PT2753646T - Anticorpos anti-cd40, suas utilizações e métodos - Google Patents

Anticorpos anti-cd40, suas utilizações e métodos Download PDF

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Description

DESCRIÇÃO ANTICORPOS AltTl-CD40# SUAS UTILIZAÇÕES E MÉTODOS Campo da invençao Λ presente invenção refere-se a polipeptideos bascaoo:-> em I an L i|õp:pp.o|l çppilpfpõoif'iõiíõidelpp: (iigaTPp.. &amp;° 0'f-':s!i^j|||^;;i; 1': uma lãif|;,nIdeielltPilfior adi iHliliullp# 1'|ppíâ:: iaçòfí-:|:§:|É:;í ο Φ-ίβ ι-βΙΓ! ρρύί|ηΜόη|ί|ί 1ÉI11 dÕiÕl'-l'IP:l .........d.................... invenção também se refere; a composições farmacêuticas, utilizações# métodos e kits que compreendem tais anticorpos. Introdução O cancro é responsável por mais de 30 % das mortes nos países desenvolvidos. Embora tenha sido alcançado um granae progresso no tratamento de certos tumores (doença de Hodgkin# alguns linfomas/leucemias# cancro cutâneo localizado), as terapias convencionais tais como a cirurgia# quimioterapia# e radioterapia# são frequentemente ineficazes na cura de tumores sdiilõl A. imuncterapia (sinónimo de terapia biológica) do cancro é muito promissora no tratamento de vários tipos diferentes de cancro# incluindo tumores metastáticos disseminados (Stagg et al., 2007, Immunol Rev, 220:82-101; Meliet# 2008, Iramuníty, 29:372-383# Melero et al»# 2007, Nat. Rev. Cancer# 7:95-106; Waldraann# 2006, .Annu. Rev Hsd. 57:65-81; Kbawli et al., 2008, lÍpÍmao<||... 181 c2ii|l ||32:|i:| 20-0'7:||iiácoiiié::i':fii |!Íp· Su|ÍH|. i:.: iiviçB®!:; Eíoilor || .....1¾¾ III; 74 -:||i| <I Tem ...gij:ρ;|ί;ρ%;:; slmçpqtãi o f ipgpptí imunitário do paciente para combater o cancro e gerar uma erradicação de longo prato das células tumorais. IÍ::^r'XCÍS5'3 ||V:á:ti;|§§| 'pillpifdiqppA dlfetÇii|;ep!!:|â Jii:idt:er|p:||: f|é ':i|p|rο·:, i.;|Ç;ípi7:MÕ||á:é. seguintes j (1) A terapia com anticorpos monocionais íxa&amp;b) pode ser utilizada para; i) alvejar células cancerosas para déatriflçiil léu :|t:illsa:Íddi: |dp' eptiidptpdS)' :pfpi||jí(;p:ÍS.jlÍÍÍlÍ;l!! con i ugados com uma toxina (por exemplo, M tuxlmab} , o/ou 1 i } bloquear recetoras do fator de crescimento (poo exemplo, Hexcaptin®/; o/ou iii) estimular o sistema imunitário, (7} Vacinas contra o cancro, quo incluem vac mas de cé lulas tumoral s (uuIdiogas ou aloqénícas) , cacinaa antigen teas ο vacinas do célula® dontriti.ca® (Cp®}, vacinas de ADO, e vacinas caseadas em voteres (por exemplo, transferência de gores baseada em adenovirus): > (3) imun orerapias na 0 - espeoi £.·. ca s: e a d j u van tes, que agem p d r estimulação do sistema imunitário de forma maxs gorai e deste modo ativam. cé.i υ.; as /.munes específicas a tumores^ que tendam sido suprimidas peio ambiente tumoral. Isto pode ser real ima do por estimulação ou ativação de células efe toras da imunidade, originando uma reação imune ao tumor (por exemplo, célula® í efetoras, mu cé:lulas®«:f) , cu por inàbfçâ® ou inativação do células com um fendtipo inibitório (por exemplo:, células T reguladoras, ôu. ds/ , Uma: abordagem, como esta, irá incluir moléculas ativas tais come citocinas, adjSvantes bacterlanos, assim como iármacos (Incluindo mAbs) que alvejam recetores imnnorregulatorios (por exemplo, CTLA---4 e CD-40) , Abordagan® adicionais incluem: transferência adotiva de células τ e terapias de redução do T*^,·. que se situam algures entre os dois últimos grupo®. O CD4.:(3 é uma glicoproteina expressa na superficie celular que pertence à superfamiiia dos recetores do fator de necrose turnora i (‘téPr) e tem. um papel centrai no sistema imunitário, É expressa numa variedade de células imunes, tais como célula® B, células: dendritica®, mouóeitos e maorófagos * Quando ocorre sinalíração através do CD40, sab ativadas célula® apresentadoras do uutigeno profissionais (CAàs} (revisto por $ c imo n beck e Lib}.)y, 2001, Ceil Mol bife Sei.,: 58(1) ; 4-43} . O 1igante natural do CU40, designado CD154 ou CD4 0L, é expresso principalmente em linfóci.to T madura® (Armitage et ai,, Ida®, Mature, 351 í 80-8:2 ? Bchonbeek et al,, 2001, Cell Mol Life Soí,, 58),40-433 van boot on at al,, 2000, J, Leak. Biol., 67: 2-17; Quezada et al., 2004, Annu. Rev. Immunol., 1 22 : 3077-328) . A Éi:¾¾22:x-Q·;l|§||§ 111104¾ dN^|Í|j|i;J:Hi 11vário» evento» ^:p:o:s;11ií:|!|íó,1_ui-i.:r-^c|o: ||;|||vi||:S||| de|::bé|Í4..|l|ii(1 7:J;fápué||. 111 FP;||§l|o de |piÍÍÍ|nii£S: 11 j; II! iólionlelp et, |! 1 |;0||if :<|i||l|lddl. J|| £:e||l|:i llllll: 4 01-:4: lOlNaS; 0 i; :í ífeoten et ,f iOÈiOy i |ii|ii B:í o.i1| 6|1|| il llllll. |;i|||í4.zagâ:l| ^;^.Ι|Ι|ί|ρ:ί5j|i!ll!||p;3i p§|á 111 | ......d:i!:|at:p:||p' ||||||:|)ΒπΡό:|::|®®· (ipS: |||||i§;:láS |Β·| | e OS !: Ν'
1 ::p§mSl|d|' ei|il||:l4 f I pullllDá |l|||||.g £uff|doMl ::: j;ló ;; N imunoô suprim1dos (toy et al., 1993, J Exp Me d 5:1567-1575; Siepmann et. al., 2001, Ixnmunoiogy 3:263-272; Allen et al., 1993, Science, 259:990-993). Ά estimulação de células apresentadoras de antigenos, tais como as células β humanas e células denditricas com CD40L recombinante e anticorpos anti-CD40, induz uma suprarregulação de marcadores de supo.Í.licie, tais como o CD23, CDS0, CD36, Fas e MHC II, e secreção de cito cl. nas solúveis, por exemplo, IL-12, TNF-y e TMF~« (van Kooten et al., 2000, J Leucoc Síol,67:2-17; SchonbecK et ai., 2001, sapralllilo óditHlp Se :uri|lp^ células dend.itricas estimuladas pelo CD4G podem ativar células || ΐ efectoras específicas a tumores, que têm o potencial para ;::|!ixliil|í||ãil cêl||iii||tir||araí:S { van Kooten et al«, 2000, J Leucoc | !!!|i:dÍ2'6l!cl|:17.; 'i||||:tpitiy:cr et |li|||,. 1S9&amp;*...............Mature Mspitigil | !!!:|| :?íq-II l|lli, A expressão do CD40 ocorre em muitas células normais e em | células tamorais. Por exemplo, todos os 1infornas B e 30 % até 70 % dos tumores sólidos têm expressão de CD4Q. Os melanomas e carcinomas pertencem aos tumores com expressão de CD40, Está bem estabelecido que a ativação do CD4 0 é eficaz a despoletar respostas antitumorais (Tong et ai., 2003, Cancer Gene Therapy, 10(1):i~!3; Ottalano et al., 2002, Tumorí, 63 (5):361-6), O efeito da ativação do CD40, que contribuí para o impedimento !!!|:§|:: ρί||:|;ό:ί&amp;οη1|| t illipal, envolve pelo menos mecanismos de produzem uma resposta de células T especifica a tumores, um efeito apoptótico direto em tumores -D40'-po8.Í.L,ivo^f esi...irn.Uà.;:;Vr, uma resposta humoral que leva a ' !<*m,nem xoram i eraLados efeitos antituxnorais por. ativação lillil Ilril ...........S i.....iiyi | bfíQj 11 ||l:: e!lÍSí 11111° ^||i-, HN4||||feg;,;í#yiill| 'Wifuíplf; li lb|f ^J1|||: Pl|||xf a|ierra;p|ca.||c|| ^||Í||:i|pV;t
PpPPiyí f5®'1pip!;efHf '/α íortemeri'-o ϊ|i|iqa ao aparecimento i;cillPilci|1 PP; ••Unfôcitos T citotóxicoe eSpeeificos a tumores.
Foram propostos adjuvantes Iparia p| vapipip ;|óP p eaaoiçypii: envoiveado estimuiaçao de CD40. Foi demonstrada uma prova de oonceiuo p£w~chnicd paraa anticorpos agonistas de CD40, em várias formas de cancro (Kalbashi et ai <, 2010, j
Immunotherapy, 33:810-81¾. Loskog et âLí 2009, seioin
Iramunoiogy, 21.: >v I. ~iu /; French et a.l. 1999., Nature Medicina, 548-553; Sotomayor et a.l., [999, Nature Medicine, 5:780-787; etaveley et a.1., 2u03, Nature Medicine, 171:697-707), Também foram realizados testes clínicos para anticorpos agonistas de CC-40, incru.indo o SGN-40 (um anticorpo humanizado que tem propriedades agenistas parciais e fracas) e o CP-870893 (um 3-txcpfpO:í:| 'u:Ê;pppp::|:;pp|)ip:í: |ύ:âgpuiibt a PP; dep pipflri ill sel et iPdll;::.. ie% ..............-Piit-ΪΡ § V4Pnde|balp|;p :2:0p%j| Upda te on '1 .......... | ||t§fÍP|||g|* p|P|ppll |g|,; | Hu|s e|!| |y|f I a|P II 2010, P| ........|| p| ::ii;"p:.0: doedgfntb'^PP 2'P|I/:0:||3;i4fi3|tíivulé|pg§:;s? igqiglop;métodos
Ivipa'PeliPn............ini:b:lqiòí:::':''':de...........Stjgibadedpp. di|..ri:|id|)|ppppp'.fpi pdi|lp| :|. qudlppi|:i.o:'''::P'::; liP7tel:||:dlipp:|%:lp||i| |o|ci||| f .oppc pllpf || |ρ|ρΡ|ρ|.:||:§ s lip! l:::PPi|.'Pp3,;|Pdi;é:, Pp hii||igi:tJPg p.f p dpppppiij) fli f€ illPP i|: p p'f rpgmlphdippppiíié:,.. liiP'lafa||:d::3pííip :P|Pgq;y: gdlgiiig||gb|ppppqiePP slipppi;;n#:xeia||iPp: ler as "ϊίίίΡΙόίρΜβ^^ iilii pppp|:sii:§ PPlgirld P iii '::^iibP||:y^P^^^^LPPPp ^||N#||-^|tÉiÍ;|Í;IÍÍ£XÍ|ii· Pf.P|| í || pÍi|l|P............: ;Pip ||:p||eisPPd|:í:PII:i aír esgebx til|iéi|t éppli |||i g| úé 1 f f4:|pp;pp)|ressp:|i|! IÍ;.............w&amp;UMXMm*.......eti '|uepg®|| |.IlIIldP4pí antigeno CD40 s:::P':::b|Íqq|s:Id'PilpiPglral^ |iTíifed:|í|:dp P:p||:0' p:pp:ÍUM deste Tfiodo 7s:lip;lbi:n;lbPPpp|Ps i:i; Itlplf|pppi|:i|i:|apes pppilir| polo CD4 0. í||| "isJllΙιίΰιΐρ^ΙϊιίΙ;^:::: ÍSí.:tX:'fc::^titlPiP^iÍStaiPl|dP: 0o ||ppdp|i|i|n|p:; WO | Q'0 0 /07 3 4 4 3 lsl|:ollfld;lPl||p .....sll! media-das pa lá; estimiláçáo da sinal i.xáÇ:Ío; do CDl© -pals· CdBd, incidindo canoros·, tala cómó -mexict^s, οοΙηοΙοηοΡοη cam, oe.l ulus S a· tumores sólidos, e doenças au distarlaios· quo tom dma ccaipcsact;® ácCaíffiáBc e/ou inflamatória, incluinte r:ej.elqio de oxglos e de transplante de tecidos,
Me entant©> a a:drfC-:n,ls,C,rá'ÇÍc. sistemies pie anticorpos' CD4Q fox. asseoiada. coir©'feitos secundários adeersos, tais com©· síndroma: de sUoqdó: é· sindrome: de liperfcaçã© de cif.coin ao (can, Bierle ©1 al,, ê'W&amp;2:( tree,.. dstl, ãoad, Sei,. OSS, :Í9jõielteSSil eanMierlo ei ai, , 2 004* J Immunol 17 3¾ 6:753;-"didS} ,
Tend©· em: couta á desorit© aelma, permaneCS: a ae©essa.da:de: de terapias antitumor ais- malãoradas, particularmente anticorpos, agonistas :anCi~GD40 adequados .para atilicaçao· o lia iça·*·· S-araá:r.io·.. .da ,1'ncengãO:. 'tem primeiro. aspe· to, a. .toéençio fornece: pat anticorpo. ou respetivo fragmento de liqáçlo ao antigeno com. èSpOOifiOidade d.e· ligaçao multivalent© ao 004¾ que compreende COR© tal como. de fid Ida a :no; present::© document©:, que retém a· e:spe,©ifi©i dadé de .ligação- Èraitivalente ao 'CDlQ, em que a potência do ásticorpo cu fragmento de ligação, a©, antigeno para a átiçaçlo de células dendrItioas, e maia· alta. que;., ou é Igual .1, sua. potência: para a a t reação: de eé l ula s. B* e er que ο entiGcag© ou fragmento de ligação· ao- antigeno: tem· uia afinidade. fKDj pelo. ίϊΜΟ: de· menos de íxXÍH$ M leu seja,, dpi nip , ólternativament·©, ou adieionaimentS:, o primeiro espeto; da inr-engls fornes©: dm anticorpo: ou. um respetivo. fragment©: de Ligação ao antigen©, cem: Sápeeif i-Cidade. dó: llgs;g:i© muitícaleute as. díMO, que. retám a :e::sp:ed tf 1 cidade; de rigaçl.o .multivalent©: ao C:D4Cg e® que: o anticorpo: ou reap©tiro fragmento' de ligdçae ao antigen©., ó capar de ©msfçer efeitos eifotódrees· duplos na·® células idmorais 10:46:4, (preferivelmente in rimo), O termo· "tefeitos ciictdiicoc duples", inclui um: efeito ηρορρόΡίοο direto· nas células tumor a is ©: um of eito oito: tos ioo indireto; me:diado por células imunes (por exemplo, ddCÇi nus cél U ia S- t:tBBÕ:r:a.l:S „ O termo: ''potência", cora reaps': it o a ativação de células dendr i ticas e a t.ivaçao de células B, quer d 1 rer o ECSÓ para ama tal ativação de cal elas pelo ao ir corpo , fragmento de ligação ao antigeoo, ou fusão, variante ou derivado respetivo. Será aproei add pelos: peritos os especialidade que a potência para ativação do células dendriticas e ativação de células B pode ser medida por diferoutes métodos, incluindo, mas não limi tados aos métodos descritos aos exemplos abaixo. duma forma de realíração, a ativação de células dendr iticas é definida por referência a um ECSO para a estimulação da expressão do: ÇD80 medida por análise por EéCS (tal como no Exemplo 4.) , o a aliveçio de células B é definida por referência a um EC50 para o prol if e ração de células R (tal como no Exorap i o 6; < B sabido que o anticorpo anti-CPiD desenvolvido peia Rfirer, GP-870833, tem ursa potência aproxi.madamente 20 veres maior para a ativação de células E do que para. a ativação de células dendriticas (Gindue et ai., ,2011, Cancer Immunol Tmmuuotberapy f7), 100 9-1017> . iamfoém foi demonstrado que um dos grandes efeitos farmacológicos do tratamento com CP-170003, ê um rápido decréscimo na percentagem de células 8 entre os linfoeitos sanguineas periféricos tPonderheide et al -, 2007, Journal of Clinical Oncmdogy 25, 7, 27 6-88 3} . 0 efeito nas células B pode resultar numa toxicidade limitadora da dose, a ima dose de fret ament o que é insuficiente para ativar células dendriticas< Cs presentes inventores acreditam que a ativação de estalas dendriticas é de maior relevância clinica que a atívaçlo das células B, h terapia do cancro por agonist as de GD4 0 está firmamente ligada a ativação de células T iFrench et al.,: 13 33, Nature Medicine, Si 8-553; van Kooten. et ai., 2000, 3 Leucoc B1 o 1,07:2-17; Sotomayor et a 1 , , 1933, Nature Medicine, SPlRO-ifip, a esta ativação de células T depende da ativação de oéluias apresentadoras de antigeno profissionais, em particular células dendrit icas (Melief et al.., 2000, 75: 23.5--2:82 Ϊ .
Qs pxeseotae dêO:e.uçOleersm clones .de ant ieoxpoS: anri~:CB49 agonistaa gns tern uma. eapâeidade· me Iterada de ativar' células dendrlticas.,
Muma forma- de ..rcalizaçâ©:*. da antieorpds eu fragmentds dê: ligação ao antigen©* da inoençãe* têm uma potência para at.inaglá das; .células dendrllioas: que é: maior do g.g.e> ora igual á.. sua potência para atitação. 'de células Ba Qu* colocado- dê: outra forms.?; ©s gntigorpò.s. dú fxa.§mearde de· ligação ao antigen©* dâ ineemção* tom uma potência para aiitaç:l-0 dê· cela las- B gus:· é mais· paixa, "do quê*. 0¾ igual, e* :s.na atita:ç.|.o de células: dendrlticas .quê: á maior d© quê* da. igual a, .sa:a.;pdt:eoe.ia para atixaçâ.© de. 'Células gendrxtioss.,. 0. 'term© êspeed fieidade do ligação- .in.oi.ui. a. capacidade· do auticsrp'O oa fragment:©: de ligação: .a© arti.:gemo?· da inuênção:* de ligar-se pel.©' m:en©.s· IB teres iiiaie; fort.emênte a© CD4'0: que a. qnalqiier outer© poXipeptideo* prefer imeXmoirte' pelo mends· ·5:0. vezes -nia.i:'©· tortemente e mal,s pre-ferlxelmente: pelo menes 10Ό ueae.s' maia: fortemonta:* .Preterite lEierte* o anticorpo· ©u fragfiieutò de. ligação ao ãnt íg©no* da intenção:* .llgaeãe so letixamente: a© C'PIO em oondi.çOea· fisiológicas· (pox sxemplr© in viMG* ê por exemplo*. quando ©· 004:0 esta pro sente na superfície, celalari < o tsao mfíípx.içgXênfe^ inclui que © antioorp© on. fragmonf o dê ligação ao antigens* da ísxenção-* compreende· dois. ou. maia lenais do ligação d© antigens ©gm espec.i:f.icidade de ligação ao C-D-iO, Fox exemplo,: o· anticorpo^ pede cempreende dois* ou. Pros* ou gnat xo* ou cinco* nu seis* ou ma is* dês tos locais. do ligação a© antigen ο· λ duma forma dê xeul inaçao* 0 anfícoxpc é um •anti.coxpd l gG intacto,* Plwlenfê* ú'G.D4Q é uma gl.ioeproteina expressa na aupexfíeie ©elulaf qu®. pertence â. superfamllia do· reset,ox do: fator de neorose: 'tumoral- (flifr): q tem um papel contrai ftp· sistema imunitário·.,. E express© numa, ea r reded®· de, células .Imunes:* tais coao células· S*. células· denuriCioss * mosecitos* © macréfagos* e. s-l© atioadãs Cítâs protis signals: suando ocorre sinalização atraréa dó CDÍO vreuíwed. by TascI et al,,, 2ÕÒ1, Cell,: Mal. Life Soí,. (SB) , A esptepsão do CD40 ococre era multas células normais e em .células tumorals, La is como li n foras s B, L uacres sólidos, molanomae e carcinomas, Esta bera estabelecido due o ativaçao do €04 D é efieas a de apoie ta r respostas antituíto:raisf e o eleito da ativação do CD10 cord r ifcui para o Impedimento do crescimento L amora i , pelo menos pe.Los mecanismos de a ti vaçáo imune, ara efeito apoptbt1co di.reto era tumores €04Õ~posífcivos e a estimulação de ama resposta humoral que leva: a ADCC e CDut A ocorrência de ADCC e CDC depende do sistema imunitário hospedeiro interagir com a parte Fc do anticorpo, que á determinado pela região cons tanta da cedeis pesada. Das regiões const an tes qae ocorrem na t ar almost a:, o garra 1 é o isótopo que evoca mats eí loa emento o ADCC e o CDC (Janoway' s Immuuohioloqy. 22QS, 7S- edipao, Carland Ceience) , Em conformidade, o Fc preferido pàra os anticorpos da invenção ê am Fc gama I , farendo o anticorpo anti-CDiD um isolípo IgGi, Também seria possível aumentar ma is estes efeitos por utlliaação de uma variedade de métodos conhecidos, tais odm engenharia de Fc (mutações pontuais) o modi fica çooe de glicemos (reviste por Carter, da tare Revíeus Immunology, 20uo (6), 343-157). D mecanismo: pele qual os anticorpos ativam 0 C3AS nas células dendriticas e células 3, e dependente do epitope no CD4 0 ao quad, se liga e da mui timer i ração do recetor, A dimerimação do reootor de €04 3 pelo anticorpo bivaleute euemplar (lyGl) da invenção, é vantadqsa: pelo sou efeito agonist®. 0 termo "CD4ff inclui qualquer proteína natural ou s i n Lèt i ca com. identidade estrutural e/ou funcionai com a proteína CD40 humana, tal como definido no presents documento e/ou variantes naturais respetivas.
Fretemivelmente, o CIMO é CDdO humano:, tal corno o hniProt Aceasion l5, 323342 e GenBank Ac ession N°. AAB12419,
Fc entanto, será apreciado pelos peritos quo o 0040 possa ser de qualquer mamífero, tal como um mamífero domesticado (preverivelmente cem importância .sgrieoXa o®. comercial ineiulnde:,- um eavãl©', parco·, vaea, ovelha:, oi:©· e galo:},: 0 tecmo "proteins .mamífera**' íncini qualquer proteína encontrada. ear derivada a partir de, e/ou isolada a partir de, uma- ou pais· células de um mamiferoí por exemplo, o tsrmo: "proteins humana'í inclui uma proteína encontrada em, derivada a partir de,, m/úu isciade a partir de, uma ou mais células de um .humane,: "Tal como: discutido acima., os anticorpos: e fragmentos de ligaçlo ao antigenc, da intendi©:, são éapâxes dê· ativar células B- e células dendrlticas. lé 'Cé&amp;s pro firo íónais, tais amm·· gs· células dendrlticas, aso ativadas quando ocorre sinalização: através: de tD-áU, que déspoleta vários eventos Molagicoa, incluindo· ativgçlo1 de células Imunes;, pro.l..if©.rsqa.U: e produção de aitdOihds e: quimlocinas,, São conhecidos· na. especialidade métodos para a. detéchdhâção da ativação de oéialas dendritioas (discutido, por exemplo:, em ΒοηοηΡβύΙ:. et a.l, , fiOl, Cell Mol Life 301.*., SBrd:0'~:43.í ran Boot un et a.l.., 2 O OU, J. Le.uk,, Blol*, 67?· 2-17} e .sâo .descritos· nos Suemples anexos, Ά estimulação do oélulas B humanas coxa. CD4Q1 recombinante ou anticorpos 'ânii-d-DéB indut: uma sugxa.rregaXgçle de. marcaderès de superfície, taiS: eomo o GBr.S, GD:30·, 01330,· CB8i;, Eas e HHC 11, secreção: de eitooings solúveis, por exemplo, XL-li, TtF-r o TMF^g., e· agregação. hemeoCipiCà, Sã© ©enhetidos na especialidade métodos para s determluaçao da ativação de células B .réluoronadâ. com o. bdíB (di sent ido, por exemple,- em Schonbecfc. et al., 2301, axpra) e sae descritos nos; 'Exemplos anexos,
Ou anticorpos, e fragmentos de ligação: ao· antigen©, da. InVènçã©·, foram: otimitados de forma ã fornecer uma. potência, .melhorada, para a ativação' de: células do udr it. lea a * ditna fdfxaa de rsaiixaglo, a potência para ativação de células dondrit.roas é aumen.ta.da selef ivameríte em relação i potéhcia para. a ativação· de células :B;, •Mo- tem conhecidos :na.: especialidade »éto.do.s e analises I para p|§§||c0;a §i|: |tfi|ntic|pp|> pail
II :|çlígí|. ofôU^a:;^ a .^liíll^^clirí i X
Por exemplo, a ativação cie células deridriticas pode ser avaliada pela medição da suprarregulação de .marcadores de superfície celular, tais como o CDBβ e CD80 (ver Exemplo 3}, ||p;|o:a ,ΪΙ^!.^ί 111¾ de |e.l|al.a|i: :|!:|J|i|Í||é^iiÉ^. a..lpç:^;;.....;a^|iii;:ddipp|| shÉdmS&amp;lP E&amp;imp|ó i iãlijsçò
Da mesma forma, a ativação de células B pode ser avaliada pela medição cia suprarregulação de marcadores de superfície celular ;ta.l como o CDB(<; ver Gladue et al,, 201.1, supra) e/ou pela me d I ção|dilpudill(f|riç§c||s :|||||in.d'u||ida por WsMi/éprpiiiil: II ί|νο.|| (ã||eíi|glb ISlslilllléll||||1|
Os anticorpos e fragmentos de ligação ao antigeno, da invenção, ativam células dendriticas pelo menos tão potentemente como ativam células B {por exemplo, tal como determinado pela II medição |da suprabrief:ulação||do (pDi0 e:0,ou 0|:||;||0|1|k|ifpsiíã#i ~ 11 'írn '0 ( ;C#: 0ã|||:Çt|çdp:d £0 |f C S0fsf(ff ipS' frã0p:e|f :Ól(((:dÍ; 10 f g(0ç;Í:©(' |Í1|| ,:s:s(f:hffgé;hb0s.......podem t»!' duas vezes mais potência para a ativação de células dendriticas versus células B, por exemplo, pelo menos três vazes, quatro vezes, cinco vezes, seis vezes, sete veses, oito vezes, nove vezes, dez vests ou mais, maior potência para a ativação de células; dendriticas. 0 termo "anticorpo" inclui moléculas de anticorpo substancialmeute inLaotas, assim como anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos humanos (em que pelo menos um arránoàcido é matado em relação aos anticorpos humanos que ocorrem n.aturaimente}, anticorpos de cadeia única, anticorpos !!i(!0. específicos, cadeias pesadas de anticorpos, cadeias leves de Anticorpos, homedimeros e heterodimeros de cadeias pesadas e/ou leves de anticorpos, e fragmentos de ligação ao antígeno a derivados do mesmo. 0 te também inclui moléculas tipo Anticorpo gue podem, ser produzidas utilizando técnicas de Apresentação em fagos (phage-display; ou técnicas de seleção Aleatória para moléculas. 0 termo também, inclui todas as --lasses de ant 1 corpos, 1i(d:C:liii|ldo(0:: I||Gi IgSfii IgM, IgD e TgE.
Ill Tal COiiK) '|: ãdf plpp|afeãdÉpif: É® IlililS IIIÍBõIiiribf na φφvençâo |||:: au||igtg§:' tpiPsÍ!T:áÍ:|:" F(ataf}2f Fv e outros fragmentos respetivos que retêm o local de ligação ao antigen©, De forma semelhante, o termo ant.1 corpo" ino.!.u 1 cierivados genetiearners te modif Içados de "llliptlpdtpcfÉ 111§ 1 |||p;d|f:|||||i;|pê;|;ílas.....|:v||||fe·. cadeia|'única (FVcu}.......................... ê |!P|Ínm|i:n |§3 l||l:|ol|i :|T:g;iÍt:fr llllpodem £ §# 11 :||||o rie|:|)i|| ®|çf Jy ÉÉÉpfeeÉ1^ ""iipillil; ||::Os domínios:p|r|p:i|eii|s· do"""" lilidtlieipdi a§tdpeip:f ||li|||| |||iil:|;iil;;:' que ϊ foi|||ρ§1|ί| í §q® It% c einêbtÉP:::,.,.pidr ((?:"e t iftiêAMas iniciais | W"! :|l:q|hiii | de.......l|ptq|:êf:|pli............fo"x........ .êpçbht............... ................poÉidilÉf | íiQiílin 1 És Js ve..i "::de |\::pl|í^diillsstpddpia. podetf ((per ftmdi;dÉ;oÍ: Jid#l !#o#ltí|ÍÉ! I ddllilf ·:ϊ;ί^ í:|fumi|fÉ|:s.....de "1|||||| madlÉÉI |i; cpÉ É! P iltl éilpb |r e.ç uíf: :ant ;e:|pet;eqll|p|ps'pe cl' f i cidade..........:: anti.géni.ca do anticorpo pai do roedor (Morrison et ai,, (1984) ...... Proc<.Na tl. Acad. Ser. USA L.1, 6851-6855} ,
Também são descritos no presente docuraento, variantes, ...........fusões......:1:(¾¾¾ I PP:^Í $é 11||;||:|||||η:..... anfcígeno, da invenção, assim como .fusões de ditas variantes on derivados, desde que tais variantes, fusões e derivados tenham :: ,:éÊ&amp; i iei""" .íé.,- ativação de céluidilidépdir.If|:ρ§| s:p:I||ÉÉIÉ......^dipi|<lp qi^:l!il!ii|i!l: igual à, potência para a ativação de células B.
Como os anticorpos o fragmentos de ligação ao antígeno 1.1ΐτ|1 ii WB\â I ( iíeíâj^:^^1 I lpd;||ipppt||||i:i l" ,#u.r idrlbiil' f usoe élll e (l:d:p i||t'aqg:||:: (p#:e:pdipg:s:|: [φφ£ adt' i:c:dt||a.............W............. respetivo fragmento de ligação ao antígeno, tal como definido no presente documento, podem ser feitos por utilitacão dos |Ífq|tçÉd'S'.....ii'^ bera conhecidos na especialidade que utilizam os polinueleót idos recombinantes (ver exernp ào, ver Molécula r '_-i.oni.ngr a .Laboratory Manua.;., _> Uvj.Lyao, cambrc-oR. 4 Russel.i., :2:001, Gol4 Sprinq Harbor haborafory Press? ,
Ass I τη, sari antes, fusões a derivados do aniiOQfpb ou re spot iso fra f menu o de ligação ao anti gene, tal como definidos no presente doenfaento, podem ser feitos baseados na componente polipeptidica do anticorpo ou respet i vc fragmento de ligação ao ant igeno„ D termo Efusão", i.noiui O: dito polipeptideo fundido com qualquer outro polipeptideoPor exemplo, o dito poiipeptícleo pode ser fundido com um polipeptideo tal como a glutationa S-t r.vcns f erase (GSTi ou proteína A, de forma a facilitar a puriflcação do dito polipeptideo. Exemplos de tais: fusees são bastardo conhecidos pelos peritos na especialidade. De fôrma semelhante, o dito polipeptideo pode ser fundido com um marcador de oligchistidina tal como o Mis», ou com um epitope reconhecido: por um ant i corpo tal como o bem conheci do epl topo Mpc-tag:. lambé?u estio inoluidas no ambitç da intenção, fusões com qualquer variante ou derivado do dito polipeptideo, Ά fusão pode compreender ou consistir numa porção adicionai, que confere uma caracterIstíca doseiéve 1 no dito polipeptideo; por exemple, a porção pode ser útil na deteção oti isolamento do polipeptideo, du na promoção: de captação celular do polipeptideo, A porção pode ser, por exemplo, uma fração de feiotina, uma fração radicatira, uma fração fluoroscente, por exemplo um pequeno finoróforo ou um O uoróforo de proteína verde fluorescente: G5FP)., tal como é sabido pelos peritos na especialidade. A fração pode ser um marçader .1 munogènico, per exemplo um Spc- tag, como é saindo peles peritos na especialidade, ou pode ser uma melecala lipofillca ou dominiç pclipeptidlco que seja capa7 de promover a captação celular do poi ipeptu.deo, como é sabido pe ios peritos na és peei a li dado, O termo -'variantes"' do dito polipeptideo, inclui inserções, defeções e substituições, censereativas ou nâo-conserva t ivas. Em part i çular, incluímos variantes de poli. peptide o onde essas mudanças não alteram: safestanoialmente a atividade do dito polipeptideo. As variantes poderá incluir, por exemplo, variantes alélicas, que irão normalmente, diferir da sequência dada por apenas um, ou dois, ou três, e norma intente não ma is do que 10 ou 20 resíduos de arainoàcidos. Normalmente, as variantes têm substituições conservadoras. &amp; variante do polipeptideo pode ter urna sequência de aminoácidos que tem pelo menos 75 % de identidade com uma ou ruais sequências de aminoácidos dadas acima, por exemplo peio menos 80 %, pelo menos 90 %, peio menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % de identidade com uma ou ruais sequências de aminoácidos especificadas no presente documento»
For exemplo, variantes dos. poiipeptideos definidos no presente documento incluem poiipeptideos que compreendem uma .sequência cora peio menos 60 % de identidade com uma sequência de arm noá eidos selecionada a partir do grupo que compreende: ! B|||||§......IÍIÍI; " Si|l||p NÍr2Í; |!||g ID NOlp2§ * |:............................35Q........ID......igilil.................. | l|iil|i!ii:Illè. :Dlil|l:.D NOt'2.8.? Il||ID ||:1¾ j|||IÍI 33 ;1||| I ιφ φ 4 jf 1||i||||p. m; M t allift d μ|||β&amp; ill |1111|:q;||í:4í13úI1||: II. SEQ ID NO: 38; e SEQ ID NO: 39; e tem preferivelmente pelo menos IpO %, :|;d;|i|il;:ipu S 5 d dftlÉIlisdS: lii|ll||||dl:iê lllêllliiiidi-dlff © t||is ql;|?|:il;1:. o .mehbilIfS |3;|1|I|||||| ||! 4||||||||id :#f de sequência A. ;pÉf||tI||I||||§| Bepllldstamíniia, llpdr exemplo, pelo programa LALIGN (Huang e Miller, Adv. Appl. Math. Illiiillí lo|a.|.ll::I't“:3571: nas instalações da Expasy (http://www.ch.embnet.0rg/software./LALION form.html), I utilizando como parâmetros a opção de alinhamento global, matrizes de pontuação BLOSUM62, penalidade para lacunas de |||ρ&amp;.ρ;ρ1:1||.|:ρ:1··|, 1| !pi||l||||i||d# para |||.a:Cuni:|||||;Í|l...../|Í:Í|lSÍll -f!» a: ''pllpipapli !:§ ibpÉlÉlIb 1||Íh|:||||Ío':i#' ||ii|p:ept.íddillllllllil|r |;§§et êrB§|if||i por u|||||||||ipio :d'Ompu|iil;|ii||||p|:|: !ÍxempÍ!!i!!!!!prog do etíe: |p;|x|pi||::|hf||iònp!i|||l||liil.i sophsí§|!|ê |§é|§á li oplibídbp ::de| :i3i0;^^f;:|4'^'íÍ^|S ^ ®tt'‘J;'Íí4''''SR§lll!l^‘ '1 lllfcr€:]lá^i£|:li .:p:p:ilpli|||Íiy^s| cuja f·f .||.itih:a:dí|) $N||||i||j|| ::)bt:idíádÍ131.......... O alinhamento pode a11;ernatxv ameπto ser reaxi2k-.tiO por IlillpCC'lildo progrania ClUStai :M 0.1.·ΐ.ί- O!?:. |i||lifi||:' et a 1. , 19.94, Nuci. Acid Res., 22::4673-4680). Os parâmetros utilizados podara ser os seguintes: - parâmetros rápidos de alinhamento de pares: ^amcinho Oci (palavra) K-tuple; 1, tamanho da janela; b, penalidade para lacunas; 3, número da diagonais principais; :>< Hetocso o.e pontuação (scoring): x por cento. ......11111¾¾¾¾^¾¾¾^ ill : ψ ff If* I i ;Éa'd©^ par;a| 1f j ......lliglbbrfca^ ^^:dill|^â.r:à Μ:0:ύρ#1)):Φΐ:) e|t ensâo; |ΰ|||:§)|: j ......... i; 3331ii:3::Í^ ϊρ.......prdi|(|::|Pá3'pÉífi!'líI |p:fpe ser |||xí|i:||:dp| .........pa:i;®7)d1:l:e:rm:líná'r ||.o-çai..s. ,3 ):)3:)¾ 1'' iiiifidlip.nft"'dpi' )1¾d|qj |b anti1¾¾¾ pode j) !3;:op^^ ........il f oram ..........)6odli:ldd.ddi7iip..................
Os derivados químicos de um o:.: ruais aminoácibos podem ser conseguidos por reação com ura grupo lateral funcional. Tais moléculas deriva t izad-a s incluem., por exemplo, aquelas moléculas em que grupos amln.a livres foram, derivai.irados para formar hidrocl.oretos de arninas, grupos ρ-toluenossulfoni 1, grupos ca rboxifoen zoxi, grupos t-but iioxlca rbani1, grupos cloroacet.il ou grupos formil. Podem ser derivatizados grupos 3i: Ipltbdxil: " ^ίό::ίϊξΐπί!^;:ϊτ''' el!iís.:,.:,:é:|b'q:fei3dél 11))¾ :òOri));^:))^;:p. d. 1; :)3 1):14)1 j: ) i:òp:t:rò;ál)))::|(Í.poS:. l)lld:.:) ;:|lS)t:ét:gS ,^1).::14:1)01¾¾))¾¾^1 “ )))¾¾¾¾^ 1¾¾) 1 ))):)dd:r(i1Alíá(adòS' |pupbs Jiiáppillb.....ÉivtdÉlpál'â3.adt^|::|)em derivados;;;; de 0-acx). ou 0~alqu.il. Também estão incluídos como aenvados quisdeea aqueles péptidos que contêm derí^e^03 arnííioàcidos ))) que :::¾¾ 1:¾¾¾ ):!:i(ip:fc|l))1lf 1¾¾f 1 §)§:|*tSqi|)))f PP))) ):.) 1 exernp 1 f>:;:ã)''d3|||i:gpdd1pf p:j| linalípbbdldé:1).:1¾¾¾¾¾¾ 1:αΑ F'iiil pr l||§|51))):1 3)::á:3; 5-nidrox: 114)lbá)::.,:;^bd#j::í: séí:, é)jh éilbiídi 13 Por )ít|f ·3P:il)j )¾) 11 ).: 3 -me t 1 ihistldina :"ppt):))s:i4)i)i):òΪΐ1|ρρΐ)|3χ| db1:1 11 6astrains;|:)p;;;:;; homosserina pode ser substituída por serins e a ornitina por lisina. Os derivados também incluem pépt.idos que contenham, uma ou mais adições ou deleções, desde que a atividade requerida ......." I#i"' mantida. Outras modificações incluídas sao a anudaçâof aciiação do amino·· terminal (por exemplo, acetilaçâo ou arai dação do ácido tiogli eólico), arei dação do car.box li ••terminal IIP*!poripdcmpild j:/ Çpfr iámghl.á.dd cti me1r1 am .1 na) e as modϊ i icaçoes dos terminais semelhantes.
Será adicionalmente apreciado pelos peritos n.a cspec i a 1 idade que compοet os ρePi -* òomiíuot ιοο·3;||^:^|δθ:©|^|||ρ^ό^,:,:§θ::|ϊ:: sp ppppp||::f:É:i::i......0 isrmo "pept idomimét ico'' :|!||re-se :||||s p|||||p....... ...............m 1 mc t i.:|:k .:;i á I:ÍMÈJ:d::títi:çád:í''' !p;Í:Íd&amp;:P® PfiPliPieas llflf'e:ÍÉi®-* ® "tiápÍii;:ddpppá;:t:feJdu i, a:tfigpõimg1' agente 11erapeni 0:.5....................
Por exemplo, o dito polipeptideo inclui nâo apenas moléculas em que os resíduos de arainoácidos estão juntos por ligações de péptídos (-co-pH~) ?nas também moléculas em que a ligação pept idioa está (>-j;/er trida. láx* pept^oomrmericos .....
PpPííi.hep:: ql-íldádévt;· ti S l;# ,|£θΧ$0:iipp P ilp® IP3Jd?iifílti· ® ^ l:spp dl®Pp T Ρ|^^·::ΡΡ:ί: 11. Meriere ®ΐίίρΐ , | ;|ld||.f s^y^Π1®#πΙ1Ι' 111® ®|®3|®1'........É&amp;Íi|......' abordagem envolve fazer pscuou.p^p·... J..O.·.-.-. que -...o nt 4.·; m muoanças que envolvem a cadeia príncipef e nào a orientação de cadeias laterais. Péptídos retroinve*sob, que contem ligações NH--CO era vez. de ligações peptídicas, i?ão 'T’UiLO Πβ:13 resistentes a pfoteólise. Alternativaraente, 0 dito po.iipept.ideo pode ser um
I d|r|ii'|tí| ;ίίίρϋ:4:ίρ€ίίίί.·£3·όηΐ^ϊϊ^^,ί!:Ι:^|^ :;idi®ppp|||ssiS:.......111*1®®! re»-iduos de "::S p Iaminoác|diçiléltlio|l1®'|c:ll:i® ÈiilÉÉil® Íiii'^*·|:1 iPtf lugar da ligação amida convencionai -
Nume alternativa adicioh®^·' C! •'^•iJ^v-o p«pcraica pode ser compretamente dispensada desde que ej« utilizada urus. tração de ligação adequada que reter-hs o espaçamento entre os átomos I :déi çáptqdt! dos resíduos de airrnoácldos, uooarâ <v.er vantajoso para a fração de ligação ter substaneíalmente a mesma carga de I di s t ri bu içá o eis sufod tállç láiiáehr*·· lÉllfliíi®1 Ρα a - φ 1 :jg| a d g ç que uma .1 igaçâo pept idica,
Será apreciado quo o dito podipeplido o poda sei' bloqueado convenient emente no seu U~ ou C-terminal , para ajudar a redusir a susoeiui bi ! i date à dlqestêo exoproteo1 itica ,
Também foram uti lizados umá diveχa i dada de aminoacidas não "codificados ou modifica doo,: tais como S-aavinoá eido®: o aminoácidos M-metil, para modificar pêptidos do mamíferos „ Adlcioualmente, pode ser estabelecida uma.· presumida eonformaçáo bleatíva a través de ama modificação coso lente:, tal como uma cicliraçâu ou por incorporação: da iacxama ou outros tipos do pontes, por exemplo ver'feder et ai,, 1978, Free, lati, licad. Sei v USA 75 : 2636 e Thureel 1 et a 1 » < 1983, B ioohem, Btoqhys. Rés, Oomro, 111: IBfb
Um teria comum entre: muitas das estratégias sintéticas tem sido a introdução do alguma fração cíclica numa estrutura baseada em pêptidos, A fração eicliea restringe o espaço eonformaciooal da estrutura peptidica e isto resulta frequent emente numa especif icldade a utser i.ada do péptido para um recetor b.·.o lógico par ticular . Uma vantaqem adiciona l dest a estratégia, ê que a introdução do uma fração oiolica num péptido pode resul tar também, no péptido ter uma senslMlidada diminuída a pept idases oe 1 a iares <.
Assim, polipéptidos exemptifirativos compreendem cu consistem de aminoácidos do oistoina termina 1, Tal pclipeptídeo: podo existir numa forma cíclica netorodétíoa pela formação de uma li gação dl ssul feto dos grupos mar capta no nos âmincácldos: de cisterna terminal., ou numa forma Pompdéfelca peia formação de uma ligação peptidica amIda entre os aminoácidos terminais. Tal como indicado acima, a ciclia&amp;çáo de pequenos pêptidos através de ligações d issulfeto ou ámida entre as cisteines M~ o C··· terminai podem circundar problemas de especificidade e meia-vida, âs veres observados com pêptidos lineares, decrescendo a protediise &amp; tampem aumentando a ricider da estrutura, o que pode producer compostos com especificidade mais elevada, Os polipeptideos cioil cades por ligações tíissui feto têm terminais amino e carbcxi livres, que podem 0 ex ainda suscetíveis a degradação preteOiitica, enquanto peptides c i c lixados por fot mac ao de uma lígaçic am ida entre a amina N-terminal e o narboxi1 b-terminal já não contém terminals amino e carbox 5 1 i vies , Assist os popt i don podem sex ligados pur uma ligação C~M ou 1 igaçao dissulfeto. Λ presente divulgação uno está limitada de forma alguma pelo método de cioiisação de pèptidos,· mas engloba péptídos cuja estrutura oiolica pode ser slcgopads por qualquer método oe sintesé adequado, basing 1 ignores haterõdéticas podem, i eclair, mas nao estão limitadas a formação através de pontes dxssulíetog alguileso ou solfeto. Métodos de síntese de pèptidos homedé ticos cíclicas e pèptidos bete rodo ticos cielioas, incluindo pontes: disoaifeto, sulfeto e alqui leno, são divulgadas na patente dos EUA §€43112:, Outros exemples de métodos de ciclíaaçlo são discutidos e divulgados na patente dos EUA 60080©8, lima abordagem adicionai à síntese: de compostos peptidemimá ticos cíclicos e scab li irados, é a. meta tose de fecho de anel (Mfãd, Este método envolve etapas de sintetiraçgo de um percursor peptd.dLco e de pô-lb em contato com um catalisador MFA para productr um pé pi ido restringido a nivel conformational. Precursores peptídicos adequados pedem center duas ou ma is ligações C~C íns aturadas, 0: método pode ser realirado por etlitração de técnicas de síntese peptidies de fase sólida . Mesta forma de raa li ração,· © precursor, que esta ancorado a um suporto sólido, é feitO: eonfeâtar com um catalisador MFA e o produto é então clivado do suporte solido para p rodos i r um peptide rest ring í do a uivei eonfermaeional.
Outra abordagem, divulgada per E, H, Rich em Protease Inhibitors, Barrett e Sei veste, eds., Elsevier (198 6}, foi a de desenhar mrmícos peptídicos através da apl icaoâo do conceito de análogo do estado de transi pao no de sonhe1 de inibídoúes de encimas. For exemplo, è sab ido que o álcool secundário da estalína mimetioa o estado de transição tetraèdrlco da ligação íissil de amida do substrato de pepsína,
Sm resumo, as moOitrcuçoes terminais são úteis, como é sabido, para todunir a suscetibl iidade por digestão de proteinase, e portanto, prolongar a mela-rida dos pèptidos dm soiúçdes, particularmente em fluidos biológicos onde podem estar presentes proteases». A oiclj.caçib polipeptiárca tãmbéís é uma modificação útil, devido as estruturas estáveis formadas por oieiioaçâo - tendo em conta as atividades b:l ológicas observadas em pèptidos cici icos,
Assim, o dito polipéptido pode ser píciiç:©, Mo entanto, o dito polipéptido pode alterna!ivamenle ser linear.
Preferivelmente, o anticorpo ou respetivo fragmento de ligação ao antigeno tem: uma potência ma is elevada para a ativação de células dendriticas que o conheoido anticorpo aoli-CDiO 'VB44" (cujas sequências de aminoácidos são mostradas n o llxempj o 10 aba i n o* 0 anticorpo agon is ta B44 te% origem na biblioteca. n-CoDeR®, que ê biblioteca de exibição de rragmenios de anticorpos: Humanos, e propriedade da Biolnveri International A 8 (RPderlind et a 1 . , 2000, Mature Biotechnpl *, 13:852--6; WO 08/3284 5) 0 anti corpo B44 tem uma constante de afinidade moderada a baixa (Rb) de 1,7 nM, e potência moderada tal como defer rd. nada in vifcm (EJ.imarb et ai,, 2008, immunoiogg, 10 δ ΐ 456-483:/ Silmark et al,, 2008, AIDS Research and Human Retroviruses, 243, 387-372) , A afinidade e potência do anticorpo agonista Bi 4 tornà-o inadequado como anticorpo agonist a anti-CDdu cii ni carne nte e fcerapeuticamente relevant et
Mais preferivelmente, o anticorpo ou respetivo fragmento de ligação ao antigeno, tem um potência para a ativação de células dendtiticos (medida domo um ÉdSO’, tal come de sor it o no Exemplo 4} de pelo menos 0,5 μα/ml (ou seja, c SC50 é maís baixo ou igual a 0, 5 gg/ml) Ror exemplo, o anticorpo ou respetivo fragmento de ligação, ao antigen o pode ter um EC50 para a estimulação: do €080 {tal como raedido no Exemplo: 4) de menos de 0,5 μα/mi, por exemplo, menos de 0,« pg/mi, 0,3 ag/ml, 0,2 pq/rnl, 0,1 pg/mi, ou menos de 0,05 μα/ml. 0 ant-1 corpo ou respetivo fragmento de ligação ao antígeno, melhorou a especif icidade de ligação ao CD40 relativainente à 4 llllillll:
No que diz respeito a especi í.1 cidades de ligação dos anticorpos, o parâmetro cinético que é referido de forma mais comum é a afinidade global, normalmente expressa como a constante de dissociação (KD) . Este parâmetro estático reflete a ocupação relativa de ura recetor celular em equilíbrio e é relevante para administração sistémica- ΙΊο entanto, durante a administração local, o anticorpo pode vazar da área do tumor locai e o tempo de reação ê assim limitado. Portanto, uma taxa de associação {"on-rate") alta íka alto) pode ser muito importante para o efeito clinico durante a administração local, dado que determina o tempo que demora ao anticorpo atingir o equilíbrio (Katakura et al., Journal of Molecular Catalysis, (28), 1B1-2Q0, 2004 ) . Adicionalmente, uma taxa de dissociação ("off-rate") lenta {kd baixo) pode afetar a duração do tratmento, e pode servir para limitar o anticorpo à érea do || Ifuiir, mimiilizaillid Éxpobiçiç ,Q:^; pa.f-a medir!!!!!! ! #:;fin;i!lll!!!!!!|l!|li ΐ!ΐΐ!|! o!!!!!!!! d!!!!!!a!.!!di.!!çip' pi!!|!!!!!|!!!!!^ | .......#:OÉb!ÍmaJ!:h|!erãçI!Í.....iiiil!!!!!! um anticorpo e um iigante). São descritos métodos in vitro exemplificativos nos Exemplos anexos. Também é concebível utilizar métodos baseados em. citometría de fluxo (Sklar et al., J!;!Í!!u!!!Éiy. Bd. :s|Jp!!: f 2002)
Numa outra forma de xearizaçao preferida, o anticorpo, respetivo fragmento de ligação ao antígeno tem uma taxa de associação para o CD40 mais alta qu.e a do anticorpo B44, por exemplo uma taxa de associação (ka) superior a 2,7 >; IO6 Ms, e preferivelmente uma taxa de associação (ka) superior ã ! i|y||| 10'Ê'f|!!!!!!!!!!!!|!! !|pu !||òix !|Q'6 j|b!!!!ií;©! j s,i! x!i.oe!i|ll liil! 1 (b!i!!| io.s iflflil 7| &amp; x |!|t!M:s| òíí.íí-8^íí£|ii i|<!iiΐ#δ!ρ@ζ ou 1,0 x 107 Ms. duma outra forna do roa; ; zooao preferida, o art i. corpo, respetivo fragmento de iigaeâo ao antigeno tem uma taxa de díssooiaplo para o CD10 Mis Isalxa quo a do anticorpo B.4-4, por exemplo uma fcáxa de dissociação |kd| inferior- a 1,5 κ ID"3 s, e preferivelmente ama taxa de dissociação {ka} inferior a 3,0 x 10't s; ou 2,0· K IQ"3 sj ou 1> Q x IQ'"3 Sf ou Β,ϋ x líi'3 tf ou 8, 0 a IO"4 s; ou 7,0 x 13'·· a; ou 6, 0 x 10"5 s? ou 5,0· x Ifr4 s; ou 3* 0: x: 1Q''3 a; ou .2U 0 x 10"'4 su ou 1,0 x IO''4 a? ou 9,-0 X lift s- ©u. i.j 0 X IO"3 s.; ou 7, Ú x 10~s s; ou 6,8 x 1D~S Bf Pu St 0 x 1D~S &amp;ϊ ou 8, D x XO"3 s; ou 3, Q x 10"3 s; ou 2,0 x 10-"s ao ou 1,0 x: 10"s a.
Huma forma do rea)iração preferida, o antioorpo, respetivo fragmento de ligaçao ao antigeno,: tem uma afinidade iKD) para o CPI0 no intervalo de 1,0 χ 1ϋ"Λδ S até 1,0 x 10" ·1 d e uma taxa de associação (ka) para o CD4Q no intervalo de: 2,7 χ 10" M até 1,0 xli) 3 M< domslmente, a iuveupaò f ornece um antioorpo ou respetivo fragmento de ligação ào antigencç com: a afínidade para o CD40 locai irada na s uporf loie de uma célula, O termo "locaiirado numa super£lote de uma célula" inclui o significado que o CD40 está associado com a célula tal que uma ou mais regiões do GDiO estuo presentes na face externa da superficie celular, for exemplo, o GDI0 pode estar inserido numa membrana plasmatics da célula (ou seja, orientada como uma proteína transmemforanar) com uma ou mais regiões apresentadas na superfície: exf racelniar . .ftlternstivamente, o CDiO pode estar no exterior da célula, com interações covalcnt.es o/oa íó&amp;ieas que o loca Irram a uma região especif:;.ca ou regiões da s upe r f i o i e o e1ula r,
Assim, o termo "superfície de uma célula cancerosa" inclui o significado que o·· CD 4-0 está Idea lira do: da tal maneira em-relação a uma cu mais cèlu.1 as derivadas a partir de, ou oaractsristieas: de, uma célula cancerosa o a tumor. duma forma de reaií aaçao, o anticorpo ou respetivo: fragmente de ligação ao antigeno, compreende ou consiste de um ant1 corp a: in t a at o. dl terna tiramenfe, o anticorpo ou .respetivo f.raiment·'©· de liqaga.© a,© antigeno,.- oomprea nd-e on eonsisle da um fragmento da ligação a.o. antigen© sslae ion ado a partias do grapo qua consists emi am fragmento Fv (tal games am ,fragment®1 ip da sa.ds.ia. deles,. on um. fxagfflènto Fm ligado por disstrl fete) ,. e a®: .fragment®: FaP-~iiM tial som© um :£ragmau.fa Fall dm: fragment:®1 Fas* on pm f raqment®: Fisfe) g) ,
Bor edemplo:, © .fragment-® dp ligsçlo as antigen® p-ode; sempreunder urn ssFs, 0 terra®· '^oxeeulas: saFf", inelui moléculas s® mm -op dominios pareelfog % a Pl- ©st;a®· ligados; straves da urn o ligopeptide© flexirel, âs poteneiais cgnt-ageug· da uti.lirsç.âd de; fragmentos· de anticorpos,: 'em pen de anticorpos. inteiras.,: são· mu i tan. d 'tanMnlio-pequeno des -fragmentos. pode- 1 e-vat a. propriedades fafmsdoidgieas: me 3-.0® radas·, tais edmo uma .melnet penetraça®· no local. alsG„ &amp;s Funções efetoras dos antl.corpos inteiros , tais gema. &amp;. ligaça© ·οα®ρ.1 ementar,: see removidas·, fragmentos de anticorpos· Fad, Fv, SPFc é. d/\b pode® .ser t®des: espress·®·® rá,· e segregados a partir dag jS«.o©i-i, permitindo assim a. produção: fioil de grandes quantidades dós: ditos Itagmentos..
Preferivelmente, o anticorpo-, respetivo-: fragmento- <áe 1100:9:1:0:-^0:-:^01.1:500-0.., da. irvsnoao, ê uma molécula recomginante-, ãpos-ar .dd anticorpo poder ser· um anlied-rpo· poli o lona 1, e preferido: que sega um anticorpo monoclonal, ou que- o respetivo fragmento de; Ι,ίΡύρΊΟ1 ao -.antigen®: seda derivado de: u®.: .dnt:ido.rps> 'taonooi onal *
Podem, ser pregarqdos aftti-Gorpds .monodlon-âi s adequados pélas teoni-ca.s eondeoidas, por- eremplo aquel-as: divulgada®: em ^oncolPinai -AntiOddie.sí d manual ©£ 100001:5003^,- H tola fdR© Press, iSid ) e em. "Honodional, Mpfer-idorna ãntifeod-iC-sx Techniques and ãppl1001100^, pSR Eurre.1,1. .(GRC Press,- ISSll, 'Podem ser produtidos anticorpos :pol...i:0'.l.sna.ís que sejam, p® lie spend fico a eu monoe-speei flees., £ pre:.fe.ridO' que sejam monges peei. f idos-, ΙΙΙΙΙΙΙv;||iiii:f| ||o φ|ό| |||i, | χ|||§ If lif i i i|y||m!blillllb· 1;;; 1 .igaçáo| an L igeno | m huriailillli 'lulaacl ||||# co aíí t i.coa.pos pcmem; κβι an iccuvpoa rummnoc no aa*1*'r 1 cio ^ 11 quem têm sallinciaa ::p||arQi:|g|':cidg;| ;ίί:β|||||ί.^|:|:^^^;ί |i|||||b|d: com eaç-eci i j.cidade poxa. /jprotérpã i/lãlísisídêlrn/rda:o go :í/pxp sente,*?: 11 :::|:gpíÍlqí|||:, í§§ ePtan ttf Éi|| â | 1|f pfi|ií|αφΐ||Ι met.odi.o||;|.ác:||||;|| i|: |f||:.....s:g|p||l|f||φρ''........glia não......it 7111f:f|®::|:Pi!|:J|||'iiif açao ie||||m|:p|i||||i:p'r |pa:mf||J/ ffd/ί:φ:|!Ifll^iililil· ||df poáôiTi || |l|:E'QÍp|ilÍP'S lit φίί|;|::|ϊ!φ^ί ^:Ρΐ|:ρ5:ϊ§Ρ:|^|:|11ΙΙ I |p|md;|p| iii|;|||||.à:0'~h:umaí|| ,ll|il.|ife|iil't.i¥amii't:p:l! M i|á:it:ól; |'|i|i||;|igénico:S |qii| pintem, s de iií 1§|:|ηορ|,||||ρ.ηα huma|:a |l|ppi| ¥.aa.f|taii ;p:|||%:|:|fl · 1.998) Nature :.||i||:iíi|Íbο^|ϊ.||||!||: 1 6, S35|iÍ3|l! i||||pt|:|:|i|:r'p|.s náof|uf|f§ic|| |gstPP^p;piiii;Íl^i^ii^;;;;: t|^c|||||Íi||i|i|ii.s;||ios* ;|ff χ ΙΐΙρΙΙϊαΡίΙΙΡφ#|#ida|fl:; por exemplo por li |l|ts:ei|iiãii|||;|:.s ||:|g i ôe s||:.Df llislián til corpos de / r a to a a estrutura de | |i|xc§xf||l|/ Ι|;||1ΐρ:ηαβν |||
Anticorpos quiméricos sáo discutidos por Neubergcr et ai, (1998, 8th Internat ionai Biotechnology Symposium Part 2, 7 92-79 9}.
Será apreciado pelos peritos na especíalidade que a especi f icidade de ligação de um anticorpo ou respetivo .fragmento de ligação ao antigeno, é conter ido peia presença de regiões determinantes de contp 1 ernentarxdade (CDRs) dentro das reqioes variáveis das cadeias pesadas e leves constituintes-, Tal como discutido acima, numa forma de realização pa rticu iarment e preferida dos anti corpos e respetivos fragmentos de ligação ao .antigeno,, a especificidade de ligação pelo CD40 é conferida peia presença de uma ou ^ais sequências :/:11::do aminoácfd|í: CDB de f i..uid-dd/l:hp Ipliêêápt"I;ppip%ié:pCdí;||::: !|||c| |lê:|||| >sami;n.oâci.|p.||:|||l|||||di?/||I'il 1.,|a|p :|||..........pii|:|i||:|:SS:g /;hdqliilen!o11 f|g 1 ui os vl||tá||ligi,,iiá&amp;id°s|||dr'|:p/ genetícamenfce codificados e os seus estereoisónveros correspondentes na forma t/ç7:il|ll|pçi|>á,rápp com a .fio11ΜNisífçii^ ΐί «mi noácd dos ò|/pggi||| lç|i|f β|; lPgiluiPac:idos quell ò:d|rx§pi ii n a t. u r i m e n. t e | / arai no á c idos náa-conyenciiouais (par exemplo, aminoacidos «,m~díssuPefcitaidos, amínoáctdos N~alquilo, etc. } e aniincácido® derivaiirádos :Ct*et abaixei <
Quando um aminoa eido esteja a ser espeoificamenie enumerado, tal como 'Qua nina" ou "Ai a" ou *"*&amp;*', o termo retere- se a L^alaniua e D-a J an! na, a rate ser que seja explicitamente declarada de outro moei eu Outros eminoacirfos n á o ·· c o n v e a c i o n a i e pedem também ser componentes adequados para polípepf ideos da presente invenção, desde que a propriedade funcionai desejada seja mantida peio pollpèptidee, Para os peptides mostrados? cada resíduo de aminoaoido codificado, onde apropriado, é representado per uma designação com uma única letra, que corresponde ao noite trivial do aminoáoido convencional> duma forma de real.inação, os polipept 1 decs tái come definidos no presente documento, compreendam ou consistem de Imaminoáeidas, 0 anticorpo ou fragmento compreende uma cadeia leve variável (%} em que o CDPl compreende ou consiste ri:&amp; sequência de anu. noácides ; CTQSXrdlIQêdYXavi [SBQ 10 MOilj em que;
Ki é S ou T; e X;: è K ou H ou B OU G ou ti. O anticorpo ou fragmento compreende adicionaimente uma medeia leve variável (V.·,} em que o CDR2 compreende ou consiste na sequência de aminoácidos: X-ítlTflPPS [SEQ ID N0:2j em que; X.i â G ou R. ú anticorpo ou fragmento compreende adicíonaimerte uma cadeia leve variável (%s em que o CDR3 compreende ou consiste na sequêncíá de amínoácídoe: CMmmAKsXMi&amp;IMz (SEQ ID MO: 31 em que: 1¾ é B ou S ou :E eu G ou K? e X;, é S ou T ou G; e | III! è L 'Oil III οϋ!! ί ill L!!!o'i!!l j e ;;!!!||||!.é S ou|Ι|oo|.l|;;! § ! 111! è ¥ ou mi !!!ll Mats ^^·3!ίί||ί^|τϊί^;ίρt; ;; pill; cadela ;;|;1χοί;;;;:¥;|¥ί;^¥θ;ΐ !;;;;|¥i,) .am qoe:;!;!;d !!:lfeÍ!!!!!¥°^|ÍSto||i;;: οΐ|;;;!|; ;; ;ioi;|||;s'te nu:rf|;!!s:eq|i§ild|;a <§| aminoàcídos |;|;;i|;||o;||;|a |l;;;;;||u:p;l;;;;guO!;!!!!!; ;;;;; |0||||!ΐ|:ο βϊ|||;;;;;;;;;;;;;;;::::::!;;;;;;;; '1!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!;^ Ill|ll|l ¢1¾¾ * |||||| "......111||||1 ||!Ν§!||τι |||||| q|G;|;s||||â|||||!!!!;: 111(1111 IHINllfc ? 111!!!!; ':l!!!!!!!!!!!!!!!!!!! !!!!!!!!|11|!! IHINIIII^ > IIIII! I !!!!!!!|!ll! ¢1¾¾]; |||| c||sd|||!ll|¥ie; I !!!!!!!!||||!!! i|!!lll|]. !!!!!!!!!!!
Maia preferivelmente, o anticorpo ou fragmento compreende uma cadeia leve variável (VI) em que o CDR2 compreende ou I consiste cJ^::::.adn.±do giiljie que consiste em: GNINRFS [SEQ ID MO:10]; e :: RMIMRSS::: [SSQ ID NO: 11 j . ·ν···ν····^ o anticorpo ou fragmento compreende uma cadeia leve variável (¾¾ e.m que o CDR3 compreende ou consiste numa sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: CMWDDSLSGLV [SEQ ID NQí12J; e CAAWDSSSSGLV [SEQ id N0:13j } e CAAMDESITGLV [SEQ ID NO: 14};: é CÃAWDGSLLGLV [SEQ ID NO:15j; e ÇAAWDGTLTGLL [SEQ ID N0:17j; e CWWDKSlSGLV [SEQ 1D é CAAWDGGLLGLV [SSQ id NO: 18 j .
Sm formas de realização da invenção partieularme-nte preferidas, o anticorpo ou respetivo fragmento de ligação ao ant.igeno, compreende uma cadeia leve variável (Υχ,) que !;!c|mpreend:e!!;^ :§Í||F* íJ (:í) SEQ ID: NO: 1 &amp; SEQ ID NO;2 e SEQ ID NO; 3; Gu
(ii) SEQ ID NO:4 e 3EQ ID NO;10 e SEQ ID NO;12; ou (ill) SEQ ID NO;5 e SEQ ID NO:10 e SEQ ID NO:13; OU (iv) SEQ ID NO;4 e SEQ ID NO:10 e SEQ ID NO:12; ou (v) SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO;10 e SEQ ID NO:14; ou (vl) SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO :11 e SEQ ID NO:15; ou (vii) SEQ ID NO: 8 e SEQ I'D NO: 10 SEQ ID NO: 16; OU (vlii) SEQ ID NO:9 e SEQ ID NO:10 e SEQ ID NO:17; ou (1¾} SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO:10 e SEQ ID NO:.12; ou (x} SEQ ID NO:9 e SEQ ID NO:IQ e SSQ ID NO:18.
Em ainda urna forma de realização adicional, o anticorpo ou fragmento compreende uma cadeia leve variável (Viá que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo ii lué. conlipl;# em; |||||||| SSQ ID NO:19; SEQ ID NO:20? SSQ ID NO:21; SEQ ID NO:22; SEQ ID NO:23; SSQ ID NO:24; SEQ ID NO:25; SEQ ID NO:26; e j|li||||D:i||il2:i.. lliillllllHiii
Numa forma de realização, o anticorpo ou fragmente P compreende uma cadeia leve constante (Cl) que compreende a sequência de amínoáeídos da SSQ ID NO:63< O: anticorpo ou fragmento compreende adícionalmente uma cadeia pesada variável ( Vh5 em que o CDRI compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de: !! Qf:llWYQÍl!l [SEQ ID NO; 28] Q anticorpo ou fragmento compreende adícionalmente uma ...........:padeia::í||ÍS:ada variável (Vb) em que o CDR2 compreende ÍiÍiÍPàí::.:.:sÉ|iÍ(^ncá'a liteiqamPBidiips de:||||||||| . :§ι|§:ε11ιΙ§11111|γ f SEQ is Np|:||:3 :tillll^:' :I|||P'Q iiiippiiio· |idi||iiiipde a.d içi 0 náiBnt:||:pma,p|i cadeia pesada variável (Vk) em que o CDR3 compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de: CARILRGGSGMDL [SEQ ID NO:30]
Numa forma de realização da invenção particularmente preferida, o anticorpo ou fragmento compreende adícionalmente uma cadeia pesada variável (Vh) que compreende as CDEs da SEQ ID NO:78 e SEQ ID NO:29 e SEQ ID 20:30,
Duma forma do realização: preferida adicional,, o anticorpo οα fragmento compreende uma cadeia pesada variável (V>;; qae compreendo una sequência do aminoãoides soloedonada do grupo que consisto em: SEQ 10 NO: 31 ; SEQ ID NO: 32; SEQ: 1D 10:38? SEQ ID MO: 34; SEQ i D NO;35? SEQ ID NO;31? SEQ ID 10:3? ?: SEQ TD NO: 38; e SEQ ID NO;39,
Numa forma de rea Li.cação, o anticorpo ou fragmente compreende nma cadeia pesada constante (CQ) gue compreende :&amp; sequência de aminoacidos SEQ ID 10:62 , É particalarmeírte preferido que o·. anticorpo ou fraqmento compreenda as seguintes CDRs: (II SEQ ID 10:1. e SEQ ID NO; 2 e SEQ: ID 10:3 e SEQ XD 10:28 e SEQ ID NO;29 e SEQ 10 IO;30? ou fill SEQ ID mt-4 e SEQ ID 10:10 e SEQ ID 10:12 e
SEQ ID 10;28 SEQ ID 10:29 e SEQ XO 10:30? OU (11i} SEQ ID 10:5 e SEQ ID 10:10 e SEQ ID 10:13 e SEQ ID NO:28 e SEQ íD 10:29 e SEQ ID NO:80; ou íív? SEQ ID 10:4 s SEQ ID NO: 10 é SEQ XD MO: 12; e SEQ ID 10:28 e SEQ XD 10:22 e SEQ ID 10:30? ou fvt SEQ XD 1Q; 8 e SEQ XD 10:10 e SEQ ID 10:14 e SEQ ID 10;28 e SEQ ID 10:29 e SEQ ID 10:30? ou {vi} SEQ XD MO? 7 e SEQ IS NO: 11 e SEQ ID HQ: 1 5 e. SEQ XD 10:28 e SEQ ID 10:29 e SEQ ID NO:30? ou
Cviid SEQ XD 10: 8 e SEQ XD 10:10: e SEQ; XD 10:16 e SEQ ID 10:88 e SEQ ID 10:29 c SEQ XD NO:30; ou (vi 1.1:} SEQ ID NO: 3 e SEQ ID 00:10 e SEQ XD NO: 17 e SEQ XD HO; 28 e SEQ ID :10:29 e SEQ XD NO: 20; ou lix) SEQ ID NO;9 e SEQ XD 10:10 e SEQ ID NO:12 é SEQ XD 10:28 o SKO ID 10:29 ή: SEQ ID NO: 30? ου (χ> SEQ ID 10:9 e SEQ ID 10:10 e SEQ XD 10:18 e SEQ ID 10?28 e SEQ ID: 10:29 e SEQ ID NO: 30.
Numa forma de real! cação, o anticorpo ou respetivo fragmento de liqoçDo ao antlgeno, da. invençãof liga-se a ;.:m epitopo no primeiro domínio < Dll elo GD4G (preferlrelmsvntOf QD40 numamo) .
Por exemplo,- o anticorpo ou respetivo fragmento de ligação ao antlgeno, pode competir peio 1 igaçâo ao GD 4 o com: um ou maia dos anticorpos exempli.fi ca ti voa da invenção iver Quadro .0; tal como descrito nos Exemplos abaixo) ;
Ooadtro A
óss.mre O: anr.icorpo ou reaperivo fragmento de lignçmo ao autigeno, pode ligar-se ao mesmo epitepo d.e: C:D40 corno um ou mui s dos ant icorpos exempli i .icai:ívos da invenção. duma forma de realizaçâo preferida* o anticorpo ou respetivo fragmento de 1igaçao ao antigeno da invenção, compreende os pares ·/... o 1¾ de um dos anticorpos esempllf.reativos da invenção (tal como mostrado no Quadro /\) .
Esslm, numa forma do reaiixgçao partícularmente preferida, o anticorpo ou respetivo fragmento efe ligação ad antlgemo:* compreende uma cadela, loco v*novel {ν·:·.} e uma cadeia posada variável (¾) gue compreendem as seguintes segaemclus do aminoácidos:
Hl SEQ lã NO: 19 e SEQ ID 00:31; on (ii) SEQ ID HO:20 e SEQ ID NO:32; ou iiii) EEQ ID iOíil d SEQ ID NO: 33; ou
Uv) SÈQ ID NO:22 e SEQ ID NO: 34; oa (v) S.EQ ID MO:23 e SEQ ID MO: 35; ou (vi) SEQ ID NO:24 e SEQ ID NO:36: ou (vii) SEQ ID NO:25 £ SEQ ID MO:37; ου (viii) SEQ ID MO:26 e SEQ ID MO;38; ou 11131' :p|Q ID |l3p7|i|||E|| I ill M||3;i 11
Preferivelisenter o anticorpo ou respetivo fragmento de ligação ao antigeno, compreende uma região Fe de anticorpos. Será apreciado peio perito na especial idade que a porção Ec pode ser cie um anticorpo IgG, ou de uma classe diferente de ;|pof pQlliitieipoe ......|2|i:0| pul Iglii« Po|| exemplo, | a 11 ........f|> || IgQ|. ||| gGliislplg,.. ;§èl I qG f 11 iliBpiiiintl'ilf :p;;||yg:ilãg;:dááiied::f :p|Ç iiiiPÇ p u|i|||ii:id:ii: |§d ϊ g<3 111 çliíQsltll |c 1 f Igiiossf f %if çí| tl|f a| ItêM 111 (||ÍíÍ|:ÍK:e||p.Ip:; par te 11 Q3dálgfe:s:a:p:t:ÍC;pii:p|d:nid |:dp | |||||?òi||||f' 1| t|i£liáll f .....sspctlpiepi® 'Wdl °Ί I s# | .......a..........................%di: :^:çq;if |· |ii| y;i||;p|:nt;:|' )|^ Podem 11 ó&amp;ás········^.....pontuai s que me.1.hoc:em a: sua — capacidade, de ligar FcE, por exemplo, alterando a meia-vida do soro ou melhor&amp;ndo a ligação a recetores Fcv (FcvRj envolvidos em ADCC e CDC, Em particular, mutações que melhorara a ligação ao FcyRIIB, par exemplo, a S267.E (Strohl et al., 2009, curr Op in Bioteehnol, 20: 665*· 691) podem ser vantajosas para a invenção dando a relação entre ligação do FcyRIIB e a atividade funcionai de anticorpos CD-I0 tf-1· et- s.·.,, s.Oaj., science, 333;1030-1034).
Numa forma de realização, « reqrao í c compreende ou consiste na sequência de aminoácioos cuvç u) MO:6a. É preferido que o anticorpo ou respetivo fragmento ae
:::á:P.Í::í:§:è;^ P Ρ; ^If ÉPÉÍÍP ^Éllf U ^ IP f W flgrte n t o g.e|: Jtgiglo........;í:fc| |P||UlTic' ||||^ ff"w |Ι|1^ flf | Pil i: sequência de aminoácidos de uma sequência igo P«=--rCalarruent« preferida, é descrita nos Exemplos '-,neXwS* UI Muma forma 'Idel t eaf Idá|;^i: I:::\M iilrtrIIu0£:l;ll: °ii £ÍPfç 1 uNN: ..........1...........2l:||gl;||.......ao.................. Η (hd^fl :;(::(|ί$$££ :0tiÉítd h 0 termo "diretamente cit©tóxica", inclui o significado que a fração è uma que por si só ó citotòxica. 0 termo " i nd iret araen te citotóxi.ca" inclui o siqnifiçado que a fração é uma que, apesar dela própria não ser citofõxi.ca, pode induzir ;h1¾i-# per | adicionai ou por ação adicionai nela.
Convenient.emente, a fração citotóxica é citotóxica quando é intracelular e, preferivelmente, não é ci totóxiea quando é extracelular. 11yf||ifivelme|t'éy:i;;;:;jj|;i;hhjl;n:^ fornece umI antiç#£'|># |pu|| th;;irespetivo fragmento -hst:t>; antigen©, Nófm;(;;|;||t:, JI1-f;aÍ:#°!! citotóxica é um agente quimloterapêutico diretamente citolôxico, Opel onalmente, a fração ci totóxiea é um polípeptideo di retarnente citotóxica. Os agentes quimioterapêutícos citof. óxicos são bem conhecidos na hhh hd:ãp:éÇã':P:Íi;l;dpdp hhlil: |h||e||||i| ®|ití-Í'iS£0í^iii ( I |J;td:ÍÍ:X:lddsl: i;lía|;Óul#|·|ÍÍ|lht|tÍ;Ç:|p;i | Incluem: !^.##'......... :hh::i mp^dfã-ipdíélllllpçlll;' 'ãpctiqih; 1 taish hhh; como c|pígdp;^ ;h::íP^:llhP..... hNhhó£Ç:ÉóJ(lhP;É;;ÍÍIÉ:d4|:hh lifih0:^fdfii,da:ph -|.hip^. 11¾¾¾o?--::::hhh;:fhlhtt" :;C^^:¾Í;hpi:%Ç::::: ;§;(;(( h h hdiÓreÉlti;ç|h|;;|;;; !!!^#-f- fh |i| | met i Ime .1 ami n a s ........;:§::álc^|hhjpfc......s hexamet11me iami na, fiotepa; alquilsulfonatos cais como pussulfano; nitrosureias cais como carmusfcina (ECWJ), hh;iomust ína {CCNU) J;; hipittllt inã(( (met i I-CCliU h e esi.reptozoci.na {estreptozotocina · ; e triazenos tais como dacaroaxina iuiC; dime?:.;! it r i a xenoim ida xo! - carbo xami da) ; Ant χίδ<ϊ tabolitos incluindo análogos de ácido fóiico tais como metotrexato (ametopterina) ; análogos de pirimidína tais como flucrouracira h; hhl 0(1:11¾ d'l:Í:Íl:Í c i||; 1 (hlHf M?} % J| fidxulhid ingl!·' f f FOdR) o çítarabina (citosina arabinosida}; e anaiogos de purina e inibídores relacionados tais como met onptopu r.na (6-rnercaptopurina} 6~fóp) f tioguanina (6-troguamna; 16} o pentostat.ina (2f -oeoxiceformicina) . Procuitoa natursns incluindo alcaloides da vinca tais coxao vinblastina (VLB) e vincristina; epipodof i. lotoxinas tais corso etoposids e teniposida; antibióticos tais como dactinomicína {actinomicina D), daunorrubicina (daunomiclnaj rubidomicina), doxorrubíeina, bieomicina, plicaraicina (mitramicina) e mitomieina {mitomieina C); enzimas tais como L-asparaginase; ||f ólddlii !d|: .fóipoit i! | |;i;dljoi|yi4 llc interferao. Agentes diversos incluindo complexos de coordenação de platina tais como cisplatiria {eis-DDP} ; J jj ρ fi §r acê úe.dlbhá. ntrona e an trad diflitá.; irSildlll i icii|s:|4|:|p'|d4: tp:|il|im;|;i bid ri xátllipif 1; me f iiii dr á b| b|i)í) tal como proearbazina {N-met1Xhidrazina, HlH)? e supressor adrenocortica 1 tal como mitota.no (o, p' -.000) e ífii 1| fiddl, |ivt^l 1 | ÍI|^'i0^ÍÍl')Íi:i|vÍÉoÍll ίί 1 e ..|l .g:0pÉ;i::S:ÍÍ In t é.igbblP iidsllldll ; h 1¾¾½¾¾) t :|í|||"' diftipl if Hl t alii.ldii e tamoxifeno. Vários destes agentes foram anter.iorme.ute ligados a anticorpos o a outros agentes de entrega no local alvo, e por isso anticorpos dei invenção que compreendam estes agentes podem ser prontamente rei tos peio perito na especialidade. For exenypio, a corri ugaçao de carbodi.im.ida (Bauminger &amp; Wilchek (1980) Methods Enzymol. 70, 151-159) podo ser utilizada para conjugar uma variedade de agentes, incluindo a doxorrubíeina, s, 1 ir \ ptpt l||||s i|||| ....... As carbod i im.Idas oill|>reendftiut):id:fllppige::dpi0pp:0:0pstêm:: ou|i| ^l:.iy|:..I|ssP^|Íêíl 1. ou ar orna t i cos Ji;. e; is a ό ú 1 :iÉ)l:bg||od|)ip yiih:'::1 A:r p||esp:g:::: ρριι :.i. j gbç õe.s....... peptidicas. 0 procedimento preparatório é simples, relativamente rápido, eé realizado sob condições ligeiras, oa compostos de carbodiixnida atacam grupos carboxí.licos para os transformar em locais reativos a grupos amina livres. A earPeóirmida solúvel ea água, a l-etil-3- (3~dimetilaxiúnopropil) carbodiímida (EDC) é particuXazmente útil para conjugar uma fração funcional com uma fração de liqaçâo e pill) IMMi |u|d||i|ada ) para |ίο<|η1:Ρρ:0;|;.............. |. |pO.S: !?3;ii:ii i.v^fcííiis: ^¾¾¾¾.^íâ tumdreS . A Çonj :^§jÇãp!j ;N; :i:. 'Sip®......dbtj^gâ.ção requate a pfe.géllǧ| PN ii :::; iiii::^ ':;S:i|::^^iiiiii^:i^i^|^;ip i SJ^:!ii^.^^^;^:jC:!||i <l|Sp |ί;Ρ|:φ·^·.^ίί: dOXOrrubiclnã, iff ulnjgrMpb ij j:
Si;:;................................................. i-igíiíS^ii: pélO ij 3 Π t 1 COÍpO . iiiiiidHSiliiillilgiip I de carbodi iminas Ipiaxdiii: ii pi ii i; ............. ligações pepti.dicus, a EDO t iamb ail. biape |#pi i ii utinzaaa para preparar ésteres ativos tais corno o éster de N~hidrox.j.ssuccraímida (HHS) <. O éster NHS, que se liga apenas a grupos affiina, pode então ser utilizado para induzir a íor.maçao de urna ligação amidica com o único grupo a mi na da doxorrubicina. Ά utilização de EDC e MHS em combinação è normalmente utilizada para conjugação, de forma a aumentar o rendimento de uma formação conjugada (Baumínger &amp;, Wilchek, suprat 1980} .
Também podem ser utilizados outros métodos para conjugar uma fração oitotóxica com anticorpos. Por exemplo, pode ser utilizada a oxidação de periodato de sódio, seguida de alquilaçâo redutiva de reagentes apropriados, assim como j::}:::;};rifitÍ;:Çjj:|Í:iÇ:§l;i;} j fdio en t lil:0i||é!pd go g|i|;çl d o que, indepe.ndontemente de que método i; j j:iigég' a. ίίϊ:;ίί%φj:<çda invenção,· deve d; ser feita uma determinação de que o anticorpo mantém a sua capacidade de al.vejarnento e que a fração funcional mantém a sua
Numa forma de féaÍ}irq;|ãÇjd| jjipvebÇàO:, a fragipi qffdfogigã/l! y téf p^:ipép|i;dd|çtjt:çj^ jf |dça|lpoi ipepfjiii ΐ®
Nlijiscldjlç.....qualquer Ifil:ç§dllqi:|' 1 idMéj a ijjfpr te· oe|j|laji............ieptii'dib!I j:HHj c 1.1. o16x i co s e j; :¾¾ agólisj :pb liipéptbidl-oaii são bq$|i:' obn|llj|'ldi:S:ijnj especialidade e incluem, por exemplo, riciria, abrina, exotoxina de Pseudomonas? fator tissular e semelhantes. Também sâo conhecidos na especialidade métodos para os ligar a frações jit dié a llllãbéptõg iy baJliii f óm<|j a|t|f οφίΙοΒ· >1 &amp; ut ii; iMObílb um agente citotóxíeo é déborifia em Burrous glTbdrpéljllIjdllj ϊ Proo, Natl. Acad, Sol, USA 90, 8986-9000, e a utilização de fator tissular, que leva a coagulação sanguínea localizada e enfarte de um tumor , foi descrita por Ran et ai., (1998) Cancer
Res , 58, 464:6-4653 e BUaag et aL f (1 997} Sa 1 enoe 27 5, 547-550 * 0 artigo Tsai et ai,s (1995} Bis, Colon Rectum li, 1087---1074:, descreva a cadeia abrina 8 eoniuqada com am ant i corpo monoclonal, Sutras proteínas inativadoras de rifcossomas são descrita s como agentes cito tonic os no document·:© do 96 70S 841, A exotoxina de Pseudomonas também pode ser ut ilixada como uma tragic de polipept ideo cltotdxico (ver, por exemplo, die Ho et a'i ., Q995) Prod:, Pati . Road. Sci, USA 92, lQiS?~10d&amp;l )o
Certas c.i. toe in us, tais coao o TiliM e o IL-2 também poderão ser ateis como agentes citotoxicos.
Certos átomos radioativos também podem ser oitotóxioos se entregues em doses su ti cientes,: Assim, a tração eitotoxida pode compreende um átomo radioativo que, em uti 11 sapão, entrega nma quantidade suficiente do rad i oaf ividado ao local alvo de forma a ser cltotôxlcO:, Atamos radioativos: adequados Incluem o fósto00---32, iCfdo-irõ, lodo-131, indio-lll . rónio--d 86, rénio-188 ou 1t ri o-90, ou qualquer outro isotopo que emita energia suficiente para destruir células vix falia s, organolos ou ácido nuclaico, Preferivelmente, os isétopos e densidade dos átomos radioativos nos agentes da invenção, são tais que seja entregue ao sítio sito uma dose de ma 1s de 4 000 cGy £preferivelmente pelo manes 5590, 3990 ou 10000 oQg) e, preferiveimante, às células no sitio alvo e aos seus organs i os, P ar t i c u la rms nt e o nu o is- o. O átomo radioativo pode estar ligado no armcorpo, fra.gmen.tc de 1 icação ao antigeno, variante, fusão ou derivado respet ivo por f ormas conheci das, Por exemplo o ROTA ou outro agente guelante pode estar ligado ã fração de ligação e ser utitirado para ligar ου ®δϊ. Os resíduos de tiresina podem ser d t rotation te marcados com 1 ou ?1J. * A fração cito tóxica. pode ser um polipepfcldeo indlret:àmeute: oitatóxioo adequado, Mama forma de reali.ração partieelarmente preferida, o polipeptideo indiretamente ci.totôxico é um poli peptide o que tem atividade encimatica e pode converter um oro- íárrraco não-toxico o/ou rolaiicamente não-· tóxico, num fârmaco citotóxico. Cora anticorpos, este tipo IIJJ | è|g'--J|||^|%:S: ^^^i!;.:^:yiji;Di||ϊί^;α||3,3;3; | |^o.r!|||b.t;|p:§:^;;|í;; i; i; |> | sistema requere que o anticorpo coloque a porção enzimâtica no locai desejado no corpo o o paciente e apòs cio do tempo pai-a a enzima se colocar no local.. adminiôtrar-se ura pró-fármaco que seja um substrato da enzima,, sendo o produto final da catálise um composto citotóxico. 0 objetivo da abordagem é o de maximizar a concentração do fárraaco no local, desejado e o de minimizar a concentração de fármaco nos tecidos normais (ver Senterq P. D. et; ai. , (19881 "Anti.-tumour effects of antibody-alkaline ;;"l;:::ifsibsbi^ .;|P:bpÍ|::ú:9gif j f i IX n i ii ii j cbiiiibillbb:: jiilli h ||^ppbs:idb j j ....... phosphate’' PrtS j'hahis:::jhbp$^.didi,!|||4 434:|||§|B.4 6 f f Bág·p|fápp | .................... Br. J. Cancer.......|:pg::fh:pl;!2iffe .B;l|:d^Pvl| -|Él|?®:t· &amp;I.-;|f (Jf|8:Íj "A cytotoxic agent, can be generated selectively at cancer sites” Br. J. Cancer. 53., 700-703} .
Numa forma de realização preferida, a fração ci totóxiça é capaz de converter um. pró-fármaco nâo-ci totóxico num fárraaco .......sfiitiitbxiçf <x:f!!!!!!!l flliffihh:i;i^ ifl|:| S t|málll|f;iÍÍÍÍi záffbmh 'ihiliátd li ....'mi;fbaba Jltiil. como f|p:scb |Íb::slih# Jf i|f r eáfebieliÊilid^bn td|i: IpblhjjiNhf jf qualquer uma daquelas que foram anteriormenfe propostas. A substância ci totóxiça pode ser qualquer fârmaco antlcanc.ro existente tal como um agente alquilante, timidina sintetase, ribonucleotide xedufcase, nucieósídos qulnases ou t-opoisomerase; ou ura agente que pro.dusa morte celular por interação cora qualquer outro constituinte celular, A etoposida é um exemplo de um inlbidor de topeisomerase,
Sistemas prò-farmaco relatados incluem: nm pró-fármaco de mostarda de fenol ativado por uma β-glucuronidase de E, Coli (Wang et al,, 1992 e Roffler et al., 1991}.: um pro··· fárraaco de doxorrubici na ativado por uma g .1 ucuroni da se humana (Bossi.et ffhi aid,, 1994 }:j.......mais pr#§|fiáfmáhóe. dbffdqhb£xub. |i§|§§|á pfpy |idtfbfffoifld i| «i:|h.l:ÍidtÓstêlÍib p|. qllii debbsflf j :|l|so.nlhyffhlf Pilffjj li p rif faimiice óf di· dahnorif ft|§ e ihh if s t po r f ||y bf :§íf: .|g dtps idas e ii de grãos de ca£è (Gesso nec al. , 1994); um prò-f áriaaco de 5~f luoridina ativado por u.ma β-gaiactosi dase de F., Coli (Abraham et a.l. >f í594); e pr.o~.í.àrmacos de ruetotrexato (por exemplo, m e t o t r e x a o o - a i a n .ma; ativados peia carboxipeptigalactcsidase h (Kuefner et. al., 1990, Vitols et # MÈm ΊΙΜΜ fill il 111IlllllN 5llillll;t e I i 1# I dllllslsi1 í JlilllPill no Quadro 8, abaixo.
Qaadrc B
Q- dsad.ro />. ;é adaptado· de Baganawe (1.:1351 Drag Det* Hes, 31* 2.23:---232., 'de onde pede®.: see efofeidas xeieten:oi.â.s completas pare estes: sacies :a.is: temas.;' e aerieátío dS: taxot é: descrtt'p: em-Rodrtgaee., M. L . et ai. , (133 §( OPemi strf' &amp; Biology '2, 22:3..
Eneimas: adedyadáe papá. formar parte de ama portão enaxmátiea incisem: eecpsptidases* tais demo eárde«ipep't.ídás:ee: 2/ 21 a €2 (paxa prô-istmoces de mostarda glutaniilada}1, saxdoxipept ida.ses: M s Ά {para p.ro~'£ármacoS' dgseadds em. Mid) e amieppeptèdaaes (para p'rd~; f armacss: HiC l-m-smincaeil;? dndog'ep:t.idâ..sesí tais dome· per- exemplo .a tdromdolysis' (para prò~fârmaeds: de tromMasd; hidrola.ses* 'tais. dome tos faia sés. :|pot exemplo, fosfatase alcalina.; ou suifatases (por exemplo·.,. aTllselfarasasl (para :£sxma.eos fosloxilados ou estiarados'); amidases, tale como- penicilioa ama dates e .srilaeiiamidsse.;' lactsmaaes, ta.is eome p-lactamases1; ρΙχοοΒίΟοχΡο, tais como p.“pla:caeo.aidaee (para aptra:0;ídiip.a.s de. Jl-gl.aeuroBdmida’) , u—galaotosidase: (para amigdaiinaj: e p-palâcfcosidase: (para antxacioiina de p—galaetose© ; deamipasea:, ta ia pome daseminase de. cltosína (para itC;: quinasse.., "tais como' ureqaiaass é timidína quinase: (para o gancieiseix) ,;· redo,fc.ases* tais· come nitroredstase (para iÇBlJBd e analegosj ? ar ©.reds, tas©· (par a;:mo star dos d© aaopenoepol: « Dt—diatorase (para C:Biid4:) ; oxida·ses,· t.ais d.omd glicose oxidase: (para, glicose.) , ηοΛχηο oxidase (para... xsntíjia)· e lac fcoperom.da.se.;' .Dlmacemases·, anticorpos oafcâ li ticos· ê ci oiddex' t ri o.âs*
Bxefériteilmènte., © pxe-iármaeo é PeiativMipPié aÍG~tõxí cp. comparado- com o fármsoo. o.i to toxico , Nòxmaimenfe.e, tem· men os de. 10: f da t:©«iord.â.dspretorireImentd mends de. X % da·: toxicidade tal como medida nnm teste de cttotomi cidade is
Vi trOiliapequadolli È provável que a fração que é capaz de converter um pró-fàrmaco num tármaco citotóxico estará ativa em isolamento do resto do agente da menção, mas é apenas necessário que esteja ativa quando (a) está combinação com o resto do agente da invenção e (b) o agente da invenção está ligado a, adjacente a, oi^l! íJ;|í:t: © ;i ^ ilndo Itlk. podam, estar, ligadas uma com ~ outra po.r. qua.j.squer o as formas convencionais de reticubaçâo de polipepticeos, tais como .....AilllerI, ΐϋΏ.,.1 ilpli....... f ragmepto de 13i|o|«|í a;o antigeno, pcoe ser.....i^fèg|i|ufôç3g:©;............... !!!!§t||dpos||ti.:p 1 alialti'a,|i|.d adicionai teita ppaqtq;:::qsp um AgS|;@: foi funcionai capas de reagir com esses grupos fciol, por exempio o éster de N-hidrοχΊssuccinimida do ácido iodoacético (NHIA) ου o M-succinimidil--3-- (2-piridílditio} prop!onat.o (SPC-F) , As ligações araidicas e de tioéteres, por exemplo conseguidas com éster de m~ma lei raidoben-zoi I ~N~foidrQ:xd s s-uccí nim-i dasão geralmente main estáveis .·/« vivo que ligações dlssulfeto.
Alternativamente, o anticorpo ou respetivo fragment o de ligação ao antígeno, pode ser produzido corno uru composto de fusão por técnicas de ADN reeomhinante, era que urna extensão do &amp;DN compreende regiões respetivas que codificam as duas frações do agente da invenção, tanto adjacentes uma à outra ou separadas por uma região que codi£ica ura pèptido de ligação que não ce-S:i|. rpgip a1 pr çpt :zié ǧ:§|§:Ç i; Ipõdiç eb i. ve 1/aen 1. e, !!!!§:» |;úd|||porçf|e:íí:i‘ íicbtépdtAsc :po|||f | efí atíqntél:o:p ||l|j|:rdl:ã.SõnteÍi |1
IjÁ '|||aç:ap jiilPi:^:É:. um #iiis:|Q|| l§f§i ||"s I jd%| |e s J| li! ||||| .χ: j|p:|lpl r:ilii. ||p|l, lall Jl t ii|ii:i n|ç | :¾. 1lgéii:ça::t"ái|ò.áç 1 :||f ipdáfçfoaúíigj ,vi; nicpt|.|:ia||:i.d| 11 11¾¾. ::i: 13c a§d.:í|p!lé:ú! |||idi.f|jjj ||||||e:|i 1|o..| ex|jí||.i:||;; |||l|ín; ||i |χ||| (i||i||l |f|||, |||ç||||á|t ||||
................s nilii! ||l....... ||| I ............5 ,..,,..,.......... m te............ . ........... . ..........Drugs 14, ....... "'"2bj; Hors™n Í199S) Acta Oncol. 34, 571-5*7, sh,„,oy i: .............. Ml Η 10' 533-551, Mitchell :¾ ,ΙΙΐίί,Ιβ,Γ»· ..................... Ϊ1Ι®1|0*«1. 5«;,||i|||6:) iiirtls 5 KÍDtz„JiJlw; M. 1 J. Radlat. Oncol. Biol. Phys. 16, 1235-1241, Brown po89) X»t J. Radiat. Oncol. Biol- Phys. IS, 997-993, Brown a985) Cancer hi:;, 22.r2-2226 } , Mém disso, a entrega de genes „as célu,as cocto rsdiossensltirá-Ias, por exemplo a entrega do gene p53 ou
^; ilillani}:e b:::: ur -tl9:?b} , Neurosurgt 89 ,12S i......!!1ϋ- ||®ί:ϊ.^...1||||ι||||^ρΙΐ......ili........'ί::1ί'”1ι A fração adicional pode ser uma que ae torna clrotóxice, ou que liberta uma tração oitotôxica, quando irradiada. Por exemplo, o isótopo de boro 10, quaiKio aptopriadamente irradiado, liberta partículas « que são citotôxicas (por exemplo, ver a patente doa EUA 4348376 para Goldanbergí iPrimus eív ai,, {1096} Bioconjug, Chenu 7, 532-53$) . mF'^2|í elii Ψ2i~:if'f Q ll*™ioHsóxica pode se1' |2 -:2 llflrtl ............%:'% ΐ:|? .......si|Ji!..... 889-905}. A iiaçao adicioíictj. pooe compreender unia molécula d? Actio nucieieo que é diretamente ou indiretamente citotóxica. Por . 11# x fli l;|||||uor|' iod:!l|:':':':':':'âi^':':Í|É ·;| oligonucleotide antisense que, após localização .no .local alvo, é capaz de entrar em células e levar á sua morte. O I,'1.J; j|ór|:énó|:|:: pgp| :|: expressão :¾. um gene.......;ps||pc::i;i|i|:: !p:|, ':i$mjliiiql|^ na expressão génico que||qul||l:. 212¾ ts<|ió. di t ei óífie# llipa mdiilÓillg %Mê d| dó, ilidis 1 dd:: Igie.....çdiiiib<i:........ um pol i.pept ideo diretamente e/ou indiretamente cito tóxico. S.........;gxAm:p:l:#i:s 2$|:.....ρ1::|00%1|: í Ip;t:ÍdóSl!ó:dp:CJÍÍ dp;Í^ggÍÍS:l;qiSli::'' §pÍSl5ÓS|:' :|5 dirigidos ao bc.1-2 (Ziegler et ai», (1997) J. Natl. Cancer Inst, 22:2:: pi ||ίΓ |:0||1ίΓQ 3 6i| f fe ||a lpd2|p I; ilsipliig..Jl%: 2ie;|ó;i:iifhiir |Jl ** t 2: i2ÓÍ,.2;àlllK........................pÍS:::«:::::::::::|:p:|..............s
Gs ácidos nucleidos cie peptides podem ser úteis, em vez de ácidos núoleioos convencionais { ver Knudsen &amp; Mieisen 'ξ 139.7 f Anticance? Dregs 8, 113-118? . duma forma de realilação adiozonai, d anticorpo ou respetivo fragmento de ligação ao antigen©, poda estar compreendido mm veiculo de entrega, para a entrega de acido nucleic ao alvo. 0 veiculo do entrega podo ser qua Iquor veiculo de entrega adequado-, Pode ser, por exemplo, um lipossoms que: contém ácido uuc-leico, ou pode ser um vírus ου uma partícula, semelhante a virus que sega capaz de entregar soldo nuoleieo. destes casos, a molécula ;a ser entregue está nomsalmente presente na superfiei o do veiculo de entrega. Dor exemplo, um fragmento de antíoerpo adequado pode estar presente na superfície entorna de um 11posaorna e o ácido nucleico a ser entregue pode estar presente no interior do iíporsoma. Gomo outro exemplo, um vetor virai, tal como um vetor retroviral ou adenoviral, è construído de maneira a que a fração de ligação está ligada a, ou Iodai izadã na super facie da partícula viral, permitindo assim que a partícula virai seja dirigida para o teça 1 desejada, Tumoém são conhecidos sistemas de entrega dirigidos, tais como os sistemas da adenovirus modificades descritos no domu.mento 'WO 14/10313 em que, tipicamente, o IDE é transportado dentro do adenovirus,; on numa part leni a semelhante a adenovirus.. Michael et al„, (1388?: 'Sens therapy 2;, 680--668, descreve uma modificação do adenovirus de forma a adicionar uma fração seletiva de células numa fibra proteica. Também estão disponíveis etrovlros dirigidos para utilização na Invenção; por exemplo, podam: sor cord.ruidas sequências que conferem: afinidades de ligação especificas em genes virai s env preoxistentes (ver Miller á Vlle (1890) Faseb J. 8, 190-199 para uma revisão deste e outros vetores dirigidos para terapia genética? <
Podem ser utílxaados imunoi ipeasomas (lipossomas dirigidos com anticorpos) Para a preparação de i muno 1 i ρ o s s orna s, é; si ate ti a a do II MPB-?E i:ÍNiÍ||ii'ΡΐΙίΐΐΡ;.^—'ίχάtex|^!!ί!ί|||;!;||^ίί|!-^ί!ρ I in a) <f||; .....dP^iísxtxuM^ í||f::8lili J- Biol. Chem. 257, 286-288. O MPB-PE é incorporado nas bicamaoas .1 ipossomais para permitir uru acoplamento covalente do anticorpo, ou respetivo fragmento, à superfície lipossomai, lllIliipM pitp ||, fp|;vliilint^méllii: cart e;|li||||:|illl:ilp. |i| f ||t r|| ;:::::::||^^:^;^:t5:ÍC i; ClíÇ i:p|;iͧ, M$X r§||:(llU S Ρ©|!1|1:||1.1 l||lipiit |^Ρ^ί1θΐ11| ...........""pela dlã||ii;f;|i:i Il|p0|i(it|aç mi|||i:i:ibluçãb ip$ 4^ί·Ε^||: const rut o genético, seguido de uma extrusào sequencial através de filtros de membrana de policarbonato cota 0,6 μη e 0,2 μια de tamanho dos poros, sob pressões de azoto até 0,8 M?a, Após extrusào, o construto de ADN apanhado é separado do oonstruto de AON livre por ultracentrifugação a 80000 x g durante 45 min.
Os M U' B - P E - .1.1. ρο s s orna s recentemente preparados em tampão desoxígenado, são misturados com anticorpo recentemente preparado (cr respetivo fragmento) e as reações de acoplamento são realizadas numa atmosfera de azoto a 4 °C sob rotação de uma ponta à outra constante, de um dia para o outro. Os imunolipossornas são separados de anticorpos não conjugados por ultracentrifugação a 80000 x g durante 45 min. Os iraunolipossomas podem ser injetados de forma intraperitoneal lllililli'df:r|timerte he||tumor . O ácido nucleico entregue no locai alvo pode ser qualquer AON adequado que leve, diretamente ou indiretamente, a cítoxicidade. Por exemplo, o ácido nueleico pode codificar um ri boa.some que seja çítotóxico para a célula, ou pode codificar uma enzima que seja capaz de converter um pró-fármaco substane i almen te não-tóxico num fármaco citotóx.íco (este último sistema é por vezes chamado GDEPT: Gene Directed Ensím.e Prodrug Therapy (TPEDG - Terapia de Pró-férmacos com Enzimas j ji j|3r x i fidis |||i!|| S#| eç ||«
Ribossomas que podem ser codificados no ácido nueleico para serem entregues no alvo, sao descritos em Cecil e Herschlag "Site-spedfic cleavage of single stranded DMA” patente dos EUA 5180818; Altman et ai "Cleavage of targeted ENA by RNAse P” patente doa EUA 5168053, Cantin et al., "Ribo2yme cleavage o.f HIV-1 RNA" patente dos EUA 514 97 96; Cech et al., ”RNA rlbozyme restriction endoribonucleases and methods”, patente dos EUA 5316742? Been et al ”RNA ríhozyme polymerases, dephosphoryiases, restriction' endonucleases and methods”, patente dos EUA 5093246; and Been et al " RN A ribotyme polymerases, dephosphorylases, restrletion endorxbonucleases and methods; cleaves single-stranded AHA at specific site by transesLer.1 .til cat ion", patente dos EUA 4 987 071, Alvos adequados para ribossomas incluem fatores de transcrição tais como c-fos e c-myc, e bcl~2. Durai et ai., (.199?) An ti cancer Res. 17, 3307-3312, descreve um ríbossoma em cabeça de martelo contra o b:oi---2 > .0 documento ER 0415731 descreve o sistema GDSPTb Considerações semelhantes em relação â escolha de enzima e prò-fármaco, aplicam-se ao sistema GDEPT, assim como ao sistema :s7!:^:BÍÍT..... 0 ácido nucieico entregue ao local alvo pode codificar um .. pbi:lÍ?iii|i|dÍo di::|pEil|:|||ta Iplt o ΐ!!!!|!!!!!!!^ itdiçáo opf c|on:a,i pode compreender um : |||pi|ilplpl|pe||||' |||íii|||e|t|dP φ§ |cdifíq|||4j;|||ipeptideo I '':'::g||Ç::::::Plps:::ê d!i^dta||ph|i|. o:|||j|d|ret.ai|(esnl;|' cistdiliiiiiddii,. ruas t.em um i !!!|?:eibf iç|i|!i|terap|hti't|;iis Bpe|yi,oo d| |a|||> polipfòppipç^
p;||||^í||ai!|ii|;.a|i |o| ant|AlA j|pm|fbri||l: lie lllltlljçf I iiiiiilp tipfp li|fp|||i y|ll|: ii|p.h||ppu· 1 st|r |^.||b d||qd ®j| íM | J| In || || liJ i :: çi|q:u].áí|i||de ssàfguiii diiipdpi podo s.|i|:· £i:||i::!:;p|IddiyiM! fl ))ϊ;ϊί||ρ^ no s|t:l:t|||é|||b:; iid| cancilol: WÊ
...ól. :fP°ce ustíslitdintbs deyiiiiilM liiilbldõtl ||ρΙ I
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Is.....A ^lÍ|ÍA:ÍAÍicio;|a:|, |p|)bòpi pode 'ao.r|(u|:i|fhdn:liliiiilip enzima q^s I ..............i||iy;rt|l|;um............))precur|b§ IIIJ........ enaostatina. As metaloproteinases de matriz humana, tais como a eiastase macrofáqica, gelatlease e estromelisina, convertem plasminogénio em angiostatina (Cornelius et al., (1998) J. Immunol. 161, 664 5-68 52). O plasminogén.io é um precursor da aag id stati na, lama forna de realização, α anticorpo ou respetivo fragmento de ligação ao antigene, compreende urna fração eitotóx i ca que compreende um átomo radioativo, por exemplo um átomo radioativo select ouado a partir do grupo que consiste emr f ôsf:oro~J2; iodo-125; .iodo ~131 ? indio-lll, rénio-lS êj r e π i e ~ X 8 8; 11 ri o ~ 90 » duma forma de realização proferida, a invenção fornece um antiçorpe ou respetivo fragmente de ligação ao ántígeno, que compreende adieionalmente uma fraçáo prontamente detetarei» O termo "i ração prontamente detetável" inclui o significado de que a fração é uma que, guando localizada no local aivo, a seguir a administração do agente da invenção no paciente, pode ser detetada, normaimente de forma não··· invasive a partir do enteripr do corpo, a o local do: alvo ser localizado» ásslm, os agentes desta forma de réslixaçâo da invençle sáo úteis em imaqioloqia e diagnóstico.
Marmai.mente, a fração prontamente detetável ê ou compreende um átomo rádios tive, o que é útil em 1 maqioioqia. Átomos radloat ivos adequados incluem o 9S!dc e o XS3I para estudos de eintifografia> Outras frações prontamente detetáveis ingluem,: por exemplo, mareaderes de spin para .imagem por ressonância magnética (1'Rld tais como li3l outra ver, x3Ii, miu, v't, i3C, lsd, :l70Q, gadcliuio, manganês ou ferro. Ciaramente, o agente da invenção tem de ter uma quantidade suficiente de isótopos atómicos apropriados, de forma a que a molécula ceia p:rontamente detet a da:.
Os rádio~m.arcadores ou outros marcadores, podem, ser incorporados por meios conhecidos.. For exemplo, o anticorpo, fragmento de ligação ao ancigano, variante, fusão ou derivado respetivo, pode ser eiose inter irado ou pode ser slntet irado por sintese química de am Inoácidos ut ilizando precursores de aminoáeidos adequados envolvendo, por exemplo, flúor-13 no lugar do hidrogénio* Marcadores tails como o ssdFe, l£7i:, X8sRh, e 113In podem, por exemplo, ser ligados a polipeptldeos llii: t j|| vé:il 'da. ilpibl-dqqs' d allidilis't a;|:R;d d díí l! t-f. §prI ·I i? W' il ^ ttillll lllià^êaiilda .llillirèlll^áa :;iill||I:s'||.|:iy;i iH hilipip;: ||||i|||«pi::: ; j i 'III (::í:9i||lllll|b|||,. B|||||á. IINIII §<ft^§| ^lllllilll: ||Ρ|ι:|||ι:::::; dl|.I.|'|:a|i!!p|i;|i|; o ll^illl l^bll^^lbfÉÉíliÉ ......... I Pi|l||a|lll!l|l;l: IS|'ι||^ llif ll ibllÉÉl·'!: i flfft, h'ress ·' ll|g.|11 Idul;.os i; j|i|:|do.||. em|'í§et;||i!|f 1 llllllil í jr filerIII]§ié§ta, lllllllll flllilll l|r|p:|||||:||!'|1 detetável ΡΙΙΙρΓίΡβΒΟ: um I âfpMO lPil:É|:p;a'táV:lÍl :ί|;1ΡΒΡσνίΡ·:··'9'.9!3ΐ ςφ lJ:p4ò“|i|ii|:|!!!!|:
Jlllll ãijfernap Jl|m:§πta,|||||||a11|fp:||p|||i||||| lii|i:|:c::ldlia.dlll|lli pã;|'t X Γ lllllllllplll ||d6l|:i:idi:i:|:|;||ll|mi11 |oaof 2 -5 ? K: j||>|| ~ 1:J| tlllllllld||| 11j 1111111111--1:1| k.....||: ca|b|d||||| 11 ippl|g;|| Jy................ !!!!Ía!:p§:nJbt!i!!i: g:.X:n:1.c^;pllÉ|Íl;:bl:^:ÍS:tip:Sã;;í:: ferro, 1
Numa forma de realização preferida aa invenção adicionai, a fração adicional é capaz de se ligar seletivamente a uma fração diretamerite ou indiretamente citotox'iea, ou a uma tração prontamente detetável, Assim, nesta forma de realização, a fração adicional pode set qualquer fração que se lique a um composto ou componente adicional que seja cítol. óxrco ou pr on t amen t e de te t á >/e .1. A fração adicional pode, portanto, ser um anticorpo que se liqa se.l.etivamente ao composto ou componente adicionai, ou pode ser alguma outra fração de ligação tal como a estreptavidina ou biotina ou semelhante. Os exemplos seguintes ilustram os tipos de moléculas que estão inc.lu.ldas na invenção; outras moléculas deste tipo são pronta-mente aparentes dos ensinamentos do presente documento,
Gm anticorpo blespecifico em que um. locai, de ligação compreende o anticorpo, fragmento de ligação ao antigeno, II variante, fgpftdsippi diiijlvadol respe:f xplfpllié o segundo.......iqcal'Sdils....... 11 ui|:||:|rã:ÇÍe que|:'s;i .:íiJgdiill........ 11 en:||:ma blidlé Icdlq I §e .d|;|ile.r:|::|r yjpi|>:|&amp;f y dilbt-tõpyidi: S:rii^!!^;^.:iÉi^&amp;iii^ll^ d:-iÍÍi<áit:ó:^:iliiÉb^ .111 11
Spin ppipéqj.qdp qii|psllant Jib|pgb OU re spafc.iv 0ssS|pagm.sh®!!::, de ligação ao antigeno, da invenção, são reagentes úteis para investigação e como agentes terapêuticos, Adequadamente, os anticorpos e respetivos fragmentos de ligação ao anf ígeno, da invenção,, são marcados de forma detetável, por exemplo podem estar marcados de tal maneira que possam ser diretamente ou indiretamente detetados,
Convenientemente, os anticorpos estão marcados com uma fração radioativa, ou uma fração colorida, ou uma fração fluorescente, ou podem estar ligados a uma encima, Normalrciente, a enzima ê uma que pode converter um substrato nâo-colorido (ou ||: nâo-f iuorescente) num produtdj|of fill:idOsílIiussífÉbpfddpItif:} flli.. : anticorpo pode estar marcado por brotina (ou estreptavidina) e ser então detetado .indiretamente por utilização de estreptavidina (ou bíotina), que tenha sido marcada com uma fração radioativa, ou uma fração colorida, ou uma fração fluorescente, ou semelhante, ou pode estar ligado a uma enzima de tipo descrito acima.
Preferivelmente, a fração prontamente detetável compreende um átomo radioativo, por exemplo tecnéeio-39.® ou #u! Ifm. átomo Q?upo ΐ||ί:θ||
I ámííll iodo-.] 23.? ::g|pd:0:nl4:4/ 1.1: J .....il(cal!i!!|l!|:|:i! lf#l|id|ÍHi|á|l(:.. laiiiiihjp ! |Í|n;|áp%d| ferro-,
Num segundo aspeto, a invenção fornece uma mo a. ecu la ae ácido nucleioo que codifica um anticorpo ou respetivo fragmento de lióaçáo ao antigen©, de acordo coai a invenção, o termo "molécula de ácido nucleic©" inclui moléculas de ADÍSÍ, ADNe e ......Ipodlmliiir .fie iá4el(i( :a ^ : pj-ç fÍÇ f Í:Vá11111¾dl ci (&amp;θί0l||; 1M GO |áÇ:j|do|n:||d 1.0-ÇiippSiNdndpiril uma. ou maís sequências de nucleotides seiec.ionaaas a partir do grupo que consiste em: SSQ H> NO: 40; SEQ lu NO:41; S?IQ: I.NO té 2.? ou SEQ ID NO: 43·? ou 3Kp 10 NOí 4 4 ; ou :iy! i! # lyif!!!!!!!!!!!! s.b:c|| :ΐ:ο|||:ΐ|4:4 ; ||Φ- 111¾ || Ηφ|ΐ| || m | SEO Id NO:IS/ 1 ll(dd(llllSEQ liD 1¾):(1 411(11 (4-^(11(*4(11 ll(l;:OUl.l SEQ ID NO:51; or SEQ ID NO:52/ ou SEQ ID NO:53; ou SF’O ID MO: 54/ ou SEQ ID NO: 55/ ou SmQ x u NO; So; ou SEQ ID NO:57,
Ainda mals preferivelmente,· a invenção fornece uma molécula de ácido nucieíco que compf©«nde as seguintes 3 e q u ê n c i a s d e n u c i e ó t i do s: ;-MM iifMillpllllj.|g||p no14S; #!:ii|ii (ii) SEQ ID NO:41 e SEQ ID NO;50; ou {ill} SEQ tD 10:42 e SEQ IO 170:52; ou p-v) Hl:|| :;! 11Vi Sfl§If| NO ; 4 4 e ||!||||iff: |:iff'í| J ír ..........SEQ ID NO; 45 elISlQ· .2:1 INI 1:5 5; ίΝΠΙ (vil) SEQ ID NO: 46 e‘ SSQ ID NO: 56; ou (viii) SEQ ID NO:47 e SEQ ID NO:57; ou <ix) SEQ ID NO:48 e SEQ ID NO:51,
Num terceiro aspeto,, a invenção fornece um vetor que :;Γi1-4-ΙΙι,οομ Mi segundo aspeto da invenção,
Preferivelmente, o vetor é um vetor de expressão. 0 termo "vetor de expressão" quer direr um que seja capaz, num hospedeiro apropriado, de expressar, um polipeptídeo codificado hl :i|é'iijj||diécu|á pelpoidlf ':Í|pÍÍ|.%d|:, lllllfl'is vetores pdfféíilldér nt;ei:i||iillg|sp:tess.|p|: lo'liadldicprildl1' j;:;l:Jp||||iOa.do f |fr agilnifd ç|p l:iS;ddio|g.p' :a.ni:iq;:eí|Í|:, ν% %nS|p ,1" f us:§p:' ,| ou derivado respetivo, da invenção, numa célula hospedeira para a produção de quantidades úteis.
Foram desenvolvidos uma variedade de métodos para ligar de forma operávei moléculas de âcído nueleico, especialmente AON, a vetores, por exemplo, através de terminais coesivos complementares. Por exemplo, podem ser adicionados tratos homopoiiméricos ao segmento de ADN a ser inserido no ADN do ............vetor-, 0 i!Íor!|NMg!feenl! 'deíÉi|lNâ:Íjlh:teSd JuiÉip lilluma liliagliilj ':'h||e M:dro|p!l;o Ín.||Í para formarem moléculas de ADN reoombiraru. e,
Fragmentos de ligação sintéticos que contém um ou mais locais de restrição, fornecem um método alternativo para juntar o segmento de ADN aos vetores. 0 segmento de ADN, por exemplo
aerado pela digestão com endonucleases de restrição, è tratado com JRíR4-'^erase .·. de ADM de EM Gol i, er · z i ma st #|eii.| ## idili t e rglpdil o ÍNf §1 án t q s df i; ddddialll simples W com as 31 'tr.±.oi^e|||e' preenches; extremidad.es 3' recuadas com as suas atividades A combinação destas atividades geram, portanto# segmentos lllADdlll ex:||dmii.|i:d'l:l iNgl * Its ÍÍÍ;|mêT|io|iid€3i#^ "ilssll.....então e:ulÍba'di|Hd'd|)Sli Pi· glapiP exlil-sf# |í|í||o:r Ío|md:i|dU:|;dllll lllll:.. ligação, nalipredpPpdlNNl:umi f;|pa p;ial|!|i a ligação das moléculas de ADN de extremidade cega, tais como |í-.......a §4 ip||d:|' :i:pi|dd| ApSi^d ψ......... sào segmentos de ADN que carregam sequências de ligação f" pof xiPriPallpÍmi&amp;ááM^:0Pliemldã bdÍ,;.:.:.Jsiii.. então clivados com uma enzima de restrição apropriada e ligadas :::........S;?S|:E-:-1 ^Ρ-Ι'^Ιΐΐ^ ΟΟ® |Ν:Α ψί"Ι terminais compatíveis com os do segmento de ADN.
Estão disponíveis cometcialmenta a partir ae várias I Ilillslf |i||l|gplctjs! 1 pá f§g:aç:áfe|' |||1^ό;ό1φΐΙ| gdpf variedade de .locais de endonucleases de restrição, .1.0-:.01.01000 a International Biotechnologies Inc., New Haven, CN, EDA.
Uma forma desejável de modificar a codificação de ADN de um pel 1 peptide o, é por utilização de PCR. Este método pode ser utilizado para introduzir o ADN num vetor: adequado, por exemplo por manipuiaçáo em locais de restrição aaequ&amp;dos, ou pode ser utilizado para modificar o ADN de outras formas úteis, tal como 3i: § saoido nii eipidi a li dadi|i!i! ijjljltfel^lllmildio, Jj AD|l|i':'l|:f;i ίίφ:^ é | flanqueado por dois iniciadores específicos que ficam, eles próprios incorporados no ADN ampli.f ícaao. Os rnicr scores ii êáp|Íd:i::i|ioáii: podem cohief: 1ϊ1;ρόφ:|1.:.:.:1φ:* |4^1 endonucleases de restrição, que podem ser uticizados para i id|.onaipiiiém vetjdfesiiii||é expredÉ;ã:0'-i:dfiiiiiadpddi^d;td4:C'f''''qdpA?sçidpp 3; na e s p e c i a i i d a d e. ...........::Í|iiii|:DNÍiiiÍ Ij.tilnbiiida so.- iie ||b ti# φ-§ f :#fc 1 j j i:Áht|:Í 3 %' entâ o | expresso nuru hospedeiro adequado para produzir um pí-;J-ipes:.-r.ideio que compreende o agente da invenção. Assim, o ADN que codifica o polipeptideo pode ser utilizado de acordo com técnicas conhecidas, modificado aproptiadamente, tendo em conta os ensinamentos contidos no presente documento, para construir um vetor: de expressão que é então at i .11 ta do para transformar uma célula hospedeira apropriada para a expressão e produção do polipeptideo. Tais; técnicas incluem as divulgadas nas Patentes dos EUA K°s: 4440859 concedida a 3 de aorrl oe z984 a Rutter |· |pl| 411110'I ::|||:ncedidi :i|p3::.|dd; juino de 1980333^11335^ ii 4:.5:|. cd||ii;i;i:d:|ll|a X 5 dê llldri 11 de 33! 9 8 6 i ψ 'Ur ou p 5;; 3 :4:|f 7063........... ..... ::|:ipc;eiiilllil|: delllmho. de 111 f 183 a Mark et al. ,· 4 678 /51 ,ll:a 71 did gulihdlldê 1 Sililiia Uoedílelili 4 7 0 4 362 concecsKm a 8 de novembro de 1987 a Itakura et al., 4710463 concedida a 1 de dezembro de 1907 a Murray, 4 757006 concedida a 12 de juino de 1388 a Toole, jr. et al. , 47 66075 concedida a 23 de agosto de 1988 a Goeddei et al., e 4810648 concedida a 7 de março de 1989 a Stalker. O ADN (ou no caso de vetores retrovirais, ARN) que codificara um polipeptideo, pode ser adicionado a uma vasta variedade de outras sequências para a rntroauoao num hospedeiro apropriado. 0 ADN companheiro dependera da natureza ao hospedeiro, na maneira com que o ADN é introduz.ido no hospedeiro, e se é desejada manutenção ep ia somai ou 1 ntegraçao·.
Geralmente, o ADN é inserido num vetor d.e expressão, t.ai. como um plasmideo, com orientação apropriada e um quadro de leitura correto para a expressão. Se necessário, o ADN pode ser ligado às sequências nucleotidicas de controlo regulator,, o da transcrição e tradução apropriadas, reconhecidas pelo hospedeiro desejad©/ apesar de tais controlos esLurem geralmente disponíveis no vetor de expressão, O vetor e então introduzido no hospedeiro através de técnicas padrão, lilies^·jpdy ® rtO:iÉ3iiiÍi;^árâ! ÍÉSí: Sêveã d ii Μ1 ® r iinf d. ,11 sexãll jlliid aidil· r idllisf êiêê rpnilli:::, pApêl 1 3 ψβ: lllihDÍ|iedêll|||ll|tJã:n |t|||3lléçhiiÇS. ':dU|.: 1 li incorporar no vetor de expressão uma sequência de UNA, com quaisquer elementos de controlo necessários, que codifica para uma caraoteristica selecionável na célula transformada, tu.·, como resistência, a antibióticos, Aiternativament;e, o gene para. tal caracterx st ica selecionável pode ser: outro vetor, e utilizado para cotransformax a célula hospedeira desejada,
As células que foram transformadas pelo vetor de expressão da invenção são então cultivadas durante terupo suficiente e sob condições apropriadas conhecidas peros peritos na especialidade, tendo em conta os ensinamentos divulgados no presente documento, para permitir a expressão do polipepfcídeo que pode então ser recuperado.
Muitos sistemas de expressão são cvunu--··dos, '.ιηοΐ^·-oco bactér ias ípor exemplo, Escherichia coli e bai- -·*··'us scfct.1 ; χ s 1 , leveduras (por exemplo, Saccharomyces c^.s.ev >oxae; , ruugos filamentosos {por exemplo, Aspergillus) < celuras venerais, células animais e células de insetos.
Os vetores incluem normalmente urn .r.epi:-cao procariotu, tal como o colEl ori, para propagação num procar iota, mesmo que :í.....0' v|fcc#!!i:|dNÍ itllllllil ipa:rl:iia _ | ........ ........: ciftlá:||ll:|i;PÍp;rÓiilíili1vetores também p§:de|t'j 1 Pç:;i|p|f^ íaÍssss promotor apropriado tai como um promotor procatiota capar de llligipliix |lldX|s:ie'l|ilp l|l;ranip:iiçld:: |%. célula hospedeira bacteriana, tal como a E* colxf transformada :1|ΐΡ:0ηΐ Í::S:f;iq „ i:
Um promotor é um elemento de controlo de expressão formado por urra sequência de AON que permite a ligação de polímera se de ARN e que ocorra transcrição. As sequências promotoras compatíveis com hospedeiros fcaeterianos exemplificativos, são normalmente fornecidas em vetores plasmidícos que contêm locais de restrição convenientes para a inserção de um. segmento j||:é 5 nvençáo,
Vetores plasmidícos procarxotas típicos, são o pUC18, pUC19, OBR322 e o pBR329 disponibilirados pela Biorad Laboratories (Richmond, CA, EUA), e o pTrc99A e pKK223--3 disponibilixados pela Pharmacia, Piscataway, NJ, EUA. 1 ÍÍDjíí. '^^!i^ÍÍÍÍiÍiÍ=:P^ disporsíbi lí zado pela Pharmacia, Pi a cat away, NJ, EUA, Este ......^0^φξlit:il^i:Íl!Í!|x'o|lb||'|: ifcdjil §i|r|gJllL expriliio _ de genes cionsdos, sendo que o nível asais alto de expressão é encontrado nas células T produtoras de <rnt.lge.nof tal como as .....|1dl|;i||.a.s ;|q|l|l||l
Ura exemplo de uia vetor de expressão de mamífero induzível é o pMSG, também disponíbilízado pela Phannacia. Este vetor I !iit:;l|dpiãís:d.....pif I- 111 ái||pi répiillpãllt
JhpliMilil! ipngpldo Ρ:||:ρί|. tumor a '1 ápIilf^l.pl.gdliiltO';: pa:tá::,dítiipitjls a expressão do gene clonedo.
Vetores plasmídicos de levedura úteis são o pRS403---406 e o pRS413~416 e são geralmente dísponifciiirados pela Stratagene I Cloning Systems, 'Lo |||§:1:|4:::. CL Vl:|Í3§|; 1¾¾¾.3i;i: 1! ! ptilQll, pi®:4 0 3 <§ pRSliiliiii&amp;ãiil^ if p:at||l!1:e:ypdd:rd|: i :f i|i;|p|lll|ll:à'St. Integrating p||§gmida'}|:ρ iirgd:tp||pp|:dp.....maxcafc§p|. ::| .§ ÉNLfiilíllil d| lefedura Í||SJrl|lRLi , LSU2 e r/RA3, Os plasmideos ΐ pR3413-4I6 são plasmideos com Centromere de Levedura íYcps -...... : Yeast Centromere plasmids)*
Outros vetores e sistemas de expressão são bem. conhecidos na especialidade para utilização com uma diversidade de células hospedeiras:.
Num quarto aspeto, a invenção fornece uma célula hospedeira recombinante que compreende uma molécula de ácido nu ciei co de acordo com o segundo aspeto da invenção, ou um. vetor ·|ρ|1|ί|ρ·ο.;| G:om|||ii t |ll:ét.xlll|;|:p|t:0 da isinveqçipl; 11 llllllileferi.vf||te|:|iii, á||||é|u:I.á hospedei|é| l jé;f uma célula . b:|p te ífi a na ou I|:i upll! çé 1 ui;!!! d|i marai 1. f x o, t ã|. 1 Pptíbllumasgii' bilímanãil .....VÉIhlpshbppédèi.;:ts ippd e Is e;r p| oca· r í gt <$ pil lé B| r células bacterianas são células hospedeiras preferidas e normalmente são uma estirpe de S, colí tal como, por exemplo, as estirpes E. coli DH5, d ispon i bi1i za das pela Bethesda
Rl|;|:|:rgÍ Laboratories lh|lL.||B|;f.!Í|sdPf......... MD, EÃJh, e a RR.1. |
díJ||||à:pí 1.1 xai|: pela Lmerú::ii|:h|T'|;Í|e!d|jl.tufl: Collection (LTCC) I ' ,- a - iPiirte Rockville, MD, EOA (5Je. ATCC 31343), Células hc-V e d® feucsar iotas preferidas incluem células de levedura, ^.;l0 sarai feros, p r e f e r i ve Imente células de vertebrado tai*’ de um rato- ratazana, macaco, ou de linhas celular©-’ 1 ........ :: ‘j .Ο V ** fibroblásticas e dos rins. Células hospedeiras de incluem a YPK499, YPH500 e YPH501 que são <3eta, C* v , Toi·*1·* dísponibili radas pela Stratagene Cloning Systems, na <·· ' . v- fp' l- ‘ * 92037, EUA, Células hospedeiras de mamíferos P-:·"' fC>tfC.» incluem células de ovário d.o hamster chrnv"- < 0$ &amp; disponibilizadas pela ATCC, assim como as células ,-4$ 293 que são células erabrionárias de rim humanas, ce-^· . r. qfstao.«t inseto preferidas são as células Sí:9 que podem ser tru^-’-" com vetores de expressão do baculovlrus. Ά transformação de células hospedeiras apropriaoas com um construto de ADN da presente invenção é conseguida por métodos bem conhecidos que dependem normalmente do tipo de vetor ué! lizado. Uo que respeita à transformaς:ão de células hospedeiras procariotas, ver, por exemplo, Cohen et al,, (1372) I Ér:ocfclilisiicad 1 Si&amp;il. USA S9|l!2.ÍÍ)ÍS:e)))Sãmbf 00ίϊ%tt ψ^;(:νψ§gi|::ii: I Molecular Cloning, A Laboratory Manual, :i::i:
Laboratory, Cold Sprang Harbor, MY. A transformação de células de levedura é descrita em Sherman et al,, (1986) Methods χη Yeast Cenetfcs, h Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, O método de Beggs (1978) Mature 273, 104-109 é também útil. No que respeita a células de vertebrados, .reagentes úteis na transfeçâo de tais células, por exemplo o fosfato de cálcio e DEAE-dextrano ou formulações de lipossoraas, estão disponibiiizados pela Stratagene Cloning Systems, ou p<aia yyf<r> Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, EUA, lllllllll Aiiéiiétrõipdrádpb i)||iliMbÉm util paiililllriii! »/ou i 1 iibiliisfiifc|;çIo :||ρ c;| |ρ3-ί|:|1||β bem: çcnhscillll il) i âi:|)|an|:fqrmáçiip (pi ui .i Hl células de inseto e células de vertebrados.
Por exemplo, muitas espécies bacteríanas podem Sfir transformadas pelos métodos descritos em Luchansky er : ........'φΜξ :||ώ||||&amp;||| II 0 rfiaior |«|||:ii|âlll transforrcíantes é consistent emente recuperado após elet.rcporaçáo da .mistura ADM-céluIa, suspensa em 2,.5 PEB Utilizando 6250 $t por cm., a 25 pFD. Métodos para a transformação te leveduras por eietroporaçâo sâo divulgados em Becker &amp; (áuarente (1990) Methods Enxymoi. 194, 182, Células transformadas cora sucesso? ou seja, células que pdUifc:Ém^ préééhti©:) invenção, podem ser | íder,ti£içadas por técnicas bem conhecidas, Bor exemplo, as .................è:-ipíiil.-iíii g>
Ilida presente ::^lpódéfi sei: Ιό?1!5-1-ií:^^ΐίΡ·^^lll po.l i.pepti de o da invenção. As células poderá ser recolhidas e lísadas e o seu conteúdo de ADM examinado para a presença de ADK, utilizando ura método tal como o descrito por Southern (1975) J, Moí. Biol. 98, 503 ou Berent et ai,, (1985) Biotech, 3> 208, Aiternativamante, a presença aa proteína no sobrenadaste pode ser detetada por utilização de anticorpos, bdíÉI:· dosC'iitldli abáixêilllll
Adieionalmente a analisar-se diretamente para a presença de AON reeorabinnnte, uma transformação oem-suceaida pode ser dipflliiiadó mét odolã ιρϊ:θ:ΐΐ'|ϊ.'ίϊ?:θ:χquando o ADN || P|phmblna|i.l||e· capas do d!!!i||irial ddprf'aflplda prot eina ,i|||p:||| éiXiÉptpjls: céilúi a s t ran s io||f|§pa. s ||cp|u ||s u ce '1 S:p||qd?|||p'U. y at or |||f;|||
lllproduzem illpiiiielidaal |l yl|f 11| ;:ÍÍÍIII |||ni|:|ihi dl-dlib a:prGpr:i,i:i||||||| .Amo.s'||dll do c<&amp;’X.u.s|; de estarem trq:||;p:tp;p|rat||ip||i: IliliãO' 're|iili.||:s. a ana|||il:iii:| pfliá I d ^:^;|||||||| !!!!!®tiailiiP. |Aftequadon|||||||||||||||||||| A célula hospedeira pode ser. um a célula hospedeira dentro de um corpo animal não-humano. Assim, são incluídos animais não-humanos fcxansgénicos que expressem um agente de acordo com a invenção (ou uma fração de ligação respetiva) por virtude da presença do transgene. Preferivelmente, o animal não-humano transqénico é um roedor, tal como um rato. Os animais nâP-iumános t.ransgsnicos· podem -sex' criados pox utilisefS.©' d© métodos hem 'oonfseoldos. na especialidade:»
Num quinto aspeto* a liwengfi:.© fornece uma '®®psii||ú faxmaedutida que οοχΏρχΟοηΡ©· uma quantidade e fica a ã&amp; Mrs. anticorpo: ©u .respetivo· fragmento de- ligapa©' as an fel, g eivo·, da invengl©:f e ura: tampão 'fa.lraa.©eufcidam:©nt© aceita mel > exóiplente?: dlluéute ou feituls, imá. "quatttidade toNiapeNtio-amente: df I ©&amp;&amp;*% ou ''quauf.idade eficaz·"* :qq. “texapeuticamente: afίε®2-% tal com©: utilizado ts presente· documento·* refeie-so &amp; ·ρη entidade; que fornece um efeito terapêutlc© p.axa. uma dada ©'ondiqS© e regi me: de: aámiuisetxaqâo·.. Esta ê. ama quanfidada' qxedeterminada de' .anticorpo a ti xo, calculada paxa prdduxl.x um efeito texapêutiot: desejado em., associagã©' com © aditivo· e diluent© nédeás âr iost ou s«:j.âf um- veioul© Pu textulo de admxnistxagã'©,,: Sdieionalmentef pretende-ne que signifique unta, quantidade· pufiolnnt©· puxa: réduzlx' tu. prevenir um défice; oliniceMeni©. signlf reativo' 'na atividade* fançâ©· d. resposta. dd: 'hospedeiro:·,: Ui.terna:tluamentey ama quan.ti.da.de texapeutioamenie· eficaz é saf Icienis: paxa paU-Sax uma melhoxia da uma condi gâ©·. elinlesmemta signi fica ti.ua. num hospedeiro..· Tal tema é apr:e©iad©; "pelos pexitos1 na ©specie lida©©* a quantidade de PdíHpes tp: pode variar depesdende da sua. at. it idade· espeeifioa.:.· Quantidades de dosagem adequadas: podem conter uma quantidade pxedetéxmlnads de: q.©mp.©si.g:i·©: ativa;:í caic·.·i^da para produzir· e efeito terapêutico desej;ado. em «ssa.ei.a.çi&amp; dom .©; diluente. neoeasàxid:, dma guantida.de texapeutioamente eficaz· pode sor deteiminadá por um. geríi© noxmal aã e..speoia:I.idade medica ou deteridâxia baseado nas: oaxadtexi:St:i.ò:as' do- pa©lente* tã.fs ooffiô ideda* pes·©* seis, condl-plOf. compiloacdes* puirás· áasaças·, situ*. tax tomo d hem dondecido na espemialldabe, dssiiri.f o- antipoxpp ou .respetivo fragmento· de ligação ao antigenO'pode sei' formulado -a várias ooradent^lapoes:if d.epeude:ndo da. é:fu.d:a.c.i.a../t.Q:x.i.'òidade^ do poli peptide©· que: está a sor utilizado, Preferivelmente, a f oro·;; ia ca o coup rear; de o polipeptldêo atido a uma concentração de outre: §:f 1 ntt e '1 mM, por exemplo entre 1 μΜ e SOO μΜ, entre SOO μΗ e 1 nil, ou entre 300 μ Μ e 7 00 μ,Η..
Ho termo 'farmacauticaTuente aceitável" está incluído que a formulação ê estéril a livre de pirogonos. Veicules í a rma ce u t i earner; t a aceitáveis sá o bem conhecidos na espacial idade de farmácia, O veiculo (s) Ceve(m) ser "aceitável (is) ' no sen tido de seriem) compe;t:ível|lc) cem o anticorpo da itvvençáD e não prejudicial ris) aos: recipientes rasp a ti vos, bermaImente, os veicules serio água ou seineso salina que será estéril e livre do pirbgenos; no e:ntanto:, podem, ser utilizados outros veículos aceitáveis.
Tampões, diluentes, veículos e oxcip restos farmaceut.) camonto aceitávei.s adequados, são bom conhecidos: na especialidade (ver Remington^s Pharmaceutical Sciences, 10* edição, A. u Genua ro, Gd,, Mack Pub listing Company (1990) e handbook of Pharraaceutical Excipients, 3;' edição, A, Kibbo, Ed, , Eh a rmâ cê at real Frees (100:5) ),
Fret ends ~se que o t e rmo"t ample" inclua uma solução aquosa que contém uma mistura ácido-base com o objetivo de estere lixar o pfL Exemplos de tampbes são: ã irixma, Bícina, Tricina, MOPS, MOPSO, MODS, Tris, Dopes, REFBB, MbS, feetato, carbonato, acetato, citrato,: giicoiato, lactato,- borato, ACES, RDA, tarta reto, RHP, AMPB, AMPSO, BED, CABS, oacodílato, GRES , DIPSO, EPPS, etánoismlna, glicina, HEPPSG, i midasol, ácido imidazôlolático, P1FK3, SBC, SSPE, PGPSO, TAPS, TABS, TAP30 e TER ,
Fretobde-so: que o termo Mi l eant e " inclua uma solução aquosa ou não-aquosa com: o objetivo de diluir o agente na preparação farmacêutica, 0 diluente pode ser um ou ma 1s de solução salina, água, polreiilenog1 icei, propileneglicol, etanoi cu óleos (tais como: o Moo de eârtamo:, ôleo de milho, oleo oe amendoim, óleo de semente de algodão ou óleo de sésamo) >
Pretende-se que o terms "adjuvante" inclua qualquer composto adicionado à formulação para aumentar o efeito biológico do agente da invenção» 0 adjuvante pode ser um ou ma is de sais de zinco, cobre ou prata, cora diferentes aníões, por e< empio, ’τι-¾.¾ a, fluoreto, eleito,|1 ls.:. jj||ódet-íj|: jbiioeliilid, fed.;£d^;f ato,ljca:bb<IÍ'a:to|j lactal.o, g.Iicolato, citrato, borato, tartarato, e acetatos de composição acilo diferente. Os adjuvantes também podem ser polímeros catiónicos tais como éteres; de celulose cat.iónícos, ésteres de celulose catiónicos, ácido hialuròníco desaceti.lado, qui tosaria, dendrímeros catióni cos, polímeros o pel í vl ttí 1 iírtxdiiiibé:,j|l|; | poiipeptideos catiónicos tais como polihistidína, po|i:§if.s.iri|j| 1 i poliarginina, e péptidos que contêm estes aminoãcidos. ’|ii!!!ii:;.;Q:ac um. ou maís de oarbefeidratosg........
Is:: polímeros, iipidos e minera is. Exemplos de carbohídratos incluem lactose, glicose, sucrose, manítol, e ciclodextrinas, que sâo adicionados à composição, por exemplo para facilitarem ......de |||||f' celulose, 1|| jlldlil-ldllpi imeiilclf uiosll |n í drox 1 celilose ,|| etilbidroxietilcélulose, aiginatos, oarragenínas, ácido· hiaiucónico e derivados respetivos, ácido poiiacrílíco, polisulfonato, polietilenoglicoi/ óxido de polietíleno, poletiienoóx.ldo/ óxido de polipropileno, álcool poliviníiico/ acetato de polívinílo com diferent.es graus ae hidrólise, e poiivinllpirroiidona, todos com. diferentes pesos moleculares, que são adicionados à composição, par exemplo, para controlo de viscosidade, para conseguir bioadesâo, ou para proteger o iipipp deiidigradaç&amp;d: jj; i ii · Ip^ddpidpll^qjji
Iipidos são ácidos gordos, fosfolípidos, mono···, aí···, e trigiicéridos, ceramidas, esf ingolípídos e glícoiíp.idos, todos com comprimentos da cadeia aciia e saturaçao diferentes, lecitina de ovo, lecitina de soja, ovo hídrogenado e lecitina de soja, que suo adicionados à composição por razoes |:éd||,ha||é| Id: dll Ι1®®ρ|:Ιό11Ι:ΙόΐΜΐ8 4§|§:ίηΙ§®ί|; sâo | talco:,||| I óxido......cie......mdghpbid:!: iiiillida ôxpsfe' 'que 'Sâcó|| ^lillliliplillãdis à ο#4|®141ο Ipsrá a '::P&amp;tJp§:|4 v:t&amp;.i::s||| I l'4ygo||ll®:dlyã·» ddl: llillmulaqiil..............do ::41l||bt.fp o-d? propriedades | |g:ai|t:|;|iys.d:|i do 'pf .
Os agentes ativos baseados em anticorpos da invenção podem ser formulados eta qualquer tipo de composição .farmacêutica conhecida na arte como sendo adequada para a respetiva entrega.
Numa forma de realização, as composições farmacêuticas da invenção podem, estar na forma de um lipossoma, em. que o soante é combinado, adicionairaente a outros veículos ! f a 41 a ce ut i.;iiilifpugçpf tide 4%· ,céf 1a góp |.ρ g||i|iqf Itpbs 11 como 11 feitiPiPlãJl's .1 nsdldd'llii old|tif fqj,η:Ι|ο-:daiy gl,;:|:|||p.1dos adequados jt ! yiaipbll;: llilmaçppl; i| i ii l|l||50''sl df id ||;:: inglpl^ 1:: | lÊill# .4 1 gdSO||:Í ídpdidO.S·,: | ídlgfli Jí fosfolipidos,.· saponina, ácidos biliares, e semelhantes. Lip.idos adeouados também incluem os lípides acima modificados pelo poli et i.ienoglicoi no grupo cabeça polar para prolongar o tempo de circulação na corrente sanguines, d preparação de tais formulações lipossoraais pode ser encontrada por exemplo na pa t en t e do s E U.?-. 4 2358 7 .1. I lis 14 9ÍB;;;yll; 1 est.Sir na forma dc: microes iqí-ÉiiS· bilÉÉPIpaqÉIP-fiVililg ideÉt dpqf í: i 1 a .1.1.fát i.cos t t ais como isòiid:S:|.:dpi::-' 'ρο.|ρ4ρρ|ιηο::: '1 ff1 '1 | poiiqiidllico 11|APGi liélll1-H|dP^íilil': ...................................111 1 po .l icaprΡΐ&amp;ρρρρ f llll PCldl| | i dl. gqill· ||f tdr id' .f ppipl ί. gbp 1 emente .. 1 |4#^^L2^|^o-^||||ÍÍiiWí^|||!iiiÍiÍlÍÍíSri^Í^NÍ 11 I lâldlosllellllli Pr·©pa.11 ^ίϊ^ΙΙΡ-^ΐίΐ·# II ddednfcradas na patente ddslíSddl 4:.bi:;p.|bg;:p^ (3;2:ld'l:6d4l\v;: 1 N uma forma de >iii ϊ ii’ farmacêuticas da invenção são fornecidas na forma de géis políméricos, onde polímeros tats coito o amido, éteres de | celulose,, iligtó | lltqil '':l;idfi:nl:p:Se:il;ll h i d r o x i. p r o pii me til c e X u 1 o s e, h i d r o x i e 111 o e I u .1 o s e, etilhidrox i etílcelulose, e1g in.a to s, carrag en inas, âci d o hialurónico e. derivados respetivos, ácido pole acrílico, p o li v i ni i i ri i d a z o .1 e , p ο I i s u .1 f on a t o, p o 1 i e t ile n ogi i c o 1 / ô x .1 d o de polietileno, polet 1 lenoòxido/ copo i i meros de. óxido de poiípropileno, álcool poliviniiico/ acetato de pelivinilo com diferentes graus de hidrólise, e poiiviniipírrolidonu, são utilizados para o espessamento da solução que contém o agente.
Os polímeros também podem compreender gelatina ou colagénio.
Aiternativamente, os agentes poderá simplesmente ser dissolvidos era solução salina, água, polietiienoglieçi, propilenoglicolf etanoi ou óleos {tais como o óleo de çártarao, òleo de milho, óleo de amendoim, óleo de semente de a 1 godào ou óleo de sésamo), goma adragante, e/ou diversos tampões.
Será apreciado que as composições farmacêuticas da invenção podem incluir iões e ura pH definido para potenciação da ação do agente ativo, kdicionalmente, as composições podem ser sujeitas a operações farmacêut.icas convencionais tais como esterilizaçáo e/ou podem conter adjuvantes convencionais tais como conservantes, estabilizadores, agentes de humedecimento, emulsificantes, tampões, enchimentos, etc.
As composições farmacêuticas de acordo com a invenção podem ser administradas por qualquer via adequada conhecida pelos peritos na especialidade. Assim, vias de administração possíveis incluem: a parenteral (intravenosa, subcutânea e intramuscular), tópica, ocular, nasal, pulmonar, bucal, oral, ! pdfentiferailjjivá§fllílÉisP ή®'l!Ès- :lambélf 1 '&amp;$ possí:;g;Ól'''''''ãdmÉpistração j Ê a|jp'arii.r jii .ii j||||||||||||||.
Vari 1'ajosamente, a coRiposição facmacéutica é adequada para 1:|;:|Μχη1:δόη:||!:|ο. íii: óu pólio dp: 'dócil, di/tpffiip/ por exemplo, por Ijiiã i:Í!fr;al:ipo:'|iÍ :|j|||pe:ri:t!Í)ror:al, .Ijjjjj :jf|: ptiÉirilili? :i|iillã. ;/ jl: para plilllliilllijljiltlipd ;pi:b:ã::;::i0;f Óf Íͧ^ pill) c anfci.q||fcpsiSt$timáli^^ f ãlllãdêntdqaM serão bem 'ephhecrclp-p;·;:: pelos peritos nas especialidades de medicina e farmácia. São descritas composições preferidas nos Exemplos anexos.
Os agentes (ou seja, anticorpo ou respetivo fragmento de ligação ao aetígeno), medicamentos o composiçoes farmacêuticas da invenção,: pode;*· ser entregues uli.I i ?ando um sistema de entrega de fé roucos de libertação sustentada írnetàvel. Estes são desenhados espeeifiçamente para roducxr a frequência de injeções, hm exemplo de tal sistema é e Nutfoçin Depot que encapsula hormona de c: tea cri monto humana, recombinant e (rgbH) em m icroesteras b.i.odegradàve.i s que, uma ves in jeca das, libertam riíSh len lamente durante um período: prolongado.
Proto ranch almcnle, a cal rega c rea ; 1 rada i.ntramuscularmente li, eu) e / ο α subcutaneamente í s . o,) e/ou íntraeênosamente {i. v <} .
Os agentes, medicamentos: e ccesçosiçôes tarma cent iças da invenção podem ser administrados por um aparelho cirúrgico que 11 bcr ta o f a rma o o d i r et amo n te no loc a I no cos s ár: io, Po r eeemp lo, O: Vitrasert liberta: qanclclovir biretemente no: olho para tratar a retinite por CMVt A aplicação direta deste agente tóxico no local da doença consegue: arid terapia ericas, sem os significativos efeitos secundários sistémicos do fármaeo,
Os sistemas de terapia por e let topo raça o (TElh também: podem ser otilixados pare a administração de agentes, medicamentos e composiçoes farmacêntloas da invenção, hm aparelho que entrega um campo aiotrice poisado em ceioias, aumenta a permeabilidade das células ao tármaco, resultando numa melhoria signif íoativa da entrega ititracelular do fármaeo,
Os agentes, medicamentos e composicóos turmacéus icas da invenção também podem ser entregues por eietroincorporaçao {EI) , A BI ocorre quando parti cuias pequenas de até 30 microns em diâmetro na superfície da peie, expeximehtam pulsos elétricos idênticos ou semelfeantee aqueles utilixados na eletroporação, Na EI, estás partículas elo dirigidas através do: estrato corneo e pars camadas mais profundes: de pele. Estas partículas podem ser carregadas ou revestidas com. tármacos ou genes, ou podem simplesmente agir como 'vbalas'" gue cru ara poros na peie através dos quais os tárrnacos podem: entrar.
Dm método alternativo .de entrega dos agentes·,,· medicamentos &amp; composições £ãsmaoéutiea.s cia invenção ê o sistema inj©tavel Bedel,, nine é termossensível, dbaixo da temperatura do· θθ'Ρρ©:,· o BeSel e urri: .liquido írjçtáv#],, enquanto que a teíBpsra.tura do corpo f&amp;trara Imedlatamante· um reservatório de: gel que ao desgasta 1 antamenta δ * dissolve em pol.imeros: eiGo.feeodcios^: seguros;, 'Biodegradáveis, ,% substância otlva. ο entregue: .© longe do' tempo' ô medida que e.s odopciimeros se di ssolvem',, ds agente s , medicamentos e composigdes: farmacêuticas da inventl·© também .podeat set er.tfcgues: gmlmanto, D processo utiliza ura processo natural para. ca.ptaçã.©: oral da. vitamina .&amp; e/ou vitamina D ts corpo, para td.ent;rt'dar:ptgtoifi:a:S e: peptides, Aq serem levados, pele sistema: de CâptaeS© da ui tarai na. Bus eÇou vitamina, D, os agentes, ffiedxcamanCo.S': e composlcdes1 farmacêuticas da invenção· pedem mover-se através da parede· intestinal, São: sintetizados· complexos entre· anâlogoa1 da Vitamina Bis e./gn análogos' da vitamina. D, e o fármaçg nu.® retêm all nida de 'significativa peio fator lot line eco- · F!) , na. .porção do vitamina Hm / porção do vitamina 1 do rompi emoç © Moa tl vida de· .slgnl.ficativa, da. 'Substancia: ativa dg completo·-:
De agentec, medicamentoe e ceopcMpOes: famaoSuticas^ da. invenção podem, ser inirgduaidos em. células: por 'wpdptidps Troianos", Estes· sae urna eiacs·© do pdlipspaldeoS' eBãmados· penetratiras que· têm propriedades. do 'translooução-e são csp-axss de irarspdrtar eomposics nidrofi lidos através da membrana pls.smátí-os.. '.Este sistema: permite um axvegamonto: direto do çitoptasma e do nudieo por Olxgopeptidsqs:.,,· s· podo ser nâ o-especifico1 ao· 'tipo. de célula: e altamente eficiente·,: 'Ver BefosSx et âl,,, íilBSi, 1 rends Soil Blol, 0> 8l-B7:,
Preferivelmente, os medicamentos' e/ou οοΡρο;οί Oõês farmaeéatieas da prssenla invemgáo. sip uma dosagem unitária que contém uma. dosd diária gu unidade:.,* tubdose: ou uma fração·· apropriada, respetiva, do Ingrediente: ativo·,
De agentes, medicamentos1 a Composições. fârmaoêutloâ.8;. da iiv/enção irão normaImente ser admmist.cactos otalmence ou por qua.tquer...............pteehidddl, «a: ||fa|pá::: | if ι^ϊ^^ΙΙΪ|: farmacêutica eras compreende o ingrediente ativo, opcionaimente na forrna de um ácido, ou base, sai de adiça o, orgânico v;nãdt ÉóiXálçp rdll ixidÉiiâpiidPi numa: rí::ϋi: i aceitável. Dependendo do distúrbio e paciente a ser tratado, assim, como da via de administração, as composições podem ser ......db¥:'do#e:i| pdiiÉvei::|||:
Na terapia humana, os agentes, medicamentos e composições farmacêuticas da invenção podem ser acfeunxat.xaaos sozinhos, mas serão gera Imente admin.·, strados em mistura comum exci.pi este 1¾.. ,,::f qpnraceblri c am e^i:Élladei|said di lf|f {|f t f|oi| ipé í1 fçiçça:fíga s:
'::|;:rl;;eúd:p.. em.......Çpbtq ãS:::'V:Íá;::. de :ÍS:Ç^1ÍÍ.£1 a. p||at l|Çg:|: I farmacêutiea padrão.
Por exemplo,· os agentes, medicamentos e composições farmacêuticas da invenção podem ser administrados oralmente, hues .Imante, ou subi íngua.emente, na ror mu de <.x>m.pr .umidos, cápsulas, óvulos, elixires, soluções ou suspensões, que |pr!^|Í||Í||ê|i | f# c©r|nt|||, 11 | If ft| I :!Jp|fll||j|:Ilde. !!!Íbí!!.|!c| |:áld|al|li reiá'|<|4:f.| ou c:o|tií:||-dÍ|rl|í|;S| | !§ ||m|||i|peá f;fticag|da||n|:|riqp|| :!| também poetem ser admínist r aoos ou-iavès de '.nieça·^ int racavernosa.
Tais comprimidos podem conter exciprerues ta;.a corno celulose míorocristalina, lactose, citrato oe soua.o, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio difeásico e glicina, desintegrastes tais como o amido {preferivelmente, amido de milho, batata ou taoioea; < glico.lato de a/aido de sodxo, tr9:rfypu;;e.i.0oe de sócio e certos silicates complexos, e ligantes oe qicinul«çáo tais ! yjp.........I!íp|iviniMMMàMPfÊ I f 1Stòtlí .....: hidroxipropilcelulose (HPC), sacarose, gelatina e acácia. como o estereafco de magnésio, ácido esteárico, oeenato de çíiiceríio e talco.
Composições sólidas de ura tipo semelhante, tarsbêm podem ser empregues como enchimento em cápsulas de gelatina. A este xespeito, excipientes preferidos incluem a lactose, amido, celulose, açúcar de leite ou políetilenoglicois com alto peso molecular. Para suspensões aquosas e/ou elixires, os agentes, medicamentos e composições farmacêuticas da invenção podem ser combinados com vários agentes adocicant.es ou aromatizantes, matéria corante ou tinturas, cora agentes emulsificadores e/ou de suspensão, e cora diluentes tais como a água, etanol, propilenoglicoi e glicerina, e combinações respetivas.
Os agentes, medicamentos e composições farmacêuticas da invenção podem ser administrados parenteralmente, por exemplo, intravenosamente, irrtra-arteríatraente, intraperitoneaimente, intrateoalmente, intraventricu1armente, intraesterna1mente, intracraniaraente, intramuscu1armente ou subcutaneamente, ou podem ser administrados por técnicas de infusão, São melhor utilizados na forma de soluções aquosas estéreis que podem conter outras substâncias, por exemplo, sais suficientes ou glicose para tornar a solução, isotónica com o sangue. Se necessário, as soluções aquosas devem ser: tamponades f a:<|pgú||êil|ú:t© ·|^^ί^ί|ι3Ε;^;ϊτ·ΐiiirip f!!lltl ;piHllllllÍte.||lé'llllllil. 9) /|Élll f f|;|||l|:áçiõ|P!||||rM i fí|||p|||ii;çõ éil|| j|:pa;dt|p:. ;S|íii©m:|p|i|| pllitos. f^álliiliirli 111 |||lqquadaP||:|pa |iiͧ§||^ 1 ué|i: Opllxf·||ί||||ί iplpiçlple st bacter.íostát i cos e solutos, que tornam a formulação isotónica com o sangue do recipiente pretendido; e suspensões estéreis aquosas e não-aquosas que podem incluir agentes de suspensão e agentes espessastes. Os medicamentos e composições '%d;ii:§í Í3S^:i3: O S ^ÓÍÍ! única ou rnultidose, por exemplo ampolas e frascos selados, e podem ser armazenados numa condição de desidratação por congelação (líofilizado) requerendo apenas a adição do veiculo liquido estéril, por exemplo água para injeções, imediatamenfe antes; de utilizar. Podem ser pr opa radas soluções de injeção ........extemporâneas e sflptnaõeO' a lpaçfi;:f: :^θ!ρφ:||ΐρΐ·|ί||.ι,&amp;Λ IliilÉós i 1§1 comprimidos do género ilicáiieíis^ir: .Ò|jáòeiteé, medicamentos ií composições.....J:Íixisaáluti:pailli;Íi. 11 IpvençlÇ· taflfeám pqderi sor i: inalação, e são eonvenientemente entregues* na forma de um-inalador de pó seco ou uma apresentação de pulverização aerossol a pari. ir de ura recipiente pressurizado, bomba, pulveri zador ou nebulizador com a utilização de um propelem.o adequado, por exemplo díclorodif .1 uoraraetano, 11 Iri ο I erpl§lpó|§§|:||^ ;ss;iilli:ielpp blói: pai lllif e ta η o '::ll||||||:;, uilll ΪΙi|i como c ljlç;lj. lt£||:|t ra||ili|Í|::|:no '"llliâ. I l||j:i||||i ou 1| 1, lllllp ||> 3, 3 --3re|!M |:bp:a:n:Sl||||^ ............. dióxido de carbono ou. outro gás adequado, No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada pelo fornecimento de uma válvula para entregar uma quantidade medida, 0 recipiente pressurizado, bomba, pulverizador ou nebulizador pode conter uma solução ou suspensão do agente ativo, por exemplo por utilização de uma mistura de etanol e do propelente como solvente, que pode adicionalmente conter um lubrificante, por exemplo trioleato de sorbitano. As cápsulas e cartuchos (feitas, por exemplo, de gelatina) para utilização num inalador ou insuf lador podem ser formulados para conter uma mistura de pó de um agente da invenção e uma base de pò adequada, tal cotio lactose ou amido, 11111111¾.....iqirfdi:,corapos;||:C:f:lll| ç.....farmacêuticas da invenção podem ser :%'%?t|h;|:b:tl:Éidç: na fçrS|§i: dil|l 1 um supositório OU pessário,. eu ^^x; ........na........forma de iiãallldçl;||| solução-, 1¾¾% pit '||||11 1 ilglifes, mcdlcNlpit 111111:. composi:l|i i^nvlãçlpill também podem ser administrados transdermicamente, por exemplo peia utilização de um adesivo para a pele. Também podem ser administrados pela via ocular, particularmente para tratar doençaa dos o1hos-
Numa utilização oftalmológica, os agentes, medicamentos e composições farmacêuticas da invenção podem ser formulados iiiiçp|PO|f d|||e“soes :ff niddi .a|11|τ|!Ι®;ο:|ίρ salinasiSteàpf 1 isotónicas, com pH ajustado, ou, preferivelmente como soluções em soluções salinas, estéreis isotónicas, coir pH ajustado, |'lip dff!abp|:exÉabf e,i! tal comolifnj | y ii :0|.|ΐ:όί|ο|||ΐο .foi:ncii|;iiçõii'0., iiiiitliinalify; formulados numa pomada tal como o petrolato.
Numa aplicação tópica na pele, os agentes, medicamentos e composições farmacêuticas da .invenção podem ser formulados it iff rs$$: y :;::ppma. id ia. ;Οϊ§;Ηλ Sptf: St 1VO SUSpOfiSO OU '|
iii y dliilo |||i§g cm, iiporiiiilfp ipliiliiiiuma. ,mf Iffli:.......com um ou ma is dos I seguintes; òleo mineral, petrolato líquido, petrolato branco, propílenog ii oo.1, po 1 ioxet ileno, agente po 1 ioxiprop.i Xeno, cera emulsifíoante e água. Alternativamente, podem ser formulados I tf fiaf iilpa |içâO: <ff cri||fiiadl|f:lÍos, |;1|:ρ;§:^|ρ| iif p if i ylfif i:ÉiliiÍÍii,yit :: 1 ipff iilpxempào, u§§s m|s|'if If de: Ifm. .:oulilaiiáiiiiÍÍl:i 1:¾ ;|f: i;f fesp óleo 1 mineral, mso.nostear.ato de sorbi ta no, po 1 ie t i. lenog li co 1, parafina liquida, polissorbafo 60, cera de ésteres cetilieos, álcool cetearilíco, 2-octildodecanol, álcool benzílico e água.
Formulações adequadas para administração tópica na boca incluem lozengos que compreendem o ingrediente at i vo numa base aromatizada, normaImente sacarose e acácia ou adrsoante; yh i pff:lililliáfh fufii com|' tifilifit o,::|fiif© iiaif.ο1||p· bfgi§:'.ii|liffe« :!l yiiff I|fi|moiii|p'.Íiil:'í na? e iff leaf||!l|: Id d^iipo:f^iiiiliiiiilip f | #i;: eJ.ili.rpfiS: ;1 i iílfillili; q||i ciipfíiprriiiii^iipiifd^r·Stg.vt>; nom ¥1 ff filo ligai,||§|iiiiii ti Hildepiliddil! i| f 1| men t e, φ§ |jà u;gfp©· s|.: 1|: %:cii.í ní:i|ill|;i:o.......φφ :;||li§ép||i:s,.... m medicament os e da Vx:bvfb||||| ɧf: fliiiiiii 1 y iff rf p |;p||oça i do Idiffí,.:Jiiiiliijí.lii :|.ff.fiifiip^sii úX|Í?' 'nÍP::: ''' yiyaiailifit:fiàçá'0 iftfaifl^flil OU ppxifumaidfilis....... iiiiiiiiii:pildiiiiut li iilafãifi; fft egfiffá.gi.fif ii:Pi|; agentes:|P:::med:jsffpffffdf e.,sj iiiC:b||pl|iiç:f|:S faf|afiiMitiicafiiii|ii: Ifdf.fçio ido a;||ai:f||if|li|:s fpmfiiiiiii riiiifp formulação l;dé:ff4#fmiÍÉ if acordo com a.....ip:r§|:'ifp......""" ί ii iff texfbilf fa nojia | iè| f ii ©f il§xf|Jp |pfffrlifrifii f lá defcexmf ffaf||b regime de dos;|||ç|i| ΜI f|i§|: iiiiialiiiJii|-Ji^x·^^ iiifçju^· será mais
apropr iado ipa||: xM -!iG
Mum sexto aspeto, a .invenção fornece uru Pit que corapreende uma composição farmacêutica de acordo coro o quinto aspeto da invenção.
Hum sétimo aspeto, a invenção fornece um anticorpo ou respetivo fragmento de ligação ao antigeno, de acordo com o p r i me iro ϋΙΦ!Ρ uma mol écuiu d.^;ii | .............. de acordo com o segundo aspeto da invenção, ou umpelpr·.d|f ãBidoli" com-o- terceiro.....iipifcqlilp ou uma .cèi-ui:|. dlli5 acordo coat o quarto aspeto da invenção, ou uma composição .farmacêutica de acordo com o quinto aspeto da invenção, para utilização em medicina,
Num oitavo aspeto, a invenção fornece um anticorpo ou respetivo fragmento de ligação ao antigeno, de acordo com o primeiro aspeto da invenção, ou uma molécula de ácido nucleico de acordo com o segundo aspeto da invenção, ou um vetor de acordo com o terceiro aspeto da invenção, ou uma célula hospedeira de acordo com o quarto aspeto da invenção, ou uma composição farmacêutica de acordo cora o quinto aspeto da invenção, para |||||Ílllli|á'<|l o 'riiisí· ''"llllllllllirfffer|i<ll|tenf .ο|;ί no1|l|ét.i|||||||/o:||| oitavo aspetos da;; invenção -fexa t a.men t o do ca acro compreende a etapa de administração de uma quantidade eficaz de anticorpo ou fraqpraento de ligação ao antigeno,. ou uma variante, fusão ou derivado respetivo, ou molécula de ácido nucleico, ou vetor ou célula hospedeira, ou composição farmacêutica, a um indivíduo n ec e ss1tado re spet ivo * Ê preferido que, no sétimo e/ou oitavo aspetos da invenção, a etapa de administração a um indivíduo necessitado respetivo, compreenda administração local, por exemplo, administração local a um tumor num paciente (por exemplo, íntratumoralmente ou peritumoralmente) « É sabido que tal injeção local de um anticorpo anti--CD40 num tumor, pode gerar um efeito antitumor sistémico a uma dosagem muito menor (van Mi.er.lo et al., 2002, Proo li at 1 ncac
Kc.í ϋ.'ίΑ, 93: 5561-5566; Kalbasi et al., 2010, J Immunotherapy, 33:810-816) . Além disso, foi reportado que ratos tratados intratumoralmente num flanco foram capazes de limpar tumores no flanco oposto, e que o efeito antitumor depen.de da ativação cie células tíendríticas, e subsequentemente ativação de uma resposta por linfócitos T citotóxicos. Adieionalmente, o tratamento produziu uma imunidade protetora a nova provocação do tumor.
Apôs otimização específica ao paciente da dose de anticorpo ou fragmento de ligação ao antiqeno, ou ume variante, fusão oil derivado respetivo, tal como descrito acima, é então administrado ao paciente a dose Ιίϊί^ί^ΐίίίϊ Ji duração do tratamento. No entanto, será apreciado que a dose pode ser reduzida ao longo do tempo, uma vez que o tratamento comece a ter o efeito terapêutico requerido.
Normalmente, a dose terapêutica do anticorpo ou fragmento .slip. uma! vaxi an tá respetivo, num paciente humano, estará no intervalo de 100 μg a 7 00 mg por administração í base a do num peso corporal de 70 Kg).
Por exemplo, a dose máxima terapêutica pode estar no intervalo de 0,1 até .10 mg/kg por admini s tração, por exemplo, entre 0,1 e 5 mg/kg ou entre 1 e 5 mg/kg ou entre 0,1 e 2 mg /kg. Será apreciado que tal dose poderá ser administrada a inliiilldi,....,. ;$iiid!!! determinado pelo oncologist s/médico; por exemplo, uma dose pode ser administrada diariamente, duas vezes por semana, semanaImente, gpi,n:z:e||i|;i||é.n|Í!Íii ou :mensá:i|llii.t.|i |||!
Numa forma de realização, a dose terapêutica máxima do ..... anticorpo ou respetivo fragmento de ligação ao antígeno, è uma dose baixa. Por exemplo, a dose a ser administrada localmente na presente invenção, pode ser menos de 25 % da dose sistémica típica do mesmo agente, necessária para produzir um efeito terapêutico. Numa forma de realização, a dose é menos de ou igual a .1. mg por administração, por exemplo menos de ou iguai a 500 pg, 400 μα, 300 pg, 200 μα, 100 pg, 50 μ-g, 30 μα, 20 pg, 10 pq, 5 pg ou 1 μg por administração. Será apreciado que tais doses podem ser administradas repetidamente ao pael.en.te ao ......ii^:fg||dií::t|pipp,;...... de dois em dois dias, duas vezes por semana, uma vez por semana, uilni pi|te:# pidtdl 1111
Numa -forma de rea 1 i zaçào, o {s) aqente (s} baseado {s) em anticorpos, e/sáo para uti^.ir.ayao com uma dose de 10 pq até 100 pg por administração.
Por exemplo, o(s) agente(s) baseadois) em anticorpos, pode(m) ser utilizado<s) com uma dose de 20 μα até 40 pg por administração, por exemplo 30 pg por administração.
Numa forma de realizaçao, o(s) agenteís) baseado(s) em anticorpos, ê/sâo capazes de fornecer um efeito antitumoral :|[l|d:s|;êmii||||......Tal ®£©ito|| ||f bíetomllb llpl||e| sl| ji -¾¾. conipeguuddiiii mesmo séé ,:' nóli? ííísmepãnldiiii li éit f s i t.a I !l|o|dme||||||tra.t.dmo:ralme||;|f,f..|:íí|5|í4|Íq illse· 1 ÍÍdi!|n.i4t'r| 41 ii ..... :i®n t a:c:cipdiiii:r mune t er .gpêu;t d'ócdiíÉsntef i.·.·.·.·.· pdili exemplo por injeções intratumorais, apenas células na área do tumor sào alvejadas para terapia CD4Q. Portanto, é apenas a concentração do a genista de cD40 na área çio teoido, onde se pretende que exexça os seus efeitos, que influencia o nivei de ativação do CD40; Quando se administra localmunte, a dose ótima pode ser determinada pelo volume da area de tecido que é relevante tratar e não o peso corporal do paciente. Quando se está a tratar intratumoraimente, este volume pode em ver disso ser definido pelo volume do tumor, h cose total relevante pode assim ser mais baixa do que a do tratamento sistémico, e pode ser definida I; ;!::p:4|;qaqa:!:!p^ íiidi jdmdfl ppr' ,:|;|T|ou. outibsitiêitddos dálll |Pdi:d.....pdapli||dl|ó4d3-en.t.e'-,ll^ .......|::'§:;P:i|4.....á^ébtps 'básplidos e:||;:á.iii.di.ripd|| d|il ::::μό;|:όη.μ46.|ίliplraff btllit&amp;çip no lll.rdlátiérltilldeli "% ^:ájiipi^ipiiiâiíe pjpcpp Ipauilló Ipudl: v7 â^â.^!|clÉis!iiii|ip i;ifp:|n#o.e4''Í|m :bep||ilbiJP::
ViiHii :lf :|pO:lell|eT::: séildionaloPP do 1 grupo que consiste em: cancro da próstata; cancro da mama; cancro colorretal; cancro pancreático; cancro dos ovários; cancro do pulmão; cancro cervical; rafcdomlossarcoma; neuroba a aroma; m i o.;, orna mu 1t ip lo; 1 cu cernia; 1 eucem i a ........|.j|oppgipçprçp ^qnciaiii ; :méi:4í|p#âi:sí...............cancro bexiga e :: gIifhiN|fomf§
Numa forma oe realização, o cancro é associado com as Q|| iii Nd :ί|;|||4ΐ;·|ό·|| dpi i; :4.|41|®θ: :#áeÍÍ:dó:S': ,:¾¾ anticorpos da invenção podem também ser utilirados no tratamento de cancros associados com as células tumoraís CD4Q".
Sera adiçionalmente apreciado que os aaent.es baseados em anticorpos da invenção podem ser utilizados coroo tratamento único para o cancro nua* paciente, ou coroo parte de um tratamento combinado (em que © tratamento adicional pode ser .um agente farmacêutico,, radioterapia e/ou cirurgia) ,. és si tu o paciente também pode receber um ou mats tratamentos para o cancro, por exemplo agentes farmaeêuticos {t. a i. s c orno a go a t e a qu imi o t e r apêuticos) e / o u e í r u r gin.
Numa forma de realização, o um ou mats tratamentos são selecionados a partir do grupo que consiste de agentes quim lot', e rape u t .1 co s con venci, on a i. s (t a i s como a gent e s alquilantes, antimetabolitos, alcaloides vegetais e terpenóides, inxbidores de topoisomerase e ant ineop.làsícos}, agentes radíoterapêuticos, agentes terapêuticos baseados em anticorpos {tais como gemtuzuraab, aiemtuzumafo* rituximab, trastururaab:., n imotuzumab, cetuximab, bevac.i xuruab) , e esteroides,
Também está descrito no presente documento um método para produzir um anticorpo ou respetivo fragmento de ligação ao antigeno, de acordo com a invenção, método este que compreende çu|;tç;:vá:rllgmál çélula hospede ira oe aoo;4í$idS?:b.bi^ .......::
......da|InViiipêp irlidóndiçóbillqui'##éÊÍiÍl?illí: essàpfdo aq|:t.gftfP :::||:dpdifr|fã||ó p:ull|p:epçt.iV;||(lfragmento de i:i:gqçâç:i:®g|?dbtd.gp:p4':r:í:ií
Sdbl(lllmfpón|j®e idosÍdalb#P:e!ci;a;iáda:dél^^'fc^É^'®fF^^s ''ppi|;:r;pap;;;;::|i células hospedeiras e isolar proteínas, r e combi nan t es. Será apreciado que, dependendo da célula hospedeira,, as proteínas produzidas podem diferir> Por exemplo, certas células hospedeiras, tal como o amido ou células bacteríanas, ou não têm, ou têm sistemas diferentes de modificação pós-tradução que ϊ podem resultar na fsfqdiiÇáo ddllf ovifáfl f$ppiqe:itte:|ldd|iiiig ·| 1 1 ϋ 1||ρο|θ'1.|||ο s.; |; |$fi§f podem ||o:r||||||i:f ic|d<|.| |:| 1 I rdl u|| I ld|| %il, Ib^É 1 ;f | 11 I i.^SiM rpfpet ivos 4:i;ii|ioxi;|pa! qe|. ;;
If1 §. ;i.g IMil! Jsl lap til|'i|:d| 1. Idã |||h v||f çlpf £ §1 f r açõe sf f f f ||£ liiá## % :;| INllOdlibt 'ilpad 1 |i se ] am ppddpiidps n u m. s i s t. ema e o c a r .1 ot.a, t a. .1 como i I |íu^iill^-iélijliâ..X!
De acordo cora uraa forma do realização menos preferia a , os anfcicomos e respetivos fragmentos de rigaçao ao antigeno, da invenção, poderá ser. produzidos .in vitro por zaçao de um sistema de tradução in v.i tro comera*aIntente disponível, tai como um lisado reticulòc.x uo de coeJ.no ou 1* sacio de gérmen de trigo (disponibilizatíos pela Promega), Preferivelmente, o sistema do tradução e iisaoo eicu.i.oci. i.o c.e ootíiho. Convenient emente, o sistema de txuvdução pode ser acoplaao com lum eis tesa 1! idb.t; 'idtandbélvblMll jçbbb.lll IIêí^^IIII® de 1 !tr&amp;ns#i|W 111¾: ::i|tNNillll lll^f s^llfNl 11¾¾.............Λ1 Γ::;ll%:áill:!!krs|i::'àél d..i§lilittiiçai|í|;^|pep ad.eqúá4|| iilpa.gp.r || :ldea|Í^lpdll:|í^dÉ.:éé1ÍiddlldN^^Íh'-í-mesma reaçao|||uéli:' a tradução. .... Será ::pp:f%:diaddlllqbb^iiiiidt|p(§1tf bfil oompxfpuf|a·| |i.regffe:|f: distintas, ρο r exemp 1 o xddmIÉip;S|dq |d.|:ggça o e / oq||q pifobqxiqp P|t estas frações podem ser codificadas por ura ou ms..is moiécu.ias de ácido nucleic©.
Preferivelmente, o método de produção compreende uma etapa adicional de isolamento doa anticorpos e respetivos fragmentos de ligação ao antígeno, da invenção, produzido a partir da célula hospedeira ou da mistura de tradução in vitro, Preferivelmente, o isolamento utiliza um anticorpo que liga seletivamente o p©1ípeptideo expresso aa invenção. Sáo bem conhecidos na e sρe ciaii daae métodos para a produção de anticorpos. Por exemplo, podem ser criados anticorpos num animal por irauni zaçào cora oai pèptido aprooriado. Alternativamente, com a tecnologia atual, é possível fazer anticorpos sem a necessidade da utilização de animais; lais técnicas incluem, por exemplo, tecnologia de exibição em faqos de anticorpos, como é bem conhecido na especialidade.
Numa s Γ O .tma 'dê Çí. ssabfílppirp 1
Illliilafmeitd | de i:||açâp:: I| |antl|épty:: | df xnvf r|ç||, :êl|c|: !|itp|p:|p,sÍl diretamente ou indíretamente, de otimização proteica in vitro {por exemplo, por utilização da tecnologia FIND® da Alligator Bioscience AB, tal como descrito no documento NO 02/4B35.1 e WO 03/097834). A listagem ou discussão nesta especificação de um documento aparentemente publicado previaraente, não deve ser tomado necessariamente como um reconhecimento que o documento seja parte do estado da técnica ou que seja de conhecimento l§èrli libtiõmii
Exemplos preteridos, não limitativos, que incorporam certos aspetos da invenção serão agora descritos, com !!!|3-Νsegptnt®:Éi :ί||;|οΙ·||| || ΐΐ|! Hi WÊ&amp; Jiiifêr· 'dòéilll; |resul tados|das |:d|lp|d:is|pe rasf .|ilj||deli li|f teffdi.|ler|ll|: (Bfp........' - high throughput screening;. Cada caixa representa uma posição de aminoácido, Os mapas de calor estão restritos a posições onde foram introduzidas mutações e/ou encontradas por análise de sequências, O ligador entre VB e VI, não é apresentado. A frequência de mutação em cada posição é pi ibilcadMi £>td. ê Sfiífcrã iPlfi fdpi |:ç;f;|0|ρρη|::ϊ:: mais de 5 mutações calculadas, baseadas nas sequências do procedimento de seleção.
Figura 2 ~ Visualização dos resultados HTS. A razão entre as duas medições do ELISA (lavagem normal e lavagem intensa) é ss::::::://ê:bÍeebú:fÉdl; no M|ip|·.|ΐ life 8Íxo~x, é apresentado o sinal de j /idiifAçip) Í'N ELISA |plillÍf|o:|( lavãg|í|||jbi||iãi:)', |:Gdiaj|#;di|Lg|:p:p........... gráfico representa, os dados de um clone. São mostrados ο B4 4 -c:«2snto) e clones da ronda de seleção número 5 (preto)* 3 - Diagrama esquemático dos domínios do CD40. ^?ftaa:a. 4 — Análise de ressonância, plasmónica de superf ície °Gs clones do anticorpo de CD40 ligados ao alvo a 37 °C e pH aisioldgicc.
Figura 5 - Suprarregulação do marcador de superfície, CDB6, pelos clones do anticorpo de CD40 relativamence ao anticorpo B44 -
Figura € ~ É apresentado o peso dos tumores medidos no dia do ponto final (dia 28}, 0 tratamento com 30 ug de G12 ou controlo isotipi.cc é apresentado (**p < 0,01 para ambos os grupos de tratamento comparado com o controlo, utilizando o FÁgttra 7 - &amp; apresentado o volume médio tumoral (n - 9; dos ;Éf f di f iélib é|;. 'pr updi . .déllif a f dMdn'td jl (± K PH) ,|; Os ra tos t rat ados cora 30 uç de fármaco são comparados com o controlo isotípico }1; |;d:.01. y g| d liJiliijiilt o edit M tfr $;§ id (1¾ |;:t eit o a nt.it. «mor ai o ''''dillfçclfç ,s;|dd f Í;pi.:pdi::( 1 (}Ipld'· E::||;||:r i:ldn peád(}dol.! t;U2Íoty e medi dpt |n o dia ; H;; C5o;; 1¾¾ li I ,í: Ipal yd|isgf § '%|%|(&amp; .jflf| a d||(i|: om o· t )||:|§me||;||||| (};;: co.m IlEPl ':yilájifp réçgn<|lls:í" de alas iiddd1d fipipae h d&amp;^||§||| -: 1 tillJ#is.....t|lliiã|t^ílli:' (1*|i™: 10) enxertou iilli:icd&amp;-k élllliiíik íéllÉiIkpa Ρ;Ρϊ:ΡήIpJad dent,t:ili::cus de doi|:|; dadores Hdlf efpiites::: fjçi:nppliiáf'ctllpã1$.(pa qdrpψ to|:|:|| |iey ;|fg;:||!! ratos QÉ!f|ioe/tfi|pi cofpi-lifc com i: yd- ypntk dí q· i t iilf> ipo li|:y|y|:5' pa 11( y p | gi| po} de: }(ly :§ t||aeilos comparado cora o controlo, u ti listando o teste t de Student, duas caudas},
^ ~ É apresentado o volume médio tumora.i (n ~ 10; dos diferentes grupos de tratamento (± DfM). Os ratos foram tratados com 30 uç e comparados com o tratamento com PBS na presença de células dendritícas humanas e células T, em que cada grupo de tratamento (n ~ 10} enxertou com células T autóloçus e células dentritieas de dois dadores diferentes (cinco ratos para cada dador, no total ae aex ratos}» O tratamento cora g12 é significativo comparado cora o oontrol.0 :| :||Íbtí |liçg | |||||
Fxgura 10 — são mostradas curvas de sobrevivência de ratog laáiidpçujía^dd' dorit'tiamlibfe'iltra|pPiÍ|io©m: f áfftalópil0 tratamento 00¾ |1 GI2 aumenta sign!fícativaruente a sobrevivência doa anrmajs comparado coar o controlo isotípico (p < 0,Ul3)> A curva sobrevivência dos ratos tratados com G12 foi comparavei coj^ a de S2C€ (p < 0,13). A sobrevivência de ratos tratados com 32Cò £oi comparável à do controlo isotípico (p < 0ft!8d) . Ca^a rtittd|ppp|i:d:ò 1 |tr:|||a:r|éntb ||éif |f. st|||||pm' § PltoAí;.I § 11 tf ii11
Figura li - São mostradas curvas de sobrevivência ae rato§ |:|:|;|::|:!|:;l|btp f pslfiirf||:t:rlladd|' dpdlf afilie© < As. culpiplpf r llliilliÉll^ l|m dados agf dpppflf tyfíl :pfiPp:!;dpNt ratos tratados com G1.2 e do controlo isotípico consistiu 20 animais em cada grupo. Os ratos tratados com d2c6 consistiram em 12 animais. A curva de sobrevivência do grupo tratado com G12 e o grupo tratado com S2C6 foi comparado corno o grupo tratado com o controlo isotípico, peio teste de lítidllAiiUdbiO dj H;·; t /fi'iddsipAlaplès llmuJ||ifilpsfl iff | f |ú.rAfiplt do G12;;;pit: ψ ilibai lllllí
Figura 12 - São apresentados os níveis de citocina em ratos .....ilJlI-ffmf ©fit<f | de soro p| p Ί IIP lllll faif s|f r|ÍadDS: ||||:s:||iífp| Slp|sp||;g;g|pal 11|
l::;:::i;;;;:l.::::fÍllP;;;Pn|:| Iè'|dd&amp;. 1|ΙΙ|| '| C í f · ft ||||| ©Cl ÍÍ|||©|| %f Ρ| 1pid|.iigp:::sdp|v| II ......i; .3ΐί^|?It=&amp;^ uma ANOVA one-way com toste de Bonferroni de comparações múltiplas para calcular os valores de p ajustados. O tratamento com G12 é significativo comparado como os ratos tratados com S2C6. Os níveis de citocina marcados como *** apresentaram um p < 0,001, dados marcados como * * a p re se n t a r a m um v a .1 o r p d e 0,0 0 '1 < p < 0, 01, e n 1. v e i. s d e citocina marcados com * apresentaram um valor p da 1111 0,01 < § ΐΡΐΡν bi- b: p|i|p;d| d| iffáefmenfò :ρρηι S12'ie|:p||pbgpil|p::' tratamento com S2 06 consistic em 23 ratos, M ™ 23, O grape de- tratamento do controlo isofclpíoo consistiu em 13 ratos, H - 18 .
Figura 13 -* Uiveis de anticorpo no soro de ratos tratados. Amostrás de sort t iradas 4 b apbs o primeiro idia 7) e segundo fdi.a 10) tratamento com (312 ou controlos, foram analisadas para níveis de anti corpos. Mo dia 7 a 10, o titule de anticorpos estava signifieativamante maia Pairo, aproximas ame n t o duas veres, para o close G12 do anticorpo ar. ti. -004 0 comparado oomo O clone: S2C6, Um teste t nâo-enuparelhado de uma cauda, lei utiiitádo para calcular o valor p para a comparaçao das mediae do G12 e S2C6. 0 título de soro G12 foi aproximadamente 100 veres maia baixo comparado oomo o controlo isotlpico devido a efeitos relacionados: com o alvo fo titulo de QlÊ é semelhante a© titulo do isdtipo em ratos nega tires a. ÇD40 humano) .
Após o tratamento com doses idênticas: (30 ug) de G12 e S2C6 há uma diferença significativa nos titaXos de soro do G12 e S2C6, i horas pds-tratamento. Isto indica que o Gi2 é retido mais tempo no tumor e tecido circundante, comparado com o S2C6, â diferença pode ser um resultado: de uma tara de associação alta do G12 e afinidade ao alvo {C:D4Ql , comparado como outros anticorpos de CD4 0, por exemplo S2C6.
Os níveis de anticorpo marcados com ** apresentaram uns. p < 0, 01H, dados marcados com. ** apresentaram um valor p de 0,001 < p < 0,01. 0 grupo de tratamento com dl2: e o grupo de tratamento com S2C6 consistiu em: 23 ratos, H - 23. O grupo de tratamento do controlo isotipiço consistiu em 18 ratos, d ~ 18. EXHMPLOS
Essessplo 1 - Evolução dirigida de um anticorpo agonisfca a CD40 cem pefcêaci.a melhorada
Introdução G anticorpo 844 é originado a partir da: biblioteca n-CoDoMO, que é uma biblioteca de exibição de fragmentos de anticorpos humanos (Sõderiínd et a.1. , 2000) . Foram utiii radas as sequências de arninoácido e ura modelo de estrutura do anticorpo agonist ico anti~CD40 B4 4, para desenhar as bibliotecas, exceto uma biblioteca, em que foram inseridas mutações aleatórias por toda a sequência.
Foram preparados anticorpos da invenção e selecionados como se segue.
Desenho das Bibliotecas :!!!Í.f^^íP-íSé; . tresl biÉiliiitêdlê d|q;§iHmiqq ϊ ie pr||ii i; 1 ..........-ii/sêidip :|||||||β;|1|^β ill! peqqifidia^si iii ii ii modqÉaplOjiiiie.st riiifliiqili1' ΙΡίίΐηί licillil......Bi|iã § ópiodiillii.ee-tiil plpíai íidi i: ii ::S:iiiiiiiiiiii!|iÉ er|pSiirn.li|Pidii| modelo ;ii|.diquidiii|i: IMlâ; para |f Bi ii ii e.......2i'JSÊi;pa|iÍ' 'p|||||po. biaçp |$|: 'lado# dp||pidt:iiiiiiil|í ÍP:|p|í| III% :ff|~1 pi3íítííl|ÍJiíi|: :iiii| |eiiS"lil:UOs| dpi. ||:ol|ill|||.iiepifci|pt (’-'hot |i; :ϊίίί^ίϊ^^^^^ί·)W'^íiilliiií^i:adil 0'p!!iiiiiii|| i||pipl:gplfPP ii, iiliiip i .p|wii|iii§i|figt v ::;d:pil| IIP /Somai:í iciippel||.itat'lops/}||: dp| S|i|!|| '|i|rq|§, idem if | l;app 1:........por1f;i; Íi:iiaT.iáliii|i|ie''Idie sequência|Ée. nucliêlfiiliiillpo· e Past an s<Therapeutic;i;| s"........phtiibili:i#'i:l......Hie:piibp#::: arid.....piridi|bçb:i:iSí'í|........2l®J|.........liPiPÍ........Humana Press) ,
Mutações doe pontos qpe.nli|si:i:i:dã piniba gli'tsiilliiiili^.^ib posições de |l pÉipbáliiillill: 11, dipinild || iiilli|::iáTexi|| ^^|||||||ίίΙ§|νϊ.ϊχ11 '|íi:rÍ|Pxã:B:j:ldod|íííi: t|il. .piojiiipiroipepalliiiii a sofper f||p||ppes: I ..................lid. liÍ.pi|ii|Í||PÉipiib |Β:θΡΙ|1ίί|:00: , Q:|íiíiíi. r:ei|íi|:pUlí:S Ρ|:||;ί§:;:ί:ί:ί:ί:ίίρ;^ 'biíi;£^::i,:ii iii |i ^^^^|Ε-®:βί;!ϊίίί<ί5ΐ:^;||;1^ί^1β^|ί|;Ι||ίί!|5:ΐ^ ||Oiij^3d3 .É;||iiiip ^jpK |||§|i!^:i^;t;o-a|ii||iii^ii^p^ ·##ϊ iii |ii:c|p|'unito ooPiiiiiiolii. xei|ddposliidO'|iii:ldp|ips qu|ii|i|és d|Í|iil.Bpl|i|dii|pdl:|| f I Iplllsílilipl^^líllte ad|a:ceÍtêiiiip|ÍIil:·' ϋ v|í|i|pb:il ilide lii:q|pia ::i|i|a:i | :!i^:::::-iMa3...IlÍPiU dOS ::|ΐ^^ό ||:: ^ ^.ΐίΙΪ^'ί#| restringida a 8-9 residues selecionados, piara redus.ir a complexidade e gerar uma biblioteca sitamente funcionai. Estes resíduos foram selecionados para representar as propriedades físioquimíeas de todos {20} os amínoácidos que ocorrem naturalmente (Tanping, Protein Engineering, 2001, 16, 323-330} (Koi.de et al. , 2009, ACS Chemical biology}, mantendo ao mesmo tempo a complexidade e variabii idade teórica a um nive.l i| qq:nle||iônii|,i|:i'l| iipliiiãbiilídildêl |f prrlilliiip.a b|:p:|:ií.otliçq:: ...... iiiiiii lil SiiiMiltq? iial|:á:piti|ii ihdipi|:dníã|| |;
Na Μ»·· 10013-05, todos os resíduos CDR expostos a superfície forare identificados baseados no modelo estruturai do 844. Estes resíduos foram feitos variar, restringindo a yariab.ilidade até 1 ou dois resíduos homólogos, exceto em H3 onde foi introduzida variabilidade adicional {ver. Figura 1} ♦ O objetivo foi o de criar uma biblioteca altamente funcional, mantendo ao mesmo tempo a complexidade e variabilidade teórica a um nível conveniente. A variabilidade teórica desta biblioteca foi de 1,9 x 10? variantes individuais.
Na biblioteca desenhada AL-10013-06, foram a.leatorirados (n = 11} resíduos na parte central do CDRL3 e resíduos no esc i iitural men te adjacente CDRH2. Os resíduos foram identificados baseados no modelo estruturai do Bi 4. A variabilidade em cada posição foi restringida até 4-5 resíduos, s e i ec ionado s para rep re sentar propri edades fia ioquimicas adequadas cara a geração de um. epitoco de ligação proteica com mflfelililla :!i|:r|ldti|! ^et ja||, 2009, ACS j 1 '4; ÓT- ......f|||:hdbll;:;; A ^l:Fp-5:i{aibj|fídáde' leórcca g|||m nis^eí:ρ j conven 1 ente. Ajólbqb^ldlptídd^i:.. f Qjll-QA ^'bilf^55!!!jíf ^ x ill1 variantes únicas.
Na biblioteca randomízada AL-10013-07, toda a sequência B4 4 foi. randomíseda por uí. πiração de um matooo de ecR propenso-a "-erros desenhado para minimizar parcialidades mutacionaís (Genereorph) , O tamanhos gerado da biblioteca qlglr^llllloi 11111',ÉÍ::|......íll .......'i||:|ga:s;i.........................
Estratégia de seleção ao CDiO-Fcy, deste modo criando um agrupamento de sequências para cada biblioteca que codificava ligantes funcionais ("Ronda 1" no Quadro I). O enriquecimento inicial para ligantes foi verificado por sequencxaçâo* ll|r:l::i j lllllllllxliiytelltísl <|| 1 N-|rid|fc:edl fi|cí.osaI:s: 14e|||:|:i|p|pp:açj |
foram fl§F bti.·^-1-ϊ;^:P§fi{ÉQÍr liNiPfll I A tecnologia do FIND® da Alligator Bioscience AB é descrita no ! ιΐρΛΛ:|)''Ί|| I ê^il ·| i:J:£|i!!!|i!!!!|||o:3 çilX|4ft4çá ϊ ||ÉÉÉi?Ílf®sòMfo|::p'áda iÇgmpreentíiojií: 1114 |||8 | !i^;|iiaaii:<e| iifllçill 11 &amp; ^|4||<|444ΐ' 144ÍÉÊlll§ÍfâK'ifo:ifí4;||a produrida........foi........su j ei ta p||| quatro rondas de seleção adicionai ("Rondas 2 até 5" no I |pp|:p.ro 1$ 111 A partir do cada ronda de seleção, forara selecionados 20OQ clones e rastreados numa análise de alto rendimento. G protocolo de soleçào para maturação de afinidade incluiu etapas cora impacto nas seguintes propriedades: afinidade; taxa de I essoci ação; taxaláeípiplppieç4dllllliÍPimerl 2aça o; e p|ru|Ieppadlli epi tópica. 1111|.|ρ idrpa.iilalupeNtdir a a:lllllded|llll||;i 1ncluida uma.......redução de |(dpi|. rçpppií:'eiçdpççpt:ra.çâd|pp. a:ntlipdf|p· emit pits toadas .,· seguido ::.s| ip ιΙΙίΙΐιρ^οο? ^Ilpe |llll:||eent|al||:o de íantigeno ;esm...........
II iças .p:piri:pí:^í;;S II PliiiA'Sppilp' Jp aldpçiippillllli llllnllll:!perils|i|· map|i:dg:;f..........e.......:|pp||| lSí'·.......miéSiçâ.........tempo de iucubaçáo................... - h taxa de dissociação foi desenhada para ser melhorada por aumento do rigor, de lavagem, O CD40 não biotiniiatí© foi incluído nas rondas 4 e 5 para prevenir a multimerisaçao e pars suprimir seleção para avidex.
Os resultados da seleção para o r a st rei o de alto rendimento (HTS) são resumidos nos °raapas de calor" das bibliotecas, que mostram a posição e frequência das mutações geradas era cada biblioteca (figura IA). A Figura iB demonstra como é que a tecnologia de recombinação FIND·® diminui o numero de resíduos mutados ..............aumentando ainda a.laf:l|i:ldadeilllllllllllllli!:
Quadro 1: Estratégia de seleção
I! |a«tl|;l!0:..Jl!.§llll|r Aidimenta (RARj llipifti:x|||iill|pad.a ronda ;|Ι|| seleg|||:::: £ορ§|&amp; :ÍaÉéç;i|§ÍÍ^ ;il apuioximadsmente 2000 clones e is a s t: 2: 1 rendimento. f A análise de rastreio de alto rendimento foi desenhada como se segue: foi realizado um método para medir a taxa de dissociação em duas condições diferentes de lavagem num ELISA de ligação direta·* Melhores taxas de dissociação correlacionaram-se com uma maior razão entre as duas medições. Os resultados da análise de rastreio de alto rendimento foram traçados, medindo a razão versus sinal de ligação no ELISA ..... (Figura 2). •A análise RAR foi. baseada num ELISA sanduíche que mede a lígaçâo do fragmento ScFv-bís, em sobrenadant.es crus de E. colij, ao C04Q revestido em placas rcíerotituladas.
Uma piaca-394 branca com fundo plano de alta capacidade de ligação (Greiner #781074) foi revestida com CD40mFc (Apollo #9Ô25R) por incubação durante 2 h à temperatura ambiente, ou de am dia para o outro a 4 °C. As placas foram lavadas [Tampão de lavagem; PB$f0,05 % Tween 20 (PBST), lavador de micropiaeas Medicago#09-9410-100, ELx40õ (BioTek)] e então bloqueadas em PBST í- 3 % de leite em pó (Semper) . As placas foram lavadas outra vez e as amostras ou controlos foram adicionados aos poços. As erilno cavadas, ut.xiizando'-se Uma lavagem normal (3 ciclos de j.avagemj ou lavagem incensa (3 ciclos de lavagem seguidos de .................leílÉ 1 $**13 ar*tC' 3 0 : :¾¾"“"^^l:::::^!::::::!©:^^:^ "il de lavagem), ro.i adicionado ac de deteção, Penta~Ris-HRP (Q.iagen "i:1.331a3 placas foram sdÍ5:S;ÍígSec:deíediiíl^s.....refélâdái........com pel utirízaçao do sistema SuperSígnal Pico Chemiluminescent Sues ti ate «Tnernio #3 OCa) e detetadas com o leitor Envision A”' íF^:|:hih:|ID;Í^^l:
Jbsessplo 2 ~ &amp;±iníd&amp;d&amp; melhorada da &amp;ntxeo£pos anti~CD4Ú exesg?2i .fica tí.vos WSÍ arjlicorpos an ti -CD40 ; terem ('KD':):11^¾.0iiii!i;ii§ii#fe!i^.íi.^i^ ..... '"··i)4i ^ * W:Mí3a3b3$$:33 1|di§:s | :;^.^.t.i|::icj^i^^o^!iii!!i^lirtifedb j|alvoilifei: de Lo rm i..na tí a po r i|r^s:fphi:ifÇii.a | ipigsmbhipp: !iid3:^!!iii^''0.f3-sâiií? o^i^iiiiiiiies 1 as..... llllpehsi 3e:| %li| |J|. s ||I1 φ§ alllll c :i|i||.d!lljli il&amp;lll! ............:.a.íimp;|pi3g:::.i£prÍJf::3Mí^iP^§33::::3|lip3^ ..............................^’^iiÍQ.ΐ: comparados como o anticorpo original B44. Quadro 2 e Figura 3, a ura pH fisiológico e 37 °c. A afinidade melhorada dos clones do anticorpo anti-CD40 também foi observada a um pH baixo, Quadro 2, Foi utilizada ressonância pi aamónioa de superfície para determinar as !!!!|o:ns t an;|f 41 g||ie §| .ca s ::l||:::;p||:pi|4el Ipllel 3:7 compara d as i ao !!!l$ntíq©:^ opi: |n| |a|! :át.j|'||:b;.x e-^ΪΙ lllpp^na© .poleia dgm|n|.e a fillip, s iieillll|.|ii,|uiil;p di|i fifl ;pli3 Slil, |!!!;!^í==···ϊ^ϊϊ^:- :0 n|3ρ.|::|;||:ρ.χ3ΐ3ο· dpmlliâli:;: cilliQ ilHlll llilmahéle ......... (apesar das taxas de dissociação e de associação terem mudado indivíduaIroente). Isto poderá ter um beneficio clínico em imanoterapia local que utilize a invenção. ............De t prg Jp q ção d%>pàMài§M Iríói !p:lp:di:i:dcl|idtdpp:p.f ppif dpi d&amp;f .a ri n i da de 11 WDDMl gbpp......rif §3 DÊfilibâ s . PÓl! f ebf dpincfili plíp:iapmá' WM piiperflipiiblii
As medidas de afinidade dos anticorpos purificados por ressonância plasmmniea de super Π cio, yÍ.ÍÍl:Çsndo: o inst nn-entc 8iacoro 30 OQ^ foram roa lis a das do acordo como os protocolos dò fabricante. O COiOhfo IRsDsystamOf FU A) foi imoMl isa do no: chip: sensor BlAcore,, CMS, utilí s.andi>--se nm acoplamento: convenciona.! de am 1 nas , Da anticorpos anti -CD10 da invenção (dxiuidos em série cie 1/3, de 1 até 0,012 nH) foram anal iaados para ligação em ABS-P (OE:, BS" 103 3™ 681 a una taxa de fluxo de 3¾ jii/mirp a 3? °C e pH de 7,3. A associação foi seguida durante 3 minutos e a dissociação durante 10 minutos , A regeneração f oi. real irada duas veres uti lie ando-· se dâ mM de pá OH dar ante 30 segundos. Os parâmetros cinéticos e as constantes âe afinidade foram calculados com o software EÍÁevaluation 1,1, .AI ter na tivamontef as amostras foram incubadas em tampão acetato com pH de 5, 4, 10 mM de acetato:, ISO rdfde BaCl, 0^00o % de Ί20, a 37 °C.
Os resultados a ao aios trados nos Quadros 2 e 3, Résultados ÇAs&amp;datd 2 , Constantes oinétioas para a inter açíáo: ent re o reoietor CD40 imobilizado e c 1 ones do anticorpo anti-ODi0 comparado com; B44 a um. pH fisioiôg1co tal como determinado por ressonância
n : S.eτηήn 1 πa de s uOO rf:í c3 O
Quadro 3. Cons; antes ci nétleas para a ;.n l.eruçâo entre o recetor CD4Q imofoilisado e clones do antiod.rp© antl-CDCO comparado com B44 a no pH ~ S,s tal c omo deter rain ado po r ressonância plasmouxca de
superfície. maeospt® 3 M&amp;p®&amp;m®nto do ®p£ topos e rsa trod dad® cmmsrada dos smtxoozpos da immmeuso 0 recetor CIMO consiste eia quatro domínios extracelolares, cada no composto por dois tipos de unidades moduiaros (Naxsmith c Sprang, 1996, Trends Brocham, (23) /4-73} é cada módulo e esrabi1 irado por uma: OU duas 1 igaçoes di«sulfeto, De forma a analisar a especificidade tine do scFv selecionado, a localreaçao de cada epitope so Fr foi determinada por mapeamentd de domínios, Jt capacidade dos fragmentos seFv de se ligarem a construtos-ttDíO truncados, expressos na superfleie de células COS··? ou L, foi medida com â uti 1 tração da análise FBOPca-n (tal como descrito por Ellmark st ai, * 2002, Immunology)* Os anticorpos exemptificativos da invenção foram capares de ligar ccnatxutos onde c primeiro módulo tinha sido removido Í01/B2) , mas na o a cons trutos onde tinha sido removido o p r i me 1 r o d om ínio completo do Cí>ií) (ter Figura. 4 e Quadro 4 ; , D-tííuSyO 4
Esp ec if id da d&amp; ct u 2 a da
Os clones do anticorpo da .ic«ve.n.çâ-o .reagem cru.2-»adam'ent.e coin 0 CD'ID de um macaco cinomolgor urn macaco rhesus e outras espécies de macaco relevantes. Não reagem cruzadamente com CD4 m u r 1 η o o u c a n i η o. Εχ&amp;χψΐο 4 ~ ^uprar.ragulação de moléculas de supaxfáciB de aélnXaa dendriticas pox anticorpos ant±~CD4Ú cxissssplxficatlvos Ά ligação do recetor CD40 induz ativação de células dendr i.t icas, que potênciaImente leva à at ivação de uma resposta de células T anti.tumorals especifica. As células dendriticas derivadas de monócitos, tratadas com um anticorpo anti-CD40, apresentan expressão suprarregnlada das moléculas de superfície CDB3, |pi|p:6lés HLA-DR A suprarrcgu 1 ação das 1; ..............li|i:i|ul:||;^^..............1............. lio célul a s :|lsCll|jtéiçpr jjpé3 <|éi CDi0 aqoni st as, j ... CIItp|v|llálãprOXinodament.ÇlaÍ|fÉCCf; mai S alta lliilãrd j df/íqêléldd iff do que para a 'SfifcSiçâg :ié· pi| || 2.011 r: Cancer X|fniife g
ll|||iilp|l|......ΊI ti! :ί|Ρ:"".f i fçé:!g|.'iá' de:d:|.i§iti.e:as |ié|! m|:i. s: 1.10111:1:1111 # el mi earners te do que a ativação de células B, e o efeito nas t ox|:!fiii;ld£ quelllfiltlll, :pip;|-é:M' uma J! ϊ3^·^^Nii iti;vlliiili|i;|iias: déhdrlfldid! :È acairi! J vantajoso melhorar a potência para ativação de células dendr 1 ticas,· enquanto se mantém no mesmo intervalo a potência para ativação de células B. Os clones descritos na invenção têm uma potência para ativação de células B que está no mesmo muervedo q-ο « ativação de células dendríticas, o que pode
A potência melnorada dos clones de anticorpo anfci-CD4Q oara pcon-ον®r ativação de células dendr.it.1 cas em comparação com 0 ant-ioon>o anti-CD4Q original, 844, foi determinado por análises i# v^trc- Foi observada urna potência melhorada era 'òXôhaiàí ;an:ti'”:CD4&amp; I 11¾ células 1| dendri r i cas> tal como determinado pela suporárregulação das SUpétf AibA® biOPfey: MtiMi sssssssstit os |lij|:ii:thdpl' destes estudos de expressão de marcadores de superfície.
Ma Fig'ara 5&amp; e B, é mostrada a expressão do CDS6 e a sua dependência da concentração,
Ma te ri. ais e Métodos
Análise de ativação de células dendrítlcas
As células dendriticas foram derivadas a partir de monócitos de sangue periférico. Sueintamente, células mononucleates de sangue periférico (CMSP} foram separadas a partir de camadas leuco-píaquetárias totais de sangue total pelo gradiente de FicolI, e monócitos CD14+ foram isolados com microesf eras de. CD14+ MACS (Miltenyi) de acordo com as instruções do fabricante. Ag células CD14+, que atingiram ~95 % .....|çii|i|:Vâd:ah| ΙβΙΙΙίΙΐΡ' RPM;I:|IÍi: !!|:i|:|:illp^^Kíl dp |í^:p:|lF Ι^ΙΐΒϋ nlpmf.. !Íâ:Í!lS|:4, '^!^'Xi!iiiiÍÍÍÍ^;^iS^^#iiiiii^ QÇ '|, jp| l'dl. éUfeati.tUÍdo 80% do meio, com meio fresco e citoeinas, após três dias de cultura,
Após t #.|:.aplfi|« cglpç:|l'nla:hll:liuhaiillPllÍÍÈlllllt subrregulaetc e o CDla supra r regu ia do. Foram lavadas, ressuspensas em meio com citocinas frescas e séries de diluição de anticorpos estimuladores. As células foram cultivadas a uma concentração de 667000 céluias/ml e os anticorpos de 3,3 até 0,υ.·.3 ug/ml. Os anticorpos estimuladores foram o 844 e oito clones, A4, A5, B9, C4-, F6, G12, Hll e H12. As células deíiornicas foram cultivadas a 37 ac durante 40 horas aoicionaii s . Sm seguida, a suprarregu 1 ação dos marcadores de ar.: vaçao Cu86, CD80 e HLA-DR, foram analisados por FACS.
Qtts.dro S,· 0' SC S O niédic e α sell tiple de amieste (fold inc rease ) máxirso de expressão de Ccôo, GD8C1 a MHC II de clones da ic voncão e B4S,
Exemplo 5 ~ Secreção melhorada de ΙΜΉ-ypor células T Induzidas por anticorpos ant±-CD4õ ex&amp;mplxfíc&amp;tlvOs A aI. ivaçao in vitro cie ce lui as T per células dendriticas estimuladas por clones de anticorpos auti-C04D foi estudada e a produção de IFM~f foi analisada.
Qs resultados estão resumidos no Quadro 6. A potênci a dos cl ones de anticorpos anti~~CS4Q foi. melhorada. comparado oóm o anti corpo B44 na cé 1 ula T a lo géni ca e na análise de células dendritieas.
Materials e Métodos ãnáli&amp;e do ativação de células T alogêníoaa pox: cé laias darei n ? ficas
As células dendriticas foram derivadas a partir de monooi tos de sangue periférico tal corso descrito na análise de atitacão de células dendritieas,
Após seis diarp as células dendritieas foram lavadas, reesaspensas era meio com citocinas frascas a cultivadas na presença de células T de um dador diferente.. As bélulas f foram isoladas do BBMC com mi cr oesf eras de 1.)1)3- MACS (Mi l.teny 1) de acordo com as instruções do fabricante:-
As concent rações de célul as dendriticas e células T na análise de ativaçao de células 1 foram de 667000 células/mi em cada tipo de célula. Alem disso, a occur tiara cent linda ISO ng/ml de SM-CSF e Só ag/mX de Ih~4, e sérios de diluições de autieorpos esf imuladprèis doada 3, 3 ats 0,013 pc/ml- Anticorpos estimuladores foram o ;B.44 o oito clones, A4, AS, Eé, C4f Fu, Ci 2, Hi 1 e H12 - A cocai tora foi. incubada a 37 *C durante 72 toras adicionais. Sm seguida, os sobrenadantes foram analisados para conteúdo de ÍFd-γ por ELISA (Biolegends:) de acordo com as ins:trações do fabricante. Çla&amp;dro 6 - Melhoramento da secreção de i FN—y por an ti corpos anti~CD4G da. invenção comparado com o anticorpo B44,
gxmsplo 6 - Comparação da ativaç&amp;o d® células B por anticorpos &amp;nt±~CB40 oxmspliflc&amp;tíws
III: Ά ligação de 114f a 41É4f §41. ill Isil® i#' ép I células 8 resulta I IIP 411114:44 lÍP^PPÉ:PII:. agregação homeotipica e suprarregu iaçào de marcadores de ?s13der£ic.1 ©.. tais como o Cb23, CD30, CuSt, -..1)8b, Eds, complexo principal de h i stocompa 11 b il i da de (MHC) II e citocinas solúveis, por exemplo iL—b, TK:F~(x e Idl-β <, Scnõnbeek e níobv, Moi |i íliiiiif444 4jp | if | A medição da proliferação de células B induzidas por CD4 0, é normalmente, utilisada para avaliar anticorpos agonistas ao CD40 (Pound et a'i -, 1999, Int Ijmmunoi., (11), 11-20} .
Material e Métodos Células sjononucleares de sangue periférico (CMSP; foram
..........a....."pffetir......;dp)|dd?8:|;d.ac· ..........Ifl...........I sangue total peio gradiente de Ficoli, e células B CDISH foram isoladas com microesferas de GDI 9+ MACS (Miltenyi) de acordo coro as instruções do fabricante. As células CD19t {9-7,5 x lOVpoço), que alcançaram -95 % de pure2a foram (ΜϊΡ::.·ΐεϊ#^:^:::;!:]^:ΡΜ:Χ:::3 j :|||4 f f 31'1 ·1§ PÇ/ml i§f§, IÍ|| O Séries de diluição de anticorpos. Após 48-72 h, a atividade metabólica ::· 4 $ ;bí: gsidf líla......dtp p|Cp::i if i t éf 4 m§ÊÈ ridfaf gd li Os vai ores EC50; if Õ r 1|! 1: calculados utiIirando o GraphPad Prism, fiesultados
Quadro 7. Ativação de células £
Os anti, corpos: anti -0 Bi :(5 4a :ÍBveftç:ê.o têm potência semelhante sa ativação 'de células B (cu eej.a* da mesma ordem da magnitude} que na do B4 4 (ver Quadro 7) >
Exemplo 7 - Capacidade da anticorpos anti-CDéÔ
euxmgrli. flcatiuos da invenção para ligação a célul&amp;s RAMOS h capacidade dos anticorpos anr.I-CD40 da invenção para se ligareis a células RAMOS foi. determinada in uivo. Foi. raalirada análise dé FAQS dos anticorpos anti~PD4Q ligados â linha celular RAMGE do 1 inferna de Bufkitt humano. Qs valores ECSB foram calculados para os anticorpos antl-CDln da invenção e: o anticorpo: anfi-CDlS Bli original*
Materiais ψ. jlê todos A linha celular SAIBOS do 1 i nfoma de Burklfct humano foi utilirada para análise de ligação ('ECAQíl, Sigma Aldrich* BUA): « Os anticorpos aoti-GDiO uiO”conjugados da invenção foram analisados para ligação às células EAMCM,
As células RABOS, apronimadameute 121000 céiniasç foram inçudadas opm anticorpo antl-CDiCÇ diluídas em série de 1/3, desde 3D até 0,- 0015 pg/ml, durante 30 minutos a 4 aCh As células foram lavadas duas veres dom tampão FACS e o anticorpo secundário:, auti-humano lq F(abM2/FITG de coelho (DAKCç d lost r up , Díhamarcaj * f oi subsequent ement a adicionado âs células durant e ma is 30 minutos a 4 °C. As células foram lavadas e analisadas num aparelho FACScai lour, de acordo com as ínstruodes do: fabricante (Beaton Dickinson, EDA) s foi então determinada a intensidade média de fluoIescência rIMP»,.
Resultados ΤίΓιΓίίΙίΙίΓΐίΙίΙ^ΙΙίΙΙ^^Ι^^Ι^^ ^""IMí 'rlRNpla f s P: : I yiáSio 4í i-
Os clones do anticorpo snt.·* -γ>γ.αλ ,
..... ;™ :::P:ff :f d : ;:é 14d |! 0 | βΧΟίφ i J f 1¾§M$M3, . t SO 4 ! ypè'dÍiíaila:ÉÍnt:èllvsíia !itògaii·^Ilidi;Ó0;;i:;"s=:-'''o!!!!?·', If 111 . li ^δι’«: aumentaaa, comparada com o anticorpo B44,
Quadre 8. Liqaçào de clones d€:
ar**·-; ,, , * .................dcc-'-orpo a células RAMOS»
Exexmlo S ~~ E£sx tos dos anticorpo® , xfu. ca tm70s ln vivo nnm modelo tumoral om rato 111111111¾. I afel v 1 d a de llllllilllifc'uxidill' f: lá á il f 1 lf1,1; li 11 1 1J!1 ° a n t.;. c o r p o s a n t x - C D 4 0 11 diisieiMAtivollldaillnii^ Jllf J: 11' fllf/Jlll "'''·α!·<ά num moaej.o era rato ft.v-.r 11 dilliiilèndllà' é nillbreSancalslde leiiDltdáipFif:; f; iff α"> i· e células ctendriticas. lÍ::|lllS:|:tídds que liti:! 1 z a fcumbmdiisi Do s < <- <iff lifiínq-Riftu;:i:í: : llll!!!!!!! i 1 .#I1|1|||| l|. |l T e lpel«.l a a· .gdeud! | lli e;d;§iiill liliBii'JiW&amp; Métodos
Obtivemos ratos fêmea NSG ; MOD. Cg- tu kdoSi-ifJ 11 ?rgtim/wj.r/ez j (NSGs ) da uackson, e deixamo-los aclimatizar, antes do l|i|lÍÍ|d|:dl, Foram llnjeillMaiBiitilícptá&amp;i^^^ lllillliiillgl | tceltfiia|-E-|i| 3 χ 1101 !p:ellulddilrd;:tdlf 1 illlppi:.!vpnjepadBl'l'lll· ..............ill:tla:fDmd|li.lmié:ilt'e 101111d.u um pdílfildlprlpppi^...... 14 com uma dose de 1,2 mg/kg (30 ug) « 0 volume do tumor loi medido no dia 0, 7, 10, 14, 17, 21, 23 e 27. Os tumores foram excisados e pesados no dia 28»
Rosv! ts<Jos
Os resultados são mostrados nas Figuras 6 e 7> (B) Estudo que utilisa temores positivos ao CD-I0 na presença de células 1 e células dendriticas Matesis is é Métodos
Obtivemos ratos ferae a USB (110 D < Cg-fiMe*1^5 listóiten/gg j (MBS)} da Jackson, e deixámo-1 os aciimat irar antes do L ca aumento, Foram injetadas subcot.aneamen te cé i uias ce canoro cia bexiga (oéiu ias··· Be, 2, S χ lõ5 oétulas/rato} em conjunto com células DC (1 χ 105} e células ? (5 x 10s) obtidas do: mesmo dador, ts células dendri ticas foram preparadas a partir de mon.6cl.tos ftal como descrito acima} * Cada grupo de tratamento consistiu do 10 ratos (n 10} f onde células ? e DC de do 1 s dadores foi uttftrado em cinco ratos/dador (ver Quadro 9) ,
Oiiadro 9
0 G12 ou controlo de DBS,· foi injetado intratumoraimente no dia 0, 7 e 14 dom uma dose de 1,2 mg/kg Ç 3D ug) < G volume do tumor foé medido: no dia 0, 7, 16, 14, 17, 21, 23 @ 27, Os tumores foram exeisados e pesados no dia 231
Resultadas
Os resultados são mostradon nas Figuras 8 e 9<
Bxmsplo 9 - Cspsc±ÚB.ds de resgatar células da apoptose A capacidade doa anticorpos anfci~CD4Q para resgatar células:, que expressam o CD40 humano, da apoplone e paragem, de crescimento, foi realirada in witro. Ά apoptose e paragem de crescimento foi índurida em células transfstadas EEHI™231 por adição de anticorpos anti-lgtb As células foram resgatadas por adição de anticorpo: anti-CD40Snbsegnentemente, foi determinada a capacidade das células para proliferar. .11 ;ipò:il éhAeliiidá tuma!i:pddf;Pr:i§. ·ΐiiii pira os clones de anticorpos anti~Cu4v ^eiativaroente ao anticorpo E44 - ver Quadro 9.
Materiais e Métodos Resgate da apop tose; lllllllrlll ):lo:iiMlÍP:p:fef|^:::Éi.a7;ldhÍ:P7:bft huCD40/WEHI-231, e Utilizada paw investigar o resgate da apoptose e paragem de crescimento (Ellmark et ai., 2003, Immunology', 108, 452-7), As células, haCD4O/WEKI-231, foram c u .1t i va da s n uma placa de 96 iippppp|: liy*; a Cd op;i:i|;|ias|ppppí) ri|||| presença ou ausência de IgM anti-rato (Jackson .immunoresearch, EUA), e um anticorpo anti~CQ40 da invenção, diluído era série de 1/3 desde 25 até 0,0001 pg/ml, durante 72 horas. Foi adicionado CeilTiter-G.lo e a mistura foi incubada durante 30 minutos á temperatura ambiente (Promega, EUA), As células foram anal isadas para proliferação medindo a libertação de ATP. .....sinal.............. .......fdl" ::ίΡϊ.ίϋϊ |A|::éi|a§.ha|n| ill ............Quadro 10. Qi:]llpil|ide' :d##l dlf-nedi 'dé^fadiopipp resfilpafem: || 7Í7ÍI:::;":oc:êl:u.Í.id77iiC il>odt:déê: e oaraaem de crescimento. 7711
Exemplo 10; Sxmário da Inform&amp;ção de sequência
Para cada anticorpo descrito abaixo, são mos-tradas as posições 1-112 do aminoácido Vã, e as posições 1-119 do amlnoácido Vf;, em conjunto com a sequência de nuciectídos correspondente. Os CDRs são sublinhados nas .sequências de aminácidos - na sequência de aminoácidos V3„ os CDR.s são encontrados n a a peeipees 23--40 íCOAl) ,, pasdpoee 52 - 28 (C DR2/ e § d------1 Dl (CDR3) cios amínoáeidos; na sequência de amirióáeidee V;;, os CDRs sio Mcõstiados fias posições 26-35 (CDRi; pool oõea 0 2-57 (CDR2' é 57--108 ÍCDR37 dos ardnoác.rdos..
Antcicorpo B44
Seoreacla de amtnoáqidoa de cadela______1 ove......varlávei.......f %)p 8¾ 1D dO : Sa
VPDRFSG$KSGTSASLAISG.tRSEDEADYYCA-HVVDDSLSeLVFGGGTKLTvLG
Sequènclá de npcledtidoe de cadeia leve variável (%) SEQ ID HO:59
CÀGT CTGTGCf GACT CAGCCACCCT C AGCGTCT GGGACCCCCGGGCAG AGGGT CA GC AT CT CTTGO ACT GGG AGCAGCTCCA.AC AT CGGGGCAGGTTAT AAT GTATÀCT GG TATCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCT CAT CT AT GGTAACATCAAT CG GCCCTCAGGGGTCCCTGACCGA'ITCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCC CTGGCCATCAGT GGGCTCCGGT CCGAGGsAT GAGGGTGATT ÂTTACT GT GCAGGATG GG.ATGACAGCCTGAGTGGTCTGGTTTTCGGCGGÀGGAACCAAGCTGACGGTCCTA GGT
Sequência de aoi noâeidos de cadeia pesada variável (¾] - SEQ ID- DO ; 65
’EVailESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWLSYISGGSSYI
FYADSVRGRRlSRDNSENA^LQMNaLRAEDTAWYCARILROGSG^DLWGOGTLVT
VSS
Seanêricia Cie neeleôtldos de cadeia pesada variável (Vy -SEQ ID MO?61 'gaggtgcãgctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtgcctg agactctcgtgtgcagcctctggattcaccitcagtacttatggcatgcactgggt ccgccaggctccagggaaggggctggagtggctttcatatattagtggtggtagt
AGTTACATTTTCTACGC AGAGT CAGTGAGGGGCCGATT CACCAT CT CGAGAGACAA ctccgagaacgcgctgtatctgcaaatgaacãgcctgagagccgaggacacggcc
GTGTAnACTGTGCGAGAATATTAAGAGGCGGGAGCGGTATGGACCTCTGGGGCC ÂAGGTACACT GGTCACCGT GAGCTCA
Clone do anticorpo A4 í ^ i'·; qO (0'i CÍO S (j-tf* C j'? vÍT'V Í &amp; ] cu-y-p \/ ρ T 1 â- Vs^ l ( V r i ''' SSg ID HO: l 9
ÕSVifÕPPSÃSGTPGORVllSCTOSTSNK^AGYKVYWYQQtPGTAFKLL^YeNtNRPSG 0\ ό^'ν ’ ^ ϊ'ί ··"'i Π /·> ρ <·γγ ^ ρ |:ρ,·Χ·;" -j ^"jVv Ο* (*> .χο'νρ Ί ρ 1 •p'y p V'^ ^ 1 Λ’ ·’ \,?V ^ SEQ ID 00:40
CAGTCfGTGCfciACTCAGCCACCCTCAGCeTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCA 00 O>N.'AC7^T0CxCXC3CXX0A077'X'T7O^A7'OT^TsAXXOvOO
TATCâGCAGCT CCC AGGâACGGCCCCCAÁACT CCTC AT CT AT GGTASCAT CAAT CG GCCCTCAGGGGTCCCTGACCGAT7 CTCTGGCT CCAAGT CT GGCACCTCAGCCTCC CTGGCCATCAGTGGGC-TCCGGTCCGAGGAT GAGGCT GATTATTACTGT GCAGCAT G GGATGAC AGO CTGAGT GGT CT GGTTTTC GGCGGAGGAACC AAGCT GACGGT C CIA GGT SáHaênoia d® amííioácickis de cadeia Dosada variável .(¾) ~ SEQ: ID 00:31 EVQtLÉSGGGtVGPGGSLRLSCAASGFTFSTYGMHVWRQAPGKGLGWLSYISGGSSY] VSS: SEQ: I D 00:49
GAGGíGCÃGCtGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCGTG AGACTCTCCTGTGGAGCCTCTGGATTCACC1TCAGTACTTATGGCATGCACTGGGT CCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGCTTrCATATATTAGTGGTGGTAGT AGTTACATTTTCTACGCAGACTCAGTGAGGGGCCGATTCACCAT'CTCCAGAGACAA CTGCGAGAACGCÔCTGTATCTGCAMTGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCC GTGTAFTACTGTGCGAe.AATATT.AAGAGGGGGGAGCGGTATGGACCTCTGGGGCC AAGGTACACT GGTCAOCGTGAGCT CA
sequências da aríúncácidos CDS u.ORs. < ois Kr s> { tG' hy .i, I/ InUv .í. w-j- ΟΠΗ 1: CA^MODSXjSOLV í SBln X D NO: 1 7 ] t ? . Γ'ΠΡί'*. ·Λί·ν© ‘i A ·ν ·£;;<·;ν V v<V;v< Y fqví;.; Γ < > ’' T Λ λ]Α v O O 1 S H V.Ui’vb:·*. i\.n .. S7Í 1 £ via .SvOld:· ( XI UO VI J. y W í À G j CDEi; GARiLRQGBdMDL |BEG ID BO: 30:
Clone do anticorpo AS
Bo<|uôncia^ de ard.rioác idea de cadeia leve variável (VxD .-SBO XD NO: 20 OSVLfOPPSASGTPGQRVTkSCTGSSS^iGAGYHVYWYQOLPGTAFKLLlYGSjNRPSG YP0RF$GSKSGT$GSlAISGtRSEDBADYY€AAWDSS3SGtYFGGGTKtT¥LG BodDâdclaç de nacl cot I doc clc cadeia leve variável (Υχ,) -SEQ ID BO:41
€AGTCfGTGCTGACTCAGCCAGCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGeGGAGAGGGTC.A CC AT CT CTT GO ACT GGGAGCAGCT€€AACATC GGGGC AGGTT AT AAT GTATACTGG TATCAGCÂGGTCCGAGGAACGGCCCCCAAACTGCTCATCTATGGTAACÂTCAATCG GGCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGOCTCG CT GGCCAT CAGTGGGCT CCGGT CCGAGGAT GAGGCT GATTATTACTGTGCAGCAT G GGATGAOAGCCT GAGT GGTGTGGTTTT CGGCGGAGGÂACC AAGCT GACGGT OCT A GOT
Sequência de arninoacidoe de cadela pesada.....variável .(¾..¾.....q; BBQ ID NO:32 EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFT'FSTY'GyHVWRGAPGKGLEWLSYjSGGSSYl
FYADSVRGRFTISRDNSEHALYtOMHSLRAEDTAYYYCARjLPGGSGMDLWGGGTLW
VSS .....da rrac led tidos d#cadaia _pesada variável [Ye) -
Slip id NO: 50
'GAGGTGCAeCTGTTGGAGTCTGeGeGAGGCTTGGTAGAGCCTGGGGGeTCCCTG AGAGT CTCCT GTGCÂGCCT CT GGATT CACCTTCAGTACTTAT GGCATGGACT GGGT
CCGCGAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCATATATOGTGGTGGTAGT AG1TÂCÂTTÍT CTACGCAGÂGT CAGTGAGGGGCCGATTCACCAT CT CCAGAGACAA CTCCGAGAACGGGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACAGGGCG GTGTATTACTGTGCGAGAATATTAAGAGGCGGGAGCGGTATGGACCTCTGGGGCC sequências do a.minoáci dog COB Vs, CDRs: CDRi: CTGSSSBIGAGYHYY [SBQ ID HO: 5] CDR2: GNIHEPS ÍSEQ ID BOx 10] ÇDR3i O&amp;SWDOSBSGLV [SEQ ID NO:131
Vh CDRs : cmi; GF1FSTYGMH { SFQ ID NO: 28] GDR2: GKGGEWLSYISGGSSYXFGRnSVRGR [SEQ; ID 10:28] CDR3: CADTLRGGSGMiX. [SSQ ID DO: 80]
Clone do aj'iti corpo C4
Sequência de apinOáGldos do cadeia leve variável 8¾} ™ SEQ ID Kpql
VPDRFSGSKSGTSASLAjSGLRSEDEÂDYYCAAVVDDSLSGLVFGGGTKLTVLG
Sequência de η υ,ο led tidos do cade ia le ve var iáv a 1 | %] _ pp SEQ ID 00:48
CAGTCTGTGCf GACTCAGCC.ACCCTCAGCGTCT GGGACCCCCGGGCAGAGGGTCA
CCATCTCTTGCACTGGGAGCACCTCCAACATCGGGGCAGGTTACAAAGTATATTGG
TATCÂGCÀGCTCCCÁGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACATCAATCG
GCCCrCAeGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCC
CT GGCC AT CÂGT GGGCT CCGGT CCGAGG AT GAGGCT GATTATTACT GT GCAGCAT G
GGATGACAGCCTGAGTGGTCTGGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTA
GGT 8e;qai:neia ;dfe aminoácidos de cadeia pesada ’variável íVh) SEQ ID NO:83
E^LliSGGGLVGPGGSLRLSCAASGFTFGTYGMHWVRQAPGRGLEWLSYjSGGSSYI
FYADTVRGRFTISRDNSERALYLQ^NSLRAEDTAVYYCARSLRGGSGMDLYVGQGTLVT vss
Sequência do nucieólicos as oaeeia pesada variável 1¾) SΓ.·0 i D NU: 8 :
GAGG TGCÃGC TG TTGG AGT CTG GGGGAGGC TI GGT A€ AGCCTGGGGGGTC GO TG AGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAYTCACC1TCAGTACTTATGGCATGCACTGGGT CGGCCAGGCTCCAGGG.AAGGGGCTGGAG'TGGC'rTT€ATATA11AGTGGTGGTAGT AGITACATTTTCTACGCAGACACAGTGAGGGGCCGAWCAGTATCTCCAGAGACAA CT C CGAGAACGCACT GTATCTGCAAAT GAAC AGCCT GAGAGCCGAGGAC ACGGCC GT GTATTACT GT GCGAGAATATT AAG AGGGGGGAGCGGT AT GGACCT CT GGG8CC AAGGTAC ACT GGTCACCGTGAGCT CA sequências de areincácidos ODE Vi, CDRs: C»I; CÍGSTSNIGASIKYY ÍSSQ ID 00:4] CDR2 : miMWm [8EQ ID HO::0] CDR3: CAAIDSOLSGOV (OEQ ID 10; 1 f] % CDRs: CDR1: OBTFSTYOMH [OEQ ID 10:381 CDR2: GKCd.EDLSYISGGSSYIFIA.DO vRGD (SBQ ID 10:29] COM3; CAR I LRGGSGHD.L [SSO ID 10 : 301
Clone do anfcàcorpo G4
Se:qn:âedia- ds siispáGiãos o.e cedei* leve variável (%,} SEy ID 10:22
QSVtTQPDSASGTFG0R¥T1SCTQSSSNjGAG¥KVYVVYQQLPGTAPKLL]YGN]lRFSG
VPDRFSeSKSGTSASlAISGLRSEDeADYYeAâMíiSOOLVFGGGTlLTVLG
Sequência de nucleotides de cadeia lev»: variável (VI) SEQ ID 10:02
CAGTCTGTGCTGACT CAGCCACCCTCAGCGTCT GGGACCCCCGGGCÀGAGGGT CA
CCATCTCTTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATAATGTATACTGG
TATCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACATCAATCG
GCCCTCAGGGGTCCCTGACCGAWCTCTGGCTCCAAGTCTGGCÂCCTCAGCCTCC
CT GGCCAT CAGTGGGCT CGGGTCCG AGGAT GAGGCT GATTATTACTGTGCAGCAT G
GGATGACAGCCTGAGTGGTCTGGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTA
GGI
Sequência de arni.aoâei dos de cadeia pesada variável |Vh] ~ SFO ID 10:34
~ÍVQLLE^^GLVQPGGSLRLSGAASGFTySTYGMHWVROAPGKGL£\Aft.SVISQGSSYI
FYADSVRGRFTISRDNSEMALYLQyMSLRAEOTAVYYCARILRGGSGyDLWGQGTtVT rtMOIVyuiUWWnVW^wNv^V .SSSSSSSSSSSNSSK'.^^SSNNSSSSSSSSSNSNSNSSSSSSSS·
Sequência de nncledL idos de cadei a pesada variável -(¾| ~ 010 ID 10:32 gaggtgcagctgttggâgtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctg
AGACTCT CCTGT GC AGCC TCT GGATT CACCTTCAGTAG1TATGGC AT GCACT GGGT GCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGCTTTCATATATTAGTGGTGGTAGT AGTTACATTTTCTACGCA6AGTCAGTGAGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAA CTCCGAGAAC GCGCT GTAT CT GCAAAT GAACAGCCT GAGAGCGGAGGACACGGCC GTGTATTACTGTGCGAGAATATI'AAGAGGCGGGAGCGGTATGGACCTCTGGGGCC AAGGTACACTGGT CACCGT G AGCT CA sequências de âmínoaexclee SDK '% CDEsc CDKl: CTGKSSNXKdGYKKY ÍEEQ ID DD: 5 J CD;·:2 ; GNXMKPS [SEQ ID NO: 10 I CDR3: CAARDESITOLV [SEQ I D NO ;141 vh CDKs : CDE1; OPIFSTIGMH [SEQ ID NO; 28] CDR2 : GEODERLSYX SQQB SYI FYADS VKGR [SEQ IDqÍOíES] CDE3: COhILROGSGFíDL [SEQ ID MD;30]
Clane do anticorpo Ρβ
Sequência de arid node idos de cade xa leve variável (V J;) SEQ ID MO:23
QSVjTaPPSASGTPOaRVTlSCTGSSSNjeAGYDWWYQQLfiQTAPKUJYRHIHRPSG
VPDRFSGSKSGTSASIAISGLRSEDEADYYCMWDGSLLGIVFGGGTKLTVLG
Sequência.....de nucleótd doe de cadeia leve.......vsriávei {V;.} SEQ ID MO; 43
'GAGfCfGTGGfGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCA CCATCTCTÍGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTATACTGG TATCAGCÂGCTCCCAGGMCGGCCCCCAAACT CCTCAT CTATCGTAACAT CAATCG
GCCCTCAGGGGT CCCTGACCGATT CTCTGGCTCCAAGT CT GGCACCT CAGCCT CC C T GGCCAT CAGT GGGCT GCGGT CCGAGG ATGAGGCTGATTA1TAC7GTGCAGC ATG GGATGGCAGCCT GCT GGGT CT GGTTTT CGGCGGA6GAACCAAGCT GACGGT C CT G GGT
Secuenc i a de and. no ácidos de cadeia pesada variável (%] - SEQ ID MO;35 EWtiESGGGtVaPGGS^^^ FYADSVRGRFnSRDNSENAlYlO^NSLRAEDTAVYYGARiLRGGSGMOLWGQGTLVí
VSS
Sequência de nucl.eotidod de cadeia pesada variável (Os) ··· SEQ Xii NO; 53
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGGTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTG
AGACTCTCCTGT GCAGCCT CT GGATTC ACCTTCAGTACTTATGGC AT GCACT GGGTT CGCCAGGCT CCAGGGAAGGGGCT GGAGT GGCTTTCATATATTAGTGGT GGTAGTA GTTACATmCTACGCAGACTCAGTGAGGGGCCGATTCACGATCTCCAGAGACAAC TCCGAGAACGCGCTGT ATC TGC AAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCG tgtattactgtgcgagaatattaagaggcgggagcggtatggagctctggggccaa
GGTACACT GGT OACCOTGAGCTCA soqeècclac de amlBoacld;re CUR v5, ('DRa ; CDRI: CTGSSSNIGAGYDVY [SSQ ID DO(7] DDR2: RD IMEPS (SÉQ ID: NO; 11 } DDRS5 CAAMDGSLDGDY [SEQ ID HO:IS] % CDRs ; ÇDR1: GEIPDIYGMH [SEQ: ID RO:2D] CDR2: ΟΗΟΙ,ΕΗΙ,ΒΥΤΟΟΟόΟΥΙΑΥΑΟΟίΑΗΟΕ [REG ID MR 29] CSR3; CARTLGGGESMDL [SEQ ID MO;30}
Clone do anEioorpo F9
Sdqaervcia cie ami n oácidos de cadeia leve variável }¥?,} "" EDO ID NO:24
QSWTQPP^Se-IPGQRVTISCTGSSSNieAGYeVVWYQOLPOTAPKLLIYONINRPSG VFDRFSGSKSGTSASLAfSGLRSEDEADWCAAWDGTLTGLLFGGGTKLWLG Sequência de nccleóridos de ca dei a leve variável Í¥ri ·· SBQ ID NO;46
CÃGTCTGTGCTGACTDAfôCXACCCTCÀGGGTCTGGGACCGCCGGGCAGAGGGTCA
CCAT CT CTTGCACTGGGAGCAGCT CCAACATCGGGGCAGGTTATGGTGT ATACT GG
TATCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCQTCATCTATGGTAACATCAATCG
GCCC T CAGGGGTCCCT GÂCCGATTCTCTGGCT CCAAGT CT GGCACCT CAGCTT C GC
TGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGâTGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATG
GGATGGCACCCTGACCGGTCTGCTGTTCGGGGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTA
GGT
Seguceçià de am]noácidos de cadela pecada variável (%} - SEQ ID HO;36 EVGLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYGyHWVRQAPGKGLEWLSYfSGGSSY]
FYADSYiRGRFTISRDNSEHALYLQMMSlRAEDTAVYYCARiLRGGSGMDtWGOGTLVT
VSS
Sequência de nuclQétldea de eadela pesada p/ar lacei ?%j: ~ SEQ ID NO: 54
GAGGIGCAGCIGITGGAGT CT GGGGGAGGCTTGGTACAGCCT GGGGGGTCGCT G AGACT CTCCT GT GCAGCCT CTGGATT CACCTT CAGTACTT ATG6CAT GCACTGGGT
AGTTACATTTTCTAGGCAGACTCAGTGAGGGGCC6ATTCACCATCTGCAGAGAC.AA
CTCCGAGAACGCGCTGTATCTGCAAATe.AACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCC
GTGTATTAGTGTGCGAGAATATTAAGAGGCGGGAGCGGTATGGAGCTCTGGGGCC sedaêneias de asainoaoiáoaODR VQ ODRs : CDE1 : CTGSSSNIOAGSOi/S [SEQ ID MO: 5 ] Q0R2: GM1MAPS [SEQ ID OOíXOj CDE3: CASWDGTl,EGLL: [SEQ ID NQ:XS1 Vh CDRs : CDR:1: GETFSTTSMM. [ SEQ I D NO : 28] CDR2: GKGLEWLSSISGGSSEIFYADSVRGR [SEQ: XD 00:29] CDBSs OAEILAGQSGiDE [SEQ ID M0c30]
Clone d© anticorpo G12
Sequencea de arainqâcidea da cade.i.a 1 ece ear lave 1 J; PS) - SEC) ID MO: 25
QSVtfQPPSASGTPGQRVTjSCTGSSSNjGAGYNVYVVYQQtPGTAPKLLIYGN^RPSG
VPDRFSGSKSGTSAStAISGLRSEDíãADYYCAAWDKSlSGLVFGGGTKLTVLG
Sequênciade nucieótldqc de cadeia levo cardave j "· SEQ 10 MO:45
CAGTCTGtGCdXsACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCA
GGATCTCTTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCGGGTTACAATGTATACTGG
TATCAGCAGCTCCGAGGAACGGGGCCGAAACTGGTCATCTATGGTAACÁTCAATCG
GCCCTCAGGGGTGCCTGACCGATTCÍCTGGCTCC.AAGTCTGGCACCTCAGCCTCC
GGATAAGAGCATTTCTGGTGTGGTnTCGGCGGAeGAAGGAAGCTGACGGTCCTAG o { S Θ C| Un C .1 3 CÍCí 3ΙΤ· χ ΓεΟ3 Ο Χ^1·0 £; CÍCv C&amp;cte i.cl IsiX iac.iciiX V ci .X X cl V Θ .1 ( V Si } EVQtLESGGGtVQPeeSLRLSCAASGrTFSWeMHWVRQAPGKQLEWtSYsSGGSSYj
FYADSVRGRFTiSRPNSENALYLQMNSLRAEDTAVYYCARILRGGSGMDLWGQGTLVT vss
Seqcéncl&amp; de nucieot,1dos.....cie cadeia pesada variável (V?.·) - SE:Q 1D MO; 35:
GAGGTGCAGC?GTTGGAGTCTGGGGGAGGC'rTGGTACAGCCTGGG6GGTCCCTG AGAC TCT CCTGT GCAGCCTCT GGATT CACCTT GAGTAC TTA TGGGATGCAC 1'GGGT CCGCCAGGCT C CAGGGAAGGGGCTGGAGTGGCTTT CAT ATATTAGI GGT GGTAGI AGITACATTTTCTACGCAGACT CAGT GAGGGGCCGATT CACCATCT CCAGAGACAA CTCCGAGAACGCGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCC GTGTATTACTGTGCGAGAATATTAAGAGGCGGGAGCGGTATGGACCTGTGGGGCC AAGGTACACTGGTCACCGT GAGCT CA s s quê n c I as de adi I π o a c idos C DR % CQRSi COEI: CTGSSSMIGAS¥:d¥E [SEQ ID DQ; 9} CM2 ; GNIEEPS [SEQ 1D HO; 12] CDF3: OAAWDESISGLY [SEQ ID DO;17j dg CDEs; CEM ; ΟΙΊόΉίΥΟΕΙΗ [SEQ ID MD: 28] :CDE2 í GESSEtESYISGGS SOIFYADSvRGE |SEQ !D HO; 2 9] CDS 3 ; CiARX LRGGSGHDL [SEQ ID HO: 30]
Clone do anticorpo M12
SeqnSndlé oc aailDeGeadds:______cie: cadeia _ lese; eqriáMl, SEQ IO HO;26
GS¥trQFPSASGTPGQR¥TiSCTGSSSf9iGAGYGVYWYOQLPGTAPKLyYGGiGRPSG
VPORFSGSKSGTSASlAiSGLRSEDEADYYGAAWDDSLSGLVFGGGmtmG
Sequência cie nucleót. idos de ca d a Ia leve carianel {Vjj ~ SEQ IP 10:46
CAGT CTGT G CT GAOTCAGCC ACCCT C AGCGTCTGGGACC C CCGGGCAGAGGGT CA QCATCTCTTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATMTGTATACTGG TATCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGeTAACATCAATCG GCCCTCAGGGGTCCXTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAGCTCAGCCTCC CT GGCCAT CAGTGGGCTCCGGT CCGAGGATGAGGCTGATTA'TTACT GT GCAGCATG GG ATGACAGCCT GAGTGGTCTGGTTTTCGGC GGÂGGAACCAAGCT GAGGGT CCT A GGTGAGTAGAACôTACGCTAGCAAôCTTOGATCCACGATCCTGAGCAAGGACCTGT GCCCTCCCTGTTCAGACCCTTGCTTGCCTCAGCAGGTCATTACAACCACTTCACCTG TGAC CGCAGGGGC AGGGGACT AGATAGAATG ACCTACT GAGCCT CGT CTGT GT GT CTGTCTGTCTCTC T GTTT GTCTGT CTGTCTCTCT GTTT GTCTCTCTGTCTGTCTG AC A GGCGC AGGCTGGGTCTCTAAGCC ΓΓGTT GT GTTCT GGCCT CCTCAGT CT GGGTTCT TGTCGGMCAGCTITGCCCTTGGGTTACCTGGGrrCCATGTCCTGGGGAATTGGGA ACAAGGGGTCTGAGGGAGGCACCTCCTGGGAGACTTTAGAAGGACCCAGTGCCCT CGGGGCT GATGCT CGGG A .....amlavcáoidos de cadela pecada variável (Yw) - 3&amp;Q ID NO:38 EVQLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFrFCTYGWWVRQAPGKGLEWLSYjSGGSSYj
PYADSVRGRFIjSRDNS£NALYLQyNSLRAEDTAWYCARItRGGS.GIVlDtWGQGTLVT
VSS
Sequênci a_____de nqclent idos de cqdqie pesada variável (¥íí| SKQXD JSIO: GÂGGT GCàGCT gttggagtc tgggggaggcttggtàcagcgt ggggggt ccgtg
AGACT CT C CTGT GC AGCCT C 1'GGATTC ACCTT C AGT ACTT AT C3QCAT GC ACT 6GGT CCeCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGCTTTCÃTATATTAGTeGTGGTAGT AGTTACATITTCTACGCAGACTCAGTGAGGGGCCGArTCACCATCTCCAGAGACAA CT CCGAGAACGCGCTGTAT CTGCAAAT GAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCC GTGTATTACTGTGCGAGAATATTAAGAGGCGGGAGCGGTATGGACCTCTGGGGCC AAGGTACACT GGT CÂCCGT GAGCTCAGGTGAGT CGTACGCTÁGC AAGCTTTCT GGG GCAGGCCAGGCCT GACCTT GGCTTT GGGGC AGGGAGGGGGCTAAGGT GAGGCAG GTGGCGCCAGCCAGGTGCACACCCAATGCCCATGAGCCCAGACACTGGACGCTGA ACCTCGCGGACAGTTAAG.AACCCAGGGGCCTCTGCGCCCTGGGGCCAGCTCTGTC CCâCACCGCGGTGACATGGCACCACCTCTCTTGGAGCCTCCACCAAGGGCCCATC GGT CTT CCCCCT GGC ACCCTCCT CCAAGAGCACCT CTGGGGGCAC AGCGGCCCT G GGCT GCCT GGT CAAGGACTACTT CCCCG.AAGCGGTGACGGTGTCGT GGAACTC AG GCGCCCTGAC CAGCGGCGTGCACACCTT CCCGGCT GTCCTACAGT CCT C ACGACT CIA aa quine las de a ml noácido s CDR Vl DDEs : CDR] : CTG8SSD TGAGYDVY [SEQ 1D NO: 9 j GDS2;: GD I DE ES [ ESS I D DG :10] GOES; CAGQDDSLSGLv [SEQ ID NO: 12] VH CDP.s: CDS1; GFTGSTYOSH [SEQ ID NO:28] CDE2:ΐ (smmmBTmGmmtFmDBwmm [sgq td ho: 2 θ ] CDR3 : CARILRGGSGHDL ]SEQ ID DO;30]
Clones dos smaicorpos B9 e Hll
Sequência de amlDGáeidos de cadeia leve variável SEQ ID DO;27
QSVlTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSdfGÂGYNVYWYQQLPeTAPKLljYeNIGRPSG
VPDRFSGSKSGTSASlAiSGtRSEDEADYYCAAWDGGLLGLVFGGGTKLTVLG
Sequencla de n u o lootidos. ^ de ca d eia leve : va ri ave i f % % -~ SEQ IP DO:47
C AGT CT GTGOT GACT CAGCCAGCCTCAGCGT C T GGGACCCCCGGGCAGAGGGT CA CCATCT CTT GC ACT GGGAGCAGCTCCAACAT CGGGGCAGGTTATAATGTATACTGG TAT CAGCAGCT CCCAGOAACAGCCCCCAAACTCCTCAT CIAI GGTÀACAT 0 AAT CG GCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCMGTCTOGCACCTCAGCCTCC CTGGCCATCAGT GGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGT GCAGCAT G GGATGGCGGCCT GCTGGGT C T GGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGT CCTA GGT
Sdgdenola do arninoácidoacie cadeia pecada variável - SEQ XD PO:39 EVOtiESGGGLVGPGGSLRtSCAÃSGFTfSTYGfd^iVWRGAPeKGLEWtSYISeGSSY^
FYADSVRGRFnSRD^SENALYtQMNSLRAEDTÀVYYCARjLRGGSG^DLWGQGTLVT
VBS
Saíjdêina ia de nacleotidoa de: cade i a pe sada ea r iá ae i (1½] - Q rr\··^ τ γ·. ma ». ^ tw:* ·0 *
GAGGTGCÃGCTGITGeAGTCTeGGGGAGGCTTeGTACAGCGTGGGGGGTCCCTG
AGACTGTCCTGTGCAGCCTCTGGATTOACCTTCAGTACTTATGGCXATGCACTGGGT
CCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGGTGGAGTGGG'rTTCATATATTAGTGGTGGTAGT
AGTTACATTrrCTACGCAGACTCAGTGAGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAA
CTCGGAGMCGCGCTGTATCTGCAAATGÂAÇAGCGTGAGAGGGGAGGACACGGCC
AAGGTACAGTGGT C ACCGTG AGCT G AGGT GAGT CGTACGCTAGCAAGCTTT CT GGG sequências de am ia ei eidos CDR. vl CDEs; CDP1: CTGGGSiIGAQ YMYY [SEQ ID HO: 9] CDR2 : GMINRPS í SEQ ID HO:10] 0DR3: CAAWDGGLLGDY [SEQ 1D MO:li]
Yh CDRa: CDR 3: GFTFSTYGM.H [SEQ XD 10:28] GDR2 : GKGI:EWLSY 1SGGSSYIFYADSVRGR [SEQ ID HO: 29] CDP3 : CARIÊRGGSGRDB í SEQ ID 10: 30] .Regi dea constantes da afi ti corpos 1 ££ c a t àvos da Iwvnnçâo >sp\ POIOS? ilGHGi MBMAM Ig gama-Ί região C cadeia pesada OS-Romo sapiens GH-IGBG1 PE-2 SY-1
ASTKGPSVFPlAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTBGVKrfPAVlQ
SSGLYSI.SSWTWSSSLGTQTYÍCNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCOKTHTCPPCPAPEL
LGGPSVFLFPPKPKDTLMÍSRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWWDOVEVHNAKTKPR EEGYNSTYRWSVtWLHQDWLNG&amp;EYKCKVSNKAlPAPíR&amp;TtSKA&amp;GGPREPQVYTt
PPSROeLTKNQVSLTCLVKGFYPSDiAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLySKL
TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK fSEG ID ·ΜΟ',β2| i IEO.2? i gfo j AAASilO'G 11 i mimo globulins lambda região Çê cadeia lave (Homo sapiens 1
0PKAAPSVTLFPPSSEELQ,ANKATLVCUSDFYPGAV1¥AWKADSSPVKAGVETTTPSK
QSNNKVAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVBCTVAPTECS
[SEQ m NO;63]
Mubmçó&amp;s d<a estratsra exempli£1cativss mm .região variável da cadeia parada (V&amp;). A a mstaçbes ést:â<a indicadas abai kc em negrito e subi ilibadas.
Seguència de aminoácidoscie caiei a pesada car lave i (Os) [ SSQ: XD 101641
EVQLtÈÍGGGLVGR3GSLRLSCAASGFTPSTYGMHVWR0APGKGtEVVLSYISGGSSYi FYAPSVRGRFT ISR ON SENTLY LQMN SLRAEDTAYYY GAR í L RGGSGNDLVVGQGTLW VSS
Sequência. de nucleõfcidoa do gadoia pesada variável {%) [SFQ ID HO:65;
GÀGGTGCAGCfGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTG
AGACTCTCCT GT GCAGC CT CT GGATT CAC CTT GAGTACTTATGGGATGCACT GGGT
CCGCCAGGCT CCAGGGMGGGGCTGGAGT GGCTTT CATAIATTAGT GGTGGTAGI
AGTTACATTITCTACGCÂGACTCAGTGAGGGGCCGATTCACCATCTCGAGAGACAA
CTCCGÂGAACACGCTGTATCTGGAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCC GT GTATT ACT GT GCGAGAATATT AAGAGG CGGGAGCGGTAT GG ACCT CT GGGGCC
ÀAGGTACACT GGTCACGGT GAGCT GA
Hegueno.ia de am.inoácidos oe cadeia pesada: variável ....(¾) [GEQ IP NO: 66]
EVQtLESGGGL¥GPGGSLRÍ.SCAASGR'FSTYGI^HWVRQAFGRGLEWl.SYISGGSSYI
FYADSVRGRRlSRDNSRHlLYLGMNSLRAEDTAVYTCARlLRGGSGyDLWGQGTLVT
WSB
Sequência de imcleotidos de cade i a pesada variável .(:¾) [ÍBQ ID HO :67] GAGGTGCAGCT GTT GGAGT CT GGGGGÁGGCTT GGTACAGCCT GGGGGGT CCCTG AGACTCTC CTGT GCAGCCT CT GG ATT CACCTT GAGTÁCTT AT GGC AT GCACTGGGT CCGCC AGGCTCCAGGG AAGGGGCTGGAGT GGCTTT CATATATTAGT GGTGGTAGT AGTTACATTTT CTACGCAG ACT CAGTGAGGGGGCGATT C ACCÂT CT CCAGAGACAA CTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAAT'GAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCC gtgtattactgtgcgagaatattaagaggcgggagcggtatggacctctggggcc
ÂAGGTACACT GGT CACCGTGAGCT CA
Quadro IX
Quadro 12
Exmsplo 11: Formula.goes fa.xmMcêutla^s BK&amp;mpli£I.ea 11 va&amp;
Apesar de ser possível para um anticorpo da invenção ser administrado soxinho, é pteferivsl apresentitle como um medicamento ou formulação farmacêutica, cm earn unto com um o u mats veículos aceitáveis. Die) veiculo (o) deve dip ser Aaeeiravelieis)w no sentido de serem compatíveis com o agente da invenção e não prejudxciais para os destinatários respetivos, lomalmentç,. os veiculos serão água ou solução salina que serão estireis e livres do pirógenos.
Os exemplos seguintes ilustram medicamentos ou composi çoos íarmacêutrcas do acordo com a invenção em que o ingrediente ativo è um anticorpo Ou Invenção,
Exemp lo A; Comprimi cio
Ingrediente ativo 1 mg
Lactose 200 mg
Amido SÓ mg P o i1v x n i1p i rro1i do ri a 5 mg
Esteara to cie magnésio i m.g
Os comprimidos são preparados a partir dos ingredientes anteriores por granulação húmida seguida de compressão,
Exemplo B:.....Soluçãg_o:£talmologica
Ingrediente ativo 1 m§ 0ioreto de Sódio, qualidade analirica 0,9 g
Tiomersal 0,001 g Água purificada a 100 ml pli a just eido a , 5
BrempXo €:; Formulações de comprimidos
As seguintes tormaiaçoes A e 8 são prepararão por granulação húmida dos ingredientes com uma solução de povidona.r seguida da adição de estearato de magnésio e campressuCK
Formulação A mg/ mg/ comprimido: comprimido tá} Ingrediente ativo 1 1 (b) Lactose B.P> 210 2€ fo) Povidona BiP. 15 0 (df GlicolatO: de .amido de sodio 26 12 (o) Estearato de magnésio 5 3 251 51
Formulação 8 mg/ mg/ _ odppbimido comprimido ia) Ingredi&amp;nre ativo 1 1 (b) Lactose 150 ic). Avieel m 101® 60 26 (d) Peóidddá B*P. IS 2 (a) Glicólato de amido de sadio 20 12 (f; Estearato de magnésio 5 __ 3 251 51
Formulação C
Ingrediente atiro 1
Lactose 200:
Amido 50
Foridona 5 .Estearató de magnésio 4 260
As seguintes formulações, :D e: E, são preparadas por Otmipressao direta dos ingredientes misturados. Â lactose utllirada na formulação E é do tipo de compressão direta.
Formulaçao D oq/oápsula ingrediente ativo 1
Amido pré---gel atinado NF1.5 150 151
Formulação E; mg/eápsa 1 a ingrediente atiro 1
Lactose 150
Avisei® 100 251
Formulação F(Formulagdo de idbertaçao Controlada) A formulação é preparada, por granulação húmida doa .ingredientea (abaixo) com uma solução de povidona, seguido da adiça© de esterca to de magnésio e compressão
Mg f ççmpr 1 m ido (a) Ingrediente atiam 1 {b} Eidromipropilmctiloeiulose 115 (Methocei FIM Premium}'®: (c) Lactose 8. P, S3 (d) Povidona B.P.C 28 (ej E:s tea rato. de magnésio 7 ^ 201 A libertação do fãrmaco ocorre durante um período do €-8 hora* e ficou completa apos 12 noras.
Exemplo D. Forme1açoes de Capsuias Formulação A
Uma formulação de cápsulas é preparada ndsturándó os ingredientes da Forma-isçaO P no Fxemp.io G acirra e enchendo uma cápsula de duaa pa r tes de gelatina dura, Â Formulação B (infra) é preparada de maneira semelhante,
Formulaçao B rrg/câpsula^ (a) Tngredi.ente atire 1 (b) Lactose B.P, 143 (c} Glieclato de amido de sódio 25 (d) Esteara to de maqnési o 2 171
Formulação C mg/cápsula |a! Ingrediente atiro 1 (d! Macr o go l 4P00 BP 3 5 0 ___ 3S1
As cápou ias sáo preparadas por fusão do Hacrogoi 4000 'BP, dispersando o ingrediente afeito na fusão: e enchendo uma cápsula de duas partes de geiatina dura com a fusão* rgrnaglação p mgrcâpsuia
Ingrediente atiro 1
Lecitina 100
Meo de amendoim. lílO· 201
As cápsulas são preparadas dispersando c i agredi ente atino na leci t i na o oleo de âmendoiKp e enchendp cãpsuias de gelatina moles, elásticas, corá a dispersão,
Formu laça o E (Cápsula do Libertação Contro) uda} ã seguinte forimilaçâo de cápsulas de libertação controlada é preparada por extrusão dos ingredientes a, b e c, utilirando uma. eatrusora, seguido de esf eróni ração do extrude do e secagem. As pe i I ei. s (pelota si secas são então retest ida©: ©a® :uaa tfmdrara ©entr©fadara dê· liberfagia {43 &amp; ©©©hem uma· aápspfa d© dua© :p.art-e? de gelatina dera·,. mg/qággala·
Osi. Ingrediente st ia© 1 i'o) .Cefulbs© mío:rbbt.IsiaXi.na 125 (©} Lactase 13,· 0. 125 (dl Etilsetulese . 13 2®4
Exemple: E :: Formulaql© Injetarei Ingrediente Ativa· 1 ®g
Tampa© fbsfat©· livre: de pi r ©genes.., esterll (pH 7,0¾ a 10 ml Q ingredient© stie© é dissalrida na maior parte. de tampã© fosfata (36-(10 &amp;Ε|, ©emplatada em velame e. filtrada Strands· de: tM flltr©· ®l©r©pg.f©©a estéril para dentro de um frase©; d©: vidro, .ambarirada 'da: 10 ml. entê.fl.1 (Pipe ij ©: sblsdb dam fendas ©ater©ia © s.e 1 antes ..
Esgmpl©. Fí tapeai©. fafpsi®isd0ld.r:
Ingrediente. atáv© 1, mg
Hieobl.. bensillna 0:,.11 g •Glueafarol 7SM 1,.45 g
Agua para in j agio ggs.p, 3:,-02 ml d ingrediente ativei disselvidotn© gli©aforai , O .|.l©e©l denriliae © então. adi©I©ned© © disseivid©·, &amp; é adicionada agua a 3 ml, A mistura. © srtãn filtrada a trapes de ui® filtre, mie raparas b através. da am.: flltr© miar©gero©o estéril e selade em frase©© de vldr© -dá '3 ml· estér©!.© |t..ipd 1J «
Exemplo G; Suspensão de Xarope
Ingredient:© afifa 1 mg;
Salaçâ©: de ser Sai tal 1,6.00Q: g
Glinerdf. ..2,00CM g
Gelai©©.© dispersiva. OpO'753 g. .Benaoetb de addio 0,0050: g ialar, Fênaege 1"?'.., 12., 316:3 0,012.5®! !!!!!!;^^:p:|P*;! > 0000 mi I Ιο ^ ft IIP porção :|p|f :|!pft||| purificada e a solução do sorbitol é adicionada. 0 ingrediente ativo é adicionado e dispersado. O espessante é dispersado no glicerol {celulose dispersivaί. As duas dispersões são misturadas e completadas até ao volume requerido com a água ,| |:i|r|:|lca4|l j||;all||iça|o^ lift .elp^il§|dt:§ msii||!|§p^ di! s{||pe|i§pp * ;| S x emp1o H: Bupositório mg/s upositòrio (a) Ingrediente ativo (63 * 1 (b) Gordura, dura, BP (Witepso.1 H15 1 //0 ......................... j;ÍJdli|||| ________III.. Ml,,MiJÊÈÈ':JÈ:......... ||| ll|i jf § *0 ingrediente ativo è ut 1..1.1 ta do como um pó em que pelo menos 90 % das partículas têm 63 pm de diâmetro ou. menos.
Uru quinto do Witepso.l B.15 é fundido numa panela de pressão d|!i ioglÍbíóiit|i{§|..i.|l:Í :1: Uma peneira da'li :Q.e adiei:dii:i.ddlÉ|bã:l;l||:IIÍclip·!'|f·|P|Pppftdoq;: c'-'ía uma 51 Iverson equipada com uma cabeça cortante, ate que seja conseguiàa uma dispersão uniforme. Mantendo a misturai a 4o °C, Λ'-1tepsol Hi5 restante é adicionado à suspensão e agitado para assegurar uma mistura homogénea. I suspensão inteira e passada, através de uma teia de aço inoxidável de 230 pm e, com agitação cont.inua, é deixada arrefecer até 40 °C. A uma temperatura de •3í3 ‘1 até 4 0 °C, enche-·se 2,02 g da mistura em moldes plásticos wcequad.os. Os supositórios são deixados arrefecer atè á ; IM; i:;l ®í:|í|xr n«Jb || bxempjQ x; Peasârios mg/pessário.....
Ingrediente ativo 1
Dextrose anidra 380 llpidàlpf! bit|í .li!! Illii!
Mste^rrafco de: magnésio ί _ 15.1
Os ingredientes: adima são- misétoadôs diretâmenfe e sao· preparados pesairias: por- compressão: direta· dS' Mistura resultante.
Exemplo 12: EE&amp;ito de anticorpos exemplificatiiros ia vivo mm mod®lo tvsmoTõil ®m rato « aPi-Y-idade. aftt.i'l':uK«5pal de ai arry. corpo anti-GDlt da íutérigio foi. estudada M ratos· transgeuicoa: edM 0:0:40 humano:, ihoeolados eomoéialas de eancioda.h-exiga. to oé:.l.uXas: da estond-da bexiga MB49 fora® inoculadas. audedtsaaameate' em. .ratos hrãasgéhises com Cdi©- tornaro, Os: patês foram. tratados pe:r:itum©ral:me:n:t:e r® dia '1 e l.:Ô: com Old ou c®nS.mias,: 0 tratameuta ocmi GIS' results num efeito anti tumoral signification comparado com &amp; controlo isofipiod,. 0: anticorpo- d©: referência S2C6 è um anticorpo àntirC.Q40 gaiMêr-i.to composto pelos dominíos sariáseis murioos.-, 7H c to, fundidos: as regiões constant e-s gamai e- capa .tomarias respetiramonfe '(Patente: Bur-opeia Kf , EBlfihrii, Franrcis^ã et .a 1,, 2:00θ Cancor Reseattol . Ó anti-corpo o a.ss.im dm, analoge. do atoicorpo .atoi-CBiQ rmiaaáixádo BQtoiO fLêm atai, r 2QG5 Saucer Be soa rola )i S; 001-4:0 foi ator dato em testas clínicos (tosari et ai.. f 2Qi3 ,J Clinicai tocologgs Hussein et âl»* 20:10 Haamatolo-gioaj, la teria. X o Métodos. .¾ linha oe-iuiar- MB.4S é um es-rcinoma. das células de tretoi-çãO- indu:ridas: por· oafclBotoh-toto * detltodâ. a. partir de ratos'macro: OSitoto flummerhages &amp; Brao-ks, UB 3,.. Journal of. the latlorei torcer institute^ * ts MM© expressa GDi©- murino:mas: hâo expresse CXMO humano.. O G12 não: reage: crutodamente como CIMO merino e não· se pode li-gar a -ceia las 'tniaorsis MB49.
'Porem, inneal-adas .s uhea: tsreament© 2, S x 10$ células: M&amp;4J de cancro- da. 'totoga -no flanco de· ratos itsnsgéricos: CéfBíX® eom. €040 .feminino humano,. no dia Q* da ratos-ttanagéfiiods oom CMO ||14Φ|·0 -íS:^1::pMΜi^ ί 1 iii^|ÉÍI^^:^l!l )))|1|)|:Π0: hUj|Í)). I ,::ρ%!φ ! :C:1 :;-|:a.t:C;|:|^.arn p^:;^d,0:xp|r|:p:i:^|^^: ^|>-| 0|!|;i!);||!54 0 —i|||:
fÍ^::;;:::Í:t^ Ο 0:1|||:)|ί|') ||·0 ))))51-1) )|: Οθ|ί I |||)|θ§|^p^!!!|.n:j:©t':a^P |)ip§|)$|lÉ^^ 'ill :|§i||:|p.n'ec| |©))||)| $ |s||dia. '10' :|||||:| ......ll:G'li|ígl'0ae' d|'))t|'-|l|:| :|i§|) cedido ΙΜ§^&amp;&amp;βξ'§^:β<^ΐιά ::|blf))im. ,;
"^ÈÍ^^:#@:|^-C^|iiiilí© '’:::^i^:iÉi5Í.fcí.xr^. .fe i: :i|:^i|||Í!Íí§;0. iii;Í^~· |ί!^;φά?^^:ίρ..ί3. :11: J ':l||fè:lJp|pi|ell||í:P fitos cá-^liNi NI))Í) t.utao r ΡΙΙΙΡΙΙΙΙΙιβ:3· || la. d)i)c#tai)* lirlfn tí|:|da:|||:|G|:t::Ía.s |1))1ο·γ©: i 'i||l após cada tratamento. Os níveis de c.itoqnína nas amostras de soro foraja analisados no Mouse Proínf lamm&amp;tory 7~P.lex Ultra-Ssns ít i ve Kit, utilizando a plataforma Me so Scale Discovery (MSD, Gaithersburg, MD, EUA) , 0 titulo do anticorpo foi medido no soro, utilizando ELISA sanduíche. A linha celular MB49 é um carcinoma das células de transição indusidas por earcinogénicos, derivada a partir de ratos macho C57BU6 (Summerhayes &amp; Franks, 197 9, Journal of the National Cancer Institute) . 0 MB4 9 expressa CD40 murine mas não expressa CD40 humano. O G.12 não reage cruzadamente cosi o CD40 murine· e não ......·))|1 %β:1:§άΜφ 1||ο||:|)|)|ΡΒ4 11 :))))))
Resultados ^i©) mosl)rali)|))):ha |i)gurti): l(|| |)|))||): O tratamento como Gi 2 aumenta si.qnif icati vamente a s.obrevivêncía de animais comparado com o controlo isotipico (p < 0,013). A curva de sobrevivência de ratos tratados com o G12 foi comparável com o 5206 (p < 0,13). A sobrevivência de ))))) rf)t;PS'.....®:|r:||ddb|:itdoni!)::| :))520:1: |§O' 1))))0cmpa)|;gV'e:i))))))ç||í .sip'1"p:pn::|: t|)f)|............ isotipico (p < 0,088).
ExmupXo IS; Ε£®χto de anticorpos exexpli£1 aãt£%ros in vivo mm .modal© tumoral ^ xat© A atividade anti tumoral dos anticorpos ant1-CD40 Int.er 1 eucina~6 (ΐχ,-6) , fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) ........ ci t-ocina de j|:i|:|a'|:i|t0||'.toJ): |f$|§) (t ajnbém )|θ||||:|1):||)))::):' por ligando .1. de qirimJ.oc.ina (.motivo C-X-C) / CXCL1) forara estucados unirza.ndo-se dados agrupados ("pooled"') de um grupo maior de animais tratados. 0 grupo de tratamento G12 continha um. grupo de 2 0 an imas, o grupo de tratamento S2C6 cdnlarimi 12 animais, e o grupo de controlo i no típico cent in ha .2G animais, &amp;&amp; células de cancro cia bexiga MB4S foram inoculadas subeutaueamente ern ratos iransqenicos com CDi 0 humano, O o ra too foram tratados per i I. omo raiment, e no dia 7 e 10 cora Gi 2, o o confcrolosi. d tratamento cem G12 fornece ·«&amp;. aumento significativo do sobrevivência dos ratos com tumores comparado com o grupo tratado com o controlo Isotiplc© (Figura 11) ,
Foram tiradas amostras de soro de ratos tratados e analisadas para níveis do o 1 toei na . Os n ivers de citocina apes t ra tamonto demonstram uma Indução mais forte da resposta imunitária do Gl.2 comparado com o anticorpo: de referência, S/C6 (Figura 12) .
Materrais e Métodos E’er am inoculadas suboutans amente fqB s 10·· células MBdv de canoro da fee siga no flanco de ratos tranagéníocs GdlBL/ê som CD4Ô feminino humano, no dia 0. Os retos 1. rensgéni cos com CD4 0 humano expressam CD4Q Mild-type humano numa fea.se de rato com deficiência em CS40 ;mC040---/-} . O tratamente começou no dia 1 asm anticorpos injetados peribumoralmênfe no: tumor subcutâneo no dia 7 e dia 10 (duas doses)„ 0 volume do tumor foi medido 2 Vexes7òem.ana coit um compasso: de ca libre c calculado pel a fórmula do volume de uma elxpsotde, Os ratos foram saorifiçados ao o tumor excedeu 1 end ou se desenvolveram úlceras. Foram retiras amostras de soro 4 b após câda tratamento, 0s níveis do citoquina nas amostras de soro foram analisados no Mouse Prolnf lammafory 7-Pi ex Olltra-Sensitivé Kit, utilixando a plataforma Me so Scale Discovery (MSD, Gaithersburg, MD, EOÃ) , Ά análise esta ti stiça foi realirada ut i li ran do o GraphFad Prism 6,0 (GraphPad Software, Inc, La delia, CU), :Ee quitados
Os resultados são mostrados nas Figuras 11 e 12, Exemplo 1.4: Análise ia vivo de niveis de anticorpos
Qs ratos tratad.O:S foram analisados para uiveis de anticorpos no soro, &amp;s amostras: de scro foram tiradas apoa o primeiro (dia 7) a segando (dia 10): trai ament osu 0 ti to lo de anticorpo foi signifioativaménte Mais haimo para 0 clone do anticorpo auti-CDêO comparado com os anticorpos de referência. £)s dados aio mostrados na Figura 13,
Materiais: 3 ,Mrtpdps
Foram analisadas para os niveis de anticorpos, amostras de soro; tiradas i h após o primeiro (dia 7) e segando (dia 10) tratamentos da experiência descrita ao Exemplo X, O titulo do anticorpo foi medido no soro utilizando ELISA sanduíche< O grupo da tratamento €12 consistia em 23 ratos: (p ~ 23) f o grupo de tratamento do anticorpo de referência 32C6 consistia em 23 ratos (M — 23) e o grupo de tratamento do cor t rolo i. so tip ico consist i u em 18 ratos (N — 18) ,
Resultados
Os resultados sac mostrados na Figura 13.
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DOCUMENTOS REFERIDOS HA DESCRIÇÃO
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Claims (6)

  1. I it,.It;;i tpl ::ii ο:α|||||||βspeti vo I ||a'i|iei|^|!|;p|! iigaçáo t|.õll it 'p|#t l^|Nil::^p^Ítll|í0'^-dâde cie :p|:pa.:|tl<|: xniitlt W'M. I o CD40, em que o :ppp§4||Í||ou £Yag||fi||i p|x!|g||i|de. 'iJptigppdla. t leve variável (ν.ϋ iffa tjlli o COR 3 |p4||pr4dpdillil. 'pddéttpiéiVplicss sequência de aminoáeidos: CTGSXiSNIGÃGYX?VY fSEQ ID NO: 3.) f :§ί£ tlOO::: f .............. é S ou T? e X; é K ou H ou D ou G ou N eni que o anticorpo ou fragmento compreende uma cadeia leve variável (V> na qual o CD.R2 compreende ou consiste ?:a séquência t de ί|ύύΐ1:Π oqqidPPt: | 111¾ íl l|;|i:|tttttttttttt:;: :3Í dNitilll. 1, trtttitxtt:l|p 1§;i| i|i em cue o anticorpo ou fragmente; compreende uma cadeia leve variável (Vi.) na qua 1 o CDR3 compreende ou consiste na sequência tttdl. ::::d#i|o|||:dd|tttll: :;Λ3ιΜΛ^ |s|l? id |oc31| titi ......................... tttttttt X.·; é D ou S ou £ ou G ou K; e ........t Ittlut i | lltlli t| Xtl|:u! |θη||::|θ| Ι· Οθ||,; || .....:í J-í é s||utt||upt; |t éi: vliiltit: !!. em que o anticorpo ou fragmento compreende uma cadeia pesada variável (v«) na qual o CDR1 compreende ou consiste na sequência :t\t vtMp::^llllll>l lí lltt ||ό|Ρ> * 21||; em que o anticorpo ou fragmente; compreende uma cadeia pesada variável <Vh) na qual o CDR2 compreende ou consiste na sequênera Ç::: i: litlP tOii- 1 GKGLSWLSYISGGSSYIFYADSVRGE [SEQ ID Χ40ί29·\ era cue © anticorpo ©a fragment© compreende uma cadeia pesada variável (%) na qua i o COR3 ©©mpréende ©u cons.· ate na sequência de aminoácidos; CÀP.TLROOSGED:. [SEQ IP NO; 30] em que a potência de antlcorpe cm d© fragment© de ligação a© antigen© para a ativação de células dendritic as e male alt a qua* ou é igual á sua potência para a ativaçao de células E e em que © anticorp©: ou © fragmento de ligação: ao antigen© tem uma afinidade [KD) ao CD4 0 de menus de .1x10'- M em que o an ri corpo ©u um raspotivc fragmento de ligação ao antigen© é capam de ligar-"se ao dominie 1 do CD4 0 e em. quo a afinidade (KD) ao C;D9 0 é medida por rena ©nine ia plasmoniça de: superfície- 2, um anticorpo ©n fragmento de ligaçã© ao antigeno de acgrd© com a Reivindicação 1# em qua c anticorpo ©o fragmento de ligação ao ant iqeno tem uma potência má is alta para a ativação de células denditricas do que a do anticorpo B44 que compreende uma sequência de avo noáeidos de oadeia leve variável com SEQ XD RO:©8 e uma sequência de amlnoacidoe d© cadeia pecada, variável com ?>EQ ID RO:SO, 3l Dm anticorpo ou fragmente de ligação a© antigeno de acordo com a Reivindicação 1 ou 2, em que o anticorp© ou fragmento compreende os CDRs seguintes: (i.) SEQ ID HÚi 4 © SE® IO NOXIDeSEQ; ID RO: 12 é SEQ: ID MQ:28 e SEQ ID MO:29 e SEQ ID R0:30; ou (11) SEQ ID RD:5 e SEQ ID RO: 10 e SEQ ID EÔ;Í3 e SEQ ID NO:20 e SEQ 1D RO? 22 e SEQ IO RO:30; ou (iii) SEQ ID MO: i © SEQ ID NO: 10 d SEQ ID RO: 12 e SEQ ID RO:28 e SEQ ID RO:29 e SEQ XD ND:30; ou tiv) SEQ ID ND:S é SEQ ID RO:10 e SEQ XD RO:li e SEQ 1D HO:28: e SEQ ID RO : 2:9 e SEQ ID HO: 3Q; ©n M SEQ ID RO;7 e SEQ ID RO111 e SEQ ID RO:15 e SEQ ID RO:28 e SEQ ID RO:29 c SEQ ID RO;30; ©n (vi) SEQ ID NO;8 © SEQ ID RO:ID © SEQ ID HO:X 6 e SEQ ID MDl2B e SEQ ID MO: 29 e SEQ ID MO: 10; ou <vii) SEQ ID MO: 9 e SEQ ID HO;:ID ® SEQ ID MO: 1 ? e SEQ ID MOiOB: e DIO: ID MO;29 e SEQ ID MO;30; su iviii} SEQ ID DO: 3 e ESQ: ID MO: 10 e EDO ID SO: 12 C SEQ ID MO: 20 e SEQ ID NO: 29 8s SEQ: ID 10 : 30.; DU (is; SEQ ID MO: 3 o SEQ ID SOHO e SKQ ID 10:18 e SEQ ID MOHS e SEQ ID 10:20 e SEQ: ID 10:30.
  2. 4 . Urn ant. I corpo on f ragmen to de 1 igaçôo ao a:0. Iqeno de acordo coo qualquer reivindicação ante rl or , que coiapteendé uma reqi So Fc de anticorpo a partir cie urt anticorpo IgGI ,
    3. Dm anticorpo on fragmente de ligação ao anti go no de acordo com a Reivindicação 4, em que a região Fc compreende ou consiste na sequência de amísoácidós de SEQ ID MG:32,
  3. 6. Dm antxeorpó ou fragmento de ligação ao antígero de acordo com qualquer rei vindicação anterior^ compreendendo adieionalmsnte nma fração cltotoxioa, S, Um anticorpo eu fragmento De iigaçâo ao antigeno cie acorde com a Eeivindicação &amp;.? em que a fração cltotôxics é· câpae do converter um pro~f á rmaco não-oi totoxico num fármaco citotoxico ou em quo a fração çitotomlca é um radiossensiMiiisanfo,
  4. 8, Uma molécula de acide nuoleieo que codifica um anticorpo ou fragmento de ] 1 gação ao antiqeno tal como definido em qualquer uma das Re ir in dl. caçoes I até 71 S> Um vetor que compreende uma molécula de ácido nucleico tal come definido na Seivlndicação 8.
  5. 10. Orna céiul. a hospedeira rocombxnan te que compreende uma molécula de ácido rurcleico tal como: def inido na Reivindicação 3 ou um vetor tal como definido na Reivindicação: g. II * Uma composição farmacêutica. que compreende u?aa quuntldude afloat de um anticorpo cu fragmento de ligação ao sntigene tal core; definido em qualquer uma daa Foivincii cações 1 até Ί f e um: tampão, ezeipiente, Oil cent e ou veiculo f armaeeutí sarnèfits aceitiveia, em que a eoa-posição farmacêutica é opcionalmente: adequada para administração parenteral e/ου admireis tração locai no ou porto do iocal do um tumor, 12,: um anticorpo ou fragmenio do ligação ap antlgéno tal obmP definido em qualquer uma daa Reivindicações 1 até 7> ou uma molécula de ácido nucloico tal como definida na Reivindicação 8, ou um vetor tal como definido na Rei vindioação 3, ou uma dó lula hospedeira tal como definida na Rei vi nd l cação 10, ou uma composição farmacêutica tal como definida na ReióindicaçãO: .11, para n ti li. ração no tratamento dd canoro,
  6. 13 , Um anticorpo ou fragmento de ligação ao entigeno, cu; uma molécula do ácido uucleioc, ou um vetor, eu uma célula hospedeira, ou uma composição farmacêutica para utiliaaçâo de acordo com a Reivindicação 12, em que © cancro © selecionado a partir do grupo que eousíste emi cancro da próstata; cancro da mama; can oro color retal; cancro papereático? canoro don ovários? canoro do pulmão? cancro cervical; rabdomlossarcoma; neuroblastoma; mialoma múltiplo? leucemia; leucemia Mn fedia et ica aguda; melanoma; canoro da bexiga e gli ©bias torsa, Lisboa, 31 de Janeiro de 201R
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