JP4430303B2 - タンパク質機能のインビトロ分子進化方法 - Google Patents
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Description
本発明は、タンパク質機能のインビトロ分子進化方法に関し、特にヌクレアーゼを用いて得られた一本鎖DNAセグメントのシャフリングによる方法に関する。
【0002】
タンパク質機能は、部位の命令付き突然変異誘発(アルバー外(Alber et al),Nature,5;330(6143):41−46,1987)、組み合わせクローニング(ハス外(Huse et al),Science,246:1275−1281,1989;マークス外(Marks et al),Biotechnology,10:779−783,1992)及び適した選択システムと組み合わせたランダム突然変異誘発(バーバス外(Barbas et al),PNAS.USA,89:4457−4461,1992)を含め、種々の方法によりインビトロで修正・改良することができる。
【0003】
選択を伴うランダム突然変異誘発の方法は,タンパク質機能を改良するために多くの場合に使用されてきており、2つの異なる方策が存在する。第一に、願望される性質を持つ変異体の(突然変異の)タンパク質の選択と共同する全遺伝子シーケンスのランダム化は新ラウンドのランダム突然変異誘発と選択に伴われる。従って、この方法は、最適と考えられるタンパク質変異体を見出すまで繰り返すことができる(シーア外(Schier R.et al),J.Mol.Biol.1996 263(4):551−567)。ここでは、突然変異を導入する従来からのルートは、約0.7%の突然変異比率で、誤りやすい(以下、エラー・プロウンともいう。)PCR(レング外(Leung et al),Technique,1:11−15,1989)による。第二に、遺伝子の限られた領域を、変質したプライマーで突然変異を誘発することができる。このプライマーが100%までの突然変異比率をもたらす(グリフィス外(Griffiths et al),EMBO.J,13:3245−3260,1994;ヤング外(Yang et al),J.Mol.Biol.254:392−403,1995)。使用する突然変位比率が高ければ高いほど、突然変異を受けることができる遺伝子の領域がそれだけ大きく限定される。
【0004】
ランダム突然変異は抗体工学の分野で広く用いられてきた。インビボで形成された抗体遺伝子をインビトロでクローニングすることができ(ラリック外(Larrick et al),Biochem.Biophys.Res.Commun.160:1250−1256,1989)、かつ、種々の重い遺伝子と軽い遺伝子をコード化する(以下、エンコードするともいう。)遺伝子のランダムな組み合わせが選択を受けることができる(マークス外(Marks et al),Biotechnology,10:779−783,1992)。選択された機能性抗体フラグメントは、ランダム突然変位誘発と選択の追加のラウンドとを用いてさらに改良することができる(シーア外(Schier R.et al),J.Mol.Biol.1996 263(4):551−567)。
【0005】
ランダム突然変異誘発の方策は選択を伴う。興味深い性質を持つ変異体を選択することができ、かつ、各々が興味深い性質を持ち、異なる変異体から突然変異したDNA領域が一つのコーディング・シーケンス(以下、シーケンスを配列とも称する。)に組入れられる(ヤング外(Yang et al),J.Mol.Biol.254:392−403,1995)。これは多段シーケンス方法であり、異なる領域における異なる突然変異の潜在的相乗効果が失われる可能性がある。これらが共同して選択を受けないからである。このようにして、これらの二つの方策は、限定領域の同時突然変異誘発とこれらの領域の組み合わせの選択とを含まない。別の方法は、例えば抗体親和性を改良するために使用することがある遺伝子の組み合わせの対合を伴う(マークス外(Marks et al),Biotechnology,10:779−783,1992)。ここでは、各々異なる遺伝子の三つのCDR領域が固定され、この技法は、クローン間で、例えばCDR領域を含む種々のドメインに対して遺伝子の個々の遺伝子セグメントのシャフリングをもたらさない。
【0006】
DNAシャフリング(ステマー(Stemmer),Nature 370:389−391,1994)の概念は、DNAのランダムなフラグメント化と機能性コーディング・シーケンス中へのフラグメントの集合とを利用する。この方法では、化学合成DNAシーケンスを導入することと、このようにしてDNAシーケンスが既知である遺伝子において限定された場所に変化をねらうこととが可能である(クラメリ外(Crameri et al),Biotechniques,18:194−196,1995)。ステマー(Stemmer)と共同研究者はこのインビトロ方法を開発した。この方法は、現実にタンパク質の普通に起きる進化プロセスをリアセンブルする。DNAシャフリングは、個々の遺伝子から有用な突然変異を組入れる組換えにより多様性を生成する。それは、例えば酵素とサイトカインのような異なるタンパク質の人為的進化に対して首尾よく使用されてきた(チャン外(Chang et al),Nature Biotech.17,793−797,1999;ザン外(Zhang et al),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94,4504−4509,1997;クリスチャン外(Christians et all),Nature Biotech.17,259−264,1999)。遺伝子は、デオキシリボヌクレアーゼIを用いてランダムにフラグメント化され、次に相互組換えによりリアセンブルされる。出発物質は、シングル遺伝子(エラー・プロウンPCRを用いて始めにランダムに突然変異化された)であるか、あるいはファミリ・シャフリングと呼ばれる自然発生の相同シーケンスである。デオキシリボヌクレアーゼIは、ピリミジン・ヌクレオチドに隣接する部位で選択的にDNAを加水分解する。それ故、それはDNAのタンダム・フラグメント化に適する選択である。しかしながら、活性度はMgイオン、又はMnイオンに依存し、Mgイオンはフラグメント・サイズを50bpに制限し、一方Mnイオンは50bp以下のフラグメント・サイズを与えるであろう。それ故、組換えのために全ての可能性のサイズを持つために、問題の遺伝子は、二つの異なるイオンの両方の存在下でデオキシリボヌクレアーゼIにより少なくとも2回処理し、引き続きこれらのイオンを除去する必要がある。
【0007】
理論では、任意のクローン間でDNAをシャフルすることが可能である。しかしながら、シャフルされた遺伝子が発現と活性度の点で機能的になる場合、シャフルされようとするクローンは、好ましくは、低水準のランダム突然変異の例外と関連するあるいは同一である必要がある。遺伝子的に異なるクローン間のDNAシャフリングは一般的に非機能性遺伝子を生成する。しかしながら、種間融合ライブラリ(ライブラリーともいう。)は、DNAレベルで50%の相同性しかない大腸菌と人間のグリシンアミド・リボヌクレオチド・トランスフォーミラーゼ遺伝子のフラグメント間でつくることができることがイッチイ(ITCHY)の方法研究により立証された(オスターマイヤー外(Ostermeier et al),Nat Biotechnol 17,1205−9,1999)。
【0008】
二つの異なる遺伝子間の好結果の組換えはヘテロ二本鎖分子の形成を必要とする。幾つかのケースでは、ファミリ・シャフリングは、低頻度の組換えで発生するホモ二本鎖を形成するに過ぎないことが多い。この問題はデオキシリボヌクレアーゼIで消化された一本鎖化DNAの使用により焦点が当てられてきた(菊地外 Gene 243,133−137 2000)。
【0009】
一本鎖化DNAは本質的に異なる二つの方法で得ることができる。第一に、PCR反応においてビオチン化プライマーを例えばダイナビーズ(Dynabeads)(ダイナル(Dynal)、ノルウェー)またはアフィニティップ・ストレプタビジン・カプチャー・マイクロ・カラム(AffiniTip Streptavidin Capture Micro-columns)(ゲノシ・バイオテクノロジ社(Genosys Biotechnologies Inc.)、ウッドランド、米国)と組み合わせて使用することによる。第二に、一本鎖化DNAをパックすることができるバクテリオファージを利用することによる(最近の微生物学におけるウイルス及び関連生物、原理と応用、171頁−192頁、バージ(Ed. E.A.Birge)、ブラウン出版社(Wm.C.Brown Publishers)、1992;サムブルック外(Sambrook et al)、分子クローニング、研究所マニュアル・第二版、コールド・スプリング・ハーバー(Cold Spring Harbor)研究所出版、1989)。
【0010】
改変され改良された性質をもつ酵素の選択は酵素の実際の機能に基づくことが多い。例えば、酵素の耐熱性の増加は、野生型酵素を不活性にする温度でトランスフォームされたコロニーを培養することにより選択することができ、また、改良されたβ−グルコシダーゼ活性は基質としてPNPGを使用することにより見分けることができる(アリズビエタ外(Arrizubieta et al) Biol Chem Jun 27,2000)。
【0011】
分子ライブラリーからの機能性タンパク質の選択は、ファージ・ディスプレイ技法の開発により大刷新された(パームリイ外(Parmley et al),Gene,73:305‐391 1988;マッカフェティ(McCaffety et al),Nature,348:552−554,1990;バーバス外(Barbas et al),PNAS.USA,88:7978−7982,1991)。ここでは、表現型(タンパク質)はその対応する遺伝子型(DNA)に直接リンクしており、このことにより、タンパク質機能を改良するためにさらに修飾を受けることができる遺伝子型物質を直接クローニングすることができる。ファージ・ディスプレイは、1011に達するサイズの形質転換体をもつ多様な分子ライブラリから機能性バインダーを直接クローニング(以下クローン化する、又はクローンするともいう。)するために使用される(グリフィス外(Griffiths et al),EMBO.J,13:3245−3260,1994)。このようにして、ファージ・ディスプレイは分子ライブラリーから機能性バインダーを直接クローンするために使用することができ、始めに選択されたクローンをさらに改良するためにも使用することができる。タンパク質ライブラリの表面発現に使用される別の型のウイルスおよびその選択はバキュロウイルス(ボーブリック外(Boublik et al) Biotechnol 13:1079−1084,1995;モターヘッド外(Mottershead et al) Biochem Biophys Res Com 238:717−722,1997;グラブヘア外(Grabherr et al) Biotechniques 22:730−735,1997)とレトロウイルスである(バッハホルツ外(Buchholz et al)Nature Biotechnol 16:951−954,1998)。
【0012】
分子ライブラリからの機能性タンパク質の選択はセル表面ディスプレイによっても行うことができる。またここでは、表現型はその対応する遺伝子型に直接リンクしている。バクテリア・セル表面ディスプレイは、例えば、カルボキシメチルセルラーゼ(CMCase)の改良変異体のスクリーニングに使用されてきた(キム外(Kim et al)Appl Environ Microbiol 66:788−93,2000)。この目的に使用することができる別のセルは酵母セル(ボダーとウィトラップ(Boder and Wittrup) Nat.Biotechnol 15:553−557,1997)、COSセル(樋口外 J Immunol Meth 202:193−204,1997)、及び昆虫セル(グランツェリオ外(Granzerio et al) J Immunol Meth 203:131−139,1997;エルンスト外(Ernst et al) Nucleic Acids Res 26:1718−1723,1998)である。
【0013】
願望する機能の選択と組み合わせた、突然変異した異なるクローンからのDNAのランダム組み入れは、シーケンスの選択と選択したクローンの組み入れとに比較して、シーケンス・スペースの全域を探索するのに、より効率の良い方法である。
【0014】
この発明は、インビトロでのタンパク質進化の改良方法を提供しようとするものである。特に、本発明は、より効率的な組換えとシャフリング方法の提供を目的とする。これらは、より改変された分子を生じさせ、これにより願望する特性を有する分子を見つける確率を改善する。
【0015】
本発明の一つの局面によると、一つ以上のタンパク質特性をエンコードした親一本鎖ポリヌクレオチド・シーケンスからポリヌクレオチドのシーケンスあるいはシーケンス集団を生成するための方法を提供する。この方法は以下の工程を有する。
a)親ポリヌクレオチド・シーケンスのプラス鎖とマイナス鎖を構成する一本鎖DNAを準備する工程と、
b)一本鎖フラグメントの集団を生成するためにエキソヌクレアーゼを用いて一本鎖ポリヌクレオチド・シーケンスを消化する工程と、
c)プラス鎖から生成したフラグメントをマイナス鎖から生成したフラグメントと接触させる工程、かつ、場合よっては、少なくとも一つの親ポリヌクレオチドの3’末端と5’末端とにアニーリング条件でアニールするプライマー・シーケンスを加える工程と、
d)親ポリヌクレオチドによりエンコードされた一つ以上のタンパク質特性に比較して改変された特徴をもつ一つ以上のタンパク質特性をエンコードした少なくとも一つのポリヌクレオチド・シーケンスを生成するために、相互にアニールするフラグメントを増幅する工程。
【0016】
それ故、代表的には、願望された特徴を持つ、ポリヌクレオチドのシーケンスあるいはシーケンス集団を生成するためにポリヌクレオチド・フラグメントを組み入れる方法が提供される。この方法は以下の工程を有する。
a)異なる長さの一本鎖フラグメント集団を生成するために、一つ以上のタンパク質特性をエンコードする線状親一本鎖ポリヌクレオチドをデオキシリボヌクレアーゼI以外のヌクレアーゼを用いて消化する工程と、
b)工程(a)に由来するシーケンスからポリヌクレオチド・シーケンスをアセンブルする工程。
【0017】
好ましくは、この方法は、(c)アセンブルされたポリヌクレオチド・シーケンスによりエンコードされた生成タンパク質を発現する工程、及び(d)願望された特徴を求めてタンパク質をスクリーニングする工程を有する。
【0018】
ヌクレアーゼの反応時間を制御することにより、ポリヌクレオチド・フラグメントの大きさを制御することができる。このようにしてポリヌクレオチド・フラグメントの長さを決めることによって願望する長さのフラグメントをゲルから精製するような追加の工程を備えなければならないという必要性が回避される。
【0019】
願望する特徴をもつポリヌクレオチド・シーケンスを生成するために、一つ以上のタンパク質特性をエンコードする親ポリヌクレオチドが、異なって突然変異したその誘導体をつくるための突然変異誘発を受けることがある。同様に、未知のシーケンスの複数の変異体タンパク質特性を既にエンコードした親ポリヌクレオチドを得ることがある。ランダム突然変異は上述のように任意の従来からの方法で行うことができるが、適切な方法はエラー・プロウンPCRである。
【0020】
一本鎖ポリヌクレオチド・フラグメントを二本鎖ポリヌクレオチド・シーケンス中にアセンブルするために、PCR技法を使用することが好ましい。
【0021】
ポリヌクレオチド・シーケンスは、好ましくはDNAであり、RNAを使うこともある。簡単のため、用語ポリヌクレオチドは、ここでは以下の記述でDNAに関して使用されるが、本発明がRNAとDNAの両方に適用可能であることを認識すべきである。
【0022】
好ましくは、ポリヌクレオチドを5’プライム末端から3’プライム末端へ、3’プライム末端から5’プライム末端へ、あるいは両方の3’と5’末端とから消化する任意のエキソヌクレアーゼを使用することができる。本発明に従って使用することができる適切なエキソヌクレアーゼの実例はBAL31、T7遺伝子6エキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼVII及びエキソヌクレアーゼRec Jfを含む。
【0023】
好ましくは、エキソヌクレアーゼはBAL31である。
【0024】
本発明のDNAシャフリング方法にBAL31ヌクレアーゼを使用すると、迅速・容易で且つ制御可能なシステムが提供される。この酵素により、あらゆる大きさの遺伝子フラグメントを得ることができ、酵素の活性度は、種々の時点で消化を停止することにより容易に制御することができる。BAL31は、主として、線状DNAの二本鎖の両3’末端からモノヌクレオチドを取り除く3’プライム・エキソヌクレアーゼである。このようにして、3’プライム・エキソヌクレアーゼ活性により生成した一本鎖DNAはエンドヌクレアーゼにより減成する。3’プライム・エキソヌクレアーゼの酵素活性はエンドヌクレアーゼよりも約20倍有効に働く。従って、酵素濃度は得られるDNAフラグメントに重要である。高濃度の酵素は平滑末端付きDNAを有利にするけれども、低濃度で一本鎖DNA末端が極めて長いことがある。BAL31は反応速度論的に異なる二つの酵素形態からなり、これらは迅速形態(F)と緩慢形態(S)である。S形態はF形態のタンパク質分解酵素の減成生成物である。さらに、BAL31は非同期的に働き、その末端が種々の程度に切除され且つその一本鎖尾部が長さにおいて変化するDNA分子の集団を生成する。両方の形態が、また、高度に進歩的様式でエキソヌクレオリティックな形でssDNA上で作用する。攻撃の方向は、二本鎖DNAの減成のモードと対照的に、5’末端からである。ヌクレアーゼ分子は、当初5’末端から離れて非生産的に結合され、容易に拡散して生産的な(ターミナルで結合される)酵素基質錯体を生じることが示唆された(ル及びグレイ(Lu T and Gray jr. HB)Biochimica et Biophysica Acta 1995,vol. 1251,p125−138)。酵素はコ・ファクターとしてCa2+を使用する。これは、EGTA(エチレングリコールビス(β−アミノエチルエーテル)N,N,N’,N’,−四酢酸)との錯体に結合されることがある。線状DNAシーケンスはBAL31で消化され、反応はEGTAの添加により異なる時点で停止される。
【0025】
消化された個々のフラグメントは精製され、混合され、PCR技法でリアセンブルされる。アセンブルされた(再構成された)遺伝子は、次に、タンパク質を発現するため発現ベクター中にクローンされる。タンパク質は、次に、改良した特徴を求めて分析される。
【0026】
本発明の方法は既知のシャフリング技法を超える幾つかの利点を提供し、これらには組み換えの比率増加とフラグメントの大きさの制御とが含まれる。
【0027】
本発明の方法は、BAL31処理からDNA試料を引き出す各時点で一組の累進的に短縮されたDNAフラグメントを生成する。DNA試料は集められ、一緒にプールされることがあり、あるいは、場合によっては、個別の試料が選択され、この方法に使用されることがある。このようにして、本発明は、どんなDNA試料を組み換えシステムに使用することになるか選択できることによってより良好な制御を提出する。
【0028】
本発明の方法は、例えば抗体又は抗体の一部、酵素又は受容体のような結合性又は触媒性を有する任意のタンパク質で例示される特別な生成物にコードする任意のポリヌクレオチドに実施されることがある。さらに、例えば触媒RNAに改変されることがある機能を有する任意のポリヌクレオチドが本発明に従ってシャフルされることがある。一つ以上のタンパク質特性をエンコードする親ポリヌクレオチドが少なくとも12個のヌクレオチド長さであることが好ましく、より好ましくは少なくとも20個以上のヌクレオチド長さであり、さらにより好ましくは少なくとも50個以上のヌクレオチド長さである。少なくとも100個のヌクレオチド長さである、あるいは少なくとも200個のヌクレオチド長さであるポリヌクレオチドが使用されることがある。酵素あるいは抗体のような大きなタンパク質をエンコードする親ポリヌクレオチドが使用される場合、これらは数百あるいは数千の塩基長さを有する。本発明は任意の大きさの親ポリヌクレオチドに実施されてよい。
【0029】
本発明は、また、上述の方法により生成され、願望される特徴を有するポリヌクレオチド・シーケンスを提供する。これらのシーケンスは、遺伝子治療ベクター、及び、複製欠陥のある遺伝子治療構成体、あるいは、DNAベースの種痘用種痘ベクターの生成に使用されることがある。さらに、ポリヌクレオチド・シーケンスは研究の道具として使用されることがある。
【0030】
本発明は、また、願望される特徴を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドが選択され、上述の方法で生成される、シーケンスのポリヌクレオチド・ライブラリを提供する。ポリヌクレオチド・ライブラリがaDNAまたはcRNAのライブラリであることが好ましい。
【0031】
本発明は、また、上述の方法により生成した野生種のものとは異なる特徴を有する、酵素、抗体、及び受容体のような、タンパク質を提供する。これらのタンパク質は、個別に、あるいはワクチンとして薬剤的に受容される担体内に、あるいは例えば免疫体、抗原または特定の抗体を得る別のものとして治療用医薬内に使用されることがある。これらは研究の道具として使用されることがある。
【0032】
本発明により生成されるポリヌクレオチドまたは本発明により生成されるポリヌクレオチドによりエンコードされるタンパク質の願望される特徴は、野生種(親)ポリヌクレオチド、あるいはポリペプチド、タンパク質、あるいはそれがエンコードするタンパク質特性の通常の活性における任意の変化または改変であることがある。例えば、酵素の触媒活性を減少又は増加すること、あるいは抗体の結合特異性を改良または低減することが望ましいことがある。さらに、タンパク質またはポリヌクレオチドが免疫体である場合、それに対する固有の抗体を得るためにその性能を減少または増加することが望ましいことがある。親ポリヌクレオチドは好ましくは一つ以上のタンパク質特性をエンコードする。これは、特徴的タンパク質機能を有するまたは潜在的に有するポリペプチド・シーケンスをエンコードする、ポリヌクレオチドの領域により決定される。例えば、タンパク質特性は、全体タンパク質の一部、すなわちエピトープまたは開裂部位または触媒部位等を決めることがある。しかしながら、本発明の範囲内では、発現したタンパク質特性は活性度をディスプレイするまたは「正しく」折畳まれている必要はない。
【0033】
一部のエピトープの立体配座を改変するようにタンパク質を修飾することによりその抗原性を改良する及び/又は交さ反応性を低減することが望ましいことがある。例えば、そのようなタンパク質が抗原として使用されると仮定すると、修飾が、同様のタンパク質と出現した抗体の任意の交さ反応性を低減することがある。
【0034】
用語「酵素」が使用されるけれども、これは、酵素様活性すなわち触媒機能を有する任意のポリペプチドをも含むとして説明されるべきである。例えば、酵素の一部であるポリペプチドはなお触媒機能を所有する。その上、インターフェロンおよびサイトカインのようなタンパク質が含まれる。同じように、用語「抗体」は、要求される特異性と共に結合ドメインを有する任意の結合物質を含むとして解釈されるべきである。これは抗体フラグメント、抗体の誘導体、機能性等価体及び同族体を含むとともに、合成分子とその形状が、それに抗体またはエピトープを結合することを可能にする抗体の形状を模写する分子とを含む。抗体または別の結合パートナーを結合することができる抗体フラグメントの実例は、VL、VH、Cl及びCHlの各ドメインからなるFabフラグメント、VH及びCHlの両ドメインからなるFdフラグメント、抗体のシングル・アームのVL及びVHの両ドメインからなるFvフラグメント、VHドメインからなるdAbフラグメント、隔離されたCDR領域及びF(ab’)2フラグメント、ヒンジ区域でジスルフィド・ブリッジによりリンクされる二つのFabフラグメントを含む二価フラグメントである。シングル・チェーンFvフラグメントも含まれる。
【0035】
生成したポリヌクレオチド・シーケンスの発現を得るために、そのシーケンスが、その発現を制御するために、ポリヌクレオチド・シーケンスに操作可能にリンクした制御シーケンスを有するベクターに組み入れられることがある。ベクターは、挿入されたポリヌクレオチド・シーケンスの発現を推進するためにプロモーターまたはエンハンサーのような別のシーケンスを含むことがあり、ポリヌクレオチドでエンコードされたタンパク質が融合体として生産されるようにそれ以上のポリヌクレオチド・シーケンスを含むことがあり、及び/又は、宿主細胞内で生産されたタンパク質がその細胞から分泌されるように分泌シグナルをエンコードする核酸を含むことがある。ポリヌクレオチド・シーケンスでエンコードされたタンパク質は、次に、ベクターが機能性である宿主細胞内にベクターをトランスフォームすること、タンパク質が生産されるように宿主細胞を培養すること、及び宿主細胞または取り巻く媒質からタンパク質を受容することによって得ることができる。原核生物の細胞と真核生物の細胞が当該技術でこの目的に使用され、これらは大腸菌の株、酵母及びCOS細胞またはCHO細胞のような真核生物の細胞を含む。宿主細胞の選択は、例えばタンパク質が宿主細胞内でデポジトされるまたはグリコシレーションのような性質に影響を及ぼす場所を制御する、それらの細胞に発現したタンパク質の性質を制御するために使用することができる。
【0036】
ポリヌクレオチド・シーケンスでエンコードされたタンパク質は、当該技術で公知の方法により発現されることがある。便宜的には、発現は、タンパク質の発現を引起すまたは与える適切な条件下でそのようなベクターを含む宿主細胞を培養により成長させることにより達成されてもよい。
【0037】
種々の異なる宿主細胞内のタンパク質のクローニングと発現のためのシステムが公知である。適切な宿主細胞は、バクテリア、哺乳動物と酵母のような真核生物の細胞、及びバキュロウイルス・システムを含む。また、クローニングと発現のためにレトロウイルス・システムを使用することは、良好な代替案である。この理由は、このウイルスが多くのセルの型と共に使用することができるためである。異類変性のポリペプチドのために当該技術で利用できる哺乳動物細胞系統は、中国ハムスター卵巣細胞、HeLa細胞、赤子ハムスター腎細胞、COS細胞及び多くの他の細胞を含む。一般的な、好ましいバクテリア宿主は大腸菌である。
【0038】
適切なベクターを選択するあるいは組み立てることができる。適切なベクターは、プロモーター・シーケンス、ターミネーター・フラグメント、ポリアデニレーション・シーケンス、エンハンサー・シーケンス、マーカー遺伝子及び適切な他のシーケンスを含む適当な調整シーケンスを含んでいる。ベクターは、適切な、プラスミド、例えばファージのようなウイルス、またはファスミドであることがある。さらに詳細には、例えば、分子クローニング:研究所マニュアル:第二版、サムブルック外(Sambrook et al)、1989年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)を参照ください。ポリヌクレオチド・シーケンスを操作するための多くの公知の技法と報告が、例えばポリヌクレオチド構成体の調製、突然変異誘発、シーケンシング(以下配列決定ともいう。)、DNAの細胞内への導入及びタンパク質の分析において、分子生物学における最近の報告、アウスベル外(Ausubei et al)編集、John Wiley & Sons、1992年に詳細に記述される。
【0039】
システムは、多くの方法で願望されるタンパク質機能を求めてスクリーニングすることができる種々のシーケンスを有するDNAライブラリをつくるために使用することができる。酵素機能は、例えばカルボキシメチルセルラーゼ活性、β−グルコシダーゼ活性及び熱安定性のような実際的酵素機能に特有の方法でスクリーニングすることができる。さらに、ファージ・ディスプレイおよびセル表面ディスプレイが、酵素機能を求める(クラメリ外(Crameri A. et al),Nature 1998 15;391(6664):288−291;ザーン外(Zhan J.H. et al),PNAS. USA 1997 94(9):4504−4509;ワーレン外(Warren M.S. et al),Biochemistry 1996,9;35(27):8855−8862;キム外(Kim et al),Appl Environ Microbiol 66:788−93,2000)と同様に例えば抗体の改変された結合性を求める(グリフィス外(Griffith et al),EMBO J. 113:3245−3260,1994)スクリーニングに使用されることがある。
【0040】
本発明により提供されるタンパク質は、活性又は機能に影響を与えるまたは調節する分子を求めるスクリーニングに使用されることがある。そのような分子は治療の関係(おそらく予防を含めて)に有用なことがある。
【0041】
本発明は、また、上述の方法で生成したポリヌクレオチド・シーケンスを有するベクターを提供する。
【0042】
本発明は、また、ポリヌクレオチド・シーケンス、ポリヌクレオチド・シーケンスを有するベクター、あるいは、上述の方法で生成するタンパク質と薬剤的に受容できるキャリヤー、あるいは、研究目的に適するキャリヤー、を有する組成物を提供する。
【0043】
本発明は、また、上述の方法により願望する特徴を有する、ポリヌクレオチドあるいはポリペプチドの同定に引続いて、場合によっては付加的ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと共に、このポリペプチドまたはポリヌクレオチドの全体または一部を製造することを含む方法を提供する。
【0044】
願望する特徴を有するポリヌクレオチドあるいはポリペプチドの同定に引続いて、これらが、次に、PCR、クローニング及び宿主細胞内の発現のような公知の技法により、より多くの量を提供するために製造される。
【0045】
得られたポリペプチドあるいはポリヌクレオチドは、例えば低温度でより高い活性が好ましい、クリーニング店の洗浄性酵素のような工業用酵素の製造に使用されることがある。あるいは、製造されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは研究道具として使用されることがある。すなわち、抗体が免疫検定に使用されることがあり、ポリヌクレオチドがハイブリダイゼイション・プローブまたはプライマーとして使用されることがある。あるいは、得られたポリペプチドあるいはポリヌクレオチドは、以下に述べるように、診断用途、製剤用途、治療等用の医薬の調製に使用されることがある。
【0046】
本発明の方法で生成され、望ましい特徴を有するとして同定されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、医薬組成物に配合することができる。この組成物は、上述の物質の一つに加えて、当業者に公知で医薬的に受容される賦形剤、キャリヤー、緩衝剤、安定剤または他の物質を有することがある。そのような物質は、無毒性であらねばならず、活性成分の効能と干渉してはならない。キャリヤーまたは他の物質の正確な性質は、例えば経口、静脈、皮膚または皮下、鼻、筋肉内、腹腔内の経路の投与経路によることがある。
【0047】
経口投与用の医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末及び液体の形態であることがある。
錠剤は、ゼラチンまたはアジュバントのような固体キャリヤーを含むことがある。液体薬剤組成物は、一般的に、水、石油、動物油または植物油、鉱油または合成油のような液体キャリヤーを含む。生理的食塩水、ブドウ糖、または他の糖類溶液またはエチレングリコール、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコールのようなグリコールが含まれることがある。
【0048】
静脈、皮膚または皮下注射、あるいは苦痛部位での注射用には、活性成分は、ピロゲンを含まず、且つ適切なpH、アイソトニシティ及び安定性を有し、非経口で受容できる水溶液の形態である。当業者は、例えば、食塩注射剤、リンゲル液注射剤、乳酸加リンゲル液注射剤のようなアイソトニックな分散媒を使用する適切な溶液を調製することが十分にできる。保存剤、安定剤、緩衝材、抗酸化剤及び/又は別の添加剤が、必要に応じて、含まれることがある。
【0049】
個人に与えられるべきものが、本発明による生成に引続いて同定された、例えば抗体及びそのフラグメントのようなポリペプチド、酵素、ポリヌクレオチドまたは核酸分子である場合、投与は、好ましくは、「予防的に有効な量」であり、あるいは「治療に有効な量」(事情により、予防処置が治療と考えられることもあるけれども)である。これは個人に利益を示すに十分である。投与された実際の量、及び投与の速さとタイム・コースは、治療する対象の性質と重さに依るであろう。例えば投与量等の決定のような治療の処方は、一般医と他の医者の責任範囲内にあり、治療されるべき障害、個々の患者の状態、到達の部位、投与の方法及び開業医に公知の別の因子が、代表的に、考慮される。上述の技法と報告の実例は、レミングトン(Remington)の医薬の科学(Pharmaceutical Sciences)、16版、オーサル(Osol,A)編集、1980に見出すことができる。
【0050】
あるいは、標的をねらう治療は、抗体または細胞特定リガンドのような標的システムにより、有効薬剤をある種の細胞により多く特定して配送するために使用されることがある。標的をねらうことは種々の理由のために望ましいことがある。これは、例えば、薬剤が、受容できないほど有毒である場合、または薬剤が、そうしなければ、高すぎる投与量を必要とする場合、あるいは薬剤が、そうしなければ、標的細胞に入れることができない場合である。
【0051】
これらの薬剤を直接に投与する代わりに、これらは、例えばウイルス・ベクター内のような細胞中に導入されたエンコード遺伝子からの発現により標的細胞内で生産することができる(VDEPT技法の変異体、すなわち、例えば酵素のような活性剤は、ウイルス・ベクター内のエンコードDNAからの発現によりベクター内に産出する)。ベクターは、治療されようとしている特定の細胞を標的にすることができるであろう。あるいは、ベクターは、標的細胞により多少選択的に切り換えられる調節要素を含むことができるであろう。
【0052】
あるいは、治療されようとする細胞にて活性剤により生産される、活性形態へ転換するための薬剤を前駆体の形態で投与することが、または、治療されようとする細胞を標的にすることができるであろう。この種類の取り組みはADEPTまたはVDEPTとして知られる場合が多い。前者は、細胞特異性抗体への接合により細胞に活性剤をねらいをつけることを含み、一方、後者はウイルス・ベクター内にDNAをエンコードすることから発現によりベクター内に、例えば酵素のような活性剤を産出することを含む(例えば、欧州特許第415731号明細書及び国際公開公報第90/07936号明細書を参照ください)。
【0053】
組成物は、それのみで、あるいは、治療されようとする状態によって同時にまたは順番に別の治療と組み合わせて、投与されることがある。
【0054】
さらに別のこととして、本発明の方法による生成に引続いて望ましい特徴を持つとして同定されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドによりエンコードされた活性ポリペプチドを合成することができない、あるいは、正常な水準ではそれを合成することができない、患者に対して遺伝子治療の方法で使用することにより、対応する野生型タンパク質により与えられる効果を提供することができるであろう。
【0055】
ウイルス・ベクターのようなベクターは、ポリヌクレオチドを広範囲の異なる標的細胞中に導入するために従来技術で使用されてきた。代表的には、ベクターが標的細胞に露出される結果として、トランスフェクションが十分な割合の細胞で起きて、望まれるポリペプチドの発現から治療のまたは予防の有用な効果を与えることができる。トランスフェクションされた核酸は、標的の各腫瘍細胞のゲノム中に永久に組み込まれ、長期に継続する効果を与えることがある。あるいは治療は定期的に繰り返さなければならないことがある。
【0056】
種々のベクターは、ウイルス・ベクター及びプラスミド・ベクター共に、当該技術に公知であり、米国特許第5,252,479号明細書及びPCT国際公開公報93/07282号明細書に見られる。特に、多くのウイルスが、遺伝子転移ベクターとして使用されてきた。これには、SV40のようなパポバウイルス、ワクシニア・ウイルス、ヘルペス・ウイルス、HSV及びEVB、レトロウイルスが含まれる。既存技術における多くの遺伝子治療報告では、不活性化されたネズミのレトロウイルスが使用されてきた。
【0057】
ウイルス・ベクターを使用する代わりとして、細胞中に核酸を導入する別の既知の方法は、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈殿、細胞内注入のような機械的技法、リポソームに媒介される転移、直接的DNA取り込み及びレセプター媒介DNA転移を含む。
【0058】
上述のように、ポリペプチドまたはその活性部をエンコードする核酸を用いる遺伝子治療の狙いは、野生型ポリペプチドが存在しないあるいは低水準で存在するに過ぎない細胞において核酸の発現産物の量を増加することである。そのような治療は、病気にかかりやすい対立遺伝子を有する従って例えばがん素質を有することがスクリーニングにより既知である個人の治療において、既にガンにかかっているまたは予防する細胞の治療に有効であることがある。
【0059】
本発明は、また、ssDNA調製用試薬、エキソヌクレアーゼ及び例えば熱安定性DNA(ヌクレオチド)のようなPCR技法実施用成分及び例えばEGTAのような停止用品を有し、望まれる特徴を有するポリヌクレオチドのシーケンスまたはシーケンス集団を生成するキットを提供する。
【0060】
先に概述したように、本発明は、突然変異した酵素遺伝子シーケンスと、望ましい特徴を有する機能性酵素へのそのランダム組み入れとの創作を使いやすく備える。本発明のこの側面の実例として、酵素遺伝子は、約0.7%の突然変異比率の結果になるエラー・プロウンPCRにより突然変異する。突然変異した酵素遺伝子の得られた供給源は、次に、エキソヌクレアーゼ、好ましくはBAL31、により消化され、反応は、異なる時点でのEGTAの添加により停止され、異なる大きさの一組のDNAフラグメントが得られる。これは、上述のようにPCRベースのリアセンブリを受けることがある。得られたアセンブルされたDNAフラグメントは、次に、クローニングされ、遺伝子ライブラリが構成される。次に、クローンがこのライブラリから選択され、シーケンシングされることがある。
【0061】
この技法の更なる用途は、さらなる選択と分析に使用することができる種々のDNAシーケンスの集団の生成である。例えば抗体フラグメントと酵素のようにより大きなタンパク質をエンコードするに加えて、DNAは、分子の機能性の特徴が異なる選択システムの設計に使用することができるペプチドをエンコードすることがある。ペプチドをエンコードする、組み換えられたDNAシーケンスの選択は既に記述した(フィシュ外(Fisch et al),PNAS. USA 1996 Jul 23;93(15):7761−7766)。加えて、種々のDNA集団は、例えば触媒活性を持つRNA分子の集団の産出に使用することがでできる。バイシュ外(Vaish et al)(PNAS. USA 1998 Mar 3;95(5):2158−2162)は触媒性RNAの選択用機能性システムの設計を示した。エクスタイン(Eckstein F)(Ciba Found. Symp.1997;209;207−212)は細胞内触媒性RNAの特異的導入による触媒性DNAの応用を概説した。システムは、組み換えられたDNAシーケンスをベースとする触媒活性を持つ機能性ペプチド/分子の選択におけるシーケンス・スペースを通じたさらなる研究に使用することがある。
【0062】
本発明の特徴と実施例が、これから、付属の図を参照しながら具体例により説明されるであろう。それ以上の特徴と実施例が当業者に明らかであろう。
【0063】
【実施例】
DNAシャフリング手法は、図1乃至図5に示す工程で説明することができる。ここでは、プラスミドpFab5chis中の所定のタンパク質(X)をエンコードする遺伝子をこの実施例に用いる。誤りやすいPCRにより、ランダム突然変異(以下変異ともいう。)を導入する。一本鎖DNAを作製する。これは、上述のとおり、ビオチン化プライマーにより、若しくは一本鎖DNAを包むことができるファージを使用することにより実施可能である。エンコードするssDNA鎖とエンコードしないssDNA鎖を異なる反応(A及びB)で作製する。どちらの反応によるssDNA鎖も、例えばBAL31を用いる別々の酵素処理を施される。等モルの一本鎖DNAフラグメントの二つの供給源を混合することにより、遺伝子を、二つの連続したPCR反応物を用いて、シャッフルされた形の多くのバージョンでリアセンブルすることができるが、そこでは最初の反応ではプライマーを含まない。このリアセンブルしたpY内の遺伝子のライブラリーをクローニングした後、改良された所定の分子を得る選択をすることができる。
【0064】
本発明の例を以下に更に詳しく説明する。
【0065】
実施例1
試薬
アンプリタック (AmpliTaq(登録商標))ポリメラーゼをパーキンエルマー社(Perkin-Elmer Corp.)より、dNTPをベーリンガー・マンハイム・バイオケミカ(Boehringer Manheim Biochemica)(ドイツ国マンハイム)より、そしてヌクレアーゼBAL31をニューイングランド・バイオラブ社(New England Biolabs Inc.)(アメリカ合衆国ビバリー)より購入した。制限酵素は全てニューイングランド・バイオラブ社(New England Biolabs Inc.)(アメリカ合衆国ビバリー)より購入した。臭化エチジウムは、ハーキュレスのバイオラッド・ラボラトリーズ(Bio-Rad Laboratories)(アメリカ合衆国カリフォルニア州)から購入した。T4DNAリガーゼは、ニューイングランド・バイオラブ社(New England Biolabs Inc.)(アメリカ合衆国ビバリー)より購入した。EDTA及びEGTAはケボ・ラブ(Kebo Lab)(スウェーデン国)より購入した。
【0066】
全てのプライマーは、ラボで設計されてライフ・テクノロジーズ(Life Technologies) [スウェーデン国テビー(Taby)]及びSGS-DNA[スウェーデン国ケピング(Koping)]から入手した。
【0067】
PCR
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は全て、自動サーモサイクラー[パーキンエルマーセタス480 (Perkin-Elmer Cetus 480)、アメリカ合衆国コネチカット州ノーウォーク]の中で行なった。核酸増幅のPCR技術は、米国特許第4,683,195号明細書に記載されている。PCR技術の一般的用途における参考文献として、マリス(Mullis)ら「定量的生物学に関するコールド・スプリング・ハーバー・シンポジア」第51巻263頁(1987)[Cold spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263 (1987)]、ニューヨークのストックトン・プレスよりEhrlich編「PCR技術」(1989)[PCR Technology, Stockton Press, NY (1989)]、Ehrlichら「サイエンス」第252巻1643頁乃至1650頁(1991)[Science, 252:1643-1650 (1991)]、ニューヨークのアカデミック・プレスよりInnisら編「PCRプロトコル;メソッド及びアプリケーションへの指針」(1990)["PCR protocols; A Guide to Methods and Applications", Academic Press, New York (1990)]を含む。
【0068】
配列決定
全ての構築体は、ビッグダイ・ターミネーター・サイクル・シークエンシング・キット(BigDye Terminator Cycle Sequencing kit)(アメリカ合衆国カリフォルニア州エルマービル在パーキンエルマー)(Perkin-Elmer, Elmervill, CA, USA)を用いて配列した。配列決定はABIプリズム377DNAシークエンサー(ABI Prism 377DNA Sequencer)を用いて行なった。
【0069】
アガロース電気泳動
DNAのアガロース電気泳動は、トリス酢酸バッファー(TAE-buffer 0.04M Tris-acetate, 0.001M EDTA)中の臭化エチジウムが0.25μg/mlである2%アガロースゲル(アガロース、アメリカ合衆国メイン州ロックランドFMCバイオプロダクツ)[AGAROSE (FMC Bioproducts, Rockland, ME, USA)]を用いて行なった。電気泳動用サンプルは、25%フィコールとブロモフェノールブルーからなる滅菌、ろ過済みの添加バッファーに混合し、2%アガロースゲルのウェルに添加した。電気泳動は、0.25μg/ml臭化エチジウムのトリス酢酸バッファー中で、他に指定のない限り90Vで45分行なわれた。必要に応じて、適切なサイズのバンドをキアクイックゲル抽出キット(Qiaquick Gel Extraction Kit)(ドイツ国ヒルデン,キアゲン社)(Qiagen GmbH, Hilden, Germany)を用いてゲル精製した。分子量標準として、DNA分子量マーカー1kbラダー (DNA molecular weight marker 1kb ladder) (ギブコBRL)(Gibco BRL)を使用した。ゲル抽出生成物のDNA濃度は、分光光度計を用いて推定した。
【0070】
細菌株
形質転換の細菌宿主として、TOP10F'大腸菌(Escherichia coli)株を使用した。化学的な適切細胞であるこの株を、基本的に1983年生物学ジャーナルのD.ハナハン著「プラスミドによる大腸菌(Escherichia Coli)の形質転換の研究」第166巻557頁乃至580頁(Hanahan, D. 1983. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166:557-580) に記述されるとおりに産生した。この細菌株のエレクトロコンピーテント・セルを産生した(1988年、W.J.ダウアー、J.F.ミラー及びC.W.ラグスデール著「高電圧エレクトロポレーションによる大腸菌(E.Coli)の高効率形質転換」、核酸リサーチ第16巻6127頁)(Dower, W.J., J.F. Miller, and C.W. Ragsdale. 1988: High efficiency transformation of E.coli by high voltage electroporation, Nucleic Acids Res. 16:6127)
プラスミド
遺伝子操作は全て、「ラボラトリーマニュアル、分子クローニング」(Molecular cloning; a laboratory manual)(1989年コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレスより第二版)(Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に従い、pFab5chis中で行なった。このベクターは、SfiI部位(サイト)とNotIサイトの間に挿入されたいかなるsdFv遺伝子も含む(harbour)ように設計されている。SfiIサイトはpelB始端部に位置し、NotIサイトはVL領域のすぐ後ろに位置し、それ故VH-リンカー-VLが挿入される。このケースでは、CD40へ導く抗体を使用する。
【0071】
プライマー
pFab5chisの抗体遺伝子を囲む二つのビオチン化プライマーは、指定された独自の制限酵素認識部位を含む以下の配列で設計した。
1736 SfiI フォワードプライマー
5'-ATT ACT CGC GGC CCA GCC GGC CAT GGC CCA CAG GTC AAG CTC GA
及び1735NotI リバースプライマー
5'-TTA GAG CCT GCG GCC GCC TTG TCA TCG TCG TCC TT
pFab5chisの抗体遺伝子を囲む二つの非ビオチン化プライマーは、指定された独自の制限酵素認識部位を含む以下の配列で設計した。
1664 SfiI フォワード・プライマー
5'-ATT ACT CGC GGC CCA GCC GGC CAT GGC CCA CAG GTC AAG CTC GA
及び1635 NotI リバース・プライマー
5'-TTA GAG CCT GCG GCC GCC TTG TCA TCG TCG TCC TT
標準PCR
標準PCR反応は、次のプロフィールにて25サイクルで行なった。変性(94℃で1分間)、プライマー・アニーリング(55℃で1分間)及びイクステンション(72℃で3分間)である。各々のPCR反応は、pH8.3のトリス塩酸を10mM、KClを50mM、MgCl2を1.5mM、dNTPを200μM、フォワード・プライマーを1μM、リバース・プライマーを1μM、アンプリタック(登録商標)熱安定DNAポリメラーゼ(AmpliTaq(登録商標)thermostable DNA polymerase)(パーキンエルマー社)(Perkin-Elmer Corp.)を1.25U、及び鋳型50ngを最終容積100μl中に含んだ。
【0072】
誤りやすいPCR
誤りやすいPCR反応を、NaClを500mM、pH8.8で、トリス塩酸を100mM、MgCl2を5mM、ゼラチンを100μgを含む10x緩衝剤中で行なった[カイパーら著、1991年8月25日「核酸リサーチ」第19(16)巻4558頁(Kuipers et al., Nucleic Acids Res. 1991, Aug 25;19(16):4558)に準じるが、MgCl2濃度は2mMから5mMに増加した。]。
100μlの反応毎に以下を混合した。
【0073】
dATP5mM 5μl
dGTP5mM 5μl
dTTP10mM 10μl
dCTP10mM 10μl
20μM 3'プライマー 1.5μl
20μM 5'-プライマー 1.5μl
10xKuipersバッファー 10μl
滅菌mp H2O 46.3μl
pFab5chisベクター中の鋳型を50ngの量で添加した。10mMのMnCl2を10μlを添加し、管にMnO2の沈殿が生じていないことを確認した。最後に5単位のTaq酵素を添加した。誤りやすいPCRを次の温度で25サイクル、ホットスタート無しで作動した。94℃で1分間、45℃で1分間、72℃で1分間更に72℃で7分間である。得られた生成物は、ほぼ750bpのタンパク質上にわたるエラー・プロウン化インサートであった。更に処理を行なう前に、このインサートをギブコPCR精製キット(Gibco PCR purification kit)で精製した。
【0074】
ビオチン化プライマーによる一本鎖DNAの生成
所定のフラグメントを、別個の二つのPCR反応によって増幅した。これらの反応は、上述した標準PCR、または同様に上述した誤りやすいPCRであり得る。プライマーは、一つの反応でフォワード・プライマーをビオチン化し、もう一つの反応でリバース・プライマーをビオチン化するよう設計すべきである。例えば、pFab5chis抗体を鋳型として、上述のプロフィールによってA)プライマー1736と1635、及びB)プライマー1664と1735を用いたPCR反応を25サイクル行なった。これによりほぼ750bpのPCR産生物を生じ、A)では上の鎖がビオチン化し、B)では下の鎖がビオチン化した。
【0075】
ビオチン化していない鎖は、例えばダイナビーズのようなストレプトアビジンでコートした固体マトリックスを用いて精製して取り出した。この磁性ビーズは、PBS1%のBSAと、pH7.5のトリスを5mM、NaClを1M及びEGTAを0.5mM含むB&Wバッファーで洗浄し平衡化する。各PCR産生物の100μlを2xB&Wバッファーに溶解しているビーズ100μlと混合し、室温で15分間、回転で培養する。結合していないPCR産生物は、B&Wで入念に2回洗浄して取り除く。捕獲したDNAのビオチン化していない鎖は、DNAを0.1MのNaOHを25μl用いて室温で10分間培養することにより、アルカリ変性によって溶出する。この溶解液は、ビーズと分離し、0.33MのHClを7.5μl及びpH8の1Mトリスを2.5μl用いて中和する。
【0076】
ファージを用いる一本鎖DNAの生成
制限酵素PstI/HindIIIを使用して、所定のフラグメントをバクテリオファージM13のベクターであるM13mp18及びM13mp19中にクローン化した。これらのバクテリオファージは、TOP10F'大腸菌(Escherichia Coli)株を用いた従来の方法で繁殖した。上の鎖の一本鎖DNAはバクテリオファージベクターM13mp18から作製し、下の鎖の一本鎖DNAはバクテリオファージベクターM13mp19から作製した。1.5mlの感染した細菌培養液を12000g、4℃で5分間、簡単に遠心分離機にかけた。浮遊物は、200μlの20%PEG8000と2.5M NaClにより沈殿させた。ペレット化したバクテリオファージは、100μlのTE中に再懸濁した。トリス塩酸(pH8.0)によって平衡化したフェノールを50μl添加し、サンプルを渦攪拌した。遠心分離機に12000g、RTで1分間かけた後、DNAを含む上相は、移動しエタノールによって沈殿した。DNAペレットは、50μlのTE(pH8.0)中に溶解させ、20℃で保管した(1989年コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレスよりチャプター4、サムブルックら著、「ラボラトリーマニュアル第二版、分子クローニング」)(Sambrook et al. Molecular Cloning, A laboratory manual 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989, chapter 4)。ファージから作製した一本鎖DNAは、環状であり、BAL31処理に先立って開いていなければならない。これは、一本鎖DNAを開裂し得るエンドヌクレアーゼを用いて行なうことができる。
【0077】
BAL31を用いる一本鎖切断DNAの生成
いずれかの反応(それぞれ上または下の鎖を含む)によるssDNAは、例えばBAL31を用いる別個の酵素処理を受けた。各々の消化反応では、0.02μg/μlのssDNA、600mMのNaCl、20mMのトリス塩酸、12mMのCaCl2、12mMのMgCl2、1mMのpH8.0のEDTA及び0.1〜5U/mlの範囲で様々な酵素濃度のBAL31が含まれた。この反応は30℃で培養され、消化したssDNAのフラクションは、10、30、60及び120秒またはそれ以上の時間で順次回収した。反応をEDTAの添加と10分間65℃の熱処理とで停止した。フェノール・クロロフォルム抽出によって、このssDNAフラグメントを精製し、エタノールで沈殿させた。このssDNAはpH8.0のトリス10mM中に再懸濁する。
【0078】
消化パターンは1%アガロースゲル電気泳動によって評価した。
【0079】
消化により生成したフラグメントの精製
消化したDNAフラグメントは、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール抽出により精製した。50μlの緩衝フェノールを、クロロホルム及びイソアミルアルコールの混合液(24:1)50μlと共に100μlのサンプル各管に添加した。これらの管を30秒間渦攪拌した後、微量遠心において14000r.p.m.で1分間遠心分離機にかけた。次に、上相を回収し、2.5容積の99.5%エタノール(1/10はpH5.2の3M酢酸ナトリウムであった)と混合した。DNAは−80℃で1時間沈殿させた。次に、このDNAを、微量遠心において14.000r.p.m.で30分間遠心することによりペレット化した。このペレットは、70%エタノールで1回洗浄し、10μlの滅菌水に再溶解した。
【0080】
消化により生成し精製したフラグメントのアガロースゲル上における分析
各時点及びブランクからの溶解したペレット5μlを、2.5μlの添加緩衝液(25%フィコール及びブロモフェノールブルー)と混合し、2%アガロースゲルのウェルに添加した。異なる時点の電気泳動は、上述の通りに行なった。
【0081】
完全長フラグメントのリアセンブリ
ssDNAフラグメントのリアセンブリを、二つの連続したPCR反応によって実現した。第一のPCR反応では、pH8.3のトリス塩酸を10mM、KClを50mM、MgCl2を1.5mM、dNTPを200μM、Taqポリメラーゼを0.3U及びBAL31処理サンプルを2μl、これら全てを最終容積の25μlに含み、次のプロフィールによって5サイクル行なった。94℃で1分間、50℃で1分間及び72℃で2分間更に72℃で5分間である。第二のPCR反応では、pH8.3のトリス塩酸を10mM、KClを50mM、MgCl2を1.5mM、dNTPを200μM、Taqポリメラーゼを0.6U、フォワード・プライマーを1μM、リバース・プライマーを1μM、及び第一のPCR反応からサンプルを5μl、これら全てを最終容積の50μlに含み、次のプロフィールによって15サイクル行なった。94℃で1分間、55℃で1分間及び72℃で2分間更に72℃で7分間である。得られた生成物は、アガロースゲル電気泳動によって評価した。
【0082】
SfiIとNotIによるリアセンブルしたフラグメント及びプラスミドの制限消化
リアセンブルしたフラグメント及びプラスミドpFab5chisは、BSAと11U酵素/μgのDNAを含むNEBバッファー2を使用してまずSfiIで開裂した。この反応は、50℃で4時間行なった。この後、変換バッファー(conversion buffer)と6U酵素/μgのDNAを添加し、このDNAをNotIで開裂した。この反応は、37℃で一夜行なった。
【0083】
制限消化したベクター及び制限消化したリアセンブル・フラグメントのゲル精製
開裂反応を1%アガロースゲルで分析した。制限消化したインサートは、約750bpの開裂生成物を示した。これは、予想されるサイズとかなり一致する。開裂したインサートのバンドとプラスミドを切り出し、前述のとおりゲル抽出した。
【0084】
制限消化したpFab5chisによるリアセンブル制限消化フラグメントのライゲーション
精製、開裂したpFab5chisを、精製しリアセンブルした制限消化フラグメントにより12℃の水浴で16時間ライゲートした。ベクター50μlを50μlのインサート及び15μlの10×バッファー(酵素と共に供給)、7.5μlのリガーゼ(5U/μl)及び最終容積150μlになるまで滅菌水と混合した。いかなるインサートも用いない制限消化したpFab5chisのライゲーションも、同様の方法で行った。
【0085】
ライゲートしたリアセンブル・インサート及びpFab5chisによる化学的に適切なTOP10F'大腸菌(E. coli)の形質転換
ライゲーション反応物を、上述のとおりフェノール/クロロホルム抽出によって精製した。この抽出から上相を回収し、2.5容積の99.5%エタノール(1/10はpH5.2の3M酢酸ナトリウムであった)と混合した。このDNAを−80℃で1時間沈殿させた。次に、そのDNAを、微量遠心において14.000r.p.m.で30分間遠心することによりペレット化した。ペレットは、70%エタノールで1回洗浄し、次に10μlの滅菌水に再溶解した。ライゲーション物を各々5μl別個に、95μlの化学的に適切なTOP10F'大腸菌(E. Coli)と混合し、氷上で1時間培養し、形質転換した(1989年コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレスより、サムブルックら著、「ラボラトリーマニュアル第二版、分子クローニング」)(Sambrook et al. Molecular Cloning, A laboratory manual 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)。1時間の増殖後、これら2つの形質転換体からの細菌を、アンピシリン含有寒天プレート(100μg/ml)上に塗布した。これらのプレートは、上下面を逆にして37℃の培養器内で14時間増殖した。
【0086】
実施例2― 組換え頻度; dsDNAとssDNAとの比較
更なる比較実験において、3個のscFv抗体フラグメントがdsDNA或いはssDNAのいずれかとして組換え実験に使われた。
【0087】
dsDNA
上記の3個のscFv遺伝子は、それぞれフォワード・プライマーとリバース・プライマーを使用し、標準PCR手順を使用したPCRで増殖された。バンドの大きさはアガロース電気泳動により確認され、残りの増殖されたPCR生成物はコンサートPCR精製装置(ギブコ(Gibco))を使用して精製された。3個のscFvから得られたdsDNAは等モル量で混合され、BAL31で処理された。各消化反応は異なる酵素濃度(4U酵素/ml反応容積、20U酵素/ml反応容積と100U酵素/ml反応容積を使用)で0.02μg/μl反応容積濃度のdsDNA,600 mMのNaCl, 20mMのTris-HCl, 12mMのCaCl2, 12mMのMgCl2, 1mMのEDTApH8.0とBAL31とを含んでいた。反応は30(Cで培養され、消化されたdsDNAのフラクションは10分、20分、30分及び50分の順で集められた。反応は、EDTAと熱処理(代替に、EDTAを使用しない熱失活プロトコールを使用してもよい; 下記参照)で停止され、フェノール/クロロホルム抽出とエタノール沈殿を使用して精製された。dsDNA試料は10mMトリスpH8.0で再度懸濁された。
【0088】
各時点を分離したままで、試料にプロトコルに従ってリアセンブリPCR(このリアセンブリには60ngDNAが使われる)と増幅PCRがおこなわれ、試料はpGEM(生成物No. A362A,プロメガ(Promega)、マヂソン(Madison)、米国)でクローン化された。各時点から18のクローンが配列決定され、組換えの数と頻度が定量された。
【0089】
エキソヌクレアーゼ消化の熱失活化
BAL31反応をEDTAを使わずに停止させるプロトコルは確立されている。この熱失活プロトコルは、健康に危険でありまた材料を損失させるフェノール/クロロフォルム抽出の使用をしないようにする。
【0090】
簡単に言えば、試料は10分間95(Cで培養され、次に直接に氷に漬けて酵素反応を停止させる。この後、試料をエタノールを使用して直接に沈殿させることができる。
【0091】
ssDNA
上記の3個のscFv遺伝子がそれぞれ、フォワード/リバース・ビオチンとフォワード・ビオチン/リバースのプライマー対を使用し、標準PCR手順を使用した2個のPCR反応で増幅された。バンドの大きさはアガロース電気泳動により確認され、残りの増殖されたPCR生成物はコンサートPCR精製装置(ギブコ(Gibco))を使用して精製された。一本鎖DNAがプロトコルに従った磁気ビーズを使用して得られ、3個のセンス鎖と3個のアンチセンス鎖が形成された。3個のscFvからのセンス鎖とアンチセンス鎖は、それぞれ、等モル量で混合されプロトコル(1.25U酵素/ml反応容積或いは11U酵素/ml反応容積と0.015μg/μl反応容積の濃度のssDNAを使用)に従ってBAL31で処理され、試料が0分(即ち、消化されず)、10分、30分と50分で取り出された。反応はEDTAと熱処理で停止され、フェノール/クロロフォルム抽出とエタノール沈殿を使用して精製された。各時点を離したままで、しかしセンス鎖とアンチセンス鎖を混合して、試料にはプロトコルに従ったリアセンブリPCR(このリアセンブリには60ngDNAが使用される)と増殖PCRがなされて、試料はpGEMでクローン化された。各時点から18クローンが配列決定され、組換えの数と頻度が定量された。
【0092】
結果
dsDNAを使用した組換えの最も高い頻度が20U酵素/ml反応容積(0.02μg/μlDNAを含む)を使用し、10分間処理を行い達成された。これにより、39%の一乗り換えのあるクローンとなり(図6)、17%の二乗り換えのあるクローン(図7)となった。4U酵素/mlの使用はフラグメンテ―ションの時間に関係なく乗り換えを発生させず、100U酵素/mlの使用は、リアセンブリの間に全長遺伝子を取り戻すことができなかったことに示されているように、完全なフラグメンテ―ションとなり非常に小さいフラグメントを発生させた。
【0093】
ssDNAを使用した実験から得られた結果は図8乃至図10に示されている。図8は1.25U/mlBA31と一乗り換えを持ったするクローンを示している。図9は1.25U/mlBA31と二乗り換えを持ったクローンを示している。図10は1.25U/mlBA31と一乗り換えを持ったクローンを示している。図11は11U/mlBA31と二乗り換えを持ったクローンを示している。
【0094】
ssDNAを使用して一乗り換えを発生させた組換えの最高頻度は、11U酵素/mlを使い10分間の処理により達成された(図10)。59%のクローンが一乗り換えを持っていた。ssDNAを使用して二乗り換えを発生させた組換えの最高頻度は、1.25U酵素/mlを使い30分間の処理により達成された(図9)。20%のクローンが二乗り換えを持っていた。
【0095】
結論と見解
これらのデータは、組換えの頻度がssDNAを使用しすると高くなることを明らかに示している。使用された3個のscFvは同じ骨格配列を持ち、報告された乗り換えの数は配列相違が結果として起こらない領域での乗り換えによりより高くなり得ることを示している。ssDNAを使ったこれらの実験は、3個のすべての分子からのすべての鎖が混合されているため、最大の組換えを示すのに最適ではない態様で行われた。1つのscFvからのセンス鎖を別のscFvからのアンチセンス鎖と混合すると乗り換えの頻度をより高くなる。下記の実施例3を参照。また、ここでは各時点が離されており、異なる時点、即ち異なるフラグメントの大きさが混合されれば乗り換えの頻度は高くなると推定するのは論理的であろう。
【0096】
実施例3 − 組換え頻度; ssDNAを使用した相同性依存度
乗り換えを達成するのに必要とされる相同性を調べるために、私達は、次のように異なる相同体と3対を作っている4つのscFv(SMUC159, CT17,AE11、 MO152と呼ぶ)を組替える実験を用意した。
【0097】
SMUC159―CT17 92%
SMUC159―AE11 70%
SMUC159―MO152 60%
上記の4つのscFv遺伝子がそれぞれ、フォワード/リバース‐ビオチンとフォワード‐ビオチン/リバースのプライマー対を使用した2つのPCR反応で標準PCR手順を使用して増殖された。バンドの大きさはアガロース電気泳動により確認され、残りの増殖されたPCR生成物はコンサートPCR精製装置(ギブコ(Gibco))を使用して精製された。一本鎖DNAがプロトコルに従った磁気ビーズを使用して得られ、4つのセンス鎖と4つのアンチセンス鎖が形成された。各鎖はプロトコル(4.2U酵素/mlあるいは12.5U酵素/mlを使用)に従ってBAL31で処理され、試料が0分、10分、30分と50分或いは0分、15分、30分、45分と60分で取り出された。反応はEDTAと熱処理で停止され、フェノール/クロロフォルム抽出とエタノール沈殿を使用して精製された。各時点を離し、しかし上記の対を作っているセンス鎖とアンチセンス鎖を混合し、試料にプロトコルに従ってリアセンブルPCRと増殖PCRがなされて、試料はpGEMでクローン化された。各時点から15のクローンが配列決定され、組換えの数と頻度が定量された。
【0098】
結果
乗り換えはscFvのすべての組み合わせに見られ、60%と低い相同性が組換えを達成するのに十分であることを示している。
【0099】
実施例4 ― エキソヌクレアーゼを使用する、フラグメントの大きさの改良された制御
(A) エキソヌクレアーゼ
私達は、本発明の方法におけるフラグメンテーションにエキソヌクレアーゼ、例えばBAL31、エキソヌクレアーゼI、エキソヌクレアーゼV, エキソヌクレアーゼVII、エキソヌクレアーゼT7遺伝子6、バクテリオファージ・ラムダ・エキソヌクレアーゼとエキソヌクレアーゼRec Jfを使用する。これらの酵素は一時に1つのヌクレオチドを5'末端か3'末端から或いは両末端から切断する。反応は使用された酵素次第でEDTA或いは熱失活(上記参照)を使用して停止される。これは、ただ1つのヌクレオチドで相違するあらゆる可能な大きさのフラグメントが得られることを意味する。
【0100】
次の実施例は、どの様にしてエキソヌクレアーゼの消化が、使われる条件次第で様々の制御可能の大きさのフラグメントをどのようにして作ることができるかを実証する。
【0101】
BAL31
一本鎖DNAは実施例1におけるプロトコルに従ってBAL31により4.2U/ml反応容積の酵素濃度と0.008μg/μl反応容積のssDNA濃度で消化された。
【0102】
代表的な実験において、約300ngDNAがBAL31処理の各時点で分離される。図12は、未処理ssDNAによる当実験のアガロース電気泳動ゲル・イメージをレーン4に、10分間処理されたssDNAによる当実験のアガロース電気泳動ゲル・イメージをレーン3に、30分間処理されたssDNAによる当実験のアガロース電気泳動ゲル・イメージをレーン2に、50分間処理されたssDNAによる当実験のアガロース電気泳動ゲル・イメージをレーン1に、分子量(MW)標準をレーン5に示す。
【0103】
図13乃至図15はそれぞれ、これらのレーンの対応するゲルクロマトグラムを示している。図13は未処理物質であり、多数のピークはssDNAの異なる立体配座を示す。図14はレーン3と10分間処理された物質に対応する。物質は熱処理されて酵素反応を停止し、従って異なる立体配座を分解し、別個の大きさが1ピークで示される。図15はレーン2と30分間処理された物質に相当する。
【0104】
大きなフラグメントに対応するピークが減り、小さいDNAフラグメントのピークが現れたことがここに明らかである。
【0105】
エキソヌクレアーゼVII
1本鎖DNAはエキソヌクレアーゼVIIにより7.7U/ml反応容積の酵素濃度と0.008μg/μl反応容積のssDNA濃度で消化された。反応緩衝液は67mM燐酸カリウム(pH7.9) 10mMのメルカプトエタノール、6.7mMのMgCl2と8.3mMのEDTAを含む。
【0106】
反応を、熱失活(95℃で5分間)により停止される前に37℃で10分間、20分間、30分間進行させた。
【0107】
図16に、エキソヌクレアーゼVIIを使用したフラグメンテーション・パターンが示されている。レーン1はMW標準、レーン2は未処理ssDNA、レーン3はエキソヌクレアーゼVIIで10分間フラグメンテーションされたssDNA、レーン4はエキソヌクレアーゼVIIで20分間フラグメンテーションされたssDNA、
レーン5はエキソヌクレアーゼVIIで30分間フラグメンテーションされたssDNAである。これはフラグメントの大きさが時間の経過により小さくなることを示している。
【0108】
エキソヌクレアーゼRec J f
一本鎖DNAが、0.36U酵素/μgDNAと1.4U酵素/μgDNAにそれぞれ対応して、2.5U/ml反応容積の酵素濃度或いは10U/ml反応容積の酵素濃度と0.007μg/μl反応容積のssDNA濃度を使用してエキソヌクレアーゼRec Jfで消化された。反応緩衝液は塩化ナトリウム50mM、トリス塩化水素10mM、塩化マグネシウム10mMとジチオトレイトール1mMからなり、pH7.9であった。
【0109】
反応を熱失活(95℃で5分間)により停止する前に37℃で10分間、20分間及び30分間進行させた。
【0110】
図17にはエキソヌクレアーゼRec Jfを0.36U酵素/μgssDNAにおいて使用するフラグメンテーション・パターンが示されている。レーン1は未処理ssDNA、レーン2はエキソヌクレアーゼRec Jfで10分間フラグメンテーションされたssDNA、レーン3はエキソヌクレアーゼRec Jfで20分間フラグメンテーションされたssDNA、レーン4はエキソヌクレアーゼRec Jfで30分間フラグメンテーションされたssDNAである。これはフラグメントの大きさが時間と共に小さくなることを示している。図18において、酵素濃度は4倍に増え(1.4U/μgのssDNA)、フラグメンテーション・パターンは0分から30分までのものであり、図17に比べて高いフラグメンテーション率を示している。これは時間と酵素濃度とがフラグメンテーションを制御するのに使用できることを示している。
【0111】
(B) エンドヌクレアーゼ
従来のDNAシャフリング方法はフラグメンテーションにデオキシリボヌクレアーゼ Iを代表的に使用する(例えば、ステマー(Stemmer)、1994、ネイチャ(Nature) 370:389-391参照)。デオキシリボヌクレアーゼIはDNAをピリミジンに隣接する部位でエンドヌクレアーゼ様式でDNAを分断する。結果として、必ずしもフラグメントの可能なすべての大きさは得られない。
【0112】
更に、反応緩衝液にマグネシウムを使い、モノマーとオリゴマーの相同混合体が得られる。従って、異なる大きさのフラグメントを単離するためには、ゲル・アガロース電気泳動精製あるいはゲルろ過のような異なる方法が使われなければならない。小さい大きさのフラグメント、あるいは小さいフラグメントと大きいフラグメントの混合体が組換えを最適にするのに望ましいことが多い。しかし、これらの精製方法は一本鎖ニックを二本鎖PCR生成物に導入する。ゲル上で精製された特定の大きさのフラグメントはこのようにして多くの一本鎖ニックをもったdsDNAからなるであろう。このことは変性の際に多くの小さいフラグメントを発生させるであろう。このことは、変性の際に発生した一本鎖フラグメントの多くは短すぎてアニーリング中にプライマーとして機能できず、生成物の大量損失となることを意味している。
【0113】
反応緩衝液中にマンガンを使用すると50bpより小さい大きさのフラグメントを作り、ゲル精製は必要でない。しかし、ここであなたが小さいフラグメントだけしか使用できず、これらの小さいフラグメントが大きいフラグメントと混合できないとすると、それが組換え頻度を幾分高めるであろう。
【0114】
エンドヌクレアーゼの使用に関連する問題が次の実験に示される。
【0115】
デオキシリボヌクレアーゼ I
DNAはデオキシリボヌクレアーゼ Iで5分間0.15U/μgDNAの濃度で消化された。
マグネシウム緩衝液とマンガン緩衝液とが、デオキシリボヌクレアーゼIによりフラグメンテーションされた際に比較され、結果は図9に示されている。レーン1はMW標準、レーン2はMg緩衝液中の未処理ssDNA、レーン3はステマー(Stemmer)(1994)ネーチャ(Nature)370:389-391)によるMg緩衝液中のデオキシリボヌクレアーゼ IによるフラグメンテーションssDNA、レーン4はMn緩衝液中の未処理ssDNA、レーン5は菊地他(Kikuchi et al.)(2000)遺伝子(Gene)243:133-137)によるMn緩衝液中のデオキシリボヌクレアーゼIによりフラグメンテーションされたssDNAである。Mg緩衝液とステマー(Stemmer)及び菊地の論文による条件とを使うと、フラグメンテーションは起こらないことが図19から明白である。更に、Mn緩衝液とステマー(Stemmer)及び菊地の論文による条件とを使うと、物質の全部がほんの数分内に完全にフラグメンテーションされる。
【0116】
異なる大きさのフラグメントを得ようと私達はMg緩衝液を使い酵素の濃度を高くすることにした。図20はデオキシリボヌクレアーゼ Iを使用したこのような実験のアガロース電気泳動ゲル・イメージを示す。レーン1はMW標準、レーン6は未処理ssDNA、レーン12は0.15U酵素/μgDNAを使用してステマー(Stemmer)と菊地論文に従って処理されたssDNA、レーン13は1U酵素/μgDNA(即ち、6倍以上の酵素)で処理された同じ物質である。
【0117】
図21乃至図23は対応するクロマトグラムである。未処理DNAは熱処理されているので、図21では1個のピークしか現れていない(矢印でしめされている)。図22では、デオキシリボヌクレアーゼ Iをステマー(Stemmer)と菊地論文に従ったデオキシリボヌクレアーゼ Iの量で使用すると、未処理ssDNAのピークは幾分下がる(矢印で示されている)が、フラグメンテーションされたDNAにははっきりとしたピークが見られずただぼやけている。6倍以上の酵素を使用すると、未処理ssDNAは完全に使えなくなり(図23)、フラグメントの見えるピークはここでもまったくない。
【0118】
マング・ビーン・ヌクレアーゼ
一鎖DNAがマング・ビーン・ヌクレアーゼ(製品番号MO250S、ニューイングランドバイオラブズ(New England Biolabs)を用いて、0.375U/ml反応容積の酵素濃度と0.007μg/μl反応容積の濃度のssDNAを使用して消化された。反応緩衝液は酢酸ナトリューム50mM、NaCl30mMとZnSO41mMからなり、pH5.0であった。
【0119】
反応は熱失活(95℃で5分間)により停止される前に、25℃で10分間進められた。
【0120】
図24は別のエンドヌクレアーゼ、マング・ビーン・ヌクレアーゼを使用したフラグメンテーションを示す。レーン1は未処理ssDNA、レーン2は10分間処理された同じ物質、レーン3はMW標準を示す。
【0121】
結果は、酵素を製造業者が薦める濃度よりも低い濃度で使用したにもかかわらずほんの10分のマング・ビーン・ヌクレアーゼ消化の後にすべてのDNAが完全にフラグメンテーションされた(レーン2参照)ことを示している。
【0122】
結論と見解
上述の実施例は、フラグメントの大きさがエキソヌクレアーゼを使用し、反応条件即ち時間、反応容積、酵素濃度を変えてどのように制御されることができるかを示す。異なるピークがゲル・イメージ・クロマトグラムを使用して可視化される。
【0123】
対照的に、デオキシリボヌクレアーゼ Iのようなエンドヌクレアーゼを使うと制御が難しい反応を起こす。文献に参照されている条件を使うと、MgかMnを含む緩衝液を使うとすべてがフラグメンテーションされるかあるいは何もフラグメンテーションされない場合の状態が起きる、特に図20を参照。別のエンドヌクレアーゼ(マング・ビーン・ヌクレアーゼ)を使用する実験でこれらの観察された事柄を確認できる。
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1は鋳型分子から改良分子を得る方法の原理を示す。
【図2】 図2はビオチンを用いる一本鎖DNAの調製の原理工程を示す。
【図3】 図3はファージを用いる一本鎖DNAの調製の原理工程を示す。
【図4】 図4はエキソヌクレアーゼ処理を用いて一本鎖DNAフラグメントを生成する原理工程を示す。
【図5】 図5はPCRを用いる一本鎖DNAのアセンブリのための原理工程を示す。
【図6】 図6は種々の期間の時間で20U/mlBAL31を用いてdsDNAの消化に引続く一乗り換えを有する、形成された組み換え体の%を示す。
【図7】 図7は種々の期間の時間で20U/mlBAL31を用いてdsDNAの消化に引続く二乗り換えを有する、形成された組み換え体の%を示す。
【図8】 図8は種々の期間の時間で1.25U/mlBAL31を用いてssDNAの消化に引続く一乗り換えを有する、形成された組み換え体の%を示す。
【図9】 図9は種々の期間の時間で1.25U/mlBAL31を用いてssDNAの消化に引続く二乗り換えを有する、形成された組み換え体の%を示す。
【図10】 図10は種々の期間の時間で11U/mlBAL31を用いてssDNAの消化に引続く一乗り換えを有する、形成された組み換え体の%を示す。
【図11】 図11は種々の期間の時間で11U/mlBAL31を用いてssDNAの消化に引続く二乗り換えを有する、形成された組み換え体の%を示す。
【図12】 図12はBAL31を用いた50分(レーン1)、30分(レーン2)、および10分(レーン3)の300ngのssDNAの消化に引続き生成されたフラグメントのアガロース電気泳動ゲル・イメージを示す。未処理ssDNAがレーン4に示される。分子量マーカーがレーン5に示される。
【図13】 図13は図12のレーン4の対応ゲル・クロマトグラムを示す。
【図14】 図14は図12のレーン3の対応ゲル・クロマトグラムを示す。
【図15】 図15は図12のレーン2の対応ゲル・クロマトグラムを示す。
【図16】 図16はエキソヌクレアーゼVIIを用いた10分(レーン3)、20分(レーン4)、および30分(レーン5)の300ngのssDNAの消化に引続き生成されたフラグメントのアガロース電気泳動ゲル・イメージを示す。未処理ssDNAがレーン2に示される。分子量マーカーがレーン1に示される。
【図17】 図17はエキソヌクレアーゼRec Jf(9U/mgのssDNA)を用いた10分(レーン2)、20分(レーン3)、および30分(レーン4)の300ngのssDNAの消化に引続き生成されたフラグメントのアガロース電気泳動ゲル・イメージを示す。未処理ssDNAがレーン1に示される。分子量マーカーがレーン5に示される。
【図18】 図18はエキソヌクレアーゼRec Jf(36U/mgのssDNA)を用いた10分(レーン3)、20分(レーン4)、および30分(レーン5)の300ngのssDNAの消化に引続き生成されたフラグメントのアガロース電気泳動ゲル・イメージを示す。
未処理ssDNAがレーン2に示される。分子量マーカーがレーン6に示される。
【図19】 図19はデオキシリボヌクレアーゼI(0.15U酵素/mgDNA)を用いた300ngのDNAの消化に引続き生成されたフラグメントのアガロース電気泳動ゲル・イメージを示す。レーン試料は以下の通りである。
レーン1:分子量マーカー
レーン2:Mg緩衝液中の未処理ssDNA
レーン3:Mg緩衝液中のデオキシリボヌクレアーゼIでフラグメント化されたssDNA
レーン4:Mn緩衝液中の未処理ssDNA
レーン5:Mn緩衝液中のデオキシリボヌクレアーゼIでフラグメント化されたssDNA
レーン6:(空)
レーン7:(空)
【図20】 図20はデオキシリボヌクレアーゼIを用いた300ngのDNAの消化に引続き生成されたフラグメントのアガロース電気泳動ゲル・イメージを示す。レーン試料は以下の通りである。
レーン1: 分子量マーカー
レーン2: Mg緩衝液中の未処理dsDNA
レーン3: Mg緩衝液中の未処理dsDNA
レーン4: Mg緩衝液中の未処理ssDNA(フォワード・ストランド)
レーン5: Mg緩衝液中の未処理ssDNA(フォワード・ストランド)
レーン6: Mg緩衝液中の未処理ssDNA(リバース・ストランド)
レーン7: Mg緩衝液中の未処理ssDNA(リバース・ストランド)
レーン8: Mg緩衝液中のデオキシリボヌクレアーゼI(0.24U酵素/μgDNA)を用いてフラグメント化されたdsDNA
レーン9: Mg緩衝液中のデオキシリボヌクレアーゼI(1.3U酵素/μgDNA)を用いてフラグメント化されたdsDNA
レーン10: Mg緩衝液中のデオキシリボヌクレアーゼI(0.24U酵素/μgDNA)を用いてフラグメント化されたssDNA(フォワード・ストランド)
レーン11: Mg緩衝液中のデオキシリボヌクレアーゼI(1.3U酵素/μgDNA)を用いてフラグメント化されたssDNA(フォワード・ストランド)
レーン12: Mg緩衝液中のデオキシリボヌクレアーゼI(0.24U酵素/μgDNA)を用いてフラグメント化されたssDNA(リバース・ストランド)
レーン13: Mg緩衝液中のデオキシリボヌクレアーゼI(1.3U酵素/μgDNA)を用いてフラグメント化されたssDNA(リバース・ストランド)
【図21】 図21は図20のレーン6の対応ゲル・クロマトグラムを示す。
【図22】 図22は図20のレーン12の対応ゲル・クロマトグラムを示す。
【図23】 図23は図20のレーン13の対応ゲル・クロマトグラムを示す。
【図24】 図24はマング・ビーン・ヌクレアーゼを用いた300ngのDNAの消化に引続き生成されたフラグメントのアガロース電気泳動ゲル・イメージを示す。
レーン1:Mg緩衝液中の未処理ssDNA
レーン2:マング・ビーン・ヌクレアーゼで10分フラグメント化されたssDNA
レーン3:分子量マーカー
Claims (15)
- 一つ以上のタンパク質モチーフをコード化した親一本鎖ポリヌクレオチドから、ポリヌクレオチド或いはポリヌクレオチドの集団を生成する方法であって、
a)親ポリヌクレオチドのプラス鎖を構成する一本鎖DNAとマイナス鎖を構成する一本鎖DNAとを準備する工程と;
b)前記プラス鎖とマイナス鎖とをエキソヌクレアーゼで別々に消化して、別々のプラス鎖一本鎖フラグメント集団とマイナス鎖一本鎖フラグメント集団とを生成する工程と;
c)前記プラス鎖から生成された前記フラグメントを前記マイナス鎖から生成された前記フラグメントに接触させる工程と;
d)前記親ポリヌクレオチドによりコード化された前記一つ以上のタンパク質モチーフに比較して改変された特徴を持つ一つ以上のタンパク質モチーフをコード化した少なくとも一つのポリヌクレオチドを生成するために、互いにアニールする前記フラグメントを増幅する工程と、を有する方法。 - 工程c)が、少なくとも一つの親ポリヌクレオチドの3'末端と5'末端にアニーリング条件下でアニールするプライマーを加える工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記エキソヌクレアーゼが、BAL31、エキソヌクレアーゼI、エキソヌクレアーゼV、エキソヌクレアーゼVII、及びエキソヌクレアーゼRec Jfからなる群から選択される請求項1又は2記載の方法。
- 前記エキソヌクレアーゼがBAL31である、請求項3記載の方法。
- 一つのまたは複数の親ポリヌクレオチドが突然変異誘発を受けている、請求項1乃至4のいずれか1項に記載の方法。
- 工程b)において生成した前記フラグメント集団が突然変異誘発を受けている、請求項1又は2記載の方法。
- 前記突然変異誘発がエラー・プロウンPCRである、請求項5又は6に記載の方法。
- 工程b)が、異なる長さの一本鎖フラグメントの集団を生成するために実施される、請求項1乃至7のいずれか1項に記載の方法。
- 工程b)が、50のヌクレオチド以上の平均長を持つ一本鎖フラグメントの集団を生成するために制御される、請求項8に記載の方法。
- コード化されたポリペプチドを産出するために、工程d)で生成した少なくとも1つのポリヌクレオチドを発現する工程を有する、請求項1乃至9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記コード化されたポリペプチドを所望の特性に関して試験する工程を有する、請求項10記載の方法。
- 前記親ポリヌクレオチドが抗体あるいはその抗体フラグメントをコード化する、請求項1乃至11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記親ポリヌクレオチドが酵素をコード化する、請求項1乃至11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記親ポリヌクレオチドが抗原をコード化する、請求項1乃至11のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1乃至14のいずれか1項に記載の方法に従ってポリヌクレオチド或いはポリヌクレオチドの集団を生成し、続いて、所望の特性を持つポリヌクレオチドを同定した後に、前記ポリヌクレオチドを試料中の標的ポリヌクレオチドの検出及び/或いは増幅に使用することを有する方法。
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