CN103930442B - 抗cd40抗体、用途和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及对CD40具有多价结合特异性的抗体(及其片段、变体、融合体和衍生物)，其具有大于或等于对B细胞激活效力的对树突细胞激活的效力，其中所述抗体、其抗原结合片段、或融合体、变体或衍生物对CD40的亲和性(KD)小于1x10‑10M，其可用于疾病如癌症的治疗。本发明还涉及药物组合物、用途、方法和包含这样的抗体的试剂盒。

Description

抗CD40抗体、用途和方法
技术领域
本发明涉及具有CD40结合特异性的基于抗体的多肽，其表现出改进的亲和性和/或激动剂效力，具有治疗如癌症的疾病的用途。本发明还涉及包含这种抗体的药物组合物、用途、方法和药剂盒。
背景技术
癌症占发达国家死亡人数的30％以上。虽然在某些肿瘤的治疗(霍奇金病，某些淋巴瘤/白血病，局部性皮肤癌)中已经取得了重大进展，但是传统的疗法如手术、化疗和放疗往往在治疗播散的实体肿瘤中是无效的。
癌症的免疫疗法(与生物疗法同义)对治疗几种不同类型的癌症，包括播散的转移性肿瘤具有很好的前景(Stagg等人,2007,Immunol Rev.220:82-101；Melief,2008,Immunity,29:372-383,Melero等人,2007,Nat Rev Cancer,7:95-106；Waldmann,2006,Annu.Rev Med.57:65-81；Khawli等人,2008,Handb.Exp.Pharmacol.181:291-328；Berinstein,2007,Vaccine,25增补2:B72-B88；Mellor&Munn,2008,Nat Rev Immunol.8:74-80)。其目的在于动员患者自身免疫系统战胜癌症，并长期消除肿瘤。
已经开发了几种不同的用于癌症免疫疗法的方法，包括以下：
(1)单克隆抗体(Mab)疗法可用于：i)使用裸露的或缀合至毒素(例如，利妥昔单抗)的抗体，靶向待破坏的癌细胞；和/或ii)阻断生长因子受体(例如，赫赛汀)；和/或iii)刺激免疫系统。
(2)癌症疫苗，其包含肿瘤细胞疫苗(自体的或异体的)、抗原疫苗和树突细胞(DC)疫苗、DNA疫苗、和基于载体的疫苗(如，基于腺病毒的基因转移)。
(3)非特异性免疫疗法和佐剂，其通过更广泛地刺激免疫系统发挥作用，从而激活被肿瘤环境抑制的肿瘤特异性免疫细胞。这可以通过刺激或激活产生对肿瘤的免疫反应的免疫效应细胞(例如，效应T细胞或Teff细胞)实现，或通过抑制或失活具有抑制性表型的细胞(例如，调节性T细胞、或Treg细胞)实现。类似的方法包括活性分子，如细胞因子、细菌佐剂以及靶向免疫调节受体(例如，CTLA-4和CD40)的药物(包括mAb)。其它的方法包括过继T细胞转移和Treg耗竭疗法，其落在后两组之间的范围。
CD40是细胞表面表达的糖蛋白，属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族，并在免疫系统中起主要作用。其表达在多种免疫细胞，如B细胞、树突细胞、单核细胞和巨噬细胞。当通过CD40发生信号传导时，专门的抗原提呈细胞(APC)被激活(Schonbeck和Libby,2001,Cell Mol Life Sci,58(1):4-43的综述)。
CD40的天然配体，命名为CD154或CD40L，主要表达在成熟T淋巴细胞(Armitage 等人,1992,Nature,357:80-82；Schonbeck等人,2001,Cell Mol Life Sci.,58,40-43；vanKooten等人,2000,J.Leuk.Biol.,67:2-17；Quezada等人,2004,Annu.Rev.Immunol.,22:3077-328)。CD40L介导的信号传导触发一些生物事件，包括免疫细胞激活、增殖、和细胞因子和趋化因子的产生(Schonbeck等人,2001,Cell Mol Life Sci.,58:40-43；van Kooten等人,2000,J.Leuk.,Biol.,67:2-17)。
CD40信号传导对于T细胞依赖性和B细胞信赖性免疫应答是重要的，具有无功能的CD40或CD40L的患者是明显免疫抑制的(Foy等人,1993,J Exp Med5:1567-1575；Siepmann等人,2001,Immunology3:263-272；Allen等人,1993,Science,259:990-993)。刺激抗原提呈细胞，如具有重组CD40L或抗CD40抗体的人B细胞和树突细胞，可诱导表面标记物，如CD23、CD80、CD86、Fas和MHC II的上调，以及可溶性细胞因子，如IL-12、TNF-γ和TNF-α的分泌(van Kooten等人,2000,J Leucoc Biol,67:2-17；Schonbeck等人,2001,同上)。在肿瘤背景中，CD40刺激的树突细胞能够激活肿瘤特异性效应T细胞，该肿瘤特异性效应T细胞具有根除肿瘤细胞的潜力((van Kooten等人,2000,J Leucoc Biol,67:2-17；Sotomayor等人,1999,Nature Medicine,5:780-787)。
CD40表达发生在许多正常细胞和肿瘤细胞中。例如，全部B淋巴细胞和30％至70％的实体肿瘤具有CD40表达。黑色素瘤和癌属于具有CD40表达的肿瘤。已经公认CD40的激活有效地触发抗肿瘤反应(Tong等人,2003,Cancer Gene Therapy,10(1):1-13；Ottalano等人,2002,Tumori,88(5):361-6)。CD40激活促进肿瘤生长损害的作用至少涉及以下机制：产生肿瘤特异性T细胞反应的免疫激活、对CD40阳性肿瘤直接的细胞凋亡作用和刺激导致ADCC的体液反应。已经报道了CD40激活对CD40阴性肿瘤的抗肿瘤作用(Tutt等人,2002,JImmunol.,168(6):2720-8；van Mierlo等人,2002,Proc Natl Acad Sci,USA,99(8):5561-6)。此处，观察到的肿瘤根除与CTL、肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞的出现强烈相关。
已经提议了一种参与CD40刺激的癌症疫苗佐剂。临床前验证性概念证实了激动CD40抗体用于一些类型的癌症(Kalbashi等人,2010,J Immunotherapy,33:810-816；Loskog等人,2009,Semin Immunology,21:301-307；French等人,1999,Nature Medicine,548-553；Sotomayor等人,1999,Nature Medicine,5:780-787；Staveley等人,2003,NatureMedicine,171:697-707)。对于激动CD40抗体，包括SGN-40(具有部分和弱激动特性的人源化抗体)、和CP-870,893(全人以及选择性CD40激动单克隆抗体)，已经进行了临床试验(Khalil和Vonderheide,2007,Update on Cancer Therapeutics,2:61-65；Hussein等人,2010,Haematologica,95:845-848)。
但是，全身施用CD40抗体与副作用相关，如休克综合征和细胞因子释放综合征(van Mierlo等人,2002,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99:5561-5566；van Mierlo等人,2004,J Immunol173:6753-6759)。
由于以上，仍然需要一种改进的抗肿瘤疗法，特别是适合于临床应用的抗CD40激动抗体。
发明内容
在第一方面，本发明提供了一种对CD40具有多价结合特异性的抗体或其抗原结合片段，或所述抗体或抗原结合片段的变体、融合体或衍生物，或所述变体的融合体或其衍生物，其保留了对CD40的多价结合特异性，其中所述抗体、其抗原结合片段、或融合体、变体或衍生物对树突细胞激活的效力高于、或等于其对B细胞激活的效力，其中所述抗体、其抗原结合片段、或融合体、变体或衍生物对CD40的亲和性(KD)小于1x10-10M(即，0.1nM)。
可选择地，或另外地，本发明的第一方面提供了一种对CD40具有多价结合特异性的抗体或其抗原结合片段，或所述抗体或抗原结合片段的变体、融合体或衍生物，或所述变体的融合体或其衍生物，其保留了对CD40的多价结合特异性，其中所述抗体、其抗原结合片段、或融合体、变体或衍生物能够发挥对CD40+肿瘤细胞的双重细胞毒性作用(优选在体内)。通过“双重细胞毒性作用”，我们包括对肿瘤细胞直接的细胞凋亡作用和对肿瘤细胞间接的免疫细胞介导的细胞毒性(例如，ADCC)作用。
通过“效力”，在树突细胞激活和B细胞激活方面，我们指由抗体、其抗原结合片段、或融合体、变体或衍生物引起的该细胞激活的EC50。本领域技术人员将理解对于树突细胞激活和B细胞激活的效力可以通过不同的方法测量，包括但不局限于以下实施例中描述的那些方法。
在一个实施方案中，通过引用FACS分析测量的对CD80表达的刺激的EC50定义树突细胞激活(如实施例4)，通过引用对增殖B细胞的EC50定义B细胞激活(如实施例6)。
已知Pfizer开发的抗CD40抗体，CP-870,893，对B细胞激活比对树突细胞激活具有高大约20倍的效力(Gladue等人,2011,Cancer Immunol Immunotherapy(7),1009-1017)。还证实了用CP-870,893治疗的主要药效学作用之一是快速降低外周血淋巴细胞中的B细胞百分比(Vonderheide等人,2007,Journal of Clinical Oncology25,7,876-883)。对B细胞的作用可能导致了在治疗剂量上的剂量限制性细胞毒性，该治疗剂量不足以激活树突细胞。本发明人相信树突细胞的激活比B细胞激活具有更高的临床相关性。癌症的CD40激动剂疗法与T细胞激活密切相关(French等人,1999,Nature Medicine,548-553；van Kooten等人,2000,J Leucoc Biol,67:2-17；Sotomayor等人,1999,Nature Medicine,5:780-787)，该T细胞激活依赖于专门的抗原提呈细胞的激活，特别是树突细胞的激活(Melief等人,2000,75:235-282)。
本发明人开发了激动型抗CD40抗体克隆，其具有改进的激活树突细胞的能力。
在一个实施方案中，本发明的抗体、其抗原结合片段、变体、融合体及衍生物具有对树突细胞激活的效力，该效力高于或等于其对B细胞激活的效力。或者，换言之，本发明的抗体、其抗原结合片段、变体、融合体及衍生物具有对B细胞激活的效力，该效力低于或等于其对树突细胞激活的效力，高于或等于其对树突细胞激活的效力。
通过“结合特异性”，我们包括本发明的抗体、其抗原结合片段、变体、融合体或衍生物以比对任何其它多肽强至少10倍地结合CD40的能力；优选强至少50倍，以及更优选强至少100倍。优选地，本发明的抗体、其抗原结合片段、变体、融合体或衍生物在生理条件下选择性地结合CD40(例如，在体内；和例如，当CD40存在于细胞表面时)。
通过“多价”，我们包括本发明的抗体、其抗原结合片段、变体、融合体或衍生物包含两个或多个对CD40具有结合特异性的抗原结合位点。例如，抗体可以包含两个或三个或四个或五个或六个或更多该抗原结合位点。在一个实施方案中，抗体是完整、二价的IgG抗体。
CD40是细胞表面表达的糖蛋白，属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族，并在免疫系统中起核心作用。其表达在多种免疫细胞，如B细胞、树突细胞、单核细胞和巨噬细胞上，当通过CD40发生信号传导时，专门的APC被激活(Tasci等人,2001,Cell Mol Life Sci,58:4-43的综述)。CD40表达发生在许多正常细胞和肿瘤细胞中，如B淋巴细胞、实体肿瘤、黑色素瘤和癌症中。已经公认CD40的激活有效地触发抗肿瘤反应，且CD40的激活至少通过以下机制促进肿瘤生长损害：免疫激活、对CD40阳性肿瘤直接的细胞凋亡作用和刺激导致ADCC和CDC的体液反应。
ADCC和CDC的发生依赖于与由重链恒定结构域决定的抗体Fc部分相互作用的宿主免疫系统。在天然发生的恒定结构域中，γ1是最有效引起ADCC和CDC的同种型(Janeway′sImmunobiology,2008,第七版,Garland Science)。因而，对于本发明抗体的优选Fc是γ1Fc，其使抗CD40抗体是IgG1的同种型。还可能使用许多已知的方法进一步增加这些作用，如Fc工程化(点突变)和聚糖修饰(Carter,Nature Reviews Immunology,2006(6),343-357的综述)。
抗体激活树突细胞和B细胞上的CD40的机制依赖于其所结合的CD40上的表位，以及受体多聚化。由本发明示例性二价抗体(IgG1)引起的CD40受体二聚化对其激动作用是有利的。
通过“CD40”，我们包括具有与文中定义的人CD40蛋白相同结构和/或功能的任何天然或合成的蛋白，和/或其天然变体。
优选地，CD40是人CD40，如UniProt登录号P25942和GenBank登录号AAH12419。
但是，技术人员将理解，CD40来自任何哺乳动物，如驯养的哺乳动物(优选有农业或商业意义的，包括马、猪、牛、羊、狗和猫)。通过“哺乳动物蛋白”，我们包括存在于、来源于和/或分离自一个或多个哺乳动物细胞的任何蛋白；例如，术语“人蛋白”包括存在于、来源于和/或分离自一个或多个人细胞的蛋白。
如以上所讨论的，本发明的抗体、其抗原结合片段、变体、融合体及衍生物能够激活B细胞和树突细胞。
当通过CD40发生信号传导时，如树突细胞的专门APC被激活，该信号传导触发一些生物事件，包括免疫细胞激活、增殖、和细胞因子和趋化因子的产生。用于确定与CD40相关的树突细胞激活的方法是本领域公知的(例如，在以下文献中讨论的：Schonbeck等 人,2001,Cell Mol Life Sci.,58:40-43；van Kooten等人,2000,J.Leuk.,Biol.,67:2-17)，以及在附加实施例中描述的。
用重组CD40L或抗CD40抗体刺激人B细胞诱导了如CD23、CD30、CD80、CD86、Fas和MHC II的表面标记物的上调，可溶性细胞因子如IL-6、TNF-γ和TNF-α的分泌，和同型聚集。用于确定与CD40相关B细胞激活的方法是本领域公知的(例如在Schonbeck等人,2001中讨论的,同上)，以及在附加实施例中描述的。
为了提供改进的激活树突细胞的效力，优化了本发明的抗体、其抗原结合片段、变体、融合体及衍生物。在一个实施方案中，相对于激活B细胞的效力，激活树突细胞的效力选择性地增加了。
用于确定抗体激活树突细胞和B细胞效力的方法和试验是本领域公知的。
例如，可通过测量细胞表面标记物如CD86和CD80的上调(参见实施例3)，和/或通过测量抗CD40抗体诱导的T细胞分泌IFNγ(参见如下实施例4)评估树突细胞的激活。
同样地，可通过测量细胞表面标记物(如CD86；参见Gladue等人,2011,同上)的上调和/或通过测量抗CD40抗体诱导的B细胞增殖(参见以下的实施例6)评估B细胞的激活。
本发明的抗体、其抗原结合片段、变体、融合体及衍生物至少以与激活B细胞相同的效力激活树突细胞(例如，如在之后通过测量CD80和/或CD86的上调所确定的)。因而，本发明的抗体、其抗原结合片段、变体、融合体及衍生物相对于B细胞的激活，可具有高2倍的激活树突细胞的效力，例如，至少3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更高激活树突细胞的效力。
通过“抗体”，我们包括基本上完整的抗体分子、以及嵌合抗体、人源化抗体、人抗体(其中至少一个氨基酸相对于天然存在的人抗体是突变的)、单链抗体、双特异抗体、抗体重链、抗体轻链、抗体重链和/或轻链的同二聚体和异二聚体、及其抗原结合片段和衍生物。该术语还包括抗体样分子，可由分子的噬菌体展示技术或其它的随机选择技术生成所述抗体样分子。该术语还包括所有类型的抗体，包括：IgG、IgA、IgM、IgD、和IgE。
如以下进一步讨论的，本发明还包括抗体片段，如Fab、F(ab’)2、Fv和其它保留抗原结合位点的其片段。相似地，术语“抗体”包括抗体遗传工程化的衍生物，如单链Fv分子(scFv)和单链结构域抗体(dAb)。通过多聚化使得该片段和衍生物成为对CD40多价的，如scFv-scFV或dAb-dAb二聚体。
抗体的可变重(VH)和可变轻(VL)结构域参与抗原识别，该事实首次被早期蛋白酶消化实验发现。通过啮齿动物抗体“人源化”找到了进一步的确认。啮齿动物来源的可变结构域可融合至人来源的恒定结构域，从而获得的抗体保留了啮齿动物亲本抗体的抗原特异性(Morrison等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81,6851-6855)。
本发明涵盖了本发明抗体和抗原结合片段的变体、融合体和衍生物，以及所述变体 的融合体或衍生物，只要这种变体、融合体和衍生物具有CD40的结合特异性、以及高于或等于激活B细胞效力的激活树突细胞的效力。
由于抗体及其抗原结合片段包含一个或多个多肽组分，可以使用重组多核苷酸，应用本领域公知的蛋白质工程化和定点诱变的方法制备文中所定义的抗体及其抗原结合片段的合适变体、融合体及衍生物(参见例如，参见Molecular Cloning:a LaboratoryManual,第三版,Sambrook&Russell,2001,Cold Spring Harbor Laboratory Press,并入此处作为参考)。
因而，可以根据抗体或其抗原结合片段的多肽组分制备如文中所定义的抗体或其抗原结合片段的变体、融合体和衍生物。
通过“融合体”，我们包括融合于任何其它多肽的所述多肽。例如，为了有助于所述多肽的纯化，所述多肽可融合至如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或蛋白A的多肽。该融合体的例子是本领域技术人员公知的。类似地，所述多肽可以融合至寡组氨酸标签，如His6或被抗体识别的表位，如公知的Myc标签表位。所述多肽至任何变体或衍生物的融合体也包括在本发明的范围内。
融合体可以包括或由赋予所述多肽期望特性的另外的部分组成；例如，该部分可用于检测或分离多肽，或促进多肽的细胞摄取。该部分可以是，例如生物素半簇、放射性半簇、荧光半簇、例如小荧光团或绿色荧光蛋白(GFP)荧光团，以及本领域技术人员公知的那些。如本领域技术人员公知的，该半簇可以是免疫原性的标签，例如Myc-标签，或者可以是如本领域技术人员公知的能够促进多肽的细胞摄取的亲脂性分子或多肽结构域。
通过所述多肽的“变体”，我们包括保守或非保守的插入、删除和取代。特别是，我们包括多肽的变体，其中所述变化基本上不改变所述多肽的活性。变体可以包括，例如，典型地只有一个或两个或三个，和典型地不多于10个或20个氨基酸残基不同于给定序列的等位基因变体。通常，变体具有保守取代。
多肽变体可以具有这样的氨基酸序列，其与一个或多个以上给定的氨基酸序列具有至少75％的同一性，例如与一个或多个文中特定的氨基酸序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。
例如，文中定义的多肽变体包含多肽，所述多肽包含与选自以下的氨基酸序列具有至少60％同一性的序列：SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:27；和SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:35；SEQ ID NO:36；SEQ IDNO:37；SEQ ID NO:38；和SEQ ID NO:39；优选与所述序列具有至少70％或80％或85％或90％同一性，更优选与所述序列具有至少95％、96％、97％、98％、或99％同一性。
可通过例如LALIGN程序(Huang和Miller,Adv.Appl.Math.(1991)12:337-357)在Expasy设备网站上(http://www.ch.embnet.org/software/LALIGN_form.html)使用作为参数 的全局比对选项、评分矩阵BLOSUM62、开放缺口罚分-14、延伸缺口罚分-4确定同一性百分比。可选择地，两个多肽间的序列同一性百分比可使用适当的计算机程序确定，例如威斯康辛大学遗传计算机组的GAP程序，可以理解计算与序列已被优化比对的多肽有关的同一性百分比。
可选择地，使用Clustal W程序(如Thompson等人,1994,Nucl.Acid Res.22:4673-4680中描述的，其并入文中引作参考)进行比对。使用的参数如下：
-快速配对比对参数：K-数组(tuple)(代码)的大小；1，窗口大小；5，缺口罚分；3，顶对角线的数目；5，评分方法：百分之x。
-多元比对的参数：缺口开放罚分；10，缺口延伸罚分；0.05。
-评分矩阵：BLOSUM。
可选择地，BESTFIT程序可用于确定局部序列比对。
本发明的抗体、抗原结合片段、变体、融合体或衍生物可包含或由一个或多个被修饰的或衍生的氨基酸组成。
一个或多个氨基酸的化学衍生物可以通过与功能性侧基反应获得。该衍生的分子包括，例如其中游离氨基被衍生化形成盐酸胺、p-甲苯磺酰基、羧基苯氧基、t-丁氧羰基、氯乙酰基或甲酰基的那些分子。游离羧基可以被衍生化形成盐、甲基和乙基酯或其它类型的酯和酰肼。游离羟基可被衍生化形成O-酰基或O-烷基衍生物。作为化学衍生物，本发明还包括含有20种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物的那些肽。例如：4-羟基脯氨酸可取代脯氨酸，5-羟基赖氨酸可以取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可以取代组氨酸；高丝氨酸可以取代丝氨酸；以及鸟氨酸取代赖氨酸。衍生物还包括含有一个或多个添加或缺失的肽，只要保留了所需的活性。其它包括的修饰是酰胺化、氨基端酰化(例如乙酰化或巯基乙酸酰胺化)、末端羧基酰胺化(例如与氨或甲胺)等末端修饰。
本领域技术人员将进一步地理解拟肽化合物也是有用的。术语“拟肽”指模拟作为治疗剂的特定肽的构象和想要特性的化合物。
例如，所述多肽不仅仅包括氨基酸残基通过肽键(-CO-NH-)连接的分子，还包括肽键被反转的分子。这样的逆反转(retro-inverso)拟肽可以通过本领域已知的方法制备，例如，如Meziere等人(1997)J.Immunol.159,3230-3237中描述的，在此并入引做参考。该方法包括制备假肽，所述假肽包含涉及骨架而非侧链方向的改变。含有NH-CO键，而不是CO-NH肽键的逆反转的肽更能抵抗蛋白水解。可选择地，所述多肽可以是这样的拟肽化合物，其中一个或多个氨基酸残基被-y(CH2NH)-键连接，而不是常规的酰胺键。
进一步可选择地，如果使用了合适的接头半簇，所述接头半簇保留了氨基酸残基碳原子间的间距，那么可以完全省去肽键；对于接头半簇，有利地是与肽键具有基本上相同的电荷分布和基本上相同的平面性。
将理解所述多肽可以在其N或C端被便利地阻断，从而帮助降低对外蛋白水解消化的易感性。
还使用了多种非编码的或修饰的氨基酸(如D氨基酸和N甲基氨基酸)来修饰哺乳动物肽。另外，可通过共价键修饰稳定推测的生物活性构象，如通过环化或并入内酰胺或其它类型的桥，例如参见Veber等人,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:2636和Thursell等人,1983,Biochem.Biophys.Res.Comm.111:166，其在文中并入引做参考。
在众多合成策略中共有的主题是向基于肽的框架导入某些环状半簇。环状半簇限制肽结构的构象空间，这经常导致肽对特定生物受体的特异性增加。该策略额外的优点是向肽中导入环状半簇还可以产生具有对细胞肽酶敏感性减小的肽。
因而，本发明示例的多肽包含或由末端半胱氨酸氨基酸组成。该多肽可通过末端半胱氨酸氨基酸中巯基二硫键的形成以杂环(heterodetic cyclic)形式存在、或通过末端氨基酸间酰胺肽键的形成以纯环(homodetic)形式存在。如以上指出的，通过N端和C端半胱氨酸之间二硫键或酰胺键形成的环化小肽可防止有时在线性肽观察到的特异性和半衰期的问题，该环化小肽通过降低蛋白水解和增加结构刚性，可以产生特异性更高的化合物。通过二硫键环化形成的多肽具有游离的氨基和羧基端，其仍然对蛋白水解降解易感，然而由N端胺和C端羧基间的酰胺键环化形成的肽，因此不再含有游离氨基或羧基端。因而，该肽可由C-N键或由二硫键连接。
本发明不局限于肽环化方法的任何方式，但是本发明涵盖通过任何适当的合成方法实现其环状结构的肽。因而，杂环键可以包括但不局限于通过二硫、亚烷或亚硫桥形成。包括二硫、亚硫和亚烷桥的合成环状纯环肽和环状杂环肽的方法，公开于US5,643,872中，其在此并入引做参考。其它环化方法的实例在US6,008,058中讨论并公开了，其在此并入引做参考。
环状稳定拟肽化合物的进一步的合成方法是闭环复分解(RCM)。该方法包括合成肽前体以及使其与RCM催化剂接触产生构象限制性肽的步骤。适当的肽前体可以包含两个或多个不饱和C-C键。可以使用固相肽合成技术执行该方法。在该实施方案中，锚定于固体支持物的前体与RCM催化剂接触，然后从所述固体支持物切下以产生构象限制性肽。
在此并入引做参考的D.H.Rich in Protease Inhibitors,Barrett和Selveson,编辑,Elsevier(1986)中公开了另一种方法，该方法通过应用酶抑制剂设计中的过渡态类似物概念设计了肽模拟物。例如，已知staline(无对应中译文)的仲醇模拟胃蛋白酶底物易断裂的酰胺键的四面体过渡态。
总之，如公知的，末端修饰可用于降低对蛋白酶消化的易感性，从而延长溶液中、特别是有蛋白酶存在的生物液体中肽的半衰期。由于环化形成的稳定结构以及考虑到对环状肽观察到的生物活性，多肽环化也是一种有用的修饰。
因而，在一个实施方案中，所述多肽是环状的。但是，在一个替代的实施方案中，所述多肽是线性的。
优选地，抗体、其抗原结合片段、变体、融合体或衍生物比已知的抗CD40抗体“B44”(其氨基酸序列在以下实施例10中表示)具有更高的树突细胞激活效力。
B44激动型抗体来源自文库，该文库是人抗体片段展示文库，是BioInvent International AB公司的财产(等人,2000,Nature Biotechnol.,18:852-6；WO98/32845)。如在体外确定的，B44抗体具有中等到低的亲和性常数(KD)，为1.7nM，以及中等的效力(Ellmark等人,2002,Immunology,106:456-463；Ellmark等人.,2008,AIDSResearch and Human Retroviruses,243,367-372)。B44激动型抗体的亲和性和效力使其不适合作为临床和治疗相关的抗CD40激动剂抗体。
更优选地，抗体、其抗原结合片段、变体、融合体或衍生物对树突细胞激活的效力是至少0.5μg/ml(如实施例4所述，测量为EC50)(即EC50小于或等于0.5μg/ml)。例如，抗体、其抗原结合片段、变体、融合体或衍生物刺激CD80的EC50(如实施例4所测量的)小于0.5μg/ml，例如小于0.4μg/ml、0.3μg/ml、0.2μg/ml、0.1μg/ml、或小于0.05μg/ml。
在本发明的一个实施方案中，抗体、其抗原结合片段、变体、融合体或衍生物相对于B44抗体具有改进的CD40结合特异性。
关于抗体的结合特异性，最常引用的动力学参数是整体亲和性，其通常表示为解离常数(KD)。该静态参数反映了在平衡状态下细胞受体的相对占据(relativeoccupancy)，且与全身施用有关。但是，在局部施用期间，抗体可能漏出局部肿瘤区域，因而反应时间有限。所以，在局部施用期间的高结合速率(高ka)对临床效果非常重要，理由是其决定了抗体达到平衡需要的时间(Katakura等人,Journal of Molecular Catalysis,(28),191-200,2004)。另外，缓慢的解离速率(低kd)影响治疗的持续时间，可用于将抗体限制于肿瘤区域，从而降低全身的暴露和毒性。
用于测量相互作用(如抗体和配体间的相互作用)的整体亲和性(KD)和结合速率(ka)和解离速率(kd)的方法是本领域公知的。体外的示例性方法描述于随附实施例中。还可以考虑使用基于流式细胞术的方法(Sklar等人,Annu Rev Biophys Biomol Struct,(31),97-119,2002)。
本发明的抗体、或其抗原结合片段、变体、融合体或衍生物对CD40的亲和性(KD)小于1.0x10-10M，例如KD小于9.0x10-11M、8.0x10-11M、7.0x10-11M、6.0x10-11M、5.0x10-11M、4.0x10-11M、3.0x10-11M、2.0x10-11M或小于1.0x10-11M。
在另一个优选的实施方案中，因而，抗体、其抗原结合片段、变体、融合体或衍生物对CD40的结合速率高于B44抗体，例如结合速率(ka)大于2.7x106Ms，优选地结合速率(ka)大于3.0x106Ms；或4.0x106Ms；或5.0x106Ms；或6.0x106Ms；或7.0x106Ms；或8.0x106Ms；或9.0x106Ms；或1.0x107Ms。
在另一个优选的实施方案中，抗体、其抗原结合片段、变体、融合体或衍生物对CD40具有较低的解离速率，所述解离速率低于B44抗体，例如解离速率(kd)低于4.5x10-3s,优选地解离速率低于3.0x10-3s；或2.0x10-3s；或1.0x10-3s；或9.0x10-4s；或8.0x10-4s；或7.0x10-4s；或6.0x10-4s；或5.0x10-4s；或3.0x10-4s；或2.0x10-4s；或1.0x10-4s；或9.0x10-5s；或8.0x10-5s；或7.0x10-5s；或6.0x10-5s；或5.0x10-5s；或4.0x10-5 s；或3.0x10-5s；或2.0x10-5s；或1.0x10-6s。
在一个优选的实施方案中，抗体、其抗原结合片段、变体、融合体或衍生物对CD40的亲和性(KD)在1.0x10-10M至1x10-11M的范围内，对CD40的结合速率(ka)在2.7106至1x107Ms的范围内。
典型地，本发明提供了一种抗体、或其抗原结合片段、或变体、融合体或衍生物，其对位于细胞表面的CD40具有亲和性。
通过“位于细胞表面”，我们包括CD40与细胞相关，从而CD40的一个或多个区域存在于细胞表面外面的含义。例如，CD40可以插入细胞质膜(即，作为跨膜蛋白定位)，其一个或多个区域存在于细胞外表面。或者，CD40可在细胞外，以共价和/或离子相互作用使其位于细胞表面的特定区域。
因此，通过“癌症细胞表面”，我们包括CD40以与源自癌症细胞或肿瘤、或具有癌症细胞或肿瘤特征的一个或多个细胞相关的方式定位的含义。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段、或变体、融合体或衍生物包含或由完整的抗体组成。
可选择地，抗体或其抗原结合片段、或变体、融合体或衍生物包含或由抗原结合片段组成，所述抗原结合片段选自：Fv片段(如单链Fv片段、或二硫键连的Fv片段)和Fab样片段(如Fab片段；Fab’片段或F(ab)2片段)。
例如，抗原结合片段、或其变体、融合体或衍生物可包含scFv。
通过“ScFv分子”，我们包括其中VH和VL伴侣结构域通过柔韧的寡肽连接的分子。
使用抗体片段，而不是全长抗体的潜在优点是多方面的。片段的较小尺寸可引起改进的药学特性，如向靶位点较好的穿透性。去除了全长抗体的效应功能，如补体结合。Fab、Fv、scFv和dAb抗体片段均可以表达在大肠杆菌中，并从大肠杆菌分泌，从而允许容易地大量产生所述片段。
优选，本发明的抗体、其抗原结合片段、变体、融合体或衍生物是重组分子。
尽管抗体可以是多克隆抗体，或者如果其是单克隆抗体，优选其抗原结合片段、变体、融合体或衍生物源自单克隆抗体。
可以使用公知的技术制备合适的单克隆抗体，例如在“Monoclonal Antibodies；Amanual of techniques”,H Zola(CRC Press,1988)和在“Monoclonal HybridomaAntibodies:Techniques and Application”,SGR Hurrell(CRC Press,1982)中公开的那些。多克隆抗体可以制备成多特异性或单特异性的抗体。优选其为单特异性的。
优选，抗体、其抗原结合片段、变体、融合体或衍生物是人或人源化的。
在具有此处定义的CD40蛋白特异性的人抗体氨基酸序列的意义上，抗体可以是人抗体，但是应当理解可以使用本领域中已知的不需要免疫人的方法制备这些抗体。例如，所述抗体多肽可以在体外人或非人细胞系中产生。或者，可获得在本质上含有人免疫球蛋白基因的转基因小鼠(参见Vaughan等人(1998)Nature Biotechnol.16,535-539)。
适当制备的非人抗体可以用已知方法进行“人源化”，例如通过将小鼠抗体的CDR区插入人抗体的框架。
嵌合抗体由Neuberger等人(1998年，第8届国际生物技术研讨会第2部分，792-799)讨论。
本领域技术人员将理解抗体或其抗原结合片段的结合特异性由组成的重链和轻链的可变区中存在的互补性决定区(CDR)赋予。如下面讨论的，在一个特别优选的此处所定义的抗体和其抗原结合片段、变体、融合体和衍生物的具体实施方案中，存在一个或多个此处定义的CDR氨基酸序列赋予CD40的结合特异性。
如此处所用，术语“氨基酸”包括标准的20个遗传编码的氨基酸和其相应的“D”型立体异构体(相比于天然“L”型)，ω-氨基酸的其它天然存在的氨基酸，非常规的氨基酸(例如α，α-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸等)和化学衍生的氨基酸(参见下面)。
当氨基酸被明确列举时，如“丙氨酸”或“Ala”或“A”，该术语指的是L-丙氨酸和D-丙氨酸二者，除非另有明确说明。只要多肽保留所希望的功能性质，其它非常规氨基酸也可以是用于本发明多肽的合适组分。对于所示的肽，每一个编码的氨基酸残基，在适当情况下由对应于常规氨基酸俗名的一个单字母命名来表示。
在一个实施方案中，文中定义的多肽包含或由L-氨基酸组成。
在一个优选的实施方案中，所述抗体、片段、变体、融合体或衍生物包含可变轻链(VL)，其中CDR1包含或由以下氨基酸序列组成：
CTGSX1SNIGAGYX2VY [SEQ ID NO：1]
其中：
X1是S或T；和
X2是K或H或D或G或N。
在一个优选的实施方案中，所述抗体、片段、变体、融合体或衍生物包含可变轻链(VL)，其中CDR2包含或由以下氨基酸序列组成：
X3NINRPS[SEQ ID NO：2]
其中：
X3是G或R。
在一个优选的实施方案中，所述抗体、片段、变体、融合体或衍生物包含可变轻链(VL)，其中CDR3包含或由以下氨基酸序列组成：
CAAWDX4X5X6X7GLX8[SEQ ID NO：3]
其中：
X4是D或S或E或G或K；和
X5是S或T或G；和
X6是L或S或T或L或I；和
X7是S或T或L；和
X8是V或L。
更优选地，所述抗体、片段、变体、融合体或衍生物包含可变轻链(VL)，其中CDR1包含或由选自以下氨基酸序列组成：
CTGSTSNIGAGYKVY[SEQ ID NO：4]；和
CTGSSSNIGAGYHVY[SEQ ID NO：5]；和
CTGSSSNIGAGYKVY[SEQ ID NO：6]；和
CTGSSSNIGAGYDVY[SEQ ID NO:7]；和
CTGSSSNIGAGYGVY[SEQ ID NO:8]；和
CTGSSSNIGAGYNVY[SEQ ID NO:9]。
更优选地，所述抗体、片段、变体、融合体或衍生物包含可变轻链(VL)，其中CDR2包含或由选自以下的氨基酸序列组成：
GNINRPS[SEQ ID NO：10]；和
RNINRPS[SEQ ID NO：11]。
更优选地，所述抗体、片段、变体、融合体或衍生物包含可变轻链(VL)，其中CDR3包含或由选自以下的氨基酸序列组成：
CAAWDDSLSGLV[SEQ ID NO：12]；和
CAAWDSSSSGLV[SEQ ID NO：13]；和
CAAWDESITGLV[SEQ ID NO：14]；和
CAAWDGSLLGLV[SEQ ID NO：15]；和
CAAWDGTLTGLL[SEQ ID NO：16]；和
CAAWDKSISGLV[SEQ ID NO：17]；和
CAAWDGGLLGLV[SEQ ID NO：18]。
在本发明的特别优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段，或变体，融合体或衍生物包含可变轻链(VL)，所述可变轻链包含以下的CDR：
(i)SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3；或
(ii)SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12；或
(iii)SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：13；或
(iv)SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12；或
(v)SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：14；或
(vi)SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：15；或
(vii)SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：16；或
(viii)SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：17；或
(ix)SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12；或
(x)SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：18。
在又一个优选的实施方案中，所述抗体、片段、变体、融合体或衍生物包含可变轻链(VL)，所述可变轻链(VL)包含选自以下的氨基酸序列：
SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:22；
SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:26；和
SEQ ID NO:27。
在一个实施方案中，所述抗体、片段、变体、融合体或衍生物包含一个恒定的轻链(CL)，所述恒定的轻链(CL)包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列。
还优选抗体、片段、变体、融合体或衍生物包含可变重链(VH)，其中CDR1包含或由以下氨基酸序列组成：
GFTFSTYGMH[SEQ ID NO：28]。
还优选的是，所述抗体、片段、变体、融合体或衍生物包含可变重链(VH)，其中CDR2包含或由以下氨基酸序列组成：
GKGLEWLSYISGGSSYIFYADSVRGR[SEQ ID NO：29]
还优选的是，所述抗体、片段、变体、融合体或衍生物包含可变重链(VH)，其中CDR3包含或由以下氨基酸序列组成：
CARILRGGSGMDL[SEQ ID NO：30]。
在一个特别优选的本发明的实施方案中，所述抗体、片段、变体、融合体或衍生物包含可变重链(VH)，所述可变重链(VH)包含SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30的CDR。
在进一步优选的实施方案中，所述抗体、片段、变体、融合体或衍生物包含可变重链(VH)，所述可变重链(VH)包含选自以下的氨基酸序列：
SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:34；
SEQ ID NO:35；SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:37；SEQ ID NO:38；和
SEQ ID NO:39；
在一个实施方案中，所述抗体、片段、变体、融合体或衍生物包含恒定的重链(CH)，所述恒定的重链(CH)包含SEQ ID NO：62的氨基酸序列。
特别优选地，所述抗体、片段、变体、融合体或衍生物包含以下的CDR：
(i)SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30；或
(ii)SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30；或
(iii)SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：28和SEQ IDNO：29和SEQ ID NO：30；或
(iv)SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30；或
(v)SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30；或
(vi)SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30；或
(vii)SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：28 和SEQ IDNO：29和SEQ ID NO：30；或
(viii)SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：28和SEQ IDNO：29和SEQ ID NO：30；或
(ix)SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30；或
(x)SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30。
在一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段、或变体、融合体或衍生物，结合CD40(优选人CD40)第一结构域(D1)内的表位。
例如，本发明的所述抗体或其抗原结合片段、变体、融合体或衍生物，可与本发明的一个或多个示例性抗体竞争结合CD40(见表A；如以下实施例中描述的)：
表A
本发明的示例性抗体(可变区)
因此，本发明的抗体或其抗原结合片段、或变体、融合体或衍生物，可以与本发明的一个或多个示例性抗体结合相同的CD40表位。
在一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段、或变体、融合体或衍生物，包括本发明示例性抗体之一的VL和VH对(如表A所示)。
因此，在一个特别优选的实施方案中，所述抗体、其抗原结合片段、变体、融合体或衍生物，包含可变轻链(VL)和可变重链(VH)，所述可变轻链和可变重链包含以下氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：31；或
(ii)SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：32；或
(iii)SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：33；或
(iv)SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：34；或
(v)SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：35；或
(vi)SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：36；或
(vii)SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：37；或
(viii)SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：38；或
(ix)SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：39。
优选地，所述抗体、其抗原结合片段、变体、融合体或衍生物，包含抗体Fc区。本领域技术人员可以理解Fc部分可以来自IgG抗体，或来自不同类的抗体(如IgM、IgA、IgD或IgE)。例如，Fc区可以来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。然而，有利的是Fc区来自IgG1抗体。
Fc区可以是天然存在的(例如，内源性产生的抗体的部分)，或可以人工的(例如相对于天然存在的Fc区包含一个或多个点突变)。具有改进其与FcR结合能力的点突变的Fc区可以是有利的，例如通过改变血清半衰期或改进与参与ADCC和CDC的Fcγ受体(FcγR)的结合。特别地，增强与FcγRIIB结合的突变，例如S267E(Strohl等人，2009,Curr OpinBiotechnol,20:685–691)对本发明可能是有利的，因为给出了FcγRIIB的结合与CD40抗体的功能活性之间的联系(Li等人，2011,Science,333:1030-1034)。
在一个实施方案中，Fc区包含或由SEQ ID NO：62的氨基酸序列组成。
优选地，本发明的抗体、其抗原结合片段、变体、融合体或衍生物是IgG分子、或者是IgG分子的抗原结合片段、其变体、融合体或衍生物。一个特别优选的IgG序列的氨基酸序列在所附的实施例中进行描述。
在一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段、或变体、融合体或衍生物还包含细胞毒性半簇，其可以是直接和/或间接细胞毒性。
通过“直接细胞毒性”，我们包括半簇本身是细胞毒性的含义。通过“间接细胞毒性”我们包括尽管半簇本身不是细胞毒性的，但其可诱导细胞毒性的含义，例如可以通过其对其它分子的作用或通过在其上的其它作用诱导细胞毒性。
方便地，细胞毒性半簇在细胞内时是细胞毒性的，且优选其在细胞外时是没有细胞毒性的。
优选地，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段、或变体、融合体或衍生物，其中细胞毒性半簇是直接细胞毒性的化疗剂。任选地，细胞毒性半簇是直接细胞毒性的多肽。细胞毒性化疗剂是本领域熟知的。
细胞毒性化疗剂(如抗癌剂)包括：烷化剂，其包括氮芥例如二氯甲基二乙胺(HN2)、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑(L-溶肉瘤素)和苯丁酸氮芥；乙烯亚胺和甲基蜜胺如六甲蜜胺、噻替哌；烷基磺酸盐/酯如白消安；亚硝基脲如卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、司莫司汀(甲基-CCNU)和链脲菌素(链脲霉素)；和三氮烯如达卡巴嗪(DTIC；二甲基三氮烯基咪唑-甲酰胺)；抗代谢物，包括叶酸类似物如甲氨蝶呤(氨甲蝶呤)；嘧啶类似物，如氟尿嘧啶(5-氟尿嘧啶；5-FU)、氟尿苷(氟脱氧尿苷；FUdR)和阿糖胞苷(胞嘧啶阿拉伯糖苷)；和嘌呤类似物和相关的抑制剂，如巯基嘌呤(6-巯基嘌呤，6-MP)、硫鸟嘌呤(6-硫鸟嘌呤；TG)和喷司他丁(2'-脱氧柯福霉素)。天然产品包括长春花生物碱，如长春花碱(VLB)和长春新碱；表鬼臼毒素如依托泊苷和替尼泊苷；抗生素，如更生霉素(放线菌素D)、柔红霉素(道诺霉素；红比霉素)、多柔比星、博来霉素、普 卡霉素(光辉霉素)和丝裂霉素(丝裂霉素C)；酶，如L-天冬酰胺酶；和生物应答调节剂如干扰素alphenomes(无对应中译文)。多种药剂包括如顺铂(cis-DDP)和卡铂的铂配合物；蒽醌如米托蒽醌和蒽环霉素；取代脲，如羟基脲；甲基肼衍生物如甲基苄肼(N-甲基肼，MIH)；和肾上腺皮质抑制剂如米托坦(o，p'-DDD)和氨鲁米特；紫杉醇及其类似物/衍生物；和激素激动剂/拮抗剂如氟他胺和他莫昔芬。
先前所述各种这样的药剂已附着到抗体和其它靶标位点递送剂，因而本领域技术人员可以容易地制备包含这些药剂的本发明的抗体。例如，碳二亚胺缀合(Bauminger&Wilchek(1980)Methods Enzymol.70,151-159；通过引用并入此处)可用于将多种药剂(包括多柔比星)缀合至抗体或肽。
碳二亚胺包括一组具有通式R1-N＝C＝N-R2的化合物，并用于合成肽键，其中R1和R2可以是脂肪族或芳香族。制备过程简单、相对快速、并且在温和的条件下进行。碳二亚胺化合物攻击羧基将它们转换为游离氨基的反应位点。
水溶性碳二亚胺、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)特别用于将官能半簇缀合至结合半簇，并且可用于将多柔比星缀合至肿瘤归巢肽。多柔比星与结合半簇的缀合需要氨基基团和羧基基团的存在，其中氨基基团由多柔比星提供，而羧基基团由抗体提供。
除了使用碳二亚胺用于直接形成肽键外，EDC也可用于制备活性酯，例如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯。然后仅结合氨基的NHS酯可以被用来诱导与多柔比星的单氨基形成酰胺键。通常将EDC和NHS的组合用于缀合，以提高缀合物形成的产量(Bauminger&Wilchek，同上，1980)。
也可以使用其它的方法将细胞毒性半簇缀合至抗体。例如，可以使用高碘酸钠氧化，其后进行适当反应物的还原性烷基化，因为可以戊二醛交联。然而，认识到无论选择哪种制备本发明缀合物的方法，必须确定该抗体保持其靶向能力，而且官能半簇保持其相应的功能。
在本发明的一个实施方案中，细胞毒性半簇是细胞毒性肽或多肽半簇，通过该术语我们包括任何导致细胞死亡的半簇。细胞毒性肽和多肽半簇是本领域熟知的，并且包括例如蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、假单胞菌外毒素、组织因子等。将其连接到靶向半簇(如抗体)的方法也是本领域已知的。利用蓖麻毒蛋白作为细胞毒性剂描述在Burrows&Thorpe(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90,8996-9000中，通过引用并入此处，而Ran等人(1998)Cancer Res.58,4646-4653和Huang等人(1997)Science275,547-550描述了利用组织因子导致肿瘤局部血液凝固和梗死。Tsai等人(1995)Dis.Colon Rectum38,1067-1074描述了缀合至单克隆抗体的相思豆毒蛋白A链，并通过引用并入此处。在WO96/06641中描述了作为细胞毒性剂的其它核糖体失活蛋白。假单胞菌外毒素也可以被用作细胞毒性多肽半簇(参见，例如Aiello等人(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA92,10457-10461；通过引用并入此处)。
某些细胞因子，如TNF-α和IL-2也可以用作细胞毒性剂。
如果以足够的剂量递送，某些放射性原子也可能是细胞毒性的。因此，细胞毒性半簇可包含放射性原子，在使用中，该放射性原子向靶标位点递送足够量的放射性，从而成为细胞毒性。合适的放射性原子包括磷-32、碘-125、碘-131、铟-111、铼-186、铼-188或钇-90、或放出足够能量来破坏邻近细胞、细胞器或核酸的任何其它同位素。优选地，在本发明药剂中的同位素和放射性原子的密度是这样的，超过4000cGy的(优选至少6000、8000或10000cGy)的剂量递送至靶标位点，优选在靶标位点的细胞和其细胞器，特别是细胞核。
放射性原子可通过已知的方法被附着到抗体、其抗原结合片段、变体、融合体或衍生物。例如，EDTA或其它螯合剂可连接到结合半簇，并用于附着111In或90Y。酪氨酸残基可以直接标记有125I或131I。
细胞毒性半簇可以是合适的间接细胞毒性多肽。在一个特别优选的实施方案中，间接细胞毒性多肽是具有酶活性的多肽，并且其可以将无毒的和/或相对无毒的前药转换成为细胞毒性药物。与抗体一起，这种类型的系统通常被称为ADEPT(抗体导向的酶前药疗法)。该系统需要抗体将酶部分定位在患者体内的期望位点，在允许酶定位在位点的时间之后，施用是酶底物的前药，催化的最终产物是细胞毒性化合物。该方法的目的是最大限度地提高药物在期望位点的浓度，并减少在正常组织中的药物浓度(见Senter,P.D.等人(1988)“Anti-tumour effects of antibody-alkaline phosphatase conjugates incombination with etoposide phosphate”Proc.Natl.Acad.Sci.USA85,4842-4846；Bagshawe(1987)Br.J.Cancer56,531-2；以及Bagshawe,K.D.等人(1988)“A cytotoxicagent can be generated selectively at cancer sites”Br.J.Cancer.58,700-703.)。
在一个优选的实施方案中，细胞毒性半簇能够将无细胞毒性的前药转换成细胞毒性药物。
使用如此处所述靶向酶的系统的酶和前药可以是之前提出的任意者。细胞毒性物质可以是任何现有的抗癌药物如烷化剂；插入DNA中的药剂；抑制任何关键酶(如二氢叶酸还原酶、胸苷合成酶、核苷酸还原酶、核苷激酶或拓扑异构酶)的药剂；或与任何其它细胞成分相互作用影响细胞死亡的药剂。依托泊苷是一种拓扑异构酶抑制剂的例子。
报告的前药系统包括：由大肠杆菌β葡萄糖醛酸酶激活的苯酚芥前药(Wang等人,1992和Roffler等人,1991)；由人β-葡萄糖醛酸酶激活的多柔比星前药(Bosslet等人,1994)；由咖啡豆α-半乳糖苷酶激活的其它多柔比星前药(Azoulay等人,1995)；由咖啡豆α-D-半乳糖苷酶激活的柔红霉素前药(Gesson等人,1994)；由大肠杆菌β-D-半乳糖苷酶激活的5-氟尿苷前药(Abraham等人,1994)；和由羧肽酶A激活的甲氨蝶呤前药(如甲氨蝶呤-丙氨酸)(Kuefner等人,1990,Vitols等人,1992和Vitols等人,1995)。这些和其它包括在以下表B中。
表B
表A改编自Bagshawe(1995)Drug Dev.Res.34,220-230，从中可以得到对各种这样系统的充分引用；紫杉醇衍生物在Rodrigues,M.L.等人(1995)Chemistry&Biology2,223)中描述了。
用于形成酶部分的一部分的合适的酶包括：外肽酶，如羧肽酶G、G1和G2(对于谷氨酸化(glutamylated)芥的前药)，羧肽酶A和B(用于基于MTX的前药)和氨肽酶(2-α-氨酰基MTC前药)；内肽酶，如例如溶血栓素(凝血酶前药)；水解酶，如磷酸酶(例如碱性磷酸酶)或硫酸酯酶(如芳基硫酸酯酶)(用于磷酸化或硫酸盐前药)；酰胺酶，如青霉素酰胺酶和芳基酰基酰胺酶；内酰胺酶，如β-内酰胺酶；糖苷酶，如β-葡萄糖醛酸酶(β-glucuronomide(无对应中译文)蒽环霉素)，α-半乳糖苷酶(对苦杏仁苷)和β-半乳糖苷酶(β-半乳糖蒽环霉素)；脱氨酶，如胞嘧啶脱氨酶(对5FC)；激酶，如尿激酶和胸苷激酶(对丙氧鸟苷)；还原酶，如硝基还原酶(对CB1954和类似物)，偶氮还原酶(对偶氮苯芥)和DT-心肌黄酶(对CB1954)；氧化酶，如葡萄糖氧化酶(对葡萄糖)，黄嘌呤氧化酶(对黄嘌呤)和乳过氧化物酶；DL-消旋酶，催化抗体和环糊精。
优选地，与细胞毒性药物相比，前药是相对无毒的。典型地，在适合的体外细胞毒性测试中所测量的，其具有低于10％的毒性，优选低于1％的毒性。
能够将前药转化为细胞毒性药物的半簇在从本发明药剂的其余部分分离时，有可能是活性的，但只有在以下情况下其是活性的是必要的：(a)其与本发明药剂的其余部分组合，和(b)本发明药剂被附着到靶标细胞、邻近于靶标细胞或内化在靶标细胞中。
当各半簇是多肽时，这两个部分可以通过交联多肽的任何常规方式连接在一起，如 O'Sullivan等人(1979)Anal.Biochem.100,100-108中通常描述的那些。例如，抗体、其抗原结合片段、变体、融合体或衍生物，可以用巯基富集，且其它的半簇与能够与那些巯基反应的双功能剂反应，例如碘乙酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHIA)或N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)。例如用m-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯获得的酰胺和硫醚键，通常在体内比二硫键更稳定。
可选地，所述抗体、其抗原结合片段、变体、融合体或衍生物，可以通过重组DNA技术制备成融合化合物，由此DNA长度包括编码本发明药剂的两个半簇的各区域，这两个区域或彼此邻近，或由编码不破坏药剂所需性质的接头肽的区域分开。可以想象，药剂的两个部分可以全部或部分重叠。
细胞毒性半簇可以是放射增敏剂。放射增敏剂包括氟嘧啶、胸苷类似物、羟基脲、吉西他滨、氟达拉滨、烟酰胺、卤代嘧啶、3-氨基苯甲酰胺、3-氨基苯二酰胺、依他硝唑(etanixadole)、哌莫硝唑和米索硝唑(参见，例如McGinn等人(1996)J.Natl.CancerInst.88,1193-11203；Shewach&Lawrence(1996)Invest.New Drugs14,257-263；Horsman(1995)Acta Oncol.34,571-587；Shenoy&Singh(1992)Clin.Invest.10,533-551；Mitchell等人(1989)Int.J.Radiat.Biol.56,827-836；Iliakis&Kurtzman(1989)Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.16,1235-1241；Brown(1989)Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.16,987-993；Brown(1985)Cancer55,2222-2228)。
此外，基因向细胞的递送可以使其放射增敏，例如p53基因或细胞周期蛋白D的递送(Lang等人(1998)J.Neurosurg.89,125-132；Coco Martin等人(1999)Cancer Res.59,1134-1140)。
其它的半簇可以是当辐射时变成细胞毒性、或释放细胞毒性半簇的半簇。例如，硼10同位素，当受到适当的辐射时，释放细胞毒性的α粒子(例如，参见Goldenberg的US4,348,376；Primus等人(1996)Bioconjug.Chem.7,532-535)。
类似地，细胞毒性半簇可以是在光动力疗法中有用的半簇，如光卟啉(见，例如Dougherty等人(1998)J.Natl.Cancer Inst.90,889-905)。
其它的半簇可以包括核酸分子，其可是直接或间接的细胞毒性。例如，所述核酸分子可以是反义寡核苷酸，在定位在靶标位点时，其能够进入细胞并导致细胞死亡。因此，寡核苷酸可以是防止必需基因表达的寡核苷酸，或引起基因表达的变化，而导致细胞凋亡的寡核苷酸。或者，所述细胞毒性半簇是编码直接和/或间接细胞毒性多肽的核酸分子。
合适的寡核苷酸的例子包括在bcl-2(Ziegler等人(1997)J.Natl.CancerInst.89,1027-1036)和DNA聚合酶α和拓扑异构酶IIα(Lee等人(1996)Anticancer Res.16,1805-1811)中描述的那些。
肽核酸在代替传统核酸中是有用的(见Knudsen&Nielsen(1997)AnticancerDrugs8,113-118)。
在另一实施方案中，所述抗体、其抗原结合片段、变体、融合体或衍生物可以包含在用于递送核酸至靶标的递送载体中。递送载体可以是任何合适的递送载体。例如，其 可以是能够递送核酸的含有核酸的脂质体，或者其可以是能够递送核酸的病毒或病毒样颗粒。在这些情况下，要递送的分子一般存在于递送载体的表面上。例如，合适的抗体片段可存在于脂质体的外表面，而要递送的核酸可存在于脂质体的内部。作为另一个例子，病毒载体，如逆转录病毒或腺病毒载体，经工程化从而结合半簇附着到或定位于病毒颗粒的表面上，从而使病毒颗粒被靶向至所希望的位点。靶向递送系统也是已知的，如在WO94/10323中描述的修饰的腺病毒系统，其中典型地，在腺病毒内、或腺病毒样颗粒内携带DNA。Michael等人(1995)Gene Therapy2,660-668中描述了修饰腺病毒以向成纤维蛋白添加细胞选择性半簇。靶向逆转录病毒也可用于本发明中使用；例如，赋予特异性结合亲和性的序列可以被工程化至预先存在的病毒env基因中(对于这方面和其它基因疗法的靶向载体的综述，见Miller&Vile(1995)Faseb J.9,190-199)。
也可使用免疫脂质体(抗体导向的脂质体)。为了制备免疫脂质体，根据Martin&Papahadjopoulos(1982)J.Biol.Chem.257,286-288的方法合成MPB-PE(N-[4-(对-马来酰亚胺苯基)-丁酰基]-磷脂酰乙醇胺)。将MPB-PE并入脂质体双层以允许抗体或其片段共价偶联至脂质体表面。该脂质体便利地装载有用于递送至靶细胞的DNA或其它遗传构建体，例如在DNA或其它遗传构建体溶液中形成所述脂质体，随后在氮气压力达0.8MPa下顺次挤压通过0.6μm和0.2μm孔径的聚碳酸酯膜过滤器。挤出后，通过在80000×g超速离心45分钟，从游离DNA构建体中分离捕获的DNA构建体。在脱氧缓冲液中新鲜制备的MPB-PE-脂质体与新鲜制备的抗体(或其片段)混合，在氮气气氛中在4℃下，恒定的端对端旋转下过夜进行偶联反应。通过在80000×g超速45分钟，从非缀合的抗体中分离免疫脂质体。免疫脂质体可腹腔内或直接注入肿瘤。
待递送到靶标位点的核酸可以是任何合适的DNA，其直接或间接导致细胞毒性。例如，该核酸可以编码对细胞是细胞毒性的核酶，或者其可以编码能够将基本上无毒性的前药转化为细胞毒性药物的酶(后一种系统有时称为GDEPT：基因导向的酶前药疗法)。
待递送到靶标的可以在核酸中进行编码的核酶在Cech和Herschlag“Site-specific cleavage of single stranded DNA”US5,180,818；Altman等人“Cleavage oftargeted RNA by RNAse P”US5,168,053,Cantin等人“Ribozyme cleavage of HIV-1RNA”US5,149,796；Cech等人“RNA ribozyme restriction endoribonucleases and methods”,US5,116,742；Been等人“RNA ribozyme polymerases,dephosphorylases,restrictionendonucleases and methods”,US5,093,246；以及Been等人“RNA ribozyme polymerases,dephosphorylases,restriction endoribonucleases and methods；cleaves single-stranded RNA at specific site by transesterification”,US4,987,071中描述了，所有通过引用并入此处。核酶合适的靶标包括转录因子如c-fos和c-myc和bcl-2。Durai等人(1997)Anticancer Res.17,3307-3312描述了抗bcl-2的锤头状核酶。
EP0415731描述了GDEPT系统。与如上所述对ADEPT系统关于酶和前药的选择相似的考虑，可应用于GDEPT系统。
待递送至靶标位点的核酸可以编码直接的细胞毒性多肽。
可替代地，其它的半簇可以包括这样的多肽或多核苷酸，其编码没有直接或间接细胞毒性的、但是具有治疗益处的多肽。此类多肽的实例包括抗增殖或抗炎性细胞因子，和影响血液凝固的抗增殖、免疫调节的或因子，其可能是医疗有益的，例如在癌症治疗中有益。
其它的半簇可以用作血管生成抑制剂，如肽血管抑素或内皮抑素。其它的半簇也可以用作将前体多肽转换成血管抑素或内皮抑素的酶。人基质金属蛋白酶，如巨噬细胞弹性蛋白酶、明胶酶和溶基质素将纤溶酶原转换成血管抑素(Cornelius等人(1998)J.Immunol.161,6845-6852)。纤溶酶原是血管抑素的前体。
在一个实施方案中，抗体、其抗原结合片段、变体、融合体或衍生物包括细胞毒性半簇，所述细胞毒性半簇包含放射性原子，例如选自以下的放射性原子：磷-32；碘-125；碘-131；铟-111；铼-186；铼-188；钇-90。
在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种抗体、其抗原结合片段、变体、融合体或衍生物，其还包括容易检测的半簇。
通过“容易检测的半簇”，我们包括，当将本发明的药剂施用到患者后，其定位于靶标位点时，该半簇是可以被检测的含义，典型地非侵入性地从体外进入并定位于靶标位点。因此，本发明的这个实施方案的药剂在成像和诊断中是有用的。
通常情况下，容易检测的半簇是或包含在成像中是有用的放射性原子。合适的放射性原子包括用于闪烁照相研究的99mTc和123I。其它容易检测的半簇包括，例如用于磁共振成像(MRI)的自旋标记，如再次指出123I、131I、111In、19F、13C、15N、17O、钆、锰或铁。显然，本发明的药剂必须有足够的合适的原子同位素，以使分子容易被检测。
放射性或其它标记可以以已知的方式并入此处。例如，抗体、其抗原结合片段、变体、融合体或衍生物可以是生物合成的、或使用合适的氨基酸前体通过化学氨基酸合成而合成的，氨基酸前体涉及例如氟-19代替氢。标签如99mTc、123I、186Rh、188Rh和111In例如可以通过多肽中的半胱氨酸残基附着。钇-90可以通过赖氨酸残基来附着。IODOGEN方法(Fraker等人(1978)Biochem.Biophys.Res.Comm.80,49-57)可用于掺入123I。参考文献(“MonoclonalAntibodies in Immunoscintigraphy”,J-F Chatal,CRC Press,1989)详细描述了其它方法。
优选地，所述容易检测的半簇包含放射性原子，如例如锝-99m或碘-123。
可替换地，容易检测的半簇可以选自：碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰、铁。
在本发明另一个优选的实施方案中，其它半簇能够选择性地结合到一个直接或间接的细胞毒性半簇或易检测半簇。因此，在本实施方案中，其它半簇可以是结合到其它细胞毒性或容易检测的化合物或组分的任何半簇。
其它半簇因此可以是抗体，其选择性结合其它化合物或组分，或者其可以是一些其它结合半簇，如链霉亲和素或生物素等。下面的例子说明了包括在本发明中的分子种类；其它这样的分子是从此处的教导显而易见的。
双特异性抗体，其中一个结合位点包含本发明的抗体、其抗原结合片段、变体、融合体或衍生物，而且第二个结合位点包含结合至例如酶的半簇，所述酶能够将基本无毒的前药转化为细胞毒性药物。
将被理解的是，本发明的抗体、其抗原结合片段、变体、融合体、以及衍生物是有用的研究试剂和治疗剂。合适地，本发明的抗体、其抗原结合片段、变体、融合体以及衍生物被可检测地标记，例如它们可以按照直接或间接地被检测的方式得以标记。
方便地，抗体用放射性半簇或有色半簇或荧光半簇标记，或者它们可以连接到酶。典型地，酶可以将无色(或无荧光)底物转化为有色(或荧光)的产物。该抗体可通过生物素(或链霉亲和素)标记，然后使用已被标记放射性半簇或有色半簇或荧光半簇的链亲和素(或生物素)等，或者它们可以连接至上面描述的任何类型的酶，进行间接检测。
优选地，容易检测的半簇包含放射性原子，例如锝-99m或碘-123，或选自以下的放射性原子：碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳13、氮-15、氧-17、钆、锰、铁。
在第二方面，本发明提供了一种核酸分子，其编码根据本发明的抗体或其抗原结合片段、或变体、融合体或衍生物，或其多肽链组分。通过“核酸分子”，我们包括DNA、cDNA和mRNA分子，其可以是单链或双链的。
优选地，所述核酸分子包含选自以下的一个或多个核苷酸序列：SEQ ID NO：40；SEQ ID NO：41；SEQ ID NO：42；或SEQ ID NO：43；或SEQ ID NO：44；或SEQ ID NO：45；或SEQID NO：46；或SEQ ID NO：47；或SEQ ID NO：48；或SEQ ID NO：49；或SEQ ID NO：50；或SEQ IDNO：51；或SEQ ID NO：52；或SEQ ID NO：53；或SEQ ID NO：54；或SEQ ID NO：55；或SEQ IDNO：56；或SEQ ID NO：57。
甚至更优选地，本发明提供了核酸分子，其包含以下的核苷酸序列：
(i)SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:49；或
(ii)SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:50；或
(iii)SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:52；或
(iv)SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:53；或
(v)SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:54；或
(vi)SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:55；或
(vii)SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:56；或
(viii)SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:57；或
(ix)SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:51。
在第三方面，本发明提供包含根据本发明第二方面的核酸分子的载体。
优选地，所述载体是表达载体。由“表达载体”我们指一种能够在适当的宿主中表达由所述核酸分子编码的多肽的载体。
这些载体可用于在宿主细胞中表达本发明编码的抗体、其抗原结合片段、变体、融合体或衍生物，用于有用的量的生产。
已开发了多种方法例如通过互补粘性末端可操作地将核酸分子，尤其是DNA，连接到载体。例如，互补的均聚物束(homopolymer tracts)可以被添加到将被插入到载体DNA的DNA片段。然后载体和DNA片段通过互补均聚物尾部之间的氢键连接，以形成重组DNA分子。
含有一个或多个限制性位点的合成接头提供连接DNA片段与载体的另一种方法。用噬菌体T4DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ处理例如通过内切酶限制性消化产生的DNA片段，上述酶通过其3'-5'核酸外切活性去除突出的3'-单链末端，并通过其聚合活性填补凹陷3'末端。
因而这些活性组合产生平端的DNA片段。然后在能够催化平端DNA分子连接的酶(如噬菌体T4DNA连接酶)的存在下，将该平端片段与较大摩尔过量的接头分子进行孵育。从而，该反应的产物是在其末端携带聚合的接头序列的DNA片段。然后用适当的限制性酶切割这些DNA片段，并连接到表达载体，上述表达载体已被酶切割产生与那些DNA片段相容的末端。
含有多种限制性内切酶位点的合成接头可商购自许多来源，包括InternationalBiotechnologies Inc.,New Haven,CN,USA。
修饰编码多肽的DNA的一个理想方法是使用PCR。该方法可以用于将DNA引入合适的载体中，例如通过在合适的限制性位点工程化，或者该方法可以用于以本领域已知的其它有用方法来修饰DNA。
在此方法中将被酶促扩增的DNA两侧具有两个特异性引物，所述两个引物其本身掺入到扩增的DNA中。该特异性引物可含有限制性内切酶识别位点，该识别位点可用于使用本领域已知的方法克隆至表达载体。
然后在合适的宿主中表达DNA(或在逆转录病毒载体的情况下，RNA)，以产生包含本发明药剂的多肽。因此，编码多肽的DNA可以按照公知的技术使用，基于此处包含的教导适当地修饰以构建表达载体，然后将表达载体用于转化适当的宿主细胞用于多肽的表达和生产。这样的技术包括以下公开的那些：Rutter等人的1984年4月3日发布的美国专利号4,440,859、Weissman的1985年7月23日发布的4,530,901、Crowl的1986年4月15日发布的4,582,800、Mark等人的1987年6月30日发布的4,677,063、Goeddel的1987年7月7日发布的4,678,751、Itakura等人的1987年11月3日发布的4,704,362、Murray的1987年12月1日发布的4,710,463、Toole Jr.等人的1988年7月12日发布的4,757,006、Goeddel等人1988年8月23日发布的4,766,075和Stalker的1989年3月7日发布的4,810,648，都通过引用并入此处。
编码多肽的DNA(或在逆转录病毒载体的情况下，RNA)可结合到多种用于导入合适的宿主中的其它DNA序列。伴随DNA将取决于宿主性质、将DNA导入宿主的方式、以及是否期望维持或整合游离体(episomal)。
通常，以适当的方向和用于表达正确的阅读框将DNA插入到表达载体，如质粒中。如果需要，可以将DNA连接到由所需宿主识别的合适的转录和翻译调节控制核苷酸序 列，尽管这样的控制通常可在表达载体中获得。然后将载体通过标准技术导入宿主中。通常，不是所有宿主将由载体转化。因此，有必要选择转化的宿主细胞。一个选择技术包括向表达载体中并入具有任何必要控制元件的DNA序列，该控制元件编码用于转化细胞的可选择性状，如抗生素抗性。或者，用于该可选择的性状的基因可以在另一载体上，该载体用于共转化所需的宿主细胞。
然后，基于此处所公开的教导，在本领域技术人员已知的适当条件下将被本发明表达载体所转化的宿主细胞培养足够的时间，以允许所述多肽的表达，然后其可以被回收。
许多表达系统是已知的，包括细菌(例如，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis))、酵母(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、丝状真菌(例如曲霉属(Aspergillus))、植物细胞、动物细胞和昆虫细胞。
载体通常包括原核复制子(如ColE1ori)用于在原核生物中繁殖，即使该载体用于在其它非原核生物的细胞类型中表达。载体还可以包含合适的启动子，如能指导基因在其转化的细菌宿主细胞，如大肠杆菌中表达(转录和翻译)的原核启动子。
启动子是由DNA序列形成的表达控制元件，其允许RNA聚合酶的结合和转录发生。与示范性细菌宿主相容的启动子序列通常被提供在含有用于插入本发明DNA片段的方便的限制性位点的质粒载体中。
典型的原核载体质粒是可从Biorad Laboratories(Richmond,CA,USA)获得的pUC18、pUC19、pBR322和pBR329，以及可从Pharmacia,Piscataway,NJ,USA获得的pTrc99A和pKK223-3。
典型的哺乳动物细胞载体质粒是可从Pharmacia,Piscataway,NJ,USA获得的pSVL。此载体使用SV40晚期启动子驱动克隆基因的表达，在T抗原产生细胞(如COS-1细胞)中发现表达水平最高。
可诱导的哺乳动物表达载体的一个例子是pMSG，其也可以从Pharmacia获得。此载体使用小鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复的糖皮质激素诱导型启动子，以驱动克隆基因的表达。
有用的酵母质粒载体是pRS403-406和pRS413-416，其一般可从StratageneCloning Systems,La Jolla,CA92037,USA获得。质粒pRS403、pRS404、pRS405和pRS406是酵母整合质粒(YIp)，其纳入了酵母选择标记物HIS3、TRP1、LEU2和URA3。质粒pRS413-416是酵母着丝粒质粒(Ycp)。
其它载体和表达系统是本领域熟知的用于各种宿主细胞。
在第四方面，本发明提供了一种重组宿主细胞，其包含根据本发明第二个方面的核酸分子或根据本发明第三方面的载体。
优选地，所述宿主细胞是细菌细胞或哺乳动物细胞，如人细胞。
所述宿主细胞可以是原核或真核的。细菌细胞优选是原核宿主细胞，通常是大肠杆菌菌株，如例如可从Bethesda Research Laboratories Inc.,Bethesda,MD,USA获得的大肠杆菌菌株DH5，以及可从美国典型培养物中心(American Type Culture Collection(ATCC)， Rockville,MD,USA获得的RR1(No.ATCC31343)。优选的真核宿主细胞包括酵母、昆虫和哺乳动物细胞，优选脊椎动物细胞，如那些来自小鼠、大鼠、猴子或人成纤维细胞和肾细胞系的细胞。酵母宿主细胞包括YPH499、YPH500和YPH501，其一般可从StratageneCloning Systems,La Jolla,CA92037,USA获得。优选的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，其作为CRL1658和293细胞可从ATCC获得，这些细胞是人胚胎肾细胞。优选的昆虫细胞是Sf9细胞，其可以用杆状病毒表达载体转染。
通常根据所用载体的类型，通过熟知的方法完成用本发明的DNA构建体转化适当的细胞宿主。对于原核宿主细胞的转化，参见例如Cohen等人(1972)Proc.Natl.Acad.Sci.USA69,2110和Sambrook等人(1989)Molecular Cloning,ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY。酵母细胞的转化描述于Sherman等人(1986)Methods In Yeast Genetics,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,NY。Beggs(1978)Nature275,104-109的方法也是有用的。关于脊椎动物细胞，在转染这些细胞中有用的试剂，例如磷酸钙和DEAE-葡聚糖或脂质体制剂，可从Stratagene Cloning Systems或Life Technologies Inc.,盖瑟斯堡,MD20877,USA获得。
电穿孔也用于转化和/或转染细胞，并且本领域熟知酵母细胞、细菌细胞、昆虫细胞和脊椎动物细胞的转化。
例如，许多细菌种可以通过在Luchansky等人(1988)Mol.Microbiol.2,637-646描述的方法进行转化，其通过引用并入此处。在25μFD、使用6250V每厘米，电穿孔悬浮于2.5PEB的DNA-细胞混合物后，一致地回收到转化体的最大数目。
通过电穿孔转化酵母的方法公开于Becker&Guarente(1990)MethodsEnzymol.194,182中。
成功转化的细胞，即含有本发明DNA构建体的细胞，可以通过熟知的技术鉴定。例如，引入本发明表达构建体所产生的细胞可生长以产生本发明的多肽。可收获并裂解细胞，并使用如Southern(1975)J.Mol.Biol.98,503或Berent等人(1985)Biotech.3,208描述的方法检测存在DNA的DNA含量。或者，可以如下所述使用抗体检测上清液中存在的蛋白。
除了直接分析重组DNA的存在，当重组DNA能够指导蛋白的表达时，成功的转化可通过熟知的免疫学方法来确认。例如，用表达载体成功转化的细胞产生显示适当抗原性的蛋白。
收集怀疑被转化的细胞样品并使用合适的抗体分析蛋白。
所述宿主细胞可以是非人类动物体内的宿主细胞。因此，由于转基因的存在，本发明包括表达根据本发明的药剂(或其结合半簇)的转基因非人动物。优选地，所述转基因非人类动物是啮齿动物如小鼠。可以应用本领域公知的方法生产转基因非人类动物。
在第五方面，本发明提供了药物组合物，其包含有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段、或者变体、融合体或衍生物，以及药学上可接受的缓冲液、赋形剂、稀释剂或载体。
如此处使用的，“治疗有效量”或“有效量”或“治疗有效的”，指该量提供给定条件和施用方案的治疗效果。这是计算的与所需要的添加剂和稀释剂(即载体或施用载体)联合产生期望治疗效果的活性抗体的预定量。另外，其意指足以减少或防止宿主活动、功能和反应中的显著临床缺陷的量。或者，治疗有效量足以引起宿主临床显著状况的改进。如由本领域技术人员所理解的，化合物的量可以根据其特异的活性而变化。合适的剂量可以含有经计算与需要的稀释剂联合产生所期望的治疗效果的活性组合物的预定量。
治疗有效量可以由普通熟练的医学或兽医工作者根据患者特征，如年龄、体重、性别、病状、并发症、其它疾病等的来确定，这在本领域中已知的。
因此，所述抗体或其抗原结合片段、变体、融合体或衍生物可以以各种浓度配制，这取决于所使用的多肽的功效/毒性。优选地，所述制剂包含浓度为0.1μM和1mM之间的活性多肽，例如1μM和500μM之间、500μM和1mM之间、或300μM和700μM之间。
通过“药学上可接受的”，包含该制剂是无菌的并且是无热源的。合适的药用载体是药学领域中众所周知的。载体必须是“可接受的”，即与本发明的抗体相容且不会有害于其接受者。通常，载体是无菌并且无热源的水或盐水；然而，也可以使用其它可接受的载体。
合适的药学上可接受的缓冲剂、稀释剂、载体和赋形剂是本领域公知的(见Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版,A.R Gennaro,Ed.,Mack PublishingCompany(1990)和handbook of Pharmaceutical Excipients,第三版,A.Kibbe,Ed.,Pharmaceutical Press(2000)，其公开内容在此引入作为参考)。
术语“缓冲液”意指包括含有以稳定pH为目的的酸碱混合物的水溶液。缓冲液的例子是Trizma(无对应中译文)、N-二甘氨酸、Tricine(无对应中译文)、MOPS、MOPSO、MOBS、Tris、Hepes、HEPBS、MES、磷酸盐、碳酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、乙醇酸盐、乳酸盐、硼酸盐、ACES、ADA、酒石酸盐、AMP、AMPD、AMPSO、BES、CABS、甲次砷酸盐、CHES、DIPSO、EPPS、乙醇胺、甘氨酸、HEPPSO、咪唑、咪唑乳酸、PIPES、SSC、SSPE、POPSO、TAPS、TABS、TAPSO和TES。
术语“稀释剂”意指包括用在药物制剂中稀释药剂目的的水性或非水性溶液。该稀释剂可以是一种或多种盐水、水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇或油(如红花油、玉米油、花生油、棉子油或芝麻油)。
术语“佐剂”意指包括在制剂中加入的任何化合物，以增加本发明药剂的生物作用。佐剂可以是具有不同阴离子的锌、铜或银盐的一种或多种，例如，但不限于氟化物、氯化物、溴化物、碘化物、硫氰酸盐(tiocyanate)、亚硫酸盐、氢氧化物、磷酸盐、碳酸盐、乳酸盐、羟乙酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐、酒石酸盐和不同酰基组成的乙酸盐。佐剂也可以是阳离子聚合物，如阳离子纤维素醚、阳离子纤维素酯、脱乙酰化透明质酸、壳聚糖、阳离子树枝状聚合物、阳离子合成聚合物如聚(乙烯基咪唑)、和阳离子型多肽，如聚组氨酸、聚赖氨酸、聚精氨酸和含有这些氨基酸的肽。
赋形剂可以是碳水化合物、聚合物、脂质和矿物质的一种或多种。碳水化合物的例子包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、以及环糊精，它被添加到组合物，例如用于促进冻干。聚合物的实例是淀粉、纤维素醚、纤维素羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、藻酸盐、角叉菜胶、透明质酸及其衍生物、聚丙烯酸、聚磺酸盐、聚乙二醇/聚环氧乙烷、聚环氧乙烷/聚环氧丙烷的共聚物、不同水解度的聚乙烯醇/聚乙酸乙烯酯、以及聚乙烯吡咯烷酮，所有不同的分子量被加入到组合物中，例如用于控制粘度，以实现生物粘附，或用于保护脂质免受化学和蛋白水解降解。脂质的实例为脂肪酸、磷脂、单-，二-和三甘油酯、神经酰胺、鞘脂和糖脂，所有不同的酰基链长度和饱和度、蛋卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化蛋和大豆卵磷脂被添加到组合物中，其原因类似于聚合物的那些。矿物质的例子是滑石、氧化镁、氧化锌和氧化钛，其被加入到组合物中以获得如减少液体积聚或有利的颜料性能的益处。
本发明的以活性抗体为基础的药剂可以配制成本领域中已知药物组合物的任何类型，以适于其递送。
在一个实施方案中，本发明的药物组合物可以是脂质体的形式，其中除了其它药学上可接受的载体外，药剂还与两性药剂如脂质组合，所述脂质作为胶束、不溶性单层和液晶以聚集形式存在。用于脂质体制剂的合适的脂质包括但不限于甘油单酯、甘油二酯、硫苷脂、溶血卵磷脂、磷脂、皂苷、胆汁酸等。适合的脂质还包括由极性头部中的聚(乙二醇)修饰的上述脂质，以延长血液循环的时间。这样的脂质体制剂的制备可以在例如US4,235,871中找到，其中公开的内容通过引用并入此处。
本发明的药物组合物还可以是可生物降解的微球形式。脂肪族聚酯，如聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、PLA和PGA的共聚物(PLGA)或聚(己内酯(carprolactone))(PCL)和聚酐已被广泛用作微球生产中的生物可降解聚合物。这样的微球制剂可以在US5,851,451和在EP0213303中找到，其公开的内容通过引用并入此处。
在另一实施方案中，本发明的药物组合物以聚合物凝胶的形式提供，其中聚合物，如淀粉、纤维素醚、纤维素羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、藻酸盐、角叉菜胶、透明质酸和其衍生物、聚丙烯酸、聚乙烯基咪唑、聚磺酸酯、聚乙二醇/聚环氧乙烷、聚环氧乙烷/聚环氧丙烷共聚物、不同水解度的聚乙烯醇/聚乙酸乙烯酯和聚乙烯吡咯烷酮用于包含药剂的溶液的增稠。所述聚合物也可包括明胶或胶原蛋白。
或者，所述药剂可以被简单地溶解在盐水、水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇或油(例如红花油、玉米油、花生油、棉子油或芝麻油)、黄蓍胶和/或各种缓冲液中。
应当理解，本发明的药物组合物可包括离子和限定的pH，以增强活性剂的作用。此外，该组合物可以经受常规的药物操作如灭菌和/或可以含有常规的佐剂，如防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、缓冲剂、填充剂等。
根据本发明的药物组合物可以通过本领域技术人员已知的任何合适的途径施用。因此，施用的可能途径包括胃肠外(静脉内、皮下和肌内)、局部、眼、鼻、肺(pulmonar)、 含服、口服、胃肠外、阴道和直肠。同时，从植入物的施用也是可能的。
有利地，所述药物组合物适于在或接近肿瘤部位施用，例如肿瘤内或肿瘤旁施用。
优选地，所述药物组合物适于肠胃外施用。将抗体配制成药物组合物的方法是医学和药学领域的技术人员所熟知的。优选的组合物在所附的实施例中描述。
本发明的药剂(即抗体、其抗原结合片段、变体、融合体或衍生物)、药物和药物组合物可以使用注射用持续释放药物递送系统递送。这些是用于减少注射频率专门设计的。这种系统的一个实例是Nutropin储库(Nutropin Depot)(无对应中译文)，其将重组人生长激素(rhGH)包囊在可生物降解的微球中，一旦注射rhGH在一段持续时期内缓慢释放。优选地，通过肌内((i.m.)和/或皮下(s.c.)和/或静脉内(i.v.)进行递送。
本发明的制剂、药物和药物组合物可通过外科手术植入装置直接释放药物到所需的位点来施用。例如，Vitrasert(无对应中译文)直接释放更昔洛韦(ganciclovir)到眼睛，以治疗CMV视网膜炎。这种毒性剂直接应用至疾病位点实现了有效的治疗，而没有药物的显著全身副作用。
电穿孔疗法(EPT)系统也可用于本发明的药剂、药物和药物组合物的施用。向细胞递送脉冲电场的装置增加了细胞膜对药物的通透性，产生了显著增强的细胞内药物递送。
本发明的药剂、药物和药物组合物还可以通过电掺入(EI)递送。当多至30微米直径的小颗粒在皮肤表面上经历与电穿孔所用的相同或相似的电脉冲时，发生EI。在EI中，这些颗粒被驱动通过角质层进入皮肤的更深层。颗粒可以加载或涂层有药物或基因，或可以简单地充当“子弹”在皮肤上产生孔，药物能通过该孔进入。
递送本发明的药剂、药物和药物组合物的另一种方法是ReGel注射系统，其是热敏感的。低于体温时，ReGel是一种注射液体，而在体温下其立刻形成凝胶储库，缓慢地侵蚀和溶解成已知的安全的可生物降解的聚合物。将活性物质作为生物聚合物溶解物随时间递送。
本发明的药剂、药物和药物组合物还可以口服递送。该方法利用维生素B12和/或维生素D在体内口服摄取的自然过程，来共同递送蛋白和肽。通过依靠(riding)维生素B12和/或维生素D摄取系统，本发明的药剂、药物和药物组合物可经肠壁移动。在维生素B12类似物和/或维生素D类似物和药物之间合成复合物，其保留了对复合物中维生素B12部分/维生素D部分中的内因子(IF)显著的亲和性，并保留了复合物活性物质的显著生物活性。
本发明的药剂、药物和药物组合物可以通过“木马肽(Trojan peptides)”被引入到细胞中。这些是一类称为penetratins(无对应中译文)的多肽，其具有易位性能，并且能够跨质膜携带亲水性化合物。这个系统允许寡肽直接靶向细胞质和细胞核，并且可以是非细胞类型特异性且高效的。见Derossi等人(1998),Trends Cell Biol.8,84-87。
优选地，本发明的药物和/或药物组合物是单位剂量，其含有活性成分的每日剂量或单位、每日亚剂量或其适当的部分。
本发明的药剂、药物和药物组合物通常以药物组合物形式通过口服或通过任何肠胃外途径施用，所述药物组合物以药学上可接受的剂型包含活性成分、任选地无毒有机或无机酸或碱、加成盐的形式。根据不同的疾病和待治疗患者，以及施用途径，组合物可以以不同的剂量施用。
在人的治疗中，本发明的药剂、药物和药物组合物可以单独施用，但通常与合适的药物赋形剂、稀释剂或载体混合施用，所述合适的药物赋形剂、稀释剂或载体根据预期施用途径和标准药物实践进行选择。
例如，本发明的药剂、药物和药物组合物可以以片剂、胶囊、珠、酏剂、溶液或悬液的形式，通过口服、含服或舌下，用于立即、延迟、或控释应用的施用，本发明的药剂、药物和药物组合物可含有调味剂或着色剂。本发明的药剂、药物和药物组合物也可通过海绵体内注射施用。
此类片剂可含有赋形剂，例如微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸二钙和甘氨酸，崩解剂如淀粉(优选玉米、马铃薯或木薯淀粉)、淀粉乙醇酸钠、交联甲羧纤维素钠和某些复合硅酸盐，及制粒粘合剂如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、明胶和阿拉伯胶。另外，可以包括润滑剂如硬脂酸镁、硬脂酸、山嵛酸甘油酯和滑石。
类似类型的固体组合物也可以用作明胶胶囊中的填充剂。在这方面优选的赋形剂包括乳糖、淀粉、纤维素、奶糖或高分子量聚乙二醇。对于水性悬液和/或酏剂，本发明的药剂、药物和药物组合物可以与各种甜味剂或调味剂、着色物质或染料组合，与乳化剂和/或悬浮剂组合以及与稀释剂如水、乙醇、丙二醇和甘油组合，及其组合。
本发明的药剂、药物和药物组合物可以肠胃外施用，例如，静脉内、动脉内、腹膜内、intra-thecally(无对应中译文)、心室内、胸骨内、颅内、肌内或皮下施用，或它们可以通过输注技术施用。其最好以无菌水溶液的形式使用，在无菌水溶液中可以含有其它物质，例如足够的盐或葡萄糖以使溶液与血液等渗的。如果必要，水溶液应该进行适当的缓冲(优选pH为3至9)。在无菌条件下，合适的肠胃外制剂的制备很容易由本领域技术人员通过公知的标准制药技术完成。
适合于肠胃外施用的药物和药物组合物包括水性和非水性无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌悬液，其可包括悬浮剂和增稠剂。所述药物和药物组合物可以存在于单位剂量或多剂量的容器中，例如密封的安瓿和小瓶，并且可以存储在冷冻干燥(冻干)条件下，在即用前仅需要加入无菌液体载体，例如注射用水。临时注射溶液和悬液可以由无菌粉末、颗粒和先前描述的种类的片剂制备。
本发明的药剂、药物和药物组合物也可以经鼻内或通过吸入施用，并方便地以干粉吸入器或气溶胶喷雾的形式递送，所述干粉吸入器或气溶胶喷雾来自使用合适的推进剂的加压容器、泵、喷射器或喷雾器，所述合适的推进剂例如：二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、氢氟烷烃例如1,1,1,2-四氟乙烷(HFA134A或1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷(HFA227EA3)，二氧化碳或其它适宜的气体。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可以通过提供递送计量的量的阀来确定。加压容器、泵、喷射器或喷雾器可含有活性剂的溶液或悬液，例如，使用乙醇和推进剂的混合物作为溶剂，其可另外含有润滑剂，如山梨醇三油酸酯。用于吸入器或吹入器的胶囊和套筒(例如，由明胶制成)可配制成含有本发明的药剂与合适的粉末基质(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
或者，本发明的药剂、药物和药物组合物可以以栓剂或阴道栓剂的形式施用，或者它们可以以洗液、溶液、霜剂、凝胶、软膏或撒粉的形式局部施用。本发明的药剂、药物和药物组合物也可经皮施用，例如通过使用皮肤贴剂。它们也可以通过眼途径施用，特别是用于治疗眼睛疾病。
对于眼科应用，本发明的药剂、药物和药物组合物可以配制成在等渗的、pH调节的、无菌盐水中的微粉化悬液，或优选在等渗的、pH调节的、无菌盐水中的溶液，任选地与防腐剂，如苯扎氯铵组合。或者，其可以配制成软膏例如凡士林。
为了局部应用于皮肤，本发明的药剂、药物和药物组合物可以配制为含有悬浮在或溶解于混合物中的活性剂的合适软膏，例如所述混合物具有以下一种或多种：矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯剂、乳化蜡和水。或者，它们可以配制成适合的洗剂或霜剂，悬浮或溶解在例如以下的一种或多种的混合物中：矿物油、山梨醇单硬脂酸酯、聚乙二醇、液体石蜡、聚山梨醇酯60、鲸蜡酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。
适于口内局部施用的制剂包括锭剂、软锭剂和漱口水，其中锭剂包含在调味基质中的活性成分，调味基质通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶；软锭剂包含惰性基质中的活性成分，惰性基质如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶；漱口水包含适合的液体载体中的活性成分。
通常，在人中，本发明的药剂、药物和药物组合物在或接近肿瘤部位的局部施用是优选的途径，特别是肿瘤内或肿瘤旁施用。
对于兽医用途，本发明的药剂、药物和药物组合物以适当可接受的制剂按照正常兽医实践施用，兽医外科医生将确定最适合于特定动物的剂量方案和施用途径。
在第六方面，本发明提供包含根据本发明第五方面的药物组合物的试剂盒。
在第七方面，本发明提供了根据本发明第一方面的抗体或其抗原结合片段、或变体、融合体或衍生物，或根据本发明第二方面的核酸分子，或根据本发明第三方面的载体，或根据本发明第四方面的宿主细胞，或根据本发明第五方面的药物组合物，用于药物中。
在第八方面，本发明提供了根据本发明第一方面的抗体或其抗原结合片段、或变体、融合体或衍生物，或根据本发明第二方面的核酸分子，或根据本发明第三方面的载体，或根据本发明第四方面的宿主细胞，或根据本发明第五方面的药物组合物，用于治疗癌症。
在第九方面，本发明提供了根据本发明第一方面的抗体或其抗原结合片段、或变体、融合体或衍生物，或根据本发明第二方面的核酸分子，或根据本发明第三方面的载体，或根据本发明第四方面的宿主细胞，或根据本发明第五方面的药物组合物，在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
优选地，在本发明的第七和/或第八和/或第九方面，癌症的治疗包括向需要其的个体施用有效量的抗体或其抗原结合片段、或变体、融合体或衍生物、或核酸分子或载体或宿主细胞或药物组合物的步骤。
在第十个方面，本发明提供了用于治疗患有癌症的个体的方法，该方法包括向有其需要的个体施用有效量的以下物质步骤：根据本发明第一方面的抗体或其抗原结合片段、或变体、融合体或衍生物，或根据本发明第二方面的核酸分子，或根据本发明第三方面的载体，或根据本发明第四方面的宿主细胞，或根据本发明第五方面的药物组合物。
优选的是，在本发明的第七和/或第八和/或第九和/或第十方面，向有其需要的个体施用的步骤包括局部施用，例如局部施用于患者的肿瘤(例如，肿瘤内或肿瘤旁)。
已知，如将抗CD40抗体局部注射至肿瘤可以低得多的剂量产生全身抗肿瘤效果(van Mierlo等人,2002,Proc Natl Acad Sci USA,99:5561-5566；Kalbasi等人.,2010,JImmunotherapy,33:810-816)。此外，据报道在一侧肿瘤内治疗的小鼠能够清除对侧的肿瘤，并且其抗肿瘤效果依赖于树突细胞的激活，以及细胞毒性T淋巴细胞的后续激活反应。此外，该处理产生了对肿瘤再攻击的保护性免疫。
患者特异性优化如上所述的抗体或其抗原结合片段、或变体、融合体或衍生物的剂量后，然后患者被施用最大治疗剂量用于治疗的持续时间。然而，应当理解的是，一旦治疗开始，剂量可随着时间的推移而降低以产生所需的治疗效果。
典型地，所述抗体或其抗原结合片段、或变体、融合体或衍生物，在人患者中的治疗剂量在每次施用100μg至700mg的范围内(基于体重为70公斤)。
例如，最大的治疗剂量可在每次施用0.1至10mg/kg的范围，例如在0.1至5mg/kg或1至5mg/kg、或0.1至2mg/kg之间。但应该理解，如由肿瘤医生/医师确定的，这样的剂量可以以不同的时间间隔施用；例如，剂量可以是每日、每周两次、每周、每两周或每月一次施用。
在一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段、或变体、融合体或衍生物的最大治疗剂量是一种低剂量。例如，在本发明中局部施用的剂量可以是相同药剂为产生治疗效果所需的典型全身剂量的25％以下。在一个实施方案中，所述剂量为每次施用小于或等于1mg，例如每次施用小于或等于500μg、400μg、300μg、200μg、100μg、50μg、30μg、20μg、10μg、5μg或1μg。应理解，这些剂量可以经一段时间重复施用至患者，例如每日两次、每日一次、每隔一天一次、每周两次、每周一次、每月两次、每月一次等)。
在一个实施方案中，所述基于抗体的药剂是以每次施用10μg至100μg的剂量使用。
例如，基于抗体的药剂可以每次施用20μg至40μg的剂量使用，例如每次施用30μg。
在一个实施方案中，所述基于抗体的药剂能够提供全身性的抗肿瘤作用。即使疗法通过局部/肿瘤内进行，也可以实现这样的全身性抗肿瘤作用。当局部施用免疫治疗抗体时，例如，通过肿瘤内注射，CD40疗法仅靶向肿瘤区域的细胞。因此，仅在组织区域中 的CD40激动剂浓度会影响CD40的激活水平，在该组织区域中预期CD40激动剂被用于发挥其效果。当局部施用时，最佳剂量可以由相关治疗的组织区域体积确定，而不是患者体重来确定。当肿瘤内治疗时，这个体积可以替代地通过肿瘤体积来定义。因而，相关的总剂量可以比全身治疗低，并可基于由PET扫描或其它成像方法根据肿瘤的诊断来定义，而不是由患者的体重定义。
但应理解，本发明的基于抗体的药剂适合用于治疗任何类型的CD40激活可提供治疗益处的癌症。
例如，癌症可以选自：前列腺癌、乳癌、结肠直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌、子宫颈癌、横纹肌肉瘤、神经母细胞瘤、多发性骨髓瘤、白血病、急性淋巴细胞白血病、黑色素瘤、膀胱癌和成胶质细胞瘤。
在一个实施方案中，所述癌症与CD40+肿瘤细胞相关。然而，本发明的基于抗体的药剂也可以用于治疗与CD40-肿瘤细胞相关的癌症。
将进一步理解的是，本发明的基于抗体的药剂可以用作患者中癌症的唯一治疗或用作联合治疗(其进一步的治疗可以是药物制剂、放疗和/或手术)的一部分。
因此，患者还可以接受一种或多种另外的癌症治疗，例如药物制剂(如化疗剂)、放疗和/或手术。
在一个实施方案中，所述一种或多种另外的治疗选自以下的常规化疗剂(如烷化剂、抗代谢药、植物生物碱和萜、拓扑异构酶抑制剂和抗肿瘤药)、放疗剂、基于抗体的治疗剂(如吉妥珠单抗、阿仑单抗、利妥昔单抗、曲妥珠单抗、尼妥珠单抗、西妥昔单抗、贝伐单抗)和类固醇。
在第十一个方面，本发明提供了一种用于产生根据本发明的抗体或其抗原结合片段、或变体，融合体或衍生物的方法，所述方法包括在允许其所编码的抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养根据本发明第四方面的宿主细胞。
培养宿主细胞和分离重组蛋白的方法是本领域中众所周知的。将理解的是，根据宿主细胞不同，产生的蛋白可能不同。例如，某些宿主细胞，如酵母或细菌细胞，或者不具有或具有不同的翻译后修饰系统，这可能导致产生以不同方式翻译后修饰的本发明药剂(或其结合半簇)。
优选的是，本发明的抗体、其抗原结合片段、变体、融合体或衍生物(或其结合半簇)在真核系统中生成，如在哺乳动物细胞中产生。
根据一个不太优选的实施方案，本发明的抗体、其抗原结合片段、变体、融合体或衍生物，可以使用市售可获得的体外翻译系统，如兔网织红细胞裂解物或麦胚裂解物(可从Promega获得)在体外生成。优选地，该翻译系统是兔网织红细胞裂解物。方便地，所述翻译系统可以偶联到一个转录系统，如TNT转录-翻译系统(Promega)中。该系统具有在与翻译相同的反应中，从编码DNA多核苷酸制备合适的mRNA转录物的优点。
可以理解的是，其中所述药剂包含不同的半簇，例如结合和/或细胞毒性结构域，这些半簇可以被一个或多个独立的核酸分子编码。
优选地，本发明该方面的制造方法包括分离从宿主细胞或从体外翻译混合物产生的本发明的抗体、其抗原结合片段、变体、融合体或衍生物的进一步步骤。优选地，所述分离采用了选择性地结合本发明的表达多肽的抗体。
制备抗体的方法是本领域中众所周知的。例如，可通过用适当的肽免疫动物生产抗体。可替换地，以现在的技术，可能不需要使用动物来制备抗体；这样的技术包括，例如，如本领域中已知的抗体噬菌体展示技术。
在一个实施方案中，本发明的抗体、其抗原结合片段、变体、融合体或衍生物是直接或间接地在体外优化蛋白的产品(例如，如WO02/48351和WO03/097834中描述的，使用Alligator Bioscience AB的技术)。
在本说明书中的明显现有公开的文件的列举或讨论不应必然地被视为承认该文件是技术状态的一部分或是公知常识。
优选地，现在将参考以下附图描述体现了本发明某些方面的非限制性实施例：
附图说明
图1-(A)文库的“热图”和从选择到初级高通量筛选(HTS)的输出。每个方块代表一个氨基酸位置。热图被限制到已经引入突变和/或通过序列分析发现突变的位置。未显示VH和VL之间的接头。在每个位置上的突变频率由暗的阴影表示。(B)根据来自选择步骤的序列计算的多于5个突变的位置数。
图2-HTS结果的可视化。来自2个ELISA测量(正常洗涤和苛刻洗涤)的比显示在y轴；在x轴，则显示来自初级ELISA(正常洗涤)的结合信号。图中的每个球表示来自一个克隆的数据。B44(灰色)和来自选择轮5(黑色)的克隆被示出。
图3-CD40结构域的示意图。
图4-在37℃和生理pH值下，对结合靶标的CD40抗体克隆的表面等离子共振分析。
图5-相对于B44抗体，CD40抗体克隆上调的表面标记物CD86。
图6-显示在终点天数(第28天)测量的肿瘤重量。显示用30μg G12或同种型对照处理(**p<0.01相对于对照的两个处理组，使用Mann-Whitney检验，双尾)。
图7-显示不同处理组的平均(n＝9)肿瘤体积(+/-SEM)。30μg药物处理的小鼠与同种型对照(30μg)相比。与同种型对照相比，用G12处理提供了显著的抗肿瘤效果。
图8-显示在终点天数(第28天)测量的肿瘤重量。在人树突细胞和T细胞存在时，G12与PBS处理相比，在各处理组(n＝10)移植有自体T细胞和来自两个不同供体(每个供体五只小鼠，共10只小鼠)的树突细胞。与同种型对照相比，用G12处理是显著的(与对照相比，处理组p<0.05，使用学生t检验，双尾)。
图9-显示处理组的平均(n＝10)肿瘤体积(+/-SEM)。小鼠用30μg G12处理，并在人树突细胞和T细胞存在时，与PBS处理相比，在各处理组(n＝10)移植有自体T细胞和来自两个不同供体(每个供体五只小鼠，共10只小鼠)的树突细胞。与同种型对照相比，用G12处理是显著的。
图10-显示药物处理接种肿瘤的小鼠的生存曲线。与同种型对照相比，用G12处理显著增加动物的生存(p<0.013)。与S2C6相比，G12处理的小鼠的生存曲线(p<0.13)。与同种型对照相比，S2C6处理的小鼠的生存(p<0.088)。每个处理组由5只小鼠组成，N＝5。
图11-表示用药物处理的荷瘤小鼠的生存曲线。所显示的生存曲线基于汇总的数据。用G12处理的小鼠组与同种型对照的各组由20只动物组成。用S2C6处理的小鼠由12只动物组成。由对数秩检验比较G12处理组和S2C6处理组的生存曲线以及同种型对照处理组，使用Bonferroni方法调整多重比较。G12的生存曲线显著不同于同种型对照(未经调整的p0.004)。
图12-显示处理的小鼠中的细胞因子水平。在第10天的第二次处理后4小时血清样品取自处理小鼠，分析细胞因子水平。使用单因素Anova分析，并用Bonferroni多重比较检验来计算经调整的p值，比较来自G12、S2C6处理小鼠和来自同种型对照的细胞因子水平。与S2C6处理小鼠相比，G12处理是显著的。标有***的细胞因子水平显示p<0.001，标有**的数据显示p值为0.001<p<0.01，以及标记*的细胞因子水平显示p值为0.01<p<0.05。G12处理组和S2C6处理组由23只小鼠组成，N＝23。同种型对照的处理组由18只小鼠组成，N＝18。
图13-来自处理小鼠血清的抗体水平。用G12或对照第一次(第7天)和第二次(第10天)处理后4小时抽取血清样品，分析抗体水平。在第7天和第10天，与克隆S2C6相比，对于抗CD40抗体克隆G12，该抗体滴度显著降低约2倍。使用单尾非配对t-检验计算G12和S2C6平均值比较的p值。由于靶标相关的作用，血清G12滴度比同种型对照低约100倍(G12滴度与人CD40阴性小鼠中的同种型滴度相似)。
用相同剂量()G12和S2C6处理后，处理后4小时G12和S2C6的血清滴度有显著差异。这表明，与S2C6相比，G12在肿瘤和周围组织中保留更长的时间。这种差异可能是由于相对于其它CD40抗体(如S2C6)G12对靶标(CD40)的高结合速率(on-rate)和亲和性。
标有***的抗体水平显示p<0.001，标有**的数据显示p值为0.001<p<0.01。G12处理组和S2C6处理组由23只小鼠组成，N＝23。同种型对照处理组由18只小鼠组成，N＝18。
具体实施方式
实施例
实施例1-具有改进效力的激动型CD40抗体的定向进化
介绍
B44抗体来源于文库，其是人抗体片段展示文库(等人，2000)。除了一个文库之外，抗CD40激动型抗体B44的氨基酸序列与结构模型用于设计其中随机突变被插入在整个序列的文库。
本发明抗体的制备和选择如下。
文库设计
根据B44抗体的序列分析和结构模型构建三个设计文库和一个随机文库。B44的结构模型是基于适当的模板结构，在蛋白数据库(PDB)中，对于VH为1NL0，对于VL为2J6E。
在AL-10013-04中，通过核苷酸序列分析鉴定了B44中的种系热点残基(参见LeFranc等人，IMGT/VQEST，http://www.imgt.org/IMGTeducation/Tutorials/IGandBcells/_UK/SomaticHypermutations/)(Ho和Pastan“Therapeutic antibodies:Methods and protocols”,2009,(525)Humana Press)。种系热点突变是在重排的免疫球蛋白可变结构域中的氨基酸位置，该位置很容易在体细胞过突变过程中经历突变。在CDRL3中的种系热点残基随机地与结构上相邻的CDRL1中选定的种系热点残基在一起。各种系热点突变中的变异性被限制在8-9选定的残基，以减少复杂性并产生高功能的文库。选择这些残基来代表所有(20)天然存在氨基酸的理化性质(Tanping,Protein Engineering,2003,16,323-330)(Koide等人,2009,ACS Chemical biology)，同时保留在便捷水平上的复杂性以及理论变异性。这个文库的理论变异性为1.9×107个个体变体。
在AL-10013-05中，基于B44的结构模型鉴定所有表面暴露的CDR残基。这些残基是变化的，将变异性限制到1或2个同源残基，除了在H3中，在H3中引入额外的变异性(参见图1)。目的是要建立一个高功能文库，同时保留在便捷水平上的复杂性以及理论变异性。这个文库的理论变异性为1.9×107个个体变体。
在设计文库AL-10013-06中，在CDRL3中央部分的残基和在结构上相邻的CDRH2中的残基被随机化(n＝11)。从B44的结构模型鉴定残基。在每个位置上的变异性被限制在4-5个残基，被选择用来代表适于产生高亲和性、“最低限度(minimalist)”、蛋白结合表位的理化性质(Koide等人2009,ACS Chemical biology,Fellouse等人,2007,J Mol Biol)1，2，同时保留在便捷水平上的复杂性以及理论变异性。AL-10013-06文库含有1.6107个独特的变体。
在随机化的文库AL-10013-07中，使用易错PCR方法随机化完整的B44序列，该易错PCR方法设计用于减少突变偏差(Genemorph)。文库的生成大小为6.3×108个独特的变体。
选择策略
富集起始文库中与生物素化CD40-Fcγ的结合物，从而从编码功能性结合物的各文库创建序列的汇集(表1中的“第1轮”)。通过测序验证对结合物的初始富集。
其后使用重组编码功能性变体的序列汇集。Alligator Bioscience AB的技术在WO02/48351和WO03/097834中描述。
-重组文库包括2×108个独特的变体。
所产生的重组文库进行4轮附加的选择(在表1中“第2-5轮”)。
从每轮选择，选择约2000个克隆，并在高通量分析中筛选。对于亲和性成熟的选择方案包括影响以下特性的步骤：亲和性；结合速率；解离速率；多聚化；和表位的维持。
-为了提高亲和性，包括在三轮中抗原浓度降低10倍，在随后的两轮中抗原浓度降低5倍。
-设计结合速率以使其维持，并且通过缩短孵育时间进行处理。
-通过提高洗涤严谨度设计解离速率以得到改进。在第4轮和第5轮纳入未被生物素化的CD40，防止多聚化并抑制亲合力的选择。
从选择到初级高通量筛选的结果总结在文库的“热图”中，其表明在每个文库所产生的突变位置和频率(图1A)。
图1B证实了重组技术如何降低突变残基的数目，同时还改善了亲和性。
表1：选择策略
轮 Ag浓度(nM) 孵育(min)a 洗涤(min)b
1 10 60/30 标准
2 1 20/30 标准
3 0.1 10/20 标准+10
4 0.02 5/10/20 标准+30
5 0.004 5/10/15 标准+120
a孵育时间表示为：与生物素化CD40的孵育时间/与非生物素化CD40在第4轮和第5轮额外的孵育时间/允许在磁珠上回收噬菌体/抗原复合物的孵育时间。
b标准洗涤包括使用选择缓冲液(PBS-T/BSA)的七次洗涤，随后用PBS洗涤四次。在增加延长孵育的第3-5轮延长该方案(时间以分钟表示)。
高通量筛选(HTS)
从每轮选择中，选择约2000个克隆并在高通量分析中筛选。
高通量筛选分析设计如下：在两种不同洗涤条件下、在直接结合的ELISA中进行测量解离速率的方法。改进的解离速率与这两个测量的比增加相关。测量比相对于ELISA中的结合信号，对来自高通量分析的结果进行作图(图2)。
HTS分析基于夹心ELISA，测量大肠杆菌粗上清液中ScFv-his片段与包被在微滴定板中的CD40的结合。
用CD40mFc(Apollo#9025H)包被白色394-板平底高结合(Greiner#781074)，在室温下孵育2小时或在4℃下过夜。洗涤板(洗涤缓冲液：PBS+0.05％吐温20(PBST)，Medicago#09-9410-100，ELx405微板洗剂(BioTek)，然后在PBST+3％奶粉(Semper)中封闭。再次洗涤板，将样品或对照加入到孔中。样品在室温下孵育1小时，然后使用正常洗涤(3个洗涤循环)或苛刻洗涤(3个洗涤循环后用PBST孵育30分钟，随后3个洗涤循环)洗涤。
检测Ab，加入Penta-His-HRP(Qiagen#1014992)，随后使用SuperSignal Pico化学发光底物(Thermo#37069)使板显影，用Envision阅读器(Perkin Elmer)进行检测。
实施例2-示范性抗CD40抗体的改进亲和性
选择具有改进的CD40受体亲和性(KD)的重组抗CD40抗体。抗CD40抗体对靶标的亲和性是通过表面等离子体共振确定的，计算的动力学常数列于表1和表2中。相比原来的B44抗体，抗CD40抗体克隆的亲和性改进约100倍，表2和图3，在生理pH值和37℃。
由抗CD40抗体克隆改进的亲和性也在低pH值下观察到，见表2。表面等离子体共振用来确定在pH5.4和37℃下的动力学常数，并且与B44抗体比较。
结果表明，通过pH降低至5.4，整体亲和性只有适度影响，并且相对于B44，仍保留了亲和性的增加(虽然解离速率和结合速率单独改变)。这可能是使用本发明对局部免疫疗法的临床受益。
材料和方法
通过表面等离子体共振鉴定的动力学参数和亲和性常数的确定。
使用Biacore3000仪器，通过表面等离子体共振，根据制造商的方案进行纯化抗体亲和性的测量。
使用常规的胺偶联将CD40hfc(R&Dsystems,USA)固定于BIAcore传感器芯片CM5。以30μl/min的流速、在37℃和pH7.3下，分析本发明的抗CD40抗体(从1-0,012nM按1/3连续稀释)在HBS-P(GE,BR-1003-68)中的结合。该结合进行3分钟，解离10分钟。使用两次50mMNaOH进行再生30秒。动力学参数和亲和性常数使用BIAevaluation4.1软件计算。
可替代地，将样品在37℃下孵育在乙酸盐缓冲液pH5.4、10mM乙酸盐、150mM NaCl、0.005％T20中。
结果示于表2和表3。
结果
表2.与B44相比较，固定的CD40受体与抗CD40抗体克隆之间相互作用的动力学常数，在生理pH下由表面等离子体共振确定。
表3，与B44相比较，固定的CD40受体与抗CD40抗体克隆之间相互作用的动力学 常数，在pH＝5.4下由表面等离子体共振确定。
ka，结合速率常数；kd，解离速率常数，KD，亲和性常数
实施例3-本发明示例性抗体的表位作图和交叉反应
CD40受体由四个细胞外结构域组成，每个细胞外结构域包含两种类型的模块单元(Naismith和Sprang,1998,Trends Biochem,(23)74-79)，每个模块通过一个或两个二硫键稳定。为了分析所选择的scFv精确的特异性，每个scFv表位的位置由结构域作图确定。该scFv片段结合截短CD40构建体的能力、在转染的COS-7或L-细胞表面上表达的能力，采用FACScan分析测量(如Ellmark等人2002,Immunology所述)。本发明的示例性抗体能够结合第一个模块已被移除的构建体(D1/B2)，但不结合CD40的整个第一结构域已被移除的构建体(参见图4和表4)。
表4
G12 A4 A5 C4 B44 H11
D1 + + + + + +
D1/B2 + + + + + +
D2 - - - - - -
D2/B1 - - - - - -
D3 - - - - - -
交叉特异性
本发明的抗体克隆与来自食蟹猴、恒河猴和其它相关猕猴物种的CD40交叉反应。他们不与鼠或犬的CD40交叉反应。
实施例4-示例性抗CD40抗体上调树突细胞表面分子
CD40受体的连接诱导树突细胞的激活，这潜在地导致激活特定的抗肿瘤T细胞反应。用抗CD40抗体处理的单核细胞源的树突细胞显示上调表面分子CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表达。上调的表面分子，CD80和CD86，在T细胞激活的共同刺激中是需要的。
其它激动型CD40抗体，例如CP-870，893，对B细胞激活比对树突细胞激活具有约高20倍的效力(Gladue等人,2011,Cancer Immunol Immunother60[7]；1009-1017)。
树突细胞的激活比B细胞激活更与临床相关，并且对B细胞的作用可能导致在不激活树突细胞的治疗剂量下，产生剂量限制性毒性。因此，有利的是改进激活树突细胞的 效力，同时使激活B细胞的效力保持在同一范围内。在本发明中所述的克隆对B细胞激活的效力与对树突细胞激活的效力在相同的范围内，这可提供临床优势。
通过体外分析确定，与原始的抗CD40抗体B44相比，抗CD40抗体克隆对促进树突细胞激活的改进效力。如通过上调表面分子CD86所确定的，观察到抗CD40抗体克隆在树突细胞激活中改进的效力。
表5总结了来自这些表面标记物表达研究中的结果。
在图5A和B中，显示CD86的表达及其浓度依赖性。
材料和方法
树突细胞激活分析
树突细胞来源于外周血单核细胞。简言之，通过Ficoll梯度将外周血单核细胞(PBMC)从全血的全血血沉棕黄层中分离出来，根据生产商的说明书用CD14+MACS微珠(Miltenyi)分离CD14+单核细胞。达到约95％纯度的CD14+细胞培养在RPMI介质+10％FCS、150ng/ml GM-CSF和50ng/mL IL-4中，以1×106个细胞/ml的浓度在37℃下持续六天。培养三天后，用新鲜介质和细胞因子置换80％介质。
六天后在培养中细胞下调CD14和上调CD1a。洗涤细胞，再悬浮于具有新鲜的细胞因子和系列稀释的刺激抗体的介质中。细胞以667000个细胞/ml的浓度培养，抗体从3.3-0.013μg/ml。刺激抗体为B44和8个克隆A4、A5、B9、C4、F6、G12、H11和H12。树突细胞在37℃另外培养48小时。然后，通过FACS分析上调的激活标记物CD86、CD80和HLA-DR。
表5：本发明的克隆与B44的平均EC50以及CD86、CD80和MHC II表达增加的最大倍数。
实施例5-示例性抗CD40抗体诱导的T细胞激活的增强IFN-γ分泌
研究了抗CD40抗体克隆刺激的树突细胞引起的体外T细胞激活，并分析IFNγ的产生。
结果总结于表6中。
在同种异体T细胞和树突细胞的分析中，与B44抗体相比抗CD40抗体克隆的效力得到了改进。
材料和方法
分析树突细胞对同种异体T细胞的激活
树突细胞来源于外周血单核细胞，如树突细胞激活分析中所述。
六天后，洗涤树突细胞，再悬浮于具有新鲜细胞因子的介质中，在来自不同供体的T细胞存在下进行培养。按照制造商的说明书，使用CD3+MACS微珠(Miltenyi)从PBMC分离T细胞。
在T细胞激活分析中，树突细胞和T细胞的浓度为每个细胞类型667000个细胞/ml。此外，共培养物含有150ng/ml GM-CSF和50ng/mL的IL-4和从3.3-0.013μg/ml系列稀释的刺激抗体。刺激抗体为B44和8个克隆A4、A5、B9、C4、F6、G12、H11和H12。共培养物于37℃另外孵育72小时。然后，按照生产商的说明书通过ELISA(Biolegends)分析上清液的IFN-γ含量。
表6：与B44抗体相比，本发明的抗CD40抗体增强IFN-γ分泌
实施例6-示例性抗CD40抗体的B细胞激活的比较
激动型抗CD40抗体与B细胞上CD40的结合导致B细胞激活和增殖、表面标记物的同型(homeotypic)聚集和上调，如CD23、CD30、CD80、CD86、Fas、主要组织相容性复合物(MHC)II和可溶性细胞因子如IL-6、TNF-α和TNF-β(和Libby,2001,Cell Mol Life58(1),4-43)。
测量CD40诱导的B细胞增殖常用来评价CD40激动型抗体(Pound等人，1999,IntImmunol,(11),11-20)。
材料和方法
从全血的全血血沉棕黄层通过Ficoll梯度分离外周血单核细胞(PBMC)，根据制造商的说明书使用CD19+MACS微珠(Miltenyi)分离CD19+B细胞。达到约95％纯度的CD19+细胞(5-7.5x104/孔)培养在RPMI介质+10％FCS+10ng/ml的IL-4和系列稀释的抗体中。48-72小时后，采用Cell titer-Glo(Promega)检测代谢活性。使用Graph Pad Prism计算EC50值。
结果
表7-B细胞的激活
抗体 EC50(ug/ml)+/-SEM
B44 0.204+/-0.025561
A5 0.29+/-0.0155
B9 0.48+/-0.0528
C4 0.288+/-0.06225
F6 0.40+/-0.04415
F9 0.21+/-0.0815
H11 0.46+/-0.0953
H12 0.18+/-0.003
G12 0.098+/-0.019657
A4 0.16+/-0.02395
本发明的抗CD40抗体具有与B44类似的激活B细胞的效力(即，幅度的数量级相同)(见表7)。
实施例7-本发明的示例性抗CD40抗体结合RAMOS细胞的能力
在体外确定了本发明的抗CD40抗体结合RAMOS细胞的能力。我们进行了抗CD40抗体结合人Burkitt′s淋巴瘤细胞系RAMOS的FACS分析。计算了本发明的抗CD40抗体和原始B44抗CD40抗体的EC50值。
材料和方法
人Burkitt’s淋巴瘤细胞系RAMOS被用于结合分析(ECACC，Sigma Aldrich,USA)。分析了本发明的非缀合抗CD40抗体对RAMOS细胞的结合。
RAMOS细胞(约125,000个细胞)与抗CD40抗体在4℃下孵育30分钟，所述抗CD40抗体从30-0.0015μg/ml以1/3系列稀释。将细胞用FACS缓冲液洗涤两次，随后向 细胞中加入第二抗体抗人Ig兔的F(ab')2/FITC(DAKO,Glostrup,丹麦)，在4℃下另外持续30分钟。洗涤细胞并在FACScalibur仪器上按照制造商的说明书(Becton Dickinson,USA)分析细胞，然后确定平均荧光强度(“MFI”)。
结果
结果示于表8。
示例性抗CD40抗体克隆比B44抗体具有增加约100倍的效力。
表8：抗体克隆对RAMOS细胞的结合
抗CD40抗体 EC50(μg/ml)
A4 7.0x10-3
A5 6.2x10-3
B9 4.9x10-3
C4 6.1x10-3
F6 5.8x10-3
G12 6.7x10-3
H11 4.4x10-3
H12 8.9x10-3
B44 0.38
实施例8-在体内小鼠肿瘤模型中示例性抗体的作用
在不存在和存在T细胞和树突细胞的NSG小鼠模型中，对本发明的示例性抗CD40抗体的抗肿瘤活性进行了研究。
(A)在不存在T细胞和树突细胞时使用CD40阳性肿瘤的研究
材料与方法
我们从Jackson获得雌性NSG小鼠(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm/Wjl/SzJ(NSG))，在处理前允许它们适应新环境。皮下注射膀胱癌细胞(EJ细胞，3×106个细胞/鼠)。G12或同位素对照在第0天、第7天和第14天以1.2mg/kg(30μg)的剂量肿瘤内注射。在第0、7、10、14、17、21、23和27天测量肿瘤体积。在第28天切除肿瘤，并称重。
结果
结果示于图6和7。
(B)在T细胞和树突细胞存在时使用CD40阳性肿瘤的研究
材料与方法
我们从Jackson获得雌性NSG小鼠(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm/Wjl/SzJ(NSG))，在处理前允许它们适应新环境。皮下注射膀胱癌细胞(EJ细胞，2.5×106个细胞/鼠)与DC(1×105)和获自同一供体的T细胞(5×105)。从单核细胞制备树突细胞(如上所述)。每个处理组由10只小鼠(n10)组成，其中来自两个供体的T细胞和DC以5只小鼠/供体使用(见表9)。
表9
G12或PBS对照在第0天、第7天和第14天以1.2mg/kg(30μg)的剂量肿瘤内注射。在第0、7、10、14、17、21、23和27测量肿瘤体积。在第28天切除肿瘤，并称重。
结果
其结果示于图8和9。
实施例9-从细胞凋亡挽救细胞的能力
在体外进行了抗CD40抗体挽救表达人CD40的细胞免受细胞凋亡和生长停滞的能力。通过加入抗IgM抗体在转染的WEHI-231细胞中诱导细胞凋亡和生长停滞。通过加入抗CD40抗体挽救细胞。随后，确定细胞增殖的能力。
观察到抗CD40抗体克隆相对于B44抗体的高达40倍的改进效力，见表9。
材料和方法
从细胞凋亡的挽救：
用人CD40、huCD40/WEHI-231转染的稳定细胞系，并用于研究从细胞凋亡和生长停滞中的挽救(Ellmark等人,2003,Immunology,108,452-7)。在存在或不存在抗小鼠IgM(Jackson Immunoresearch,USA)、和从25-0.0001μg/ml以1/3系列稀释的本发明的抗CD40抗体时，在96孔板(2×104细胞/孔)培养细胞huCD40/WEHI-231持续72小时。加入Celltiter-Glo，并将混合物在室温温育30分钟(Promega,USA)。通过测量ATP释放分析细胞增殖。在FluoSTAR OPTIMA中测量发光信号，对信号进行归一化(BMG,德国)。
表10：抗体克隆从细胞凋亡和生长停滞中挽救细胞的能力
抗CD40抗体克隆 相对于B44抗体效力变化的倍数
G12 19
A4 46
A5 19
B9 38
C4 52
实施例10：序列信息汇总
对于下文所述的每种抗体，表示了VL氨基酸位置1-112和VH氨基酸位置1-119，以及相应的核苷酸序列。在氨基酸序列中CDR以下划线表示-在VL氨基酸序列中，CDR被发现在氨基酸位置23-40(CDR1)、位置52-58(CDR2)和90-101(CDR3)；在VH氨基酸序列中，CDR被发现在氨基酸位置26-35(CDR1)、位置42-67(CDR2)和97-108(CDR3)。
抗体B44
可变轻链(VL)氨基酸序列-SEQ ID NO：58
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVYWYQQLPGTAPKLLIYGNINRPSG
VPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLSGLVFGGGTKLTVLG
可变轻链(VL)核苷酸序列-SEQ ID NO：59
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CCATCTCTTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATAATGTATACTGG
TATCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACATCAATCG
GCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCC
CTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATG
GGATGACAGCCTGAGTGGTCTGGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTA
GGT
可变重链(VH)氨基酸序列-SEQ ID NO：60
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VSS
可变重链(VH)核苷酸序列-SEQ ID NO：61
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AGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTACTTATGGCATGCACTGGGT
CCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGCTTTCATATATTAGTGGTGGTAGT
AGTTACATTTTCTACGCAGACTCAGTGAGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAA
CTCCGAGAACGCGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCC
GTGTATTACTGTGCGAGAATATTAAGAGGCGGGAGCGGTATGGACCTCTGGGGCC
AAGGTACACTGGTCAC CGTGAGCTCA
抗体克隆A4
可变轻链(VL)氨基酸序列-SEQ ID NO：19
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSTSNIGAGYKVYVVYQQLPGTAPKLLIYGNINRPSG
VPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLSGLVFGGGTKLTVLG
可变轻链(VL)核苷酸序列-SEQ ID NO：40
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCA
CCATCTCTTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATAATGTATACTGG
TATCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACATCAATCG
GCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCC
CTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATG
GGATGACAGCCTGAGTGGTCTGGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTA
GGT
可变重链(VH)氨基酸序列-SEQ ID NO：31
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VSS
可变重链(VH)核苷酸序列-SEQ ID NO：49
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTG
AGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTACTTATGGCATGCACTGGGT
CCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGCTTTCATATATTAGTGGTGGTAGT
AGTTACATTTTCTACGCAGACTCAGTGAGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAA
CTCCGAGAACGCGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCC
GTGTATTACTGTGCGAGAATATTAAGAGGCGGGAGCGGTATGGACCTCTGGGGCC
AAGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA
CDR氨基酸序列
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CDR2:GNINRPS[SEQ ID NO:10]
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抗体克隆A5
可变轻链(VL)氨基酸序列-SEQ ID NO：20
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VPDRFSGSKSGTSGSLAISGLRSEDEADYYCAAWDSSSSGLVFGGGTKLTVLG
可变轻链(VL)核苷酸序列-SEQ ID NO：41
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TATCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACATCAATCG
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CTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATG
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GGT
可变重链(VH)氨基酸序列-SEQ ID NO：32
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可变重链(VH)核苷酸序列-SEQ ID NO：50
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CCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGCTTTCATATATTAGTGGTGGTAGT
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CTCCGAGAACGCGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCC
GTGTATTACTGTGCGAGAATATTAAGAGGCGGGAGCGGTATGGACCTCTGGGGCC
AAGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA
CDR氨基酸序列
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CDR2:GNINRPS[SEQ ID NO:10]
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抗体克隆C4
可变轻链(VL)氨基酸序列-SEQ ID NO：21
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSTSNIGAGYKVYWYQQLPGTAPKLLIYGNINRPSG
VPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLSGLVFGGGTKLTVLG
可变轻链(VL)核苷酸序列-SEQ ID NO：48
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CTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATG
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GGT
可变重链(VH)氨基酸序列-SEQ ID NO：33
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可变重链(VH)核苷酸序列-SEQ ID NO：51
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AAGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA
CDR氨基酸序列
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抗体克隆G4
可变轻链(VL)氨基酸序列-SEQ ID NO：22
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可变轻链(VL)核苷酸序列-SEQ ID NO：42
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCA
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GGT
可变重链(VH)氨基酸序列-SEQ ID NO：34
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VSS
可变重链(VH)核苷酸序列-SEQ ID NO：52
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTG
AGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTACTTATGGCATGCACTGGGT
CCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGCTTTCATATATTAGTGGTGGTAGT
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CTCCGAGAACGCGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCC
GTGTATTACTGTGCGAGAATATTAAGAGGCGGGAGCGGTATGGACCTCTGGGGCC
AAGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA
CDR氨基酸序列
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抗体克隆F6
可变轻链(VL)氨基酸序列-SEQ ID NO：23
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVYVVYQQLPGTAPKLLIYRNINRPSG
VPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDGSLLGLVFGGGTKLTVLG
可变轻链(VL)核苷酸序列-SEQ ID NO：43
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCA
CCATCTCTTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTATACTGG
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CTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATG
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GGT
可变重链(VH)氨基酸序列-SEQ ID NO：35
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWLSYISGGSSYI
FYADSVRGRFTISRDNSENALYLQMNSLRAEDTAVYYCARILRGGSGMDLWGQGTLVT
VSS
可变重链(VH)核苷酸序列-SEQ ID NO：53
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTG
AGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTACTTATGGCATGCACTGGTT
CGCCAGGCTCCAGGGAAGGGG CTGGAGTGGCTTTCATATATTAGTGGTGGTAGTA
GTTACATTTTCTACGCAGACTCAGTGAGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAAC
TCCGAGAACGCGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCG
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GGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA
CDR氨基酸序列
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抗体克隆F9
可变轻链(VL)氨基酸序列-SEQ ID NO：24
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VPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDGTLTGLLFGGGTKLTVLG
可变轻链(VL)核苷酸序列-SEQ ID NO：44
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GGT
可变重链(VH)氨基酸序列-SEQ ID NO：36
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYGMHVVVRQAPGKGLEWLSYISGGSSYI
FYADSVRGRFTISRDNSENALYLQMNSLRAEDTAVYYCARILRGGSGMDLWGQGTLVT
VSS
可变重链(VH)核苷酸序列-SEQ ID NO：54
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTG
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AAGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA
CDR氨基酸序列
VLCDRs:CDR1:CTGSSSNIGAGYGVY[SEQ ID NO:8]
CDR2:GNINRPS[SEQ ID NO:10]
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抗体克隆G12
可变轻链(VL)氨基酸序列-SEQ ID NO：25
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGAGYNVYWYQQLPGTAPKLLIYGNINRPSG
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可变轻链(VL)核苷酸序列-SEQ ID NO：45
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCA
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GT
可变重链(VH)氨基酸序列-SEQ ID NO：37
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWLSYISGGSSYI
FYADSVRGRFTISRDNSENALYLQMNSLRAEDTAVYYCARILRGGSGMDLWGQGTLVT
VSS
可变重链(VH)核苷酸序列-SEQ ID NO：55
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTG
AGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTACTTATGGCATGCACTGGGT
CCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGCTTTCATATATTAGTGGTGGTAGT
AGTTACATTTTCTACGCAGACTCAGTGAGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAA
CTCCGAGAACGCGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCC
GTGTATTACTGTGCGAGAATATTAAGAGGCGGGAGCGGTATGGACCTCTGGGGCC
AAGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA
CDR氨基酸序列
VLCDRs:CDR1:CTGSSSNIGAGYNVY[SEQ ID NO:9]
CDR2:GNINRPS[SEQ ID NO:10]
CDR3:CAAWDKSISGLV[SEQ ID NO:17]
VHCDRs:CDR1:GFTFSTYGMH[SEQ ID NO:28]
CDR2:GKGLEVVLSYISGGSSYIFYADSVRGR[SEQ ID NO:29]
CDR3:CARILRGGSGMDL[SEQ ID NO:30]
抗体克隆H12
可变轻链(VL)氨基酸序列-SEQ ID NO：26
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGAGYNVYWYQQLPGTAPKLLIYGNINRPSG
VPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLSGLVFGGGTKLTVLG
可变轻链(VL)核苷酸序列-SEQ ID NO：46
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCA
CCATCTCTTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATAATGTATACTGG
TATCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACATCAATCG
GCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCC
CTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATG
GGATGACAGCCTGAGTGGTCTGGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTA
GGTGAGTAGAACGTACGCTAGCAAGCTTGGATCCACGATCCTGAGCAAGGACCTCT
GCCCTCCCTGTTCAGACCCTTGCTTGCCTCAGCAGGTCATTACAACCACTTCACCTC
TGACCGCAGGGGCAGGGGACTAGATAGAATGACCTACTGAGCCTCGTCTGTCTGT
CTGTCTGTCTCTCTGTTTGTCTGTCTGTCTCTCTGTTTGTCTCTCTGTCTGTCTGACA
GGCGCAGGCTGGGTCTCTAAGCCTTGTTCTGTTCTGGCCTC CTCAGTCTGGGTTCT
TGTC GGAACAGCTTTGCCCTTGGGTTACCTGGGTTCCATCTCCTGGGGAATTGGGA
ACAAGGGGTCTGAGGGAGGCACCTCCTGGGAGACTTTAGAAGGACCCAGTGCCCT
CGGGGCTGATGCTCGGGA
可变重链(VH)氨基酸序列-SEQ ID NO：38
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWLSYISGGSSYI
FYADSVRGRFTISRDNSENALYLQMNSLRAEDTAVYYCARILRGGSGMDLWGQGTLVT
VSS
可变重链(VH)核苷酸序列-SEQ ID NO：56
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTG
AGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTACTTATGGCATGCACTGGGT
CCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGCTTTCATATATTAGTGGTGGTAGT
AGTTACATTTTCTACGCAGACTCAGTGAGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAA
CTCCGAGAACGCGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCC
GTGTATTACTGTGCGAGAATATTAAGAGGCGGGAGCGGTATGGACCTCTGGGGCC
AAGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCAGGTGAGTCGTACGCTAGCAAGCTTTCTGGG
GCAGGCCAGGCCTGACCTTGGCTTTGGGGCAGGGAGGGGGCTAAGGTGAGGCAG
GTGGCGCCAGCCAGGTGCACACCCAATGCCCATGAGCCCAGACACTGGACGCTGA
ACCTCGCGGACAGTTAAGAACCCAGGGGCCTCTGCGCCCTGGGCCCAGCTCTGTC
CCACACCGCGGTCACATGGCACCACCTCTCTTGCAGCCTCCACCAAGGGCCCATC
GGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTG
GGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAG
GCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCACGACT
CTA
CDR氨基酸序列
VLCDRs:CDR1:CTGSSSNIGAGYNVY[SEQ ID NO:9]
CDR2:GNINRPS[SEQ ID NO:10]
CDR3:CAAWDDSLSGLV[SEQ ID NO:12]
VHCDRs:CDR1:GFTFSTYGMH[SEQ ID NO:28]
CDR2:GKGLEWLSYISGGSSYIFYADSVRGR[SEQ ID NO:29]
CDR3:CARILRGGSGMDL[SEQ ID NO:30]
抗体克隆B9和H11
可变轻链(VL)氨基酸序列-SEQ ID NO：27
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGAGYNVYVVYQQLPGTAPKLLIYGNINRPSG
VPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDGGLLGLVFGGGTKLTVLG
可变轻链(VL)核苷酸序列-SEQ ID NO：47
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCA
CCATCTCTTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATAATGTATACTGG
TATCAGCAGCTCCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACATCAATCG
GCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCC
CTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATG
GGATGGCGGCCTGCTGGGTCTGGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTA
GGT
可变重链(VH)氨基酸序列-SEQ ID NO：39
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWLSYISGGSSYI
FYADSVRGRFTISRDNSENALYLQMNSLRAEDTAVYYCARILRGGSGMDLWGQGTLVT
VSS
可变重链(VH)核苷酸序列-SEQ ID NO：57
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTG
AGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTACTTATGGCATGCACTGGGT
CCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGCTTTCATATATTAGTGGTGGTAGT
AGTTACATTTTCTACGCAGACTCAGTGAGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAA
CTCCGAGAACGCGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCC
GTGTATTACTGTGCGAGAATATTAAGAGGCGGGAGCGGTATGGACCTCTGGGGCC
AAGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCAGGTGAGTCGTACGCTAGCAAGCTTTCTGGG
GCAGGCCAGGCCTGACCTTGGCTTTGGGGCAGG
CDR氨基酸序列
VLCDRs:CDR1:CTGSSSNIGAGYNVY[SEQ ID NO:9]
CDR2:GNINRPS[SEQ ID NO:10]
CDR3:CAAWDGGLLGLV[SEQ ID NO:18]
VHCDRS:CDR1:GFTFSTYGMH[SEQ ID NO:28]
CDR2:GKGLEWLSYISGGSSYIFYADSVRGR[SEQ ID NO:29]
CDR3:CARILRGGSGMDL[SEQ ID NO:30]
本发明示例性抗体的恒定区
>sp|P01857|IGHG1_HUMAN Igγ-1重链C区OS＝人GN＝IGHG1PE＝1SV＝1
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ
SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEL
LGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR
EEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL
PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL
TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[SEQ ID NO：62]>gi|186127|ｇｂ|AAA59107.1|免疫球蛋白λ轻链C2区[人]
QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSK
QSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
[SEQ ID NO：63]
重链可变区中的示例性框突变(VH)
突变用粗体下划线如下表示。
可变重链(VH)氨基酸序列[SEQ ID NO：64]
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWLSYISGGSSYI
FYADSVRGRFTISRDNSENTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARILRGGSGMDLWGQGTLVT
VSS
可变重链(VH)核苷酸序列[SEQ ID NO：65]
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTG
AGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTACTTATGGCATGCACTGGGT
CCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGCTTTCATATATTAGTGGTGGTAGT
AGTTACATTTTCTACGCAGACTCAGTGAGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAA
CTCCGAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACAC GGCC
GTGTATTACTGTGCGAGAATATTAAGAGGCGGGAGCGGTATGGACCTCTGGGGCC
AAGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA
可变重链(VH)氨基酸序列[SEQ ID NO：66]
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWLSYISGGSSYI
FYADSVRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARILRGGSGMDLWGQGTLVT
VSS
可变重链(VH)核苷酸序列[SEQ ID NO：67]
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTG
AGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTACTTATGGCATGCACTGGGT
CCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGCTTTCATATATrAGTGGTGGTAGT
AGTTACATTrTCTACGCAGACTCAGTGAGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAA
CTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCC
GTGTATTACTGTGCGAGAATATTAAGAGGCGGGAGCGGTATGGACCTCTGGGGCC
AAGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA
表11
相对于抗体B44，抗体克隆的氨基酸改变和在VL中的位置
抗体克隆 氨基酸改变 氨基酸改变 氨基酸改变 氨基酸改变 氨基酸改变
A4 S26T D34K
A5 D34H N53S A73G D95S L97S
G4 D34K D95E L97I S98T
F6 G52R D95G S98L
F9 D34G D95G S96T S98T V101L
G12 D34N D95K L97I
H12 D34N
B9 D34N D95G S96G S98L
C4 S26T D34K
H11 D34N D95G S96G S98L
表12
相对于抗体B44，抗体克隆的氨基酸改变和在VH中的位置
抗体克隆 氨基酸改变
A4
A5
G4
F6
F9
G12
H12
B9
C4 S63T
H11
实施例11：示例性的药物制剂
尽管本发明的抗体有可能单独施用，优选将其作为药物或药物制剂、与一种或多种可接受的载体一起施用。载体必须是“可接受的”，即与本发明的药剂相容，且对于其接受者无害。通常，载体是无菌并且无热源的水或盐水。
以下例子说明了根据本发明的药物和药物组合物，其中活性成分是本发明的抗体。
例A：片剂
片剂从上述成份通过湿法制粒随后压缩制备。
例B：滴眼液
例C：片剂制剂
通过成分与聚乙烯吡咯烷酮溶液的湿法制粒，然后加入硬脂酸镁并压制而制备下面的制剂A和B。
制剂A
制剂B
制剂C
下面的制剂D和E，通过混合成分的直接压缩制得。制剂E中使用的乳糖是方向压制类型。
制剂D
制剂E
制剂F(控释制剂)
该制剂由成分(如下)与聚乙烯吡咯烷酮溶液湿法制粒，随后加入硬脂酸镁并压制而制备。
药物释放发生约6-8小时的期间，并在12小时后完成。
例D：胶囊制剂
制剂A
胶囊制剂通过混合上述例C中制剂D的成份、并填充到两部分的硬明胶胶囊制备而成。制剂B(如下)以类似的方式制备。
制剂B
制剂C
胶囊是通过熔融聚乙二醇4000BP、将活性组分分散在熔体(melt)中、并将熔体填充至两部分的硬明胶胶囊中而制备。
胶囊通过活性成分分散在卵磷脂和花生油中、并将分散体系填充到软的弹性明胶胶 囊中而制备。
制剂E(控释胶囊)
下面的控释胶囊制剂通过使用挤出机挤出组分a、b和c、随后将挤出物滚圆(spheronisation)并干燥而制备。然后将干燥的粒包被上释放控制膜(d)、并填充到两片的硬明胶胶囊中。
例E：注射制剂
活性成分 1mg
无菌、无热源的磷酸盐缓冲液(pH7.0) 至10ml
将活性成分溶解在大部分磷酸盐缓冲液(35-40℃)中，然后补足体积，通过无菌微孔过滤器过滤到10ml无菌琥珀色玻璃小瓶(类型1)中，用无菌塞封闭并密封。
例F：肌内注射
将活性成分溶解在葡萄糖糠醛中。然后加入苯甲醇并溶解，加水至3ml。然后将混合物通过无菌微孔过滤器过滤，并在无菌3ml玻璃小瓶中(类型1)密封。
例G：糖浆悬液
将苯甲酸钠溶解在纯水的一部分，加入山梨醇溶液。将活性成分加入并分散。在甘油中分散增稠剂(可分散的纤维素)。两种分散体系混合，用纯水配制到所需体积。根据需要通过悬液额外的剪切实现进一步的增稠。
例H：栓剂
*将活性成分作为粉末，其中至少90％的颗粒是直径63μm或更小。
Witepsol H15的五分之一在最高45℃下的蒸汽夹套锅中熔融。将活性成分通过200μm的筛子筛分并使用配有切头的silverson(无对应中译文)混合加入到熔融基体中，直到获得均匀分散体系为止。在45℃保持混合物，将剩下的Witepsol H15加入到悬液中并搅拌以确保均匀地混合。整个悬液通过250μm的不锈钢筛，并在连续搅拌下，冷却至40℃。在38℃到40℃的温度下将2.02g混合物装入合适的塑料模具。将栓剂冷却到室温。
例I：阴道栓剂
将上述成分直接混合，通过直接压制得到的混合物制备阴道栓剂。
实施例12：在体内小鼠肿瘤模型中示例性抗体的作用
在接种膀胱癌细胞的人CD40转基因小鼠中研究了本发明抗CD40抗体的抗肿瘤活性。MB49膀胱癌细胞皮下接种到人CD40的转基因小鼠。在第7天及第10天用G12或对照肿瘤旁处理小鼠。用G12处理产生了与同种型对照相比显著的抗肿瘤效果。
参照抗体S2C6是一种嵌合的抗CD40抗体，其含有分别融合至人γ1和κ恒定区的鼠可变结构域VH和VL(欧洲专利号EP1885399，Francisco等人.,2000Cancer Research)。因而，该抗体是人源化抗CD40抗体SGN-40的类似物(Law等人,2005Cancer Research)。SGN-40已经在临床试验中研究了(Advani等人,2009J Clinical Oncology；Hussein等人,2010Haematologica)。
材料和方法
MB49细胞系是来自C57BL/6雄性小鼠的致癌物诱导的移行细胞癌(Summerhayes&Franks,1979,Journal of the National Cancer Institute)。MB49表达鼠CD40，但不表达人CD40。G12不与鼠CD40交叉反应，不能结合MB49肿瘤细胞。
2.5×105个膀胱癌MB49细胞在第0天皮下接种到人CD40转基因的C57BL/6雌性小鼠的腹侧。人CD40转基因小鼠在小鼠CD40缺陷(mCD40-/-)的背景下表达人野生型CD40。在第7天开始，在第7天和第10天(2个剂量)通过皮下肿瘤的肿瘤旁注射抗体进行处理。肿瘤体积用卡尺测量2次/周，由椭圆体积公式计算肿瘤体积。如果肿瘤超过1cm3或者如果发生溃疡，则处死小鼠。各处理后4小时取血清样品。使用Mesoscale发现平台(MSD,盖瑟斯堡,MD,USA)、在小鼠促炎7-Plex超灵敏试剂盒中分析血清样品中细胞因子水平。使用夹心ELISA测量血清中的抗体滴度。MB49细胞系是来自C57BL/6雄性小鼠的致癌物诱导的移行细胞癌(Summerhayes&Franks,1979,Journal of the National Cancer Institute)。MB49表达鼠CD40，但不表达人CD40。G12不与鼠CD40交叉反应，不能结合MB49肿瘤细胞。
结果
结果示于图10。
用G12处理比同种型对照显著增加动物的生存(p<0.013)。与S2C6相比，G12处理的小鼠的生存曲线(p<0.13)。与同种型对照相比，S2C6处理的小鼠的生存(p<0.088)。
实施例13：在体内小鼠肿瘤模型中示例性抗体的作用
使用来自一个更大组的处理动物的汇总数据，研究了抗CD40抗体、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和角质形成细胞衍生的细胞因子(KC)(也被称为趋化因子(C-X-C基序)配体1/CXCL1)的抗肿瘤活性。G12处理组包含20只动物的组，S2C6处理组包含12只动物，同种型对照组包含20只动物。
MB49膀胱癌细胞皮下接种到人CD40转基因小鼠。在第7天及第10天，用G12或对照肿瘤旁处理小鼠。与同种型对照处理组相比，用G12处理提供了荷瘤小鼠生存的显著增加(图11)。
血清样品取自处理的小鼠，并分析细胞因子水平。处理后的细胞因子水平显示，与参照抗体S2C6相比，G12更强地诱导免疫反应(图12)。
材料和方法
2.5×105个膀胱癌MB49细胞在第0天皮下接种在人CD40转基因的雌性C57BL/6小鼠的侧腹。人CD40转基因小鼠在小鼠CD40缺陷(mCD40-/-)的背景下表达人野生型CD40。在第7天开始，在第7天和第10天(2个剂量)通过皮下肿瘤的肿瘤旁注射抗体进行处理。肿瘤体积用卡尺测量2次/周，由椭圆体积公式计算肿瘤体积。如果肿瘤超过1cm3或者如果发生溃疡，则处死小鼠。血清样品取自各处理后4小时。使用Mesoscale发现平台(MSD,盖瑟斯堡,MD,USA)、在小鼠促炎7-Plex超灵敏试剂盒中分析血清样品中细胞因子水平。使用GraphPad Prism6.0进行统计分析(GraphPad Software,Inc.La Jolla,CA)。
结果
其结果示于图11和12。
实施例14：体内抗体水平的分析
分析经处理的小鼠的血清中抗体水平。第一(第7天)和第二次处理(第10天)后取血清样品。与参照抗体相比，抗CD40抗体克隆的抗体滴度显著较低。数据显示在图13中。
材料与方法
第一(第7天)和第二次处理(第10天)后4小时，从实施例I所述实验中取血清样品，分析血清样品的抗体水平。用夹心ELISA测量血清中的抗体滴度。
G12处理组包括23只小鼠(N＝23)，S2C6参照抗体处理组包括23只小鼠(N＝23)和同种型对照的处理组包括18只小鼠(N＝18)。
结果
结果示图13。
参考文献
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Claims (72)

1.一种对CD40具有多价结合特异性的抗体或其抗原结合片段，其中
所述抗体或其抗原结合片段对树突细胞激活的效力高于、或等于其对B细胞激活的效力，以及
其中所述抗体或其抗原结合片段对CD40的亲和性KD小于1x10-10M，
其中所述抗体或其抗原结合片段能够结合CD40的第一结构域，以及
其中所述抗体或其抗原结合片段包含以下CDR：
(i)SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30；或
(ii)SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30；或
(iii)SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30；或
(iv)SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30；或
(v)SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30；或
(vi)SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30；或
(vii)SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30；或
(viii)SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够对CD40+肿瘤细胞发挥双重细胞毒性作用。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够对肿瘤细胞具有直接的细胞凋亡作用和对肿瘤细胞具有间接的免疫细胞介导的细胞毒性作用。
4.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段相对于B细胞的激活，对树突细胞的激活具有高至少2倍的效力。
5.根据权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段相对于B细胞的激活，对树突细胞的激活具有高至少5倍的树突细胞激活效力。
6.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段具有比B44抗体高的对树突细胞的激活效力。
7.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段对树突细胞激活的效力是至少0.5μg/ml，其中所述对树突细胞激活的效力测定为EC50。
8.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段相对于B44抗体，对CD40具有改进的结合特异性。
9.根据权利要求8所述的抗体或其抗原结合片段，其中改进的结合特异性是对CD40较高的亲和性KD，亲和性小于1.0x10-10M。
10.根据权利要求8所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述改进的结合特异性是对CD40较高的亲和性KD，KD小于3.0x10-11M。
11.根据权利要求8所述的抗体或其抗原结合片段，其中改进的结合特异性是与B44抗体相比对CD40较高的结合速率ka。
12.根据权利要求8所述的抗体或其抗原结合片段，其中改进的结合特异性是与B44抗体相比对CD40较高的结合速率ka，结合速率ka大于2.7x106Ms。
13.根据权利要求8所述的抗体或其抗原结合片段，其中改进的结合特异性是与B44抗体相比对CD40较高的结合速率ka，结合速率ka大于9.0x106Ms。
14.根据权利要求8所述的抗体或其抗原结合片段，其中改进的结合特异性是与B44抗体相比对CD40较低的解离速率kd。
15.根据权利要求8所述的抗体或其抗原结合片段，其中改进的结合特异性是与B44抗体相比对CD40较低的解离速率kd，其中所述解离速率kd低于4.5x10-3s。
16.根据权利要求8所述的抗体或其抗原结合片段，其中改进的结合特异性是与B44抗体相比对CD40较低的解离速率kd，其中所述解离速率kd低于2.0x10-4s。
17.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段对CD40的亲和性KD在1.0x10-10M至1x10-11M的范围内，对CD40的结合速率ka在2.7x106至1x107Ms的范围内。
18.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中CD40位于细胞表面。
19.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含或由完整的抗体组成。
20.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含或由抗原结合片段组成，所述抗原结合片段选自：Fv片段和Fab样片段。
21.根据权利要求20所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含或由选自以下的抗原结合片段组成：单链Fv片段、二硫键连的Fv片段、Fab片段、Fab’片段和F(ab)2片段。
22.根据权利要求20所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包含scFv。
23.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是重组分子。
24.根据权利要求19所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是单克隆抗体。
25.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体、其抗原结合片段是人或人源化的。
26.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含可变轻链，所述可变轻链包含选自以下的氨基酸序列：
SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:22；
SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:26；和
SEQ ID NO:27。
27.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含可变重链，所述可变重链包含选自以下的氨基酸序列：
SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:34；
SEQ ID NO:35；SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:37；SEQ ID NO:38；和
SEQ ID NO:39。
28.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含可变轻链和可变重链，所述可变轻链和可变重链包含以下氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：31；或
(ii)SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：32；或
(iii)SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：33；或
(iv)SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：34；或
(v)SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：35；或
(vi)SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：36；或
(vii)SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：37；或
(viii)SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：38；或
(ix)SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：39。
29.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段结合CD40第一结构域内的表位。
30.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含抗体Fc区。
31.根据权利要求30所述的抗体或其抗原结合片段，其中Fc区来自IgG1抗体。
32.根据权利要求30所述的抗体或其抗原结合片段，其中Fc区包含或由SEQ ID NO：62的氨基酸序列组成。
33.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其是IgG分子、或者是IgG分子的抗原结合片段、变体、融合体或衍生物。
34.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其进一步包含细胞毒性半簇。
35.根据权利要求34所述的抗体或其抗原结合片段，其中细胞毒性半簇是直接和/或间接细胞毒性的。
36.根据权利要求34所述的抗体或其抗原结合片段，其中细胞毒性半簇在细胞内时是细胞毒性的，和/或其在细胞外时是没有细胞毒性的。
37.根据权利要求34所述的抗体或其抗原结合片段，其中细胞毒性半簇是直接细胞毒性的化疗剂或直接细胞毒性的多肽。
38.根据权利要求34所述的抗体或其抗原结合片段，其中细胞毒性半簇能够将无细胞毒性的前药转换成细胞毒性药物。
39.根据权利要求34所述的抗体或其抗原结合片段，其中细胞毒性半簇是放射增敏剂。
40.根据权利要求34所述的抗体或其抗原结合片段，其中细胞毒性半簇是能够将无细胞毒性的前药转换成细胞毒性药物的核酸分子。
41.根据权利要求34所述的抗体或其抗原结合片段，其中细胞毒性半簇是直接细胞毒性的核酸分子。
42.根据权利要求34所述的抗体或其抗原结合片段，其中细胞毒性半簇是编码直接细胞毒性多肽和/或间接细胞毒性多肽和/或治疗多肽的核酸分子。
43.根据权利要求34所述的抗体或其抗原结合片段，其中细胞毒性半簇包含放射性原子。
44.根据权利要求34所述的抗体或其抗原结合片段，其中细胞毒性半簇包含选自以下的放射性原子：磷-32；碘-125；碘-131；铟-111；铼-186；铼-188；钇-90。
45.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其进一步包括容易检测的半簇。
46.根据权利要求45所述的抗体或其抗原结合片段，其中容易检测的半簇包含放射性原子。
47.根据权利要求45所述的抗体或其抗原结合片段，其中容易检测的半簇选自：锝-99m、碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰、铁。
48.一种核酸分子，其编码权利要求1至47任一项所定义的抗体或其抗原结合片段，或其多肽链组分。
49.根据权利要求48所述的核酸分子，其包含选自以下的一个或多个核苷酸序列：SEQID NO：40；SEQ ID NO：41；SEQ ID NO：42；SEQ ID NO：43；SEQ ID NO：44；SEQ ID NO：45；SEQID NO：46；SEQ ID NO：47；SEQ ID NO：48；SEQ ID NO：49；SEQ ID NO：50；SEQ ID NO：51；SEQID NO：52；SEQ ID NO：53；SEQ ID NO：54；SEQ ID NO：55；SEQ ID NO：56；和SEQ ID NO：57。
50.根据权利要求49所述的核酸分子，其包含以下的核苷酸序列：
(i)SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:49；或
(ii)SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:50；或
(iii)SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:52；或
(iv)SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:53；或
(v)SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:54；或
(vi)SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:55；或
(vii)SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:56；或
(viii)SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:57；或
(ix)SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:51。
51.一种载体，其包含权利要求48所定义的核酸分子。
52.根据权利要求51所述的载体，其中所述载体是表达载体。
53.一种重组宿主细胞，其包含权利要求48所定义的核酸分子。
54.根据权利要求53所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌细胞。
55.根据权利要求53所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
56.根据权利要求53所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是人细胞。
57.一种重组宿主细胞，其包含权利要求51所述的载体。
58.根据权利要求57所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌细胞。
59.根据权利要求57所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
60.根据权利要求57所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是人细胞。
61.一种药物组合物，其包含：
有效量的权利要求1至47任一项所定义的抗体或其抗原结合片段，以及
药学上可接受的缓冲液、赋形剂、稀释剂或载体。
62.根据权利要求61所述的药物组合物，其适于胃肠外施用。
63.根据权利要求61所述的药物组合物，其适于在或接近肿瘤部位局部施用。
64.一种试剂盒，其包含权利要求61所述的药物组合物。
65.权利要求1至47任一项所定义的抗体或其抗原结合片段在制备药物中的用途。
66.权利要求1至47任一项所定义的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
67.根据权利要求66所述的用途，其中癌症的治疗包括步骤：向有其需要的个体施用有效量的抗体或其抗原结合片段。
68.根据权利要求66所述的用途，其中所述药物用于胃肠外施用。
69.根据权利要求66所述的用途，其中所述药物用于在或接近肿瘤部位局部施用。
70.根据权利要求67所述的用途，其中向有其需要的个体施用的步骤包括局部施用。
71.根据权利要求66所述的用途，其中所述癌症选自：前列腺癌、乳癌、结肠直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌、子宫颈癌、横纹肌肉瘤、神经母细胞瘤、多发性骨髓瘤、白血病、急性淋巴细胞白血病、黑色素瘤、膀胱癌和成胶质细胞瘤。
72.一种产生权利要求1至47任一项所述的抗体或抗原结合片段的方法，所述方法包括在允许所编码的抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养宿主细胞，
其中所述宿主细胞包含核酸分子，
所述核酸分子编码权利要求1至47任一项所述抗体或抗原结合片段或其肽链组分。
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