CN103172743B - 结合cd22的人抗体及其用途 - Google Patents

结合cd22的人抗体及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN103172743B
CN103172743B CN201310052225.7A CN201310052225A CN103172743B CN 103172743 B CN103172743 B CN 103172743B CN 201310052225 A CN201310052225 A CN 201310052225A CN 103172743 B CN103172743 B CN 103172743B
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
seq
sequence
variable region
people
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201310052225.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103172743A (zh
Inventor
D·J·金
A·维特
H·N·勒布朗
R·西奥利斯
A·马苏德
M·亚马那卡
K·D·岑斯
S·R·德威金斯
T·斯普劳尔
C·拉奥-纳伊克
D·帕斯莫尔
K·托伊
D·M·塔那马奇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
E.R. expensive precious & Sheng Si limited liability company is executed
Original Assignee
Medarex LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=39493006&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN103172743(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Medarex LLC filed Critical Medarex LLC
Publication of CN103172743A publication Critical patent/CN103172743A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103172743B publication Critical patent/CN103172743B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6829—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxins or Pseudomonas exotoxin A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1027—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against receptors, cell-surface antigens or cell-surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3061—Blood cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本公开提供了以高亲和力特异地结合CD22的分离的单克隆抗体，特别是人单克隆抗体。还提供了编码本公开的抗体的核酸分子、表达载体、宿主细胞、以及用于表达本公开的抗体的方法。还提供了包括本公开抗体的抗体-配偶体分子缀合物、双特异性分子、以及药物组合物。本公开还提供了使用本公开的抗-CD22抗体检测CD22的方法、连同治疗不同癌症及炎症及自身免疫病症的方法。

Description

结合CD22的人抗体及其用途
本申请为2007年11月30日提交的、发明名称为“结合CD22的人抗体及其用途”的PCT申请PCT/US2007/086152的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2009年7月27日，申请号为200780050465.6。
发明背景
CD22是唾液酸黏附素家族的细胞表面I型的糖蛋白。除其他名称外，CD22在本领域内又称为BL-CAM、B3、Leu-14、以及Lyb-8。CD22最初由抗体抗-S-HCL-1(Schwarting，R.等人(1985)Blood65：974-983)、HD39(Dorken，B.等人(1986)J.Immunol.136：4470-4479)、以及RFB4(Campana，D.等人(1985)J.Immunol.134：1524-1530)进行表征。已确定CD22是结合含α2，6-连接的唾液酸的配体的类凝集素黏附分子，以及B细胞抗原受体(BCR)信号的调节物。从结构上来说，CD22具有多个剪切变体，但是在人中最主要的形式是包含七个免疫球蛋白样结构域的细胞外区。
已经表明CD22由B淋巴细胞特异地表达，并作为B淋巴细胞活化的负性调节物在功能上是重要的(由Nitschke，L.(2005)Curr.Opin.Immunol.17：290-297以及Tedder，T.F.等人(2005)Adv.Immunol.88：1-50综述)。在使用表达不与α2，6-连接的唾液酸配体相互作用的突变的CD22分子的基因靶向性小鼠的研究中，已确定某些功能(诸如细胞表面CD22的表达、IgM及MHC II类在成熟B细胞上的表达、边缘区B细胞群体的维持、最佳的B细胞抗原受体诱导的增殖、以及B细胞更新速率(turnover rate))受CD22配体结合调控，然而其他功能(诸如CD22磷酸化、BCR连接后CD22对钙动员的负性调节、SHP-1向CD22的募集、以及B细胞的迁移)不需要配体的参与(Poe，J.C.等人(2004)Nat.Immunol.5：1078-1087)。
CD22被认为是抑制性共受体，通过设定阻止B细胞的过度刺激的信号阈值而下调BCR信号。通过细胞质的ITIM(基于免疫受体酪氨酸的抑制性基序)磷酸化，随后通过酪氨酸磷酸酶SHP-1或者脂质磷酸酶SHIIP的募集，使这种抑制性共受体发生活化(由Nitschke，L.(2005)Curr.Opin.Immunol.17：290-297综述)。此外，已发现CD22在控制CD19/CD21-Src-家族蛋白酪氨酸激酶(PTK)扩增途径的调节襻中起核心作用，该扩增途径调节基本的信号阈值，并在BCR连接后强化Src-家族激酶的活化(由Tedder，T.F.等人(2005)Adv.Immunol.88：1-50综述)。
大约60％至80％的B细胞恶性肿瘤表达CD22，由此使其成为被动免疫疗法的潜在靶标(参见例如，Cesano，A.和Gayko，U.(2003)Semin.Oncol.30：253-257)。而且，已建议将经CD22靶向的B细胞活性的选择性调谐作为治疗自身免疫病的一种手段(参见例如，请参考Steinfeld，S.D.和Youinou，P.(2006)Expert.Opin.Biol.Ther.6：943-949)。已对一种人源化抗-CD22单克隆抗体，依帕珠单抗(epratuzumab)进行说明(Coleman，M.等人(2003)Clin.Cancer Res.9：3991S-3994S)。然而，仍需要额外的抗-CD22反应物。
概述
本公开提供了分离的单克隆抗体，特别是人单克隆抗体，这些抗体与人CD22相结合并且表现出多种所希望的特性。这些特性包括结合至CD22的高亲和力、内化进入CD22+细胞的能力、介导抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)的能力、促进由B细胞受体(BCR)刺激诱导的Ramos细胞的细胞死亡、和/或当与细胞毒素缀合时抑制表达CD22的细胞在体内的生长。本发明的抗体可被用于，例如，治疗CD22+的B细胞恶性肿瘤和/或治疗不同的炎症或自身免疫病症。
在一方面，本公开涉及分离的人单克隆抗体、或该抗体的抗原结合部分，其中该抗体与人CD22相结合并表现出以下特性中至少一种特性：
(a)内化进入CD22+细胞；
(b)表现出针对CD22+细胞的抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)；
(c)促进由B细胞受体(BCR)刺激而诱导的Ramos细胞的细胞死亡；以及
(d)当缀合至细胞毒素时抑制CD22-表达细胞在体内的生长。在另一个优选实施方案中，该抗体表现出特性(a)、(b)、(c)、以及(d)中至少两种特性。在又一个优选实施方案中，该抗体表现出具有特性(a)、(b)、(c)、以及(d)中三种特性。在另一个实施方案中，该抗体表现出具有特性(a)、(b)、(c)、以及(d)全部四种特性。在某些实施方案中，该抗体对Ramos细胞没有直接的抗增殖作用。在某些实施方案中，该抗体不诱导Ramos细胞中的钙运转。在某些实施方案中，该抗体在Ramos细胞上不介导依赖于补体的细胞毒性(CDC)。优选地，该抗体以高亲和力结合人CD22，如以1×10-7M或更小的KD、或者以1×10-8M或更小的KD、或者以1×10-9M或更小的KD、或者以1×10-10M或更小的KD、或者以7×10-11M或更小的KD。
在另一方面，本公开涉及分离的人单克隆抗体，或其抗原结合部分，其中该抗体与参考抗体(reference antibody)交叉竞争而结合到CD22上，其中该参考抗体包括：
(a)重链可变区，其包括SEQ ID NO：31的氨基酸序列，以及轻链可变区，其包括SEQ ID NO：35的氨基酸序列；或
(b)重链可变区，其包括SEQ ID NO：32或61的氨基酸序列，以及轻链可变区，其包括SEQ ID NO：36的氨基酸序列；或
(c)重链可变区，其包括SEQ ID NO：33的氨基酸序列，以及轻链可变区，其包括SEQ ID NO：37或38的氨基酸序列；或
(d)重链可变区，其包括SEQ ID NO：34的氨基酸序列，以及轻链可变区，其包括SEQ ID NO：39或40的氨基酸序列；或
(e)重链可变区，其包括SEQ ID NO：81的氨基酸序列，以及轻链可变区，其包括SEQ ID NO：84或85的氨基酸序列；或
(f)重链可变区，其包括SEQ ID NO：82或83的氨基酸序列，以及轻链可变区，其包括SEQ ID NO：86的氨基酸序列；
其中该抗体特异地结合人CD22。
在又一方面，本发明涉及分离的单克隆抗体、或该抗体的抗原结合部分，其包括重链可变区，该重链可变区是人VH7-4.1基因、人VH4-34基因、人VH5-51基因、或人VH1-69基因的产物或衍生于所述基因，其中该抗体特异地结合人CD22。在又一方面，本发明涉及分离的单克隆抗体、或该抗体的抗原结合部分，其包括轻链可变区，该轻链可变区是人Vλ2b2基因、人VK L6基因、人VK A27基因、人VK A10基因，或人L18基因的产物或衍生于所述基因，其中该抗体特异地结合人CD22。在又另一方面，本发明涉及分离的抗体，或其抗原结合部分，其包括：
(a)重链可变区，该重链可变区是人VH7-4.1基因的产物或衍生于所述基因，以及轻链可变区，该轻链可变区是人Vλ2b2基因的产物或衍生于所述基因；或者
(b)重链可变区，该重链可变区是人VH4-34基因的产物或衍生于所述基因，以及轻链可变区，该轻链可变区是人VK L6基因的产物或衍生于所述基因；或者
(c)重链可变区，该重链可变区是人VH5-51基因的产物或衍生于所述基因，以及轻链可变区，该轻链可变区是人VK A27或A10基因的产物或衍生于所述基因；
(d)重链可变区，该重链可变区是人VH1-69基因的产物或衍生于所述基因，以及轻链可变区，该轻链可变区是人VK L6基因的产物或衍生于所述基因；或者
(e)重链可变区，该重链可变区是人VH1-69基因的产物或衍生于所述基因，以及轻链可变区，该轻链可变区是人VK L18或A27基因的产物或衍生于所述基因；
其中该抗体特异地结合人CD22。
在另一方面，本公开提供了分离的单克隆抗体、或其抗原结合部分，其包括：
重链可变区，该重链可变区包括CDR1、CDR2、以及CDR3序列；以及轻链可变区，该轻链可变区包括CDR1、CDR2、以及CDR3序列，其中：
(a)该重链可变区CDR3序列包括氨基酸序列，该氨基酸序列选自：SEQ ID NO：9-12以及69-71的氨基酸序列，以及它们的保守性修饰；
(b)该轻链可变区CDR3序列包括氨基酸序列，该氨基酸序列选自：氨基酸序列SEQ ID NO：25-30、78-80，以及它们的保守性修饰；以及
(c)该抗体结合至人CD22上。
在优选的实施方案中，这一抗体也具有以下特征中的一个或多个特征：内化进入CD22+细胞，介导ADCC活力和/或促进由BCR刺激而诱导的Ramos细胞的细胞死亡，和/或当缀合至细胞毒素时抑制表达CD22细胞在体内的生长。
优选地，重链可变区CDR2序列包括选自以下的氨基酸序列：SEQ IDNO：5-8、60、66-68的氨基酸序列，以及它们的保守性修饰；并且轻链可变区CDR2序列包括选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：19-24、75-77的氨基酸序列，以及它们的保守性修饰；
优选地，重链可变区CDR1序列包括选自以下的氨基酸序列：SEQ IDNO：1-4、63-65的氨基酸序列，以及它们的保守性修饰；轻链可变区CDR1序列包括选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：13-18、72-74的氨基酸序列，以及它们的保守性修饰。
优选的组合包括：
(a)重链可变区CDR1，其包括SEQ ID NO：1；
(b)重链可变区CDR2，其包括SEQ ID NO：5；
(c)重链可变区CDR3，其包括SEQ ID NO：9；
(d)轻链可变区CDR1，其包括SEQ ID NO：13；
(e)轻链可变区CDR2，其包括SEQ ID NO：19；以及
(f)轻链可变区CDR3，其包括SEQ ID NO：25。
另一种优选的组合包括：
(a)重链可变区CDR1，其包括SEQ ID NO：2；
(b)重链可变区CDR2，其包括SEQ ID NO：6或60；
(c)重链可变区CDR3，其包括SEQ ID NO：10；
(d)轻链可变区CDR1，其包括SEQ ID NO：14；
(e)轻链可变区CDR2，其包括SEQ ID NO：20；以及
(f)轻链可变区CDR3，其包括SEQ ID NO：26。
另一种优选的组合包括：
(a)重链可变区CDR1，其包括SEQ ID NO：3；
(b)重链可变区CDR2，其包括SEQ ID NO：7；
(c)重链可变区CDR3，其包括SEQ ID NO：11；
(d)轻链可变区CDR1，其包括SEQ ID NO：15或16；
(e)轻链可变区CDR2，其包括SEQ ID NO：21或22；
(f)轻链可变区CDR3，其包括SEQ ID NO：27或28。
另一种优选的组合包括：
(a)重链可变区CDR1，其包括SEQ ID NO：4；
(b)重链可变区CDR2，其包括SEQ ID NO：8；
(c)重链可变区CDR3，其包括SEQ ID NO：12；
(d)轻链可变区CDR1，其包括SEQ ID NO：17或18；
(e)轻链可变区CDR2，其包括SEQ ID NO：23或24；
(f)轻链可变区CDR3，其包括SEQ ID NO：29或30。
另一种优选的组合包括：
(a)重链可变区CDR1，其包括SEQ ID NO：63；
(b)重链可变区CDR2，其包括SEQ ID NO：66；
(c)重链可变区CDR3，其包括SEQ ID NO：69；
(d)轻链可变区CDR1，其包括SEQ ID NO：72或73；
(e)轻链可变区CDR2，其包括SEQ ID NO：75或76；以及(f)轻链可变区CDR3，其包括SEQ ID NO：78或79。
另一种优选的组合包括：
(a)重链可变区CDR1，其包括SEQ ID NO：64或65；
(b)重链可变区CDR2，其包括SEQ ID NO：67或68；
(c)重链可变区CDR3，其包括SEQ ID NO：70或71；
(d)轻链可变区CDR1，其包括SEQ ID NO：74；
(e)轻链可变区CDR2，其包括SEQ ID NO：77；以及；
(f)轻链可变区CDR3，其包括SEQ ID NO：80。
本公开的其他优选抗体，或这些抗体的抗原结合部分包括：
(a)重链可变区，其包括选自以下的氨基酸序列：SEQ IDNO：31-34、61以及81-83；以及
(b)轻链可变区，其包括选自以下的氨基酸序列：SEQ IDNO：35-40以及84-86；
其中该抗体特异地结合人CD22。
一种优选的组合包括：(a)重链可变区，其包括SEQ ID NO：31的氨基酸序列；以及(b)轻链可变区，其包括SEQ ID NO：35的氨基酸序列。
另一种优选的组合包括：(a)重链可变区，其包括SEQ ID NO：32或61的氨基酸序列；以及(b)轻链可变区，其包括SEQ ID NO：36的氨基酸序列。
另一种优选的组合包括：(a)重链可变区，其包括SEQ ID NO：33的氨基酸序列；以及(b)轻链可变区，其包括SEQ ID NO：37或38的氨基酸序列。
另一种优选的组合包括：(a)重链可变区，其包括SEQ ID NO：34的氨基酸序列；以及(b)轻链可变区，其包括SEQ ID NO：39或40的氨基酸序列。
另一种优选的组合包括：(a)重链可变区，其包括SEQ ID NO：81的氨基酸序列；以及(b)轻链可变区，其包括SEQ ID NO：84或85的氨基酸序列。
另一种优选的组合包括：(a)重链可变区，其包括SEQ ID NO：82或83的氨基酸序列；以及(b)轻链可变区，其包括SEQ ID NO：86的氨基酸序列。
在本公开的另一方面，提供了多种抗体、或它们的抗原结合部分，它们与上述抗体中的任何抗体竞争而结合在CD22上。
例如，本公开的抗体可以是全长抗体，例如IgG1或IgG4同种型。可选地，这些抗体可以是抗体片段，例如Fab、Fab’或Fab’2片段，或单链抗体。
本公开还提供了免疫缀合物(immunoconjugate)，其包括连接至治疗剂(例如细胞毒素或放射性同位素)的本公开的抗体、或其抗原结合部分。在特别优选的实施方案中，本发明提供了免疫缀合物，其包含连接至化合物“细胞毒素A”(例如，经硫醇键合)的本公开的抗体，或其抗原结合部分。本公开还提供了双特异性分子，其包含本公开的抗体，或其抗原结合部分，它们连接至第二功能部分，该部分具有不同于所述抗体，或其抗原结合部分的结合特异性。
还提供了包含本公开的抗体、或其抗原结合部分、或免疫缀合物、或双特异性分子以及可药用的载体的组合物。
本公开还包括编码本公开的抗体、或这些抗体的抗原结合部分的核酸分子，以及包括此类核酸的表达载体以及包括此类表达载体的宿主细胞。还提供了使用包括此类表达载体的宿主细胞制备抗-CD22抗体的多种方法，并且可包括的步骤有(i)在宿主细胞中表达抗体以及(ii)从宿主细胞中分离该抗体。
本公开的另一方面涉及抑制表达CD22的肿瘤细胞的生长的方法。方法包括用本发明的抗体，或其抗原结合部分与表达CD22的肿瘤细胞相接触，这样使表达CD22的肿瘤细胞的生长受到抑制。该肿瘤细胞可以是，例如，B细胞淋巴瘤，诸如非霍奇金淋巴瘤。在一些实施方案中，抗体，或其抗原结合部分被缀合至治疗剂上，诸如细胞毒素。
本公开的另一方面涉及治疗受试者的炎症或自身免疫病症的方法。方法包括向受试者施用本发明的抗体，或其抗原结合部分，这样使受试者的炎症或者自体免疫病症得到治疗。自身免疫病症可以是，例如，系统性红斑狼疮或类风湿性关节炎。
本公开还提供了以高亲和性力特异地结合CD22的分离的抗-CD22抗体-配偶体分子缀合物，尤其是包含人单克隆抗体的那些缀合物。此类抗体-配偶体分子缀合物中的某些缀合物能被内化进入表达CD22的细胞中并且能介导抗体依赖性细胞毒作用。本公开也提供利用在此披露的抗-CD22抗体-配偶体分子缀合物治疗癌症，例如B细胞淋巴瘤，如非霍奇金淋巴瘤的方法。
在另一方面，本发明提供了治疗受试者的炎症或自身免疫病症的方法。方法包括向受试者施用本发明的抗体，或其抗原结合部分，这样使受试者的炎症或自身免疫病症得到治疗。优选的自身免疫病症的非限制性实例包括系统性红斑狼疮以及类风湿性关节炎。自身免疫病症的其他实例包括炎症性肠病(包括溃疡性结肠炎以及克隆病)、I型糖尿病、多发性硬化、干燥综合征、自身免疫性甲状腺炎(包括格雷夫斯病以及桥本甲状腺炎)、银屑病以及肾小球肾炎。
还提供了包含本公开的与配偶体分子相缀合的抗体、或其抗原结合部分的组合物。可以有利地与如在此披露的抗体配偶体分子缀合物中的抗体相缀合的配偶体分子包括但不限于：作为药物的分子、毒素、标记分子(例如放射性同位素)、蛋白质、以及治疗剂。还在此披露了包含抗体-配偶体分子缀合物以及可药用的载体的组合物。
在一方面，此类抗体-配偶体分子缀合物通过化学接头被缀合。在某些实施例中，该接头是肽基接头，且在此被描述为(L4)p-F-(L1)m。其它接头包括肼和二硫化物接头，在此分别被描述为(L4)p-H-(L1)m或(L4)p-J-(L1)m。除了被附着在配偶体上的接头之外，本发明还提供了可剪切的连接臂，这些连接臂适于附着至基本上任何分子种类。
另一方面，本发明涉及抑制表达CD22的肿瘤细胞的生长的方法。该方法包括将表达CD22的肿瘤细胞与本公开的抗体-配偶体分子缀合物相接触，这样使CD22-肿瘤细胞的生长受到抑制。在优选的实施方案中，该配偶体分子是治疗剂，例如细胞毒素。尤其优选的表达CD22的肿瘤细胞是B细胞淋巴瘤，例如非霍奇金淋巴瘤。其他类型的表达CD22的肿瘤细胞包括伯基特淋巴瘤以及B细胞慢性淋巴细胞白血病。在又其他实施方案中，表达CD22的肿瘤细胞来自选自以下的癌症：伯基特淋巴瘤以及B细胞慢性淋巴细胞白血病。
在另一方面，本发明涉及治疗受试者癌症的方法。该方法包括向受试者施用本公开的抗体-配偶体分子缀合物，这样使受试者的癌症得到治疗。在优选的实施方案中，该配偶体分子是治疗剂，例如细胞毒素。尤其优选的用于治疗的癌症是B细胞淋巴瘤，例如非霍奇金淋巴瘤。其他类型的癌症包括伯基特淋巴瘤以及B细胞慢性淋巴细胞白血病。
参照下文的非限制性的详细说明与实施例，本公开的其他特征与优点将变得很清楚。在本申请全文中引用的所有参考文献的内容、Genbank登录号、专利、以及已公开的专利申请的内容都明确地通过引用并入本文。
附图简要说明
图1A示出了12C5人单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO：41)、以及氨基酸序列(SEQ ID NO：31)。描绘了CDR1(SEQ ID NO：1)、CDR2(SEQ ID NO：5)、以及CDR3(SEQ ID NO：9)区，并指明了V、D、以及J的种系来源。
图1B示出了12C5人单克隆抗体的λ轻链可变区的核苷酸序列(SEQID NO：45)、以及氨基酸序列(SEQ ID NO：35)。描绘了CDR1(SEQ IDNO：13)、CDR2(SEQ ID NO：19)、以及CDR3(SEQ ID NO：25)区，并指明了V与J的种系来源。
图2A示出了19A3人单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO：42)、以及氨基酸序列(SEQ ID NO：32)，以及CD22.1重组抗体的重链可变区的核苷酸序列以及氨基酸序列。19A3的重链可变区的序列与CD22.1的重链可变区的序列相同。描绘了CDR1(SEQ ID NO：2)、CDR2(SEQ ID NO：6)、以及CDR3(SEQ ID NO：10)区，并指明了V、D、以及J的种系来源。
图2B示出了19A3人单克隆抗体的κ轻链可变区的核苷酸序列(SEQID NO：46)、以及氨基酸序列(SEQ ID NO：36)，以及CD22.1重组人单克隆抗体的κ轻链可变区的核苷酸序列以及氨基酸序列。CD22.1和CD22.2的κ轻链可变区的序列与19A3的κ轻链可变区的序列相同。描绘了CDR1(SEQ ID NO：14)、CDR2(SEQ ID NO：20)、以及CDR3(SEQ ID NO：26)区，并指明了V与J的种系来源。
图2C示出了CD22.2重组人单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO：62)、以及氨基酸序列(SEQ ID NO：61)。描绘了CDR1(SEQ ID NO：2)、CDR2(SEQ ID NO：60)、以及CDR3(SEQ ID NO：10)区，并指明了V与J的种系来源。
图3A示出了16F7人单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO：43)、以及氨基酸序列(SEQ ID NO：33)。描绘了CDR1(SEQ ID NO：3)、CDR2(SEQ ID NO：7)、以及CDR3(SEQ ID NO：11)区，并指明了V、D、以及J的种系来源。
图3B示出了16F7人单克隆抗体的VK.1κ轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO：47)、以及氨基酸序列(SEQ ID NO：37)。描绘了CDR1(SEQ ID NO：15)、CDR2(SEQ ID NO：21)、以及CDR3(SEQ ID NO：27)区，并指明了V、以及J的种系来源。
图3C示出了16F7人单克隆抗体的VK.2κ轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO：48)、以及氨基酸序列(SEQ ID NO：38)。描绘了CDR1(SEQ ID NO：16)、CDR2(SEQ ID NO：22)、以及CDR3(SEQ ID NO：28)区，并指明了V与J的种系来源。
图4A示出了23C6人单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO：44)、以及氨基酸序列(SEQ ID NO：34)。描绘了CDR1(SEQ ID NO：4)、CDR2(SEQ ID NO：8)、以及CDR3(SEQ ID NO：12)区，并指明了V、D、以及J的种系来源。
图4B示出了23C6人单克隆抗体的VK.1κ轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO：49)、以及氨基酸序列(SEQ ID NO：39)。描绘了CDR1(SEQ ID NO：17)、CDR2(SEQ ID NO：23)、以及CDR3(SEQ ID NO：29)区，并指明了V与J的种系来源。
图4C示出了23C6人单克隆抗体的VK.2κ轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO：50)、以及氨基酸序列(SEQ ID NO：40)。描绘了CDR1(SEQ ID NO：18)、CDR2(SEQ ID NO：24)、以及CDR3(SEQ ID NO：30)区，并指明了V与J的种系来源。
图5A示出了12C5的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：31)与人种系VH7-4.1氨基酸序列(SEQ ID NO：51)的比对。
图5B示出了12C5的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：35)与人种系Vλ2b2氨基酸序列(SEQ ID NO：55)的比对。
图6A示出了19A3/CD22.1的重链可变区的氨基酸序列(SEQ IDNO：32)与人种系VH4-34氨基酸序列(SEQ ID NO：52)的比对。
图6B示出了19A3/CD22.1/CD22.2的轻链可变区的氨基酸序列(SEQID NO：36)与人种系VK L6氨基酸序列(SEQ ID NO：56)的比对。
图6C示出了CD22.2的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：61)与人种系VH4-34氨基酸序列(SEQ ID NO：52)的比对。
图7A示出了16F7的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：33)与人种系VH5-51氨基酸序列(SEQ ID NO：53)的比对。
图7B示出了16F7的VK.1轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：37)与人种系VK27氨基酸序列(SEQ ID NO：57)的比对。
图7C示出了16F7的VK.2轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：38)与人种系VK A10氨基酸序列(SEQ ID NO：57)的比对。
图8A示出了23C6的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：34)与人种系VH1-69氨基酸序列(SEQ ID NO：54)的比对。
图8B示出了23C6的VK.1轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：39)和23C6的VK.2轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：40)与人种系VKL6氨基酸序列(SEQ ID NO：56)的比对。
图9是条形图，示出了抗-CD22人抗体12C5、19A3、16F7、以及23C6的内化进入Raji细胞。
图10A是示出了抗-CD22人抗体12C5、19A3、16F7、以及23C6针对Daudi细胞的ADCC活性(由裂解百分数所测量)的图。
图10B是示出了抗-CD22人抗体12C5、19A3、16F7、以及23C6针对Raji细胞的ADCC活性(由裂解百分数所测量)的图。
图11是示出了固定的抗-CD22人抗体12C5、19A3、16F7、以及23C6对BCR刺激的Ramos细胞的作用的条形图，由细胞死亡百分数所测量。
图12是曲线图，该图显示与19A3亲本人抗体相比，由抗-CD22重组人抗体CD22.1及CD22.2与CD22ECD的结合。
图13是曲线图，该图显示了由抗-CD22重组人抗体CD22.1及CD22.2与在CHO细胞表面上所表达的CD22的结合。
图14是曲线图，该图显示了由抗-CD22重组人抗体CD22.1及CD22.2与在Raji细胞表面上所表达的CD22的结合。
图15是条形图，该图显示由抗-CD22抗体12C5、19A3、16F7、以及23C6，以及由重组人抗体CD22.1及CD22.2与CD22ECD氨基末端结构域1及2的结合。
图16显示在SCID小鼠中，抗体-药物缀合物CD22.1-细胞毒素A及CD22.2-细胞毒素A对Raji细胞肿瘤大小的体内作用。
图17A显示4G6人抗体的核苷酸序列(SEQ ID NO：87)与氨基酸序列(SEQ ID NO：81)。描绘了CDR1(SEQ ID NO：63)、CDR2(SEQ IDNO：66)、以及CDR3(SEQ ID NO：69)区，并指明了V、D、以及J的种系来源。
图17B示出了4G6人单克隆抗体的VK1κ轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO：90)与氨基酸序列(SEQ ID NO：84)。描绘了CDR1(SEQID NO：72)、CDR2(SEQ ID NO：75)、以及CDR3(SEQ ID NO：78)区，并指明了V与J的种系来源。
图17C示出了4G6人单克隆抗体的VK2κ轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO：91)、以及氨基酸序列(SEQ ID NO：85)。描绘了CDR1(SEQ ID NO：73)、CDR2(SEQ ID NO：76)、以及CDR3(SEQ ID NO：79)区，并指明了V与J的种系来源。
图18A示出了21F6人单克隆抗体的VH1重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO：88)与氨基酸序列(SEQ ID NO：82)。描绘了CDR1(SEQIDNO：64)、CDR2(SEQ ID NO：67)、以及CDR3(SEQ ID NO：70)区，并指明了V、D、以及J的种系来源。
图18B示出了21F6人单克隆抗体的VH2重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO：89)与氨基酸序列(SEQ ID NO：83)。描绘了CDR1(SEQID NO：65)、CDR2(SEQ ID NO：68)、以及CDR3(SEQ ID NO：71)区，并指明了V、D、以及J的种系来源。
图18C示出了21F6人单克隆抗体的κ轻链可变区的核苷酸序列(SEQID NO：92)与氨基酸序列(SEQ ID NO：86)。描绘了CDR1(SEQ IDNO：74)、CDR2(SEQ ID NO：77)、以及CDR3(SEQ ID NO：80)区，并指明了V与J的种系来源。
图19A示出了4G6的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：81)与人种系VH1-69氨基酸序列(SEQ ID NO：54)的比对。
图19B示出了4G6的VK1κ轻链可变区的氨基酸序列(SEQ IDNO：84)与人种系VK L18氨基酸序列(SEQ ID NO：93)的比对。
图19C示出了4G6的VK2κ轻链可变区的氨基酸序列(SEQ IDNO：85)与人种系VK A27氨基酸序列(SEQ ID NO：57)的比对。
图20A示出了21F6的VH1重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：82)与人种系VH4-34氨基酸序列(SEQ ID NO：52)的比对。
图20B示出了21F6的VH2重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：83)与人种系VH4-34氨基酸序列(SEQ ID NO：52)的比对。
图20C示出了21F6的κ轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：86)与人种系VK L6氨基酸序列(SEQ ID NO：56)的比对。
图21是曲线图，该图显示了由抗-CD22人抗体4G6与在CHO细胞表面表达的CD22的结合。
图22是曲线图，该图显示了由抗-CD22人抗体21F6与在CHO细胞表面表达的CD22的结合。
图23是曲线图，该图显示了由抗-CD22人抗体21F6与在Raii细胞表面表达的CD22的结合。
本公开的详细说明
本公开涉及分离的单克隆抗体，尤其是以高亲和力与人CD22特异性结合的人单克隆抗体。在某些实施方案中，本公开的抗体衍生于特定的重链及轻链种系序列和/或包含特定的结构特征，诸如包括特定氨基酸序列的CDR区。本公开提供分离的抗体、免疫配偶体分子缀合物、双特异性分子、亲和体(affibody)、结构域抗体、纳米抗体、以及unibody，制备所述分子的方法，以及包括所述分子及药物载体的药物组合物。本发明还涉及使用这些分子的方法，诸如检测CD22，以及在与CD22表达有关的或者涉及B细胞调控的疾病或病症中调节B细胞活性，所述疾病或病症诸如CD22+肿瘤以及炎症或者自身免疫病症。本公开还提供了使用本发明的抗-CD22抗体抑制CD22+肿瘤细胞的生长(例如，治疗B细胞淋巴瘤)的方法。另外，本公开提供了使用本公开的抗-CD22抗体治疗炎症或自身免疫病症的方法。
为了使本发明可以更容易地得到理解，首先对一些术语进行了定义。其他定义在整个详细说明中给出。
术语“CD22”、“BL-CAM”、“B3”、“Leu-14”、以及“Lyb-8”可以互换地使用，并包括CD22的变体、同工型(isoform)、以及物种同源物。因此，本公开的人抗体在某些情况下可以与来自除人之外的其他物种的CD22进行交叉反应。在某些实施方案中，这些抗体可以对人CD22具有完全特异性，并可能不显示物种或其他类型的非人交叉反应性。示例性的人CD22的完全氨基酸序列具有Genbank登录号NP_001762(SEQ ID NO：59)。
人CD22序列可与SEQ ID NO：59的人CD22不同，其不同之处在于具有，例如，保守性突变或者在非保守区的突变，并且该CD22具有与SEQID NO：59的人CD22基本上相同的生物学功能。例如，人CD22的生物功能是在CD22的细胞外结构域具有表位，所述表位与本公开的抗体特异地结合，或者人CD22的生物功能是调节BCR信号。
特定的人CD22序列与SEQ ID NO：59的人CD22在氨基酸序列上通常会有至少90％的同一性，并且含有这样的氨基酸残基，当与其他物种(例如鼠类)的CD22氨基酸序列进行比较时，这些氨基酸残基鉴定该氨基酸序列是人的。在某些情况下，人CD22可与SEQ ID NO：59的CD22在氨基酸序列上具有至少95％、或甚至至少96％、97％、98％、或99％的同一性。在某些实施方案中，与SEQ ID NO：59的CD22相比，人CD22序列将展示出将不超过10个氨基酸差异。在某些实施方案中，与SEQ ID NO：59的CD22相比，人CD22可展示出不超过5个、或甚至不超过4个、3个、2个、或1个氨基酸差异。按照在此的说明可以确定同一性百分数。
术语“免疫应答”是指例如，淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞、以及由以上细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子、以及补体)的作用，这些作用导致对侵入性病原体、被病原体感染的细胞或组织、癌性细胞、或者，在自身免疫或病理性炎症情况下的正常人细胞或组织的选择性损害、破坏或从人体中清除。
“信号转导途径”是指在多种信号转导分子之间的生物化学关系，这些信号转导分子在信号从细胞的一部分传递至细胞的另一部分中发挥作用。在此使用的术语“细胞表面受体”包括，例如，能够接受信号并将这种信号传递穿过细胞的质膜的分子及分子的复合物。本公开的“细胞表面受体”的实例是CD22蛋白质。
在此使用的术语“抗体”包括完整的抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或其单链。“抗体”是指至少包括通过二硫键相连接的两条重链(H链)以及两条轻链(L链)或其抗原结合部分的糖蛋白。每一条重链都包括重链可变区(在此缩写为VH)以及重链恒定区组成。该重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2以及CH3。每一条轻链都包括轻链可变区(在此缩写为VL)与轻链恒定区。该轻链恒定区包括一个结构域，CL。VH与VL区域还可再细分出被称为互补决定区(CDR)的高变区，其间散布更为保守的被称为构架区(FR)的区域。每个VH以及VL均由三个CDR以及四个FR构成，按照以下顺序从氨基端至羧基端排布：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链以及轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主的组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(如效应细胞)及经典补体系统的第一组分(C1q)。
在此使用的术语抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)是指保留了与抗原(例如CD22)特异性结合的能力的、抗体的一个或多个片段。已经证实抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来实现。术语抗体的“抗原结合部分”所涵盖的结合性片段的实例包括：(i)Fab片段，即由VL、VH、CL与CH1结构域构成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，即包括在铰链区由二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fab’片段：它实质上是带有一部分铰链区的Fab片段(参见Fundamental Immunology(Paul编著，3.sup.rd ed.1993)；(iv)由VH与CH1结构域构成的Fd片段；(v)由抗体的单臂的VL与VH结构域构成的Fv片段；(vi)由VH结构域构成的dAb片段(Ward等人，(1989)Nature341：544-546)；(vii)分离的互补决定区(CDR)；以及(viii)纳米抗体，即包含单个可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL与VH是由分离的基因编码的，但是可以使用重组方法通过合成接头将它们连接起来，使它们能够形成单蛋白链，其中VL与VH区域配对形成单价分子(已知为单链Fv(scFv)；参见如Bird等人(1988)Science242：423-426以及Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5879-5883)。术语抗体的“抗原结合部分”也旨在涵盖这类单链抗体。这些抗体片段可通过本领域技术人员已知的常规方法获得，并且可以筛选这些片段以获得能够以与完整抗体相同的方式应用的片段。
在此使用的简写“VK”是指κ轻链的可变结构域，而在此使用的“Vλ”是指λ轻链的可变结构域。在此使用的缩写“VL”是指免疫球蛋白轻链的可变结构域并因此包含VK与Vλ轻链二者。
在此使用的“分离的抗体”意指这样的抗体，它基本上不含有其他的具有不同抗原特异性的抗体(例如，特异性结合CD22的分离的抗体是基本上不含有特异性结合除CD22之外的抗原的抗体)。然而，特异性结合CD22的分离的抗体对于其他抗原，例如来自其他物种的CD22分子可具有交叉反应性。此外，分离的抗体可基本上不含有其他细胞材料和/或化学物。
在此使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指具有单一分子组成的抗体分子的制品。单克隆抗体组合物展示出单一的针对特定表位的结合特异性和亲和性。
在此使用的术语“人抗体”旨在包括这样一类抗体：它的可变区中的构架区与CDR区均来自人种系免疫球蛋白序列。此外，如果该抗体包含恒定区，则该恒定区也来自人种系免疫球蛋白序列。本公开的人抗体可以包含不是由人种系免疫球蛋白序列所编码的氨基酸残基(例如，由体外随机诱变或位点-特异性诱变引入的突变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，此处使用的术语“人抗体”并不旨在包括这样的抗体：在该抗体中来自另一哺乳动物物种(如小鼠)的种系的CDR序列被移植到人构架区序列上。
术语“人单克隆抗体”是指显示出单一结合特异性的抗体，该抗体所具有的可变区中构架区与CDR区均来自人种系免疫球蛋白序列。在一个实施方案中，人单克隆抗体由杂交瘤产生，该杂交瘤包括来自转基因非人动物的B细胞，所述转基因动物例如小鼠，具有包含与永生化细胞融合的人重链转基因与轻链转基因的基因组。
在此使用的术语“重组人抗体”包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如：(a)从对于人免疫球蛋白基因来说是转基因或转染色体的动物(如小鼠)中分离的抗体或从制备自上述转基因动物的杂交瘤中分离的抗体(下文将进一步说明)；(b)从被转化而能表达人抗体的宿主细胞(如转染瘤)分离的抗体；(c)从重组的组合人抗体文库分离的抗体；以及(d)通过任何涉及将人类免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的其他方法制备、表达、产生或分离的抗体。这类重组人抗体具有如下可变区，在该可变区中构架区与CDR区来源于人种系免疫球蛋白序列。然而，在某些实施方案中，这类重组人抗体可以经历体外诱变(或者当使用含有人Ig序列的转基因动物时，体内体细胞诱变)，这样一来，该重组抗体的VH与VL区域的氨基酸序列是这样的序列，其尽管来源于人种系VH与VL序列并与人种系VH与VL序列相关，但是并不天然存在于体内人抗体种系库之中。
此处使用的“同种型”是指由重链恒定区基因所编码的抗体类型(例如IgM或IgG1)。
短语“识别抗原的抗体”与“对抗原具有特异性的抗体”在本文中可以与术语“特异性结合抗原的抗体”互换使用。
术语“人抗体衍生物”是指人抗体的任何经修饰的形式，例如，该抗体与另一种物质或抗体的缀合物。
术语“人源化抗体”旨在指以下抗体，其中来自另一哺乳动物物种(如小鼠)的种系的CDR序列被移植到人构架区序列上。可以在人构架区序列中进行额外的构架区修饰。
术语“嵌合抗体”是意指以下抗体，其中可变区序列来自一物种而恒定区序列来自另一物种，例如其中可变区序列来自小鼠抗体而恒定区序列来自人抗体的抗体。
术语“抗体模拟物”意指能模仿抗体结合到抗原上的能力的分子，但其不局限于天然抗体结构。此类抗体模拟物的实例包括但不限于亲和体、DARPin、Anticalin、Avimer、以及Versabody，所有这些抗体模拟物在模拟传统抗体结合时均采用结合结构，它们都产生自不同的作用机理并通过这些不同的机理发挥作用。
在此使用的术语“配偶体分子”是指在抗体-配偶体分子缀合物中与抗体缀合的实体。配偶体分子的实例包括药物、毒素、标记分子(包括但不限于肽及小分子标记物，例如荧光染料标记物，以及单原子标记物，例如放射性同位素)、蛋白质以及治疗剂。
在此使用的“特异地结合人CD22”的抗体意指这样的抗体，它结合人CD22(并且可能是来自一种或多种非人物种的CD22)，但基本上不结合非CD22蛋白。在某些实施方案中，本公开的抗体特异地结合SEQ IDNO：59的人CD22或其变体。优选地，该抗体以1×10-7M或更小的KD结合人CD22，更优选为1×10-8M或更小，更优选为5×10-9M或更小，更优选为1×10-9M或更小，甚至优选为5×10-10M或更少，甚至更优选为7×10-11M或更小。
在此使用的术语“基本上不结合”蛋白质或细胞是指不结合或不以高亲和力结合蛋白或细胞，即，以1×10-6M或更大，更优选为1×10-5M或更大，更优选为1×10-4 M或更大，更优选为1×10-3M或更大，甚至更优选为1×10-2M或更大的KD结合蛋白质或细胞。
在此使用的术语“Kassoc”或“Ka”意指特定的抗体-抗原相互作用的结合速率，其中在此使用的术语“Kdis”或“Kd”意指特定的抗体-抗原相互作用的解离速率。此处使用的术语“KD”意指解离常数，它是由Kd与Ka之比(即Kd/Ka)得到，并被表示为摩尔浓度(M)。抗体的KD值可以用本领域确立的方法测定。确定抗体KD值的优选的方法是通过使用表面等离振子共振，优选使用诸如系统的生物传感器系统。
在此使用的术语针对IgG抗体的“高亲和力”是指对于靶抗原而言，抗体具有的KD值为1×10-7M或更小，更优选为5×10-8M或更小，甚至更优选为1×10-8M或更小，甚至更优选为5×10-9M或更小并且甚至更优选为1×10-9M或更小。然而，对于其他抗体同种型而言，“高亲和力”结合可以发生变化。例如，“高亲和力”结合IgM同种型是指抗体具有的KD值为10-6M或更小，更优选为10-7M或更小，甚至更优选为10-8M或更小。
在此使用的术语“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物及非哺乳动物，例如非人灵长类动物、绵羊、犬、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等等。
符号“-”无论是用作为键或以垂直于键的方式显示，都说明显示部分所在点与分子、固相载体等的其余部分进行连接。
除非另有说明，术语“烷基”其本身或者作为另一个取代基的部分，是指直链、或支链、或环烃基，或其组合，其具有指定数目的碳原子数(即C1-C10是指1至10个碳)，可以是完全饱和的、单不饱和的或多不饱和的，并可以包括二价和多价基。饱和烃基基团的实例包括但不限于以下基团，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基、以及(例如)正戊基、正己基、正庚基、正辛基的同源物或异构体、等等。不饱和烷基基团是具有一个或多个双键或三键的基团。不饱和烷基基团的实例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、丁烯基、2-异戊烯基、2-(丁间二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-丙炔基和3-丙炔基、3-丁炔基，以及更高级同源物及异构体。除非另有说明，术语“烷基”也指包括以下更详细定义的那些烷基的衍生物，例如“杂烷基”。烷基基团(它们限于是烃基团)被称为“同系烷基(homoalkyl)”。
术语“亚烷基”其本身或作为了另一个取代基的部分是指衍生于烷的二价基团，例如但不局限于-CH2CH2CH2CH2-，并且还包括以下描述为“杂亚烷基”的那些基团。通常，烷基(或亚烷基)基团应含有1至24个碳原子，本发明中优选的那些基团应含有10个或更少的碳原子。“低级烷基”或者“低级亚烷基”为短链烷基或者亚烷基基团，一般具有8个或更少的碳原子。
除非另有说明，术语“杂烷基”其本身或者与另一个术语连用是指稳定的直链或支链、或环烃基，或其组合，由所说明数目的碳原予和至少一个杂原子组成，所述杂原子选自O、N、Si、及S，其中氮、碳及硫原子可任选地被氧化，并且该氮杂原子可任选地被季铵化。一个或多个杂原子O、N、S、及Si可位于杂烷基基团的任何内部位置，或可位于烷基基团与该分子的其余部分相连接的位置。实例包括但不限于：-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3、及-CH＝CH-N(CH3)-CH3。高达两个杂原子可是连续的，例如，-CH2-NH-OCH3以及-CH2-O-Si(CH3)3。类似地，术语“杂亚烷基”其本身或者作为另一个取代基的部分，是指衍生于杂烷基的二价基，例如但不局限于，-CH2-CH2-S-CH2-CH2-以及-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。对于杂亚烷基基团，杂原子也可占据链末端的任一端或两端(例如，亚烷氧基、亚烷二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基等)。术语“杂烷基”以及“杂亚烷基”包括聚(乙二醇)及其衍生物(参见例如，Shearwater PolymersCatalog，2001)。此外，对于亚烷基以及杂亚烷基连接基团而言，连接基团的化学式的书写方向不表明连接基团的方向。例如，式-C(O)2R’-同时代表-C(O)2R’-以及-R’C(O)2-。
与术语“烷基”或“杂烷基”连用的术语“低级的”是指具有1至6个碳原子的部分。
术语“烷氧基”、“烷基氨基”、“烷基磺酰基”、及“烷硫基”(或硫代烷氧基)以它们的常规意义使用，并且是指那些通过氧原子、氨基、SO2基团或硫原子分别附着至该分子剩余部分的那些烷基基团。术语“芳基磺酰基”是指通过SO2基团附着至分子剩余部分的芳基分子，且术语“硫氢基”是指SH基团。
一般而言，“酰基取代基”也选自以上给出的组。在此用到的术语“酰基取代基”指附着至羰基碳并使其化合价饱和的基团，该羰基碳直接或间接地附着至本发明的合物的多环核上。
除非另有说明，术语“环烷基”以及“杂环烷基”其本身或者与其他术语连用，分别指环式的取代的或者未取代的“烷基”以及取代的或未取代的“杂烷基”。另外，对于杂环烷基，杂原子可占据杂环与分子残余部分相连接的位置。环烷基的实例包括但不限于环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。杂环烷基的实例包括但不限于1-(1，2，5，6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。环结构的杂原子和碳原子可以任选地被氧化。
除非另有说明，术语“卤”或“卤素”其本身或另一个取代基的部分，是指氟、氯、溴、或碘原子。此外，术语如“卤烷基”是指包括单卤烷基及聚卤烷基。例如，术语“卤(C1-C4)烷基”是指包括但不局限于，三氟甲基、2，2，2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等。
除非另有说明，术语“芳基”是指取代的或未取代的多未饱和的、芳香的、烃取代基，这些取代基可以是单环或稠合在一起或者共价连接的多环(优选1至3个环)。术语“杂芳基”是指芳基基团(或环)，其包含1至4个选自N、O、及S的杂原子，其中氮、碳及硫原子任选地被氧化，且一个或多个氮原子任选地被季铵化。杂芳基基团可通过杂原子附着至该分子的残余部分。芳基和杂芳基基团的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-唑基、4-唑基、2-苯基-4-唑基、5-唑基、3-异唑基、4-异唑基、5-异唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基、以及6-喹啉基。以上提到的芳基和杂芳基环体系中每个体系的取代基均选自以下描述的可接受的取代基。“芳基”及“杂芳基”也包括这样的环状体系，其中一个或多个非芳香性的环状体系被稠合或者另外结合至芳基或杂芳基系上。
简言之，术语“芳基”，当与其他术语(如芳氧基、芳基硫氧基(arylthioxy)、芳烷基)组合使用时，同时包括以上已定义的芳基和杂芳基环。因此，术语“芳烷基”意指包括那些基团，其中芳基基团被附着至烷基基团(例如，苄基、苯乙基、吡啶基甲基等)，包括那些烷基基团，其中碳原子(例如，亚甲基基团)已被，例如氧原子(如苯氧基甲基、2-吡啶基氧基甲基、3-(1-萘氧基)丙基等)置换。
以上术语(例如“烷基”、“杂烷基”、“芳基”和“杂芳基”)中每个术语均包括所示基团的取代和未取代形式。以下提供每一类型基团的优选取代基。
烷基、以及杂烷基基团(包括经常提到的那些基团，例如亚烷基、链烯基、杂亚烷基、杂链烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环链烯基、以及杂环链烯基)的取代基通常分别被称为“烷基取代基”和“杂烷基取代基”，且它们可以是多个基团中一个或多个基团，这些基团选自但不限于，：-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R”’、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R”’、-NR”C(O)2R’、-NR-C(NR’R”R”’)＝NR””、-NR-C(NR’R”)＝NR”’、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-NRSO2R’、-CN以及-NO2，其数量从0至(2m’+1)，其中m’是此类基团中的碳原子总数。R’、R”、R”’以及R””每一个均优选地独立地指氢、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基(例如取代有1至3个卤素的芳基)、取代或未取代的烷基、烷氧基或硫烷氧基基团、或芳烷基基团。当本发明的化合物包括多于一个R基团时，例如，当多于一个的这些基团存在时，每个R基团独立地选择，如对每个R’、R”、R”’以及R””基团选择一样。当R’和R”与同一个氮原子相连时，它们可以与氮原子相结合以形成5、6或7元环。例如，-NR’R”是指包括但不局限于，1-吡咯烷基以及4-吗啉基。从以上取代基的讨论中，本领域的技术人员会明白术语“烷基”意思是包括含有结合至除氢基团以外的基团(例如卤烷基(如-CF3及-CH2CF3)、以及酰基(如-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等))的碳原子的基团。
与描述烷基基团的取代基类似，芳基取代基和杂芳基取代基通常分别被称为“芳基取代基”和“杂芳基取代基”，且这些基团是变化的，并选自例如：卤素、-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R”’、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R”’、-NR”C(O)2R’、-NR-C(NR’R”)＝NR’”、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-NRSO2R’、-CN以及-NO2、-R’、-N3、-CH(Ph)2、氟(C1-C4)烷氧基、以及氟(C1-C4)烷基，其数量从0到芳环体系上开放化合价(open valence)的总数；且其中R’、R”、R”’以及R””优选地独立地选自：氢、(C1-C8)烷基和杂烷基、未取代的芳基和杂芳基、(未取代的芳基)-(C1-C4)烷基、以及(未取代的芳基)氧基-(C1-C4)烷基。当本发明的化合物包括多于一个R基团时，例如，当多于一个的这些基团存在时，每个R基团均独立地进行选择，如同对每个R’、R”、R”’、以及R””进行选择一样。
在芳基或杂芳基环相邻原子上的芳基取代基中的两个可任选地被具有式为-T-C(O)-(CRR’)q-U-的取代基代替，其中，T和U独立地为-NR-、-O-、-CRR’-或单键，并且q为从0到3的整数。可选地，在芳基或杂芳基环的相邻原子上的取代基中的两个取代基可任选地被式-A-(CH2)r-B-的取代基所替换，其中A和B独立地为-CRR’-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR’-、或单键，并且r是从1至4的整数。如此形成的该新环的单键中的一个可能可任选地被双键取代。可选地，在芳基或杂芳基环的相邻原子上的取代基中的两个可任选地被式-(CRR’)s-X-(CR”R”’)d-的取代基所替换，其中s和d独立地为从0至3的整数，并且X是-O-、-NR’-、-S-、-S(O)、-S(O)2-、或-S(O)2NR’-。取代基R、R’、R”以及R”’优选地独立地选自氢或取代的或未取代的(C1-C6)烷基。
在此使用的术语“二磷酸酯”包括但不局限于包含两个磷酸基团的磷酸的酯。术语“三磷酸酯”包括但不局限于包含三个磷酸基团的磷酸的酯。例如，具有二磷酸酯或三磷酸酯的具体药物包括：
在此使用的术语“杂原子”包括氧(O)、氮(N)、硫(S)、以及硅(Si)。
符号“R”是一个通用缩写，它表示一个取代基基团，该基团是选自：取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、以及取代或未取代的杂环基基团。
在以下各分部中进一步详细地说明了本公开的不同方面。
抗-CD22抗体
本公开的抗体的特征为抗体的特定的功能特征或特性。例如，抗体特异地结合人CD22。优选地，本发明的抗体以高亲和力结合人CD22，例如其中KD为1×10-7M或更低。
本公开的抗-CD22抗体优选地显示以下特征中的一种或多种特征：
(a)内化进入CD22+细胞；
(b)针对CD22+细胞表现出抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)；
(c)促进由B细胞受体(BCR)刺激诱导的Ramos细胞的细胞死亡；以及
(d)当缀合至细胞毒素时抑制表达CD22的细胞在体内的生长。
在优选的实施方案中，该抗体表现出特性(a)、(b)、(c)以及(d)中至少两种特性。在又另一个优选实施方案中，该抗体表现出具有特性(a)、(b)、(c)以及(d)中三种特性。在另一个优选实施方案中，该抗体表现出具有特性(a)、(b)、(c)以及(d)全部四种特性。
当本发明的抗-CD22抗体表现出某些功能特性时，在某些实施方案中，抗体的另一个特征是它们不表现出其他特殊的功能特性。例如，在某些实施方案中，该抗体对Ramos细胞没有直接的抗增殖作用。在其他实施方案中，该抗体不诱导Ramos细胞中的钙运转。在又某些实施方案中，该抗体在Ramos细胞上不介导依赖于补体的细胞毒性(CDC)。
值得注意的是，已报道一种人源抗-CD22抗体，epratuzumab，缺乏直接的抗增殖作用以及针对非霍奇金淋巴细胞系的CDC活性，但该抗体的确通过其他手段介导对该细胞系的细胞毒性作用(参见Carnahan，J.等人(2006)Mol.Immunol.44：1331-1341)。
优选地，本发明的抗体以1×10-7M或更少的KD与人CD22相结合，以1×10-8M或更少的KD与人CD22相结合，以5×10-9M或更少的KD与人CD22相结合，以3×10-9M或更少的KD与人CD22相结合，以1×10-9M或更少的KD与人CD22相结合，以5×10-10M或更少的KD与人CD22相结合，或以1×10-10M的KD与人CD22相结合，或以7×10-11M或更少的KD与人CD22相结合。
本领域已知评价该抗体与人CD22相结合的亲和力的标准测定，包括例如，用重组CD22进行ELISA和BIAcore分析(参见实施例3)。实例也提供了评价抗体内化(实施例4)、ADCC活性(实施例5)、促进由BCR刺激诱导的细胞死亡(实施例7)、抗体直接的抗增殖作用(实施例8)、诱导钙运转(实施例6)、以及CDC活性(实施例9)，以及抗体-药物免疫缀合物在体内对实体瘤细胞增殖的抗增殖作用(实施例10)的适宜测定的详细说明。
单克隆抗体12C5、9A3、CD22.1、CD22.2、16F7、23C6、4G6、以 及21F6
本发明优选的抗体是人单克隆抗体12C5、19A3、16F7、23C6、4G6、以及21F6，以及重组人单克隆抗体CD22.1、CD22.2，这些抗体中所有抗体均如实施例1和2中所述被分离并且在结构上进行表征。
12C5、19A3、CD22.1、CD22.2、16F7、23C6、4G6和21F6的VH氨基酸序列分别在SEQ ID NO：31、32、61、33、34、81、82和83中显示，其中19A3以及CD22.1的重链相同且与SEQ ID N O：32相对应，并且21F6的VH重链与SEQ ID NO：82或83相对应。
12C5、19A3、CD22.1、CD22.2、16F7、23C6、4G6、以及21F6的VL氨基酸序列分别在SEQ ID NO：35、36、37、38、39、40、84、85、以86中显示，其中19A3、CD22.1及CD22.2的κ轻链相同且与SEQ ID NO：36相对应，16F7的κ轻链与SEQ ID NO：37或38相对应，23C6的κ轻链与SEQ ID NO：39或40相对应，且4G6的κ轻链与SEQ ID NO：84或85相对应。
如果这些抗体中每一种抗体均能结合CD22，则可将VH和VL序列进行“混合并匹配”，以产生本公开的其他抗-CD22结合分子。可以使用上述以及实施例中所述的结合测定(例如ELISA或流式细胞术)对此类“混合并匹配”的抗体的CD22结合进行检测。优选地，当VH和VL链被混合并且匹配时，来自特定VH/VL对的VH序列被结构上相似的VH序列代替。类似地，优选地来自特定VH/VL对的VL序列被结构上相似的VL序列代替。
因此，在一个方面，本公开提供了分离的单克隆抗体，或其抗原结合部分，包括：
(a)重链可变区，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ IDNO：31-34、61、以及81-83；以及
(b)轻链可变区，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ IDNO：35-40以及84-86；
其中该抗体特异地结合CD22，优选人CD22。
优选的重链及轻链组合，包括：
(a)重链可变区，其包括SEQ ID NO：31的氨基酸序列，以及轻链可变区，其包括SEQ ID NO：35的氨基酸序列；或
(b)重链可变区，其包括SEQ ID NO：32或61的氨基酸序列，以及轻链可变区，其包括SEQ ID NO：36的氨基酸序列；或
(c)重链可变区，其包括SEQ ID NO：33的氨基酸序列，以及轻链可变区，其包括SEQ ID NO：37或38的氨基酸序列；或
(d)重链可变区，其包括SEQ ID NO：34的氨基酸序列，以及轻链可变区，其包括SEQ ID NO：39或40的氨基酸序列；或
(e)重链可变区，其包括SEQ ID NO：81的氨基酸序列，以及轻链可变区，其包括SEQ ID NO：84或85的氨基酸序列；或
(f)重链可变区，其包括SEQ ID NO：82或83的氨基酸序列，以及轻链可变区，其包括SEQ ID NO：86的氨基酸序列。
在另一方面，本公开提供了包括12C5、19A3、CD22.1、CD22.2、16F7、23C6、4G6、21F6的重链及轻链CDR1、CDR2、以及CDR3，或其组合的抗体。
12C5、19A3、CD22.1、CD22.2、16F7、23C6、4G6和21F6的VH CDR1的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：1-4以及63-65中(其中19A3、CD22.1以及CD22.2的VH序列的CDR1相同并示于SEQ ID N O：2中，并且21F6的VH1和VH2序列的CDR1相同并分别示于SEQ ID NO：64及65中。
12C5、19A3、CD22.1、16F7、23C6、CD22.2、4G6和21F6的VH CDR2的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：5-8、60、以及66-68中(其中19A3以及CD22.1的VH序列的CDR2相同并示于SEQ ID N O：6中，CD22.2的VH序列的CDR2示于SEQ ID NO：60中，并且21F6的VH1和VH2序列的CDR2示于SEQ ID NO：67及68中)。
12C5、19A3、CD22.1、CD22.2、16F7、23C6、4G6和21F6的VH CDR3的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：9-12以及69-71中(其中19A3、CD22.1以及CD22.2的VH序列的CDR3相同并示于SEQ ID N O：10中，并且21F6的VH1和VH2序列的CDR3示于SEQ ID NO：70及71中)。
12C5、19A3、CD22.1、CD22.2、16F7、23C6、4G6和21F6的VL CDR1的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：13-18以及72-74中(其中19A3、CD22.1以及CD22.2的VK序列的CDR1相同，并示于SEQ ID NO：14中，16F7的VK.1和VK.2序列的CDR1示于SEQ ID NO：15和16中，23C6的VK.1和VK.2序列的CDR1示于SEQ ID NO：17及18中，并且4G6的VK.1和VK.2序列的CDR1示于SEQ ID NO：72及73中)。
12C5、19A3、CD22.1、CD22.2、16F7、23C6、4G6和21F6的VLCDR2的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：19-24以及75-77中(其中19A3、CD22.1以及CD22.2的VK序列的CDR2相同，并示于SEQ ID N O：20中，16F7的VK.1和VK.2序列的CDR2示于SEQ ID NO：21及22中，23C6的Vκ.1和Vκ.2序列的CDR2示于SEQ ID NO：23及24中，并且4G6的VK.1和VK.2序列的CDR2示于SEQ ID NO：75及76中)。
12C5、19A3、CD22.1、CD22.2、16F7、23C6、4G6和21F6的VLCDR3的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：25-30以及78-80中(其中19A3、CD22.1以及CD22.2的VK序列的CDR3相同，并示于SEQ ID N O：26中，16F7的VK.1和VK.2序列的CDR3示于SEQ ID NOs：27及28中，23C6的Vκ.1和Vκ.2序列的CDR3在SEQ ID NO：29及30中显示，，并且4G6的VK.1和VK.2序列的CDR3示于SEQ ID NOs：78及79中)。
CDR区用Kabat系统进行说明(Kabat，E.A.，等人(1991).Sequencesof Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Healthand Human Services，NIH Publication No.91-3242)。
考虑到在这些抗体中每一种抗体均能够结合CD22、并且抗原结合特异性主要由CDR1、CDR2、及CDR3区提供，因此VH CDR1、CDR2、及CDR3序列以及VL CDR1、CDR2、及CDR3序列可以被“混合并匹配”(即，来自不同抗体的CDR可以被混合并匹配，尽管每种抗体均必须含有VH CDR1、CDR2、及CDR3，以及VL CDR1、CDR2、以及CDR3)，以产生本公开的其他抗-CD22结合分子。可以使用以上及实施例中说明的结合测定(例如，ELISA、分析)检测CD22与此类“混合并匹配”的抗体的结合。优选地，当VH CDR序列被混合并匹配时，来自特定VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列被结构上相似的一个或多个CDR序列代替。类似地，当VL CDR序列被混合并匹配时，来自特定VL序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列可优选地被结构上相似的一个或多个CDR序列代替。对于本领域普通技术人员显而易见的是，对于12C5、19A3、CD22.1、CD22.2、16F7、23C6、4G6以及21F6的单克隆抗体CDR1而言，可以通过将一个或多个VH和/或VL CDR区序列替换为结构上相似的来源于本公开的CDR序列的序列，来产生新的VH和VL序列。
因此，在另一方面，本公开提供了分离的单克隆抗体，或其抗原结合部分，包括：
(a)重链可变区CDR1，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ IDNO：1-4以及63-65；
(b)重链可变区CDR2，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ IDNO：5-8、60以及66-68；以及
(c)重链可变区CDR3，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ IDNO：9-12以及69-71。
(d)轻链可变区CDR1，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ IDNO：13-18以及72-74；
(e)轻链可变区CDR2，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ IDNO：19-24以及75-77；以及
(f)轻链可变区CDR3，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ IDNO：25-30以及78-80；
其中该抗体特异地结合CD22，优选人CD22。
在优选的实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO：1；
(b)重链可变区CDR2，其包含SEQ ID NO：5；
(c)重链可变区CDR3，其包含SEQ ID NO：9；
(d)轻链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO：13；
(e)轻链可变区CDR2，其包含SEQ ID NO：19；以及
(f)轻链可变区CDR3，其包含SEQ ID NO：25。
在另一优选的实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO：2；
(b)重链可变区CDR2，其包含SEQ ID NO：6或60；
(c)重链可变区CDR3，其包含SEQ ID NO：10；
(d)轻链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO：14；
(e)轻链可变区CDR2，其包含SEQ ID NO：20；以及
(f)轻链可变区CDR3，其包含SEQ ID NO：26。
在另一优选的实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO：3；
(b)重链可变区CDR2，其包含SEQ ID NO：7；
(c)重链可变区CDR3，其包含SEQ ID NO：11；
(d)轻链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO：15或16；
(e)轻链可变区CDR2，其包含SEQ ID NO：21或22；以及
(f)轻链可变区CDR3，其包含SEQ ID NO：27或28。
在另一优选的实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO：4；
(b)重链可变区CDR2，其包含SEQ ID NO：8；
(c)重链可变区CDR3，其包含SEQ ID NO：12；
(d)轻链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO：17或18；
(e)轻链可变区CDR2，其包含SEQ ID NO：23或24；以及
(f)轻链可变区CDR3，其包含SEQ ID NO：29或30。
在另一优选的实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO：63；
(b)重链可变区CDR2，其包含SEQ ID NO：66；
(c)重链可变区CDR3，其包含SEQ ID NO：69；
(d)轻链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO：72或73；
(e)轻链可变区CDR2，其包含SEQ ID NO：75或76；以及
(f)轻链可变区CDR3，其包含SEQ ID NO：78或79。
在另一优选的实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO：64或65；
(b)重链可变区CDR2，其包含SEQ ID NO：67或68；
(c)重链可变区CDR3，其包含SEQ ID NO：70或71；
(d)轻链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO：74；
(e)轻链可变区CDR2，其包含SEQ ID NO：77；以及
(f)轻链可变区CDR3，其包含SEQ ID NO：80。
在本领域中熟知的是，独立于一个或多个CDR1和/或CDR2结构域的CDR3结构域单独地能够确定抗体对关联抗原的结合特异性，并且能够可预测地而产生多种抗体，这些抗体具有基于共同的CDR3序列的相同的结合特异性。参见例如，Klimka等人，British J.of Cancer83(2)：252-260(2000)(描述了仅使用鼠类抗CD30抗体Ki-4的重链可变结构域CDR3来产生人源化抗CD30抗体)；Beiboer等人，J.Mol.Biol.296：833-849(2000)(描述了仅使用亲本鼠类MOC-31抗EGP-2抗体的重链CDR3序列重组上皮糖蛋白-2(EGP-2)抗体)；Rader等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95：8910-8915(1998)(描述了使用鼠类抗整联蛋白αvβ3抗体LM609的重链和轻链可变CDR3结构域产生一系列人源化抗整联蛋白αvβ3抗体，其中每一个抗体成员在CDR3结构域之外的序列均不相同并均能与亲本鼠类抗体结合至相同的表位，并且其亲和力与亲本鼠类抗体一样高或比亲本鼠类抗体更高)；Barbas等人，J.Am.Chem.Soc.116：2161-2162(1994)(披露了CDR3结构域对抗原结合的贡献最大)；Barbas等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：2529-2533(1995)(描述了将三个针对人胎盘DNA的Fab(SI-1、SI-40及SI-32)的重链CDR3序列移植至抗破伤风类毒素Fab的重链上，由此替换存在的重链CDR3，并证实CDR3结构域单独就能够赋予结合特异性)；Ditzel等人，J.Immunol.157：739-749(1996)(描述了移植研究，其中仅将亲本多特异性Fab LNA3的重链CDR3转移到结合单特异性IgG破伤风类毒素的Fab p313抗体的重链上，就足以保留亲本Fab的结合特异性)；Berezov等人，BIAjournal8：Scientific Review8(2001)(描述了基于抗HER2单克隆抗体的CDR3的肽模拟物)；Igarashi等人，J.Biochem(Tokyo)117：452-7(1995)(描述了对应于抗磷脂酰丝氨酸抗体的CDR3结构域的一种12个氨基酸的合成多肽)；Bourgeois等人，J.Virol72：807-10(1998)(显示来源于抗呼吸道合胞病毒(RSV)抗体的重链CDR3结构域的单个肽能够在体外中和所述病毒)；Levi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：4374-8(1993)(描述了基于鼠类抗HIV抗体的重链CDR3结构域的肽)；Polymenis和Stoller，J.Immunol.152：5218-5329(1994)(描述了通过移植结合Z-DNA的抗体的重链CDR3区使之能够结合scFv)；以及Xu和Davis，Immunity13：37-45(2000)(描述了重链CDR3的多样性足以使在其他部分上相同的IgM分子在多种半抗原和蛋白抗原之间得到区分)。还参见美国专利号6,951,646；6,914,128；6,090,382；6,818,216；6,156,313；6,827,925；5,833,943；5,762,905以及5,760,185，描述了由单一CDR结构域定义的已获得专利的抗体。这些参考文献中每一篇的全文均通过引用并入本文。
因此，本公开提供包括来自人或非人动物的抗体的一或多个重链和/或轻链CDR3结构域的单克隆抗体，其中该单克隆抗体能特异地结合CD22。在某些方面，本公开提供单克隆抗体，其包含来自于非人抗体(例如小鼠或大鼠抗体)的一个或多个重链和/或轻链CDR3结构域，其中该单克隆抗体能够特异地结合CD22。在一些实施方案中，包括来自非人抗体的一个或多个重链和/或轻链CDR3结构域的此类创新的抗体对相应的亲本非人抗体而言：(a)能够与其竞争而进行结合；(b)保留功能特性；(c)与其结合至相同的表位；和/或(d)与其具有相似的结合亲和力。
在其他方面中，本公开提供了单克隆抗体，其包含来自人抗体(例如，从非人的动物获得的人抗体)的一个或多个重链和/或轻链CDR3结构域，其中该人抗体能特异地结合CD22。在其他方面中，本公开提供了单克隆抗体，其包含来自第一人抗体(例如，从非人的动物获得的人抗体)的一个或多个重链和/或轻链CDR3结构域，其中该第一人抗体能特异地结合CD22，并且其中来自该第一人抗体的CDR3结构域替换了人抗体中的CDR3结构域(该人抗体缺乏对CD22的结合特异性)，以产生能特异地结合至CD22的第二人抗体。在一些实施方案中，包含来自第一人抗体的一个或多个重链和/或轻链CDR3结构域的此类创新的抗体对相应的亲本第一人抗体而言：(a)能够与其竞争而结合；(b)保留其功能特性；(c)与其结合至相同的表位；和/或(d)与其具有相似的结合亲和力。
具有特定种系序列的抗体
在某些实施方案中，本公开的抗体包括来自特定的种系重链免疫球蛋白基因的重链可变区和/或来自特定的种系轻链免疫球蛋白基因的轻链可变区。
例如，在一个优选的实施方案中，本公开提供分离的单克隆抗体、或该抗体的抗原结合部分，包括重链可变区，该重链可变区是人VH7-4.1基因、人VH4-34基因、人VH5-51基因、或人VH1-69基因的产物或衍生于所述基因，其中该抗体特异地结合人CD22。
在另一个优选的实施方案中，本公开提供了分离的单克隆抗体、或该抗体的抗原结合部分，包括轻链可变区，该轻链可变区是人Vλ2b2基因、人VK L6基因、人VK A27基因、人VK A10基因、或人VK L18基因的产物或衍生于所述基因，其中该抗体特异地结合人CD22。
在又一个优选的实施方案中，本公开提供了分离的单克隆抗体，或其抗原结合部分，其中该抗体包括重链可变区(其是人VH7-4.1基因的产物或衍生于所述基因)，并包括轻链可变区(它是人Vλ2b2基因的产物或衍生于所述基因)，其中该抗体特异地结合CD22，优选人CD22。
在又一个优选的实施方案中，本公开提供了分离的单克隆抗体，或其抗原结合部分，其中该抗体包括重链可变区(它是人VH4-34基因的产物或衍生于所述基因)，并包括轻链可变区(它是人VK L6基因的产物或衍生于所述基因)，其中该抗体特异地结合CD22，优选人CD22。
在又一个优选的实施方案中，本公开提供了分离的单克隆抗体，或其抗原结合部分，其中该抗体包括重链可变区(它是人VH5-51基因的产物或衍生于所述基因)，并包括轻链可变区(它是人VK A27或A10基因的产物或衍生于所述基因)，其中该抗体特异地结合CD22，优选人CD22。
在又一个优选的实施方案中，本公开提供了分离的单克隆抗体，或其抗原结合部分，其中该抗体包括重链可变区(它是人VH1-69基因的产物或衍生于所述基因)，并包括轻链可变区(它是人VK L6基因的产物或衍生于所述基因)，其中该抗体特异地结合CD22，优选人CD22。
在又一个优选的实施方案中，本公开提供了分离的单克隆抗体，或其抗原结合部分，其中该抗体包括重链可变区(它是人VH1-69基因的产物或衍生于所述基因)，并包括轻链可变区(它是人VK A27或L18基因的产物或衍生于所述基因)，其中该抗体特异地结合CD22，优选人CD22。
此类抗体也可具有以上详细说明的一种或多种功能特征，例如内化进入CD22+细胞，针对CD22+细胞的ADCC活性和/或促进由BCR刺激细胞毒素诱导的Ramos细胞的细胞死亡。
分别具有VH7-4.1及Vλ2b2的VH及VL的抗体的实例是12C5抗体。分别具有VH4-34及VK L6的VH及VL的抗体的实例是19A3抗体。分别具有VH4-34及VK L6的VH及VL的抗体的另一个实例是CD22.1抗体。分别具有VH4-34及VK L6的VH及VL的抗体的另一个实例是CD22.2抗体，其中VH链包括N57Q突变。分别具有VH4-34及VK L6种系的VH及VL的抗体的另一个实例是21F6抗体。分别具有VH5-51及VK A27或A10的VH及VL的抗体的实例是16F7抗体。分别具有VH1-69及VK L6的VH及VL的抗体的实例是23C6抗体。分别具有VH1-69及VK A27或L18的VH及VL的抗体的实例是4G6抗体。
如在此所用，如果抗体的可变区由使用人种系免疫球蛋白基因的系统获得，则该人抗体包含重链或轻链可变区，它是特定种系序列的“产物“或者“衍生于”该特定种系序列。此类系统包括用所感兴趣的抗原对携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠进行免疫，或者用所感兴趣的抗原对在噬菌体上进行展示的人免疫球蛋白基因文库进行筛选。人抗体是人种系免疫球蛋白序列的“产物”或“衍生于”该序列，其鉴定是通过对人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列进行比较，并选择在序列上最接近(即最大百分数同一性)人抗体的序列的人种系免疫球蛋白序列来进行的。作为特定的人种系免疫球蛋白序列的“产物”或“衍生于”该序列的人抗体，与该种系序列相比，可能含有氨基酸差异，这是由于例如，天然发生的体细胞突变或故意引入的定点突变。但是，经选择的人抗体通常与由人种系免疫球蛋白基因进行编码的氨基酸序列在氨基酸序列上具有至少90％的同一性，并且当与其他物种(例如，鼠类种系序列)的种系免疫球蛋白氨基酸序列进行比较时，含有将该人抗体鉴定为人的氨基酸残基。在某些情况中，人抗体与由该种系免疫球蛋白基因进行编码的氨基酸序列在氨基酸序列上可具有至少95％、或甚至至少96％、97％、98％，或99％的同一性。通常，与由人种系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列相比，衍生于特定的人种系序列的人抗体将展示不超过10个氨基酸差异。在某些情况中，与由种系免疫球蛋白基因进行编码的氨基酸序列相比，该人抗体可展示不超过5个，或甚至不超过4个、3个、2个，或1个的氨基酸差异。
同源抗体
在又一个实施方案中，本公开的抗体包括重链及轻链可变区，所述可变区包括与在此说明的优选抗体的氨基酸序列同源的氨基酸序列，并且其中该抗体保留了本公开的抗-CD22抗体的所希望的功能特性。
例如，本公开提供了分离的单克隆抗体，或其抗原结合部分，包括重链可变区及轻链可变区，其中：
(a)该重链可变区包括氨基酸序列，该氨基酸序列与选自以下氨基酸序列具有至少80％的同源性：SEQ ID NO：31-34、61、以及81-83；
(b)该轻链可变区包括氨基酸序列，该氨基酸序列与选自以下的氨基酸序列具有至少80％的同源性：SEQ ID NO：35-40，以及84-86；
(c)该抗体特异地结合至人CD22上。
额外地或可选地，该抗体可具有以下功能特性中的一种或多种特性：(a)以1×10-7M或更少的KD与人CD22相结合；(b)内化进入CD22+细胞；(c)在CD22+细胞上表现ADCC活性；(d)促进由(例如)BCR刺激诱导的Ramos细胞的细胞死亡；和/或(e)当与细胞毒素缀合时抑制体内表达CD22的细胞的生长。
在不同的实施方案中，该抗体可以是，例如人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
在其他实施方案中，VH和/或VL氨基酸序列可以与以上给出的序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。具有与以上给出的序列的VH与VL区具有高同源性(即，80％或更大)的VH与VL区的抗体，可以通过以下方式获得：对编码SEQ ID NO：41-44、62、或87-89、或SEQ ID NO：45-50或90-92的核酸分子进行诱变(例如，定点诱变或PCR介导的诱变)，接着使用在此说明的功能测定针对保留的功能(即，以上所给出的功能)检测编码出的被改变的抗体。
如在此所用，在两个氨基酸序列之间的百分比同源性等同于在这两个序列之间的百分比同一性。在这两个序列之间的百分比同一性是这些序列共有的相同位置的数目的函数(即，％同源性＝相同位置的#/位置的总#×100)，考虑空位(gap)的数目以及每个空位的长度，它们需要被引入以用于这两条序列的优化比对。如在以下非限制性的实例中所述，使用数学算法能完成序列的比较及在两个序列之间的百分比同一性的确定。
使用E.Meyers及W.Miller(Comput.Appl.Biosci.，4：11-17(1988))的算法可以确定两条氨基酸序列之间的百分比同一性，该算法已经被并入至ALIGN程序(版本2.0)中，该算法使用了PAM120权重残基表(weightresidue table)、空位长度罚分(gap length penalty)12以及空位罚分4。此外，使用Needleman及Wunsch(J.Mol.Biol.48：444-453(1970))算法能确定两条氨基酸序列之间的百分比同一性，该算法已被并入至GCG软件包的GAP程序中(可在www.gcg.com获得)，该算法使用了Blossum62矩阵或PAM250矩阵，以及空位权重16、14、12、10、8、6、或4以及长度权重1、2、3、4、5或6。
额外地或可选地，本公开的蛋白序列能进一步作为“查询序列”来使用，对公开数据库进行检索，从而例如鉴定相关的序列。使用Altschul，等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的XBLAST程序(版本2.0)能进行此类检索。通过XBLAST程序，记分＝50，字长＝3可进行BLAST蛋白检索，以获得与本公开的抗体分子同源的氨基酸序列。为获得用于比较目的的空位比对，如Altschul等人((1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402所述可利用Gapped BLAST。当利用BLAST及GappedBLAST程序时，各个程序(如XBLAST及NBLAST)的默认参数是有用的。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。
具有保守性修饰的抗体
在某些实施方案中，本公开的抗体包含重链可变区(其包含CDR1、CDR2及CDR3序列)，以及轻链可变区(其包含CDR1、CDR2及CDR3序列)，其中这些CDR序列中一个或多个序列包括基于在此说明的优选抗体(例如，12C5、19A3、CD22.1、CD22.2、16F7、23C6、4G6以及21F6)的特定的氨基酸序列，或它们的保守性修饰，并且其中这些抗体保留了本公开的抗-CD22抗体的所希望的功能特性。在本领域中所理解的是，可以进行某些保守性序列修饰，这些保守性序列修饰不会去除抗原结合。参见例如，Brummell等人(1993)Biochem32：1180-8((描述了对沙门氏菌属(Salmonella)特异的抗体的CDR3重链结构域的突变分析；de Wildt等人(1997)Prot.Eng.10：835-41(描述了对抗-UA1抗体的突变研究)；Komissarov等人(1997)J.Biol.Chem.272：26864-26870(表明在HCDR3中间的突变导致亲和力的消失或减退)；Hall等人(1992)J.Immunol.149：1605-12(描述在CDR3区的单个氨基酸的改变使结合活性消失)；Kelley和O’Connell(1993)Biochem.32：6862-35(描述了Tyr残基在抗原结合中的贡献)；Adib-Conquy等人(1998)Int.Immunol.10：341-6(描述了疏水性对结合的影响)、以及Beers等人(2000)Clin.Can.Res.6：2835-43(描述了HCDR3氨基酸突变体)。
因此，本公开提供了分离的单克隆抗体，或其抗原结合部分，其包含含有CDR1、CDR2、以及CDR3序列的重链可变区以及含有CDR1、CDR2、以及CDR3序列的轻链可变区，其中：
(a)重链可变区CDR3序列包括选自以下的氨基酸序列：氨基酸序列SEQ ID NO：9-12、69-71，以及它们的保守性修饰；
(b)轻链可变区CDR3序列包括选自以下的氨基酸序列：氨基酸序列SEQ ID NO：25-30、79-80，以及它们的保守性修饰；以及
(c)该抗体特异地结合至人CD22上。
另外地或可选地，该抗体可具有以下功能特性中的一种或多种特性：(a)以1×10-7M或更少的KD与人CD22相结合；(b)内化进入CD22+细胞；(c)在CD22+细胞上表现ADCC活性；和/或(d)促进由BCR刺激诱导的Ramos细胞的细胞死亡；和/或(e)当与细胞毒素缀合时抑制体内表达CD22的细胞的生长。
在优选的实施方案中，重链可变区CDR2序列包括选自以下的氨基酸序列：氨基酸序列SEQ ID No：5-8、60、66-68，以及它们的保守性修饰；并且轻链可变区CDR2序列包括选自以下的氨基酸序列：氨基酸序列SEQID Nos：19-24、75-77，以及它们的保守性修饰。在另一个优选的实施方案中，重链可变区CDR1序列包括选自以下的氨基酸序列：氨基酸序列SEQID No：1-4、63-65，以及它们的保守性修饰；并且轻链可变区CDR1序列包括选自以下的氨基酸序列：氨基酸序列SEQ ID No：13-18、72-74，以及它们的保守性修饰。
在不同的实施方案中，该抗体可以是例如人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
如在此所使用的术语“保守性序列修饰”意指不会显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。此类保守性修饰包括氨基酸的置换、添加、以及缺失。通过本领域已知的标准技术(例如定点诱变及PCR介导的诱变)可将修饰引入本公开的抗体中。保守性氨基酸置换是如下的置换，其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换。已经在本领域中定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，具有β-支链侧链的氨基酸(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)，以及具有芳香侧链的氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在本公开的抗体的CDR区中的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替代，并且使用在此说明的功能测定可以针对保留功能(即，以上给出的功能)检测被改变的抗体。
结合至与抗-CD22抗体相同的表位的抗体
在另一个实施方案中，本公开提供了下述抗体，所述抗体如本公开的抗-CD22单克隆抗体中的任何抗体所识别的一样结合至人CD22的相同表位(即，这些抗体有能力与本公开的单克隆抗体中的任何抗体进行交叉竞争而与CD22相结合)。在优选的实施方案中，用于交叉竞争研究的参照抗体可以是单克隆抗体12C5(具有的VH与VL序列分别示于SEQ IDNO：31及35)，或单克隆抗体19A3或单克隆抗体CD22.1或单克隆抗体CD22.2(具有的VH与VL序列分别示于SEQ ID NO：32/61及36)或单克隆抗体16F7(具有的VH与VL序列分别示于SEQ ID NO：33及37/38)或单克隆抗体23C6(具有的VH与VL序列分别示于SEQ ID NO：34及39/40)，或单克隆抗体4G6(具有的VH与VL序列分别示于SEQ ID NO：81及84/85)或单克隆抗体21F6(具有的VH与VL序列分别示于SEQ ID NO：82/83及86)。
根据此类交叉竞争的抗体与12C5、19A3、CD22.1、CD22.2、16F7、23C6、4G6及21F6在标准CD22结合测定中进行交叉竞争的能力，能够鉴定此类交叉竞争的抗体。例如，可采用标准ELISA测定，其中将重组的CD22固定在板上，这些抗体之一被进行荧光标记，并评价未标记抗体与标记抗体竞争结合的能力。额外地或可选地，可以使用BIAcore分析来评价抗体的交叉竞争的能力，如实例3所述(与12C5、19A3、CD22.1、CD22.2、16F7、23C6、4G6及21F6的表位定组(epitope grouping)有关)。例如，测试抗体对12C5、19A3、CD22.1、CD22.2、16F7、23C6、4G6以及21F6与人CD22结合的抑制能力说明测试抗体可以与12C5、19A3、CD22.1、CD22.2、16F7、23C6、4G6以及21F6竞争而结合人CD22，并因此与如12C5、19A3、CD22.1、CD22.2、16F7、23C6、4G6以及21F6所识别的一样结合至人CD22的相同表位。如实例3的详细说明，抗体12C5、19A3、CD22.1、CD22.2、16F7、23C6、4G6以及21F6，每一个结合至CD22上的不同表位并因此属于不同的表位群(epitope group)。在一个优选的实施方案中，结合至12C5、19A3、CD22.1、CD22.2、16F7、23C6、4G6以及21F6上相同表位的抗体是人单克隆抗体。如实施例所述，可以对此类人单克隆抗体进行制备并分离。
工程化并修饰的抗体
还可以通过下述方式制备本公开的抗体：使用具有一个或多个在此披露的VH和/或VL序列的抗体作为起始材料，工程化修饰的抗体，这种修饰的抗体可以具有与起始抗体不同的特性。可以通过改变一个或两个可变区(即VH和/或VL)中的一个或多个残基来对抗体进行工程化改造，例如可以改变一个或多个CDR区和/或一个或多个构架区中的残基。额外地或可选地，可以通过改变恒定区中的残基来对抗体进行工程化改造，例如以改变该抗体的一种或多种效应子功能。
在某些实施方式中，可以使用CDR移植以对抗体的可变区进行工程化。抗体和靶抗原主要通过位于六个重链及轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基进行相互作用。因为这一原因，CDR中的氨基酸序列在各个抗体之间比在CDR之外的序列更具有多样性。因为CDR序列负责大部分抗体-抗原相互作用，故可以通过构建包含被移植到构架序列(来自具有不同性质的不同抗体)上的来自特定天然存在抗体的CDR序列的表达载体，来表达模拟该特定天然存在抗体的性质的重组抗体(参见例如，Riechmann，L.等人(1998)Nature332：323-327；Jones，P.等人(1986)Nature321：522-525；Queen，C.等人(1989)Proc.Natl.Acad.See.U.S.A.86：10029-10033；Winter的美国专利号5,225,539，以及Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762及6,180,370)。
因此，本公开的另-个实施方案涉及分离的单克隆抗体，或其抗原结合部分，包括包含CDR1、CDR2、以及CDR3序列的重链可变区，该CDR1、CDR2、以及CDR3序列分别包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：1-4及63-65，SEQ ID N0：5-8、60、及66-68，以及SEQ ID N0：9-12及69-71；并且包括包含CDR1、CDR2、以及CDR3序列的轻链可变区，该CDR1、CDR2、以及CDR3序列、该CDR1、CDR2、以及CDR3序列分别包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID N0：13-18及72-74，SEQ ID N0：19-24及75-77，以及SEQ ID N0：25-30以及78-80。因此，此类抗体含有单克隆抗体12C5、19A3、CD22.1、CD22.2、16F7、23C6、4G6以及21F6的VH及VL CDR序列，但仍有可能含有不同于这些抗体的构架序列。
此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或已公开的文献获得。例如，人重链及轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库中找到(可在互联网www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase获得)，并且在以下文献中找到：Kabat，E.A.，等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242；Tomlinson，I.M.，等人(1992)″The Repertoire of HumanGermline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments withDifferent Hypervariable Loops″J.Mol. Biol.227：776-798；以及Cox，J.P.L.等人(1994)″A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals aStrong Bias in their Usage″Eur.J.Immunol.24：827-836；这些文献的每一篇内容均明确地通过引用并入本文。作为另一个实例，针对人重链及轻链可变区基因的种系DNA序列可以在Genbank数据库中找到。例如，在HCo7HuMAb小鼠中发现的以下重链种系序列及其Genbank登录号是可获得的：1-69(NG_0010109、NT_024637及BC070333)，3-33(NG_0010109及NT_024637)、以及3-7(NG_0010109及NT_024637)。作为另一个实例，在HCo12HuMAb小鼠中发现的以下重链种系序列及其Genbank登录号是可获得的：1-69(NG_0010109、NT_024637及BC070333)，5-51(NG_0010109以及NT_024637)，4-34(NG_0010109及NT_024637)，3-30.3(CAJ556644)、以及3-23(AJ406678)。
可以使用本领域中众所周知的一种被称为Gapped BLAST的序列相似性检索方法(Altschul等人(1997)Nucleic Acids Research25：3389-3402)，将抗体蛋白质序列与汇编的蛋白质序列数据库进行比较。BLAST是启发式算法，其中抗体序列与数据库序列之间的具有统计学显著的比对有可能包括比对字符的高得分区段对(HSP)。其得分不能通过延伸或修剪加以提高的区段对被称为命中物(hit)。简言之，可翻译VBASE源的核苷酸序列(http：//vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase1/list2.php)，并且保留FR1至FR3构架区之间的区域(包括FR1和FR3区)。这些数据库序列具有平均长度98个残基。蛋白全长上完全匹配的重复序列被剔除。蛋白质BLAST检索采用程序blastp、以及缺省标准参数，但关闭低复杂度过滤器并使用BLOSUM62的替代矩阵和用于最高5个命中物的过滤器，从而产生序列匹配。核苷酸序列按全部六种读框翻译，在数据库序列的匹配区段中不具有终止密码子的读框被视为潜在的命中物。这反过来采用BLAST程序tblastx进行确认，该程序按全部六种读框翻译抗体序列，并且将这些翻译物与按全部六种读框动态翻译的VBASE核苷酸序列进行比较。
同一性是在抗体序列与蛋白质数据库之间在序列全长上的确切的氨基酸匹配。阳性(positives)(同一性+替代匹配)是不相同的，而是由BLOSUM62替代矩阵所引导的氨基酸替代。如果抗体序列以一样的同一性匹配数据库序列中的两条序列，则具有最大阳性的命中物将被确定为匹配序列命中物。
在本公开的抗体中使用的优选构架序列是结构上与由本公开的已选择的抗体所使用的构架序列相似的构架序列，例如与由本公开优选的单克隆抗体所使用的VH7-4.1(SEQ ID NO：51)、VH4-34(SEQ ID NO：52)、VH5-51(SEQ ID NO：53)、或VH1-69(SEQ ID NO：54)构架序列和/或Vλ2b2(SEQ ID NO：55)、VK L6(SEQ ID NO：56)、VK A27(SEQ IDNO：57)、VK A10(SEQ ID NO：58)、或VK L18(SEQ ID NO：93)构架序列。这些VH CDR1、CDR2、及CDR3序列，以及VK CDR1、CDR2、及CDR3序列可以被移植至多个构架区上，这些构架区具有与从中衍生出该构架序列的种系免疫球蛋白基因中所发现的序列相同的序列，或者这些CDR序列可以被移植至构架区上，这些构架区与这些种系序列相比含有一个或多个突变。例如，已发现在某些情况下对构架区内的残基进行突变有益处，以保持或增强该抗体的抗原结合能力(例如参见，Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762及6,180,370)。
另一种类型的可变区修饰是在VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3区中对氨基酸残基进行突变，由此改善所感兴趣的抗体的一种或多种结合特性(例如亲和力)。可以进行定向诱变或PCR介导的诱变来引入一种或多种突变，并且对抗体结合、或其他所感兴趣的功能特性的作用可以在体内或体外测定中进行评估，正如在此所说明并在实施例中所提供。优选引入保守性修饰(如以上所讨论)。这些突变可能是氨基酸置换、添加或缺失，但优选是置换。此外，通常在CDR区中对不超过一个、两个、三个、四个或五个残基进行改变。
因此，在另一实施方案中，本公开提供了分离的抗-CD22单克隆抗体，或它们的抗原结合部分，包括重链可变区，该重链可变区包括：(a)VH CDR1区，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：1-4或63-65，或与SEQ IDNO：1-4或63-65相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸置换、缺失、或添加的氨基酸序列；(b)VH CDR2区，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：5-8、60或66-68，或SEQ ID NO：5-8、60或66-68相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸置换、缺失、或添加的氨基酸序列；(c)VH CDR3区，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ IDNO：9-12或69-71，或与SEQ ID NO：9-12或69-71相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸置换、缺失、或添加的氨基酸序列；(d)VLCDR1区，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：13-18或72-74，或与SEQID NO：13-18或72-74相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸置换、缺失、或添加的氨基酸序列；(e)VL CDR2区，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：19-24或75-77，或与SEQ ID NO：19-24或75-77相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸置换、缺失、或添加的氨基酸序列；以及(f)VL CDR3区，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ IDNO：25-30或78-80，或与SEQ ID NO：25-30或78-80相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸置换、缺失、或添加的氨基酸序列。
本公开的工程化抗体包括以下抗体：其中在VH和/或VL内已经对构架残基进行了修饰，从而例如改进抗体的特性。通常对此类构架进行修饰，以降低抗体的免疫原性。例如，一个方法是将一个或多个构架残基“突变回(backmutate)”相应的种系序列。更具体，已经经历了体细胞突变的抗体可能包含与从中衍生出抗体的种系序列不同的构架残基。此类残基可以通过将该抗体构架序列与从中衍生出该抗体的种系序列进行比较而被鉴定。
例如，对于12C5Vλ区而言，构架区氨基酸第40及68位(使用Kabat编号系统)与种系不同。通过进行以下L40Q及R68K置换中的一个或两个置换，这些位置中的一个或两个位置可以被突变回种系序列。
此外，对于19A3及CD22.1VH区而言，构架区氨基酸第27位(使用Kabat编号系统)与种系不同。通过进行以下R27G置换，这一位置可以被突变回种系序列。
此外，对于CD22.2VH区而言，构架区氨基酸第27及57位(使用Kabat编号系统)与种系不同。通过进行以下R27G及Q57N置换，这一位置可以被突变回种系序列。
此外，对于16F7VH区而言，构架区氨基酸第28位(使用Kabat编号系统)与种系不同。通过进行以下N28S置换，这一位置可以被突变回种系序列。
此外，对于16F7VK.2区而言，构架区氨基酸第85位(使用Kabat编号系统)与种系不同。通过进行以下A85T置换，这一位置可以被突变回种系序列。
此外，对于23C6VH区而言，构架区氨基酸第14、79及88位(使用Kabat编号系统)与种系不同。通过进行以下T14P、V79A及A88S置换中的一个、两个或全部三个置换，这些位置中的一个、两个或全部三个位置可以被突变回种系序列。
此外，对于4G6VH区而言，构架区氨基酸位置P、D、F、D、T、Y及F(使用Kabat编号系统)与种系不同。通过进行以下P？A；D？G；N？S；F？Y；D？E；T？S；Y？R；F？S中的一个、两个、三个、四个、五个、六个或全部七个置换，这一位置可以被突变回种系序列。需输入RE：KABAT编号。
此外，对于4G6VK1区而言，构架区氨基酸位置T及D(使用Kabat编号系统)与种系不同。通过进行以下T？K及D？E置换中的一个或两个置换，这些位置可以被突变回种系序列。
此外，对于21F6VH1区而言，构架区氨基酸位置S及I(使用Kabat编号系统)与种系不同。通过进行以下S？P及I？V置换，这些位置可以被突变回种系序列。
此外，对于21F6VH2区而言，构架区氨基酸位置S及M(使用Kabat编号系统)与种系不同。通过进行以下S？P及M？V置换，这些位置可以被突变回种系序列。
另一种类型的构架修饰涉及在构架区内，或甚至在一个或多个CDR区内，对一个或多个残基进行突变，以去除T细胞表位，由此降低该抗体的潜在的免疫原性。这一方法也被称为“去免疫(deimmunization)”，并且在Carr等人的美国专利公开号2003/0153043中有更详细的说明。
除了在构架区或CDR区内进行的修饰之外，或可选地，还可以对本公开的抗体进行工程化，以在Fc区内包含修饰，通常以改变该抗体的一种或多种功能特性，例如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合、和/或抗原依赖的细胞的细胞毒性作用。此外，本公开的抗体可以被化学修饰(例如，可以将一个或多个化学物部分附着至该抗体)或被修饰以改变其糖基化作用，以便再次改变该抗体的一种或多种功能特性。以下对这些实施方案中的每一个均进行另外详细的说明。Fc区中的残基的编号是Kabat的EU索引号。
在一个实施方案中，对CH1的铰链区进行修饰，这样使铰链区中的半胱氨酸残基的数目发生变化(例如，增加或减少)。在Bodmer等人的US专利号5,677,425中更说明了这一方法。CH1的铰链区中的半胱氨酸残基的数目发生变化，例如，便于组装轻链及重链或者增大或减小该抗体的稳定性。
在另一个实施方案中，对抗体的Fc铰链区进行突变以减小该抗体的生物半衰期。更具体地，将一个或多个氨基酸突变引入Fc铰链片段的CH2-CH3结构域的界面区，这样使相对于天然Fc铰链结构域的葡萄球菌A蛋白(Staphylococcyl protein A，SpA)结合而言，该抗体削弱了SpA的结合。Ward等人的US专利号6,165,745更详细地说明了这一方法。
在另一个实施方案中，对该抗体进行修饰以增大其生物半衰期。不同的方法是可能的。例如，如Ward的美国专利号6,277,375所述，引入以下T252L、T254S、T256F突变中的一种或多种突变。可选地，为增大生物半衰期，该抗体可以在CH1或CL区中发生变化以包含从IgG的Fc区的CH2结构域的两个环获得的补救受体(salvage receptor)结合表位，如Presta等人的美国专利号5,869,046及6,121,022所述。
在又其他的实施方案中，通过用不同的氨基酸残基替换至少一个氨基酸残基来改变Fc区，而改变该抗体的一种或多种效应子功能。例如，选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320及322的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸残基所替换，这样使该抗体对于效应物配体具有已改变的亲和力，但保留该亲本抗体的抗原结合能力。例如，亲和力被改变的效应物配体可以是Fc受体或补体的C1成分。Winter等人的美国专利号5,624,821和5,648,260更详细说明了这一方法。
在另一个实例中，选自氨基酸残基329、331及322的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸残基所替换，这样使该抗体具有已改变的C1q结合和/或降低或已消除的依赖于补体的细胞毒性(CDC)。Idusogie等人的美国专利号6,194,551更详细说明了这一方法。
在另一个实例中，改变氨基酸位置231及239中的一个或多个氨基酸，由此改变抗体的固定补体的能力。Bodmer等人的PCT公开文件WO94/29351中进一步说明了这一方法。
在又一个实例中，为了提高该抗体介导抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)的能力和/或提高该抗体对Fcγ受体的亲和性，通过在下列位置修饰一个或多个氨基酸，对Fc区进行了修饰：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。Presta的PCT公开文件WO00/42072中进一步详细地说明了这一方法。此外，在人IgG1上已做出针对FcγR1、FcγRII、FcγRIII及FcRn的结合位点的图谱，并描述了具有改善的结合的变体(参见Shields，R.L.等人(2001)J.Biol.Chem.276：6591-6604)。在位置256、290、298、333、334及339处的特定突变显示出改善对FcγRIII的结合。另外，下列组合突变显示出改善FcγRIII的结合：T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A及S298A/E333A/K334A。.
在再另一个实施方案中，对抗体的糖基化作用进行了修饰。例如，可以制备去糖基化(aglycoslated)的抗体(即，该抗体缺乏糖基化)。可以改变糖基化作用，以(例如)增加该抗体对抗原的亲和性。例如，通过在该抗体序列中改变一个或多个糖基化的位点可以实现此类糖类修饰。例如，可以进行一个或多个氨基酸的置换，这导致去除一个或多个可变区构架糖基化位点，由此在那个位点处消除糖基化作用。这种去糖基化作用可能提高该抗体对抗原的亲和力。Co等人的美国专利号5,714,350及6,350,861进一步详细地说明了这一方法。下述文献还详细描述了另外多种改变糖基化的方法：Hanai等人的美国专利7,214,775、Presta的美国专利号6,737,056、Presta的美国公开号20070020260、Dickey等人的PCT公开号WO/2007/084926、Zhu等人的PCT公开号WO/2006/089294，以及Ravetch等人的PCT公开号WO/2007/055916，上述文献的每一篇全文都以援引的方式纳入本文。
在一个示范性实施方案中，在19A3抗体的VH链的CDR2区内的糖基化位点通过引入N57Q突变(参见实例1)而被消除，以提供具有如SEQID NO：61中所示的VH氨基酸序列的重组抗体CD22.2。
额外地或可选地，可以制备具有改变的糖基化类型的抗体，例如具有减少的岩藻糖残基含量的低岩藻糖化抗体或具有增加的平分型(bisecting)GlcNac结构的抗体。已证实这种改变的糖基化模式可以提高抗体的ADCC能力。例如可以在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体来实现这类糖修饰。具有改变的糖基化机制的细胞在本领域中是已知的，并可被用作表达本发明的重组抗体的宿主细胞，由此产生具有改变的糖基化的抗体。例如，细胞系Ms704、Ms705和Ms709缺乏岩藻糖基转移酶基因，FUT8(α(1，6)岩藻糖转移酶)，使得在Ms704、Ms705和Ms709细胞系中表达的抗体在它们的糖上缺少岩藻糖。Ms704、Ms705和Ms709FUT8-/-细胞系是通过使用两个置换载体对CHO/DG44细胞中的FUT8基因进行靶向破坏而产生的(参见Yamane等人的美国专利公开号20040110704和Yamane-Ohnuki等人(2004)Biotechnol Bioeng87：614-22)。作为另一个实例，Hanai等人的EP1,176,195描述了一种带有被功能性破坏的FUT8基因的细胞系，该基因编码岩藻糖基转移酶，这使得通过减少或消除此α1，6键相关的酶，在这种细胞系中表达的抗体表现出低岩藻糖基化。Hanai等人也描述了这样的细胞系，它们具有低的将岩藻糖添加至与抗体Fc区结合的N-乙酰葡糖胺上的酶活性，或者不具有该酶活性，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL1662)。Presta的PCT公开号WO03/035835描述了一种变体CHO细胞系，Lec13细胞，该细胞系将岩藻糖附着至Asn(297)连结的糖类上的能力降低，这也导致在该宿主细胞系中表达的抗体的低岩藻糖化(还可参见Shields，R.L.等人(2002)J.Biol.Chem.277：26733-26740)。具有经修饰的糖基化模式的抗体也可以在鸡蛋中生产，如美国专利申请号PCT/US06/05853中所描述的。可选地，具有经修饰的糖基化模式的抗体可以在植物细胞(例如浮萍属(Lemna))中生产。在植物系统中用于生产抗体的方法也披露于美国专利申请中，该专利申请对应于Alston & Bird LLP代理参考号040989/314911，于2006年8月11日提交。Umana等人的PCT公开号WO99/54342中描述了经过工程化而表达糖蛋白修饰性糖基转移酶(例如，β(1，4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnTIII))的细胞系，使得在这种工程化细胞系中表达的抗体具有增多的平分型GicNac结构，这导致抗体的ADCC活性提高(还可参见Umana等人(1999)Nat.Biotech.17：176-180)。作为替代，可以使用岩藻糖苷酶切去抗体的岩藻糖残基。例如，岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶从抗体上切去岩藻糖残基(Tarentino，A.L.等人(1975)Biochem.14：5516-23)。
额外地或可选地，可以制备具有被改变的糖基化类型的抗体，其中那种改变涉及抗体的唾液酸化(sialyation)水平。此类改变在Dickey等人的PCT公开号WO/2007/084926及Ravetch等人的PCT公开号WO/2007/055916中有述，以上两篇文献均通过引用以其全文并入。例如，可以采用以唾液酸酶的酶促反应，诸如，例如产脲节杆菌唾液酸酶(Arthrobacter ureafacens)。这一反应的条件通常为如美国专利号5,831,077所述，其全部内容通过引用而并入本文。适宜的酶的其他非限制性实例是神经氨酸酶以及N-糖苷酶F，分别如Schloemer等人，J.Virology，15(4)，882-893(1975)以及Leibiger等人，Biochem J.，338，529-538(1999)所述。去唾液酸化的抗体可以通过使用亲和层析进一步纯化。可选地，可以采用多种方法提高唾液酸化的水平，例如采用唾液酸转移酶。这一反应的条件一般如Basset等人，Scandinavian Journal ofImmunology，51(3)，307-311(2000)所述。
由本公开所考虑的此处的抗体的另一种修饰是聚乙二醇化(pegylation)。对抗体进行聚乙二醇化，以(例如)增加抗体的生物(如，血清)半衰期。为了对抗体进行聚乙二醇化，在其中一个或多个聚乙二醇(PEG)基团附着于该抗体或抗体片段的条件下，通常将该抗体，或其抗体片段与聚乙二醇(PEG)(例如PEG的反应活性酯或醛衍生物)进行反应。优选地，使用反应性的PEG分子(或类似的反应性的水溶性聚合物)，通过酰化反应或烷基化反应进行聚乙二醇化。在此处所用的术语“聚乙二醇”旨在涵盖已用于衍生其他蛋白(例如单(C1-C10)烷氧基聚乙二醇或芳氧基聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺)的PEG的任何形式。在某些实施方案中，有待聚乙二醇化的抗体是去糖基化的抗体。对蛋白进行聚乙二醇化的方法在本领域中是已知的，并可用于本公开的抗体。参见例如，Nishimura等人的EP0154316及Ishikawa等人的EP0401384。
抗体片段和抗体模拟物
本发明不限于传统的抗体，并可通过使用抗体片段及抗体模拟物进行实用。如以下详述，已经开发了多种抗体片段及抗体模拟物技术，且这些片段及技术在本领域内是广泛已知的。虽然这些技术中有一些(例如结构域抗体、纳米抗体、以及UniBody)使用了多种传统抗体结构的片段、或对这些传统抗体结构的其他修饰，但是还存在着多种备选的技术，例如亲和体、DARPin、Anticalin、Avimer、以及Versabody，它们采用了多种结合的结构，这些结构(尽管它们模拟传统的抗体结合)产生于不同的机制并通过这些不同的机制发挥作用。
结构域抗体(dAb)是抗体的最小功能结合单位，对应于人抗体的重链(VH)或轻链(VL)的可变区。结构域抗体的分子量约为13kDa。Domantis已经开发了一系列完全人VH与VL dAb的大而高功能性文库(每一文库中有超过一百亿种不同的序列)，并使用这些文库来选择对治疗靶标特异的dAb。与许多常规抗体不同，结构域抗体在细菌、酵母，以及哺乳动物细胞系统中很好地表达。结构域抗体及其生产方法的其他细节通过引用美国专利6,291,158；6,582,915；6,593,081；6,172,197；6,696,245；美国系列号2004/0110941；欧洲专利申请号1433846以及欧洲专利0368684及0616640；WO05/035572、WO04/101790、WO04/081026、WO04/058821、WO04/003019以及WO03/002609而获得，其中每一项的全文均通过引用并入本文。
纳米抗体(Nanobody)是包含天然存在的重链抗体的独特结构及功能性质的源自抗体的治疗性蛋白质。这些重链抗体包含单一可变区(VHH)和两个恒定区(CH2和CH3)。重要的是，该经克隆并分离的VHH域是携带原始重链抗体的全部抗原结合能力的、完全稳定的多肽。纳米抗体与人抗体的VH区具有高同源性，并可进一步被人源化而不会损失任何活性。重要的是，纳米抗体具有低免疫原性潜力，这在使用源自纳米抗体先锋化合物的灵长类动物研究中已得到证实。
纳米抗体将常规抗体的优点与小分子药物的重要特征相结合。与常规抗体类似，纳米抗体显示出高靶特异性，对其靶的高亲和性及低固有毒性。然而，与小分子药物类似的是，它们能够抑制酶类并容易接近受体裂隙。此外，纳米抗体非常稳定，可以通过注射之外的方法给药(例如，参见WO2004/041867，其全文通过引用结合在此)，并且易于制造。纳米抗体的其他优点包括由于其尺寸小而可以识别不常见的或隐藏的表位，由于其独特的三维的、药物形式的柔性，而可以以高亲和性及选择性结合入蛋白靶的腔或活性位点、可以适应性调整(tailor)半衰期和容易及快速地实现药物开发。
纳米抗体由单基因进行编码，并在几乎全部的原核宿主和真核宿主中都能被有效生产，所述宿主例如是大肠杆菌(E.coli)(例如，参见US6,765,087，其全文通过引用结合在此)、霉菌(例如曲霉属(Aspergillus)或木霉属(Trichoderma))和酵母(例如酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、汉逊酵母属(Hansenula)或毕赤酵母属(Pichia))(例如，参见US6,838,254，其全文通过引用结合在此)。该生产过程可以放大规模，且已经生产了几千克量的纳米抗体。由于纳米抗体比常规抗体的稳定性高，所以它们可被配制成保质期长，立即可用型(ready-to-use)溶液。
纳米克隆(nanoclone)方法(例如，参见WO06/079372，其全文通过引用结合在此)是一种用于产生抗所希望的靶的纳米抗体的专利方法，它基于B细胞的自动高通量选择来进行，并且能够在本发明的情况中使用。
UniBody是另一种抗体片段技术，然而它基于的是IgG4抗体的铰链区的移除。删除铰链区得到基本上是传统IgG4抗体一半尺寸的分子，并且该分子具有单价结合区而不是IgG4抗体的二价结合区。已熟知的是，lgG4抗体是惰性的，并因此不与免疫系统相互作用，这对于不希望发生免疫反应的疾病的治疗可能是有利的，而这一优势被传递至UniBody。例如，UniBody的功能可以是抑制或沉默它们所结合的细胞但不会杀死该细胞。此外，与癌细胞结合的UniBody不会刺激它们增殖。此外，因为UniBbody只有传统IgG4抗体的大约一半尺寸，因此它们可以在较大的实体瘤上显示出更好的分布，具有潜在的有利功效。UniBbody从体内清除的速度与完整的IgG4抗体相似，且它们与其抗原结合的亲和性也与完整IgG4抗体相似。Unibody的更多细节可通过参考专利申请WO2007/059782号而获得，其全文通过引用结合在此。
Affibody分子代表了一类新的亲和性蛋白，基于来自葡萄球菌A蛋白的一个IgG结合结构域的58个氨基酸残基的蛋白域。这个三螺旋束结构域已被作为支架用于构建组合的噬菌粒文库(combinatorial phagemidlibrary)，使用噬菌体展示技术可从该文库中选择靶向期望分子的Affibody变体(Nord K，Gunneriusson E，Ringdahl J，Stahl S，Uhlen M，Nygren PA，Binding proteins selected from combinatorial libraries of an α-helicalbacterial receptor domain，Nat Biotechnol1997；15：772-7.Ronmark J，Gronlund H，Uhlen M，Nygren PA，Human immunoglobulin A(IgA)-specific ligands from combinatorial engineering of protein A，Eur JBiochem2002；269：2647-55.)。Affibody分子的结构简单坚固并且它们的分子量低(6kDa)，这使它们适于各种广泛的应用，如检测试剂(Ronmark J，Hansson M，Nguyen T，等人，Construction and characterization ofaffibody-Fc chimeras produced in Escherichia coli，J Immunol Methods2002；261：199-211)以及抑制受体相互作用(Sandstorm K，Xu Z，Forsberg G，Nygren PA，Inhibition of the CD28-CD80 co-stimulation signal by aCD28-binding Affibody ligand developed by combinatorial proteinengineering，Protein Eng2003；16：691-7)。Affibody及其生产的方法的更多细节可参考美国专利号5,831,012而获得，其全文通过引用结合在此。
标记的Affibody对于用于确定同种型的丰度的成像应用也可以是有用的。
DARPin(设计的锚蛋白重复序列蛋白)是抗体模拟物DRP(设计的重复序列蛋白)技术的一个实例，该技术已被开发用于研究非抗体多肽的结合能力。重复序列蛋白，例如锚蛋白或富含亮氨酸的重复序列蛋白，是普遍存在的结合分子，与抗体不同，它们出现在细胞内和细胞外。它们独特的模块结构以重复结构单元(重复序列)为特征，这些单元堆叠在一起以形成延长的重复域，从而展示出可变的模块靶结合表面。基于该模块性，可以生成具有高度多样性的结合特异性的多肽组合文库。该策略包括对展示可变表面残基的自相容重复序列(self-compatible repeat)的共有设计并将它们随机组装成重复域。
DARPin可以在细菌表达系统中以相当高的产率生产，且它们属于已知的最稳定的蛋白质。已经针对广泛靶蛋白选择出了高特异性、高亲和性的DARPin，所述靶蛋白包括人类受体、细胞因子、激酶、人类蛋白酶、病毒和膜蛋白。可以获得亲和性为一位数纳摩尔至一位数皮摩尔的DARPin。
DARPin已被用于广泛的应用中，包括ELISA、夹心ELISA、流式细胞术分析(FACS)、免疫组织化学分析(IHC)、芯片应用、亲和纯化或蛋白质印迹。还证明了DARPin在胞内区室中具有高活性，例如作为胞内标记物蛋白融合至绿色荧光蛋白(GFP)时。DARPin还被用于抑制病毒进入，其IC50在pM范围内。DARPin不仅在阻断蛋白-蛋白相互作用方面十分理想，还可用于抑制酶类。已经成功地抑制了蛋白酶、激酶和转运蛋白，最通常是通过别构抑制模式。由于非常快速并特异的在肿瘤上的富集以及非常有利的肿瘤与血液的比例，使DARPin非常适于体内诊断或治疗方法。
有关DARPin和其他DRP技术的另外的信息在美国专利申请公开号2004/0132028和国际专利申请公开号WO02/20565中均可找到，它们的全文均通过引用结合在此。
Anticalin是另一种抗体模拟技术，然而在这种情况下，结合的特异性是源自脂笼蛋白，一种在人体组织和体液中天然地丰富地表达的低分子量蛋白家族。脂笼蛋白已经进化成在体内具有与化学敏感或不溶性化合物的生理运输和存储有关的多种功能。脂笼蛋白具有坚固的内在结构，包括高度保守的β-桶，其支持着蛋白质一端的四个环。这些环形成结合口袋的入口，并且分子这一部分的构象差异是不同脂笼蛋白之间的结合特异性变化的原因。
尽管由保守的β-片层构架支持的超变环的整体结构能够让人联想起免疫球蛋白，然而脂笼蛋白与抗体在大小上存在显著差异，它由160至180个氨基酸的单一多肽链构成，微微地大于单个免疫球蛋白结构域。
对脂笼蛋白进行克隆，并使它们的环经受工程化处理以便产生Anticalin。已经生成了在结构上多样的Anticalin的文库，并且Anticalin的展示允许对结合功能进行选择和筛选，随后在原核或真核体系中通过表达和生成可溶蛋白质以进一步分析。多项研究已经成功地证明对几乎任何人类靶蛋白都可以开发出特异性的Anticalin，可以将其分离，并且可以获得在纳摩尔或更高范围内的结合亲和性。
Anticalin还可以形成双靶向性蛋白的形式，这被称为Duocalin。使用标准的生产方法，Duocalin可以在易于生产的一个单体蛋白质中结合两种不同的治疗性靶标，同时保持靶特异性和亲和性，而无论它的两个结合结构域的结构取向如何。
通过单个分子对多个靶标进行调节在已知涉及不止一种致病因子的疾病中特别有优势。此外，例如Duocalin等二价或多价结合形式在靶向疾病的细胞表面分子、通过细胞表面受体的结合和集簇来介导对信号转导途径的激动剂效应或诱导增强的内化效应方面具有显著的潜力。此外，Duocalin的高固有稳定性与单体Anticalin相似，这使得Duocalin具有灵活的配制和送递潜力。
关于Anticalin的另外信息可以在美国专利号7,250,297和国际专利申请公开号WO99/16873中找到，其全文均通过引用结合在此。
Avimers是可用于本发明的另一种抗体模拟技术。Avimers由人细胞外受体域大家族通过体外的外显子改组和噬菌体展示而演化而来，产生具有结合和抑制性质的多域蛋白。已经显示出连接多种独立的结合结构域可以产生亲和力，且与传统的单表位结合蛋白比较，这种连接导致改善的亲和性和特异性。其他潜在的优点包括在大肠杆菌中简单且有效地生成多靶特异性的分子，改善的热稳定性及对蛋白酶的抵抗力。已经得到了针对多种靶的具有亚纳摩尔亲和性的Avimers。
关于Avimers的另外信息可在美国专利申请公开号2006/0286603、2006/0234299、2006/0223114、2006/0177831、2006/0008844、2005/0221384、2005/0164301、2005/0089932、2005/0053973、2005/0048512、2004/0175756中找到，它们所有的全文均通过引用结合在此。
Versabody是可用于本发明背景的另一种抗体模拟技术。Versabody是具有大于15％的半胱氨酸的小蛋白(3至5kDa)，它形成高二硫键密度的支架，从而代替典型蛋白质所具有的疏水核芯。这种用少量的二硫键替换大量疏水性氨基酸(包括疏水核)，将使得蛋白质更小，更加亲水(聚集和非特异性结合更少)，对于蛋白酶和热具有更大的抵抗力，且具有较低密度的T细胞表位，这是因为对MHC呈递贡献最多的残基是疏水性的。这些性质中的全部四种都熟知会影响免疫原性，并预期它们一起将导致免疫原性大幅度降低。
Versabody的启示来自于水蛭、蛇、蜘蛛、蝎子、蜗牛，和海葵(anemone)产生的天然可注射生物药剂，已知这些生物药剂可以表现出预料不到的低免疫原性。从经选择的天然蛋白质家族出发，通过设计和筛选，可以将尺寸、疏水性、蛋白水解性抗原加工、和表位密度都最小化至远远低于天然可注射蛋白质的平均值的水平。
鉴于Versabody的结构，这些抗体模拟物可以提供多种多样的形式，包括多价、多特异性、多样化的半衰期机制、组织靶向模块和抗体Fc区的缺乏。此外，Versabody可以在大肠杆菌中以高产率生产，且由于它们的亲水性和小尺寸，Versabody高度可溶，并能够被配制成高浓度。Versabody极具热稳定性(它们可被煮沸)，并具有长的保质期。
关于Versabody的另外信息可在美国专利申请公开号2007/0191272中找到，其全文通过引用结合在此。
以上提供的抗体片段和抗体模拟技术的详细说明并非旨在成为可在本说明书的上下文中使用的所有技术的全面列表。例如，但并非作为限制，多种另外的技术，包括备选的基于多肽的技术，如在Qui等人，NatureBiotechnology，25(8)921-929(2007))中概述的互补决定区的融合(其全文通过引用结合在此)，以及基于核酸的技术，如在美国专利号5,789,157；5,864,026；5,712,375；5,763,566；6,013,443；6,376,474；6,613,526；6,114,120；6,261,774和6,387,620中描述的RNA适体技术(这些文献全部均通过引用结合在此)，都可用于本发明中。
抗体的物理特性
本公开的抗体还可以通过CD22抗体的多种物理特性来表征。可以使用多种测定基于这些物理性质来检测和/或区分不同类型的抗体。
在一些实施方案中，本公开的抗体可在重链或轻链可变区中含有一个或多个糖基化位点。在可变区中一个或多个糖基化位点的存在可导致抗体的免疫原性提高或抗体的pK值发生变化，这是因为抗原结合的改变(Marshall等人(1972)Annu Rev Biochem41：673-702；Gala FA和Morrison SL(2004)J Immunol172：5489-94；Wallick等人(1988)J Exp Med168：1099-109；Spiro RG(2002)Glycobiology12：43R-56R；Parekh等人(1985)Nature316：452-7；Mimura等人(2000)Mol Immunol37：697-706)。已知糖基化会发生在含有N-X-S/T序列的基序中。可以使用Glycoblot测定来检测可变区的糖基化，在该测试法中抗体被切割产生Fab，并接着使用测量高碘酸盐氧化和Schiff碱形成的测定来检测糖基化。备选地，可以使用Dionex光色谱(Dionex-LC)来检测可变区的糖基化，其中将来自Fab的糖切割为单糖并分析每种糖的含量。在某些情况下，优选具有不包含可变区糖基化的抗CD22抗体。这可以通过选择在可变区中不含有糖基化基序的抗体，或者通过使用本领域熟知的标准技术突变该糖基化基序中的残基来实现。
在优选的实施方案中，本公开的抗体不合有天冬酰胺同分异构位点。在N-G序列或D-G序列上可以分别发生脱酰胺或异天冬氨酸效应。脱酰胺或异天冬氨酸效应导致生成异天冬氨酸，这通过在侧链羧基端而不是主链上生成一个扭结结构从而降低抗体的稳定性。可以通过使用iso-quant测定来测量异天冬氨酸的产生，该测定使用反相HPLC来检测异天冬氨酸。
每种抗体都具有独特的等电点(pI)，但是抗体通常都落在pH6至9.5之间的范围内。IgG1抗体的pI通常落在pH7-9.5的范围内，且IgG4抗体的pI通常落在pH6-8的范围内。抗体可能具有上述范围之外的pI值。虽然该效应通常并不清楚，但是推测pI在正常范围之外的抗体在体内条件下可能会有一定的解折叠(unfolding)和不稳定性。可以使用毛细管等电聚焦测定来测量等电点，该测定法产生一个pH梯度，并可以使用激光聚焦来提高准确性(Janini等人(2002)Electrophoresis23：1605-11；Ma等人(2001)Chromatographia53：S75-89；Hunt等人(1998)J Chromatogr A800：355-67)。在某些情况下，优选使用pI值落在正常范围内的抗CD22抗体。这可以通过选择pI值在正常范围内的抗体，或者通过使用本领域熟知的标准技术突变带电荷的表面残基来实现。
每种抗体都有解链温度(melting temperature)，这是热稳定性的指标(Krishnamurthy R和Manning MC(2002)Curr Pharm Biotechnol3：361-71)。较高的热稳定性表明抗体在体内的总体稳定性较好。可以使用诸如差示扫描量热法等技术来测量抗体的解链温度(Chen等人(2003)Pharm Res20：1952-60；Ghirlando等人(1999)Immunol Lett68：47-52)。TM1表示抗体开始解折叠的温度。TM2表示抗体完全解折叠的温度。通常优选地，本公开抗体的TM1高于60℃，优选地高于65℃，甚至更优选地高于70℃。备选地，可以使用圆二色性来测量抗体的热稳定性(Murray等人(2002)J.Chromatogr Sci40：343-9)。
在优选的实施方案中，选择不会快速降解的抗体。可以使用本领域充分理解的毛细管电泳(CE)和MALDI-MS来测量抗CD22抗体的片段化(Alexander AJ和Hughes DE(1995)Anal Chem67：3626-32)。
在另一个优选的实施方案中，选择具有最小聚集效应的抗体。聚集可能导致引发不需要的免疫反应和/或变化的或不良的药代动力学性质。通常，可接受的抗体的聚集度为25％或更低，优选地20％或更低，甚至更优选地为15％或更低，甚至更优选地为10％或更低，并甚至更优选地为5％或更低。可以使用本领域熟知的几种技术来测量聚集以识别单体、二聚体、三聚体或多聚体，所述技术包括大小排阻色谱(SEC)、高效液相色谱(HPLC)，和光散射法。
工程化抗体的方法
如上所述，通过修饰VH和/或VL序列，或其附着的一个或多个恒定区，可以使用具有在此披露的VH和VL序列的抗-CD22抗体以产生新的抗-CD22抗体。因此，在本公开的另一方面，使用本公开的抗-CD22抗体(例如12C5、19A3、CD22.1、CD22.2、16F7、23C6、4G6及21F6)的结构特征，用于产生在结构上相关的抗-CD22抗体，该抗体保留了本公开抗体的至少一种功能特性，例如结合人CD22。例如，如以上所讨论，可以将12C5、19A3、CD22.1、CD22.2、16F7、23C6、4G6及21F6的一个或多个CDR区、或它们的突变与已知的构架区和/或其他CDR重组地组合，以产生额外的重组工程化的本公开的抗-CD22抗体。其他类型的修饰包括上节中说明的那些修饰。用于工程化方法的起始材料是在此提供的VH和/或VL序列中的一个或多个序列，或它们的一个或多个CDR区。为产生工程化的抗体，不必实际地制出一种抗体(即，表达成一种蛋白)，该抗体具有在此提供的VH和/或VL序列中的一个或多个序列、或它们的一个或多个CDR区。相反，使用这个或这些序列中包括的信息作为起始材料，生成衍生于一个或多个原始的序列的“第二代”序列，并接着制备这个或这些“第二代”序列，并将其表达成蛋白。
因此，在另一个实施方案中，本公开提供了制备抗-CD22抗体的方法，其包括：
(a)提供：(i)重链可变区抗体序列，其包括：选自SEQ ID NO：1-4以及63-65的CDR1序列；选自SEQ ID NO：5-8、60、以及66-68的CDR2序列，和/或选自SEQ ID NO：9-12以及69-71的CDR3序列；和/或(ii)轻链可变区抗体序列，其包括：选自SEQ ID NO：13-18以及72-74的CDR1序列；选自SEQ ID NO：19-24以及75-77的CDR2序列；和/或选自SEQ IDNO：25-30以及78-80的CDR3序列；
(b)改变在重链可变区抗体序列和/或轻链可变区抗体序列中的至少一个氨基酸残基，以产生至少一种被改变的抗体序列；并且
(c)将该被改变的抗体序列表达成蛋白质。
例如，可以使用标准的分子生物学技术来制备并表达该被改变的抗体序列。
优选地，由被改变的一种或多种抗体序列进行编码的抗体是这样的一种抗体，它保留了在此说明的抗-CD22抗体的一种、一些或全部功能特性，该功能特性包括但不限于：
(a)内化进入CD22+细胞；
(b)在CD22+细胞上表现ADCC活性；
(c)增强由BCR刺激而诱导的Ramos细胞的细胞死亡；
(d)对Ramos细胞不具有直接的抗增殖作用；
(d)不诱导Ramos细胞中的钙运转；
(e)不介导Ramos细胞上的CDC活性；和/或
(f)当与细胞毒素缀合时抑制表达CD22的细胞在体内的生长。
使用本领域可获得的和/或在此所述的标准测定(例如实施例中所给的测定)评估被改变的抗体的功能特性。
在本公开的工程化抗体的方法的某些实施方案中，可以沿抗-CD22抗体编码序列的全长或一部分随机地或选择性地引入突变，并针对结合活性和/或在此说明的其他功能特性对得到的经修饰的抗-CD22抗体进行筛选。在本领域中已经说明了多种突变的方法。例如，Short的PCT公开号WO02/092780说明了使用饱和诱变、合成连接装配、或它们的组合来生成并筛选抗体突变的方法。可选地，Lazar等人的PCT公开号WO03/074679说明了使用计算机筛选方法优化抗体的生理化学特性的方法。
编码本公开的抗体的核酸分子
本公开的另一个方面涉及编码本公开的抗体的核酸分子。这些核酸可能存在于整个细胞中、细胞裂解液中、或者以部分纯化或基本上纯的形式存在。当通过标准技术(包括碱/SDS处理，CsCI成带、柱层析法、琼脂糖凝胶电泳以及本领域的其他熟知技术)从其他细胞成分或其他污染物(例如，其他细胞核酸或蛋白)中纯化出核酸时，核酸是“分离的”或“使之基本上是纯的”。参见F.Ausubel等人(1987)Current Protocols in MolecularBiology，Greene Publishing and Wiley Interscience，New York。本公开的核酸可以是，例如DNA或RNA，并且可以包含或不包含内含子序列。在优选的实施方案中，该核酸是cDNA分子。
使用标准的分子生物学技术可以获得本公开的核酸。对于由杂交瘤表达的抗体(例如，从以下进一步说明的携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)而言，通过标准的PCR扩增或cDNA克隆技术可以获得由杂交瘤制备的编码抗体的轻链及重链的cDNA。对于从免疫球蛋白基因文库中获得的抗体(如，使用噬菌体展示技术)而言，从该基因文库中可以回收编码此类抗体的核酸。
本公开的优选的核酸分子是对12C5、19A3、CD22.1、CD22.2、16F7、23C6、4G6及21F6单克隆抗体的VH和VL序列进行编码的核酸分子。编码12C5、19A3、CD22.1、16F7、23C6、CD22.2、4G6及21F6的VH序列的DNA序列分别显示于SEQ ID NO：41-44、62以及87-89中(其中19A3以及CD22.1的重链相同并与SEQ ID N O：42相对应；CD22.2的重链与SEQ ID NO：62相对应；以及21F6的重链与SEQ ID NO：82及83相对应)。编码12C5、19A3、CD22.1、CD22.2、16F7、23C6、4G6及21F6的VL序列的DNA序列分别显示于SEQ ID NO：45-50以及90-92中(其中19A3、CD22.1以及CD22.2的κ轻链相同并与SEQ ID N O：46相对应，16F7的κ轻链与SEQ ID NO：47或48相对应，23C6的κ轻链与SEQ ID NO：49或50相对应，以及4G6的κ轻链与SEQ ID NO：90或91相对应)。
一旦获得了编码VH及VL区段的DNA片段，则通过标准的重组DNA技术，可以对这些DNA片段进行进一步操作，例如将可变区基因转变成全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，编码VL或VH的DNA片段被有效连接至编码另一种蛋白(例如抗体恒定区或柔性接头)的另一条DNA片段上。本文所使用的术语“有效连接”意指将两条DNA片段连接，这样使由这两条DNA片段编码的氨基酸序列符合读框。
通过将编码VH的DNA有效连接至另一个编码重链恒定区(CH1、CH2及CH3)的DNA分子上，可以将编码VH区的分离的DNA转变成全长重链基因。人重链恒定区基因的序列在本领域中是已知的(参见例如，Kabat，E.A.，等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242)，并且包括这些区的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。该重链恒定区可以是IgG1、IgQ1、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但最优选是IgG1或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因而言，对编码VH的DNA可以被有效连接至另一个仅编码重链CH1恒定区的DNA分子。
通过将编码VL的DNA有效连接至另一个编码轻链恒定区CL的DNA分子上，编码VL区的分离的DNA可以被转变成全长轻链基因(就像Fab轻链基因一样)。人轻链恒定区基因的序列在本领域中是已知的(参见例如，Kabat，E.A.，等人(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIHPublication No.91-3242)，并且包括这些区的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。在优选的实施方案中，轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。
为产生scFv基因，将编码VH和VL的DNA片段有效连接至另一条编码柔性接头的片段，例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3，这样使VL和VH序列可表达为相邻的单链蛋白，其中VH和VL区通过柔性接头连接(例如，参见，Bird等人(1988)Science242：423-426；Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5879-5883；McCafferty等人，(1990)Nature348：552-554)。
本公开的单克隆抗体的生产
可以通过多种技术产生本公开的单克隆抗体(mAb)，所述技术包括常规的单克隆抗体方法学，例如Kohler和Milstein(1975)Nature256：495的标准体细胞杂交技术。虽然优选体细胞杂交步骤，但是大体上可以采用其他技术用于生产单克隆抗体，例如B淋巴细胞的病毒性转化或致癌性转化。
用于制备杂交瘤的优选的动物系统是鼠类系统。在小鼠中产生杂交瘤是充分确立的程序。用于分离被免疫的脾细胞以进行融合的免疫方案及技术在本领域中是已知的。融合配偶体(partner)(例如，鼠骨髓瘤细胞)及融合程序也是已知的。
基于如以上所述制备的非人单克隆抗体的序列，可以制备本公开的嵌合抗体或人源化抗体。从所感兴趣的非人杂交瘤中可以获得编码重链及轻链免疫球蛋白的DNA，并且使用标准的分子生物学技术进行工程化，以包含非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。例如，为生成嵌合抗体，可使用本领域中已知的方法将鼠类可变区与人恒定区相连接(参见例如Cabilly等人的美国专利号4,816,567)。为了产生人源化抗体，使用本领域已知的方法可以将鼠类CDR区插入至人构架(参见例如，Winter的美国专利号5,225,539以及Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762以及6,180,370)。
在一个优选的实施方案中，本公开的抗体是人单克隆抗体。使用携带部分人免疫系统而不是小鼠系统的转基因小鼠或转染色体小鼠，可以产生此类针对CD22的人单克隆抗体。这些转基因小鼠和转染色体小鼠在此分别指HuMAb及的小鼠，并在此都指“人Ig小鼠”。
HuMAb(Inc.)含有编码非重排的人重链(μ及γ)、以及κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因微基因座(miniloci)，并含有使内源性μ及κ链基因座失活的靶向突变(参见例如，Lonberg，等人(1994)Nature368(6474)：856-859)。因此，这些小鼠表现出小鼠IgM或κ的表达降低，并且响应于免疫，被引入的人重链和轻链转基因经历了类别转换及体细胞突变，以产生高亲和力的人IgGκ单克隆抗体(Lonberg，N.等人(1994)，见上；综述于Lonberg，N.(1994)Handbook ofExperimental Pharmacology113：49-101；Lonberg，N.和Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.13：65-93，以及Harding，F.和Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.764：536-546)。的制备及用途，以及由这种小鼠携带的基因组修饰，进一步记载于Taylor，等人(1992)NucleicAcids Research20：6287-6295；Chen，J.等人(1993)InternationalImmunology5：647-656；Tuaillon等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：3720-3724；Choi等人(1993)Nature Genetics4：117-123；Chen，J.等人(1993)EMBO J.12：821-830；Tuaillon等人(1994)J.Immunol.152：2912-2920；Taylor，L.等人(1994)International Immunology6：579-591；以及Fishwild，D.等人(1996)Nature Biotechnology14：845-851，所有这些文献的全文都通过引用特异地结合于此。进一步参见，均为Lonberg及Kay的美国专利号5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；以及5,770,429；Surani等人的美国专利号5,545,807；均为Lonberg及Kay的PCT公开号WO92/03918，WO93/12227，WO94/25585，WO97/13852，WO98/24884及WO99/45962；以及Korman等人的PCT公开号WO01/14424。
在另一个实施方案中，使用在转基因及转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小鼠(例如，携带人重链转基因及人轻链转染色体的小鼠)可以生产本公开的人抗体。这种小鼠在此被称为并且在Ishida等人的PCT公开号WO02/43478中有详细的说明。
再者，备选的表达人免疫球蛋白基因的转基因动物系统在本领域内是可以获得的，并且可用于生产本公开的抗-CD22抗体。例如，可以使用备选的被称作Xenomouse(Abgenix，Inc.)的转基因系统；这种小鼠记载于，例如Kucherlapati等人的美国专利号5,939,598；6,075,181；6,114,598；6,150,584及6,162,963中。
此外，备选的表达人免疫球蛋白基因的转基因动物系统在本领域内是可以获得的，并且可以被用于生产本公开的抗-CD22抗体。例如，可以使用被称作“TC小鼠”的携带人重链转染色体及人轻链转染色体的小鼠；这种小鼠记载于Tomizuka等人(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97：722-727中。此外，在本领域中已经说明了携带人重链转染色体及人轻链转染色体的牛(例如，Kuroiwa等人(2002)Nature Biotechnology20：889-894以及PCT申请号WO2002/092812)，并且这些牛可用于生产本公开的抗-CD22抗体。
通过用于筛选人免疫球蛋白基因文库的噬菌体展示方法也可以制备本公开的人单克隆抗体。此类用于分离人抗体的噬菌体展示方法在本领域内是已经确定的。参见例如：Ladner等人的美国专利号5,223,409；5,403,484；以及5,571,698；Dower等人的美国专利号5,427,908及5,580,717；McCafferty等人的美国专利号5,969,108及6,172,197；以及Griffiths等人的美国专利号5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915以及6,593,081。
使用SCID小鼠也可以制备本公开的人单克隆抗体，其中人免疫细胞已被重组入SCID小鼠，这样使免疫时可以产生人抗体反应。这种小鼠记载于，例如Wilson等人的美国专利号5,476,996及5,698,767中。
在另一个实施方案中，可以使用如Buechler等人的美国专利号6,794,132中描述的人Ig小鼠与噬菌体展示技术的结合制备人抗-CD22抗体。更确切地说，该方法首先涉及通过用CD22抗原对人Ig小鼠(例如，以上所述的HuMab小鼠或KM小鼠)进行免疫，在小鼠中产生抗-CD22抗体反应，随后从小鼠的淋巴细胞中分离编码人抗体链的核酸，并将这些核酸引入展示载体(例如，噬菌体)中，以提供展示包(display package)的文库。因此，每个文库成员包含编码人抗体链的核酸，并且每种抗体链通过展示包被展示出来。然后用CD22抗原对该文库进行筛选，以分离与CD22特异地结合的文库成员。然后分离所选择的文库成员的核酸插入片段，并通过标准的方法进行测序，以确定所选择的CD22结合成员(binder)的轻链及重链可变序列。通过标准的重组DNA技术可以将可变区转化成全长抗体链，这些技术例如，将可变区克隆进入携带人重链及轻链恒定区的表达载体，这样使VH区有效连接至CH区、并且VL区有效连接至CL区。
人Ig小鼠的免疫
当人Ig小鼠被用于生产本公开的人抗体时，用经纯化的或富集的CD22抗原和/或重组CD22的制品、或表达CD22的细胞、或CD22融合蛋白对这种小鼠进行免疫，如Lonberg，N.等人(1994)Nature368(6474)：856-859；Fishwild，D.等人(1996)Nature Biotechnology14：845-851；以及PCT公开文件WO98/24884及WO01/14424所述。优选地，这些小鼠在初次输注时是6-16周龄。例如，纯化的或重组的CD22抗原制品(5-50μg)可用于经腹膜内对人Ig小鼠进行免疫。最优选地，用于生产本公开抗体的免疫原是重组人CD22细胞外结构域以及被工程化以在细胞表面表达全长人CD22的CHO细胞的组合(如实例1进一步所述)。
用于产生CD22的全长人单克隆抗体的详细步骤在以下实施例1中说明。关于不同抗原的积累的经验已显示，在以下条件下转基因小鼠会应答：当用完全Freund’s佐剂中的抗原在腹膜内(IP)进行初始免疫，随后每隔一周用不完全Freund’s佐剂中的抗原进行IP免疫(共达6次)。然而，还发现除Freund’s佐剂之外的其他佐剂是有效的。另外，发现了在没有佐剂的情况下整个细胞具有高度的免疫原性。在免疫方案过程中可以用眶后取血得到的血浆样品对免疫应答进行监测。通过ELISA(如以下所述)可对血浆进行筛选，并且具有足够滴度的抗-CD22人免疫球蛋白的小鼠可用于融合。可以在处死并去除脾脏前的3天，用抗原静脉内对小鼠增强。预期对每次免疫可能需要进行2-3次融合。每种抗原一般对6-24只小鼠进行免疫。HCo7与HCo12两个品系经常都被使用。另外，HCo7与HCo12这两种转基因均可被一起培育进入具有两种不同的人重链转基因(HCo7/HCo12)的单一小鼠中。可选地或另外地，如实例1所述，可以使用品系以及KM-λHAC品系。
产生本公开的人单克隆抗体的杂交瘤的生成
为了生成产生本公开的人单克隆抗体的杂交瘤，来自经免疫的小鼠的脾细胞和/或淋巴结细胞可以被分离，并且被融合至适合的无限增殖化细胞系，例如小鼠骨髓瘤细胞系。为了抗原特异的抗体的产生可以对得到的杂交瘤进行筛选。例如，用50％的PEG可以将来自经免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬液与六分之一数量的P3X63-Ag8.653非分泌型小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL1580)相融合。可选地，使用基于电场的电融合方法，使用CytoPulse大室细胞融合电穿孔仪(large chamber cell fusionelectroporator)(CytoPulse Sciences，Inc.，Glen Burnie Maryland)，可以融合来自经免疫小鼠的脾淋巴细胞单细胞悬液。将大约2×105的细胞培养于平底微量滴定板上，之后在以下选择性培养基中孵育2周：该培养基含有20％胎克隆血清、18％“653”条件培养液、5％origen(IGEN)、4mML-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、5mM HEPES、0.055mM的2-巯基乙醇、50单位/ml青霉素、50mg/ml链霉素、50mg/ml艮他霉素以及1X HAT(Sigma；融合后24小时加入HAT)。大约2周后，可以将细胞培养于以HT替代HAT的培养基中。然后为了人单克隆IgM与IgG抗体，通过ELISA筛选各个孔。一旦出现杂交瘤的扩大生长，通常可以在10-14天后观察培养基。可以对分泌抗体的杂交瘤进行再铺板、再筛选，并且如果对人IgG仍是阳性，则可以通过有限稀释将该单克隆抗体亚克隆至少2次。然后可以在体外培养该稳定的亚克隆以便在组织培养基物中产生少量抗体用于表征。
为了纯化人单克隆抗体，可以将已选择的杂交瘤培养于2升的转瓶中用于单克隆抗体纯化。可以将上清液进行过滤并浓缩，之后用A蛋白-琼脂糖(Pharmacia，Piscataway，N.J.)进行亲和层析。可以通过凝胶电泳和高效液相色谱检测洗脱的IgG以确保纯度。可以将缓冲液换为PBS，并通过OD280使用1.43的消光系数确定浓度。可以将单克隆抗体分成等分试样，并保存于-80℃。
生成产生本公开的单克隆抗体的转染瘤
也可以使用例如重组DNA技术和基因转染方法的结合在宿主细胞转染瘤中产生本公开的抗体，这是本领域中熟知的(例如Morrison，S.(1985)Science229：1202，)。
例如，为了表达抗体或它们的片段，可以通过标准的分子生物学技术(例如，使用表达感兴趣的抗体的杂交瘤进行PCR扩增或cDNA克隆)获得编码部分或全长轻链和重链的DNA，并且可将DNA插入至表达载体中，使得基因有效连接转录和翻译的控制序列。术语“有效连接”在此上下文中意指抗体基因被连接进入载体，使得载体中的转录和翻译控制序列可以起到其调节抗体基因的转录和翻译的预期功能。对表达载体和表达控制序列进行选择以便与所使用的表达宿主细胞相容。
可以将抗体轻链基因和抗体重链基因插入至分开的载体中，或者更通常地是将两个基因均插入至相同的表达载体中。可以通过标准的方法将抗体基因插入至表达载体中(例如，连接抗体基因片段和载体上的互补限制性位点，或者如果不存在限制性位点时进行平端连接)。可以通过以下方法将本文所述抗体的轻链和重链可变区用于形成任何抗体同种型的全长抗体基因：将轻链和重链可变区插入至已经编码期望同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中，使得VH区段有效连接载体中的CH区段，并且VL区段有效连接载体中的CL区段。另外地或备选地，该重组表达载体可以编码有利于从宿主细胞中分泌抗体链的信号肽。可以将抗体链基因克隆进入载体，使得信号肽在符合读框地连接至抗体链基因的氨基末端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或者异源的信号肽(即来自非免疫球蛋白蛋白质的信号肽)。
本公开的重组表达载体除了携带抗体链基因之外还携带在宿主细胞中控制抗体链基因表达的调节序列。术语“调节序列”意在包括启动子、增强子及控制抗体链基因的转录或翻译的其他表达控制元件(例如多腺苷酸化信号)。这些调节序列记载于例如Goeddel(Gene Expression Technology.Methods in Enzymology185，Academic Press，San Diego，CA(1990))中。本领域技术人员将会了解，表达载体的设计，包括调节序列的选择，可能要依赖于以下因素，如待转化的宿主细胞的选择、所希望的蛋白质的表达水平等。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调节序列包括指导蛋白质在哺乳动物细胞中高水平表达的病毒元件，例如衍生自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒的启动子和/或增强子。备选地，可以使用非病毒调节序列，例如泛素启动子或β-珠蛋白启动子。再者，调节元件可以由不同来源的序列组成，例如包含来自SV40早期启动子的序列和I型人类T细胞白血病病毒的长末端重复的SRα启动子系统(Takebe，Y.等人(1988)Mol.Cell.Biol.8：466-472)。
本公开的重组表达载体除了携带抗体链基因和调节序列之外还可携带额外的序列，例如在宿主细胞中调节载体复制的序列(例如复制起点)和可选择的标记基因。可选择的标记基因有利于对其中已引入了载体的宿主细胞的选择(参见例如均为Axel等人的美国专利号4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如，通常可选择的标记基因赋予已引入载体的宿主细胞对例如G418、潮霉素或氨甲蝶呤等药物的抗性。优选的可选择的标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(与氨甲蝶呤选择/扩增一起用于dhfr-宿主细胞中)和neo基因(用于G418的选择)。
为了表达轻链和重链，通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体(一或多种)转染至宿主细胞中。术语“转染”的各种形式意在涵盖范围宽广的多种技术，这些技术一般用于将外源DNA引入原核的或真核的宿主细胞，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。虽然在理论上可能在原核宿主细胞或在真核宿主细胞中表达本公开的抗体，但是在真核细胞并且最优选地在哺乳动物宿主细胞中表达抗体是最优选的，这是因为这些真核细胞并且特别是哺乳动物细胞比原核细胞更有可能组装并分泌正确折叠的具有免疫学活性的抗体。已经报道了抗体基因的原核表达不能有效产生大量活性抗体(Boss，M.A.和Wood，C.R.(1985)Immunology Today6：12-13)。
优选的用于表达本公开的重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，说明于Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4216-4220，使用DHFR可选择的标记，例如在R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)J.Mol.Biol.159：601-621中所述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞及SP2细胞。特别是，对于使用NSO骨髓瘤细胞而言，另一个优选的表达系统是在(Wilson的)WO87/04462、(Bebbington的)WO89/01036、以及(Bebbington的)EP338,841中披露的GS基因表达系统。当编码抗体基因的重组表达载体基因被引入哺乳动物宿主细胞时，通过对宿主细胞培养一段时间可以产生这些抗体，所述时间段足以使该抗体在该宿主细胞中得到表达，或者更优选地，使该抗体分泌进入宿主细胞生长的培养基。使用标准的蛋白纯化方法可以从培养基中回收抗体。
抗体结合至抗原的表征
可以通过例如标准ELISA检测本发明的抗体与CD22的结合。简言之，用PBS中μg/ml的经纯化和/或重组CD22(例如，如实施例1中所述的CD22ECD)对微量滴定板进行包被，并接着用PBS中5％的牛血清白蛋白进行封闭。抗体的稀释液(例如，来自经CD22免疫的小鼠的血清的稀释液)被加至每个孔并在37℃下孵育1-2小时。用PBS/Tween冲洗该板，并接着用与缀合至碱性磷酸酶的第二试剂(例如，对于人抗体而言，山羊-抗人IgG Fc特异的多克隆试剂)在37℃下孵育1小时。冲洗后，用pNPP底物(1mg/ml)对该板进行显影，并在OD405-650下进行分析。优选将形成最大滴定的小鼠用于融合。
上述描述的ELISA测定还可用于筛选与CD22免疫原显示阳性反应性的杂交瘤。对以高亲合力结合CD22的杂交瘤进行亚克隆并对其进行进一步表征。可以从每个杂交瘤选择一个保持亲本细胞反应性的克隆(通过ELISA)，用于制备5-10小瓶细胞库保存在-140℃下，并用于抗体纯化。
为了纯化抗-CD22抗体，可以将已选择的杂交瘤培养于2升的旋瓶中用于单克隆抗体纯化。可以将上清液进行过滤并浓缩，之后用A蛋白-琼脂糖(Pharmacia，Piscataway，N.J.)进行亲和层析。通过凝胶电泳及高效液相色谱可以检查被洗脱的IgG以确保纯度。可以将该缓冲液替换为PBS，并通过OD280使用1.43消光系数确定其浓度。可以将这些单克隆抗体分成等份，并保存于-80℃。
为了确定已选择的抗-CD22单克隆抗体是否结合至独特的表位，使用可商购的试剂(Pierce，Rockford，IL)可以对每种抗体进行生物素酰化。使用未标记的单克隆抗体及生物素酰化的单克隆抗体的竞争研究可以如以上所述使用CD22包被的ELISA板进行。使用链霉素(strep)-抗生物素蛋白-碱性磷酸酶探针可以检测生物素酰化的mAb结合。
为了确定经纯化的抗体的同种型，可以使用对具体同种型的抗体特异的试剂进行同种型ELISA。例如，为了确定人单克隆抗体的同种型，可以用1μg/ml的抗-人免疫球蛋白在4℃下过夜对微量滴定板的孔进行包被。用1％BSA进行封闭后，该板与1μg/ml或更低的检测单克隆抗体或者经纯化的同种型对照在环境温度下反应1-2小时。随后将这些孔与人IgG1或人IgM-特异的碱性磷酸酶缀合的探针进行反应。如以上所述对这些板进行显影并分析。
可以通过Western印迹法对抗-CD22人IgG与CD22抗原的反应性进行进一步检测。简言之，可制备CD22并对其进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，将单独的抗原转移至硝化纤维素膜上，用10％胎牛血清进行封闭，并用待检测的单克隆抗体进行探测。对于人IgG结合，使用抗-人IgG碱性磷酸酶进行检测并用BCIP/NBT底物片(substratetablet)进行显影(Sigma Chem.Co.，St.Louis，Mo.)。
本公开的抗体的结合特异性还可以通过监测该抗体与表达CD22的细胞的结合而确定，例如通过流式细胞术。可使用自然表达CD22的细胞系，例如Daudi细胞或Raji细胞，或者可用编码CD22跨膜形式的表达载体转染细胞系，诸如CHO细胞系。该被转染的蛋白质可包含标签，诸如myc标签，优选在N末端，用于使用针对该标签的抗体进行检测。本公开的抗体与CD22的结合可以通过将这些已转染的细胞与该抗体进行孵育，并对被结合的抗体进行检测而进行测定。抗体与在经转染的蛋白质上的标签的结合可被用作是阳性对照。
双特异性分子
在另一方面，本公开的特征在于包括本公开的抗-CD22抗体、或其片段的双特异性分子。本公开的抗体，或其抗原结合部分，可被衍生化或与另一种功能分子相连接，该功能分子例如为另一种肽或蛋白(例如，另一种抗体或受体的配体)，以生成与至少两种不同结合位点或靶分子相结合的双特异性分子。事实上，本公开的抗体可能被衍生化或连接至多于一个的其他功能分子，以生成结合多于两种的不同结合位点和/或靶分子的多特异性分子；本文所用的术语“双特异性分子”也旨在涵盖此类多特异性分子。为了生成本公开的双特异性分子，可将本公开的抗体与一个或多个其他结合分子(例如另一种抗体、抗体片段、肽或结合模拟物)进行功能性地连接(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价连接或其他方式)，由此得到双特异性分子。
因此，本公开包括双特异性分子，该双特异性分子包括针对CD22的至少一种第一结合特异性以及针对第二靶向表位的第二结合特异性。在本公开的一个具体实施方案中，该第二靶向表位是Fc受体，例如人FcγRI(CD64)或人Fcα受体(CD89)。因此，本公开包括的双特异性分子既能够结合至表达FcγR或FcαR的效应细胞(例如单核细胞、巨噬细胞或多形核细胞(PMN))，又能够结合表达CD22的靶细胞。这些双特异性分子将表达CD22的细胞靶向效应细胞，并触发Fc受体介导的效应细胞活性，例如，表达CD22的细胞的吞噬作用、抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)、细胞因子的释放，或超氧化物阴离子的生成。
在本公开的一个实施方案(其中该双特异性分子是多特异性的)中，该分子除了包括抗-Fc结合特异性及抗-CD22结合特异性外，还包括第三结合特异性。在一个实施方案中，该第三结合特异性是抗增强因子(EF)部分，例如，结合至涉及细胞毒活性的表面蛋白并由此增强针对该靶细胞的免疫应答的分子。“抗增强因子部分”可以是结合至给定分子(如抗原或受体)的抗体、功能性抗体片段、或配体，并由此导致对于Fc受体或靶细胞抗原的结合决定簇作用的增强。“抗增强因子部分”可以结合Fc受体或靶细胞抗原。可选地，抗增强因子部分可以结合实体，该实体不同于和第一及第二结合特异性相结合的实体。例如，抗增强因子部分可结合细胞毒性T细胞(如，经CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-1、或导致针对该靶细胞的免疫应答增强的其他免疫细胞)。
在一个实施方案中，本公开的双特异性分子作为根据结合特异性包括至少一种抗体，或其抗体片段，包括，例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、Fd、dAb或单链Fv。抗体还可以是轻链或重链二聚物，或是其任何最小片段，例如Fv或单链构建体，如Ladner等人的美国专利号4,946,778所述，其内容以引用的方式并入。
在一个实施方案中，Fcγ受体的结合特异性由单克隆抗体提供，其结合并未被人免疫球蛋白G(IgG)所阻断。在此所使用的术语“IgG受体”指位于1号染色体上的8个γ-链基因的任何。这些基因总共编码12种跨膜受体或可溶性受体同种型，它们被分为三类Fcγ受体：FcγRI(CD64)、FcγR II(CD32)、以及FcγRIII(CD16)。在一个优选的实施方案中，Fcγ受体是人高亲和性FcγRI。人FcγRI是72kDa的分子，它对单体IgG具有高亲合性(108-109M-1)。
在Fanger等人的PCT公开号WO88/00052及美国专利号4,954,617中说明了某些优选的抗-Fcγ单克隆抗体的制备及表征，其中传授的内容都通过引用全部结合在此。这些抗体在下述位点结合至FcγRI、FcγRII及FcγIII的表位，所述结合位点区别于受体的Fcγ结合位点，并因此它们的结合基本上不会被生理水平的IgG所阻断。在本公开有用的特异的抗-FcγRI抗体是mAb22、mAb32、mAb44、mAb62、以及mAb197。产生mAb32的杂交瘤可以从美国典型培养物保藏中心，ATCC登录号HB9469获得。在其他实施方案中，抗-Fcγ受体抗体是单克隆抗体22(H22)的人源化形式。H22抗体的生产及表征描述于Graziano，R.F.等人J.(1995)Immunol155(10)：4996-5002，及Tempest等人的PCT公开文件WO94/10332中。产生H22抗体的细胞系被命名为HA022CL1，保藏于美国典型培养物保藏中心，登录号为No.CRL11177。
在又其他优选的实施方案中，对于Fc受体的结合特异性由结合至人IgA受体的抗体提供，该人IgA受体例如是Fc-α受体(FcαI(CD89))，这种结合优选不会被人免疫球蛋白A(IgA)所阻断。术语“IgA受体”意指包括位于19号染色体上的一个α基因(FcαRI)的基因产物。已知这一基因对几种55-110kDa的可选的剪接的跨膜同种型进行编码。FcαRI(CD89)在单核细胞/巨噬细胞、嗜酸性粒细胞及嗜中性粒细胞上进行组成型表达，但在非效应细胞群上不表达。FcαRI对于IgA1和IgA2均具有中等亲合力(≈5×107M-1)，该亲合力在暴露至细胞因子例如G-CSF或GM-CSF时会增加(Morton，H.C.等人(1996)Critical Reviews in Immunology16：423-440)。已经描述了四种FcαRI特异性的单克隆抗体，被鉴定为A3、A59、A62及A77，它们结合IgA配体结合域外的FcαRI(Monteiro，R.C.等人J.Immunol.148：1764，(1992))。
FcαRI和FcγRI是优选的触发受体，用于本公开的双特异性分子，因为它们：(1)主要在免疫效应细胞，例如单核细胞、PMN、巨噬细胞及树突细胞上表达；(2)高水平表达(例如，5,000-100,000/细胞)；(3)细胞毒性活性的介导物(例如，ADCC、吞噬作用)；以及(4)介导靶向它们的抗原(包括自身抗原)的增强的抗原呈递。
虽然人单克隆抗体是优选的，但是其他可用于本公开的双特异性分子的抗体是鼠类抗体、嵌合抗体以及人源化单克隆抗体。
使用本领域中已知的方法通过使构成物的结合特异性(例如，抗-FcR及抗-CD22的结合特异性)相缀合来制备本公开的双特异性分子。例如，可以单独地生成双特异性分子中的每一种结合特异性，并接着将它们彼此缀合。当该结合特异性是蛋白质或肽时，可以使用多种偶合剂或交联剂进行共价缀合。交联剂的例子包括A蛋白、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5，5’-二硫双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻-亚苯基二马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代) 丙酸酯(SPDP)、以及4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯(sulfosuccinimidyl4-(N-maleimidomethyl)cyclohaxane-1-carboxylate)(磺基-SMCC)(参见例如，Karpovsky等人(1984)J.Exp.Med.160：1686；Liu，MA等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：8648)。其他方法包括在Paulus(1985)Behring Ins.Mitt.No.78，118-132；Brennan等人(1985)Science229：81-83，以及Glennie等人(1987)J.Immunol.139：2367-2375))中描述的方法。优选的缀合剂是SATA及磺基-SMCC，均可从Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)公司购得。
当这些结合特异性是抗体时，它们可以通过两个重链的C末端铰链区的巯基键相缀合。在特别优选的实施方案中，在缀合之前对铰链区进行修饰，使其含有奇数个数的巯基残基，优选含有一个巯基残基。
可选地，两种结合特异性分子均可以在相同的载体中被编码并在同一宿主细胞中被表达并装配。当双特异性分子是mAb×mAb、mAb×Fab、Fab×F(ab’)2或配体×Fab融合蛋白时，这一方法特别有用。本公开的双特异性分子可以是包含一个单链抗体及结合决定簇的单链分子，或包括两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可包括至少两条单链分子。制备双特异性分子的方法说明在，例如美国专利号5,260,203；5,455,030；4,881,175；5,132,405；5,091,513；5,476,786；5,013,653；5,258,498及5,482,858中，所有文献都明确地通过引用结合在此。
将双特异性分子结合至它们的特异性靶，可以通过下列方法来确认，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、FACS分析、生物测定(例如，生长抑制)，或Western印迹测定。这些测定中的每一种测定通常均通过采用对感兴趣的蛋白-抗体复合物特异的经标记的试剂(例如，抗体)，检测特别感兴趣的复合物的存在。例如，使用例如识别并特异地结合至抗体-FcR复合物的酶联抗体或抗体片段来检测FcR-抗体复合物。可选地，使用多种其他免疫测定中的任何测定可以检测这些复合物。例如，可对该抗体进行放射性标记，并将其用于放射免疫测定(RIA)(见例如，Weintraub，B.，Principles of Radioimmunoassays，SeventhTraining Course on Radioligand Assay Techniques，The Endocrine Society，March，1986年，它通过引用结合在此)。可以使用例如γ计数器或闪烁计数器或通过放射自显影来检测放射性同位素。
接头
本发明提供了抗体-配偶体缀合物，其中该抗体经化学接头连接到该配偶体上。在一些实施方案中，该接头是肽基接头，且在此被描述为(L4)p-F-(L1)m。其他的接头包括肼接头及二硫化物接头，并在本文中被分别表示为(L4)p H-(L1)m或(L4)p-J-(L1)m。除了被附着至该配偶体的接头之外，本发明还提供了可剪切的连接臂，这些连接臂适于附着至几乎任何分子种类。本发明的连接臂方面在此通过参考它们附着至治疗部分而作为示范。然而，对本领域的技术人员来说很明显，该接头可连接到多个种类，包括但不局限于，诊断剂、分析剂、生物分子、靶向剂、可检测的标记等。
在抗体配偶体缀合物中使用肽基以及其他接头说明于美国临时专利申请系列号60/295,196；60/295,259；60/295342；60/304,908；60/572,667；60/661,174；60/669,871；60/720,499；60/730,804；60/735,657；60/891,028；以及美国专利申请序列号10/160,972；10/161,234；11/134,685；11/134,826；及11/398,854以及美国专利号6,989,452以及PCT专利申请号PCT/US2006/37793，所有文献都通过引用结合在此。
其他接头说明于美国专利号6,214,345(Bristol-Myers Squibb)，美国专利申请2003/0096743以及美国专利申请2003/0130189(二者均属于SeattleGenetics)，de Groot等人，J.Med.Chem.42，5277(1999)；de Groot等人J.Org.Chem.43，3093(2000)；de Groot等人，J.Med.Chem.66，8815，(2001)；WO02/083180(Syntarga)；Carl等人，J.Med.Chem.Lett.24，479，(1981)；Dubowchik等人，Bioorg & Med.Chem.Lett.8，3347(1998)。
在一方面，本发明涉及用于将靶向基团附着于治疗剂以及标记的接头。在另一方面，本发明提供赋予化合物稳定性的接头，降低它们在体内的毒性，或以其他方式有利地影响它们的药物代谢动力学、生物利用度和/或药物动力学。在此类实施方案中通常优选的是一旦药物被递送至其作用位点，则接头即被切割，释放出活性药物。这样，在本发明的一个实施方案中，本发明的接头是无痕迹的，这样使一旦接头从治疗剂或标记上去除(例如在活化期间)，则不会留下该接头存在的痕迹。
在本发明的另一个实施方案中，接头的特征在于它们在靶细胞内或靶细胞附近位点(例如治疗作用位点或标记活性位点)被切割的能力。这种剪切本质上是酶促的。这一特点有助于减小治疗剂或标记物的系统活化作用、减少毒性及系统副作用。优选的用于酶切的可剪切的基团包括肽键、酯键、以及二硫键。在其他的实施方案中，接头对pH敏感，并通过改变pH而被切割。
本发明的重要方面是控制接头的剪切速度的能力。快速剪切的接头经常是理想的。然而，在一些实施方案中，可能优选剪切较慢的接头。例如，在缓释制剂或同时具有快速释放成分和慢速释放成分的制剂中，提供剪切较慢的接头是有用的。WO02/096910提供了几种特异性具有肼接头的配体-药物复合物。然而，无法根据所需的环化速度来“调节”接头构成，并且所描述的具体的化合物从该药物上剪切配体的速度比起对于多种药物-接头缀合物所优选的速度要更慢。相反，本发明的肼接头提供了从很快到很慢的环化速度的范围，由此允许基于该希望的环化速度选择具体的肼接头。
例如，用剪切时产生单一5元环的肼接头可实现非常快速的环化。将细胞毒剂靶向递送到细胞的优选的环化速度，可用剪切时在孪位上具有两个甲基的接头上产生的两个5元环或单一6元环的肼接头实现。已显示，与在孪位没有两个甲基的单一6元环相比，这种偕-二甲基(gem-dimetyl)效应加快了环化反应的速度。这是因为张力在环中得以释放。然而有时，取代基可能减慢反应速度而不是使它变快。通常延迟发生的原因可追溯于位阻。例如，与孪位碳(geminal carbon)为CH2时相比，偕-二甲基的取代使环化反应发生得更快。
然而，需要重视的是，在某些实施方案中，剪切更慢的接头可能是优选的。例如，在缓释制剂或同时具有快速释放成分和慢速释放成分的制剂中，提供剪切较慢的接头是有用的。在某些实施方案中，使用肼接头可实现慢速环化，一旦剪切所述肼接头，将产生没有该偕二甲基取代的单一6元环，或单一7元环。
这些接头也有助于在循环中稳定治疗剂或标记物，防止其降解。这一特性提供了重要的有利因素，因为这种稳定作用导致附着剂(attached agent)或标记物的循环半衰期得到延长。该接头也有助于减弱附着剂或标记物的活性，这样使该缀合物在循环中相对为良性并具有所希望的作用，例如，在所希望的作用位点活化后，是有毒的。对于治疗剂缀合物而言，接头这一特点有助于改善该物质的治疗指数。
优选地选择稳定化的基团，用于限制由可能存在于血液或者非靶组织中的酶类清除并代谢治疗剂或标记物，且所述酶类进一步被选择用于限制所述剂或者标记物运输进入细胞。稳定化的基团有助于阻止所述剂或者标记物的降解，且也可能在提供该剂或标记物的其他物理特性中发挥作用。稳定化的基团也可能以经配制的或非经配制的形式在储存过程中改善所述剂或标记物的稳定性。
理想地，如果稳定化的基团有助于保护治疗剂或标记物不被降解，当通过将所述剂或标记物在人血液中于37℃下贮藏2小时进行测试时，该稳定化的基团对于稳定所述剂或标记物是有用的，并导致在给定的分析条件下由存在于人血液中酶对所述剂或标记物的切割少于20％，优选少于10％，更优选少于5％，并甚至更优选少于2％。
本发明也涉及包含这些接头的缀合物。更特别地，本发明涉及前体药物，这些前体药物可用于治疗疾病，特别是癌症化疗。具体而言，使用在此说明的接头提供了多种药物前体，其相对于相似结构的前体药物而言，作用特异性高、毒性降低，且在血液里的稳定性得到改善。
在此说明的本发明的接头可位于配偶体分子内的多种位置。
因此，提供了接头，该接头可包含多种基团中的任何基团作为其链的一部分，相对于缺乏这种基团的构建体而言，它以提高了的速度在体内(例如在血流中)进行剪切。还提供了连接臂与治疗剂和诊断剂的缀合物。这些接头对于形成治疗剂的前体药物的类似物是有用的，且可逆地连接治疗剂或诊断剂至靶向剂、可检测标记、或固相支持体。接头可被掺入包括本发明的细胞毒素的复合物中。
除了可剪切的肽、肼、或二硫化物基团外，一个或多个的自消(self-immolative)接头基团L1被任选地引入细胞毒素与靶向剂之间。这些接头基团还可被描述为间隔区基团，并包含至少两个反应性官能团。通常，间隔区基团的一个化学官能度(functionality)键合至该治疗剂(例如细胞毒素)的化学官能度上，而间隔区基团的其他化学官能度被用于键合至靶向剂或者可剪切的接头的化学官能度上。间隔区基团的化学官能度的实例包括羟基、巯基、羰基、羧基、氨基、酮、以及巯基基团。
自消接头，用L1表示，通常是取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基，或者取代或未取代的杂烷基基团。在一个实施方案中，烷基或芳基基团可包含1和20个之间的碳原子。它们还可以包含聚乙二醇部分。
示例性间隔区基团包括，例如6-氨基己醇、6-巯基己醇、10-羟基癸酸、甘氨酸以及其他氨基酸、1，6-己二醇、β-丙氨酸、2-氨基乙醇、半胱胺(2-氨基乙硫醇)、5-氨基戊酸、6-氨基己酸、3-马来酰亚胺基苯甲酸、2-苯并[c]呋喃酮、α-取代的2-苯并[c]呋喃酮、羰基基团、缩醛胺酯、核酸、肽等。
间隔区可有助于将其他分子量和化学官能度引入细胞毒素-靶向剂复合物中。通常，其他分子量以及官能度将影响复合物的血清半衰期以及其他特性。因此，通过仔细挑选间隔区基团，可以产生血清半衰期在一定范围内的细胞毒素化合物。
位于与药物部分直接相邻的位置的一个或多个间隔区也表示为(L1)m，其中m是整数，该整数选自0、1、2、3、4、5和6。当存在多个L1间隔区时，可使用相同或不同的间隔区。L1可以是任何自消基团。
L4是一个接头部分，它利用包含该部分的接头，优选地赋予缀合物增强的溶解度或者减少的聚集特性，或修饰缀合物的水解速度。该L4接头不必具有自消性。在一个实施方案中，L4是取代的烷基、未取代的烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂烷基、或未取代的杂烷基，它们中的任何可以是直链的、支链的或者环状的。取代可以是，例如低级(C1-C6)烷基、烷氧基、烷基硫代、烷基氨基、或者二烷基氨基。在某些实施方案中，L4包括非环状部分。在另一个实施方案中，L4包括任何带正电荷或负电荷的氨基酸聚合物，例如聚赖氨酸或聚精氨酸(polyargenine)。L4可包括聚合物，例如聚乙二醇部分。另外，L4接头可同时包括，例如聚合物部分以及小化学部分。
在优选的实施方案中，L4包括聚乙二醇(PEG)部分。L4的PEG部分可为1-50个单元长。优选地，PEG将具有1-12个重复单元，更优选3-12个重复单元，更优选2-6个重复单元，或甚至更优选3-5个重复单元，并且最优选4个重复单元。L4可仅仅由PEG部分组成，或也可包括其他取代的或未取代的烷基或杂烷基。将PEG作为L4部分的一部分进行组合可以用于提高复合物的水溶性。另外，PEG部分可能在药物与抗体相缀合时降低聚集度。
在一些实施方案中，L4包括：
其直接附着于(AA1)c的N末端。R20是选自下述的成员：H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、以及酰基。R25、R25’、R26、以及R26’各自独立地选自H、取代的或未代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基以及取代的或未取代的杂环烷基；并且s和t独立地是1-6的整数。优选地，R20、R25、R25’、R26以及R26’是疏水性的。在一些实施方案中，R20是H或烷基(优选未取代的低级烷基)。在一些实施方案中，R25、R25’、R26以及R26’独立地是H或烷基(优选是未取代的C1至C4烷基)。在一些实施方案中，R25、R25’、R26、以及R26’全为H。在一些实施方案中，t是1，并且s是1或2。
肽接头(F)
如以上所述，本发明的肽基接头可用通式：(L4)p-F-(L1)m表示，其中F表示包括肽基部分的接头部分。在一个实施方案中，该F部分包括一个或多个任选的附加自消接头，L2，以及羰基基团。在另一个实施方案中，该F部分包括氨基基团以及一个或多个任选的间隔区基团，L3。
因此，在一个实施方案中，包括该肽基接头的缀合物包括下式(a)的结构：
在这一实施方案中，L1为自消接头，如以上所述，并且L4为下述部分，该部分优选地赋予增强的溶解性，或减少的聚集特性，或改变水解速率，如以上所述。L2表示一个或多个自消接头。此外，m为0、1、2、3、4、5、或6；并且o和p独立地为0或1。AA1表示一个或多个天然氨基酸，和/或非天然α-氨基酸；c是从1-20的整数。在一些实施方案中，c处于2-5的范围内或c是2或3。
在本发明的上式(a)的肽接头中，AA1在其氨基末端直接连接到L4或，当缺少L4时，直接连接到X4基团(即，靶向剂、可检测的标记、受保护的反应官能团或不受保护的反应官能团)。在一些实施方案中，当L4存在时，L4不包括直接附着于(AA1)c的N末端的羧基酰基基团。因此，在这些实施方案中，不需要存在一个直接在L4或X4与AA1之间的羧基酰基单元，而在美国专利6,214,345的肽接头中这是必需的。
在另一个实施方案中，包括该肽基接头的缀合物包括下式(b)的结构：
在这一实施方案中，L4是一个部分，该部分优选赋予增加的溶解性、或减少的聚集特性，或改变水解速率，如上所述；L3是间隔区基团，该间隔区基团包括伯胺或仲胺或羧基官能团，且L3的胺与D的侧羧基官能团形成酰胺键或者L3的羧基与D的侧胺官能团形成酰胺键；且o和p独立地为0或1。AA1表示一个或多个天然氨基酸，和/或非天然α-氨基酸；c是从1-20的一个整数。在这一实施方案中，不存在L1(即，在通式中m是0)。
在本发明的上式(b)的肽接头中，AA1在其氨基末端直接连接到L4或，当缺少L4时，直接连接到X4基团(即，靶向剂、可检测的标记、受保护的反应官能团或不受保护的反应官能团)。在一些实施方案中，当L4存在时，L4不包括直接附着于(AA1)c的N末端的羧基酰基基团。因此，在这些实施方案中，不需要存在直接在L4或X4与AA1之间的羧基酰基单元，而在美国专利6,214,345的肽接头中这是必需的。
自消接头L2
自消接头L2是双官能化学部分，它能将两个间隔的化学部分共价连接在一起成为一个正常情况下稳定的三节分子(tripartate molecule)，通过酶剪切从该三节分子释放所述间隔的化学部分中的一个；并且在所述酶切割之后，从分子的残余部分中自发切割而释放所述间隔的化学部分中的另一个部分。根据本发明，自消间隔区在其一端与肽部分共价连接，而在其另一端与药物部分的化学反应位点共价连接，所述药物部分的衍生作用抑制药理活性，以间隔并将肽部分与药物部分共价连接在一起成为一个三节分子，该三节分子在靶酶不存在的情况下是稳定的且无药理活性，但通过这种靶酶可在共价连接间隔区部分与肽部分的键处进行酶切割，从而影响肽部分从该三节分子释放。反过来，这种酶切割能激活间隔区部分的自消性质，并引发将间隔区部分共价连接至药物部分的键的自发切割，由此影响药理活性形式的药物的释放。
自消接头L2可以是任何自消基团。L2优选是取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、未取代的杂环烷基、取代的杂环烷基、取代及未取代的芳基、以及取代及未取代的杂芳基。
一个特别优选的自消间隔区L2可以由式(c)表示：
氨基苄基基团的芳环可由一个或多个“K”基团取代。“K”基团是芳环上的取代基，它替换了原本附着于作为环结构一部分的四个未取代的碳之一上的氢。“K”基团可以是单一原子，例如卤素，或可以是多原子的基团，例如烷基、杂烷基、氨基、硝基、羟基、烷氧基、卤烷基、以及氰基。每一个K独立地选自：取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基、未取代的杂环烷基、卤素、NO2、NR21R22、NR21COR22、OCONR21R22、OCOR21、以及OR21，其中R21及R22独立地选自：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基以及未取代的杂环烷基。示例性K取代基包括但不限于F、Cl、Br、I、NO2、OH、OCH3、NHCOCH3、N(CH3)2、NHCOCF3、以及甲基。对于“Ki”，i是0、1、2、3、或4中的整数。在一个优选的实施方案中，i是0。
以上显示的结构的醚氧原子与羰基基团相连。NR24官能度进入芳环的线表示胺功能度可以与5个碳中的任何碳键合，这5个碳形成环并未被一CH2-O-基团取代。优选地，X的NR24官能度在相对于-CH2-O-基团的对位与芳环共价键合。R24是选自以下的成员：H，取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、以及未取代的杂烷基。在具体的实施方案中，R24为H。
在一个实施方案中，本发明提供以上式(a)的肽接头，其中F包含以下结构：
其中R24是选自：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、以及未取代的杂烷基。每一个K是独立地选自以下的成员：取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基、未取代的杂环烷基、卤素、NO2、NR21R22、NR21COR22、OCONR21R22、OCOR21、以及OR21，其中R21及R22独立地选自：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基、未取代的杂环烷基；并且i是0、1、2、3、或4中的整数。
在另一个实施方案中，上式(a)的肽接头包含-F-(L1)m-，它含有以下结构：
其中每个R24独立地选自以下的成员：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、以及未取代的杂烷基。
在一些实施方案中，自消间隔区L1或L2包括：
其中每一个R17、R18、以及R19均独立地选自：H、取代的或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及取代或未取代的芳基，并且w是从0到4的整数。在一些实施方案中，R17和R18独立地为H或烷基(优选未取代的C1-C4烷基)。优选地，R17和R18为C1-C4烷基，例如甲基或乙基。在一些实施方案中，w是0。尽管不希望被任何具体理论所束缚，但实验中已发现这一特定的自消间隔区环化相对较快。
在一些实施方案中，L1或L2包括：
间隔区基团L3
间隔区基团L3的特征在于它包括伯胺或仲胺或羧基官能团，且L3基团的胺与D的侧羧基官能团形成酰胺键，或者L3的羧基与D的侧胺官能团分子形成酰胺键。L3可选自：取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、或取代或未取代的杂环烷基。在一个优选的实施方案中，L3包括芳族基团。更优选地，L3包括苯甲酸基团、苯胺基团或吲哚基团。可用做-L3-NH-间隔区的结构的非限制性例子包括下列结构：
其中Z是选自以下的成员：O、S以及NR23，并且其中R23是选自以下的成员：H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及酰基。
剪切包含L3的本发明的接头后，L3部分仍然附着于药物D上。因此，选择该L3部分，使它附着于D而不严重改变D的活性。在另一个实施方案中，药物D其自身的部分用作L3间隔区发挥作用。例如，在一个实施方案中，药物D是多卡米星(duocarmycin)的衍生物，其中药物的一个部分作为L3间隔区发挥作用。此类实施方案的非限制性实例包括下述那些实例，其中NH2-(L3)-D具有结构，该结构选自：
以及
其中，Z是选自以下的成员：O、S以及NR23，其中R23是选自以下的成员：H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及酰基；并且其中各个结构上的NH2基团与(AA1)c进行反应形成-(AA1)c-NH-。
肽序列AA1
基团AA1表示单个氨基酸或多个通过酰胺键连接在一起的氨基酸。这些氨基酸可以是天然氨基酸和/或非天然α-氨基酸。
肽序列(AA1)c在功能上是单个氨基酸(当c＝1时)或多个通过酰胺键连接在一起的氨基酸的酰胺化(amidification)残基。在生物学系统中，对本发明的肽进行选择，用于在所感兴趣的位置由酶指导酶催化的肽切割。例如，对于使用靶向剂被靶向至细胞但未被该细胞进行内化的缀合物而言，对由一个或多个蛋白酶剪切的肽进行选择，这些酶可存在于细胞外基质中，例如，由于附近的垂死细胞的细胞内含物的释放，这样使该肽在细胞外被剪切。肽内氨基酸的数目可在从1到20范围内，但更优选存在包括(AA1)c的1-8个氨基酸、1-6个氨基酸或1、2、3或4个氨基酸。易于被特异的酶或酶类剪切的肽序列在本领域内是熟知的。
许多在血清、肝、肠等被酶切割的肽序列在本领域是已知的。本发明的示范性肽序列包括被蛋白酶剪切的肽序列。本公开的焦点除蛋白酶敏感的序列的用途之外，是为了说明清楚并且不用于限制本发明的范围。
当剪切该肽的酶为蛋白酶时，该接头通常包括含有该蛋白酶的剪切识别序列的肽。蛋白酶的剪切识别序列是在蛋白水解的剪切过程中被蛋白酶识别的特定的氨基酸序列。本领域已知的许多蛋白酶剪切位点，这些和其他剪切位点可包括在该接头部分中。参见例如，Matayoshi等人Science247：954(1990)；Dunn等人Meth.Enzymol.241：254(1994)；Seidah等人Meth.Enzymol.244：175(1994)；Thornberry，Meth.Enzymol.244：615(1994)；Weber等人Meth.Enzymol.244：595(1994)；Smith等人Meth.Enzymol.244：412(1994)；Bouvier等人Meth.Enzymol.248：614(1995)，Hardy等人，in Amyloid Protein Precursor in Development，Aging，andAlzheimer′s Disease，编著Masters等人第190-198页(1994)。
基于肽序列(AA1)c的氨基酸对于由特定分子(例如肿瘤相关蛋白酶)进行选择性酶切的适宜性，对肽序列(AA1)c的氨基酸进行选择。所用的氨基酸可以是天然或非天然氨基酸。它们可能是L或D构型。在一个实施方案中，使用了至少三种不同的氨基酸。在另一个实施方案中，仅仅使用了两种氨基酸。
在一个优选的实施方案中，选择肽序列(AA1)c是基于它被溶酶体蛋白酶剪切的能力，这些蛋白酶的非限制性实例包括组织蛋白酶B、C、D、H、L、以及S。优选地，该肽序列(AA1)c在体外能被组织蛋白酶B切割，这可以使用本领域已知的体外蛋白酶切割测定法进行测试。
在另一个实施方案中，选择肽序列(AA1)c是基于它被肿瘤相关蛋白酶剪切的能力，该蛋白酶例如在肿瘤细胞附近在细胞外发现的蛋白酶，其非限制性实例包括甲拌磷寡肽酶(TOP)和CD10。肽能被TOP或CD10切割的能力可用本领域已知的体外蛋白酶切割测定法进行测试。
适宜在本发明的缀合物中使用的适宜的但非限制性的肽序列实例包括Val-Cit、Cit-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp、Cit、Phe-Ala、Phe-N9-甲苯磺酰基-Arg、Phe-N9-硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：94)、β-Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：95)、Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ.ID NO：96)、Val-Ala，Leu-Leu-Gly-Leu(SEQ ID NO：97)、Leu-Asn-Ala、以及Lys-Leu-Val。优选的肽序列是Val-Cit和Val-Lys。
在另一个实施方案中，位于与药物部分最近的位置的氨基酸选自：Ala、Asn、Asp、Cit、Cys、Gln、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、以及Val。在又一个实施方案中，位于与药物部分最近的位置的氨基酸选自：Ala、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、GIy、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、以及Val。
蛋白酶与癌症转移有关。蛋白酶尿激酶合成的增加在许多癌症中与转移能力的增加相关。尿激酶将纤溶酶原激活为纤溶酶，纤溶酶原在细胞外隙中广泛存在，并且其激活作用导致细胞外基质中的蛋白降解，由此转移肿瘤细胞侵入。纤溶酶也可以激活胶原酶，因此促进在围绕毛细管以及淋巴系统的基底膜中胶原的降解，由此允许肿瘤细胞侵入到靶组织中(Dano，等人Adv.Cancer.Res.，44：139(1985))。因此，使用通过尿激酶剪切的肽序列作为接头也在本发明的范围内。
本发明也提供对类胰蛋白酶切割敏感的肽序列的用途。人类的肥大细胞表达至少四种不同的类胰蛋白酶，被称作α、βI、βII、以及βIII。这些酶不被血浆蛋白酶抑制剂控制，并且仅在体外切割一些生理学底物。丝氨酸蛋白酶的类胰蛋白酶家族与涉及肥大细胞的多种过敏性疾病以及炎性疾病有关，因为在患有这些病症的患者的生物液体里发现了类胰蛋白酶水平升高。然而，仍需要对类胰蛋白酶在疾病的病理生理学中的确切作用进行描绘。类胰蛋白酶的生物学功能的范围以及相应的生理学结果基本上由它们的底物特异性限定。
类胰蛋白酶是尿激酶原纤溶酶原激活物(uPA)的有效的激活剂，uPA是与肿瘤转移以及侵入有关的蛋白酶的酶原形式。纤溶酶原级联反应的激活(导致细胞外基质的破坏而产生细胞溢出以及迁移)可以是在Pro-Arg-Phe-Lys的P4-P1序列(SEQ ID NO：98)上类胰蛋白酶激活化尿激酶原纤溶酶原激活物的函数(Stack等人Journal of BiologicalChemistry269(13)：9416-9419(1994))。血管活性肠肽(一种神经肽，与血管渗透性的调控有关)也被类胰蛋白酶切割，主要在Thr-Arg-Leu-Arg(SEQ.ID NO：99)序列处切割(Tam，等人，Am.J.Respir.CellMol. Biol.3：27-32(1990))。G-蛋白偶联的受体PAR-2可在Ser-Lys-Gly-Arg(SEQ.IDNO：100)序列上被类胰蛋白酶剪切并被激活，以促进成纤维细胞的增殖，而凝血酶激活受体PRA-1在Pro-Asn-Asp-Lys(SEQ.ID NO：101)序列上被类胰蛋白酶灭活(Molino等人，Journal of Biological Chemistry272(7)：4043-4049(1997))。综合在一起，这一证据提示类蛋白激酶在疾病导致的组织重塑中起核心作用。这与在几个肥大细胞介导的病症中观察到的深刻变化一致。慢性哮喘以及其他的长期的呼吸道疾病的一个特点是下面组织(underlying tissue)的纤维化以及增厚，这可能是类胰蛋白酶激活其生理学靶标的结果。类似地，一系列报道已经表明血管生成与多种癌症中的肥大细胞密度、类胰蛋白酶活性、以及不良的预后有关(Coussens等人，Genesand Development13(11)：1382-97(1999))；Takanami等人，Cancer88(12)：2686-92(2000)；Toth-Jakatics等人，Human Pathology31(8)：955-960(2000)；Ribatti等人，International Journal of Cancer85(2)：171-5(2000))。
本领域已知评价特定的蛋白酶是否切割已选择的肽序列的方法。例如，使用7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)荧光肽底物是确定蛋白酶特异性的已很好确立的方法(Zimmerman，M.，等人，(1977)AnalyticalBiochemistry78：47-51)。N-酰苯胺键(anilide bond)的特异性切割释放荧光AMC离去基团，允许对各个底物的切割速率进行简单测定。近来，通过在单个实验中对宽范围的底物进行取样，可采用AMC肽底物文库的阵列(Lee D.等人(1999)Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters9：1667-72)和位置扫描(positional-scanning)文库(Rano T.A.等人(1997)Chemistry and Biology4：149-55)快速描绘蛋白酶的N末端的特异性。因此，本领域中的技术人员可容易地评定肽序列的阵列，以确定它们在本发明中的效用，而不用采取过度的实验。
本发明的抗体-配偶体缀合物可任选地包含两个或两个以上接头。这些接头可以相同或不同。例如，肽基接头可能用于将药物连接到配体上，并且第二肽基接头可将诊断剂附着到复合体上。另外的接头的其他用途包括将分析剂、生物分子、靶向剂、以及可检测标记连接到抗体-配偶体复合体。
同样在本发明的范围之内的是本发明的化合物，它们是多价(poly-或multi-)的种类，包括，例如，诸如本发明的化合物或其反应性类似物的二聚体、三聚体、四聚体、或更高的同系物的种类。多价的种类可由本发明的单一种类或多于一个种类装配而成。例如，二聚体构建体可为“均二聚体”或者“异二聚体”。此外，多价的构建体(例如聚赖氨酸、葡聚糖、羟乙基淀粉等)也是在本发明的范围内，该构建体中本发明的化合物或其反应性类似物与寡聚或多聚构架相附着。构架优选是多官能的(即，具有一批用于附着本发明的化合物的反应性位点)。此外，该构架可用本发明的单一种类或本发明的多于一个的种类进行衍生。
此外，本发明包括多种化合物，这些化合物相对于没有类似地被官能化的类似化合物而言，被官能化以产生具有增强了的水溶性的化合物。因此，在此给出的取代基中的任何取代基可被类似的具有增强了的水溶性的基团替换。例如，用二醇或具有季铵、羟基胺或类似的更具有水溶性部分的胺替换羟基基团，这也在本发明的范围内。在一个优选的实施方案中，通过用增强亲本化合物水溶性的部分对在此给出的化合物的离子通道的活性不是必需的位点进行取代，赋予了附加的水溶性。增强有机化合物水溶性的方法在本领域中是已知的。此类方法包括，但不局限于，用永久带电的部分，例如季铵、或在生理学上相关的pH条件下带电的基团(例如羧酸、胺)使有机核官能化。其他方法包括向有机核添加包含羟基或胺的基团，例如醇、多元醇、聚醚等等。代表性的例子包括但不局限于，聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚(乙二醇)以及聚(丙二醇)。这些化合物的适宜的官能化化学以及方案在本领域中是已知的。见，例如，Dunn，R.L.，等人，编著.Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems，ACS Symposium Series Vol.469，American Chemical Society，Washington，D.C.1991。
肼接头(H)
在第二实施方案中，本发明的缀合物包含肼自消接头，其中该缀合物具有以下结构：
X4-(L4)p-H-(L1)m-D
其中，D、L1、L4、以及X4如上所限定，并且在此处进一步说明，并且H是包含以下结构的接头：
其中n1是从1至10的整数；n2是0、1、或2；每个R24均是独立地选自以下的成员：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、以及未取代的杂烷基；并且I或是键(即，主链上的碳原子与临近氮原子之间的键)、或是以下结构：
其中，n3是0或1，条件是当n3是0时，n2不是0；并且n4是1、2或3，其中当I是键，n1是3，并且n2是1时，D不能是：
其中R是Me或CH2-CH2-NMe2。
在一个实施方案中，苯环上的取代是对位取代。在优选的实施方案中，n1是2、3、或4或n1是3。在优选的实施方案中，n2是1。在优选的实施方案中，I是一个键(即，主链上的碳原子与临近氮原子之间的键)。一方面，肼接头H可在切割时形成6元的自消接头，例如当n3是0并且n4是2时。另一方面，肼接头H可在切割时形成两个5元的自消接头。在其他方面，切割时，H形成5元的自消接头、H形成7元的自消接头、或H形成5元的自消接头以及6元的自消接头。切割速率受切割时形成的环大小的影响。因此，依据所希望的剪切速率，可选择剪切时形成的适宜大小的环。
五元的肼接头
在一个实施方案中，该肼接头包括5元的肼接头，其中H包括以下结构：
在一个优选的实施方案中，n1是2、3或4。在另一个优选的实施方案中，n1是3。
在以上结构中，每个R24是独立选自：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、以及未取代的杂烷基的成员。在一个实施方案中，每个R24均独立地为H或C1-C6烷基。在另一个实施方案中，每个R24均独立地为H或C1-C3烷基，更优选H或CH3。在另一个实施方案中，至少一个R24为甲基基团。在另一个实施方案中，每个R24均是H。对每个R24进行选择以调整化合物的空间效应并且用于改变溶解性。
5元的肼接头可经历一次或更多环化反应，将药物与接头分开，并且可以通过例如下式进行说明：
制备本发明的5元的接头的示例性合成路线为：
在具有亚硫酰二氯的溶液中，受Cbz保护的DMDA b与2，2-二甲基丙二酸a反应，形成Cbz-DMDA-2，2-二甲基丙二酸c。在EDC存在下，化合物c与Boc-N-甲基肼d反应，形成DMDA-2，2-二甲基丙二酸-Boc-N-甲基肼e。
六元的肼接头
在另一个实施方案中，该肼接头包括6元的肼接头，其中H包括以下结构：
在优选的实施方案中，n1是3。在以上结构中，每个R24是独立地选自如下的成员：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、以及未取代的杂烷基。在一个实施方案中，每个R24独立地为H或C1-C6烷基。在另一个实施方案中，每个R24均独立地为H或C1-C3烷基，更优选H或CH3。在另一个实施方案中，至少一个R24为甲基基团。在另一个实施方案中，每个R24均是H。每个R24被选择为对该化合物的位阻效应进行调整并且用于改变溶解性。在一个优选的实施方案中，H包括以下结构：
在一个实施方案中，H包括偕二甲基取代。在以上结构的一个实施方案中，每个R24均独立地为H或取代或未取代的烷基。
6元肼接头会经历环化反应，该反应将该药物与该接头分开，并可被描述为：
制备本发明的6元接头的示例性合成路线为：
在含二氯甲烷的溶液中，受Cbz保护的二甲基丙氨酸a与HOAt、以及CPI反应，形成受Cbz保护的二甲基丙氨酸肼b。该肼b通过甲醇作用而被脱保护，形成化合物c。
其他肼接头
预期本发明包括具有七元的接头。这一接头不可能像五元或六元接头那样快的进行环化，但对一些抗体-配偶体缀合物而言这可能是优选的。类似地，该肼接头可包括两个六元环或具有一个六元及一个五元环化产物的肼接头。还考虑了五元和七元接头以及六元和七元的接头。
另一种肼结构H具有下式：
其中q是0、1、2、3、4、5、或6；并且
每个R24均是独立地选自以下的成员：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、以及未取代的杂烷基。该肼结构也可形成五-、六-、或七-元环，并且可以加入附加成分以形成多个环。
二硫化物接头(J)
在又一个实施方案中，该接头包括可进行酶促切割的二硫化物基团。在一个实施方案中，本发明提供一种具有式(d)结构的细胞毒性抗体-配偶体化合物：
其中，D、L1、L4、以及X4如以上所定义，并且在此进一步说明，并且J是包括具有以下结构的基团的二硫化物接头：
其中，每个R24均是独立地选自以下的成员：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、以及未取代的杂烷基；每个K均是独立地选自以下的成员：取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基、未取代的杂环烷基、卤素、NO2、NR21R22、NR21COR22、OCONR21R22、OCOR21、以及OR21，其中，R21和R22独立地是选自：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基、以及未取代的杂环烷基；i是0、1、2、3、或4的整数；并且d是0、1、2、3、4、5、或6的整数。
该二硫化物接头的芳环可用一个或多个“K”基团取代。“K”基团是芳环上的取代基，它替换原本附着于为部分环结构的四个未取代的碳之一的氢。“K”基团可以是单个原子，如卤素，或可以是多原子的基团，如烷基、杂烷基、氨基、硝基、羟基、烷氧基、卤烷基、以及氰基。示例性的K取代基独立地包括但不限于F、Cl、Br、I、NO2、OH、OCH3、NHCOCH3、N(CH3)2、NHCOCF3、以及甲基。对于“Ki”，i是0、1、2、3或4的整数。在一个特定实施方案中，i是0。
在一个优选的实施方案中，该接头包含具有下式的可酶促切割的二硫化物基团：
在这一实施方案中，L4、X4、p、以及R24的身份已如以上说明，并且d是0、1、2、3、4、5、或6。在一个特定实施方案中，d是1或2。
更具体的二硫化物接头如下式所示
这一实施方案的一个特定实例如下：
优选地，d是1或2。
另一种二硫化物接头如下式所示：
这一实施方案的一个特定实例如下：
优选地，d是1或2。
在不同的实施方案中，二硫化物在胺的邻位。在另一个特定的实施方案中，a是0。在一个优选的实施方案中，R24独立地选自H和CH3。
制备本发明的二硫化物接头的示例性合成路线如下：
3-巯基丙酸a的溶液与aldrithiol-2进行反应，形成碘化3-甲基苯并噻唑(3-methyl benzothiazolium iodide)b。碘化3-甲基苯并噻唑c与氢氧化钠进行反应，形成化合物d。化合物d的甲醇溶液与化合物b进一步反应，形成化合物e。通过乙酰氯与甲醇的作用，化合物e被脱保护，形成化合物f。
对于细胞毒素的类型、接头、以及将治疗剂缀合至抗体的其它方法的进一步讨论，还参见Gangwar等人的PCT公开文件WO2007/05940，且标题为“Cytotoxic Compounds And Conjugates，”Saito，G.等人(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55：199-215；Trail，P.A.等人(2003)Cancer Immunol.Immunother.52：328-337；Payne，G.(2003)Cancer Cell3：207-212；Allen，T.M.(2002)Nat.Rev.Cancer2：750-763；Pastan，I.and Kreitman，R.J.(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs3：1089-1091；Senter，P.D.and Springer，C.J.(2001)Adv.Drug Deliv.Rev.53：247-264，它们中的每一个的全文均并入本文作为参考。
配偶体分子
一方面，本发明的描述了缀合配偶体分子(例如细胞毒素、药物(如免疫抑制剂)或放射性毒素)的抗体。此类缀合物在此也被称为“免疫缀合物”。包括一种或多种细胞毒素的免疫缀合物被称为“免疫毒素”。细胞毒素或者细胞毒剂包括任何对细胞有害(例如杀死细胞)的物质。
本发明的配偶体分子的实例包括紫杉醇、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙素、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、以及嘌呤霉素、以及其类似物或同系物。配偶体分子的实例还包括，例如抗代谢物(如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氮烯咪胺)、烷基化剂(如氮芥、噻替哌、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)及洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺(cyclothosphamide)、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C，及顺二氯二胺铂(II)(DDP顺铂)、蒽环类抗生素(如柔红比星(以前称柔红霉素)以及多柔比星)，抗生素(如更生霉素(以前称放线菌素)、博来霉素、光辉霉素，及安曲霉素(AMC))，以及抗有丝分裂剂(如长春新碱以及长春碱)。
其他可与本发明的抗体缀合的配偶体分子优选实例包括多卡米星、加利车霉素、美坦辛、以及阿里斯达汀(auristatin)、以及其衍生物。加利车霉素抗体缀合物的一种实例是可商购的(American HomeProducts)。
配偶体分子的优选的例子是CC-1065以及多卡米星(duocarmycin)。CC-1065首次由Upjohn公司在1981年从泽尔链霉菌(streptomyceszelensis)分离出来(Hanka等人，J.Antibiot.31：1211(1978)；Martin等人，J.Antibiot.33：902(1980)；Martin等人，J.Antibiot.34：1119(1981))，并且被发现在体外以及在实验动物中都具有有效的抗肿瘤以及抗微生物活性(Li等人，Cancer Res.42：999(1982))。CC-1065结合到双链B-DNA的具有优先序列为5′-d(A/GNTTA)-3′以及5′-d(AAAAA)-3′的小沟内(Swenson等人，Cancer Res.42：2821(1982))，并且通过它在分子中存在的CPI左手单元使3′-腺嘌呤的N3位置烷基化(Hurley等人，Science226：843(1984))。尽管CC-1065具有有效且广泛的抗肿瘤活性，但因为CC-1065引起了实验动物的迟缓死亡，所以它不能被用于人类。
CC-1065以及多卡米星的许多类似物以及衍生物在本领域是已知的。已对许多化合物的结构、合成以及特性的研究进行综述。参见，例如，Boger等人，Angew.Chem.Int.编著Engl.35：1438(1996)；以及Boger等人，Chem.Rev.97：787(1997)。
Kyowa Hakko Kogya Co.，Ltd.的一个团队已经制备了许多CC-1065衍生物。参见，例如，美国专利号5,101,038；5,641,780；5,187,186；5,070,092；5,703,080；5,070,092；5,641,780；5,101,038；以及5,084,468；以及已公开的PCT申请WO96/10405以及已公开的欧洲申请0537575A1。
Upjohn Company(Pharmacia Upjohn)已经在积极制备CC-1065的衍生物。参见，例如，美国专利号5,739,350、4,978,757、5,332,837、以及4,912,227。
本发明的一个特别优选的方面提供了细胞毒素化合物，该化合物具有根据下式(e)的结构：
其中，环体系A是选自取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、以及取代或未取代的杂环烷基中的成员。示例性的环体系包括苯基以及吡咯。
符号E和G独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、杂原子、单键，或者E和G可任选地进行结合形成环状体系，该体系选自取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、以及取代或未取代的杂环烷基。
符号X表示选自O、S以及NR23中的成员。R23是选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及酰基的成员。
符号R3表示选自(＝O)、SR11、NHR11以及OR11中的成员，其中R11是H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、磺酸酯、酰基、C(O)R12R13、C(O)OR12、C(O)NR12R13、P(O)(OR12)2、C(O)CHR12R13、SR12或SiR12R13R14。符号R12、R13、以及R14独立地表示H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及取代或未取代的芳基，其中R12和R13与它们所附着的氮原子或碳原子一起可任选地相连接以形成一个取代或未取代的杂环烷基环状体系，该环状体系具有4到6元，可任选地包含2个或多个杂原子。R12、R13、或R14中的一个或多个在其结构内可包括可切割的基团。
R4、R4’、R5以及R5’是独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基、卤素、NO2、NR15R16、NC(O)R15、OC(O)NR15R16、OC(O)OR15、C(O)R15、SR15、OR15、CR15＝NR16、以及O(CH2)nN(CH3)2的成员，其中，n是从1到20的整数，或者R4、R4’、R5及R5’的任何相邻的一对与它们所附着的碳原子连接在一起以形成有4到6元的取代或未取代的环烷基或杂环烷基环状体系。R15和R16独立地表示H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基、以及取代或未取代的肽基，其中R15和R16与它们所附着的氮原子一起可任选地相连接以形成取代或未取代的杂环烷基环状体系，该环状体系具有4到6元，可任选地包含两个或更多个杂原子。一个示例性的结构是苯胺。
R4、R4’、R5、R5’、R11、R12、R13、R15以及R16在它们的结构内可任选地包括一个或多个可切割的基团，例如可切割的接头或可切割的底物。示例性的可切割的基团包括，但不限于肽、氨基酸、肼、二硫化物、以及头孢菌素衍生物。
在一些实施方案中，R4、R4’、R5、R5’、R11、R12、R13、R15以及R16中的至少一个用于将药物与本发明的接头或酶可切割的底物相结合，如此处所说明的，例如连接至L1上(如果存在)，或连接至F、H、J、或X2、或J上。
在又一个示例性实施方案中，R4、R4’、R5、R5’、R11、R12、R13、R15以及R16中的至少一个带有适合用于缀合该化合物的反应基。在另一个示例性实施方案中，R4、R4’、R5、R5’、R11、R12、R13、R15以及R16独立地选自H、取代的烷基以及取代的杂烷基，并且在烷基或杂烷基部分的游离末端具有反应官能团。R4、R4’、R5、R5’、R11、R12、R13、R15以及R16中的一个或多个可以缀合到另一种类上，例如，靶向剂、可检测的标记、固相支持体等。
R6是单键，它存在或不存在。当R6存在时，R6和R7结合形成一个环丙基环。R7是CH2-X1或-CH2-。当R7是-CH2-时，它是环丙烷环的一个组成部分。符号X1表示离去基团如卤素，例如Cl、Br或F。以不会违反化学价原则的方式解释R6和R7的组合。
X1可以是任何离去基团。有用的离去基团包括但不限于卤素、叠氮化物、磺基酯(如烷基磺酰基、芳基磺酰基)、氧离子、高氯酸烷基酯、氨基烷烃磺酸酯、烷基氟代磺酸酯以及氟化化合物(如三氟甲磺酸盐(triflate)、全氟丁基甲磺酸盐(nonaflate)、三氟乙磺酸盐(tresylate))等等。用作离去基团的具体卤素是F、Cl以及Br。对于特定的反应条件组来说适当的这些以及其他离去基团的选择在本领域的普通技术人员的能力之内(参见，例如，March J，Advanced Organic Chemistry，第二版，JohnWiley和Sons，1992；Sandler SR，Karo W，Organic Functional GroupPreparations，第二版，Academic Press，Inc.，1983；以及Wade LG，Compendium of Organic Synthetic Methods，John Wiley and Sons，1980)。
六元环中的曲线表明该环可具有一个或多个不饱和度，并且它可以是芳族的。因此，环结构(如以下所给出)、以及相关结构在式(f)的范围内：
在一些实施方案中，R4、R4’、R5、以及R5’中的至少一个将所述药物连接至L1(如果存在)上，或连接至F、H、J、或X2上，并且包括
其中v是从1到6的整数；并且R27、R27’、R28以及R28′各自均独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基、以及取代或未取代的杂环烷基。在一些实施方案中，R27、R27’、R28以及R28’都是H。在一些实施方案中，v是从1到3的整数(优选是1)。这一单位可用于将芳基取代基与药物分开，并因此阻碍或避免产生多抗药性的底物的化合物。
在一个实施方案中，R11包括一个部分X5，它不会自我环化，并将药物连接至L1(如果存在)上，或连接至F、H、J、或X2上。部分X5优选使用酶可剪切，并且被剪切时提供活性药物。作为一个实例，R11可具有以下结构(其右侧与药物的其余部分相偶联)：
在示例性实施方案中，式(e)的环状体系A是取代或未取代的苯基环。环状体系A可被在本文定义部分中给出的一个或多个芳基取代基所取代。在一些实施方案中，该苯基环被CN或甲氧基部分所取代。
在一些实施方案中，R4、R4’、R5、以及R5’中的至少一个将所述药物与L1(如果存在)相连接，或与F、H、J、或X2相连接，并且R3选自SR11、NHR11以及OR11。R11选自-SO(OH)2、-PO(OH)2、-AAn、-Si(CH3)2C(CH3)3、-C(O)OPhNH(AA)m、
或任何其它糖或糖组合，
及其可药用的盐，其中n是1到10范围内的任意整数，m是1到4范围内的任意整数，p是1到6范围内的任意整数，并且AA是任何天然或非天然氨基酸。在一些实施方案中，AAn或AAm选自以上说明的肽接头(F)的相同氨基酸序列并且任选地与在R4、R4’、R5或R5’的接头部分所用的氨基酸序列相同。在至少一些实施方案中，R3在体内是可切割的以提供活性药物化合物。在至少一些实施方案中，R3提高化合物在体内的溶解度。在一些实施方案中，血液中活性药物浓度降低的速率实质上快于提供活性药物的R3的切割速率。当活性药物的毒性实质上高于药物前体形式的毒性时，这可能是特别有用的。在其他的实施方案中，为提供活性药物而剪切R3的速率快于血液中活性药物浓度的降低的速率。
在另一个示例性实施方案中，本发明提供了具有根据式(g)的结构的化合物：
在这个实施方案中，取代基R3、R4、R4’、R5、R5’、R6、R7以及X的身份，以及对于特定的实施方案的优选项，基本上如同以上对于式(a)所做的说明所述。符号Z是独立选自O、S和NR23的成员。符号R23表示选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及酰基的成员。对每个R23进行独立地选择。符号R1代表H、取代或未取代的低级烷基，或C(O)R8或CO2R8。R8是选自取代的烷基、未取代的烷基、NR9R10、NR9NHR10以及OR9的成员。R9和R10独立地选自H、取代或未取代的烷基、以及取代或未取代的杂烷基。R2是H、或取代或未取代的低级烷基。通常优选的是当R2是取代的烷基时，它不同于全氟烷基，例如CF3。在一个实施方案中，R2是取代的烷基，其中取代不是卤素。在另一个实施方案中，R2是未取代的烷基。
在一些实施方案中，R1是酯部分，例如CO2CH3。在一些实施方案中，R2是低级烷基，它可以是取代或未取代的。目前优选的低级烷基是CH3。在一些优选的实施方案中，R1是CO2CH3且R2是CH3。
在一些实施方案中，R4、R4’、R5、以及R5’是独立地选自H、卤素、NH2、OMe、O(CH2)2N(R29)2、以及NO2的成员。每个R29均独立地是H或低级烷基(例如甲基)。
在一些实施方案中，对药物进行选择，使离去基团X1是选自以下的成员：卤素、烷基磺酰基、芳基磺酰基、以及叠氮化物。在一些实施方案中，X1是F、Cl、或Br。
在一些实施方案中，Z是O或NH。在一些实施方案中，X是O。
在又一个示例性实施方案中，本发明提供了具有根据式(h)或(i)的结构的化合物：
式(e)的多卡米星类似物的另一个优选的结构是结构，其中环状体系A是未取代的或取代的苯基环。当环状体系A是吡咯时在以上说明的具有式7的结构的药物分子上的优选的取代基也是当环状体系A是未取代的或取代的苯基环时优选的取代基。
例如，在一个优选的实施方案中，药物(D)包括结构(j)：
在这一结构中，R3、R6、R7、X如以上对式(e)所述。此外，Z是选自以下的成员：O、S以及NR23，其中R23是选自以下的成员：H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、以及酰基；
R1是H、取代的或未取代的低级烷基、C(O)R8、或CO2R8，其中R8是选自以下的成员：NR9R10以及OR9，其中R9和R10是独立地选自以下的成员：H、取代的或未取代的烷基以及取代的或未取代的杂烷基。
R1’是H、取代的或未取代的低级烷基、或C(O)R8，其中R8是选自以下的成员：NR9R10和OR9，其中R9和R10是独立地选自H、取代的或未取代的烷基以及取代的或未取代的杂烷基的成员；
R2是H、或取代的或未取代的低级烷基或者未取代的杂烷基或氰基或烷氧基；并且R2’是H、或取代的或未取代的低级烷基或者未取代的杂烷基。
R4、R4’、R5、R5’、R11、R12、R13、R15、或R16的至少一个将药物连接至L1上(如果存在)，或连接至F、H、J、或X2上。
另一个实施方案中药物(D)包括结构(k)，其中R4和R4’已相结合形成杂环烷基：
在这一结构中，R3、R5、R5’、R6、R7、X如以上对式(e)所述。此外，Z是选自O、S、以及NR23的成员，其中R23是选自以下的成员：H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、以及酰基；
R32选自H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的杂环烷基、卤素、NO2、NR15R16、NC(O)R15、OC(O)NR15R16、OC(O)OR15、C(O)R15、SR15、OR15、CR15＝NR16、以及O(CH2)nN(CH3)2，其中，n是从1-20的一个整数。R15和R16独立地表示H，取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的杂环烷基以及取代的或未取代的肽基，其中R15和R16与它们所附着的氮原子一起进行任选地结合，形成取代的或未取代的杂环烷基环体系，该环体系具有从4至6元环，任选地包含两个或更多杂原子。R32在其结构中任选地包含一个或多个可剪切的基团，例如可剪切接头或可剪切的底物。示范性可剪切的基团包括但不局限于，肽、氨基酸、肼、二硫化物、以及头孢菌素衍生物。而且，对在此所述的针对R4、R4’、R5、R5’、R15、以及R16的取代基进行的任何选择也可用于R32。
R5、R5’、R11、R12、R13、R15、R16、或R32中的至少一个将药物连接至L1上(如果存在)，或连接至F、H、J、或X2上。在至少一些实施方案中，R32将药物连接至L1上(如果存在)，或连接至F、H、J、或X2。
这一化合物的一个优选的实施方案是：
R1是H、取代的或未取代的低级烷基、C(O)R8、或CO2R8，其中R8是选自以下的成员：NR9R10以及OR9，其中R9和R10是独立地选自H、取代的或未取代的烷基以及取代的或未取代的杂烷基的成员；
R1’是H、取代的或未取代的低级烷基、或C(O)R8，其中R8是选自以下的成员：NR9R10和OR9，其中R9和R10是独立地选自H、取代的或未取代的烷基以及取代的或未取代的杂烷基的成员。
R2是H、或取代的或未取代的低级烷基或者未取代的杂烷基或氰基或烷氧基；并且R2’是H、或取代的或未取代的低级烷基或者未取代的杂烷基。
另一个实施方案具有下式：
在这一结构中，A、R6、R7、X、R4、R4’、R5、以及R5’如以上对式(e)所述。此外，Z是选自以下的成员：O、S以及NR23，其中R23是选自以下的成员：H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、以及酰基；
R33选自H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的杂环烷基、卤素、NO2、NR15R16、NC(O)R15、OC(O)NR15R16、OC(O)OR15、C(O)R15、SR15、OR15、CR15＝NR16、以及O(CH2)nN(CH3)2，其中，n是从1-20的一个整数。R15和R16独立地表示H，取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的杂环烷基以及取代的或未取代的肽基，其中R15和R16与它们所附着的氮原子一起进行任选地结合，形成取代的或未取代的杂环烷基环体系，该环体系具有从4至6元，任选地包含两个或更多杂原子。R33将药物连接至L1上(如果存在)，或连接至F、H、J、或X2。
优选地，A是取代的或未取代的苯基或者取代的或未取代的吡咯。此外，此处对于R11所说明的取代基的任何选择也适用于R33。
配体
X4表示一种配体，该配体选自：受保护的反应官能团、未受保护的反应官能团、可检测的标记、以及靶向剂。优选的配体是靶向剂，如抗体及其片段。
在一些实施方案中，基团X4可以被说明为选自R29、COOR29、C(O)NR29、以及C(O)NNR29的成员，其中R29是选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及取代或未取代的杂芳基的成员。在又一个示例性的实施方案中，R29是硫醇反应成员。在另一个示例性实施方案中，R29是硫醇反应成员，选自卤代乙酰基以及烷基卤化物衍生物、马来酰亚胺、氮丙啶、以及丙烯酰衍生物。以上的硫醇反应成员可以充当反应保护基团，这些反应保护基团可以与(例如)靶向剂(如抗体)的氨基酸侧链反应，由此使该靶向剂连接至该接头-药物部分上。
可检测为标记
与本发明的化合物结合使用的特定的标记或可检测的基团以及本发明的方法通常不是本发明的关键方面，只要它不显著干扰本发明的化合物的活性或效用。可检测的基团可以是任何具有可检测的物理或化学特性的物质。此类可检测的标记在免疫测定的领域中已得到很好的发展，并且通常，在此类方法中有用的大部分任何标记都能被应用至本发明中。因此，标记是可通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学手段可检测的任何组分。本发明中有用的标记包括磁珠(例如DYNABEADSTM)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素、德克萨斯红、罗丹明等)、放射性标记(例如3H、125I、35S、14C、或32p)、酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶以及其他在ELISA中常用的酶)、以及比色标记，如胶体金或有色玻璃或塑料珠(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、胶乳等)。
根据本领域熟知的方法，标记可直接或间接偶联到本发明的化合物上。如以上所指，可使用多种标记，标记的选择取决于所需的灵敏度、与化合物缀合的容易程度、稳定性需求、可用的仪器、以及可支配的供应物。
当本发明的化合物与可检测的标记相缀合时，该标记优选是选自以下的成员：放射性同位素、荧光剂、荧光剂前体、生色团、酶类及它们的组合。将各种基团缀合到抗体的方法在本领域是熟知的。例如，经常被缀合到抗体的可检测的标记是酶，如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、以及葡萄糖氧化酶。
非放射性标记常常是通过间接手段附着的。通常，配体分子(例如生物素)被共价地结合到该缀合物的一个成分上。然后该配体与另一个分子(如抗生蛋白链菌素)结合，该分子是固有地可检测的或者与信号系统(如可检测的酶、荧光化合物、或化学发光化合物)共价结合。
本发明的缀合物的成分还可以直接缀合到产生信号的化合物上，例如通过与酶或荧光团相缀合。作为标记的目的酶主要是水解酶，特别是磷酸酶、酯酶以及糖苷酶、或氧化酶(oxidotase)，特别是过氧化物酶。荧光化合物包括荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹酰、伞形酮等。化学发光化合物包括萤光素、以及2，3-二氢酞嗪二酮，例如鲁米诺。对于可以使用的各种标记或信号产生体系的评述，参见美国专利号4,391,904。
检测标记的手段是本领域普通技术人员熟知的。因此，例如，当该标记是放射性标记时，检测手段包括闪烁计数器或如在放射自显影法中的照相胶片。当该标记是荧光标记时，可通过用适当光波长激发荧光染料并检测产生的荧光可对其进行检测。可通过照相胶片、通过使用电子探测器(例如电荷耦合器件(CCD)或光电倍增管等等)，可对该荧光进行视觉上的检测。类似地，可通过提供酶的适当底物并检测产生的反应产物来对酶标记进行检测。最后，可通过观察与该标记相关的颜色对简单的比色标记进行简单地检测。因此，在各种浸渍片测定(dipstiek assay)中，所缀合的金经常显示成粉红色，而各种缀合的珠子显示出珠子的颜色。
荧光标记是目前优选的，因为它们具有操作上需要的预防措施少、并适合高通量显像技术(光学分析包括在包含计算机的集成系统中用于分析的图像的数字化)的优点。优选的标记通常具有以下的一项或多项特征：高灵敏度、高稳定性、低背景、低环境敏感性、以及标记的高特异性。许多荧光标记可从以下公司商购获得：SIGMA化学公司(Saint Louis，MO)、Molecular Probes(Eugene，OR)、R&D systems(Minneapolis，MN)、Pharmacia LKB Biotechnology(Piscataway，NJ)、CLONTECHLaboratories，Inc.(Palo Alto，CA)、Chem Genes Corp.、Aldrich ChemicalCompany(Milwaukee，WI)、Glen Research，Inc.、GIBCO BRL LifeTechnologies，Inc.(Gaithersburg，MD)、Fluka Chemica-BiochemikaAnalytika(Fluka Chemie AG，Buchs，Switzerland)、以及AppliedBiosystems(Foster City，CA)，以及许多技术人员已知的其他的商业来源。此外，本领域的普通技术人员将认识到如何选择合适的荧光团用于特定的应用中，并且如果它不容易商购获得，则能够从头合成必需的荧光团或对可商购的荧光化合物进行合成修饰以获得所希望的荧光标记。
除了小分子荧光团外，天然发生的荧光蛋白以及此类蛋白的工程化的类似物在本发明中也是有用的。此类蛋白包括(例如)刺胞动物的绿色荧光蛋白(Ward等人Photochem.Photobiol.35：803-808(1982)；Levine等人，Comp.Biochem.Physiol.，72B：77-85(1982))、来自费氏弧菌(Vibriofischeri)菌株的黄色荧光蛋白(Baldwin等人，Biochemistry29：5509-15(1990))、来自共生甲藻属甲藻物种(dinoflagellate Symbiodinium sp.)的多甲藻黄素-叶绿素(Morris等人，Plant Molecular Biology24：673：77(1994))、来自蓝细菌(如聚球藻属(Synechococcus))的藻胆蛋白，例如藻红蛋白和藻蓝蛋白(Wilbanks等人J.BioL. Chem.268：1226-35(1993))，及类似物。
通常，在细胞毒素与靶向(或其他)剂之间形成连接(并且任选是间隔区基团)之前，这些化学官能度中的至少一个会被激活。本领域的普通技术人员将理解，可以使用许多种标准方法和条件来激活化学官能度，包括羟基、氨基以及羧基基团。例如，可以通过用光气处理形成相应的氯甲酸盐或用对硝基苯基氯甲酸盐处理形成相应的碳酸盐来激活细胞毒素或靶向剂的羟基。
在一个示例性实施方案中，本发明利用包括羧基官能度的靶向剂。羧基可通过，例如，转变为相应的酰卤或活性酯而被激活。这一反应可在March，见上第388-89页中阐述的多种条件下进行。在一个示例性实施方案中，通过含羧基的基团与草酰氯进行反应来制备酰卤。被激活的剂与细胞毒素或细胞毒素-连接臂组合进行反应，以形成本发明的缀合物。本领域的普通技术人员将理解使用含羧基的靶向剂仅仅是说明性的，并且具有许多其他官能团的物质可缀合到本发明的接头上。
反应官能团
为了阐述的清晰性，后面的讨论集中于本发明的细胞毒素与靶向剂的缀合。焦点例证了本发明的一个实施方案，从这个实施方案，本领域的技术人员很容易推断出其他的实施方案。集中讨论单个实施方案并不意味着对本发明的限制。
本发明的示例性化合物带有反应官能团，该官能团通常位于取代或未取代的烷基或杂烷基链上，使它们易附着于另一种类上。该反应基的一个有利位置是该链的末端位置。
在实施本发明时有用的反应基和反应种类通常是那些在生物缀合化学领域所熟知的反应基和反应种类。反应官能团可以是受保护的或未受保护的，并且该官能团的受保护的本性可以通过有机合成领域已知的方法进行改变。用反应性细胞毒素类似物可获得的优选的反应种类是那些在相对温和的条件下进行的反应种类。这些反应种类包括但不限于亲核取代(例如，胺和醇与酰卤、活性酯的反应)、亲电取代(例如，烯胺反应)以及碳-碳以及碳-杂原子多个键的加成(例如，迈克尔反应(Michael reaction)、第尔斯-阿尔德加成(Diels-Alder addition))。这些以及其他有用的反应讨论于例如March，Advanced Organic Chemistry，第3版，John Wiley & Sons，New York，1985；Hermanson，Bioconjugate Techniques，Academic Press，San Diego，1996；以及Feeney等人，Modification of Proteins；Advances inChemistry Series，198卷，American Chemical Society，Washington，D.C.，1982。
示例性反应类型包括羧基及其不同的衍生物的反应，羧基衍生物包括但不限于N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基苯并三唑酯、酰卤、酰基咪唑、硫酯、对硝基苯基酯、烷基、链烯基、炔基以及芳族酯。羟基基团可被转变为酯、醚、醛等。通过与例如胺、羧酸阴离子、硫醇阴离子、碳负离子或醇盐离子进行反应，卤烷基基团可被转变为新的种类。亲双烯体(例如马来酰亚胺)基团参与第尔斯-阿尔德反应。醛基或酮基基团可被转变为亚胺、腙、缩氨基脲或肟，或通过例如Grignard加成反应或烷基锂加成反应这样的机制完成这些转变。磺酰卤容易与胺进行反应，例如形成磺酰胺。胺或巯基基团被(例如)酰化、烷基化或氧化。使用环加成作用、酰化作用、迈克尔加成等，可将烯转变为一系列新的种类。环氧化物容易与胺以及羟基化合物反应。
本领域的普通技术人员将容易理解，这些连接中有许多可通过多种方法并使用多种条件产生。对于酯的制备，见例如，March见上1157页；对于硫酯，见March，见上，362-363页，491，720-722，829，941，和1172；对于碳酸酯，见March，见上，346-347页；对于氨基甲酸酯，见March，见上1156-57页；对于酰胺，见March见上at1152页；对于脲及硫脲，见March见上，1174页；对于缩醛以及缩酮，见Greene等人见上178-210和March supra，1146页；对于酰氧基烷基衍生物，见Prodrugs：Topical andOcular Drug Delivery，K.B.Sloan，编著，Marcel Dekker，Inc.，New York，1992；对于烯醇酯，见March见上1160页；对于N-磺基亚磺亚酰胺(N-sulfonylimidates)，见例如Bundgaard等人，J.Med.Chem.，31：2066(1988)；对于酸酐，见March见上at355-56，636-37，990-91，和1154；对于N-酰胺，见March见上379页；对于N-曼尼希碱，见March见上800-02，和828；对于羟甲基酮酯，见Petracek等人Annals NY Acad.Sci.，507：353-54(1987)；对于二硫化物，见March supra，1160页；以及对于磷酸酯及膦酰胺酯(phosphonamide)的制备。
反应官能团可以是未被保护的并被选择，使得它们不参与或干涉反应。备选地，反应官能团可通过保护基团的存在受到保护而不参与反应。本领域的普通技术人员将理解怎样保护特定官能团不干扰已选择的一组反应条件。对于有用的保护基的例子，参见Greene等人，Protective Groups inOrganic Synthesis，John Wiley & Sons，New York，1991。
通常，使用标准的化学技术通过靶向剂各自的化学官能度将它们共价连接至细胞毒素上。任选地，接头或物质通过一个或多个间隔区基团与该物质偶联。当组合使用时，间隔区基团可以是等效的或不同的。
通常，在细胞毒素与反应性官能团(并且任选地是间隔区基团)之间形成键之前，化学官能度中的至少一个将被激活。本领域的普通技术人员将理解，使用许多种标准方法和条件可以激活多种化学官能度，包括羟基、氨基以及羧基基团。在一个示例性实施方案中，本发明包含作为反应官能团的羧基官能度。羧基可以如以上说明被激活。
可切割的底物
本发明的可切割的底物被说明为“X2”。优选地，可切割的底物是一种可被酶切割的可切割的酶底物。优选地，这种酶优选直接或间接与待处理的肿瘤或其他靶细胞相关联。该酶可以由待处理的肿瘤或其他靶细胞产生。例如，该可切割的底物可以是肽，该肽优选可被肿瘤或其他靶细胞周围或在其中发现的一种酶切割。另外地或备选地，该酶可被附着于与肿瘤细胞进行特异结合的靶向剂，例如对肿瘤抗原特异的抗体。
作为适宜于偶联到以上说明的药物的酶可剪切的底物的例子，PCT专利申请公开文件WO00/33888、WO01/95943、WO01/95945、WO02/00263以及WO02/100353(它们均并入本文作为参考)公开了可剪切的肽与药物的附着。这种肽可被与肿瘤相关的酶剪切，例如trouase(如甲拌磷寡肽酶)、CD10(中性溶酶)、基质金属蛋白酶(如MMP2或MMP9)、II型跨膜丝氨酸蛋白酶(如Hepsin、睾蛋白(testisin)、TMPRSS4或matriptase/MT-SP1)、或组织蛋白酶。在这个实施方案中，前体药物包括以上说明的药物、肽、稳定化基团、以及任选地在药物与肽之间的连接基团。稳定化基团附着于肽末端，以保护前体药物在到达肿瘤或其他靶细胞前不被降解。适宜的稳定化基团的例子包括非氨基酸，例如琥珀酸、二甘醇酸、马来酸、聚乙二醇、焦谷氨酸、醋酸、萘羧酸、对苯二酸、以及戊二酸衍生物；以及非遗传编码的氨基酸或天冬氨酸、或谷氨酸，其在天冬氨酸的β-羧基或谷氨酸的γ-羧基处附着于肽的N末端。
肽典型地包括3至12(或更多)个氨基酸。特定氨基酸的选择将至少部分取决于将用于剪切该肽的酶，以及这种肽在体内的稳定性。适宜的可切割肽的一个例子是β-AlaLeuAlaLeu。这可与稳定化基团组合，形成琥珀酰基-β-AlaLeuAlaLeu。其他适宜的可切割肽的例子提供于以上引用的文献中。
作为一个说明性实例，CD10，也被称为中性溶酶、中性内肽酶(NEP)、以及常见急性淋巴细胞白血病抗原(CALLA)，是II型细胞-表面锌依赖型金属蛋白酶。适宜用于CD10的可切割的底物包括LeuAlaLeu以及IleAlaLeu。其他已知的用于CD10的底物包括长度达50个氨基酸的肽，尽管催化效率常随底物变大而降低。
另一个说明性实例基于基质金属蛋白酶(MMP)。作为也许是与肿瘤有关的最佳表征的蛋白水解酶，在肿瘤微环境中MMP的激活存在明显的相关性。特别是，已经对可溶性基质酶MMP2(明胶酶A)以及MMP9(明胶酶B)进行了深入研究，并且它们在包括肿瘤生长在内的组织重塑中显示出被选择性地激活。已设计出可被MMP2以及MMP9剪切的肽序列并测试了以下物质的缀合物：葡聚糖和氨甲蝶呤(Chau等人，Bioconjugate Chem.15：931-941(2004))；PEG(聚乙二醇)和多柔比星(Bae等人，Drugs Exp.Clin.Res.29：15-23(2004))；以及白蛋白和多柔比星(Kratz等人Bioorg.Med. Chem.Lett.11：2001-2006(2001))。适宜与MMP一起使用的序列的实例包括但不限于：ProValGlyLeuIleGly(SEQ IDNO：102)、GlyProLeuGlyVal(SEQ ID NO：103)、GlyProLeuGlyIleAlaGlyGln(SEQ ID NO：104)、ProLeuGlyLeu(SEQ IDNO：105)、GlyProLeuGlyMetLeuSerGln(SEQ ID NO：106)、以及GlyProLeuGlyLeuTrpAlaGln(SEQ ID NO：107)。(参见例如，前文引用的参考文献连同Kline等人，Mol.Pharmaceut.1：9-22(2004)以及Liu等人，Cancer Res.60：6061-6067(2000))。也可使用其他可切割的底物。
又一个实例是II型跨膜丝氨酸蛋白酶。这一组酶包括例如hepsin、睾蛋白、以及TMPRSS4。GlnAlaArg是一种底物序列，该序列与蛋白裂解酶(matriptase)/MT-SP1(在乳腺癌和卵巢癌中被过表达)一起使用，并且LeuSerArg与hepsin(在前列腺和其他一些肿瘤类型中被过表达)一起使用。(参见例如，Lee等人，J.Biol. Chem.275：36720-36725以及Kurachi和Yamamoto，Handbook of Proeolytic Enzymes2卷，第2版(Barrett AJ，Rawlings ND & Woessner JF，eds)第1699-1702页(2004))。也可使用其他可切割的底物。
另一类型的可切割的底物的安排包括制备能够剪切该可切割的底物的单独的酶，该底物变得与肿瘤或细胞相关联。例如，酶能够偶联到肿瘤特异的抗体(或其他实体，该实体优选地被吸引至肿瘤上或其他靶细胞上，例如受体配体)上，然后该酶-抗体缀合物可提供给患者。酶-抗体缀合物可定向到肿瘤相关的抗原并与之结合。随后，将该药物-可切割的底物缀合物作为前体药物提供给患者。当药物-可切割的底物缀合物与已变得与肿瘤相结合的酶相互作用时，药物只在肿瘤附近释放，这样可切割的底物被剪切并且药物被释放。例如，美国专利号4,975,278；5,587,161；5,660,829；5,773,435；以及6,132,722，所有文献都并入本文作为参考，公开了这种安排。适宜的酶以及底物的例子包括但不限于，β-内酰胺酶以及头孢菌素衍生物、羧肽酶G2及谷氨酸及天冬氨酸的叶酸衍生物。
在一个实施方案中，酶-抗体缀合物包括抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段是基于它对于目的靶细胞或靶位点上表达的抗原的特异性来进行选择。在上文提供了抗体的讨论。适宜的头孢菌素-可切割的底物的一个例子是
缀合物的实例
本发明的接头及可剪切的底物可用于包含多个配偶体分子的缀合物中。本发明的缀合物的例子在以下作进一步详尽的说明。除非特别指出，如以上所给出的涉及细胞毒素、接头、以及可剪切底物的章节对取代基进行限定。
A.接头缀合物
适宜的缀合物的一个例子是下式的化合物：
其中L1是自消接头，m是整数0、1、2、3、4、5、或6；F是包含以下结构的接头：
其中AA1是一个或多个独立地选自以下的成员：天然氨基酸以及非天然α-氨基酸；c是从1-20的一个整数；L2是自消接头并且包括
其中每个R17、R18、及R19独立地选自H、取代的或未取代的烷基，取代的或未取代的杂烷基以及取代的或未取代的芳基，并且w是从0-4的整数；o是1；L4是接头成员；p是0或1；X4是选自以下的成员：受保护的反应官能团、未被保护的反应官能团、可检测的标记、以及靶向剂；并且D包含如下结构：
其中环状体系A是选自以下的成员：取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基以及取代的或未取代的杂环烷基；E和G是独立地选自以下的成员：H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、杂原子、单键，或者E和G相结合形成环状体系，该环状体系选自取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基以及取代的或未取代的杂环烷基；X是选自以下的成员：0、S以及NR23；R23是选自以下的成员：H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、以及酰基；R3是OR11，其中R11是选自以下的成员：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、磺酸酯、酰基、C(0)R12R13、C(0)OR12、C(0)NR12R13、P(0)(0R12)2、C(0)CHR12R13、SR12及SiR12R13R14，R4、R4’、R5及R5’是独立地选自以下的成员：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基、未取代的杂环烷基、卤素、NO2、NR15R16、NC(0)R15、OC(0)NR15R16、OC(0)OR15、C(0)R15、SR15、OR15、CR15＝NR16、以及0(CH2)nN(CH3)2，或者R4、R4’、R5及R5’的任何邻近的一对与它们所附着的碳原子一起相结合，形成具有4-6元的取代的或未取代的环烷基或者杂环烷基环状体系；其中n是从1-20的一个整数；R15和R16独立地选自H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的杂环烷基、以及取代的或未取代的肽基，其中R15和R16与它们所附着的氮原子一起进行任选地结合，形成具有4-6元的，任选地包含两个或多个杂原子的取代的或未取代的杂环烷基环状体系；R6是单键，它存在或不存在，并且当存在时，R6和R7相结合形成环丙基环；并且R7是与R6在所述环丙基环中结合的CH2-X1或-CH2-，其中X1是离去基团，其中R11将所述药物连接至L1(如果存在)，或连接至F。
在一些实施方案中，药物具有以上的结构(c)或(f)。适宜作为缀合物使用的化合物的一个具体的例子是
一类缀合物的另一个例子是具有下式的化合物
其中L1是自消接头；m是整数0、1、2、3、4、5、或6；F是包括以下结构的接头：
其中AA1是独立地选自以下的一个或多个成员：天然氨基酸和非天然α-氨基酸；c是从1到20的整数；L2是自消接头；o是0或1；L4是接头成员；p是0或1；X4是选自受保护的反应官能团、未受保护的反应官能团、可检测的标记、以及靶向剂的成员；并且D包含以下结构：
其中环状体系A是选自取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、以及取代或未取代的杂环烷基基团的成员；E和G是独立选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、杂原子、单键的成员，或者E和G相结合，形成一个环状体系，该环状体系选自取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、以及取代或未取代的杂环烷基；X是选自0、S以及NR23的成员；R23是选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及酰基的成员；R3是选自以下的成员：(＝O)、SR11、NHR11以及OR11，其中R11选自以下的成员：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、磺酸酯、酰基、C(0)R12R13、C(O)0R12、C(0)NR12R13、P(0)(0R12)2、C(0)CHR12R13、SR12以及SiR12R13R14，其中R12、R13、及R14是独立选自以下的成员：H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及取代或未取代的芳基，其中R12和R13与它们所附着的氮原子或碳原子一起可任选地连接以形成一个取代或未取代的杂环烷基环状体系，该环状体系具有4到6元，任选地包含两个或更多个杂原子；R4、R4’、R5及R5’是独立选自以下的成员：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基、未取代的杂环烷基、卤素、NO2、NR15R16、NC(0)R15、0C(0)NR15R16、OC(0)0R15、C(0)R15、SR15、0R15、CR15＝NR16、以及0(CH2)nN(CH3)2，或者R4、R4’、R5及R5’的任何相邻对与它们所附着的碳原子连接在一起以形成一个具有4到6元的、取代或未取代的环烷基或杂环烷基环状体系，其中n是从1到20的整数；R15和R16独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基、以及取代或未取代的肽基，其中R15和R16与它们所附着的氮原子一起可任选地相连接以形成一个取代或未取代的杂环烷基环状体系，该环状体系具有4到6元，任选地包含两个或更多杂原子；其中R4、R4’、R5及R5’中的至少一个连接所述药物到L1(如果存在)上，或连接至F上，并且包括
其中v是从1到6的整数；并且R27、R27’、R28及R28’各自独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、以及取代或未取代的杂环烷基；R6是单键，它存在或者不存在，并且当存在时，R6和R7相结合，形成环丙基环；并且R7是在所述环丙基环中与R6结合的CH2-X1或-CH2-，其中X1是离去基团。
在一些实施方案中，药物具有以上的结构(c)或(f)。适宜作为缀合物使用的化合物的一个具体的例子是
其中r是从0到24范围内的整数。
适宜的缀合物的另一个例子是具有下式的化合物：
其中L1是自消接头；m是整数0、1、2、3、4、5、或6；F是包括以下结构的接头：
其中AA1是独立地选自以下的一个或多个成员：天然氨基酸和非天然α-氨基酸；c是从1到20的整数；L3是含有伯胺或仲胺或羧基官能团的间隔区基团；其中如果L3存在，则m是0，并且L3的胺与D的侧羧基官能团形成酰胺键或者L3的羧基与D的侧胺官能团形成酰胺键；o是0或1；L4是接头成员，其中L4包括
其直接附着到(AA1)c的N端上，其中R20是选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及酰基的成员，R25、R25’、R26、以及R26’各自独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、以及取代或未取代的杂环烷基；并且s和t独立地是从1到6的整数；p是1；X4是选自以下的成员：受保护的反应官能团、未受保护的反应官能团、可检测的标记、以及靶向剂；并且D含有以下结构：
其中环状体系A是选自取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、以及取代或未取代的杂环烷基基团的成员；E和G是独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、杂原子、单键的成员，或者E和G相结合，形成一个环状体系，该环状体系选自取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、以及取代或未取代的杂环烷基；X是选自O、S以及NR23的成员；R23是选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及酰基的成员；R3是选自以下的成员：(＝0)、SR11、NHR11以及0R11，其中R11是选自以下的成员：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、磺酸酯、酰基、C(0)R12R13、C(0)0R12、C(0)NR12R13、P(0)(0R12)2、C(0)CHR12R13、SR12以及SiR12R13R14，其中R12、R13和R14是独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及取代或未取代的芳基的成员，其中R12和R13与它们所附着的氮原子或碳原子一起可任选地相连接以形成一个取代或未取代的杂环烷基环状体系，该环状体系具有4到6元，任选地包含两个或更多个杂原子；R4、R4’、R5以及R5’是独立选自以下的成员：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基、未取代的杂环烷基、卤素、NO2、NR15R16、NC(0)R15、0C(0)NR15R16、0C(O)OR15、C(O)R15、SR15、0R15、CR15＝NR16、以及0(CH2)nN(CH3)2，或R4、R4’、R5以及R5’的任何相邻对与它们所附着的碳原子连接在一起以形成一个具有4到6元的、取代或未取代的环烷基或杂环烷基环状体系，其中n是从1到20的整数；R15和R16是独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基、以及取代或未取代的肽基，其中R15和R16与它们所附着的氮原子一起可任选地相连接以形成一个取代或未取代的杂环烷基环状体系，该环状体系具有4到6元，任选地包含两个或更多杂原子；R6是单键，存在或者不存在，并且当R6存在时，R6和R7相结合，形成环丙基环；并且R7是在所述环丙基环中与R6结合的CH2-X1或-CH2-，其中X1是离去基团，其中R4、R4’、R5、R5’、R15或R16中的至少一个将所述药物连接至L1(如果存在)上，或连接至F上。
在一些实施方案中，该药物具有以上结构(c)或(f)。适宜作为缀合物使用的化合物的一个具体例子是
其中r是从0-24范围内的整数。
其他的适宜作为缀合物使用的化合物的例子包括：
以及
其中R是
并且r是从0-24范围内的一个整数。
也可使用具有结构(g)的药物形成缀合物，例如以下化合物：
(其中r是从0-24范围内的一个整数)。
也可用具有以下结构的药物形成缀合物：
以及
此类毒素的合成，以及关于它们连接到抗体的细节披露于系列号为60/991，300的美国专利申请中。
B.可切割的接头缀合物
适宜的缀合物的一个例子是具有以下结构的化合物：
其中L1是自消间隔区；m是0、1、2、3、4、5、或6的整数；X2是可切割的底物；并且D含有以下结构：
其中环状体系A是选自取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、以及取代或未取代的杂环烷基基团的成员；E和G是独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、杂原子、单键的成员，或者E和G结合形成一个环状体系，该环状体系选自取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、以及取代或未取代的杂环烷基；X是选自O、S以及NR23的成员；R23是选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及酰基的成员；R3是选自以下的成员：(＝0)、SR11、NHR11以及0R11，其中R11是选自以下的成员：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、磺酸酯、酰基、C(0)R12R13、C(O)OR12、C(0)NR12R13、P(O)(0R12)2、C(0)CHR12R13、SR12以及SiR12R13R14，其中R12、R13以及R14是独立选自以下的成员：H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及取代或未取代的芳基，其中R12和R13与它们所附着的氮原子或碳原子一起可任选地相连接以形成一个取代或未取代的杂环烷基环状体系，该环状体系具有4到6元，任选地包含两个或更多个杂原子；R6是单键，它存在或者不存在，并且当R6存在时，R6和R7结合形成环丙基环；并且R7是在所述环丙基环中与R6结合的CH2-X1或-CH2-，其中X1是离去基团，R4、R4’、R5以及R5’是独立选自以下的成员：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基、未取代的杂环烷基、卤素、NO2、NR15R16、NC(O)R15、0C(0)NR15R16、OC(O)0R15、C(O)R15、SR15、OR15、CR15＝NR16、以及0(CH2)nN(CH3)2，或R4、R4’、R5以及R5’的任何相邻的一对与它们所附着的碳原子连接在一起以形成一个具有4到6元的、取代或未取代的环烷基或杂环烷基环状体系，其中n是从1到20的整数；R15和R16独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基、以及取代或未取代的肽基，其中R15和R16与它们所附着的氮原子一起可任选地相连接以形成一个取代或未取代的杂环烷基环状体系，该环状体系具有4到6元，可任选地包含两个或更多个杂原子；其中R4、R4’、R5以及R5’中的至少一个将所述药物连接至L1(如果存在)上，或连接至X2上，并且选自：
其中R30、R30’、R31以及R31’各自独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、以及取代或未取代的杂环烷基；并且v是从1到6的整数。
适宜的可切割的接头的例子包括β-AlaLeuAlaLeu以及
药物组会物
在另一方面，本公开提供了一种组合物，例如药物组合物，该组合物包含本公开的一种单克隆抗体或多种单克隆抗体的组合、或它们的一个或多个抗原结合部分，并与可药用的载体共同配制而成。这种组合物可包含本公开的一种抗体或(例如，两种或多种不同的)多种抗体的组合、或免疫缀合物、或双特异性分子。例如，本公开的药物组合物可以包含多种抗体(或免疫缀合物、或双特异性分子)的组合，其与该靶抗原上的不同表位结合、或具有互补的活性。
还可以在联合治疗中施用本公开的药物组合物(即，与其他药物组合)。例如，该联合疗法可以包括本公开的抗-CD22抗体，该抗-CD22抗体与至少一种其他抗癌剂、抗免疫剂或免疫抑制剂组合。以下在本公开的关于抗体用途的章节中对可用于联合治疗的治疗剂的实例进行了更加详尽的说明。
如此处使用的“可药用的载体”包括任何及全部的生理学上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂及抗真菌剂、等渗剂及吸收延缓剂等。优选地，该载体适宜于静脉内、肌内、皮下、胃肠外、脊髓或表皮给药(例如通过注射或输注)。依据给药途径，活性化合物(即抗体、免疫缀合物、或双特异性分子)可用材料包被以保护该化合物免受可能导致该化合物失活的酸以及其他自然条件的作用。
本公开的药物化合物可包含一种或多种可药用的盐。“可药用的盐”是指一种盐，它保持了亲本化合物的希望的生物活性并不会引起任何不希望的毒理学效应(参见例如Berge，S.M.，等人(1977)J.Pharm.Sci.66：1-19)。这种盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括源自无毒无机酸的盐，例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、磷酸等，以及源自无毒有机酸的盐，例如脂肪族单羧酸及二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳香酸、脂肪族及芳香族磺酸等。碱性加成盐包括源自碱土金属的盐，例如钠、钾、镁及钙等的盐，以及源自无毒有机胺的盐，例如N，N′-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺及普鲁卡因等。
本公开的药物组合物还可包含可药用的抗氧化剂。可药用的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)，丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯及α-生育酚等；以及(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸及磷酸等。
在本公开的药物组合物中可以采用的适宜的水性及非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇及聚乙二醇等)，以及它们的适宜的混合物、植物油，如橄榄油，以及可注射的有机酯，例如油酸乙酯。例如通过使用包衣材料(如卵磷脂)、通过维持分散系中所需颗粒的大小、以及通过使用表面活性剂，可以维持适当的流动性。
这些组合物还可包含佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂及分散剂。可通过灭菌程序(见上文)，以及通过加入不同的抗细菌剂及抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等)均可确保防止微生物的存在。将等渗剂(如糖及氯化钠等)包含进入这些组合物中也可能是令人希望的。另外，通过包含延迟吸收的物质(如单硬脂酸铝及明胶)可以实现可注射药物形式的延长吸收。
可药用的载体包括无菌水溶液或分散系(dispersion)、以及用于无菌注射溶液或分散系的即时配制的无菌粉末。用于药学活性物质的这种介质及物质的使用在本领域中是已知的。除了与活性化合物不相容的任何常规介质或物质之外，可考虑它在本公开的多种药学组合物中使用。还可以在这些组合物中掺入辅助性活性化合物。
治疗组合物通常必须是无菌的并且在制造及存储条件下是稳定的。该组合物可以被配制成溶液、微乳剂、脂质体、或者其他适于高药物浓度的有序结构。该载体可以是溶剂或分散介质，包含例如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇，以及液体聚乙二醇等)，以及它们的适宜的混合物。例如，通过使用一种包衣(如卵磷脂)、通过维持分散系中所需颗粒的大小、以及通过使用表面活性剂，可维持适合的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露醇、山梨醇)，或氯化钠。通过在组合物中包含延迟吸收的物质，例如单硬脂酸盐及明胶，可以实现可注射组合物的延长吸收。
通过在适当的溶剂中所需量的活性化合物与以上列举的多种组分中的一种或组合(按照需要)相掺和、然后进行无菌微过滤即可制备出无菌注射液。总体上，通过将活性化合物掺入至无菌载体(它包含基本分散介质及上述列举的所需的其他组分)来制备分散体。对于用于制备无菌注射液的无菌粉末的情况，优选的制备方法是真空干燥及冷冻干燥(冻干)，制得该活性组分以及任何来自其预先无菌过滤的溶液的其他希望的组分的粉末。
与载体物质组合以产生单一剂型的活性组分的量值将随着正在接受治疗的受试者及具体给药方式而变化。与载体物质组合以产生单一剂型的活性组分的量一般是产生治疗效果的组合物的量。总体上讲，在100％的数量内，与可药用的载体组合的活性组分的量大约是从0.01％至约99％的范围内，优选从约0.1％至约70％，最优选从约1％至约30％。
对剂量方案进行调节以提供最佳的理想的反应(如治疗反应)。例如，可给予单次大丸剂，可以随时间施用几次分份剂量，或者根据治疗情况的紧急程度所示按比例减少或增加剂量。为给药方便以及剂量统一而按剂量单位形式配制成肠胃外组合物尤为有利。此处使用的剂量单位形式指用于待治疗的受试者单一剂量所适合的物理上不连续的单位；每个单位包含经计算能与所需的药学载体相结合产生理想的疗效的预定量的活性化合物。本公开的剂量单位形式的说明由以下因素决定并直接取决于以下因素：(a)活性化合物的独特特性及待实现的特定疗效，以及(b)配制这种用于治疗个体敏感性的活性化合物的领域中固有的局限性。
对于该抗体的给药，剂量范围为约0.0001至100mg/kg，并且更经常是0.01至5mg/kg宿主体重。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或者在1至10mg/kg的范围内。一种示例性治疗方案限定为每周给药一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每三个月一次或每3至6个月一次。本公开的抗-CD22抗体的优选的剂量方案包括通过静脉内给药1mg/kg体重或3mg/kg体重，使用以下剂量方案之一给予抗体：(i)每4周给予6个剂量，之后每3个月给药；(ii)每三周给药；(iii)3mg/kg体重一次给药，接着每三周按1mg/kg体重给药。
在一些方法中，两种或多种具有不同的结合特异性的单克隆抗体被同时给药，这种情况下，所给予的每种抗体的剂量都在所指示的范围之内。通常在多个时间点给予抗体。单个剂量之间的间隔可以是，例如一周、一个月、每三个月或一年。间隔也可以是不规则的，如通过测量患者的针对靶抗原的抗体的血液水平所指示。在一些方法中，调整剂量使血浆抗体浓度大约是1至1000μg/ml，并且在一些方法中大约是25至300μg/ml。
备选地，抗体可以作为缓释制剂给药，在这种情况中需要以较低频率给药。剂量及频率随抗体在患者体内的半衰期而变。一般而言，人抗体的半衰期最长，其次是人源化抗体、嵌合抗体、以及非人抗体。给药的剂量及频率可根据治疗是预防性的或是治疗性的而变化。在预防性应用时，在很长的一段时间内以相对较不频繁的间隔给予相对少的剂量。一些患者在其余生中继续接受治疗。在治疗性的应用时，有时需要在相对较短的间隔内给予相对较高的剂量直至疾病缓减或终止，并且优选地直至患者显示疾病症状的部分或完全改善。之后，该患者可以接受预防性的给药方案。
为用于与细胞增殖异常有关的疾病预防和/或治疗，所施用化合物的循环浓度优选为大约0.001μM到20μM，优选大约0.01μM到5μM。
此处说明的化合物的患者口服给药剂量典型地是从大约1mg/天到大约10,000mg/天的范围内，更典型地从大约10mg/天到大约1,000mg/天，并且最典型地从大约50mg/天到大约500mg/天。按照患者体重所述，典型的剂量是从大约0.01到大约150mg/kg/天的范围内，更典型地从大约0.1到大约15mg/kg/天，并且最典型地从大约1到大约10mg/kg/天，例如5mg/kg/天或3mg/kg/天。
在至少一些实施方案中，患者的阻滞或抑制肿瘤生长的剂量可以是1μmol/kg/天或者更少。例如，患者的剂量可以是0.9、0.6、0.5、0.45、0.3、0.2、0.15或0.1μmol/kg/天或更小(指药物的摩尔)。优选地，抗体-药物缀合物当在至少5天时间内以日剂量给药时，阻止肿瘤的生长。在至少一些实施方案中，该肿瘤为SCID小鼠体内的人型的肿瘤。作为一个例子，SICD小鼠可以是CB17.SCID小鼠(可从Taconic，Germantown，NY获得)。
可以改变本公开的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平，以获得针对特定患者、组合物及给药方式而言有效实现所希望的治疗反应而对患者无毒的活性成分的量。所选的剂量水平将取决于多种药物代谢动力学因素，包括采用的本公开的特定组合物或其酯、盐、或酰胺的活性，给药途径，给药时间，所用的特定化合物的排泄速率，疗程，在与所采用的特定组合物组合中使用的其他药物、化合物和/或材料，正在接受治疗的患者的年龄、性别、体重、状态、总体健康状态和病史，以及在医学领域众所周知的类似因素。
本公开的抗CD22抗体的“治疗有效剂量”优选地导致减轻疾病症状的严重程度、延长无疾病症状时间的频率及持续时间、或防止由于该病痛产生的损害或残疾。例如，对于CD22阳性肿瘤的治疗而言，“治疗有效剂量”优选地抑制细胞生长或肿瘤生长至少约20％，更优选至少约40％，甚至更优选至少约60％，并仍更优选至少约80％(相对于未治疗的受试者)。化合物抑制肿瘤生长的能力可以在预测人类肿瘤功效的动物模型系统中进行评价。备选地，组合物的这一特性可通过检验该化合物的抑制细胞生长能力来评价，这种抑制作用可通过有经验的从业者已知的测定方法在体外测定。治疗性化合物的治疗有效量可减小肿瘤的大小，或者缓解受试者的症状。本领域的技术人员应能根据受试者的大小、受试者症状的严重程度、以及所选具体组合物或所选择的给药途径等因素而确定这种量值。
使用本领域已知的一种或多种方法通过一种或多种给药途径可以对本公开的组合物进行给药。如技术人员应当理解，给药途径和/或方式将随所希望的结果而变化。本公开的抗体的优选给药途径包括静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、脊髓或其他胃肠外给药途径，例如通过注射或输注。此处使用的短语“胃肠外给药”是指除了肠内及局部给药外的其他给药方式，通常通过注射，并包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下腔、脊柱内、硬膜外及胸骨内注射及输注。
备选地，本公开的抗体可经非胃肠外途径进行给药，非胃肠外途径例如局部、表皮或粘膜途径给药，例如经鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部途径给药。
活性化合物可用载体制备，该载体将保护化合物免于快速释放，例如控释制剂，包括植入剂、经皮贴剂、以及微囊化递送系统。可以使用生物降解的、生物相容性的聚合物，例如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯、以及聚乳酸。用于制备这种制剂的许多方法已获得专利，或者是本领域技术人员所熟知的。参见，例如Sustained and ControlledRelease Drug Delivery SystemsJ.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，NewYork，1978。
治疗组合物可利用本领域中已知的医用装置进行给药。例如，在优选的实施方案中，本公开的治疗组合物可利用无针皮下注射装置进行给药，例如在美国专利号5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824或4,596,556中所披露的装置。在本公开中有用的熟知的植入剂与装置的实例包括：美国专利号4,487,603，它披露了用于以受控速度释放药物的一种可植入式微量输注泵；美国专利号4,486,194，它披露了用于通过皮肤给药的一种治疗装置；美国专利号4,447,233，它披露了用于以精确的输注速度递送药物的一种药物输注泵；美国专利号4,447,224，它披露了用于持续药物递送的一种可变流速的可植入输注装置；美国专利号4,439,196，它披露了一种具有多腔区室的渗透药物送递系统；以及美国专利号4,475,196，它披露了一种渗透药物送递系统。这些专利通过引用并入本文。许多其他这种植入剂、递送系统、以及模型是本领域技术人员已知的。
在某些实施方案中，对本公开的人类单克隆抗体进行配制以确保其在体内分布适宜。例如，血脑屏障(BBB)阻止了许多高亲水性化合物。为确保本公开的治疗性化合物穿过BBB(如果需要时)，(例如)可以将它们配制在脂质体中。用于制造脂质体的方法，参见，例如，美国专利号4,522,811；5,374,548；以及5,399,331。这些脂质体可能包含一个或多个部分，这些部分被选择性地输送到特定的细胞或器官中，由此增强靶标药物的递送(参见，例如V.V.Ranade J.Clin.Pharmacol.29：685，(1989))。示例性靶向部分包括叶酸或生物素(参见，例如Low等人的美国专利号5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等人，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗体(P.G.Bloeman et al(1995)FEBS Lett.357：140；M.Owais等人(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180)；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe等人(1995)Am.J.Physiol.1233：134)；D120(Schreier等人(1994)J.Biol. Chem.269：9090)；也参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346；123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods4：273。
本公开的方法与用途
本公开的抗体，特别是人抗体、抗体组合物、以及方法具有多种体外和体内诊断与治疗用途，包括CD22参与的一些疾病与病症的诊断和治疗。例如，可在体外或离体地将这些分子对培养的细胞给药，或者例如在体内，对人受试者给药，以治疗、预防并诊断多种病症。
在此使用的术语“受试者”旨在包括人及非人动物。非人动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物及非哺乳动物，例如，非人灵长类动物、绵羊、犬、猫、牛、马、鸡、两栖动物、以及爬行动物。优选的受试者包括患有由CD22活性介导的病症的人患者。当CD22的抗体与另一种物质联合给药时，这两种物质可以依次或者同时给药。
考虑到本公开的抗体对CD22的特异性结合，本公开的抗体可用于在细胞表面专门检测CD22的表达，而且还可用于通过免疫亲和纯化对CD22进行纯化。
在体内或体外施用本公开的抗体组合物(例如，人单克隆抗体、多特异性及双特异性分子、以及免疫缀合物)的适宜途径在本领域中是所熟知，并且可由那些普通技术人员进行选择。例如，可通过注射(例如，经静脉内或皮下)施用这些抗体组合物。所用的分子的适宜剂量将取决于受试者的年龄及体重以及抗体组合物的浓度和/或配方。
如前所述，本公开的人抗-CD22抗体可与一种或其他多种治疗剂(例如，细胞毒剂、放射性毒剂或免疫抑制剂)进行共同给药。可将抗体连接至治疗剂(作为免疫复合物)上，或者可与该治疗剂分开给药。在后一种(分开给药)情况下，该抗体可以在该治疗剂之前、之后给药、或与该治疗剂同时给药，或者可以与其他已知疗法(例如，抗癌疗法，如放射)进行共同给药。此类治疗剂包括抗肿瘤剂，例如多柔比星(阿霉素)、顺铂硫酸博来霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、以及环磷酰胺羟基脲等，它们自身只在对患者有毒性或亚毒性的水平时才是有效的。以每四周一次100mg/kg的剂量经静脉内给予顺铂，并且以每21天一次60-75mg/ml的剂量经静脉内给予阿霉素。本公开的人抗-CD22抗体，或它们的抗原结合片段与化疗剂的共同给药，提供了两种抗癌剂，这两种抗癌剂通过不同的机制起作用，产生针对人肿瘤细胞的细胞毒效应。这种共同给药可解决由于对药物发展了抗性或由于肿瘤细胞的抗原性的变化(这种变化会导致这些肿瘤细胞与该抗体不反应)所引起的问题。
本公开的靶标特异性效应细胞，例如与组合物(例如，人抗体、多特异性分子以及双特异性分子)相连接的效应细胞，也可被用作治疗剂。用于靶向的效应细胞可以是人白细胞，例如，巨噬细胞、嗜中性粒细胞或单核细胞。其他细胞包括嗜酸性粒细胞、天然杀伤细胞以及其他带有IgG-或IgA-受体的细胞。如果需要，效应细胞可从待治疗的受试者体内获得。这些靶特异的效应细胞可作为生理学上可接受的溶液中的细胞悬液进行给药。施用的细胞数可以是108-109数量级，但会根据治疗目的有所变化。通常，该量值足以定位于该靶细胞(例如表达CD22的肿瘤细胞)，并且通过例如吞噬作用产生细胞杀伤作用。给药途径也可以改变。
靶标特异性效应细胞的疗法可与其他去除所靶向的细胞的技术联合进行。例如，使用本公开的组合物(例如，人抗体、多特异性分子以及双特异性分子)和/或带有这些组合物的效应细胞的抗肿瘤疗法可以与化学疗法联合使用。额外地，联合免疫疗法可用于指导两种不同的细胞毒性效应群针对肿瘤细胞的排斥。例如，与抗FcγRI或抗CD3相连接的抗-CD22抗体可与IgG-或IgA-受体特异的结合剂联合使用。
本公开的双特异性分子及多特异性分子也可用于调节效应细胞上的FcγR或FcγR水平，例如通过对细胞表面的受体进行的遮蔽及清除。抗-Fc受体的混合物也可用于这一目的。
在补体存在时，还可使用具有补体结合位点的本公开的组合物(例如，人抗体、人源化抗体、或嵌合抗体、多特异性及双特异性分子、以及免疫缀合物)，这些补体结合位点例如来自IgG1、IgG2、或IgG3、或IgM的结合补体的部分。在一个实施方案中，细胞群(包括具有本公开的结合剂的靶细胞及合适的效应细胞)的离体治疗可通过添加补体或包括补体的血清进行补充。包被有本公开的结合剂的靶细胞的吞噬作用可通过补体蛋白结合得以改善。在另一个实施方案中，包被有本公开的组合物(例如，人抗体、多特异性及双特异性分子)的靶细胞还可被补体裂解。在又一实施方案中，本公开的组合物不激活补体。
本公开的组合物(例如，人抗体、人源化抗体、或嵌合抗体、多特异性及双特异性分子以及免疫缀合物)也可与补体一起给药。因此，在本公开的范围内是包含人抗体、多特异性或双特异性分子及血清或补体的组合物。这些组合物是有利的，因为补体位于接近人抗体、多特异性或双特异性分子的位置。可选地，本公开的人抗体、多特异性或双特异性分子，与补体或血清，可以被分开给药。
本公开的抗体也可以与一种或多种其他治疗性抗体或其他结合剂(例如Ig融合蛋白)联合使用。其他抗体或结合剂(本公开的抗-CD22抗体可以与其进行组合给药)的非限制性实例包括CTLA-4、PSMA、CD30、IP-10、IFN-γ、CD70、PD-1、PD-L1、TNF、TNF-R、VEGF、VEGF-R、CCR5、IL-1、IL-18、IL-18R、CD19、Campath-1、EGFR、CD33、CD20、Her-2、CD25、gpIIb/IIIa、IgE、CD11a、α4整联蛋白的抗体或结合剂。
同样在本公开范围内的是包含本公开的抗体组合物(例如，人抗体、双特异性或多特异性分子，或免疫缀合物)及使用说明书的试剂盒。该试剂盒可以进一步包括一种或更多种其他试剂，例如免疫抑制试剂、细胞毒剂或放射性毒剂、或一种或更多种本公开的其他的人抗体(例如，有互补活性的人抗体，其结合的CD22抗原中的表位与该第一人抗体的不同)。
因此，由本公开的抗体组合物治疗的患者可(在施用本公开的人抗体之前、同时或之后)被额外地施用另一种治疗剂，例如细胞毒剂或放射毒剂，这增强或放大这些人抗体的治疗效果。
在其他实施方案中，可以用一种物质对受试者进行额外地治疗，该物质通过例如，用细胞因子治疗受试者，对Fcγ或Fcγ受体的表达或活性进行调整(例如增强或抑制)。用多特异性分子治疗过程中优选的用于施用的细胞因子包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-γ(IFN-γ)、以及肿瘤坏死因子(TNF)。
本公开的组合物(例如，人抗体、多特异性及双特异性分子)还可用于靶向表达CD22的细胞，例如为了对此类细胞进行标记。对于这种用途，可将结合剂与可被检测的分子相连接。因此，本公开提供了离体或体外对表达CD22的细胞进行定位的方法。该可检测的标记可以是，例如放射性同位素、荧光化合物、酶、或酶辅因子。
在一个具体的实施方案中，本公开提供了检测CD22抗原在样品中的存在、或者测量CD22抗原的量的方法，这些方法包括：将该样品及对照样品与人单克隆抗体、或其抗原结合部分相接触，该抗体或其抗原结合部分在允许抗体或其部分与CD22之间形成复合物的条件下特异性地结合至CD22上。然后检测复合物的形成，其中与对照样品相比，在样品之间形成差异复合物指示在样品中存在CD22抗原。
在又一个实施方案中，本发明的免疫缀合物可用于通过将此类化合物(例如，治疗剂、标记、细胞毒素、放射性毒素免疫抑制剂等)与抗体相连接而将化合物靶向表达CD22的细胞。例如，抗-CD22抗体可与披露于美国专利号6,281,354以及6,548,530、美国专利公开号20030050331、20030064984、20030073852、以及20040087497或在WO03/022806公开的中描述的毒素化合物中任何化合物相缀合。这样，本发明还提供了用于离体地或者在体内将表达CD22的细胞(例如，具有可检测的标记，例如放射性同位素、荧光化合物、酶、或酶辅因子)定位的方法。可选地，免疫缀合物可被用于通过将细胞毒素或放射性毒素靶向CD22而杀伤具有CD22细胞表面受体的细胞。
已知CD22在高百分比的B细胞淋巴瘤上进行表达且也已知CD22参与调控B细胞活性，从而使经CD22的靶向而治疗自身免疫性疾病。因此，在这些临床情况的每一种情况中，本公开的抗-CD22抗体(与免疫缀合物以及双特异性分子)可以被用来调节CD22活性。
因此，在一方面，本发明提供了抑制表达CD22的肿瘤细胞的生长的方法。该方法包括用本发明的抗体、或其抗原结合部分与表达CD22的肿瘤细胞相接触，这样使表达CD22的肿瘤细胞的生长受到抑制。优选地，表达CD22的肿瘤细胞是B细胞淋巴瘤，例如非霍奇金淋巴瘤。其他类型的表达CD22的肿瘤细胞包括伯基特淋巴瘤(Burkitt’s lymphomas)与B细胞慢性淋巴细胞白血病。
在一个抑制肿瘤细胞生长的方法的实施方案中，该抗体、或其抗原结合部分与配偶体分子相缀合，该配偶体分子例如治疗剂，例如细胞毒素、放射性同位素或化疗剂。在其他实施方案中，该抗体、或其抗原结合部分与一个或多个其他抗肿瘤剂组合进行给药。该抗体可与其他癌症治疗(例如手术和/或放射)联合，和/或与其他抗-肿瘤剂(例如以上所讨论并给出的抗-肿瘤剂)联合，所述其他抗-肿瘤的试剂包括化疗药物以及其他抗肿瘤的抗原抗体，包括但不限于抗CD20抗体(例如，)。
在另一方面，本发明提供了治疗受试者的炎症或自身免疫病症的方法。该方法包括向受试者施用本发明的抗体、或其抗原结合部分，这样使受试者的炎症或自身免疫病症得到治疗。优选的自身免疫病症的非限制性实例包括系统性红斑狼疮以及类风湿性关节炎。自身免疫病症的其他实例包括炎症性肠病(包括溃疡性结肠炎以及克隆病)、I型糖尿病、多发性硬化、干燥综合征、自身免疫性甲状腺炎(包括格雷夫斯病以及桥本甲状腺炎)、银屑病以及肾小球肾炎。该抗体可以被单独使用或与其他抗炎剂或免疫抑制剂联合使用，例如非甾类抗炎药(NSAID)、皮质类固醇(例如，泼尼松、氢化可的松)、氨甲蝶呤、COX-2抑制剂、TNF拮抗剂(例如，依那西普、英利昔单抗、阿达木单抗)、以及免疫抑制剂(例如，6-巯嘌呤、硫唑嘌呤以及环孢素A)。
通过不应被解释为进一步限定的以下实施例，对本公开进行进一步阐述。本申请通篇引用的所有附图及所有参考文献、专利及公开的专利申请的内容均通过引用明确地结合在此。
实施例1：抗-CD22的人单克隆抗体的产生
使用表达人抗体基因的转基因小鼠，按照以下步骤，产生抗-CD22人单克隆抗体。
抗原
用于培育抗-CD22抗体的抗原是人CD22的细胞外结构域以及在CHO细胞上表达的全长CD22蛋白。为了获得该胞外结构域，使用编码人CD22的cDNA(可从Open Biosystems，Inc.商购)，构建编码融合到C-末端六组氨酸标签(hexahistidine tag)的整个CD22β细胞外结构域(CD22ECD)的表达载体。在通过标准技术转染CHO细胞并选择稳定的转染子之后，从细胞培养基中用金属螯合层析对CD22ECD进行纯化。此外，用包含全长CD22cDNA的表达载体转染细胞，产生在细胞表面表达全长CD22的重组的CHO细胞。在对经转染的细胞进行选择后，根据与荧光素标记的抗-CD22的反应性(可从Becton-Dickinson-Pharmingen商购)，通过荧光活化的细胞分选，分离出那些在细胞表面上高水平表达CD22的细胞。
小鼠品系
使用转基因HuMAb小的HCo7和HCo12/Balbc系、以及转基因转染色体小鼠的KM及KM-λHAC系制备CD22的完全人单克隆抗体，上述小鼠均表达人抗体基因。
在这些小鼠品系的每种品系中，内源性小鼠κ轻链基因已被纯合地断裂，如Chen等人(1993)EMBO J.12：811-820中所述，且该内源性小鼠重链基因已被纯合地断裂。如PCT公开文件WO01/09187的实施例1所述。这些品系中的每一品系携带人κ轻链转基因，KCo5(如Fishwild等人(1996)Nature Biotechnology14：845-851中所述)并且还包含SC20转染色体，该转染色体携带人Ig重链基因座，如PCT公开文件WO02/43478所述。
该HCo7品系携带了HCo7人重链转基因，如美国专利号5,545,806、5,625,825以及5,545,807所述。HCo12品系携带了HCo12人重链转基因，如PCT公开文件WO01/09187的实施例2中所述。
KM小品系在美国专利申请号20020199213中详细说明。
KM-λHAC品系与KM品系非常相似，因为内源性小鼠重链和κ轻链基因座已经断裂且已插入SC20转染色体及KCo5转基因，但KM-λHAC品系也携带了衍生于携带人λ轻链基因座的人染色体22的人人工染色体。因此，KM-λHAC品系可表达利用λ轻链或κ轻链的人抗体。KM-λHAC小鼠也在美国申请号20060015958中详细说明。
免疫
为了培育CD22的完全人单克隆抗体，用重组人CD22ECD及表达CD22的CHO细胞(如以上所述针对该抗原进行的制备)对上述品系的动物进行免疫。在携带人抗体基因的小鼠品系中培育人抗体的一般免疫方案说明于例如，Lonberg，N.等人(1994)Nature368(6474)：856-859；Fishwild，D.等人(1996)Nature Biotechnology14：845-851以及PCT公开文件WO98/24884。当开始进行免疫时小鼠为10-12周龄。每周用以RIBI作为佐剂的20μg的CD22ECD或107个经转染的CHO细胞对小鼠进行腹膜内及皮下免疫。以含有CD22ECD的RIBI佐剂进行最初的两次免疫，之后可选地使用CD22ECD或经转染的细胞每周一次进行6次附加免疫(总共达8次免疫)。通过眶后取血对免疫应答进行监测。用ELISA及FACS对血清进行筛选。使用具有足够滴度的抗-CD22人IgG免疫球蛋白的小鼠用于融合。在处死并移除脾脏之前的第4及第3天，经静脉内及经腹膜内对小鼠分别用CD22ECD进行一次加强及用表达CD22的CHO细胞进行一次加强。
抗体选择
为了鉴定产生结合CD22的抗体的小鼠，针对结合至表达人CD22的CHO细胞以及亲本CHO细胞，用流式细胞术对经免疫的小鼠的血清进行筛选。还可以在表达CD22的人Daudi B细胞上用流式细胞术(FACS)对血清进行筛选。在该项FACS实验中以1∶50的稀释度对所有经免疫的小鼠的血清进行测试。将经稀释的血清加入至细胞并在37℃下孵育30分钟后，冲洗细胞并用PE标记的抗-人IgG抗体对结合进行检测。采用FACSCalibur流式细胞术(Becton Dickinson，San Jose，CA)进行流式细胞分析。鼠抗-CD22单克隆抗体(M抗-CD22)在实验中作为阳性对照使用。所有三种受试小鼠显示出对CHO-CD22及CHO亲本细胞(CHO-S)的滴度。对CHO-S细胞的结合反映出存在抗体与在CHO细胞表面除CD22外的分子进行结合。这一结果是我们所期望的，这是因为用CHO经转染的细胞对小鼠进行了免疫。还对三只小鼠中的人Daudi细胞的滴度进行了检测，表明了对CD22特异的、能够结合来自非重组来源的CD22的抗体存在的可能存在。
用ELISA对用于结合人CD22ECD的血清进行进一步检测。简言之，用在CHO细胞中产生的经纯化的CD22ECD蛋白在室温下在PBS中(50μl/孔)以1-2.5μg/ml包被微量滴定板2小时。然后用含1％BSA的PBS以300μl/孔封闭平板。将经CD22免疫的小鼠的血清稀释液(100-20000)加至每孔，并在环境温度下孵育1-2小时。用PBS/Tween清洗该板，并用缀合有辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗人IgG多克隆抗体在室温下孵育1小时。洗涤后，用含过硼酸盐(Sigma#P4922)或Moss ABTS-1000的磷酸柠檬酸盐缓冲液的ABTS底物(Sigma#A9941)对该板进行显色，并用分光光度计法在OD415-495nm下进行分析。这三种受试的小鼠具有良好的抗-CD22抗体的滴度，并因此用于融合。
脾细胞融合
使用CytoPulse大腔细胞融合电穿孔仪(large chamber cell fusionelectroporator)(Cyto Pulse Sciences，Inc.，Glen Burnie，MD)，用基于电场的电融合将小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系融合。将来自经免疫的小鼠的脾细胞的单一细胞悬浮液以1∶1的比例与Ag8.653小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL1581)融合。将细胞以大约2×104/孔铺板在平底微量滴定板中。该板在含有以下物质的DMEM高葡萄糖培养基中孵育1周：L-谷氨酰胺、丙酮酸钠(Mediatech，Inc.，Herndon，VA)、10％胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)、18％P388DI条件培养基、5％Origen杂交瘤克隆因子(BioVeris，Gaithersburg，VA)、4mM L-谷氨酰胺、5mM HEPES、0.055mMβ-巯基乙醇、50单位/ml青霉素、50mg/ml链霉素，以及1×次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)。一周后(第七天)，用含有HT的培养基替换HAT生长培养基。当广泛的发生杂交瘤的生长时(第10-11天)，在HTRF均匀测定中对杂交瘤上清液中人IgG抗体的存在进行检测。针对具有人κ或人λ轻链的人IgG的存在对来自KM-λHAC小鼠的融合进行筛选。然后通过FACS在Daudi细胞上对阳性的杂交瘤进行筛选，并通过ELISA对CD22特异的人IgG抗体的存在对所述阳性的杂交瘤进行筛选。除了用杂交瘤上清液(50-100μl/孔)代替血清稀释液，ELISA和FACS实验如以上所述进行。抗原特异的亲本杂交瘤系被转移至24孔板，对其进行再次筛选并且，如果对人IgG仍为阳性，则用有限稀释进行一次亚克隆。稳定的亚克隆在体外按比例被增加，且对抗体进行纯化用于进一步表征。
选出18个亚克隆用于扩展以抗体纯化。经扩展的亚克隆的同种型包括以下同种型：IgG1；IgG4；IgG4/IgM；IgG1/IgM；IgG1/IgG2/λ；及IgG4/λ。这些经纯化的抗体中有十三种用ELISA和FACS进行滴定，且在两类测定中每一种抗体均显示出对人CD22的特异性结合。对四种亚克隆，12C5、19A3、16F7、23C6，进行选择用于进一步结构分析及测序。
重组抗体CD22.1及CD22.2的生产
抗-CD22抗体19A3在CHO细胞中被表达成人IgG1(f同种异型)且该重组抗体被命名为CD22.1。此外，制成了被称为CD22.2的19A3变体，其中进行了N57Q突变以去除VH链中CDR2区内的N-糖基化位点。
从cDNA克隆中用PCR对19A3的VK和VH区进行扩增，且这些区被克隆进入pCR4BIunt-TOPO(Invitrogen)以引入限制性位点用于克隆。接着进行定点诱变以将N57Q突变引入该重链序列中以去除CDR2中的N-糖基化位点。19A3VK被亚克隆进入pICOFSneoK2.hCMV2.1kb载体以产生载体pICOFSneoK2.hCMV2.1kb(CD22.19A3)，且该VH(野生型和N57Q突变体二者)区被亚克隆进入pICOFSpurG载体以产生载体pICOFSpurG(CD22.19A3)、以及pICOFSpurG(CD22.19A3.VH.N57Q)。使用DMRIE-C(Invitrogen)将用于表达轻链和重链的这些构建体线性化并且共转染进入CHO-S细胞，并且使用标准技术选择稳定的克隆。
CHO-S克隆8G9被选择用于CD22.1的表达。这一克隆的过度生长的培养物产生约75mg/升的抗体。CHO-S克隆17E11被选择用于CD22.2的表达并在过度生长的培养物上产生大约413mg/升。接着确定重组抗体CD22.1和CD22.2的结构及功能(参见以下实施例3及实施例10)。
实施例2：人抗-CD22单克隆抗体的结构表征
使用标准的DNA测序技术，对编码实例1中所述的由12C5、19A3、16F7、23C6、CD22.1、CD22.2、4G6及21F6克隆表达的mAb的重链及轻链可变区的cDNA序列进行测序，并用标准的蛋白化学分析对该表达的蛋白质进行表征。
12C5、19A3、CD22.1、CD22.2、16F7、以及23C6的表征
已发现12C5克隆表达包括IgG1重链及λ轻链的抗体。已发现19A3克隆表达包括IgG1重链及κ轻链的抗体。被8G9克隆表达的重组mAb的重链和轻链与被19A3克隆表达的那些相同。除了引入N57Q突变外，被17E11表达的重组mAb的重链与被19A3表达的那个相同。由17E11克隆表达的重组mAb的轻链与由19A3克隆表达的那个相同。已发现16F7克隆表达多种抗体，这些抗体包括IgG1重链以及两种不同的κ轻链(在此指VK.1和VK.2，其中43％的抗体蛋白包括VK.1且57％的抗体蛋白包括VK.2)之一。已发现23C6克隆也表达多种抗体，这些抗体包括IgG1重链以及两种不同的κ轻链(VK.1和VK.2，其中40％的抗体蛋白包括VK.1且60％的抗体蛋白包括VK.2)之一。已发现4G6克隆表达多种抗体，这些抗体包括IgG1重链以及两种不同的κ轻链(此处指VK.1和VK.2)之一。已发现21F6克隆表达多种抗体，这些抗体包括两种不同的IgG1重链(此处指VH1和VH2)之一以及一种κ轻链。
12C5的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别如图IA以及SEQ IDNO：41及31所示。
12C5的λ轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别如图1B以及SEQ IDNO：45及35所示。
将12C5重链免疫球蛋白序列与已知的人种系免疫球蛋白重链序列进行比较，证明了12C5重链利用了来自人种系VH7-4.1的VH区段、来自人种系3-3的D区段、以及来自人种系JH 6B的JH区段。使用CDR区测定的Kabat系统对12C5 VH序列进行进一步分析，得到分别如图1A以及SEQ ID NO：1、5、以及9所示的重链CDR1、CDR2、以及CDR3区的示意图。
将12C5轻链免疫球蛋白序列与已知的人种系免疫球蛋白轻链序列进行比较，证明了该12C5λ轻链利用了来自人种系Vλ2b2的一个Vλ区段以及来自人种系JL2的一个Jλ区段。使用CDR区测定的Kabat系统对12C5Vλ序列进行进一步分析，得到分别如图1B以及SEQ ID NO：13、19及25所示的轻链CDR1、CDR2、以及CDR3区的示意图。
19A3的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别如图2A以及SEQ IDNO：42与32所示。CD22.1的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列与19A3的那些序列完全相同，且分别对应于如图2A以及SEQ ID NO：42与32所示的核苷酸和氨基酸序列。
CD22.2的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别如图2C以及SEQID NO：61与60所示。
19A3的轻链可变区的核苷酸及氨基酸序列分别如图2B以及SEQ IDNO：46及36所示。CD22.1以及CD22.2二者的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列与19A3的那些序列完全相同，且分别对应于如图2A以及SEQ IDNO：46与36所示的核苷酸和氨基酸序列。
将19A3/CD22.1重链免疫球蛋白序列与已知的人种系免疫球蛋白重链序列进行比较，证明了19A3重链利用了来自人种系VH4-34的VH区段、来自人种系3-9的D区段、以及来自人种系JH4B的JH区段。使用CDR区测定的Kabat系统对19A3/CD22.1VH序列进行进一步分析，得到分别如图2A以及SEQ ID NO：2、6、以及10所示的重链CDR1、CDR2、以及CDR3区的示意图。
将CD22.2重链免疫球蛋白序列与已知的人种系免疫球蛋白重链序列进行比较，证明了CD22.2重链利用了来自人种系VH4-34的VH区段、来自人种系3-9的D区段、以及来自人种系JH4B的JH区段。使用CDR区测定的Kabat系统对CD22.2VH序列进行进一步分析，得到分别如图2C以及SEQ ID NO：2、60以及10所示的重链CDR1、CDR2、以及CDR3区的示意图。
将19A3/CD22.1/CD22.2轻链免疫球蛋白序列与已知的人种系免疫球蛋白轻链序列进行比较，证明了19A3/CD22.1/CD22.2κ轻链利用了来自人种系VK L6的VK区段以及来自人种系JK1的JK区段。使用CDR区测定的Kabat系统对19A3/CD22.1/CD22.2VK序列进行进一步分析，得到分别如图2B以及SEQ ID NO：14、20及26所示的轻链CDR1、CDR2、以及CDR3区的示意图。
16F7的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别示于图3A和SEQ IDNO：43和33中。
16F7的VK.1κ轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别示于图3B以及SEQ ID NO：47及37中。
16F7的VK.2κ轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别示于图3C以及SEQ ID NO：48及38中。
将16F7重链免疫球蛋白序列与已知的人种系免疫球蛋白重链序列进行比较，证明了16F7重链利用了来自人种系VH5-51的VH区段、来自人种系3-10的D区段、以及来自人种系JH3B的JH区段。使用CDR区测定的Kabat系统对16F7VH序列进行进一步分析，得到分别如图3A以及SEQ ID NO：3、7及11所示的重链CDR1、CDR2、以及CDR3区的示意图。
将16F7VK.1κ轻链免疫球蛋白序列与已知的人种系免疫球蛋白κ轻链序列进行比较，证明了16F7VK.1κ轻链利用了来自人种系VK A27的VK区段以及来自人种系JK1的JK区段。使用CDR区测定的Kabat系统对16F7VK序列进行进一步分析，得到分别如图3B以及SEQ ID NO：15、21及27所示的轻链CDR1、CDR2、以及CDR3区的示意图。.
将16F7VK.2κ轻链免疫球蛋白序列与已知的人种系免疫球蛋白κ轻链序列进行比较，证明了16F7VK.2κ轻链利用了来自人种系VK A10的一个VK区段以及来自人种系JK2的一个JK区段。使用CDR区测定的Kabat系统对16F7 VK序列进行进一步分析，得到分别如图3C以及SEQ IDNO：16、22及28所示的轻链CDR1、CDR2、以及CDR3区的示意图。.
23C6的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别如图4A和SEQ IDNO：44和34所示。
23C6的VK.1κ轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别如图4B以及SEQ ID NO：49及39所示。
23C6的VK.2κ轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别如图4C以及SEQ ID NO：50及40所示。
将23C6重链免疫球蛋白序列与已知的人种系免疫球蛋白重链序列进行比较，证明了23C6重链利用了来自人种系VH1-69的VH区段、来自人种系2-15的D区段、以及来自人种系JH6B的JH区段。使用CDR区测定的Kabat系统对23C6VH序列进一步分析，得到分别如图4A以及SEQID NO：4、8、以及12所示的重链CDR1、CDR2、以及CDR3区的示意图。
将23C6VK.1κ轻链免疫球蛋白序列与已知的人种系免疫球蛋白κ轻链序列进行比较，证明了该VK.1κ轻链利用了来自人种系VK L6的VK区段以及来自人种系JK1的JK区段。使用CDR区测定的Kabat系统对23C6VK.1序列进一步分析，得到分别如图4B以及SEQ ID NO：17、23及29所示的轻链CDR1、CDR2、以及CDR3区的示意图。
将23C6VK.2κ轻链免疫球蛋白序列与已知的人种系免疫球蛋白κ轻链序列进行比较，证明了该VK.2κ轻链利用了来自人种系VK L6的VK区段以及来自人种系JK1的JK区段。使用CDR区测定的Kabat系统对23C6VK.2序列进一步分析，得到分别如图4B以及SEQ ID NO：18、24及30所示的轻链CDR1、CDR2、以及CDR3区的示意图。
图5A示出了12C5重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：31)与种系VH7-4.1编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：51)的比对。对CDR1、CDR2、以及CDR3区进行了说明。
图5B示出了12C5λ轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：35)与种系Vλ2b2编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：55)的比对。对CDR1、CDR2、以及CDR3区进行了说明。
图6A示出了19A3重链可变区的氨基酸序列以及CD22.1重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：32)与种系VH4-34编码的氨基酸序列(SEQID NO：52)的比对。对CDR1、CDR2、以及CDR3区进行了说明。
图6B示出了19A3、CD22.1、以及CD22.2κ轻链可变区的氨基酸序列(所有序列与SEQ ID NO：36相同)与种系VK L6编码的氨基酸序列(SEQID NO：56)的比对。对CDR1、CDR2、以及CDR3区进行了说明。
图6C示出了CD22.2重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：32)与种系VH4-34编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：52)的比对。对CDR1、CDR2、以及CDR3区进行了说明。
图7A示出了16F7重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：33)与种系VH5-51编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：53)的比对。对CDR1、CDR2、以及CDR3区进行了说明。
图7B示出了16F7VK.1κ轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：37)与种系VK A27编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：57)的比对。对CDR1、CDR2、以及CDR3区进行了说明。
图7C示出了16F7VK.2κ轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：38)与种系VK A10编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：58)的比对。对CDR1、CDR2、以及CDR3区进行了说明。
图8A示出了23C6重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：34)与种系VH1-69编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：54)的比对。对CDR1、CDR2、以及CDR3区进行了说明。
图8B示出了23C6VK.1κ轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：39)及该VK.2κ轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：40)与种系VK L6编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：56)的比对。对CDR1、CDR2、以及CDR3区进行了说明。
4G6及21F6的表征
4G6的重链可变区的核苷酸及氨基酸序列分别如图17A以及SEQ IDNO：87与81所示。
4G6的VK.1κ轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别示于图17B以及SEQ ID NO：90及84中。
4G6的VK.2κ轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别示于图17C以及SEQ ID NO：91及85中。
将4G6重链免疫球蛋白序列与已知的人种系免疫球蛋白重链序列进行比较，证明了4G6重链利用了来自人种系VH1-69的VH区段、来自人种系7-27的D区段、以及来自人种系JH4B的JH区段。使用CDR区测定的Kabat系统对4G6VH序列进行进一步分析，得到分别如图17A以及SEQID NO：63、66及69所示的重链CDR1、CDR2、以及CDR3区的示意图。
将4G6VK.1κ轻链免疫球蛋白序列与已知的人种系免疫球蛋白κ轻链序列进行比较，证明了16F7VK.1κ轻链利用了来自人种系VK L18的VK区段以及来自人种系JK2的JK区段。使用CDR区测定的Kabat系统对4G6VK序列进行进一步分析，得到分别如图3B以及SEQ ID NO：72、75及78所示的轻链CDR1、CDR2、以及CDR3区的示意图。
将4G6VK.2κ轻链免疫球蛋白序列与已知的人种系免疫球蛋白κ轻链序列进行比较，证明了4G5VK.2κ轻链利用了来自人种系VK A27的一个VK区段以及来自人种系JK4的一个JK区段。使用CDR区测定的Kabat系统对4G6VK序列进行进一步分析，得到分别如图17C以及SEQ IDNO：73、76、及79所示的轻链CDR1、CDR2、以及CDR3区的示意图。
21F6的VH.1重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别如图18A以及SEQ ID NO：88及82所示。
21F6的VH.2重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别如图18B以及SEQ ID NO：89及83所示。
21F6的κ轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别如图18C以及SEQID NO：92及86所示。
将21F6VH.1重链免疫球蛋白序列与已知的人种系免疫球蛋白重链序列进行比较，证明了21F6重链利用了来自人种系VH4-34的VH区段、来自人种系3-9的D区段、以及来自人种系JH4B的JH区段。使用CDR区测定的Kabat系统对21F6VH序列进行进一步分析，得到分别如图3A以及SEQ ID NO：64、67及70所示的重链CDR1、CDR2、以及CDR3区的示意图。
将21F6VH.2κ轻链免疫球蛋白序列与已知的人种系免疫球蛋白κ轻链序列进行比较，证明了21F6VH.2重链利用了来自人种系VH4-34的VH区段、来自人种系3-9的D区段、以及来自人种系JH4B的JH区段。使用CDR区测定的Kabat系统对21F6VH序列进行进一步分析，得到分别如图18B以及SEQ ID NO：65、68及71所示的轻链CDR1、CDR2、以及CDR3区的示意图。.
将21F6κ轻链免疫球蛋白序列与已知的人种系免疫球蛋白κ轻链序列进行比较，证明了21F6κ轻链利用了来自人种系VK L6的VK区段以及来自人种系JK4的JK区段。使用CDR区测定的Kabat系统对21F6VH序列进行进一步分析，得到分别如图18C以及SEQ ID NO：74、77及80所示的轻链CDR1、CDR2、以及CDR3区的示意图。.
图19A示出了4G6重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：81)与种系VH1-69编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：54)的比对。对CDR1、CDR2、以及CDR3区进行了说明。
图19B示出了4G6VK.1κ轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：84)与种系VK1L18编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：93)的比对。对CDR1、CDR2、以及CDR3区进行了说明。
图19C示出了4G6VK.2κ轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：85)与种系VK A27编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：57)的比对。对CDR1、CDR2、以及CDR3区进行了说明。
图20A示出了21F6VH.1重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：82)与种系VH4-34编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：52)的比对。对CDR1、CDR2、以及CDR3区进行了说明。
图20B示出了21F6VH.2κ轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：83)与种系VH4-34编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：52)的比对。对CDR1、CDR2、以及CDR3区进行了说明。
图20C示出了21F6κ轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：86)与种系VK L6编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：56)的比对。对CDR1、CDR2、以及CDR3区进行了说明。
重组同种型转化
使用标准的重组DNA技术，可以将12C5、19A3、16F7、23C6、CD22.1、CD22.2、4G6、以及21F6的可变区转变成任何所希望的同种型的全长抗体。例如，可将编码VH及VL区的DNA克隆进入下述表达载体，该表达载体携带该重链及轻链恒定区，这样使这些可变区被有效连接到恒定区。可选地，单独的载体可以被用于表达全长重链及全长轻链。适宜用于产生全长抗体的表达载体的非限制性实例包括在Black的美国专利申请号20050153394中说明的pIE载体。
实施例3：抗-CD22人单克降抗体的结合特征
在这一实施例中，抗-CD22抗体12C5、19A3、16F7、23C6、以及4G6的结合亲和力用BIAcore分析法进行测定。用ELISA分析以及FACS流式细胞术证实19A32重组衍生的抗体CD22.1和CD22.2保持了CD22结合亲和力。
12C5、19A3、16F7、以及23C6抗体的表位定组(epitope grouping)可用BIAcore分析法进行。
最后，使用表达仅包含CD22的氨基末端结构域1和2的融合蛋白的CHO细胞对本发明的抗-CD22抗体特异地结合的CD22结构域制图。
结合亲和力及动力学
为确定抗体亲和力(KD)，进行实验，其中使用针对抗原上存在的His标签的抗体，CD22抗原在BIAcore芯片上被捕获。如制备商所推荐的，将抗-His单克隆抗体ab15149(Abcam，贮存浓度0.5mg/mL)以高密度(3500RU)对CM5芯片进行包被。在流速为6μL/min的条件下持续60秒，CD22ECD(6.6μg/mL)被捕获在这一表面上。将单一浓度(20μg/mL)的抗-CD22纯化的mAb以25μg/mL的流速注射在被捕获的抗原上，其中结合时间是5分钟且解离时间是8分钟。在每一个循环后用10μL的25mMNaOH对芯片表面进行再生。在芯片上进行同种型对照，并且将这些数据用于减去非特异性结合。使用BIAcore控制软件v3.2，在Biacore3000表面等离振子共振仪上进行所有的实验。使用BiaEvaluation v3.2软件进行数据分析。
在亲和力实验中对14种经选择的抗-CD22抗体进行检测。已获得的12种抗体的亲和力值的范围是0.07-9.95×10-9M。在实施例2中在结构方面进行表征的四种抗体的结果在以下表1中进行总结：
表1.抗-CD22HuMAb的BIAcore结合数据
重组衍生的抗体CD22.1和CD22.2对CD22结合亲和力的保留
为了确定CD22.1和CD22.2是否保留了CD22结合亲和力，进行了ELISA分析，在该分析中，将由CD22.1及CD22.2和CD22ECD的结合与由衍生于杂交瘤的亲本抗体19A3的结合进行比较。
将重组CD22胞外结构域(CD22ECD)以2μg/ml在96孔ELISA平板上进行包被，并在清洗后，用5％牛血清白蛋白进行封闭并再次进行清洗，从10μg/ml向下以1∶3的稀释对测试抗体进行滴定。在孵育1小时后，对板进行清洗，并将山羊抗-人IgG HRP缀合物加入每个孔中。再孵育1小时后，再次清洗平板且通过加入TMB底物检测到结合的HRP缀合物，一直孵育直到颜色显现，并用1M的盐酸终止反应。接着在平板读数器中在450nm下读取吸光度。结果(图12)清楚地表明CD22.1和CD22.2结合到CD22ECD的能力与亲本抗体19A3相当。这表明抗体在CHO细胞中的表达是成功的，且去除N-糖基化位点的突变不影响抗原结合。
也研究了4G6及21F6抗-CD22单克隆抗体结合CD22ECD的能力，并发现它们特异地结合CD22ECD。
在细胞表面上表达的CD22的FA CS分析
用流式细胞术法也证实了CD22.1和CD22.2结合CD22的能力。将转染了全长CD22(CHO-CD22)的CHO细胞，或Raji细胞以2×105细胞/孔重悬于FACS缓冲液中，并在沉淀细胞后，以10μg/ml开始并1∶3系列稀释，将抗体滴定入孔中。在冰上混合并孵育45分钟后，加入FACS缓冲液并清洗细胞4次。清洗后，加入山羊抗-人IgG PE缀合物，并接着再次在冰上孵育30分钟，再次清洗细胞4次，之后在FACS缓冲液中进行重悬，并在FACS阵列机(FACS array machine)上读取PE荧光。结果(图13和14)显示CD22.1和CD22.2强地并等效地与CHO-CD22转染子及Raji细胞相结合。
4G6和21F6与在Raji细胞及用CD22转化的CHO细胞的表面表达的CD22的结合也可用FACS分析法进行分析。该结果证明了获得了高水平的细胞结合。参见图21、22A、以及22B。没有抗体能结合至无CD22转染的CHO细胞上。
表位定组
根据标准的固定方法将已选择的抗体固定在CM5芯片上，并使抗体抗原复合物在表面流动，进行表位框并(epitope binning)。具有重叠表位的抗体被淘汰出来，而那些具有非重叠表位的抗体同时结合至抗原上。信号增强表示表位与在芯片上包被的抗体不同，并且如果信号减弱，则反之是正确的。选择表现出较快的解离速度(off-rate)常数的抗体，将其包被于Biacore CM5芯片上，因为它们会使再生变得更容易而重复利用芯片。以高密度在不同CM5芯片的不同表面上用经纯化的抗-CD22抗体进行包被。进行几轮反复的框并(binning)，直到鉴别出不同的表位群(epitopegroup)。抗体的浓度在50-200μg/mL之间变化，该浓度的抗体与4nM至50nM CD22ECD在室温下孵育2小时。经孵育的复合物以5-10μL/min通过每个芯片上用抗体进行包被的表面，持续2-6分钟。用15-30mM的NaOH对每一个循环进行再生。在注射2-5分钟后，针对抗体浓度对获得的信号进行作图，以确定该表位群。根据以上实验观察得出的解释，抗体被分成不同的表位。
表位定组实验的结果是可以鉴定出四组不同的表位群。在检测的14种抗-CD22抗体中，发现有5种属于表位群1、3种属于表位群2、4种属于表位群3、1种属于表位群4、并且1种属于表位群3&4，这表明在表位群3与4之间存在一些重叠。在实施例2中在结构方面进行表征的四种抗体的结果在以下表2中进行总结：
表2.由BIAcore描绘的CD22表位群
抗-CD22抗体 表位群
阳性对照 1
12C5 4
19A3 1
16F7 3
23C6 2
CD22氨基末端结构域的识别
CD22的细胞外区包含7个免疫球蛋白型的结构域，该结构域的氨基末端的2Ig型结构域对CD22配体结合可能是特别重要的。为了绘制人抗体结合于哪个结构域，制备了重组构建体，其中仅ECD的氨基末端结构域1和2被融合至小鼠IgG重链的铰链区及Fc区。产生的融合蛋白，被命名为CD22d1d2-mFc，表达于CHO细胞中，并被纯化以用于结合测定。随后对人抗体(先前被显示结合至CD22的整个ECD上)就其结合到CD22d1d2-mFc的能力进行检测。
用山羊抗-小鼠IgG以5μg/m对96孔的ELISA板进行包被。在4℃孵育过夜后，对板进行清洗，并以2μg/ml将CD22d1d2-mFc加入到每个孔中，之后在室温下孵育1小时。清洗平板后，用5％的牛血清白蛋白进行封闭并再次进行清洗，以10μg/ml加入测试抗体。在孵育1小时后，对板进行清洗，并将山羊抗-人IgG HRP缀合物加入每个孔中。再孵育1小时后，再次清洗平板，且通过加入TMB底物检测结合的HRP缀合物，一直孵育直到颜色显现，并用1M的盐酸终止。接着在平板读取器中在450nm下读取吸光度。
结果(图15)显示将抗体分为两组。组1由结合至CD22d1d2-mFc上的23C6、19A3、以及19A3的重组衍生物-CD22.1和CD22.2表示，而组2由不结合至CD22d1d2-mFc上的12C5及16F7表示。这提示了12C5及16F7识别在氨基末端结构域之外的CD22ECD上的表位。
在细胞表面上表达的CD22的FACS分析
用流式细胞术法也证实了CD22.1和CD22.2与CD22的结合。转染了全长CD22(CHO-CD22)的CHO细胞或Raji细胞以2×105细胞/孔重悬于FACS缓冲液中，并在沉淀细胞后，以10μg/ml开始并1∶3系列稀释，将抗体滴定至孔中。在冰上混合并孵育45分钟后，加入FACS缓冲液并清洗细胞4次。清洗后，加入山羊抗-人IgG PE缀合物，并接着再次在冰上孵育30分钟，再次清洗细胞4次，之后在FACS缓冲液中进行重悬，并在FACS阵列机(FACS array machine)上读取PE荧光。结果(图13和14)显示CD22.1和CD22.2强地并等效地与CHO-CD22转染子及Raji细胞进行结合。
4G6和21F6与在Raji细胞及用CD22转化的CHO细胞的表面表达的CD22的结合也可用FACS分析法进行分析。该结果证明了获得了高水平的细胞结合。参见图21、22A、以及22B。没有抗体能结合至无CD22转染的CHO细胞上。
实施例4：抗-CD22抗体的内化
为了确定抗-CD22人抗体内化到表达CD22的细胞的能力，使用Hum-ZAP内化测定以及伯基特淋巴瘤细胞系Raji(它表达CD22)。Hum-Zap测定测试了第一抗体的内化，这是通过结合第二抗体，所述第二抗体具有针对缀合至毒素皂草毒蛋白的人IgG的亲和力。
表达CD22的Raji细胞以2.0×104细胞/孔(35μl/孔)进行接种。以1.5μg/ml(35μl/孔)将抗-CD22抗体加入至孔中。仅有培养基的作为阴性对照。以3.0μg/mL(35μl/孔)的浓度将Hum-ZAP试剂(AdvancedTargeting Systems，San Diego，CA，IT-22-25)加入至孔的一半，而孔的另一半仅加入培养基。在37℃下孵育平板72小时。用CellTiter-Glo发光细胞活力测定法(Promega，Madison，WI，#G7571)确定细胞活力。将CellTiter-Glo缓冲液与CellTiter-Glo底物进行混合，并将100μL的混合物加入至每个孔中。根据生产商提供的说明，利用Veritas MicroplateLuminometer以及Veritas软件(Turner BioSystems，Sunnyvale，CA)对发光进行检测。
测试了12种不同的抗-CD22抗体且都表现出内化的能力。实施例2中在结构方面进行表征的四种抗体的结果显示在图9的条形图中。如图9所示，在包含抗-CD22抗体及HumZAP试剂的所有的孔中，包括具有阳性对照的孔中，观察到Raji细胞活力显著降低，而在仅包含抗-CD22抗体不包含HumZAP试剂的孔中，细胞活力没有受到影响，表明抗-CD22抗体自身不触发杀死细胞。正如期望的那样，当抗-CD22抗体不存在时，阴性对照(指培养基)在HumZAP试剂存在或不存在时不显示任何细胞杀伤。这些数据证明了抗-CD22抗体有效地进行内化，且细胞内的皂草毒蛋白的释放负责了当HumZAP试剂存在时杀伤表达CD22的Raji细胞。
实施例5：抗-CD22抗体的ADCC活力的评价
为了确定当效应细胞存在时，该抗-CD22人抗体通过抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)杀死CD22+细胞系的能力，使用了荧光细胞毒性测定法。
如以下所述从全血中制备人效应细胞。通过标准的菲可帕克(Ficoll-paque)分离，从经肝素化的全血中纯化人外围血单核细胞。将细胞重悬于含10％FBS(已热灭活)和200U/ml的人IL-2的RPMI1640培养基中，并于37℃孵育过夜。次日收集细胞，并在培养基中洗涤4次，以1×107细胞/ml重悬。将靶CD22+细胞以每1×106个靶细胞/ml2.5μlBATDA，与BATDA试剂(Perkin Elmer，Wellesley，MA)在37℃下孵育20分钟。将靶细胞洗涤4次，离心，并使终体积达到1×105细胞/ml。
使用以下的Delfia荧光发射分析法测试CD22+细胞系Raji(人B淋巴细胞伯基特淋巴瘤；ATCC登录号CCL-86)、以及Daudi(人B淋巴细胞伯基特淋巴瘤；ATCC登录号CCL-213)中对人抗-CD22单克隆抗体的抗体特异的ADCC。每一个靶细胞系(100μl经标记的靶细胞，104细胞/孔)与50μl的效应细胞(106细胞/孔)及50μl的抗体(终浓度为10ug/m1)一起进行孵育。整个实验中使用的靶细胞与效应细胞比为1∶50。在所有研究中，使用人IgG1同种型对照作为阴性对照。将细胞以2000rpm进行离心，并在37℃孵育1小时。然后收集上清液，进行离心，并将20μl的上清液转移至平底平板上，将180μl的Eu溶液(Perkin Elmer，Wellesley，MA)加至该板，并在RubyStar读数器上读数(BMG Labtech)。计算裂解百分数如下：(样品释放量-自发释放量＊100)/(最大释放量-自发释放量)，其中自发释放量为来自包含靶细胞及效应细胞的孔的荧光，并且最大释放量是来自含靶细胞并用2％Triton-X处理了的孔的荧光。
对于Raji和Daudi细胞ADCC测定，对13种不同的抗-CD33抗体及阴性对照和阳性对照抗体(分别是hIgG1及CD20)一起进行测试。在每一个测定中，13种抗-CD22抗体中有10种表现出与阳性对照抗体相同或更高的ADCC活性水平。在实施例2中进行结构表征的四种抗体的结果显示于图10A(Daudi细胞)、以及10B(Raji细胞)的图中，其显示％细胞裂解。数据表明可选择展示有ADCC活性的人抗-CD22抗体，尽管每一种抗体对CD22+细胞的细胞毒性的程度可能依据哪种细胞系被用作靶细胞而不同。
实施例6：由抗-CD22抗体对钙运转的刺激作用
为评价抗-CD22人抗体刺激CD22+细胞中的钙运转的能力，使用以下的钙运转测定法。用台盼蓝排阻显微镜法对有活力的Ramos细胞(ATCC登录号CRL-1596)进行计数，并在RPMI+10％FBS培养基中稀释到2×106个细胞/ml。从这一细胞悬浮液中，将2×105个细胞(100μl/孔)分配至PolyD-赖氨酸表面、没有涂布(black)的，底部干净的96孔板(Corning#3667)的所有孔中。将上样染料(Molecular Devices货号#R7181)加入至细胞悬浮液中，100μl/孔。将平板在1100rpm下离心4分钟，并随后在37℃下孵育30分钟。从50μg/ml到40ng/ml的抗-CD22抗体及人IgG1同种型对照的5倍的稀释液系列，在成分B(Component B)(Molecular Devices#R7181)+0.1％BSA缓冲液中进行制备。将抗体一式三份分配于先前制备的96孔板的A-F行中。将成分B+0.1％BSA分配进入测定板上的行G&H的所有孔中。使用Flex Station(Molecular Devices)测定钙运转，在17秒时向测定板的每孔加入22μl试剂。分析作为FI Max-Min的数据，并且使用GraphPadTM PRISM、非线性回归、S形剂量反应、可变性斜率绘制针对抗体浓度的图。
在测定中对17种不同的抗-CD22人抗体进行了评估。结果显示与人IgG1同种型对照或仅缓冲液相比，经测试的17种抗-CD22抗体中没有一种刺激显著的钙运转。先前已证明了响应于用山羊抗-人IgM F(ab’)2刺激BCR，Ramos细胞使钙运转。
实施例7：抗-CD22抗体对BCR刺激诱导的效应的调控
在这一实施例中，对固定化的抗-CD22抗体调控B细胞受体(BCR)刺激诱导的效应的能力进行了检测。在该测定中，将抗-CD22人抗体及人IgG1同种型对照稀释至在RPMI+10％FBS中5μg/ml，并以100μl/孔一式三份分配进入Microlite1Flat Bottom平板(Corning#7416)中。在4℃下孵育过夜后，用冷PBS清洗平板一次，然后用RPMI1640(Mediatech)+10％FBS(GIBCO)清洗一次。用台盼蓝排阻显微镜法对有活力的Ramos细胞(ATCC登录号CRL-1596)进行计数，并在RPMI+10％FBS中稀释至2×105细胞/ml。将20,000个细胞(50μl/孔)分配进入经抗体包被的96孔板中。将抗-人IgM F(ab’)2(Jackson货号#109-006-129)稀释至RPMI+10％FBS中5μg/ml，并且将其以100μl/孔分成终浓度为2.5μg/ml。对测定板孵育72小时。加入CellTiter-Glo试剂(Promega G7571)、100μl/孔，持续10分钟对细胞活力进行测定。在Pherastar GMB Labtech上使用Luminescence Test平板1Nunc96对发光进行测量。分析数据作为相对于人IgG1同种型对照(它代表100％细胞活力)的％细胞死亡。
在测定中对17种不同的抗-CD22抗体进行了检测，且这一组表现出范围很宽的活性，依据特定的抗体，范围从观察到的％细胞死亡值为约80％至观察到的与同种型的对照大致相同的％细胞死亡值。在实施例2中进行结构表征的四种抗体的结果显示于图11的条形图中，该图显示固定化的19A3、23C6、以及12C5，每个均有效地增强了BCR刺激细胞死亡的抗增殖作用，而16F7与同种型对照相比没有明显不同。
实施例8：抗-CD22抗体在细胞增殖方面的作用
在这一实施例中，对具有或不具有抗体交联的可溶性抗-CD22抗体对细胞增殖的直接作用进行了检测。在所用的测定中，用台盼蓝排阻显微镜法对有活力的Ramos细胞(ATCC登录号CRL-1596)进行计数，并在RPMI+10％FBS中稀释至2×105细胞/ml。将20,000个细胞(50μl/孔)分配进入包被抗体的96孔培养处理的平板中。将交联的抗体山羊抗-人IgGFc(Rockland货号#709-1117)用在RPMI+10％FBS中稀释至80μg/ml，并以25μl/孔分配进入Ramos细胞测定板的一半。仅稀释剂(25μl/孔)被分配进入该板其余部分。将抗-CD22人抗体及人IgG1同种型对照在RPMI+10％FBS中稀释至20μg/ml，并以25μl/孔一式三份分配进入包含Ramos+交联剂以及Ramos+稀释剂的孔中，这样使抗体的终浓度为5μg/ml抗-CD22+/-20μg/ml交联抗体。在37℃下孵育测定板72小时。加入CellTiter-Glo试剂(Promega G7571)，100μl/孔，持续10分钟对细胞活力进行测定。在Pherastar GMB Labtech上使用Luminescence Test1平板Nunc96对发光进行测量。分析数据作为相对于人IgG1同种型对照(它代表0％抑制作用)的生长抑制百分数。
在测定中对17种不同的抗-CD22人抗体进行了评估。这些结果显示当抗体不是交联的或当它们是交联的，经检测的17种抗-CD22抗体中没有一种显著改变Ramos细胞增殖的速率。这些结果说明这些抗-CD22抗体中没有一种对Ramos细胞具有直接的抗增殖作用，即使该抗体是交联的。
实施例9：抗-CD22抗体的CDC活性的评价
在这一实施例中，对可溶性抗-CD22人抗体介导依赖于补体的细胞毒性(CDC)的能力进行检测。在所用的测定中，用台盼蓝排阻显微镜法对有活力的Ramos细胞(ATCC登录号CRL-1596)进行计数，并在CDC缓冲液(RPMI1640+0.1％BSA+20mM HEPES+1％Pen/strep)中稀释至1×106个细胞/ml。将细胞悬液在96孔平底组织培养处理板中以50,000个细胞(50μl/孔)分配。通过在56℃下孵育1小时，对人补体(Quidel货号#A113)进行热灭活。在CDC缓冲液中以1∶3稀释每一种活性的及热灭活的补体，并以50μl/孔分配至Ramos测定板中。在CDC缓冲液中将抗-CD22人抗体、人IgG1同种型对照以及抗-CD20阳性对照抗体均各自稀释至40μg/ml。经稀释的抗体以50μl/孔一式两份被分配至具有活性的及热灭活的补体的Ramos测定板上，这样使抗体的终浓度为10μg/ml。在37℃下孵育测定板2小时。为了分析细胞活力，以50μl/孔加入阿尔玛蓝(alamar blue)试剂(BioSource货号#DAL1100)，并在37℃下将平板进一步孵育21小时。将细胞活力测定为与使用SPECTROMAXGEMINI荧光平板读数器(Molecular Devices S/N G02243)的荧光测量成比例。
对18种不同的抗-CD22抗体，以及作为阳性对照的，已知在有活性的但未经加热灭活的补体存在时表现出强的细胞毒性的抗-CD20的抗体，一起进行检测。该结果显示与人IgG1同种型对照相比，经检测的抗-CD22抗体中没有一种表现出显著的CDC活性。
实施例10：抗-CD22抗体-药物缀合物在体内对实体瘤细胞增殖的抑制作用
为了测定是否可以制备CD22.1和CD22.2的药物缀合物(该缀合物能在体内有效地抑制已建立的实体瘤的增殖)，将抗-CD22重组抗体CD22.1和CD22.2缀合至细胞毒性药物细胞毒素A，并且使用Ramos皮下肿瘤细胞模型对产生的ADC化合物的功效进行检测。
CD22.1和CD22.2与细胞毒性化合物细胞毒素A的缀合
将CD22.1及CD22.2浓缩至约5mg/ml，将缓冲液变成20mM的磷酸盐缓冲液、50mM NaCl、2mM DTPA、3％甘油、pH7.5且被14倍摩尔过量的2-Imminothiolane在室温下巯化60分钟。巯化作用后，用含有5mM甘氨酸、2mM DTPA、以及0.5％聚维酮(10K)的50mM HEPES缓冲液(pH5.5)对抗体进行缓冲液交换。用4，4”-二硫代二吡啶通过在324nM下测量硫代吡啶(thiopyridine)释放对巯化作用进行定量。以细胞毒素A比巯基为3∶1的摩尔比率加入细胞毒素A而实现缀合。在室温孵育60分钟，之后通过以N-乙基马来酰亚胺对巯基为10∶1的摩尔比率进行加成，对反应混合物阻断任何残余巯基。
用离子交换层析法对产生的缀合物进行纯化。对每一种反应混和物进行过滤，并上样至用缓冲液A(50mM HEPES、5mM甘氨酸、0.5％聚维酮(10K)、pH5.5)进行平衡的SP-Sepharose高效柱上。用24％缓冲液B(50mM HEPES、5mM甘氨酸、1M NaCl、0.5％的聚维酮(10K)、pH5.5)对抗体缀合物进行洗脱。对含有单体抗体-细胞毒素A缀合物的组分进行收集，并用50mM HEPES、5mM甘氨酸、100mM NaCl、0.5％的聚维酮(10K)、pH6.0进行透析。通过在280nm及340nm下测量吸光度确定取代比率，并用SEC-HPLC对缀合物进行分析。
CD22.1-细胞毒素A缀合物以1.7的取代比率得到制备，且CD22.2缀合物以1.6的取代比率得到制备。
抗-CD22抗体-药物缀合物CD22.1-细胞毒素A及CD22.2-细胞毒素A在体 内的疗效
将Raji细胞以基质胶(matrigel)中每只小鼠1000万个细胞皮下植入SCID小鼠，且肿瘤得到生长直到充分达到中位数大小约为190mm3。接着用单一剂量的CD22.1-细胞毒素A抗体缀合物、CD22.2-细胞毒素A缀合物、不结合Raji细胞的对照人IgG1-细胞毒素A缀合物，或者仅用载体，对8只小鼠的组进行治疗。给药后63天、或直到动物因肿瘤生长超过1500mm3而被安乐死后，对肿瘤大小进行监控。CD22.1-细胞毒素A以0.18μmol/kg的药物当量进行给药，且CD22.2-细胞毒素A及对照ab-细胞毒素A以0.3μmol/kg的药物当量进行给药。结果证明了CD22.1及CD22.2缀合物这两者均具有良好的抗-肿瘤功效(图16)。
序列表概述
SEQ ID NO： 序列 SEQ ID NO： 序列
1 VH CDR1a.a.12C5 31 VH a.a.12C5
2 VHCDR1a.a.19A3 32 VH a.a.19A3
3 VH CDR1a.a.16F7 33 VH a.a.16F7
4 VH CDR1a.a.23C6 34 VH a.a.23C6
5 VH CDR2a.a.12C5 35 VK a.a.12C5
6 VH CDR2a.a.19A3 36 VK a.a.19A3
7 VH CDR2a.a.16F7 37 VK.1a.a.16F7
8 VH CDR2a.a.23C6 38 VK.2a.a.16F7
39 VK.1a.a.23C6
9 VH CDR3a.a.12C5 40 VK.2a.a.23C6
10 VH CDR3a.a.19A3
11 VH CDR3a.a.16F7 41 VHn.t.12C5
12 VH CDR3a.a.23C6 42 VH n.t.19A3
43 VHn.t.16F7
13 VK CDR1a.a.12C5 44 VH n.t.23C6
14 VK CDR1a.a.19A3
15 VK.1CDR1a.a.16F7 45 VK n.t.12C5
16 VK.2CDR1a.a.16F7 46 VK n.t.19A3
17 VK.1CDR1a.a.23C6 47 VK.1n.t.16F7
18 VK.2CDR1a.a.23C6 48 VK.2n.t.16F7
49 VK.1n.t.23C6
19 VK CDR2a.a.12C5 50 VK.2n.t.23C6
20 VK CDR2a.a.19A3
21 VK.1CDR2a.a.16F7 51 VH7-4.1种系a.a.
22 VK.2CDR2a.a.16F7 52 VH4-34种系a.a.
23 VK.1CDR2a.a.23C6 53 VH5-51种系a.a.
24 VK.2CDR2a.a.23C6 54 VH1-69种系a.a.
25 VK CDR3a.a.12C5 55 Vλ2b2种系a.a.
26 VK CDR3a.a.19A3 56 VK L6种系a.a.
27 VK.1CDR3a.a.16F7 57 VK A27种系a.a.
28 VK.2CDR3a.a.16F7 58 VKA10种系a.a.
29 VK.1CDR3a.a.23C6
30 VK.2CDR3a.a.23C6 59 人CD22(NP_001762)
60 VH CDR2a.a.CD22.2 61 VH a.a.CD22.2
62 VH n.t.CD22.2
63 VH CDR1a.a.4G6 81 VH a.a.4G6
SEQ ID NO： 序列 SEQ ID NO： 序列
64 VH1CDR1a.a.21F6 82 VH1a.a.21F6
65 VH2CDR1a.a.21F6 83 VH2a.a.21F6
66 VH CDR2a.a.4G6 84 VK1a.a.4G6
67 VH1CDR2a.a.21F6 85 VK2a.a.4G6
68 VH2CDR2a.a.21F6 86 VK a.a.21F6
69 VH CDR3a.a.4G6
70 VH1CDR3a.a.21F6 87 VH n.t.4G6
71 VH2CDR3a.a.21F6 88 VH1n.t.21F6
89 VH2n.t.21F6
72 VK1CDR1a.a.4G6
73 VK2CDR1a.a.4G6 90 VKj n.t.4G6
74 VK CDR1a.a.21F6 91 VK2n.t.4F6
92 VK2n.t.21F6
75 VK1CDR2a.a.4G6
76 VK2CDR2a.a.4G6 93 VK1L18种系a.a.
77 VK CDR2a.a.21F6
94 肽接头
78 V K1CDR3a.a.4G6 95 肽接头
79 VK2CDR3a.a.4G6 96 肽接头
80 VK CDR3a.a.21F6 97 肽接头
98 肽接头
99 肽接头
100 肽接头
101 肽接头
102 肽接头
103 肽接头
104 肽接头
105 肽接头
106 肽接头
107 肽接头
108 12C5JH6b种系 118 21F64-34种系VH1
109 JL2种系 119 21F6JH4b种系VH1
110 JK1种系 120 21F64-34种系VH2
111 JK4b种系 121 21F6JH4b种系VH2
112 JK3b种系 122 21F6VK L6种系
113 JK1种系 123 21F6VK JK4种系
114 JK2种系 124 4G6VH1-69种系
115 2-15种系 125 4G6VH JH4b种系
116 JK1种系 126 4G6VK1JK2种系
117 JH4b种系 127 4G6VK2A27种系
128 4G6VK2JK4种系

Claims (28)

1.分离的人单克隆抗体，或其抗原结合部分，包含
(a)重链可变区CDR1，其由序列如SEQ ID NO:2所示的氨基酸组成；
(b)重链可变区CDR2，其由序列如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:60所示的氨基酸组成；
(c)重链可变区CDR3，其由序列如SEQ ID NO:10所示的氨基酸组成；
(d)轻链可变区CDR1，其由序列如SEQ ID NO:14所示的氨基酸组成；
(e)轻链可变区CDR2，其由序列如SEQ ID NO:20所示的氨基酸组成；以及
(f)轻链可变区CDR3，其由序列如SEQ ID NO:26所示的氨基酸组成。
2.权利要求1的抗体或其抗原结合部分，包含
(a)重链可变区CDR1，其由序列如SEQ ID NO:2所示的氨基酸组成；
(b)重链可变区CDR2，其由序列如SEQ ID NO:6所示的氨基酸组成；
(c)重链可变区CDR3，其由序列如SEQ ID NO:10所示的氨基酸组成；
(d)轻链可变区CDR1，其由序列如SEQ ID NO:14所示的氨基酸组成；
(e)轻链可变区CDR2，其由序列如SEQ ID NO:20所示的氨基酸组成；以及
(f)轻链可变区CDR3，其由序列如SEQ ID NO:26所示的氨基酸组成。
3.权利要求1的抗体或其抗原结合部分，包含
(a)重链可变区CDR1，其由序列如SEQ ID NO:2所示的氨基酸组成；
(b)重链可变区CDR2，其由序列如SEQ ID NO:60所示的氨基酸组成；
(c)重链可变区CDR3，其由序列如SEQ ID NO:10所示的氨基酸组成；
(d)轻链可变区CDR1，其由序列如SEQ ID NO:14所示的氨基酸组成；
(e)轻链可变区CDR2，其由序列如SEQ ID NO:20所示的氨基酸组成；以及
(f)轻链可变区CDR3，其由序列如SEQ ID NO:26所示的氨基酸组成。
4.权利要求1的抗体或其抗原结合部分，包含
(a)重链可变区，其由序列如SEQ ID NO:32所示的氨基酸组成，以及
(b)轻链可变区，其由序列如SEQ ID NO:36所示的氨基酸组成。
5.权利要求1的抗体或其抗原结合部分，包含
(a)重链可变区，其由序列如SEQ ID NO:61所示的氨基酸组成，以及
(b)轻链可变区，其由序列如SEQ ID NO:36所示的氨基酸组成。
6.权利要求1-5的任一项的抗体或其抗原结合部分，其为IgG1同种型的全长抗体。
7.权利要求1-5的任一项的抗体或其抗原结合部分，其为IgG4同种型的全长抗体。
8.如权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分以1×10-9M或更小的KD与人CD22相结合。
9.如权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分以5×10-10M或更小的KD特异性地与人CD22相结合。
10.组合物，其包括如权利要求1-9任一项所述的抗体或其抗原结合部分、以及可药用的载体。
11.免疫缀合物，其包括如权利要求1-9的任一项所述的抗体或其抗原结合部分、以及配偶体分子，其中该配偶体分子是治疗剂。
12.权利要求11的免疫缀合物，其中所述配偶体分子通过化学接头与抗体缀合。
13.权利要求12的免疫缀合物，其中所述化学接头选自肽基接头、肼接头和二硫化物接头。
14.如权利要求11-13任一项所述的免疫缀合物，其中该治疗剂是细胞毒素。
15.如权利要求11-13中任一项所述的免疫缀合物，其中该治疗剂是放射性同位素。
16.组合物，其包含如权利要求11-15任一项所述的免疫缀合物以及可药用的载体。
17.分离的核酸，该核酸编码如权利要求1-9中任一项所述的抗体或其抗原结合部分。
18.表达载体，其包括如权利要求17所述的核酸。
19.宿主细胞，其包括如权利要求18所述的表达载体。
20.权利要求1-9中任一项的抗体或其抗原结合部分、或权利要求10的组合物的用途，其用于制备药物，所述药物用于治疗表达CD22的肿瘤。
21.权利要求11-15中任一项的免疫缀合物、或权利要求16的组合物的用途，其用于制备药物，所述药物用于治疗表达CD22的肿瘤。
22.如权利要求20或21所述的用途，其中表达CD22的肿瘤为B细胞淋巴瘤。
23.如权利要求22所述的用途，其中该B细胞淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤。
24.如权利要求20或21的用途，其中所述表达CD22的肿瘤为伯基特淋巴瘤。
25.如权利要求20或21的用途，其中所述表达CD22的肿瘤为慢性淋巴细胞白血病。
26.权利要求1-9中任一项的抗体或其抗原结合部分、或权利要求10的组合物的用途，其用于制备药物，所述药物用于治疗炎症或自身免疫病症。
27.如权利要求26的用途，其中所述自身免疫病症是系统性红斑狼疮。
28.如权利要求26的用途，其中所述自身免疫病症是类风湿性关节炎。
CN201310052225.7A 2006-12-01 2007-11-30 结合cd22的人抗体及其用途 Expired - Fee Related CN103172743B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US86823106P 2006-12-01 2006-12-01
US60/868,231 2006-12-01

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2007800504656A Division CN101626782B (zh) 2006-12-01 2007-11-30 结合cd22的人抗体及其用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103172743A CN103172743A (zh) 2013-06-26
CN103172743B true CN103172743B (zh) 2015-04-08

Family

ID=39493006

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2007800504656A Expired - Fee Related CN101626782B (zh) 2006-12-01 2007-11-30 结合cd22的人抗体及其用途
CN201310052225.7A Expired - Fee Related CN103172743B (zh) 2006-12-01 2007-11-30 结合cd22的人抗体及其用途

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2007800504656A Expired - Fee Related CN101626782B (zh) 2006-12-01 2007-11-30 结合cd22的人抗体及其用途

Country Status (17)

Country Link
US (3) US8481683B2 (zh)
EP (1) EP2097097B1 (zh)
JP (2) JP5398538B2 (zh)
KR (2) KR20150067395A (zh)
CN (2) CN101626782B (zh)
AR (1) AR064109A1 (zh)
BR (1) BRPI0717902A2 (zh)
CA (1) CA2671457C (zh)
CL (1) CL2007003479A1 (zh)
ES (1) ES2678060T3 (zh)
IL (1) IL199036A (zh)
MX (1) MX2009005776A (zh)
NZ (1) NZ578064A (zh)
SG (1) SG177168A1 (zh)
TW (1) TWI447124B (zh)
WO (1) WO2008070569A2 (zh)
ZA (1) ZA200904079B (zh)

Families Citing this family (76)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2671457C (en) 2006-12-01 2017-09-26 Medarex, Inc. Human antibodies that bind cd22 and uses thereof
US8680247B2 (en) * 2007-07-17 2014-03-25 Medarex, L.L.C. Monoclonal antibodies against glypican-3
WO2009124109A1 (en) * 2008-04-04 2009-10-08 The Government Of The U.S. A. As Represented By The Secretary Of The Dept. Of Health &Human Services Human monoclonal antibodies specific for cd22
WO2010096394A2 (en) 2009-02-17 2010-08-26 Redwood Biosciences, Inc. Aldehyde-tagged protein-based drug carriers and methods of use
US8394922B2 (en) 2009-08-03 2013-03-12 Medarex, Inc. Antiproliferative compounds, conjugates thereof, methods therefor, and uses thereof
CA2824143C (en) 2011-01-14 2018-12-18 Redwood Bioscience, Inc. Aldehyde-tagged immunoglobulin polypeptides and method of use thereof
CN106928362B (zh) * 2011-04-29 2021-10-26 埃派斯进有限公司 抗-cd40抗体及其使用方法
US8852599B2 (en) 2011-05-26 2014-10-07 Bristol-Myers Squibb Company Immunoconjugates, compositions for making them, and methods of making and use
BR112014004162A2 (pt) 2011-08-22 2018-04-24 Cangene Corp anticorpos contra clostridium difficile
WO2013061083A2 (en) * 2011-10-28 2013-05-02 Fredax Ab Therapeutic agents and uses thereof
AR089972A1 (es) 2012-02-13 2014-10-01 Bristol Myers Squibb Co Compuestos de enediino, conjugados de estos y sus usos y metodos
US9814782B2 (en) * 2012-02-24 2017-11-14 Alteogen Inc. Modified antibody in which motif comprising cysteine residue is bound, modified antibody-drug conjugate comprising the modified antibody, and production method for same
US9856323B2 (en) * 2012-04-26 2018-01-02 Bioatla, Llc Anti-CD22 antibodies
JP6578206B2 (ja) * 2012-07-19 2019-09-18 レッドウッド バイオサイエンス， インコーポレイテッド Ｃｄ２２に特異的な抗体およびその使用方法
US9474803B2 (en) 2012-11-27 2016-10-25 Alteogen Inc. Composition for stabilizing fusion protein in which protein and FC domain are fused
CA2900854C (en) 2013-02-14 2017-08-22 Bristol-Myers Squibb Company Tubulysin compounds, methods of making and use
EP3689904A1 (en) * 2013-03-13 2020-08-05 Prothena Biosciences Limited Tau immunotherapy
CN103214578B (zh) * 2013-05-10 2014-05-28 北京东方百泰生物科技有限公司 一种新型的人源化抗cd22抗体
MX368016B (es) 2013-08-14 2019-09-13 Univ Rice William M Derivados de uncialamicina, métodos de sintesis y su uso como agentes antitumor.
US20160237163A1 (en) * 2013-10-02 2016-08-18 Suri Technologies Ltd. Patient-specific immunotherapy for treating heterogeneous tumors
KR102442738B1 (ko) 2013-11-19 2022-09-15 프레닥스 에이비 인간화된 안티 칼리크레인-2 항체
EP3095462B1 (en) * 2014-01-15 2019-08-14 Order-Made Medical Research Inc. Therapeutic pharmaceutical composition employing anti-slc6a6 antibody
GB201409558D0 (en) 2014-05-29 2014-07-16 Ucb Biopharma Sprl Method
WO2015187519A1 (en) * 2014-06-06 2015-12-10 Merck Sharp & Dohme Corp. Tslp assay
GB201412659D0 (en) 2014-07-16 2014-08-27 Ucb Biopharma Sprl Molecules
GB201412658D0 (en) 2014-07-16 2014-08-27 Ucb Biopharma Sprl Molecules
US9821059B2 (en) 2014-10-17 2017-11-21 Alteogen Inc. Composition for stabilizing protein and pharmaceutical formulation comprising the same
US10077287B2 (en) 2014-11-10 2018-09-18 Bristol-Myers Squibb Company Tubulysin analogs and methods of making and use
CN113929770A (zh) 2014-11-21 2022-01-14 百时美施贵宝公司 包含修饰的重链恒定区的抗体
TW201632532A (zh) 2015-01-14 2016-09-16 必治妥美雅史谷比公司 伸雜芳基－橋聯苯并二氮呯二聚體，其共軛物及製造及使用方法
WO2016196344A1 (en) 2015-05-30 2016-12-08 Molecular Templates, Inc. De-immunized, shiga toxin a subunit scaffolds and cell-targeting molecules comprising the same
GB201601075D0 (en) 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibodies molecules
GB201601073D0 (en) 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
GB201601077D0 (en) * 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibody molecule
GB201521393D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
GB201521383D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl And Ucb Celltech Method
GB201521382D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
GB201521389D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl Method
GB201521391D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
US20180362619A1 (en) 2015-12-21 2018-12-20 Bristol-Myers Squibb Company Variant antibodies for site-specific conjugation
CA3019398A1 (en) 2016-04-26 2017-11-02 R.P. Scherer Technologies, Llc Antibody conjugates and methods of making and using the same
DK3452507T3 (da) 2016-05-02 2022-11-14 Prothena Biosciences Ltd Tau-immunoterapi
JP7481726B2 (ja) 2016-05-02 2024-05-13 プロセナ バイオサイエンシーズ リミテッド タウ認識抗体
KR20230070336A (ko) 2016-05-02 2023-05-22 프로테나 바이오사이언시즈 리미티드 타우 인식 항체
CN109069665A (zh) 2016-05-10 2018-12-21 百时美施贵宝公司 具有增强的稳定性的微管溶素类似物的抗体-药物缀合物
EP3500574B1 (en) 2016-08-19 2021-11-24 Bristol-Myers Squibb Company Seco-cyclopropapyrroloindole compounds, antibody-drug conjugates thereof, and methods of making and use
US10398783B2 (en) 2016-10-20 2019-09-03 Bristol-Myers Squibb Company Antiproliferative compounds and conjugates made therefrom
CU24636B1 (es) 2017-05-02 2022-12-12 Prothena Biosciences Ltd Anticuerpos que reconocen tau en los residuos 257-271 o 320-334 de la seq id no: 1
EP3630833A1 (en) 2017-05-25 2020-04-08 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies comprising modified heavy constant regions
KR20200021069A (ko) * 2017-06-08 2020-02-27 블랙 벨트 테라퓨틱스 리미티드 Cd38 조정 항체
US10494370B2 (en) 2017-08-16 2019-12-03 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a pyridine or pyrazine moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10508115B2 (en) 2017-08-16 2019-12-17 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having heteroatom-linked aromatic moieties, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10472361B2 (en) 2017-08-16 2019-11-12 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a benzotriazole moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10457681B2 (en) 2017-08-16 2019-10-29 Bristol_Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a tricyclic moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10487084B2 (en) 2017-08-16 2019-11-26 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a heterobiaryl moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US11827672B2 (en) 2018-03-30 2023-11-28 Eureka Therapeutics, Inc. Constructs trageting CD22 and uses thereof
WO2019209811A1 (en) 2018-04-24 2019-10-31 Bristol-Myers Squibb Company Macrocyclic toll-like receptor 7 (tlr7) agonists
EP3801629A1 (en) 2018-05-29 2021-04-14 Bristol-Myers Squibb Company Modified self-immolating moieties for use in prodrugs and conjugates and methods of using and making
US11554120B2 (en) 2018-08-03 2023-01-17 Bristol-Myers Squibb Company 1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidine compounds as toll-like receptor 7 (TLR7) agonists and methods and uses therefor
US20220106400A1 (en) 2018-11-28 2022-04-07 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies comprising modified heavy constant regions
CA3121131A1 (en) 2018-11-30 2020-06-04 Bristol-Myers Squibb Company Antibody comprising a glutamine-containing light chain c-terminal extension, conjugates thereof, and methods and uses
CN113544155A (zh) 2018-12-12 2021-10-22 百时美施贵宝公司 经修饰用于转谷氨酰胺酶缀合的抗体、其缀合物以及方法和用途
WO2020180819A1 (en) 2019-03-03 2020-09-10 Prothena Biosciences Limited Antibodies recognizing tau
KR20210152472A (ko) * 2019-03-11 2021-12-15 메모리얼 슬로안 케터링 캔서 센터 Cd22 항체 및 이를 사용하는 방법
CN109970858B (zh) * 2019-04-12 2023-05-09 深圳普瑞金生物药业股份有限公司 Cd22单域抗体、核苷酸序列及试剂盒
WO2021055306A1 (en) 2019-09-16 2021-03-25 Bristol-Myers Squibb Company Dual capture method for analysis of antibody-drug conjugates
JP2023521635A (ja) * 2020-04-02 2023-05-25 ナンチン イアソ バイオセラピューティクス カンパニー，リミティド 全ヒト化抗ヒトｃｄ２２のキメラ抗原受容体及びその応用
CN113527507A (zh) * 2020-04-16 2021-10-22 上海赛比曼生物科技有限公司 靶向cd22的嵌合抗原受体及其制法和应用
KR20210143096A (ko) * 2020-05-19 2021-11-26 (주)이노베이션바이오 Cd22에 특이적인 항체 및 이의 용도
KR20210143097A (ko) * 2020-05-19 2021-11-26 (주)이노베이션바이오 Cd22에 특이적인 항체 및 이의 용도
US20230212286A1 (en) * 2020-06-01 2023-07-06 Innobation Bio Co., Ltd. Antibodies specific for cd22 and uses thereof
CN114075286A (zh) * 2020-08-21 2022-02-22 张家港博泽利斯生物技术有限公司 一种抗人cxcr1蛋白单克隆抗体的制备方法
US20230416360A1 (en) * 2020-12-03 2023-12-28 Simcere Zaiming Pharmaceutical Co., Ltd. Anti-cd22 nano antibody and use thereof
KR20220122844A (ko) * 2021-02-26 2022-09-05 (주)이노베이션바이오 Cd22에 특이적인 인간화 항체 및 이의 용도
CN114702585B (zh) * 2021-11-26 2023-09-08 深圳宾德生物技术有限公司 一种抗cd22的单克隆抗体4f6及其制备方法和用途
WO2023216218A1 (zh) * 2022-05-13 2023-11-16 上海吉倍生物技术有限公司 Cd22特异性结合抗体及其制备方法和用途

Family Cites Families (190)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2484892A (en) * 1946-05-22 1949-10-18 Keston Reva Harris Chewed gum receptacle
US4391904A (en) 1979-12-26 1983-07-05 Syva Company Test strip kits in immunoassays and compositions therein
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4475196A (en) 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4486194A (en) 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
US4912227A (en) 1984-02-21 1990-03-27 The Upjohn Company 1,2,8,8A-tetrahydrocyclopropa(c)pyrrolo(3,2-e)-indol-4-(5H)-ones and related compounds
US4978757A (en) 1984-02-21 1990-12-18 The Upjohn Company 1,2,8,8a-tetrahydrocyclopropa (C) pyrrolo [3,2-e)]-indol-4(5H)-ones and related compounds
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US5374548A (en) 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
MX9203291A (es) 1985-06-26 1992-08-01 Liposome Co Inc Metodo para acoplamiento de liposomas.
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4954617A (en) 1986-07-07 1990-09-04 Trustees Of Dartmouth College Monoclonal antibodies to FC receptors for immunoglobulin G on human mononuclear phagocytes
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4881175A (en) 1986-09-02 1989-11-14 Genex Corporation Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5332837A (en) 1986-12-19 1994-07-26 The Upjohn Company CC-1065 analogs
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
US5013653A (en) 1987-03-20 1991-05-07 Creative Biomolecules, Inc. Product and process for introduction of a hinge region into a fusion protein to facilitate cleavage
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
AU612370B2 (en) 1987-05-21 1991-07-11 Micromet Ag Targeted multifunctional proteins
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5773435A (en) 1987-08-04 1998-06-30 Bristol-Myers Squibb Company Prodrugs for β-lactamase and uses thereof
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5476996A (en) 1988-06-14 1995-12-19 Lidak Pharmaceuticals Human immune system in non-human animal
US5084468A (en) 1988-08-11 1992-01-28 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Dc-88a derivatives
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
ATE102631T1 (de) 1988-11-11 1994-03-15 Medical Res Council Klonierung von immunglobulin sequenzen aus den variabelen domaenen.
ATE135370T1 (de) 1988-12-22 1996-03-15 Kirin Amgen Inc Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor
JP2598116B2 (ja) 1988-12-28 1997-04-09 協和醗酵工業株式会社 新規物質ｄｃ１１３
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
US6291158B1 (en) 1989-05-16 2001-09-18 Scripps Research Institute Method for tapping the immunological repertoire
US5187186A (en) 1989-07-03 1993-02-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Pyrroloindole derivatives
JP2510335B2 (ja) 1989-07-03 1996-06-26 協和醗酵工業株式会社 Ｄｃ―８８ａ誘導体
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
SG48759A1 (en) 1990-01-12 2002-07-23 Abgenix Inc Generation of xenogenic antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
WO1991016324A1 (en) 1990-04-25 1991-10-31 The Upjohn Company Novel cc-1065 analogs
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5763566A (en) 1990-06-11 1998-06-09 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue SELEX
US5712375A (en) 1990-06-11 1998-01-27 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue selex
US6261774B1 (en) 1990-06-11 2001-07-17 Gilead Sciences, Inc. Truncation selex method
US5864026A (en) 1990-06-11 1999-01-26 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue selex
US5789157A (en) 1990-06-11 1998-08-04 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue selex
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
EP0814159B1 (en) 1990-08-29 2005-07-27 GenPharm International, Inc. Transgenic mice capable of producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) * 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
GB9108652D0 (en) 1991-04-23 1991-06-12 Antisoma Ltd Immunoreactive compounds
JPH0597853A (ja) 1991-10-07 1993-04-20 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Ｄｃ−８９誘導体の臭化水素酸塩
ATE408012T1 (de) 1991-12-02 2008-09-15 Medical Res Council Herstellung von autoantikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken
EP0616640B1 (en) 1991-12-02 2004-09-01 Medical Research Council Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
EP0746609A4 (en) 1991-12-17 1997-12-17 Genpharm Int NON-HUMAN TRANSGENIC ANIMALS CAPABLE OF PRODUCING HETEROLOGOUS ANTIBODIES
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
EP0640094A1 (en) 1992-04-24 1995-03-01 The Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
GB9314960D0 (en) 1992-07-23 1993-09-01 Zeneca Ltd Chemical compounds
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US6765087B1 (en) 1992-08-21 2004-07-20 Vrije Universiteit Brussel Immunoglobulins devoid of light chains
ATE231002T1 (de) 1992-09-16 2003-02-15 Scripps Research Inst Menschliche, neutralisierende, monoklonale antikörper gegen das respiratorische synzytialvirus
GB9223377D0 (en) 1992-11-04 1992-12-23 Medarex Inc Humanized antibodies to fc receptors for immunoglobulin on human mononuclear phagocytes
JP3919830B2 (ja) 1992-11-28 2007-05-30 財団法人化学及血清療法研究所 抗ネコヘルペスウイルス−１組換え抗体および該抗体をコードする遺伝子断片
AU6819494A (en) 1993-04-26 1994-11-21 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6838254B1 (en) 1993-04-29 2005-01-04 Conopco, Inc. Production of antibodies or (functionalized) fragments thereof derived from heavy chain immunoglobulins of camelidae
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
US5484892A (en) 1993-05-21 1996-01-16 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Monoclonal antibodies that block ligand binding to the CD22 receptor in mature B cells
WO1994029351A2 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Celltech Limited Antibodies
US5625825A (en) 1993-10-21 1997-04-29 Lsi Logic Corporation Random number generating apparatus for an interface unit of a carrier sense with multiple access and collision detect (CSMA/CD) ethernet data network
US5831077A (en) 1993-12-09 1998-11-03 Redmond; John William Glycosylhydrazines, preparation, immobilization and reactions of: glycoprotein analysis and O-glycan removal
AU1866895A (en) 1994-01-04 1995-08-01 Scripps Research Institute, The Human monoclonal antibodies to herpes simplex virus and methods therefor
SE9400088D0 (sv) 1994-01-14 1994-01-14 Kabi Pharmacia Ab Bacterial receptor structures
AU685939B2 (en) 1994-04-22 1998-01-29 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. DC-89 derivative
JPH07309761A (ja) 1994-05-20 1995-11-28 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd デュオカルマイシン誘導体の安定化法
IL114909A (en) 1994-08-12 1999-10-28 Immunomedics Inc Immunoconjugates and humanized antibodies specific for b-cell lymphoma and leukemia cells
EP0786252A4 (en) 1994-09-30 1998-01-07 Kyowa Hakko Kogyo Kk ANTI-TUMOR AGENT
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6013443A (en) 1995-05-03 2000-01-11 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue SELEX
US6114120A (en) 1995-05-03 2000-09-05 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue selex
WO1997012862A1 (en) 1995-10-03 1997-04-10 The Scripps Research Institute Cbi analogs of cc-1065 and the duocarmycins
US6090382A (en) 1996-02-09 2000-07-18 Basf Aktiengesellschaft Human antibodies that bind human TNFα
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US6183744B1 (en) 1997-03-24 2001-02-06 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
US6306393B1 (en) 1997-03-24 2001-10-23 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
CA2289115A1 (en) 1997-05-07 1998-11-12 Bristol-Myers Squibb Company Recombinant antibody-enzyme fusion proteins
DE69833755T2 (de) 1997-05-21 2006-12-28 Biovation Ltd. Verfahren zur herstellung von nicht-immunogenen proteinen
AU754083B2 (en) 1997-05-22 2002-11-07 Scripps Research Institute, The Analogs of duocarmycin and CC-1065
DE19742706B4 (de) 1997-09-26 2013-07-25 Pieris Proteolab Ag Lipocalinmuteine
GB9722131D0 (en) 1997-10-20 1997-12-17 Medical Res Council Method
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
AU3657899A (en) 1998-04-20 1999-11-08 James E. Bailey Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
GB9814383D0 (en) 1998-07-02 1998-09-02 Cambridge Antibody Tech Improvements relating to antibodies
US6951646B1 (en) 1998-07-21 2005-10-04 Genmab A/S Anti hepatitis C virus antibody and uses thereof
WO2000033888A2 (en) 1998-12-11 2000-06-15 Coulter Pharmaceutical, Inc. Prodrug compounds and process for preparation thereof
CN1237076C (zh) 1999-01-15 2006-01-18 杰南技术公司 具有改变的效应功能的多肽变体
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US6914128B1 (en) 1999-03-25 2005-07-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing
EP2264166B1 (en) 1999-04-09 2016-03-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
US7829064B2 (en) 1999-05-10 2010-11-09 Immunomedics, Inc. Anti-CD74 immunoconjugates and methods
EP1543839B1 (en) * 1999-06-09 2017-09-20 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of autoimmune disorders using antibodies which target B-cells
CA2375912C (en) * 1999-06-09 2014-03-11 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of autoimmune disorders using antibodies which target b-cells
US6387620B1 (en) 1999-07-28 2002-05-14 Gilead Sciences, Inc. Transcription-free selex
JP2003516718A (ja) 1999-07-29 2003-05-20 メダレックス インク ＨＥＲ２／ｎｅｕに対するヒトモノクローナル抗体
EP2829609A1 (en) 1999-08-24 2015-01-28 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Human CTLA-4 antibodies and their uses
US6794132B2 (en) 1999-10-02 2004-09-21 Biosite, Inc. Human antibodies
JP2004510703A (ja) 2000-06-14 2004-04-08 メダレックス，インコーポレイティド 酵素−分解性プロドラッグ化合物
AU7552501A (en) 2000-06-14 2002-01-08 Corixa Corp Tripeptide prodrug compounds
JP2004510702A (ja) 2000-06-14 2004-04-08 メダレックス，インコーポレイティド イソロイシンを有するプロドラッグ化合物
JP2004512262A (ja) 2000-06-20 2004-04-22 アイデック　ファーマスーティカルズ　コーポレイション 非放射性抗ｃｄ２０抗体／放射標識抗ｃｄ２２抗体の組合せ
DE60140474D1 (de) 2000-09-08 2009-12-24 Univ Zuerich Sammlung von proteinen mit sich wiederholenden sequenzen (repeat proteins), die repetitive sequenzmodule enthalten
JP2004529610A (ja) * 2000-10-13 2004-09-30 ユーエイビー リサーチ ファンデーション ヒト抗上皮増殖因子受容体一本鎖抗体
US6818216B2 (en) 2000-11-28 2004-11-16 Medimmune, Inc. Anti-RSV antibodies
PT1354034E (pt) 2000-11-30 2008-02-28 Medarex Inc Roedores transgénicos transcromossómicos para produção de anticorpos humanos
EP1243276A1 (en) 2001-03-23 2002-09-25 Franciscus Marinus Hendrikus De Groot Elongated and multiple spacers containing activatible prodrugs
US20050053973A1 (en) 2001-04-26 2005-03-10 Avidia Research Institute Novel proteins with targeted binding
US20060223114A1 (en) 2001-04-26 2006-10-05 Avidia Research Institute Protein scaffolds and uses thereof
US20050089932A1 (en) 2001-04-26 2005-04-28 Avidia Research Institute Novel proteins with targeted binding
US20050048512A1 (en) 2001-04-26 2005-03-03 Avidia Research Institute Combinatorial libraries of monomer domains
US20030157561A1 (en) 2001-11-19 2003-08-21 Kolkman Joost A. Combinatorial libraries of monomer domains
US20040175756A1 (en) 2001-04-26 2004-09-09 Avidia Research Institute Methods for using combinatorial libraries of monomer domains
DK1390535T3 (da) 2001-04-26 2010-12-06 Amgen Mountain View Inc Kombinatoriske biblioteker af monomer-domæner
CA2658221C (en) * 2001-04-27 2012-11-27 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Anti-cd40 monoclonal antibody
CN100448992C (zh) 2001-05-11 2009-01-07 麒麟医药株式会社 含人抗体λ轻链基因的人类人工染色体
JP2004532038A (ja) 2001-05-17 2004-10-21 ディヴァーサ コーポレイション 新規抗原結合分子の治療、診断、予防、酵素、産業ならびに農業各分野への応用とそのための新規抗原結合分子の作製とスクリーニングの方法
EP1434778A4 (en) 2001-05-31 2005-07-13 Medarex Inc CYTOTOXINS, PROMEDICAMENTS, BINDERS AND STABILIZERS USEFUL THEREFOR
DE60239679D1 (de) 2001-06-11 2011-05-19 Medarex Inc Methode für die ausarbeitung von cd10-aktivierten prodrug-verbindungen
DK1399484T3 (da) 2001-06-28 2010-11-08 Domantis Ltd Dobbelt-specifik ligand og anvendelse af denne
EP1539233B1 (en) * 2001-07-12 2011-04-27 FOOTE, Jefferson Super humanized antibodies
NZ603111A (en) * 2001-08-03 2014-05-30 Roche Glycart Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
EP1423110A4 (en) 2001-09-07 2005-04-27 Scripps Research Inst CBI ANALOGUE OF CC-1065 AND DUOCARMYCINES
US7091186B2 (en) 2001-09-24 2006-08-15 Seattle Genetics, Inc. p-Amidobenzylethers in drug delivery agents
WO2003027135A2 (en) 2001-09-26 2003-04-03 The Government Of The United States, As Represented By The Secretary Of Health And Human Services Mutated anti-cd22 antibodies with increased affinity to cd22-expressing leukemia cells
DE60232265D1 (de) 2001-10-25 2009-06-18 Genentech Inc Glycoprotein-zusammensetzungen
US20060191026A1 (en) 2005-02-18 2006-08-24 Origen Therapeutics, Inc. Tissue specific expression of antibodies in chickens
ATE482719T1 (de) * 2002-02-21 2010-10-15 Univ Duke Behandlungsverfahren unter verwendung von anti- cd22-antikörpern
AU2003217912A1 (en) 2002-03-01 2003-09-16 Xencor Antibody optimization
AU2003215732B2 (en) 2002-03-01 2009-12-17 Immunomedics, Inc. Internalizing anti-CD74 antibodies and methods of use
EA200401325A1 (ru) 2002-04-09 2005-04-28 Киова Хакко Когио Ко., Лтд. Клетки с модифицированным геномом
GB0210121D0 (en) * 2002-05-02 2002-06-12 Celltech R&D Ltd Biological products
NZ573563A (en) 2002-05-02 2010-10-29 Wyeth Corp Calicheamicin derivative-carrier conjugates with reduced low conjugated fraction (LCF)
WO2003105782A2 (en) 2002-06-17 2003-12-24 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Specificity grafting of a murine antibody onto a human framework
EP1517921B1 (en) 2002-06-28 2006-06-07 Domantis Limited Dual specific ligands with increased serum half-life
EP1558646A2 (en) 2002-11-08 2005-08-03 Ablynx N.V. Single domain antibodies directed against interferon- gamma and uses thereof
JP2006523090A (ja) 2002-12-27 2006-10-12 ドマンティス リミテッド リガンドに、そしてリガンド受容体に特異的な二重特異性単一ドメイン抗体
CA2525120C (en) 2003-05-14 2013-04-30 Domantis Limited A process for recovering polypeptides that unfold reversibly from a polypeptide repertoire
ES2315664T3 (es) 2003-06-30 2009-04-01 Domantis Limited Anticuerpos de dominio unico (dab) pegilados.
EP1660654B1 (en) 2003-09-04 2011-11-09 Medarex, Inc. Expression vector
US20050164301A1 (en) 2003-10-24 2005-07-28 Avidia Research Institute LDL receptor class A and EGF domain monomers and multimers
JP4813364B2 (ja) 2003-11-25 2011-11-09 アメリカ合衆国 突然変異型抗ｃｄ２２抗体および免疫複合体
US20060008844A1 (en) 2004-06-17 2006-01-12 Avidia Research Institute c-Met kinase binding proteins
EP1824796A4 (en) 2004-11-16 2010-02-17 Avidia Res Inst PROTEIN SKELETONS AND USES THEREOF
WO2006079372A1 (en) 2005-01-31 2006-08-03 Ablynx N.V. Method for generating variable domain sequences of heavy chain antibodies
CA2607663C (en) * 2005-05-19 2014-08-12 Amgen Inc. Compositions and methods for increasing the stability of antibodies
EP1929073A4 (en) 2005-09-27 2010-03-10 Amunix Inc PROTEIN MEDICAMENT AND ITS USE
EP2455100A3 (en) 2005-11-07 2012-11-07 The Rockefeller University Reagents, methods and systems for selecting a cytotoxic antibody or variant thereof
CA2627190A1 (en) 2005-11-10 2007-05-24 Medarex, Inc. Duocarmycin derivatives as novel cytotoxic compounds and conjugates
EA016609B1 (ru) 2005-11-28 2012-06-29 Генмаб А/С Рекомбинантные моновалентные антитела и способы их получения
EP1973940A2 (en) 2006-01-17 2008-10-01 Biolex Therapeutics, Inc. Compositions and methods for humanization and optimization of n-glycans in plants
EP2639242A3 (en) 2006-03-06 2013-10-16 MedImmune, Inc. Humanized anti-CD22 antibodies and their use in treatment of oncology, transplantation and autoimmune disease
EP2447282B1 (en) 2006-05-30 2016-01-27 Genentech, Inc. Anti-CD22 Antibodies, their Immunoconjugates and uses thereof
CA2671457C (en) 2006-12-01 2017-09-26 Medarex, Inc. Human antibodies that bind cd22 and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
US20100143368A1 (en) 2010-06-10
JP2014039548A (ja) 2014-03-06
WO2008070569A2 (en) 2008-06-12
EP2097097B1 (en) 2018-05-30
US9499632B2 (en) 2016-11-22
KR20150067395A (ko) 2015-06-17
TWI447124B (zh) 2014-08-01
CN101626782B (zh) 2013-03-27
NZ578064A (en) 2012-01-12
JP5846695B2 (ja) 2016-01-20
CL2007003479A1 (es) 2009-01-23
KR20090088920A (ko) 2009-08-20
CA2671457A1 (en) 2008-06-12
KR101552735B1 (ko) 2015-09-14
SG177168A1 (en) 2012-01-30
IL199036A (en) 2014-11-30
JP5398538B2 (ja) 2014-01-29
CA2671457C (en) 2017-09-26
US20130230530A1 (en) 2013-09-05
CN101626782A (zh) 2010-01-13
MX2009005776A (es) 2009-06-10
WO2008070569A3 (en) 2008-11-20
ZA200904079B (en) 2010-04-28
US20170058031A1 (en) 2017-03-02
EP2097097A2 (en) 2009-09-09
JP2010511388A (ja) 2010-04-15
EP2097097A4 (en) 2011-03-09
BRPI0717902A2 (pt) 2013-10-29
AU2007329529A1 (en) 2008-06-12
IL199036A0 (en) 2010-03-28
TW200840823A (en) 2008-10-16
US8481683B2 (en) 2013-07-09
CN103172743A (zh) 2013-06-26
ES2678060T3 (es) 2018-08-08
AR064109A1 (es) 2009-03-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103172743B (zh) 结合cd22的人抗体及其用途
JP5517626B2 (ja) Ｃｄ１９に結合するヒト抗体およびその使用
JP5816558B2 (ja) Ｃａｄｍ１に特異的な完全ヒト抗体
US20100150950A1 (en) Human antibodies that bind cd70 and uses thereof
CN103897058A (zh) 结合cxcr4的人类抗体及其用途
CN101636502B (zh) 结合cd19的人类抗体及其用途
CN101951959A (zh) 抗b7h4单克隆抗体-药物缀合物和使用方法
CN101605906A (zh) 结合cd70的人类抗体及其用途
KR20100101124A (ko) 단백질 티로신 키나제 ７ (ｐｔｋ７)에 대한 모노클로날 항체 파트너 분자 컨쥬게이트
AU2007329529B2 (en) Human antibodies that bind CD22 and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
C53 Correction of patent of invention or patent application
CB02 Change of applicant information

Address after: new jersey

Applicant after: MEDAREX,INC

Address before: new jersey

Applicant before: Medarex Inc.

SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20161121

Address after: new jersey

Patentee after: E.R. expensive precious & Sheng Si limited liability company is executed

Address before: new jersey

Patentee before: MEDAREX,INC

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20150408

Termination date: 20181130