JP2014531201A - 抗ｃｄ４０抗体、使用、および方法 - Google Patents

抗ｃｄ４０抗体、使用、および方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、CD40に対する多価の結合特異性を伴う抗体(ならびにその断片、変異体、融合体、および誘導体)であって、樹状細胞を活性化する効力が、B細胞を活性化する効力より大きいかまたはこれと同等であり、CD40に対するアフィニティー(KD)が、1?10-10M未満であり、がんなどの疾患の処置において有用な抗体に関する。本発明はまた、このような抗体を含む医薬組成物、使用、方法、およびキットにも関する。

Description

本発明は、CD40に対する結合特異性を伴う抗体ベースのポリペプチドであって、がんなどの疾患の処置において有用なアフィニティーの改善および/またはアゴニスト効力を呈示するポリペプチドに関する。本発明はまた、このような抗体を含む医薬組成物、使用、方法、およびキットにも関する。
導入
がんは、先進国における死亡のうちの30%超を占める。特定の腫瘍(ホジキン病、一部のリンパ腫/白血病、限局性皮膚がん)の処置においては大きな進歩が達成されているが、手術、化学療法、および放射線療法など、従来の治療は、播種性充実性腫瘍を治癒させるのには有効でないことが多い。
がんの免疫療法(生物学的療法と同義)は、播種性の転移性腫瘍を含めた複数の異なる種類のがんの処置に極めて有望である(Staggら、2007、Immunol Rev. 220: 82〜101頁; Melief、2008、Immunity、29: 372〜383頁、Meleroら、2007、Nat Rev Cancer、7: 95〜106頁; Waldmann、2006、Annu. Rev Med. 57: 65〜81頁; Khawliら、2008、Handb. Exp. Pharmacol. 181 : 291〜328頁; Berinstein、2007、Vaccine、25巻増刊2号: B72〜B88頁; MellorおよびMunn、2008、Nat Rev Immunol. 8: 74〜80頁)。がんの免疫療法は、患者自身の免疫系を動員して、がんと闘い、長期にわたる腫瘍細胞の根絶をもたらすことを目的とする。
以下を含め、がん免疫療法への複数の異なる手法が開発されている。
(1)モノクローナル抗体(Mab)療法を用いて、i)裸の抗体または毒素(例えば、リツキシマブ)へとコンジュゲートした抗体を用いて、がん細胞を破壊の標的とし、かつ/またはii)成長因子の受容体を遮断し(例えば、Herceptin)、かつ/またはiii)免疫系を刺激することができる。
(2)腫瘍細胞ワクチン(自己または同種異系)、抗原性ワクチン、および樹状細胞(DC)ワクチン、DNAワクチン、ならびにベクターベースのワクチン(例えば、アデノウイルスベースの遺伝子導入)が含まれる、がんワクチン。
(3)免疫系をより一般に刺激し、これにより、腫瘍環境により抑制される腫瘍特異的免疫細胞を活性化させることにより作用する非特異的免疫療法およびアジュバント。これは、腫瘍に対する免疫反応をもたらす免疫エフェクター細胞(例えば、エフェクターT細胞またはTeff細胞)を刺激するかまたは活性化させることにより行うこともでき、阻害性の表現型(例えば、調節性T細胞またはTreg細胞)で細胞を阻害するかまたは不活化させることにより行うこともできる。このような手法には、サイトカイン、細菌性アジュバントのほか、免疫調節的受容体(例えば、CTLA-4およびCD40)を標的とする薬物(mAbを含めた)などの活性分子が含まれる。さらなる手法には、後者の2つの群の中間に当たる養子T細胞伝達およびTreg枯渇療法が含まれる。
CD40とは、細胞表面で発現する糖タンパク質であって、腫瘍壊死因子受容体(TNFR)スーパーファミリーに属し、免疫系において中心的な役割を果たす糖タンパク質である。CD40は、B細胞、樹状細胞、単球、およびマクロファージなどの多様な免疫細胞上で発現する。CD40を介するシグナル伝達が生じると、プロフェッショナルの抗原提示細胞(APC)が活性化する(SchonbeckおよびLibby、2001、Cell Mol Life Sci、58(1): 4〜43頁により総説されている)。
CD154またはCD40Lと称するCD40の天然のリガンドは、成熟Tリンパ球上で主に発現する(Armitageら、1992、Nature、357: 80〜82頁; Schonbeckら、2001、Cell Mol Life Sci.、58、40〜43頁; van Kootenら、2000、J. Leuk. Biol.、67: 2〜17頁; Quezadaら、2004、Annu. Rev. Immunol.、22: 3077〜328頁)。CD40Lを媒介するシグナル伝達は、免疫細胞の活性化、増殖、ならびにサイトカインおよびケモカインの産生を含めた複数の生物学的イベントを誘発する(Schonbeckら、2001、Cell Mol Life Sci.、58: 40〜43頁; van Kootenら、2000、J. Leuk.、Biol.、67: 2〜17頁)。
CD40シグナル伝達は、T細胞依存性免疫応答およびB細胞依存性免疫応答にとって極めて重要であり、非機能性のCD40またはCD40Lを伴う患者は、免疫が顕著に抑制される(Foyら、1993、J Exp Med 5: 1567〜1575頁; Siepmannら、2001、Immunology 3: 263〜272頁; Allenら、1993、Science、259: 990〜993頁)。組換えCD40Lまたは抗CD40抗体による、ヒトB細胞および樹状細胞などの抗原提示細胞の刺激は、CD23、CD80、CD86、FasおよびMHC IIなどの表面マーカーの上方調節、ならびに可溶性のサイトカイン、例えば、IL-12、TNF-γおよびTNF-αの分泌を誘導する(van Kootenら、2000、J Leucoc Biol,67: 2〜17頁; Schonbeckら、2001、前出)。腫瘍環境において、CD40により刺激された樹状細胞は、腫瘍細胞を根絶する可能性を有する、腫瘍特異的エフェクターT細胞を活性化させうる(van Kootenら、2000、J Leucoc Biol,67: 2〜17頁; Sotomayorら、1999、Nature Medicine、5: 780〜787頁)。
CD40の発現は、多くの正常細胞および腫瘍細胞において生じる。例えば、全てのBリンパ腫および充実性腫瘍のうちの30%〜70%は、CD40を発現させる。黒色腫および癌腫は、CD40を発現させる腫瘍に属する。CD40の活性化は、抗腫瘍応答を誘発するのに効果的なことが十分に確立されている(Tongら、2003、Cancer Gene Therapy、10(1): 1〜13頁; Ottalanoら、2002、Tumori、88 (5): 361〜6頁)。腫瘍成長の障害に寄与するCD40活性化の効果は、少なくとも、腫瘍特異的なT細胞応答、CD40陽性腫瘍に対する直接的なアポトーシス作用をもたらし、ADCCをもたらす体液性応答を刺激する、免疫活性化機構を伴う。CD40活性化による抗腫瘍効果はまた、CD40陰性腫瘍においても報告されている(Tuttら、2002、J Immunol.、168 (6): 2720〜8頁; van Mierloら、2002、Proc Natl Acad Sci、USA、99(8): 5561〜6頁)。ここでは、腫瘍の根絶が、腫瘍特異的細胞傷害性Tリンパ球であるCTLの出現と強く連関することが観察された。
CD40の刺激を伴うがんワクチンアジュバントが提起されている。アゴニスト性CD40抗体は、複数のがん形態について、前臨床における概念実証がなされている(Kalbashiら、2010、J Immunotherapy、33: 800〜816頁; Loskogら、2009、Semin Immunology、21: 301〜307頁; Frenchら、1999、Nature Medicine、548〜553頁; Sotomayorら、1999、Nature Medicine、5: 780〜787頁; Staveleyら、2003、Nature Medicine、171 : 697〜707頁)。また、SGN-40(部分的で弱いアゴニスト性の特性を有するヒト化抗体)およびCP-870,893(選択的なCD40アゴニスト性の完全ヒトモノクローナル抗体)を含めたアゴニスト性CD40抗体についての臨床試験も実行されている(KhalilおよびVonderheide、2007、Update on Cancer Therapeutics、2: 61〜65頁; Husseinら、2000、Haematologica、95: 845〜848頁)。
しかし、抗CD40抗体の全身投与は、ショック症候群およびサイトカイン放出症候群などの有害な副作用と関連している(van Mierloら、2002、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、99: 5561〜5566頁; van Mierloら、2004、J Immunol、173: 6753〜6759頁)。
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上記に照らすと、抗腫瘍療法、特に、臨床使用に適する抗CD40アゴニスト抗体の改善が依然として必要とされている。
第1の態様では、本発明は、樹状細胞を活性化する効力が、B細胞を活性化するその効力より大きいかもしくはこれに等しく、CD40に対するアフィニティー(KD)が、1×10-10M(すなわち、0.1nM)未満である、CD40に対する多価の結合特異性を伴う抗体またはその抗原結合断片、あるいはCD40に対する多価の結合特異性を保持する、前記抗体もしくは抗原結合断片の変異体、融合体、もしくは誘導体、または前記変異体もしくはその誘導体の融合体を提供する。
代替的に、または加えて、本発明の第1の態様は、CD40+腫瘍細胞(好ましくはin vivoにおける)に対して二重の細胞傷害効果を及ぼすことが可能な、CD40に対する多価の結合特異性を伴う抗体またはその抗原結合断片、あるいはCD40に対する多価の結合特異性を保持する前記抗体もしくは抗原結合断片の変異体、融合体、もしくは誘導体、または前記変異体もしくはその誘導体の融合体を提供する。「二重の細胞傷害効果」により、本発明者らは、腫瘍細胞に対する直接的なアポトーシス作用と、腫瘍細胞に対する間接的な免疫細胞介在性細胞傷害性(例えば、ADCC)効果とを包含する。
樹状細胞の活性化およびB細胞の活性化に関する「効力」により、本発明者らは、抗体、抗原結合断片、またはその融合体、変異体、もしくは誘導体によるこのような細胞の活性化のEC50を意味する。当業者は、樹状細胞を活性化する効力およびB細胞を活性化する効力を、以下の実施例において記載される方法が含まれるがこれらに限定されない異なる方法により測定しうることを察知するであろう。
一実施形態では、樹状細胞の活性化を、FACS解析により測定されるCD80の発現に対する刺激のEC50(実施例4などにおける)への参照により定義し、B細胞の活性化を、B細胞の増殖のEC50(実施例6などにおける)への参照により定義する。
Pfizerにより開発された抗CD40抗体であるCP-870,893は、B細胞を活性化する効力が、樹状細胞を活性化する効力の約20倍であることが知られている(Gladueら、2011、Cancer Immunol Immunotherapy (7)、1009〜1017頁)。また、CP-870,893による処置の主要な薬力学的作用のうちの1つが、末梢血リンパ球中のB細胞の百分率の急速な低下であることも裏付けられている(Vonderheideら、2007、Journal of Clinical Oncology 25、7、876〜883頁)。B細胞に対する作用は、樹状細胞を活性化させるには不十分な処置用量で、用量制限毒性を結果としてもたらしうる。本発明者らは、樹状細胞の活性化の臨床的関与性が、B細胞の活性化より大きいと考える。がんに対するCD40アゴニスト療法は、T細胞の活性化と強く連関しており(Frenchら、1999、Nature Medicine、548〜553頁; van Kootenら、2000、J Leucoc Biol,67: 2〜17頁; Sotomayorら、1999、Nature Medicine、5: 780〜787頁)、このT細胞の活性化は、プロフェッショナルの抗原提示細胞、特に、樹状細胞の活性化に依存する(Meliefら、2000、Adv. Immunol.、75:235〜282頁)。
本発明者らは、アゴニスト性の抗CD40抗体クローンであって、樹状細胞を活性化させる能力が改善されたクローンを開発した。
本発明の一実施形態では抗体、その抗原結合断片、変異体、融合体、および誘導体の、樹状細胞を活性化する効力が、それらのB細胞を活性化する効力より大きいか、またはこれと同等である。あるいは言い換えると、本発明の抗体、その抗原結合断片、変異体、融合体、および誘導体の、B細胞を活性化する効力は、それらの樹状細胞を活性化する効力より小さいか、またはこれと同等である。
「結合特異性」により、本発明者らは、CD40に、他の任意のポリペプチドより少なくとも10倍強く結合し、好ましくは少なくとも50倍強く結合し、より好ましくは少なくとも100倍強く結合する本発明の抗体、その抗原結合断片、変異体、融合体、または誘導体の能力を包含する。本発明の抗体、その抗原結合断片、変異体、融合体、または誘導体は、生理学的条件下で、CD40に選択的に結合する(例えば、in vivoで、例えば、CD40が細胞表面上に存在する場合に)ことが好ましい。
「多価」により、本発明者らは、本発明の抗体、その抗原結合断片、変異体、融合体、または誘導体が、CD40に対する結合特異性を伴う2つ以上の抗原結合部位を含むことを包含する。例えば、抗体は、2つまたは3つまたは4つまたは5つまたは6つ以上のこのような抗原結合部位を含みうる。一実施形態では、抗体が、無傷の二価IgG抗体である。
CD40とは、細胞表面で発現する糖タンパク質であって、腫瘍壊死因子受容体(TNFR)スーパーファミリーに属し、免疫系において中心的な役割を果たす糖タンパク質である。CD40は、B細胞、樹状細胞、単球、およびマクロファージなどの多様な免疫細胞上で発現し、CD40を介するシグナル伝達が生じると、プロフェッショナルのAPCが活性化する(Tasciら、2001、Cell. Mol. Life Sci.、(58)、4〜43頁により総説されている)。CD40の発現は、多くの正常細胞、ならびにBリンパ腫、充実性腫瘍、黒色腫、および癌腫などの腫瘍細胞において生じる。CD40の活性化は、抗腫瘍応答を誘発するのに効果的であり、CD40の活性化は、少なくとも免疫活性化、CD40陽性腫瘍に対する直接的なアポトーシス作用、ならびにADCCおよびCDCをもたらす体液性応答の刺激の機構を介して、腫瘍成長の障害に寄与することが十分に確立されている。
ADCCおよびCDCの発生は、重鎖定常ドメインにより決定される抗体のFc部分と相互作用する、宿主の免疫系に依存する。自然発生の定常ドメインのうちでは、ガンマ1ドメインが、ADCCおよびCDCを最も効果的に引き起こすアイソタイプである(Janeway's Immunobiology、2008、7版、Garland Science)。したがって、本発明の抗体に好ましいFcがガンマ1 Fcであることから、抗CD40抗体は、IgG1アイソタイプとなる。おそらくまた、Fc操作(点突然変異)およびグリカン修飾(Carter、Nature Reviews Immunology、2006 (6)、343〜357頁により総説されている)など、多数の既知の方法を用いれば、これらの作用がさらに増強されるであろう。
抗体が樹状細胞上およびB細胞上のCD40を活性化させる機構は、抗体が結合するCD40上のエピトープと、受容体の多量体化との両方に依存する。本発明の例示的な二価抗体(IgG1)によるCD40受容体の二量体化は、そのアゴニスト性の作用に有利である。
「CD40」により、本発明者らは、本明細書で規定されるヒトCD40タンパク質および/またはその天然の変異体に対する構造的および/または機能的な同一性を伴う、任意の天然または合成のタンパク質を包含する。
CD40は、UniProt受託番号第P25942号およびGenBank受託番号第AAH12419号などのヒトCD40であることが好ましい。
しかし、当業者は、CD40は、家畜化された哺乳動物(ウマ、ブタ、ウシ、ヒツジ、イヌ、およびネコを含め、農業上または商業上の重要性を有する哺乳動物であることが好ましい)など、任意の哺乳動物に由来することを察知するであろう。「哺乳動物タンパク質」により、本発明者らは、哺乳動物の1もしくは複数の細胞において見出され、これに由来し、かつ/またはこれから単離される任意のタンパク質を包含し、例えば、「ヒトタンパク質」という用語は、ヒトの1もしくは複数の細胞において見出され、これに由来し、かつ/またはこれから単離されるタンパク質を包含する。
上記で論じた通り、本発明の抗体、その抗原結合断片、変異体、融合体、および誘導体は、B細胞および樹状細胞を活性化させることが可能である。
CD40を介するシグナル伝達であって、免疫細胞の活性化、増殖、ならびにサイトカインおよびケモカインの産生を含めた複数の生物学的イベントを誘発するシグナル伝達が生じると、樹状細胞など、プロフェッショナルのAPCが活性化する。当技術分野では、CD40と関連する樹状細胞の活性化を決定するための方法が知られており(例えば、Schonbeckら、2001、Cell Mol Life Sci.、58: 40〜43頁; van Kootenら、2000、J. Leuk. Biol.、67: 2〜17頁において論じられている)、付属の実施例でも記載される。
組換えCD40Lまたは抗CD40抗体によるヒトB細胞の刺激は、CD23、CD30、CD80、CD86、FasおよびMHC IIなどの表面マーカーの上方調節、可溶性のサイトカイン、例えば、IL-6、TNF-γおよびTNF-αの分泌、ならびに同型凝集を誘導する。当技術分野では、CD40と関連するB細胞の活性化を決定するための方法が知られており(例えば、Schonbeckら、2001、前出において論じられている)、付属の実施例でも記載される。
樹状細胞を活性化する効力を改善するために、本発明の抗体、その抗原結合断片、変異体、融合体、および誘導体を最適化した。一実施形態では、樹状細胞を活性化する効力が、B細胞を活性化する効力と比べて選択的に増大する。
当技術分野では、樹状細胞およびB細胞を活性化する抗体の効力を決定するための方法およびアッセイがよく知られている。
例えば、樹状細胞の活性化は、CD86およびCD80などの細胞表面マーカーの上方調節を測定する(実施例3を参照されたい)ことにより評価することもでき、かつ/または抗CD40抗体により誘導されるIFNγのT細胞からの分泌を測定する(以下の実施例4を参照されたい)ことにより評価することもできる。
同様に、B細胞の活性化も、細胞表面マーカーの上方調節を測定する(CD86など;Gladueら、2011、前出を参照されたい)ことにより評価することもでき、かつ/または抗CD40抗体により誘導されるB細胞の増殖を測定する(以下の実施例6を参照されたい)ことにより評価することもできる。
本発明の抗体、その抗原結合断片、変異体、融合体、および誘導体は、樹状細胞を、それらがB細胞を活性化させるのと少なくとも同じくらい強力に活性化させる(例えば、それらによるCD80および/またはCD86の上方調節の測定により決定される)。したがって、本発明の抗体、その抗原結合断片、変異体、融合体、および誘導体は、樹状細胞を活性化する効力が、B細胞を活性化する効力と対比して、2倍であることが可能であり、例えば、樹状細胞を活性化する効力が、少なくとも3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍以上でありうる。
「抗体」により、本発明者らは、実質的に無傷の抗体分子のほか、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体(この場合、少なくとも1つのアミノ酸が、自然発生のヒト抗体と比べて突然変異している)、単鎖抗体、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体の重鎖および/または軽鎖のホモ二量体およびヘテロ二量体、ならびにこれらの抗原結合断片、および誘導体を包含する。この用語はまた、ファージディスプレイ法または分子についての他のランダム選択法を用いて作製しうる抗体様分子も包含する。この用語はまた、IgG、IgA、IgM、IgD、およびIgEを含めた全てのクラス抗体も包含する。
以下でさらに論じられる通り、本発明にはまた、Fab、F(ab')2、Fvなどの抗体断片、および抗原結合部位を保持するこれらの他の断片も包含される。同様に、「抗体」という用語は、単鎖Fv分子(scFv)および単一ドメイン抗体(dAb)など、遺伝子操作された抗体の誘導体も包含する。このような断片および誘導体は、多量体化により、CD40に対して多価とすることができる(例えば、scFv-scFV二量体またはdAb-dAb二量体)。
抗体の重鎖可変ドメイン(VH)および軽鎖可変ドメイン(VL)は、抗原の認識に関与するが、これは、早期のプロテアーゼ消化実験により最初に認識された事実である。さらなる確認は、齧歯動物抗体の「ヒト化」により見出された。結果として得られる抗体が、齧歯動物親抗体の抗原に対する特異性を保持するように、齧歯動物由来の可変ドメインを、ヒト由来の定常ドメインと融合させることができる(Morrisonら(1984)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81、6851〜6855頁)。
本発明は、そのような変異体、融合体、および誘導体が、CD40に対する結合特異性を有し、これらの樹状細胞を活性化する効力が、B細胞を活性化する効力より大きいか、またはこれと同等であるという条件で、本発明の抗体および抗原結合断片の変異体、融合体、および誘導体のほか、前記変異体または誘導体の融合体も包摂する。
抗体およびそれらの抗原結合断片は、1または複数のポリペプチドの構成要素を含むので、組換えポリヌクレオチドを用いる当技術分野でよく知られている、タンパク質操作および部位指向突然変異誘発の方法を用いて、本明細書で規定される適切な抗体およびその抗原結合断片の変異体、融合体、および誘導体を作製することができる。(実施例を参照され、参照により本明細書に組み込まれる、Molecular Cloning: a Laboratory Manual、3版、SambrookおよびRussell、2001、Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照されたい)。
したがって、本明細書で規定される抗体またはその抗原結合断片の変異体、融合体、および誘導体は、抗体またはその抗原結合断片のポリペプチドの構成要素に基づき作製することができる。
「融合体」により、本発明者らは、他の任意のポリペプチドへと融合させた前記ポリペプチドを包含する。例えば、前記ポリペプチドは、前記ポリペプチドの精製を容易とするために、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)またはプロテインAなどのポリペプチドと融合させることができる。当業者には、このような融合体の例がよく知られている。同様に、前記ポリペプチドは、His6などのオリゴヒスチジンタグまたは抗体により認識されるよく知られたMycタグエピトープなどのエピトープと融合させることもできる。また、前記ポリペプチドの任意の変異体または誘導体との融合体も、本発明の範囲に包含される。
融合体は、所望の特色を前記ポリペプチドに付与するさらなる部分を含むか、またはこれからなることが可能であり、例えば、この部分は、ポリペプチドを検出または単離するのに有用な場合もあり、細胞によるポリペプチドの取込みを促進する場合もある。この部分は、例えば、当業者によく知られている、ビオチン部分、放射性部分、蛍光部分、例えば、小型のフルオロフォアまたは緑色蛍光タンパク質(GFP)によるフルオロフォアでありうる。この部分は、当業者に知られている免疫原性タグ、例えば、Mycタグの場合もあり、当業者に知られている、細胞によるポリペプチドの取込みを促進することが可能な、脂溶性分子またはポリペプチドドメインの場合もある。
前記ポリペプチドの「変異体」により、本発明者らは、保存的または非保存的な挿入、欠失、および置換を包含する。特に、本発明者らは、ポリペプチドの変異体であって、前記ポリペプチドの活性を実質的に改変しない変異体を包含する。変異体には、例えば、対立遺伝子の変異体であって、所与の配列から1または2または3アミノ酸残基だけ変化することが典型的であり、10または20アミノ酸残基だけ変化することが典型的な変異体が含まれうる。変異体は、保存的置換を有することが典型的である。
ポリペプチドの変異体は、上記で与えられるアミノ酸配列のうちの1または複数との少なくとも75%の同一性、例えば、本明細書で指定されるアミノ酸配列のうちの1または複数との少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を有しうる。
例えば、本明細書で規定されるポリペプチドの変異体は、配列番号19;配列番号20;配列番号21;配列番号22;配列番号23;配列番号24;配列番号25;配列番号26;配列番号27;および配列番号28;配列番号32;配列番号33;配列番号34;配列番号35;配列番号36;配列番号37;配列番号38;および配列番号39を含む群から選択されるアミノ酸配列に対する少なくとも60%の同一性を伴う配列を含むポリペプチドを組み入れ、好ましくは少なくとも70%または80%または85%または90%の前記配列に対する同一性を有し、より好ましくは少なくとも95%、96%、97%、98%または99%の前記配列に対する同一性を有する。
同一性パーセントは、例えば、グローバルアライメントのオプション、スコアリングマトリックスであるBLOSUM62、ギャップオープンペナルティーである-14、ギャップエクステンションペナルティーである-4をパラメータとして用いる、Expasy施設のサイト(http://www.ch.embnet.org/software/LALIGN_form.html)のLALIGNプログラム(HuangおよびMiller、Adv. Appl. Math. (1991)、12: 337〜357頁)により決定することができる。代替的に、2つのポリペプチドの間の配列同一性パーセントは、適切なコンピュータプログラム、例えば、University of Wisconsin Genetic Computing GroupのGAPプログラムを用いて決定することができ、その配列が最適に配列決定されたポリペプチドとの関係で同一性パーセントが計算されることが察知されるであろう。
代替的に、アライメントは、Clustal Wプログラム(参照により本明細書に組み込まれる、Thompsonら、1994、Nucl. Acid Res. 22: 4673〜4680頁において記載される)を用いて実行することもできる。用いられるパラメータは、以下の通りでありうる。
・ファーストペアワイズアライメントパラメータ:Kタプル(ワード)のサイズ: 1、ウィンドウのサイズ: 5、ギャップペナルティー: 3、上対角行列の数: 5.スコアリング法:xパーセント。
・多重アライメントパラメータ:ギャップオープンペナルティー: 10、ギャップエクステンションペナルティー: 0.05。
・スコアリングマトリックス: BLOSUM。
代替的に、BESTFITプログラムを用いて、局所配列アライメントを決定することもできる。
本発明の抗体、抗原結合断片、変異体、融合体、または誘導体は、修飾または誘導体化された1もしくは複数のアミノ酸を含むか、またはこれからなることが可能である。
1または複数のアミノ酸の化学的誘導体は、機能性の側鎖基と反応させることにより達成することができる。このような誘導体化された分子には、例えば、アミン塩酸塩、p-トルエンスルホニル基、カルボキシベンゾキシ基、t-ブチロキシカルボニル基、クロロアセチル基、またはホルミル基を形成するように遊離アミノ基が誘導体化された分子が含まれる。遊離カルボキシル基を誘導体化して、塩、メチルエステルおよびエチルエステル、または他の種類のエステル、ならびにヒドラジドを形成することができる。遊離ヒドロキシル基を誘導体化して、O-アシル誘導体またはO-アルキル誘導体を形成することができる。化学的誘導体としてはまた、20の標準アミノ酸の自然発生のアミノ酸誘導体を含有するペプチドも含まれる。例えば、4-ヒドロキシプロリンでプロリンを置換することができ、5-ヒドロキシリシンでリシンを置換することができ、3-メチルヒスチジンでヒスチジンを置換することができ、ホモセリンでセリンを置換することができ、オルニチンでリシンを置換することができる。必須の活性が維持されている限りにおいて、誘導体にはまた、1または複数の付加または欠失を含有するペプチドも組み入れられる。組み入れられる他の修飾は、アミド化、アミノ末端のアシル化(例えば、アセチル化またはチオグリコール酸によるアミド化)、カルボキシル末端のアミド化(例えば、アンモニアまたはメチルアミンによる)などの末端修飾である。
当業者にはまた、ペプチド模倣体化合物も有用でありうることが察知されるであろう。「ペプチド模倣体」という用語は、治療用薬剤としての特定のペプチドのコンフォメーションおよび所望の特色を模倣する化合物を指す。
例えば、前記ポリペプチドには、アミノ酸残基がペプチド(-CO-NH-)連結により接合される分子だけでなく、また、ペプチド結合が逆向きにされる分子も組み入れられる。このようなレトロインベルソペプチド模倣体は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Meziereら(1997)J. Immunol. 159、3230〜3237頁において記載されている方法など、当技術分野で知られた方法を用いて作製することができる。この手法は、骨格に関与するが、側鎖の配向性には関与しない変化を含有するシュードペプチドを作製するステップを伴う。CO-NHペプチド結合の代わりにNH-CO結合を含有するレトロインベルソペプチドは、タンパク質分解に対する抵抗性がはるかに大きい。代替的に、前記ポリペプチドは、アミノ酸残基のうちの1または複数が、従来のアミド連結の代わりに-y(CH2NH)-結合により連結されるペプチド模倣体化合物でもありうる。
さらなる代替法では、アミノ酸残基の炭素原子間の間隔を保持する適切なリンカー部分を用いるという条件で、ペプチド結合をすっかりなくすこともでき、リンカー部分が、ペプチド結合と実質的に同じ電荷分布およびペプチド結合と実質的に同じ平面性を有することは、有利でありうる。
エクソ型のタンパク質分解による消化に対する感受性を低減する一助となるように、前記ポリペプチドを、そのN末端またはC末端においてブロックすると好都合でありうることが察知されるであろう。
また、D-アミノ酸およびN-メチルアミノ酸などの多様な非コードアミノ酸または修飾アミノ酸も、哺乳動物のペプチドを修飾するのに用いられている。加えて、推定される生体活性のコンフォメーションは、環化またはラクタムもしくは他の種類の架橋の組込みなどを介する共有結合的修飾により安定化させることができる。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Veberら、1978、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 2636頁およびThursellら、1983、Biochem. Biophys. Res. Comm. 111 : 166頁を参照されたい。
何らかの環状部分をペプチドベースのフレームワークへと導入することが、合成戦略の多くのうちの一般的な主題となっている。環状部分は、ペプチド構造のコンフォメーション空間を制限し、これは、特定の生物学的受容体に対するペプチドの特異性の増大をしばしば結果としてもたらす。この戦略のさらなる利点はまた、環状部分のペプチドへの導入により、細胞内ペプチダーゼに対する感受性を減殺させたペプチドも結果としてもたらしうることである。
したがって、本発明の例示的なポリペプチドは、末端のシステインアミノ酸を含むかまたはこれからなる。このようなポリペプチドは、末端のシステインアミノ酸におけるメルカプチド基によるジスルフィド結合の形成を介するヘテロデチック環状形態で存在する場合もあり、末端アミノ酸の間のアミドペプチド結合の形成を介するホモデチック形態で存在する場合もある。上記で示した通り、小型のペプチドを、N末端システインとC末端システインとの間のジスルフィド結合またはアミド結合を介して環化することは、タンパク質分解を減殺することにより、また、特異性が高い化合物をもたらしうる構造の厳密性を増大させることにもより、直鎖状ペプチドについては場合によって観察される特異性および半減期の問題を回避することができる。よって、ジスルフィド結合により環化されたポリペプチドが、タンパク質分解に対してなおも感受性でありうる、遊離アミノ末端および遊離カルボキシ末端を有するのに対し、N末端のアミンとC末端のカルボキシルとの間のアミド結合の形成により環化されたペプチドは、遊離アミノ末端または遊離カルボキシ末端をもはや含有しない。したがって、ペプチドは、C-N連結により連結することもでき、ジスルフィド連結により連結することもできる。
本発明は、いかなる形であれ、ペプチドを環化する方法により限定されず、任意の適切な合成法によりその環状構造を達成しうるペプチドを包摂する。したがって、ヘテロデチック連結には、ジスルフィド架橋、アルキレン架橋、またはスルフィド架橋を介する形成が含まれうるがこれらに限定されない。ジスルフィド架橋、スルフィド架橋およびアルキレン架橋を含めた、環状ホモデチックペプチドおよび環状ヘテロデチックペプチドの合成法については、参照により本明細書に組み込まれる、US5,643,872において開示されている。環化法の他の例は、参照により本明細書に組み込まれる、US6,008,058において論じられ、開示されている。
安定化させた環状ペプチド模倣体化合物を合成するためのさらなる手法は、閉環メタセシス(RCM)である。この方法は、ペプチド前駆体を合成するステップと、それをRCM触媒と接触させて、コンフォメーション的に制限されたペプチドをもたらすステップとを伴う。適切なペプチド前駆体は、2つ以上の不飽和C-C結合を含有しうる。方法は、固相ペプチド合成法を用いて実行することができる。この実施形態では、固体の支持体へとアンカリングされた前駆体を、RCM触媒と接触させ、次いで、生成物を固体の支持体から切断して、コンフォメーション的に制限されたペプチドをもたらす。
参照により本明細書に組み込まれる、D. H. Rich、Protease Inhibitors、BarrettおよびSelveson編、Elsevier (1986)により開示されている別の手法は、酵素阻害剤のデザインにおける遷移状態類似体の概念を適用することにより、ペプチド模倣体をデザインすることであった。例えば、スタチン(staline)の二級アルコールは、ペプシン基質の切断可能なアミド結合の四面体の遷移状態を模倣することが知られている。
まとめると、よく知られている通り、末端修飾は、プロテイナーゼによる消化に対する感受性を低減し、したがって、プロテアーゼが存在しうる溶液中、特に、体液中のペプチドの半減期を延長するのに有用である。ポリペプチドの環化はまた、環化により形成される安定的な構造のために有用な修飾でもあり、環状ペプチドについて観察される生物学的活性を考慮して有用な修飾でもある。
したがって、一実施形態では、前記ポリペプチドが環状である。しかし、代替的な実施形態では、前記ポリペプチドが直鎖状である。
抗体、その抗原結合断片、変異体、融合体、または誘導体は、樹状細胞を活性化する効力が、既知の抗CD40抗体「B44」(そのアミノ酸配列を、以下の実施例10に示す)より大きいことが好ましい。
B44アゴニスト性抗体は、Biolnvent International ABの所有権に属するヒト抗体断片ディスプレイライブラリーである、n-CoDeR(登録商標)ライブラリー(Soederlindら、2000、Nature Biotechnol.、18: 852〜6頁; WO98/32845)に由来する。B44抗体のアフィニティー定数(KD)は、中程度〜低度の1.7nMであり、in vitroにおいて決定された中程度の効力を有する(Ellmarkら、2002、Immunology、106: 456〜463頁; Ellmarkら、2008、AIDS Research and Human Retroviruses、243、367〜372頁)。B44アゴニスト性抗体のアフィニティーおよび効力は、B44アゴニスト性抗体を、臨床的および治療的に関与性の抗CD40アゴニスト抗体として不適切なものとする。
抗体、その抗原結合断片、変異体、融合体、または誘導体は、樹状細胞を活性化する効力(実施例4において記載されるEC50として測定される)が、少なくとも0.5μg/ml(すなわち、EC50が、0.5μg/mlより低値であるか、またはこれと同等である)であることがより好ましい。例えば、抗体、その抗原結合断片、変異体、融合体、または誘導体は、CD80の刺激のEC50(実施例4において測定される)が、0.5μg/ml未満、例えば、0.4μg/ml、0.3μg/ml、0.2μg/ml、0.1g/ml未満、または0.05μg/ml未満でありうる。
本発明についての一実施形態では、抗体、その抗原結合断片、変異体、融合体、または誘導体のCD40に対する結合特異性が、B44抗体の場合と比べて改善されている。
抗体結合の特異性に関して最も一般に言及される反応速度パラメータは、通常解離定数(KD)として表現される全体のアフィニティーである。この静的パラメータは、平衡における細胞受容体の相対的な占有を反映し、全身投与に関与性である。しかし、局所投与時において、抗体は、局所腫瘍領域から漏出する可能性があり、したがって、反応時間は限定される。したがって、高値のオン速度(高値のka)は、抗体が平衡に到達する所要時間を決定するので、局所投与時における臨床効果に極めて重要でありうる(Katakuraら、Journal of Molecular Catalysis、(28)、191〜200頁、2004)。加えて、遅いオフ速度(低値のkd)は、処置の持続時間に影響を及ぼす可能性があり、抗体を腫瘍領域へと拘束し、これにより、全身への曝露および毒性を最小化するのに用いられうる。
当技術分野では、相互作用(抗体とリガンドとの間の相互作用など)全体のアフィニティー(KD)ならびに相互作用のオン速度(ka)およびオフ速度(kd)を測定するための方法がよく知られている。例示的なin vitro法は、付属の実施例でも記載される。また、フローサイトメトリーベースの方法を用いることも想定可能である(Sklarら、Annu Rev Biophys Biomol Struct、(31)、97〜119頁、2002)。
本発明の抗体、またはその抗原結合断片、変異体、融合体、もしくは誘導体のCD40に対するアフィニティー(KD)は、1.0×10-10M未満であり、例えば、9.0×10-11M、8.0×10-11M、7.0×10-11M、6.0×10-11M、5.0×10-11M、4.0×10-11M、3.0×10-11M、2.0×10-11M未満、または1.0×10-11M未満のKDである。
別の好ましい実施形態では、抗体、その抗原結合断片、変異体、融合体、または誘導体のCD40に対するオン速度が、B44抗体のオン速度より大きく、例えば、オン速度(ka)が2.7×106Msを超え、オン速度(ka)が、3.0×106Ms;または4.0×106Ms;または5.0×106Ms;または6.0×106Msまたは7.0×106Ms;または8.0×106Ms;または9.0×106Ms;または1.0×107Msを超えることが好ましい。
別の好ましい実施形態では、抗体、その抗原結合断片、変異体、融合体、または誘導体のCD40に対するオフ速度が、B44抗体のオフ速度未満であり、例えば、オフ速度(kd)が4.5×10-3s未満であり、オフ速度が、3.0×10-3s;または2.0×10-3s;または1.0×10-3s;または9.0×10-4s;または8.0×10-4s;または7.0×10-4s;または6.0×10-4s;または5.0×10-4s;または3.0×10-4s;または2.0×10-4s;または1.0×10-4s;または9.0×10-5s;または8.0×10-5s;または7.0×10-5s;または6.0×10-5s;または5.0×10-5s;または4.0×10-5s;または3.0×10-5s;または2.0×10-5s;または1.0×10-6s未満であることが好ましい。
好ましい一実施形態では、抗体、その抗原結合断片、変異体、融合体、または誘導体の、CD40に対するアフィニティー(KD)が、1.0×10-10M〜1×10-11Mの範囲にあり、CD40に対するオン速度(ka)が、2.7×106〜1×107Msの範囲にある。
本発明は、細胞の表面に局在化するCD40に対するアフィニティーを伴う抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体を提供することが典型的である。
「細胞の表面に局在化する」により、本発明者らは、CD40の1または複数の領域が、細胞表面のうちの外部表面上に存在するように、CD40が細胞と関連するという意味を包含する。例えば、CD40は、1または複数の領域を細胞外の表面上に存在させながら、細胞膜内に挿入されうる(すなわち、膜貫通タンパク質として配置されうる)。代替的に、CD40は、共有結合的相互作用および/またはイオン的相互作用がCD40を細胞表面の1または複数の特定の領域へと局在化させるので、細胞の外部にも存在しうる。
したがって、「がん細胞の表面」により、本発明者らは、CD40が、がん性細胞または腫瘍に由来するか、またはこれに特徴的な1または複数の細胞との関連で、局在化するという意味を包含する。
一実施形態では、抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体は、無傷抗体を含むかまたはこれからなる。
代替的に、抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体は、Fv断片(単鎖Fv断片またはジスルフィド結合させたFv断片など)およびFab様断片(Fab断片、Fab'断片、またはF(ab)2断片など)からなる群から選択される、抗原結合断片を含むかまたはこれからなる。
例えば、抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体は、scFvを含みうる。
「ScFv分子」により、本発明者らは、パートナーのVHドメインとVLドメインとが可撓性のオリゴペプチドを介して連結される分子を包含する。
全抗体ではなく、抗体断片を用いる潜在的な利点は、幾重にもわたるものである。断片のサイズが小さくなると、標的部位への透過の改善など、薬理学的特性の改善をもたらすことができる。補体結合など、全抗体のエフェクター機能は、除去される。Fab抗体断片、Fv抗体断片、ScFv抗体断片、およびdAb抗体断片は全て、大腸菌(E. coli)内で発現させ、これから分泌させることができ、したがって、大量の前記断片の容易な作製が可能となる。
本発明の抗体、その抗原結合断片、変異体、融合体、または誘導体は、組換え分子であることが好ましい。
抗体は、ポリクローナル抗体でありうるが、モノクローナル抗体であるか、またはその抗原結合断片、変異体、融合体、もしくは誘導体がモノクローナル抗体に由来することが好ましい。
適切なモノクローナル抗体は、既知の技法、例えば、「Monoclonal Antibodies; A manual of techniques」、H Zola (CRC Press、1988)および「Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Application」、SGR Hurrell (CRC Press、1982)において開示されている技法により調製することができる。多特異性のポリクローナル抗体を作製することもでき、単一特異性のポリクローナル抗体を作製することもできる。それらは、単一特異性であることが好ましい。
抗体、その抗原結合断片、変異体、融合体、または誘導体は、ヒト抗体、その抗原結合断片、変異体、融合体、もしくは誘導体、またはヒト化抗体、その抗原結合断片、変異体、融合体、もしくは誘導体であることが好ましい。
抗体は、それらが、ヒト抗体のアミノ酸配列を有するという意味で、本明細書で規定されるCD40タンパク質に対して特異的なヒト抗体でありうる。しかし、それらは、当技術分野で知られた方法であって、ヒトの免疫化を要請しない方法を用いて調製しうることが察知されるであろう。例えば、抗体ポリペプチドは、in vitroのヒト細胞系により作製することもでき、非ヒト細胞系により作製することもできる。代替的に、本質的にヒト免疫グロブリン遺伝子を含有するトランスジェニックマウスも利用可能である(Vaughanら(1998)、Nature Biotechnol. 16、535〜539頁を参照されたい)。
適切に調製された非ヒト抗体は、例えば、マウス抗体のCDR領域を、ヒト抗体のフレームワークへと挿入することにより、既知の方途により「ヒト化」させることができる。
キメラ抗体は、Neubergerら(1998、8th International Biotechnology Symposium Part 2、792〜799頁)により論じられている。
当業者は、抗体またはその抗原結合断片の結合特異性が、構成要素である重鎖および軽鎖の可変領域内の相補性決定領域(CDR)の存在により付与されることを察知するであろう。以下で論じられる通り、本明細書で規定される抗体ならびにそれらの抗原結合断片、変異体、融合体、および誘導体の特に好ましい実施形態では、CD40に対する結合特異性が、本明細書で規定されるCDRのアミノ酸配列のうちの1または複数の存在により付与される。
本明細書で用いられる用語「アミノ酸」は、標準的な20の遺伝子によりコードされるアミノ酸およびそれらの対応する「D」型(天然の「L」型と比較される)の立体異性体、オメガアミノ酸、他の自然発生のアミノ酸、非定型的アミノ酸(例えば、α,α-二置換アミノ酸、N-アルキルアミノ酸など)、および化学的に誘導体化されたアミノ酸(以下を参照されたい)を包含する。
「アラニン」または「Ala」または「A」などのアミノ酸を具体的に列挙する場合、別段に明示的に言明しない限り、「アミノ酸」という用語は、L-アラニンおよびD-アラニンの両方を指す。所望の機能的特性がポリペプチドにより保持される限りにおいて、他の非定型的アミノ酸もまた、本発明のポリペプチドに適する構成要素でありうる。示されるペプチドについて、コードされる各アミノ酸残基は、適切な場合、定型的アミノ酸の慣用名に対応する単一文字表示により表される。
一実施形態では、本明細書で規定されるポリペプチドが、L-アミノ酸を含むか、またはこれからなる。
好ましい実施形態では、抗体、断片、変異体、融合体、または誘導体が、CDR1が、アミノ酸配列:
CTGSX1SNIGX2VY[配列番号1]
[配列中、
X1は、SまたはTであり、
X2は、KまたはHまたはDまたはGまたはNである]
を含むかまたはこれからなる可変軽鎖(VL)を含む。
好ましい実施形態では、抗体、断片、変異体、融合体、または誘導体が、CDR2が、アミノ酸配列:
X3NINRPS[配列番号2]
[配列中、
X3は、GまたはRである]
を含むかまたはこれからなる可変軽鎖(VL)を含む。
好ましい実施形態では、抗体、断片、変異体、融合体、または誘導体が、CDR3が、アミノ酸配列:
CAAWDX4X5X6X7GLX8[配列番号3]
[配列中、
X4は、DまたはSまたはEまたはGまたはKであり、
X5は、SまたはTまたはGであり、
X6は、LまたはSまたはTまたはLまたはIであり、
X7は、SまたはTまたはLであり、
X8は、VまたはLである]
を含むかまたはこれからなる可変軽鎖(VL)を含む。
より好ましくは、抗体、断片、変異体、融合体、または誘導体が、CDR1が、
CTGSTSNIGAGYKVY[配列番号4];および
CTGSSSNIGAGYHVY[配列番号5];および
CTGSSSNIGAGYKVY[配列番号6];および
CTGSSSNIGAGYDVY[配列番号7];および
CTGSSSNIGAGYGVY[配列番号8];および
CTGSSSNIGAGYNVY[配列番号9]
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる可変軽鎖(VL)を含む。
より好ましくは、抗体、断片、変異体、融合体、または誘導体が、CDR2が、
GNINRPS[配列番号10];および
RNINRPS[配列番号11]
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる可変軽鎖(VL)を含む。
より好ましくは、抗体、断片、変異体、融合体、または誘導体が、CDR3が、
CAAWDDSLSGLV[配列番号12];および
CAAWDSSSSGLV[配列番号13];および
CAAWDESITGLV[配列番号14];および
CAAWDGSLLGLV[配列番号15];および
CAAWDGTLTGLL[配列番号16];および
CAAWDKSISGLV[配列番号17];および
CAAWDGGLLGLV[配列番号18]
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる可変軽鎖(VL)を含む。
本発明の特に好ましい実施形態では、抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体が、以下のCDR:
(i)配列番号1および配列番号2および配列番号3;または
(ii)配列番号4および配列番号10および配列番号12;または
(iii)配列番号5および配列番号10および配列番号13;または
(iv)配列番号4および配列番号10および配列番号12;または
(v)配列番号6および配列番号10および配列番号14;または
(vi)配列番号7および配列番号11および配列番号15;または
(vii)配列番号8および配列番号10および配列番号16;または
(viii)配列番号9および配列番号10および配列番号17;または
(ix)配列番号9および配列番号10および配列番号12;または
(x)配列番号9および配列番号10および配列番号18
を含む可変軽鎖(VL)を含む。
なおもさらなる好ましい実施形態では、抗体、断片、変異体、融合体、または誘導体が、
配列番号19;配列番号20;配列番号21;配列番号22;配列番号23;配列番号24;配列番号25;配列番号26;および配列番号27
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖(VL)を含む。
一実施形態では、抗体、断片、変異体、融合体、または誘導体が、配列番号63のアミノ酸配列を含む定常軽鎖(CL)を含む。
また、抗体、断片、変異体、融合体、または誘導体が、CDR1が、
GFTFSTYGMH[配列番号28]
のアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる可変重鎖(VH)を含むことも好ましい。
また、抗体、断片、変異体、融合体、または誘導体が、CDR2が、
GKGLEWLSYISGGSSYIFYADSVRGR[配列番号29]
のアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる可変重鎖(VH)を含むことも好ましい。
また、抗体、断片、変異体、融合体、または誘導体が、CDR3が、
CARILRGGSGMDL[配列番号30]
のアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる可変重鎖(VH)を含むことも好ましい。
本発明の特に好ましい実施形態では、抗体、断片、変異体、融合体、または誘導体が、配列番号28および配列番号29および配列番号30のCDRを含む可変重鎖(VH)を含む。
さらなる好ましい実施形態では、抗体、断片、変異体、融合体、または誘導体が、
配列番号31;配列番号32;配列番号33;配列番号34;配列番号35;配列番号36;配列番号37;配列番号38;および配列番号39
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖(VH)を含む。
一実施形態では、抗体、断片、変異体、融合体、または誘導体が、配列番号62のアミノ酸配列を含む定常重鎖(CH)を含む。
抗体、断片、変異体、融合体、または誘導体が、以下のCDR:
(i)配列番号1および配列番号2および配列番号3および配列番号28および配列番号29および配列番号30;または
(ii)配列番号4および配列番号10および配列番号12および配列番号28および配列番号29および配列番号30;または
(iii)配列番号5および配列番号10および配列番号13および配列番号28および配列番号29および配列番号30;または
(iv)配列番号4および配列番号10および配列番号12および配列番号28および配列番号29および配列番号30;または
(v)配列番号6および配列番号10および配列番号14および配列番号28および配列番号29および配列番号30;または
(vi)配列番号7および配列番号11および配列番号15および配列番号28および配列番号29および配列番号30;または
(vii)配列番号8および配列番号10および配列番号16および配列番号28および配列番号29および配列番号30;または
(viii)配列番号9および配列番号10および配列番号17および配列番号28および配列番号29および配列番号30;または
(ix)配列番号9および配列番号10および配列番号12および配列番号28および配列番号29および配列番号30;または
(x)配列番号9および配列番号10および配列番号18および配列番号28および配列番号29および配列番号30
を含むことが特に好ましい。
本発明の一実施形態では、抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体が、CD40(好ましくは、ヒトCD40)の第1のドメイン(D1)内のエピトープに結合する。
例えば、本発明の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体は、CD40に対する結合について、本発明の例示的な抗体(Table A(表1)を参照されたい;以下の実施例においても記載される)のうちの1または複数と競合しうる。
したがって、本発明の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体は、本発明の例示的な抗体のうちの1または複数と同じCD40エピトープに結合しうる。
本発明の好ましい一実施形態では、抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体が、本発明の例示的な抗体(Table A(表1)に示される)のうちの1つのVLとVHとの対を含む。
したがって、特に好ましい実施形態では、抗体、その抗原結合断片、変異体、融合体、または誘導体が、以下のアミノ酸配列:
(i)配列番号19および配列番号31;または
(ii)配列番号20および配列番号32;または
(iii)配列番号21および配列番号33;または
(iv)配列番号22および配列番号34;または
(v)配列番号23および配列番号35;または
(vi)配列番号24および配列番号36;または
(vii)配列番号25および配列番号37;または
(viii)配列番号26および配列番号38;または
(ix)配列番号27および配列番号39
を含む可変軽鎖(VL)および可変重鎖(VH)を含む。
好ましくは、抗体、その抗原結合断片、変異体、融合体、または誘導体が、抗体のFc領域を含む。当業者は、Fc部分が、IgG抗体に由来する場合もあり、抗体の異なるクラス(IgM、IgA、IgD、またはIgEなど)に由来する場合もあることを察知するであろう。例えば、Fc領域は、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体、またはIgG4抗体に由来しうる。しかし、Fc領域は、IgG1抗体に由来することが有利である。
Fc領域は、自然発生(例えば、内因的に産生された抗体の部分)の場合もあり、人工の場合もある(例えば、自然発生のFc領域と比べた1または複数の点突然変異を含む)。FcRに結合するそれらの能力を改善する点突然変異を有するFc領域は、例えば、血清半減期を改変することにより有利な場合もあり、ADCCおよびCDCに関与するFcγ受容体(FcγR)への結合を改善することにより有利な場合もある。特に、FcγRIIBへの結合を増強する突然変異、例えば、S267E(Strohlら、2009、Curr Opin Biotechnol、20: 685〜691頁)は、本発明がFcγRIIBへの結合と、抗CD40抗体の機能的活性との連関をもたらすのに有利でありうる(Liら、2011、Science、333: 1030〜1034頁)。
一実施形態では、Fc領域が、配列番号62のアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる。
本発明の抗体、その抗原結合断片、変異体、融合体、または誘導体は、IgG分子であるか、またはIgG分子の抗原結合断片、変異体、融合体、もしくは誘導体であることが好ましい。特に好ましいIgG配列のアミノ酸配列は、付属の実施例において記載される。
本発明の一実施形態では抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体が、直接的および/または間接的に細胞傷害性でありうる細胞傷害性部分をさらに含む。
「直接的に細胞傷害性の」により、本発明者らは、この部分が、それ自体で細胞傷害性の部分であるという意味を包含する。「間接的に細胞傷害性の」により、本発明者らは、この部分が、細胞傷害性であるが、それ自体で細胞傷害性ではなく、例えば、さらなる分子に対するこの部分の作用により、またはこの部分に対するさらなる作用により細胞傷害作用を誘導しうる部分であるという意味を包含する。
細胞傷害性部分は、細胞内にある場合に細胞傷害性であり、好ましくは、細胞外にある場合は細胞傷害性でないことが好都合である。
好ましくは、本発明は、細胞傷害性部分が、直接的に細胞傷害性の化学療法剤である、抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体を提供する。場合によって、細胞傷害性部分は、直接的に細胞傷害性のポリペプチドである。当技術分野では、細胞傷害性の化学療法剤がよく知られている。
抗がん剤などの細胞傷害性化学療法剤には、メクロレタミン(HN2)などの窒素マスタード、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン(L-サルコリシン)、およびクロランブシルを含めたアルキル化剤;エチレンイミンおよびヘキサメチルメラミン、チオテパなどのメチルメラミン;ブスルファンなどのアルキルスルホン酸塩;カルムスチン(BCNU)、ロムスチン(CCNU)、セムスチン(メチル-CCNU)などのニトロソウレア、およびストレプトゾシン(ストレプトゾトシン);ならびにデカルバジン(DTIC;ジメチルトリアゼノイミダゾールカルボキサミド)などのトリアゼン;メトトレキサート(アメトプテリン)などの葉酸類似体を含めた代謝拮抗剤;フルオロウラシル(5-フルオロウラシル;5-FU)、フロクスウリジン(フルオロデオキシウリジン;FUdR)、およびシタラビン(シトシンアラビノシド)などのピリミジン類似体;ならびにメルカプトプリン(6-メルカプトプリン;6-MP)、チオグアニン(6-チオグアニン;TG)、およびペントスタチン(2'-デオキシコホルマイシン)などのプリン類似体および類縁の阻害剤が含まれる。天然生成物には、ビンブラスチン(VLB)およびビンクリスチンなどのビンカアルカロイド;エトポシドおよびテニポシドなどのエピポドフィロトキシン;ダクチノマイシン(アクチノマイシンD)、ダウノルビシン(ダウノマイシン;ルビドマイシン)、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン(ミトラマイシン)、およびマイトマイシン(マイトマイシンC)などの抗生剤;L-アスパラギナーゼなどの酵素;ならびにインターフェロンアルフェノームなどの生物学的応答修飾剤が含まれる。その他の薬剤には、シスプラチン(cis-DDP)およびカルボプラチンなどの白金配位錯体;ミトキサントロンおよびアントラサイクリンなどのアントラセンジオン;ヒドロキシウレアなどの置換尿素;プロカルバジン(N-メチルヒドラジン、MIH)などのメチルヒドラジン誘導体;ならびにミトタン(o,p'-DDD)およびアミノグルテチミドなどの副腎皮質抑制剤;タキソールおよび類似体/誘導体;ならびにフルタミドおよびタモキシフェンなどのホルモンアゴニスト/アンタゴニストが含まれる。
多様なこれらの薬剤の、抗体および他の標的部位送達薬剤への接合は、既になされているので、当業者は、これらの薬剤を含む本発明の抗体を容易に作製することができる。例えば、カルボジイミドコンジュゲーション(参照により本明細書に組み込まれる、BaumingerおよびWilchek (1980)、Methods Enzymol. 70、151〜159頁)を用いて、ドキソルビシンを含めた多様な薬剤を、抗体またはペプチドへとコンジュゲートすることができる。
カルボジイミドは、一般式R1-N=C=N-R2[式中、R1およびR2は、脂肪族または芳香族であることが可能であり、ペプチド結合の合成に用いられる]を有する化合物群を含む。調製手順は簡単であり、比較的迅速であり、穏和な条件下で実行される。カルボジイミド化合物は、カルボキシル基を攻撃して、それらを遊離アミノ基に対する反応性部位へと変化させる。
水溶性のカルボジイミドである1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)は特に、官能性部分を、結合部分へとコンジュゲートするのに有用であり、ドキソルビシンを、腫瘍ホーミングペプチドへとコンジュゲートするのに用いることができる。ドキソルビシンと結合部分とのコンジュゲーションは、ドキソルビシンにより供与されるアミノ基と、抗体により供与されるカルボキシル基との存在を要請する。
カルボジイミドを、直接的なペプチド結合の形成に用いることに加えて、EDCはまた、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステルなどの活性エステルを調製するのにも用いることができる。次いで、アミノ基だけに結合するNHSエステルを用いて、ドキソルビシンの単一のアミノ基とのアミド結合の形成を誘導することができる。EDCおよびNHSの組合せによる使用は一般に、コンジュゲート形成の収率を増大させる目的でコンジュゲーションに用いられる。(BaumingerおよびWilchek、前出、1980)。
また、細胞傷害性部分を抗体へとコンジュゲートするための他の方法も用いることができる。例えば、過ヨウ素酸ナトリウムによる酸化の後、グルタルアルデヒドによる架橋形成など、適切な反応剤の還元性のアルキル化を用いることができる。しかし、本発明のコンジュゲートを作製するどの方法が選択されるのかに関わらず、抗体がそのターゲティング能力を維持し、官能性部分が、その関与性の官能性を維持するのかどうかの決定を下さなければならないことが認識される。
本発明の一実施形態では、細胞傷害性部分が、細胞傷害性ペプチド部分または細胞傷害性ポリペプチド部分であり、これにより、本発明者らは、細胞死をもたらす任意の部分を包含する。当技術分野では、細胞傷害性ペプチド部分および細胞傷害性ポリペプチド部分がよく知られており、これらには、例えば、リシン、アブリン、シュードモナス属の外毒素、組織因子などが含まれる。当技術分野ではまた、それらを抗体などのターゲティング部分へと連結する方法も知られている。細胞傷害作用剤としてのリシンの使用は、参照により本明細書に組み込まれる、BurrowsおよびThorpe (1993)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90、8996〜9000頁において記載されており、腫瘍に対して限局的な血栓形成および梗塞をもたらす組織因子の使用は、Ranら(1998)、Cancer Res. 58、4646〜4653頁;およびHuangら(1997)、Science 275、547〜550頁により記載されている。Tsaiら(1995)、Dis. Colon Rectum 38、1067〜1074頁は、モノクローナル抗体にコンジュゲートしたアブリンA鎖について記載しており、参照により本明細書に組み込まれる。細胞傷害作用剤としてのタンパク質を不活化させる他のリボソームは、WO96/06641において記載されている。また、シュードモナス属の外毒素も、細胞傷害性のポリペプチド部分として用いることができる(例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Aielloら(1995)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92、10457〜10461頁を参照されたい)。
また、TNFαおよびIL-2など、特定のサイトカインも、細胞傷害作用剤として有用でありうる。
また、特定の放射性原子も、十分な用量で送達されれば細胞傷害性でありうる。したがって、細胞傷害性部分は、用いられると、細胞傷害性となるのに十分な量の放射能を標的部位へと送達する放射性原子を含みうる。適切な放射性原子には、リン32、ヨウ素125、ヨウ素131、インジウム111、レニウム186、レニウム188、もしくはイットリウム90、または近傍の細胞、細胞小器官、もしくは核酸を破壊するのに十分なエネルギーを放射する他の任意のアイソトープが含まれる。本発明の薬剤中のアイソトープおよび放射性原子の密度は、4000cGyを超える用量(少なくとも6000、8000、または10000cGyであることが好ましい)が標的部位へと送達され、好ましくは、標的部位における細胞およびそれらの細胞小器官、特に、核へと送達されるようなアイソトープおよび放射性原子の密度であることが好ましい。
放射性原子は、抗体、その抗原結合断片、変異体、融合体、または誘導体に、既知の方途により結合させることができる。例えば、EDTAまたは別のキレート化剤を結合部分に接合させ、111Inまたは90Yに接合させるのに用いることができる。チロシン残基は、125Iまたは131Iで直接的に標識することができる。
細胞傷害性部分は、適切な間接的に細胞傷害性のポリペプチドでありうる。特に好ましい実施形態では、間接的に細胞傷害性のポリペプチドが、酵素活性を有し、非毒性および/または相対的に非毒性のプロドラッグを、細胞傷害作用薬へと転換しうるポリペプチドである。抗体の場合、この種の系は、ADEPT(抗体誘導性酵素プロドラッグ療法)と呼ばれることが多い。この系は、抗体が、酵素部分を、患者の体内の所望の部位へと配置し、酵素がその部位に局在化する時間を経過させた後で、酵素に対する基質であり、触媒反応の最終産物が細胞傷害性化合物であるプロドラッグを投与することを要請する。手法の目的は、所望の部位における薬物濃度を最大化し、正常組織における薬物濃度を最小化することである(Senter、P.D.ら(1988)、「Anti-tumour effects of antibody-alkaline phosphatase conjugates in combination with etoposide phosphate」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85、4842〜4846頁; Bagshawe (1987)、Br. J. Cancer 56、531〜2頁;およびBagshawe、K.D.ら(1988)、「A cytotoxic agent can be generated selectively at cancer sites」、Br. J. Cancer. 58、700〜703頁を参照されたい)。
好ましい実施形態では、細胞傷害性部分が、非細胞傷害性のプロドラッグを、細胞傷害性の薬物へと転換することが可能である。
本明細書において記載されるターゲティング酵素を用いる系の酵素およびプロドラッグは、既に提起された酵素およびプロドラッグのうちのいずれかでありうる。細胞傷害効果物質は、アルキル化剤など、任意の既存の抗がん薬;DNA内に挿入される薬剤;ジヒドロ葉酸レダクターゼ、チミジンシンセターゼ、リボヌクレオチドレダクターゼ、ヌクレオシドキナーゼ、もしくはトポイソメラーゼなど、任意の鍵となる酵素を阻害する薬剤;または他の任意の細胞内構成要素と相互作用することにより、細胞死をもたらす薬剤でありうる。エトポシドとは、トポイソメラーゼ阻害剤の例である。
報告されているプロドラッグ系には、大腸菌β-グルクロニダーゼにより活性化するフェノールマスタードのプロドラッグ(Wangら、1992;およびRofflerら、1991);ヒトβ-グルクロニダーゼにより活性化するドキソルビシンのプロドラッグ(Bossletら、1994);コーヒー豆α-ガラクトシダーゼにより活性化するさらなるドキソルビシンのプロドラッグ(Azoulayら、1995);コーヒー豆α-D-ガラクトシダーゼにより活性化するダウノルビシンのプロドラッグ、(Gessonら、1994);大腸菌β-D-ガラクトシダーゼにより活性化する5-フルオロウリジンのプロドラッグ(Abrahamら、1994);およびカルボキシペプチダーゼAにより活性化するメトトレキサートのプロドラッグ(例えば、メトトレキサートアラニン)(Kuefnerら、1990; Vitolsら、1992;およびVitolsら、1995)が含まれる。これらのプロドラッグ系および他のプロドラッグ系は、以下のTable B(表2)に包含されている。
Table A(表1)は、これらの多様な系についての完全な参考文献を得ることができる、Bagshawe (1995)、Drug Dev. Res. 34、220〜230頁から転載したものであり、タキソール誘導体については、Rodrigues, M.L.ら(1995)、Chemistry & Biology 2、223頁において記載されている。
酵素部分の形成部分に適する酵素には、カルボキシペプチダーゼG、G1、およびG2(グルタミル化マスタードのプロドラッグ用)、カルボキシペプチダーゼAおよびB(MTXベースのプロドラッグ用)、およびアミノペプチダーゼ(2-α-アミノシルMTCのプロドラッグ用)などのエクソペプチダーゼ、;例えば、トロンボリシン(トロンビンのプロドラッグ用)などのエンドペプチダーゼ;ホスファターゼ(例えば、アルカリホスファターゼ)またはスルファターゼ(例えば、アリールスルファターゼ)などのヒドロラーゼ(リン酸化プロドラッグ用または硫酸化プロドラッグ用);ペニシリンアミダーゼおよびアリールアシルアミダーゼなどのアミダーゼ;β-ラクタマーゼなどのラクタマーゼ;β-グルクロニダーゼなどのグリコシダーゼ(β-グルクロノミドによるアントラサイクリン用)、α-ガラクトシダーゼ(アミグダリン用)およびβ-ガラクトシダーゼ(β-ガラクトースによるアントラサイクリン用);シトシンデアミナーゼなどのデアミナーゼ(5FC用);ウロキナーゼおよびチミジンキナーゼなどのキナーゼ(ガンシクロビル用);ニトロレダクターゼ(CB1954および類似体用)、アゾレダクターゼ(アゾベンゼンマスタード用)、およびDT-ジアフォラーゼ(CB1954用)などのレダクターゼ;グルコースオキシダーゼ(グルコース用)、キサンチンオキシダーゼ(キサンチン用)、およびラクトペルオキシダーゼなどのオキシダーゼ;DL-ラセマーゼ、触媒性抗体、およびシクロデキストリンが含まれる。
プロドラッグは、細胞傷害作用薬と比較して相対的に非毒性であることが好ましい。プロドラッグは、適切なin vitroの細胞傷害作用試験において測定される毒性の10%未満であることが典型的であり、in vitroの細胞傷害作用試験において測定される毒性の1%未満であることが好ましい。
プロドラッグを細胞傷害作用薬へと転換することが可能な部分は、本発明の薬剤の残りの部分から単離しても活性であろうが、(a)それが本発明の薬剤の残りの部分と組み合わされる場合、および(b)本発明の薬剤を、標的細胞に接合させるか、標的細胞に隣接させるか、または標的細胞内に内部化する場合に活性となるためだけに必要である可能性が高い。
各部分がポリペプチドである場合、これらの2つの部分は、O'Sullivanら(1979)、Anal. Biochem. 100、100〜108頁において一般に記載されている方途など、ポリペプチドを架橋形成する従来の方途のうちのいずれかにより併せて連結することができる。例えば、抗体、その抗原結合断片、変異体、融合体、または誘導体は、チオール基、およびこれらのチオール基と反応することが可能な二官能性薬剤と反応するさらなる部分、例えば、ヨード酢酸のN-ヒドロキシスクシンイミドエステル(NHIA)またはN-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸(SPDP)に富む可能性がある。例えば、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルにより達成されるアミド結合およびチオエーテル結合は一般に、in vivoにおいてジスルフィド結合より安定的である。
代替的に、抗体、その抗原結合断片、変異体、融合体、または誘導体は、組換えDNA技法により、ある長さのDNAが、本発明の薬剤の所望の特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域と互いに隣接するかまたはこれにより隔てられる薬剤の2つの部分をコードする各領域を含む、融合化合物として作製することができる。場合によって、薬剤の2つの部分は、完全または部分的に重複しうる。
細胞傷害性部分は、放射線増感剤でありうる。放射線増感剤には、フルオロピリミジン、チミジン類似体、ヒドロキシウレア、ゲムシタビン、フルダラビン、ニコチン酸アミド、ハロゲン化ピリミジン、3-アミノベンズアミド、3-アミノベンゾジアミド、エタニダゾール、ピモニダゾール、およびミソニダゾールが含まれる(例えば、McGinnら(1996)、J. Natl. Cancer Inst. 88、1193〜11203頁; ShewachおよびLawrence (1996)、Invest. New Drugs 14、257〜263頁; Horsman (1995)、Acta Oncol. 34、571〜587頁; ShenoyおよびSingh (1992)、Clin. Invest. 10、533〜551頁; Mitchellら(1989)、Int. J. Radial Biol. 56、827〜836頁; IliakisおよびKurtzman (1989)、Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 16、1235〜1241頁; Brown (1989)、Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 16、987〜993頁; Brown (1985)、Cancer 55、2222〜2228頁を参照されたい)。
また、遺伝子の細胞への送達、例えば、p53遺伝子またはサイクリンDの送達も、細胞の放射線感受性を増大させることが可能である(Langら(1998)、J. Neurosurg. 89、125〜132頁; Coco Martinら(1999)、Cancer Res. 59、1134〜1140頁)。
さらなる部分は、照射されると、細胞傷害性となるか、細胞傷害性部分を放出する部分でありうる。例えば、アイソトープであるボロン10は、適切に照射されると、細胞傷害性であるα粒子を放出する(例えば、GoldenbergによるUS4,348,376; Primusら(1996)、Bioconjug. Chem. 7、532〜535頁を参照されたい)。
同様に、細胞傷害性部分は、フォトフリンなどの光力学療法において有用な部分でありうる(例えば、Doughertyら(1998)、J. Natl. Cancer Inst. 90、889〜905頁を参照されたい)。
さらなる部分は、直接的または間接的に細胞傷害性である核酸分子を含みうる。例えば、核酸分子は、標的部位に局在化すると、細胞に侵入し、それらの死をもたらすことが可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドでありうる。したがって、オリゴヌクレオチドは、必須の遺伝子の発現を阻止するか、またはアポトーシスを引き起こす遺伝子発現の変化をもたらすオリゴヌクレオチドでありうる。代替的に、細胞傷害性部分は、直接的および/または間接的に細胞傷害性であるポリペプチドをコードする核酸分子でもある。
適切なオリゴヌクレオチドの例には、bcl-2を指向するオリゴヌクレオチド(Zieglerら(1997)、J. Natl. Cancer Inst. 89、1027〜1036頁)、ならびにDNAポリメラーゼαおよびトポイソメラーゼIIαを指向するオリゴヌクレオチド(Leeら(1996)、Anticancer Res. 16、1805〜1811頁)が含まれる。
ペプチド核酸は、従来の核酸の代わりに有用でありうる(KnudsenおよびNielsen (1997)、Anticancer Drugs 8、113〜118頁を参照されたい)。
さらなる実施形態では、抗体、その抗原結合断片、変異体、融合体、または誘導体が、核酸を標的へと送達するための送達媒体内に含まれうる。送達媒体は、任意の適切な送達媒体でありうる。送達媒体は、例えば、核酸を含有するリポソームの場合もあり、核酸を送達することが可能なウイルスまたはウイルス様粒子の場合もある。これらの場合において、送達される分子は、送達媒体の表面上に存在することが典型的である。例えば、リポソームの外部表面には適切な抗体断片を存在させることができ、リポソームの内部には送達される核酸を存在させることができる。別の例として述べると、レトロウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターなどのウイルスベクターは、結合部分が、ウイルス粒子の表面に結合するか、またはそこに配置され、したがって、ウイルス粒子を所望の部位へとターゲティングすることが可能となるように操作する。また、WO94/10323において記載される改変アデノウイルス系など、ターゲティングされた送達系であって、DNAが、アデノウイルス粒子内またはアデノウイルス様粒子内に保有されることが典型的な送達系も知られている。Michaelら(1995)、Gene Therapy 2、660〜668頁は、細胞選択的部分を繊維タンパク質へと添加させるアデノウイルスの改変について記載している。ターゲティングされたレトロウイルスはまた、本発明における使用にも利用可能である;例えば、特異的な結合アフィニティーを付与する配列は、既存のウイルスenv遺伝子内へと操作することができる。(遺伝子療法用にターゲティングされたこのベクターおよび他のベクターの総説については、MillerおよびVile (1995)、Faseb J. 9、190〜199頁を参照されたい)。
イムノリポソーム(抗体指向リポソーム)を用いることができる。イムノリポソームを調製するには、MartinおよびPapahadjopoulos (1982)、J. Biol. Chem. 257、286〜288頁の方法に従い、MPB-PE (N-[4-(p-マレイミドフェニル)-ブチリル]-ホスファチジルエタノールアミン)を合成する。MPB-PEを、リポソームの二重層へと組み込み、抗体またはその断片のリポソーム表面への共有結合的カップリングを可能とする。例えば、DNAまたは他の遺伝子コンストラクトの溶液中で前記リポソームを形成した後、最高0.8MPaの窒素圧下における小孔サイズが0.6μmおよび0.2μmのポリカーボネート膜によるフィルターを介して逐次的に射出することにより、リポソームに、標的細胞へと送達するためのDNAまたは他の遺伝子コンストラクトを充填すると好都合である。射出後、封入されたDNAコンストラクトを、80000×gで45分間にわたる超遠心分離により遊離DNAコンストラクトから分離する。脱酸素化された緩衝液中の新たに調製されたMPB-PEリポソームを、新たに調製された抗体(またはその断片)と混合し、4℃で一晩にわたる定常的な撹拌回転下の窒素雰囲気中でカップリング反応を実行する。イムノリポソームを、80000×gで45分間にわたる超遠心分離によりコンジュゲートされていない抗体から分離する。イムノリポソームは、腹腔内注射することもでき、腫瘍へと直接注射することもできる。
標的部位へと送達される核酸は、直接的または間接的に細胞傷害作用をもたらす任意の適切なDNAでありうる。例えば、核酸は、細胞に対して細胞傷害性であるリボザイムをコードする場合もあり、実質的に非毒性のプロドラッグを、細胞傷害作用薬へと転換することが可能な酵素をコードする場合もある(この後者の系を、場合によって、GDEPT:遺伝子指向酵素プロドラッグ療法と称する)。
標的へと送達される核酸内でコードされうるリボザイムは、参照により全てが本明細書に組み込まれる、CechおよびHerschlag、「Site-specific cleavage of single stranded DNA」、US5,180,818; Altmanら、「Cleavage of targeted RNA by RNAse P」、US5,168,053、Cantinら、「Ribozyme cleavage of HIV-1 RNA」、US5,149,796; Cechら、「RNA ribozyme restriction endoribonucleases and methods」、US5,116,742; Beenら、「RNA ribozyme polymerases、dephosphorylases、restriction endonucleases and methods」、US5,093,246;およびBeenら、「RNA ribozyme polymerases、dephosphorylases、restriction endoribonucleases and methods; cleaves single-stranded RNA at specific site by transesterification」、US4,987,071において記載されている。リボザイムに適する標的には、c-fosおよびc-myc、ならびにbcl-2などの転写因子が含まれる。Duraiら(1997)、Anticancer Res. 17、3307〜3312頁は、bcl-2に対するハンマーヘッド型リボザイムについて記載している。
EP0415731は、GDEPT系について記載している。酵素およびプロドラッグの選択に関しては、上記で記載したADEPT系の場合と同様の検討事項が、GDEPT系にも適用される。
標的部位へと送達される核酸は、直接的に細胞傷害性のポリペプチドをコードしうる。
代替的に、さらなる部分は、直接的または間接的に細胞傷害性ではなく、治療的利益を有するポリペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含みうる。このようなポリペプチドの例には、抗増殖性サイトカインまたは抗炎症性サイトカインが含まれ、血栓形成に影響を及ぼす抗増殖性因子または免疫調節性因子は、医療において、例えば、がんの処置において有益でありうる。
さらなる部分は、アンジオスタチンまたはエンドスタチンのペプチドなどの血管新生阻害剤であると有用でありうる。さらなる部分はまた、前駆体のポリペプチドを、アンジオスタチンまたはエンドスタチンへと転換する酵素であっても有用でありうる。マクロファージエラスターゼ、ゼラチナーゼ、およびストロメリシンなどのヒトマトリックスメタロプロテアーゼは、プラスミノーゲンを、アンジオスタチンへと転換する(Corneliusら(1998)、J. Immunol. 161、6845〜6852頁)。プラスミノーゲンとは、アンジオスタチンの前駆体である。
一実施形態では、抗体、その抗原結合断片、変異体、融合体、または誘導体が、放射性原子、例えば、リン32、ヨウ素125、ヨウ素131、インジウム111、レニウム186、レニウム188、イットリウム90からなる群から選択される放射性原子を含む細胞傷害性部分を含む。
好ましい実施形態では、本発明は、容易に検出可能な部分をさらに含む、抗体、その抗原結合断片、変異体、融合体、または誘導体を提供する。
「容易に検出可能な部分」により、本発明者らは、この部分が、本発明の薬剤を患者へと投与した後、標的部位に配置されると、体外および配置された標的部位から非侵襲的に検出されうることが典型的な部分であるという意味を包含する。したがって、本発明の本実施形態の薬剤は、造影および診断において有用である。
容易に検出可能な部分は、造影で有用な放射性原子であるか、またはこれを含むことが典型的である。シンチグラフィー研究に適する放射性原子には、99mTcおよび123Iが含まれる。他の容易に検出可能な部分には、例えば、ここでもまた123I、131I、111In、19F、13C、15N、17O、ガドリニウム、マンガン、または鉄など、磁気共鳴造影(MRI)のためのスピン標識が含まれる。分子が容易に検出可能であるためには、本発明の薬剤が、適量の適切な原子のアイソトープを有さなければならないことが明らかである。
放射線または他の標識は、既知の方途により組み込むことができる。例えば、抗体、その抗原結合断片、変異体、融合体、または誘導体は、生合成される場合もあり、例えば、水素の代わりにフッ素19を伴う適切なアミノ酸前駆体を用いる化学的アミノ酸合成により合成される場合もある。99mTc、123l、186Rh、188Rh、および111Inなどの標識は、例えば、ポリペプチド内のシステイン残基を介して接合させることができる。イットリウム90は、リシン残基を介して接合させることができる。IODOGEN法(Frakerら(1978)、Biochem. Biophys. Res. Comm. 80、49〜57頁)は、123Iを組み込むのに用いることができる。参考文献(「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」、J-F Chatal、CRC Press、1989)は、他の方法について詳細に記載している。
容易に検出可能な部分は、例えば、テクネシウム99mまたはヨウ素123などの放射性原子を含むことが好ましい。
代替的に、容易に検出可能な部分は、ヨウ素123、ヨウ素131、インジウム111、フッ素19、炭素13、窒素15、酸素17、ガドリニウム、マンガン、鉄を含む群から選択することができる。
本発明のさらなる好ましい実施形態では、さらなる部分が、細胞傷害性部分または容易に検出可能な部分に、直接的または間接的に、選択的に結合することが可能である。
したがって、この実施形態では、さらなる部分が、細胞傷害性であるか、または容易に検出可能であるさらなる化合物または構成要素に結合する任意の部分でありうる。
したがって、さらなる部分は、さらなる化合物または構成要素に選択的に結合する抗体の場合もあり、ストレプトアビジンまたはビオチンなどの他の一部の結合部分の場合もある。以下の例では、本発明に包含される種類の分子について例示する。他のこのような分子は、本明細書の教示から容易に明らかである。
本発明には、1つの結合部位が、本発明の抗体、その抗原結合断片、変異体、融合体、または誘導体を含み、第2の結合部位が、例えば、実質的に非毒性のプロドラッグを細胞傷害作用薬へと転換することが可能な酵素に結合する部分を含む、二重特異性抗体が包含される。
本発明の抗体、その抗原結合断片、変異体、融合体、および誘導体は、有用な研究用試薬および治療用薬剤であることが察知されるであろう。本発明の抗体、その抗原結合断片、変異体、融合体、および誘導体は、検出可能に標識することが適切であり、例えば、それらを、直接的または間接的に検出されうる形で標識することができる。
抗体は、放射性部分または有色部分または蛍光部分で標識することが好都合であるか、またはそれらを酵素に連結することができる。酵素は、非有色(または非蛍光)基質を、有色(または蛍光)生成物へと転換しうる酵素であることが典型的である。抗体は、ビオチン(またはストレプトアビジン)で標識し、次いで、放射性部分または有色部分、または蛍光部分などで標識されたストレプトアビジン(またはビオチン)を用いて間接的に検出することもでき、上記で記載した種類の任意の酵素に連結することもできる。
容易に検出可能な部分は、放射性原子、例えば、テクネシウム99mまたはヨウ素123、またはヨウ素123、ヨウ素131、インジウム111、フッ素19、炭素13、窒素15、酸素17、ガドリニウム、マンガン、鉄からなる群から選択される放射性原子を含むことが好ましい。
第2の態様では、本発明は、本発明に従う抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体をコードする核酸分子、またはその成分であるポリペプチド鎖を提供する。「核酸分子」により、本発明者らは、一本鎖または二本鎖でありうるDNA分子、cDNA分子、およびmRNA分子を包含する。
核酸分子は、配列番号40;配列番号41;配列番号42;または配列番号43;または配列番号44;または配列番号45;または配列番号46;または配列番号47;または配列番号48;または配列番号49;または配列番号50;または配列番号51;または配列番号52;または配列番号53;または配列番号54;または配列番号55;または配列番号56;または配列番号57からなる群から選択される1または複数のヌクレオチド配列を含むことが好ましい。
なおより好ましくは、本発明は以下のヌクレオチド配列:
(i)配列番号40および配列番号49;または
(ii)配列番号41および配列番号50;または
(iii)配列番号42および配列番号52;または
(iv)配列番号43および配列番号53;または
(v)配列番号44および配列番号54;または
(vi)配列番号45および配列番号55;または
(vii)配列番号46および配列番号56;または
(viii)配列番号47および配列番号57;または
(ix)配列番号48および配列番号51
を含む、核酸分子を提供する。
第3の態様では、本発明は、本発明の第2の態様に従う核酸分子を含むベクターを提供する。
好ましくは、ベクターが、発現ベクターである。「発現ベクター」により、本発明者らは、適切な宿主内で、核酸分子によりコードされるポリペプチドを発現させることが可能なベクターを意味する。
このようなベクターは、有用な量を作製するために、宿主細胞内でコードされる本発明の抗体、その抗原結合断片、変異体、融合体、または誘導体を発現させるのに有用でありうる。
核酸分子、とりわけ、DNAを、ベクターへと、例えば、相補的な付着末端を介して作動可能に連結するための多様な方法が開発されている。例えば、相補的なホモポリマートラクトを、ベクターDNAへと挿入されるDNAセグメントへと添加しうる。次いで、ベクターとDNAセグメントとを、相補的なホモポリマーテール間の水素結合により接合して、組換えDNA分子を形成する。
1または複数の制限部位を含有する合成リンカーは、DNAセグメントをベクターへと接合する代替法をもたらす。例えば、エンドヌクレアーゼによる制限消化を介して生成するDNAセグメントを、突出する3'側一本鎖末端をそれらの3'側から5'側へのエクソヌクレアーゼ活性により除去する酵素であるバクテリオファージのT4 DNAポリメラーゼまたは大腸菌のDNAポリメラーゼIで処理し、3'側の凹端をそれらの重合化活性で充填する。
したがって、これらの活性の組合せにより、平滑端のDNAセグメントが生成する。次いで、平滑端のセグメントを、バクテリオファージのT4 DNAリガーゼなど、平滑端DNA分子のライゲーションを触媒することが可能な酵素の存在下で、モル過剰の大きなリンカー分子と共にインキュベートする。したがって、反応生成物は、それらの端部にポリマーのリンカー配列を保有するDNAセグメントである。次いで、これらのDNAセグメントを適切な制限酵素で切断し、これらのDNAセグメントの末端と適合可能な末端を生成させる酵素で切断された発現ベクターへとライゲーションした。
多様な制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する合成リンカーは、International Biotechnologies Inc.、New Haven、CN、USAを含めた多数の販売元から市販されている。
ポリペプチドをコードするDNAを修飾する所望の方途は、PCRを用いることである。この方法は、例えば、適切な制限部位における操作により、DNAを適切なベクターへと導入するのに用いることもでき、当技術分野で知られる他の有用な方途により、DNAを修飾するのに用いることもできる。
この方法では、酵素的に増幅されるDNAを、それら自体が増幅されるDNAへと組み込まれる2つの特異的プライマーで挟む。特異的プライマーは、制限エンドヌクレアーゼ認識部位であって、当技術分野で知られた方法を用いて発現ベクターへとクローニングするのに用いうる認識部位を含有しうる。
次いで、DNA(またはレトロウイルスベクターの場合は、RNA)を適切な宿主内で発現させて、本発明の薬剤を含むポリペプチドを生成させる。したがって、ポリペプチドをコードするDNAを、既知の技法に従い用い、本明細書に含有される教示の観点から適切に修飾して、発現ベクターを構築することができ、次いで、これを、ポリペプチドを発現させて産生するのに適する宿主細胞を形質転換するのに用いる。このような技法には、それらの全てが参照により本明細書に組み込まれる、1984年4月3日に取得されたRutterらによる米国特許第4,440,859号、1985年7月23日に取得されたWeissmanによる同第4,530,901号、1986年4月15日に取得されたCrowlによる同第4,582,800号、1987年6月30日に取得されたMarkらによる同第4,677,063号、1987年7月7日に取得されたGoeddelによる同第4,678,751号、1987年11月3日に取得されたItakuraらによる同第4,704,362号、1987年12月1日に取得されたMurrayによる同第4,710,463号、1988年7月12日に取得されたToole Jr.らによる同第4,757,006号、1988年8月23日に取得されたGoeddelらによる同第4,766,075号、および1989年3月7日に取得されたStalkerによる同第4,810,648号において開示されている技法が含まれる。
ポリペプチドをコードするDNA(またはレトロウイルスベクターの場合は、RNA)は、適切な宿主へと導入するための多種多様な他のDNA配列へと接合することができる。対の片方のDNAは、宿主の性質、DNAを宿主へと導入する形、およびエピソーム内の維持が所望されるのか組込みが所望されるのかに依存する。
一般に、DNAは、適正な方向および発現に適確なリーディングフレームにより、プラスミドなどの発現ベクターへと挿入する。必要な場合、DNAは、所望の宿主により認識される、適切な転写および翻訳のための調節的な制御ヌクレオチド配列に連結することができるが、このような制御は一般に、発現ベクター内で利用可能である。次いで、ベクターを、標準的な技法を介して宿主へと導入する。一般に、宿主の全てが、ベクターにより形質転換されるとは限らない。したがって、形質転換された宿主細胞を選択することが必要となる。1つの選択法は、発現ベクターへの、形質転換される細胞における抗生剤耐性などの選択可能な形質をコードする任意の必要な制御エレメントを伴うDNA配列の組込みを伴う。代替的に、このような選択可能な形質に対する遺伝子を、所望の宿主細胞を共形質転換するのに用いられる別のベクターに存在させることもできる。
次いで、本発明の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を、十分な時間にわたり、本明細書で開示される教示の観点から当業者に知られた適切な条件下で培養して、ポリペプチドの発現を可能とし、次いで、これを回収することができる。
細菌(例えば、大腸菌(Escherichia coli)および枯草菌(Bacillus subtilis))、酵母(例えば、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae))、糸状真菌(例えば、アスペルギルス(Aspergillus)属)、植物細胞、動物細胞、および昆虫細胞を含めた多くの発現系が知られている。
ベクターを、原核生物以外の他の細胞型において発現させるために用いる場合であっても、ベクターには、原核細胞内で増殖させるための、ColE1 oriなどの原核生物レプリコンを組み入れることが典型的である。ベクターにはまた、それにより形質転換される大腸菌などの細菌の宿主細胞内の遺伝子の発現(転写および翻訳)を方向付けることが可能な原核生物プロモーターなどの適切なプロモーターも組み入れることができる。
プロモーターとは、DNA配列により形成される発現制御エレメントであって、RNAポリメラーゼの結合および転写が生じることを可能とする発現制御エレメントである。例示的な細菌宿主と適合可能なプロモーター配列は、本発明のDNAセグメントを挿入するのに好都合な制限部位を含有するプラスミドベクター内に備えられることが典型的である。
典型的な原核生物ベクタープラスミドは、Biorad Laboratories(Richmond、CA、USA)から入手可能なpUC18、pUC19、pBR322、およびpBR329、ならびにPharmacia、Piscataway、NJ、USAから入手可能なpTrc99AおよびpKK223-3である。
典型的な哺乳動物細胞によるベクタープラスミドは、Pharmacia、Piscataway、NJ、USAから入手可能なpSVLである。このベクターでは、SV40後期プロモーターを用いて、クローニングされた遺伝子の発現を駆動し、最高レベルの発現は、COS-1細胞などのT抗原産生細胞において見出される。
誘導型哺乳動物発現ベクターの例は、これもまたPharmaciaから入手可能なpMSGである。このベクターでは、マウス乳がんウイルスの長末端反復配列のグルココルチコイド誘導型プロモーターを用いて、クローニングされた遺伝子の発現を駆動する。
有用な酵母プラスミドベクターは、pRS403-406およびpRS413-416であり、Stratagene Cloning Systems、La Jolla、CA 92037、USAから一般に入手可能である。プラスミド pRS403、pRS404、pRS405、およびpRS406は、酵母組込み型プラスミド(Yips)であり、酵母選択マーカーであるHIS3、TRP1、LEU2、およびURA3を組み込む。プラスミドpRS413-416は、酵母セントロメアプラスミド(Ycps)である。
当技術分野では、多様な宿主細胞と共に用いられる他のベクターおよび発現系もよく知られている。
第4の態様では、本発明は、本発明の第2の態様に従う核酸分子または本発明の第3の態様に従うベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。
宿主細胞は、細菌細胞またはヒト細胞などの哺乳動物細胞であることが好ましい。
宿主細胞は、原核細胞の場合もあり、真核細胞の場合もある。細菌細胞は、好ましい原核生物の宿主細胞であり、例えば、Bethesda Research Laboratories Inc.、Bethesda、MD、USAから入手可能な大腸菌株であるDH5、およびRockville、MD、USAのAmerican Type Culture Collection(ATCC)から入手可能なRR1(受託番号: ATCC 31343)などの大腸菌株であることが典型的である。好ましい真核生物の宿主細胞には、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞が含まれ、マウス、ラット、サル、またはヒトの線維芽細胞系および腎臓細胞系に由来する脊椎動物細胞などの脊椎動物細胞であることが好ましい。酵母の宿主細胞には、Stratagene Cloning Systems、La Jolla、CA 92037、USAから一般に入手可能なYPH499、YPH500、およびYPH501が含まれる。好ましい哺乳動物の宿主細胞には、ATCCからCRL 1658として入手可能なチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞およびヒト胎児由来腎臓細胞である293細胞が含まれる。好ましい昆虫細胞は、バキュロウイルス発現ベクターをトランスフェクトしうるSf9細胞である。
適切な細胞宿主の、本発明のDNAコンストラクトによる形質転換は、よく知られている方法であって、用いられるベクターの種類に依存することが典型的な方法により達成される。原核生物の宿主細胞の形質転換については、例えば、Cohenら(1972)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69、2110頁;およびSambrookら(1989)、Molecular Cloning, A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NYを参照されたい。酵母細胞の形質転換は、Shermanら(1986)、Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor、NYにおいて記載されている。また、Beggs (1978)、Nature 275、104〜109頁の方法も有用である。脊椎動物細胞については、このような細胞をトランスフェクトするのに有用な試薬、例えば、リン酸カルシウム処方物およびDEAE-デキストラン処方物またはリポソーム処方物が、Stratagene Cloning SystemsまたはLife Technologies Inc.、Gaithersburg、MD 20877、USAから入手可能である。
また、電気穿孔も、細胞を形質転換および/またはトランスフェクトするのに有用であり、当技術分野では、酵母細胞、細菌細胞、昆虫細胞、および脊椎動物細胞の形質転換でよく知られている。
例えば、多くの細菌種を、参照により本明細書に組み込まれる、Luchanskyら(1988)、Mol. Microbiol. 2、637〜646頁において記載される方法により形質転換することができる。25μFDで1cm当たり6250Vを用いた2.5XのPEB中に懸濁させたDNA細胞混合物の電気穿孔後では、最大数の形質転換細胞が常に回収される。
酵母を電気穿孔により形質転換するための方法は、BeckerおよびGuarente (1990)、Methods Enzymol. 194、182頁において開示されている。
形質転換に成功した細胞、すなわち、本発明のDNAコンストラクトを含有する細胞は、よく知られた技法により同定することができる。例えば、本発明の発現コンストラクトの導入から結果として生じる細胞を成長させて、本発明のポリペプチドを作製することができる。細胞を採取し、溶解させ、Southern (1975)、J. Mol. Biol. 98、503頁またはBerentら(1985)、Biotech. 3、208頁により記載されている方法などの方法を用いて、それらのDNA内容物をDNAの存在について検討することができる。代替的に、以下で記載される通りに、抗体を用いて上清中のタンパク質の存在を検出することもできる。
組換えDNAの存在について直接的にアッセイすることに加えて、組換えDNAが、タンパク質の発現を方向付けることが可能な場合は、形質転換の成功を、よく知られている免疫学的方法により確認することもできる。例えば、発現ベクターによる形質転換に成功した細胞は、適切な抗原性を提示するタンパク質を産生する。
形質転換されたことが疑われる細胞の試料は、採取され、適切な抗体を用いてタンパク質についてアッセイされる。
宿主細胞は、非ヒト動物の体内の宿主細胞でありうる。したがって、本発明に従う薬剤(またはその結合部分)を、トランス遺伝子の存在により発現させる非ヒトトランスジェニック動物も包含される。非ヒトトランスジェニック動物は、マウスなどの齧歯動物であることが好ましい。非ヒトトランスジェニック動物は、当技術分野でよく知られた方法を用いて作製することができる。
第5の態様では、本発明は、有効量の本発明の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体と、医薬として許容される緩衝液、賦形剤、希釈剤、または担体とを含む医薬組成物を提供する。
本明細書で用いられる「治療有効量」または「有効量」または「治療的に有効な」は、所与の状態および投与レジメンに治療効果をもたらす量を指す。これは、要請される添加剤および希釈剤、すなわち、担体または投与媒体と会合して所望の治療効果をもたらすように計算された活性抗体の所定量である。さらに、活性、機能、および宿主の応答が臨床的に重要な程度に不足することを軽減または阻止するのに十分な量を意味することが意図される。代替的に、治療有効量とは、宿主における臨床的に重大な状態の改善を引き起こすのに十分でもある。当業者により察知される通り、化合物の量は、その特異的活性に応じて変化しうる。適切な用量は、要請される希釈剤と会合して所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性組成物を含有しうる。
治療有効量は、当技術分野でよく知られている通り、医療または獣医療の技術分野の当業者が、年齢、体重、性別、状態、合併症、他の疾患など、患者の特徴に基づき決定することができる。
したがって、抗体またはその抗原結合断片、変異体、融合体、もしくは誘導体は、用いられるポリペプチドの有効性/毒性に応じて、多様な濃度で調合することができる。処方物は、活性ポリペプチドを、0.1μM〜1mMの間、例えば、1μM〜500μMの間、500μM〜1mMの間、または300μM〜700μMの間の濃度で含むことが好ましい。
「医薬として許容される」により、処方物が無菌であり、発熱物質を含まないことが包含される。医薬の技術分野では、適切な医薬担体がよく知られている。担体は、本発明の抗体と適合可能であり、そのレシピエントに対して有害でないという意味で「許容可能」でなければならない。担体は、無菌であり、発熱物質を含まない水または生理食塩液であることが典型的であるが、他の許容可能な担体も用いることができる。
当技術分野では、医薬として許容される適切な緩衝液、希釈剤、担体、および賦形剤がよく知られている(それらの開示が参照により本明細書に組み込まれる、Remington's Pharmacerutical Sciences、18版、A.R Gennaro編、Mack Publishing Company (1990);およびHnadbook of Parmaceutical Excipients、3版、A. Kibbe編、Pharmaceutical Press (2000)を参照されたい)。
「緩衝液」という用語は、pHを安定化させることを目的とする酸塩基混合物を含有する水溶液を包含することを意図する。緩衝液の例は、Trizma緩衝液、Bicine緩衝液、Tricine緩衝液、MOPS緩衝液、MOPSO緩衝液、MOBS緩衝液、トリス緩衝液、Hepes緩衝液、HEPBS緩衝液、MES緩衝液、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、グリコール酸緩衝液、乳酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、ACES緩衝液、ADA緩衝液、酒石酸緩衝液、AMP緩衝液、AMPD緩衝液、AMPSO緩衝液、BES緩衝液、CABS緩衝液、カコジル酸緩衝液、CHES緩衝液、DIPSO緩衝液、EPPS緩衝液、エタノールアミン緩衝液、グリシン緩衝液、HEPPSO緩衝液、イミダゾール緩衝液、イミダゾール乳酸緩衝液、PIPES緩衝液、SSC緩衝液、SSPE緩衝液、POPSO緩衝液、TAPS緩衝液、TABS緩衝液、TAPSO緩衝液、およびTES緩衝液である。
「希釈剤」という用語は、医薬調製物中の薬剤を希釈することを目的とする水溶液または非水性の溶液を包含することを意図する。希釈剤は、生理食塩液、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、または油(サフラワー油、トウモロコシ油、ラッカセイ油、綿実油、またはゴマ油など)のうちの1または複数でありうる。
「アジュバント」という用語は、処方物へと添加されて、本発明の薬剤の生物学的作用を増大させる任意の化合物を包含することを意図する。アジュバントは、例えば、異なるアシル組成物のフッ化物イオン、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン、チオシアン酸イオン、亜硫酸イオン、水酸化物イオン、リン酸イオン、炭酸イオン、乳酸イオン、グリコール酸イオン、クエン酸イオン、ホウ酸イオン、酒石酸イオン、および酢酸イオンであるがこれらに限定されない異なるアニオンを伴う亜鉛、銅、または銀の塩のうちの1または複数でありうる。アジュバントはまた、カチオン性セルロースエーテル、カチオン性セルロースエステル、脱アセチル化ヒアルロン酸、キトサンなどのカチオン性ポリマー、カチオン性デンドリマー、ポリ(ビニルイミダゾール)など、カチオン性の合成ポリマー、ならびにポリヒスチジン、ポリリシン、ポリアルギニン、およびこれらのアミノ酸を含有するペプチドなどのカチオン性ポリペプチドでもありうる。
賦形剤は、炭水化物、ポリマー、脂質、および鉱物のうちの1または複数でありうる。炭水化物の例には、例えば、凍結乾燥化を容易とするための組成物へと添加される、ラクトース、ブドウ糖、スクロース、マンニトール、およびシクロデキストリンが含まれる。ポリマーの例は、例えば、粘性を制御するため、生体接着を達成するため、または脂質を化学的分解およびタンパク質分解から保護するために組成物へと添加される、デンプン、セルロースエーテル、セルロースカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸、カラギーナン、ヒアルロン酸、およびその誘導体、ポリアクリル酸、ポリスルホン酸塩、ポリエチレングリコール/酸化ポリエチレンコポリマー、酸化ポリエチレン/ポリ酸化プロピレンコポリマー、加水分解の程度が異なるポリビニルアルコール/ポリビニル酢酸、およびポリビニルピロリドン、分子量の異なるこれらの全てである。脂質の例は、ポリマーの場合の理由と同様の理由で組成物へと添加される、脂肪酸、リン脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、およびトリグリセリド、セラミド、スフィンゴ脂質、および糖脂質、アシル鎖の長さおよび飽和度が異なるこれらの全て、卵黄レシチン、ダイズレシチン、水素化卵黄レシチンおよび水素化ダイズレシチンである。鉱物の例は、液体の蓄積の低減または有利な色素特性などの利益を得るために組成物へと添加される、滑石、酸化マグネシウム、酸化亜鉛、および酸化チタンである。
本発明の抗体ベースの活性薬剤は、その送達に適するように、当技術分野で知られている、任意の種類の医薬組成物へと調合することができる。
一実施形態では、本発明の医薬組成物を、リポソームの形態とすることが可能であり、この場合、薬剤は、他の医薬として許容される担体に加えて、ミセル、不溶性の単分子層、および液晶などの凝集形態で存在する脂質などの両親媒性剤と組み合される。限定せずに述べると、リポソーム処方物に適する脂質には、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リソレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸などが含まれる。また、適切な脂質には、血流中の循環時間を延長するために、極性ヘッド基内のポリ(エチレングリコール)により修飾された上記の脂質も含まれる。このようなリポソーム処方物の調製は、例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、US4,235,871において見出すことができる。
本発明の医薬組成物はまた、生体分解性のマイクロスフェアの形態でもありうる。マイクロスフェアの作製では、ポリ(乳酸)(PLA)、ポリ(グリコール酸)(PGA)、PLAとPGAとのコポリマー(PLGA)、またはポリ(カプロラクトン)(PCL)、およびポリ無水物などの脂肪族ポリエステルが、生体分解性ポリマーとして広く用いられている。このようなマイクロスフェアの調製は、それらの開示が参照により本明細書に組み込まれる、US5,851,451およびEP0213303において見出すことができる。
さらなる実施形態では、本発明の医薬組成物が、デンプン、セルロースエーテル、セルロースカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸、カラギーナン、ヒアルロン酸、およびその誘導体、ポリアクリル酸、ポリビニルイミダゾール、ポリスルホン酸塩、ポリエチレングリコール/酸化ポリエチレンコポリマー、酸化ポリエチレン/ポリ酸化プロピレンコポリマー、加水分解の程度が異なるポリビニルアルコール/ポリビニル酢酸、およびポリビニルピロリドンなどのポリマーが、薬剤を含有する溶液を増粘化するために用いられたポリマーゲルの形態で提供される。ポリマーはまた、ゼラチンまたはコラーゲンも含む。
代替的に、薬剤を、生理食塩液、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノールまたは油(サフラワー油、トウモロコシ油、ラッカセイ油、綿実油、またはゴマ油など)、トラガントガム、および/または多様な緩衝液中に単に溶解させることもできる。
本発明の医薬組成物には、活性薬剤の効果を強化するために、イオンおよび規定されたpHを組み入れうることが察知されるであろう。さらに、組成物は、滅菌化など、従来の製薬工程にかけられる場合もあり、かつ/または防腐剤、安定化剤、保湿剤、乳化剤、緩衝液、充填剤など、従来のアジュバントを含有する場合もある。
本発明に従う医薬組成物は、当業者に知られた任意の適切な経路を介して投与することができる。したがって、可能な投与経路には、非経口(静脈内、皮下、および筋内)経路、局所経路、眼内経路、鼻腔内経路、肺内経路、口腔内経路、経口経路、膣内経路、および直腸内経路が含まれる。また、インプラントからの投与も可能である。
医薬組成物は、腫瘍部位における、または腫瘍部位の近傍における投与、例えば、腫瘍内投与または腫瘍周囲投与に適すると有利である。
医薬組成物は、非経口投与に適することが好ましい。医療および製薬の当業者には、抗体を医薬組成物へと調合するための方法がよく知られているであろう。好ましい組成物は、付属の実施例でも記載される。
本発明の薬剤(すなわち、抗体、その抗原結合断片、変異体、融合体、または誘導体)、医薬、および医薬組成物は、注射用の持続放出型薬物送達系を用いて送達することができる。これらは、とりわけ、注射の頻度を低減するようにデザインされている。このような系の例は、組換えヒト成長ホルモン(rhGH)を生体分解性のマイクロスフェア内に封入するNutropin Depotであって、注射されると、rhGHをある持続時間にわたりゆっくりと放出するNutropin Depotである。送達は、筋内(i.m.)送達および/または皮下(s.c.)送達および/または静脈内(i.v.)送達で実施することが好ましい。
本発明の薬剤、医薬、および医薬組成物は、手術により植え込まれたデバイスであって、薬物を要請される部位へと直接放出するデバイスにより投与することができる。例えば、Vitrasertは、ガンシクロビルを眼へと直接放出して、CMV網膜炎を処置する。この毒性薬剤を疾患部位へと直接適用すれば、この薬物の全身にわたる重大な副作用を伴わずに、効果的な療法が達成される。
また、電気穿孔療法(EPT)系も、本発明の薬剤、医薬、および医薬組成物を投与するために使用することができる。パルス電場を細胞へと送達するデバイスは、細胞膜の薬物透過性を増大させる結果として、細胞内への薬物送達を大幅に増強する。
本発明の薬剤、医薬、および医薬組成物はまた、エレクトロインコーポレーション(electro-incorporation; EI)によっても送達することができる。EIは、皮膚の表面における最大直径30ミクロンの小型の粒子が、電気穿孔において用いられるパルスと同一または同様の電気パルスを受けるときに生じる。EIでは、これらの粒子が、角質層を通り、皮膚の深層へと駆動される。粒子は、薬物または遺伝子を充填されるかまたはこれらでコーティングされる場合もあり、皮膚にそれを介して薬物を投入しうる小孔を施す「弾丸」としてのみ作用する場合もある。
本発明の薬剤、医薬、および医薬組成物を送達する代替的な方法は、感熱性のReGel注射用システムである。ReGelは、体温より低温では、注射用の液体であるのに対し、体温では、既知の安全な生体分解性ポリマーへとゆっくり崩壊および溶解するゲル状レザバーを瞬時に形成する。活性物質は、生体ポリマーが溶解する時間にわたり送達される。
本発明の薬剤、医薬、および医薬組成物はまた、経口送達することもできる。この過程では、ビタミンB12および/またはビタミンDの体内への経口による取込みのための天然の過程を使用して、タンパク質およびペプチドを共送達する。ビタミンB12および/またはビタミンDの取込み系に便乗することにより、本発明の薬剤、医薬、および医薬組成物は、腸管壁を通過しうる。ビタミンB12類似体および/またはビタミンD類似体と薬物との複合体であって、複合体のビタミンB12部分/ビタミンD部分の内因性因子(IF)に対する大きなアフィニティー、および複合体の活性物質の大きな生体活性の両方を保持する複合体が合成される。
本発明の薬剤、医薬、および医薬組成物は、「トロイペプチド」により細胞へと導入することができる。これらのペプチドは、ペネトラチンと称するポリペプチドのクラスであって、移行特性を有し、親水性の化合物を、細胞膜を越えて運ぶことが可能なクラスである。この系により、オリゴペプチドを、細胞質および核へと直接ターゲティングすることが可能となり、細胞型特異的ではないが高度に効率的でありうる。Derossiら(1998)、Trends Cell Biol. 8、84〜87頁を参照されたい。
好ましくは、本発明の医薬および/または医薬組成物は、1日当たりの用量もしくは単位、1日当たりの部分用量、またはその適切な画分の有効成分を含有する単位用量である。
本発明の薬剤、医薬、および医薬組成物は通常、有効成分を含む医薬組成物の形態で、場合によって、非毒性の有機酸もしくは無機酸または塩基、添加塩の形態で、医薬として許容される投与形態で、経口投与されるかまたは任意の非経口経路を介して投与される。処置される障害および患者のほか、投与経路にも応じて、組成物は、用量を変化させて投与することができる。
ヒトの療法では、本発明の薬剤、医薬、および医薬組成物を、単独で投与しうるが、一般には、意図される投与経路および医薬についての標準的な慣行に照らして選択される、適切な医薬賦形剤、希釈剤、または担体と混合して投与する。
例えば、本発明の薬剤、医薬、および医薬組成物は、即時放出適用、遅延放出適用、または制御放出適用のために、香味剤または着色剤を含有しうる、錠剤、カプセル、膣坐薬、エリキシル剤、溶液、または懸濁液の形態で、経口投与することもでき、口腔内投与することもでき、舌下投与することもできる。本発明の薬剤、医薬、および医薬組成物はまた、陰茎海綿体内注射を介して投与することもできる。
このような錠剤は、結晶セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、二塩基性リン酸カルシウム、およびグリシンなどの賦形剤、デンプン(好ましくはトウモロコシデンプン、バレイショデンプン、またはタピオカデンプン)、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、および特定のケイ酸複合体などの崩壊剤、ならびにポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)、ヒドロキシプロピルセルロース(HPC)、スクロース、ゼラチン、およびアカシアなどの造粒結合剤を含有しうる。さらに、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリル、および滑石などの潤滑剤も組み入れることができる。
また、同様の種類の固体組成物も、ゼラチンカプセル内で充填剤として使用することができる。この点で好ましい賦形剤には、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖、または高分子量のポリエチレングリコールが含まれる。水性懸濁液および/またはエリキシル剤のために、本発明の薬剤、医薬、および医薬組成物は、多様な甘味剤または香味剤、着色物質または色素、乳化剤および/または懸濁剤、ならびに水、エタノール、プロピレングリコール、およびグリセリン、ならびにこれらの組合せなどの希釈剤と組み合せることもできる。
本発明の薬剤、医薬、および医薬組成物は、非経口投与、例えば、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、髄腔内投与、脳室内投与、胸骨内投与、頭蓋内投与、筋内投与、または皮下投与することもでき、注入法を介して投与することもできる。それらは、他の物質、例えば、溶液を血液と等張性とするのに十分な塩またはブドウ糖を含有しうる、滅菌水溶液の形態で最もよく用いられる。必要な場合は、水溶液を適切に(好ましくは3〜9のpHへと)緩衝処理すべきである。無菌条件下における適切な非経口処方物の調製は、当業者によく知られた標準的な製薬法により容易に達成することができる。
非経口投与に適する医薬、および医薬組成物には、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、および処方物を意図されるレシピエントの血液と等張性とする溶質を含有しうる、水性および非水性の滅菌注射溶液;ならびに懸濁剤および増粘剤を組み入れうる、水性および非水性の滅菌懸濁液が含まれる。医薬、および医薬組成物は、単位用量の容器内または複数回投与用の容器内、例えば、密封アンプル内およびバイアル内に入れ、使用の直前に滅菌の液体担体、例えば、注射用水の添加だけを要請するフリーズドライ(凍結乾燥)状態で保存することができる。即席の注射溶液および懸濁液は、既に記載した種類の滅菌の粉末、顆粒、および錠剤から調製することができる。
本発明の薬剤、医薬、および医薬組成物はまた、鼻腔内投与することもでき、吸入を介して投与することもでき、乾燥粉末吸入器または適切な高圧ガス、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、1,1,1,2-テトラフルオロエタン(HFA 134A3または1,1,1,2,3,3,3-ヘプタフルオロプロパン(HFA 227EA3)などのハイドロフルオロアルカン、二酸化炭素、もしくは他の適切な気体の使用を伴う加圧型容器、ポンプ、スプレー、もしくは噴霧器からのエアゾールスプレーの提示の形態で送達されると好都合である。加圧型エアゾールの場合、用量単位は、計量された量を送達するバルブを装備するにより決定することができる。加圧型容器、ポンプ、スプレー、または噴霧器は、例えば、エタノールと、潤滑剤、例えば、ソルビタントリオレエートをさらに含有しうる溶媒としての高圧ガスとの混合物を用いる、活性薬剤の溶液または懸濁液を含有しうる。吸入器または注入器内で用いられるカプセルおよびカートリッジ(例えば、ゼラチンから作製される)は、本発明の薬剤と、ラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤との粉末ミックスを含有するように調合することができる。
代替的に、本発明の薬剤、医薬、および医薬組成物は、坐剤またはペッサリーの形態で投与することもでき、ローション、溶液、クリーム、ゲル、軟膏、または散布用粉末の形態で局所適用することもできる。本発明の薬剤、医薬、および医薬組成物はまた、例えば、皮膚パッチを用いることにより経皮投与することもできる。それらはまた、特に、眼の疾患を処置するために、眼内経路を介しても投与することができる。
眼科的使用のためには、本発明の薬剤、医薬、および医薬組成物を、等張性でpHを調整した滅菌生理食塩液中で微粒化された懸濁液として調合することもでき、好ましくは、場合によって、塩化ベンザルコニウムなどの防腐剤と組み合わせた、等張性でpHを調整した滅菌生理食塩液中の溶液として調合することもできる。代替的に、それらは、ワセリンなどの軟膏中に調合することもできる。
皮膚へと局所適用するためには、本発明の薬剤、医薬、および医薬組成物を、例えば、以下:鉱物油、液体ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン薬剤、乳化ワックス、および水のうちの1または複数を伴う混合物中に懸濁または溶解させた活性薬剤を含有する適切な軟膏として調合することができる。代替的に、それらは、例えば、以下:鉱物油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリエチレングリコール、液体パラフィン、ポリソルベート60、セチルエステルワックス、セテアリールアルコール、2-オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、および水のうちの1または複数の混合物中に懸濁または溶解させた適切なローションまたはクリームとしても調合することができる。
口腔内の局所投与に適する処方物には、通常はスクロースおよびアカシアまたはトラガントである香味を施された主成分中に有効成分を含むトローチ;ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシアなど、不活性の主成分中に有効成分を含む芳香錠;ならびに適切な液体担体中に有効成分を含む口腔洗浄剤が含まれる。
ヒトでは一般に、本発明の薬剤、医薬、および医薬組成物の、腫瘍部位における局所投与または腫瘍部位の近傍における局所投与、特に、腫瘍内投与または腫瘍周囲投与が、好ましい経路である。
獣医学的使用のためには、本発明の薬剤、医薬、および医薬組成物を、通常の獣医学的実践に従う適切な許容される処方物として投与し、獣外科医が、特定の動物に最も適する投与レジメンおよび投与経路を決定する。
第6の態様では、本発明は、本発明の第5の態様に従う医薬組成物を含むキットを提供する。
第7の態様では、本発明は、医療における使用のための、本発明の第1の態様に従う抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体、あるいは本発明の第2の態様に従う核酸分子、あるいは本発明の第3の態様に従うベクター、あるいは本発明の第4の態様に従う宿主細胞、あるいは本発明の第5の態様に従う医薬組成物を提供する。
第8の態様では、本発明は、がんの処置における使用のための、本発明の第1の態様に従う抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体、あるいは本発明の第2の態様に従う核酸分子、あるいは本発明の第3の態様に従うベクター、あるいは本発明の第4の態様に従う宿主細胞、あるいは本発明の第5の態様に従う医薬組成物を提供する。
第9の態様では、本発明は、がんの処置のための医薬の製造における、本発明の第1の態様に従う抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体、あるいは本発明の第2の態様に従う核酸分子、あるいは本発明の第3の態様に従うベクター、あるいは本発明の第4の態様に従う宿主細胞、あるいは本発明の第5の態様に従う医薬組成物を提供する。
本発明の第7の態様および/または第8の態様および/または第9の態様では、がんの処置が、有効量の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体、あるいは核酸分子、あるいはベクター、あるいは宿主細胞、あるいは医薬組成物を、それを必要とする個体へと投与するステップを含むことが好ましい。
第10の態様では、本発明は、がんを伴う個体を処置するための方法であって、それを必要とする個体へと、有効量の、本発明の第1の態様に従う抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体、あるいは本発明の第2の態様に従う核酸分子、あるいは本発明の第3の態様に従うベクター、あるいは本発明の第4の態様に従う宿主細胞、あるいは本発明の第5の態様に従う医薬組成物を投与するステップを含む方法を提供する。
本発明の第7の態様および/または第8の態様および/または第9の態様および/または第10の態様では、それを必要とする個体へと投与するステップが、局所投与、例えば、患者における腫瘍への局所投与(例えば、腫瘍内投与または腫瘍周囲投与)を含むことが好ましい。
腫瘍への抗CD40抗体のこのような局所注射は、はるかに低用量で全身性の抗腫瘍効果を生成しうることが知られている(van Mierloら、2002、Proc Natl Acad Sci USA、99: 5561〜5566頁; Kalbashiら、2010、J Immunotherapy、33: 810〜816頁)。さらに、一方の脇腹において腫瘍内処置されたマウスは、反対側の脇腹における腫瘍も消失させることが可能であり、抗腫瘍効果は、樹状細胞の活性化、およびその後の細胞傷害性Tリンパ球による応答の活性化に依存することも報告された。加えて、この処置は、腫瘍再免疫試験に対する防御的免疫ももたらした。
上記で記載した通りに、抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体の用量を患者特異的に最適化した後、次いで、処置の持続時間にわたり、患者に最大治療用量を投与する。しかし、処置が、要請される治療効果を及ぼし始めたら、用量を、ある時間にわたり低下させうることが察知されるであろう。
ヒト患者における抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体の治療用量は、投与1回当たり100μg〜700mgの範囲とする(70kgの体重に基づく)ことが典型的である。
例えば、最大治療用量は、投与1回当たり0.1〜10mg/kg、例えば、0.1〜5mg/kgの間、または1〜5mg/kgの間、または0.1〜2mg/kgの間の範囲としうる。このような用量は、がん専門医/主治医により決定される異なる間隔で投与しうることが察知されるであろう。例えば、用量は、毎日、毎週2回、毎週、隔週、または毎月投与することができる。
一実施形態では、抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体の最大治療用量が低用量である。例えば、本発明において局所投与される用量は、治療効果をもたらすのに必要とされる同じ薬剤の典型的な全身用量の25%未満でありうる。一実施形態では、用量が、投与1回当たり1mg以下、例えば、投与1回当たり500μg、400μg、300μg、200μg、100μg、50μg、30μg、20μg、10μg、5μg、または1μg以下である。このような用量は、例えば、毎日2回、毎日1回、隔日1回、毎週2回、毎週1回、毎月2回、毎月1回など、ある期間にわたり、患者へと繰り返し投与することができることが察知されるであろう。
一実施形態では、抗体ベースの薬剤が、投与1回当たり10μg〜100μgの用量における使用のための薬剤である。
例えば、抗体ベースの薬剤を、投与1回当たり20μg〜40μg、例えば、投与1回当たり30μgの用量で用いることができる。
一実施形態では、抗体ベースの薬剤により、全身性の抗腫瘍効果をもたらすことが可能である。このような全身性の抗腫瘍効果は、療法を局所/腫瘍内において施す場合であっても達成することができる。免疫療法用抗体を、例えば、腫瘍内注射により局所投与する場合、腫瘍領域内の細胞だけがCD40療法の標的とされる。したがって、その効果を及ぼすことが意図される組織領域内のCD40アゴニストの濃度だけが、CD40活性化のレベルに影響を及ぼす。局所投与する場合、最適用量は、患者の体重ではなく、処置に関与性の組織領域の容量により決定することができる。腫瘍内処置を施す場合は、この容量が、代わりに腫瘍容量により規定される。したがって、関与性の総用量は、全身処置の場合の総用量未満であり、患者の体重によるのではなく、PET走査または他の造影法による腫瘍の診断に基づき規定されうる。
本発明の抗体ベースの薬剤は、CD40の活性化が治療的利益をもたらしうる任意の種類のがんの処置において用いるのに適することが察知されるであろう。
例えば、がんは、前立腺がん、乳がん、結腸直腸がん、膵臓がん、卵巣がん、肺がん、子宮頸がん、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、多発性骨髄腫、白血病、急性リンパ性白血病、黒色腫、膀胱がん、および神経膠芽腫からなる群から選択することができる。
一実施形態では、がんが、CD40+腫瘍細胞と関連する。しかし、本発明の抗体ベースの薬剤はまた、CD40腫瘍細胞と関連するがんの処置においても用いることができる。
本発明の抗体ベースの薬剤は、患者におけるがんに対する唯一の処置として用いることができ、組合せ処置(ここで、さらなる処置は、医薬剤、放射線療法、および/または手術でありうる)の一部として用いることもできることがさらに察知されるであろう。
したがって、患者には、がんに対する1または複数のさらなる処置、例えば、医薬剤(化学療法剤など)、放射線療法、および/または手術も施すことができる。
一実施形態では、1または複数のさらなる処置を、従来の化学療法剤(アルキル化剤、代謝拮抗剤、植物アルカロイド、およびテルペノイド、トポイソメラーゼ阻害剤、ならびに抗新生物剤など)、放射線治療用薬剤、抗体ベースの治療用薬剤(ゲムツズマブ、アレムツズマブ、リツキシマブ、トラスツズマブ、ニモツズマブ、セツキシマブ、ベバシズマブなど)、およびステロイドからなる群から選択される。
第11の態様では、本発明は、本発明に従う抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体を作製するための方法であって、本発明の第4の態様に従う宿主細胞を、コードされる抗体またはその抗原結合断片の発現を可能とする条件下で培養するステップを含む方法を提供する。
当技術分野では、宿主細胞を培養し、組換えタンパク質を単離するための方法がよく知られている。宿主細胞に応じて、産生されるタンパク質が異なりうることが察知されるであろう。例えば、酵母細胞または細菌細胞など、特定の宿主細胞は、異なる翻訳後修飾系であって、異なる形で翻訳後修飾されうる本発明の薬剤(またはその結合部分)の形態の産生を結果としてもたらしうる系を有さない場合もあり、これを有する場合もある。
本発明の抗体、その抗原結合断片、変異体、融合体、または誘導体(またはその結合部分)は、哺乳動物細胞などの真核細胞系内で産生されることが好ましい。
それほど好ましくない実施形態に従えば、本発明の抗体、その抗原結合断片、変異体、融合体、または誘導体を、ウサギ網状赤血球溶解物またはコムギ胚芽溶解物(Promegaから入手可能である)など、市販されているin vitro翻訳系を用いて、in vitroにおいて作製することができる。翻訳系は、ウサギ網状赤血球溶解物であることが好ましい。翻訳系は、TNT転写翻訳系(Promega)などの転写系とカップリングしうると好都合である。この系は、コードDNAポリヌクレオチドに由来する適切なmRNA転写物を、翻訳と同じ反応において産生する利点を有する。
薬剤が、異なる部分、例えば、結合ドメインおよび/または細胞傷害性ドメインを含む場合、これらの部分は、1または複数の別個の核酸分子によりコードされうることが察知されるであろう。
本発明のこの態様の作製法は、宿主細胞から産生されるか、またはin vitroの翻訳ミックスから産生された、本発明の抗体、その抗原結合断片、変異体、融合体、または誘導体を単離するさらなるステップを含むことが好ましい。単離は、発現した本発明のポリペプチドに選択的に結合する抗体を使用することが好ましい。
当技術分野では、抗体を作製するための方法がよく知られている。例えば、抗体は、適切なペプチドで免疫化することにより、動物において作製することができる。代替的に、最新の技法により、動物を用いる必要なしに抗体を作製することも可能であり、このような技法には、例えば、当技術分野でよく知られている抗体ファージディスプレイ法が含まれる。
本発明の一実施形態では、抗体、その抗原結合断片、変異体、融合体、または誘導体が、直接的または間接的に、in vitroにおけるタンパク質の最適化(例えば、WO02/48351およびWO03/097834において記載されている、Alligator Bioscience ABのFIND(登録商標)法を用いる)の産物である。
本明細書における、明らかに既に公表された文献についての列挙または考察は、この文献が、必ずしも、最新技術の一部であるか、または共通の一般的知識であることの承認として理解するべきではない。
ここで、以下の図を参照しながら、本発明の特定の態様を実施する好ましい非限定的な例について記載しよう。
ライブラリーおよび選択〜初回のハイスループットスクリーニング(HTS)からの出力についての「ヒートマップ」である。各ボックスは、アミノ酸位置を表す。ヒートマップは、突然変異を導入した位置および/または配列解析により突然変異が見出される位置に限定される。VHとVLとのリンカーは、表示しない。各位置における突然変異の頻度は、濃い影により示される。 選択手順に由来する配列に基づき計算した、5カ所を超える突然変異を伴う位置の数を示す図である。 HTS結果の視覚化を示す図である。2回にわたるELISA測定(正常洗浄および強化洗浄)による比をy軸に表示し、x軸には、初回のELISA(正常洗浄)に由来する結合シグナルを表示する。グラフ内の各点は、1つのクローンに由来するデータを表す。B44(グレー)および選択ラウンド番号5に由来するクローン(黒色)が示される。 CD40のドメインについての概略図である。 37℃および生理学的pHにおける、CD40抗体クローンの標的への結合についての表面プラズモン共鳴解析を示す図である。 CD40抗体クローンによる、表面マーカーCD86の上方調節を、B44抗体と比べて示す図である。 最終日(28日目)において測定される腫瘍の重量を表示する図である。30ugのG12またはアイソタイプ対照による処置を表示する(**マン-ホイットニーの両側検定を用いて対照と比較した両方の処置群について、p<0.01)。 異なる処置群の平均(n=9)腫瘍容量を表示する図である(±SEM)。30ugの薬物で処置されたマウスを、アイソタイプ対照(30ug)で処置されたマウスと比較する。G12による処置は、アイソタイプ対照と比較して大きな抗腫瘍効果をもたらす。 最終日(28日目)において測定される腫瘍の重量を表示する図である。G12を、ヒト樹状細胞およびT細胞の存在下で、PBSによる処置と比較する(各処置群(n=10)には、2匹の異なるドナー(計10匹のマウス中、各ドナーにつき5匹ずつのマウス)に由来する自己T細胞および自己樹状細胞を移植する)。G12による処置は、アイソタイプ対照と比較して有意である(スチューデントの両側t検定を用いて対照と比較した処置群について、p<0.05)。 処置群の平均(n=10)腫瘍容量を表示する図である(±SEM)。マウスを、ヒト樹状細胞およびT細胞の存在下で、30ugのG12で処置し、PBSによる処置と比較した(各処置群(n=10)には、2匹の異なるドナー(計10匹のマウス中、各ドナーにつき5匹ずつのマウス)に由来する自己T細胞および自己樹状細胞を移植した)。G12による処置は、アイソタイプ対照と比較して有意である。 腫瘍を接種されたマウスであって、薬物で処置されたマウスの生存曲線を示す図である。G12による処置は、動物の生存を、アイソタイプ対照と比較して有意に延長する(p<0.013)。G12で処置されたマウスの生存曲線を、S2C6で処置されたマウスの生存曲線と比較する(p<0.13)。S2C6で処置されたマウスの生存を、アイソタイプ対照で処置されたマウスと比較する(p<0.088)。各処置群は、5匹ずつのマウス(N=5)からなった。 薬物で処置された腫瘍保有マウスの生存曲線を示す図である。表示される生存曲線は、プールされたデータに基づく。G12で処置されたマウスの群およびアイソタイプ対照で処置されたマウスの群は、各群において20匹ずつの動物からなった。S2C6で処置されたマウスは、12匹の動物からなった。G12処置群およびS2C6処置群の生存曲線を、ボンフェローニ法を用いて多重比較のために補正するログランク検定により、アイソタイプ対照処置群と比較した。G12による生存曲線は、アイソタイプ対照と比較して有意に異なる(未補正のp<0.004)。 処置されたマウスにおけるサイトカインレベルを表示する図である。10日目の2回目の処置の4時間後に、血清試料を、処置されたマウスから採取し、サイトカインレベルについて解析した。G12、S2C6、およびアイソタイプ対照で処置されたマウスに由来するサイトカインレベルを、ボンフェローニの多重比較試験により補正されたp値を計算する一元Anovaを用いて比較した。G12による処置は、S2C6処置マウスと比較して有意である。***で印をつけたサイトカインレベルは、p<0.001を表示し、**で印をつけたデータは、0.001<p<0.01のp値を表示し、*で印をつけたサイトカインレベルは、0.01<p<0.05のp値を表示した。G12処置群およびS2C6処置群は、23匹ずつのマウス(N=23)からなった。アイソタイプ対照による処置群は、18匹のマウス(N=18)からなった。 処置されたマウスに由来する血清中の抗体レベルを示す図である。1回目(7日目)および2回目(10日目)のG12または対照による処置の4時間後に血清試料を採取し、抗体レベルについて解析した。7および10日目において、抗CD40抗体のクローンであるG12の抗体力価は、クローンであるS2C6と比較して有意に低く、約2分の1であった。G12の平均とS2C6の平均とを比較するために、対応のない片側t検定を用いてp値を計算した。血清G12力価は、標的関連効果に起因して、アイソタイプ対照と比較して約100分の1であった(ヒトCD40陰性マウスにおいて、G12の力価は、アイソタイプの力価と同様である)。同一用量(30μg)のG12およびS2C6による処置後において、G12とS2C6とでは、処置の4時間後の血清中力価に有意差が認められる。これは、G12が、S2C6と比較して、腫瘍内および組織周囲に長く保持されることを示す。この差違は、G12の標的(CD40)に対する、他のCD40抗体、例えば、S2C6と比較して高度なオン速度およびアフィニティーの結果でありうる。***で印をつけた抗体レベルは、p<0.001を表示し、**で印をつけたデータは、0.001<p<0.01のp値を表示した。G12処置群およびS2C6処置群は、23匹ずつのマウス(N=23)からなった。アイソタイプ対照による処置群は、18匹のマウス(N=18)からなった。
(実施例)
(実施例1)
効力が改善されたアゴニスト性CD40抗体の指向的発生
序説
B44抗体は、ヒト抗体断片ディスプレイライブラリーであるn-CoDeR(登録商標)ライブラリーに由来する(Soederlindら、2000)。ランダム突然変異を配列全体にわたり挿入した1つのライブラリーを除き、抗CD40アゴニスト性抗体であるB44のアミノ酸配列および構造モデルを用いて、ライブラリーをデザインした。
本発明の抗体は、以下の通りに調製および選択した。
ライブラリーのデザイン
デザインされた3つのライブラリーおよび1つのランダムライブラリーを、B44抗体の配列解析および構造モデル化に基づき構築した。B44の構造モデルは、タンパク質データバンク(PDB)における、VHに適する鋳型構造である1NL0およびVLに適する鋳型構造である2J6Eに基づいた。
AL-10013-04では、ヌクレオチド配列解析(HoおよびPastan「Therapeutic antibodies: Methods and protocols」、2009、(525)、Humana Press)により、B44における生殖細胞系列のホットスポット残基(LeFrancら、IMGT/V QEST、http://www.imgt.org/IMGTeducation/Tutorials/IGandBcells/_UK/SomaticHypermutations/を参照されたい)を同定した。生殖細胞系列のホットスポットにおける突然変異は、再配列された可変免疫グロブリンドメイン内のアミノ酸位置であって、体細胞超突然変異過程において突然変異を受けやすいアミノ酸位置における突然変異である。生殖細胞系列のCDRL3内のホットスポット残基を、構造的に隣接するCDRL1内で選択された生殖細胞系列のホットスポット残基と共にランダム化した。生殖細胞系列のホットスポットにおける突然変異の各々における可変性は、選択した8〜9カ所の残基へと制限して、複雑性を低減し、高度に機能的なライブラリーを作製した。これらの残基は、複雑性および理論的可変性を、好適なレベルに保持しながら、自然発生のアミノ酸の全て(20)の生理化学的特性(Tanping、Protein Engineering、2003、16、323〜330頁; Koideら、2009、ACS Chemical biology)を表すように選択した。このライブラリーの理論的可変性は、個別の変異体1.9×107個であった。
AL-10013-05では、全ての表面に露出されたCDR残基を、B44の構造モデルに基づき同定した。これらの残基は、さらなる可変性が導入されたH3内の残基を除き、可変性を1または2カ所の相同性残基へと制限して変化させた(図1を参照されたい)。目的は、複雑性および理論的可変性を、好適なレベルに保持しながら、高度に機能的なライブラリーを創出することであった。このライブラリーの理論的可変性は、個別の変異体1.9×107個であった。
デザインされたライブラリーであるAL-10013-06では、CDRL3の中心的部分内の残基および構造的に隣接するCDRH2内の残基をランダム化した(n=11)。残基は、B44の構造モデルから同定した。各位置における可変性は、4〜5カ所の残基へと制限したが、これらの残基は、複雑性および理論的可変性を、好適なレベルに保持しながら、高アフィニティーで「ミニマリスト」のタンパク質結合エピトープを発生させるのに適する生理化学的特性(Koideら、2009、ACS Chemical biology; Fellouseら、2007、J Mol Biol)1、2を表すように選択した。AL-10013-06ライブラリーは、1.6×107個の固有の変異体を含有する。
無作為的に選択されたライブラリーであるAL-10013-07では、B44の配列の全体を、突然変異によるバイアスを最小化するようにデザインされたエラープローンPCR法(Genemorph)を用いてランダム化した。作製されたライブラリーのサイズは、固有の変異体6.3×108個であった。
選択の戦略
出発ライブラリーは、ビオチニル化CD40-Fcγに対する結合剤について濃縮し、これにより、配列のプールを、機能性結合剤をコードする各ライブラリーから創出した(Table 1(表3)における「ラウンド1」)。結合剤についての最初の濃縮は、配列決定により検証した。
その後、FIND(登録商標)を用いて、機能性の変異体をコードする配列のプールを組み換えた。Alligator Bioscience ABのFIND(登録商標)法は、WO02/48351およびWO03/097834において記載されている。
FIND(登録商標)組換えライブラリーは、2×108個の固有の変異体を含んだ。
作製されたFIND(登録商標)組換えライブラリーを、4ラウンドのさらなる選択(Table 1(表3)における「ラウンド2〜5」)にかけた。
各選択ラウンドからは、ハイスループットアッセイにより、約2,000個のクローンを選択およびスクリーニングした。アフィニティー成熟のための選択プロトコールは、以下の特性:アフィニティー、オン速度、オフ速度、多量体化、およびエピトープの維持に影響を及ぼすステップを包含した。
・アフィニティーを増大させるために、3ラウンドで抗原濃度を10分の1とした後、2ラウンドで抗原濃度を5分の1とするステップを包含した。
・オン速度を保持するようにデザインし、インキュベーション時間を短縮することにより対処した。
・オフ速度は、洗浄の厳密性を増大させることにより改善するようにデザインした。ラウンド4および5では、非ビオチニル化CD40を組み入れて多量体化を阻止し、アビディティーについての選択を抑制した。
選択〜初回のハイスループットスクリーニングからの結果を、ライブラリーの「ヒートマップ」にまとめるが、これにより、各ライブラリーにおいて発生させた突然変異の位置および頻度が示される(図1A)。
図1Bは、FIND(登録商標)による組換え法が、アフィニティーをなおも改善しながら、突然変異した残基の数をいかに減少させるのかを裏付ける。
ハイスループットスクリーニング(HTS)
各選択ラウンドからは、ハイスループットアッセイにより、約2,000個のクローンを選択およびスクリーニングした。
ハイスループットスクリーニングアッセイは、以下の通りにデザインした。オフ速度を直接結合ELISAの2つの異なる洗浄条件で測定するための方法を実施した。改善されたオフ速度は、2つの測定値の比の増大と相関した。ハイスループットアッセイからの結果は、ELISAにおける結合シグナルと対比した測定比としてプロットした(図2)。
HTSアッセイは、大腸菌の粗上清中のScFv-his断片の、マイクロ滴定プレート内にコーティングされたCD40への結合を測定するサンドイッチELISAに基づいた。
白色384ウェル平底高結合プレート(Greiner: #781074)を、室温で2時間にわたり、または4℃で一晩にわたりインキュベートすることにより、CD40mFc(Apollo: #9025H)でコーティングした。プレートを洗浄し(洗浄緩衝液:PBS+0.05%のTween 20(PBST)、Medicago #09-9410-100、ELx405マイクロプレート洗浄剤(BioTek))、次いで、PBST+3%の脱脂粉乳(Semper)中でブロッキングした。プレートを再度洗浄し、試料または対照をウェルへと添加した。試料を室温で1時間にわたりインキュベートし、次いで、通常洗浄(3回にわたる洗浄サイクル)または強化洗浄(3回にわたる洗浄サイクルの後、PBSTを伴う30分間にわたるインキュベーションの後、3回にわたる洗浄サイクル)を用いて洗浄した。
検出用AbであるPenta-His-HRP(Qiagen: #1014992)を添加し、その後、SuperSignal Pico Chemiluminescent基質(Therrmo: #37069)を用いてプレートを現像し、Envisionリーダー(Perkin Elmer)で検出した。
(実施例2)
例示的な抗CD40抗体のアフィニティーの改善
FIND(登録商標)組換え抗CD40抗体を、CD40受容体に対するアフィニティー(KD)の改善について選択した。抗CD40抗体の標的に対するアフィニティーは、表面プラズモン共鳴により決定し、計算された反応速度定数を、Table 1(表3)およびTable 2(表4)に示す。アフィニティーは、抗CD40抗体クローンについて、元のB44抗体と比較して約100倍改善された(Table 2(表4)および図3;生理学的pHおよび37℃で)。
抗CD40抗体クローンによるアフィニティーの改善はまた、低度のpHでも観察された(Table 2(表4))。表面プラズモン共鳴を用いて、pH 5.4および37℃における反応速度定数を決定し、B44抗体と比較した。
結果は、pHを5.4へと低下させることにより全体のアフィニティーに及ぶ影響は、中程度に過ぎず、B44と比較したアフィニティーの増大は維持される(オフ速度とオン速度とは個別に変化したが)ことを示す。これは、本発明を用いる局所免疫療法のための臨床的利益でありうる。
材料および方法
表面プラズモン共鳴により同定される反応速度パラメータおよびアフィニティー定数の決定
Biacore 3000測定器を用いる表面プラズモン共鳴による精製抗体のアフィニティーの測定は、製造元のプロトコールに従い実施した。
従来のアミンカップリングを用いて、CD40hfc(R&Dsystems、USA)を、BIAcore製のセンサーチップであるCM5へと固定化した。本発明の抗CD40抗体(1〜0.012nMで1/3倍に系列希釈された)、を、HBS-P(GE、BR-1003-68)中の結合について、37℃およびpH 7.3における流速30μl/分で解析した。会合を3分間にわたり、解離を10分間にわたり追跡した。再生は、50mMのNaOHを用いて、30秒間ずつ2回にわたり実施した。反応速度パラメータおよびアフィニティー定数は、BIAevaluation 4.1ソフトウェアを用いて計算した。
代替的に、試料を、37℃、pH 5.4の酢酸緩衝液(10mMの酢酸、150mMのNaCl、0.005%のT20)中でもインキュベートした。
結果を、Tables 2および3(表4および5)に示す。
結果
(実施例3)
本発明の例示的な抗体のエピトープマッピングおよび交差反応性
CD40受容体は、各々が2種類のモジュラーユニット(NaismithおよびSprang、1998、Trends Biochem、(23)、74〜79頁)からなり、各モジュールを、1つまたは2つのジスルフィド結合により安定化させた、4つの細胞外ドメインからなる。選択されたscFvの微細な特異性を解析するために、各scFvエピトープの位置を、ドメインマッピングにより決定した。FACScan解析(Ellmarkら、2002、Immunologyにより記載されている)を用いて、トランスフェクトされたCOS-7細胞またはL細胞の表面上で発現する切断型CD40コンストラクトに結合するscFv断片の能力を測定した。本発明の例示的な抗体は、CD40の第1のモジュールが除去されたコンストラクト(D1/B2)に結合することは可能であったが、CD40の第1のドメイン全体が除去されたコンストラクトに結合することは可能でなかった(図4およびTable 4(表6)を参照されたい)。
交差特異性
本発明の抗体クローンは、カニクイザル、アカゲザル、および他の関与性のマカク種に由来するCD40と交差反応する。それらは、マウスCD40またはイヌCD40とは交差反応しない。
(実施例4)
例示的な抗CD40抗体による樹状細胞表面分子の上方調節
CD40受容体のライゲーションは、樹状細胞の活性化を誘導し、これは、特異的な抗腫瘍T細胞応答の活性化を潜在的にもたらす。抗CD40抗体で処置された単球由来樹状細胞は、表面分子CD80、CD83、CD86、およびHLA-DRの発現の上方調節を提示する。T細胞の活性化の共刺激では、表面分子CD80およびCD86の上方調節が要請される。
他のアゴニスト性CD40抗体、例えば、CP-870,893のB細胞を活性化する効力は、樹状細胞を活性化する効力の約20倍である(Gladueら、2011、Cancer Immunol Immunother 60[7]; 1009〜1017頁)。
樹状細胞の活性化は、B細胞の活性化より臨床的な関与性が大きく、B細胞に対する効果は、樹状細胞を活性化させない処置用量で、用量制限毒性を結果としてもたらしうる。したがって、B細胞を活性化させる効力を同じ範囲内に保持しながら、樹状細胞を活性化する効力を改善することが有利である。本発明で記載されるクローンのB細胞を活性化する効力は、樹状細胞を活性化する効力と同じ範囲内にあり、これは、臨床的利点をもたらしうる。
抗CD40抗体クローンの樹状細胞の活性化を促進する効力の、元の抗CD40抗体であるB44と比較した改善は、in vitroアッセイにより決定した。効力の改善は、抗CD40抗体クローンについて、表面分子CD86の上方調節により決定される樹状細胞の活性化において観察された。
Table 5(表7)は、表面マーカーについてのこれらの発現研究からの結果についてまとめる。
図5Aおよび図5Bには、CD86発現およびその濃度依存性を示す。
材料および方法
樹状細胞活性化アッセイ
樹状細胞は、末梢血単球に由来した。略述すると、末梢血単核細胞(PBMC)を、Ficoll勾配法により全血液の軟膜から分離し、CD14+単球を、製造元の指示書に従い、CD14+ MACSマイクロビーズ(Miltenyi)により単離した。約95%の純度に到達したCD14+細胞を、RPMI培地+10%のFCS、150ng/mlのGM-CSF、および50ng/mlのIL-4中、37℃、細胞1×106個/mlの濃度で、6日間にわたり培養した。3日間にわたる培養の後、培地のうちの80%を、新鮮な培地およびサイトカインで置きかえた。
6日間にわたる培養後、細胞は、CD14を下方調節し、CD1aを上方調節した。それらを洗浄し、新鮮なサイトカインおよび刺激抗体の希釈系列を伴う培地中に再懸濁させた。細胞を、細胞667000個/mlおよび抗体3.3〜0.013μg/mlの濃度で培養した。刺激抗体は、B44、ならびに8つのクローンであるA4、A5、B9、C4、F6、G12、H11およびH12であった。樹状細胞を、37℃でさらに48時間にわたり培養した。次いで、活性化マーカーCD86、CD80、およびHLA-DRの上方調節について、FACSにより解析した。
(実施例5)
例示的な抗CD40抗体により誘導された活性化T細胞によるIFN-γ分泌の増強
抗CD40抗体クローンにより刺激された樹状細胞による、in vitroにおけるT細胞の活性化について研究し、IFNγの産生について解析した。
結果を、Table 6(表8)にまとめる。
同種異系T細胞および樹状細胞アッセイにおける抗CD40抗体クローンの効力は、B44抗体と比較して改善された。
材料および方法
樹状細胞による同種異系T細胞の活性化についてのアッセイ
樹状細胞活性化アッセイにおいて記載した通り、樹状細胞は、末梢血単球に由来した。
6日後、樹状細胞を洗浄し、新鮮なサイトカインを伴う培地中に再懸濁させ、異なる供与者に由来するT細胞の存在下で培養した。製造元の指示書に従い、CD3+ MACSマイクロビーズ(Miltenyi)により、T細胞を、PBMCから単離した。
T細胞活性化アッセイにおける樹状細胞およびT細胞の濃度は、各細胞型の細胞667,000個/mlであった。さらに、共培養物は、150ng/mlのGM-CSFおよび50ng/mlのIL-4および刺激抗体の3,3〜0.013μg/mlの希釈系列を含有した。刺激抗体は、B44、ならびに8つのクローンであるA4、A5、B9、C4、F6、G12、H11およびH12であった。共培養物を37℃でさらに72時間にわたりインキュベートした。次いで、上清を、IFN-γ含量について、製造元の指示書に従い、ELISA(Biolegends)により解析した。
(実施例6)
例示的な抗CD40抗体によるB細胞の活性化の比較
アゴニスト性の抗CD40抗体のB細胞上のCD40への結合は、B細胞の活性化および増殖、同型凝集、ならびにCD23、CD30、CD80、CD86、Fas、主要組織適合性複合体(MHC)IIなどの表面マーカーおよび可溶性のサイトカイン、例えば、IL-6、TNF-α、およびTNF-βの上方調節を結果としてもたらす(SchoenbeckおよびLibby、2001、Cell Mol Life 58(1)、4〜43頁)。
CD40誘導されるB細胞の増殖の測定は一般に、CD40アゴニスト性抗体を評価するのに用いられる(Poundら、1999、Int Immunol、(11)、11〜20頁)。
材料および方法
末梢血単核細胞(PBMC)を、Ficoll勾配法により全血液の軟膜から分離し、CD19+ B細胞を、製造元の指示書に従い、CD19+ MACSマイクロビーズ(Miltenyi)により単離した。約95%の純度に到達したCD19+細胞(ウェル1つ当たり5〜7.5×104個)を、RPMI培地+10%のFCS+10ng/mlのIL4および抗体の希釈系列中で培養した。48〜72時間後、Cell titer-Glo(Promega)で代謝活性を測定した。Graph Pad Prismを用いて、EC50値を計算した。
結果
本発明の抗CD40抗体のB細胞を活性化させる効力は、B44と同様である(すなわち、同じ桁数である)(Table 7(表9)を参照されたい)。
(実施例7)
例示的な本発明の抗CD40抗体のRAMOS細胞に結合する能力
本発明の抗CD40抗体のRAMOS細胞に結合する能力を、in vitroにおいて決定した。本発明者らは、抗CD40抗体の、ヒトバーキットリンパ腫細胞系であるRAMOSへの結合についてのFACS解析を実施した。本発明の抗CD40抗体および元のB44抗CD40抗体のEC50値を計算した。
材料および方法
ヒトバーキットリンパ腫細胞系であるRAMOSを、結合解析に用いた(ECACC、Sigma Aldrich、USA)。コンジュゲートされていない本発明の抗CD40抗体を、RAMOS細胞への結合についてアッセイした。
約125,000個のRAMOS細胞を、4℃で30分間にわたり、30〜0.0015μg/mlで1/3倍に系列希釈された抗CD40抗体と共にインキュベートした。細胞を、FACS緩衝液で2回にわたり洗浄し、その後、二次抗体である抗ヒトIgウサギF(ab')2/FITC(DAKO、Glostrup、Denmark)を、4℃でさらに30分間にわたり、細胞へと添加した。細胞を洗浄し、製造元の指示書に従い、FACScalibur測定器により解析し(Becton Dickinson、USA)、次いで、平均蛍光強度(「MFI」)を決定した。
結果
結果を、Table 8(表10)に示す。
例示的な抗CD40抗体クローンの効力は、B44抗体と比較して約100倍である。
(実施例8)
in vivoのマウス腫瘍モデルにおける例示的な抗体の効果
例示的な本発明の抗CD40抗体の抗腫瘍活性を、T細胞および樹状細胞の非存在下および存在下にあるNSGマウスモデルにおいて研究した。
(A)T細胞および樹状細胞の非存在下におけるCD40陽性腫瘍を用いる研究
材料および方法
本発明者らは、雌NSGマウス(NOD.Cg-Prkdcscid ll2rgtm/Wjl/ SzJ (NSG))をJacksonから得、それらを馴致させてから処置した。膀胱がん細胞(EJ細胞;マウス1匹当たりの細胞3×106個)を皮下注射した。G12またはアイソタイプ対照を、0、7、および14日目に、1.2mg/kg(30ug)の用量で腫瘍内注射した。0、7、10、14、17、21、23、および27日目に腫瘍容量を測定した。28日目に、腫瘍を切除し、秤量した。
結果
結果を、図6および図7に示す。
(B)T細胞および樹状細胞の存在下におけるCD40陽性腫瘍を用いる研究
材料および方法
本発明者らは、雌NSGマウス(NOD.Cg-Prkdcscid ll2rgtm/Wjl/ SzJ (NSG))をJacksonから得、それらを馴致させてから処置した。膀胱がん細胞(EJ細胞;マウス1匹当たりの細胞2.5×106個)を、同じドナーから得られるDC(1×105個)およびT細胞(5×105個)と併せて皮下注射した。樹状細胞は、単球から調製した(上記で記載した通り)。各処置群は、10匹のマウスからなり(n=10)、ここで、2匹のドナーに由来するT細胞およびDCを、ドナー1匹当たり5匹ずつのマウスにおいて用いた(Table 9(表11)を参照されたい)。
G12またはPBS対照を、0、7、および14日目に、1.2mg/kg(30ug)の用量で腫瘍内注射した。0、7、10、14、17、21、23、および27日目に腫瘍容量を測定した。28日目に、腫瘍を切除し、秤量した。
結果
結果を、図8および図9に示す。
(実施例9)
細胞をアポトーシスからレスキューする能力
ヒトCD40を発現させる細胞をアポトーシスおよび成長の停止からレスキューする抗CD40抗体の能力をin vitroにおいて決定した。アポトーシスおよび成長の停止は、トランスフェクトされたWEHI-231細胞において、抗IgM抗体を添加することにより誘導した。抗CD40抗体を添加することにより、細胞をレスキューした。この後、細胞の増殖する能力を決定した。
抗CD40抗体クローンについては、B44抗体と比べて、最大で40倍の効力の改善が観察された(Table 9(表11)を参照されたい)。
材料および方法
アポトーシスからのレスキュー:
安定的な細胞系を、ヒトCD40、huCD40/WEHI-231でトランスフェクトし、アポトーシスおよび成長の停止からのレスキューについて探索するために用いた(Ellmarkら、2003、Immunology、108、452〜7頁)。huCD40/WEHI-231細胞を、抗マウスIgM(Jackson Immunoresearch、USA)および25〜0.0001μg/mlで1/3倍に系列希釈された本発明の抗CD40抗体の存在下または非存在下にある96ウェルプレート(ウェル1つ当たりの細胞2×104個)内で72時間培養した。Cell titer-Glo(Promega、USA)を添加し、混合物を室温で30分間にわたりインキュベートした。ATPの放出を測定することにより、細胞を増殖についてアッセイした。発光シグナルをFluoSTAR OPTIMA(BMG、Germany)により測定し、シグナルを標準化した。
(実施例10)
配列情報のまとめ
以下で記載される各抗体については、対応するヌクレオチド配列と共に、VLアミノ酸1〜112位およびVHアミノ酸1〜119位を示す。アミノ酸配列内のCDRに下線を付す(VLアミノ酸配列では、アミノ酸23〜40位(CDR1)、52〜58位(CDR2)、および90〜101位(CDR3)においてCDRが見出され、VHアミノ酸配列では、アミノ酸26〜35位(CDR1)、42〜67位(CDR2)、および97〜108位(CDR3)においてCDRが見出される)。
抗体B44
可変軽鎖(VL)のアミノ酸配列(配列番号58)
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVYWYQQLPGTAPKLLIYGNINRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLSGLVFGGGTKLTVLG
可変軽鎖(VL)のヌクレオチド配列(配列番号59)
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATAATGTATACTGGTATCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACATCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAGTGGTCTGGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGT
可変重鎖(VH)のアミノ酸配列(配列番号60)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWLSYISGGSSYIFYADSVRGRFTISRDNSENALYLQMNSLRAEDTAVYYCARILRGGSGMDLWGQGTLVTVSS
可変重鎖(VH)のヌクレオチド配列(配列番号61)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTACTTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGCTTTCATATATTAGTGGTGGTAGTAGTTACATTTTCTACGCAGACTCAGTGAGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACTCCGAGAACGCGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAATATTAAGAGGCGGGAGCGGTATGGACCTCTGGGGCCAAGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA
抗体クローンA4
可変軽鎖(VL)のアミノ酸配列(配列番号19)
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSTSNIGAGYKVYWYQQLPGTAPKLLIYGNINRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLSGLVFGGGTKLTVLG
可変軽鎖(VL)のヌクレオチド配列(配列番号40)
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATAATGTATACTGGTATCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACATCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAGTGGTCTGGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGT
可変重鎖(VH)のアミノ酸配列(配列番号31)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWLSYISGGSSYIFYADSVRGRFTISRDNSENALYLQMNSLRAEDTAVYYCARILRGGSGMDLWGQGTLVTVSS
可変重鎖(VH)のヌクレオチド配列(配列番号49)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTACTTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGCTTTCATATATTAGTGGTGGTAGTAGTTACATTTTCTACGCAGACTCAGTGAGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACTCCGAGAACGCGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAATATTAAGAGGCGGGAGCGGTATGGACCTCTGGGGCCAAGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA
CDRのアミノ酸配列
VL CDRs: CDR1: CTGSTSNIGAGYKVY[配列番号4]
CDR2: GNINRPS[配列番号10]
CDR3: CAAWDDSLSGLV[配列番号12]
VH CDRs: CDR1: GFTFSTYGMH [配列番号28]
CDR2: GKGLEWLSYISGGSSYIFYADSVRGR[配列番号29]
CDR3 CARILRGGSGMDL[配列番号30]
抗体クローンA5
可変軽鎖(VL)のアミノ酸配列(配列番号20)
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGAGYHVYWYQQLPGTAPKLLIYGSINRPSGVPDRFSGSKSGTSGSLAISGLRSEDEADYYCAAWDSSSSGLVFGGGTKLTVLG
可変軽鎖(VL)のヌクレオチド配列(配列番号41)
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATAATGTATACTGGTATCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACATCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAGTGGTCTGGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGT
可変重鎖(VH)のアミノ酸配列(配列番号32)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWLSYISGGSSYIFYADSVRGRFTISRDNSENALYLQMNSLRAEDTAVYYCARILRGGSGMDLWGQGTLVTVSS
可変重鎖(VH)のヌクレオチド配列(配列番号50)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTACTTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGCTTTCATATATTAGTGGTGGTAGTAGTTACATTTTCTACGCAGACTCAGTGAGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACTCCGAGAACGCGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAATATTAAGAGGCGGGAGCGGTATGGACCTCTGGGGCCAAGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA
CDRのアミノ酸配列
VL CDRs: CDR1: CTGSSSNIGAGYHVY[配列番号5]
CDR2: GNINRPS[配列番号10]
CDR3: CAAWDSSSSGLV[配列番号13]
VH CDRs: CDR1: GFTFSTYGMH[配列番号28]
CDR2: GKGLEWLSYISGGSSYIFYADSVRGR[配列番号29]
CDR3: CARILRGGSGMDL[配列番号30]
抗体クローンC4
可変軽鎖(VL)のアミノ酸配列(配列番号21)
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSTSNIGAGYKVYWYQQLPGTAPKLLIYGNINRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLSGLVFGGGTKLTVLG
可変軽鎖(VL)のヌクレオチド配列(配列番号48)
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGCACTGGGAGCACCTCCAACATCGGGGCAGGTTACAAAGTATATTGGTATCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACATCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAGTGGTCTGGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGT
可変重鎖(VH)のアミノ酸配列(配列番号33)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWLSYISGGSSYIFYADTVRGRFTISRDNSENALYLQMNSLRAEDTAVYYCARILRGGSGMDLWGQGTLVTVSS
可変重鎖(VH)のヌクレオチド配列(配列番号51)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTACTTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGCTTTCATATATTAGTGGTGGTAGTAGTTACATTTTCTACGCAGACACAGTGAGGGGCCGATTCACTATCTCCAGAGACAACTCCGAGAACGCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAATATTAAGAGGGGGGAGCGGTATGGACCTCTGGGGCCAAGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA
CDRのアミノ酸配列
VL CDRS: CDR1: CTGSTSNIGAGYKVY[配列番号4]
CDR2: GNINRPS[配列番号10]
CDR3: CAAWDDSLSGLV[配列番号12]
VH CDRS: CDR1: GFTFSTYGMH[配列番号28]
CDR2: GKGLEWLSYISGGSSYIFYADSVRGR[配列番号29]
CDR3 CARILRGGSGMDL[配列番号30]
抗体クローンG4
可変軽鎖(VL)のアミノ酸配列(配列番号22)
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGAGYKVYWYQQLPGTAPKLLIYGNINRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDESITGLVFGGGTKLTVLG
可変軽鎖(VL)のヌクレオチド配列(配列番号42)
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATAATGTATACTGGTATCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACATCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAGTGGTCTGGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGT
可変重鎖(VH)のアミノ酸配列(配列番号34)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWLSYISGGSSYIFYADSVRGRFTISRDNSENALYLQMNSLRAEDTAVYYCARILRGGSGMDLWGQGTLVTVSS
可変重鎖(VH)のヌクレオチド配列(配列番号52)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTACTTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGCTTTCATATATTAGTGGTGGTAGTAGTTACATTTTCTACGCAGACTCAGTGAGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACTCCGAGAACGCGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAATATTAAGAGGCGGGAGCGGTATGGACCTCTGGGGCCAAGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA
CDRのアミノ酸配列
VL CDRs: CDR1: CTGSSSNIGAGYKVY[配列番号6]
CDR2: GNINRPS[配列番号10]
CDR3: CAAWDESITGLV[配列番号14]
VH CDRs: CDR1: GFTFSTYGMH[配列番号28]
CDR2: GKGLEWLSYISGGSSYIFYADSVRGR[配列番号29]
CDR3: CARILRGGSGMDL[配列番号30]
抗体クローンF6
可変軽鎖(VL)のアミノ酸配列(配列番号23)
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVYWYQQLPGTAPKLLIYRNINRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDGSLLGLVFGGGTKLTVLG
可変軽鎖(VL)のヌクレオチド配列(配列番号43)
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTATACTGGTATCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATCGTAACATCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGGCAGCCTGCTGGGTCTGGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTGGGT
可変重鎖(VH)のアミノ酸配列(配列番号35)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWLSYISGGSSYIFYADSVRGRFTISRDNSENALYLQMNSLRAEDTAVYYCARILRGGSGMDLWGQGTLVTVSS
可変重鎖(VH)のヌクレオチド配列(配列番号53)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTACTTATGGCATGCACTGGGTTCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGCTTTCATATATTAGTGGTGGTAGTAGTTACATTTTCTACGCAGACTCAGTGAGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACTCCGAGAACGCGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAATATTAAGAGGCGGGAGCGGTATGGACCTCTGGGGCCAAGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA
CDRのアミノ酸配列
VL CDRs: CDR1: CTGSSSNIGAGYDVY[配列番号7]
CDR2: RNINRPS[配列番号11]
CDR3: CAAWDGSLLGLV[配列番号15]
VH CDRS: CDR1: GFTFSTYGMH[配列番号28]
CDR2: GKGLEWLSYISGGSSYIFYADSVRGR[配列番号29]
CDR3: CARILRGGSGMDL[配列番号30]
抗体クローンF9
可変軽鎖(VL)のアミノ酸配列(配列番号24)
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGAGYGVYWYQQLPGTAPKLLIYGNINRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDGTLTGLLFGGGTKLTVLG
可変軽鎖(VL)のヌクレオチド配列(配列番号44)
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGGTGTATACTGGTATCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACATCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCTTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGGCACCCTGACCGGTCTGCTGTTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGT
可変重鎖(VH)のアミノ酸配列(配列番号36)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWLSYISGGSSYIFYADSVRGRFTISRDNSENALYLQMNSLRAEDTAVYYCARILRGGSGMDLWGQGTLVTVSS
可変重鎖(VH)のヌクレオチド配列(配列番号54)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTACTTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGCTTTCATATATTAGTGGTGGTAGTAGTTACATTTTCTACGCAGACTCAGTGAGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACTCCGAGAACGCGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAATATTAAGAGGCGGGAGCGGTATGGACCTCTGGGGCCAAGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA
CDRのアミノ酸配列
VL CDRs: CDR1: CTGSSSNIGAGYGVY[配列番号8]
CDR2: GNINRPS[配列番号10]
CDR3: CAAWDGTLTGLL[配列番号16]
VH CDRS: CDR1: GFTFSTYGMH[配列番号28]
CDR2: GKGLEWLSYISGGSSYIFYADSVRGR[配列番号29]
CDR3: CARILRGGSGMDL[配列番号30]
抗体クローンG12
可変軽鎖(VL)のアミノ酸配列(配列番号25)
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGAGYNVYWYQQLPGTAPKLLIYGNINRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDKSISGLVFGGGTKLTVLG
可変軽鎖(VL)のヌクレオチド配列(配列番号45)
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCGGGTTACAATGTATACTGGTATCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACATCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATAAGAGCATTTCTGGTCTGGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGT
可変重鎖(VH)のアミノ酸配列(配列番号37)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWLSYISGGSSYIFYADSVRGRFTISRDNSENALYLQMNSLRAEDTAVYYCARILRGGSGMDLWGQGTLVTVSS
可変重鎖(VH)のヌクレオチド配列(配列番号55)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTACTTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGCTTTCATATATTAGTGGTGGTAGTAGTTACATTTTCTACGCAGACTCAGTGAGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACTCCGAGAACGCGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAATATTAAGAGGCGGGAGCGGTATGGACCTCTGGGGCCAAGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA
CDRのアミノ酸配列
VL CDRs: CDR1: CTGSSSNIGAGYNVY[配列番号9]
CDR2: GNINRPS[配列番号10]
CDR3: CAAWDKSISGLV[配列番号17]
VH CDRS: CDR1: GFTFSTYGMH[配列番号28]
CDR2: GKGLEWLSYISGGSSYIFYADSVRGR[配列番号29]
CDR3: CARILRGGSGMDL[配列番号30]
抗体クローンH12
可変軽鎖(VL)のアミノ酸配列(配列番号26)
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGAGYNVYWYQQLPGTAPKLLIYGNINRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLSGLVFGGGTKLTVLG
可変軽鎖(VL)のヌクレオチド配列(配列番号46)
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATAATGTATACTGGTATCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACATCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAGTGGTCTGGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGTGAGTAGAACGTACGCTAGCAAGCTTGGATCCACGATCCTGAGCAAGGACCTCTGCCCTCCCTGTTCAGACCCTTGCTTGCCTCAGCAGGTCATTACAACCACTTCACCTCTGACCGCAGGGGCAGGGGACTAGATAGAATGACCTACTGAGCCTCGTCTGTCTGTCTGTCTGTCTCTCTGTTTGTCTGTCTGTCTCTCTGTTTGTCTCTCTGTCTGTCTGACAGGCGCAGGCTGGGTCTCTAAGCCTTGTTCTGTTCTGGCCTCCTCAGTCTGGGTTCTTGTCGGAACAGCTTTGCCCTTGGGTTACCTGGGTTCCATCTCCTGGGGAATTGGGAACAAGGGGTCTGAGGGAGGCACCTCCTGGGAGACTTTAGAAGGACCCAGTGCCCT CGGGGCTGATGCTCGGGA
可変重鎖(VH)のアミノ酸配列(配列番号38)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWLSYISGGSSYIFYADSVRGRFTISRDNSENALYLQMNSLRAEDTAVYYCARILRGGSGMDLWGQGTLVTVSS
可変重鎖(VH)のヌクレオチド配列(配列番号56)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTACTTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGCTTTCATATATTAGTGGTGGTAGTAGTTACATTTTCTACGCAGACTCAGTGAGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACTCCGAGAACGCGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAATATTAAGAGGCGGGAGCGGTATGGACCTCTGGGGCCAAGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCAGGTGAGTCGTACGCTAGCAAGCTTTCTGGGGCAGGCCAGGCCTGACCTTGGCTTTGGGGCAGGGAGGGGGCTAAGGTGAGGCAGGTGGCGCCAGCCAGGTGCACACCCAATGCCCATGAGCCCAGACACTGGACGCTGAACCTCGCGGACAGTTAAGAACCCAGGGGCCTCTGCGCCCTGGGCCCAGCTCTGTCCCACACCGCGGTCACATGGCACCACCTCTCTTGCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCACGACTCTA
CDRのアミノ酸配列
VL CDRs: CDR1: CTGSSSNIGAGYNVY[配列番号9]
CDR2: GNINRPS[配列番号10]
CDR3: CAAWDDSLSGLV[配列番号12]
VH CDRS: CDR1: GFTFSTYGMH[配列番号28]
CDR2: GKGLEWLSYISGGSSYIFYADSVRGR[配列番号29]
CDR3: CARILRGGSGMDL[配列番号30]
抗体クローンB9およびH11
可変軽鎖(VL)のアミノ酸配列(配列番号27)
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGAGYNVYWYQQLPGTAPKLLIYGNINRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDGGLLGLVFGGGTKLTVLG
可変軽鎖(VL)のヌクレオチド配列(配列番号47)
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATAATGTATACTGGTATCAGCAGCTCCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACATCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGGCGGCCTGCTGGGTCTGGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGT
可変重鎖(VH)のアミノ酸配列(配列番号39)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWLSYISGGSSYIFYADSVRGRFTISRDNSENALYLQMNSLRAEDTAVYYCARILRGGSGMDLWGQGTLVTVSS
可変重鎖(VH)のヌクレオチド配列(配列番号57)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTACTTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGCTTTCATATATTAGTGGTGGTAGTAGTTACATTTTCTACGCAGACTCAGTGAGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACTCCGAGAACGCGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAATATTAAGAGGCGGGAGCGGTATGGACCTCTGGGGCCAAGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCAGGTGAGTCGTACGCTAGCAAGCTTTCTGGGGCAGGCCAGGCCTGACCTTGGCTTTGGGGCAGG
CDRのアミノ酸配列
VL CDRs: CDR1: CTGSSSNIGAGYNVY[配列番号9]
CDR2: GNINRPS[配列番号10]
CDR3: CAAWDGGLLGLV[配列番号18]
VH CDRs: CDR1: GFTFSTYGMH[配列番号28]
CDR2: GKGLEWLSYISGGSSYIFYADSVRGR[配列番号29]
CDR3: CARILRGGSGMDL[配列番号30]
本発明の例示的な抗体の定常領域
>sp|P01857|IGHG1_HUMAN Igγ-1重鎖C領域 OS=ヒト(Homo sapiens) GN=IGHG1 PE=1 SV=1
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK[配列番号62]
>gi|186127|gb|AAA59107.1|免疫グロブリンλ軽鎖C2領域[ヒト]
QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS[配列番号63]
重鎖可変領域(VH)における例示的なフレームワークの突然変異
以下では、突然変異を、太字で下線を付して示す。
可変重鎖(VH)のアミノ酸配列[配列番号64]
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWLSYISGGSSYIFYADSVRGRFTISRDNSENTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARILRGGSGMDLWGQGTLVTVSS
可変重鎖(VH)のヌクレオチド配列[配列番号65]
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTACTTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGCTTTCATATATTAGTGGTGGTAGTAGTTACATTTTCTACGCAGACTCAGTGAGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACTCCGAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAATATTAAGAGGCGGGAGCGGTATGGACCTCTGGGGCCAAGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA
可変重鎖(VH)のアミノ酸配列[配列番号66]
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWLSYISGGSSYIFYADSVRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARILRGGSGMDLWGQGTLVTVSS
可変重鎖(VH)のヌクレオチド配列[配列番号67]
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTACTTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGCTTTCATATATTAGTGGTGGTAGTAGTTACATTTTCTACGCAGACTCAGTGAGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAATATTAAGAGGCGGGAGCGGTATGGACCTCTGGGGCCAAGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA
(実施例11)
例示的な医薬処方物
本発明の抗体は、単独で投与することが可能であるが、1または複数の許容される担体と併せて、医薬または医薬処方物として提示することが好ましい。担体は、本発明の薬剤と適合可能であり、そのレシピエントに対して有害でないという意味で「許容可能」でなければならない。担体は、無菌であり、発熱物質を含まない、水または生理食塩液であることが典型的である。
以下の例では、本発明に従う医薬および医薬組成物であって、有効成分が本発明の抗体である医薬および医薬組成物について例示する。
例A:錠剤
有効成分 1mg
ラクトース 200mg
デンプン 50mg
ポリビニルピロリドン 5mg
ステアリン酸マグネシウム 4mg
錠剤は、湿式造粒に続く圧縮により、前出の成分から調製する。
例B:眼科的溶液
有効成分 1mg
塩化ナトリウム(解析グレード) 0.9g
チオメルサール 0.001g
精製水 100mlとなる量
pHの調整値 7.5
例C:錠剤処方物
以下の処方物AおよびBは、ポビドン溶液を伴う成分に湿式造粒を施した後、ステアリン酸マグネシウムを添加し、圧縮することにより調製する。
処方物A
mg/錠剤 mg/錠剤
(a)有効成分 1 1
(b)ラクトースB.P. 210 26
(c)ポビドンB.P. 15 9
(d)デンプングリコール酸ナトリウム 20 12
(e)ステアリン酸マグネシウム 5 3
_
251 51
処方物B
mg/錠剤 mg/錠剤
(a)有効成分 1 1
(b)ラクトース 150 -
(c)Avicel PH 101(登録商標) 60 26
(d)ポビドンB.P. 15 9
(e)デンプングリコール酸ナトリウム 20 12
(f)ステアリン酸マグネシウム 5 3
_
251 51
処方物C
mg/錠剤
有効成分 1
ラクトース 200
デンプン 50
ポビドン 5
ステアリン酸マグネシウム 4
_
260
以下の処方物DおよびEは、混合された成分を直接的に圧縮することにより調製する。処方物E中で用いられるラクトースは、直接圧縮型である。
処方物D
mg/カプセル
有効成分 1
あらかじめゼラチン化されたデンプンNF15 150
_
151
処方物E
mg/カプセル
有効成分 1
ラクトース 150
Avicel(登録商標) 100
_
251
処方物F(制御放出型処方物)
処方物は、ポビドン溶液を伴う(以下の)成分に湿式造粒を施した後、ステアリン酸マグネシウムを添加し、圧縮することにより調製する。
mg/錠剤
(a)有効成分 1
(b)ヒドロキシプロピルメチルセルロース 112
(Methocel K4M Premium)(登録商標)
(c)ラクトースB.P. 53
(d)ポビドンB.P.C. 28
(e)ステアリン酸マグネシウム 7
_
201
薬物の放出は、約6〜8時間にわたり生じ、12時間後に完了した。
例D:カプセル処方物
処方物A
カプセル処方物は、上記の例Cにおける処方物Dの成分を混合し、2部分型硬質ゼラチンカプセルへと充填することにより調製する。処方物B(後出)も、同様の形で調製する。
処方物B
mg/カプセル
(a)有効成分 1
(b)ラクトースB.P. 143
(c)デンプングリコール酸ナトリウム 25
(d)ステアリン酸マグネシウム 2
_
171
処方物C
mg/カプセル
(a)有効成分 1
(b)Macrogol 4000 BP 350
_
351
カプセルは、Macrogol 4000 BPを溶融させ、有効成分を溶融物中に分散させ、溶融物を2部分硬質ゼラチンカプセルへと充填することにより調製する。
処方物D mg/カプセル
有効成分 1
レシチン 100
ラッカセイ油 100
_
201
カプセルは、有効成分をレシチンおよびラッカセイ油中に分散させ、分散液を軟質の弾性ゼラチンカプセルへと充填することにより調製する。
処方物E(制御放出型カプセル)
以下の制御放出型カプセル処方物は、射出器を用いて成分a、b、およびcを射出した後、射出物を球形化および乾燥させることにより調製する。次いで、乾燥したペレットを、放出制御膜(d)でコーティングし、2部分型硬質ゼラチンカプセルへと充填する。
mg/カプセル
(a)有効成分 1
(b)結晶セルロース 125
(c)ラクトースBP 125
(d)エチルセルロース 13
_
264
例E:注射用処方物
有効成分 1mg
滅菌で発熱物質を含まないリン酸緩衝液(pH7.0) 10mlとなる量
有効成分を多量のリン酸緩衝液(35〜40℃)中で溶解させ、次いで、規定容量とし、滅菌細孔フィルターを介して、10mlの滅菌アンバーガラス製バイアル(1型)へと濾過し、滅菌止栓および封印で密封した。
例F:筋内注射用
有効成分 1mg
ベンジルアルコール 0.10g
Glucofurol 75(登録商標) 1.45g
適量の注射用水 3.00mlとなる量
有効成分をグリコフロール中に溶解させる。次いで、ベンジルアルコールを添加し、溶解させ、水を3mlまで添加する。次いで、混合物を、滅菌細孔フィルターを介して濾過し、3mlの滅菌ガラス製バイアル(1型)内に密封する。
例G:シロップ懸濁液
有効成分 1mg
ソルビトール溶液 1.5000g
グリセロール 2.0000g
分散性セルロース 0.0750g
安息香酸ナトリウム 0.0050g
香味剤(ピーチ)17.42.3169 0.0125ml
適量の精製水 5.0000mlとなる量
安息香酸ナトリウムを、添加される精製水およびソルビトール溶液の一部に溶解させる。有効成分を添加し、分散させる。グリセロール中では、増粘剤(分散性セルロース)を分散させる。2つの分散液を混合し、精製水により要請される最大容量とする。懸濁液をさらにせん断することにより、要請に応じたさらなる増粘化を達成する。
例H:坐剤
mg/坐剤
有効成分(63μm)* 1
硬質脂質BP(Witepsol H15 - Dynamit Nobel) 1770
_
1771
*有効成分は、粒子のうちの少なくとも90%が直径63μm以下の粉末として用いられる。
Witepsol H15の5分の1は、最高45℃のスチームジャケット付きのパン内で溶融させる。有効成分を、200μmの篩を介して篩にかけ、滑らかな分散が達成されるまで切削ヘッドを取り付けたSilversonミキサーを用いて混合しながら、溶融した基剤へと添加した。混合物を45℃で維持し、残りのWitepsol H15を、懸濁液へと添加し、撹拌して、均一なミックスを確保した。懸濁液の全体を、持続的に撹拌しながら、250μmのステンレス鋼製スクリーンを介して流過させ、40℃まで冷却させる。38℃〜40℃の温度になったら、2.02gの混合物を、適切なプラスチック製鋳型へと充填する。坐剤を室温まで冷却させる。
例I:ペッサリー
mg/ペッサリー
有効成分 1
デキストロース無水物 380
バレイショデンプン 363
ステアリン酸マグネシウム 7
_
751
上記の成分を直接混合し、結果として得られる混合物を直接圧縮することにより、ペッサリーを調製する。
(実施例12)
in vivoのマウス腫瘍モデルにおける例示的な抗体の効果
本発明の抗CD40抗体の抗腫瘍活性を、膀胱がん細胞を接種されたヒトCD40トランスジェニックマウスにおいて研究した。MB49膀胱がん細胞を、ヒトCD40トランスジェニックマウスへと皮下接種した。マウスには、7および10日目に、G12または対照による腫瘍周囲処置を施した。G12による処置は、アイソタイプ対照と比較して大きな抗腫瘍効果を結果としてもたらす。
基準抗体であるS2C6は、ヒトガンマ1定常領域およびカッパ定常領域のそれぞれへと融合させたマウス可変ドメインであるVHおよびVLからなる抗CD40キメラ抗体である(欧州特許第EP1885399号; Franciscoら、2000、Cancer Research)。したがって、抗体は、抗CD40ヒト化抗体であるSGN-40(Lawら、2005、Cancer Research)の類似体である。SGN-40は、臨床試験において研究されている(Advaniら、2009、J Clinical Oncology; Husseinら、2010、Haematologica)。
材料および方法
MB49細胞系は、発がん物質により誘導される移行上皮癌であって、C57BL/6雄マウスに由来する移行上皮癌である(SummerhayesおよびFranks、1979、Journal of the National Cancer Institute)。MB49は、マウスCD40は発現させるが、ヒトCD40は発現させない。G12は、マウスCD40と交差反応せず、MB49腫瘍細胞に結合することが可能でない。
0日目において、2.5×105個の膀胱がんMB49細胞を、雌ヒトCD40トランスジェニックC57BL/6マウスの脇腹に皮下接種した。ヒトCD40トランスジェニックマウスは、マウスCD40欠損(mCD40-/-)バックグラウンドにおいて、ヒト野生型CD40を発現させる。処置は、7日目に開始し、7日目および10日目に、皮下腫瘍の腫瘍周囲に抗体を注射した(2回にわたる投与)。毎週2回、キャリパーで腫瘍容量を測定し、楕円体容量式により計算した。腫瘍が1cm3を超えるか、または、潰瘍が発症したら、マウスを屠殺した。各処置の4時間後に血清試料を採取した。Meso Scale Discoveryプラットフォーム(MSD、Gaithersburg、MD、USA)を用いるMouse Proinflammatory 7-Plex Ultra-Sensitive Kitにより、血清試料中のサイトカインレベルを解析した。サンドイッチELISAを用いて、血清中の抗体力価を測定した。MB49細胞系は、発がん物質により誘導される移行上皮癌であって、C57BL/6雄マウスに由来する移行上皮癌である(SummerhayesおよびFranks、1979、Journal of the National Cancer Institute)。MB49は、マウスCD40は発現させるが、ヒトCD40は発現させない。G12は、マウスCD40と交差反応せず、MB49腫瘍細胞に結合することが可能でない。
結果
結果を、図10に示す。
G12による処置は、動物の生存を、アイソタイプ対照と比較して有意に延長する(p<0.013)。G12で処置されたマウスの生存曲線を、S2C6で処置されたマウスの生存曲線と比較する(p<0.13)。S2C6で処置されたマウスの生存を、アイソタイプ対照で処置されたマウスと比較する(p<0.088)。
(実施例13)
in vivoのマウス腫瘍モデルにおける例示的な抗体の効果
処置された動物のより大きな群からプールされたデータを用いて、抗CD40抗体、インターロイキン6(IL-6)、腫瘍壊死因子α(TNF-α)、およびケラチン生成細胞由来サイトカイン(KC)(また、ケモカイン(C-X-Cモチーフ)リガンド1/CXCL1としても知られている)の抗腫瘍活性を研究した。G12処置群は、20匹の動物による群を含有し、S2C6処置群は、12匹の動物を含有し、アイソタイプ対照群は、20匹の動物を含有した。
MB49膀胱がん細胞を、ヒトCD40トランスジェニックマウスへと皮下接種した。7日目および10日目に、腫瘍周囲において、G12または対照によりマウスを処置した。G12による処置は、腫瘍保有マウスの生存を、アイソタイプ対照で処置された群と比較して有意に延長する(図11)。
血清試料を、処置されたマウスから採取し、サイトカインレベルについて解析した。処置後のサイトカインレベルにより、G12による、基準抗体であるS2C6と比較してより強力な免疫応答の誘導が裏付けられる(図12)。
材料および方法
0日目において、2.5×105個の膀胱がんMB49細胞を、雌ヒトCD40トランスジェニックC57BL/6マウスの脇腹に皮下接種した。ヒトCD40トランスジェニックマウスは、マウスCD40欠損(mCD40-/-)バックグラウンドにおいて、ヒト野生型CD40を発現させる。処置は、7日目に開始し、7日目および10日目に、皮下腫瘍の腫瘍周囲に抗体を注射した(2回にわたる投与)。毎週2回、キャリパーで腫瘍容量を測定し、楕円体容量式により計算した。腫瘍が1cm3を超えるか、または、潰瘍が発症したら、マウスを屠殺した。各処置の4時間後に血清試料を採取した。Meso Scale Discoveryプラットフォーム(MSD、Gaithersburg、MD、USA)を用いるMouse Proinflammatory 7-Plex Ultra-Sensitive Kitにより、血清試料中のサイトカインレベルを解析した。統計学的解析は、Graph Pad Prism 6.0(GraphPad Software, Inc.、La Jolla、CA)を用いて実施した。
結果
結果を、図11および図12に示す。
(実施例14)
in vivoにおける抗体レベルの解析
処置されたマウスを、血清中の抗体レベルについて解析した。1回目(7日目)および2回目(10日目)の処置の後で血清試料を採取した。抗CD40抗体クローンについての抗体力価は、基準抗体と比較して有意に低かった。データを、図13に示す。
材料および方法
実施例1で記載した実験から、1回目(7日目)および2回目(10日目)の処置4時間後に採取された血清試料を、抗体レベルについて解析した。サンドイッチELISAを用いて、血清中の抗体力価を測定した。
G12処置群は、23匹のマウス(N=23)からなり、S2C6基準抗体処置群も、23匹のマウス(N=23)からなり、アイソタイプ対照による処置群は、18匹のマウス(N=18)からなった。
結果
結果を、図13示す。
(参考文献)

Claims (75)

  1. 樹状細胞を活性化する効力が、B細胞を活性化するその効力より大きいかもしくはこれに等しく、かつ/またはCD40に対するアフィニティー(KD)が、1×10-10M未満である、
    CD40に対する多価の結合特異性を伴う抗体もしくはその抗原結合断片、
    あるいはCD40に対する多価の結合特異性を保持する、前記抗体もしくは抗原結合断片の変異体、融合体、もしくは誘導体、または前記変異体もしくはその誘導体の融合体。
  2. CD40+腫瘍細胞に対して二重の細胞傷害効果を及ぼすことが可能な、請求項1に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体。
  3. 腫瘍細胞に対する直接的なアポトーシス作用および腫瘍細胞に対する間接的な免疫細胞介在性細胞傷害効果が可能な、請求項1に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体。
  4. 樹状細胞を活性化する効力が、B細胞を活性化する効力と対比して2倍である、例えば、樹状細胞を活性化する効力が、少なくとも3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍以上である、請求項1から3のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体。
  5. 樹状細胞を活性化する効力が、B44抗体より大きい、請求項1から4のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体。
  6. 樹状細胞を活性化する効力(EC50として測定される)が、少なくとも0.5μg/mlである、請求項1から5のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体。
  7. CD40に対する結合特異性が、B44抗体の場合と比べて改善された、請求項1から6のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体。
  8. 改善された結合特異性が、CD40に対して1.0×10-10M未満の高アフィニティー、例えば、9.0×10-11M、8.0×10-11M、7.0×10-11M、6.0×10-11M、5.0×10-11M、4.0×10-11M、3.0×10-11M、2.0×10-11M未満、または1.0×10-11M未満のKDである、請求項1から7のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体。
  9. 改善された結合特異性が、CD40に対してB44抗体より大きなオン速度、例えば、2.7×106Ms;または3.0×106Ms;または4.0×106Ms;または5.0×106Ms;または6.0×106Ms;または7.0×106Ms;または8.0×106Ms;または9.0×106Ms;または1.0×107Msを超えるオン速度(ka)である、請求項1から8のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体。
  10. 改善された結合特異性が、CD40に対してB44抗体より小さいオフ速度、例えば、4.5×10-3s;または3.0×10-3s;または2.0×10-3s;または1.0×10-3s;または9.0×10-4s;または8.0×10-4s;または7.0×10-4s;または6.0×10-4s;または5.0×10-4s;または3.0×10-4s;または2.0×10-4s;または1.0×10-4s;または9.0×10-5s;または8.0×10-5s;または7.0×10-5s;または6.0×10-5s;または5.0×10-5s;または4.0×10-5s;または3.0×10-5s;または2.0×10-5s;または1.0×10-6s未満のオフ速度(kd)である、請求項1から9のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体。
  11. CD40に対するアフィニティー(KD)が、1.0×10-10M〜1×10-11Mの範囲にあり、CD40に対するオン速度(ka)が、2.7×106〜1×107Msの範囲にある、請求項1から10のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体。
  12. CD40が、細胞の表面に局在化する、請求項1から11のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体。
  13. 無傷抗体を含むかまたはこれからなる、請求項1から12のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体。
  14. Fv断片(単鎖Fv断片、またはジスルフィド結合させたFv断片などの)およびFab様断片(Fab断片、Fab'断片、またはF(ab)2断片などの)からなる群から選択される抗原結合断片を含むかまたはこれからなる、請求項1から13のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体。
  15. scFvを含む、請求項14に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体。
  16. 組換え分子である、請求項1から15のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体。
  17. 抗体が、モノクローナル抗体である、請求項1から16のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体。
  18. ヒト抗体、その抗原結合断片、変異体、融合体、もしくは誘導体、またはヒト化抗体、その抗原結合断片、変異体、融合体、もしくは誘導体である、請求項1から17のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体。
  19. CDR1がアミノ酸配列:
    CTGSX1SNIGX2VY[配列番号1]
    [配列中、
    X1は、SまたはTであり、
    X2は、KまたはHまたはDまたはGまたはNである]
    を含むかまたはこれからなる可変軽鎖(VL)を含む、請求項1から18のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体。
  20. CDR2がアミノ酸配列:
    X3NINRPS[配列番号2]
    [配列中、
    X3は、GまたはRである]
    を含むかまたはこれからなる可変軽鎖(VL)を含む、請求項1から19のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体。
  21. CDR3がアミノ酸配列:
    CAAWDX4X5X6X7GLX8[配列番号3]
    [配列中、
    X4は、DまたはSまたはEまたはGまたはKであり、
    X5は、SまたはTまたはGであり、
    X6は、LまたはSまたはTまたはLまたはIであり、
    X7は、SまたはTまたはLであり、
    X8は、VまたはLである]
    を含むかまたはこれからなる可変軽鎖(VL)を含む、請求項1から20のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体。
  22. CDR1が、
    CTGSTSNIGAGYKVY[配列番号4];および
    CTGSSSNIGAGYHVY[配列番号5];および
    CTGSSSNIGAGYKVY[配列番号6];および
    CTGSSSNIGAGYDVY[配列番号7];および
    CTGSSSNIGAGYGVY[配列番号8];および
    CTGSSSNIGAGYNVY[配列番号9]
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる可変軽鎖(VL)を含む、請求項19に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体。
  23. CDR2が、
    GNINRPS[配列番号10];および
    RNINRPS[配列番号11]
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる可変軽鎖(VL)を含む、請求項20に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体。
  24. CDR3が、
    CAAWDDSLSGLV[配列番号12];および
    CAAWDSSSSGLV[配列番号13];および
    CAAWDESITGLV[配列番号14];および
    CAAWDGSLLGLV[配列番号15];および
    CAAWDGTLTGLL[配列番号16];および
    CAAWDKSISGLV[配列番号17];および
    CAAWDGGLLGLV[配列番号18]
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる可変軽鎖(VL)を含む、請求項21に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体。
  25. 以下のCDR:
    (i)配列番号1および配列番号2および配列番号3;または
    (ii)配列番号4および配列番号10および配列番号12;または
    (iii)配列番号5および配列番号10および配列番号13;または
    (iv)配列番号4および配列番号10および配列番号12;または
    (v)配列番号6および配列番号10および配列番号14;または
    (vi)配列番号7および配列番号11および配列番号15;または
    (vii)配列番号8および配列番号10および配列番号16;または
    (viii)配列番号9および配列番号10および配列番号17;または
    (ix)配列番号9および配列番号10および配列番号12;または
    (x)配列番号9および配列番号10および配列番号18
    を含む可変軽鎖(VL)を含む、請求項1から24のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体。
  26. 配列番号19;配列番号20;配列番号21;配列番号22;配列番号23;配列番号24;配列番号25;配列番号26;および配列番号27
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖(VL)を含む、請求項1から25のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体。
  27. CDR1が、
    GFTFSTYGMH[配列番号28]
    のアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる可変重鎖(VH)を含む、請求項1から26のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体。
  28. CDR2が、
    GKGLEWLSYISGGSSYIFYADSVRGR[配列番号29]
    のアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる可変重鎖(VH)を含む、請求項1から27のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体。
  29. CDR3が、
    CARILRGGSGMDL[配列番号30]
    のアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる可変重鎖(VH)を含む、請求項1から28のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体。
  30. 配列番号28および配列番号29および配列番号30のCDRを含む可変重鎖(VH)を含む、請求項1から29のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体。
  31. 配列番号31;配列番号32;配列番号33;配列番号34;配列番号35;配列番号36;配列番号37;配列番号38;および配列番号39
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖(VH)を含む、請求項1から30のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体。
  32. 以下のCDR:
    (i)配列番号1および配列番号2および配列番号3および配列番号28および配列番号29および配列番号30;または
    (ii)配列番号4および配列番号10および配列番号12および配列番号28および配列番号29および配列番号30;または
    (iii)配列番号5および配列番号10および配列番号13および配列番号28および配列番号29および配列番号30;または
    (iv)配列番号4および配列番号10および配列番号12および配列番号28および配列番号29および配列番号30;または
    (v)配列番号6および配列番号10および配列番号14および配列番号28および配列番号29および配列番号30;または
    (vi)配列番号7および配列番号11および配列番号15およびSEQ ID
    NO:28および配列番号29および配列番号30;または
    (vii)配列番号8および配列番号10および配列番号16およびSEQ ID
    NO:28および配列番号29および配列番号30;または
    (viii)配列番号9および配列番号10および配列番号17およびSEQ ID
    NO:28および配列番号29および配列番号30;または
    (ix)配列番号9および配列番号10および配列番号12およびSEQ ID
    NO:28および配列番号29および配列番号30;または
    (x)配列番号9および配列番号10および配列番号18およびSEQ ID
    NO:28および配列番号29および配列番号30
    を含む、請求項1から31のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体。
  33. 以下のアミノ酸配列:
    (i)配列番号19および配列番号31;または
    (ii)配列番号20および配列番号32;または
    (iii)配列番号21および配列番号33;または
    (iv)配列番号22および配列番号34;または
    (v)配列番号23および配列番号35;または
    (vi)配列番号24および配列番号36;または
    (vii)配列番号25および配列番号37;または
    (viii)配列番号26および配列番号38;または
    (ix)配列番号27および配列番号39
    を含む可変軽鎖(VL)および可変重鎖(VH)を含む、請求項1から32のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体。
  34. CD40の第1のドメイン(D1)内のエピトープに結合する、請求項1から33のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体。
  35. CD40に対する結合について、本発明の例示的な抗体(Table A(表1)に列挙された)のうちの1または複数と競合する、請求項1から34のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体。
  36. 抗体のFc領域を含む、請求項1から35のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体。
  37. Fc領域が、IgG1抗体に由来する、請求項36に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体。
  38. Fc領域が、配列番号62のアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる、請求項36または37に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体。
  39. IgG分子、またはIgG分子の抗原結合断片、変異体、融合体、もしくは誘導体である、請求項1から38のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体。
  40. 細胞傷害性部分をさらに含む、請求項1から39のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体。
  41. 細胞傷害性部分が、直接的および/または間接的に細胞傷害性である、請求項1から40のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体。
  42. 細胞傷害性部分が、細胞内にある場合は細胞傷害性であり、かつ/または細胞外にある場合は細胞傷害性でない、請求項40または41に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体。
  43. 細胞傷害性部分が、直接的に細胞傷害性の化学療法剤であるか、または直接的に細胞傷害性のポリペプチドである、請求項40または41に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体。
  44. 細胞傷害性部分が、非細胞傷害性のプロドラッグを、細胞傷害性の薬物へと転換することが可能な、請求項40または41に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体。
  45. 細胞傷害性部分が、放射線増感剤である、請求項40または41に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体。
  46. 細胞傷害性部分が、非細胞傷害性のプロドラッグを、細胞傷害性の薬物へと転換することが可能な核酸分子である、請求項40または41に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体。
  47. 細胞傷害性部分が、直接的に細胞傷害性の核酸分子である、請求項40または41に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体。
  48. 細胞傷害性部分が、直接的に細胞傷害性のポリペプチドおよび/または間接的に細胞傷害性のポリペプチドおよび/または治療用ポリペプチドをコードする核酸分子である、請求項40または41に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体。
  49. 細胞傷害性部分が、放射性原子、例えば、リン32、ヨウ素125、ヨウ素131、インジウム111、レニウム186、レニウム188、イットリウム90からなる群から選択される放射性原子を含む、請求項40または41に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体。
  50. 容易に検出可能な部分をさらに含む、請求項1から49のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体。
  51. 容易に検出可能な部分が、放射性原子、例えば、テクネシウム99mまたはヨウ素123を含む、請求項50に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体。
  52. 容易に検出可能な部分が、ヨウ素123、ヨウ素131、インジウム111、フッ素19、炭素13、窒素15、酸素17、ガドリニウム、マンガン、鉄からなる群から選択される、請求項50に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体。
  53. 請求項1から52のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体、またはその成分であるポリペプチド鎖をコードする核酸分子。
  54. 配列番号40;配列番号41;配列番号42;または配列番号43;または配列番号44;または配列番号45;または配列番号46;または配列番号47;または配列番号48;または配列番号49;または配列番号50;または配列番号51;または配列番号52;または配列番号53;または配列番号54;または配列番号55;または配列番号56;または配列番号57からなる群から選択される1または複数のヌクレオチド配列を含む、請求項53に記載の核酸分子。
  55. 以下のヌクレオチド配列:
    (i)配列番号40および配列番号49;または
    (ii)配列番号41および配列番号50;または
    (iii)配列番号42および配列番号52;または
    (iv)配列番号43および配列番号53;または
    (v)配列番号44および配列番号54;または
    (vi)配列番号45および配列番号55;または
    (vii)配列番号46および配列番号56;または
    (viii)配列番号47および配列番号57;または
    (ix)配列番号48および配列番号51
    を含む、請求項54に記載の核酸分子。
  56. 請求項53または54に記載の核酸分子を含むベクター。
  57. 発現ベクターである、請求項56に記載のベクター。
  58. 請求項53から55のいずれか一項に記載の核酸分子、または請求項56または57に記載のベクターを含む組換え宿主細胞。
  59. 細菌細胞である、請求項58に記載の宿主細胞。
  60. ヒト細胞などの哺乳動物細胞である、請求項59に記載の宿主細胞。
  61. 有効量の、請求項1から52のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体と、医薬として許容される緩衝液、賦形剤、希釈剤、または担体とを含む医薬組成物。
  62. 非経口投与に適する、請求項61に記載の医薬組成物。
  63. 腫瘍部位における局所投与または腫瘍部位の近傍における局所投与、例えば、腫瘍内投与または腫瘍周囲投与に適する、請求項61または62に記載の医薬組成物。
  64. 請求項61から63のいずれか一項に記載の医薬組成物を含むキット。
  65. 医療における使用のための、請求項1から52のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体、あるいは請求項53から55のいずれか一項に記載の核酸分子、あるいは請求項56または57に記載のベクター、あるいは請求項58から60のいずれか一項に記載の宿主細胞、あるいは請求項61から63のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  66. がんの処置における使用のための、請求項1から52のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体、あるいは請求項53から55のいずれか一項に記載の核酸分子、あるいは請求項56または57に記載のベクター、あるいは請求項58から60のいずれか一項に記載の宿主細胞、あるいは請求項61から63のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  67. がんの処置のための医薬の製造における、請求項1から52のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体、あるいは請求項53から55のいずれか一項に記載の核酸分子、あるいは請求項56または57に記載のベクター、あるいは請求項58から60のいずれか一項に記載の宿主細胞、あるいは請求項61から63のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
  68. がんの処置が、有効量の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体、あるいは核酸分子、あるいはベクター、あるいは宿主細胞、あるいは医薬組成物を、それを必要とする個体へと投与するステップを含む、請求項66に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体、あるいは核酸分子、あるいはベクター、あるいは宿主細胞、あるいは医薬組成物、あるいは請求項67に記載の使用。
  69. がんを伴う個体を処置するための方法であって、それを必要とする個体へと、有効量の、請求項1から51のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体、あるいは請求項53から55のいずれか一項に記載の核酸分子、あるいは請求項56または57に記載のベクター、あるいは請求項58から60のいずれか一項に記載の宿主細胞、あるいは請求項61から63のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与するステップを含む方法。
  70. それを必要とする個体へと投与するステップが、局所投与を含む、請求項65、66、または68のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体、あるいは核酸分子、あるいはベクター、あるいは宿主細胞、あるいは医薬組成物、あるいは請求項67に記載の使用、あるいは請求項69に記載の方法。
  71. がんが、前立腺がん、乳がん、結腸直腸がん、膵臓がん、卵巣がん、肺がん、子宮頸がん、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、多発性骨髄腫、白血病、急性リンパ性白血病、黒色腫、膀胱がん、および神経膠芽腫からなる群から選択される、請求項65、66、または68のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体、あるいは核酸分子、あるいはベクター、あるいは宿主細胞、あるいは医薬組成物、あるいは請求項67に記載の使用、あるいは請求項69に記載の方法。
  72. 請求項1から52のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片を作製するための方法であって、請求項58から60のいずれか一項に記載の宿主細胞を、コードされる抗体またはその抗原結合断片の発現を可能とする条件下で培養するステップを含む方法。
  73. 実質的に本特許請求の範囲において記載される、抗体もしくは抗原結合断片、またはその変異体、融合体、もしくは誘導体。
  74. 実質的に特許請求の範囲で規定される、医薬組成物または核酸分子またはベクターまたは宿主細胞またはキット。
  75. 実質的に特許請求の範囲で規定される、使用または方法。
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