ES2244670T5 - Un método para una evolución molecular in vitro de una función proteínica - Google Patents

Abstract

Un método para generar una secuencia o una población de secuencias de polinucleótidos a partir de secuencias de polinucleótidos madre de hebra sencilla que codifican uno o más motivos de proteína, que comprende los pasos de:<br /><br />a) proporcionar ADN de hebra sencilla que constituye hebras de más y menos de las secuencias de polinucleótido madre; <br /><br />b) digerir las secuencias de polinucleótidos de hebra sencilla con una exonucleasa para generar poblaciones de fragmentos de hebra sencillas; <br /><br />c) poner en contacto dichos fragmentos generados de las hebras más con fragmentos generados de las hebras menos y opcionalmente, añadir las secuencias de plantilla que se fusionan a terminales 3'' y 5'' de al menos uno de los polinucleótidos madre en condiciones de fusión; <br /><br />d) amplificar los fragmentos que se fusionan entre sí para generar al menos una secuencia de polinucleótidos que codifica uno o más motivos de proteína teniendo características alteradas en comparación con el uno o más motivos de proteína codificados por dichos polinucleótidos madre.

Description

[0001] La presente invención se refiere a un método para la evolución molecular en vitro de la función proteína, en particular para combinar los segmentos de ADN de hebra sencilla obtenidos usando una nucleasa.

[0002] La función de proteína puede ser modificada y mejorada in vitro por una variedad de métodos, incluyendo que la mutagénesis orientada al sitio (Alber et al., Nature, 5; 330 (6143): 41-46, 1987), clonación combinatoria (Huse et al., Science, 246: 1275-1281, 1989; Marks et al., Biotechnology, 10: 779-783, 1992) y mutagénesis aleatoria combinada con sistemas de selección apropiados (Barbas et al., PNAS. USA, 89: 4457-4461, 1992).

[0003] El método de mutagénesis aleatoria junto con selección ha sido usado en varios casos para mejorar la función de proteína y existen dos estrategias diferentes. En primer lugar, la randomización de la secuencia del gen entero en combinación con la selección de una proteína variante (mutante) con las características deseadas, seguida por un nuevo ciclo de mutagénesis y selección aleatorias. Este método entonces puede ser repetido hasta que una variante de proteína sea encontrada la que sea considerada óptima (Schier R et al., J Mol. Biol. 1996, 263 (4): 551-567). Aquí, la vía tradicional de introducir las mutaciones es por error PCR prono (Leung et al., Technique,

1: 11-15, 1989) con una tasa de mutación de aproximadamente 0,7 %. En segundo lugar, las regiones definidas del gen pueden ser mutagenizadas con plantillas elementales degeneradas, que permiten tasas de mutación hasta 100 % (Griffiths et al., EMBO. J, 13: 3245-3260, 1994; Yang et al., J Mol.

[0004] Biol. 254: 392-403, 1995). Mientras más alta sea la tasa de mutación que se usa, más limitada será la región del gen que pueda ser sometida a las mutaciones.

[0005] La mutación aleatoria ha sido usada exhaustivamente en el campo de la ingeniería de anticuerpos. Los genes de anticuerpo formados in vivo pueden ser clonados in vitro (Larrick et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 160: 1250-1256, 1989) y las combinaciones aleatorias de los genes que codifican los genes variables pesados y ligeros pueden ser sometidas a selección (Marks et al., Biotechnology, 10: 779-783, 1992). Los fragmentos de anticuerpo funcionales seleccionados adicionalmente pueden ser mejorados usando mutagénesis aleatoria y ciclos adicionales de selección (Schier R et al., J Mol. Biol. 1996, 263 (4): 551-567).

[0006] La estrategia de mutagénesis aleatoria es seguida por selección. Las variantes con las características interesantes pueden ser seleccionadas y las regiones de ADN mutadas de variantes diferentes, cada una con las características interesantes, son combinadas en una secuencia de codificación (Yang et al., J Mol. Biol. 254: 392403, 1995). Este es un proceso secuencial multipaso, y los efectos sinergísticos potenciales de las mutaciones diferentes en regiones diferentes pueden ser perdidos, ya que no son sometidas a selección en la combinación. Por lo tanto, estas dos estrategias no incluyen mutagénesis simultánea de regiones definidas y selección de una combinación de estas regiones. Otro proceso involucra el emparejamiento combinatorio de genes que pueden ser usados para mejorar, por ejemplo, la afinidad de anticuerpo (Marks et al., Biotechnology, 10: 779-783, 1992). Aquí, las tres regiones CDR en cada gen variable son fijadas y esta tecnología no permite combinar los segmentos de genes individuales en el gen para dominio variable, por ejemplo, incluyendo las regiones CDR, entre clones.

[0007] El concepto de ADN que combina (Stemmer, Nature 370: 389-391, 1994) utiliza la fragmentación aleatoria de ADN y el ensamblaje de fragmentos en una secuencia de codificación funcional. En este proceso es posible presentar las secuencias de ADN químicamente sintetizadas y de este modo dirigir la variación a lugares definidos en el gen cuya secuencia de ADN es conocida (Crameri et al., Biotechniques, 18: 194-196, 1995). Stemmer y colaboradores desarrollaron este método in vitro, que reensambla el proceso que ocurre normalmente de la evolución de proteína en la naturaleza. El combinar el ADN se genera diversidad por recombinación, combinando las mutaciones útiles de genes individuales. Ha sido usado con éxito para la evolución artificial de proteínas diferentes, por ejemplo enzimas y citoquinas (Chang et al. Nature Biotech. 17, 793-797, 1999; Zhang et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 4504 -4509,1997; Christians et al. Nature Biotech.. 17, 259-264, 1999). Los genes son fragmentados al azar usando DNasa I y luego vueltos a reunir por recombinación entre sí. El material de partida puede ser un gen solo (primero mutado usando error PCR prono al azar) o una secuencia homologa que ocurre naturalmente denominada familia al combinar. La hidrólisis de ADN DNasa I de forma preferencial en los sitios adyacentes a los nucleótidos de pirimidina, por tanto éste es una elección apropiada para la fragmentación aleatoria de ADN. Sin embargo, la actividad está en función de los iones de Mg o Mn, los iones Mg restringen el tamaño del fragmento hasta 50bp mientras que los iones Mn darán tamaños de fragmentos menores de 50bp. Por lo tanto, para tener todos los tamaños posibles para la recombinación el gen en cuestión tiene que ser tratado por lo menos dos veces con DNasa I en presencia de cualquiera de los dos iones diferentes, seguida por el retiro de estos mismos iones.

[0008] En teoría, es posible combinar ADN entre cualquiera de los clones. Sin embargo, si el gen combinado resultante es el ser funcional con respecto a la expresión y actividad, los clones a ser combinados preferentemente tienen que estar relacionados o aun idénticos con la excepción de un bajo nivel de las mutaciones aleatorias. K\La combinación de ADN entre clones genéticamente diferentes en general producirá genes no funcionales. Sin embargo, ha sido demostrado por la metodología de ITCHY que pueden ser creadas bibliotecas de fusión de interspecies entre fragmentos del E. coli y genes de transformilasa de ribonucleótido de glicinamida humana, que tienen identificación solamente al 50 % sobre el nivel de ADN (Ostermeier et al., Nat Biotechnol 17, 1205-9, 1999).

[0009] Una recombinación exitosa de dos genes diferentes requiere la formación de moléculas de hetero dúplex. En algunos casos la familia que combina solamente forma homo dúplex dando como resultado una frecuencia baja de recombinación. Este problema ha sido dirigido usando ADN de una sola hebra digerido por DNasa I (Kikuchi et al. Gene 2000, 243,133 -137).

[0010] Un ADN de una sola hebra puede ser obtenido esencialmente de dos maneras diferentes. En primer lugar, por el uso de plantillas elementales bioestanadas en las reacciones PCR en combinación por ejemplo con microcolumnas de captura tipo Dynabeads (Dynal, Noruega) o AffiniTip Streptavidin (Genosys Biotechnologies Inc., The Woodlands, USA). En segundo lugar, utilizando bacteriófagos que pueden contener ADN de una sola hebra (virus y entidades relacionadas en Modern Microbiology, Principles y Applicacions pp.171 -192, Ed. E.A. Birge, Wm.

C. Brown Publishers 1992; Sambrook et al. Molecular Cloning, A laboratory manual 2nd edition. Cold Spring Habor Laboratory Press, 1989).

[0011] La selección de enzimas con propiedades alteradas y mejoradas está a menudo basada en la función verdadera de la enzima. Por ejemplo la estabilidad térmica aumentada de una enzima puede ser seleccionada porque incubando las colonias transformadas a las temperaturas que causan la desactivación de enzimas de tipo natural y la actividad de 13-glucosidasa mejorada pueden ser identificadas usando PNPG como el sustrato (Arrizubieta et al, J Biol Chem, 27 de jun. 2000).

[0012] La selección de proteínas funcionales de bibliotecas moleculares ha sido revolucionada por el desarrollo de la tecnología de muestra de fagos (Parmley et al., Gene, 73: 305-391, 1988; McCafferty et al., Nature, 348: 552-554, 1990; Barbas et al., PNAS. USA, 88: 7978-7982, 1991). Aquí, el fenotipo (proteína) está directamente vinculada a su genotipo correspondiente (ADN) y esto permitirá directamente clonar del material genético que puede entonces ser sometido a modificaciones adicionales para mejorar la función de proteína. La muestra de Fago ha sido usada para clonar ligantes funcionales de una variedad de bibliotecas moleculares con hasta 1011 transformantes en el tamaño (Griffiths et al., EMBO. J. 13: 3245-3260, 1994). Por lo tanto, la muestra de fago puede ser usada para clonar ligantes funcionales de bibliotecas moleculares directamente, y además también puede ser usada para mejorar los clones originalmente seleccionados. Otras clases de virus que han sido usados para la expresión de superficial de bibliotecas de proteína y sus selecciones son baculovirus (Boublik et al, Biotechnol 13: 1079-1084. 1995; Mottershead et al, Biochem Biophys Res Corn 238:717-722, 1997; Grabherr et al, Biotechniques 22: 730-735, 1997) y retrovirus (Buchholz et al, Nature Biotechnol 16:951-954, 1998).

[0013] La selección de proteínas funcionales de bibliotecas moleculares también puede ser llevada a cabo por la muestra de célula superficial. También aquí, el fenotipo es vinculado directamente con su genotipo correspondiente. La muestra de célula superficial bacteriano ha sido usada por ejemplo para someter a revisión las variantes mejoradas de carboximetil celulosa (CMCase) (Kim et al, Appl Environ Microbiol 66:788-93, 2000). Otras células que pueden ser usadas para este propósito son células de levadura (Boder y Wittrup, Nat. Biotechnol 15: 553-557, 1997), células de COS (Higuchi et. al, J Inmunol Meth 202:193-204, 1997) y células de insectos (Granzerio et. al., J Inmunol Meth 203:131-139, 1997; Ernst et al, Nucleico Acids Res 26:1718-1723, 1998).

[0014] La combinación aleatoria de ADN de diferentes clones mutados en combinación con la selección de la función deseada es una manera más eficaz de buscar a través del espacio de secuencias como se comparaba con una selección secuencial y una combinación de clones seleccionados.

[0015] La presente invención trata de proporcionar métodos mejorados para la evolución de la proteína en vitro. En particular, la presente invención aspira a proporcionar unos métodos de recombinación y combinación más eficientes; que darán un aumento de moléculas más modificadas y así mejorar la probabilidad de encontrar moléculas con las propiedades deseables.

[0016] De acuerdo con un aspecto de la presente invención, aquí se proporciona un método para generar una secuencia de polinucleótidos o población de secuencias a partir de secuencias madre de polinucleótidos de hebra sencilla que codifican uno o más motivos de proteína, que comprende los pasos:

a) Proporcionar ADN de hebra sencilla que forman hebras de más y menos de las secuencias madre de polinucleótidos.

b) Digerir las secuencias de polinucleótidos de hebra sencilla con una exonucleasa para generar poblaciones de fragmentos de hebra sencillas.

c) Poner en contacto dichos fragmentos generados a partir de las hebras más con los fragmentos generados de las hebras menos y opcionalmente, añadiendo las secuencias de plantilla que se fusionan a terminales 3' y 5' al menos de uno de los polinucleótidos madre en condiciones de fusión.

d) Amplificar los fragmentos que se fusionan entre sí para generar al menos una secuencia de polinucleótidos codificando uno o más motivos de proteína teniendo características modificadas en comparación con uno o más motivos de proteína codificados por dichos polinucleótidos madre.

[0017] Por lo tanto, típicamente, se proporciona un método de combinar fragmentos de polinucleótidos para generar una secuencia o población de secuencias de polinucleótidos de las características deseadas, método que comprende los pasos de:

a) Digerir un polinucleótido lineal madre de una sola hebra que codifica uno o más motivos de proteína con una nucleasa diferente a DNasa I para generar una población de fragmentos de una sola hebra de longitudes diferentes.

b) Ensamblar una secuencia de polinucleótidos de las secuencias obtenidas del paso (a).

[0018] Preferentemente el método comprende el paso de:

(c) Expresar la proteína resultante codificada adicionalmente por la secuencia de polinucleótidos y

d) Escoger la proteína para las características deseadas.

[0019] Al controlar el tiempo de reacción de la nucleasa, puede ser controlado el tamaño de los fragmentos de polinucleótidos. Determinar las longitudes de los fragmentos de polinucleótidos de este modo evita la necesidad de tener que proporcionar un paso adicional como es la purificación en un gel de los fragmentos en busca de la longitud deseada.

[0020] Para generar una secuencia de polinucleótidos de las características deseadas el polinucleótido madre que codifica uno o más motivos de proteína puede ser sometido a mutagénesis para crear una pluralidad de sus derivados mutados de manera diferente. Igualmente, un polinucleótido madre puede ser obtenido ya codificando una pluralidad de motivos de proteína variantes de la secuencia desconocida.

[0021] La mutación aleatoria puede ser lograda por cualquier método convencional como se describe arriba, pero un método apropiado es error PCR prono.

[0022] Es preferible usar la tecnología de PCR para ensamblar los fragmentos de polinucleótidos de una sola hebra en una secuencia de polinucleótidos de doble hebra.

[0023] La secuencia de polinucleótidos es preferentemente ADN, aunque puede ser usado el ARN. Para sencillez el polinucleótido será usado ahora en la siguiente texto en relación con ADN pero será apreciado que la presente invención es aplicable tanto a ARN como ADN.

[0024] Preferentemente, puede ser usada cualquier exonucleasa que digiera polinucleótidos del extremo principal 5' al extremo 3', del 3' al extremo 5' o de ambos extremos 3' y 5'. Los ejemplos de una exonucleasa apropiada que puede ser usada de conformidad con la presente invención incluyen BAL31, exonucleasa VII y exonucleasa Rec Jf.

[0025] Preferentemente, la exonucleasa es BAL31.

[0026] Usar nucleasa BAL31 al combinar ADN en el proceso de la presente invención proporciona un sistema rápido, fácil y controlable. Esta enzima puede dar todos los tamaños de fragmentos de gen y la actividad de la enzima puede ser fácilmente controlada deteniendo la digestión a varios valores de tiempo. BAL 31 es predominantemente la principal exonucleasa 3' que retira mononucleótidos de ambos terminales de las dos hebras de un DNA lineal. BAL 31 es también una nucleasa terminal, por lo tanto, el ADN de una sola hebra generado por la principal actividad de la exonucleasa 3' es degradado por la nucleasa terminal. La actividad de la principal exonucleasa 3' de la enzima funciona 20 veces más eficientemente que la nucleasa terminal. Las concentraciones de enzima son por lo tanto importantes para los fragmentos de ADN obtenidos. La alta concentración de enzima favorece la terminación brusca del ADN, mientras que en concentraciones bajas las terminales de ADN de una sola hebra podrían ser muy largas. La BAL 31 consta de dos formas cinéticamente distintas de la enzima, una rápida (F) y una forma lenta (S). La forma S es un producto de degradación proteolítica de la forma F. Además, BAL 31 trabaja asincrónicamente generando una población de moléculas de ADN cuyas terminales han sido reseccionadas a diversas extensiones y cuyas colas de una sola hebra varían de longitud. Ambas formas también actúan sobre ssADN en un modo exonucleótico de una manera muy procesiva. La dirección del ataque es desde el extremo 5', en contraste con el modo de la digestión de ADN dúplex. Ha sido indicado que las moléculas de nucleasa inicialmente no están productivamente atadas fuera de los terminales 5' y pasan por una difusión facilitada para producir los complejos de substratos enzima s(enlace terminal) (Lu T y Gray jr. HB Biochimica et Biophysica Acta 1995, vol. 1251, p125 -138). La enzima usa Ca2+ como un cofactor que puede ser enlazado en un complejo con EGTA (ácido etilenglicol bis((de 3-aminoetil éter) N, N, N', N' -tetraacético). Las secuencias de ADN lineales son digeridas con BAL31 y la reacción se detiene a intervalos de tiempo diferentes por la adición de EGTA.

[0027] Los fragmentos individuales digeridos son purificados, mezclados y vueltos a reunir con la tecnología PCR. El gen (reconstituido) ensamblado luego puede ser clonado en un vector de expresión para expresar la proteína. La proteína entonces puede ser analizada para sus características mejoradas.

[0028] El método de la presente invención proporciona algunas ventajas sobre las técnicas conocidas de combinación, incluyendo tasas aumentadas de recombinación y el control de los tamaños de los fragmentos.

[0029] El método de la presente invención produce un juego de fragmentos de ADN progresivamente acortados para cada intervalo de tiempo en el que una muestra de ADN es tomada del tratamiento con BAL31. Las muestras de ADN pueden ser recogidas y mezcladas juntas u, opcionalmente, las muestras individuales pueden ser escogidas y usadas en el método. Por lo tanto, la presente invención permite una selección de cuales muestras de ADN serán usadas en el sistema de recombinación y así brinda un grado adicional de control.

[0030] El método de la presente invención puede ser realizado con cualquier polinucleótido que codifique un producto particular, por ejemplo, cualquier proteína que tenga propiedades ligantes o catalíticas, por ejemplo, anticuerpos o partes de anticuerpos, enzimas o receptores. Adicionalmente, cualquier polinucleótido que tenga una función que pueda ser modificada, por ejemplo, ARN catalítico puede ser combinado de conformidad con la presente invención. Es preferible que el polinucleótido madre que codifica uno o más motivos de proteínas sea al menos 12 nucleótidos en longitud, más preferentemente al menos 20 nucleótidos en longitud, aun más preferente más de 50 nucleótidos en longitud. Pueden ser usados polinucleótidos que sean al menos 100 nucleótidos en longitud o incluso al menos 200 nucleótidos de longitud. Cuando son usados polinucleótidos madre que codifican proteínas grandes como enzimas o anticuerpos, estos podrían ser de muchos cientos o miles de plantillas de longitud. La presente invención puede ser llevada a cabo en polinucleótidos madre de cualquier tamaño.

[0031] La presente invención también proporciona las secuencias de polinucleótidos generadas por el método descrito arriba que tengan las características deseadas. Estas secuencias pueden ser usadas para generar los vectores de terapia de genes y los vectores de construcción por terapia de reproducción de genes defectuosos o vectores de vacunación para las vacunaciones basadas en ADN. Adicionalmente, las secuencias de polinucleótidos pueden ser usadas como herramientas de investigación.

[0032] La presente invención también proporciona una biblioteca de secuencias de polinucleótidos generadas por el método descrito más arriba de las que un polinucleótido puede ser seleccionado, que codifique una proteína que tenga las características deseadas. Es preferible que la biblioteca de polinucleótidos sea una biblioteca de ADN o cADN.

[0033] La presente invención también proporciona proteínas como enzimas, anticuerpos, y receptores que tengan características de calidad diferente a las del tipo natural producido por el método descrito arriba. Estas proteínas pueden ser usadas por separado o dentro de un portador farmacéutico aceptable como vacunas o medicamentos para terapia, por ejemplo, como inmunogenes, antígenos o de otra manera al obtener anticuerpos específicos. También pueden ser usadas como herramientas de investigación.

[0034] Las características deseadas de un polinucleótido generado por la presente invención, o de una proteína codificada por un polinucleótido generado por la presente invención, podrían ser cualquier variación o alteración en la actividad normal del polinucleótido de tipo natural (madre) o el polipéptido, proteína o motivos de proteína que codifica. Por ejemplo, puede ser deseable disminuir o incrementar la actividad catalítica de una enzima, o mejorar o reducir la especificidad ligante de un anticuerpo. Adicionalmente, si la proteína, o el polinucleótido es un inmunogen, puede ser deseable disminuir o incrementar su habilidad de obtener anticuerpos específicos contra él. El polinucleótido madre codifica preferentemente uno o más motivos de proteína. Estos son definidos por regiones de la secuencia de polinucleótidos, que codifica la secuencia de polipéptidos que tiene o potencialmente tiene la función característica de la proteína. Por ejemplo, un motivo de proteína puede definir una parte de toda una proteína, i.e. un epítope o un sitio de escisión o un sitio catalítico, etc. Sin embargo, dentro del alcance de la presente invención, un motivo de proteína expresado no tiene que exhibir actividad, o estar doblado "correctamente".

[0035] Pudiera ser deseable modificar una proteína para modificar la conformación de ciertos epítopes, mejorando así su antigenicidad, y/o reduciendo la reactividad cruzada. Por ejemplo, si tal proteína será usada como un antígeno, la modificación puede reducir cualquier reacción cruzada de anticuerpos levantados con proteínas similares.

[0036] Aunque es usado el termino "Enzima", esto debe ser interpretado como que también incluye cualquier polipéptido que tenga actividad semejante a la de la enzima, i.e., una función catalítica. Por ejemplo, los polipéptidos que sean parte de una enzima todavía podrían poseer una función catalítica. Además, son incluidas las proteínas como interferones y citoquinas. Igual, el termino "Anticuerpo" debe ser interpretado como que abarca cualquier sustancia de ligadura que tenga un dominio ligante con la especificidad requerida. Esto incluye fragmentos de anticuerpo, derivados equivalentes funcionales y homólogos de anticuerpos, incluyendo moléculas sintéticas y moléculas cuya forma imita a la de un anticuerpo, que le permita ligar un antígeno o epítope. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos, capaces de unir un antígeno u otra pareja ligante es el fragmento Fab que consta de los dominios VL, VH, CI y CHI, el fragmento Fd que consta de los dominios VH y CHI; el fragmento Fv que consta de los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; el fragmento dAb que consta de un dominio VH; regiones aisladas CDR y los fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente incluyendo dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra. Los fragmentos de cadena Fv solos también están incluidos.

[0037] Para obtener la expresión de la secuencia generada de polinucleótidos, la secuencia puede ser incluida en un vector que tenga secuencias de control por operación vinculadas con la secuencia de polinucleótidos para controlar su expresión. Los vectores podrían incluir otras secuencias como promotores o aumentadores para conducir la expresión de la secuencia insertada de polinucleótidos, la secuencia adicional de polinucleótidos, de forma que la proteína codificada por el polinucleótido sea producida como una secreción de codificación del ácido de fusión y/o nucleico marca con el propósito de que la proteína producida en la célula del hospedador sea segregada de la célula. La proteína codificada por el polinucleótido secuencia puede entonces ser obtenida transformando los vectores en células de hospedador en las cuales el vector es funcional, cultivando las células del hospedador con el propósito de que la proteína sea producida y recuperar la proteína de las células del hospedador o el entorno circundante. Para este propósito son usadas células procarióticas y eucarióticas en la técnica, incluyendo las variedades de E. coli; levadura, y células eucarióticas como Coes o células de CHO. La elección de la célula del hospedador puede ser acostumbrada al control que las propiedades de la proteína expresaron en estas células, por ejemplo, controlando dónde es dejada en las células del hospedador la proteína o afectando las propiedades como su glicosilación.

[0038] La proteína codificada por la secuencia de polinucleótidos puede ser expresada por los métodos conocidos en la técnica. Convenientemente, la expresión puede ser conseguida dejando crecer una célula del hospedador en el cultivo que conteiene tal vector, en condiciones apropiadas que causan o admiten la expresión de la proteína.

[0039] Son conocidos los sistemas para la clonación y la expresión de una proteína en una variedad de diferentes células del hospedador. Las células del hospedador apropiadas incluyen bacterias, células eucarióticas como de mamíferos y levadura, y sistemas de baculovirus. También, es una buena alternativa utilizar el sistema de retrovirus para la clonación y la expresión, ya que este virus puede ser usado junto con varios tipos de células. Las líneas de células mamíferas disponibles para la técnica para la expresión de un polipéptido heterologo incluyen células de ovario de hámster chino, células de HeLa; células de riñón de hámster recién nacido, células de COS y muchas otras. Un hospedador bacteriano común y preferido es E. coli.

[0040] Los vectores apropiados pueden ser escogidos o construidos, conteniendo las secuencias reguladoras apropiadas, incluyendo las secuencias de promotores, fragmentos terminadores, las secuencias de poliadenilación, las secuencias aumentadoras, genes marcadores y otras secuencias tales como sean apropiadas. Los vectores podrían ser plásmidos, virales por ejemplo fagos, o fagomidos, como tales sean apropiado. Para detalles adicionales véase, por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et at, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muchas técnica y protocolos conocidos para la manipulación de las secuencias de polinucleótidos, por ejemplo en preparaciones de conceptos de polinucleótidos, mutagénesis, secuenciación, introducción de ADN dentro de células y expresión de genes, y el análisis de proteínas, son descritos en detalle en Current Protocols en Molecular Biology, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992.

[0041] El sistema puede ser usado para la creación de bibliotecas de ADN que comprendan las secuencias variables que puedan ser seleccionadas de varias maneras para la función de proteína deseada. La función de enzima puede ser seleccionada con los métodos específicos para la función de enzima verdadera por ejemplo, para la actividad de la actividad CMC, glucosidasa 13 y también la estabilidad térmica. Además, pueden ser usadas muestra de fagos y muestra superficiales de células para examinarlas en busca de la función de enzima (Crameri A. et al., Nature 1998, 15; 391 (6664):288-291; Zhang J. H. et al., PNAS. USA 1997, 94 (9): 4504-4509; Warren M.S. et al., Biochemistry 1996, 9; 35(27): 8855-8862; Kim et al., Appl Environ Microbiol 66:788-93, 2000) también en cuanto a las propiedades ligantes modificadas, por ejemplo, de anticuerpos (Griffith et al., EMBO J: 113, 3245-3260, 1994).

[0042] Puede ser usada una proteína proporcionada por la presente invención para examinar en busca de moléculas que imiten o modulen su actividad o función. Tales moléculas podrían ser útiles en un contexto terapéutico (posiblemente incluyendo el profiláctico).

[0043] La presente invención también proporciona vectores que comprenden las secuencias de polinucleótidos generadas por el método descrito arriba.

[0044] La presente invención también proporciona compuestos que comprenden cualquier secuencia de polinucleótidos, los vectores que comprenden las secuencias de polinucleótidos o las proteínas generadas por el método descrito arriba y un portador farmacéutico aceptable o un portador apropiado para los propósitos de investigación.

[0045] La presente invención también proporciona un método que comprende el seguir la identificación del polinucleótido o el polipéptido que tenga las características deseadas por el método descrito arriba, la elaboración de ese polipéptido o polinucleótido en su totalidad o en parte, opcionalmente en conjunción con polipéptidos adicionales

o polinucleótidos.

[0046] Luego de la identificación de un polinucleótido o polipéptido que tenga las características deseadas, estos entonces pueden ser fabricados para proporcionar números mayores por las técnica conocidas como PCR, clonación y expresión dentro de una célula hospedador.

[0047] Los polipéptidos o polinucleótidos resultantes pueden ser usados en las preparaciones de enzimas industriales, por ejemplo enzimas para los detergente de lavado de ropa donde es preferida una actividad aumentada a temperaturas más bajas. Alternativamente, el polinucleótido o polipéptido elaborado puede ser usado como una herramienta de investigación, i.e., los anticuerpos pueden ser usados en ensayos inmunológicos, y los polinucleótidos pueden ser usado en las investigaciones de hibridización o en plantillas. Alternativamente, los polipéptidos o polinucleótidos resultantes pueden ser usados en las preparaciones de medicamentos para uso diagnóstico, uso farmacéutico, terapia, etc. como se discute a continuación.

[0048] Los polipéptidos o polinucleótidos generados por el método de la presente invención e identificados que tienen las características deseadas pueden ser formulados en composiciones farmacéuticas. Estos compuestos podrían comprender un excipiente farmacéutico aceptable, portador, búfer, estabilizador u otros materiales bien conocidos para los expertos en la técnica, en adición a una de las sustancias anteriormente mencionadas. Tales materiales no deben ser tóxicos y no deben impedir la eficacia del ingrediente activo. La naturaleza precisa del portador o de otra material puede depender de la vía de administración, por ejemplo, cutánea, subcutánea, oral, intravenosa, intraperitoneal, nasal e intramuscular.

[0049] Los compuestos farmacéuticos para administración oral pueden estar en forma de pastilla, cápsula, polvo o líquida. Una pastilla podría incluir un portador sólido como gelatina o un adyuvante. Los compuestos farmacéuticos líquidos incluyen a un portador líquido como agua, petróleo, aceites animal, vegetal, aceite mineral o aceite sintético en general. Pueden ser incluidas en solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacarosa o glicoles como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol.

[0050] Para inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, o inyección en el sitio de aflicción, el ingrediente activo estará en forma de una solución acuosa parenteral aceptable que esté libre de pirógeno y tiene el pH, isotonicidad y estabilidad apropiadas. Los expertos de dominio relevante en la técnica pueden preparar bien las soluciones apropiadas usando, por ejemplo vehículos isotónicos como inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección de Lactato de Ringer. Pueden ser incluidos conservantes, estabilizadores, búferes, antioxidantes y/o otros aditivos, como se requiera.

[0051] Ya sea un polipéptido, por ejemplo, un anticuerpo o su fragmento, una enzima, un polinucleótido o molécula de ácido nucleico, identificado luego de la generación por la presente invención, que debe ser administrada a una persona individual, la administración será preferentemente en una "cantidad eficaz profiláctica" o una "cantidad terapéutica eficaz " (cuando el caso pueda ser, aunque la profilaxis pueda ser considerada terapia), esto es suficiente para mostrar el beneficio a la persona individual. La cantidad verdadera administrada, la tasa, tiempo y curso de la administración, dependerán de la naturaleza y la gravedad del paciente que debe ser tratado. La receta del tratamiento, por ejemplo, las decisiones sobre la dosis, etc., está dentro de la responsabilidad de médicos generales y otros médicos especialistas, y toma en cuenta el trastorno que debe ser tratado, la condición del paciente individual, el sitio de la entrega, el método de la administración y los otros factores típicamente conocidos por los profesionales. Los ejemplos de las técnica y las protocolos mencionado de arriba pueden ser encontrados en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed), 1980.

[0052] Alternativamente, se pueden usar terapias direccionadas en suministrar el agente activo más específicamente a ciertas clases de células, por el uso de sistemas direccionados como anticuerpos o células ligandos específicas. El direccionamiento puede ser deseable por una variedad de razones; por ejemplo, si el agente es inaceptablemente tóxico, o de otra forma se requeriría una dosis demasiado alta, o de otra forma si no se podría entrar en las células objetivo.

[0053] En lugar de administrar estos agentes directamente, podrían ser producidos en las células objetivo por la expresión de un gen de codificación introducido en las células, por ejemplo en un vector viral (una variante de la técnica de VDEPT, i.e., el agente activador, por ejemplo, una enzima es producida en un vector por la expresión de ADN de codificación en un vector viral). El vector podría ser dirigido a las células específicas a ser tratadas, o podría contener elementos reguladores que son cambiados de una forma selectiva más o menos por las células objetivo.

[0054] Alternativamente, el agente podría ser administrado en forma de un precursor, para la conversión a la forma activa por un agente activador producido en, o direccionado a, las células que deben ser tratadas. Este tipo de enfoque es a veces conocido como ADEPT o VDEPT; el primero presupone dirigir el agente activador a las células por la conjugación con un anticuerpo especifico a una célula, mientras que el último presupone producir el agente activador, por ejemplo una enzima, en un vector por la expresión de ADN de codificación en un vector viral (véanse, por ejemplo, EP-A-415731 y WO 90/07936).

[0055] Una composición puede ser administrada individual o conjuntamente con otros tratamientos, simultánea o secuencialmente en dependencia de la condición a ser tratada.

[0056] Como una alternativa adicional, el polinucleótido identificado que tiene características deseables siguientes a la generación por el método de la presente invención podría ser usado en un método de terapia de genes, para tratar a un paciente que sea incapaz de sintetizar el polipéptido activo codificado por el polinucleótido, o incapaz de sintetizarlo al nivel normal, proporcionando así el efecto proporcionado por la correspondiente proteína del tipo natural.

[0057] Los vectores como los vectores virales han sido usados en el estado más avanzado de la técnica para introducir polinucleótidos en una gran variedad de células objetivo diferentes. Típicamente, los vectores son expuestos a las células objetivo con el propósito de que pueda tener lugar la transfección en una proporción suficiente de las células para proporcionar un efecto terapéutico o profiláctico útil de la expresión del polipéptido deseado. El ácido nucleico transfectado puede ser incluido en el genoma de cada una de las células tumorales objetivo, para proporcionar un efecto prolongado, o alternativamente el tratamiento puede tener que ser repetido periódicamente.

[0058] Una variedad de vectores, tantos los vectores virales como los vectores plásmidos, son conocidos en la técnica, véanse la patente de los No EE.UU. 5.252.479 y WO 93/07282. En particular, han sido usados varios virus como vectores de transferencia de genes, incluyendo papovavirus, como SV40, virus de vacunas, virus de herpes, incluyendo HSV y EBV, y retrovirus. Muchos protocolos de terapia génica en el estado más avanzado de la técnica han usado retrovirus de murina desactivado.

[0059] Como una alternativa para el uso de vectores, otros conocidos métodos virales de introducir el ácido nucleico en células incluyen la electroporación, coprecipitación con fosfato de calcio, técnica mecánicas como la microinyección, transferencia mediada por liposomas y consumo directo de ADN y la transferencia de ADN mediada por receptor.

[0060] Como se dijo anteriormente, el objetivo de la terapia génica usando ácido nucleico que codifica un polipéptido, o una parte activa suya, es incrementar la cantidad del producto de expresión del ácido nucleico en células, en las que el nivel del polipéptido de tipo natural esté ausente o presente solamente a niveles reducidos. Tal tratamiento podría ser terapéutico en el tratamiento de células que ya son cancerosas o profilácticas en el tratamiento de personas individuales conocidas en su revisión que tienen una susceptibilidad aléele y por lo tanto una predisposición, por ejemplo, al cáncer.

[0061] La presente invención también proporciona un equipo para generar una secuencia de polinucleótidos o población de secuencias de las características deseadas que comprende reactivos para preparaciones de ssADN, una exonucleasa y componentes para realizar una técnica PCR, por ejemplo, ADN termoestable (nucleótidos) y un dispositivo de detención, por ejemplo, EGTA.

[0062] Como se señalo mas arriba, la presente invención proporciona convenientemente la creación de secuencias de genes de enzimas mutadas y su combinación aleatoria a enzimas funcionales que tengan características deseables. Como un ejemplo de este aspecto de la presente invención; los genes de enzima son mutados por error PCR prono que da como resultado una tasa de mutación de aproximadamente 0,7 %. La mezcla resultante de genes de enzima mutada es digerida entonces con una exonucleasa, preferentemente BAL31, y la reacción inhibida por adición de EGTA a diferentes intervalos de tiempo, resultando en un juego de fragmentos de ADN de tamaños diferentes. Estos pueden luego ser sometidas al reensamblaje basado en PCR como se describe arriba. Los fragmentos de ADN reensamblados resultantes luego son clonados y construida una biblioteca de genes. Los clones entonces pueden ser escogidos de esta biblioteca y secuenciados.

[0063] Una aplicación adicional de esta tecnología es la generación de una población de las secuencias de ADN variables, que pueden ser usadas para selecciones y análisis adicionales. Además de que codifica proteínas mayores, por ejemplo, fragmentos de anticuerpo y enzimas, el ADN puede codificar péptidos donde las moléculas funcionales características pueden ser usadas para el diseño de sistemas de selección diferentes. La selección de secuencias de ADN recombinadas que codifican péptidos ha sido descrita antes (Fisch et al., PNAS. USA 1996, 23 de jul. de 93 (15): 7761-7766). Además, la población de ADN variable puede ser usada para producir una población de moléculas de ARN por ejemplo actividades con catalíticas. Vaish et al., (PNAS. USA 1998, 3 de mar.; 95(5): 2158-2162) demostraron el diseño de sistemas funcionales para la selección de ARN catalítico y Eckstein F (Ciba Found. Symp. 1997; 209; 207-212) ha dado un intervalo general de las aplicaciones de ARN catalítico por la introducción específica de ARN catalítico en células. El sistema puede ser usado para buscar adicionalmente en el espacio de secuencias en la selección de péptidos / moléculas funcionales con actividades catalíticas sobre la plantilla de secuencias de ADN recombinadas.

[0064] Los aspectos y las realizaciones de la presente invención serán ahora ilustrados, por vía del ejemplo, con referencia a las figuras acompañantes. Los aspectos adicionales y las realizaciones serán evidentes para los expertos en la técnica.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0065]

La Figura 1 muestra el principio del método a partir de una molécula de plantilla a una molécula mejorada.

La Figura 2 muestra los pasos principales en la preparación de un ADN de hebra sencilla usando biotina.

La Figura 3 muestra los pasos principales en la preparación de un ADN de hebra sencilla usando fago.

La Figura 4 muestra los pasos principales en la generación de fragmentos de ADN de hebra sencilla usando el tratamiento de exonucleasa.

La Figura 5 muestra los pasos principales en el ensamblado de fragmentos de ADN de hebra sencillas usando PCR.

La Figura 6 muestra el % de recombinantes formados teniendo una reacción cruzada seguido a la digestión con dsDNA con 20 U / ml BAL31 para diferentes períodos de tiempo.

La Figura 7 muestra el % de recombinantes formados teniendo dos reacciones cruzadas luego de la digestión con 20 U / ml de dsADN BAL31 durante períodos de tiempo diferentes.

La Figura 8 muestra el % de recombinantes formados teniendo una reacción cruzada luego de la digestión de ssADN con 1,25 U / ml BAL31 durante períodos de tiempo diferentes.

La Figura 9 muestra el % de recombinantes formados teniendo dos reacciones cruzadas luego de la digestión de ssADN con 1,25 U / ml de BAL31 durante períodos de tiempo diferentes.

La Figura 10 muestra el % de recombinantes formados teniendo una reacción cruzada luego de la digestión de ssADN con 11 U / ml BAL31 durante períodos de tiempo diferentes.

La Figura 11 muestra el % de recombinantes formados teniendo dos reacciones cruzadas luego de la digestión de ssADN con 11 U / ml de BAL31 durante períodos de tiempo diferentes.

La Figura 12 muestra una imagen de gel en electroforesis de agarosa de los fragmentos generados luego de la digestión de 300 ng de ssADN con BAL31 durante 50 minutos (línea 1), 30 minutos (línea 2) y 10 minutos (línea 3). El ssADN sin tratar esta mostrado en la línea 4. Los marcadores de pesos moleculares son mostrados en la línea 5.

La Figura 13 muestra los cromatogramas de gel correspondientes a la línea 4 en la Figura 12.

La Figura 14 muestra los cromatogramas de gel correspondientes a la línea 3 en la Figura 12.

La Figura 15 muestra los cromatogramas de gel correspondientes a la línea 2 en la Figura 12.

La Figura 16 muestra una imagen en electroforesis de gel de agarosa de fragmentos generados luego de la digestión de 300 ng de ADN con exonucleasa VII durante 10 minutos (línea 3), 20 minutos (línea 4) y 30 minutos (línea 5). El ssADN sin tratar es mostrado en la línea 2. Los marcadores de peso molecular son mostrados en la línea 1.

La Figura 17 muestra una imagen en electroforesis de gel de agarosa de fragmentos generados luego de la digestión de 300 ng de ADN con exonucleasa Rec Jf (9 U / mg de ss / ADN) durante 10 minutos (línea 2), 20 minutos (línea 3) y 30 minutos (línea 4). El ssADN sin tratar es mostrado en la línea 1. Los marcadores de peso molecular son mostrados en la línea 5.

La Figura 18 muestra una imagen en electroforesis de gel de agarosa de fragmentos generados luego de la digestión de 300 ng de ADN con exonucleasa Rec Jf (36 U / mg de ssADN) durante 10 minutos (línea 3), 20 minutos (línea 4) y 30 minutos (línea 5). El ssADN sin tratar es mostrado en la línea 2. Los marcadores de peso molecular son mostrados en las líneas 1 y 6.

La Figura 19 muestra una imagen en electroforesis de gel de agarosa de fragmentos generados luego de la digestión de 300 ng de ADN con DNasa I (0,15 U de enzima / mg de ADN). Las muestras de las líneas eran a saber:

Línea 1:

Marcadores de peso molecular

Línea 2:

ssADN sin tratar en búfer de Mg

Línea 3:

ssADN fragmentado con DNasa I en búfer de Mg

Línea 4:

ssADN sin tratar en búfer de Mg

Línea 5:

ssADN fragmentado con DNasa I en búfer

Línea 6:

(vacío)

Línea 7:

(vacío)

La Figura 20 muestra una imagen en electroforesis de gel de agarosa de fragmentos generados luego de la digestión de 300 ng de ADN con DNasa I. Las muestras de las líneas eran a saber:

Línea 1: Marcadores de peso molecular de

Línea 2: dsADN sin tratar en búfer de Mg

Línea 3: dsADN sin tratar en búfer de Mg

Línea 4: ssADN sin tratar (hebra delantera) en búfer de Mg

Línea 5: ssADN sin tratar (hebra delantera) en búfer de Mg Línea 6: ssADN sin tratar (hebra posterior) en búfer de Mg Línea 7: ssADN sin tratar (hebra posterior) en búfer de Mg Línea 8: dsADN fragmentado con DNasa I (0,24 U enzima/µg ADN) en búfer de Mg. Línea 9: dsADN fragmentado con DNasa I (1,3 U enzima/µg ADN) en búfer de Mg. Línea 10: ssADN (hebra delantera) fragmentado con DNasa I (0,24 U enzima/ µg ADN) en búfer

de Mg.

Línea 11: ssADN (hebra delantera) fragmentado con DNasa I (1,3 U enzima/ µg ADN) en búfer de Mg. Línea 12: ssADN (hebra posterior) fragmentado con DNasa I (0,24 U enzima/ µg ADN) en búfer de

Mg. Línea 13: ssADN (hebra posterior) fragmentado con DNasa I (1,3 U enzima/ µg ADN) en búfer de

Mg. La Figura 21 muestra los cromatogramas de gel correspondientes a la línea 6 en la Figura 20. La Figura 21 muestra los cromatogramas de gel correspondientes a la línea 6 en la Figura 20. La Figura 22 muestra los cromatogramas de gel correspondientes a la línea 12 en la Figura 20. La Figura 23 muestra los cromatogramas de gel correspondientes a la línea 13 en la Figura 20. La Figura 24 muestra una imagen en electroforesis de gel de agarosa de fragmentos generados luego de la

digestión de 300 ng de ADN con nucleasa de frijol mung. Las muestras de las líneas eran a saber:

Línea 1: ssADN sin tratar en búfer de Mg.

Línea 2: ssADN fragmentado con nucleasa de frijol mung durante 10 minutos.

Línea 3: Marcadores de peso molecular. EJEMPLOS [0066] El procedimiento de combinación de ADN puede ser ilustrado por los pasos mostrados en las Figuras 1 a 5. El gen que codifica la proteína de interés (X) en el plásmido pFab5chis es usado en este ejemplo. Las mutaciones aleatorias son introducidas por error PCR prono. Es preparado el ADN de una sola hebra. Esto puede ser realizado por cualquier plantillas bioestanadas, o sea por el uso de fago, siendo capaz de empacar ADN de una sola hebra, como se discutió más arriba. La codificación y las hebras de ssADN no codificado son predetenidas en reacciones diferentes (A y B). Las hebras de ssADN de cualquier reacción son sometidas al tratamiento enzimático separado usando por ejemplo BAL 31. Mezclando las dos mezclas de fragmentos de ADN de una sola hebra en cantidades equimolares, el gen puede ser reensamblado en una naturaleza combinada y en muchas versiones por el uso de las dos reacciones PCR consecutivas, donde la primera reacción no contiene ninguna plantilla. Después de clonar esta biblioteca de genes reensamblados en pY, pueden ser realizadas las selecciones para conseguir la molécula mejorada de interés.

[0067] Una descripción más detallada de los ejemplos de la presente invención es dada a continuación.

Ejemplo 1

REACTIVOS

[0068] La polimerasa AmpliTaq ® fue comprada de Perkin-Elmer Corp., dNTPs de Boehringer Mannheim Biochemica (Mannheim,, Alemania), y la Nucleasa BAL31 de Biolabs Inc de New England. (Beverly, USA). Todas las enzimas de restricción fueron compradas de Biolabs Inc de New England. (Beverly, USA). El bromuro de Etidio fue comprado de Bio-Rad Laboratories (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). La Ligasa T4 de ADN fue comprado de New England Biolabs Inc. (Beverly, USA). EDTA y EGTA fueron compradas de Kebo Lab (Suecia).

[0069] Todas las plantillas fueron diseñadas en el laboratorio y obtenidas de Life Technologies (Taby, Suecia) y SGS -ADN (Koping, Suecia).

PCR [0070] Todas las reacciones en cadena de polimerasa (PCR) fueron realizados en un Thermocycler automático (Cetus 480 de Perkin-Elmer, Norwalk, CT, USA,). La técnica PCR de amplificación para el ácido nucleico esta descrita en la Patente de los EE.UU. No 4.683.195. Las referencias para el uso general de las técnica PCR incluyen a Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51: 263, (1987), Ehrlich (ed), PCR technology, Stockton Press, NY, 1989, Ehrlich et al., Science, 252: 1643-1650, (1991), "PCR protocols; A Guide to Methods and Applications", Eds. Innis et al., Academic Press, New York,, (1990).

SECUENCIACIÓN

[0071] Todos las construcciones han sido secuenciados por el uso del equipo de secuenciación BigDye Terminator Cycle Sequencing kit (Perkin-Elmer, Elmervill, CA, USA. La secuenciación fue realizada en un secuenciador ABI Prism 377 ADN Sequencer.

ELECTROFORESIS EN AGAROSA

[0072] La electroforesis en agarosa de ADN fue realizada con geles de agarosa al 2 % (AGAROSA (FMC Bioproducts, Rock-land, ME, USA)) con 0,251u, g / ml de bromuro de etidio en búfer de Tris -acetato (búfer de TAE Tris -acetato 0,04M -EDTA 0,001 M). Las muestras para electroforesis fueron mezcladas con un búfer de carga filtrado estéril compuesto de 25 % de Ficoll y azul Bromfenólico y se cargaron en viales a un gel de agarosa al 2 %. Los electroforesis se llevo a cabo a 90 v durante 45 minutos a menos que se diga lo contrario en búfer de Tris acetato bromuro de etidio con 0,25 µg/ml. Bandas del tamaño apropiado fueron purificadas en gel usando el equipo de extracción de gel Qiaquick Gel Extraction Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania) cuando se necesitaba. Como el estándar de peso molecular, fue usado en escalera un marcador de peso molecular ADN de 1 kb (Gibco BRL). La concentración del ADN en los productos extraídos en el gel se calculó usando un espectrofotómetro.

CEPAS BACTERIANAS

[0073] La cepa TOP10F de Escherichia coli fue usada como un hospedador bacteriano para las transformaciones. Células químicamente competentes de esta cepa fueron producidas básicamente como se describe en Hanahan, D. 1983. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166: 557-580. Fueron producidas células electrocompetentes de esta cepa bacteriana (Dower, W. J., J. F. Miller, y C.W. Ragsdale. 1988: High efficiency transformation of Ecoliby high voltage electroporation. Nucleic Acids Res. 16:6127).

PLÁSMIDOS

[0074] Todas las manipulaciones genéticas fueron llevadas a cabo en pFabSchis de acuerdo con Molecular cloning; a laboratory manual (Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Este vector es diseñado para abarcar cualquier gen scFv insertado entre los sitios Sfil y Notl. El sitio Sfil está ubicado en el líder pelB y el sitio Notl está ubicado justo después de la región VL, de forma que es insertado el VL – vinculador -VH. Fue usado en este caso, un anticuerpo dirigido a CD40.

PLANTILLAS

[0075] Fueron diseñados dos plantillas elementales bioestanadas que circundan el gen de anticuerpo pFabSchis con las siguientes secuencias incluyendo únicos sitios de restricción designados:

Plantilla delantera 1736 Sfil:

5'-ATT ACT CGC GGC CCA GCC GGC CAT GGC CCA CAG GTC AAG CTC GA

y Plantilla posterior 1735 Notl:

5'-TTA GAG CCT GCG GCC GCC TTG TCA TCG TCG TCC TT

[0076] Fueron diseñadas dos plantillas elementales no bioestanadas circundando el gen de anticuerpo de pFab5chis con las siguientes secuencias incluyendo los sitios únicos de restricción designados:

Plantilla delantera 1664 Sfil:

5'-ATT ACT CGC GGC CCA GCC GGC CAT GGC CCA CAG GTC AAG CTC GA

y Plantilla posterior 1635 Notl:

5'-TTA GAG CCT GCG GCC GCC TTG TCA TCG TCG TCC TT

ESTÁNDAR PCR

[0077] Las reacciones PCR usuales fueron dirigidas en 25 ciclos consistiendo en seguir el perfil: denaturación (94°C, 1 minuto), fusión de plantilla (55°C, 1 minuto) y extensión (72 C°C, 3 minutos). Cada reacción PCR contenía 10 mM de Tris -HCI, pH 8,3, 50 mM de KCI, 1,5 mM de MgCI2; 200 µM de dNTP, 1 µM de plantilla delantera, 1 µM de

plantilla posterior, 1,25 U de polimerasa de ADN AmpliTaq®termoestable (Perkin-Elmer Corp.), y 50 ng de plantilla en un volumen final de 10011l.

ERROR PCR PRONO

[0078] Las reacciones error PCR prono fueron realizadas en un 10 x búfer que contenia 500 mM NaCl , 100 mM de Tris -HCI, pH 8,8, 5 mM de MgCI2, 100 µg de gelatina (de acuerdo con Kuipers et al., Nucleic Acids Res. 1991, Aug 25; 19 (16):4558 pero con la concentración de MgCI2 aumentada de 2 mM a 5 mM).

[0079] Para cada 100 µl de reacción fue mezclado lo siguiente:

dATP 5mM

5 µl

dGTP 5 mM

5 µl

dTTP 10 mM

10

dCTP 10 mM

10

20 µM de plantilla 3'

1,5 11I

20 µM de plantilla 5'

1,5 µl

[0080] La plantilla en el vector de pFab5chis fue añadida en una cantidad de 50 ng. Fueron añadidos 10 µl de 10 mM MnCI2, y fue verificado que en el tubo no ocurría ningún precipitado de MnO2. Fueron añadidas por lo menos 5 unidades de la enzima Taq. El error PCR prono fue llevado a cabo a las siguientes temperaturas durante 25 ciclos sin un comienzo con calentamiento: a 94°C 1' de, 45°C 1', 72°C 1', +72°C durante 7 minutos. El producto resultante fue un inserto de error prono sobre la proteína de aproximadamente 750 bp. Este inserto fue purificado con el equipo de purificación PCR de Gibco, antes del tratamiento adicional.

GENERACIÓN DE ADN DE HEBRA SENCILLA POR PLANTILLAS BIOESTANADAS

[0081] El fragmento de interés fue amplificado por dos reacciones PCR distintas. Estas reacciones también pueden ser PCR usuales como está descrito más arriba o por error PCR prono como se describe anteriormente. Las plantillas elementales deben ser diseñadas con el propósito de que en una reacción la plantilla delantera sea bioestanadas y en la otra reacción la plantilla posterior sea bioestanada. Por ejemplo, las reacciones de PCR con A) plantillas elementales 1736 y 1635 y B) plantillas elementales 1664 y 1735, con el perfil anteriormente mencionado fueron realizadas durante 25 ciclos con el anticuerpo pFab5chis como plantilla. Esto produjo los productos de PCR de aproximadamente 750 bp en los que en A la hebra superior fue bioestanada y en B la hebra inferior fue bioestanada.

[0082] Las hebras no bioestanadas fueron recuperadas por purificación usando una matriz sólida recubierta con estreptavidina, por ejemplo, Dynabeads. Las cuentas magnéticas son lavadas y equilibradas con búfer PBS / 1 % de BSA y búfer B & W conteniendo 5 mM de Tris pH 7,5, 1 M de NaCl, y 0,5 mM de EGTA. Fueron mezclados 100 µl de cada producto de PCR con 100 µl de cuentas, disueltos en búfer 2 x B & W e incubado con rotación a la temperatura ambiente durante 15 minutos. Los productos de PCR no enlazados son retirados por lavado cuidadoso dos veces con B & W. El hebra no bioestanada del ADN capturado es eluída por denaturación alcalina dejando al ADN incubar con 25 µl 0,1 M de NaOH durante 10 minutos en la temperatura ambiente. La solución es separada de las cuentas y neutralizada con 7,5 µl de 0,33 M de HCI y 2,5 µl de Tris 1M pH 8.

GENERACIÓN DE ADN DE HEBRA SENCILLA USANDO FAGO

[0083] El fragmento de interés fue clonado en los vectores bacteriófagos M13, M13mp18 y M13mp19, usando las enzimas de restricción Pstl / Hindlll. El bacteriófago fue propagado usando la cepa TOP10F de Escherichia coli de acuerdo con métodos convencionales. El ADN de hebra sencilla para la hebra superior fue preparado a partir del vector de bacteriófago M13mpl8, y de ADN de hebra sencilla para la hebra más baja fue preparado a partir del vector de bacteriófago M 13mpl 9. Brevemente, 1,5 ml de un cultivo bacteriano infectado fue centrifugado en 12 000 g durante 5 minutos a 4°C. El sobrenadante fue precipitado con 200 µl de PEG 8000/2,5 M al 20% de NaCl. El bacteriofago peletizado fue resuspendido en 100 µl de TE. Fueron añadidos 50 µl de fenol equilibrado con Tris-CI (pH 8,0) y la muestra fue virada. Después de la centrifugación en 12 000 g durante 1 minuto en RT la fase superior, conteniendo el ADN, fue trasladada y precipitada con etanol. La pastilla de ADN fue disuelta en 50 µl de TE (pH = 8,0) y guardada a -20°C. (Sambrook et al. Molecular Cloning, A laboratory manual 2nd edition. Cold Spring Habor Laboratory Press. 1989, capitulo 4). El ADN de hebra sencilla preparado a partir de fago es circular y debe ser abierto antes del tratamiento con BAL31. Esto puede llevarse a cabo con una nucleasa capaz de escindir el ADN de hebra sencilla.

GENERACIÓN DE ADN FRAGMENTADO DE HEBRA SENCILLA USANDO BAL 31

[0084] Las hebras de ssADN de cualquiera de las reacciones (conteniendo hebras inferior y superior respectivamente) fueron sometidas a tratamiento enzimático para separarlas usando por ejemplo BAL 31. Cada reacción de digestión contenía 0,02 µg / µl de ssADN, 600mM de NaCl, 20 mM de Tris – HCI, 12 mM de CaCI2, 12 mM de MgCI2, 1 mM de EDTA pH = 8,0 y BAL 31 a varias concentraciones de enzima que se extendían desde 0,1 5 U / ml. Las reacciones fueron incubadas a 30°C y las fracciones de ssADN digerido fueron colectadas secuencialmente a 10, 30, 60 y 120 segundos de duración. Las reacciones fueron detenidas por adición de EDTA y tratamiento con calor a 65°C durante 10 minutos. Los fragmentos de ssADN fueron purificados por extracción de fenol / cloroformo y precipitado con etanol. El ssADN fue resuspendido en 10 mM de Tris pH = 8,0.

[0085] El patrón de digestión fue evaluado por electroforesis de gel de agarosa 1%.

PURIFICACIÓN DEL FRAGMENTO PRODUCIDO POR LA DIGESTIÓN:

[0086] Fragmentos de ADN digeridos fueron purificados por extracción de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico. 50 µl de fenol tamponeado fue añadido a cada tubo con 100 µl de muestra de una mezcla de cloroformo y alcohol isoamílico (24:1). Los tubos fueron vibrados durante 30 segundos y luego centrifugados durante 1 minuto en microtubos a 14000 r.p.m. La fase superior es luego colectada y mezclada con 2,5 volúmenes de 99,5 % etanol (1/10 fue acetato de sodio de 3M, pH = 5,2). El ADN fue precipitado a 1 hora a -80°C. El ADN fue luego peletizado por centrifugación durante 30 minutos a 14 000 r.p.m. El precipitado fue lavado una vez con etanol 70 % y luego redisuelto en 10 µ l de agua estéril.

ANÁLISIS DE LA DIGESTIÓN PRODUCIDA POR FRAGMENTOS PURIFICADOS SOBRE GEL DE AGAROSA.

[0087] 5 µl del precipitado disuelto para cada intervalo de tiempo y desde un blanco fueron mezclados con 2,5 µl de búfer de carga (25% Ficoll y Bromofenólico color azul) y cargar cada pozo en un gel de agarosa 2 %. La electroforesis de los diferentes intervalos de tiempo fue llevada a cabo como se describió más arriba.

REENSAMBLAJE DE FRAGMENTOS DE LONGITUD COMPLETA

[0088] El reensamblaje de los fragmentos de ssADN es conseguido por dos reacciones de PCR secuenciales. La primera reacción de PCR debe contener 10 mM Tris -HCI, pH = 8,3, 50 mM KCI, 1,5 mM MgCI2, 200 µM dNTP, 0,3 U polimerasa Taq y 2 µl BAL31 con la muestra tratada, todos en un volumen final de 25 µl y sometida a 5 ciclos con el siguiente perfil: 94 °C por 1 minutos, 50°C por 1 minuto y 72°C por 2 minutos + 72°C por 5 minutos. La segunda reacción de PCR debe contener 10 mM Tris -HCI, pH = 8,3, 50 mM KCI, 1,5 mM MgCI2, 200 µM dNTP, 0,6 U Taq polimerasa, 1 µM plantilla delantera, 1 µM plantilla posterior, y 5 µl de muestra de la primera reacción de PCR, todo en un volumen final de 50 µl; y sometida a 15 ciclos con el siguiente perfil: 94°C durante 1 minutos, 55°C durante 1 minuto y 72°C durante 2 minutos y + 72°C durante 7 minutos. Los productos resultantes pueden ser valorados por electroforesis de gel de agarosa.

DIGESTIÓN DE RESTRICCIÓN DE FRAGMENTO REENSAMBLADO Y PLÁSMIDO CON SFIL Y NOTL

[0089] El fragmento reensamblado y el plásmido pFab5chis fueron escindidos primero con Sfil usando búfer NEB 2 que incluye BSA y 11 U enzima / µg ADN. La reacción fue llevada para 4 h a 50 °C. Después de ésto, el ADN fue escindido con Notl añadiendo búfer de conversión y 6 U enzima / µg ADN. Esta reacción fue llevada a cabo a 37 °C durante toda la noche.

PURIFICACIÓN EN GEL DEL VECTOR DIGERIDO DE RESTRICCIÓN Y FRAGMENTO REENSAMBLADO DIGERIDO DE RESTRICCIÓN.

[0090] Las reacciones de escisión fueron analizadas sobre un gel de agarosa 1%. El inserto digerido de restricción indica un producto de escisión de aproximadamente 750 bp. Esto se corresponde con el tamaño esperado. La banda del Inserto escindido y el plásmido fue cortada y extraída del gel como fue descrito antes.

LIGACIÓN DEL FRAGMENTO DIGERIDO DE RESTRICCIÓN REENSAMBLADO DIGERIDO CON RESTRICCIÓN PFAB5CHIS.

[0091] El pFab5chis escindido y purificado fue ligado con el fragmento digerido reensamblado de restricción purificado a 12 °C en baño de agua durante 16 horas. 50 µl del vector fue mezclado con 50 µl del inserto y 15 µl de búfer 10x (proporcionado con la enzima), 7,5 µl de ligasa (5 U / µl) y agua estéril para un volumen final 150 µI. Una ligación del pFab5chis digerido de restricción sin algún inserto fue también llevada a cabo de la misma manera.

TRANSFORMACIÓN DE E. COLI TOP10F QUÍMICAMENTE COMPETENTE CON EL INSERTO REENSAMBLADO LIGADO Y PFAB5CHIS

[0092] Las reacciones de ligación fueron purificadas por extracción fenol / cloroformo como fue descrito arriba. La fase superior de la extracción fue colectada y mezclada con 2,5 volúmenes de 99,5 % de etanol (1/10 fue acetato de sodio 3M, pH = 5,2). El ADN fue precipitado por 1 hora a -80°C. El ADN fue peletizado por centrifugación y durante 30 minutos en una microtubos a 14.000 r.p.m. El peletizado fue lavado una vez con etanol 70 % y luego re-disuelto en 10 µl de agua estéril. 5 µl de cada ligación fue mezclado con 95 µl de E. coli TOP10F químicamente competente incubado sobre hielo durante 1 hora y luego transformado por separado (Sambrook et al. Molecular Cloning, A laboratory manual 2nd edition. Cold Spring Habor Laboratory Press, 1989). Después del crecimiento de una hora las bacterias de las dos transformaciones fueron difundidas en placas de agar que contienen ampicillina (100 µg/ml ). Las placas fueron cultivadas de revés a 37 °C durante 14 horas.

Ejemplo 2 -Frecuencias de recombinación; comparación de dsADN y ssADN

[0093] En los experimentos comparables adicionales, tres fragmentos de anticuerpos scFv fueron usados en experimentos de recombinación ya sea como dsDNA o como ssADN.

DSADN

[0094] Los tres genes scFv fueron amplificados en PCR usando plantillas delanteras y posteriores por un procedimiento de PCR estándar. El tamaño de las bandas fue confirmado con electroforesis de agarosa y el resto de los productos de PCR amplificados fueron purificados usando Equipo de Purificación PCR (Gibco). El dsADN de los tres scFv fue mezclado en cantidades equimolares y tratadas con BAL31. Cada reacción de digestión contenía dsADN en una concentración de 0,02 µg/µl volumen de reacción de 600 mM de NaCl, 20 mM de Tris – HCI, CaCI2, 12 mM MgCI2, 1 mM EDTA pH = 8,0 y BAL31 a varias concentraciones de enzima (usando 4, 20 ó 100 U/ml volumen de reacción). Las reacciones fueron incubadas a 30 °C y las fracciones digeridas de dsADN fueron colectadas secuencialmente a 10, 30, y 50 minutos. Las reacciones fueron detenidas con EDTA y tratamiento térmico (alternativamente, puede ser usado un protocolo de inactivación con calor libre -EDTA; ver abajo) y purificadas usando extracción de fenol / cloroformo y precipitación con etanol. Las muestras de dsADN fueron resuspendidas en 10 mM Tris pH = 8,0.

[0095] Manteniendo cada intervalo de tiempo por separado, las muestras fueron sometidas para reensamblar PCR (para este reensamblaje se usan 60 ng ADN) y PCR de amplificación de acuerdo con el protocolo, y clonado en pGEM (Producto No. A362A, Promega, Madison, USA). Dieciocho clones de cada intervalo de tiempo fueron secuenciados y el número y la frecuencia de recombinaciones fueron determinados.

Inactivación por calor de digestión de exonucleasa

[0096] Un protocolo para parar la reacción de BAL31 sin usar EDTA ha sido establecido. Este protocolo de inactivación de calor evita usar extracción de fenol/ cloroformo, que es peligrosa a la salud y también causa la pérdida del material.

[0097] En resumen, la muestra es incubada durante 10 minutos a 95 °C y luego poner directamente en hielo, para la reacción enzimática. Después de esto la muestra puede ser directamente precipitada usando etanol.

SsADN

[0098] Los tres genes de scFv fueron amplificados en dos reacciones PCR usando pares de plantilla delantera / posterior -biotina y delantera -biotina / posterior usando procedimiento estándar PCR. El tamaño de las bandas fue confirmado con electroforesis de agarosa y el resto de los productos de PCR amplificados fueron purificados usando equipo de purificación de PCR (Gibco). ADN de hebra sencilla fue obtenido usando cuentas magnéticas de acuerdo con el protocolo, logrando tres hebras de sentido y tres hebras de antisentido. Las hebras de sentido y las hebras de antisentido, respectivamente, de los tres scFv eran mixtas en cantidades equimolares y tratadas con BAL31 de acuerdo con el protocolo (usando 1,25 ó 11 U enzima / ml de volumen de reacción y ssADN a concentraciones de 0,015 µg / µl volumen de reacción) y las muestras fueron tomadas a 0 (es decir, no digerido), 10, 30 y 50 minutos. Las reacciones fueron detenidas con EDTA y el tratamiento de calor y purificadas usando extracción de fenol / cloroformo y precipitación de etanol. Manteniendo cada intervalo de tiempo distinto, pero mezclando el sentido y las hebras antisentido, las muestras fueron sometidas para reensamblar PCR (para este reensamblaje 60 ADN de ng es usado) y PCR de amplificación de acuerdo con el protocolo, y clonar en pGEM. Dieciocho clones de cada intervalo de tiempo fueron secuenciados y el número y la frecuencia de las recombinaciones fueron determinadas.

RESULTADOS

[0099] La frecuencia más alta de recombinación usando dsADN fue conseguida usando 20 U enzima / ml de volumen de reacción (conteniendo 0,02 µg / µl ADN) y tratado durante 10 minutos. Esto da 39 % de los clones con un paso (Figura 6) y el 17 % de los clones con dos pasos (Figura 7). Usando 4 U de enzima / ml da independiente del tiempo para la fragmentación y 100 U enzima / ml resultó en la fragmentación completa en fragmentos muy pequeños, como demuestra el fracaso de recuperar la longitud completa del gen durante el reensamblaje.

[0100] Los resultados de los experimentos que usan ssADN son mostrados en la Figuras 8 a la 10. La Figura 8 muestra BAL31 a 1.25 U / ml y clones con un paso, La Figura 9 muestra BAL31 a 1.25 U / ml y clones con dos pasos. La Figura 10 muestra BAL31 a 11 U / ml y clones con un paso, y la Figura 11 muestran a 11 U / ml de BAL31 y clones con dos pasos.

[0101] La frecuencia más alta de la recombinación que da un paso usando ssADN fue lograda usando 11 U enzima / ml y fue alcanzada usando durante 10 minutos (Figura 10). 59 % de los clones tenían una cruzada desde lo

alto. El de mayor frecuencia de recombinación que da dos pasos usando ssADN fue conseguida usando 1,25 U de enzima / ml y convidando durante 30 minutos (Figura 9). 20 % de los clones tenían dos operaciones.

CONCLUSIONES Y COMENTARIOS

[0102] Estos datos muestran claramente que evidentemente una frecuencia más alta de recombinación es conseguida usando ssADN. Los tres scFv usado tienen las mismas secuencias de plantilla, indicando que el número de paso informado podría ser más alto debido a paso en regiones donde ninguna diferencia de secuencia dará como resultado. Estos experimentos que usaban ssADN fueron realizados de un modo no óptimo para mostrar la recombinación máxima, ya que todas las hebras de las tres moléculas estaban mezcladas. Mezclar la hebra de sentido de un scFv con la hebra de antisentido de otro scFv causaría las frecuencias más altas de pasos, ver Ejemplo 3. También, cada intervalo de tiempo aquí fue conservado por separado y sería lógico calcular la frecuencia de pasos para aumentar para diferentes intervalos de tiempo, es decir fragmentos de diferentes tamaños, son mezclados.

Ejemplo 3 -Frecuencias de recombinación; la dependencia de homologia usando ssADN

[0103] Investigar la homologia requerida para conseguir pasos, pusimos los experimentos para recombinar cuatro scFv (designado, AE11 y MO152) haciendo tres pares con diferentes homologías como sigue:

SMUC159 -CT17

92%

SMUC159 -AE11

70%

SMUC159-O152

60%

[0104] Los cuatro genes de scFv fueron amplificados en dos reacciones de PCR usando pares de plantillas delantera / posterior -biotina y delantero -biotina / posterior usando procedimiento de PCR estándar. El tamaño de las bandas fue confirmado con electroforesis de agarosa y resto de los productos de PCR amplificados fueron purificados usando equipo de purificación de PCR (Gibco). ADN de hebra sencilla fue obtenido usando camas magnéticas de acuerdo con el protocolo, logrando cuatro hebras de sentido y cuatro hebras de antisentido. Cada hebra fue tratada con BAL31 de acuerdo con el protocolo (usando 4,2 o 12,5 U enzima U / ml) y las muestras fueron sacadas a los tiempos 0, 10, 30 y 50 minutos, ó de 0, 15, 30, 45 y 60 minutos. Las reacciones fueron detenidas con EDTA y tratamiento de calor y purificadas usando extracción de fenol / cloroformo y precipitación de etanol. Manteniendo cada intervalo de tiempo por separado, pero mezclando el sentido y las hebras de antisentido formando los pares como se indica de arriba, las muestras eran sustitutas y sometidas a PCR de reensamblaje y a PCR de amplificación de acuerdo con el protocolo, y clonar en pGEM. Quince clones de cada intervalo de tiempo fueron secuenciados y el número y la frecuencia de la recombinación fueron determinadas.

RESULTADOS

[0105] Los pasos fueron identificados en todas las combinaciones de scFv, indicando que tan bajo como 60 % de homología es suficiente para conseguir la recombinación.

Ejemplo 4 -Control mejorado de tamaño de fragmento usando exonucleasas.

A) Exonucleasas

[0106] Se usan exonucleasas, por ejemplo BAL31, exonucleasa I, exonucleasa V, exonucleasa VII, y exonucleasa Rec Jf para la fragmentación en los métodos de la presente invención. Estas enzimas escinden un nucleótido a la vez, en el extremo 5 ' o en el extremo 3 ' de ambos extremos. La reacción puede ser parada usando EDTA o por inactivación con calor (vea arriba), dependiendo de la enzima usada. Esto quiere decir que fragmentos de todos tamaños posibles, difieren con solamente un nucleótido, pueden ser obtenidos.

[0107] Los siguientes ejemplos demuestran cómo la digestión exonucleasa permite la digestión de fragmentos de varios tamaños controlables dependiendo de las condiciones usadas.

BAL 31

[0108] ADN de una sola hebra fue digerida con BAL31 de acuerdo con el protocolo en el Ejemplo 1, con una concentración de 4,2 U / ml volumen de reacción y concentración de ssADN de 0,008 µg / µl volumen de reacción.

[0109] En un experimento típico, aproximadamente 300 ng de ADN son aislados en cada intervalo de tiempo del tratamiento de BAL31. La Figura 12 muestra una imagen de electroforesis en gel de agarosa de tales experimentos con ssADN sin tratar en la línea 4 y ssADN tratado por 10 minutos en la línea 3, por 30 minutos en la línea 2 y por 50 minutos en la línea 1. La línea 5 es el patrón de peso molecular (MW).

[0110] La Figuras 13 a la 15 muestran los cromatogramas de gel correspondientes de las líneas, respectivamente. La Figura 13 es la material sin tratar y los picos múltiples se refieren a conformaciones diferentes del ssADN. La Figura 14 se corresponde a la línea 3 y el material tratado durante 10 minutos. La material fue tratado con calor para parar la reacción enzimática, y por lo tanto, resolver las conformaciones diferentes, y es indicado uno de los picos de un tamaño distinto. La Figura 15 se corresponde a la línea 2 y el material tratado durante 30 minutos.

[0111] Aquí está claro que el pico correspondiente a los fragmentos más grandes está disminuyendo y aparece el pico más pequeño de fragmentos de ADN .

Exonucleasa VII

[0112] ADN de una sola hebra fue digerida con exonucleasa VII usando una concentración de enzima de 7,7 U / ml de volumen de reacción y concentración de ssADN de 0,008 µg / µl de volumen de reacción. El búfer de reacción comprende 67 mM de fosfato de potasio (pH = 7,9), 10 mM de mercaptoetanol, 6,7 mM MgCI2 y 8,3 mM de EDTA.

[0113] La reacción se permite seguir a 37 °C por 10, 20 y 30 minutos, antes de ser parada por inactivación de calor (95 °C durante 5 minutos).

[0114] En la Figura 16 el patrón de fragmentación usando exonucleasa VII es mostrado. La línea 1 es estándar de peso molecular, la línea 2 es ssADN sin tratar, línea 3 es ssADN fragmentado con exonucleasa VII durante 10 minutos, línea 4 es ssADN fragmentado con exonucleasa VII durante 20 minutos, y línea 5 es ssADN fragmentado con exonucleasa VII durante 30 minutos. Este muestra que los tamaños de los fragmentos son reducidos por tiempo.

Exonucleasa Rec Jf

[0115] ADN de una sola hebra fue digerido con exonucleasa Rec Jf usando una concentración de enzima de casi 2.5 U / ml del volumen de reacción o 10 U / ml del volumen de reacción y una concentración de ssADN de 0,007 µg / µl del volumen de reacción, corresponde a 0,36 U enzima / µg ADN 1,4 U enzima / µg ADN, respectivamente. El búfer de reacción comprendía 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCI, 10 mM MgCI2 y 1 mM de ditiotreitol, pH = 7,9.

[0116] La reacción fue permitida seguir a 37 °C por 10, 20 y 30 minutos, antes de ser parada por inactivación con calor (95 °C durante 5 minutos).

[0117] En la Figura 17 es mostrado el patrón de fragmentación usando exonucleasa Rec Jf a 0,36 U de ssADN / microgramo. La línea 1 es ssADN sin tratar, la línea 2 es ssADN fragmentado con exonucleasa Rec Jf durante 10 minutos, la línea 3 es ssADN fragmentado con exonucleasa Rec Jf durante 20 minutos, y la línea 4 es ssADN fragmentado con exonucleasa Rec Jf durante 30 minutos. Esto muestra que los tamaños de fragmento son reducidos en el tiempo. En la Figura 18 la concentración de enzima es incrementada 4 veces (1,4 U de ssADN / microgramo) y el patrón de fragmentación es mostrado de 0 a 30 minutos, demostrando un alto grado de fragmentación en comparación con la Figura 17. Esto muestra que ambos tiempos y concentración de enzima pueden ser usados para controlar la fragmentación.

(B) Endonucleasa

[0118] Los métodos de combinación de ADN convencionales usan típicamente DNasa I para la fragmentación (por ejemplo, véase Stemmer; 1994, Nature 370: 389-391). DNasa escinde el ADN a un modo endonucleótido en sitios adyacentes a lo pirimidinas. Consecuentemente, no todos los tamaños de fragmento posibles pueden ser obtenidos.

[0119] Además, usando Magnesio en el búfer de reacción, es obtenida una mezcla de mono de oligómeros de mononucleosis -y. Por lo tanto los métodos diferentes como la purificación en electroforesis de gel agarosa o la filtración de gel tienen que ser usados para aislar fragmentos de los tamaños diferentes. A menudo los fragmentos de pequeño tamaño o unas mezclas de fragmentos pequeños y más grandes son deseados para optimizar la recombinación. Sin embargo, estos métodos de purificación introducen cortes de una sola hebra en los productos de PCR doble -hebra. Fragmentos de un tamaño en particular purificado sobre gel consta de dsADN con un número grande de cortes de una sola hebra por lo que daría elevar muchos fragmentos pequeños sobre desnaturalización. Esto significa que muchos de los fragmentos de una sola hebra generaron sobre desnaturalización que serían demasiado cortas para funcionar como plantillas durante la fusión, resultando en una gran pérdida del producto.

[0120] Usar Manganeso en el búfer de reacción crea fragmentos de tamaños más pequeños que 50 bp y no es necesaria la purificación en gel. Sin embargo, aquí se restringe usar solamente fragmentos pequeños y estos no pueden ser mezclados con fragmentos más grandes, algo que probablemente incrementaría la frecuencia de recombinación.

[0121] Los problemas relacionados con el uso de endonucleasas son demostrados en los siguientes experimentos:

DNasa I

[0122] El ADN fue digerido durante 5 minutos con DNasa I a una concentración de 0,15 U / µg de ADN.

[0123] Búferes de Magnesio y Manganeso fueron comparados cuando se fragmentaban con DNasa I y el resultado es mostrado en la Figura 19. Línea 1 es el patrón de peso molecular, línea 2 es ssADN sin tratar en búfer Mg, línea 3 es ssADN fragmentado con DNasa en búfer Mg acorde Stemmer (1994) Nature 370 389-391, la línea 4 es ssADN sin tratar en búfer Mn y la línea 5 es ssADN fragmentado con DNasa I en búfer Mg de acuerdo con Kikuchi et al. (2000) Gene 243 133-137. Está claro en la Figura 19, cuando se usa búfer de Mg y condiciones de acuerdo con los trabajos de Stemmer y Kikuchi, no ocurre ninguna fragmentación. Además, cuando usamos búfer de Mn y condiciones de acuerdo con los trabajos de Stemmer y Kikuchi, todo el material está totalmente fragmentado solamente en algunos minutos.

[0124] En el intento de obtener fragmentos de diferentes tamaños se decide usar búfer de Mg y aumentar la concentración de enzima. La Figura 20 muestra una imagen de electroforesis en gel de agarosa de un experimento en que se usa DNasa I. Línea 1 es el patrón de peso molecular. La línea 6 es ssADN sin tratar. La línea 12 es ssADN tratado de acuerdo con los trabajos de Stemmer y lo Kikuchi, usando 0,15 U enzima / microgramo de ADN y la línea 13 es el mismo material tratado con 1 U de enzima / microgramo de ADN (es decir seis veces mayor cantidad de enzima).

[0125] Las Figuras 21 a 23 muestran los cromatogramas correspondientes. El ssADN sin tratar ha sido tratado con calor, por lo que solamente aparece un pico en la Figura 21 (mostrado por la flecha). En la Figura 22, la cantidad de DNasa I es aparente a la usada de acuerdo con los trabajos de Stemmer y Kikuchi donde el pico para ssADN sin tratar es algo reducido (demostrado por la flecha), pero el pico distinto es visible para el ADN fragmentado, solamente una mancha. Usando 6 veces más enzima, el ssADN sin tratar es totalmente abolido (Figura 23) y ni aquí es visible ningún pico de los fragmentos.

Nucleasa Frijol de Mung

[0126] El ADN de una sola hebra fue digerido con nucleasa de frijol de mung (Producto No MO250S, New England Biolabs) usando una concentración de enzima de 0,375U/ml volumen de reacción y ssADN a una concentración de 0,007 µg/µl volumen de reacción. El búfer de reacción comprende 50 mM de acetato de sodio, 30 mM NaCl 1 mM ZnSO4, a pH = 5,0

[0127] La reacción fue permitida seguir a 25°C durante 10 minutos, antes de ser parada por inactivación con calor (95 °C durante 5 minutos).

[0128] La Figura 24 muestra la fragmentación usando otra endonucleasa, nucleasa de frijol de mung. La línea 1 es el ssADN sin tratar, la línea 2 es el mismo material tratado durante 10 minutos. La Línea 3 es el patrón de peso molecular.

[0129] Los resultados muestran que todo el ADN estaba totalmente fragmentado después de la digestión de solamente 10 minutos con la nucleasa de frijol de mung (véase la línea 2), a pesar de usar la enzima a una concentración más baja que lo recomendado por el fabricante.

CONCLUSIONES Y COMENTARIOS

[0130] Los ejemplos anteriores muestran cómo los tamaños de los fragmentos pueden ser controlados usando exonucleasas y alterando las condiciones de reacción, i.e., el tiempo, el volumen de reacción, la concentración de la enzima. Los picos diferentes son visualizados usando cromatogramas de intervalo de gel.

[0131] Por el contrario, usando endonucleasas, como DNasa I, se da una reacción que es difícil controlar. Usando las condiciones como se refieren en la literatura, sea usando búferes conteniendo Mg o Mn, da típicamente una situación cuando todo o nada está fragmentado, véase particularmente la Figura 20. Un experimento que usa otra endonucleasa (nucleasa de frijol de mung) confirma estas observaciones.

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un método para generar una secuencia o una población de secuencias de polinucleótidos a partir de secuencias de polinucleótidos madre de hebra sencilla que codifican uno o más motivos de proteína, que comprende los pasos de:

   a) proporcionar ADN de hebra sencilla que constituye hebras de más y menos de las secuencias de polinucleótido madre;

   b) digerir las secuencias de polinucleótidos de hebra sencilla con una exonucleasa para generar poblaciones de fragmentos de hebra sencillas;

   c) poner en contacto dichos fragmentos generados de las hebras más con fragmentos generados de las hebras menos y opcionalmente, añadir las secuencias de plantilla que se fusionan a terminales 3' y 5' de al menos uno de los polinucleótidos madre en condiciones de fusión;

   d) amplificar los fragmentos que se fusionan entre sí para generar al menos una secuencia de polinucleótidos que codifica uno o más motivos de proteína teniendo características alteradas en comparación con el uno o más motivos de proteína codificados por dichos polinucleótidos madre.

2. 2.

   Un método como se reivindica en la reivindicación 1, en el que la exonucleasa se selecciona entre el grupo que consta de BAL31, exonucleasa I, exonucleasa V, exonucleasa VII, y exonucleasa Rec Jf.

3. 3.

   Un método como se reivindica en la reivindicación 2, en el que la exonucleasa es BAL31.

4. 4.

   Un método como se reivindica en la reivindicación 1, 2 o 3 en el que una secuencia o unas secuencias de polinucleótidos madre han sido sometidas a mutagénesis.

5. 5.

   Un método como se reivindica en la reivindicación 1, en el que la población de fragmentos generados en el paso b) es sometida a mutagénesis.

6. 6.

   Un método como se reivindica en la reivindicación 4 o 5, en el que la mutagénesis es PCR propenso a error.

7. 7.

   Un método como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el paso b) es realizado para generar una población de fragmentos de una sola hebra de longitudes diferentes.

8. 8.

   Un método como se reivindica en la reivindicación 7, en que el paso b) es controlado para generar una población de fragmentos de una sola hebra que tiene una longitud media de más de aproximadamente 50 nucleótidos.

9. 9.

   Un método como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 que adicionalmente comprende el paso de expresar al menos una secuencia de polinucleótidos generados en el paso d) para producir el polipéptido codificado.

10. 10.

    Un método como se reivindica en la reivindicación 9 que adicionalmente comprende el paso de ensayar el polipéptido codificado para las características deseadas.

11. 11.

    Un método como se reivindica en una cualquiera de la reivindicaciones 1 a 10, en el que la secuencia de polinucleótidos madre codifica un anticuerpo o fragmento del mismo.

12. 12.

    Un método como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la secuencia de polinucleótidos madre codifica una enzima.

13. 13.

    Un método como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la secuencia de polinucleótidos madre codifica un antígeno.

14. 14.

    Un método como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que adicionalmente comprende el paso de incorporar al menos una secuencia de polinucleótidos generada en el paso d) en un vector.

15. 15.

    Un método como se reivindica en la reivindicación 14, que adicionalmente comprende el paso de expresar in vitro la al menos una secuencia de polinucleótidos incorporada en un vector para producir el polipéptido codificado.

16. 16.

    Un método como se reivindica en la reivindicación 14 o 15, que adicionalmente comprende el paso de formular la secuencia o los vectores de polinucleótidos que comprenden el polinucleótido o el polipéptido codificado por el polinucleótido en una composición farmacéutica aceptable.