度纯化且有活力的CD34+细胞群的技术。参见例如美国专利第5,536,475号、第5,035,994号、第5,130,144号和第4,965,205号。
然而越来越多的证据表明，并不是所有的造血干细胞均表达CD34。例如，Nakauchi,Hirmitsu,Hematopoietic stem cells:Are they CD34-positive or CD34-negative,Nature medicine 4:1009-1010(1998)。
本领域技术人员将根据设想的用途选择包含造血干细胞的起始细胞群。本领域已经描述了包含造血干细胞的多种细胞来源，包括骨髓、外周血、新生儿脐带血、胎盘或者其他来源如肝，例如胎儿肝脏。
可以通过选择还为CD38-的CD34+细胞完成HSC的进一步富集。此类富集可以根据用于细胞阴性选择的公开方法和/或商业方法来完成，其包括但不限于基于CD38特异性抗体与非期望的细胞群的结合的选择。可以利用针对CD20、CD3、CD14、CD56、CD97和/或CD235的抗体从干细胞库中移除替代的非期望的细胞群。
术语“CD133”指蛋白质prominin-1，其是在人和小鼠中鉴定的一类新型五次跨膜(pentaspan membrane)蛋白中的第一种，并且最初被归类为原始造血干细胞和神经干细胞的标志物。现在研究证实了CD133作为造血干细胞标志物的用途。针对CD133的抗体在本领域可广泛获得。
鉴定和分离HSC，例如具有高重建潜能的HSC的方法。
在一个实施方案中，本公开提供产生可用于鉴定和分离人造血干细胞(例如具有高重建潜能的HSC)的抗体的方法，其包括从针对造血干细胞产生的抗体群中筛选能结合2-3唾液酸化乳糖-新乳糖型结构；并且能够鉴定和分离人HSC(例如具有高重建潜能的HSC)的抗体。
在一个实施方案中，用于产生抗体群的造血干细胞是CD34+。在一个实施方案中，用于产生抗体群的造血干细胞是CD34+/CD38-。在一个实施方案中，用于产生抗体群的造血干细胞是CD34-。
在一个实施方案中，2-3唾液酸化乳糖-新乳糖型结构选自：sialyl I(大I，参见图1a)、sialyl i(小i、参见图1b)、N-乙酰基唾液酸乳糖胺(参见图图2a)、唾液酸乳糖-N-四糖(参见图2b)、唾液酸乳糖-N-新四糖(参见图2c)以及唾液酸乳糖(参见图3)。
在一个实施方案中，2-3唾液酸化乳糖-新乳糖型结构是唾液酸乳糖(参见图3)。
在一个实施方案中，抗体能结合人干细胞标志物CD133上表达或存在的2-3唾液酸化乳糖-新乳糖型结构。
在一个实施方案中，抗体能特异性结合3’SL-CD133。
在一个实施方案中，抗体能特异性结合3’SL-CD133但不结合唾液酸苷酶处理的3’SL-CD133。
在一个实施方案中，抗体可用于分离如通过体内模型在功能上确定的具有高重建潜能的原始HSC。
在一个实施方案中，体内模型包括将测试细胞群移植进经辐射的小鼠(例如NOD/SCID IL2Ry无小鼠，也称为NOG小鼠)中，然后评估那些测试细胞群的长期再建群潜能。
在一个实施方案中，抗体结合或增强性结合CD133和人岩藻糖苷酶处理的CD133，但不结合唾液酸苷酶处理的CD133。在一个实施方案中，该抗体可用于分离如通过体内模型在功能上确定的具有高重建潜能的原始HSC。在一个实施方案中，体内模型包括将测试细胞群移植进经辐射的小鼠(例如NOD/SCID IL2Ry无小鼠，也称为NOG小鼠)中，然后评估那些测试细胞群的长期再建群潜能。
在一个实施方案中，可以从骨髓分离造血干细胞。在一个实施方案中，可以从外周血分离这些细胞。在一个实施方案中，可以从白细胞去除术产物中分离这些细胞。在一个实施方案中，可以从脐带血中分离这些细胞。在一个实施方案中，可以从组合来源分离这些细胞。
在一个实施方案中，可以通过FACS分选，免疫磁珠和/或亲和基质分离造血干细胞。
在一个实施方案中，从HSC分离人干细胞标志物CD133。在一个实施方案中，从CD34+HSC分离人干细胞标志物CD133。在一个实施方案中，从CD34+/CD38-HSC分离人干细胞标志物CD133。
本公开涉及发现和产生可用于鉴定和分离具有高重建潜能的原始早期造血干细胞的抗体的方法和组合物。还提供通过此类方法分离的细胞和由此产生的抗体在再生医学应用中的多种用途。
在一个实施方案中，本文公开的技术为快速开发用于检测和分离造血干细胞(例如具有高重建潜能的HSC)的诊断性和治疗性抗体提供了新的策略。在一个实施方案中，本文公开的技术为治疗血液疾病和慢性疾病(如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤)、治疗心血管病症或治疗伤口(例如促进伤口愈合)提供了新的策略。在一个实施方案中，HSC、来源于HSC的细胞或抗体用于治疗晚期滤泡性淋巴瘤。在另一实施方案中，HSC、来源于HSC的细胞或抗体用于治疗儿科血液疾病。在一个实施方案中，HSC、来源于HSC的细胞或抗体用于治疗成人血液疾病。在另一实施方案中，HSC、来源于HSC的细胞或抗体用于治疗急性髓性白血病。在一个实施方案中，HSC、来源于HSC的细胞(包括来源于HSC的EPC)、通过来源于HSC的EPC调节的介质或者抗体用于治疗心血管病症。在一个实施方案中，HSC、来源于HSC的EPC、通过来源于HSC的EPC调节的介质或者抗体用于治疗伤口和/或促进伤口愈合。在一个实施方案中，在增殖和繁殖之前和/或在用于治疗之前将HSC进行遗传修饰。
在一个实施方案中，本公开涉及可用于鉴定和分离造血干细胞，例如具有高重建潜能的HSC的抗体。在一个实施方案中，抗体对2-3唾液酸化乳糖-新乳糖型结构具有特异性，所述结构如sialyl I(大I，参见图1a)、sialyl i(小i，图1b)、N-乙酰基唾液酸乳糖胺(参见图2a)、唾液酸乳糖-N-四糖(参见图2b)、唾液酸乳糖-N-新四糖(参见图2c)以及唾液酸乳糖(参见图3)。
在一个实施方案中，提供发现和产生可用于鉴定和分离造血干细胞的抗体的细胞群。在一个实施方案中，用于产生抗体的细胞群包含具有高重建潜能的造血干细胞。
在一个实施方案中，本公开提供对2-3唾液酸化乳糖-新乳糖新型结构具有特异性的抗体，所述结构如sialyl I(大I，参见图1a)、sialyl i(小i，参见图1b)、N-乙酰基唾液酰乳糖胺(参见图2a)、唾液酸乳糖-N-四糖(参见图2b)、唾液酸乳糖-N-新四糖(参见图2c)以及唾液酸乳糖(参见图3)，所述抗体由包括下述步骤的方法产生：用CD34+、CD38-的HSC注射小鼠，并筛选得到的抗体中能结合多孔板上包被的2-3唾液酸化乳糖-新乳糖型结构(如sialyl I(大I)，sialyl i(小i)和唾液酸乳糖)的那些抗体。
可以通过多种技术产生本公开的单克隆抗体(MAb)，包括常规单克隆抗体方法，例如Kohler和Milstein，1975，Nature 256：495的标准体细胞杂交技术。可以使用体细胞杂交程序或者可以应用产生单克隆抗体的其他技术，包括例如B淋巴细胞的病毒性或致癌性转化。
本领域技术人员可以用人Ig基因座的大片段将小鼠抗体产生有缺陷的小鼠品系工程化，以使此类小鼠在无小鼠抗体的情况下产生人抗体。大的人Ig片段可以保持大的可变基因的多样性以及适当调控的抗体产生和表达。通过利用用于抗体多样性和选择以及对人蛋白质缺乏免疫耐受的小鼠机制，在这些小鼠品系中再产生的人抗体库获得针对任何目标抗原(包括人抗原)具有高亲和力的抗体。利用杂交瘤技术，可以产生并选择具有期望特异性的抗原特异性的人MAb。
在可选的实施方案中，本公开的抗体可以在杂交瘤细胞系之外的细胞系中表达。在这些实施方案中，可将编码具体抗体的序列用于转化合适的哺乳动物宿主细胞。根据这些实施方案，可以利用将多核苷酸引入宿主细胞的任何已知方法来实现转化，包括例如将多核苷酸包装进病毒(或病毒载体)中并用病毒(或载体)转导宿主细胞，或者通过本领域已知的转染程序。此类程序由美国专利第4,399,216号、第4,912,040号、第4,740,461号和第4,959,455号示例。通常，所使用的转化程序可以取决于待转化的宿主。将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞的方法在本领域众所周知，并且其包括但不限于：葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将多核苷酸封装在脂质体中、以及将DNA直接显微注射进细胞核。
在一个实施方案中，本公开提供能够结合3’-唾液酸化乳糖的抗体。在一个实施方案中，抗体能够结合人造血干细胞表面上的3’-唾液酸化乳糖。
在另一实施方案中，本公开提供能够特异性结合人干细胞标志物CD133上表达或存在的2-3唾液酸化乳糖-新乳糖型结构的抗体。在一个实施方案中，该CD133分离自HSC。在一个实施方案中，CD133分离自具有高重建潜能的造血干细胞。
筛选能够特异性结合人干细胞标志物CD133上表达的2-3唾液酸化乳糖-新乳糖型结构的杂交瘤/抗体，可以通过本领域技术人员可用的多种技术中的任何技术来实现。在一个实施方案中，筛选方法包括利用固定在亲和基质上的抗CD133抗体，通过亲和层析纯化从人造血干细胞和祖细胞提取的CD133分子。在另一实施方案中，然后利用固定在亲和基质上的MAA凝集素(Maakia amenuris)，通过凝集素亲和层析从这些CD133分子中进一步纯化表达2-3唾液酸化乳糖结构的特定糖型的CD133。MAA凝集素能结合2-3唾液酸化乳糖结构。
在一个实施方案中，在微量滴定板的孔中包被纯化的特定糖形的CD133(例如3’唾液酸化乳糖/新乳糖结构-CD133或3’SL-CD133)。在一个实施方案中，用唾液酸苷酶处理一半3’SL-CD133包被的孔。唾液酸苷酶切割能结合所筛选的期望抗体的表位上的末端唾液酸残基。然后纯化和/或克隆特异性结合3’SL-CD133但不结合唾液酸苷酶处理的3’SL-CD133的那些抗体。
在一个实施方案中，然后测试特异性结合3’SL-CD133但不结合唾液酸苷酶处理的3’SL-CD133的抗体分离具有高重建潜能(如通过体内模型在功能上确定的)的HSC的能力。
在另一实施方案中，在微量滴定板的孔中包被纯化的CD133。用人岩藻糖苷酶处理一半CD133包被的孔。岩藻糖苷酶移除CD133上非期望的更加分化的碳水化合物结构上的路易斯岩藻糖(sialyl Lex)。然后针对杂交瘤结合或增强性结合CD133和人岩藻糖苷酶处理的CD133但不结合唾液酸苷酶处理的CD133的能力选择杂交瘤。在一个实施方案中，然后可对这些抗体分离如通过体内模型在功能上确定的具有高重建潜能的HSC的能力进行测试。
在一个实施方案中，本公开涉及人造血干细胞，例如具有高重建潜能的HSC。本公开提供分离这些细胞的方法以用于潜在的治疗用途。
在另一实施方案中，提供包含根据本公开的方法之一产生的干细胞的组合物。
在另一实施方案中，根据本公开的方法之一产生的干细胞可以直接用于治疗多种疾病状态和病况，包括血液疾病、病症或病况(例如地中海贫血症、镰状细胞病、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤)的治疗策略。
在另一实施方案中，可在用于治疗多种疾病状态和病况，包括遗传疾病、病症或病况，如遗传血液疾病、病症或病况(例如镰状细胞、地中海贫血或严重联合免疫缺陷)的基因疗法策略之前，对根据本公开的方法之一产生的干细胞进行遗传修饰。
在另一实施方案中，根据本公开的方法之一产生的干细胞可以部分或完全分化为期望谱系的细胞，并且那些细胞可用于治疗多种疾病状态和病况，包括血液疾病、病症或病况(例如地中海贫血、镰状细胞病、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤)、心血管病症或者用于治疗伤口(例如促进伤口愈合)的治疗策略。在一个实施方案中，将细胞或抗体用于治疗晚期滤泡性淋巴瘤。在另一实施方案中，将细胞或抗体用于治疗儿科血液疾病。在一个实施方案中，将细胞或抗体用于治疗成人血液疾病。在另一实施方案中，将细胞或抗体用于治疗急性髓性白血病。
在另一实施方案中，根据本公开的方法之一产生的遗传修饰的干细胞可以部分或完全分化为期望谱系的遗传修饰的细胞，并且那些遗传修饰的细胞可以用于治疗多种疾病状态和病况，例如遗传血液疾病、病症或病况(例如镰状细胞、地中海贫血或严重联合免疫缺陷)的治疗策略。
在一个实施方案中，将原始早期HSC(例如具有高重建潜能的HSC)用于治疗心血管病症或治疗伤口(例如促进伤口愈合)。在一个实施方案中，可从HSC繁殖EPC以用于治疗心血管病症或治疗伤口(例如促进伤口愈合)或者调节介质以用于治疗心血管病症或治疗伤口(例如促进伤口愈合)。
根据本文所述的实施，适用于离体培养HSC，包括培养已被遗传修饰的HSC的培养基在本领域众所周知，例如如美国专利第5,811,416号和J.Hartshorn等人,“Ex VivoExpansion of Hematopoietic Stem Cells Using Defined Culture Media”，在CellTechnology for Cell Products,第III章，221-224页中所公开的。此类培养基包括但不限于含有L-谷氨酰胺的高葡萄糖达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)，其众所周知且容易商购获得。培养基可以补充重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)并且包含血清(如人血清)和抗生素。将细胞培养物保持在二氧化碳环境中(例如5％至12％)以维持培养液的pH，并在37℃下在湿润的环境中孵育。合适的化学限定的无血清培养基描述于美国系列号08/464,599和WO96/39487中，以及“完全培养基”描述于美国专利第5,486,359号中，并且在此将这些通过引用并入。化学限定的培养基包括最低必需培养基，如伊思柯夫改良达尔伯克培养基(IMDM)(Gibco)，其补充有人血清白蛋白、人Ex Cyte脂蛋白、转铁蛋白、胰岛素、维生素、必需和非必需氨基酸、丙酮酸钠、谷氨酰胺和丝裂原。这些培养基刺激细胞生长但不分化。如本文所使用的，丝裂原指刺激细胞的细胞分裂的试剂。此类试剂可以是化学品，通常是促进细胞开始细胞分裂以触发有丝分裂的某种形式的蛋白质。培养基的其他实例包括RPMI 1640、伊思柯夫改良达尔伯克培养基(IMDM)和Opti-MEM SFM(Invitrogen Inc.)。化学限定的培养基包括最低必需培养基，如伊思柯夫改良达尔伯克培养基(IMDM)(Gibco)，其补充有人血清白蛋白、人Ex Cyte脂蛋白、转铁蛋白、胰岛素、维生素、必需和非必需氨基酸、丙酮酸钠、谷氨酰胺、并且丝裂原也适用。也可以根据实施例6中所述的方法扩增HSC。
本公开的抗体和细胞(无论纯抗体/细胞、标记的抗体/细胞、与毒素融合的抗体等)的施用途径与已知方法一致。
在某些实施方案中，药物组合物可以包含用于改变、维持或保持例如组合物的pH、渗透性、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或渗透的配制物质。在此类实施方案中，合适的配制物质包括但不限于：氨基酸(如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)；抗微生物剂；抗氧化剂(如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲剂(如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其他有机酸)；填充剂(如甘露糖醇或甘氨酸)；螯合剂(如乙二胺四乙酸(EDTA))；络合剂(如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)；填料；单糖；双糖；和其他碳水化合物(如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白质(如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色剂、调味剂和稀释剂；乳化剂；亲水聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐抗衡离子(如钠)；防腐剂(如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(如甘露糖醇或山梨糖醇)；悬浮剂；表面活性剂或润湿剂(如普朗尼克、PEG、脱水山梨醇酯、聚山梨醇酯如聚山梨醇酯20、聚山梨酸酯80、Triton、三甲胺、卵磷脂、胆固醇、泰洛沙泊(tyloxapal))；稳定性增强剂(如蔗糖或山梨糖醇)；张力增强剂(如碱金属卤化物，例如氯化钠或氯化钾、甘露糖醇山梨糖醇)；递送介质；稀释剂；赋形剂和/或药物佐剂。参见Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，(A.R.Gennaro编辑)，1990，Mack Publishing Company。
在某些实施方案中，本领域技术人员将根据例如预期的施用途径，递送形式和期望的剂量来确定包含本文所述的抗体和/或细胞的合适的药物组合物。参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences，同上。在某些实施方案中，此类组合物可影响本公开的抗体的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。
在某些实施方案中，药物组合物中的主要介质或载体本质上可以是水性或非水性的。例如，合适的介质或载体可以是用于注射的水、生理盐水溶液或人工脑脊液，可能补充有用于肠胃外给药的组合物中常见的其它物质。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是另外的示例性介质。在一些实施方案中，药物组合物包含约pH 7.0-8.5的Tris缓冲液或约pH 4.0-5.5的乙酸盐缓冲液，并且还可以包含山梨糖醇或其合适的替代物。在本公开的某些实施方案中，可以通过将具有所需纯度的所选组合物与任选的配制剂(Remington'sPharmaceutical Sciences，同上)混合来制备冻干的块状物或水溶液形式的用于储存的组合物。此外，在某些实施方案中，可以利用合适的赋形剂如蔗糖将产品配制为冻干物。
可以选择本公开的药物组合物用于肠胃外递送。可以选择组合物用于吸入或通过消化道递送，如口服。此类药学可接受的组合物的制备在本领域的技术范围内。
制剂组分可以以施用部位可接受的浓度存在。在某些实施方案中，使用缓冲液将组合物维持在生理pH或稍低的pH下，通常在约5至约8的pH范围内。
当考虑肠胃外施用时，用于本公开的治疗组合物可以以无热原肠胃外可接受的水溶液的形式提供，所述水溶液包含含有期望抗体和/或细胞的药学可接受的载体。用于肠胃外注射的合适介质的实例是无菌蒸馏水，其中将抗体配制为无菌的等渗溶液，并妥善保存。在某些实施方案中，制备可以包括用可以提供产物的控制释放或持续释放的试剂(如可注射的微球体、生物可侵蚀颗粒、聚合物化合物(如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠或脂质体)配制期望的分子，所述产物可以通过储库注射递送。在某些实施方案中，也可以使用透明质酸，其具有促进循环持续时间的作用。在某些实施方案中，可以使用可植入递送装置引入期望的抗体和/或细胞。
可将本公开的药物组合物配制用于吸入。在这些实施方案中，将抗体配制为用于吸入的干粉。在一些实施方案中，也可以用推进剂配制抗体吸入溶液用于气雾剂递送。在某些实施方案中，溶液可以雾化。因此，肺部施用和配制方法在通过引用并入的国际专利公开第WO94/20069号中进一步描述，其描述了化学修饰的蛋白质的肺部递送。
也考虑可以口服施用的制剂。可以用或不用组合固体剂型(如片剂和胶囊)中常用的载体配制以此类方式施用的抗体。在某些实施方案中，当生物利用度最大化并且系统前降解最小化时，可将胶囊设计为在胃肠道中的点释放制剂的活性部分。可以包含其他试剂以促进抗体的吸收。也可以应用稀释剂、调味剂、低熔点的蜡、植物油、润滑剂、悬浮剂、片剂崩解剂以及粘合剂。
本公开的一些药物组合物包含有效量的本文所述的一种或多种抗体，其处于与适合制备片剂的无毒赋形剂的混合物中。通过将片剂溶解于无菌水或其他合适的介质中，可以制备单位剂量形式的溶液。合适的赋形剂包括但不限于：惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠或碳酸氢盐、乳糖或磷酸钙；或者粘合剂，如淀粉、明胶或阿拉伯树胶；或者润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。
其它药物组合物对于本领域技术人员将是显而易见的，其包括涉及持续递送或控制递送制剂的制剂。用于配制多种其他持续递送或控制递送装置(如脂质体载体、生物可侵蚀微粒或多孔珠和储库注射剂)的技术对于本领域技术人员众所周知。参见例如国际专利公开号WO93/15722，其描述了用于递送药物组合物的多孔聚合物微粒的控制释放。持续释放制剂可以包含成型制品形式的半渗透性聚合物基质，例如膜或微胶囊。持续释放基质可以包括：聚酯、水凝胶、聚丙交酯(如美国专利第3,773,919号和欧洲专利申请公开第EP058481号中公开的)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman等人,1983,Biopolymers 22:547-556)、聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等人,1981,J.Biomed.Mater.Res.15：167-277和Langer,1982,Chem.Tech.12:98-105)、乙烯醋酸乙烯酯(Langer等人，同上)或聚-D(-)-3-羟基丁酸(欧洲专利申请公开号EP 133,988)。持续释放组合物还可以包含可通过本领域已知的数种方法中的任何方法制备的脂质体。参见例如Eppstein等人,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3688-3692；欧洲专利申请公开第EP036,676号、第EP 088,046号和第EP 143,949号。
用于体内施用的药物组合物通常作为无菌制剂提供。可以通过经无菌滤膜的过滤来完成灭菌。当冻干组合物时，可以在冻干和重构之前或之后进行利用该方法进行的灭菌。用于肠胃外施用的组合物可以以冻干形式或溶液储存。通常将肠胃外组合物放入具有无菌入口的容器中，例如具有皮下注射针头可刺穿的塞子的静脉注射溶液袋或瓶。
一旦配制了药物组合物，其可以作为溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体或者作为脱水的或冻干粉末储存在无菌瓶中。此类制剂可以以即用形式或以在施用前重构的形式(例如冻干)储存。适合使用的药物组合物包括这样的组合物，其中包含有效实现其预期目的的量的一种或多种本发明的抗体和/或细胞。更具体地，治疗有效量意为有效预防、减轻或改善疾病症状或延长所治疗的对象的存活的抗体和/或细胞的量。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，特别是根据本文提供的详细公开内容。可以通过利用体外和体内方法来确定治疗有效剂量。
在一个实施方案中，本发明的抗体也可用于体内或离体检测HSC。通过下述实现体内检测：标记本文所述的抗体，将标记抗体施用于对象，然后使对象成像。根据本公开可用于诊断成像的标记物的实例是：放射性标记物(如I123、I131、I111、Tc99m、P32、I125、H3、C14和Rh188)，荧光标记物(如荧光素(fluorescein)和若丹明)，核磁共振活性标记物，正电子发射断层扫描(“PET”)扫描仪可检测到的正电子发射同位素，化学发光物(如荧光素(luciferin))以及酶标志物(如过氧化物酶或磷酸酶)。也可以应用短程辐射发射器，如短程检测器探针(如经直肠探针)可检测到的同位素。可以利用本领域已知的技术用此类试剂标记抗体。对于涉及放射性标记抗体的技术，例如参见Wensel和Meares，Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy,Elsevier,N.Y.(1983)，在此将其通过引用并入。也参见D.Colcher等人，“Use of Monoclonal Antibodies asRadiopharmaceuticals for the Localization of Human Carcinoma Xenografts inAthymic Mice”,Meth.Enzymol.121:802-816(1986)，在此将其通过引用并入。
根据本公开的放射性标记的抗体可以用于体外诊断测试。抗体、其结合部分、探针或配体的比活性取决于放射性标记物的半衰期，同位素纯度以及如何将标记物掺入生物试剂中。在免疫分析测试中，一般而言，比活性越高，灵敏度越好。用放射性同位素标记抗体的程序在本领域通常是已知的。
可以将放射性标记的抗体施用于患者，在该患者中，其定位于携带能与抗体反应的抗原的HSC，并利用已知技术(如利用例如γ相机或发射断层扫描的放射性核素扫描)对体内进行“检测”或“成像”。参见例如A.R.Bradwell等人,“Developments in AntibodyImaging”，Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy，R.W.Baldwin等人(编辑)，pp.65-85(Academic Press 1985)，在此将其通过引用并入。可选地，当放射性标记物发射正电子(例如C11、F18、O15和N13)时，可以使用正电子发射轴向断层扫描扫描仪，如位于Brookhaven国家实验室的指定Pet VI。
可以由本领域已知的标准部分制备荧光团和发色团标记的生物学试剂。由于抗体和其他蛋白质吸收波长高达约310nm的光，因此应该选择在310nm以上的波长例如400nm以上具有大量吸收的荧光部分。Stryer，Science，162：526(1968)和Brand，L等人，AnnualReview of Biochemistry，41：843-868(1972)描述了多种合适的荧光剂和发色团，在此将其通过引用并入。可以通过诸如美国专利第3,940,475号、第4,289,747号和第4,376,110号中所公开的那些的常规程序用荧光发色团标记抗体，在此将其通过引用并入。
在根据本公开的另一实施方案中，提供治疗、监测治疗性治疗的进展和/或有效性的方法。
在本文所述的各治疗方法的一个实施方案中，首先对对象进行增加或置换HSC的需求的诊断。在本文所述的各治疗方法的一个实施方案中，对象需要增加的血细胞。在另一实施方案中，对象患有选自血液疾病、病症或病况(例如地中海贫血、镰状细胞病、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤等)的疾病。在一个实施方案中，将细胞或抗体用于治疗晚期滤泡性淋巴瘤。在另一实施方案中，将细胞或抗体用于治疗儿科血液疾病。在一个实施方案中，将细胞或抗体用于治疗成人血液疾病。在另一实施方案中，将细胞或抗体用于治疗急性髓性白血病。
在本文所述的各治疗方法的一个实施方案中，首先对对象进行心血管病症和/或对HSC或EPC的需求的诊断，并且所述细胞或抗体用于治疗心血管病症。在另一实施方案中，对象有伤口，并且所述细胞或抗体用于治疗伤口(例如促进伤口愈合)。在另一实施方案中，将从HSC繁殖的细胞用于调节介质，其用于治疗心血管病症或治疗伤口(例如促进伤口愈合)。
在本文所述的各治疗方法的一个实施方案中，首先对对象的遗传疾病、病症或病况和/或对遗传修饰的HSC的需求进行诊断。在一个实施方案中，将遗传修饰的HSC用于治疗血液疾病或病症，例如镰状细胞、地中海贫血和严重联合免疫缺陷。
在一个实施方案中，本文描述了移植具有高重建潜能的人HSC群的方法。在一个实施方案中，本文描述了移植来源于具有高重建潜能的人HSC的细胞群的方法。在一个实施方案中，本文描述了用于移植具有高重建潜能的遗传修饰的人造血干细胞群的方法。
本文公开的某些方法适用于需要较大百分比或数目的HSC的任何情况，适用于临床研究，适用于药物发现或者适用于人造血干细胞移植中的植入，例如适用于挽救细胞消融治疗之后的患者。例如，在骨髓移植中，已知植入接受者中的HSC的数目或百分比越高，则捐献者的HSC在接受者中的植入成活率就越高。
本文公开的某些方法适用于需要遗传修饰的HSC的任何情况，适用于临床研究，适用于药物发现或者适用于人造血干细胞移植中的植入，例如适用于基因疗法。
在一个实施方案中，本文描述了药物组合物，其包含含有HSC(例如具有高重建潜能的HSC)的分离的细胞群和药学可接受的载体，。
在一个实施方案中，本文描述了药物组合物，其包含含有从HSC(例如具有高重建潜能的HSC)繁殖的细胞的分离的细胞群和药学可接受的载体，。
在一个实施方案中，本文描述了药物组合物，其包含含有遗传修饰的造血干细胞(例如具有高重建潜能的HSC)的分离的细胞群和药学可接受的载体。
根据具体实施方案，本文所述的药物组合物可以包含例如刺激或促进HSC扩增/自我更新/长期培养起始集落形成能力的试剂或者通过此类扩增产生的细胞。因此，用于施用此类组合物的制剂将取决于具体实施方案。例如，可以通过用于促进扩增的试剂的任何合适的途径来施用所述试剂。施用途径包括但不限于：皮内、肌肉内、腹膜内，静脉内和皮下途径。施用途径还可以包括直接施用，例如向伤口部位直接施用。
尽管存在增加从骨髓进入循环的HSC的动员的方法，本文公开的方法可以与这些动员方法结合使用以增加收获之前捐献者的循环HSC的量和骨髓中的HSC的量。此外，本文公开的方法可用于从捐献者获得细胞之后但在将细胞移植进接受者之前增加HSC的量。最初将从捐献者获得的HSC离体培养并通过本文公开的方法在培养物中扩增。当HSC的数目达到期望的量时，可以收获培养的HSC并将其植入接受者中。
在一个实施方案中，从对象分离HSC，任选地培养以扩增数目，收集并移植回同一对象，即自体细胞移植。在一个实施方案中，从对象分离HSC，进行遗传修饰，以及任选地培养以扩增数目，收集并将其移植回同一对象，即自体细胞移植。
在另一实施方案中，HSC分离自与接受者对象HLA-类型匹配的捐献者，其中捐献者和接受者是两个单独的个体。这是同种异体移植。捐献者-接受者的抗原类型匹配在本领域中众所周知。HLA类型包括HLA-A、HLA-B、HLA-C和HLA-D。通常，这些代表了移植所需的最小数目的细胞表面抗原匹配。
在一个实施方案中，在移植前将包含HSC或遗传修饰的HSC的分离的细胞群冷冻保存。
移植方法不受捐献者或接受者性质的限制。在一些实施方案中，捐献者和接受者均为人类。移植物接受者与捐献者可以完全或部分同种异体。移植可以是自体的。移植物接受者或捐献者的年龄可以小于五岁，1至10岁，5至15岁，10至20岁，15至25岁，20至30岁，25岁至35岁，30至40岁，35至45岁，40至50岁，45至55岁，50至60岁，55至65岁，60至70岁或者70岁或更大。
在另一个实施方案中，正在治疗的对象接受了亚致死剂量或致死剂量的辐射作为移植的辅助(例如，已受辐射)。
考虑到本文所公开的本公开的说明书和实施，本公开的其他实施例对于本领域技术人员将是显而易见的。
HSC，例如具有高重建潜能的HSC在临床中具有多种用途。对于综述，参见例如Weissman IL,Shizuru JA,The origins of the identification and isolation ofhematopoietic stem cells,and their capability to induce donor-specifictransplantation tolerance and treat autoimmune diseases,Blood,2008Nov 1,112(9):3543-53。
本领域可以找到干细胞移植在人类疗法中的用途的多个具体实例。参见，例如Anthony D.Ho,Rainer Haas和Richard E.Champlin编辑的Hematopoietic Stem CellTransplantation,Marcel Dekker Inc.2000；Schrauder A,von Stackelberg A,SchrappeM,Cornish J,Peters C,ALL-BFM研究组,EBMT PD WP,I-BFM研究组,Allogeneichematopoietic SCT in children with ALL:current concepts of ongoingprospective SCT trials,Bone Marrow Transplant,2008年6月,41增刊2:S71-4；CopelanEA,Hematopoietic stem-cell transplantation,N Engl J Med,2006年4月27日,354(17):1813-26；Kim SW,Hematopoietic stem cell transplantation for follicularlymphoma:optimal timing and indication,J Clin Exp Hematop,2014,54(1):39-47；Choi SW,Reddy P,Current and emerging strategies for the prevention of graft-versus-host disease,Nat Rev Clin Oncol,2014年9月,Vol.11,pp.536-47；Rambaldi A,Biagi E,Bonini C,Biondi A,Introna M,Cell based strategies to manage leukemiarelapse:efficacy and feasibility of immunotherapy approaches,Leukemia,29:1-10,2014年7月8日,doi:10.1038/leu.2014.189.[印刷前的电子版]；Kekre N,Antin JH,Hematopoietic stem cell transplantation donor sources in the 21st century:choosing the ideal donor when a perfect match doesn't exist,Blood,2014年7月17日,Vol.124(3),pp.334-343；以及Tsirigotis P,Shimoni A,Nagler A,The expandinghorizon of immunotherapy in the treatment of malignant disorders:Allogeneichematopoietic stem cell transplantation and beyond,Ann Med,2014,Vol.46(6),pp.384-396。
可以利用常规方法，通过本领域普通技术人员确定施用途径、移植细胞的数目/体重，接受者的移植前和移植后处理以及HSC或具有高重建潜能的HSC的施用速率和频率。在一个实施方案中，施用方法是静脉输注。输注/移植的细胞的数目将考虑诸如下述的因素：性别、年龄、体重、疾病或病症的类型、疾病或病症的阶段、细胞群中期望细胞的百分比(例如细胞群的纯度)以及产生治疗益处所需的细胞数目。本文所述的方法可与多种辅助治疗一起使用。一方面，辅助治疗包括抗真菌剂、抗细菌剂和抗病毒剂等。
如以上所述，将根据出于具体目的的常规程序凭经验确定实现治疗效果所需的细胞的量。通常，对于出于治疗目的细胞施用，给予药理学有效剂量的细胞。“药理学有效量”或“药理学有效剂量”是足以产生期望的生理效应的量或者能够达到期望结果的量，例如对象中植入或存活的量。治疗益处还包括停止或减缓潜在疾病或病症的进展，不管改善是否实现。
实施例
实施例1：用于免疫的人CD34+，CD38-的HSC的分离
利用阳性免疫磁性选择收获的人CD34+造血干细胞可以获自Lonza或任何其他商业来源。它们可以来源于，例如骨髓、外周血、白细胞去除术产物和/或脐带血。在一个实例中，在Ficoll-Hypaque上分离低密度的骨髓单核细胞(小于1.077g/mL)。利用Cell Pro Inc(Bothel，WA)市售的细胞分离系统试剂盒富集CD34+细胞，将其用含1％BSA的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次，重悬于1％BSA中至浓度为2×108个细胞/mL，并与生物素化的抗CD34IgM单克隆抗体(MoAb)(12.8)室温孵育25分钟。用1％BSA洗涤细胞以移除未结合的抗体，然后以2×107个细胞/mL重悬于5％BSA中并上样至抗生物素蛋白柱上。将吸附的CD34+细胞通过手动挤压凝胶床释放，重悬于含20％FCS的IMDM中，并在Coulter计数器(CoulterElectronics，Hialeah，FL)上计数。
可选地，利用Ficoll Hypaque(Pharmacia，Piscataway，NJ)密度离心从人骨髓分离单核细胞。然后利用小型磁性活化细胞分选系统(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)预富集单核细胞部分中的CD34+细胞，其提供85％至90％纯度的CD34+群。然后将得到的细胞与异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗CD34(HPCA2-FITC；Becton Dickinson，San Jose，CA)和藻红蛋白(PE)标记的抗CD38(Leu 17-PE；Becton Dickinson)孵育，并通过FACSVantage(BectonDickinson)将CD34+/CD38-细胞分离至纯度大于99％。获得的CD34+CD38-细胞为具有高CD34抗原表达且CD38荧光低于同种型对照的最高PE荧光的一半的那些细胞。
实施例2：用于产生针对CD133表面上的2-3唾液酸化乳糖-新乳糖型结构(如sialyl I(大I)、sialyl i(小i)和唾液酸乳糖)的抗体的CD133的分离
可以通过本领域普通技术人员已知的数种方法中的任何方法完成CD133自人造血干细胞和祖细胞的分离和纯化。在一个实例中，将CD133+细胞(利用例如来自MiltenyiBiotec，Auburn，CA的抗CD133包被的磁珠/Diamond CD133分离试剂盒分离)(2×109)用PBS洗涤并在提取缓冲液中裂解。将细胞在室温间歇涡旋5分钟，然后在冰上放置20分钟。通过在4℃以10,000g离心10分钟来移除细胞核和碎片。上样至在洗涤缓冲液(0.125M NaCl、25mM Tris、pH 8.0、0.01％NaN3、2.5mM EDTA和0.1％Brij)中平衡的0.5mL抗CD133亲和柱之前，通过0.2-μm过滤器过滤裂解物/上清液。然后用洗涤缓冲液充分洗涤柱子，并在50mM乙醇胺，pH 11.5、0.1％Brij和0.01％NaN3中洗脱CD133抗原。用HCl将pH调节至中性。可以通过额外的层析法(包括使抗原洗脱液通过在洗涤缓冲液中平衡的300μl床体积的DEAE柱)以及第二亲和层析步骤移除残留的污染蛋白。可以通过例如SDS-PAGE和蛋白质印迹分析来确认洗脱的CD133抗原的纯度和身份。
实施例3：针对2-3唾液酸化乳糖-新乳糖型结构(如sialyl I(大I)、sialyl i(小i)和唾液酸乳糖)的抗体的产生
在一个实例中，为了产生针对2-3唾液酸化乳糖-新乳糖型结构(如sialyl I(大I)、sialyl i(小i)和唾液酸乳糖)的鼠单克隆抗体(Mab)，用pH 7.4含5×105个CD34+，CD38-的HSC的0.03mL PBS皮下免疫(例如足垫)BALB/c小鼠至少3次，每周两次。第一次免疫在存在完全弗氏佐剂(Sigma，St Louis，MD，USA)的情况下进行。将不完全弗氏佐剂(Sigma)添加到随后的免疫中。此外，可以在注射前将细胞与1:100的植物凝集素(PHA)孵育10分钟。在融合前三天，用5×105个CD34+、CD38-的HSC加强免疫的小鼠。在大约第21天，分别通过脾脏输注和切碎近端淋巴结而由免疫的小鼠制备脾细胞和淋巴细胞，收获并与SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞(ATCC，Rockville，MD，USA)融合。融合方案可以如Kohler和Milstein(Nature，256：495-497,1975)所述。
然后将融合细胞进行HAT选择。一般而言，为了制备单克隆抗体或其功能片段，尤其是鼠源的单克隆抗体或其功能片段，可以参考例如手册“抗体”(Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor NY，pp.726，1988)中所述的技术。在融合之后大约10天，筛选杂合细胞的集落。对于初筛，通过ELISA对杂交瘤上清液中所产生的针对2-3唾液酸化乳糖-新乳糖型结构(如sialyl I(大I)、sialyl i(小i)和唾液酸乳糖)中的一种的Mab的分泌进行评估。在一个实例中，对上清液中能结合ELISA板上包被的人血清白蛋白(HSA)缀合的3’唾液酸化乳糖但不结合单独的HAS的那些进行评估。将该测试中的阳性反应物扩增，克隆并回收一组杂交瘤，纯化并对其特异性结合人干细胞标志物CD133上表达的2-3唾液酸化乳糖-新乳糖型结构的能力进行筛选。在每个实验中使用同种型对照(Sigma，ref M90351MG)。
实施例4：能够特异性结合人干细胞标志物CD133上表达的2-3唾液酸化乳糖-新乳糖型结构的杂交瘤的选择
用含CD133(提取自人造血干细胞和祖细胞)的PBS(例如1g/mL，50L)包被96孔板的每个孔，并在37℃孵育1小时。然后将含有待选抗体的杂交瘤培养物上清液加入单独的孔中，并在37℃另外孵育1小时。然后用PBS-吐温洗涤孔，并与标记的第二抗小鼠抗体(例如不同同种型的HRP缀合的山羊抗小鼠抗体)在37℃孵育1小时。孵育之后，用PBS洗涤各孔并根据第二抗体标记物使结合的抗体(例如利用用邻苯二胺作为HRP的显色底物的比色测定；利用酶标仪于492nm下的吸光度读数)可视化。
可以利用朝鲜槐(Maakia amurensis)(MAA)凝集素，通过凝集素亲和层析来纯化表达2-3唾液酸化乳糖结构的具体糖型的CD133。MAA凝集素层析凝胶可以从商业来源(例如EYlabs)获得。将凝胶倒入小柱(例如塑料微型柱)中并用10倍凝胶体积的缓冲液洗涤。将提取自人造血干细胞和祖细胞的CD133施加于柱上，并用缓冲液从柱上洗去未结合的物质。然后用所选缓冲液中的合适的碳水化合物如2-3唾液酸乳糖-新乳糖型结构洗脱结合的物质。
一些期望的抗体结合3’唾液酸化的CD133(3’SL-CD133)，但不结合唾液酸苷酶处理的3’SL-CD133。可以利用任何完善建立的功能性体内模型测试此类抗体对具有高重建潜能的原始HSC的分离。
在其他情况下，期望的抗体结合CD133(包被的孔)和人岩藻糖苷酶处理的CD133(包被的孔)，但不结合唾液酸苷酶处理的CD133。可以使用任何完善建立的功能性体内模型测试此类抗体对具有高重建潜能的原始HSC的分离。
实施例5：对能够分离具有高重建潜能的HSC的杂交瘤/抗体的筛选
本领域普通技术人员已知有数种方法可以用作分析分离的造血细胞群的自我更新能力和重建潜能的工具。此类方法之一包括将测试细胞群移植入经辐射的小鼠(例如NOD/SCID IL2Ry无小鼠，也称为NOG小鼠)中，然后对那些测试细胞群的长期再建群潜能进行评估。参见例如，Majeti R，Park CY和Weissman IL，(2007)Identification of aHierarchy of Multipotent Hematopoietic Progenitors in Human Cord Blood，CellStem Cell，Vol.1(6)：635-645；以及Wang，JC，Lapidot，T.，Cashman，JD，Doedens，M.，Addy，L，Sutherland，DR，Nayar，R.，Laraya，P.，Minden，Keating，A.，Eaves，AC，Eaves，CJ和Dick，JE，(1998)High level engraftment of NOD/SCID mice by primitive normal andleukemic hematopoietic cells from patients with chronic myeloid leukemia inchronic phase,Blood 91,2406–2414。
NOD/SCID IL2Ry无小鼠可获自Jackson实验室(Bar Harbor，ME)。如本领域充分描述的，在移植之前，利用Gamma Cell 40铯源，分别用100或270拉得对新生小鼠和成年小鼠进行高达24小时的亚致死性辐射。然后将要测试其重建潜能的分离的人细胞群(例如能结合如以上所述制备的抗(2-3唾液酸化乳糖结构)抗体的HSC)在出生之后最初的48小时内通过心内注射或面部静脉注射转移至新生小鼠中，或者通过尾静脉注射转移至成年(2-4月龄)小鼠中。可以通过下述进行二次移植：将来自初次接受者小鼠的股骨和胫骨的5×106个骨髓细胞转移至3-5只经致死性辐射的NOG小鼠的每一只中。在移植之后第1、2、3、4和5个月对来自二次接受者小鼠的外周血细胞进行分析。
在将测试细胞注射进NOG小鼠之后的不同时间点(例如在12周至30周)，通过颈椎脱臼使小鼠安乐死，并收获血液、骨髓(胫骨、股骨)、脾脏、淋巴结和胸腺。然后利用本领域众所周知的方法对这些组织的捐献者嵌合状态和白细胞亚群进行流式细胞术分析。例如，将骨髓在含有0.1％牛血清白蛋白的DMEM中重悬。用异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的抗人CD45和PE缀合的抗小鼠CD45将骨髓细胞进行染色；也用下述PE缀合的抗体中的一种将人白细胞亚群进行染色：CD3、CD14、CD16、CD20、CD41和CD56。用抗小鼠TER119-FITC和抗人血型糖蛋白A(GPA)-PE(CD235a)将红血细胞进行染色；用人CD45-FITC和CD71-PE将红细胞亚群进行染色。所有抗体均可购自BD Biosciences。可选地，可以利用抗人抗体，如PB缀合的CD45，HI30；APC-Alexa Fluor 750缀合的CD3，S4.1；APC缀合的CD19，SJ25-C1；PE缀合的CD13，TK1(Caltag)；PE缀合的CD33，P67.6；PE缀合的GPA，GA-R2；APC缀合的CD41a，HIP8(BDBiosciences)进行谱系分析。分别基于Alexa488或PE-Cy7-缀合的CD45.1，克隆A20.1.7以及PE-Cy5或PE-Cy7-缀合的Ter119(eBiosciences，San Diego，CA)的表达鉴定小鼠白细胞和红细胞。多家供应商(包括R&D Systems)提供多组谱系分化标志物。
可以如下由外周血计算嵌合状态或人白细胞重建水平：
嵌合状态＝％CD45+人细胞/(％CD45+人细胞+％CD45+小鼠细胞)
利用这些方法，鉴定的具有高重建潜能的HSC将(1)显示至少10％的嵌合状态，或(2)在初次接受者中仅在12周或更久之后显示出明显的植入，但在二次接受者中显示多谱系重建。
实施例6：具有高重建潜能的HSC的体内扩增和分化
可以通过多种方法离体扩增HSC，包括具有高重建潜能的原始早期HSC。在扩增之前，可对HSC进行遗传修饰，以使得到的细胞含有期望的遗传修饰。可商购获得的扩增培养基和方案的实例包括StemMACSTM HSC扩增培养基(Miltenyi Biotec)、STEMGENIX HSC GEM/StemlineTM培养基(SIGMA)和PromoCell的DXF培养基(PromoCell GmbH)。其他扩增方法在本领域中众所周知。参见例如Walasek，MA，van Os R和de Haan G，(2012)Hematopoieticstem cell expansion：challenges and opportunities；Ann N Y，Acad Sci.2012年8月，1266：138-50；以及Rodríguez-Pardo VM和Vernot JP，Mesenchymal stem cells promotea primitive phenotype CD34+c-kit+in human cord blood-derived hematopoieticstem cells during ex vivo expansion,Cell Mol Biol Lett,2013年3月，18(1)：11-33。
HSC可以分化为多种谱系。对于综述，参见例如Seita J.和Weissman I.L.，(2010)Hematopoietic Stem Cell：Self-renewal versus Differentiation，Wiley InterdiscipRev Syst Biol Med，2(6)：640-653。这些谱系中的一些可以在体外分化。例如，已经衍生出一种方法从BM来源的HSC体外获得单核细胞。Magga J,Savchenko E,Malm T,Rolova T,Pollari E,Valonen P,LehtonenJantunen E,Aarnio J,Lehenkari P,Koistinaho M,Muona A,Koistinaho J,Production of monocytic cells from bone marrow stemcells:therapeutic usage in Alzheimer's disease,J Cell Mol Med,2012年5月,16(5):1060-73。此外，可以以为骨骼、软骨和肺提供长效前体细胞的方式培养干细胞。Pereira,R.F.等人,Cultured adherent cells from marrow can serve as long-lasting precursor cells for bone,cartilage,and lung in irradiated mice,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 92,4857–4861(1995)。也可以用遗传修饰的干细胞进行此类培养。

Claims (41)

1.产生可用于鉴定和分离人造血干细胞(HSC)的抗体的方法，其包括筛选抗体群中能结合2-3唾液酸化乳糖-新乳糖型结构并且能鉴定人HSC的抗体。
2.如权利要求1所述的方法，其中产生针对CD34+/CD38-HSC的所述抗体群。
3.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中鉴定的HSC是具有高重建潜能的HSC。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述2-3唾液酸化乳糖-新乳糖型结构选自：sialyl I、sialyl i、唾液酸乳糖、唾液酸乳糖-N-四糖、唾液酸乳糖-N-新四糖以及N-乙酰基唾液酸乳糖胺。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述2-3唾液酸化乳糖-新乳糖型结构是唾液酸乳糖。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体能结合人干细胞标志物CD133上的2-3唾液酸化乳糖-新乳糖型结构。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体能特异性结合3’SL-CD133而不能特异性结合唾液酸苷酶处理的3’SL-CD133。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体能够用于分离如通过体内模型在功能上确定的具有高重建潜能的原始HSC。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述体内模型是将具有高重建潜能的原始HSC移植入经亚致死性辐射或致死性辐射的小鼠中。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体能结合或者增强性结合CD133和人岩藻糖苷酶处理的CD133，但不能结合唾液酸苷酶处理的CD133。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述体内模型是将具有高重建潜能的原始HSC移植入经亚致死性辐射或致死性辐射的小鼠中。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述HSC获自选自骨髓、动员的外周血和脐带血的至少一种来源。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过选自FACS分选、免疫磁珠和亲和基质的至少一种方法获得所述HSC。
14.如权利要求6-13中任一项所述的方法，其中所述人干细胞标志物CD133分离自人HSC或人造血祖细胞。
15.利用通过权利要求1-14中任一项所述的方法产生的抗体分离的HSC群。
16.遗传修饰的HSC群，其通过下述产生：
利用通过权利要求1-14中任一项所述的方法产生的抗体分离HSC；和
对所分离的HSC进行遗传修饰。
17.如权利要求15或16所述的细胞群，其中所述细胞分离自骨髓、外周血、白细胞去除术产物、脐带血或其组合。
18.淋巴谱系细胞群，其由权利要求15-17中任一项所述的群分化。
19.红细胞谱系细胞群，其由权利要求15-17中任一项所述的群分化。
20.内皮祖细胞群，其由权利要求15-17中任一项所述的群分化。
21.分离的小鼠单克隆抗体，其通过权利要求1-14中任一项所述的方法产生。
22.治疗血液疾病、治疗血液病症、治疗血液病况、治疗心血管病症、治疗伤口、使之从化疗中解脱和/或使对象从高剂量辐射中解脱的方法，其包括施用权利要求15-20中任一项所述的细胞群。
23.利用权利要求15-20中任一项所述的细胞群重建造血的方法。
24.利用权利要求1-14中任一项所述的方法产生的抗体诊断疾病、病症或病况的方法。
25.利用权利要求1-14中任一项所述的方法产生的抗体纯化HSC的方法。
26.利用权利要求1-14中任一项所述的方法产生的抗体治疗淋巴瘤的方法。
27.利用权利要求1-14中任一项所述的方法产生的抗体监测疾病、病症或病况的方法。
28.利用权利要求1-14中任一项所述的方法产生的抗体监测疾病、病症或病况的治疗的方法。
29.利用权利要求15-20任一项中所述的细胞治疗晚期滤泡性淋巴瘤的方法。
30.利用权利要求15-20任一项中所述的细胞治疗儿科血液疾病的方法。
31.利用权利要求15-20任一项中所述的细胞治疗血液病症的方法。
32.利用权利要求15-20任一项中所述的细胞治疗心血管病症的方法。
33.利用权利要求15-20任一项中所述的细胞促进伤口愈合的方法。
34.如权利要求30所述的方法，其中所述疾病是急性髓性白血病。
35.利用权利要求16-20任一项中所述的细胞治疗遗传疾病、病症或病况的方法。
36.治疗患有血液疾病、病症或病况的患者的方法，其包括：
从捐献者获得细胞群；
利用权利要求1-14中任一项所述的方法产生的抗体鉴定所述细胞群中的HSC；以及
向所述患者施用所鉴定的HSC或来源于所鉴定的HSC的细胞。
37.治疗从化疗或辐射暴露恢复的患者的方法，其包括:
从捐献者获得细胞群；
利用权利要求1-14中任一项所述的方法产生的抗体鉴定所述细胞群中的HSC；以及
向从化疗或辐射暴露恢复的患者施用所鉴定的HSC或来源于所鉴定的HSC的细胞。
38.促进有伤口的患者的伤口愈合的方法，其包括：
从捐献者获得细胞群；
利用权利要求1-14中任一项所述的方法产生的抗体鉴定所述细胞群中的HSC；以及
向从化疗或辐射暴露恢复的患者施用所鉴定的HSC或来源于所鉴定的HSC的细胞。
39.治疗患有遗传疾病、病症或病况的患者的方法，其包括：
从捐献者获得细胞群；
利用权利要求1-14中任一项所述的方法产生的抗体鉴定所述细胞群中的HSC；
对所鉴定的HSC进行遗传修饰；以及
向所述患者施用经遗传修饰的HSC或来源于所述经遗传修饰的HSC的细胞。
40.如权利要求36-39中任一项所述的方法，其中所述捐献者是所述患者。
41.如权利要求36-39中任一项所述的方法，其中所述捐献者不是所述患者。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109053892A (zh) * 2018-09-19 2018-12-21 苏州思坦维生物技术股份有限公司 特异结合人及猴cd38抗原的单克隆抗体及其制备方法与应用

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110755608A (zh) * 2018-07-27 2020-02-07 上海微创医疗器械（集团）有限公司 一种特异性抗体的用途、一种植入医疗器械及其制备方法
JPWO2020158943A1 (ja) * 2019-02-01 2021-12-02 住友化学株式会社 抗体及びその機能性断片

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1280611A (zh) * 1997-09-25 2001-01-17 糖技术公司 结合造血干细胞的方法和组合物
US20100145032A1 (en) * 2007-01-18 2010-06-10 Suomen Punainen Risti, Veripalelu Novel carbohydrate profile compositions from human cells and methods for analysis and modification thereof
CN101848991A (zh) * 2007-08-08 2010-09-29 协和发酵麒麟株式会社 分离的细胞群
US20100292095A1 (en) * 2007-11-09 2010-11-18 Suomen Punainen Risti, Veripalvelu Human monoclonal antibodies directed to sialyl lewis c, sialyl tn and n glycolylneuraminic acid epitopes and a method of analysis of stem cells comprising said epitopes
CN101896200A (zh) * 2007-12-06 2010-11-24 Csl有限公司 抑制白血病干细胞的方法
WO2012045913A1 (en) * 2010-10-06 2012-04-12 Suomen Punainen Risti, Veripalvelu Method for isolating cells and a cell population thereof
US20120093782A1 (en) * 2009-05-13 2012-04-19 Grove Robert I Enhanced Hematopoietic Stem Cell Engraftment

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US3940475A (en) 1970-06-11 1976-02-24 Biological Developments, Inc. Radioimmune method of assaying quantitatively for a hapten
US4263428A (en) 1978-03-24 1981-04-21 The Regents Of The University Of California Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same
US4289747A (en) 1978-12-26 1981-09-15 E-Y Laboratories, Inc. Immunological determination using lectin
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
EP0088046B1 (de) 1982-02-17 1987-12-09 Ciba-Geigy Ag Lipide in wässriger Phase
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
US4615885A (en) 1983-11-01 1986-10-07 Terumo Kabushiki Kaisha Pharmaceutical composition containing urokinase
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US4965204A (en) 1984-02-06 1990-10-23 The Johns Hopkins University Human stem cells and monoclonal antibodies
US5130144B1 (en) 1984-02-06 1995-08-15 Univ Johns Hopkins Human stem cells and monoclonal antibodies
JPS6147500A (ja) 1984-08-15 1986-03-07 Res Dev Corp Of Japan キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
JPS61134325A (ja) 1984-12-04 1986-06-21 Teijin Ltd ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
FR2596413B1 (fr) 1986-03-27 1988-06-10 Merieux Inst Nouveaux milieux de culture de bacteries appartenant au genre bordetella, contenant des derives etherifies de polymeres de d-glucose, et leur application
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
US5536475A (en) 1988-10-11 1996-07-16 Baxter International Inc. Apparatus for magnetic cell separation
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5486359A (en) 1990-11-16 1996-01-23 Osiris Therapeutics, Inc. Human mesenchymal stem cells
US6565841B1 (en) 1991-03-15 2003-05-20 Amgen, Inc. Pulmonary administration of granulocyte colony stimulating factor
EP0590058B1 (en) 1991-06-14 2003-11-26 Genentech, Inc. HUMANIZED Heregulin ANTIBODy
WO1993015722A1 (en) 1992-02-07 1993-08-19 Syntex (Usa) Inc. Controlled delivery of pharmaceuticals from preformed porous microparticles
US5908782A (en) 1995-06-05 1999-06-01 Osiris Therapeutics, Inc. Chemically defined medium for human mesenchymal stem cells
US5719867A (en) 1995-06-30 1998-02-17 Scientific-Atlanta, Inc. Plural telephony channel baseband signal demodulator for a broadband communications system
US6043348A (en) * 1996-11-13 2000-03-28 Lawman; Michael J. P. Antibody recognizing a small subset of human hematopoietic cells
AU4336599A (en) 1998-06-08 1999-12-30 Osiris Therapeutics, Inc. (in vitro) maintenance of hematopoietic stem cells
CN1328571B (zh) 1998-12-23 2016-08-31 辉瑞大药厂 抗ctla-4的人单克隆抗体
WO2001014424A2 (en) 1999-08-24 2001-03-01 Medarex, Inc. Human ctla-4 antibodies and their uses
FI20095459A0 (fi) * 2009-04-24 2009-04-24 Suomen Punainen Risti Veripalv Uusia määritysmenetelmiä
US8464599B2 (en) 2011-01-10 2013-06-18 GM Global Technology Operations LLC Eight speed dual clutch transmission

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1280611A (zh) * 1997-09-25 2001-01-17 糖技术公司 结合造血干细胞的方法和组合物
US20100145032A1 (en) * 2007-01-18 2010-06-10 Suomen Punainen Risti, Veripalelu Novel carbohydrate profile compositions from human cells and methods for analysis and modification thereof
CN101848991A (zh) * 2007-08-08 2010-09-29 协和发酵麒麟株式会社 分离的细胞群
US20100303766A1 (en) * 2007-08-08 2010-12-02 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Cell population with enhanced transplantation activity
US20100292095A1 (en) * 2007-11-09 2010-11-18 Suomen Punainen Risti, Veripalvelu Human monoclonal antibodies directed to sialyl lewis c, sialyl tn and n glycolylneuraminic acid epitopes and a method of analysis of stem cells comprising said epitopes
CN101896200A (zh) * 2007-12-06 2010-11-24 Csl有限公司 抑制白血病干细胞的方法
US20120093782A1 (en) * 2009-05-13 2012-04-19 Grove Robert I Enhanced Hematopoietic Stem Cell Engraftment
WO2012045913A1 (en) * 2010-10-06 2012-04-12 Suomen Punainen Risti, Veripalvelu Method for isolating cells and a cell population thereof

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HEMMORANTA H等: "N-glycan structures and associated gene expression reflect the characteristic N-glycosylation pattern of human hematopoietic stem and progenitor cell", 《EXP HEMATOL》 *
廖子君: "《肿瘤转移学》", 《肿瘤转移学》 *
林果为 著: "《现代临床血液病学》", 《现代临床血液病学》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109053892A (zh) * 2018-09-19 2018-12-21 苏州思坦维生物技术股份有限公司 特异结合人及猴cd38抗原的单克隆抗体及其制备方法与应用
CN109053892B (zh) * 2018-09-19 2021-03-26 苏州思坦维生物技术股份有限公司 特异结合人及猴cd38抗原的单克隆抗体及其制备方法与应用

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CA3002880A1 (en) 2017-05-11
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