PT1391464E

PT1391464E - Anticorpo monoclonal anti-cd40

Info

Publication number: PT1391464E
Application number: PT02720634T
Authority: PT
Inventors: Toshifumi Mikayama; Hitoshi Yoshida; Walker R Force; Xingjie Chen; Nobuaki Takahashi
Original assignee: Kirin Pharma Kk
Priority date: 2001-04-27
Filing date: 2002-04-26
Publication date: 2007-11-15
Also published as: AU2009200017A1; US7193064B2; US20100234578A1; US20040120948A1; DK1391464T3; US20070077242A1; CA2658221C; CA2658221A1; CN101508734A; EP2009027A1; EP2011802A2; US7537763B2; ATE374214T1; EP2011802A3; EP2009027B1; US20090123466A1

Description

1

DESCRIÇÃO "ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-CD40"

ÁREA TÉCNICA A presente invenção refere-se a um anticorpo ou respectivo fragmento funcional que reconhece um antigene CD40 humano presente na superfície de células B e células dendríticas (DCs) humanas e afins. Especificamente, a presente invenção refere-se a um anticorpo anti-CD40 humano ou respectivo fragmento funcional que é substancialmente antagonista para um antigene CD40 humano na superfície de células dendríticas (DCs) e a um anticorpo anti-CD40 humano agonista ou respectivo fragmento funcional que se espera exercer um efeito terapêutico superior ao dos anticorpos anti-CD40 humano convencionais.

TÉCNICA ANTERIOR 1. CD40 0 CD40 é um antigene com um peso molecular de 50 kDa que está presente na superfície de membranas celulares. O CD40 é expresso em células B, células dendríticas (DCs), certos tipos de células cancerosas e células epiteliais tímicas. É conhecido que o CD40 desempenha um papel-chave na proliferação e diferenciação de células B e DCs. O CD40 foi identificado como um antigene que é expresso na superfície de células B humanas (E. A. Clark et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 83: 4494, 1986, I. Stamenkovic et al., EMBO J. Q: 1403, 1989) . Com base na homologia de sequências de aminoácidos, pensa-se que o CD40 seja um membro da família de receptores do TNF, à qual pertencem um receptor do NGF de baixa afinidade, receptor do TNF, CD27, 0X40, CD30 e afins. 0 gene de um ligando (CD40L) para o CD40 humano e de 2 ratinho foi recentemente clonado, revelando que é uma proteína membranar de tipo II e que é expresso em células T CD4 + activadas. Também foi mostrado que o CD40L induz sinais de activação fortes em células B humanas e de ratinho.

A expressão do CD40 foi mais frequentemente confirmada em células dendríticas do que em células B, de modo que se tornou claro que o CD40 desempenha um papel importante. A ligação do CD40 ao CD40L activa células apresentadoras de antigenes (APCs). Especificamente, aumenta a expressão de moléculas de co-estimulação, como CD80 (B7-1) e CD86 (B7-2), ou a produção de IL-12 (Caux, C., et al., "Activation of human dendritic cells through CD40 cross-linking" J. Exp. Med. 180: 1263, 1994, Shu, U., et al., "Activated T cells induce interleukin-12 production by monocyte via CD40-CD40 ligand interaction" Eur. J. Immunol. Z5: 1125, 1995). As células dendríticas exibem forte capacidade apresentadora de antigenes e têm forte capacidade activadora de células T auxiliadoras (Th). Além disso, pensa-se que células dendríticas controlam a diferenciação de células Th virgens em células Thl ou Th2. Quando se provoca a maturação de células dendríticas (DCl) por cultura de monócitos do sangue periférico que são células dendríticas mielóides na presença de GM-CSF e IL-4 e usando CD40L, as DCl in vitro são capazes de produzir IL-12, estimular e activar células Th virgens alogeneicas e, assim, induzir células T produtoras de iFNy (especificamente, promovem a diferenciação em Thl). Uma vez que esta acção é inibida por anticorpos anti-IL-12, a reacção pode ser mediada por IL-12. Por outro lado, quando se preparam linfócitos-células dendríticas (DC2) por cultura de regiões T de tecido linfático ou células T 3 plasmocitóides presentes no sangue periférico com ligandos de IL-3 e CD40, as DC2 são incapazes de produzir IL-12, estimular e activar células Th virgens alogeneicas, induzir células T produtoras de IL-4 e, assim, promover a diferenciação em Th2. Pensa-se que células Thl estejam envolvidas na activação de imunidade celular e que células Th2 estejam envolvidas na intensificação da capacidade de imunidade humoral, bem como na supressão da capacidade de imunidade celular. Células T citotóxicas (CTL) activadas com o auxilio de células Thl podem remover factores causadores (muitos virus, Listeria monocytogenes, tubercle bacillus, protozoários toxoplasma e afins) que se multiplicam no citoplasma e células tumorais.

Foi mostrado que anticorpos monoclonais anti-CD40 que reconhecem o CD40 expresso nas superfícies membranares exercem uma variedade de actividades biológicas em células B. Os anticorpos monoclonais anti-CD40 são classificados de forma lata em anticorpos agonistas e antagonistas que interferem na interacção entre o CD40 e CD40L. 2. Anticorpo agonista A activação de células B é conhecida como uma acção de anticorpos agonistas. Por exemplo, foi relatado que anticorpos anti-CD40 induzem adesão celular (Barrett et al., J. Immunol. 146: 1722 , 1991; Gordon et al., J. Immunol. 140: 1425, 1988), aumentam a dimensão celular (Gordon et al.f J. Immunol. 140: 1425, 1988; Valle et al., Eur. J. Immunol. 19: 1463, 1989), induzem a divisão de células B que são activadas apenas com anticorpos anti-IgM, anticorpos anti-CD20 ou éster de forbol (Clark e Ledbetter,

Proc. Natl. Acad. , Sei. U.S.A. 83: 4494, 1986; Gordon et al., "Leucocyte Typing III", A. J. McMicheal, editor, 4

Oxford University Press, Oxford, página 426/ Paulie et ai., J. Immunol. 142: 590, 1989), induzem a divisão de células B na presença de IL4 (Valle et al., Eur. J. Immunol. 19: 1463, 1989; Gordon et al., Eur. J. Immunol. 1_7: 1535, 1987), induzem a expressão de IgE (Jabara et al., J. Exp. Med. 172: 1861, 1990; Gascan et al., J. Immunol. 147: 8, 1991), IgG e IgM (Gascan et al., J. Immunol. 147: 8, 1991) de células estimuladas com IL-4 e cultivadas sem células T, aumentam a secreção e a expressão na célula (Challa A., Allergy 5^: 576, 1999) de CD23/Fcs RII solúvel de células B por IL-4 (Gordon e Guy, Immunol. Today 8: 339, 1987; Cairns et al., Eur. J. Immunol. 18: 349, 1988) e promovem a produção de IL-6 (Clark e Shu, J. Immunol. 145: 1400, 1990). Suplementarmente, foi relatado que são estabelecidos clones de células B a partir de células B de culturas primárias humanas por adição de IL-4 e anticorpos anti-CD40 na presença de células de adesão CDw32+ (Bancherau et al., Science 241: 70, 1991) e que a inibição da apoptose de células do centro germinativo é mediada por CD40 independentemente da função de receptores de antigenes (Liu et al., Nature 342: 929, 1989). Como descrito acima, o CD40 foi identificado como um antigene expresso na superfície de células B humanas. Assim, a maior parte dos anticorpos isolados foi avaliada maioritariamente utilizando como indicadores a função para induzir a proliferação e diferenciação de células B humanas e a actividade para induzir morte celular em células cancerosas (Katira, A., et al., "Leukocyte Typing" V. S. F. Schlossossman et al., editores, página 547, Oxford University Press, Oxford, W. C. Flansow et al., "Leukocyte Typing" V. S. F. Schlossossman et al., editores, página 555, Oxford University Press, Oxford, U. D. Pound et ai., International Immunology ]A: 11, 1999) . 5

Foi mostrado que anticorpos anti-CD40 causam maturação de DCs (Z. H. Zhou et al., Hybridoma 18_: 471, 1999). Além disso, foi relatado que o papel de células T CD4 na iniciação de células T CD8 especificas para antigenes activa DCs via sinalização de CD40-CD40L. Foi mostrado que o papel de células T auxiliadoras CD4 na activação de células dendriticas (DCs) pode ser substituído pelo de anticorpos monoclonais (mAb) anti-CD40 (Shoenberger, S. P., et al., "T-cell help for cytotoxic T lymphocytes is mediated by CD40-CD40L interactions" Nature 480, 1998).

Suplementarmente, foi mostrado em ratinhos que o organismo pode ser protegido não só de células tumorais que expressam o CD40 mas também de células tumorais que não o expressam por administração de anticorpos anti-CD40 (French, R. R., et al., "CD40 antibody evokes a cytotoxic T-cell response that eradicates lymphoma and bypasses T-cell help" Nature Medicine, 5, 1999) . A maior parte dos anticorpos relatados até à data não foi isolada utilizando como indicador o efeito em DCs. No entanto, em termos da modificação de funções de DCs, é provável que anticorpos seleccionados pela sua acção em células B sejam insuficientes como agentes terapêuticos. Foi relatado que, entre anticorpos monoclonais contra o CD40 de ratinho, há clones que reagem a DCs mas não reagem a células vasculares endoteliais e, inversamente, clones que não reagem a DCs mas reagem a células vasculares endoteliais, dependendo dos epítopos que os anticorpos reconhecem (Van Den Berg, T. K., et al., Immunology 88: 294, 1996) . Também se presume que a ligação e acção de anticorpos para o CD40 humano quanto a DCs diferem, dependendo dos epítopos. 6 É conhecido que anticorpos anti-CD40 ou ligandos do CD40 podem suprimir a proliferação de linhas de células de linfomas que expressam o CD40 e, assim, podem induzir a morte celular (Funakoshi S., et al., Blood £3: 2782, 1994; Funakoshi S., et al., Journal of Immunotherapy, 1_9, 93, 1996; Z. H. Zhou et al., Hybridoma 18_: 471, 1999, e Joseph A. et al., Câncer Research 60_: 3225, 2000). O que é interessante nos anticorpos agonistas é o facto da função do anticorpo nem sempre coincidir com a do CD40L. A acção para activar células B também não coincide com a acção para suprimir o crescimento tumoral de células B. É desejado desenvolver anticorpos com capacidade de activação de DCs e acção de supressão da proliferação de células tumorais. Além disso, entre os anticorpos agonistas estão presentes anticorpos que inibem e os que não inibem a ligação de CD40L ao CD40 (Challa A., et al., Allergy 54_: 576, 1999). Por exemplo, anticorpos produzidos por G28-5 (N° da ATCC HB-9110) competem com CD40L e, em consequência, não há nenhum efeito resultante da utilização combinada com CD40L. O grau de activação de células que expressam o CD40 difere, dependendo dos anticorpos. Mesmo quando os anticorpos exibem, independentemente, actividade agonista fraca, a utilização combinada dos anticorpos com ligandos do CD40 pode promover mais significativamente a actividade na presença dos anticorpos do que a actividade resultante de ligandos do CD40 isoladamente. Em contraste, mesmo quando os anticorpos exibem, independentemente, actividade agonista, a inibição de ligandos do CD40 pode diminuir a actividade na presença dos anticorpos em maior extensão do que a actividade resultante de ligandos do CD40 isoladamente (Pound et al., International Immunology 11: 11, 1999). Foi mostrado, com anticorpos que não competem com ligandos do CD40, que se pode obter supressão mais 7 forte da proliferação na presença de ligandos do CD40, apesar da acção de supressão da proliferação de células tumorais do próprio anticorpo ser fraca (Joseph A., et al., Câncer Research _60: 3225, 2000) . Em conformidade, é desejado desenvolver anticorpos que se liguem ao CD40, para suprimir independentemente a proliferação celular, mas que não inibam a ligação de ligandos do CD40 ao CD40. Ao tirar partido dessas caracteristicas é possível desenvolver um agente terapêutico que seja mais eficiente do que um CD40L solúvel. Por exemplo, o CD40L solúvel é activado por ligação ao CD40 e, simultaneamente, suprime a função do CD40L presente in vivo. Um anticorpo que não compita com o CD40L não causa essa supressão, e podem esperar-se melhores efeitos terapêuticos por efeito sinergético. 3. Anticorpo antagonista

Entretanto e como descrito acima, uma vez que o CD4 0 desempenha um papel importante na reacção imunológica, é esperado que se possam desenvolver agentes terapêuticos para supressão imunológica por transplantação de órgãos e contra doenças autoimunes por inibição da ligação do CD40 ao seu ligando. Sawada-Hase et al. relataram que a proporção de células que expressam fortemente o CD40 estava aumentada nos monócitos do sangue periférico de pacientes com doença de Crohn. No entanto, anticorpos que inibem a ligação do CD40 ao seu ligando não estão bem compreendidos. Por exemplo, aqueles anticorpos que inibem a ligação podem ser eficazes para a análise funcional do CD40 e terapia contra doenças para a qual é necessária a activação do CD40. Além disso, também foi mostrado que anticorpos que inibem ligandos do CD40 têm o potencial de serem eficazes como agentes contra doenças nas quais está envolvida a ligação do CD40 a ligandos do CD40. No entanto, foi 8 relatado que o CD40L é expresso em plaquetas sanguíneas activadas (V. Henn et al., Nature 391: 591, 1998). Assim, foi relatado que há risco de causarem trombos se forem utilizados anticorpos anti-CD40L como agentes terapêuticos (T. Kawai et al., Nat. Medi. 6: 114, 2000). Desse ponto de vista, pode esperar-se que anticorpos contra o CD40 sejam mais seguros do que anticorpos anti-CD40L como agente terapêutico de anticorpo que inibe a ligação do CD40 ao seu ligando. Os anticorpos anti-CD40 são necessários para suprimir a ligação do CD40L ao CD40 e não activam o CD40 pelo próprio anticorpo.

Apesar de ter sido conduzido no passado um número muito grande de estudos respeitantes a anticorpos que se ligam especificamente ao CD40 humano e que suprimem a ligação do CD40L ao CD40 sem activarem o CD40, só foi relatado um único caso, que é um anticorpo de ratinho anti-CD40 humano denominado 5D12 (J. Kwekkeboom et al., Immunology J9_: 439, 1993). Adicionalmente, ainda não se sabe se anticorpos que exibem actividade de neutralização para células B também exibirão, ou não, a mesma actividade para DCs, isto é, se os anticorpos poderão neutralizar a acção de ligandos do CD40. Suplementarmente, foi relatado que a acção de anticorpos anti-CD40 de ratinho biotinilados é intensificada por formação de ligações cruzadas com avidina (Johnson et al., Eur. J. Immunol. 2_4: 1835, 1994). Intensificámos a acção de ligandos solúveis do CD40 contra uma linha de células B (células Ramos) utilizando anticorpos (M2) contra marcadores (FLAG), que tinham sido previamente fornecidos aos ligandos solúveis por técnicas de engenharia genética, e medimos a actividade de neutralização. Assim, confirmámos que o 5D12 (N° da ATCC HB-11339) exibe actividade de neutralização apenas ligeira. 9

Descobrimos de novo que o 5D12, um anticorpo antagonista, tem actividade agonista por si próprio resultante da formação de ligações cruzadas mesmo na ausência do CD40L. Convencionalmente, foi relatado que a acção de anticorpos para o CD40 de ratinho é reforçada por formação de ligações cruzadas de biotina com avidina (Johnson et al., Eur. J. Immunol. 7A\ 1835, 1994). Suplementarmente, é conhecido que a manipulação em fase sólida de anticorpos para o CD40 utilizando anticorpos anti-imunoglobulinas em fase sólida numa placa conduz a um aumento da actividade para suprimir a proliferação de células tumorais. Pensou-se que seria um efeito resultante da manipulação em fase sólida. Contudo, não se sabia que, quando anticorpos anti-imunoglobulinas são adicionados a uma solução de cultura para a formação de ligações cruzadas de anticorpos anti-CD40, poderia mesmo ser possível que anticorpos antagonistas exibissem actividade agonista. Se os anticorpos a serem utilizados para terapia tiverem antigenicidade poderá dar-se um efeito completamente oposto, de modo que serão produzidos anticorpos que se ligam a anticorpos para o CD40 num corpo humano e com os quais os anticorpos para o CD40 formam ligações cruzadas, sendo produzida uma actividade aparentemente igual à de ligandos do CD40. Em conformidade, tendo em vista a segurança de um agente terapêutico, é muito importante manter a antigenicidade de anticorpos num nível baixo. Considere-se um caso em que se desenvolve um agente terapêutico por tecnologia de humanização com base na sequência de uma região variável de um anticorpo de ratinho. Uma vez que é conhecido que anticorpos humanizados têm imunogenicidade, poderão ser produzidos anticorpos anti-CD40 anti-humanizados após a administração. Especificamente, pode haver o risco dos anticorpos se tornarem anticorpos agonistas. Mesmo que a antigenicidade 10 seja baixa, anticorpos anti-CD40 poderão formar ligações cruzadas com receptores de anticorpos (FcR). Considerando estas questões, um anticorpo antagonista preferido é um anticorpo humano que se liga especificamente ao CD40, suprime a ligação do CD40L, não activa o CD40 nem mesmo por formação de ligações cruzadas e exibe ligação fraca a FcRs.

RESUMO DA INVENÇÃO

Como descrito acima, recentemente as funções de DCs têm sido cada vez mais analisadas, de modo que o CD40 começou a ser reconhecido como um gene importante no controlo das funções de DCs. Neste contexto, a finalidade da presente invenção é proporcionar, empregando um sistema de avaliação que utiliza DCs, um anticorpo anti-CD40 humano, ou respectivo fragmento funcional, que seja substancialmente antagonista também para um antigene CD40 humano na superfície de células dendríticas (DCs), e um anticorpo anti-CD40 humano agonista, ou respectivo fragmento funcional, que se espera que tenha um efeito terapêutico superior ao do anticorpo anti-CD40 humano convencional.

Em resultado de estudos intensivos respeitantes à preparação de anticorpos contra o CD40 humano, completámos a presente invenção conseguindo produzir um novo anticorpo agonista e anticorpo antagonista que se pensa exercerem um efeito terapêutico contra doenças superior ao do anticorpo anti-CD40 convencionalmente conhecido. Isto é, a presente invenção consiste no seguinte. (1) Um anticorpo contra um CD40 humano, ou respectivo fragmento funcional, com pelo menos uma propriedade seleccionada das seguintes propriedades (a) até (f): 11 (a) actua em células dendríticas para produzir IL-12 na presença de LPS e IFNy; (b) tem actividade para actuar em células dendríticas, causando a maturação das células, que é mais elevada do que a de um anticorpo G28-5; (c) tem actividade para promover uma linha de células B estabelecida para expressarem CD95 que é mais elevada do que a do anticorpo G28-5; (d) tem actividade para suprimir a proliferação de uma linha de células B estabelecida que é mais elevada do que a do anticorpo G28-5; (e) induz morte celular de uma linha de células B estabelecida, e (f) não inibe a ligação de ligandos do CD40 ao CD40. (2) 0 anticorpo acima, ou respectivo fragmento funcional, da presente invenção em que a maturação de células dendríticas é efectuada a uma concentração de 20 pg/mL ou inferior. Adicionalmente, o anticorpo ou respectivo fragmento funcional promove a linha de células B estabelecida para expressarem CD95 à concentração do anticorpo de 20 pg/mL ou inferior. Exemplos da linha de células B estabelecida incluem Ramos, HS-Sulton ou afins. 12 são adicionados os anticorpos a uma concentração de 1 μς/mL ou superior. (4) Suplementarmente, na gama de concentrações do anticorpo entre 0,01 μς/ηΛ e 10 μρ/mL, o anticorpo acima ou respectivo fragmento funcional da presente invenção promove a linha de células B estabelecida (células Ramos) para expressarem CD95 com uma eficácia aproximadamente 2 até 3 vezes, ou mais, superior à que é expressa por um anticorpo G28-5 como controlo. Por exemplo, com uma concentração do anticorpo de 0,01 \iq/mh, a expressão é promovida com uma eficácia aproximadamente 2 até 6 vezes, ou mais, superior à que é expressa pelo anticorpo G28-5 como controlo. Com uma concentração do anticorpo de 0,1 μρ/ηΛ, a expressão é promovida com uma eficácia aproximadamente 2 até 7 vezes superior, ou mais, à que é expressa pelo anticorpo G28-5 como controlo. Com uma concentração do anticorpo de 1 a expressão é promovida com uma eficácia aproximadamente 2 até 7 vezes superior, ou mais, à que é expressa pelo anticorpo G28-5 como controlo. Com uma concentração do anticorpo de 10 \iq/mL, a expressão é promovida com uma eficácia aproximadamente 2 até 6 vezes superior, ou mais, à que é expressa pelo anticorpo G28-5 como controlo. (5) Um anticorpo ou respectivo fragmento funcional com as sequências de aminoácidos da região variável de uma cadeia pesada e da região variável de uma cadeia leve de um anticorpo que é produzido por um hibridoma KM302-1 (N° de Acesso da FERM BP-7578), KM341-1-19 (N° de Acesso da FERM BP-7759), 2105 (N° de Acesso da FERM BP-8024) ou Fl-102 (N° de Acesso da ATCC PTA-3337); descritos para comparação. 13

Nome N° de Acesso Data do depósito Depositado em: KM302-1 EERM BP-7578 9 de Maio de 2001 Cfepositário de Organismos de Patentes Internacionais, Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia Industrial Avançada (Central 6, 1-1-1, Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japão) KM341-1-19 EERM BP-7759 27 de Setembro de 2001 2105 EERM BP-8024 17 de Abril de 2002 Fl-102 ATCC PTA-3337 24 de Abril de 2001 American Type Culture Collection (10801 University Blvd. Mánassas, Virgínia, 20110-2209, E.U.A.) (6) Um anticorpo ou respectivo fragmento funcional com sequências de aminoácidos das porções maduras da região variável de uma cadeia pesada e da região variável de uma cadeia leve do anticorpo produzido por um hibridoma F2-103, que são respectivamente codificadas por DNAs plasmidicos com os N°s de Acesso da ATCC PTA-3302 e ATCC PTA-3303; região variável de uma cadeia pesada e região variável de uma cadeia leve do anticorpo produzido por um hibridoma F5-77, que são respectivamente codificadas por DNAs plasmidicos com os N°s de Acesso da ATCC PTA-3304 e ATCC PTA-3305, ou região variável de uma cadeia pesada e região variável de uma cadeia leve do anticorpo produzido por um hibridoma F5-157, que são respectivamente codificadas por DNAs plasmidicos com os N°s de Acesso da ATCC PTA-3306 e ATCC PTA-3307; descritos para comparação. 14

Nome N° de Acesso Data do depósito Depositado em: Cadeia pesada de F2-103 (F2-103-H) ATOC PTA-3302 19 de Abril de 2001 American Type Culture Collection (10801 University Blvd. ítonassas, Virgínia, 20110-2209, E.U.A.) Cadeia leve de F2-103 (F2-103-L) ATOC PTA-3303 19 de Abril de 2001 Cadeia pesada de F5-77 (F5-77-H) ATCC PTA-3304 19 de Abril de 2001 Cadeia leve de F5-77 (F5-77-L) ATOC PTA-3305 19 de Abril de 2001 Cadeia pesada de F5-157 (F5-157-H) ATOC PTA-3306 19 de Abril de 2001 Cadeia leve de F5-157 (F5-157-L) ATOC PTA-3307 19 de Abril de 2001 (7) Um anticorpo ou respectivo fragmento funcional com sequências de aminoácidos das porções maduras da região variável de uma cadeia pesada e da região variável de uma cadeia leve do anticorpo produzido por um hibridoma KM341-1-19, que são respectivamente representadas pelas ID SEQ NOS: 28 e 30; região variável de uma cadeia pesada e região variável de uma cadeia leve do anticorpo produzido por um hibridoma 2105, que são respectivamente representadas pelas ID SEQ NOS: 32 e 34; região variável de uma cadeia pesada e região variável de uma cadeia leve do anticorpo produzido por um hibridoma 110, que são respectivamente representadas pelas ID SEQ NOS: 36 e 38; região variável de uma cadeia pesada e região variável de uma cadeia leve do anticorpo produzido por um hibridoma 115, que são respectivamente representadas pelas ID SEQ NOS: 40 e 42; região variável de uma cadeia pesada e região variável de uma cadeia leve do anticorpo produzido por um hibridoma KM643-4-11, que são respectivamente representadas pelas ID SEQ NOS: 52 e 54; região variável de uma cadeia pesada e região variável de uma cadeia leve do anticorpo produzido por um hibridoma F2-103, que são respectivamente representadas pelas ID SEQ NOS: 60 e 62, ou região variável de uma cadeia pesada e região variável de uma cadeia leve do anticorpo produzido 15 por um hibridoma F5-77, que são respectivamente representadas pelas ID SEQ NOS: 64 e 66; descritos por motivos de comparação. (8) Um anticorpo ou respectivo fragmento funcional com sequências de aminoácidos das porções maduras da região variável de uma cadeia pesada e da região variável de uma cadeia leve que são codificadas por sequências de ácidos nucleicos isoladas de um hibridoma KM341-1-19, que são respectivamente representadas pelas ID SEQ NOS: 27 e 29; região variável de uma cadeia pesada e região variável de uma cadeia leve que são codificadas por sequências de ácidos nucleicos isoladas de um hibridoma 2105, que são respectivamente representadas pelas ID SEQ NOS: 31 e 33; região variável de uma cadeia pesada e região variável de uma cadeia leve que são codificadas por sequências de ácidos nucleicos isoladas de um hibridoma 110, que são respectivamente representadas pelas ID SEQ NOS: 35 e 37; região variável de uma cadeia pesada e região variável de uma cadeia leve que são codificadas por sequências de ácidos nucleicos isoladas de um hibridoma 115, que são respectivamente representadas pelas ID SEQ NOS: 39 e 41; região variável de uma cadeia pesada e região variável de uma cadeia leve que são codificadas por sequências de ácidos nucleicos isoladas de um hibridoma KM643-4-11, que são respectivamente representadas pelas ID SEQ NOS: 51 e 53; região variável de uma cadeia pesada e região variável de uma cadeia leve que são codificadas por sequências de ácidos nucleicos isoladas de um hibridoma F2-103, que são respectivamente representadas pelas ID SEQ NOS: 59 e 61, ou região variável de uma cadeia pesada e região variável de uma cadeia leve que são codificadas por sequências de ácidos nucleicos isoladas de um hibridoma F5-77, que são 16 respectivamente representadas pelas ID SEQ NOS: 63 e 65; descritos por motivos de comparação. (9) Um anticorpo contra um CD40 humano ou respectivo fragmento funcional com pelo menos uma propriedade seleccionada das seguintes propriedades (g) até (j): (g) neutraliza a acção de ligandos no CD40; (h) neutraliza ou atenua um ou mais efeitos que ligandos,

que se destinam ao CD40 numa linha de células B

estabelecida, exercem em células que expressam o CD40, e tem acção agonista no CD40 na linha de células B estabelecida acima mais fraca do que a do 5D12, devido à formação de ligações cruzadas por anticorpos anti-imunoglobulinas; (i) atenua ou neutraliza a acção de ligandos do CD40 na linha de células B estabelecida para aumentar a expressão de CD95, e (j) tem acção antagonista no CD40 expresso em células dendriticas. (10) O anticorpo ou o fragmento funcional de (9) acima consegue suprimir a expressão de CD95 em células Ramos num nivel aproximadamente de 10% ou inferior relativamente ao de um controlo quando anticorpos com uma concentração de 0,1 pg/mL são adicionados às células Ramos com uma concentração de 1 x 106 células/mL suplementadas com uma quantidade saturada de células que expressam o CD40L; consegue suprimir a expressão de CD95 em células Ramos na mesma extensão de um controlo negativo quando se adicionam os anticorpos com uma concentração de 1 pg/mL, e consegue suprimir a expressão de CD95 nas células Ramos na mesma 17 extensão do controlo negativo quando se adicionam os anticorpos com uma concentração de 10 pg/mL. (11) O anticorpo ou respectivo fragmento funcional de (9) acima, em que a proliferação de células B tonsilares é suprimida in vitro em aproximadamente 80 até 95% ou superior quando os anticorpos com uma concentração entre 0,001 μg/mL e 10 μg/mL são adicionados a 1 x 105 células B tonsilares suplementadas com CD40L solúvel (1 μg/mL). Por exemplo, quando se adicionam os anticorpos com uma concentração entre 0,01 pg/mL e 10 pg/mL, a proliferação de células B tonsilares é suprimida em aproximadamente 95% ou mais. Em particular, quando se adicionam os anticorpos com uma concentração de 0,001 pg/mL, a proliferação de células B tonsilares é suprimida em aproximadamente 80% ou mais. (12) Um anticorpo ou respectivo fragmento funcional com as sequências de aminoácidos da região variável de uma cadeia pesada e região variável de uma cadeia leve do anticorpo produzido por um hibridoma KM281-1-10 (N° de Acesso da FERM BP-7579), descrito por motivos comparativos, 4D11 (N° de Acesso da FERM BP-7758) ou F4-465, descrito por motivos comparativos (N° de Acesso da ATCC PTA-3338).

Nome N° de Acesso Data do depósito Depositado em: KM281-1-10 FERM BP-7579 9 de Maio de 2001 Depositário de Organismos de Patentes Internacionais, Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia Industrial Avançada (Central 6, 1-1-1, Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japão) 4D11 FERM BP-7758 27 de Setembro de 2001 F4-465 ATCC PTA-3338 24 de Abril de 2001 American Type Culture Collection (10801 University Blvd. Manassas, VA, 20110-2209, E.U.A.) 18 (13) Um anticorpo ou respectivo fragmento funcional com sequências de aminoácidos das porções maduras da região variável de uma cadeia pesada e da região variável de uma cadeia leve do anticorpo produzido por um hibridoma KM281-1-10, que são respectivamente representadas pelas ID SEQ NOS: 44 e 46; região variável de uma cadeia pesada e região variável de uma cadeia leve do anticorpo produzido por um hibridoma 4D11, que são respectivamente representadas pelas ID SEQ NOS: 48 e 50, ou região variável de uma cadeia pesada e região variável de uma cadeia leve do anticorpo produzido por um hibridoma F4-465, que são respectivamente representadas pelas ID SEQ NOS: 56 e 58. (14) Um anticorpo ou respectivo fragmento funcional com sequências de aminoácidos das porções maduras da região variável de uma cadeia pesada e da região variável de uma cadeia leve que são codificadas por sequências de ácidos nucleicos isoladas de um hibridoma KM281-1-10, que são respectivamente representadas pelas ID SEQ NOS: 43 e 45; região variável de uma cadeia pesada e região variável de uma cadeia leve de um anticorpo produzido por um hibridoma 4D11, que são respectivamente representadas pelas ID SEQ NOS: 47 e 4 9, ou região variável de uma cadeia pesada e região variável de uma cadeia leve que são codificadas por sequências de ácidos nucleicos isoladas de um hibridoma F4-465, que são respectivamente representadas pelas ID SEQ NOS: 55 e 57. (15) Exemplos do anticorpo ou do respectivo fragmento funcional de (1) até (14) acima incluem anticorpos humanos. 19 (16) Uma composição farmacêutica que contém, como ingrediente activo, o anticorpo ou respectivo fragmento funcional de qualquer um de entre (1) até (15) acima. (17) Um agente de potenciação imunológica, agente antitumoral ou agente anti-doença autoimune que contém, como ingrediente activo, o anticorpo ou respectivo fragmento funcional de qualquer um de entre (1) até (8) acima. (18) Um agente imunossupressor, agente anti-doença autoimune, agente terapêutico contra alergias ou agente terapêutico contra a síndroma de inibição do factor VIII de coagulação do sangue que contém, como ingrediente activo, o anticorpo ou respectivo fragmento funcional de qualquer um de entre (9) até (14) acima. (19) Aqui, um epítopo de um CD40 humano que o anticorpo monoclonal da presente invenção reconhece pode ser determinado por um método conhecido, tal como examinando a ligação a oligopéptidos sintéticos com sobreposição obtidos da sequência de aminoácidos primária do CD40 humano (por exemplo, Ed Harlow e David Lane (editores), "Antibodies: A Laboratory Manual" 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Patente U.S. N° 4708871). Para o mapeamento de epítopos também pode utilizar-se um estojo de bibliotecas de péptidos com o processo de expressão em fagos (New England BioLabs). A presente invenção também abrange um anticorpo ou respectivo fragmento funcional que reconhece um novo epítopo do CD40 humano que o anticorpo ou respectivo fragmento funcional produzido por cada um dos hibridomas acima reconhece. 20 (20) A presente invenção também proporciona um ácido nucleico (RNA ou cDNA) que codifica pelo menos a região variável de uma cadeia pesada e/ou cadeia leve de um anticorpo isolado de cada um dos hibridomas acima, um vector que contém o ácido nucleico e uma célula-hospedeiro que transporta o ácido nucleico. A presente invenção será descrita em pormenor. Esta especificação inclui parte ou a totalidade do conteúdo revelado na especificação e/ou figuras da Candidatura PCT PCT/US01/13672 (registada em 27 de Abril de 2001), Candidatura de Patente Japonesa N° 2001-142482 (registada em 11 de Maio de 2001), Candidatura de Patente Japonesa N° 2001-310535 (registada em 5 de Outubro de 2001) e Candidatura de Patente U.S. USSN 10/040 244 (registada em 26 de Outubro de 2001), que são documentos de prioridade da presente candidatura.

Como será descrito posteriormente, descobrimos que um anticorpo monoclonal conhecido 5D12 (N° da ATCC HB-11339) que é antagonista para o CD40 em células B não é antagonista para o CD40 em DCs. Também descobrimos que muitos anticorpos monoclonais exibem actividade agonista por si próprios resultante da formação de ligações cruzadas por anticorpos anti-imunoglobulinas, mesmo que sejam anticorpos antagonistas que bloqueiam a acção do CD40L. 1. Definição

Os termos utilizados nesta especificação são definidos do modo seguinte. O termo "CD40 humano" na presente invenção designa um polipéptido com uma sequência de aminoácidos apresentada 21 por Clark et al. (E. A. Clark et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 8_3: 4494, 1986) ou Stamenkovic et al. (I. Stamenkovic et al., EMBO J. 8_: 1403, 1989). Especificamente, o CD40 humano é um polipéptido antigénico que é expresso na superfície de uma célula B, DC, macrófago, célula endotelial, célula epitelial ou células tumorais destas células. O termo "anticorpo monoclonal anti-CD40" designa qualquer anticorpo monoclonal contra o CD40 expresso por uma célula, CD40 completo ou CD40 parcial. Um anticorpo monoclonal anti-CD40 mais preferido liga-se à porção extracelular do CD40 e exerce acção agonista ou antagonista nas células que expressam o CD40.

Suplementarmente, o termo "anticorpo" na presente invenção deriva de um gene (genericamente denominado "gene de anticorpo") que codifica a região variável de uma cadeia pesada, a região constante de uma cadeia pesada, a região variável de uma cadeia leve e a região constante de uma cadeia leve que compõem uma imunoglobulina. O anticorpo da presente invenção abrange um anticorpo que pertence a qualquer classe de imunoglobulinas e de qualquer isotipo. O termo "fragmento funcional" do anticorpo na presente invenção é uma parte (um fragmento parcial) de um anticorpo como definido acima e designa um fragmento que retém uma ou mais acções do anticorpo num antigene. Exemplos específicos desses fragmentos funcionais incluem F(ab')2/ Fab', Fab, Fv, FVs com ligação dissulfureto, FV de filamentação simples (scFV) e respectivos polímeros (D. J. King., "Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies" 1998, T. J. International Ltd.). 22 0 termo "anticorpo humano" na presente invenção designa um anticorpo que é o produto de expressão de um gene de anticorpo derivado de humano. 0 termo "agonista" designa uma acção para promover a ligação de ligandos do CD40 ao CD40 expresso nas superfícies de células como células B, células tumorais ou células dendríticas, ou uma acção para dotar células que expressam o CD40 de um ou mais efeitos que são fornecidos por ligandos do CD40 em células que expressam o CD40. 0 termo "anticorpo agonista" designa um anticorpo com essa acção agonista. 0 termo "antagonista" designa uma acção para inibir a ligação de ligandos do CD40 ao CD40 expresso nas superfícies de células como células B, células tumorais ou células dendríticas, ou uma acção para neutralizar um ou mais efeitos que são proporcionados por ligandos do CD40 a células que expressam o CD40. 0 termo "anticorpo antagonista" designa um anticorpo com essa acção. 0 termo "células dendríticas (DCs)" na presente invenção indica um grupo de células, que também são referidas como leucócitos dendríticos, com uma função forte de apresentação de antigenes. As células dendríticas utilizadas aqui são induzidas por cultura de células precursoras positivas para CD34 contidas, por exemplo, na medula óssea, sangue do cordão umbilical ou sangue periférico. Alternativamente, as células dendríticas podem ser obtidas por cultura de monócitos positivos para CD14 em sangue periférico na presença de GM-CSF e IL-4. 23 0 termo "DCs imaturas" designa DCs que são negativas para CD14, fortemente positivas para CDla, positivas para CD83, CD86 e positivas para MHC de classe II. 0 termo "DCs maduras" designa DCs que são negativas para CD14, positivas para CDla e que se tornaram fortemente positivas para CD83, CD86 e MHC de classe II. 0 termo "activar DCs" na presente invenção designa uma alteração que DCs induzem em resposta à estimulação por CD40. Por exemplo, também significa causar a maturação de DCs imaturas, a expressão elevada de CD80, CD86 e HLA-Classe II e a intensificação da produção de IL-12. Alternativamente, quando coexistem células T, também significa estimular células T para promover a sua proliferação. 0 termo "activar células B e uma linha de células B" na presente invenção designa uma alteração que as células induzem ao responderem à estimulação por CD40. Por exemplo, significa causar síntese de DNA, promover a incorporação de timidina e, assim, aumentar a quantidade de expressão de CD95. 2. Obtenção do anticorpo

Para obter o anticorpo da presente invenção é preferido imunizar ratinhos utilizando, como antigene, uma linha de células de ratinho recombinante genética que expressa um CD40 humano ou um CD40 humano solúvel que foi produzido e purificado com recombinantes. É preferido que os ratinhos usados para imunização produzam anticorpos humanos (Tomizuka et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 2000, Volume 97: 722). Ao seleccionar anticorpos monoclonais que 24 se ligam a CD40 humano solúvel que foi produzido e purificado com recombinantes, anticorpos que também reagem com CD40 expresso em células diferentes de células B podem ser mais facilmente obtidos do que no caso em que se seleccionam clones que reagem especificamente com células B. Os hibridomas podem ser produzidos pelo método de Kohler e Milstein et al. (Nature, 1975, Volume 256: 495) geralmente utilizado na produção de anticorpos monoclonais utilizando as células de nodos linfáticos ou esplenócitos de ratinhos imunizados.

Suplementarmente, analisa-se a ligação do CD40L solúvel ao CD40 utilizando um sistema de ressonância de plasmões de superfície como BIAcore 2000 (Biacore) e depois seleccionam-se anticorpos que não competem com o CD40L. Adicionalmente, seleccionam-se anticorpos que suprimem independentemente a supressão do crescimento celular de linfoma B. Além disso, procede-se à selecção de anticorpos usando como indicador a condição de actuarem ou não em DCs. Este procedimento permite produzir e seleccionar anticorpos com as vantagens de actuarem em células dendríticas ou células B sem competirem com o CD40L e suprimirem a proliferação de células cancerosas que expressam o CD40. O anticorpo da presente invenção é obtido por cultura do hibridoma assim obtido. Além disso, um gene que codifica um anticorpo monoclonal humano, ou respectiva região variável, é clonado a partir de uma célula produtora do anticorpo, como uma célula B ou um hibridoma, o gene clonado é incorporado num vector apropriado e, seguidamente, o vector é introduzido num hospedeiro (por exemplo, uma linha de células de mamífero, Escherichia coli, célula de levedura, célula de insecto ou célula de planta) de modo a ser 25 possível preparar um anticorpo recombinante produzido por tecnologia de recombinação genética (P. J. Delves, "Antibody Production Essential Techniques", 1997, Wiley; P. Shepherd e C. Dean, "Monoclonal Antibodies", 2000, Oxford University Press; J. W. Goding, "Monoclonal Antibodies: principies and practice", 1993, Academic Press). Além disso, são gerados gado vacum, cabras, ovelhas ou porcos transgénicos nos quais um gene de anticorpo alvo é incorporado no gene endógeno por técnicas de geração de animais transgénicos. Do leite destes animais transgénicos podem obter-se, em grandes quantidades, anticorpos monoclonais derivados do gene de anticorpo. Quando se cultivam hibridomas in vitro, estes crescem e são mantidos e armazenados de um modo adequado para várias condições, tais como as propriedades da espécie de célula a ser cultivada, finalidades das experiências e estudos e métodos de cultura. Em seguida, os hibridomas podem ser cultivados utilizando qualquer meio nutriente que é induzido e preparado a partir de um meio nutriente conhecido ou meio básico conhecido que é utilizado para a produção de anticorpos monoclonais no sobrenadante da cultura. 3. Rastreio O rastreio de anticorpos agonistas é efectuado por análise usando linfoma B humano, de modo a ser possível seleccionar anticorpos que promovam a expressão de CD95. Os anticorpos são suplementarmente adicionados a uma solução de cultura de DCs purificada e depois seleccionam-se os anticorpos que causam maturação. Alternativamente, seleccionam-se anticorpos exibindo actividade para proliferar células T numa reacção de linfócitos misturados utilizando DCs imaturas. Além disso, adicionam-se anticorpos a DCs maduras e depois seleccionam-se anticorpos com acção para promover 26 a produção de IL-12. Suplementarmente, seleccionam-se anticorpos com actividade para suprimir o crescimento de células tumorais que expressam CD40 ou actividade para induzir a morte celular das células tumorais. A competição com CD40L pode ser distinguida de outros casos com base no anticorpo inibir ou não a ligação de CD40 solúvel a ligandos do CD40 solúveis utilizando, por exemplo, um sistema de ressonância de plasmões de superfície (BlOCore). Alternativamente, também pode ser distinguida de outros casos com base no anticorpo intensificar ou não a acção de ligandos do CD40 numa linha de células B. 0 rastreio de anticorpos antagonistas é realizado por análise utilizando linfoma B humano. A adição suplementar de CD40L solúvel com FLAG como marcador na presença de anticorpo anti-FLAG permite rastrear anticorpos que inibem mais fortemente a ligação de CD40L solúvel ao CD40 na célula de linfoma B humano. Ao introduzir um gene que codifica o CD40L, em vez do CD40L solúvel, também é possível utilizar células recombinantes que expressam muitos ligandos do CD40 na superfície celular. Subsequentemente, anticorpos humanos formam ligações cruzadas com anticorpos anti-IgG humana de modo a remover clones que activam linfoma B por formação de ligações cruzadas. Suplementarmente, seleccionam-se anticorpos exibindo actividade para suprimir a proliferação de células T numa reacção de linfócitos misturados utilizando DCs purificadas e maduras, ou anticorpos com acção para suprimir a produção de IL-12 quando se adicionam ligandos de CD40 a DCs maduras. 27

Os anticorpos que são obtidos como descrito acima têm pelo menos qualquer uma das propriedades seguintes, que se pensa serem terapeuticamente eficazes. (1) No caso do anticorpo agonista (a) 0 anticorpo actua em células dendriticas originando a produção de IL-12 na presença de LPS (lipopolissacárido) e IFNy. Neste caso, a concentração de LPS varia desde 10 pg/mL até 10 ng/mL e a concentração de IFNy varia desde 10“4 M até 10’2 M. Com uma concentração do anticorpo de 1 μρ/ιτΛ ou superior, ou preferivelmente 0,1 μρ/πΛ ou superior, a quantidade produzida de IL-12 é superior à de um teste utilizando como controlo anticorpo G28-5, o anticorpo anti-CD40 agonista conhecido. Quando os anticorpos, com uma concentração de 0,1 μρ/ηιΐ ou superior, são adicionados a células dendriticas com uma concentração de 1 x 106 células/mL, são produzidos 100 pg/mL ou mais de IL-12, ou, na mesma situação quando se adiciona uma concentração de 1 μg/mL ou superior, são produzidos 1 000 pg/mL ou mais, ou, preferivelmente, 10 000 pg/mL ou mais de IL-12 (ver

Exemplos 9 e 13). (b) O anticorpo tem acção de ligação a células dendriticas e, assim, causa a maturação das células dendriticas. Além disso, quando os anticorpos, com uma concentração de 20 \xq/x^L ou inferior, preferivelmente 0,1 até 15 pg/mL, mais preferivelmente 5 até 15 \xq/mL, foram cultivados com células dendriticas, a actividade para causar maturação é mais elevada do que a do anticorpo G28-5 (ver Exemplo 9). (c) O anticorpo tem actividade para promover a expressão de CD95 de uma linha de células B estabelecida que é superior 28 à do anticorpo G28-5. Neste caso, com uma concentração do anticorpo de 10 μς/πΛ ou superior, preferivelmente 1 μρ/πΛ ou superior, mais preferivelmente 0,1 μς/ΐίΛ ou superior, ainda mais preferivelmente 0,01 μς/mL ou superior e muito preferivelmente 0,001 μς/mL ou superior, a actividade para promover a expressão de CD95 é mais elevada do que a do anticorpo G28-5 que é usado como controlo num teste. As razões entre a actividade do anticorpo G28-5, que foi utilizado num teste como controlo, para promover a expressão de CD95 e a do anticorpo com concentrações de 10 μς/πiL, 1 μς/πΛ, 0,1 μς/πΛ e 0,01 μς/ΐΐΛ estão apresentadas abaixo (Tabela 1).

Tabela 1

Concentração do anticorpo Razão 10 μg/mL Aproximadamente 2 vezes, preferivelmente aproximadamente 3 vezes, mais preferivelmente 4,5 vezes e muito preferivelmente 6 vezes 1 μg/mL Aproximadamente 2 vezes, preferivelmente aproximadamente 5 vezes, mais preferivelmente aproximadamente 6 vezes e ainda mais preferivelmente 7 vezes 0,1 μg/mL 2 vezes, preferivelmente 6 vezes, mais preferivelmente aproximadamente 7 vezes 0,01 μg/mL 2 vezes, preferivelmente 4 vezes, mais preferivelmente 5 vezes, ainda mais preferivelmente aproximadamente 6 vezes

A expressão promovida de CD95 significa que o anticorpo activa a linha de células B estabelecida. Aqui, exemplos da linha de células B estabelecida incluem células Ramos e células HS-Sulton. Adicionalmente, células Ramos provêm de linfoma de Burkitt, que são células modelo de células B 29 centroblásticas humanas. Células HS-Sulton provêm de linfoma de Burkitt (ver Exemplos 6 e 12). (d) 0 anticorpo tem actividade para suprimir a síntese de DNA, incorporação de timidina e proliferação da linha de células B estabelecida (células Ramos ou células HS-Sulton), que é mais elevada do que a do anticorpo G28-5. Neste caso, a concentração do anticorpo é pelo menos 0,05 μς/ΓηΒ ou, preferivelmente, 0,1 até 15 μς/ΓηΒ (ver Exemplo 8) .

(e) O anticorpo induz morte celular da linha de células B estabelecida (ver Exemplo 16). (f) O anticorpo não inibe a ligação de ligandos do CD40 ao CD40. O termo "não inibe" significa que o CD40L pode ligar-se ao CD40 na mesma extensão de quando o anticorpo está ausente, mesmo quando o anticorpo se liga previamente ao CD40 (isto é, na presença do anticorpo) . Um ou ambos de entre ligandos do CD40 e CD40 podem consistir num tipo de proteína que é expresso na membrana ou numa proteína solúvel (ver Exemplo 11) .

Anticorpos com as propriedades acima são produzidos, por exemplo, por um hibridoma KM302-1 (FERM BP-7578) e um hibridoma KM341-1-19 (FERM BP-7759).

Determinaram-se as sequências de nucleótidos e sequências de aminoácidos das regiões variáveis da cadeia pesada (cadeia H) e cadeia leve (cadeia L) de um anticorpo monoclonal produzido pelo hibridoma KM341-1-19 (Exemplo 17) . A presente invenção proporciona DNA que codifica pelo menos a região variável da cadeia pesada, ou a cadeia 30 pesada completa, e DNA que codifica a região variável da cadeia leve do anticorpo monoclonal produzido pelo hibridoma KM341-1-19. Os DNAs também incluem outros DNAs que codificam as mesmas sequências de aminoácidos devido à degeneração de codões para além dos descritos no Exemplo 17. Além disso, a presente invenção proporciona anticorpos monoclonais, ou respectivos fragmentos funcionais, especificados pelas sequências de aminoácidos pelo menos das regiões variáveis das cadeias pesadas ou as sequências de aminoácidos das cadeias pesadas completas, e as sequências de aminoácidos das regiões variáveis das cadeias leves, como revelado no Exemplo 17. (2) No caso do anticorpo antagonista (g) O anticorpo neutraliza a acção de ligandos para o CD40. Aqui, o termo "a acção de ligandos" significa a acção de ligandos expressos em células T ou noutras células e a acção de ligandos livres para o CD40 (ver Exemplos 7 e 14). (h) O anticorpo neutraliza um ou mais efeitos que ligandos para o CD40, na linha de células B estabelecida, exercem em células que expressam o CD40, e não exibem acção agonista para o CD40 na linha de células B estabelecida acima por formação de ligações cruzadas por anticorpos anti-imunoglobulinas. Esta acção é mais fraca do que a do 5D12. O termo "efeitos que ligandos têm em células que expressam o CD40" significa a activação das células que expressam o CD40. Especificamente em células B, o efeito significa a activação da incorporação de timidina e proliferação de células B, e a activação da expressão intensificada de CD95 na linha de células B estabelecida. Suplementarmente, em DCs, o efeito significa a activação da maturação de DCs, a activação da expressão intensificada de CD86 e HLA-DR, a 31 activação da incorporação de timidina pelas células T coexistentes, a promoção da proliferação, a activação da produção de IL-12 e IL-10 e afins. Procede-se à formação de ligações cruzadas por anticorpos anti-imunoglobulinas pela presença de 0,1 μρ/πΛ ou mais de anticorpos anti-imunoglobulinas numa solução de cultura (ver Exemplo 7). (i) O anticorpo atenua ou neutraliza a actividade de CD40L com ligações cruzadas ou CD40L expresso por células para aumentar a expressão de CD95 na linha de células B estabelecida. O anticorpo também atenua ou neutraliza a actividade do CD40L, cuja acção é intensificada por formação de ligações cruzadas por anticorpos e afins contra marcadores. A ligação de ligandos (incluindo ligandos livres e ligandos expressos por células especificas) para o CD40 a células que expressam o CD40 ocasiona a transdução de sinal intracelular e, por fim, faz com que as células expressem CD95 (Fas) nas superfícies celulares. Em conformidade, o anticorpo antagonista da presente invenção inibe a transdução do sinal acima por ligação ao CD40, desse modo neutralizando a expressão de CD95. Neste caso, a concentração do anticorpo é 1 pg/mL ou superior, ou preferivelmente 0,1 pg/mL ou superior (ver Exemplos 7 e 14) . (j) O anticorpo é antagonista para o CD40 em DCs. Especificamente, o anticorpo atenua ou neutraliza a actividade do CD40L para activar DCs. Quando DCs são estimuladas por ligandos em células T coexistentes com as DCs, as células T são activadas, de modo que são promovidas a incorporação de timidina e afins. Na reacção de linfócitos misturados, em que se permite a coexistência de 32 DCs e células T que são ambas derivadas de indivíduos diferentes, as DCs interagem com células T causando activação das células T. 0 anticorpo antagonista da presente invenção inibe a interacção acima por ligação ao CD40, resultando em incorporação suprimida de timidina. Neste caso, a concentração do anticorpo é pelo menos 0,001 pg/mL ou, preferivelmente, 0,1 até 10 pg/mL (ver Exemplo 10) . O anticorpo antagonista acima é produzido, por exemplo, pelos hibridomas KM281-1-10 (FERM BP-7579) e KM281-2-10-1-2 (FERM BP-7580) (9 de Maio de 2001, Depositário de Organismos de Patentes Internacionais (IPOD) do Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia Industrial Avançada (Central 6, 1-1-1, Higashi, Tsukuba, Ibaraki)) e o 4D11 inventivo (FERM BP-7758). (3) O anticorpo da presente invenção pode ser alterado num anticorpo de uma subclasse diferente (por exemplo, ver a publicação EP314161) por modificação realizada por técnicas de engenharia genética conhecidas do experimentado na área, especificamente substituindo uma região que define a subclasse de uma cadeia pesada do anticorpo por uma região que define outra subclasse. A região variável de uma cadeia pesada e a região constante de outra subclasse podem estar directamente ligadas. Por exemplo, uma alteração da subclasse do anticorpo da presente invenção em IgG2 ou lgG4 possibilita diminuir o grau de ligação do anticorpo a um receptor Fc. Especificamente, o sítio Nhe I (GCTAGC) é introduzido numa cadeia pesada do anticorpo humano, sítio do índice EU 118 (Ala), 119 (Ser) de acordo com Kabal et ai. ("Sequence of Proteins of Immunological Interest", 5a Edição, Public Health Service, National Institute of 33

Health, Bethesda, Md. (1991)). Por digestão com a enzima de restrição pode mudar-se para outra subclasse, IgG, sem alterar o aminoácido. Além disso, a alteração artificial da sequência de aminoácidos de uma região constante, ou a ligação de uma sequência da região constante com essa sequência alterada à região variável do anticorpo da presente invenção pode diminuir o grau de ligação a um receptor Fc (Lund J., et al., J. Immunol. 1991, volume 147: 2657-2662) ou também pode aumentar ou diminuir a actividade de CDC (Tao M., et al., J. Exp. Med. 1991, volume 1025-1028; Idusogie E. E., et al., J. Immunol. 2001, volume 166: 2571-5) . Suplementarmente, para evitar a acção de ADCC, CDC ou afins, só podem ser previamente seleccionados anticorpos da subclasse IgG2 ou IgG4. Adicionalmente, a ligação de um radionuclido, toxina bacteriana, agente quimioterapêutico, pró-fármaco ou afins ao anticorpo da presente invenção pode aumentar suplementarmente o efeito terapêutico contra doenças, como cancro. 4. Composição farmacêutica

Uma composição farmacêutica contendo uma preparação farmacêutica que consiste no anticorpo purificado na presente invenção também está abrangida no âmbito da presente invenção. Essa composição farmacêutica contém, preferivelmente, um diluente ou transportador fisiologicamente aceitável para além do anticorpo, ou pode consistir numa mistura com outros anticorpos ou outros fármacos, como antibióticos. Exemplos do transportador apropriado incluem, mas não se limitam a estes, uma solução salina fisiológica, uma solução salina tamponada com fosfato, uma solução de glucose salina tamponada com fosfato e soro fisiológico tamponado. Alternativamente, o anticorpo é liofilizado e depois é utilizado, quando 34 necessário, adicionando a solução aquosa tamponada acima para a reconstituição. Exemplos da via de administração incluem uma via oral e uma via parentérica, incluindo injecções ou distribuição do fármaco pela via intravenosa, intramuscular, hipodérmica e intraperitoneal.

Neste caso, a dose eficaz a ser administrada na forma de uma combinação da dose eficaz do anticorpo da presente invenção, um diluente apropriado e um transportador farmacologicamente aceitável varia desde 0,1 mg até 100 mg por kg de peso do corpo por administração. A administração é efectuada em intervalos de 2 dias até 8 semanas.

Quando se usa uma composição farmacêutica que contém o anticorpo da presente invenção e, particularmente, quando se usa o anticorpo agonista, a composição é usada como um fármaco de potenciação imunológica (agente antiviral e fármaco anti-infeccioso), agente antitumoral ou agente anti-doença autoimune. Podem ocorrer em conjunto múltiplos exemplos destas doenças. Alternativamente, o anticorpo também pode ser usado como adjuvante em combinação com uma vacina, como um péptido específico para cancro. Quando a composição contém o anticorpo antagonista, é útil como agente imunossupressor (agente profiláctico ou terapêutico contra rejeição imunológica ou GVHD por transplantação de ilhéus de Langerhans, rins ou afins) por transplantação de órgãos, ou um agente anti-doença autoimune (por exemplo, contra reumatismo, ou como agente terapêutico contra esclerose arterial, esclerose disseminada, lúpus eritematoso sistémico, trombocitemia idiopática ou doença de Crohn), agente terapêutico contra alergias como asma, ou agente terapêutico contra a síndroma de inibição do factor 35 VIII de coagulação do sangue. Podem ocorrer em conjunto múltiplos exemplos destas doenças.

Quando o anticorpo anti-CD40 é usado como meio terapêutico contra uma doença na qual o CD40 está envolvido, pode esperar-se obter anticorpos que proporcionam um melhor efeito terapêutico por selecção dos anticorpos utilizando como indicador a função de DCs.

No caso do anticorpo agonista, pode esperar-se obter anticorpos com forte acção de potenciação imunológica por selecção de anticorpos que conseguem activar DCs mais eficazmente. Além disso, utilizando como indicador a promoção da produção de IL-12 por DCs maduras podem obter-se anticorpos com forte acção indutora de CTLs. Através da indução de CTLs podem obter-se anticorpos altamente eficazes para remover células infectadas com vírus ou células tumorais. Suplementarmente, uma vez que se podem esperar efeitos sinergéticos, anticorpos preferidos ligam-se ao CD40 sem inibir a ligação de ligandos do CD40 ao CD40. Quando se considera o tratamento de cancro, se estiverem presentes anticorpos que induzem directamente a morte celular de células cancerosas que expressam o CD40 ou suprimem a sua proliferação, e activarem DCs eficazmente, podem esperar-se efeitos sinergéticos, e esses anticorpos podem ser um agente terapêutico que pode ser utilizado contra tumores que não expressam o CD40. Estes anticorpos são considerados úteis como agentes terapêuticos contra doenças virais ou agentes antitumorais.

Entretanto, também é de esperar que anticorpos que se ligam especificamente ao CD40 e suprimem a ligação do CD40L sem activarem o CD40 sejam capazes de suprimir não só a acção 36 de ligandos para células B mas também a acção em DCs. No entanto, até à data foram obtidos anticorpos utilizando como indicador o seu efeito em células B. Assim, é altamente significativo obter anticorpos com forte acção supressora também em células dendriticas e desenvolvê-los como produto farmacêutico. Além disso, é uma preocupação que o anticorpo anti-CD40 possa ter uma acção totalmente oposta por formação de ligações cruzadas, como descrito acima. Assim, são necessários anticorpos que não activem o CD40 nem mesmo por formação de ligações cruzadas. Também é uma preocupação que anticorpos monoclonais derivados de um mamífero não humano, como um ratinho, anticorpos quiméricos consistindo na região variável de um anticorpo monoclonal de ratinho e uma região constante de uma imunoglobulina humanizada e anticorpos humanizados resultantes de enxerto de CDR, que até à data foram relatados como anticorpos contra o CD40 humano, tenham antigenicidade. Em consequência, é desejável um anticorpo humano como anticorpo para inibir a ligação a ligandos do CD40.

DESCRIÇÃO BREVE DAS FIGURAS A Fig. 1 mostra que anticorpos KM302-1 promoveram a expressão de CD95. A Fig. 2A mostra que os anticorpos antagonistas neutralizaram a acção de ligandos do CD40 em células Ramos. A Fig. 2B mostra que os anticorpos antagonistas neutralizaram a acção de ligandos do CD40 em células Ramos. A Fig. 3 mostra que anticorpos KM281-1-10 neutralizaram a acção de ligandos do CD40 em células Ramos. A Fig. 4 mostra que anticorpos KM281-1-10 com ligações cruzadas não promoveram a expressão de CD95. A Fig. 5 mostra que anticorpos 5D12 com ligações cruzadas promoveram a expressão de CD95. 37 A Fig. 6 mostra o efeito supressor da proliferação de anticorpos KM302-1 em células tumorais. A Fig. 7 mostra que anticorpos KM302-1 promoveram a maturação de DCs. A Fig. 8 mostra que anticorpos KM302-1 promoveram a produção de IL-12 por DCs. A Fig. 9 mostra que anticorpos KM281-1-10 neutralizaram a acção de ligandos do CD40 em DCs. A Fig. 10 mostra que anticorpos KM281-1-10 neutralizaram a acção de ligandos do CD40 em DCs. A Fig. 11 mostra que anticorpos KM302-1 activaram DC-MLR imaturas. A Fig. 12 mostra que anticorpos KM341-1-19 e afins promoveram a expressão de CD95 por células Ramos. A Fig. 13 mostra que anticorpos KM341-1-19 promoveram a produção de IL-12 por DCs maduras. A Fig. 14 mostra que anticorpos KM341-1-19 promoveram a produção de IL-10 por DCs maduras. A Fig. 15 mostra que anticorpos 4D11 e afins neutralizaram a acção de ligandos do CD40 em células Ramos. A Fig. 16 mostra que anticorpos KM302-1 exibiram efeito antitumoral no modelo de ratinho transplantado com células tumorais humanas. A Fig. 17 mostra que anticorpos KM341-1-19 exibiram um efeito supressor da proliferação contra células tumorais. A Fig. 18 mostra que F4-465, 4D11 e KM281-1-10 suprimiram a produção de IgG especifica para antigenes. A Fig. 19 mostra que F4-465, 4D11 e KM281-1-10 suprimiram a produção de IgM especifica para antigenes. A Fig. 20 mostra que F4-465 suprimiu a proliferação de células B tonsilares.

MELHOR MODO DE IMPLEMENTAR A INVENÇÃO 38 A presente invenção será suplementarmente descrita em pormenor por referência aos exemplos. No entanto, o âmbito técnico da invenção não é limitado por estes exemplos.

[Exemplo 1] Preparação do antigene (1) Células Células EL-4 provêm de uma linha de células T estabelecida derivada de ratinho e podem ser facilmente obtidas (N° da ATCC TIB-39). Células B Ramos (N° da ATCC CRL-1596) e hibridoma produtor de anticorpo de ratinho anti-CD40 G28-5 (HB-9110) e 5D12 (HB-11339) foram adquiridos à ATCC. (2) Expressão e purificação do antigene

Regiões extracelulares foram amplificadas por PCR utilizando como modelo cDNA do CD40 humano (Número de Acesso da Genbank: NM_001250) e os seguintes "primers", nas condições de 20 ciclos de 95°C durante 5 segundos, 55°C durante 30 segundos e 72°C durante 30 segundos. " Prime r" 1· ^-CCCAGATCTGTCCATCCAGAACCACCCACTGCATGCAGAG-S' (ID SEQ NO: 1) "Primer" 2: 5'*AC^AGATCTCGGCTCTACCTATCTCAGCCGATCCTGGGGàC*3’ (ID SEQ NO: 2) O cDNA amplificado foi inserido após a sequência de sinal de melitina e antes da região FC derivada de IgGl humana ou região FC derivada de IgG2a de ratinho de um vector pFastBac (Gibco BRL). Para produzir o CD40 prepararam-se baculovirus recombinantes de acordo com as instruções. Células Th5 foram infectadas com os virus recombinantes e depois foram cultivadas durante 4 dias. Tratou-se o sobrenadante com um filtro de 0,22 nm, adicionou-se-lhe 39

Proteína G sefarose (Amersham Pharmacia) e, em seguida, agitou-se suavemente a mistura a 4°C. Após uma noite, a sefarose foi transferida para uma coluna e foi lavada com um volume 20x de PBS. Uma proteína FC do CD40 humano eluiu com um tampão de glicina 20 mM (pH 3,0) . O vector para expressar o CD40 em superfícies celulares foi obtido de Randolph J. Noelle (Inui, S., et al., EJI, 20_, 1747-1753, 1990) . O cDNA completo foi clivado com a enzima Xba I e depois foi inserido em pCDNA3 (Invitrogen). Introduziu-se o vector em células EL-4 e, seguidamente, cultivaram-se as células na presença de 0,5 mg/mL de G418 (Gibco BRL), desse modo obtendo-se uma estirpe com expressão estável. A expressão do CD40 foi confirmada por análise FACS utilizando anticorpos anti-CD40 humano conjugados com FITC (Pharmingen).

[Exemplo 2] Geração de ratinhos para imunização

Os ratinhos utilizados para imunização tinham um fundo genético pelo qual eram homozigóticos para a cadeia pesada e cadeia leve κ de Ig endógena fragmentada, e os ratinhos albergavam, simultaneamente, o fragmento do cromossoma 14 (SC20) que continha o locus do gene da cadeia pesada de Ig humana e o transgene da cadeia Igic humana (KCo5) . Geraram-se estes ratinhos cruzando ratinhos de uma linha A, com o locus do gene da cadeia pesada de Ig humana, com ratinhos de uma linha B, com um transgene da cadeia IgK humana. Os ratinhos da linha A são homozigóticos para a cadeia pesada e cadeia leve κ de Ig endógena fragmentada e albergam o fragmento do cromossoma 14 (SC20) que é transmissível à progenitura, como descrito, por exemplo, no relato de Tomizuka et al. (Tomizuka et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 2000, Volume 97: 722). Os ratinhos da linha A foram 40 imunizados, de modo que se obtiveram os seguintes hibridomas F2-103 e F5-77. Suplementarmente, os ratinhos da linha B (ratinhos transgénicos) são homozigóticos para a cadeia pesada e cadeia leve κ de Ig endógena fragmentada e albergam um transgene da cadeia IgK humana (KCo5), como descrito, por exemplo, no relato de Fishwild et al. (Nat. Biotechnol., 1996, Volume 14: 845).

Para a seguinte experiência de imunização utilizaram-se indivíduos obtidos por cruzamento de ratinhos machos da linha A com ratinhos fêmeas da linha B, ou ratinhos fêmeas da linha A com ratinhos machos da linha B, e com a cadeia pesada e cadeia leve κ de Ig humana detectadas simultaneamente nos soros (Ishida & Lonberg, IBC's llth Antibody Engineering, Resumo 2000) . Adicionalmente, os ratinhos produtores de anticorpos humanos acima são disponibilizados pela Kirin Brewery Co., Ltd., via contrato. Por imunização dos ratinhos acima obtiveram-se os seguintes hibridomas KM302-1, KM341-1-19, KM643-4-11, 2053, 2105, 3821, 3822, 285, 110, 115, KM281-1-10, KM281-2-10-1-2, KM283-5, KM292-1-24, KM225-2-56, KM341-6-9, 4D11, 5H10, 11E1, 5G3, 3811, 3411 e 3417. Além disso, também se utilizaram para a seguinte experiência de imunização ratinhos quiméricos (Kuroiwa et al., Nat. Biotechnol., 2000, volume 18: 1086) albergando a cadeia Lambda do anticorpo humano, relatado por Kuroiwa et al. Do ratinho obteve-se um hibridoma F4-465.

[Exemplo 3] Preparação do anticorpo monoclonal humano contra o CD40 humano

Neste exemplo prepararam-se anticorpos monoclonais de acordo com um método geral descrito em "Introduction of 41

Experimental Procedures for Monoclonal Antibodies" (da autoria de Tamie Ando et al., Kodansha, 1991). O CD40 humano usado aqui como imunogene consistiu em FC humana de CD40 humano e células EL-4 que expressam o CD40 preparados no Exemplo 1. Os animais utilizados aqui para imunização foram ratinhos produtores de anticorpo humano que produzem a imunoglobulina humana preparada no Exemplo 2.

Os ratinhos produtores de anticorpo humano foram imunizados com 2 até 100 μς/ίηπαηίζ3ς30 de CD40: hFc por ratinho. Excluindo a primeira imunização, uma solução de antigene foi misturada com um volume equivalente de adjuvante de Freund incompleto (Sigma) e depois foi injectada subcutaneamente em várias posições separadas. A imunização foi realizada 3 até 4 vezes aproximadamente cada 10 dias até 3 semanas. Para a primeira imunização utilizou-se adjuvante de Freund incompleto (Sigma). Recolheu-se sangue da cauda do ratinho e depois mediu-se γ e κ do anticorpo humano contra o CD40 no soro utilizando ELISA. Três até 4 dias antes da excisão do baço efectuou-se a imunização final injectando 20 μρ de CD40:Fc dissolvidos em PBS pela veia caudal.

Os ratinhos produtores de anticorpo humano foram imunizados com células EL-4 de ratinho que expressam o CD40 humano. Células EL-4 (108 células/mL) foram suspensas em PBS e depois foram suavemente misturadas com um volume equivalente de adjuvante RIBI previamente emulsionado com PBS. A imunização foi realizada com as células 3 até 5 vezes aproximadamente cada 10 dias até 3 semanas. Quando não se utilizou o adjuvante, as células foram irradiadas com raios X com 8000 rad para utilização. 42 0 baço foi obtido cirurgicamente dos ratinhos imunizados. Os esplenócitos recolhidos foram misturados com mieloma de ratinho SP2/0 (N° da ATCC CRL1581) numa razão de 5 para 1. As células foram fundidas utilizando polietilenoglicol 1500 (Boehringer Mannheim) como agente para a fusão celular, tendo-se assim preparado um grande número de hibridomas. Procedeu-se à selecção de hibridomas por cultura em meio DMEM contendo HAT (Gibco BRL) suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (FCS), hipoxantina (H), aminopterina (A) e timidina (T) . Suplementarmente, obtiveram-se clones únicos pelo método de diluição limitante utilizando meio DMEM contendo HT. A cultura foi realizada numa placa de microtitulo de 96 cavidades (Beckton Dickinson). Efectuou-se o rastreio de clones de hibridomas produtores de anticorpos monoclonais humanos anti-CD40 humano por medição utilizando um ensaio imunoabsorvente de ligação a enzima (ELISA) e triagem de células activadas por fluorescência (FACS), como descrito posteriormente no Exemplo 4. O rastreio do hibridoma produtor de anticorpos monoclonais humanos por ELISA foi efectuado por 3 tipos de análises de ELISA e FACS, como descrito abaixo. Deste modo obteve-se um grande número de hibridomas produtores de anticorpos monoclonais humanos que tinham a cadeia γ de imunoglobulina humana (hlgy) e cadeia leve κ de imunoglobulina humana e tinham reactividade especifica para o CD40 humano. Em qualquer um dos seguintes exemplos, incluindo este exemplo, e tabelas e figuras que apresentam os resultados de teste dos exemplos, cada clone de hibridoma produtor do anticorpo monoclonal humano anti-CD40 humano da presente invenção foi designado utilizando símbolos. Um clone representado pelos símbolos precedido de "anticorpo" designa um anticorpo que é produzido por cada um dos hibridomas, ou um anticorpo 43 recombinante que é produzido por uma célula-hospedeiro que contém um gene de anticorpo (completo ou uma região variável) isolado do hibridoma. Adicionalmente, num sentido contextualmente claro, o nome de um clone de hibridoma pode expressar o nome de um anticorpo.

Os seguintes clones de hibridoma representam clones únicos. Anticorpo agonista: KM302-1, KM341-1-19, KM643-4-11, 2053, 2105, 3821, 3822, 285, 110, 115, Fl-102, F2-103, F5-77 e F5-157.

Anticorpo antagonista: KM2 81-1-10, KM281-2-10-1-2, KM283-5, KM292-1-24, KM225-2- 56, KM341-6-9, 4D11, 5H10, 11E1, 5G3, 3811, 3411, 3417 e F4-465.

Três clones de hibridoma KM 302-1, KM 281-1-10 e KM 281-2-10-1-2 de entre aqueles foram depositados em 9 de Maio de 2001, os clones KM341-1-19 e 4D11 foram depositados em 27 de Setembro de 2001 e o clone 2105 foi depositado em 17 de Abril de 2002 no Depositário de Organismos de Patentes Internacionais do Instituto Nacional de Ciência e

Tecnologia Industrial Avançada (Central 6, 1-1-1, Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japão) ao abrigo do Tratado de Budapeste. Os plasmideos com as regiões variáveis da cadeia pesada e cadeia leve de F2-103, F5-77 e F5-157 foram depositados em 19 de Abril de 2001 e os clones de hibridoma Fl-102 e F4-465 foram depositados em 24 de Abril de 2001 na ATCC (American Type Culture Collection, 10801 University Blvd. Manassas, Virgínia, E.U.A.) ao abrigo do Tratado de Budapeste (Tabela 2). 44

Tabela 2

Nome N° de Acesso KM302-1 FERM BP-7578 KM281-1-10 FERM BP-7579 KM281-2-10-1-2 FERM BP-7580 KM341-1-19 FERM BP-7759 4D11 FERM BP-7758 2105 FERM BP-8024 Fl-102 ATCC PTA-3337 F4-465 ATCC PTA-3338 Cadeia pesada de F2-103 (F2-103-H) ATCC PTA-3302 Cadeia leve de F2-103 (F2-103-L) ATCC PTA-3303 Cadeia pesada de F5-77 (F5-77-H) ATCC PTA-3304 Cadeia leve de F5-77 (F5-77-L) ATCC PTA-3305 Cadeia pesada de F5-157 (F5-157-H) ATCC PTA-3306 Cadeia leve de F5-157 (F5-157-L) ATCC PTA-3307 [Exemplo 4] Rastreio de hibridoma

Detecção de anticorpo monoclonal com cadeia γ de imunoglobulina humana.

Adicionou-se a FC de ratinho de CD40 humano (1 μς/πΛ) preparada no Exemplo 1, a 50 μL/cavidade, a cada cavidade de uma microplaca de 96 cavidades para ELISA (Maxisorp, Nunc) e incubou-se o sistema a 4°C, para que a FC de ratinho de CD40 humano ficasse adsorvida na microplaca. Seguidamente deitou-se fora o sobrenadante e adicionou-se a cada cavidade um reagente bloqueador (Block Ace, Dainippon Pharmaceutical), seguido de incubação à temperatura ambiente para o bloqueio. O sobrenadante da cultura (50 μΕ) de cada hibridoma foi adicionado a cada cavidade para a reacção e depois cada cavidade foi lavada com um tampão de fosfato que continha Tween20 0,1% (PBS-T). Anticorpo de cabra anti-IgG (γ) humano (Sigma, A0170) etiquetado com 45 peroxidase foi diluído 5 000 vezes com PBS-T contendo FBS 1%. Adicionou-se a solução (50 μ1/θ3νίά3άθ) a cada cavidade e realizou-se a incubação. A microplaca foi lavada 3 vezes com PBS-T e depois adicionou-se a cada cavidade uma solução de substrato cromogénico (TMB, 50 μ1/σ3νίά3άθ, Sumitomo Bakelite), seguido de incubação à temperatura ambiente durante 30 minutos. Adicionou-se a cada cavidade uma solução de terminação (50 μ!/θ3νίά3άβ) para terminar a reacção. Mediu-se a absorvância a um comprimento de onda de 4 50 nm com um leitor de microplacas. O sobrenadante da cultura de cavidades positivas foi analisado por FACS e depois seleccionaram-se as cavidades onde células Ramos ficaram coradas. As células presentes nas cavidades foram clonadas pelo método de diluição limitante e seguidamente obtiveram-se por cavidade as células de 1 clone. Confirmou-se o estado positivo para hK por ELISA utilizando a FC de ratinho de CD40 humano. Em resultado, anticorpos anti-CD40 humano de 173 clones foram obtidos de 20 ratinhos. Alguns destes anticorpos foram apresentados na Tabela 3 (anticorpos agonistas) e Tabela 4 (anticorpos antagonistas). Entre os anticorpos agonistas, pelo menos KM341-1-19 e 2105 não competiram significativamente com ligandos num teste competitivo empregando células que expressam o CD40L, células que expressam o CD40 e os anticorpos. 46

Tabela 3. Anticorpo agonista

Hibridoma Antigene Subclasse DCs Células tumorais KM302-1 FC de ratinho de CD40 IgG4 activadas proliferação suprimida KM341-1- 19 EL-4 que expressa CD40 humano IgG2 activadas proliferação suprimida KM643-4- 11 FC de ratinho de CD40 IgGl não implementado não implementado 2053 FC de ratinho de CD40 IgG2 não implementado não implementado 2105 FC de ratinho de CD40 IgG2 não implementado não implementado 3821 EL-4 que expressa CD40 humano IgG3 não implementado não implementado 3822 EL-4 que expressa CD40 humano IgG3 não implementado não implementado 285 FC de ratinho de CD40 IgGl não implementado não implementado 110 FC de ratinho de CD40 IgG4 não implementado não implementado 115 FC de ratinho de CD40 IgG4 não implementado não implementado F2-103 FC de ratinho de CD40 IgGl não implementado não implementado F5-77 FC de ratinho de CD40 IgGl não implementado não implementado 47

Tabela 4. Anticorpo antagonista

Hibridoma Antigene Subclasse Efeito da formação de ligações cruzadas DC-MLR KM281-1- 10 FC de ratinho de CD40 IgGl baixo suprimidas KM281-2- 10-1-2 FC de ratinho de CD40 IgGl baixo não implementado KM283-5 FC de ratinho de CD40 IgG4 significativo não suprimidas KM225-2- 56 FC de ratinho de CD40 IgG4 significativo não implementado KM292-1- 24 FC de ratinho de CD40 IgG2 significativo não implementado KM341-6-9 EL-4 que expressa CD4 humano IgGl significativo não implementado 4D11 FC de ratinho de CD40 IgGl baixo não implementado 5H10 FC de ratinho de CD40 IgGl baixo não implementado 11E1 FC de ratinho de CD40 IgGl baixo não implementado 5G3 FC de ratinho de CD40 IgG2 significativo não implementado 3811 EL-4 que expressa CD40 humano IgGl significativo não implementado 3411 EL-4 que expressa CD40 humano IgG2 significativo não implementado 3417 EL-4 que expressa CD40 humano IgG2 significativo não implementado F4-465 EL-4 que expressa CD40 humano IgGl não implementado não implementado 48

Detectaram-se anticorpos monoclonais com a cadeia leve κ de imunoglobulina (IgK) humana de um modo semelhante ao método ELISA descrito acima para a cadeia γ de imunoglobulina humana, com a excepção de se terem utilizado anticorpos de cabra anti-IgK humana (diluídos 1 000 vezes, 50 μL/cavidade, Southern Biotechnology) etiquetados com peroxidase.

Identificou-se a subclasse de cada anticorpo monoclonal de um modo semelhante ao método ELISA acima para a cadeia γ de imunoglobulina humana, com a excepção de se ter utilizado um anticorpo de ovelha anti-IgGl humana, anticorpo de ovelha anti-IgG2 humana, anticorpo de ovelha anti-IgG3 humana ou anticorpo de ovelha anti-IgG4 humana (cada um diluído 2 000 vezes, 50 pL/cavidade, The Binding Site) etiquetado com peroxidase.

Teste de reacção de cada anticorpo monoclonal contra células que expressam o CD40 humano

Estudou-se por análise FACS a reactividade de cada anticorpo monoclonal contra uma linha de células Ramos da qual foi relatado que expressa o CD40. A linha de células Ramos foi suspensa, a uma concentração de 2 x 106/ml, num tampão de coloração (SB) de NaN3 0,1% e PBS contendo FCS 2%. A suspensão de células (100 μΤ/θ3νίά3άβ) foi distribuída numa placa de fundo redondo de 96 cavidades (Beckton Dickinson) . Adicionou-se o sobrenadante de cultura (50 μΒ) de cada hibridoma e realizou-se a incubação à temperatura do gelo durante 30 minutos. Utilizaram-se como controlo negativo anticorpos de 49

IgGl humana contra albumina do soro humano, tendo sido preparados a uma concentração de 2 pg/mL com um meio de cultura de hibridoma. Adicionaram-se 50 pL da solução e efectuou-se a incubação à temperatura do gelo durante 15 minutos. Após lavagem com SB adicionaram-se 50 pL de anticorpo anti-humano etiquetado com fluorescência de R-PE (Southern Biotechnology) diluido 250 vezes e efectuou-se a incubação à temperatura do gelo durante 15 minutos. Após lavagem duas vezes com SB, o produto foi suspenso em 300 até 500 pL de um tampão de FACS e mediu-se a intensidade da fluorescência de cada célula por FACS (FACSort e FACScan, Beckton Dickinson). Em resultado seleccionaram-se anticorpos com actividade de ligação para a linha de células Ramos.

[Exemplo 5] Preparação de cada anticorpo O sobrenadante da cultura contendo anticorpos monoclonais foi preparado pelo método seguinte.

Obteve-se um hibridoma produtor de anticorpo G28-5 da ATCC (N° da ATCC HB-9110). Os hibridomas produtores de anticorpo anti-CD40 foram aclimatizados em meio eRDF (Kyokutoseiyaku) que continha insulina bovina (5 pg/mL, Gibco BRL), transferrina humana (5 pg/mL, Gibco BRL), etanolamina (0,01 mM, Sigma) e selenito de sódio (2,5 x 10’5 nM, Sigma). Os hibridomas foram cultivados num balão rotativo. Recolheu-se o sobrenadante da cultura quando a taxa de células viáveis dos hibridomas atingiu 90%. Aplicou-se o sobrenadante recolhido em filtros de 10 pm e 0,2 pm (German Science) de modo a eliminar detritos diversos, como hibridomas. 50

Os anticorpos anti-CD40 foram purificados do sobrenadante da cultura acima pelo método seguinte. O sobrenadante da cultura que continha os anticorpos anti-CD40 foi submetido a purificação por afinidade utilizando uma coluna de Proteína A Hyper D (NGK Insulators, Ltd.) ou uma coluna de Proteína G (para a purificação de IgGl de ratinho, Amersham Pharmacia Biotech) de acordo com as instruções anexas, utilizando PBS (-) como tampão de adsorção e tampão de citrato de sódio 0,1 M (pH 3) como tampão de eluição. Adicionou-se solução de 1 M Tris-HCl (pH 8,0) ou Na2HP04 para ajustar a fracção de eluição, de modo a ter um pH de cerca de 7,2. A solução preparada de anticorpo foi substituída por PBS (-) utilizando uma membrana de diálise (limite 10000, Spectrum Laboratories) ou coluna SP (Amersham Pharmacia Biotech) e depois efectuou-se esterilização por filtração utilizando um filtro membranar Millex-GV (Millipore) com uma dimensão dos poros de 0,22 pm. Determinou-se a concentração do anticorpo purificado medindo a absorvância a 280 nm e depois calculando com 1 mg/mL a 1,45 OD.

[Exemplo 6] Promoção da expressão de CD95 em células Ramos por anticorpo agonista anti-CD40

Uma suspensão de células Ramos 5,0 x 105 células/mL foi inoculada a 100 pL/cavidade (5 x 104 células por cavidade) para uma placa de 96 cavidades. O sobrenadante da cultura de hibridoma ou o anticorpo purificado foi diluído para 20 pg/mL com um meio e depois a solução foi adicionada, a uma concentração de 100 pL/cavidade, a uma placa de 96 cavidades. Após cultura durante a noite, as células foram recolhidas e analisadas por FACSCan ou FACSsort (Beckton Dickinson) utilizando anticorpos anti-CD95 etiquetados com 51 R-PE (Pharmingen NJ) . A Figura 1 apresenta os resultados. Os eixos horizontais na Fig. 1 indicam a intensidade da expressão de CD95. A adição de anticorpos está indicada com uma linha grossa, e a não adição de anticorpos está indicada com uma linha fina. Foi mostrado que os anticorpos KM302-1 promoveram a expressão de CD95 melhor do que anticorpos G28-5, que eram os anticorpos conhecidos. Isto é, foi mostrado que o anticorpo KM302-1 é agonista de forma mais eficaz.

[Exemplo 7] Supressão da expressão de CD95 em células Ramos por anticorpo antagonista anti-CD40

Uma suspensão de células Ramos 1,0 x 106 células/mL foi inoculada, a 50 μ1/θ3νίά3άθ, numa placa de 96 cavidades. O sobrenadante da cultura de hibridoma ou o anticorpo purificado foi ajustado para 2 μρ/Γηΐ com um meio e depois foi adicionado, a 100 μΙ/cavidade, a uma placa de 96 cavidades. Adicionaram-se ao meio ligandos do CD40 solúveis (4 μg/mL, Alexis Corporation) e anticorpos anti-FLAG (4 μρ/ηιΐ, M2, Sigma) e depois o meio foi adicionado à placa de 96 cavidades a 50 μL/cavidade. Após cultura durante a noite, as células foram recolhidas e seguidamente analisadas por FACS utilizando anticorpos anti-CD95 etiquetados com R-PE (Pharmingen NJ). As Figuras 2A e 2B e 3 apresentam os resultados. Os eixos horizontais nas figuras indicam a intensidade da expressão de CD95. A expressão de CD95 foi suprimida na mesma extensão da do controlo negativo pelos anticorpos produzidos por cada um dos seguintes hibridomas: KM281-1-10, KM281-2-10-1-2, KM283-5, KM292-1-24 e KM225-2-56. 52

Na Fig. 3, os anticorpos KM281-1-10 (painel inferior) suprimiram a expressão de CD95 mais eficazmente do que os anticorpos 5D12 (painel central), o anticorpo conhecido suprimiu apenas ligeiramente a expressão de CD95. Especificamente, foi mostrado que o anticorpo KM281-1-10 é antagonista de forma mais eficaz. Assim, foi mostrado que o anticorpo monoclonal humano é um anticorpo antagonista.

Efeito da formação de ligações cruzadas por anticorpo anti-imunoglobulina

Uma suspensão de células Ramos 1,0 x 106 células/mL foi inoculada, a 50 μL/cavidade, numa placa de 96 cavidades. O sobrenadante da cultura de hibridoma ou o anticorpo purificado foi ajustado para 2 μg/mL com um meio e depois foi adicionado, a 100 μΕ/θ3νίά3άθ, a uma placa de 96 cavidades. Adicionaram-se ao meio anticorpos anti-IgG humana (Sigma, 13382) ou anticorpos anti-IgG de ratinho (Biosource, AMI3401) , a 4 μς/πΛ, e depois o meio foi adicionado a uma placa de 96 cavidades a 50 μΙ/θ3νίά3άθ. Após cultura durante a noite, as células foram recolhidas e seguidamente analisadas por FACS utilizando anticorpos anti-CD95 etiquetados com R-PE (Pharmingen NJ). As Figuras 4 e 5 apresentam os resultados. Os eixos horizontais nas figuras indicam a intensidade da expressão de CD95. A expressão de CD95 foi suprimida pelos anticorpos produzidos por cada um dos hibridomas KM281-1-10 e KM281-2-10-1-2. Inversamente, a expressão de CD95 foi aumentada pelos anticorpos produzidos por cada um dos seguintes hibridomas 5D12, KM283-5, KM292-1-24 e KM225-2-56.

[Exemplo 8] Supressão da proliferação em células Ramos por anticorpo agonista anti-CD40 53

Uma suspensão de células Ramos e HS-Sulton 1,0 x 105 células/mL foi inoculada, a 100 μ1/θ3νίά3άβ, numa placa de 96 cavidades. Adicionou-se ao meio uma mistura de quantidade equivalente dos anticorpos purificados ou ligandos do CD40 solúveis e anticorpos anti-FLAG (M2) . Passados 2 dias de cultura adicionaram-se 10 μΐ de 1 2 3H-Timidina 100 pCi/mL (Amersham Pharmacia) . Passadas 18 horas, o produto da cultura foi recolhido num Printed Filtermat A (Wallac) utilizando um Ceifador Macro 96 (Skatron), foi seco e depois bem imerso em Betap;Scint (Wallac). Após o empacotamento mediu-se a actividade utilizando um contador de cintilações liquidas 1205 Betaplate. A Figura 6 apresenta os resultados. Na figura, os eixos longitudinais indicam a quantidade de 3H timidina incorporada por células e os eixos horizontais indicam a concentração do anticorpo ou CD40L na solução de cultura. Quando os anticorpos KM302-1 foram adicionados a células Ramos e células HS-Sulton, a quantidade de timidina incorporada foi inferior à dos anticorpos G28-5 convencionais e CD40L. Assim, foi mostrado que o anticorpo KM302-1 é um anticorpo agonista que consegue suprimir eficazmente a proliferação de células tumorais.

[Exemplo 9] Activação de células dendríticas por anticorpo agonista para o CD40 1

Materiais e métodos 2

Adquiriu-se IL-4 humana recombinante à Genzyme techne. Adquiriram-se esférulas MACS anti-CD14 humano à Miltenyi Biotech GmbH. Adquiriu-se Lymphoprep à Nycomed Pharma AS. O meio utilizado para a cultura foi RPMI1640 (Gibco BRL) 3 suplementado com FCS inactivado pelo calor 10% (Cell 54

Culture Technologies ), HEPES 10 mM (Sigma), 2- mercaptoetanol 55 μΜ (Gibco BRL) e sulfato de estreptomicina (Meij i Seika Kaisha, Ltd.) quando as DCs foram induzidas. As células num processo de coloração foram lavadas com PBS (Sigma) suplementado com FCS 2% (Cell Culture Technologies) e Azaid 0,02%. Quando as células foram congeladas utilizou-se Cell Banker (Nippon Zenyaku Kogyo). (2) Indução de DCs derivadas de monócitos

Prepararam-se células mononucleares (PBMC) do sangue periférico por centrifugação com gradiente de densidade utilizando Lymphoprep. As células foram sujeitas a selecção positiva utilizando esférulas MACS anti-CD14 humano, de modo a separar as células numa fracção positiva e fracção negativa para CD14. Adicionaram-se à fracção positiva GM-CSF humano recombinante (50 ng/mL) e IL-4 humana recombinante (100 ng/mL), seguido de cultura numa placa de 6 cavidades em meio RPMI1640 suplementado com FCS 10%. No início da cultura, as células foram cultivadas a uma concentração de 1 x 106/mL (3 mL por cavidade). Durante a cultura, o meio foi mudado uma vez em cada 2 dias. Efectuou-se a permuta do meio por amostragem de 10% da solução de cultura num tubo de centrifugação, centrifugando a solução, removendo o sobrenadante, suspendendo com uma nova solução de cultura (contendo citoquina e afins à concentração acima) num volume 2 vezes maior do que o da solução de cultura submetida a amostragem e depois repondo a suspensão em cada cavidade. No dia 6 da cultura, as células foram recolhidas, calculou-se o número de células e, em seguida, as células foram suspensas no meio acima a uma concentração de 1 x 106/mL. Adicionaram-se ao meio anticorpos anti-CD40 ou respectivos controlos do isotipo e 55 o sistema foi cultivado durante mais 4 dias numa placa de 24 cavidades. Durante este período não se efectuou permuta da cultura (número de células por cavidade de 1 x 101 2 células e concentração de células de 1 x 102/mL) . (3) Coloração de células e análise por citómetro de fluxo

Para a coloração utilizaram-se anticorpos anti-HLA-DR (controlo do isotipo: lgG2a de rato), anticorpos anti-CD86 (controlo do isotipo: IgGl de rato) e anticorpos anti-CD83 (controlo do isotipo: IgG2b de rato). Primeiramente adicionaram-se os anticorpos e depois efectuou-se a incubação a 4°C durante 30 minutos. Após 3 lavagens realizou-se a análise utilizando o FACS Calibur (Beckton Dickinson). (4) Aumento da capacidade de secreção de IL-12 por DCs Maduras

Depois de se terem obtido DCs imaturas como descrito acima adicionaram-se LPS (400 pg/mL) e IFN γ (10’3 M) e efectuou-se a cultura durante 2 dias, desse modo obtendo-se DCs maduras. Às DCs maduras adicionaram-se 10 μg/mL de anticorpos anti-CD40 ou controlo do isotipo. Para o sobrenadante passadas 24 horas mediu-se a produção de IL-12 utilizando ELISA (Pharmingen). 1

Resultados e Discussão 2 A Figura 7 mostra o efeito de anticorpos KM302-1, os anticorpos agonistas, na maturação de DCs, e a Figura 8 mostra o efeito de anticorpos KM302-1 na produção de IL-12 por DCs maduras. Comparou-se o grau de maturação com anticorpos G28-5 como controlo. Quando se examinou a expressão de CD86 e a de HLA-DR, a expressão estava suplementarmente aumentada, isto é, o grau de maturação 56 aumentou no caso de anticorpos KM302-1 em comparação com o caso de anticorpos G28-5. Também foi mostrado que a secreção de IL-12 aumentou com o tratamento de DCs maduras com anticorpos KM302-1. Em conformidade, foi mostrado que os anticorpos KM302-1 actuaram em DCs como anticorpos agonistas.

[Exemplo 10] DC-MLR

Sangue (sangue periférico) recolhido de um humano normal foi centrifugado a 2000 rpm durante 10 minutos e o soro foi absorvido. A fracção de células sanguíneas foi novamente suspensa com PBS e foi suavemente colocada em Ficoll (Amersham Pharmacia). A centrifugação foi realizada a 2000 rpm durante 30 minutos, de modo que uma porção de PBMCs presente na camada intermédia foi recolhida, lavada duas vezes com PBS e seguidamente utilizada para um certo processo de separação de células utilizando MACS.

Procedeu-se à separação de monócitos para cultura de DCs de acordo com as instruções adjuntas utilizando MACS (Miltenyi Biotec GmbH). Este procedimento é brevemente explicado do modo seguinte. Adicionaram-se a PBMCs (1 x 108) 800 μΐϋ de Tampão MACS e 200 μΤ de CD14 MACS (Miltenyi Biotec GmbH, 502-01), que depois foram tratadas a 4°C durante 15 minutos. As células foram adsorvidas numa coluna MACS LS e depois foram lavadas. As células adsorvidas na coluna foram recolhidas como monócitos. Às células que não ficaram adsorvidas na coluna adicionou-se MACS HLA-DR (Miltenyi Biotec GmbH, 461-01) . Removeram-se as células positivas para HLR-DR com uma coluna BS, desse modo preparando-se uma fracção de células T. Mediu-se por FACS a proporção de células positivas para CD3 e depois calculou-se o número substancial de células T a partir do número total de 57 células presentes na fracção de células T. Os monócitos obtidos foram cultivados em meio RO (meio PPMI suplementado com β-mercaptoetanol (Gibco) e HEPES (Sigma)) que continha 100 ng/mL de IL-4 (R&D System), 50 ng/mL de G-CSF (Kirin) e FCS 10% (Sigma) a uma concentração de 1 x 106 células/mL numa placa de cultura de 6 cavidades. No dia 5 após a cultura adicionaram-se 10 ng/mL de LPS (Difco), para as células se diferenciarem em DCs maduras.

Efectuou-se MLR misturando células T e DCs maduras, que tinham sido isoladas de diferentes humanos. A razão de células entre células T e DCs foi 1:80 e o número de células T foi 2 x 105 células/cavidade. Em primeiro lugar, adicionaram-se anticorpos às DCs para a reacção prosseguir durante 30 minutos. Subsequentemente adicionaram-se células T, realizou-se a cultura durante 4 dias e depois adicionaram-se 10 μΡ de 3H-Timidina 100 μCi/mL (Amersham Pharmacia). Catorze horas mais tarde, as células foram recolhidas em Printed Filtermat A (Wallac) utilizando um Ceifador Macro 96 (Skatron), foram secas e depois bem imersas em Betap;Scint (Wallac). Após o empacotamento mediu-se a actividade utilizando um contador de cintilações líquidas 1205 Betaplate. Efectuou-se MLR utilizando DCs imaturas por mistura de células T com DCs maduras, que tinham sido isoladas de diferentes humanos. De modo semelhante efectuou-se MLR com uma razão de células entre células T e DCs de 1:40. As Figuras 9 e 10 apresentam os resultados. Foi mostrado que a adição de anticorpos KM281-1-10 diminuiu a incorporação de timidina e, assim, foi possível suprimir MLR. Suplementarmente, foi mostrado na Fig. 10 que os anticorpos KM283-5 e 5D12 não conseguiram suprimir DC-MLR. Isto é, apenas o anticorpo KM281-1-10 é um anticorpo antagonista que neutraliza a acção de ligandos do 58 CD40 em DCs. Além disso, a Fig. 11 mostra os resultados do exame do efeito de anticorpos KM302-1, que são anticorpos agonistas, em MLR utilizando DCs imaturas. A activação de DCs promoveu a interacção com células T e provocou um aumento da incorporação de timidina. Estes resultados indicaram que ο KM302-1 é um anticorpo agonista que actua em DCs imaturas.

[Exemplo 11] Efeito do anticorpo para o CD40 na ligação do CD40L ao CD40

Provocou-se a ligação de anticorpos anti-CD40 a FC humano de CD40 imobilizado utilizando BlAcore 2000 (Biacore) e depois mediram-se alterações da quantidade de ligação do CD40L solúvel ao CD40. De acordo com as instruções anexas ao sistema, FC humano de CD40 solúvel foi imobilizado num "chip" CM (CM5, Biacore). Seguidamente adicionaram-se 25 μg/mL de anticorpos anti-CD40, para ligação ao CD40. Também se adicionaram 10 μg/mL de CD40L solúvel para a ligação. Mediu-se uma diferença entre as quantidades de ligação antes e após a adição do CD40L. Quando se adicionou IgG de controlo, a quantidade de ligação do CD40L foi 100 RU. Após a adição de anticorpos KM302-1, a quantidade de ligação do CD40L foi 110 RU, e após a adição de anticorpos KM283-5, a quantidade de ligação do CD40L foi 18 RU. Assim, foi mostrado que o anticorpo KM302-1 não inibe a ligação do CD40L ao CD40.

[Exemplo 12] Promoção da expressão de CD95 em células Ramos por anticorpo agonista anti-CD40

Analisaram-se anticorpos purificados dos hibridomas obtidos no Exemplo 4 de acordo com o método do Exemplo 6 e depois seleccionaram-se clones produtores de anticorpos agonistas (número de células por cavidade 5 x 104; concentração de 59 células 2,5 x 105/mL) . A Figura 12 apresenta os resultados. Na figura, o eixo horizontal indica a concentração do anticorpo em soluções de cultura, e o eixo longitudinal indica intensidades médias de fluorescência, isto é, intensidades de expressão de CD95. A uma concentração de 0,01 pg/rnL ou superior, verificou-se que os anticorpos KM341-1-19 e 2105 promovem a expressão de CD95 por células Ramos mais eficazmente do que anticorpos G28-5, que são anticorpos de ratinho conhecidos. Especificamente, verificou-se que os anticorpos KM341-1-19 e 2105 eram anticorpos agonistas mais eficazes. Além disso, a actividade agonista (para aumentar a expressão de CD95 por células Ramos) dos anticorpos KM341-1-19 e 2105 (0,01 μρ/πΛ) foi mais elevada do que a de anticorpos G28-5 (10 μg/mL) (Fig. 12). A Tabela 5 resume, para cada concentração de anticorpo, quantas vezes o nível de expressão de CD95 é superior ou inferior ao expresso pela adição de anticorpos G28-5.

Tabela 5

Concentração do anticorpo (μς/πΛ) KM341-1-19 2105 F5-77 F2-103 0,01 5,7 3,9 0,1 7,0 7,1 1,2 1,2 1 5,7 5,1 1,7 1,8 10 4,5 3,3 2,0 1,7 [Exemplo 13] Activação de células dendríticas por anticorpo agonista para o CD40

De acordo com o método do Exemplo 9 examinou-se o efeito de anticorpos agonistas para o CD40 na produção de IL-12 e produção de IL-10 por DCs maduras. Mediu-se a IL-10 pelo método de ELISA (Pharmingen). As Figuras 13 e 14 apresentam 60 os resultados. Mostrou-se que a secreção de IL-12 foi aumentada por tratamento com anticorpos KM341-1-19. Em contraste, mesmo quando se permitiu a coexistência de células L recombinantes que expressam ligandos do CD40 (2 x 105 células/mL) que tinham sido irradiadas com raios X (5000 rad), as concentrações de IL-12 e IL-10 em soluções de cultura foram 254 e 51 pg/mL, respectivamente. Foram inferiores ao caso em que se adicionou 1 pg/mL de anticorpos KM341-1-19.

Como descrito acima, foi mostrado que anticorpos KM341-1-19 actuam em DCs como anticorpos agonistas eficazes. A actividade agonista de anticorpos KM341-1-19 (0,1 μg/mL)

para provocar a secreção de IL-12 por DCs maduras foi mais elevada do que a de anticorpos G28-5 (100 pg/mL). A actividade agonista de anticorpos KM341-1-19 (1 μρ/ΐΐΛ) para provocar a secreção de IL-12 por DCs maduras foi 100 vezes mais elevada, ou superior, do que por anticorpos G28-5 (100 pg/mL) (Fig. 13) . Suplementarmente, a actividade agonista de anticorpos KM341-1-19 (1 μρ/ιηΐ) para provocar a secreção de IL-10 por DCs maduras foi 10 vezes mais elevada, ou superior, do que por anticorpos G28-5 (100 pg/mL) (Fig. 14). Além disso, uma vez que a subclasse do anticorpo KM341-1-19 era IgG2, o anticorpo tem menor capacidade de ligação ao receptor Fc do que IgGl ou IgG3. A sua capacidade para sensibilizar a actividade assassina de células NK e a capacidade para activar o sistema do complemento também são fracas. Em conformidade, pode haver um risco baixo da função de células que expressam o CD40 ou do número das próprias células diminuir devido ao anticorpo. Suplementarmente, o anticorpo não é facilmente submetido à formação de ligações cruzadas por um receptor 61

Fc, de modo que se pode esperar que o efeito do fármaco seja facilmente controlado sem qualquer flutuação grande da actividade agonista in vivo devido à formação de ligações cruzadas.

[Exemplo 14] Supressão da expressão de CD95 em células Ramos por anticorpo antagonista anti-CD40

Uma suspensão de células Ramos 1,0 x 106 células/mL foi inoculada, a 50 μL/cavidade, numa placa de fundo plano de 96 cavidades (número de células por cavidade 5 x 104). A uma placa de 96 cavidades adicionaram-se anticorpos purificados diluídos com meio, a 100 μΐ/ο3νίό306. Prepararam-se células L de ratinho recombinantes que expressam ligandos do CD40 humano (ver Spriggs, Μ. K., et al., J. Exp. Med. 176: 1543, 1992; Garrone, P., et al., J. Exp. Med. 182: 1265, 1995, e afins) a 1,0 x 105 células/mL. Adicionaram-se as células preparadas a 50 μ1/θ3νίά3άθ (número de células Ramos por cavidade 5 x 104; concentração de células Ramos 2,5 x 104 células/mL; número de células L de ratinho por cavidade 5 x 103; concentração de células de ratinho 2,5 x 104 células/mL). Após cultura durante a noite, as células foram recolhidas e seguidamente analisadas por FACS utilizando anticorpos anti-CD95 etiquetados com R-PE. A Figura 15 apresenta os resultados. Na figura, o eixo longitudinal indica a intensidade média da fluorescência, isto é, a intensidade da expressão de CD95. Enquanto os anticorpos 5D12 conhecidos suprimiram ligeiramente a expressão, os anticorpos 4D11 suprimiram, mesmo a uma concentração de 0,1 μρ/πΛ, a expressão de CD95 na mesma extensão do caso de um controlo negativo em que não tinham sido adicionadas células que expressam o CD40L. Além disso, a uma concentração de 1 4D11, F4-465 e 62 ΚΜ281-1-10 suprimiram a expressão de CD95 na mesma extensão do caso do controlo negativo em que não tinham sido adicionadas células que expressam o CD40L. estes resultados mostraram que os anticorpos 4D11, F4-465 e KM281-1-10 são anticorpos antagonistas mais eficazes. A Tabela 6 apresenta valores relativos da intensidade média da fluorescência correspondente a cada concentração de anticorpo quando o valor do caso de controlo em que não se adicionaram anticorpos antagonistas é 100.

Tabela 6

Concentração do 5D12 4D11 F4-465 KM281-1-10 anticorpo (μς/πιΣ,) 0,1 77, 6 11,8 49,6 60,1 1 72,3 0,01 2,5 7,3 10 69,5 0 1,1 2,6 [Exemplo 15] Efeito antitumoral no modelo de transplantação de células Ramos por anticorpo agonista anti-CD40

Injectaram-se intravenosamente anticorpos anti-asialo GM1 em ratinhos C.B.17/lcr-scidJcl com 5 semanas de idade (Clea Japan). Um dia mais tarde injectaram-se intravenosamente 5 x 106 células Ramos por ratinho como células tumorais. Um dia mais tarde injectaram-se intravenosamente anticorpos KM302-1 ou anticorpos IgG humana anti-albumina humana como controlo negativo. As doses por ratinho de anticorpos KM302-1 foram 1, 10 e 100 \\,q, e a dose dos anticorpos de controlo negativo foi 100 μρ. Cada um destes anticorpos foi administrado uma vez a 5 ratinhos. A Figura 16 apresenta os resultados. Cerca do dia 34 após a transplantação, todos os ratinhos do grupo administrado com controlo negativo tinham morrido, ao passo que todos os 5 ratinhos de cada um dos 63 grupos administrados com 10 pg e 100 pg de anticorpos KM302-1 sobreviveram. Assim, confirmou-se o efeito antitumoral de anticorpos KM302-1. O anticorpo KM302-1 pertence à subclasse IgG4, de modo que a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) mediada por receptores Fc e a activação do sistema do complemento são fracas. Apesar destas caracteristicas, observou-se que uma única administração de 10 pg de anticorpos KM302-1 prolongou o tempo de sobrevivência de ratinhos com tumores.

[Exemplo 16] Supressão da proliferação de células Ramos por anticorpo agonista anti-CD40

Preparou-se uma suspensão de células Ramos, a 1 x 104 células/mL, num meio RPMI1640 suplementado com FBS 10% e depois distribuiram-se 100 pL da suspensão numa placa de 96 cavidades. Adicionou-se um anticorpo KM341-1-19 ou solução de ligando solúvel preparada a 20 pg/mL utilizando meio. Permitiu-se a coexistência de anticorpos anti-FLAG (M2), com a mesma concentração dos ligandos, com os ligandos solúveis (a concentração na solução reaccional foi 10 pg/mL), desse modo intensificando a actividade. Após 5 dias de cultura adicionaram-se a cada cavidade 20 pL de reagente MTS (Promega) e deixou-se o sistema reagir durante 2 até 3 horas. Mediram-se diferenças na absorvância entre as cavidades sem células e sem anticorpos e as cavidades que continham células e anticorpos a um comprimento de onda de 490 nm, desse modo determinando-se a contagem de células viáveis. Suplementarmente, comparou-se a acção supressora da proliferação com a de anticorpos G28-5 utilizando de modo semelhante uma placa de fundo em u de 96 cavidades. Adicionaram-se anticorpos KM341-1-19 ou anticorpos G28-5 preparados a 2 pg/mL utilizando meio. A Figura 17 apresenta 64 os resultados. Em cavidades às quais se tinham adicionado anticorpos KM341-1-19 observaram-se células mortas, o número de células foi significativamente inferior ao de cavidades às quais se tinham adicionado anticorpos G28-5 ou os ligandos e a absorvância também foi baixa. Estes resultados indicam que a proliferação de células tumorais foi suprimida e que foi induzida morte celular.

[Exemplo 17] Clonagem de cDNA de gene de anticorpo

Cultivaram-se hibridomas produtores de anticorpos KM341-1-19, 2105, 110, 115, KM281-1-10, 4D11, KM643-4-11, F4-465, F2-103 e F5-77 e recolheram-se as células por centrifugação. Adicionou-se Trizol (Gibco BRL) às células e depois extraiu-se RNA Total de acordo com as instruções adjuntas. Procedeu-se à clonagem das regiões variáveis do cDNA do anticorpo de acordo com as instruções adjuntas, utilizando um Estojo de amplificação de cDNA Smart Race (Clontech) . Utilizando como modelo 5 pg de RNA total construiu-se o Ia Filamento de cDNA. Para amplificar as cadeias pesadas (cadeia H) de KM341-1-19, 2105, 110, 115, KM281-1-10, 4D11, KM643-4-11, F2-103 e F5-77 utilizou-se Z-Taq (Takara) e os "primers" UMP e hh6, e um ciclo de 98°C durante 1 segundo e 68°C durante 30 segundos foi repetido 30 vezes. Suplementarmente, utilizando como modelo 1 pL da solução reaccional e os "primers" NUMP e hh3, um ciclo de 98°C durante 1 segundo e 68°C durante 30 segundos foi repetido 20 vezes. Para amplificar uma cadeia pesada de F4-465 utilizaram-se os "primers" UMP e hh2 e um estojo de PCR Advantage 2 (Clonthech, # catálogo 1910) e realizaram-se 5 ciclos de 94°C durante 5 segundos e 72°C durante 3 minutos, 5 ciclos de 94°C durante 5 segundos, 70°C durante 0 segundos e 72°C durante 3 minutos, e 25 ciclos de 94°C 65 durante 5 segundos, 68°C durante 10 segundos e 72°C durante 3 minutos. primer" hh6: 5’-GGT CCG GOA GAT CAT GAG GGT GTC CTT-3’ (ID SEQ NO: 3) primer" hh3: 5'"GTG CAC GCC GCT GGT CAG GGC GCC TG-3' (ID SEQ NO: 4) primer" hh2: 5M3CT OGA GGG CAC GGT CAC CAC GCT 0-3' (ID SEQ NO: 5)

Subsequentemente, o produto de PCR amplificado foi purificado utilizando um estojo de purificação de PCR (Qiagen) e determinou-se a sequência de nucleótidos utilizando como "primer" hh4. Alternativamente, o produto foi subclonado em PCR-Script (Stratagene, Lajolla, CA) ou PCR-Blunt (Invitrogene, Carlsbad, CA) e depois efectuou-se a sequenciação. Com base nas informações da sequência sintetizaram-se "primers" específicos para a cadeia pesada do anticorpo. Sintetizou-se um "primer" 341H no caso de KM341-1-19, um "primer" 2105Hsal no caso de 2105, um "primer" llOHsal no caso de 110 e 115, um "primer" 281Hsal no caso de KM281-1-10, um "primer" 4DllSal no caso de 4D11, um "primer" 643Hsal no caso de KM643-4-11, "primer" Hll-9 5' no caso de F4-465, um "primer" F2-103H no caso de F2-103 e "primer" F5-77H no caso de F5-77. Utilizando os "primers" específicos para a cadeia pesada dos anticorpos e hh4 amplificou-se cDNA do Ia Filamento de cDNA e depois determinou-se a sequência na direcção oposta utilizando como modelo o produto amplificado e os "primers" específicos para os anticorpos. "primer" hh4: 5*-GGTGCCAOGCOGAAGACCCATGG-3' (ID SEq N0: 6) "primer" 341H: SUatatgtcgacGCTGAATTCTGÕCTGACCAGGGCAG-T* (jd gEQ NO: 7) 2105Hsal: atafg*cgacTCCCAGGTGTTTCCATTCAGTGATCAG (ID SEQ N0. 8) ^^QHsal* âíeigtcgacTTCCATrCGGTGATCAGCACTGAACAC (JD SEQ N0‘ 9) 66 28lHsal: atalgtegacTTTG AG AGTCCTG G AGCTCCTGTG (ID SEQ N0: i0) 4DllSal · 'r4cil gtcgacGAGTC ATCG ATCTC AT GTGO A A G (jj) SEQ NO- 11) 643Hsal· atat8tcgacCCAGGGCAGTCACCAGAGCTCCAGA€ ^ID SEq Nq. ^2)

Hl 1 - 9 5 ' · "ACC GTG TC0 ACT ACG CGC GAG TGA CT (ID SEQ NO · 13) F2-103 H: *ecWcl*c*c,l‘,<*M*C,íe*C* (ID SEQ NO: 14) F5_77 H. accgigtegacggígatcaggactgaacag (ID SEQ HQ; 15|

Amplificaram-se as cadeias leves (cadeias L) de KM341-1-19, 2105, 110, 115, KM281-1-10, 4D11, KM643-4-11, F2-103 e F5-77 utilizando os "primers" UMP e hk2 e repetindo 30 vezes um ciclo de 98°C durante 1 segundo e 68°C durante 30 segundos. Amplificou-se a cadeia leve de F4-465 utilizando os "primers" UMP e hL2 e repetindo 30 vezes um ciclo de 98°C durante 1 segundo e 68°C durante 30 segundos. O produto de PCR amplificado foi purificado utilizando um estojo de purificação de PCR e depois determinou-se a sequência de nucleótidos utilizando o "primer" hk6 ou hL2. Com base nas sequências sintetizaram-se "primers" específicos para as cadeias leves. Sintetizou-se um "primer" 341K no caso de KM341-1-19, "primer" 2053KBgl no caso de 2105, "primer" llOKBgl no caso de 110 e 115, "primer" 28lKBgl no caso de KM281-1-10, 4DllKBgl no caso de 4D11, "primer" 643KBgl no caso de KM643-4-11, "primer" Lambda 5' no caso de F4-465 e "primer" F2-103K no caso de F-103 e F5-77.

No caso de 341-1-19, 110, 115, KM643-4-11, KM281-1-10, 4D11 e 2105, amplificou-se cDNA do Io Filamento de cDNA utilizando o "primer" específico para a cadeia leve e o "primer" hk6. Determinou-se a sequência em ambas as direcções utilizando como modelo o produto amplificado. 67

Para F4-465, F2-103 e F5-77, procedeu-se à subclonagem em PCR-Script (Stratagene, Lajolla, CA) ou PCR-Blunt (Invitrogene, Carlsbad, CA) para determinar a sequência. "primer" hk2 : 5*OTTCAA GCTCTTTGTGAC GGG CGAGC-3' (ip SEQ NO: 16) "primer" hL2 : TC7TCTCCÁCGG TGCTCC CTTCAT-3' (ID SEq N0: 17) "primer" 341K· 5*-ataiagatctGAACTGCTCAGTTAGGACCCAGAGG-3' (jp SEQ NO' 18) 2053KBgl: ««»g»tctCGCGGGGAAGGAGACTGCTCAGTT (ID SEQ N0: 19) llOKBgl· atátagalctAGTCAGACCCAGTCAGGACACAGC (id SEQ NO* 20) 281KBgl· statagatctõAGCTGCTCAGTTAGGACCCAGAGGG (ID SEQ NQ. 2\) 4DllKBgl: âtâtâgâtctTAAGCAAGTGTAACAACTCAGAGTAC (jp gEQ NO: 22) 643KBgl· ã*at3fíatctGAGGAACTGCTCAGTTAGGACCCAGAGG SEq ^q. 23) , . . ,, «AACTCCAGATCTGCCTCAGGAAGCAOCATC c_. ...

Lambda 5': (ID SEQ NO: 24) F2-103 K: ‘*“«8*«»ÍM«»gc»8>Eg«.c (ID JEQ NQ. 25) "primer” hk6: S'-TCGOOOOAAOATOAAO*CAOATOGTO-3' (ID SEQ N0. 26)

Apresentam-se abaixo, respectivamente, DNAs de 341-1-19 que codificam as regiões variáveis da cadeia H e cadeia L completas e as sequências de aminoácidos da cadeia H e cadeia L. O ponto de iniciação da tradução do DNA da cadeia H é um codão ATG que começa na 50a adenina (A) a partir da extremidade 5' da ID SEQ NO: 27 e o codão de terminação é TGA que começa na 1472a timina (T) . A fronteira entre a região variável do anticorpo e a região constante está localizada entre a 493a adenina (A) e a 494a guanina (G) a partir da extremidade 5'. Na sequência de aminoácidos, a região variável da cadeia H vai desde o terminal N até ao 148° resíduo serina (S) da ID SEQ NO: 28 e a região constante começa na 149a alanina (A) e resíduos seguintes.

Foi previsto, com um "software" de previsão de sequências genéticas (Signal P versão 2) que a sequência de sinal da cadeia H vai desde o terminal N até à 20a serina (S) da ID SEQ NO: 28. Pensa-se que o terminal N da proteina madura seja a 21a glutamina (Q) da ID SEQ NO: 28. O ponto de iniciação da tradução do DNA da cadeia L é um codão ATG que começa na 29a A a partir da extremidade 5' da ID SEQ NO: 29, e a região variável vai desde a extremidade 5' até à 400a adenina (A). Na sequência de aminoácidos, a região variável vai desde o terminal N até à 124a lisina (K) da ID SEQ NO: 30. A análise do terminal N da proteina da cadeia L purificada revelou que a sequência de sinal da cadeia L vai desde o terminal N até à 20a glicina (G) da ID SEQ NO: 30, e o terminal N da proteina madura é o 21° ácido glutâmico (E) da ID SEQ NO: 30.

Cadeia H de 341-1-19 (ID SEQ NO: 27) : 69

CTOOGOCCAAOGGACCACGGTCACCOTCTCTTCAGCCTCCACCAAGGGCC

CATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAG

CGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTG

TCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGT

CCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTC

CAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCA

GCAACACCAAGGTCGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGC

CCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCC

CCAAAACCCAAGGACACCCTCATOATCTCCCOGACCCCTGAGGTCACGTG

ÇGTGGTGÔTGGACGTÔAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGT

ACaTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGA

GCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCA

GGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGC

CTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCG

AGAACCACAÔGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGA

ACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCG ccgtggagtgggagagcaatgggoagccggagaacaactacaagaccac

ACCTCCCATGCTGGACTCAGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCAC

CGTGGACAAGAGCAGGTOGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGA

TGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTC

C G GGTA A AT G AG G ATCC

Sequência de aminoácidos da cadeia H de 341-1-19 (ID SEQ NO: 28)

MSVSFLIFLPVLGLFWGVLSQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSA

TWNWIRQSPSRDLEWLGRTYYRSKWYRDYVGSVKSRII1NPDTSNNQPSLQL

NSVTPEDTAiYYCTRAQWLGGDYPYYYSMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVF

PLAPCSRSTSESTAAtGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY

SLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAG

PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKT 70 Κ

Cadeia L de 341-1-19 (ID SEQ NO: 29) :

ACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTC

CTGGCATCCCàGCCAGGTTCáGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACT

CTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTOTCAGC

Sequência de aminoácidos da cadeia L de 341-1-19 (ID SEQ NO: 30)

MEAPAQLLFLtLtWLFDTTGEIVLTQSPATlSLSPGERATLSCRASQSVSSYLA

WYQQOGQAPRLL1YDASNRÀTGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC

QQRSNTFGPGTKVDIICRT

Apresentam-se abaixo DNAs de 2105 que codificam a região variável da cadeia H e região variável da cadeia L e as sequências de aminoácidos da cadeia H e cadeia L. O ponto de iniciação da tradução do DNA da cadeia H é um codão ATG que começa na 70a adenina (A) a partir da extremidade 5' da ID SEQ NO: 31. A fronteira entre a região variável do anticorpo e a região constante está localizada entre a 495a adenina (A) e a 496a guanina (G) a partir da extremidade 5'. Na sequência de aminoácidos, a região variável da cadeia H vai desde o terminal N até ao 142° resíduo serina (S) da ID SEQ NO: 32, e a região constante começa na 149a alanina (A) e resíduos seguintes. Foi previsto, com um "software" de previsão de sequências genéticas (Signal P versão 2), que a sequência de sinal da cadeia H vai desde o terminal N até à 19a cisteína (C) da ID SEQ NO: 32. Pensa-se que o terminal N da proteína madura seja o 20° ácido glutâmico (E) da ID SEQ NO: 32. O ponto de iniciação da tradução do DNA da cadeia L é um codão ATG que começa na 28a A a partir da extremidade 5' da ID SEQ NO: 33, e a região variável vai desde a extremidade 5' até à 405a adenina (A). Na sequência de aminoácidos, a região variável vai desde o terminal N até à 126a lisina (K) da ID SEQ NO: 34. Foi previsto, com um "software" de previsão de sequências genéticas (Signal P versão 2), que a sequência de sinal da cadeia L vai desde o terminal N até à 20a glicina (G) da ID SEQ NO: 34. Pensa-se que o terminal N da proteína madura seja o 21° ácido glutâmico (E) da ID SEQ NO: 34.

Cadeia H de 2105 (ID SEQ NO: 31)

CTGAACACAGACCCGTCGACTCCCAGGTGTTTCCATTCAGTGATCAOCACT

OAACACAGAGOACTCACCATGGAGTTGGGACTGAGCTGGATTTTCCTTTTG

GCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGG aggcttggtacagcctggcaggtccctgagactctcctgtgcagcctctgg attactgtgcaagagataggctatttcggggagttaggtactacggtatgga

CGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCrCCTCAGCTAGCACCAAGG 72

Sequência de aminoácidos da cadeia H de 2105 (ID SEQ NO: 32)

Cadeia L de 2105 (ID SEQ NO: 33)

AACCTGGCCàGGCTCCCàGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCA

AGCGTAGCCACTGGCTCACTTTCGGCGGGGGGACGAAGGTGGAGArCAAA

CGTACGGTG

Sequência de aminoácidos da cadeia L de 2105 (ID SEQ NO: 34)

WYQQKPGQAFRLLiyDASNRATGlPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAYYYC

QQRSHWLTFGGGTKVEIKRTV

Apresentam-se abaixo, respectivamente, DNAs de 110 que codificam a região variável da cadeia H e região variável da cadeia L e as sequências de aminoácidos da cadeia H e cadeia L. 73 0 ponto de iniciação da tradução do DNA da cadeia H é um codão ATG que começa na 60a adenina (A) a partir da extremidade 5' da ID SEQ NO: 35. A fronteira entre a região variável do anticorpo e a região constante está localizada entre a 479a adenina (A) e a 480a guanina (G) a partir da extremidade 5'. Na sequência de aminoácidos, a região variável da cadeia H vai desde o terminal N da ID SEQ NO: 36 até ao 140° resíduo serina (S), e a região constante começa na 141a alanina (A) e resíduos seguintes. Foi previsto, com um "software" de previsão de sequências genéticas (Signal P versão 2), que a sequência de sinal da cadeia H vai desde o terminal N até à 19a cisteína (C) da ID SEQ NO: 36. Pensa-se que o terminal N da proteína madura seja a 20a glutamina (Q) da ID SEQ NO: 36. O ponto de iniciação da tradução do DNA da cadeia L é um codão ATG que começa na 35a A a partir da extremidade 5' da ID SEQ NO: 37, e a região variável vai desde a extremidade 5' até à 421a adenina (A). Na sequência de aminoácidos, a região variável vai desde o terminal N até à 129a lisina (K) da ID SEQ NO: 38. Foi previsto, com um "software" de previsão de sequências genéticas (Signal P versão 2), que a sequência de sinal da cadeia L vai desde o terminal N até à 22a cisteína (C) da ID SEQ NO: 38. Pensa-se que o terminal N da proteína madura seja a 23a valina (V) da ID SEQ NO: 38.

Cadeia H de 110 (ID SEQ NO: 35) 74

Sequência de aminoácidos da cadeia H de 110 (ID SEQ NO: 36)

Cadeia L de 110 (ID SEQ NO: 37)

OGT GGÁAATCAAACGTÀCG

Sequência de aminoácidos da cadeia L de 110 (ID SEQ NO: 38) 75

YYCQQYYSFPWTFGQGTKVEÍKRT

Apresentam-se abaixo, respectivamente, DNAs de 115 que codificam a região variável da cadeia H e região variável da cadeia L e as sequências de aminoácidos da cadeia H e cadeia L. 0 ponto de iniciação da tradução do DNA da cadeia H é um codão ATG que começa na 60a adenina (A) a partir da extremidade 5' da ID SEQ NO: 39. A fronteira entre a região variável do anticorpo e a região constante está localizada entre a 479a adenina (A) e a 480a guanina (G) a partir da extremidade 5'. Na sequência de aminoácidos, a região variável da cadeia H vai desde o terminal N da ID SEQ NO: 40 até ao 140° resíduo serina (S) , e a região constante começa na 141a alanina (A) e resíduos seguintes. Foi previsto, com um "software" de previsão de sequências genéticas (Signal P versão 2), que a sequência de sinal da cadeia H vai desde o terminal N até à 19a cisteína (C) da ID SEQ NO: 40. Pensa-se que o terminal N da proteína madura seja a 20a glutamina (Q) da ID SEQ NO: 40. O ponto de iniciação da tradução do DNA da cadeia L é um codão ATG que começa na 35a A a partir da extremidade 5' da ID SEQ NO: 41, e a região variável vai desde a extremidade 5' até à 421a adenina (A). Na sequência de aminoácidos, a região variável vai desde o terminal N até à 129a lisina (K) da ID SEQ NO: 42. Foi previsto, com um "software" de previsão de sequências genéticas (Signal P versão 2), que a sequência de sinal da cadeia L vai desde o terminal N até à 22a cisteína (C) da ID SEQ NO: 42. Pensa-se que o terminal 76 N da proteína madura seja a 23a valina (V) da ID SEQ NO: 42.

Cadeia H de 115 (ID SEQ NO: 39)

CGTGAAGCK3CCGATTCACCATCTCCAGAGACAÁTFCCAAGAACACGCTGTA

Sequência de aminoácidos da cadeia H de 115 (ID SEQ NO: 40)

MEFGLSWVFLVAÍLRGVQCQVQLVES0GGVVGPGESLRLSCAASGFTFSSYG

Cadeia L de 115 (ID SEQ NO: 41)

T C AC AG ATCTAOTC AG A C C C A GTC A G G A C A C A GC AT 0 GA C ATG A G G G TCC

77

GGTGGAAATCAAACGTACG

Sequência de aminoácidos da cadeia L de 115 (ID SEQ NO: 42)

YYCQQYVSFPWTFGQGTKVE1KRT

Apresentam-se abaixo, respectivamente, DNAs de 281-1-10 que codificam a região variável da cadeia H e região variável da cadeia L e as sequências de aminoácidos da cadeia H e cadeia L. O ponto de iniciação da tradução do DNA da cadeia H é um codão ATG que começa na 52a adenina (A) a partir da extremidade 5' da ID SEQ NO: 43. A fronteira entre a região variável do anticorpo e a região constante está localizada entre a 468a adenina (A) e a 469a guanina (G) a partir da extremidade 5'. Na sequência de aminoácidos, a região variável da cadeia H vai desde o terminal N da ID SEQ NO: 44 até ao 139° resíduo serina (S) , e a região constante começa na 140a alanina (A) e resíduos seguintes. Foi previsto, com um "software" de previsão de sequências genéticas (Signal P versão 2) , que a sequência de sinal da cadeia H vai desde o terminal N até à 19a serina (S) da ID SEQ NO: 44. Pensa-se que o terminal N da proteína madura seja a 20a glutamina (Q) da ID SEQ NO: 44. 78 0 ponto de iniciação da tradução do DNA da cadeia L é um codão ATG que começa na 41a A a partir da extremidade 5' da ID SEQ NO: 45, e a região variável vai desde a extremidade 5' até à 424a adenina (A). Na sequência de aminoácidos, a região variável vai desde o terminal N até à 128a lisina (K) da ID SEQ NO: 46. Foi previsto, com um "software" de previsão de sequências genéticas (Signal P versão 2), que a sequência de sinal da cadeia L vai desde o terminal N até à 20a glicina (G) da ID SEQ NO: 46. Pensa-se que o terminal N da proteína madura seja o 21° ácido glutâmico (E) da ID SEQ NO: 46.

Cadeia H de 281-1-10 (ID SEQ NO: 43)

CCTGTCCCAOGTóCAGCTOCAGGAGTCGGGCCCAOOACTGGTGAAGCCTT

Sequência de aminoácidos da cadeia H de 281-1-10 (ID SEQ NO: 44) 79

Cadeia L de 281-1-10 (ID SEQ NO: 45)

Sequência de aminoácidos da cadeia L de 281-1-10 (ID SEQ NO: 46)

MBTFAQLLFLLLLWLPDTTGElVLTQSPGrLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYL

AWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYY

CQQYGSSPITFGQGTRLEIKRT

Apresentam-se abaixo, respectivamente, DNAs de 4D11 que codificam a região variável da cadeia H e região variável da cadeia L e as sequências de aminoácidos da cadeia H e cadeia L. O ponto de iniciação da tradução do DNA da cadeia H é um codão ATG que começa na 16a adenina (A) a partir da extremidade 5' da ID SEQ NO: 47. A fronteira entre a região variável do anticorpo e a região constante está localizada entre a 456a adenina (A) e a 457a guanina (G) a partir da extremidade 5'. Na sequência de aminoácidos, a região variável da cadeia H vai desde o terminal N da ID SEQ NO: 80 48 até ao 147° resíduo serina (S) , e a região constante começa na 148a alanina (A) e resíduos seguintes. Foi previsto, com um "software" de previsão de sequências genéticas (Signal P versão 2), que a sequência de sinal da cadeia H vai desde o terminal N até à 26a serina (S) da ID SEQ NO: 48. Pensa-se que o terminal N da proteína madura seja a 27a glutamina (Q) da ID SEQ NO: 48. O ponto de iniciação da tradução do DNA da cadeia L é um codão ATG que começa na 59a A a partir da extremidade 5' da ID SEQ NO: 49, e a região variável vai desde a extremidade 5' até à 442a adenina (A). Na sequência de aminoácidos, a região variável vai desde o terminal N até à 128a lisina (K) da ID SEQ NO: 50. Foi previsto, com um "software" de previsão de sequências genéticas (Signal P versão 2), que a sequência de sinal da cadeia L vai desde o terminal N até à 22a cisteína (C) da ID SEQ NO: 50. Pensa-se que o terminal N da proteína madura seja a 23a alanina (A) da ID SEQ NO: 50.

Cadeia H de 4D11 (ID SEQ NO: 47)

AXAT GTC G A C G A 0 T CàT G O AT C T C ΑΤΟ IG CA A G A A A ATG A A G CA CC TO TG G ttcttcctcctgctggtggcggctcccagatgggtcctgtcccagctgcag

CTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTACTGA.AGCCTTCGGAGACCCTGTCCCT

ccgccgcagacacggctgtgtattactgtacgagacctgtagtacgatattt

TGGGTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGCTCACCGTCTCCTCAG

CTAGC 81

Sequência de aminoácidos da cadeia H de 4D11 (ID SEQ NO: 48)

MDLMCKKMKHLWFFLLLVAAPRWVtSQLQLQESOPOLLKPSETLSLTCTVSG

GSíSSPGYYGGWIRQPPGKGLEWIGSIYKSGSTYHNPS.LKSRVTISVDTSKNQF slklssvtaaptavyyctrpvvryfgwfdpwgqgtlvtvssas

Cadeia L de 4D11 (ID SEQ NO: 49)

AGGGCATTãGCAGTGCTTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGCAAAGCT cctaaoctcctgatctatgatgcctccaatttggaaagtggggtcccatcaa ggttcagcgccagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcc tgcagcctgaagattttgcaacttattactgtcaacagtttaatagttaccc gacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaacgtacg

Sequência de aminoácidos da cadeia L de 4D11 (ID SEQ NO: 50)

YY CQQFNS YPTFGQGTK VE1KRT

Apresentam-se abaixo, respectivamente, DNAs de KM643-4-11 que codificam a região variável da cadeia H e região variável da cadeia L e as sequências de aminoácidos da cadeia H e cadeia L. 82 0 ponto de iniciação da tradução do DNA da cadeia H é um codão ATG que começa na Ia adenina (A) a partir da extremidade 5' da ID SEQ NO: 51. A fronteira entre a região variável do anticorpo e a região constante está localizada entre a 447a adenina (A) e a 448a guanina (G) a partir da extremidade 5'. Na sequência de aminoácidos, a região variável da cadeia H vai desde o terminal N da ID SEQ NO: 52 até ao 149° resíduo serina (S), e a região constante começa na 150a alanina (A) e resíduos seguintes. Foi previsto, com um "software" de previsão de sequências genéticas (Signal P versão 2) , que a sequência de sinal da cadeia H vai desde o terminal N até à 20a serina (S) da ID SEQ NO: 52. Pensa-se que o terminal N da proteína madura seja a 21a glutamina (Q) da ID SEQ NO: 52. O ponto de iniciação da tradução do DNA da cadeia L é um codão ATG que começa na 38a A a partir da extremidade 5' da ID SEQ NO: 53, e a região variável vai desde a extremidade 5' até à 409a adenina (A). Na sequência de aminoácidos, a região variável vai desde o terminal N até à 124a lisina (K) da ID SEQ NO: 54. Foi previsto, com um "software" de previsão de sequências genéticas (Signal P versão 2), que a sequência de sinal da cadeia L vai desde o terminal N até à 20a glicina (G) da ID SEQ NO: 54. Pensa-se que o terminal N da proteína madura seja o 21° Ácido glutâmico (E) da ID SEQ NO: 54.

Cadeia H de KM643-4-11 (ID SEQ NO: 51) 83 atgtctotctccttcctcatcttcctqcccotqctgggcctcccatgggotg

TCCTGTCACAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCC

TCGCAGACCCTCTCATTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGC aacagtgctgcttggaactggatcacgcagtccccatcgagagcccttga

GTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTATAAAGATTATGCAGT

ATCTGTGAAAAGTCGAATAACCATCAACCCAGACACATCCAAÔAACCAGTT

CTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACCCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTG

TGCAAGAGGGTATTACTATGGTTCGGGGAGCTATCCCTACTACTACCAAATG

GACGTCTGGGGCCAAGOGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGC

Sequência de aminoácidos da cadeia H de KM643-4-11 (ID SEQ NO: 52)

MSVSFUFLPVLGLFWOVLSQVQLQGSGPGLVKPSQTLSFTCAISGDSVSSNSA

AWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYKDYAVSVKSRmNPDTSKNQFSLQL

NSVTPEDTAVYYCARGYYYGSGSYPYYYQMDVWGQGTTVTVSSAS

Cadeia L de KM643-4-11 (ID SEQ NO: 53) aattgaggaactgctcagttaggacccagagogaaccatggaagccccag ctcagcttctcttcctcctoctactctggctcccagataccaccggagaaat tgtgttgacacagtctccacccaccctgtctttgtctccaggggaaagtgc caccctctcctgcagggccagtcagagtgtogcagctacttagcctggta ccaacagaaacctggccaggctccxaggctcctcatctatgatgcatccaa cagggccactggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacag

ACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTA ctgtcaccagcgtagcaacactttcggcggagggaccaaggtggagatca aacgaac

Sequência de aminoácidos da cadeia L de KM643-4-11 (ID SEQ NO: 54) 84

QQRSNTFGGGTKVEIKR

Apresentam-se abaixo, respectivamente, DNAs de F4-465 que codificam a região variável da cadeia H e região variável da cadeia L e as sequências de aminoácidos da cadeia H e cadeia L. 0 ponto de iniciação da tradução do DNA da cadeia H é um codão ATG que começa na 47a adenina (A) a partir da extremidade 5' da ID SEQ NO: 55. A fronteira entre a região variável do anticorpo e a região constante está localizada entre a 484a adenina (A) e a 445a guanina (G) a partir da extremidade 5'. Na sequência de aminoácidos, a região variável da cadeia H vai desde o terminal N da ID SEQ NO: 56 até ao 146° resíduo serina (S) , e a região constante começa na 147a alanina (A) e resíduos seguintes. Foi previsto, com um "software" de previsão de sequências genéticas (Signal P versão 2), que a sequência de sinal da cadeia H vai desde o terminal N até à 19a serina (S) da ID SEQ NO: 56. Pensa-se que o terminal N da proteína madura seja a 20a glutamina (Q) da ID SEQ NO: 56. O ponto de iniciação da tradução do DNA da cadeia L é um codão ATG que começa na 81a A a partir da extremidade 5' da ID SEQ NO: 57, e a região variável vai desde a extremidade 5' até à 440a (C) . Na sequência de aminoácidos, a região variável vai desde o terminal N até à 120a Treonina (T) da ID SEQ NO: 58. Foi previsto, com um "software" de previsão de sequências genéticas (Signal P versão 2), que a sequência de sinal da cadeia L vai desde o terminal N até à 85 19a alanina (G) da ID SEQ NO: 58. Pensa-se que o terminal N da proteína madura seja a 20a serina (S) da ID SEQ NO: 58.

Cadeia H de F4-465 (ID SEQ NO: 55) ctcaacacagacccgtcgactacgcgggagaccacagctccacaccatgc

ACTGGACCTGGAGGATCCTATTCTTGGTGGCAGCAGCAACAGGTGCCCACT cccaggtgcagctggtgcàatctgggtctgagttgaagaagcctggggcc

TCAGTGAAGGTCCCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTAGCTATGCTA

TGAATTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGG atcaacaccaacactgggaacccaacgtatgcccagggcttcacaggacg

GTTTGTCTTCTCCTTGCACACCTCTGTCAGCACGGCATATCTGCAGATCAGC

AGCCTAAAGGCTOAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAGGTAGTA

CCAGTXGCTATGAOGGTAACTCACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGC

CAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAA

Sequência de aminoácidos da cadeia H de F4-465 (ID SEQ NO: 56)

MDWTWR1LFLVAAATGAHSQVQLVQSGSEIKKPGASVKVPCKASGYTFTSYA

MNWVRQAPGQGLEWMGWINTNTGNPTYAQGFTGRFVPSLDTSVSTAYLQIS

SLKAEDTAVYYCAREVVPVAMlVTHYyYGMDVWGQGTTVTVSSAST

Cadeia L de F4-465 (ID SEQ NO: 57) 86

CAGGAAGCAGCATCÔGAGGTGCCTCAGCCATGGCATGGATCCCTCTCTTCC

ATCCCTGCGCGATTCtCTôGCTCCAAOTCTGGGAACACAGCCACTCTGACC

TGGATTCGTGACCAACATA

Sequência de aminoácidos da cadeia L de F4-465 (ID SEQ NO: 58)

MAWIPLFLGVLVYCTGSVASYELTQPPSVSVAPGQTASSTCSGDKLGBNFTCW

QVTHEGSTVEKTVAPTECS

Apresentam-se abaixo, respectivamente, DNAs de F2-103 que codificam a região variável da cadeia H e região variável da cadeia L e as sequências de aminoácidos da cadeia H e cadeia L. 87 0 ponto de iniciação da tradução do DNA da cadeia H é um codão ATG que começa na 32a adenina (A) a partir da extremidade 5' da ID SEQ NO: 59. A fronteira entre a região variável do anticorpo e a região constante está localizada entre a 463a adenina (A) e a 464a Guanina (G) a partir da extremidade 5'. Na sequência de aminoácidos, a região variável da cadeia H vai desde o terminal N da ID SEQ NO: 60 até ao 144° residuo Serina (S) , e a região constante começa na 145a Alanina (A) e resíduos seguintes. Foi previsto, com um "software" de previsão de sequências genéticas (Signal P versão 2), que a sequência de sinal da cadeia H vai desde o terminal N até à 19a Cisteína (C) da ID SEQ NO: 60. Pensa-se que o terminal N da proteína madura seja o 20° Ácido glutâmico (E) da ID SEQ NO: 60. O ponto de iniciação da tradução do DNA da cadeia L é um codão ATG que começa na 29a A a partir da extremidade 5' da ID SEQ NO: 61, e a região variável vai desde a extremidade 5' até à 415a adenina (A). Na sequência de aminoácidos, a região variável vai desde o terminal N até à 129a Lisina (K) da ID SEQ NO: 62. Foi previsto, com um "software" de previsão de sequências genéticas (Signal P versão 2), que a sequência de sinal da cadeia L vai desde o terminal N até à 22a Cisteína (C) da ID SEQ NO: 62. Pensa-se que o terminal N da proteína madura seja a 23a Asp (D) da ID SEQ NO: 62.

Cadeia H de F2-103 (ID SEQ NO: 59)

GGOTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAOGTGCAGCTGO

AGTAGCACAACCTACGCGGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGA

GACAACGCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCCOA

GGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAGATAGAGTACTATGGATCGGGGA

GTTATCCTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGT

CTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTC

CAAGAGCACCTCT

Sequência de aminoácidos da cadeia H de F2-103 (ID SEQ NO: 60) ϋΐϊΎ'Λί XI íl f {> ϊ Υίχ ϊ V t/ í"* I ,f Λ ί'ιΓ'ΐ í Λ v \ϊ¥?ΛΛΛ1ιΤ"'ϊ' ή f j*v* /ή í i ΙΓ< f

APSSKSTS

Cadeia L de F2-103 (ID SEQ NO: 61)

CA

Sequência de aminoácidos da cadeia L de F2-103 (ID SEQ NO: 62)

MDMRVFAQLLGLLLLWiPôAKCDlQMTQSPSTLSASVGDRVTÍTCRASQSÍSN

WLAWYQQKPGKAPKLIXyKASGLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTINSLQFDDFA

KVYACEVTííQGL

Apresentam-se abaixo, respectivamente, DNAs de F5-77 que codificam a região variável da cadeia H e região variável da cadeia L e as sequências de aminoácidos da cadeia H e cadeia L. O ponto de iniciação da tradução do DNA da cadeia H é um codão ATG que começa na 100a adenina (A) a partir da extremidade 5' da ID SEQ NO: 63. A fronteira entre a região variável do anticorpo e a região constante está localizada entre a 528a adenina (A) e a 529a Guanina (G) a partir da extremidade 5'. Na sequência de aminoácidos, a região variável da cadeia H vai desde o terminal N da ID SEQ NO: 64 até ao 143° resíduo Serina (S) , e a região constante começa na 144a Alanina (A) e resíduos seguintes. Foi 90 previsto, com um "software" de previsão de sequências genéticas (Signal P versão 2) , que a sequência de sinal da cadeia H vai desde o terminal N até à 19a Cisteina (C) da ID SEQ NO: 64. Pensa-se que o terminal N da proteína madura seja o 20° Ácido glutâmico (E) da ID SEQ NO: 64. O ponto de iniciação da tradução do DNA da cadeia L é um codão ATG que começa na 59a A a partir da extremidade 5' da ID SEQ NO: 65, e a região variável vai desde a extremidade 5' até à 445a adenina (A). Na sequência de aminoácidos, a região variável vai desde o terminal N até à 129a Lisina (K) da ID SEQ NO: 66. Foi previsto, com um "software" de previsão de sequências genéticas (Signal P versão 2), que a sequência de sinal da cadeia L vai desde o terminal N até à 22a Cisteina (C) da ID SEQ NO: 66. Pensa-se que o terminal N da proteína madura seja a 23a Asp (D) da ID SEQ NO: 66.

Cadeia H de F5-77 (ID SEQ NO: 63)

91

Sequência de aminoácidos da cadeia H de F5-77 (ID SEQ NO: 64)

SSKSTSGGTAALGCLVKDYFP

Cadeia L de F5-77 (ID SEQ NO: 65)

TTCC

AGTCACCCATCAGGGCCTGA

Sequência de aminoácidos da cadeia L de F5-77 (ID SEQ NO: 66) 92 yprea&vqwkvdnalqsgmsqesvteqdskdstyslsstltlskady.ekhk

VYACEVTHQGL

[Exemplo 18] Expressão da proteína do anticorpo em célula de animal 0 fragmento de DNA obtido acima contendo a região variável do anticorpo foi incorporado num vector apropriado, como N5KG1 (Idec Pharmaceuticals, patente U.S. 6001358), desse modo preparando-se um vector de expressão do anticorpo. Como célula-hospedeiro para a expressão utiliza-se apropriadamente, por exemplo, CHO-Ras (Katakura Y., et al., Cytotechnology 31_: 103-109, 1999) . O vector pode ser introduzido na célula-hospedeiro, por exemplo, por electroporação. Aproximadamente 2 pg do vector de expressão do anticorpo foram linearizados com uma enzima de restrição. O gene foi introduzido em 4 x 107 células CHO-Ras, em condições de 350 V e 500 pF utilizando um aparelho de electroforese Bio-Rad, e depois foi inoculado numa placa de cultura de 96 cavidades. Adicionou-se um fármaco correspondente ao marcador de selecçâo do vector de expressão e continuou-se a cultura. Quando se observaram colónias, seleccionaram-se linhas que expressam o anticorpo pelo método descrito no Exemplo 4. Os anticorpos podem ser purificados das células seleccionadas de acordo com o Exemplo 5.

[Exemplo 19] Acção supressora da produção de anticorpos específicos para antigenes do anticorpo antagonista para o CD40 93

Ratinhos com um fundo genético pelo qual eram homozigóticos para o CD40 fragmentado endógeno de ratinho e albergando um transgene de um gene CD40 humano (Yasui et al., Int. Immunol. 2002, Volume 14: 319) foram sensibilizados por injecção intraperitoneal de 100 pg (numa quantidade de NP-CGG) de um complexo de conjugados 4-hidroxi-3-nitrofenilacetil-y-globulina de galinha (NP-CGG, distribuído por Hitoshi Kikutani, Professor, Instituto de Investigação de Doenças Microbianas, Universidade de Osaka) e ARAM (ARAM: Motivo de Activação do Reconhecimento de Antigenes). Trinta ou 100 pg de cada anticorpo monoclonal foram administrados, pela veia caudada, imediatamente antes da sensibilização a antigenes. Como controlo negativo administraram-se 100 pg de anticorpo IgG4 humano anti-albumina humana. Sete dias após a sensibilização recolheu-se sangue do plexo venoso orbital e mediram-se as quantidades de anticorpos IgGl e IgM específicos para NP no soro pelo método ELISA. Implementou-se o método ELISA adicionando albumina do soro bovino ligada a NP (NP-BSA: 2,5 pg/mL) (50 pL/cavidade) a cada cavidade de uma microplaca de 96 cavidades para ELISA (Maxisorp, Nunc), incubando a 4°C e depois absorvendo NP-BSA. Em seguida, o sobrenadante foi eliminado, adicionou-se a cada cavidade um reagente bloqueador (Super Block, Pierce) e depois realizou-se a incubação à temperatura ambiente para o bloqueio. Cada cavidade foi então lavada 3 vezes com um tampão de fosfato que continha Tween20 0,1% (PBS-T). Subsequentemente, cada soro diluído com PBS-T que continha BlockAce 10% foi adicionado (50 pL/cavidade) a cada cavidade, seguido de incubação a 37°C durante 2 horas para se dar a reacção. A microplaca foi lavada 3 vezes com PBS-T. Adicionou-se a cada cavidade uma solução preparada 94 diluindo 1 000 vezes anticorpo IgGl ou IgM de cabra anti-ratinho etiquetado com fosfatase alcalina (Cosmo Bio, 1070-04 ou 1020-04) com PBS-T que continha BlockAce 10% (50 pL/cavidade), seguido de 2 horas de incubação a 37°C. Seguidamente, a microplaca foi lavada 3 vezes com PBS-T, adicionou-se a cada cavidade uma solução de substrato cromogénico (50 μL/cavidade, Sigma 104, substrato de fosfatase) e mediu-se a absorvância a um comprimento de onda de 405 nm com um leitor de microplacas. As Figuras 18 e 19 apresentam os resultados. Nas figuras, os eixos longitudinais indicam valores obtidos por conversão usando como unidade o soro diluído 10 000 vezes no caso do anticorpo IgGl e o soro diluído 100 vezes no caso do anticorpo IgM. Aqui, o soro foi preparado injectando NP-CGG duas vezes em ratinhos C57BL/6, recolhendo sangue dos ratinhos e reunindo o soro. A administração de 100 μg de cada um dos anticorpos F4-465, 4D11 e KM281-1-10 suprimiu fortemente a produção de anticorpos IgGl e IgM específicos para NP.

[Exemplo 20] Supressão da proliferação de células B tonsilares por anticorpo antagonista para o CD40

Obtiveram-se amígdalas humanas do Children's Hospital (San Diego, Califórnia, E.U.A.). As amígdalas foram cortadas em pequenas porções, foram picadas e depois passadas num crivo celular de malha de nylon de 70 micrómetros, desse modo preparando-se uma suspensão de células. A suspensão de células foi lavada várias vezes com PBS, contou-se o número de células e, em seguida, a suspensão foi crioconservada com soro humano 90% (ICN) e DMSO 10%. Após a descongelação, as células foram novamente suspensas num meio RPMI padrão 95 suplementado com soro humano 10% e 2,5 μς/mL de anfotericina (Fangizon, Gibco/BRL) e foram utilizadas.

Adicionaram-se 1 x 105 células a uma placa de 96 cavidades e depois adicionaram-se anticorpos anti-CD40 humano às concentrações de 0,01, 0,1, 1,0 e 10 pg/rnL. O teste foi conduzido em triplicado para cada concentração. Adicionaram-se a cada cavidade 1 μρ/ΓηΡ de CD40L etiquetado com FLAG (Alexis) e 1 pg/mL de anticorpos intensificadores de CD40L (Alexis), seguido de 3 dias de cultura. Depois adicionou-se a cada cavidade 1 μΟί de [3H] timidina. Passadas 12 até 15 horas recolheram-se as células e mediu-se a proliferação de células B tonsilares utilizando um contador de cintilações liquidas. À contagem obtida quando células B proliferaram devido à estimulação de CD40L e sem adição de anticorpo atribuiu-se o valor 100, e à contagem obtida quando não se adicionou CD40L e células B não tinham sido estimuladas atribuiu-se o valor 0. Por exemplo, quando a contagem relativa medida foi 30, foi expressa nesta experiência como tendo ocorrido 70% de inibição da proliferação. O anticorpo 5D12, que é o anticorpo antagonista conhecido, não exibiu mais de 50% de inibição da proliferação mesmo para a concentração do anticorpo de 100 pg/mL. O anticorpo F4-465 exibiu aproximadamente 80% de supressão da proliferação mesmo com a concentração do anticorpo tão baixa quanto 0,01 pg/mL, e exibiu aproximadamente 95% de supressão da proliferação com uma concentração do anticorpo de 0,1 até 10 pg/mL (Fig. 20).

Aplicabilidade Industrial 96 A presente invenção proporciona um anticorpo contra o CD40. 0 anticorpo da presente invenção inclui um anticorpo que actua de forma agonista no CD40 e um anticorpo que actua de forma antagonista no CD40. Assim, estes anticorpos são úteis, por exemplo, como agente de potenciação imunológica e agente imunossupressor, respectivamente.

Texto Livre da Listagem de Sequências ID SEQ NO: 1: DNA sintético ID SEQ NO: 2: DNA sintético ID SEQ NO: 3: DNA sintético ID SEQ NO: 4: DNA sintético ID SEQ NO: 5: DNA sintético ID SEQ NO: 6: DNA sintético ID SEQ NO: 7: DNA sintético ID SEQ NO: 8: DNA sintético ID SEQ NO: 9: DNA sintético ID SEQ NO: 10: DNA sintético ID SEQ NO: 11: DNA sintético ID SEQ NO: 12: DNA sintético ID SEQ NO: 13: DNA sintético ID SEQ NO: 14: DNA sintético ID SEQ NO: 15: DNA sintético ID SEQ NO: 16: DNA sintético ID SEQ NO: 17: DNA sintético ID SEQ NO: 18: DNA sintético ID SEQ NO: 19: DNA sintético ID SEQ NO: 20: DNA sintético ID SEQ NO: 21: DNA sintético ID SEQ NO: 22: DNA sintético ID SEQ NO: 23: DNA sintético ID SEQ NO: 24: DNA sintético ID SEQ NO: 25: DNA sintético ID SEQ NO: 26: DNA sintético 97

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

<110> KIRIN BEER KABUSHIKI KAISHA <120> ANTICORPO MONOCLONAL ΑΝΤΙ CD40

<130> PH-1569-PCT <140> <141> <150> PCT/US01/13672 <151> 2001-04-27 <150> US09/844 684 <151> 2001-04-27 <150> JP2001/142482 <151> 2001-05-11 <150> JP2001/310535 <151> 2001-10-05 <150> US10/040 244 <151> 2001-10-26 <160> 66 <170> Patentln Versão 2.1

<210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: DNA sintético <4 0 0 > 1 eecagstctg tccatccaga accacccact gcatgcagag 40 98 <210> 2 <211> 41 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: DNA sintético <400> 2 acaagatetg ggctctacgt atctcagccg atcetgggga c 41 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: DNA sintético <400> 3 ggtccggfag atcstgaggg tgtcctt 27 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: DNA sintético <4 0 0> 4 gtgcacgccg ctggtcaggg cgcctg 26

<210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: DNA sintético 99 <4 Ο Ο> 5 gctggagggc acggtcacca c-gclg 2$

<210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: DNA sintético <2 Λ Π (Ί Ç\ g%tgccam& igaagãccga tgg 23

<210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: DNA sintético <400> 7 atatgttgas getgaattct ggctgaccag ggcag 35

<210> 8 <211> 37 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: DNA sintético <400> 8 statgtcgac tcccaggtgt ttceattcag tgãtcàg 37

<210> 9 <211> 37 <212> DNA <213> Sequência Artificial 100 <2 2 0 > <223> Descrição da Sequência Artificial: DNA sintético <400> 9 atatgtcgac ttecettcgg tgatcegcac tgaacac 37 <210> 10 <211> 34 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: DNA sintético <4nn> in atatgtcgac tttgagagtc ctggacctcc tgtg 34 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: DNA sintético í-zinns 1 1 atatgtcgac gagtcatgga teteatgtgc aag 33

<210> 12 <211> 36 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: DNA sintético <4 0 0 > 12 ataígtcgsc ccagggcagt caccagagct ceagac 36 <210> 13 <211> 26 101 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: DNA sintético <4 0 0> 13 ficcgtgtcga ctacgcgggs gtgact <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: DNA sintético <4 0 0> 14 accgtgtcga cgcigatcag gactgcaca 29 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: DNA sintético 1 ς accgfgtcga cggtgatcag gaeigaacag 30 <210> 16 <211> 26 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: DNA sintético <400> 16 gttgaagetc tttgtgacgg gcgagc 26 102

<210 > 17 <211> 24 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: DNA sintético <400> 17 tcttctccae ggtgctccct tcat 24

<210> 18 <211> 35 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: DNA sintético <4 0 0 > 18 statagateí geacígctea gnaggacee agagg 35

<210 > 19 <211> 34 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: DNA sintético <400> 19 âtatagatct cgcggggaag gagaetgctc agtt 34

<210> 20 <211> 34 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: DNA sintético 103 <400> 20 aiíitâgatct agtcagaccc agtcaggaca cagc 34

<210> 21 <211> 36 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: DNA sintético <400> 21 statagatct gagctgctca gttagpecc agaggg <210> 22 <211> 36 <212> DNA <213> Sequência Artificial 36 <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: DNA sintético <400> 22 atatagatct taagcaagtg taaeaactca gagtac <210> 23 <211> 38 <212> DNA <213> Sequência Artificial 36 <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: DNA sintético <400> 23 atatagatct gaggaactgc t.vagttagga cccagagg 38 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Sequência Artificial 104 <2 2 0 > <223> Descrição da Sequência Artificial: DNA sintético <400> 24 asciccagat etgccteagg aagcagcate 30

<210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: DNA sintético <400> 25 aactccagat ctagggcaag tagtggtaae 30

<210> 26 <211> 26 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: DNA sintético <400> 26 tggcgggâag atgaapcag atggtg 26

<210> 27 <211> 1480 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 105 gtegacgctg aaíicíggct gaccsgggca cttCCtçatc ttcctgcccg tgctgggcct gcagcagtca ggtccaggac tggtgaagcc ctccggggac agtgtctcta gcaacagtgc gagagacctt gagtggctgg gmggacata aggatctgtg aaaagtegaa taatcatcaa gcagctgaae tctgtgaetc ccgaggacac gctg.gg.aggg gattacccet actactacag caccgtctct tcagcctcca ccaagggcec gageacetec gagageacag cggccetggg ggtgacggtg tcgtggMct caggcgctct cctacagtcc teaggaetet aetccctcag cggoaeccag aectacacct geaacgtaga gacagttgag cgcaaatgtt gtgtcgâgtg accgtcagtc ncctettcc ccccaaaacc tgaggtcacg tgcgtggtgg tggacgtgag gtacgtggac ggcgtggsgg tgcataatgc cagcacgttc cgtgíggtca gcgtcctcac ggagtaeasg tgcaaggtct ccââcaaagg eaaaaceaaa gggcegcccc gagaaecaca gatgaceaag aaceaggtea gectgaectg cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc gctggactea gacggctcct tcttcctcta gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt geagaagage ctctccctgt ctccgggtaa gccaccagsg ctccagacaa tgtctgtctc 60 ccoatggggt gtcctgtcac aggtccaact 120 ctcgcagaec ctctcactca cctgtgeeat 160 tacttggaae tggatcaggc agtccccatc 240 etacaggtcs aagtggtatc gtgattatgt 300 cccagãcaca tcc-aacaacc agttctccct 360 ggctatatat tactgtacaa gagcmagtg 420 tatggacgtc tggggceaag ggaceaeggt 480 ãtcggtcttc ccéetgsegc cctgctccag 540 ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc 600 gaccagcggc gtgcácáECt tcEcagetgt 660 cagogtggtg accgtgcccl ecageaaett 720 teacaagccc agcaacaeca aggtggacaa 780 cceaeegtgc eçagEaecac ctgfcggcagg 840 caaggacacc ctcatgatct cccggacccc 900 ccacgaãgac cccgaggtec agtteaactg 960 caagacaaag ccacgggagg agcagtteaa 1020 cgttgtgcaç caggôctggc tgaaeggcaa 1080 eotcccagcc ççeatcgaga aaaecatctc 1140 ggtgtacacc ctgcccccat eeegggagga 1200 cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat 1260 ggagaacaac tacaagacca cacctcccat 1320 cageaagctc aecgtggaca agagcaggtg 1380 gatgcãtgag gctctgcaca aceactacac 1440 atgaggatcc 1480

<210> 28 <211> 474 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 106

Mat Ser Yal Ser Phe Leu lie Phe Leu Pro Vai Leu Gly Leu Pio Trp 1 5 LO 15

Gly Vai Leu Ser Gin Vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Gly leu Vai 20 25 30

Lys Pro Ser Gin Thr Leu Ser Leu Thr Cy.s Ala Ile Ser Gly Asp Ser 35 40 15

Vai Ser Ser Asa Ser Ala Thr Trp hm Trp 11« Arg Gla Ser Pro Ser 50 55 00

Arg Asp Leu Glu Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr 65 70 75 B0

Arg Asp Tyr Vai Gly Ser Vai Lys Ser Arg lie fie Ile Asn Pro Asp 85 90 95

Thr Ser Asn Asn Gin Phe Ser Leu Glri Leu Asn Ser Vai Thr Pro Glu 100 105 110

Asp Thr Ala lie Tyr Tyr Cys Thr Arg Ais Gin Trp Leu Gly Gly Ãsp 115 120 125

Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Vai Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai 130 135 140

Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala 145 ISO 155 160

Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 165 170 175

Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly 180 IBS 190

Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Vai Leu Gin Ser Ser 195 200 205 107 01y Leu Tyr Ser Lm Ser Ser Vai Vai Thr Vai Fro Ser Ser Asn Fhe 21Ô 215 220

Gly Thr 61r Thr Tyr Thr Cys Asn Vai Asp His Lys Pro Ser Asn Thr 225 230 235 24.0

Lys Vai Asp Lys Thr Vai Glu Arg Lys Cys Cys Vai Glu Cys Pro Pro 245 250 255

Cys Pro Ala Pro Pro Yal Ala Gly Pro Ser Vai Fhe Leu Phe Pro Fro 260 255 270

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Fro Glu Vai Thr Cys 275 280 28S

Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Yal Gin Phe Asn Trp 290 295 300

Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Aso Ala Lys Thr lys Pro Arg Glu 305 310 3.15 320

Glu Gin fhe Asn Sor Thr fhe Arg Vai Vai Ser Vai. Leu Thr Vai Vai 325 330 335 Hís Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn 340 345 350

Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly 355 360 365

Gin Pro Arg Glu Pro Glu Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 370 375 380 fet Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai lys Gly Phe Tyr 385 390 395 400

Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 40S 410 415

Aon Tyr Lys Thr Thr Pro Fro Met Lea Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 420 425 430 108

leu Tyr Ser lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asm 43S 440 44S

Vai. Phe Ser Cys Ser Vai Met Hís Glu Ala leu Kis Asa Hís Tyr Thr 450 455 460

Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470

<210> 29 <211> 406 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 actgctcagt taggacccag agggaaccat ggaagcceea gctcagettc tcttcctect 60 gctactetgg ctcecagata ccaceggaga aattgtgttg aeacagtctc cagccaccct 120 gtctttgtct ccaggggaaa gagccâcect ctcctgcagg gccagtcaga gtgttagcag 180 ctacttagcc tggtaccaae agaaacctgg ccaggctccc aggctcctca tctatgatgc 240 atecaacagg. gecactggca teccagccag gttcagtggc agtgggtctg ggaeagactt 300 caetctcace atcagcagee tagegectga agatttígca gtttattact gtcagcagcg 380 tagcaacact ttcggccctg ggaceaasgt ggatatcaaa egtacg 406

<210> 30 <211> 126 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30

Met Glu Ala Pro Ala Gin Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15

Asp Thr Thr Gly Glu Ile Vai Leu Thr GTn Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 3õ

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser 35 40 45

Vai Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro 109 50 55: 60

Arg Leu Leu Ils Ty.r Asp Âla Ser Asn Ar® Ala Thr Gly lie Pro Ala 65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr II e Ser 85 m 95

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin G.1& Arg Ser 100 105 110

Asn Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Vai Asp Ile Lys Arg Thr 115 120 m

<210> 31 <211> 508 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 cigaacaceg acccgtcgac teccaggtgt ttccâttcag tgatcagfiac tgaaeâeaga 60 ggacteacca tggagttggg aetgagctgg attttecttt tggctatttt aaaaggtgtc 120 cagtgtgaag tgeagctggt ggagtctggg ggaggcttgg tacagcctgg caggtccctg 180 âgâetctect gtgcagcctc tggattcacc tttgatgatt atgceatgca ctgggtcegg 24 Ô caagctceag ggaagggect ggagtgggtc tcaggtatta gttggaatag tggtagcttg 300 gtgcetgcgg actctgtgaa gggccgatte accatctcca gagacaacgc eaagaactcc 360 ctgtatctgc ããatgaacag tctgagagct gaggacacgg ççttgtatta otgtgcaaga 420 gataggctat ttçggggagt taggtactac ggtatggaeg tctggggcca agggaceacg 480 gtcaccgtct cctcagctag naceaagg 508

<210> 32 <211> 146 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 110

Met Glu Leu Gly Leu Ser Trp Ile Phe leu leu Ãla Ile Leu Lys Gly 1 S 10 15

Vai Gin Cys Glu Vai Glrs Leu Vai Glu Sei* Gly Gly Gly Leu Vai Gin 20 25 30

Fro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45

Asp Asp Tyr Ala Met ttis Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60

Glu Trp Vai Ser Gly Ile Ser Trp Asa Ser Gly Ser Leu Vai li is Ala 65 70 75 80

Asp Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asm Ala tys Asn 85 90 95

Ser Leu Tyr leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu 100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg teu Phe Arg Gly Vai Arg Tyr Tyr Gly 115 120 1.25

Met Asp Vai Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr Vai. Ser Ser Ala Ser 130 135 140

Thr Lys 145

<210> 33 <211> 414 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 33 111 ctgctcsgtt aggacccaga gggaaccatg ctactctggc tcccagatac caccggagaa tetttgtctc caggggaaag agccaccctc tacttagcct ggtaccaeca gaaaeeigge tccaacaggg ccact.ggcat cccagccagg actctcacca tcagcagcct agagcctgaa agccactggc tcactttcgg cggggggacc gaagccccag cteagcttct cttcctcctg 60 attgtgftga eaeagtctcc agccaccctg 120 tcctgcaggg ccagtcagag tgttsgcagc ISO caggctccca ggctccicat ctatgatgca 240 ttcagtggca gtgggtctgg gacagacttc 300 gattttgcag tttattactg tcagcagcgt 360 aaggtggaga tcaaacgtac ggtg 414

<210> 34 <211> 129 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 fet Glu Ala Pro Ala Gin leu Leu Fhe Leu leu Leu Leu Trp Leu Pro

1 5 10 ' IS

Asp Thr Thr G"íy Glu Ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser 35 40 45

Vai Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro 50 55 60

Arg Leu Leu íle Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala 65 TO 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 05

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser 1QG 105 110

His Trp Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr tys Vai Glu Ile Lys Arg Thr 115 120: 125

Vai 112

<210> 35 <211> 493 <212> DNA <213> Homo sapiens <4 Ο Ο > 35 ctgaacâcag acccgtcgac ttccattcgg tggagtttgg getgagetgg gttttcctcg tgcaptggt ggãgUíggg ggaggcgtgg gtgcagcgtc tggatteacc ttcagtagct gcaaggggct ggagtgggtg gcagttatat aetccgtgaa gggecpttc accatctcca aaatgaacag cctgapgec gaggacacgg atattttgac tggttatttt ggctactggg ctagcaccaa ggg

<210> 36 <211> 144 <212> PRT <213> Homo sapiens ígateagcac tgaacacaga ggactcaeca 60 ttgctctttt aagaggtgtc cagtftcagg 120 tecagectgg gaggtccctg ágactctcct 180 atggcatgca ctgggtccgc caggctccag 240 ggtatgatgg aagtattaaa tactatgcag 30Ô gagacaattc caagaacaGg ctgtatctgc 360 ctgtgtatta ctgtgcgaga gagggctaea 420 gccagggaac cctggtcacc gtctccteag 480 493 <400> 36 113

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Vai Phe leu Vai Âla Leu Leu Arg Gly 1 5 10 15

Vai Gin Cys Gin Vai Gin Leu ¥al Glu Ser Gly Gly Gly Vai Vai Gin 20 25 30

Pro Gly Arg Ser Leu Arg leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45

Ser Ser Tyr Gly tóet Bis Trp Vai Arg Gla Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60

Glu Trp Vai Ala Vai íle Trp Tyr Asp Gly Ser lie Lys Tyr Tyr Ala 65 70 75 80

Asp Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg A$p Aso Ser Lys Asn 85 90 95

Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai 100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Clu Gly Tyr Asn lie Leu Thr Gly Tyr Phe Gly 115 120 125

Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser Âla Ser Thr Lys 130 135 140

<210> 37 <211> 427 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 37 114 tcacagatct agtcagaccc agtcaggaca cagca.tggau atgagggtcc cegetcagcí 60 cctggggctc ctgctgctct ggctcccagg tgccagatgt gtcatctgga tgacccagtc 120 tccatecfcta ôtfttetgcat ctacaggaga cagagteaoe atcagttgtc ggatgagtca 180 gggeattagc agtgatttag cetggtatea gcaaaaaeca gggaaagacc ctgagctcct 240 ptctetget gcatceactt tgcaaagtgg ggtcccatca aggttcagtg gcagtggatc 300 tgggacagat Uaactctca ccatcagctg cctgcagtct gaagattttg caacttatta 360 ctgtcaaeag tanatagtt ttccgtggac gttcggccaa gggaccaagg tggaaatcaa 420 acgtacg 427

<210> 38 <211> 131 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 U&t Ásp Met Àrg Vai Pro Ala Gin Leu Leu Gly teu Leu Leu Leu trp 1 5 10 15

Leu Pro Gly Ala Arg Cys Vai IIe Trp Met Thr Gin Ser Pro Ser Leu 20 25 30 leu Ser Ala Ser Thr Gly Asp Arg Vai Thr lie Ser Cys Arg Met Ser 35 40 45

Gin Gly Ile Ser Ser Asp Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys 50 55 60

Ala Pro Glu Leu Leu Ile Ser Ala Ala Ser Thr Leu Gin Ser Gly Vai 65 70 75 80

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 85 90 95

Ile Ser Cys Leu Gin Ser Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin ioô m uo

Tyr Tyr Ser Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu He 115 120 125

Lys Arg Thr 130 115 <210> 39 <211> 492

<212> DNA <213> Homo sapiens <4 Ο Ο> 39 etgaacacag acccgtcgac ttccattcgg tgatcagcac tgaaçacaga ggactcacca 80 tggagtttgg gctgagctgg gttttcctcg ttgctctttt aagaggtgtc cagtgtcagg 120

tgcagctggt ggsgtctggg ggaggcgtgg tccagcctgg gaggtccctg agactctcct ISO gtgcagcgtc tggatteacc ttcagtagct atggcatgca ctgggtccgc caggctccag 240 geaaggggct ggagtgggtg gcagttatat ggaatgatgg aagtattaaa tactat-gcag 300 actccgtgaa gggccgattc aceatctcca gagacaattc caagaacacg ctgtatctgc 360 aaatgaacag cctgagagcc gagpcacgg clgtgtstta ctgtgcgaga gagggctaca 420 âtatittgae tggttãtttt ggctactggg gecagggaac cctggtcacc gtctcctcag 480 ctagcaceaa gg 4S2

<210> 40 <211> 144 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40

I 5 W IS

Vai Gin Cys Glr> Vai Gin Ua Vai Glu Ser Gly Gly Gly Vai Vai Gla 20 m 30

Pro Gly Arg Ser Leu Arg Las Ser Cys Ala Ala Ser Gly Pfee Thr Phe 35 m 45

Ser Ser Tyr Gly ílat Hk Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly tys Gly Leu 50 55 60 01« Trp Vai Ala Vai lie Trp Asa Asp Gly Ser II© Lys lyr Tyx Ala 65 ?Ô 75 80

Asp S«r Vai Ly$ Gly Arg Phe Thr ílé Ser Arg ásp Asn Ser Lys Asa 85 30 95

Thr Leu Tyx Leu 6b Mut Asa Ser teu Arg Ala 81« Âsp Thr Ala Vai 100 105 110 lyr lyr Cys Ala Arg Gla Gly lyr Asa II© Leu Thr Gly Tyr Pfee Gly 115 120 125

Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys MO ϊ.35 MG <210> 41 116 <211> 427 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 41 tcscagatet sgtcagacco cctggggctc ctgctgctct tύcâtce11a ctctcfcgcat gggcattagc ãgtgatttag gatctctgct gcatceactt ggctcccagg ctBcaggaga cctggtatca tgeaaagtgg tgggacagat ítcãetctca ccatcagctg ctgtcaacag tattatagtt ttccgtggae eagcatggac atgagggtec ccgotcagct 60 tgccagatgt gtcatctgga tgacccagtc 120 cagagtcacc atcagttgtc ggatgagtca 180 geaaaaacca gggaaagccc ctgagctcct 240 ggtcccatca aggttcagtg gcagtggatç 300 çctgçagtct gaagattttg caacttatta 360 gttcggccaa gggaccaagg tggaaatoaa 420 acgtacg <210> 42 <211> 131 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Met Asp Met árg ¥í il Pro Ala Gin 1 S Leu Pro Gly Ala As rg Cys Vai 11« lm Ser Ala Ser Tf sr 01? Asp Arg as 40 SI» ôly II e Ser Ser A$p Leu Ala §Ô 55

Ala Pro fila Leu Leu He Ser Ala 65 70 Pro Ser Art P&e Ser 01? Ser Gly He Sor Cn iee m ÍJví1 Gin Ser GIu Asp Tyr Tyr Ser Phe Pro Trp Thr Fhe 115 lf$ Arg Thr 120 <210> 43 <211> 481 <212> DNA <213> Homo sapiens

Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 10 Trp iet Thr fila aí 15 Ser Pro Ser Leu Ah Val Thr Oe Ser *5U Cys Arg Met Ser Trp Tyr Gin 61a Lys Pro Gly tys 60 Ala Ser Thr Leu Gin Ssr Gly Val 75 80 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr m m Phe Ala Tb.r Ty? Tyr Cys Gin Gin 106 .110 ! 01? 01« Gly Thr tys Vai Clu He 1.25 m 117 <400> 43

ctgaaeaçag acccgtçgac tttgagagte ctggacctec tgtgcsagaa catgaeacat SO ctgtggttct tccttctcct ggtggcaget cccagatggg tcctgtccca ggtgcagctg 120

eaggagtcgg gcceaggsct ggtgaagcct tcggagaece tgtccctcae ctgcactgtc ISO tctggtggct ecatcagtgg ttactactgg agetggatcc ggcagccccc agggaaggga 240 ctggagtgga ttgggtatat ctattacagt gggagcacca aetacaatcc ctccctcaag 300 agtcgagtca «atatcagt agacacgtcc aagaaccagt tcteectgaa gctgaattct 360 gtgaccgctg cggaeaeggc cgtgtattac tgtgcgagag ccccettgca cggtgactac 420 aaatggttce acccctgggg ccagggaacc ctggtcaccg tcteetcagc tagcaceaag 480

<210> 44 <211> 143 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44

Met Lys His Leu Trp Phe Phe leu leu Leu Vai Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15

Vai Leu Ser Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Vai Lys 20 25 30

Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Vai Ser Gly Gly Ser Ile 35 40 45

Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly teu 50 $5 60

Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Astt Pro 65 70 75 80

Ser Leu Lys Ser Arg Vai Thr Ile Ser Vai Asp Thr Ser Lys Ásn Gin 85 90 95

Phe Sor Leu Lys Leu Asn Ser Vai Thr Ala Ala Asp Thr Ala Vai Tyr 100 105 Π0

Tyr Cys Ala Arg Ala Pro Leu Hís Gly Asp Tyr Lys Trp Phe His Pro 115 120 125

Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys 130 135 140 118

<210> 45 <211> 430 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 45 tcaeagatct gagetgctca gttsggacce tctcttcctc ctgctactct ggetcecaga tccaggcacfi ctgtetttgt ctccagggga gágtgttagc agcagctact tagcctggta cetcatctat ggtgcateca gcagggccac gtctgggacâ gacttcactc tcaccateag ttactgtcag cagtatggta gctcaccgat caaasgtacg

<210> 46 <211> 130 <212> PRT <213> Homo sapiens agagggaacc alggaaaccc eagcgcagct 60 taceaccgga gaaattgtgt tgacgcagtc 120 aagagccacc ctctcctgca gggeeagtca 180 ccagcágaaa cctggccagg ctcccaggct 240 tggcatccca gecaggttca gtggcagtgg 300 eagactggag cctgaagstt ttgcagtgta 360 eaectteggc caagggacac gactggagat 420 430 <400> 46

Hat GTu Thr Pro Ak 01» Li« Leu Phe teia teu Leu Leu Irp teu Fro 1 S 10 t§

Asp Thr Thr G1 y Gk Ik Vsl Lm Thr Gin Ser Fro Gly T&r Leu Ser 20 IS 30

Leu $wr Fro 01? Gk Ârg Ala Thr Leu Ser Cys ârg âla Saí 35 40 IS

Vai Ser Ser Ser Tyr Lee AU Trs? ΐπ Un Sln Ifs Pro Gly Gin 50 SS «G

Asp ârg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr hm Phé Thr Im Tkr Ik 8S 90 95

Ser ârg Lee GIu Pre Gk hsp PU Ala Vai Tyr Tyr €ys Gk Gin Tyr 100 105 HG

Gly Ser Ser Pro Ik Tkr Phe Gly Gk Gly Tkr ârg leu Ok Ik tys m 120 125

119 <210> 47 <211> 462

<212> DNA <213> Homo sapiens <4 Ο Ο> 47 atatgtcgac gagtcatgga ctgctggtgg eggctcccag ggactaetga agccttegge

gttcttccte 60 gtegggccca 120 cggetccatc ISO tctcatgtge aagaaaatga agcacctgtg atgggtcctg tescagctgc agetgeagga gaoectgtcc ctcacctgca ctgtctstgg agcagtcctg gttsctacgg gggctggatc attgggagta tctataaaag tgggagcacc accatatccg tãgacacgtc eaagaaceag gcagacacgg ctgígtatta ctgtacgaga ccctggggcc· .Sgggaaccct ggtcaccgtc cgccageçcc zagggaaggg gctggagtgg 240 taccacascc cgtcccteaa gagtcgãgtç 300 ttctçcctga agctgagete tgtgacegcc 360 cctgtagfcac gatattttgg gtggttcgae 420 tcctcagcta gc

<210> 48 <211> 149 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48

Mei Asp leu Met: Cys Lys Lys Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu 1 5 10 15

Leu Vai Ala Ala Pro Ârg trp Vai Leu Ser 01a Leu Gin Leu Gin Glu 20 25 30

Ser Gly Pro Gly leu leu Lys Pro Ser Glu Thr leu Ser Leu Thr Cys 35 40 45

Thr Vai Ser Gly Gly Ser He Ser Ser Pro Gly íyr Tyr Gly Gly Irp 50' 55 60

Lys Sor Gly Ser Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Vai Thr 85 90 m 120 lie Ser Vai Àsp Thr Ser Lys Âsn Gin Phe Ser Lee lys Leu Ser Ser 100 105 110 Vai Thr Aja Ala As p Thr Ala Vai Tyr Tyr Gys Thr Arg Pro Vai Vai 115 120 125 Arg Tyr Fite Gly Trp Phe Asp Pró Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr 130 135 140 Vai Ser Ser Ala Ser 145

<210> 49 <211> 448 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 49 gacacagcat 60 caggtgccag 120 gagaeagagt Í80 atcagcagaa 240 gtggggtccc 300 gcagcc.tgcá 360 egttcggcca 420 agatettaag ggacatgsgg atKtgccato eaeeatcact accagggaaa atçaaggttc gectgaagat agggaccaag eaagtgtaae gtccecgctc eagttgaccc tgmgggcaa gctcctaagc tttgcaactt gtggaaatca aacteagagt agctcctggg agtetccatc gtcagggcat teetgatcta gatctgggso attactgtca aacgtecg acgcggggag gcttctgctg ctccctgtct tagcagtgct igaígectcc agatttcact acagtttaat acccactcag ctctggctcc gcatctgiag ttagcetggt aatttggaaa ctcacc&tca agttacccgâ

<210> 50 <211> 130 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 121

Set Asp Stet Arg Vai Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 15 10 15

Leu Pro Gly Ale Arg Cys Ala Ile Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser 20 25 30

Leu Ser Ala Ser Vai Gly Asp Arg Vai Thr Il.e Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45

Gin Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala Trp lyr Gin Gin Lys Pro Giy Lys 50 55 60

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn teu Glu Ser Gly Vai 65 ?0 75 30

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr leu Thr 85 90 95

lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 100 105 UO

Phe Asn Ser Tyr Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys 115 120 125

Arg Thr 130

<210> 51 <211> 453 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 51 atgtctgtct ccttcetcst cággtaeagc tgcagcsgtc acctgtgcea tctccgggga. eagteeecat cgagaggeet aaagaítatg câgtatetgt cagttctccc tgcagctgaa agãgggtatt aetatggttc caagggacca cggtcaccgt cttcctgccc gtgctgggcc aggtccagga ctggtgeagc cagtgtctct ageáácagtg tgagtggetg ggaaggacat gaaaagtcga ataaccatca ctctgtgacc eeegaggaca ggggagetat eectactact ctcctxagct age tcccatgggg tgtcctgtca 60 cetegeagac «ctctcattc 120 etgcttggaa etggaícagg 180 ãctaeaggtc caagtggtat 240 acccagacac atccaagaae 300 çggctgtgte ttactgtgca 360 accaaatgga cgtctggggo 420 453 122

<210> 52 <211> 151 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52

Siet Ser Vai Ser Pbe Leu 1.1 e Phe Leu Pro Vai Leu Clv Leu Pro Trp 1 5 10 15

Gly Vai Leu Ser Gin Vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Gly Leu Vai 20 25 30

Lys Pro Ser Glrt Thr Leu Ser Pha Thr Cys Ala He Ser Gly Asp Ser 35 40: 45

Vai Ser Ser Asr Ser Ala Ala Trp Asn Trp lie Arg Gin Ser Pro Ser 50 SS 60

Arg Gly Leu Glu Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser lys Trp Tyr 65 ?0 T5 80

Lys Asp Tyr Ala Vai Ser Vai Lys Ser Arg He Thr Ile Asn Pro Asp 85 90 95

Thr Ser Lys Asn Gin Fhe Ser Léu Gin Leu Asn Ser ¥al Thr Pro Glu 100 105 110

Asp Thr Ala Vaí Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly 115 120 125

Ser Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Glu Met Asp Vai Trp Gly Glu Gly Thr Thr 130 135 140

Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser 14S 150

<210> 53 <211> 414 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 53 123 âattg&ggfaa ctgeteagtt aggacecap gggaaccaig gaagecccag ctcagcttct 60 çttcctcctg ctaetctggc tcccagatac caecggagaa atigtgttga cacagtctcc 12Ô sgccacoctg tctttgtctc eaggggaaag tgccaccctc tectgcaggg ccagtcagag 180 ígttagcagc taettagcct gglaccaaca gaaaçstggc caggctccca ggctcctcat 240 otatgatgca tceaacaggg ccactggcat cccagecagg ttcagtggca gtgggtctgg 300 gacagãctíc actctcacca tcagcagect agsgcctgaâ gattítgcag tUattsctg 360 tcagcagcgt agcaaeaeit tcggeggagg gaccaaggtg gagatcaaac gaac 414

<210> 54 <211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54

Met Glu Ala Pro Ala Cia Leu Leu Phe Leu leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15

Asp Thr Thr Gly Glu lie Vai Lsu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu $er 20 25 30

Leu Ser Pro Gly Glu Ser Ala Thr Leu Ser Cys .Arg -Ala Ser Gin Ser 35 40 45

Vai Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gla Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro 50 55 60

Arg Leu Leu lie Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala 65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95

Ser Leu Glu Pro Glu Âsp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin GJn Arg Ser 100 10S Π0 Ásn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys Arg 115 120 125

<210> 55 <211> 495 <212> DNA <213> Homo sapiens 124 <4 Ο Ο > 55 ctgaacacag scecgtegac tacgcgggag accacagctc cacaccatgg actggacctg 60 gaggatecta ttcttggtgg cagcageaac aggtgeccac tcccaggtgc agctggtgca 120 atctgggtct gagttgaaga agcctggggc ctcagtgaag gtcccctgca aggcttctgg ISO atacaccttc actagctatg çtatgaattg ggtgcgaeag gcccctggac aagggcttga 240 gtggatggga tggatcaace ccaacactgg gsacccaacg tstgcccagg gcttcãcagg 300 acfgtttgtc ttctccttgg acãcctctgt cageacggca tatctgcaga tcagcagcct 360 aaaggetgag gacactgccg tgtattactg tgcgagagâg gtagtaecag ttgctatgag 420 ggtaactcsc tactactacg gtatggacgt ctggggccaa gggaeeacgg teaecgtetc 480 cteagctage aeeaa 495

<210> 56 <211> 149 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56

Set Asp Irp fNr frp Ârg íle Leu Phe teu Vál Ala Ala Ala Thr Gly 15 m 15

Ala Hís Ser 01« Vai Gin lm Vai Gin Ser Gly Ser Gin Leu Lys Lys 20 25 âO

Pro Gly Ala Ser Vai Lys Vai Pro Cys Lys Ala Ser Gly Tyr lihr Ph« 35 m 45

Thx Sar Tyr Ala Set àm Irp Vai Arg Gin Ala Fio Gly €1» Gly Leu SO 65 60

Gin Txp Mtt Gly Irp 11« Ato Thr Ato Ibr Gly Aso Pro Tbr Tyr Alt 55 70 78 30

Gin Gly Fhe flr Gly Arg Phe Vai 1¾¾ Ser Leu Asa Thr Ser Vai leu Gin j 180

Ser Ser Leu Lys Ala 105 no

fyr fyr Çys Ala Arg Gin Vai Vai Pre Vai Ala iet Arg Vai Thr HIn 115 125 12S

Tyr Tyr Tyr Gly Kat Asp Vai Irp Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr Vai ISO 1.35 140

Ser Ser Ala Ser Thr 145 <210> 57 <211> 830

<212> DNA <213> Homo sapiens 125 <4 Ο Ο> 57 ctgggtacgg iaaccgtcag atcgectgga gcatcggagg tgcctcagcc atggcatgga gcacaggate cgtggcctcc tatgagotga gacagacagc câgcatcacc tgttctggag atcagcagaa gccaggeeag tcccctgtgc cagggatccc tgcgcgattc tetggctccá gcgggaccca gfctatggat gaggctgact tggtattegg cggagggacc aagctgaccg tcactctgtt cecgecctcc tctgaggage tcataagtga cttctacacg ggagccgtga tcaag.gcg.gg agtggagacG accacaceet gcagctacet gagectgacg cctgagcagt tcacgcatga agggagcacc gtggagaaga agatcegtta acggttacea actâcetâgâ gacgccâtca cagatctgee tcaggaagca 60 tecctctctt cctcggcgtc cttgtttact 120 ctcagccacc ctcagtgtcc gtggccmag 180 ataaattggg ggataatttt acttgctggt 240 tggtcatctt tcaggattgg aagcggcgcc 300 ôgtôtgggaa Câcagecact ctgaccatca 360 attactgtca ggcgtgggac atcagcactg 420 tcctaggtca gcccaaggct gccccctcgg 480 ztcaagccaa casggccaca ctggtgtgtc 540 cagtggcctg gaaggcagai agcagccecg 800 ccaaacaaag caacaaoaag tacgcggcca 860 ggaagtccca cagaagctac agctgccagg 720 cagtggcccc tacagaatgt tcatgaattc 780 ctggãttcgt gâecaaeata 830

<210> 58 <211> 231 <212> PRT <213> Homo sapíens <400> 58

Met Ala Trp Ile Pro leu Phe Leu Gly Vãl Leu Vai Tyr Cys íhr Gly

I 5 10 IS

Ser Vai Ala Ser fyr Glu Leu Thr GIb Pro Pro Ser Vai Ser Vai Ala 29 25 30

Pro Gly 01« Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser 01? Asp Lys Leu Gly Âsp 35 40 45 126

Asn Phe Thr Cys Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Giy Gin Ser Pro Vai leu 50 55 60

Vai lie Phe Gin Asp Trp· Lys Arg Arg Pro Gly lie Pro Ala Arg Phe 65 70 75 80

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr 11« Ser G1 y Thr 85 9€· 95

Gin Ala Met Asp Glu Ala Asp lyr Tyr Cys Gin Ala Trp Asp Ile Ser 100 105 110

Thr Vai ¥al Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu Gly Gin. Pro 115 120 12$

Lys Ala Ala Pro Ser Vai Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu 130 135 14Ô GLn Ala Asn Lys Ala fhr Leu Vai Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro 145 ISO 155 160

Gly Ala Vai Thr Vai Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Vai Lys Ala 165 170 175

Gly Vai Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gin Ser Asn Asn Lys Tyr Ala 180 185 190

Ala Ser Str Tyr Leu. Ser Leu Thr Pro Glu Gin Trp Lys Ser Pis Arg 195 200 205

Ser Tyr Ser Cys Gin Vai Thr His Glu Giy Ser Thr Vai Glu Lys Thr 210 215 220

Vai Ala Pro Thr Glu Cys Ser 225 280

<210> 59 <211> 520 <212> DNA 127 <213> Homo sapiens <400> 59 gctgatcagg actgcacaca gagaactm catggagttt gggctgagct gggtttuct 60 tgttgctatt ttaaaaggtg tccagtgtga ggtgcegctg gtggagtccg ggggaggctt 120 agttcagcct ggggggtccc ígagactctc ctgtgcagtc tctggattca ccttcagtac 180 etactggatg cactgggtcc gccaagetcc agggaagggg ctggtgtggg tetdâcgtat 240 taatagtgat gggagtagca caatctacgc ggactccgtg aagggocgat Uaecatctc 300 cagagacaac gccaagsaca cgctgtatct geaaalgaac agtetgagag ccgaggacac 360 ggctgigtat tactgtgcaa gagâtagagt actatggate ggggagttat eetaetaegg 420 tatggacgtc tggggccaag ggaccacggt eaççgtctcc tcagetagca eeaagggccc 480 ateggtcttc ceçctggcae. cctcctccaa gagçacctet 520

<210> 60 <211> 163 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60

Uei Gltt Phe 01 y Leu Ser Trp Vai Phe Leu Vai Ala Ile Leu Lys Gly l S 10 15 Vai Gin Cys 6l.u Vai Gin leu Vai Glu Ser 01 y Gly Gly Leu Vai Gíf: 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Vai Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45

Ser Thr 50 Tyr Trp Met His Trp 55 Vai Arg Gira Ala Pro 60 Gly Lys Gly Leu Vai Trp Vai Ser Arg Ile ÂSÍl Ser Asp Gly Ser Ser Thr Thr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asp 85 m 95 Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asa Ser leu Arg Alá Glu Asp Thr Ala Vai 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Vai Leu Trp Ile Gly Glu Leu Ser Tyr 115 120 12$ 128

lyr Cly Met Asp Vai Trp Gly Gin G.ly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 130 135 HO

Ala Ser Thr iy$ Gly Prc Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 145 150 I5s 160

Ser Thr Ser

<210> 61 <211> 698 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 61 ggggagtcag acceagteag gacacagcat ggacatgagg gtcecegete agctcctggg 60 gctcctgctg ctctggctec ceggtgccaa atgtgacatc cágatgaecc agtctccttc 120 çaecctgtet gcatetgtag gagacagagt caccatcact tgccgggcca gtcagagtat 180 tagtaaclgg ttggcctggt ateagçagaa accagggaaa geccctaagc tcctgcteta 249 taaggcatct ggtttagaaa gtggggtcec atcaaggtte agcggcagtg gatetgggac 300 sgaattcaet cteaecatea acagcetgca gcctgatgat tttgcaactt atiactgcca 360 aeagtctsat agttatícgt ggaegttegg ccacgggaee aaggtggaaa tcaaacgtac 420 ggtggctgca ccatctgtct tcafccttecc gccatotgàt gagcagttga aautggaac 480 tgootctgtfc gtgtgcctgc tgaataaett ciatcccaga gaggccaaag tacagtggaa 540 ggtggãtaae gccctceaat cgggtaactç çcaggagagt gtcacagagc aggaeagcaa 600 ggacagcacc tacagcctca gcâgcaccct gaegctgagc asagoagset aegagaaaca 660 caaagtctac gcetgcgaag tcacccatoa gggcctga 698

<210> 62 <211> 223 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62

Met Asp &tet Arg Vai Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp I 5 10 15

Leu Pro Gly Ala Lys Cys Asp Ile Gin Mel Thr Gin Ser Pro Ser Thr 20 25 30 129

Leu Ser Ala Ser Vai Gl? Asp Arg Vâl Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45

Gin Ser lie Ser Ase Irp Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys 5Ô 55 80

Ala Pro lys Leu leu leu Tyr Lys Ala Set Gly Leu Glu Ser Gly Vai 66 70· 75 80

Pro Ser Arg Fhe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Fhe Thr Leu Thr 85 90 95 lie A,sn Ser Leu Gin Fro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 100 105 110

Ser Asn Ser Tyr Ser Trp Thr Phe Gly His Gly Thr Lys Vai Glu Ile 115 320 125

Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro· Ser Vai Fhe Ile Fhe Pro Pro Ser Asp 130 135 140

Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn 145 ISO 155 180

Phs Tyr Fro Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lys Vai Asp Asn Ála Leu 165 170 175

Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp 180 185 190

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 195 200 205

Glu Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gin Gly teu 210 215 220

<210> 63 <211> 630 <212> DNA <213> Homo sapiens 130 <400> 63 130 ítatata ctttttcttg tttsgcaget tcagctatta agcagagctg ggtacgtcct tgatcaggac tgaaeagags tggctatttt aaaaggtgte tacagcctgg ggggtccctg aí gccatgag ctgggtccgc gtggtagtgg tggtagcaea accatctcca gagacaattc caagaacacg gaggacaegg ccgtatatta ctgtgcgaaâ gggiac.it tg actactgggg ccagggaacc ggeecatcgg tcttccecct ggcaecctcc ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc eacattcagt gatcagcact gaacacagac 60 gaacteacca tggagtttgg gctgegctgg 120 cagtgtgagg tgeagctgtt ggagtctggg 180 agactctcct gtgcagcctc tggattcacc 240 caggetccag ggaaggggct ggagtgggtc 300 tãctaegcag actccgtgaa gggccggttc 360 ctgtatetgc aaatgaacâg cctgagagcc 420 gatggggggt aetatggitc gggpgtiat 480 ctggtcaccg tctcctcagc tagcaeeaag 540 teeaagagca ectctggggg eaeagcggce 600 630

<210> 64 <211> 177 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64

Met Glu Phe Gíy Leu Ser Trp Leu 1 5

Vai Gin Cys Glu Vai Gin Leu Leu 20

Pro Gly Gíy Ser Leu Arg Leu Ser 35 40

Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Vai 50 55

Glu Trp Vai Ser Ala íle Ser Gly 85 70 Âsp Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr 85

Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser 100

Phe Leu Vai Ala íle Leu Lys Gly 10 15

Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Glu 25 30 €ys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 45

Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 60

Ser Gly Gly Ser Thr Tyr lyr Ala 75 80

Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 90 95

Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai 105 MO 131

Tyr Tyr Cys Ma iy$ Asp Gly Gly Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Gly 115 120 125

Tyr Phe Asp Tyr T.rp Gly Gin Gly Thr L#u Vai Thr Vai Ser Ser Ala 13# 135 140

Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe gagtacgcgg ggggagtcag agctcctggg gctcctgctg agtctccatc ttccgtgtct gtcagggtat tagcagctgg tcctgatcta tgctggatcc gatttgggac agatttcact actattgtca acaggctagc tcaaacgtac ggtggctgea aatctggaac tgectctgtt tacagtggaa ggtggataac aggacagcaa ggacagcacc acgagaaaca caaagtctac m 165 'Pro

<210> 65 <211> 728 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 65 caagcagtgg taaeaaegca ggacatgagg gtcccegctc atgcgacatc cagatgacee caccatcact tgtcgggcga accagggaaa gcccctaagc atcaaggttc agcggcagtg gcetgaagat tttgcaactt ccaagggacc aaggtggaga gccatctgat gagcagttga ctateccaga gaggecaaag ccaggagagt gtcacagagc gacgctgagc aaagcagact gggcctga 175 acccagtcag gacacagcat 60 ctetggttcc caggttceag 120 ggatctgtag gagacagagt 180 ttagoctggt atcagcagaa 240 agtttgcaaa gtggggtcce 300 cteaceatca gcagcctgca 360 agtttecctc ggacattcgg 420 ccatctgtct tcatcttccc 480 gtgtgectgc tgaataactt 540 gccctccaat cgggtaactc 600 tacagcctca gcagcacect 660 gcctgcgaag tcacceatca 720 728

<210> 66 <211> 223 <212> PRT <213> Homo sapiens 132 <4 Ο Ο> 66

Met Asp Met Arg Vai Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Phe Pro Gly Ser Arg Cys Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Vai Ser Gly Ser Vai Gly Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gin Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gin Gin lys Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Gly Ser Ser Leu Gin Ser Gly Vai 65 70 * 7 o 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 100 105 110 Ala Ser Ser Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile 115 120 125 Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 130 135 140 Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn 145 150 155 160 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu 165 170 175 Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp 180 185 190 Ser Thr tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 195 200 20S Glu lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gin Gly Leu 210 215 220

Lisboa, 29 de Outubro de 2007

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo ou respectivo fragmento funcional para o CD40 humano que tem sequências de aminoácidos da região variável de uma cadeia pesada e da região variável de uma cadeia leve do anticorpo produzido por um hibridoma 4D11 com o N° de acesso da FERM BP-7758.

2. Anticorpo ou respectivo fragmento funcional para o CD40 humano que tem sequências de aminoácidos das porções maduras da região variável de uma cadeia pesada e da região variável de uma cadeia leve do anticorpo produzido por um hibridoma 4D11 com o N° de acesso da FERM BP-7758, que são respectivamente representadas pela ID SEQ NO: 48 e ID SEQ NO: 50.

3. Anticorpo ou respectivo fragmento funcional para o CD40 humano com sequências de aminoácidos que, respectivamente, vão desde a 27a Q até à 147a S da ID SEQ NO: 48 e 23a A até 128a K da ID SEQ NO: 50.

4. Anticorpo ou respectivo fragmento funcional de qualquer uma das Reivindicações 1 até 3, que é um anticorpo humano.

5. Composição farmacêutica que contém, como ingrediente activo, o anticorpo ou respectivo fragmento funcional de qualquer uma das Reivindicações 1 até 4.

6. Composição farmacêutica da Reivindicação 5 que é usada como agente imunossupressor, agente anti-doença autoimune, agente terapêutico contra alergias ou agente terapêutico contra a síndroma de inibição do factor VIII de coagulação do sangue. 2

7. Utilização do anticorpo ou respectivo fragmento funcional de qualquer uma das Reivindicações 1 até 4 para a preparação de uma composição farmacêutica da Reivindicação 6 que é usada como agente imunossupressor, agente anti-doença autoimune, agente terapêutico contra alergias ou agente terapêutico contra a síndroma de inibição do factor VIII de coagulação do sangue.

8. Hibridoma 4D11 com o N° de acesso da FERM BP-7758.

9. Anticorpo ou respectivo fragmento funcional para o CD40 humano produzido por um hibridoma 4D11 com o N° de acesso da FERM BP-7758.

10. Ácido nucleico que codifica a região variável de uma cadeia pesada de um anticorpo isolado de um hibridoma 4D11 com o N° de acesso da FERM BP-7758.

11. Ácido nucleico da Reivindicação 10, que é RNA ou cDNA.

12. Ácido nucleico que codifica a região variável de uma cadeia leve de um anticorpo isolado de um hibridoma 4D11 com o N° de acesso da FERM BP-7758.

13. Ácido nucleico da Reivindicação 12, que é RNA ou cDNA.

14. Vector que contém o ácido nucleico da Reivindicação 10 ou 12.

15. Célula-hospedeiro que contém o ácido nucleico da Reivindicação 10 ou 12. 3

16. Método para preparar um anticorpo ou respectivo fragmento funcional a partir de uma célula-hospedeiro onde foi introduzido um vector que contém o ácido nucleico da Reivindicação 10 ou 12.

17. Anticorpo ou respectivo fragmento funcional para o CD40 humano que tem sequências de aminoácidos das porções maduras da região variável de uma cadeia pesada e da região variável de uma cadeia leve que são codificadas por sequências de ácidos nucleicos isoladas de um hibridoma 4D11, que são respectivamente representadas pela ID SEQ NO: 47 e ID SEQ NO: 49.

18. Anticorpo ou respectivo fragmento funcional para o CD40 humano que tem sequências de aminoácidos codificadas por sequências de ácidos nucleicos que, respectivamente, vão desde a 94a C até à 456a A da ID SEQ NO: 47 e desde a 125a G até à 442a A da ID SEQ NO: 49.

19. Método para preparar um anticorpo ou respectivo fragmento funcional para o CD40 humano a partir de uma célula-hospedeiro onde foi introduzido um vector que contém um ácido nucleico que codifica a região variável de uma cadeia pesada e a região variável de uma cadeia leve do anticorpo isolado de um hibridoma 4D11 com o N° de acesso da FERM BP-7758.

20. Região variável de uma cadeia pesada do anticorpo para o CD40 humano produzido por um hibridoma 4D11 com o N° de acesso da FERM BP-7758. 4

21. Região variável de uma cadeia leve do anticorpo para o CD40 humano produzido por um hibridoma 4D11 com o N° de acesso da FERM BP-7758.

22. Porção madura da região variável de uma cadeia pesada do anticorpo para o CD40 humano, que é representada pela ID SEQ NO: 48.

23. Porção madura da região variável de uma cadeia leve do anticorpo para o CD40 humano, que é representada pela ID SEQ NO: 50. Lisboa, 29 de Outubro de 2007