CN103897058A - 结合cxcr4的人类抗体及其用途 - Google Patents

结合cxcr4的人类抗体及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN103897058A
CN103897058A CN201410083654.5A CN201410083654A CN103897058A CN 103897058 A CN103897058 A CN 103897058A CN 201410083654 A CN201410083654 A CN 201410083654A CN 103897058 A CN103897058 A CN 103897058A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
cxcr4
seq
cell
variable region
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201410083654.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103897058B (zh
Inventor
M·库恩
P·布拉姆斯
D·M·塔纳玛奇
A·科曼
J·M·卡达里尔利
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
E.R. expensive precious & Sheng Si limited liability company is executed
Original Assignee
Medarex LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=39402166&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN103897058(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Medarex LLC filed Critical Medarex LLC
Publication of CN103897058A publication Critical patent/CN103897058A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103897058B publication Critical patent/CN103897058B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Abstract

本披露提供了以高亲和力与CXCR4特异地结合的分离的单克隆抗体，尤其是人类单克隆抗体。还提供了对本披露的抗体进行编码的核酸分子、表达载体、宿主细胞、以及用于表达本披露的抗体的方法。还提供了免疫偶联物、双特异性分子以及包括本披露的抗体的药物组合物。本披露还提供了用于检测CXCR4的方法，以及使用本披露的一种抗-CXCR4抗体治疗不同癌症、炎性病症以及HIV感染的方法。

Description

结合CXCR4的人类抗体及其用途
本申请是申请日为2007年10月1日和发明名称为“结合CXCR4的人类抗体及其用途”的200780040511.4号发明专利申请的分案申请。
发明背景
趋化因子是约50种小蛋白质的一个蛋白质家族，趋化因子调节细胞运输以及血管发生，并且在肿瘤微环境中也起重要的作用(Vicari，A.P.and Caux，C.(2002)Cytokine Growth Factor Rev.13∶143-154)。根据它们的结构，趋化因子被分为C-C趋化因子(包含一种半胱氨酸-半胱氨酸模体)或C-X-C趋化因子(包含一种半胱氨酸-X-半胱氨酸模体)。结合这种趋化因子的受体因而分别分为CCR家族的成员或CXCR家族的成员。CXCR家族的一个成员是CXCR4(一种七次跨膜的G-蛋白偶联受体)，它主要在淋巴细胞表达并且激活趋化性。CXCR4结合趋化因子CXCL12(SDF-1)。
CXCR4在胚胎发生、内环境平衡以及炎症中起作用。利用经工程处理的CXCR4或SDF-1缺乏的小鼠的研究提示在器官血管形成以及在免疫及造血系统中的CXCR4／SDF-1途径(Tachibaha，K.et al.(1998)Nature393∶591-594)。此外，已经发现CXCR4作为一种辅助受体针对T淋巴营养HIV-1分离发挥作用(Feng，Y.et al.(1996)Science272∶872-877)。还已经发现CXCR4在种类广泛的肿瘤细胞类型上被表达。另外已经发现CXCR4／SDF-1途径参与了刺激多种不同新生物的转移进程(Mumhy，P.M.(2001)N.Engl.J.Med.345∶833-835)。例如，已经发现CXCR4以及SDF-1通过在原发瘤灶与转移性灶之间创造一种趋化性梯度而介导器官特异性转移(Muller，A.et al.(2001)Nature410∶50-56；Murakami，T.et al.(2002)Cancer Res.62∶7328-7334；Hanahan，D.et al.(2003)Cancer Res.63∶3005-3008)。
概述
本披露提供了分离的单克隆抗体，特别是结合人类CXCR4并且表现出多种人们希望的性质的人类单克隆抗体。这些特性包括与在一种细胞表面表达的天然人类CXCR4结合的能力、抑制SDF-1与人类CXCR4结合的能力、抑制在表达CXCR4的细胞中SDF-1诱导的钙流动的能力、抑制SDF1诱导的表达CXCR4的细胞的迁移的能力、抑制由人脐静脉内皮细胞(HuVECs)形成毛细管的能力、在表达CXCR4的细胞中诱导凋亡的能力、在体外抑制肿瘤细胞增殖的能力、在体内抑制肿瘤细胞增殖的能力、抑制CXCR4阳性的肿瘤细胞的转移的能力和／或增加CXCR4阳性肿瘤携带者的存活时间的能力。
一方面，本披露涉及一种分离的人类单克隆抗体，或它的一个抗原结合部分，其中该抗体结合至在一个细胞表面表达的天然人类CXCR4上。在一个实施方案中，该抗体还抑制SDF-1与人类CXCR4的结合，优选具有50nM或更小的EC50、或30nM或更小、或15nM或更小、或10nM或更小、或5nM或更小、或3nM或更小(例如，用于抑制的EC50是28.60nM或更小、或12.51nM或更小、或2.256nM或更小)。在另一个实施方案中，该抗体结合至在一种细胞表面表达的天然人类CXCR4，但是不抑制SDF-1与人类CXCR4的结合。在另外的其他实施方案中，在表达人类CXCR4的细胞中，该抗体也抑制SDF-1诱导的钙流动，优选具有用于抑制的EC50为3nM或更小、或2nM或更小、或1nM或更小、或0.9nM或更小、或0.8nM或更小、或0.7nM或更小、或0.6nM或更小、或0.5nM或更小、或0.4nM或更小(例如，0.9046nM或更小、0.5684或更小、或0.3219nM或更小)。在另外的其他实施方案中，该抗体也抑制SDF-1诱导的表达人类CXCR4的细胞的迁移，优选具有用于抑制的EC50是50nM或更小、或30nM或更小、或20nM或更小、或15nM或更小(例如，18.99nM或更小、或12.44nM或更小)。在再其他实施方案中，该抗体还抑制由HuVEC形成毛细管、诱导表达CXCR4的细胞的凋亡、在体外抑制肿瘤细胞的增殖、在体内抑制肿瘤细胞增殖或诱导肿瘤细胞凋亡、抑制CXCR4阳性肿瘤细胞的转移和／或增加CXCR4阳性肿瘤携带者的存活时间。
优选地，该抗体以高亲和力结合人类CXCR4，比如具有1×10-7M或更小的KD，或具有5×10-8M或更小的KD。优选地，本披露的抗体是全长抗体(即，包括可变区与恒定区)。此外，优选地培养本披露的抗体以对抗在宿主细胞或在人造膜上处于全长人类CXCR-4的天然构象中表达的全长人类CXCR-4。
在一个优选的方面，本披露涉及一种分离的人类单克隆抗体，或它的一个抗原结合部分，其中该抗体：
(a)结合至在一种细胞表面表达的天然人类CXCR4上；
(b)抑制SDF-1与人类CXCR4的结合；
(c)抑制SDF-1诱导的表达人类CXCR4的细胞中的钙流动；
(d)抑制SDF-1诱导的表达人类CXCR4的细胞的迁移；并且
(e)抑制由人脐静脉内皮细胞形成毛细管。
甚至更优选地，该抗体还诱导表达人类CXCR4的细胞的凋亡和／或抑制CXCR4阳性的肿瘤细胞的生长和／或在体内诱导肿瘤细胞凋亡。
在另一方面，本披露涉及一种分离的人类单克隆抗体，或其抗原结合部分，其中该抗体与一种参考抗体交叉竞争而结合到CXCR4上，其中该参考抗体包括：
(a)一个重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO∶25，以及一个轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO∶29；或
(b)一个重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO∶26，以及一个轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO∶30；或
(c)一个重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO∶27，以及一个轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO∶31；或
(d)一个重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO∶28，以及一个轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO∶32。
在某些实施方案中，本披露提供了一种分离的单克隆抗体，或它的一个抗原结合部分，包括一个产自或源自于人类VH3-48基因的一个重链可变区，其中该抗体特异地结合CXCR4。在其他实施方案中，本披露提供了一种分离的单克隆抗体，或其抗原结合部分，包括产自或源自于人类VK L15基因的一个轻链可变区，其中该抗体特异地结合人类CXCR4。在另外的其他实施方案中，本披露提供了一种分离的单克隆抗体，或它的一个抗原结合部分，包括产自或源自于人类VH3-48基因的一个重链可变区，以及产自或源自于人类VK L15基因的一个轻链可变区，其中该抗体特异地结合人类CXCR4。
在另一方面，本披露提供了一种分离的单克隆抗体，或其抗原结合部分，包括：
一个重链可变区，该重链可变区包括CDR1、CDR2，以及CDR3序列；以及一个轻链可变区，该轻链可变区包括CDR1、CDR2，以及CDR3序列，其中：
(a)该重链可变区CDR3序列包括一个氨基酸序列，该氨基酸序列选自下组，其构成为：氨基酸序列SEQ ID NO∶9至12，以及它们的保守性修饰；
(b)该轻链可变区CDR3序列包括一个氨基酸序列，该氨基酸序列选自下组，其构成为：氨基酸序列SEQ ID NO∶21至24，以及它们的保守性修饰；以及
(c)该抗体结合至在一种细胞表面上表达的天然人类CXCR4。
在多个优选的实施方案中，这一抗体还具有以下特性中的一种或多种特性：抑制SDF-1与CXCR4的结合，抑制在表达CXCR4的细胞中SDF-1诱导的钙流动，抑制SDF-1诱导的表达CXCR4的细胞的迁移；抑制由HuVEC形成毛细管；诱导表达CXCR4的细胞的凋亡(在体内和／或在体外)，在体外和／或在体内抑制CXCR4阳性的肿瘤细胞的生长、和／或抑制CXCR4阳性的肿瘤细胞的转移。
优选地，该重链可变区CDR2序列包括一个氨基酸序列，该氨基酸序列选自下组，其构成为：氨基酸序列SEQ ID NO∶5至8，以及它们的保守性修饰；并且该轻链可变区CDR2序列包括一个氨基酸序列，该氨基酸序列选自下组，其构成为：氨基酸序列SEQ ID NO∶17至12，以及它们的保守性修饰。优选地，该重链可变区CDR1序列包括一个氨基酸序列，该氨基酸序列选自下组，其构成为：氨基酸序列SEQ ID NO∶1至4，以及它们的保守性修饰；并且该轻链可变区CDR1序列包括一个氨基酸序列，该氨基酸序列选自下组，其构成为：氨基酸序列SEQ ID NO∶13至16，以及它们的保守性修饰。
一种优选的组合包括：
(a)一个重链可变区CDR1，包括SEQ ID NO∶1；
(b)一个重链可变区CDR2，包括SEQ ID NO∶5；
(c)一个重链可变区CDR3，包括SEQ ID NO∶9；
(d)一个轻链可变区CDR1，包括SEQ ID NO∶13；
(e)一个轻链可变区CDR2，包括SEQ ID NO∶17；以及
(f)一个轻链可变区CDR3，包括SEQ ID NO∶21。
另一种优选的组合包括：
(a)一个重链可变区CDR1，包括SEQ ID NO∶2；
(b)一个重链可变区CDR2，包括SEQ ID NO∶6；
(c)一个重链可变区CDR3，包括SEQ ID NO∶10；
(d)一个轻链可变区CDR1，包括SEQ ID NO∶14；
(e)一个轻链可变区CDR2，包括SEQ ID NO∶18；以及
(f)一个轻链可变区CDR3，包括SEQ ID NO∶22。
另一种优选的组合包括：
(a)一个重链可变区CDR1，包括SEQ ID NO∶3；
(b)一个重链可变区CDR2，包括SEQ ID NO∶7；
(c)一个重链可变区CDR3，包括SEQ ID NO∶11；
(d)一个轻链可变区CDR1，包括SEQ ID NO∶15；
(e)一个轻链可变区CDR2，包括SEQ ID NO∶19；以及
(f)一个轻链可变区CDR3，包括SEQ ID NO∶23。
另一种优选的组合包括：
(a)一个重链可变区CDR1，包括SEQ ID NO∶4；
(b)一个重链可变区CDR2，包括SEQ ID NO∶8；
(c)一个重链可变区CDR3，包括SEQ ID NO∶12；
(d)一个轻链可变区CDR1，包括SEQ ID NO∶16；
(e)一个轻链可变区CDR2，包括SEQ ID NO∶20；以及
(f)一个轻链可变区CDR3，包括SEQ ID NO∶24。
本披露的其他优选抗体，或其抗原结合部分包括：(a)一个重链可变区，包括一个氨基酸序列，该氨基酸序列选自下组，其构成为：SEQID NO∶25至28以及41至44；以及(b)一个轻链可变区，包括一个氨基酸序列，该氨基酸序列选自下组，其构成为：SEQ ID NO∶29至32以及45至48；其中该抗体特异地结合CXCR4。
一种优选的组合包括：(a)一个重链可变区，包括氨基酸序列SEQID NO∶25或41；以及(b)一个轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO∶29或45。
另一种优选的组合包括：(a)一个重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO∶26或42；以及(b)一个轻链可变区，包括氨基酸序列SEQID NO∶30或46。
另一种优选的组合包括：(a)一个重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO∶27或43；以及(b)一个轻链可变区，包括氨基酸序列SEQID NO∶31或47。
另一种优选的组合包括：(a)一个重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO∶28或44；以及(b)一个轻链可变区，包括氨基酸序列SEQID NO∶32或48。
在本披露的另一方面，提供了多种抗体、或它们的抗原结合部分，它们与上述抗体中的任何抗体竞争而结合在CXCR4上。
例如，本披露的抗体可以是全长抗体，例如IgGl或IgG4同种型。作为替代，这些抗体可以是诸如Fab、Fab’、或Fab’2片段的抗体片段，或单链抗体。
本披露还提供了一种免疫偶联物，包括连接至治疗剂(如细胞毒素或放射性同位素)的本披露的抗体，或其抗原结合部分。本披露还提供了包括本披露的抗体，或其抗原结合部分的一种双特异性分子，连接至具有不同于所述抗体，或其抗原结合部分的结合特异性的第二功能部分。
还提供了包括本披露的一种抗体、或其抗原结合部分、或免疫偶联物、或双特异性分子以及一种药学上可接受的载体的多种组合物。
本披露还包括对本披露的抗体、或它们的抗原结合部分进行编码的核酸分子，以及包括这种核酸的表达载体以及包括这种表达载体的宿主细胞。还提供了使用包括这种表达载体的宿主细胞制备抗-CXCR4抗体的方法，并且可能包括的步骤有(i)在宿主细胞中表达该抗体以及(ii)从宿主细胞中分离该抗体。
本披露的另一方面涉及在细胞内调节CXCR4活性的方法，其中该细胞与本披露的一种抗体、或其抗原结合部分接触。通过培养该细胞可以使该细胞在体外与该抗体接触或通过将该抗体给予受试者可以在体内接触该细胞。在一个优选的实施方案中，该细胞是表达CXCR4的肿瘤细胞，并且该方法导致对肿瘤细胞生长的抑制作用和／或对肿瘤细胞转移的抑制作用。在另一个实施方案中，该细胞是表达CXCR4的T细胞，并且该方法导致对HIV进入这些细胞的抑制作用。在又另一个实施方案中，该细胞是处于炎性病症的淋巴细胞，并且该方法导致对炎症的抑制作用。在又另一个实施方案里，该细胞参于血管化作用，并且该方法导致对血管发生的调节作用。
在另一方面，本披露涉及刺激CD34阳性的干细胞从受试者的骨髓向外周血的动员的方法，该方法包括给予该受试者本披露的抗体，或其抗原结合部分，使得CD34阳性的干细胞从骨髓向外周血的动员受到刺激。该方法可以进一步包括从外周血收集CD34阳性的干细胞，例如用于自体的干细胞移植。
本披露的其他特征及优点从以下详细说明及与实例中将是清楚的，这些说明与实例不应被解释为是对本披露的限制。在本申请全文中引用的所有参考文献、Genbank登录号、专利、以及已公开的专利申请都明确地通过引用结合在此。
特别地，本发明涉及以下各项：
1.一种分离的人类单克隆抗体，或它的一个抗原结合部分，其中该抗体结合在一个细胞表面表达的天然人类CXCR4。
2.如第1项所述的抗体，其中该抗体抑制SDF-l与人类CXCR4的结合。
3.如第1项所述的抗体，其中该抗体不抑制SDF-1与人类CXCR4的结合。
4.如第1项所述的抗体，该抗体抑制表达人类CXCR4的细胞中SDF-1诱导的钙流动。
5.如第1项所述的抗体，该抗体抑制SDF-1诱导的表达人类CXCR4的细包的迁移。
6.如第1项所述的抗体，该抗体抑制由人脐静脉内皮细胞形成毛细管。
7.如第1项所述的抗体，该抗体诱导表达人类CXCR4的细胞的凋亡。
8.如第1项所述的抗体，该抗体在体内抑制CXCR4阳性肿瘤细胞的生长或诱导其凋亡。
9.如第1项所述的抗体，其中所述抗体以1×10-7M或更小的KD与人类CXCR4结合。
10.如第9项所述的抗体，其中所述抗体以5×10-8M或更小的KD与人类CXCR4结合。
11.一种分离的人类单克隆抗体，或它的一种抗原结合部分，其中该抗体：
(a)结合至在一个细胞表面表达的天然人类CXCR4；
(b)抑制SDF-1与人类CXCR4的结合；
(c)抑制在表达人类CXCR4的细胞中SDF-1诱导的钙流动；
(d)抑制SDF-1诱导的表达人类CXCR4的细胞的迁移；并且
(e)抑制由人脐静脉内皮细胞形成毛细管。
12.如第11项所述的抗体，该抗体诱导表达人类CXCR4的细胞的凋亡。
13.如第11项所述的抗体，该抗体在体内抑制CXCR4阳性的肿瘤细胞的生长或诱导其凋亡。
14.如第11项所述的抗体，该抗体以50nM或更小的EC50抑制SDF-1与人类CXCR4的结合。
15.如第11项所述的抗体，该抗体以3nM或更小的EC50抑制在表达人类CXCR4的细胞中的SDF-1诱导的钙流动。
16.如第11项所述的抗体，该抗体以50nM或更小的EC50抑制SDF-1诱导的表达人类CXCR4的细胞的迁移。
17.一种分离的人类单克隆抗体，或其抗原结合部分，其中该抗体与一种参考抗体交叉竞争而结合CXCR4，其中该参考抗体包括：
(a)包括氨基酸序列SEQ ID NO∶25的一个重链可变区以及包括氨基酸序列SEQ ID NO∶29的一个轻链可变区；或
(b)包括氨基酸序列SEQ ID NO∶26的一个重链可变区以及包括氨基酸序列SEQ ID NO∶30的一个轻链可变区；或
(c)包括氨基酸序列SEQ ID NO∶27的一个重链可变区以及包括氨基酸序列SEQ ID NO∶31的一个轻链可变区；或
(d)包括氨基酸序列SEQ ID NO∶28的一个重链可变区以及包括氨基酸序列SEQ ID NO∶32的一个轻链可变区。
18.一种分离的单克隆抗体，或它的一个抗原结合部分，包括一个重链可变区，该重链可变区是一个人类VH3-48基因的产物或是源自该基因，
其中该抗体特异地结合人类CXCR4。
19.一种分离的单克隆抗体，或它的一个抗原结合部分，包括一个轻链可变区，该轻链可变区是一个人类VK L-15基因的产物或是源自该基因，
其中该抗体特异地结合人类CXCR4。
20.一种分离的单克隆抗体，或它的一个抗原结合部分，包括一个重链可变区，该重链可变区是一个人类VH3-48基因的产物或是源自该基因，以及一个轻链可变区，该轻链可变区是一个人类VK L-15基因产物或是源自该基因，其中该抗体特异地结合人类CXCR4。
21.如第1项所述的抗体，该抗体包括：
(a)一个包括SEQ ID NO∶１的重链可变区CDR1；
(b)一个包括SEQ ID NO∶5的重链可变区CDR2；
(c)一个包括SEQ ID NO∶9的重链可变区CDR3；
(d)一个包括SEQ ID NO∶13的轻链可变区CDR1；
(e)一个包括SEQ ID NO∶17的轻链可变区CDR2；以及
(f)一个包括SEQ ID NO∶21的轻链可变区CDR3。
22.如第1项所述的抗体，该抗体包括：
(a)一个包括SEQ ID NO∶2的重链可变区CDR1；
(b)一个包括SEQ ID NO∶6的重链可变区CDR2；
(c)一个包括SEQ ID NQ∶10的重链可变区CDR3；
(d)一个包括SEQ ID NO∶14的轻链可变区CDR1；
(e)一个包括SEQ ID NO∶18的轻链可变区CDR2；以及
(f)一个包括SEQ ID NO∶22的轻链可变区CDR3。
23.如第1项所述的抗体，该抗体包括：
(a)一个包括SEQ ID NO∶3的重链可变区CDR1；
(b)一个包括SEQ ID NO∶7的重链可变区CDR2；
(c)一个包括SEQ ID NO∶11的重链可变区CDR3；
(d)一个包括SEQ ID NO∶15的轻链可变区CDR1；
(e)一个包括SEQ ID NO∶19的轻链可变区CDR2；以及
(f)一个包括SEQ ID NO∶23的轻链可变区CDR3。
24.如第1项所述的抗体，该抗体包括：
(a)一个包括SEQ ID NO∶4的重链可变区CDR1；
(b)一个包括SEQ ID NO∶8的重链可变区CDR2；
(c)一个包括SEQ ID NO∶12的重链可变区CDR3；
(d)一个包括SEQ ID NO∶16的轻链可变区CDR1；
(e)一个包括SEQ ID NO∶20的轻链可变区CDR2；以及
(f)一个包括SEQ ID NO∶24的轻链可变区CDR3。
25.一种分离的单克隆抗体，或其抗原结合部分，包括：
(a)包括一个氨基酸序列的一个重链可变区，该氨基酸序列选自下组，其构成为：SEQ ID NO∶25至28以及41至44；以及
(b)包括一个氨基酸序列的一个轻链可变区，该氨基酸序列选自下组，其构成为：SEQ ID NO∶29至32以及45至48；
其中该抗体特异地结合人类CXCR4。
26.如第25项所述的抗体，该抗体包括：
(a)一个包括氨基酸序列SEQ ID NO∶25或41的重链可变区；以及
(b)一个包括氨基酸序列SEQ ID NO∶29或45的轻链可变区。
27.如第25项所述的抗体，该抗体包括：
(a)一个包括氨基酸序列SEQ ID NO∶26或42的重链可变区；以及
(b)一个包括氨基酸序列SEQ ID NO∶30或46的轻链可变区。
28.如第25项所述的抗体，该抗体包括：
(a)一个包括氨基酸序列SEQ ID NO∶27或43的重链可变区；以及
(b)一个包括氨基酸序列SEQ ID NO∶31或47的轻链可变区。
29.如第25项所述的抗体，该抗体包括：
(a)一个包括氨基酸序列SEQ ID NO∶28或44的重链可变区；以及
(b)一个包括氨基酸序列SEQ ID NO∶32或48的轻链可变区。
30.一种组合物，包括如第1项所述的抗体，或其抗原结合部分，以及一种药学上可接受的载体。
31.一种免疫偶联物，包括如第1项所述的、被连接至一种治疗剂的抗体，或其抗原结合部分。
32.一种组合物，包括如第31项所述的免疫偶联物以及一种药学上可接受的载体。
33.如第31项所述的免疫偶联物，其中该治疗剂是一种细胞毒素。
34.一种组合物，包括如第33项所述的免疫偶联物以及一种药学上可接受的载体。
35.如第31项所述的免疫偶联物，其中该治疗剂是一种放射性同位素。
36.一种组合物，包含如第35项所述的免疫偶联物以及一种药学上可接受的载体。
37.一种分离的核酸分子，该核酸分子对如第1项所述的抗体，或其抗原结合部分进行编码。
38.一种表达载体，包括如第37项所述的核酸分子。
39.一种宿主细胞，包括如第38项所述的表达载体。
40.用于制备一种抗-CXCR4抗体的一种方法，该方法包括在如第39项所述的宿主细胞中表达该抗体，并且从该宿主细胞中分离该抗体。
41.在一个细胞中调节CXCR4活性的一种方法，该方法包括用如第1项所述的抗体，或其抗原结合部分接触该细胞，使得该细胞中的CXCR4活性得到调节。
42.如第41项所述的方法，其中通过用该抗体，或其抗原结合部分培养该细胞使CXCR4的活性在体外得到调节。
43.如第41项所述的方法，其中通过对一名受试者给予该抗体，或其抗原结合部分，使CXCR4活性在该受试者体内得到调节。
44.如第41项所述的方法，其中该细胞是一种表达CXCR4的肿瘤细胞，并且该方法导致对该肿瘤细胞生长的抑制或对该肿瘤细胞转移的抑制。
45.如第41项所述的方法，其中该细胞是一种表达CXCR4的T细胞，并且该方法导致对HIV进入该细胞的抑制。
46.如第41项所述的方法，其中该细胞是在一种炎性病症中的一种淋巴细胞，并且该方法导致对炎症的抑制。
47.如第41项所述的方法，其中该细胞参于血管化作用，并且该方法导致血管发生的调节。
48.一种方法，该方法在一名受试者体内刺激CD34阳性的干细胞从骨髓向外周血的动员，该方法包括对该受试者给予如第1项所述的抗体，或其抗原结合部分，使得CD34阳性的干细胞从骨髓向外周血的动员得到刺激。
49.如第48项所述的方法，该方法进一步包括从该外周血收集CD34阳性的干细包。
附图简要说明
图1A示出了F7人类单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQID NO∶33)以及氨基酸序列(SEQ ID NO∶25)。描绘出了CDR1(SEQID NO∶9)、CDR2(SEQ ID NO∶5)、以及CDR3(SEQ ID NO∶9)区域，并指明了V、D以及J的种系来源。
图1B示出了F7人类单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列(SEQID NO∶37)以及氨基酸序列(SEQ ID NO∶29)。描绘了CDR1(SEQ IDNO∶13)、CDR2(SEQ ID NO∶17)、以及CDR3(SEQ ID NO∶21)的区域，并指明了V与J的种系来源。
图2A示出了F9人类单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQID NO∶34)以及氨基酸序列(SEQ ID NO∶26)。描绘了CDR1(SEQ IDNO∶2)、CDR2(SEQ ID NO∶6)、以及CDR3(SEQ ID NO∶10)的区域，并指明了V、D以及J的种系来源。
图2B示出了F9人类单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列(SEQID NO∶38)以及氨基酸序列(SEQ ID NO∶30)。描绘了CDR1(SEQ IDNO∶14)、CDR2(SEQ ID NO∶18)、以及CDR3(SEQ ID NO∶22)的区域，并指明了V与J的种系来源。
图3A示出了D1人类单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQID NO∶35)以及氨基酸序列(SEQ ID NO∶27)。描绘了CDR1(SEQ IDNO∶3)、CDR2(SEQ ID NO∶7)、以及CDR3(SEQ ID NO∶11)的区域，并指明了V、D以及J的种系来源。
图3B示出了D1人类单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列(SEQID NO∶39)以及氨基酸序列(SEQ ID NO∶31)。描绘了CDR1(SEQ IDNO∶15)、CDR2(SEQ ID NO∶19)、以及CDR3(SEQ ID NO∶23)的区域，并指明了V与J的种系来源。
图4A示出了E2人类单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQID NO∶36)以及氨基酸序列(SEQ ID NO∶28)。描绘了CDR1(SEQ IDNO∶4)、CDR2(SEO ID NO∶8)、以及CDR3(SEQ ID NO∶12)的区域，并指明了V、D、以及J的种系来源。
图4B示出了E2人类单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列(SEQID NO∶40)以及氨基酸序列(SEQ ID NO∶32)。描绘了CDR1(SEQ IDNO∶16)、CDR2(SEQ ID NO∶20)、以及CDR3(SEQ ID NO∶24)的区域，并指明了V与J的种系来源。
图5A示出了F7(SEQ ID NO∶25)和F7GL(SEQ ID NO∶41)的重链可变区的氨基酸序列与人类种系VH3-48氨基酸序列(SEQ ID NO∶49)(作为SEQ ID NO∶52披露的JH6b种系)的比对。
图5B示出了F7(SEQ ID NO∶29)和F7GL(SEQ ID NO∶45)的轻链可变区的氨基酸序列与人类种系Vk L-15氨基酸序列(SEQ ID NO∶50)(作为SEQ ID NO∶53披露的JK1种系)的比对。
图6A示出了F9(SEQ ID NO∶26)和F9GL(SEQ ID NO∶42)的重链可变区的氨基酸序列与人类种系VH3-48氨基酸序列(SEQ ID NO∶49)(作为SEQ ID NO∶52披露的JH6b种系)的比对。
图6B示出了F9(SEQ ID NO∶30)和F9GL(SEQ ID NO∶46)的轻链可变区的氨基酸序列与人类种系Vk L15氨基酸序列(SEQ ID NO∶50)(作为SEQ ID NO∶53披露的JK1种系)的比对。
图7A示出了D1(SEQ ID NO∶27)和D1GL(SEQ ID NO∶43)的重链可变区的氨基酸序列与人类种系VH3-48氨基酸序列(SEQ ID NO∶49)(作为SEQ ID NO∶52披露的JH6b种系)的比对。
图7B示出了D1(SEQ ID NO∶31)和D1GL(SEQ ID NO∶47)的轻链可变区的氨基酸序列与人类种系Vk L15氨基酸序列(SEQ ID NO∶50)(作为SEQ ID NO∶53披露的JK1种系)的比对。
图8A示出了E2(SEQ ID NO∶28)和E2GL(SEQ ID NO∶44)的重链可变区的氨基酸序列与人类种系VH3-48氨基酸序列(SEQ ID NO∶49)(作为SEQ ID NO∶52披露的JH6b种系)的比对。
图8B示出了E2(SEQ ID NO∶32)和E2GL(SEQ ID NO∶48)的轻链可变区的氨基酸序列与人类种系Vk L15氨基酸序列(SEQ ID NO∶50)(作为SEQ ID NO∶53披露的JK1种系)的比对。
图9是一个曲线图，示出了抗-CXCR4人类抗体F7、F9、D1以及E2与CEM细胞(该细胞在细胞表面表达人类CXCR4)的结合。
图10是一个曲线图，示出了在FITC标记的抗-CXCR4抗体F9与一组未标记的抗-CXCR4人类抗体之间的抗体竞争而结合CEM细胞。
图11是一幅曲线图，示出了由抗-CXCR4人类抗体F7、F9以及D1的抑制125I标记的SDF-1与CEM细胞的结合。
图12是一个曲线图，示出了由抗-CXCR4人类抗体F7、F9以及D1抑制CEM细胞中SDF-1诱导的钙流动。
图13是一个曲线图，示出了由抗-CXCR4人类抗体F7及F9抑制SDF-1诱导的CEM细胞的迁移。
图14是一个曲线图，图示出了由抗-CXCR4人类抗体F7、F9以及E2在体外抑制Ramos肿瘤细胞增殖。
图15A至C是曲线图，示出了在一种皮下肿瘤模型中，由抗-CXCR4人类抗体F7及F9在体内抑制Ramos肿瘤细胞的增殖。图15A示出了平均肿瘤体积生长曲线；图15B示出了中位数肿瘤体积生长曲线；图15C示出了中位数％体重变化。
图16是一个曲线图，示出了在Ramos系统肿瘤细胞模型中，用抗-CXCR4人类抗体F9处理的小鼠的存活百分数。
本披露的详细说明
本披露涉及分离的单克隆抗体，特别是人类单克隆抗体，它们特异地结合至在细胞表面表达的天然人类CXCR4。在某些实施方案中，本披露的抗体来源于特定的重链及轻链种系序列和／或包含特定的结构特征，例如包括特定氨基酸序列的CDR区域。本披露提供了分离的抗体、制备这种抗体的方法、包括这种抗体的免疫偶联物以及双特异性分子以及包括本披露的抗体、免疫偶联物或双特异性分子的药物组合物。本披露还涉及使用这些抗体的方法，例如检测CXCR4，以及在与CXCR4的表达相关或参与CXCR4／SDF-1途径(例如癌症、肿瘤转移、HIV感染、炎症以及血管发生)的一些疾病或病症中调节CXCR4活性。因此，本披露还提供使用本披露的抗-CXCR4抗体治疗癌症的方法，例如，治疗癌症，例如乳房癌、卵巢癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、鼻咽癌、肾细胞癌、淋巴瘤、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、横纹肌肉瘤、结肠直肠癌、肾癌、骨肉瘤、急性淋巴母细胞性白血病或急性髓细胞性白血病。另外，本披露提供使用本披露的抗-CXCR4抗体抑制肿瘤转移的方法。
为了使本披露可以更容易地得到理解，首先对一些术语进行了定义。其他定义在整个详细说明中给出。
术语“CXCR4”包括变异体、同种型、同系物、同源物(ortholog)以及类似物(paralog)。例如，在某些情况下，对CXCR4特异的抗体可能与来自非人类物种的CXCR4进行交叉反应。在其他实施方案中，对人类CXCR4特异的抗体可能对人类CXCR4是完全特异的，并且不显示物种或其他类型的交叉反应活性。术语“人类CXCR4”是指人类序列CXCR4，例如具有Genbank登录号P61073的人类CXCR4的全部氨基酸序列(SEQ ID NO∶51)。在本领域中，CXCR4来作为，例如，LESTR、Fusin或CD184为人所知。通过具有例如保守突变或在非保守区的突变，人类CXCR4序列可能不同于SEQ ID NO∶51的人类CXCR4，并且该CXCR4具有基本上与SEQ ID NO∶51的人类CXCR4相同的生物功能。例如，人类CXCR4的一项生物功能是在CXCR4的胞外域中具有一个表位，该表位与本披露的一种抗体特异地结合，或者人类CXCR4的生物功能是趋化因子结合或参与新陈代谢过程。
一个具体的人类CXCR4序列与SEQ ID NO∶51的人类CXCR4在氨基酸序列上通常会有至少90％的同一性，并且含有多个氨基酸残基，当与其他物种(例如鼠类)的CXCR4氨基酸序列相比时，这些氨基酸残基鉴定该氨基酸序列是人源的。在某些情况下，人类CXCR4可能与SEQID NO∶51的CXCR4在氨基酸序列方面具有至少95％、或甚至至少96％、97％、98％、或99％的同一性。在某些实施方案中，与SEQ ID NO∶51的CXCR4相比，人类CXCR4序列将展示出不超过10个氨基酸差异。在某些实施方案中，人类CXCR4序列将展示出与SEQ ID NO∶51的CXCR4相比不多于5个、或甚至不多于4个、3个、2个、或1个氨基酸差异。按照在此的说明可以确定同一性的百分数。
术语“SDF-1”是指间质细胞来源的因子1，它是CXCR4的一个配体。术语“SDF-1”包括SDF-1的不同的同种型，例如SDF-1α及SDF-1β。人类SDF-1α的氨基酸序列的Genbank登录号为NP_954637。人类SDF-1β的氨基酸序列的Genbank登录号为NP_000600。人类SDF-1还说明于美国专利号5,756,084。SDF-1也被称为CXCL12。如在此针对CXCR4的说明，人类SDF-1的氨基酸序列可不同于NP_954637或NP_000600的SDF-1。
术语“免疫应答”是指例如，淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞、以及由以上细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子、以及补体)的作用，这些作用导致对侵入性病原体、被病原体感染的细胞或组织、癌细胞、或者，在自身免疫炎症及病理炎症情况下的正常人类细胞或组织的选择性损害、破坏或将它们从人体中消清除。
“信号转导途径”是指在多种信号转导信号之间的生物化学关系，这些信号在信号从一个细胞的一部分传递至一个细胞的另一部分的转递中发挥作用。在在此所使用的术语“细胞表面受体”包括，例如，能够接受信号并将这种信号传递穿过一个细胞的细胞膜的分子及分子的复合物。本披露的“细胞表面受体”的一个实例是CXCR4受体。
在此提及的术语“抗体”包括整个抗体及任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或它们的单链。“抗体”是指包括通过二硫键相连的至少两条重链(H链)及两条轻链(L链)的糖蛋白，或其抗原结合部分。每一条重链均包括一个重链可变区(在此缩写为VH)及一个重链恒定区。该重链恒定区包括三个结构域(domain)，CH1、CH2和CH3。每一条轻链均包括一个轻链可变区(在此缩写为VL)及一个轻链恒定区。该轻链恒定区包括一个结构域，CL。VH和VL区域能进一步被分成多个高可变性区域，被称为互补决定区(CDR)，散布有更保守的被称为构架区(FR)的多个区域。每个VH及VL均由3个CDR及4个FR构成，按照以下顺序从氨基端至羧基端排布：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链及轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。这些抗体的恒定区可能介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，这些宿主组织或因子包括免疫系统的不同细胞(如效应细胞)及经典补体系统的第一成分(Clq)。
在此使用的术语抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)是指保留了特异地结合至一个抗原(例如CXCR4)的能力的抗体的一个或多个片段。已经发现抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来进行。术语抗体的“抗原结合部分”所涵盖的结合片段的实例包括：(i)Fab片段，由VL、VH、CL及CH1结构域构成的一个单价片段；(ii)F(ab′)2片段，包括通过在铰链区的一个二硫桥连接两个Fab片段的一个二价片段；(iii)Fab’片段，它实质上是带有铰链区部分的Fab(参见，FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY(Paul ed.，3raed.1993)；(iv)由VH及CH1结构域构成的Fd片段；(v)由抗体的一个单臂的VL及VH结构域构成的Fv片段；(vi)dAb片段(Ward et a1.，(1989)Nature341∶544-546)，它由VH结构域构成；(vii)分离的互补决定区(CDR)；以及(viii)纳米抗体(nanobody)，含有一个可变区及两个恒定区的一个重链可变区。此外，虽然Fv片段的两个结构域，VL及VH，是由单独的基因编码的，但是使用重组的方法由一个合成连接物可以将它们连接起来，该接头使它们成为一个单蛋白链，其中对VL及VH区域进行配对以形成单价分子(被称为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird et al.(1988)Science242∶423-426；及Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85∶5879-5883)。术语抗体的“抗原结合部分”也旨在涵盖这种单链抗体。这些抗体片段是使用本领域技术人员已知的常规方法获得的，并且对于这些片段进行的有用性的筛选与筛选完整抗体的方式相同。
在此使用的术语“分离的抗体”意指一种抗体，它基本上没有其他的具有不同抗原特异性的抗体(例如，特异地结合CXCR4的分离的抗体基本上没有特异地结合除CXCR4之外的抗原的抗体)。然而，特异地结合CXCR4的分离的抗体对其他抗原，例如来自其他物种的CXCR4分子，可能具有交叉反应性。此外，分离的抗体可能基本上没有其他细胞材料和／或化学物。
在此使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单一分子组分的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物显示了针对某一特定表位的单一结合特异性及亲和力。
在此使用的术语“人类抗体”旨在包括以下抗体：具有多个可变区，其中构架区及CDR区均来自人类种系免疫球蛋白序列。此外，如果该抗体含有恒定区，则该恒定区也来源于人类种系免疫球蛋白序列。本披露的人类抗体可包括不通过人类种系免疫球蛋白序列进行编码的氨基酸残基(例如，在体外由随机或定点特异性诱变或在体内由体细胞突变引入的突变)。然而，在此所使用的术语“人抗体”并非旨在包括这样的抗体，其中来自另一个哺乳动物物种(如小鼠)的种系的CDR序列已经被移植至人构架序列上。
术语“人类单克隆抗体”是指显示出单一的结合特异性的抗体，该抗体具有可变区，其中构架区及CDR区均源自人类种系免疫球蛋白序列。在一个实施方案中，这种人类单克隆抗体由杂交瘤细胞产生，该杂交瘤细胞包括从转基因的非人类动物(例如转基因小鼠)获得的B细胞，具有包括融合至无限增殖化细胞的一个人类重链转基因及一个轻链转基因的基因组。
在此使用的术语“重组的人类抗体”包括由重组的手段制备、表达、产生或分离的所有人类抗体，例如：(a)从动物(例如小鼠)中分离的抗体，该动物对于人类免疫球蛋白基因是转基因性的或转染色体性的，或由其制备出的杂交瘤(以下将进一步说明)；(b)从被转化以表达人类抗体的宿主细胞(例如，从转染瘤)中分离的抗体；(c)从重组的组合的人类抗体文库中分离的抗体；以及(d)由其他手段制备、表达、产生或分离的抗体，这些方法涉及将人类免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列。这种重组的人类抗体具有可变区，其中构架区及CDR区均来源于人类种系免疫球蛋白序列。然而，在某些实施方案中，这种重组的人类抗体能经受体外诱变(或者，当使用针对人Ig序列进行转染的动物时，为体内体细胞诱变)，并且接着，重组抗体的VH和VL区域的氨基酸序列是这样的序列，虽然来源于人类种系VH和VL序列并与其相关，但是这些序列在体内在人类抗体种系表达谱中可能不是天然存在的。
在此使用的“同种型”是指由该重链恒定区基因编码的抗体种类(例如IgM或IgG1)。
短语“识别一种抗原的一种抗体”及“对一种抗原特异的一种抗体”在此可以与术语“特异地结合至一种抗原的一种抗体”互换使用。
术语“人类抗体衍生物”是指人类抗体的任何经修饰的形式，例如，该抗体与另一种试剂或抗体的偶联物。
术语“人源化抗体”意指以下抗体，其中源自另一种哺乳动物物种(如小鼠)的种系的CDR序列已被移植至人构架序列上。在人构架序列中可能进行另外的构架区修饰。
术语“嵌合抗体”意指以下抗体，其中可变区序列是源自一个物种而恒定区序列是源自另一个物种，例如一种抗体，其中可变区序列源自小鼠抗体而恒定区序列源自人类抗体。
在此使用的“特异地结合人类CXCR4”的抗体意指一种抗体，它结合人类CXCR4(并且可能是来于一种或多种非人类物种的CXCR4)，但基本上不结合非CXCR4蛋白。在某些实施方案中，本披露的一种抗体特异地结合SEQ ID NO∶51的人类CXCR4或它的一种变异体。优选地，该抗体以1×10-7M或更小的KD结合人类CXCR4，更优选为5×10-8M或更小，更优选为3×10-8M或更小，更优选为1×10-8M或更小，甚至更优选为5×10-9M或更小。
在此使用的术语“基本上不结合”蛋白质或细胞是指不结合或不以高亲和力结合蛋白质或细胞，即，以1×10-6M或更大，更优选为1×10-5M或更大，更优选为1×10-4M或更大，更优选为1×10-3M或更大，甚至更优选为1×10-2M或更大的KD结合蛋白质或细胞。
在此使用的术语“Kassoc”或“Ka”意指一种特定的抗体-抗原相互作用的结合速率，其中在此使用的术语“Kdis”或“Kd”意指一种特定的抗体-抗原相互作用的解离速率。在此使用的术语“KD”意指解离常数，它是从Kd与Ka的比例(即Kd／Ka)得到的，并被表示为摩尔浓度(M)。使用本领域中已充分建立的方法可确定抗体的KD值。确定抗体KD值的一个优选的方法是通过使用表面等离振子共振，优选使用诸如
Figure BSA0000101757350000211
系统的生物传感器系统。
在此使用的术语针对IgG抗体的“高亲和力”是指对于靶抗原一种抗体具有的KD值为1×10-7M或更小，更优选为5×10-8M或更小，甚至更优选为1×10-8M或更小，甚至更优选为5×10-9M或更小并且更优选为1×10-9M或更小。然而，对于其他抗体同种型而言，“高亲和力”结合可以发生变化。例如，对于一种IgM同种型而言，“高亲和力”结合是指一种抗体具有的KD值为10-6M或更小，更优选为10-7M或更小，甚至更优选为10-8M或更小。
在此使用的术语“受试者”包括任何人类或非人类动物。术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，如哺乳动物及非哺乳动物，例如非人类的灵长类、绵羊、犬、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物、等等。
在以下各分部中进一步详细地说明了本披露的不同方面。
抗-CXCR4抗体
本披露的抗体的特征为抗体的特定的功能特征或特质。例如，该抗体结合至在一个细胞表面表达的天然的人类CXCR4。优选地，本披露的抗体以高亲和力结合CXCR4，例如具有的KD值为1×10-7M或更低。本披露的抗-CXCR4抗体优选地显示以下特征中的一种或多种特征：
(a)结合至在一个细胞表面上表达的天然人类CXCR4上；
(b)抑制SDF-1与人类CXCR4的结合；
(c)抑制在表达CXCR4的细胞中SDF-1诱导的钙流动
(d)抑制SDF-1诱导的表达CXCR4的细胞的迁移；
(e)抑制由人脐静脉内皮细胞形成毛细管；
(f)以1×10-7M或更小的KD值结合人类CXCR4；
(g)诱导表达CXCR4的细胞的凋亡
(h)在体外抑制肿瘤细胞的增殖；
(i)在体内抑制肿瘤细胞的增殖和／或诱导肿瘤细胞凋亡；
(j)抑制CXCR4阳性的肿瘤细胞的转移；和／或
(k)增加携带CXCR4阳性的肿瘤的受试者的存活时间。
在某些实施方案中，本披露的一种抗体结合至一种细胞表面上的天然人类CXCR4，但不抑制SDF-1与CXCR4的结合，并且不抑制在表达CXCR4的细胞中SDF-1诱导的钙流动，并且不抑制SDF-1诱导的表达CXCR4的细胞的迁移。在其他实施方案中，本披露的一种抗体结合至一种细胞表面上的天然人类CXCR4，并且确实抑制SDF-1与CXCR4的结合，并且确实抑制在表达CXCR4的细胞中SDF-1诱导的钙流动，但不抑制SDF-1诱导的表达CXCR4的细胞的迁移。在另外的其他实施方案中，本披露的一种抗体结合至一种细胞表面上的天然人类CXCR4，并且确实抑制SDF-1与CXCR4的结合，并且确实抑制在表达CXCR4的细胞中SDF-1诱导的钙流动，并且确实抑制SDF-1诱导的表达CXCR4的细胞的迁移。在另外的其他实施方案中，本披露的一种抗体结合至一种细胞表面上的天然人类CXCR4上，确实抑制SDF-1与CXCR4的结合，确实抑制在表达CXCR4的细胞中SDF-1诱导的钙流动，确实抑制SDF-1诱导的表达CXCR4的细胞的迁移，并且确实抑制由HuVEC形成毛细管。
优选地，本披露的一个抗体以5×10-8M或更小的KD结合人类CXCR4，以2×10-8M或更小的KD结合人类CXCR4，以5×10-9M或更小的KD结合人类CXCR4，以4×10-9M或更小的KD结合人类CXCR4，以3×10-9M或更小的KD结合人类CXCR4，以2×10-9M或更小的KD结合人类CXCR4。
优选地，本披露的一种抗体以50nM或更小的用于抑制的EC50抑制SDF-1与人类CXCR4结合，更优选为30nM或更小、或15nM或更小、或10nM或更小、或5nM或更小、或3nM或更小(例如，用于抑制的EC50为28.60nM或更小、或12.51nM或更小、或2.256nM或更小)。
优选地，本披露的一种抗体以3nM或更小的用于抑制的EC50在表达人类CXCR4的细胞中抑制SDF-1诱导的钙流动，更优选为2nM或更小，或1nM或更小，或0.9nM或更小，或0.8nM或更小，或0.7nM或更小，或0.6nM或更小，或0.5nM或更小，或0.4nM或更小(例如，0.9046nM或更小，0.5684或更小，或0.3219nM或更小)。
优选地，本披露的一种抗体以50nM或更小的用于抑制的EC50抑制SDF-1诱导的表达人类CXCR4的细胞的迁移，更优选为30nM或更小，或20nM或更小，或15nM或更小(例如，18.99nM或更小，或12.44或更小)。
评估抗体与在一种细胞表面表达的天然人类CXCR4的结合能力的标准测定在本领域内是已知的，包括例如，使用一种细胞系的流式细胞分析，该细胞系自然地表达天然CXCR4或该细胞系已被转染以表达天然CXCR4。在这些实例中详细地说明了适宜的测定。一种表达天然CXCR4的优选的细胞系是CEM T细胞系。用于评价SDF-1的结合的抑制作用、SDF-1诱导的钙流动的抑制作用、SDF-1诱导的细胞迁移的抑制作用、对由HuVEC形成毛细管的抑制作用、在体内和／或在体外在表达CXCR4的细胞中凋亡的诱导作用、在体外和／或在体内CXCR4阳性的肿瘤细胞的生长的抑制作用、和／或对CXCR4阳性的肿瘤细胞的转移的抑制作用的适宜测定在这些实例中也有详细的说明。该抗体的结合亲和力也可以通过标准方法例如通过Scatchard分析而进行测定。
单克隆抗体F7、F9、D1及E2
本披露的优选抗体是人类单克隆抗体F7、F9、D1及E2，按照实例1与2的说明进行分离并进行结构表征。F7、F9、D1及E2的VH氨基酸序列分别如在SEQ ID NO∶25、26、27及28中所示。F7、F9、D1及E2的VL氨基酸序列分别如SEQ ID NOs∶29、30、31及32所示。另外，产生了F7、F9、D1及E2的可替代的形式(其中某些构架残基被一个种系残基替换)，并且在此是指F7GL、F9GL、D1GL及E2GL。F7GL、F9GL、D1GL及E2GL的VH氨基酸序列分别示于SEQ ID NO∶41、42、43及44。F7GL、F9GL、D1GL及E2GL的VL氨基酸序列分别示于SEQID NO∶45、46、47及48。
如果这些抗体中每一种抗体均能结合CXCR4，则可将VH和VL序列进行“混合并匹配”，以产生本披露的其他抗-CXCR4结合分子。使用以上及在实例中所说明的结合进行测定(例如，CEM细胞的流式细胞术)能检测这种“经混合及匹配”的抗体与CXCR4的结合。优选地，当VH和VL链被混合并且匹配时，来自一种特定VH／VL对的VH序列被一个结构上相似的VH序列代替。类似地，优选地来自一种特定VH／VL对的VL序列被一个结构上相似的VL序列代替。
因此，在一个方面，本披露提供了分离的单克隆抗体，或其抗原结合部分，包括：
(a)一个重链可变区，包括一个氨基酸序列，该序列选自下组，其构成为：SEQ ID NO∶25至28以及41至44；以及
(b)一个轻链可变区，包括一个氨基酸序列，该序列选自下组，其构成为：SEQ ID NO∶29至32以及45至48；
其中该抗体特异地结合CXCR4，优选地结合人类CXCR4。
优选的重链及轻链组合包括：
(a)一个重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO∶25或41，以及一个轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO∶29或45；或
(b)一个重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO∶26或42，以及一个轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO∶30或46；或(c)一个重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO∶27或43，以及一个轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO∶31或47；或
(d)一个重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO∶28或44，以及一个轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO∶32或48。
在另一方面，本披露提供了多种抗体，包括F7、F9、D1或E2的重链及轻链的CDR1、CDR2及CDR3，或它们的组合。F7、F9、D1及E2的VH CDR1的氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO∶1至4中。F7、F9、D1及E2的VH CDR2的氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO∶5至8中。F7、F9、D1及E2的VH CDR3的氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO∶9至12中。F7、F9、D1及E2的VK CDR１的氨基酸序列分别显示在SEQID NO∶13至16中。F7、F9、D1及E2的VK CDR2的氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO∶17至20。F7、F9、D1及E2的VK CDR3的氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO∶21至24中。该CDR区是用Kabat系统绘出的(Kabat，E.A.，et al.(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，NIHPublication No.91-3242)。
在这些抗体中每一种体均能够结合CXCR4、并且抗原结合特异性主要由CDRl、CDR2、及CDR3区域提供的条件下，则VH CDR1、CDR2、及CDR3序列以及Vk CDR1、CDR2、及CDR3序列可以被“混合并匹配”(即，来自不同抗体的CDR可以被混合并匹配，虽然每种抗体均必须含有一个VH CDR1、CDR2、及CDR3，以及一个Vk CDR1、CDR2，及CDR3)，以产生本披露的其他抗-CXCR4结合分子。可以使用以上及实例中说明的结合测定(例如，ELISA、
Figure BSA0000101757350000251
分析)检测CXCR4与这种“混合并匹配”的抗体的结合。优选地，当VH CDR序列被混合并匹配时，来自一种特定VH序列的CDR1、CDR2和／或CDR3序列被一个结构上相似的一种或多种CDR序列代替。类似地，当Vk CDR序列被混合并匹配时，来自一种特定Vk序列的CDR1、CDR2和／或CDR3序列优选地被结构上相似的一个或多个CDR序列代替。针对单克隆抗体F7、F9、D1及E2，通过将一个或多个VH和／或VL CDR区域序列替换为来自在此所披露的结构上相似的的CDR序列，可以产生新颖的VH及VL序列，这对于本领域的普通技术人员而言是很清楚的。
因此，在另一方面，本披露提供了一种分离的单克隆抗体，或其抗原结合部分，包括：
(a)一个重链可变区CDR1，包括一种氨基酸序列，该氨基酸序列选自下组，其构成为：SEQ ID NO∶1至4；
(b)一个重链可变区CDR2，包括一种氨基酸序列，该氨基酸序列选自下组，其构成为：SEQ ID NO∶5至8；
(c)一个重链可变区CDR3，包括一种氨基酸序列，该氨基酸序列选自下组，其构成为：SEQ ID NO∶9至12；
(d)一个轻链可变区CDR1，包括一种氨基酸序列，该氨基酸序列选自下组，其构成为：SEQ ID NO∶13至16；
(e)一个轻链可变区CDR2，包括一种氨基酸序列，该氨基酸序列选自下组，其构成为：SEQ ID NO∶17至20；以及
(f)一个轻链可变区CDR3，包括一种氨基酸序列，该氨基酸序列选自下组，其构成为：SEQ ID NO∶21至24；
其中该抗体特异地结合CXCR4，优选地结合人类CXCR4。
在一个优选的实施方案中，该抗体包括：
(a)一个重链可变区CDR1，包括SEQ ID NO∶1；
(b)一个重链可变区CDR2，包括SEQ ID NO∶5；
(c)一个重链可变区CDR3，包括SEQ ID NO∶9；
(d)一个轻链可变区CDR1，包括SEQ ID NO∶13；
(e)一个轻链可变区CDR2，包括SEQ ID NO∶17；以及
(f)一个轻链可变区CDR3，包括SEQ ID NO∶21。
在另一个优选的实施方案中，该抗体包括：
(a)一个重链可变区CDR1，包括SEQ ID NO∶2；
(b)一个重链可变区CDR2，包括SEQ ID NO∶6；
(c)一个重链可变区CDR3，包括SEQ ID NO∶10；
(d)一个轻链可变区CDR1，包括SEQ ID NO∶14；
(e)一个轻链可变区CDR2，包括SEQ ID NO∶18；以及
(f)一个轻链可变区CDR3，包括SEQ ID NO∶22。
在另一个优选的实施方案中，该抗体包括：
(a)一个重链可变区CDR1，包括SEQ ID NO∶3；
(b)一个重链可变区CDR2，包括SEQ ID NO∶7；
(c)一个重链可变区CDR3，包括SEQ ID NO∶11；
(d)一个轻链可变区CDR1，包括SEQ ID NO∶15；
(e)一个轻链可变区CDR2，包括SEQ ID NO∶19；以及
(f)一个轻链可变区CDR3，包括SEQ ID NO∶23。
在另一个优选的实施方案中，该抗体包括：
(a)一个重链可变区CDR1，包括SEQ ID NO∶4；
(b)一个重链可变区CDR2，包括SEQ ID NO∶8；
(c)一个重链可变区CDR3，包括SEQ ID NO∶12；
(d)一个轻链可变区CDR1，包括SEQ ID NO∶16；
(e)一个轻链可变区CDR2，包括SEQ ID NO∶20；以及
(f)一个轻链可变区CDR3，包括SEQ ID NO∶24。
在本领域中熟知的是，独立于一个或多个CDR1和／或CDR2结构域的CDR3单独地能够确定抗体对同族抗原的结合特异性，并且能够可预测地而产生多种抗体，这些抗体具有基于共同的CDR3序列的相同的结合特异性。参见，例如，Klimka et al.，British J.ofCancer83(2)∶252-260(2000)(说明了仅使用鼠类抗CD30抗体Ki-4的重链可变结构域CDR3来产生一种人源化抗CD30抗体)；Beiboer et al.，J.Mol.Biol.296∶833-849(2000)(说明了仅使用亲代鼠类MOC-31抗-EGP-2抗体的重链CDR3序列的重组上皮糖蛋白-2(EGP-2)抗体)；Rader et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95∶8910-8915(1998)(说明了使用鼠类抗整联蛋白αvβ3抗体LM609的重链及轻链可变的CDR3结构域的一组人源化抗整联蛋白αvβ3抗体，其中每一种成员抗体在CDR3结构域外均包含一个不同的序列，并且如亲代鼠类抗体同样地结合相同的表位，其亲和力与亲代鼠类抗体一样高或比亲代鼠类抗体更高)；Barbas et al.，J.Am.Chem.Soc.116∶2161-2162(1994)(披露CDR3结构域对抗原结合提供了最重要的贡献)；Barbas et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92∶2529-2533(1995)(说明了将针对人类胎盘DNA的三个Fab(SI-1、SI-40、以及SI-32)的重链CDR3序列移植至抗破伤风类毒素Fab的重链上，由此替换存在的重链CDR3，并证实仅有CDR3结构域就给予结合特异性)；Ditzel et al.，J.Immunol.157：739-749(1996)(说明了移植研究，其中仅将亲代多特异性Fab LNA3的重链CDR3转移至单特异性IgG破伤风类毒素结合的Fab p313抗体的重链，就足以保留亲代Fab的结合特异性)。Berezov et al.，BIAjournal8∶Scientific Review8(2001)(说明了基于一种抗-HER2单克隆抗体的肽模拟物)；Igarashi et al.，J.Biochem(Tokyo)117∶452-7(1995)(说明了对应于抗磷脂酰丝氨酸抗体的CDR3结构域的一种12个氨基酸的合成多肽)；Bourgeois et al.，J.Virol72∶807-10(1998)(显示源于抗呼吸道合胞病毒(RSV)抗体的重链CDR3结构域的一个单肽能够在体外中和病毒)；Levi et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90∶4374-8(1993)(说明了基于一种鼠类抗-HIV抗体的重链CDR3结构域的一种肽)；Polymenis and Stoller，J.Immunol.152∶5218-5329(1994)(说明了通过移植一个Z-DNA结合抗体的重链CDR3结构域可结合一个scFv)以及Xu and Davis，Immunity13∶37-45(2000)(说明重链CDR3的多样性足以允许其他方面相同的IgM分子区别多种半抗原及蛋白抗原)。还参见，美国专利号6,951,646；6,914，128；6,090,382；6,818,216；6，156,313；6，827,925；5,833,943；5,762,905以及5,760,185，说明了由单一的CDR结构域定义的已获得专利权的抗体。这些参考文献中每一篇其全文均通过引用结合在此。
因此，本披露提供了多种单克隆抗体，包括来自源于人类或非人类动物的抗体的一个或多个重链和／或轻链CDR3结构域，其中该单克隆抗体能够特异地结合CXCR4。在某些方面，本披露提供单克隆抗体，包含来自于非人类抗体(例如小鼠或大鼠抗体)的一个或多个重链和／或轻链CDR3结构域，其中该单克隆抗体能够特异地结合CXCR4。在一些实施方案中，包括来自非人类抗体的一个或多个重链和／或轻链CDR3结构域的此类发明的抗体对相应的亲代非人类抗体而言：(a)能够与其竞争而进行结合；(b)保留其功能特性；(c)与其结合至相同的表位；和／或(d)与其具有相似的结合亲和力。
在其他方面中，本披露提供了多种单克隆抗体，包括来自人类抗体(例如，从非人类的动物获得的人类抗体)的一个或多个重链和／或轻链CDR3结构域，其中该人类抗体能特异地结合CXCR4。在其他方面中，本披露提供了多种单克隆抗体，包括来自一种第一人类抗体(例如，从非人类的动物获得的一种人类抗体)的一个或多个重链和／或轻链CDR3结构域，其中该第一人类抗体能特异地结合CXCR4，并且其中来自该第一人类抗体的CDR3结构域替换了人类抗体的一个CDR3结构域(该人类抗体缺乏对CXCR4的结合特异性)，以产生能特异地结合至CXCR4的一个第二人类抗体。在一些实施方案中，包括来自第一人类抗体的一个或多个重链和／或轻链CDR3结构域的这种发明的抗体对相应的亲代第一人类抗体而言：(a)能够为与其竞争而结合；(b)保留其功能特性；(c)与其结合至相同的表位；和／或(d)与具有相似的结合亲和力。
具有特定种系序列的抗体
在某些实施方案中，本披露的抗体包括来自一种特定的种系重链免疫球蛋白基因的一个重链可变区和／或来自一种特定的种系轻链免疫球蛋白基因的一个轻链可变区。
例如，在一个优选的实施方案中，本披露提供了一种分离的单克隆抗体，或它的一个抗原结合部分，包括产自或源自于人类VH3-48基因的一个重链可变区，其中该抗体特异地结合CXCR4。在另一个优选的实施方案中，本披露提供了一种分离的单克隆抗体，或它的一个抗原结合部分，包括产自或源自于人类VK L15基因的一个轻链可变区，其中该抗体特异地结合CXCR4。在又另一个优选的实施方案中，本披露提供了一种分离的单克隆抗体，或其抗原结合部分，其中该抗体包括产自或源自于人类VH3-48基因的一个重链可变区，并包含产自或源自于人类VK L15基因的一个轻链可变区，其中该抗体特异地结合CXCR4，优选人类CXCR4。此类抗体也可能具有以上详细说明的一种或多种功能特征，例如结合至在一种细胞表面表达的天然CXCR4，对SDF-1与CXCR4结合的抑制作用，对表达CXCR4的细胞中SDF-1诱导的钙流动的抑制作用，对SDF-1诱导的表达CXCR4的细胞的迁移的抑制作用，对由HuVEC形成毛细管的抑制作用，在体内和／或在体外对表达CXCR4的细胞中凋亡的诱导作用、在体外和／或在体内对CXCR4阳性的肿瘤细胞的生长的抑制作用、和／或对CXCR4阳性的肿瘤细胞的转移的抑制作用。分别具有VH3-48及VK L15的VH及VK的抗体的实例是F7、F9、D1及E2抗体。
如在此所用，如果一种人类抗体的可变区由使用人类种系免疫球蛋白基因的系统获得，则该人类抗体包含“产自”或者“源自于”一种特定种系序列的重链或轻链可变区。此类系统包括用所感兴趣的抗原对携带人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠进行免疫，或者用所感兴趣的抗原对在噬菌体上展示的人类免疫球蛋白基因文库进行筛查。通过对人类抗体的氨基酸序列与人类种系免疫球蛋白的氨基酸序列进行比较，并选择在序列上最接近(即最大百分数同一性)人类抗体的序列的人类种系免疫球蛋白序列，“产自”或“源自于”人类种系免疫球蛋白序列的一种人类抗体就可以被鉴定为是此类抗体。一种“产自”或“源自”特定的人类种系免疫球蛋白序列的人类抗体，与该种系序列相比，可能含有氨基酸差异，因为例如，自然产生的体细胞突变或故意引入定点突变。然而，经选择的人类抗体典型地与通过人类种系免疫球蛋白基因进行编码的氨基酸序列在氨基酸序列上具有至少90％的同一性，而且当与其他物种(例如，鼠类种系序列)的种系免疫球蛋白氨基酸序列进行比较时，含有将该人类抗体鉴定为人源的氨基酸残基。在某些情况中，人类抗体与通过该种系免疫球蛋白基因进行编码的氨基酸序列在氨基酸序列上可以具有至少95％、或甚至至少96％、97％、98％，或99％的同一性。典型地，与由人类种系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列相比，源自特定的人类种系序列的人类抗体将展示不超过10个氨基酸差异。在某些情况中，与通过该种系免疫球蛋白基因进行编码的氨基酸序列相比，该人类抗体可能展示不超过5个，或甚至不超过4个、3个、2个，或1个的氨基酸差异。
同源抗体
在又另一个实施方案中，本披露的一种抗体包括一些重链及轻链可变区，这些可变区包含与在此说明的优选抗体的氨基酸序列同源的氨基酸序列，并且其中该抗体保留了本披露的抗-CXCR4抗体的所希望的功能特性。
例如，本披露提供了一种分离的单克隆抗体，或其抗原结合部分，包括一个重链可变区及一个轻链可变区，其中：
(a)该重链可变区包括一个氨基酸序列，它与选自由SEQ IDNO∶25至28以及41至44构成的一个氨基酸序列具有至少80％的同源性；
(b)该轻链可变区包括一个氨基酸序列，它与选自由SEQ IDNO∶29至32以及45至48构成的一个氨基酸序列具有至少80％的同源性；
(c)该抗体结合至在一个细胞表面上表达的天然人类CXCR4。
附加地或可替代地，该抗体可能具有下列功能特性中的一种或多种特性：(i)以1×10-7M或更小的KD结合至人类CXCR4；(ii)抑制SDF-7结合CXCR4；(iii)抑制在表达CXCR4的细胞中SDF-1诱导的钙流动；(iv)抑制SDF-1诱导的表达CXCR4的细胞的迁移；(v)抑制由HuVEC形成毛细管；(vi)在体内和／或在体外诱导在表达CXCR4的细胞中的凋亡；(vii)在体外和／或在体内抑制CXCR4阳性的肿瘤细胞的生长；和／或(viii)抑制CXCR4阳性的肿瘤细胞的转移。
在不同的实施方案中，该抗体可以是例如人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
在其他实施方案中，VH和／或VL氨基酸序列可以与以上给出的序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。与以上给出的序列的VH与VK区具有高同源性(即，80％或更大)的VH与VK区的抗体，可以通过以下方式获得：对编码SEQ ID NO∶25至32或41至48的核酸分子进行诱变(例如，定点突变或PCR介导的诱变)，接着使用在此说明的功能测定针对保留的功能(即，以上所给出的功能)检测编码出的已改变的抗体。
如在此所使用，在两个氨基酸序列之间的百分比同源性等同于在这两个序列之间的百分比同一性。在这两个序列之间的百分比同一性是这些序列共有的相同位置的数目的函数(即，％同源性＝相同位置的#／位置的总#×100)，考虑到空位(gap)的数目以及每个空位的长度，它们需要被引入以用于这两条序列的优化比对。如在以下非限制性的实例中所述，使用一种数学算法能完成序列的比较及在两个序列之间的百分比同一性的测定。
使用E.Meyers及W.Miller(Comput.Appl.Biosci.，4∶11-17(1988)的算法可以确定在两条氨基酸序列之间的百分比同一性，该算法已经结合至ALIGN程序(版本2.0)中，该算法使用了PAM120权重残基表(weight residue table)、空位长度罚分(gap length penalty)12以及空位罚分4。此外，使用Needleman及Wunsch(J.Mol.Bio1.48∶444-453(1970))算法能确定在两条氨基酸序列之间的百分比同一性，该算法已结合至GCG软件包的GAP程序中(可在http∶／／www.gcg.com获得)，该算法使用了Blossum62矩阵或PAM250矩阵，以及空位权重16、14、12、10、8、6，或4以及长度权重1、2、3、4、5，或6。
额外地或可替代地，本披露的蛋白序列能进一步作为“查询序列”来使用，对公开数据库进行检索，例如鉴定相关的序列。使用Altschul，et al.(1990)J.Mol.Biol.215∶403-10的XBLAST程序(版本2.0)能进行这种检索。通过XBLAST程序，记分＝50，字长＝3进行BLAST蛋白质检索，以获得与本披露的抗体分子同源的氨基酸序列。为获得用于比较目的的空位比对，如Altschul et al.((1997)Nucleic Acids Res.25(17)∶3389-3402)所述能利用Gapped BLAST。当利用BLAST及GappedBLAST程序时，相应的程序(例如XBLAST及NBLAST)的默认参数是有用的。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。
具有保守性修饰的抗体
在某些实施方案中，本披露的一种抗体包括一个重链可变区，包括CDR1、CDR2及CDR3序列，以及一个轻链可变区，包括CDR1、CDR2及CDR3序列，其中这些CDR序列中一个或多个序列包括基于在此说明的优选抗体(例如，F7、F9、D1或E2)的特定的氨基酸序列，或它们的保守性修饰，并且其中这些抗体保留了本披露的抗-CXCR4抗体的所希望的功能特性。在本领域中所理解的是，可以进行某些保守性序列修饰，这些保守性序列修饰不会去除抗原结合。参见，例如，Brummellet al.(1993)Biochem32∶1180-8(说明了在对沙门氏菌特异的抗体的CDR3重链结构域的突变分析)；de Wildt et al.(1997)Prot.Eng.10∶835-41(说明了抗-UA1抗体的突变研究)；Komissarov et al.(1997)J.Biol.Chem.272∶26864-26870(显示了在HCDR3中间的突变，导致被消除或减低的亲和力)；Hall et al.(1992)J.Immunol.149∶1605-12(说明在CDR3区中的单一氨基酸改变消除了结合活性)；Kelley and O’Connell(1993)Biochem.32∶6862-35(说明了酪氨酸残基在抗原结合中的贡献)；Adib-Conquy et al.(1998)Int.Immunol.10∶341-6(说明了疏水性在结合中的作用)以及Beers et al.(2000)Clin.Can.Res.6∶2835-43(说明了HCDR3氨基酸突变体)。因此，本披露提供了一个分离的单克隆抗体，或其抗原结合部分，包括含有CDR1、CDR2、以及CDR3序列的一个重链可变区以及含有CDR1、CDR2、以及CDR3序列的一个轻链可变区，其中：
(a)该重链可变区CDR3序列包括一个氨基酸序列，该序列选自下组，其构成为：氨基酸序列SEQ ID NO∶9至12，以及它们的保守性修饰；
(b)该轻链可变区CDR3序列包括一个氨基酸序列，该序列选自下组，其构成为：氨基酸序列SEQ ID NO∶21至44，以及它们的保守性修饰；以及
(c)该抗体结合至一种细胞表面表达的天然人类CXCR4。
额外地或可替代地，该抗体可能具有以下功能特性中的一种或多种性质：(i)以1×10-7M或更小的KD结合人类CXCR4；(ii)抑制SDF-7与CXCR4的结合；(iii)抑制在表达CXCR4的细胞中SDF-1诱导的钙流动；(iv)抑制SDF-1诱导的表达CXCR4的细胞的迁移；(v)抑制由HuVEC形成毛细管；(vi)在体内和／或在体外诱导在表达CXCR4的细胞中的凋亡；(vii)在体外和／或在体内抑制CXCR4阳性的肿瘤细胞的生长；和／或(viii)抑制CXCR4阳性的肿瘤细胞的转移。
在一个优选的实施方案中，该重链可变区CDR2序列包括一个氨基酸序列，该氨基酸序列选自下组，其构成为：氨基酸序列SEQ ID No∶5至8，以及它们的保守性修饰；并且该轻链可变区CDR2序列包括一个氨基酸序列，该氨基酸序列选自下组，其构成为：氨基酸序列SEQ IDNos∶17至12，以及它们的保守性修饰。在另一个优选的实施方案中，该重链可变区CDR1序列包括一个氨基酸序列，该氨基酸序列选自下组，其构成为：氨基酸序列SEQ ID Nos∶1至4，以及它们的保守性修饰；并且该轻链可变区CDR1序列包括一个氨基酸序列，该氨基酸序列选自下组，其构成为：氨基酸序列SEQ ID No；13至16，以及它们的保守性修饰。
在不同的实施方案中，该抗体可以是例如人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
如在此所使用的术语“保守性序列修饰”意指不会显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。此类保守性修饰包括氨基酸的置换、插入、以及缺失。通过本领域已知的标准技术(例如定点诱变及PCR介导的诱变)可将修饰引入本披露的一种抗体中。保守性氨基酸置换是如下的置换，其中氨基酸残基被具有一条相似侧链的一个氨基酸残基替换。在本领域中已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)，具有β-支链侧链的氨基酸(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)，以及具有芳香例链的氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在本披露的抗体的CDR区中的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替代，并且使用在此说明的功能测定可以针对保留功能(即，以上给出的功能)检测被改变的抗体。
结合至与抗-CXCR4抗体相同的表位的抗体
在另一个实施方案中，本披露提供了多种抗体，它们如本披露的这些抗-CXCR4单克隆抗体中的任一个同样地结合人类CXCR4的相同表位上(即，这些抗体有能力与本披露的这些单克隆抗体中的任何一个进行交叉竞争，从而与CXCR4相结合)。在多个优选的实施方案中，用于交叉竞争研究的参照抗体可以是：单克隆抗体F7(具有的VH与VL序列分别示于SEQ ID NO∶25及29)，或单克隆抗体F9(具有的VH与VL序列分别示于SEQ ID NO∶26及30)，或单克隆抗体D1(具有的VH与VL序列分别示于SEQ ID NO∶27及31)，或单克隆抗体E2(具有的VH与VL序列分别示于SEQ ID NO∶28及32)。
根据这种交叉竞争的抗体与F7、F9、D1或E2进行交叉竞争的能力，采用标准的CXCR4结合测定能够识别这种交叉竞争抗体。例如，可以使用CEM细胞的流式细胞术，以证明与本披露的抗体的交叉竞争，其中该参照抗体用FITC进行标记，并且评估了一个测试抗体抑制FITC标记的参照抗体的结合CEM细胞的能力。对于抗体抑制例如F7、F9、D1或E2与人类CXCR4结合的能力的测试证明了该测试抗体能够与F7、F9、D1或E2竞争而结合人类CXCR4，并且因此与F7、F9、D1或E2一样结合至人类CXCR4的相同表位上。在一个优选的实施方案中，与F7、F9、D1或E2一样结合至CXCR4上相同表位上的抗体是一种人类单克隆抗体。如这些实例中所说明可以制备并分离这种人类单克隆抗体。
工程处理并修饰的抗体
通过下述方式可以进一步制备本披露的一种抗体：使用具有本文披露的的VH和／或VL序列中的一个或多个序列的抗体作为起始材料，通过工程处理经修饰的抗体，这种经修饰的抗体可能具有与起始抗体不同的性质。通过在一个或两个可变区(即VH和／或VL)中，例如在一个或多个CDR区内和／或在一个或多个构架区内中修饰一个或多个残基，可以对抗体进行工程处理。额外地或可替代地，通过在一个或多个恒定区中修饰残基，例如改变该抗体的一种或多种效应物功能，能够对抗体进行工程处理。
在某些实施方式中，可以使用CDR移植以对抗体的可变区进行工程处理。抗体和靶抗原主要通过位于六个重链及轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基进行相互作用。因为这一原因，CDR中的氨基酸序列在各个抗体之间比在CDR之外的序列更具有多样性。因为CDR序列负责大部分抗体-抗原相互作用，所以通过构建包含来自被移植至框架序列(来自具有不同性质的不同抗体)的特异的自然发生的CDR序列的表达载体，表达模拟特异的天然发生的抗体性质的重组抗体是可能的。(参见，例如，Riechmann，L.et al.(1998)Nature332∶323-327；Jones，P.et a1.(1986)Nature321∶522-525；Queen，C.et al.(1989)Proc.Natl.Acad.See.U.S.A.86∶10029-10033；Winter的美国专利号5，225，539，以及Queen等的美国专利号5，530，101；5，585,089；5，693，762以及6，180，370)。
因此，本披露的另一个实施方案涉及一种分离的单克隆抗体，或其抗原结合部分，包括包括CDR1、CDR2、以及CDR3序列的一个重链可变区，该CDR1、CDR2与CDR3序列包含一个氨基酸序列，该序列选自下组，其构成分别为：SEQ ID NO∶1至4，SEQ ID NO∶5至8，以及SEQ ID NO∶9至12，并且包括包括CDR1、CDR2、以及CDR3序列的一个轻链可变区，该CDR1、CDR2与CDR3序列包含一个氨基酸序列，该序列选自下组，其构成分别为：SEQ ID NO∶13至16，SEQ ID NO∶17至20，以及SEQ ID NO∶21至24。因此，这种抗体含有单克隆抗体F7、F9、D1或E2的VH与VLCDR序列，但可能含有与这些抗体不同的框架序列。
这种框架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或已公开的文献获得。例如，针对人类重链及轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“Vbase”人类种系序列数据库中找到(在互联网在http∶／／www.mrc-cpe.cam.ac.uk／vbase中获得)，并且在以以下献中找到：Kabat，E.A.，et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，NIHPublication No.91-3242；Tomlinson，I.M.，et al.(1992)″The Repertoire ofHuman Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segmentswith Different Hypervariable Loops″J.Mol.Biol.227∶776-798；以及Cox，J.P.L et al.(1994)″A Directory of Human Germ-line VH Segments Revealsa Strong Bias in their Usage″Eur.J.Immunol.24∶827-836；这些文献中每一篇的内容均明确地通过引用结合于此。作为另一个实例，针对人类重链及轻链可变区基因的种系DNA序列可以在Genbank数据库中找到。在HCo7HuMAb小鼠中发现的下列重链种系序列从以下所附的Genbank登录号获得∶1至69(NG_0010109、NT_024637及BC070333)，3至33(NG_0010109及NT_024637)以及3至7(NG_0010109及NT_024637)。作为另一个实例，在HCo12HuMAb小鼠中发现的下列重链种系序列从以下的所附的Genbank登录号获得∶1至69(NG_0010109、NT_024637及BC070333)、5至51(NG_0010109及NT_024637)、4至34(NG_0010109及NT_024637)、3至30.3(CAJ556644)及3至23(AJ406678)。人类重链及轻链种系序列的另一个来源是人类免疫球蛋白基因的数据库，从IMGT(http∶／／imgt.cines.fr)可以获得。
使用序列相似性检索方法中的一种方法(被称为Gapped BLAST)将抗体蛋白序列与汇编的蛋白数据库进行比较(Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Research25∶3389-3402)，这种方法对于本领域的技术人员而言是熟知的。BLAST是一种探索式算法，因为在抗体序列与数据库序列之间的在统计学上显著的比对可能包含比对字符的高得分片段对(HSP)。通过扩展或修正不能改善片段对分数的片段对被称为命中项(hit)。简言之，翻译VBASE来源的核苷酸序列(http∶／／vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase1／list2.php)，并且保留FRI至FR3构架区之间的区域(包括FR1至FR3构架区)。这些数据库序列具有的平均长度为98个残基。重复序列(它们是蛋白质全部长度上的精确匹配)被清除。用于蛋白质的BLAST检索，使用带有默认值的程序blastp、除低复杂性过滤以外的标准参数，已被关闭，以及BLOSUM62的置换矩阵，针对实现序列相配的前5个命中项进行过滤。在全部六个框架中翻译核苷酸序列，并且在数据库序列的匹配片段中不具有终止密码子的框架被视为潜在的命中项。进而使用BLAST程序tblastx对此进行确认，该程序翻译了全部六个框架中的抗体序列，并且将这些翻译与全部六个框架中被动态翻译的VBASE核苷序列进行比较。如上所述，可以与VBASE类似地搜索其他人类种系序列数据库，例如从IMGT(http∶／／imgt.cines.fr)获得的数据库。
同一性是在抗体序列与蛋白质数据库之间序列的全长的精确的氨基酸匹配。这些阳性项(同一性+取代匹配)不是完全相同的，而是由BLOSUM62取代矩阵所引导的氨基酸取代。如果抗体序列以相同的同一性匹配数据库序列中的两条序列，则具有最大阳性的命中项将被判定为是匹配的序列命中项。
在本披露的抗体中使用的优选的框架序列是结构上与由本披露的已选择的抗体所使用的框架序列相似的框架序列，例如，与VH3-48框架序列(SEQ ID NO∶49)相似和／或由本披露的优选的单克隆抗体所使用的VK L15框架序列(SEQ ID NO∶50)相似。这些VH CDR1、CDR2、和CDR3序列，以及VK CDR1、CDR2、和CDR3序列可以被移植至多个构架区上，这些构架区具有与从中衍生出该框架序列的种系免疫球蛋白基因中所发现的序列相同的序列，或者这些CDR序列可以被移植至多个构架区上，这些构架区与这些种系序列相比含有一个或多个突变。例如，已发现在某些情况下对构架区内对残基进行突变是有益的，以保持或增强该抗体的抗原结合能力(参见例如，Queen等人的美国专利号5,530，101；5，585,089；5,693,762以及6，180,370)。
另一种类型的可变区修饰是在VH和／或VK CDR1、CDR2和／或CDR3区中对氨基酸残基进行突变，由此改善感兴趣的抗体的一种或多种结合性质(例如亲和力)。可以进行定向诱变或PCR介导的诱变，以引入一种或多种突变，并影响抗体结合能力，或其他感兴趣的功能特性；如在此说明及实例中所提供在体内或体外实验能够对定向诱变或PCR介导的诱变进行评估。优选引入保守性修饰(如上所讨论)。该突变可能是氨基酸置换、插入或缺失，但优选是置换。此外，典型地在一个CDR区域中对不超过一个、两个、三个、四个或五个残基进行改变。
因此，在另一方面，本披露提供了分离的抗-CXCR4单克隆抗体，或它们的抗原结合部分，包括一个重链可变区，该重链可变区包括：(a)一个VH CDR1区，包括一个氨基酸序列，该氨基酸序列选自下组，其构成为：SEQ ID NO∶1至4，或与SEQ ID NO∶1至4相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸置换、缺失或插入的一个氨基酸序列；(b)一个VH CDR2区域，包括一个氨基酸序列，该序列选自下组，其构成为：SEQ ID NO∶5至8，或与SEQ ID NO∶5至8相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸置换、缺失或插入的一个氨基酸序列；(c)一个VH CDR3区域，包括一个氨基酸序列，该序列选自下组，其构成为：SEQ ID NO∶9至12，或与SEQ ID NO∶9至12相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸置换、缺失或插入的一个氨基酸序列；(d)一个VK CDR1区域，包括一个氨基酸序列，该序列选自下组，其构成为：SEQ ID NO∶13至16，或与SEQ ID NO∶13至16相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸置换、缺失或插入的一个氨基酸序列；(e)一个VK CDR2区域，包括一个氨基酸序列，该序列选自下组，其构成为：SEQ ID NO∶17至20，或与SEQ ID NO∶17至20相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸置换、缺失或插入的一个氨基酸序列；以及(f)一个VK CDR3区域，包括一个氨基酸序列，该序列选自下组，其构成为：SEQ ID NO∶21至24，或与SEQ ID NO∶21至24相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸置换、缺失或插入的一个氨基酸序列。
本披露的工程化抗体包括以下抗体：其中在VH和／或VK内已经对框架残基进行了修饰，例如改进了抗体的性质。典型地对这种框架进行修饰，以降低抗体的免疫原性。例如，一个方法是将一个或多个框架残基“回复突变”成为相应的种系序列。更确切地说，已经经历了体细胞突变的抗体可能包含与从中衍生出的抗体的种系序列不同的框架残基。这些残基可以通过将该抗体框架序列与从中衍生出该抗体的种系序列进行比较而被鉴定。
例如，对于F7VH区，以下构架区的氨基酸位置(利用Kabat计数系统)不同于种系1、6及25。通过进行以下Q1E、Q6E及A25S置换中的一个、两个或全部三个置换，这些位置中的一个、两个或全部三个位置可以被回复突变成种系序列。F7VH区的一个优选的修饰形式是F7GL VH(F7GL VH的氨基酸序列如图5A以及SEQ ID NO∶41所示)，F7GL VH具有以下的框架置换：Q1E及Q6E。
此外，对于F7VK区，以下构架区的氨基酸位置(利用Kabat计数系统)不同于种系1、3及84。通过进行以下A1D、R3Q及V84A置换中的一个、两个或全部三个置换，这些位置中的一个、两个或全部三个位置可以被回复突变成种系序列。F7VK区的一个优选的修饰形式是F7GL VK(F7GL VK的氨基酸序列如图5B以及SEQ ID NO∶45所示)，F7GL VK具有以下的框架置换：A1D及R3Q。此外，对于F9VH区，以下构架区的氨基酸位置(利用Kabat计数系统)不同于种系1、6及25。通过进行以下Q1E、Q6E及A25S置换中的一个、两个或全部三个置换，这些位置中的一个、两个或全部三个位置可以被回复突变成种系序列。F9VH区的一个优选的修饰形式是F9GL VH(F9GL VH的氨基酸序列如图6A以及SEQ ID NO∶42所示)，F7GL VH具有以下的框架置换：Q1E及Q6E。
此外，对于F9VK区，以下构架区的氨基酸位置(利用Kabat计数系统)不同于种系1、3、4及60。通过进行以下E1D、V3Q、L4M及P60S置换中的一个、两个、三个或全部四个置换，这些位置中的一个、两个、三个或全部四个置换可以被回复突变成种系序列。F9VK区的一个优选的修饰形式是F9GL VK(F9GL VK的氨基酸序列如图6B以及SEQID NO∶46所示)，F9GL VK具有以下的框架置换：E1D、V3Q及L4M。
此外，对于D1VH区，以下构架区的氨基酸位置(利用Kabat计数系统)不同于种系6、25及76。通过进行以下Q6E、A25S及R76K置换中的一个、两个或全部三个置换，这些位置中的一个、两个或全部三个位置可以被回复突变成种系序列。D1VH区的一个优选的修饰形式是D1GL VH(D1GL VH的氨基酸序列如图7A以及SEQ ID NO∶43所示)，D1GL VH具有以下的框架置换：Q6E。
此外，对于D1VK区，以下构架区的氨基酸位置(利用Kabat计数系统)不同于种系1、3、4、45及46。通过进行以下V1D、W3Q、V4M、E45K及L46S置换中的一个、两个、三个、四个或全部五个置换，这些位置中的一个、两个、三个、四个或全部五个位置可以被回复突变成种系序列。D1VK区的一个优选的修饰形式是D1GL VK(D1GL VK的氨基酸序列如图7B以及SEQ ID NO∶47所示)，D1GL VK具有以下的框架置换：V1D、W3Q及V4M。
此外，对于E2VH区，以下构架区的氨基酸位置(利用Kabat计数系统)不同于种系6及25。通过进行以下Q6E及A25S置换中的一个或两个置换，这些位置中的一个或两个位置可以被回复突变成种系序列。E2VH区的一个优选的修饰形式是E2GL VH(E2GL VH的氨基酸序列如图8A以及SEQ ID NO∶44所示)，E2GL VH具有以下的框架置换：Q6E。
此外，对于E2VK区，以下构架区的氨基酸位置(利用Kabat计数系统)不同于种系1、3及4。通过进行以下E1D、V3Q及L4M置换中的一个、两个或全部三个置换，这些位置中的一个、两个或全部三个位置可以被回复突变成种系序列。E2VK区的一个优选的修饰形式是E2GLVK(E2GL VK的氨基酸序列如图8B以及SEQ ID NO∶48所示)，E2GLVK具有以下的框架置换：E1D、V3Q及L4M。
另一种类型的框架修饰涉及在构架区内或甚至在一个或多个CDR区内，对一个或多个残基的残基进行突变，以去除T细胞表位，由此降低该抗体的潜在的免疫原性。这一方法也被称为“去免疫原化”，并且在Carr等人的美国专利公开号20030153043中有进一步的详细说明。
除了在构架区或CDR区域内进行的修饰之外，或作为替代，还可以对本披露的抗体进行工程处理，以在Fc区域内包含一些修饰，典型地改变该抗体的一种或多种功能特性，例如血清半衰期、补体固定(complement fixation)、Fc受体结合、和／或抗原依赖的细胞的细胞毒性作用。此外，本披露的一种抗体可以被化学修饰(例如，可以将一个或多个化学物部分(moiety)附着至该抗体)，或被修饰以改变其糖基化作用，以便再次改变该抗体的一个或多个功能特性。以下对这些实施方案中的每一个均进行进一步详细的说明。Fc区中的残基的编号是Kabat的EU索引号。
在一个实施方案中，对CH1的铰链区进行修饰，使得铰链区中的半胱氨酸残基的数目发生变化(例如，增加或减少)。在Bodmer等人的美国专利号5,677,425中进一步说明了该方法。CH1的铰链区中的半胱氨酸残基的数目发生变化，例如便于组装轻链及重链或者增大或减小该抗体的稳定性。
在另一个实施方案中，对抗体的Fc铰链区进行突变以减小该抗体的生物半衰期。更确切地说，将一个或多个氨基酸突变引入Fc铰链域片段的CH2-CH3结构域的界面区域，使得相对于天然Fc铰链域的葡萄球菌A蛋白(Staphylococal protein A，SpA)而言，该抗体削弱了SpA的结合。Ward等人的美国专利号6，165,745中更详细地说明了这一方法。
在另一个实施方案中，对该抗体进行修饰以增大其生物半衰期。不同的方法是可能的。例如，如Ward的美国专利号6,277,375中所说明，可以引入以下T252L、T254ST256F突变中的一种或多种突变。作为替代，为增大生物半衰期，该抗体可以在CH1或CL区域中发生变化以包含从IgG的Fc区域的CH2结构域的两个环处获得的一个补救受体(salvage receptor)结合表位，如Presta等人的美国专利号5,869,046及6，121,022中所说明。
在另外的其他的实施方案中，通过用不同的氨基酸残基替换至少一个氨基酸残基来改变Fc区，而改变该抗体的一种或多种效应物功能。例如，选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320及322的一个或多个氨基酸可以被一个不同的氨基酸残基所替换，使得该抗体对于效应物配体具有已改变的亲和力，但保留该亲本抗体的抗原结合能力。例如，亲和力被改变的效应物配体可以是一种Fc受体或补体的C1成分。Winter等人的美国专利号5,624,821以及5,648,260中更详细地说明了这一方法。
在另一个实施例中，选自氨基酸残基329、331及322的一个或多个氨基酸残基可以被不同的氨基酸残基所替换，使得使该抗体具有已改变的Cl q结合和／或降低或已消除的补体依赖的细胞毒性作用(CDC)。Idusogie等人的美国专利号6，194,551中更详细地说明了这一方法。
在另一个实施例中，改变氨基酸位置231及239中的一个或多个氨基酸，由此改变抗体的固定补体的能力。Bodmer等人的PCT公开文件WO94／29351中进一步说明了这一方法。
在又另一个实施例中，为了提高该抗体介导抗体依赖性细胞的细胞毒性作用(ADCC)的能力和／或提高该抗体对Fcγ受体的亲和性，通过在下列位置修饰一个或多个氨基酸，对Fc区域进行了修饰：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。Presta的PCT公开文件WO00／42072中进一步说明了这一方法。此外，在人IgG1上已做出针对FcγRI、FcγRII、FcγRIII及FcRn的结合位点的图谱，并说明了具有改善的结合的变异体(参见Shields，R.L.et al.(2001)J.Biol.Chem.276∶6591-6604)。在位置256、290、298、333、334及339具有特异的突变显示出改善对FcγRIII的结合。另外，下列组合突变显示出改善FcγRIII的结合：T256A／S298A、S298A／E333A、S298A／K224A及S298A／E333A／K334A。
在再另一个实施方案中，对一种抗体的糖基化作用进行了修饰。例如，可以制做一种去糖基化的抗体(即，该抗体缺乏糖基化)。可以改变糖基化作用，以例如增加该抗体对抗原的亲和性力。例如，通过在该抗体序列中改变一个或多个糖基化的位点可以实现这种碳水化合物修饰。例如，可以进行一个或多个氨基酸的置换，这导致去除一个或多个可变区框架糖基化位点，由此在那个位点处消除糖基化作用。这种去糖基化作用可能提高该抗体对抗原的亲和力。Co等人的美国专利号5，714,350及6,350,861中更详细地说明了这一方法。
额外地或可替代地，可以制备已改变的糖基化类型的一种抗体，例如具有减少的岩藻糖残基含量的一种低岩藻糖化抗体或具有增加的二等分GlcNac结构的一种抗体。已经证实这种已改变的糖基化类型可以提高一些抗体的ADCC能力。例如在具有已改变的糖基化作用机制的宿主细胞中表达该抗体可以实现这种碳水化合物修饰。具有已改变的糖基化作用机制的细胞在本领域中已被说明，并可以用作表达本披露的重组抗体的宿主细胞，由此产生一种具有已改变的糖基化作用的抗体。例如，细胞系Ms704、Ms705、以及Ms709缺乏岩藻糖基转移酶基因FUT8(α(1，6)岩藻糖转移酶)，使得在Ms704、Ms705，以及Ms709细胞系中表达的抗体在它们的碳水化合物中缺乏岩藻糖。Ms704、Ms705、以及Ms709FUT8-／-细胞系是通过使用两种替换载体对CHO／DG44细胞中的FUT8基因进行靶向破坏而产生的(参见Yamane等人的美国专利公开文件号20040110704及Yamane-Ohnuki(2004)Biotechnol Bioeng87∶614-22)。作为另一个实例，Hanai等人的EP1，176,195说明了一种带有在功能上被破坏的FUT8基因的细胞系(该基因编码岩藻糖基转移酶)，使得通过减少或消除α1，6键相关的酶，在这种细胞系中表达的抗体表现出低岩藻糖化。Hanai等人也说明了一些细胞系，它们具有用于将岩藻糖添加至N-乙酰葡糖胺的低酶活性(该N-乙酰葡糖胺结合至该抗体的Fc区域)，或者不具有该酶活性，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2／0(ATCC CRL1662)。Presta的PCT公开文件WO03／035835说明了一种CHO细胞系变异体，Lec13细胞，具有降低能力将岩藻糖附着至与Asn(297)相连的碳水化合物，这也导致在那个宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖化(还参见Shields，R.L.et al.(2002)J.Biol.Chem.277：26733-26740)。如美国专利申请号PCT／US06／05853中所说明，在鸡蛋中也可以生产具有一个经修饰的糖基化特性的抗体。作为替代，具有一个经修饰的糖基化特性的抗体可以在植物细胞(例如浮萍())中生产。在一种植物系统中生产抗体的方法披露于美国专利申请中(对应于Alston&Bird LLP律师案卷号040989／314911，于2006年8月11日提交)。Umana等人的PCT公开文件WO99／54342中说明了经过工程处理而表达糖蛋白修饰的糖基转移酶(例如，β(1，4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII)的细胞系，使得在这种经过工程处理的细胞系中表达的抗体具有增多的二等分GlcNac结构，这导致抗体的ADCC活性提高(还可参见Umana et al.(1999)Nat.Biotech.17∶176-180)。作为替代，使用岩藻糖苷酶可以切去该抗体的岩藻糖残基。例如，岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶从抗体上切去岩藻糖残基(Tarentino，A.L.et al.(1975)Biochem.14∶5516-23)。由本披露所考虑的本案的这些抗体的另一种修饰是聚乙二醇化(pegylation)。对一种抗体进行聚乙二醇化以便(例如)增加抗体的生物(例如，血清)半衰期。为了对一种抗体进行聚乙二醇化，在使一个或多个聚乙二醇(PEG)基团附着至该抗体或抗体片段的条件下，典型地将该抗体，或其抗体片段与PEG(例如PEG的反应活性酯类或醛类衍生物)进行反应。优选地，使用一种反应性的PEG分子(或一种类似的反应性的水溶性聚合物)，通过一个酰基化反应或一个烷基化反应进行聚乙二醇化。在本文所使用的术语“聚乙二醇”旨在涵盖已用于衍生其他蛋白质(例如单(C1-C10)烷氧基聚乙二醇或芳氧基聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺)的PEG的任何形式。在某些实施方案中，有待聚乙二醇化的抗体是一种去糖基化的抗体。对蛋白进行聚乙二醇化的方法在本领域中是已知的，并可以被应用于本披露的抗体。参见例如，Nishimura等人的EP0154316及Ishikawa等人的EP0401384。
抗体片段和抗体模拟物
本披露不限于传统的抗体，并可能通过使用抗体片段及抗体模拟物进行实用。如以下所详述，已经开发了多种抗体片段及抗体模拟物技术，且这些片段及技术在本领域内是广泛已知的。虽然这些技术中有一些(例如结构域抗体、纳米抗体、以及UniBody)使用了多种传统抗体结构的片段、或对这些传统抗体结构的其他修饰，但是还存在着多种可替代的技术，例如Affibody、DARPin、Anticalin、Avimer，以及Versabody，它们采用了多种结合的结构，这些结构(虽然它们模拟传统的抗体结合)产生于不同的机制并通过这些不同的机制发挥功能。
结构域抗体(dAb)是抗体的最小功能结合单位，对应于人类抗体的重链(VH)或轻链(VL)的可变区。结构域抗体的分子量约为13kDa。Domantis已经开发了一系列全部人类VH与VL dAb的大而高功能性文库(每一文库中有超过一百亿种不同的序列)，并使用这些文库来选择对治疗靶标特异的dAb。与许多常规抗体不同，结构域抗体在细菌、酵母，以及哺乳动物细胞系统中很好地表达。结构域抗体及其生产方法的进一步细节通过引用美国专利6,291，158；6,582,915；6,593,081；6，172,197；6,696,245；美国系列号2004／0110941；欧洲专利申请号1433846以及欧洲专利0368684及0616640；WO2005／035572、WO2004／101790、WO2004／081026、WO2004／058821、WO2004／003019以及WO2003／002609而获得，其中每一项的全文均通过引用结合在此。
纳米抗体(Nanobody)是源自抗体的治疗性蛋白质，它包含天然发生的重链抗体的独特结构及功能特性。这些重链抗体包含一个单一可变区(VHH)和两个恒定区(CH2与CH3)。重要的是，该经克隆并且被分离的VHH结构域是一个完全稳定的多肽，它携带原始重链抗体的全部抗原结合能力。纳米抗体对人类抗体的VH结构域具有高同源性，并且可以进一步被人源化而不会损失任何活性。重要的是，纳米抗体具有低免疫原性的潜力，这在使用纳米抗体所致的化合物的灵长类动物研究中已得到证实。纳米抗体结合了常规抗体的优点与小分子药物的重要特征。与常规抗体类似，纳米抗体显示出高靶点特异性，对它们的靶点的高亲和力以及低固有毒性。然而，与小分子药物类似，它们能够抑制酶类并且容易到达受体裂缝(receptor cleft)。此外，纳米抗体非常稳定，可以通过除注射之外的方法进行给药(参见，例如WO2004／041867，其全文通过引用结合在此)，并且易于制造。纳米抗体的其他优点包括：由于其尺寸小而识别不常见的或隐藏的表位；由于其独特的三维的、药物形式的灵活性，以高亲和力及选择性结合入蛋白质靶的空腔或活性位点；适应药物发现的半衰期及容易性及速度。纳米抗体被单基因编码，并在几乎所有的原核宿主及真核宿主(例如，大肠杆菌(E.coli))中有效地生产，(参见，例如US6,765,087，其全文通过引用结合在此)、霉菌(例如曲霉属或木霉属)以及酵母(例如酵母属、克鲁维酵母属、汉逊酵母属或毕赤酵母属)(参见，例如US6,838,254，其全文通过引用结合在此)。该生产方法是可比例放大的，并且已经生产了几千克量的纳米抗体。与常规抗体相比纳米抗体显示出优越的稳定性，所以它们可以被配制成保质期长，立即可用的溶液。
纳米克隆的方法(参见，例如WO06／079372，其全文通过引用结合在此)是用于产生针对一个希望的靶标的纳米抗体的一种合适的方法，它基于B细胞的自动高通量选择，并且可以用于本披露的内容。
UniBody是另一种抗体片段技术，然而这一技术是基于去除IgG4抗体的铰链区的。删除铰链区得到基本上是传统IgG4抗体一半尺寸的分子，并且该分子具有单价结合区而不是IgG4抗体的二价结合区。人们熟知这些IgG4抗体是无活性的，并因此不与免疫系统相互作用。这对于不希望有免疫反应的疾病的治疗可能会有优势，并且这一优势被传递至UniBody。例如，UniBody的功能可以是抑制或沉默它们所结合的细胞但不会杀死该细胞。此外，UniBody结合至肿瘤细胞，不刺激它们的增殖。此外，因为UniBbody具有传统IgG4抗体约一半的尺寸，所以它们可以在较大的实体瘤上显示出更好的分布，具有潜在的有利功效。UniBbody从体内被清除的速度与整个IgG4抗体相似，并且能够与整个IgG4抗体一样以相似的亲和力结合它们的抗体。Unibody的其他细节可通过参见专利WO2007／059782而获得，其全文通过引用结合在此。
Affibody分子代表了一类新的亲和蛋白质，这些蛋白质基于一个具有58个氨基酸残基的蛋白质功能域，源自葡萄球菌蛋白A的结合IgG的结构域中的一个。这个三螺旋束结构域已被作为支架用于构建组合的噬菌体文库(combinatorial phagemid library)，使用噬菌体展示技术可从该文库中选择靶向希望的分子的Affibody变异体(Nord K，Gunneriusson E，Ringdahl J，Stahl S，Uhlen M，Nygren PA，Binding proteinsselected from combinatorial libraries of anα-helical bacterial receptordomain，Nat Biotechnol1997；15∶772-7.Ronmark J，Gronlund H，Uhlen M，Nygren PA，Human immunoglobulin A(IgA)-specific ligands fromcombinatorial engineering of protein A，Eur J Biochem2002；269∶2647-55.)。Affibody分子的结构简单坚固，并且它们的分子量低(6kDa)，这使它们适宜于各种广泛的实施，例如，作为检测试剂(Ronmark J，Hansson M，Nguyen T，et al，Construction andcharacterization of afiibody-Fc chimeras produced in Escherichia coli，JImmunol Methods2002；261∶199-211)，并且抑制受体的相互作用(Sandstorm K，Xu Z，Forsberg G，Nygren PA，Inhibition of theCD28-CD80co-stimulation signal by a CD28-binding Affibody liganddeveloped by combinatorial protein engineering，Protein Eng2003；16∶691-7)。Affibody以及它们的生产方法的其他细节可通过参见美国专利号5,831，012而获得，其全文通过引用结合在此。
标记的Affibody在用于检测同种型的丰度的成像应用中也可能是有用的。
DARPin(经过设计的锚蛋白重复蛋白)是抗体模拟DRP(经过设计的重复蛋白)技术的一个实例，已对该技术进行开发以利用非抗体多肽的结合能力。重复蛋白，例如锚蛋白或富含亮氨酸的重复蛋白，是普遍存在的结合分子，与抗体不同，它们出现在细胞内及细胞外。它们独特的模块结构以重复结构单元(重复子)为特征，这些重复子堆叠在一起以形成展示可变的以及模块的靶结合表面的延长重复结构域。基于这一模块性，可以生成具有高度多样性的结合特异性的多肽的组合文库。这一策略包括自我相容的重复(self-compatible repeat)(展示可变的表面残基)的公认的设计，并将它们随机组装进入重复域中。DARPin可以在细菌表达系统中以相当高的产率进行生产，并且它们属于已知的最稳定的蛋白。已经选择出了针对大量的靶蛋白的高特异、高亲和力的DARPin，所述靶蛋白包括人类受体、细胞因子、激酶、人类蛋白酶、病毒及膜蛋白。可以获得亲和力在几纳摩尔至几皮摩尔范围内的DARPin。
DARPin已经被用于广泛的应用中，包括ELISA、夹心ELISA、流式细胞术分析(FACS)、免疫组织化学分析(IHC)、芯片应用、亲和纯化或蛋白印迹。还证明了DARPin在胞内区室中具有高活性，例如作为胞内标记物蛋白与绿色荧光蛋白(GFP)融合。DARPin进一步被用于抑制病毒进入，其IC50在pM范围内。DARPin不仅在阻断蛋白-蛋白相互作用方面是理想的，还抑制酶类。已经成功地抑制了蛋白酶、激酶、以及转运蛋白，通常是别构抑制模式。非常快速并且在肿瘤上特异地富集、并且以非常有利的肿瘤与血液的比例，这使得DARPin非常适宜体内诊断或治疗方法。
有关DARPin及其他DRP技术的另外的信息可以在美国专利申请公开号2004／0132028及国际专利申请公开号WO02／20565中找到，它们的全文均通过引用结合在此。
Anticalin是另一种抗体模拟技术，然而在这种情况下，结合的特异性源自载脂蛋白，载脂蛋白是一个低分子量蛋白质家族，在人体组织及体液中天然地大量表达。载脂蛋白已经得到进化，在体内进行与生理运输及化学敏感的或不溶性化合物的存储有关的多种功能。载脂蛋白具有坚固的内部结构，包括该蛋白质的一端支持四个环(loop)的高度保守的B-桶。这些环构成了结合口袋的入口，并且在这一部分分子的构象差异解释了单个的载脂蛋白之间的结合特异性的变化。
尽管由保守的β-片层结构支持的超可变环的整体结构让人联想起免疫球蛋白，但载脂蛋白与抗体在大小上差异显著，它由160至180个氨基酸的单一多肽链构成，在边迹性地大于单一的免疫球蛋白结构域。
对载脂蛋白进行克隆，并使它们的环经受工程处理以便产生Anticalin。已经生成了在结构上多样的Anticalin的文库，并且Anticalin的展示允许对结合功能进行选择和筛选，随后在原核或真核体系中通过表达并生成可溶蛋白以进一步分析。多项研究已经成功地证明可以开发出对几乎任何人类靶蛋白都特异性的多种Anticalin，可以将它们分离出来，并且可以获得在纳摩尔或更高范围内的结合亲和性。
Anticalin还可以被编排成双靶向性蛋白，被称为Duocalin。使用标准的生产方法，Duocalin在易于生产的单体蛋白中结合两种单独的治疗性靶标，同时保持靶向特异性和亲和性，无论它的两个结合结构域的结构取向如何。
通过一个单一分子调变多个靶标在已知的涉及多种单一发病因子的疾病中是特别有优势。此外的二价或多价结合形式(例如Duocalin)对处于疾病状态的靶向细胞表面分子具有很大的潜力，通过细胞表面受体的结合及集簇介导信号转导通路上的激动剂效应或诱导增强的内化效应。此外，Duocalin的高固有稳定性与单体Anticalin是可比的，为Duocalin提供灵活的配制及送递潜力。
有关Anticalin的其他信息可以在美国专利号7,250,297及国际专利申请公开号WO99／16873中找到，它们的全文均通过引用结合在此。
在本披露的内容中有用的另一种抗体模拟技术是Avimers。Avimers是通过体外的外显子重排及噬菌体展示从人类细胞外受体域的大家族中演化而来，产生具有结合及抑制性质的多结构域蛋白。已经显示出连接多种独立的结合结构域以产生亲和力，并且与传统的单表位结合蛋白相比，该结合结构域产生了改善的亲和力及特异性。其他潜在的优点包括在大肠杆菌中简单并有效地生成多靶特异性的分子，改善的热稳定性以及对蛋白酶的抵抗力。已经得到了针对多种靶的具有亚纳摩尔亲和力的Avimers。
有关Avimers的其他信息可以在美国专利申请公开号2006／0286603、2006／0234299、2006／0223114、2006／0177831、2006／0008844、2005／0221384、2005／0164301、2005／0089932、2005／0053973、2005／0048512、2004／0175756中找到，它们全部通过引用全文结合在此。
Versabodies是另一种可用于本披露内容的抗体模拟技术。Versabody是具有大于15％的半胱氨酸组成的小分子蛋白(3至5kDa)，它形成高二硫化物密度支架，替换典型蛋白具有的疏水核。这种用少量的二硫键替换大量疏水性氨基酸(包括疏水核)使得蛋白更小，更亲水(凝集及非特异性结合更小)，对于蛋白酶及热具有更大的抵抗力，并且具有较低密度的T细胞表位，因为对MHC呈现的贡献最多的残基是疏水性的。这些性质中的全部四种都是熟知的会影响免疫原性，并且预期它们一起会大幅度降低免疫原性。
Versabody的启示来自于由水蛭、蛇、蜘蛛、蝎子、蜗牛，以及海葵(anemone)产生的天然的可注射的生物药剂，已知这些生物药剂显示出未能预期的低免疫原性。从经选择的天然蛋白家族开始，通过设计并通过筛选尺寸，疏水性、蛋白水解抗原加工、以及表位密度被最小化至远远低于天然可注射的蛋白质的平均值的水平。
鉴于Versabody的结构，这些抗体模拟物提供了多种形式，包括多价、多特异性、多样化的半衰期机制、组织靶模块及抗体Fc区域的空缺。此外，可以在大肠杆菌中以高产率生产Versabody，且由于它们的亲水性和小尺寸，Versabody高度可溶，并能够被配制成高浓度。Versabody极具热稳定性(它们可被煮沸)，并具有延长的保质期。
关于Versabody的其他信息可在美国专利申请公开号2007／0191272中找到，其全文通过引用结合在此。
以上提供的抗体片段及抗体模拟技术的详细说明并非旨在成为可以在本说明书的上下文中使用的所有技术的综合清单。例如，但并非作为限制，多种另外的技术，包括可替代的基于多肽的技术，如在Qui et al.，Nature Biotechnology，25(8)921-929(2007))中概述的互补决定区的融合(其全文通过引用结合在此)，以及基于核酸的技术，如在美国专利号5,789,157；5,864,026；5，712,375；5,763,566；6,013,443；6,376,474；6,613,526；6，114，120；6,261,774及6，387,620中说明的RNA适体技术都可用于本披露的内容中，这些文献全部均通过引用结合在此。
抗体的物理特性
本披露的抗体的进一步的特征为抗-CXCR4抗体的不同物理特性。基于这些物理特性，可以使用不同测试来检测和／或区分不同类型的抗体。
在一些实施方案中，本披露的抗体在轻链或重链可变区可能含有一个或多个糖基化位点。在可变区中存在一个或多个糖基化位点，由于抗原结合变化，可能导致抗体的免疫原性提高或抗体的pK值发生变化(Marshall et al(1972)Annu Rev Biochem41∶673-702；Gala FA andMorrison SL(2004)J Immunol172∶5489-94；Wallick et al(1988)J ExpMed168∶1099-109；Spiro RG(2002)Glycobiology12∶43R-56R；Parekhet al(1985)Nature316∶452-7；Mimura et al.(2000)Mol Immunol37∶697-706)。已知糖基化作用发生在含有N-X-S／T序列的部分中。使用Glycoblot测试可以检测可变区的糖基化作用，该测试中对该抗体进行剪切产生一个Fab，并接着使用测量高碘酸盐氧化及Schiff碱形成的测试来检测糖基化。作为替代，使用Dionex光色谱(Dionex-LC)可以检测可变区的糖基化作用，该测试将Fab上的糖类剪切成单糖，并分析每种糖的含量。在某些情况下，优选具有不包含可变区糖基化作用的抗-CXCR4的抗体。这可以通过在可变区中选择不含有糖基化基序的抗体，或者通过使用本领域熟知的标准技术对糖基化基序中的残基进行突变来实现。
在一个优选的实施方案中，本披露的抗体不包括精氨酸同分异构位点。在N-G序列或D-G序列上可能分别发生脱酰胺反应或异天冬酰胺效应。脱酰胺反应或异天冬酰胺效导致异天冬氨酸残基的生成，这是在侧链羧基端而不是主链上，通过生成缠绕结构，降低抗体的稳定性。使用等产量测定(iso-quant assay)可以测量异天冬氨酸的产生，该测试使用反相HPLC检测异天冬氨酸。
每种抗体都将具有独特的等电点(pI)，但是通常抗体的等电点都落在pH6至9.5之间的范围内。IgG1抗体的pI典型地落在pH7至9.5的范围内，并且IgG4抗体的pI典型地落在pH6至8的范围内。虽然这些效果并不完全清楚，但是推测pI在正常范围之外的抗体在体内条件下可能具有一些解折叠(unfolding)及不稳定性。使用毛细管等电聚焦测定可以检测等电点，该测定产生pH梯度，并可以使用激光聚焦来提高准确性(Janini et al(2002)Flectrophoresis23∶1605-11；Ma et al.(2001)Chromatographia53∶S75-89；Hunt et al(1998)J ChromatogrA800∶355-67)。在某些情况下，优选具有包含pI值落在正常范围内的抗-CXCR4抗体。这可以通过选择pI值在正常范围内的抗体，或者通过使用本领域熟知的标准技术对带电的表面残基进行突变来实现。
每种抗体都有一个解链温度，这是热稳定性的指标(KrishnamurthyR and Manning MC(2002)Curr Pharm Biotechnol3∶361-71)。较高的热稳定性表明抗体在体内的总体稳定性较好。使用诸如差示扫描量热法的技术可以测量抗体的解链温度(Chen et al(2003)Pharm Res20∶1952-60；Ghirlando et al(1999)Immunol Lett68∶47-52)。TM1表示抗体起始解折叠的温度。TM2表示抗体的完全解折叠的温度。总体上，优选本披露抗体的TM1高于60℃，优选地高于65℃，甚至更优选地高于70℃。作为替代，使用圆二色性法可以测量抗体的热稳定性(Murrayet al.(2002)J.Chromatogr Sci40∶343-9)。
在一个优选的实施方案中，选择不会快速降解的抗体。使用本领域熟知的毛细管电泳(CE)及MALDI-MS可以测量抗-CXCR4抗体的片段化(Alexander AJ and Hughes DE(1995)Anal Chem67∶3626-32)。
在另一个优选的实施方案中，选择具有最小化聚集作用的抗体。聚集可能导致引发不需要的免疫反应和／或变化的或不良的药物动力学特性。总体上，可接受的抗体的聚集度为25％或更低，优选20％或更低，甚至更优选15％或更低，甚至更优选地为10％或更低，并甚至更优选地为5％或更低。通过本领域熟知的几种技术可以对聚集进行测量以识别单体、二聚体、三聚体或多聚体，所述技术包括尺寸排阻柱(SEC)、高效液相色谱(HPLC)，和光散射法。
工程处理抗体的方法
如上所述，通过修饰VH和／或Vk序列，或其附着的一个或多个恒定区，可以使用具有本文所披露的VH和Vk序列的抗-CXCR4抗体以产生新的抗-CXCR4抗体。因此，在本披露的另一方面，使用本披露的抗-CXCR4抗体(例如F7、F9、D1或E2)的结构特征，用于产生在结构上相关的抗-CXCR4抗体，该抗体保留了本披露抗体的至少一种功能特性，例如结合人类CXCR4。例如，如以上所讨论，可以将F7、F9、D1或E2的一个或多个CDR区，或它们的突变与已知的构架区和／或其他CDR重组地组合，以产生额外的重组工程化的本披露的抗-CXCR4抗体。其他类型的修饰包括上节中说明的那些修饰。用于工程处理方法的起始材料是本文提供的VH和／或Vk序列中的一个或多个序列，或它们的一个或多个CDR区。为产生工程化的抗体，不必实际地制出一种抗体(即，表达成一个蛋白)，该抗体具有本文提供的VH和／或Vk序列中的一个或多个序列或它们的一个或多个CDR区。相反，使用这个或这些序列中包括的信息作为起始材料，生成源自一个或多个原始的序列的“第二代”序列，并接着制备这个或这些“第二代”序列，并将其表达成蛋白。
因此，在另一个实施方案中，本披露提供了制备抗-CXCR4抗体的一种方法，包括：
(a)提供(i)一个重链可变区抗体序列，包括一个CDR1序列，该序列选自下组，其构成为：SEQ ID NO∶1至4；一个CDR2序列，该序列选自下组，其构成为：SEQ ID NO∶5至8；和／或一个CDR3序列，该序列选自下组，其构成为∶SEQ ID NO∶9至12；和／或(ii)一个轻链可变区抗体序列，包括一个CDR1序列，该序列选自下组，其构成为：SEQID NO∶13至16；一个CDR2序列，该序列选自下组，其构成为：SEQ IDNO∶17至20；和／或一个CDR3序列，该序列选自下组，其构成为∶SEQID NO∶21至24；
(b)改变在重链可变区抗体序列和／或轻链可变区抗体序列中的至少一个氨基酸残基，以产生至少一种改变的抗体序列；并且
(c)将改变的抗体序列表达成一种蛋白。
可以使用标准的分子生物学技术来制备并表达改变的抗体序列。
优选地，由被改变的一种或多种抗体序列进行编码的这种抗体是这样的一种抗体，它保留了在此说明的抗-CXCR4抗体的一种、几种或全部功能特性，该功能特性包括但不限于：
(i)结合至在一种细胞表面表达的天然人类CXCR4；
(ii)抑制SDF-1与人类CXCR4的结合；
(iii)抑制在表达CXCR4的细胞中SDF-1诱导的钙流动；
(iv)抑制SDF-1诱导的表达CXCR4的细胞的迁移；
(v)抑制由HuVEC形成毛细管；
(vi)以1×10-7M或更小的KD值结合人类CXCR4；
(vii)诱导表达CXCR4的细胞的凋亡
(viii)在体外抑制肿瘤细胞的增殖；
(ix)在体内抑制肿瘤细胞的增殖和／或诱导肿瘤细胞凋亡；
(x)抑制CXCR4阳性的肿瘤细胞的转移；和／或
(xi)增加携带CXCR4阳性的肿瘤的受试者的存活时间。
使用本领域已知的和／或在此说明的标准测试，例如在实例中给出的测试(例如流式细胞术、结合测定、功能测定)可以对改变的抗体的功能特性进行评估。
在本披露的工程处理抗体的方法的某些实施方案中，可以沿抗-CXCR4抗体编码序列的全长或一部分随机地或选择性地引入突变，并针对结合活性和／或在此说明的其他功能特性对得到的经改造的抗-CXCR4抗体进行筛选。在本领域中已经说明了一些突变的方法，例如，Short的PCT公开号WO02／092780说明了使用饱和诱变、合成连接，或它们的组合来生成并筛选抗体突变的方法。作为替代，Lazar等人的PCT公开号WO03／074679说明了使用计算机筛选方法优化抗体的生理化学特性的方法。
编码本披露的抗体的核酸分子
本披露的另一个方面涉及对本披露的抗体进行编码的核酸分子。这些核酸可能存在于整个细胞中、细胞裂解液中、或者以部分纯化或基本上纯的形式存在。当通过标准技术(包括碱／SDS处理，CsCl成带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳以及本领域的其他熟知技术)从其他细胞成分或其他杂质(如其他细胞核酸或蛋白质)中纯化出核酸时，核酸是“分离的”或“使之基本上是纯的”。参见F.Ausubel et al.(1987)CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley Interscience，New York。本披露的核酸可以是，例如DNA或RNA，并且可以包含或不包含内含子序列。在一个优选的实施方案中，该核酸是cDNA分子。
使用标准的分子生物学技术可以获得本披露的核酸。对于由杂交瘤表达的抗体(例如，从以下进一步说明的携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)而言，通过标准的PCR扩增或cDNA克隆技术可以获得由杂交瘤制备的编码抗体的轻链及重链的cDNA。对于从免疫球蛋白基因文库中获得的抗体(例如，使用噬菌体展示技术)而言，从该基因文库中可以回收编码这中抗体的核酸。
本披露的优选的核酸分子是对F7、F9、D1及E2单克隆抗体的VH与VL序列进行编码的核酸分子。对F7、F9、D1及E2的VH序列进行编码的DNA序列分别显示在SEQ ID NO∶33-36中。对F7、F9、D1及E2的VL序列进行编码的DNA序列分别显示在SEQ ID NO∶37-40中。
一旦获得了编码VH及VL区段的DNA片段，则通过标准的重组DNA技术(例如将可变区基因转变成全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因)，可以进一步操作这些DNA片段。在这些操作中，编码VL或VH的DNA片段被可操作地连接至编码另一种蛋白质(例如一个抗体恒定区或一个柔性连接物)的另一条DNA片段。本文所使用的术语“可操作地连接”意指连接两条DNA片段，使得由这两条DNA片段编码的氨基酸序列保留在阅读框内。
通过将编码VH的DNA可操作地连接至另一个编码重链恒定区(CH1、CH2及CH3)的DNA分子，可以将编码VH区的分离的DNA转化成全长重链基因。人类重链恒定区基因的序列在本领域中是已知的(参见例如，Kabat，E.A.，el al.(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health andHuman Services，NIH Publication No.91-3242)，并且包括这些区域的DNA片段可以通过PCR扩增来获得。该重链恒定区可以是IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但最优选是IgGl或IgG4恒定区。对于Fab重链基因而言，对VH进行编码的DNA可以被可操作地连接至另一个仅对重链CH1恒定区进行编码的DNA分子。
通过将对VL进行编码的DNA可操作地连接至另一个对轻链恒定区CL进行编码的DNA分子，可以将编码VL区的分离的DNA转化成全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人类轻链恒定区基因的序列在本领域中是已知的(参见例，Kabat，E.A.，el al.(1991)Sequences ofProteinsof Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health andHuman Services，NIH Publication No.91-3242)，并且包括这些区域的DNA片段可以通过PCR扩增来获得。在优选的实施方案中，该轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。
为了产生scFv基因，将编码VH及VL的DNA片段可操作地连接至编码柔性连接物的另一条片段(例如，编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3)，使得VL及VH序列可表达为相邻的单链蛋白，其中VL及VH区域由柔性连接物连接起来(参见，例如Bird et al.Science242∶423-426，(1988)；Huston et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA85∶5879-5883，(1988)；和McCafferty et al.，Nature348∶552-554，(1990))。
本披露的单克隆抗体的生产
可以通过多种技术产生本披露的单克隆抗体(mAb)，所述技术包括常规的单克隆抗体方法学，例如Kohler and Milstein(1975)Nature256∶495的标准体细胞杂交技术。虽然优选体细胞杂交步骤，但是大体上可以采用其他用于生产单克隆抗体的技术，例如B淋巴细胞的病毒性转化或致癌性转化。
用于制备杂交瘤的优选的动物系统是鼠类系统。在小鼠中产生杂交瘤是充分确立的程序。用于分离被免疫的脾细胞以进行融合的免疫方案和技术在本领域中是已知的。融合伴侣(例如鼠骨髓瘤细胞)和融合程序也是已知的
基于如以上所述制备的非人类单克隆抗体的序列，可以制备本披露的嵌合抗体或人源化抗体。从感兴趣的非人类杂交瘤中可以获得对重链及轻链免疫球蛋白进行编码的DNA，并且使用标准的分子生物学技术进行工程处理，以包含非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。例如，为生成嵌合抗体，使用本领域中已知的方法可以将鼠类可变区与人类恒定区连接(参见例如，Cabilly等人的美国专利号4,816,567)。为了产生人源化抗体，使用本领域已知的方法可以将鼠类CDR区插入至人类构架区(参见例如，Winter的美国专利号5,225，539及Queen等人的美国专利号5,530，101；5，585,089；5,693,762以及6，180,370)。
在一个优选的实施方案中，本披露的抗体是人类单克隆抗体。使用携带部分人免疫系统而不是小鼠系统的转基因或转染色体小鼠，可以产生直接针对CXCR4的这种人类单克隆抗体。这些转基因小鼠或转染色体小鼠在本文分别指HuMAb
Figure BSA0000101757350000581
及
Figure BSA0000101757350000582
的小鼠，并在此都指“人Ig小鼠”。
Figure BSA0000101757350000583
(
Figure BSA0000101757350000584
Inc.)含有对非重排的人类重链(μ及γ)进行编码的人免疫球蛋白基因微位点，并含有使内源性μ及κ链位点失活的靶向突变(参见例如，Lonberg，et al.(1994)Nature368(6474)：856-859)。因此，这些小鼠表现出小鼠IgM或κ的表达降低，并且响应于免疫应答，被引入的人类重链及轻链转基因经历了类别转换及体细胞突变，以产生高亲和力的人IgGκ单克隆抗体(Lonberg，N.et al.(1994)，supra；reviewed in Lonberg，N.(1994)Handbook ofExperimental Pharmacology113∶49-101；Lonberg，N.and Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.13∶65-93，and Harding，F.and Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.764∶536-546)。HuMAb小、鼠的制备及用途，以及由这种小鼠携带的基因组修饰，进一步记载于Taylor，et al.Nucleic Acids Research20∶6287-6295，(1992)；Chen，et al.InternationalImmunology5∶647-656，(1993)；Tuaillon et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA90∶3720-3724，(1993)；Choi et al.Nature Genetics4∶117-123，(1993)；Chen，et al.EMBO J.12∶821-830，(1993)；Tuaillon et al.J.Immunol.152∶2912-2920，(1994)；Taylor，et al.International Immunology6∶579-591，(1994)；及Fishwild，D.et al.Nature Biotechnoloey14：845-851，(1996)中，所有这些文献的全文通过引用特异地结合在此。进一步参见，均为Lonberg及Kay的美国专利号5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661，016；5，814,318；5,874,299；及5,770,429；Surani等人的美国专利号5,545,807；均为Lonberg及Kay的PCT公开号WO92／03918，WO93／12227，WO94／25585，WO97／13852，WO98／24884及WO99／45962；以及Korman等人的PCT公开号WO01／14424。
在另一个实施方案中，使用在转基因及转染色体上携带人类免疫球蛋白序列的小鼠(例如，携带一个人类重链转基因及一个人类轻链转染色体的小鼠)可以生产本披露的人类抗体。这一小鼠在此被称为
Figure BSA0000101757350000592
Figure BSA0000101757350000593
并且在Ishida等人的PCT公开号WO02／43478中有详细的说明。
再者，替代性的表达人免疫球蛋白基因的转基因动物系统在本领域内是可以获得的，并且可以被用于生产本披露的抗-CXCR4抗体。例如，可以使用可替代的被称为Xenomouse(Abgenix，Inc.)的转基因系统；这种小鼠记载于，例如Kucherlapat等人的美国专利号5,939,598；6,075，181；6，114,598；6，150,584及6，162,963中。
此外，替代性的表达人免疫球蛋白基因的转基因动物系统在本领域内是可以获得的，并且可以被用于生产本披露的抗-CXCR4抗体。例如，可以使用被称作“TC小鼠”的小鼠，该小鼠同时携带人类重链转染色体和人类轻链转染色体；这种小鼠记载于Tomizuka et al.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97：722-727中。此外，在本领域中已经说明了携带人类重链转染色体及轻链转染色体的牛(例如，Kuroiwa et al.(2002)Nature Biotechnology20：889-894以及PCT申请号WO2002／092812)，并且该牛可以被用于生产本披露的抗-CXCR4抗体。
通过用于筛选人类免疫球蛋白基因文库的噬菌体展示方法也可以制备本披露的人类单克隆抗体。这种用于分离人类抗体的噬菌体展示技术在本领域内是已经确定的。例如参见：Ladner等人的美国专利号5,223,409；5,403,484；及5,571,698；Dower等人的美国专利号5,427,908及5，580,717；McCafferty等人的美国专利号5,969,108及6，172,197；以及Griffiths等人的美国专利号5，885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915及6,593,081
使用SCID小鼠也可以制备本披露的人类单克隆抗体，其中人类免疫细胞已被重组入SCID小鼠，使得免疫时可以产生人类抗体反应。这种小鼠记载于，例如Wilson等人的美国专利号5,476,996及5,698,767中。
在一个特别优选的实施方案中，如Buechler等人的美国专利No.6,794,132中所述，使用人Ig小鼠及噬菌体展示技术的结合制备人类抗-CXCR4抗体。更确切地说，该方法首先涉及通过用CXCR4抗原对人Ig小鼠(例如，如上所述的HuMab小鼠或KM小鼠)进行免疫，在小鼠中产生抗-CXCR4抗体反应，随后从小鼠的淋巴细胞中分离编码人类抗体链的核酸，及将这些核酸引入展示载体(例如，噬菌体)中，以提供展示包装体(display package)的文库。因此，每个文库成员包含编码一种人类抗体链的一种核酸，并且每种抗体链通过展示包装体被展示出来。然后用CXCR4抗原对该文库进行筛选，以分离与CXCR4特异性结合的文库成员。然后分离已选择的文库成员的核酸插入，并通过标准的方法进行测序，以确定已选择的CXCR4结合成员的轻链及重链可变序列。通过标准的重组DNA技术可以将可变区转化成全长抗体链，这些技术例如，将可变区克隆进入携带人类重链及轻链恒定区的表达载体，使得VH区被可操作地连接至CH区，并且VL区被可操作地连接至CL区。对于这一重组的转基因小鼠／噬菌体展示系统制备人类抗-CXCR4抗体的进一步说明，参见实例1。
人Ig小鼠的免疫
当人Ig小鼠被用于生产本披露的人类抗体时，可以用以下物质对这种小鼠进行免疫，这些物质包括：一种经纯化的或富集的CXCR4抗原、和／或重组CXCR4的制剂、或表达CXCR4的细胞、或一种CXCR4融合蛋白，如Lonberg，N.et al.Nature368(6474)，(1994)：856-859；Fishwild，D.et al.Nature Biotechnology14：845-851，(1996)；以及PCT公开号WO98／24884及WO01／14424所述。优选地，这些小鼠在初次输注时将是6至16周龄。例如，一种纯化的或重组的CXCR4抗原制品(5至50μg)可用于经腹腔内对人Ig小鼠进行免疫。最优选地，用于生产本披露的抗体的免疫原包括在膜中的处于天然构型的人类CXCR4，它的非限制性的实例包括经转染的细胞，这些细胞在它们的细胞表面表达CXCR4；天然表达CXCR4的细胞(例如，CEM细胞)；以及已结合了CXCR4的人造膜(例如，脂质体)，例如结合CXCR4的磁性蛋白磷脂体(MPLs)(在实例1中有进一步说明)。
在以下实例1中说明了用于产生CXCR4的全长人类单克隆抗体的详细过程。关于不同抗原的积累的经验已显示，在以下条件下转基因小鼠会应答：当用完全弗氏佐剂的抗原在腹腔内(IP)进行初始免疫，随后每隔一周用不完全弗氏佐剂的抗原进行IP免疫(达到共6次)。然而，也发现除弗氏佐剂之外的其他佐剂是有效的。另外，也发现在没有佐剂的情况下整个细胞具有高度的免疫原性。在免疫过程中可以用眶后取血得到的血浆样品监测免疫应答。通过ELISA(如以下所述)可以筛选血浆，具有足够滴度的抗-CXCR4人类免疫球蛋白的小鼠可用于融合。可以在牺牲并去除脾脏前的3天，通过静脉内对小鼠追加抗原。预期对每个免疫可能需要进行2至3次融合。每种抗原通常对6至24只小鼠进行免疫。HCo7与HCo12两个株经常被一起使用。另外，HCo7与HCo12两种转基因均可以被一起培育成具有两种不同的人类重链转基因(HCo7／HCo12)的一只单一小鼠。作为替代性或另外的，如实例1所述，可以使用
Figure BSA0000101757350000621
株。
产生本披露的人类单克隆抗体的杂交瘤的生成
为了生成产生本披露的人单克隆抗体的杂交瘤，来自经免疫的小鼠的脾细胞和／或淋巴结细胞可以被分离，并且被融合至适合的无限增殖化细胞系，例如小鼠骨髓瘤细胞系。针对抗原特异的抗体的产生可以对得到的杂交瘤进行筛选。例如，用50％PEG可以将来来自经免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬液与六分之一数量的P3X63-Ag8.653非分泌型小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL1580)融合。作为替代，使用基于电场的电融合方法，使用CytoPulse大腔细胞融合电穿孔仪(large chambercellfusion electroporator)(CytoPulse Sciences，Inc.，Glen BurnieMaryland)，可以融合来自经免疫的小鼠脾淋巴细胞单细胞悬液。将大约2×105的细胞培养于平底微量滴定板上，之后在以下选择性培养基中孵育2周：该培养基含有20％胚胎克隆血清、18％“653”条件培养液、5％origen(IGEN)、4mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、5mM HEPES、0.055mM的2-巯基乙醇、50单位／ml青霉素、50mg／ml链霉素、50mg／ml庆大霉素以及1X HAT(Sigma；融合24小时后加入HAT)。大约2周后，可以将细胞培养于以HT替代HAT的培养基中。然后由ELISA筛选这些单个孔中的人单克隆IgM与IgG抗体。一旦出现杂交瘤的扩大生长，通常可以在10至14天后观察培养基。可以对分泌抗体的杂交瘤进行再培养，再筛选，并且如果其对人IgG仍是阳性，则可以通过有限稀释将该单克隆抗体亚克隆至少2次。然后可以在体外培养稳定的亚克隆以便在组织培养基中产生少量抗体用于表征。
为了纯化人类单克隆抗体，可以将已选择的杂交瘤培养于2升的旋瓶中用于单克隆抗体纯化。可以对上清液进行过滤并浓缩，之后用蛋白A-琼脂糖(Pharmacia，Piscataway，N.J.)进行亲和层析。通过凝胶电泳及高效液相色谱可以对被洗脱的IgG进行检查以确保纯度。可以将该缓冲液替换为PBS，并且通过OD280使用1.43消光系数确定其浓度。可以将该单克隆抗体分成等份，并保存在-80℃下。
产生本披露的单克隆抗体的转染瘤的生成
使用例如本领域中熟知的重组的DNA技术及基因转染方法的结合，在宿主细胞转染瘤中可以产生本披露的抗体(例如，Morrison，S.(1985)Science229：1202)。
例如，为了表达抗体，或它们的抗体片段，可以通过标准的分子生物学技术(例如，使用对感兴趣的抗体进行表达的杂交瘤的PCR扩增或cDNA克隆)获得编码部分或全长轻链及重链的DNA，并且可将DNA插入至表达载体中，使得这些基因可操作地连接至转录及翻译的控制序列。在此上下文中，术语“可操作地连接”意指将一个抗体基因连接进入一个载体，使得载体中转录及翻译的控制序列起到其调节抗体基因的转录和翻译的预期功能。对表达载体及表达控制序列进行选择以便与所使用的表达宿主细胞相容。可以将该抗体轻链基因与该抗体重链基因插入至单独的载体中，或者更典型地是将两个基因均插入至相同的表达载体中。通过标准的方法(例如，连接抗体基因片段和载体上的互补限制位点，或者如果不存在限制位点则进行平端连接)将这些抗体基因插入至该表达载体中。可以通过以下方法将在本文所说明的抗体的轻链和重链可变区用于生产任何抗体同种型的全长抗体基因：将轻链和重链可变区插入至已经对希望的同种型的重链恒定区和轻链恒定区进行编码的表达载体中，使得VH片段被可操作地连接至载体中的一个或一些CH片段，并且该VK片段被可操作地连接至载体中的CL片段。作为附加或替代的手段，重组的表达载体可以编码一种信号肽，该信号肽有助于从一个宿主细胞中分泌该抗体链。可以将这些抗体链基因克隆进入该载体，使得该信号肽在框架内被连接至该抗体链基因的氨基末端。该信号肽可以是一种免疫球蛋白信号肽或者是一种异源的信号肽(即，来自非免疫球蛋白的信号肽)。
本披露的重组表达载体除了携带这些抗体链基因之外还携带在宿主细胞中控制这些抗体链基因表达的调节序列。术语“调节序列”意指包括启动子、增强子以及控制这些抗体链基因的转录或翻译的其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。这种调节序列被说明于，例如Goeddel(Gene Expression Technology.Methods in Enzymology185，AcademicPress，San Diego，CA(1990))中。本领域技术人员将会了解，该表达载体的设计，包括调节序列的选择，可能依赖于以下因素，如待转化的宿主细胞的选择、希望的蛋白质的表达水平等。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选的调节序列包括指导在哺乳动物细胞中蛋白质高水平表达的病毒的元件，例如衍生自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))及多瘤病毒的启动子和／或增强子。作为替代，可以使用非病毒调节序列，例如泛素启动子或β-珠蛋白启动子。再者，调节元件由来自不同来源的序列组成，例如SRα启动子系统，它包含来自SV40早期启动子及人类T细胞白血病病毒I型的长末端重复(Takebe，Y.et al.(1988)Mol.Cell.Biol.8：466-472)。
本披露的重组表达载体除了携带所述抗体链基因和调节序列之外，还可能携带额外的序列，例如在宿主细胞中调节载体复制的序列(例如，复制起始点)及可选择的标记基因。该可选择的标记基因有利于对其中已导入载体的宿主细胞的选择(参见例如，均为Axel等人的美国专利号4,399,216、4,634,665及5，179,017)。例如，典型地可选择的标记基因赋予已导入载体的宿主细胞，例如G418、潮霉素或甲氨喋呤的药物抗性。优选的可选择的标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(在dhfr-宿主细胞中用于甲氨喋呤选择／扩增)以及neo基因(用于G418选择)。为了表达这些轻链及重链，通过标准技术将编码这些重链及轻链的一个或多个表达载体转染进入一个宿主细胞中。术语“转染”的不同形式旨在涵盖范围宽广的多种技术，这些技术一般用于将外源DNA导入一个原核的或真核的宿主细胞，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等等。虽然在理论上可能无论在原核宿主细胞或在真核宿主细胞中都表达这一披露的抗体，但是在真核细胞中抗体的表达，并且最优选在哺乳动物宿主细胞中的表达，是最优选的，因为这种真核细胞，并且特别是哺乳动物细胞，比原核细胞更有可能组装并分泌适当折叠且具有免疫活性的抗体。已经报道了抗体基因的原核表达，不能有效产生大量活性抗体(Boss，M.A.and Wood，C.R.(1985)Immunology Today6：12-13)。
优选的用于表达本披露的重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，说明于Urlaub andChasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4216-4220，使用一种DHFR可选择的标记物，例如R.J.Kaufman and P.A.Sharp(1982)J.Mol.Biol.159：601-621中所说明)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞及SP2细胞。特别是，对于使用NSO骨髓瘤细胞而言，另一个优选的表达系统是在(Wilson的)WO87／04462、(Bebbington的)WO89／01036、以及(Bebbington的)EP338,841中披露的GS基因表达系统。在编码抗体基因的重组表达载体基因被引入哺乳动物宿主细胞时，通过对宿主细胞培养一段时间可以产生这些抗体，以使该抗体在该宿主细胞中得到表达，或者更优选地使该抗体分泌进入宿主细胞生活的培养基。使用标准的蛋白纯化方法可以从培养基中回收抗体。
抗体结合至抗原的表征
可以通过例如标准的流式细胞术方法测试本披露的抗体与CXCR4的结合。由于本披露的抗体优选地识别在膜中的处于天然构型的CXCR4，所以结合CXCR4的测试优选地是用一种测定(例如，流式细胞术)完成的，该试验利用了一个表达天然构型的CXCR4的反应物。可用于结合试验的表达天然构型的CXCR4的反应物的非限制性实例包括：天然表达CXCR4的细胞(例如CEM细胞)、已转染的表达CXCR4的细胞(例如，用一种CXCR4表达载体转染的R1610细胞)以及已结合有CXCR4的脂质体(例如，结合CXCR4的磁性蛋白磷脂体)，它们中每一种在这些实例中均有进一步详细说明。简言之，为了流式细胞术测定，将表达CXCR4的细胞与该测试抗体进行共孵育，洗涤，与能够结合该测试抗体的经标记的第二试剂进行共孵育，再次洗涤，并进行分析以检测该二级试剂与这些细胞的结合(例如，用FACS仪器)。优选地，将形成最高滴定度的小鼠(由流式细胞术评估的)用于融合或用于进一步选择抗体(例如，通过抗体文库的噬菌体展示筛选，这些抗体文库产自于小鼠的B细胞)。
以上说明的流式细胞术测定还可被用于筛选显示具有CXCR4免疫原的阳性反应性的杂交瘤。对表达抗体(该抗体以高亲合性结合至CXCR4)的杂交瘤进行亚克隆，并进一步进行表征。可以从每个杂交瘤中(通过流式细胞术)选择保持该母细胞的活性的一个克隆，用于制备5至10小瓶细胞库，保存于-140℃，并用于抗体纯化。
为了纯化抗-CXCR4抗体，可以将已选择的杂交瘤培养于2升的旋瓶中用于单克隆抗体纯化。可以将上清液进行过滤并浓缩，之后用蛋白A-琼脂糖(Pharmacia，Piscataway，N.J.)进行亲和层析。通过凝胶电泳和高效液相色谱可以检查被洗脱的IgG以确保纯度。可以将该缓冲液替换为PBS，并且通过OD280使用1.43消光系数确定其浓度。可以将单克隆抗体分成等份，并保存于-80℃。
为了确定已选择的抗-CXCR4单克隆抗体是否结合至独特的表位，使用可商购的试剂(Pierce，Rockford，IL)可以对每种抗体进行生物素化。使用未标记的单克隆抗体及生物素化的单克隆抗体进行的竞争性研究可以通过使用一种全细胞ELISA测定来进行，其中ELISA板用表达CXCR4的细胞进行包被，并且检测了未被标记的抗体与该生物素化的抗体进行竞争而结合该表达CXCR4的细胞的能力。使用链酶-亲和素-碱性磷酸酶探针可以检测生物素化的mAb的结合。
为了确定纯化的抗体的同种型，可以使用对特定同种型的抗体特异的试剂进行同种型ELISA。例如，为了确定一个人类单克隆抗体的同种型，用1μg／ml的抗-人类免疫球蛋白抗体在4℃下过夜可以对微量滴定板的孔进行包被。用1％BSA封闭后，该板与1μg／ml或更低的测试单克隆抗体或者经纯化的同种型对照在环境温度下反应1至2小时。随后将该孔与无论人IgGl或人IgM-特异的碱性磷酸酶偶联的探针进行反应。如以上所述对板进行显影并分析。
通过蛋白印迹法可以进一步测试抗-CXCR4人IgG与CXCR4抗原的反应性。简言之，可制备CXCR4并对其进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，将单独的抗原转移至硝酸纤维素膜上，用10％胎牛血清进行封闭，并用待测试的单克隆抗体进行探测。使用抗-人IgG碱性磷酸酶进行检测并用BCIP/NBT底物片进行显影(Sigma Chem.Co.，St.Louis，Mo.)可以检测人IgG结合。
本披露的抗体的结合特异性还可以通过监测该抗体与表达CXCR4的细胞的结合而测定，例如，通过流式细胞仪。典型地，一个细胞系，如CHO细胞系，可以用编码CXCR4的跨膜形式的表达载体进行转染。该转染的蛋白可能包含如myc标签的标签(优选地在N末端)，使用针对该标签的一种抗体进行检测。本披露的一种抗体与CXCR4的结合可以通过将这些已转染的细胞与该抗体进行孵育，并检测被结合的抗体而进行测定。可将抗体与经转染蛋白上的标签的结合用作一种阳性对照。
免疫偶联物
在另一方面，本披露的特征还在于偶联至治疗性部分的一种抗-CXCR4抗体，或其片段，该治疗性部分例如是细胞毒素、药物(例如，免疫抑制剂)、或放射性毒素。这种偶联物在此此被称为“免疫偶联物”。包括一种或多种细胞毒素的免疫偶联物被称为“免疫毒素”。细胞毒素或者细胞毒性物质包括任何对细胞有害(例如，杀死细胞)的物质。实例包括紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌、光辉霉素、放射菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔，及嘌呤霉素及它们的类似物或同系物。治疗性物质还包括，例如抗代谢物(如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨氮烯咪胺)、烷基化试剂(如氮芥、thioepa苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)及洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C，及顺铂(II)(DDP)、蒽环类抗生素(如柔红比星(以前称柔红霉素)及多柔比星)，抗生素(如更生霉素(以前称放线菌素)、博来霉素、光辉霉素，及安曲霉素(AMC))，以及抗有丝分裂剂(如长春新碱及长春碱)。
可与本披露的抗体相偶联的治疗性毒素的其他优选的实例包括多卡霉素(duocarmycin)、刺孢霉素、美登素及阿里斯达汀(auristatin)以及它们的衍生物。一种刺孢霉素抗体偶联物的实例是可商购的(American Home Products)。
使用本领域已知的连接技术可以将细胞毒素偶联至本披露的抗体上。已用于将细胞毒素偶联至抗体的连接物类型的实例包括但不限于：腙、硫醚、酯类，二硫化物及含有肽的连接物。可选择的连接物是，例如，在溶酶体区室中易被低pH值剪切的连接物，或者易被蛋白酶(例如，优先在肿瘤组织中表达的蛋白酶，例如组织蛋白酶(例如，组织蛋白酶B、C、D)剪切的连接物。
关于细胞毒素、连接物以及将治疗剂偶联至抗体的方法的进一步讨论，还参见(2003)Adv.DrugDeliv.Rev.55∶199-215；Trail，P.A.et al.(2003)Cancer Immunol.Immunother.52∶328-337；Payne，G.(2003)Cancer Cell3∶207-212；Allen，T.M.(2002)Nat.Rev.Cancer2∶750-763；Pastan，I.and Kreitman，R.J.(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs3∶1089-1091；Senter，P.D.and Springer，C.J.(2001)Adv.Drug Deliv.Rev.53∶247-264。
本披露的抗体还可以被偶联至一种放射性同位素上，以产生细胞毒性的放射性药物，也被称为放射免疫偶联物。可偶联至抗体上而用于诊断或治疗的放射性同位素的实例包括但不限于：碘131、铟111、钇90以及镥177。制备放射免疫偶联物的方法在本领域内已经确立。放射免疫偶联物的实例是可商购的，包括
Figure BSA0000101757350000681
(IDEC Pharmaceuticals)及
Figure BSA0000101757350000682
(Corixa Pharmaceuticals)，并且使用类似的方法可以制备用于本披露的抗体的放射免疫偶联物。
本披露的抗体偶联物可被用于修饰已有的生物学应答，并且该药物部分不应被构建为仅限于经典的化学治疗剂。例如，该药物部分可以是具有希望的生物活性的一种蛋白或多肽。这种蛋白可能包括，例如酶活性毒素，或其活性片段，例如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素，或白喉毒素；蛋白质，例如肿瘤坏死因子或干扰素-γ；或者生物反应调节剂，例如淋巴因子、白细胞介素-1(“IL-1”)、白细胞介素-2(“IL-2”)、白细胞介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)，或其他生长因子。
用于将这种治疗性部分偶联至抗体的技术是熟知的，参见例如，Arnon et al.，″Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs InCancer Therapy"，in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeldet al.(eds.)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom et al.，″Antibodies For Drug Delivery"，in Controlled Drug Delivery(2nd Ed.)，Robinson et al.(eds.)，pp.623-53(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，″Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy∶A Review"，inMonoclonal Antibodies′84∶Biological And Clinical Applicatiohs，Pincheraet al.(eds.)，pp.475-506(1985)；″Analysis，Results，And FutureProspective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In CancerTherapy"，in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin et al.(eds.)，pp.303-16(Academic Press1985)，and Thorpe etal.，Immunol.Rev.，62∶119-58(1982)。
双特异性分子
在另一方面，本披露的特征在于包括本披露的一种抗-CXCR4抗体，或其片段的双特异性分子。本披露的抗体，或其抗原结合部分可被衍生化或与另一种功能分子相连接，例如与另一种肽或蛋白质(例如，另一种抗体或一种受体的配体)相连接，以生成能够结合至少两种不同结合位点或靶分子的一种双特异性分子。事实上，本披露的抗体可能被衍生化或连接至其他多于一个的功能分子，以生成结合到多于两种的不同结合位点和／或靶分子的多特异性分子；本文所用的术语“双特异性分子”也旨在涵盖这类多特异性分子。为了生成本披露的双特异性分子，可将本披露的抗体与一个或多个其他的结合分子(例如另一种抗体、抗体片段、肽或结合模拟物)功能性地连接(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价连接等等)，由此得到双特异性分子。
因此，本披露包括双特异性分子，该双特异性分子包括针对CXCR4的至少一种第一结合特异性以及针对一个第二靶向表位的第二结合特异性。在本披露的一个具体实施方案中，该第二靶向表位是一种Fc受体，例如人类FcγRI(CD64)或人类Fcα受体(CD89)。因此，本披露包括的双特异性分子既能够结合至表达FcγR或FcαR的效应物细胞(例如单核细胞、巨噬细胞或多形核细胞(PMN))，又能够结合表达CXCR4的靶细胞。这些双特异性分子将表达CXCR4的细胞靶向效应物细胞，并触发Fc受体介导的效应物细胞活性，例如，表达CXCR4的细胞的吞噬作用、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、细胞因子的释放，或超氧化物阴离子的生成。
在本披露的一个实施方案(其中该双特异性分子是多特异性的)中，该分子除了包括抗-Fc结合特异性及抗-CXCR4结合特异性外，能进一步包括第三种结合特异性。在一个实施方案中，该第三结合特异性是抗增强因子(EF)部分，例如，结合至涉及细胞毒素活性的表面蛋白并由此增强针对该靶细胞的免疫应答的分子。“抗增强因子部分”可以是结合至给定分子(例如抗原或受体)的抗体、功能抗体片段、或配体，并且由此增强与Fc受体或靶细胞抗原的结合决定簇的效果。“抗增强因子部分”可以结合Fc受体或靶细胞抗原。作为替代，抗增强因子部分可以结合实体，该实体不同于与第一及第二结合特异性结合的实体。例如，抗增强因子部分可结合细胞毒性T细胞(例如，经CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-1或其他免疫细胞，导致针对该靶细胞的免疫应答的增强)。
在一个实施方案中，本披露的双特异性分子作为一种结合特异性包括至少一种抗体，或它的一个抗体片段，包括，例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、Fd、dAb或单链Fv。该抗体还可以是轻链或重链二聚物，或其任何最小片段，例如Fv或单链构建体，如在Ladner等人的美国专利号4,946,778所述，其内容明确地通过引用结合在此。
在一个实施方案中，Fcγ受体的结合特异性由一个单克隆抗体提供，其结合并未被人类免疫球蛋白G(IgG)所阻断。本文所使用的术语“IgG受体”是指位于染色体1上的8γ-链基因的任何基因。这些基因总共编码了12种跨膜或可溶性受体同种型，它们被分为三类Fcγ受体：FcγRI(CD64)、FcγR II(CD32)，及FcγRIII(CD16)。在一个优选的实施方案中，该Fcγ受体是人类高亲合性FcγRI。人类FcγRI是一种72kDa的分子，它对单体IgG具有高亲合性(108至109M-1)。
在Fanger等人的PCT公开号WO88／00052和美国专利号4,954,617中说明了某些优选的抗-Fcγ单克隆抗体的制备及表征，其中传授的内容都通过引用全部结合在此。这些抗体结合至FcγRI、FcγR II及FcγIII的一个表位，结合位点区别于受体的Fcγ结合位点，并因此它们的结合基本上不会被生理水平的IgG所阻断。在本披露中有用的特异性抗-FcγRI抗体是mAb22、mAb32、mAb44、mAb62及mAb197。产生mAb32的杂交瘤可以从美国典型培养物保藏中心获得，ATCC保藏号HB9469。在其他实施方案中，抗-Fcγ受体抗体是单克隆抗体22(H22)的人源化形式。H22抗体的制备及表征说明于Graziano，et al.J.Immunol155(10)：4996-5002，(1995)及Tempest等人的PCT公开号WO94／10332中。产生H22抗体的细胞系被命名为HA022CL1，保藏于美国典型培养物保藏中心，保藏号为ATCC No.CRL11177。
在另外的其他实施方案中，对Fc受体的结合特异性由结合至人IgA受体的抗体提供，该人IgA受体例如是Fcα受体(FcαRI(CD89))，这种结合优选不会被人类免疫球蛋白A(IgA)所阻断。术语“IgA受体”旨在包括位于染色体19上的一个α基因(FcαRI)的基因产物。已知这一基因对几种55至110kDa的可替代地剪接的跨膜受体同种型进行编码。FcαRI(CD89)在单核细胞／巨噬细胞、嗜酸性粒细胞及嗜中性粒细胞上进行组成性地表达，但在非效应物细胞类群上不表达。FcαRI对于IgA1和IgA2均具有中等亲合力(≈5×107M-1)，该亲合力在暴露至细胞因子例如G-CSF或GM-CSF时会增加(Morton，H.C.et al.(1996)Critical Reviews in Immunology16∶423-440)。已经说明了四种FcαRI特异的单克隆抗体，被鉴定为A3、A59、A62及A77，它们结合IgA配体结合结构域外侧的FcαRI(Monteiro，R.C.et al.(1992)J.Immunol.148∶1764)。
在本披露的双特异性分子的使用中，FcαRI及FcγRI是优选的触发受体，因为它们：(1)主要表达于免疫效应物细胞(例如单核细胞、PMN、巨噬细胞和树突细胞)；(2)表达水平高(例如5,000至100,000／细胞)；(3)细胞毒性活性的介导物(例如ADCC、吞噬作用)；以及(4)介导靶向它们的抗原(包括自体抗原)的增强抗原呈现。
虽然人类单克隆抗体是优选的，但是其他抗体(鼠类抗体、嵌合抗体、以及人源化抗体)也可用于本披露的双特异性分子。
使用本领域中已知的方法通过偶联该组成性结合的特异性(例如，抗-FcR及抗-CXCR4结合特异性)可以制备本披露的双特异性分子。例如，可以单独地生成双特异性分子中的每一种结合特异性，并接着将它们偶联在一起。当该结合特异性是蛋白质或肽时，可以使用多种偶合试剂或交联试剂来进行共价偶联。交联试剂的实例包括蛋白A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5，5’-二硫双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻-亚苯基二马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)及4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-SMCC)(参见例如，Karpovsky et al.(1984)J.Exp.Med.160∶1686；Liu，MA et al.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82∶8648)。其他方法包括在Paulus(1985)Behring Ins.Mitt.No.78，118-132；Brennan et al.(1985)Science229∶81-83，及Glennie et al.(1987)J.Immunol.139∶2367-2375)中说明的方法。优选的偶联试剂是SATA及磺基-SMCC，都可从PierceChemical Co.(Rockford，IL)公司购得。
当这些结合特异性是抗体时，它们可以通过两个重链的C末端铰链区的二硫键相偶联。在一个特别优选的实施方案中，在偶联之前对铰链区进行改造，使其含有奇数个巯基残基，优选地含有一个巯基残基。
作为替代，两种结合特异性分子均可以在相同的载体中被编码并在同一宿主细胞中被表达并组装。当双特异性分子是mAb×mAb、mAb×Fab、Fab×F(ab’)2或配体×Fab融合蛋白时，这一方法特别有用。本披露的一种双特异性分子可以是包括一种单链抗体及一个结合决定簇的单链分子，或包括两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可能包括至少两种单链分子。制备双特异性分子的方法说明在例如美国专利号5,260,203；5,455,030；4,881，175；5，132,405；5,091，513；5,476,786；5,013,653；5,258,498及5,482,858中，所有文献都明确地通过引用结合在此。
双特异性分子结合至它们的特异性靶，可以通过下列方法来确认，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、FACS分析、生物测定(例如生长抑制)或蛋白质印迹分析。这些测定中每一种测定通常均通过采用对感兴趣的蛋白-抗体复合物特异的已标记的试剂(例如，一种抗体)，检测特定感兴趣的复合物的存在。例如，可以使用例如识别并特异地结合至抗体-FcR复合物的酶联抗体或抗体片段来检测FcR-抗体复合物。作为替代，使用多种其他免疫测定中的任何测定可以检测这些复合物。例如，该抗体可被放射性标记，并用于放射免疫测定(RIA)(参见例如，Weintraub，B.，Principles of Radioimmunoassays，Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques，The EndocrineSociety，March，1986，它通过引用结合在此)。可以使用例如γ计数器、或闪烁计数器、或通过放射自显影来检测放射性同位素。
药物组合物
在另一方面，本披露提供了一种组合物(例如一种药物组合物)，该组合物包括本披露的一种单克隆抗体或多种单克隆抗体的一个组合或它们的一个或多个抗原结合部分，并与一种药学上可接受的载体配制在一起。这种组合物可包括本披露的一种抗体或多种(即：两种或更多种不同的)抗体的一个组合、或多种免疫偶联物、或多种双特异性分子。例如，本披露的一个药物组合物可以包含多种抗体(或免疫偶联物、或双特异性分子)的一个组合，这些抗体与靶抗原上的不同表位结合，或具有互补的活性。
还可以在联合治疗中给予本披露的药物组合物(即，与其他试剂组合)。例如，该组合疗法可以包括本披露的一种抗-CXCR4抗体，该抗-CXCR4抗体与至少一种其他抗炎性或免疫抑制剂组合。以下在本披露的该抗体使用的章节中对可用于联合治疗的治疗药剂的实例进行了更加详尽的说明。
本文所使用的“在药学上可接受的载体”包括任何及全部的在生理学上相容的溶剂、分散介质、涂料、抗细菌剂及抗真菌剂、等渗剂及吸收延缓剂等。优选地，该载体适宜于经静脉、肌内、皮下、胃肠外、脊髓或表皮给药(例如通过注射或输注)。依据给药途径，活性化合物(即抗体、免疫偶联物、或双特异性分子)可用材料包被以保护该化合物免受可能使该化合物失活的酸及其他自然条件的作用。
本披露的药物化合物可能包括一种和多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是指一种盐，它保持了母体化合物的希望的生物活性并不会给予任何不希望的毒物学效应(参见例如Berge，S.M.，et al.(1977)J.Pharm.Sci.66∶1-19)。这种盐的实例包括酸加成盐及碱加成盐。酸加成盐包括源自无毒无机酸的盐，例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸及亚磷酸等，以及源自无毒有机酸的盐，例如脂肪族单羧酸及二羧酸、苯基被取代的烷醇酸、羟基烷醇酸、芳香酸、脂肪族及芳香族磺酸等。碱性加成盐包括源自碱土金属的盐，例如钠、钾、镁及钙等的盐，以及源自无毒有机胺的盐，例如N，N′-二苄基乙二胺、N-甲基葡萄糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、氨茶碱及普鲁卡因等。
本披露的一种药物组合物还可包括药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性的抗氧化剂，例如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠及亚硫酸钠等；(2)脂溶性的抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)，丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯及α-生育酚等；以及(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸及磷酸等。
在本披露的药物组合物中可以采用的适宜的水性及非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇及聚乙二醇等)及它们的适宜的混合物，植物油，如橄榄油，以及可注射的有机酯，如油酸乙酯。例如，通过使用包被材料(如卵磷脂)、通过维持分散系中所需颗粒的大小、以及通过使用表面活性剂，可维持适当的流动性。
这些组合物还可能包含佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂及分散剂。通过灭菌程序(见以上)，以及通过加入不同抗细菌剂及抗真菌剂(如羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等)均可能确保防止微生物的存在。将等渗剂(如糖及氯化钠等)包含进入这些组合物中也可能是令人希望的。另外，通过包含延迟吸收的试剂(如单硬脂酸铝及明胶)可能实现可注射药物剂型的延长吸收。
药学上可接受的载体包含无菌水溶液或分散液及用于无菌注射溶液或分散液的即时配制的无菌粉末。用于药学活性物质的这种介质及试剂的用途在本领域中是已知的。除了与活性化合物物不相容的任何常规介质或试剂外，考虑它在本披露的药学组合物种的用途。还可以在这些组合物中加入辅助性活性化合物。
治疗的组合物典型地必须是无菌的并且在制造及存储条件下是稳定的。该组合物可以被配制成溶液、微乳、脂质体，或者其他适宜高药物浓度的有序结构。该载体可以是溶剂或分散介质，包含例如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、以及液体聚乙二醇等)，以及它们的适宜的混合物。例如，通过使用一种包被(如卵磷脂)、通过维持分散系中所需颗粒的大小并通过使用表面活性剂，可维持该适合的流动性。在许多情况下，将优选在组合物中包含等渗试剂，例如糖、多元醇(如甘露醇、山梨醇)，或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中包含延迟吸收的试剂(如单硬脂酸盐及明胶)来实现。
通过在适当的溶剂中将所需量的活性化合物与以上列举的多种组分中的一种组分或多个组分的一个组合(按照需要)相结合、然后进行无菌微过滤，可以制备无菌注射液。总体上，分散液是通过将活性化合物结合进入至无菌媒介物(它包含基础分散介质及上述列举组分中的所需的其他组分)来制备。当用于制备无菌注射液的无菌粉末时，优选的制备方法是真空干燥及冷冻干燥(冻干)，制得该活性组分及任何来自其预先无菌过滤的溶液的其他希望的组分的粉末。
与载体物质组合以产生单一剂型的活性组分的量值将随着正在接受治疗的受试者及给药的特定方式而变化。与载体物质组合以产生单一剂型的活性组分的量一般是产生治疗效果的组合物的量。总体上讲，在100％的数量内，与药学上可接受的载体组合的活性组分的量大约是在从约0.01％至约99％的范围内，优选从约0.1％至约70％，最优选从约1％至约30％。
对剂量方案进行调节以提供最佳的希望的反应(如治疗反应)。例如，可给予单一的大丸药，可以随时间分剂量给予，或者根据治疗情况的紧急程度所示按比例减少或增加剂量。为给药方便以及剂量统一而按剂量单位形式配制成肠胃外用组合物尤为有利。本文所使用的剂量单位形式是指用于待治疗的受试者的物理上不连续的单位；每个单位包含经计算能产生与所需的药学载体相联系的希望的疗效的预定量的活性化合物。本披露的剂量单位形式的规格由以下因素决定并直接取决于以下因素：(a)活性组合物独特的特征及待实现的特定疗效，以及(b)配制这种用于治疗个体敏感度的活性物质的领域的固有的局限性。
对于该抗体的给药，根据使用者的体重，剂量在约0.0001至100mg／kg的范围内，并且更经常是0.01至25mg／kg。例如，剂量可以是0.3mg／kg体重、1mg／kg体重、3mg／kg体重、5mg／kg体重、或10mg／kg体重、或者在1至10mg／kg的范围内。一种示例性治疗方案限定为每周给药一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每三个月一次或每3至6个月一次。本披露的抗-CXCR4抗体的优选的剂量方案包括通过静脉给药1mg／kg体重或3mg／kg体重，利用以下剂量方案之一使用被给予的抗体：(i)每4周给予6个剂量，之后每3个月给药；(ii)每三周给药；(iii)3mg／kg体重一次给药，接着每三周按1mg／kg体重给药。
在一些方法中，两种或多种具有不同结合特异性的单克隆抗体被同时给药，在这种情况下，所给予的每种抗体的剂量都在所给出的范围之内。通常在多个时间点给予抗体。单个剂量之间的间隔可以是，例如一周、一个月、每三个月或一年。通过测量患者的针对靶抗原的抗体的血液水平所示，间隔也是不规则的。在一些方法中，调整剂量使血浆抗体浓度大约是1至1000μg／ml，并且在一些方法中大约是25至300μg／ml。
可替代地，抗体可以作为缓释制剂给药，在这种情况中需要以较低频率给药。剂量及频率随抗体在患者体内的半衰期而变。，人类抗体的半衰期最长，其次是人源化抗体、嵌合抗体、以及非人类抗体。给药的剂量及频率可根据治疗是预防性的或是治疗性的而变化。预防性的实施中，在很长的一段时间内以相对较不频率的间隔给予相对少的剂量。一些患者在其余生中继续接受治疗。在治疗性的应用中，有时需要在相对短的间隔内的相对高的剂量，直至病情缓减或终止，并且优选地直至患者表现出部分或完全的疾病症状的改善。此后，可以给予患者预防性的方案。
可以改变本披露的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平，以获得针对一个特定患者、组合物，及给药方式实现希望的治疗反应的有效的活性组分的量值，而对患者无毒。所选的剂量水平将取决于多种药物代谢动力学因素，包括所采用的本披露的特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性、给药途径、给药时间、所采用的特定化合物的排泄速率、疗程、以及在所采用的特定组合物的组合中使用的其他药物、化合物和／或材料、正在接收治疗的患者的年龄、性别、体重、状态、总体健康状态和病史，以及在医学领域熟知的类似因素。
本披露的一种抗-CXCR4抗体的“治疗有效剂量”优选地导致减轻疾病症状的严重程度、延长无疾病症状时间的频率及持续时间、或防止由于该病痛产生的损害或残疾。例如，对于CXCR4阳性肿瘤的治疗而言，与未被治疗的受试者相比，“治疗有效剂量”优选地抑制细胞生长或肿瘤生长至少约20％，更优选至少约40％，甚至更优选至少约60％，以及仍更优选至少约80％。化合物抑制肿瘤生长的能力可在预测人类肿瘤功效的动物模型系统中进行评价。可替代地，组合物的这一特性可通过检验该化合物抑制肿瘤生长的能力来评价，这种抑制可由有经验的从业者通过已知方法进行体外测定。治疗有效量的治疗化合物可减小肿瘤的大小，或者缓解受试者的症状。本领域的普通技术人员应能根据诸如受试者的大小、受试者症状的严重程度，及具体的组合物或所选择的给药途径的因素确定这种量值。
使用本领域已知的一种或多种方法通过一种或多种给药途径可以对本披露的组合物进行给药。如本领域技术人员可以理解的，给药途径和／或给药方式将随所希望的结果而变化。本披露的抗体的优选给药途径包括静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、脊髓或其他胃肠外给药途径(例如通过注射或输注)。本文所使用的短语“胃肠外给药”是指除了肠内及局部给药外其他给药方式，通常通过注射，并包括但不限于静脉内、几内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、皮内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下腔、脊柱内、硬膜外及胸骨内注射及输注。
作为替代，可经非胃肠外途径给予本披露的抗体，非胃肠外途径例如局部、表皮或粘膜途径给药，例如经鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部给药。
活性化合物可用载体制备，该载体将保护化合物免于快速释放，例如受控释放制剂，包括植入剂、经皮贴剂、以及微囊化递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容性的聚合物，例如乙烯-醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯，以及聚乳酸。用于制备这类配置品的许多方法已获得专利，或者是本领域技术人员所熟知。参见例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
可利用本领域中已知的医用装置给予治疗性组合物。例如，在一个优选的实施方案中，可利用无针皮下注射装置给予本披露的治疗性组合物，例如在美国专利号5，399,163；5，383，851；5，312,335；5,064,4l3；4,941,880；4,790,824；或4,596,556中披露的装置。在本披露中有用的熟知的植入剂及模型的实例包括：美国专利号4,487,603，它披露了用于以受控速度释放药物的一种可植入式微量输注泵；美国专利号4,486,194，它披露了用于通过皮肤给予药物的一种治疗装置；美国专利号4,447,233，它披露了用于以精确的输注速度送递药物的一种药物输注泵；美国专利号4,447,224，它披露了用于持续药物送递的可变流速的可植入式输注装置；美国专利号4,439,196，它披露了具有多腔区室的渗透药物送递系统；以及美国专利号4,475,196，它披露了一种渗透药物送递系统。这些专利通过引用结合在此。许多其他这类植入剂、送递系统，及模型是本领域技术人员已知的。
在一些实施方案中，可以对本披露的人类单克隆抗体进行配制以确保在体内的适当分布。例如，血脑屏障(BBB)阻止了许多高度亲水性的化合物。为确保本披露的治疗性化合物通过BBB(如果需要的话)，它们可以被配制成，例如在脂质体中。生产脂质体的方法，参见例如，美国专利号4,522,811；5,374,548；以及5,399,331。这些脂质体可能包含一个或多个部分，这些部分被选择性输送到特定的细胞或器官中，由此增强靶标药物的递送(参见例如，V.V.Ranade J.Clin.Pharmaco1.29：685，(1989))。示例性的靶向部分包括叶酸盐或生物素(参见，例如Low等人的美国专利号5，416,016)；甘露糖苷(Umezawa et al.，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153∶1038)；抗体(P.G.Bloeman et al.(1995)FEBS Lett.357∶140；M.Owais et al.(1995)Antimicrob.AgentsChemother.39∶180)；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe et al.(1995)Am.J.Physiol.1233∶134)；p120(Schreier et al.(1994)J.Biol.Chem.269∶9090)；还参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346∶123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods4∶273。
用途及方法
本披露的抗体，特别是人类抗体、抗体组合物以及方法具有与诊断和治疗CXCR4介导的病症相关的多种在体外和体内诊断和治疗用途。例如，可在体外或离体地将这些分子给予至培养的细胞，或者例如体内，给予人类受试者，以治疗、预防并诊断多种病症。在此使用的术语“受试者”旨在包括人类及非人类动物。非人类动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物及非哺乳动物，例如，非人灵长类动物、绵羊、犬、猫、牛、马、鸡、两栖动物以及爬行动物。优选的受试者包括人类患者，这些患者患有由CXCR4活性介导或调节的病症、或涉及CXCR4／SDF-1通路的病症。当针对CXCR4的抗体与另一种药剂联合给药时，这两种物质可相继或者同时给药。
考虑到本披露的抗体对CXCR4的特异性结合，本披露的抗体可用于在细胞表面专门检测CXCR4的表达情况，而且，还可用于通过免疫亲和纯化来纯化CXCR4。
在体内或体外给予本披露的抗体组合物(例如人单克隆抗体、多特异性及双特异性分子、以及免疫偶联物)的适宜途径在本领域中是所熟知，并且可由那些普通技术人员选择。例如，可通过注射(例如经静脉内或皮下)给予这些抗体组合物。所用的分子的适宜剂量将取决于该受试者的年龄及体重、以及该抗体组合物的浓度和／或配方。
如前所述，本披露的人类抗-CXCR4抗体可与一种或其他多种治疗剂(例如细胞毒剂、放射性毒剂、或免疫抑制剂)共同给药。该抗体可给连接至该治疗剂(作为免疫复合物)，或者可与该治疗剂分开给药。在后一种情况(分开给药)下，可在给予该治疗剂之前、之后或同时给予该抗体，或者可以与其他已知疗法例如抗癌疗法(如辐射)共同给药。除其他之外，这种治疗剂包括抗肿瘤剂，例如多柔比星(阿霉素)、顺铂硫酸博来霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、以及环磷酰胺羟基脲，它们自身只在对患者有毒性或亚毒性的水平时才是有效的。以每四周一次100mg／kg的剂量经静脉内给予顺铂，并且以每21天一次60-75mg／ml的剂量经静脉内给予阿霉素。本披露的人类抗-CXCR4抗体，或它们的抗原结合片段与化学治疗剂的共同给药提供了两种抗癌治疗剂，这两种抗癌治疗剂通过不同的机制起作用，产生针对人类肿瘤细胞的细胞毒效应。这种共同给药可解决由于对药物发展了抗药性或由于肿瘤细胞的抗原性的变化(这种变化会导致这些肿瘤细胞与该抗体不反应)所引起的问题。
本披露的靶标特异性效应细胞，例如与组合物(例如，人类抗体、多特异性分子、以及双特异性分子)相连的效应细胞，也可被用作治疗剂。用于靶向的效应细胞可以是人类白细胞，例如，巨噬细胞、嗜中性粒细胞或单核细胞。其他细胞包括嗜酸性粒细胞、天然杀伤细胞以及其他带有IgG-或IgA-受体的细胞。如果需要，效应细胞可从待治疗的受试者体内获得。这些靶特异的效应细胞可作为在生理学上可接受的溶液中的细胞悬液来给药。给予的细胞数可以是108至109数量级，但会根据治疗目的有所变化。通常，该量值足以定位于该靶细胞(例如表达CXCR4的肿瘤细胞)，并且通过例如吞噬作用产生细胞杀伤作用。给药途径也可以改变。
靶标特异性效应细胞的疗法可与其他去除靶细胞的技术联合进行。例如，使用本披露的组合物(例如，人类抗体、多特异性分子、以及双特异性分子)和／或带有这些组合物的效应细胞的抗肿瘤疗法可以与化学疗法联合使用。此外，联合免疫疗法可用于指导两种不同的细胞毒性效应群对肿瘤细胞的排斥作用。例如，与抗-FcγRI或抗-CD3相连的抗-CXCR4抗体可与IgG-或IgA-受体特异的结合剂联合使用。
本披露的双特异性分子及多特异性分子也可用于调节效应细胞上的FcγR或FcγR水平，例如通过对细胞表面的受体进行的遮蔽及清除。抗-Fc受体的混合物也可用于这一目的。
在补体存在时，还可使用具有补体结合位点的本披露的组合物(例如，人类抗体、或嵌合抗体、多特异性及双特异性分子、以及免疫偶联物)，这些补体结合位点例如来自IgG1、IgG2、或IgG3、或IgM的结合补体的部分。在一个实施方案中，细胞群(包括具有本披露的结合试剂的靶细胞及合适的效应细胞)的活体外治疗可通过添加补体或包括补体的血清来补充。包被有本披露的结合试剂的靶细胞的吞噬作用可通过补体蛋白质结合得以提高。在另一个实施方案中，包被有本披露的组合物(例如人抗体、多特异性及双特异性分子)的靶细胞还可被补体裂解。在又一实施方案中，本披露的组合物不激活补体。
本披露的组合物(例如，人类抗体、或嵌合抗体、多特异性及双特异性分子以及免疫偶联物)也可与补体一起给药。因此，在本披露的范围内是包含人类抗体、多特异性或双特异性分子及血清或补体的组合物。这些组合物是有利的，因为补体位于接近人类抗体、多特异性或双特异性分子的位置。可替代地，本披露的人类抗体、多特异性或双特异性分子、与补体或血清，可以被分开给药。
本披露的抗体也可以与一种或多种另外的治疗性抗体或其他结合试剂(例如Ig融合蛋白)联合使用。其他抗体或结合试剂(本披露的一种抗-CXCR4抗体可以与其进行组合给药)的非限制性实例包括针对CTLA-4、PSMA、CD30、IP-10、IFN-γ、CD70、PD-1、PD-L1、TNF、TNF-R、VEGF、VEGF-R、CCR5、IL-1、IL-18、IL-18R、CD19、Campath-1、EGFR、CD33、CD20、Her-2、CD25、gpIIb／IIIa、IgE、CD11a、α4整联蛋白、IFNα、以及IFNAR1的抗体或结合剂。
同样在本披露范围内的是包含本披露的抗体组合物(例如人抗体、双特异性或多特异性分子，或免疫偶联物)及使用说明书的试剂盒。该试剂盒可以进一步包括一种或更多种其他的试剂，例如免疫抑制试剂、细胞毒素剂或放射性毒素剂、或一种或更种本披露的其他的人类抗体(例如，与该第一人类抗体明显不同的具有与该CXCR4抗原中的一个表位结合的有互补活性的人类抗体)。
因此，由本披露的抗体组合物治疗的患者可(在给予本披露的人类抗体之前、同时或之后)额外地给予另一种治疗性试剂，例如细胞毒性剂或放射毒性剂，这增强或放大这些人类抗体的治疗效果。
在其他实施方案中，可以用一种试剂对该受试者进行额外的治疗，该试剂通过例如用一种细胞因子治疗该患者，对Fcγ或Fcγ受体的表达或活性进行调整(例如增强或抑制)。治疗时优选与多特异分子联合给药的细胞因子包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-γ(IFN-γ)、以及肿瘤坏死因子(TNF)。
本披露的组合物(例如人抗体、多特异性及双特异性分子)还可用于靶向表达CXCR4的细胞，例如为了标记这种细胞。对于这种用途，可将该结合剂与一种可被检测的分子相连。因此，本披露提供了活体外或体外定位表达CXCR4的细胞的方法。该可检测的标记可以是，例如放射性同位素、荧光化合物、酶、或酶辅助因子。
在一个具体的实施方案中，本披露提供了检测存在于一个样本中的CXCR4抗原、或者测量CXCR4抗原的量的方法，这些方法包括：将该样本以及一个对照样本与一个人类单克隆抗体或其抗原结合部分相接触，该抗体或抗原结合部分在其与CXCR4之间可形成复合物的条件下特异性地结合到CXCR4上。然后检测复合物的形成，其中与对照样本相比，在该样本之间形成差异复合物指示在该样本中存在CXCR4抗原。
在又另一个实施方案中，本披露的免疫偶联物可被用于通过将这种化合物连接至该抗体，将化合物(例如，治疗剂、标记物、细胞毒素、放射性毒素、免疫抑制剂等)靶向具有CXCR4细胞表面受体的细胞。因此，本披露还提供了在体外或体内定位表达CXCR4的细胞的方法(例如，具有可检测的标记，例如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子)。作为替代，该免疫偶联物可被用于通过将细胞毒素或放射性毒素靶向CXCR4而杀伤具有CXCR4细胞表面受体的细胞。
已知CXCR4表达于种类广泛的肿瘤细胞类型上，并且还已知参与了肿瘤的转移。此外，作为HIV进入T细胞的一种辅助受体，已知CXCR4参与了HIV感染。另外，已经显示CXCR4／SDF-1通路参与了炎性的病症。再者，已经显示CXCR4／SDF-1通路参与了血管发生或新生血管形成。因此，在这些临床情况(如下所列)的每一种情况中，本披露的抗-CXCR4抗体(与免疫偶联物以及双特异性分子)可以被用来调节CXCR4活性，这些临床情况包括：
A.癌症
已经显示CXCR4可由种类广泛的癌症类型表达，并且在某些情况下，在CXCR4表达与患者的预后或存活之间已经建立了负相关性关系。与CXCR4表达相关的癌症类型的非限制性实例包括：乳癌(Muller，A.et al.(2001)Nature410∶50-56)；ovarian(Scotton，C.et al.(2001)Br.J.Cancer85∶891-897；前列腺癌(Taichman，R.S.et al.(2002)CancerRes.62∶1832-1837；非小细胞肺癌(Spano J.P.et al.(2004)Ann.Oncol.15∶613-617)；胰腺癌(Koshiba，T.et al.(2000)Clin.Cancer Res.6∶3530-3535)；甲状腺癌(Hwang，J.H.et al.(2003)J.Clin.Endocrinol.Metab.88∶408-416)；鼻咽癌(wang，N.et al.(2005)J.Transl.Med.3∶26-33)；黑色素瘤(Scala，S.et al.(2005)Clin.Cancer Res.11∶1835-1841)；肾细胞癌(Staller，P.et al.(2003)Nature425∶307-311)；淋巴瘤(Bertolini，F.et al.(2002)Cancer Res.62∶3530-3535)；神经母细胞瘤(Geminder，H.et al.(2001)J.Immunol.167∶4747-4757)；胶质母细胞瘤(Rempel，S.A.et al.(2000)Clin.Cancer Res.6∶102-111)；横纹几肉瘤(Libura，J.et al.(2002)Blood100∶2597-2606)；结肠直肠癌(Zeelenberg，I.S.et al.(2003)Cancer Res.63∶3833-3839)；肾癌(Schrader，A.J.et al.(2002)Br.J.Cancer86∶1250-1256)；骨肉瘤(Laverdiere，C.et al.(2005)Clin.Cancer Res.11∶2561-2567)；急性淋巴母细胞白血病(Crazzolara，R.et al.(2001)Br.J.Haematol.115∶545-553)；以及急性髓细胞性白血病(Rombouts，E.J.C.et al.(2004)Blood104∶550-557)。
因此，本披露的抗-CXCR4抗体还被用于治疗癌症，包括但不限于一种癌症，它选自下组，其构成为乳房癌、卵巢癌、前列腺癌、非-小细胞肺癌、胰腺癌、甲状腺癌、鼻咽癌、黑色素瘤、肾细胞癌、淋巴瘤、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、横纹肌肉瘤、结肠直肠癌、肾癌、骨肉瘤、急性淋巴母细胞性白血病以及急性髓细胞性白血病。该抗体可以单独使用或与其他癌症治疗方法(诸如手术和／或放射)联合使用，和／或与其他抗-肿瘤的试剂(例如以上所讨论并给出的抗-肿瘤试剂)联合使用，其他抗-肿瘤的试剂包括化学治疗的药物以及其他抗肿瘤的抗原抗体，诸如那些结合CD20、Her2、PSMA、Campath-1、EGFR等的抗体。
B.病毒的感染，包括HIV感染
已经显示CXCR4作为HIV进入T细胞的一种辅助受体并且，另外，已经证明某些鼠类抗-CXCR4抗体能够抑制HIV分离进入T细胞(参见Hou，T.et al.(1998)J.Immunol.160∶180-188；Carnec，X.et al.(2005)J.Virol.79∶1930-1938)。因此，CXCR4可以作为一种受体被病毒使用，用于进入该细胞，并且针对CXCR4的抗体可以被用于抑制这种将CXCR4用作一种受体的病毒进入细胞。因此，本披露的抗-CXCR4抗体可以被用于抑制一种病毒进入一个细胞，其中该病毒将CXCR4用作进入细胞的一种受体，使得病毒的感染受到抑制。在一个优选的实施方案中，这些抗体被用于抑制HIV病毒进入T细胞，例如，在治疗或预防HIV／AIDS时。该抗体可以被单独使用或与其他抗病毒试剂(例如抗逆转录病毒药物，例如AZT或蛋白酶抑制剂)联合使用。
C炎性病症
已经显示CXCR4／SDF-1通路在多种炎性病症中发挥作用，炎性病症包括但不限于炎性肝脏疾病(Terada，R.et al.(2003)Lab.Invest.83∶665-672)；自身免疫性关节炎症(Matthys，P.et al.(2001)J.Immunol.167∶4686-4692)；过敏性气道疾病(Gonzalo，J.A.et al.(2000)J.Immunol.165∶499-508)；以及牙周疾病(Hosokawa，Y.et al.(2005)Clin.Exp.Immunol.141∶467-474)。
因此，抑制SDF-1与CXCR4结合的本披露的人类抗-CXCR4抗体，可以被用于抑制炎性疾病中的炎症，这些炎性疾病包括疾病选自下组，其构成为：炎性肝脏疾病、自身免疫性关节炎症、过敏性气道疾病、牙周疾病、类风湿性关节炎、炎性肠病、系统性红斑狼疮、I型糖尿病、炎性皮肤疾病(例如，银屑癣、扁平苔藓)、自身免疫性甲状腺疾病、干燥综合征、肺部炎症(例如，慢性阻塞性肺病、肺结节病、淋巴细胞性肺泡炎)以及炎性肾脏疾病(例如，IgA肾病、肾小球肾炎)。该抗体可以被单独使用或与其他抗炎试剂联合使用，其他抗炎试剂例如非甾体抗炎药物(NSAID)、皮质类固醇(例如，泼尼松、氢化可的松)、甲氨蝶呤、COX-2抑制剂、TNF拮抗剂(例如，依那西普、英利昔单抗、阿达木单抗)以及免疫抑制剂(例如，6-巯嘌呤、硫唑嘌呤以及环孢霉素A)。
D.血管发生
已经证明SDF-l通过募集表达CXCR4的成血管细胞而诱导新生血管形成(Jin，D.K.et al.(2006)Nat.Med.12∶557-567)。此外，阻断SDF-l／CXCR4通路可以在体内以一种非VEGF依赖的方式通过抑制血管发生，在体内缓解肿瘤生长(Guleng，B.et al.(2005)Cancer Res.65∶5864-58-71)。再者，如实例2所证明，本披露的抗体能够在体外抑制毛细管的形成。因此，可以使用抑制SDF-1结合到CXCR4的本披露的抗-CXCR4抗体通过干扰SDF-1／CXCR4通路而抑制血管发生。对血管发生的抑制作用可以被用于，例如，抑制肿瘤生长或肿瘤转移(无论该肿瘤是否是CXCR4阳性的)。该抗体可以被单独使用或与其他抗血管原的试剂(例如抗-VEGF抗体)联合使用。
E自体的干细胞移植
外周血干细胞是用于自体干细胞移植(例如在某些血液的恶性病的治疗中)的优选的干细胞来源。从外周血收集干细胞需要动员CD34阳性的的干细胞从骨髓进入外周血。这一过程的调节中已经说明了不同的细胞因子、趋化因子以及粘附分子(在Gazitt，Y.(2001)J.Hematother.Stem Cell Res.10∶229-236中进行综述)，包括CXCR4与SDF-1的相互作用。而且，已经证实小分子CXCR4拮抗剂刺激CD34阳性的干细胞从骨髓向外周血的快速动员(参见，例如Devine，S.M.et al.(2004)J.Clin.Oncol.22∶1095-1102；Broxmeyer，H.E.et al.(2005)J.Exp.Med.201∶1307-1318；Flomenberg，N.et al.(2005)Blood106∶1867-1874)。因此，抑制CXCR4活性(即，拮抗剂抗体)的本披露的抗-CXCR4抗体，可以被用于刺激CD34阳性的干细胞从骨髓向外周血的动员，以允许这种干细胞用于移植(例如，自体的移植)，例如在诸如多发性骨髓瘤及非霍奇金淋巴瘤的血液病症的治疗中。该抗体可以被单独使用或与用于刺激干细胞动员的其他试剂联合使用，这些试剂例如G-CSF和／或GM-CSF。因此，在另一个实施方案中，本披露提供了刺激CD34阳性的干细胞从受试者体内的骨髓向外周血动员的一种方法，该方法包括给予该受试者一种本披露的抗-CXCR4抗体，使得CD34阳性的干细胞从骨髓向外周血的动员受到刺激。该方法可以进一步包括从外周血收集CD34阳性的干细胞，例如用于自体的干细胞移植。
通过以下不应被解释为进一步限定的实例，对本披露进行了进一步阐述。本申请通篇引用的所有附图及所有参考文献、专利及已公开的专利申请的内容均通过引用明确地结合在此。
实例
实例1：针对CXCR4的人类单克隆抗体的产生
使用一种组合方法产生抗-CXCR4人类单克隆抗体，其中首先，表达人类抗体基因的小鼠被免疫，以在小鼠中产生对人类CXCR4特异的人类免疫球蛋白的表达谱，并接着第二步，从小鼠的脾细胞制备一个人类抗体文库，并展示于噬菌体，使得该噬菌体接着筛选对CXCR4特异的抗体的表达。在Bodmer等人的美国申请号20030091995中大致说明了这一组合方法。
抗原
用编码该全长人类CXCR4蛋白的表达载体转染R1610细胞(一种中国仓鼠肺细胞系，首次在Thirion，J.P.et al.(1976)Genetics83∶137-147中说明)，使得该蛋白表达于这些细胞的表面。CXCR4cDNA的一种密码子-最佳化的形式被用于该表达载体，如Mirzabekov，T.et al.(1999)J.Biol.Chem.274∶28745-28750说明对其进行制备。为了增强这些细胞的免疫原性，通过与三硝基苯磺酸(TNBS)(作为5％溶液(Sigma，Cat.#P2297)是可商购的)的水溶液一起孵育，用三硝基酚(TNP)包被这些细胞。更具体地，将1×108细胞用无菌PBS洗涤一次，与50μl的商购5％TNBS溶液在室温下避光孵育1小时，并接着用PBS洗涤三次。得到的TNP包被的、表达CXCR-4的R1610细胞作为抗原被用于进行免疫。最终的免疫原是100μl TNP包被的洗涤过的细胞(1×107个细胞)与100μl Ribi佐剂的一种混合物。小鼠随时间接受六个剂量的免疫原。
转基因转染色体KM 
Figure BSA0000101757350000882
种系
通过对转基因转染色体小鼠KM种系(KM小鼠表达人类抗体基因)进行初始免疫，制备了针对CXCR4的全部人类单克隆抗体。在这一小鼠种系中，该内源性小鼠κ轻链基因已经被同型结合地破坏(如在Chenet al.(1993)EMBO J.12∶811-820所说明)，并且该内源性小鼠重链基因已经被同型结合地破坏(如PCT公开号WO01／09187的实例1所说明)。此外，这一小鼠种系携带一个人类κ轻链基因，KCo5(如Fishwildet al.(1996)Nature Biotechnology14∶845-851所说明)，并且还含有SC20转染色体，它携带了人Ig重链基因位点，(如PCT公开号WO02／43478所说明)。KM小鼠也在美国专利申请号20020199213中被详细说明。
KM免疫作用
为了生成CXCR4的完全人类单克隆抗体，用经转染表达CXCR4并用TNP包被的(如以上对该抗原所说明)R1610细胞，对KM
Figure BSA0000101757350000881
种系的小鼠进行免疫作用。对于在携带人类抗体基因的小鼠种系中生产人类抗体的通用免疫作用方案说明于Lonberg，N.et al(1994)Nature368(6474)∶856-859；Fishwild，D.et al.(1996)Nature Biotechnology14∶845-851以及PCT申请公开号WO98／24884中。第一次输注抗原时小鼠是6至16周龄。
用抗原的Ribi佐剂中经腹膜内(IP)、皮下(Sc)、或经足垫(FP)对KM小鼠进行免疫，然后3至21天后用该抗原的Ribi佐剂经IP、Sc或FP进行重复免疫作用(共6次免疫作用)。通过眶后取血监测该免疫应答。通过FACS对表达CXCR4的R1610细胞进行染色筛选该血浆(与未转染的亲本R1610细胞比较)。具有足够滴度的抗-CXCR4人类免疫球蛋白的小鼠被用于收集脾脏。
噬菌体展示库的制备及筛选抗-CXCR4抗体
从以上说明的经免疫的小鼠收集的脾脏，被用于制作表达人类抗体重链及轻链的一种噬菌体展示文库。更具体地，从这些脾脏中分离总RNA，从该RNA制备cDNA，并且通过PCR特异地扩增人类抗体可变区cDNA，基本上如Buechler等人的美国专利申请20030091995所说明。将人类抗体可变区的文库克隆进入噬菌体表达载体，也基本上如Buechler等人的美国专利申请20030091995所说明。通过将人类CXCR4结合进入磁性蛋白脂质体(CXCR4-MPL)，针对CXCR4具有亲和力的文库成员，对该噬菌体展示文库进行筛选。表达CXCR4的MPL、或其他七次跨膜(7TM)受体(例如CCR5)，使得该7TM受体的天然构型得以保存，以前已经被说明(参见，例如Mirzabekov，T.et al.(2000)Nat.Biotechnol.18∶649-654；Babcock，G.J.et al.(2001)J.Biol.Chem.276∶38433-38440；PCT公开号WO01／49265；美国专利申请20010034432)。简言之，使用该去污剂CHAPSO从一个经转染的、能表达CXCR4的细胞系中溶解出含有一个表位标签的重组的人类CXCR4，并且由该表位标签将该蛋白捕获于磁性珠子上。在去除该去污剂的过程中，重建了一个脂质膜，使得CXCR4的天然膜构型得以保存，以产生这些CXCR4-MPL。与背景相比，该噬菌体文库在CXCR4-MPL上的三次淘选导致CXCR4结合子富集了30倍。将感兴趣的可变区片段克隆进入一个Fab表达载体，并且针对经转染的表达CXCR4的细胞的抗原结合力对该Fab进行再测试。然后使用标准的分子生物学技术，将整个抗体从这些Fab产生出来。
选出Fab克隆F7、F9、D1以及E2用于进一步分析。
实例2：人类抗-CXCR4单克隆抗体F7、F9、D1以及E2的结构表征使用标准的DNA测序技术，如实例1所述，从噬菌体展示文库筛中选获得编码F7、F9、D1以及E2Fab克隆的重链及轻链可变区的cDNA序列进行测序。
F7的重链可变区的核苷酸及氨基酸序列分别如图1A以及SEQ IDNO∶33及25所示。
F7的轻链可变区的核苷酸及氨基酸序列分别如图1B以及SEQ IDNO∶37及29所示。
将F7的重链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白重链序列进行比较，证明F7重链利用来自人类种系VH3-48的一个VH区段、来自人类种系4-23的一个D区段、以及来自人类种系JH6B的一个JH区段。使用CDR区测定的Kabat系统对F7的VH序列进一步分析，得到分别如图1A与SEQ ID NO∶1、5以及9所示的重链CDR1、CDR2以及CD3区的说明。
将F7轻链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白轻链序列进行比较，证明F7轻链利用了来自人类种系VK L15的VL区段，以及来自人类种系JK1的JK区段。使用CDR区的Kabat系统对F7VL序列进一步分析，得到分别如图1B与SEQ ID NO∶13、17以及21所示的轻链CDR1、CDR2以及CD3区。
F9的重链可变区的核苷酸及氨基酸序列分别如图2A以及SEQ IDNO∶34及26所示。
F9的轻链可变区的核苷酸及氨基酸序列分别如图2B以及SEQ IDNO∶38及30所示。
将F9重链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白重链序列进行比较，证明F9重链利用了来自人类种系VH3-48的一个VH区段、来自人类种系4-23的一个D区段、以及来自人类种系JH6B的一个JH区段。使用CDR区的Kabat系统对F9的VH序列进一步分析，得到分别如图2A以及SEQ ID NO∶2、6及10所示的重链CDR1、CDR2及CD3区。
将F9的轻链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白重链序列进行比较，证明F9轻链利用了来自人类种系VK L15的一个VL区段及来自人类种系JK1的一个JK区段。使用CDR区的Kabat系统对F9的VL序列进一步分析，得到分别如图2B以及SEQ ID NO∶14、18及22所示的轻链CDR1、CDR2及CD3区。
D1的重链可变区的核苷酸及氨基酸序列分别如图3A以及SEQ IDNO∶35及27所示。
D1的轻链可变区的核苷酸及氨基酸序列分别如图3B以及SEQ IDNO∶39及31所示。
将D1的重链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白重链序列进行较，证明D1重链利用了来自人类种系VH3-48的一个VH区段、来自人类种系4-23的一个D区段、以及来自人类种系JH6B的一个JH区段。使用CDR区的Kabat系统对D1的VH序列进一步分析，得到分别如图3A及SEQ ID NO∶3、7以及11所示的重链CDR1、CDR2及CD3区。
将D1的轻链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白重链序列进行比较，证明D1轻链利用了来自人类种系VK L15的一个VL区段及来自人类种系JK1的一个JK区段。使用CDR区的Kabat系统对D1的VL序列进一步分析，得到分别如图3B及SEQ ID NO∶15、19以及23所示的轻链CDR1、CDR2及CD3区。
E2的重链可变区的核苷酸及氨基酸序列分别如图4A以及SEQ IDNO∶36及28所示。
E2的轻链可变区的核苷酸及氨基酸序列分别如图4B以及SEQ IDNO∶40及32所示。
将E2的重链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白重链序列进行比较，证明E2重链利用了来自人类种系VH3-48的一个VH区段、来自人类种系4-23的一个D区段、以及来自人类种系JH6B的一个JH区段。使用CDR区的Kabat系统对E2的VH序列进一步分析，得到分别如图4A以及SEQ ID NO∶4、8及12所示的重链CDR1、CDR2及CD3区。
将E2的轻链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白重链序列进行比较，证明E2轻链利用了来自人类种系VK L15的一个VL区段及来自人类种系JK1的一个JK区段。使用CDR区的Kabat系统对D1的VL序列进一步分析，得到分别如图4B以及SEQ ID NO∶16、20及24所示的轻链CDR1、CDR2及CD3区。
对F7、F9、D1以及E2的VH与VL区的框架序列进行分析，与源自它们的种系序列相比，鉴定了不同于种系的不同框架氨基酸残基。选择在VH及VL区段的氨基末端区域的某些框架残基用于“回复突变”，以恢复对该种系序列的框架残基，因为在氨基末端位置的这些非种系残基是油用于产生这些噬菌体展示文库(如实例1所说明的)的引物编码。具体而言，通过标准的分子生物学技术以替换在指定的框架位置上的种系氨基酸残基，产生F7、F9、D1以及E2的VH与VL区段(针对种系，称之为“GL”形式)以下经修饰的形式：
F7GL VH∶Q1E，Q6E
F7GLVk∶A1D，R3Q
F9GL VH∶Q1E，Q6E
F9GLVk∶E1D，V3Q，L4M
D1GL VH∶Q6E
D1GLVk∶V1D，W3Q，V4M
E2GL VH∶Q6E
E2GLVk∶E1D，V3Q，L4M
图5A示出了F7(SEQ ID NO∶25)以及F7GL(SEQ ID NO∶41)重链可变区氨基酸序列，与该种系VH3-48所编码的氨基酸序列(SEQID NO∶49)的比对。描绘出CDR1、CDR2以及CDR3区。
图5B示出了F7(SEQ ID NO∶29)以及F7GL(SEQ ID NO∶45)轻链可变区氨基酸序列，与该种系VK L15所编码的氨基酸序列(SEQ IDNO∶50)的比对。描绘出CDR1、CDR2以及CDR3区。
图6A示出了F9(SEQ ID NO∶26)以及F7GL(SEQ ID NO∶42)重链可变区氨基酸序列，与该种系VH3-48所编码的氨基酸序列(SEQID NO∶49)的比对。描绘出CDR1、CDR2以及CDR3区。
图6B示出了F9(SEQ ID NO∶30)以及F9GL(SEQ ID NO∶46)轻链可变区氨基酸序列，与该种系VK L15所编码的氨基酸序列(SEQ IDNO∶50)的比对。描绘出CDR1、CDR2以及CDR3区。
图7A示出了D1(SEQ ID NO∶27)以及D1GL(SEQ ID NO∶43)重链可变区氨基酸序列，与该种系VH3-48所编码的氨基酸序列(SEQID NO∶49)的比对。描绘出CDR1、CDR2以及CDR3区。
图7B示出了D1(SEQ ID NO∶31)以及D1GL(SEQ ID NO∶47)轻链可变区氨基酸序列，与该种系VK L15所编码的氨基酸序列(SEQ IDNO∶50)的比对。描绘出CDR1、CDR2以及CDR3区。
图8A示出了E2(SEQ ID NO∶28)以及E2GL(SEQ ID NO∶44)重链可变区氨基酸序列，与该种系VH3-48所编码的氨基酸序列(SEQID NO∶49)的比对。描绘出CDR1、CDR2以及CDR3区。
图8B示出了E2(SEQ ID NO∶31)以及E2GL(SEQ ID NO∶47)轻链可变区氨基酸序列，与该种系VK L15所编码的氨基酸序列(SEQ IDNO∶50)的比对。描绘出CDR1、CDR2以及CDR3区。
使用标准的重组DNA技术将F7、F9、D1以及E2片段转变成全长抗体。例如，可以将对Fab片段的一种片段的VH及VK区进行编码的DNA克隆进入一种表达载体，该表达载体携带该重链及轻链恒定区，使得这些可变区被可操作性地连接到恒定区。作为替代，单独的载体可以被用于该全长重链及全长轻链的表达。适宜用于产生表达载体的非限制性实例包括在Black的美国专利中请号20050153394中说明的pIE载体。
实例3：抗-CXCR4人类单克隆抗体的结合特征
在这一实例中，通过流式细胞术检测抗-CXCR4抗体的结合特征。
人类T细胞系CEM，在它的细胞表面表达天然人类CXCR4，被用于检测F7、F9、D1以及E2抗体与天然的、细胞表面CXCR4相结合的能力。将全长F7、F9、D1以及E2按1∶3连续稀释进行滴定，得到从300nM至5pM的浓度范围。然后将这些抗体与CEM细胞混合，并且在用一种FITC偶联的抗人IgG的二级抗体进行检测之前允许结合该抗体。然后通过流式细胞术分析这些细胞。这些在图9的曲线图中所示得到的平均荧光强度，该曲线图证明所有四种抗-CXCR4抗体结合CEM细胞。结合F7、F9、D1以及E2的EC50分别是21nM、14nM、80nM以及290nM。
为确定一组抗-CXCR4抗体竞争而结合CXCR4的能力，进行了竞争性研究。使用这四种人类抗-CXCR4抗体F9、F7、E2以及D1，以及四种可商购的鼠类单克隆抗-CXCR4抗体(12G5、708、716以及717；R&D系统目录#∶分别是MAB170、MAB171、MAB172以及MAB173)。在恒定浓度的经FITC标记的抗-CXCR4抗体F9存在的条件下，将抗-CXCR4抗体按1∶3连续稀释系列进行滴定，产生从300nM至5pM的浓度范围。然后将抗体的混合物加入CEM细胞并且允许结合。通过流式细胞仪及FITC的检测，评估了每个抗体与F9竞争而结合CEM细胞的能力。得到的平均荧光强度如图10的曲线图所示，该曲线图证明所测试的全部七种抗体(F7、E2、D1、708、716以及717)都能与F9竞争而结合CEM细胞，尽管与这些其他抗体相比，该抗体E2只在高浓度时证明部分抑制作用。
在另一类试验中，通过流式细胞术、通过执行FACS滴定，检测F7mAb与多种不同细胞系结合的能力。用100,00个细胞与数量渐增的mAb(从小于0.001μg／ml至超过100μg／ml)进行孵育，并用流式细胞术评估结合。还测定了Bmax值，该值指出在每个细胞上大约有多少CXCR4分子。根据结合曲线，测定了用于抗体结合的EC50，该结果概述于下列表1中：
表1：mAb F7结合不同细胞系的FACS滴定结果
Figure BSA0000101757350000951
Bmax＝最大结合(GMFI单位)
这些结果显示F7mAb能够有效地结合所测试的六种细胞系，具有用Ramos以及Raji细胞系观察到的最低的EC50。这些数据也显示对于Ramos及Namalwa细胞，CXCR4受体的表达最高，并且对于MDA-MB-231细胞及DMS79细胞，CXCR4受体的表达最低。
在其他结合实验中，检测了F7mAb结合人类外周血单核细胞(PBMCs)的不同亚型的能力。使用标准方法分离人类PBMCs，并且用FACS分离不同的细胞亚型。具体而言，分离了下列细胞亚型：(i)CD3阳性的细胞；(ii)CD20阳性的细胞；(iii)CD11b阳性的细胞；以及(iv)CD14阳性的细胞。由F7mAb(在33μg／ml)进行的流式细胞术实验证明，与同种型匹配的对照抗体相比，F7mAb能够有效地结合这四种亚型中的每一种。
实例4：用抗-CXCR4抗体抑制SDF-1与CXCR4的结合
为确定抗-CXCR4的人类抗体对SDF-1与CXCR4结合的抑制能力，使用125I标记的SDF-1及天然地表达CXCR4的CEM细胞进行了一项竞争性研究。通过一种标准的放射性标记的配体结合测定，对抗-CXCR4抗体对SDF-1结合到CEM细胞上的阻断作用进行了比较。将抗-CXCR4抗体进行1：3系列稀释以得出从300nM至137pM的浓度范围。在具有2000Ci／mmole的特异活性的100pM125I-SDF-1(Amersham，catalog#IM314-25UCI)存在下，将这些抗体加入100μl750,000个CEM细胞。使用相同的同种型的无关抗体作为阴性对照。通过在4℃下、在没有这些抗体达2小时的条件下，允许125I-SDF-1结合至CEM细胞而确定可能结合了放射性标记的配体总数。通过在1μM未标记的SDF-1的存在下，允许125I-SDF-1结合至CEM细胞而确定放射性标记的配体的非特异性结合。使用标准方法确定了细胞相关的125I-SDF-1的量值。该结果显示在图11，它证明对于SDF-1结合至在CEM细胞表达的CXCR4而言，该F7抗体提供了最大有效阻断作用。F9及D1抗体也阻断SDF-1的结合，尽管比F7更缓和。E2抗体，尽管它确实结合至CEM细胞上的CXCR4(如实例3所证明)，但不能有效地阻断SDF-1与CEM细胞上的CXCR4的结合。由F7、F9以及D1阻断SDF-1的EC50分别是2.3nM、12.5nM以及28.6nM。
实例5：由抗-CXCR4抗体抑制SDF-1诱导的钙流动
为了确定抗-CXCR4人类抗体在CEM细胞对SDF-1诱导的钙流动的抑制能力，首先用荧光染料Calcium3(Molecular Devices)标记CEM细胞。抗-CXCR4抗体按1：3连续稀释系列以从100nM至1pM的浓度范围内被滴定，并且允许结合至200μl的200,000CEM细胞，在室温下孵育10分钟，然后上样进入Flexstation仪器(Molecular Devices)。使用相同的同种型的一种无关抗体作为阴性对照。然后用终浓度是50nM的重组的人类SDF-lα(Peprotech)，加入22μl体积的500nM、直到终体积是222ul，刺激细胞。测量每个孔在200秒产生的钙流动。作为阳性对照，用SDF-1α刺激没有抗体的细胞(在加入了1％BSA的Hank's缓冲盐水(HBS)中或HBS中制备)以获得最大可能的钙流动信号。用加入了1％BSA的HBS刺激细胞以确定基线。通过钙依赖的荧光随时间显影测量SDF-1α刺激的钙的释放。得到的荧光轨迹的曲线以下的面积被报告为钙流动的读数。得到的由抗-CXCR4抗体对钙流动的抑制作用展示在图12中。将这些数据进行绘图并用GraphPad Prism软件以及非线性的曲线拟合、S形曲线剂量反应公式计算这些EC50。抗体F7、F9以及D1抑制SDF-lα诱导的钙流动。虽然抗体E2确实结合CXCR4(如实例3所证明)，但它对SDF-1α诱导的钙流动的抑制不显著。由F7、F9以及D1抑制SDF-1诱导的钙流动的EC50分别是0.90nM、0.32nM以及0.57nM。
实例6：由抗-CXCR4抗体抑制SDF-1诱导的CEM细胞迁移
为了确定抗-CXCR4人类抗体抑制SDF-1诱导的CEM细胞的迁移的能力，首先用荧光染料Calcium3(Molecular Devices)标记CEM细胞。将抗-CXCR4抗体按1：3连续稀释系列进行滴定，产生从100nM至1pM的浓度范围，并允许以每毫升1千万个细胞的密度结合经标记的CEM细胞。使用相同的同种型的无关抗体作为阴性对照。将重组人类SDF-1α(Peprotech)以5nM每孔30μl加入96孔神经探针迁移板的较低的腔室，其中每孔滤光片直径5.7mm。每个孔含有5μm的细孔。将具有或没有抗体的经标记的CEM细胞以每孔50万个细胞(50μl)的浓度上载至这些滤光片上。将该迁移板在37℃下孵育2.5小时。已迁移的细胞捕获于该板较低的腔室中，进行裂解并且用铕检测溶液(PerkinElmer)进行检测。将该化学发光信号记录在融合仪器上。抗-CXCR4抗体对SDF-1α诱导迁移的抑制作用如图13所示。这些结果证明抗体F7及F9有效地抑制迁移，而抗体D1及E2对迁移的抑制不显著。由F7及F9抑制SDF-1诱导的CEM细胞迁移的EC50分别是12.44nM及18.99nM。
实例7：由抗-CXCR4抗体抑制HuVEC毛细管形成
在这一实例中，检测了抗-CXCR4人类抗体抑制由人脐静脉内皮细胞(HuVEC)形成毛细管的能力。将基质胶用RPMI按1∶1稀释，并且平铺于96孔板的孔中，并允许在37℃下聚合30分钟。当HuVEC(来自Cambrex，cat#CC-2519)处于80％融合时，对HuVEC进行胰蛋白酶消化并重悬于含有0.5％FBS的RPMI中(每毫升1×106个细胞)。将抗体与HuVEC充分混匀，终浓度是3μg／ml，并且允许在室温孵育30分钟。使用相同的同种型的无关抗体或仅有培养基作为阴性对照。使用小鼠抗人类αvβ3(CD51／CD61)抗体(R&D Systems，cat#MAB3050)作为管形成抑制作用的阳性对照。将具有或不具有抗体的HuVEC平铺于基质胶包被过的孔中，并且在37℃条件下孵育18小时。
仅用培养基或用与同种型匹配的对照抗体孵育的HuVEC形成了毛细管，结果出现了相邻孔的细胞跨过该板，每孔具有3至5个连接点或分支点。用抗-CXCR4人类抗体或抗αvβ3抗体孵育的HuVEC都没有形成毛细管。这些细胞看似是分离的并且具有少量或没有分支点。对阻断SDF-1结合、SDF-1诱导的钙流动、以及SDF-1诱导的迁移最为有效的抗-CXCR4抗体，被称为F7及F9，它们对抑制毛细管形成也是最有效的。抗-CXCR4抗体E2，它结合CXCR4，但不阻断SDF-1结合或者SDF-1诱导的效应，不抑制毛细管形成。
实例8：由抗-CXCR4抗体在体外抑制肿瘤细胞的增殖
在这一实例中，检测了抗-CXCR4人类抗体在体外抑制Ramos肿瘤细胞(人类伯基特氏淋巴瘤细胞系)增殖的能力。在该测定中，将每孔1×104个细胞与剂量逐渐增加(10-3至300nM)的F7IgG4抗体、F9IgG1抗体、E2IgG1抗体、F9Fab'抗体或同种型对照一起孵育。将细胞与抗体孵育72小时，在最后24小时的孵育中加入3H-胸腺嘧啶核苷孵育，以允许监测细胞的增殖。孵育后，通过标准技术检测这些细胞与3H-胸腺嘧啶核苷的结合。该结果如图14的曲线图所示。这些结果证明F7IgG4、F9IgG1以及E2IgG1抗体每一种均能抑制Ramos细胞增殖，如当与这些抗体孵育时3H-胸腺嘧啶核苷的结合降低所指，而F9Fab’片段不抑制细胞增殖。这些结果表明抗-CXCR4人类抗体在体外对肿瘤细胞具有直接的抗增值作用，并因此不需要二级交联以达到抗增殖的效应。
实例9：由抗-CXCR4抗体在体内抑制实体肿瘤
在这一实例中，使用Ramos皮下肿瘤细胞模型，检测了抗-CXCR4人类抗体在体内对一种已建立的实体肿瘤的增殖进行抑制的能力。在这一测定中，10x106Ramos细胞／小鼠被植入每只小鼠的面侧区，并允许生长至平均大小为40mm3(由肿瘤的长度×宽度×高度／2算得)。然后这些小鼠接受首次剂量的抗体的腹腔注射(i.p.)(表示为处理的0天)，并且在第7天接受第二次i.p.的剂量的抗体。用Fab’片段抗体处理的小鼠在第3天及第10天也接受i.p.抗体剂量。各组的小鼠(n＝8)接受以下处理(i)载体；(ii)同种型对照(15mg／kg)；(iii)F7IgG4(15mg／kg)；(iv)F9IgG1(15mg／kg)；(v)F9Fab’(10mg／kg)；或(vi)抗-CD20阳性对照(15mg／kg)。在第0天与注射后30天之间的有规律的间隔时间点(大约2至3次／星期)对肿瘤体积及小鼠体重进行测量。该试验的结果如图15A、15B以及15C所示，它们显示了平均肿瘤体积(图15A)、中位数肿瘤体积(图15B)以及中位数％体重变化(图15C)。这些结果证明，与该阳性对照相似，如增大的肿瘤体积所测量，F7IgG4及F9IgG1抗体显著抑制肿瘤细胞生长，而与该同种型对照想比，F9Fab’片段不抑制肿瘤细胞生长。体重变化不显著所说明，所有的处理都有较好的耐受性。处理组之间的体重的差异更可能是由于这些肿瘤的重量造成的。这些结果说明抗-CXCR4人类抗体在体内能抑制一种已建立的实体肿瘤的生长。
实例10：通过抗-CXCR4抗体处理增加小鼠系统肿瘤细胞模型的存活时间
在这一实例中，使用Ramos系统肿瘤细胞模型检测了一种抗-CXCR4人类抗体增加小鼠存活时间的能力。在这一测定中，在第0天将1×106Ramos细胞／小鼠经静脉内注射(i.v.)入每只小鼠。然后在第1天对这些小鼠进行首次剂量的抗体的腹膜内(i.p.)注射(即，在静脉给予肿瘤细胞一天后)，并且在第5、8、15以及22天又进行四次i.p.的剂量的抗体(接受阳性对照抗体处理的小鼠仅在第一天接受处理)。各组小鼠(n＝8)接受以下一种处理(i)载体；(ii)同种型对照(15mg／kg)；(iii)F9IgG1(15mg／kg)；或(iv)抗-CD19阳性对照(15mg／kg)。在第0天至注射后第50天的有规则的间隔来测量存活百分数(后肢瘫痪作为本试验的终点)。本实验的这些结果如图16所示，它显示了随时间变化的存活百分数。经载体或同种型对照处理的小鼠的存活中位数#天数分别是23及25.5天，而经一个剂量的抗-CD19阳性对照处理的小鼠的存活中位数天数是39天。显著地，的用5个剂量的F9IgG1抗体处理的组中的小鼠100％存活至该实验结束。这些结果表明抗-CXCR4人类抗体能够增加一个系统肿瘤细胞模型中小鼠的存活时间。
实例11：由抗-CXCR4单克隆抗体F7诱导的凋亡
在这一实例中，检测了抗-CXCR4mAb F7在不同细胞中诱导凋亡的能力。在凋亡测定中，将10μg／m1的F7mAb与Ramos细胞(500，000个细胞)、Namalwa细胞(500，000个细胞)或经转染的表达CXCR4的R1610细胞(100，000个细胞)进行孵育。未经转染的R1610细胞被用作阴性对照。将抗-CXCR4mAb F7或者同种型对照抗体与细胞在37℃下孵育，并且在24、48以及72小时去除250μl样品。为了测定凋亡，将来自不同时间点的细胞与AnnexinV-FITC-FL1以及PropidiumIodide-FL3进行孵育，随后用流式细胞术检测。在FL1、FL3以及FL1-FL3双阳性象限中收集的细胞的组合百分数被认为是凋亡。为了去除背景，将同种型抗体诱导的凋亡细胞的百分数从F7mAb诱导的凋亡的细胞的百分数中扣除。
这些结果归纳于以下表2中：
表2：由抗-CXCR4mAb F7诱导的凋亡
细胞 时间(小时) ％凋亡
R1610 72 ＜1
R1610-CXCR4 24 39
R1610-CXCR4 48 58
R1610-CXCR4 72 46
Ramos 24 22
Ramos 48 31
Ramos7222Namalwa2417Namalwa4824Namalwa7244
总％凋亡值通过同种型对照抗体诱导的基线变化进行校正。
这些结果证明F7mAb能够在Ramos、Namalwa以及R1610-CXCR4细胞内诱导凋亡，而F7对亲本R1610细胞的凋亡的诱导无效，表明该反应是CXCR4特异的。
实例12：显示的由抗-CXCR4抗体在体内抑制实体肿瘤细胞增殖的其他研究
在这一实例中，使用其他的肿瘤细胞模型(类似于以上在实例9中所说明的Ramos模型)检测了抗-CXCR4人类抗体在体内对一种已建立的实体肿瘤的增殖进行抑制的能力或诱导凋亡的能力。检测了不同的肿瘤细胞系。有代表性的实验及结果如下。
在一个实验中，将7.5×106MDA-MB231人类乳房癌细胞／小鼠植入每只小鼠的面侧区，并允许生长到平均大小为100mm3(移植后7天，由肿瘤的长度×宽度×高度／2算出)。将这些小鼠随机分入不同的处理组，并且在移植后7天接受第一剂量的抗体的经腹膜内(i.p.)注射，移植14天后接受第二i.p.剂量的抗体，并接着在移植后46天接受第三剂量。各组小鼠(n＝9)接受以下一种处理(i)载体(PBS)；(ii)IgG1同种型对照(15mg／kg)；(iii)IgG4同种型对照(15mg／kg)；或(iv)F7IgG1(15mg／kg)；或(v)F7IgG4(15mg／kg)。在规则的间隔测量肿瘤的体积，并且确定在每个间隔对每个处理组的平均数肿瘤体积及中位数肿瘤体积。本实验的这些结果概述于以下表3中，它显示了移植后52天平均肿瘤体积(mm3)以及％肿瘤正常抑制(TGI)，以及移植59天后中位数肿瘤体积(mm3)以及％TGI。
表3：由mAb F7在体内抑制MDA-MB231细胞的肿瘤生长。
Figure BSA0000101757350001021
另外、在第59天，F7IgG4处理组中一只小鼠的的肿瘤消失了。这些结果证明F7mAb能够在体内抑制MDA-MB231乳癌细胞的生长。
在一个第二项实验中，将5×106DMS79人类小细胞肺癌细胞／小鼠植入每只小鼠的面侧区，并允许生长至平均大小为160mm3(移植后7天，由这些肿瘤的长度×宽度×高度算得)。将这些小鼠随机分入不同的处理组，并且按照Q3D×5的剂量方案(每3天一次，共5次)接受经腹膜内(i.p.)注射抗体。各组小鼠(n＝9)接受以下一种处理(i)载体(PBS)；(ii)IgG4同种型对照(10mg／kg)；或(iii)F7IgG4(10mg／kg)。在规则的间隔测量肿瘤的体积，并且确定在每个间隔每个处理组的平均肿瘤体积及中位数肿瘤体积。本试验的这些结果概述于以下表4中，它显示移植后34天的平均数及中位数肿瘤体积(mm3)，以及％肿瘤生长抑制作用(％TGI)。
表4：由mAb F7在体内抑制DMS79细胞的肿瘤生长
Figure BSA0000101757350001022
这些结果证明F7mAb能够在体内抑制DMS79人类小细胞肺癌细胞的生长。
在多个实验中(类似于以上说明的那些实验及实例9的实验)，对其他皮下异种移植肿瘤的模型抗-CXCR4抗体对肿瘤生长进行抑制的能力进行了检测。在一项使用SU-DHL-6B细胞淋巴瘤细胞的实验中，结果显示：用15mg／kg的F7IgG4mAb进行处理，结果大约抑制了肿瘤生长的60％。类似地，在一项实验中使用Namalwa伯基特氏淋巴瘤细胞，结果显示以3mg／kg的F7IgG4mAb进行处理，结果大约抑制了肿瘤生长的70％。相反，在使用NIH-H226肺癌细胞或HPAC人类胰腺腺癌细胞的实验中，没有观察到由F7mAb对肿瘤生长的抑制作用。然而，在流式细胞仪实验中，用F7mAb对这些细胞进行染色显示了体外最小化的表达。虽然通过免疫组织化学通过mAb该肿瘤细胞在体内是可被染色，但是不清楚CXCR4在它们肿瘤生长的什么阶段开始被表达。这提示这两种细胞系中CXCR4的表达不足以在体内允许由抗-CXCR4抑制的肿瘤生长或诱导凋亡。
实例13：由抗-CXCR4抗体在体内抑制肺转移
在这一实例中，使用一种C57系统肿瘤细胞模型，检测了F7抗-CXCR4mAb对肺转移进行抑制的能力。更具体地说，对30只C57种系小鼠，将0.4×106B16-CXCR4细胞(经转染的表达人类CXCR4的B16细胞)由静脉注射进入每只小鼠。将这些小鼠随机分成3组，每组10只，然后各组小鼠接受以下一种处理(i)载体(PBS)；(ii)IgG4同种型对照(5mg／kg)；或(iii)F7IgG4(5mg／kg)。由静脉注射B16-CXCR4细胞30分钟后，将抗体或载体由腹膜下注射。第14天收集肺，并且对肺转移结节的个数进行定量。这些结果概述于以下表5中，它显示了各组肺转移结节数的平均数与中位数：
表5：在体内由mAb F7在体内抑制肺转移
这些结果显示用F7mAb处理导致了肺转移瘤的数目的平均数下降了56％，而用该同种型对照抗体处理仅下降了15％，证明F7mAb能够在一种系统性肿瘤模型中抑制肺转移。
Figure ISA0000101757370000011
Figure ISA0000101757370000021
Figure ISA0000101757370000031
Figure ISA0000101757370000041
Figure ISA0000101757370000051
Figure ISA0000101757370000061
Figure ISA0000101757370000071
Figure ISA0000101757370000081
Figure ISA0000101757370000091
Figure ISA0000101757370000101
Figure ISA0000101757370000111
Figure ISA0000101757370000121
Figure ISA0000101757370000131
Figure ISA0000101757370000141
Figure ISA0000101757370000151
Figure ISA0000101757370000161
Figure ISA0000101757370000181
Figure ISA0000101757370000191

Claims (11)

1.一种单克隆抗体或其抗原结合部分，其与一种参考抗体或其抗原结合部分交叉竞争结合CXCR4，其中该参考抗体或其抗原结合部分包括：
(a)由SEQ ID NO∶25所示氨基酸序列组成的一个重链可变区以及由SEQ ID NO∶29所示氨基酸序列组成的一个轻链可变区；或
(b)由SEQ ID NO∶26所示氨基酸序列组成的一个重链可变区以及由SEQ ID NO∶30所示氨基酸序列组成的一个轻链可变区；或
(c)由SEQ ID NO∶27所示氨基酸序列组成的一个重链可变区以及由SEQ ID NO∶31所示氨基酸序列组成的一个轻链可变区；或
(d)由SEQ ID NO∶28所示氨基酸序列组成的一个重链可变区由SEQ ID NO∶32所示氨基酸序列组成的一个轻链可变区。
2.如权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，包括：
(a)由选自SEQ ID NO∶41至44的氨基酸序列组成的重链可变区；以及
(b)由选自SEQ ID NO∶45至48的氨基酸序列组成的轻链可变区。
3.一种组合物，包括如前述权利要求中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，以及一种药学上可接受的载体。
4.一种免疫偶联物，包括连接至一种治疗剂的如权利要求1-2中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分。
5.一种双特异性分子，包含如权利要求1-2中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其连接至具有不同于所述单克隆抗体或其抗原结合部分的结合特异性的第二功能部分。
6.一种分离的核酸，该核酸对如权利要求1-2中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分进行编码。
7.一种表达载体，包括如权利要求6所述的核酸。
8.一种宿主细胞，包括如权利要求7所述的表达载体。
9.用于制备抗-CXCR4抗体的方法，该方法包括在如权利要求8所述的宿主细胞中表达该抗体，并且从该宿主细胞中分离该抗体。
10.一种体外调节表达CXCR4受体的细胞中的CXCR4活性的方法，该方法包括用如权利要求1-2中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分接触该细胞，使得该细胞中的CXCR4活性得到调节。
11.权利要求1-2中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分在制备用于调节受试者的细胞中的CXCR4活性、在受试者中抑制肿瘤细胞的生长或转移、在受试者中抑制HIV进入T细胞、在患有一种炎性病症的受试者中抑制炎症、在受试者中抑制血管发生或在受试者体内刺激CD34阳性的干细胞从骨髓向外周血的动员的药物组合物中的用途。
CN201410083654.5A 2006-10-02 2007-10-01 结合cxcr4的人类抗体及其用途 Active CN103897058B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US82785106P 2006-10-02 2006-10-02
US60/827,851 2006-10-02
CN200780040511.4A CN101528259B (zh) 2006-10-02 2007-10-01 结合cxcr4的人类抗体及其用途

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200780040511.4A Division CN101528259B (zh) 2006-10-02 2007-10-01 结合cxcr4的人类抗体及其用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103897058A true CN103897058A (zh) 2014-07-02
CN103897058B CN103897058B (zh) 2018-06-15

Family

ID=39402166

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200780040511.4A Active CN101528259B (zh) 2006-10-02 2007-10-01 结合cxcr4的人类抗体及其用途
CN201410083654.5A Active CN103897058B (zh) 2006-10-02 2007-10-01 结合cxcr4的人类抗体及其用途

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200780040511.4A Active CN101528259B (zh) 2006-10-02 2007-10-01 结合cxcr4的人类抗体及其用途

Country Status (30)

Country Link
US (3) US8450464B2 (zh)
EP (2) EP2066351B1 (zh)
JP (4) JP5417175B2 (zh)
KR (3) KR20150065959A (zh)
CN (2) CN101528259B (zh)
AR (2) AR063086A1 (zh)
AU (1) AU2007320024B2 (zh)
BR (1) BRPI0718197A2 (zh)
CA (1) CA2665239A1 (zh)
CL (1) CL2007002835A1 (zh)
CY (2) CY1117036T1 (zh)
DK (2) DK2486941T3 (zh)
EA (1) EA018836B1 (zh)
ES (2) ES2553553T3 (zh)
HK (1) HK1131904A1 (zh)
HU (2) HUE033630T2 (zh)
IL (1) IL197831A (zh)
LT (1) LT2486941T (zh)
ME (1) ME02269B (zh)
MX (1) MX2009003306A (zh)
NO (1) NO345287B1 (zh)
NZ (1) NZ575924A (zh)
PL (2) PL2486941T3 (zh)
PT (2) PT2066351E (zh)
RS (2) RS55740B1 (zh)
SG (2) SG178712A1 (zh)
SI (2) SI2066351T1 (zh)
TW (2) TWI522366B (zh)
WO (1) WO2008060367A2 (zh)
ZA (1) ZA200902256B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107427574A (zh) * 2015-01-09 2017-12-01 阿达尔塔私人有限公司 Cxcr4结合分子
CN108026173A (zh) * 2015-06-12 2018-05-11 百时美施贵宝公司 通过联合阻断pd-1和cxcr4信号传导途径治疗癌症
CN117003876A (zh) * 2023-08-31 2023-11-07 恺佧生物科技(上海)有限公司 一种Anti-CXCR4膜蛋白抗体及其制备方法和应用

Families Citing this family (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008009437A2 (en) 2006-07-18 2008-01-24 Noxxon Pharma Ag Sdf-i binding nucleic acids
SI2066351T1 (sl) * 2006-10-02 2016-02-29 E.R. Squibb & Sons, L.L.C. Humana protitelesa, ki vežejo cxcr4 in njihova uporaba
FR2915102B1 (fr) * 2007-04-23 2014-05-16 Pf Medicament Utilisation d'un anticorps anti-cxcr4 pour le traitement du cancer
HUE047459T2 (hu) 2007-08-06 2020-04-28 Noxxon Pharma Ag SDF-1 kötõ nukleinsavak és alkalmazásuk
CA2724409A1 (en) * 2008-05-14 2009-11-19 Eli Lilly And Company Anti-cxcr4 antibodies
US7892546B2 (en) 2008-05-14 2011-02-22 Eli Lilly And Company Anti-CXCR4 antibodies
CN102459575A (zh) 2009-06-05 2012-05-16 细胞动力国际有限公司 重编程t细胞和造血细胞的方法
US20110117113A1 (en) * 2009-10-09 2011-05-19 Gerald Beste Immunoglobulin single variable domain directed against human cxcr4 and other cell associated proteins and methods to generate them
LT2499161T (lt) * 2009-11-11 2017-11-27 Ganymed Pharmaceuticals Gmbh Specifiniai antikūnai, skirti klaudinui 6 (cldn6)
WO2011083141A2 (en) * 2010-01-08 2011-07-14 Ablynx Nv Method for generation of immunoglobulin sequences by using lipoprotein particles
GB201002238D0 (en) 2010-02-10 2010-03-31 Affitech As Antibodies
EP2371863A1 (en) * 2010-03-30 2011-10-05 Pierre Fabre Médicament Humanized anti CXCR4 antibodies for the treatment of cancer
WO2011161266A1 (en) * 2010-06-25 2011-12-29 Ablynx Nv Improved immunoglobulin single variable domains and constructs thereof directed against cxcr4
US20140120555A1 (en) * 2011-06-20 2014-05-01 Pierre Fabre Medicament Anti-cxcr4 antibody with effector functions and its use for the treatment of cancer
ES2758884T3 (es) 2011-06-24 2020-05-06 Stephen D Gillies Proteínas de fusión de inmunoglobulina a través de cadena ligera y métodos de uso de ellas
CA2840687C (en) 2011-07-01 2020-04-28 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Discovery of a somatic mutation in myd88 gene in lymphoplasmacytic lymphoma
US20140314784A1 (en) * 2011-07-20 2014-10-23 Medlmmune Limited Anti-cxcr4 antibodies and methods of use
AR087363A1 (es) * 2011-07-29 2014-03-19 Pf Medicament Uso del anticuerpo i-3859 para la deteccion y diagnostico de los canceres
AR087364A1 (es) 2011-07-29 2014-03-19 Pf Medicament Anticuerpo anti-cxcr4 y su uso para la deteccion y dianostico de canceres
SI2776032T1 (sl) * 2011-11-09 2018-12-31 Bristol-Myers Squibb Company Zdravljenje hematoloških malignih obolenj z anti-CXCR4 protitelesom
CA2891493C (en) * 2013-02-26 2022-03-15 Roche Glycart Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules
JP6636917B2 (ja) 2013-06-28 2020-01-29 エックス−ボディ インコーポレイテッド 標的細胞に特異的な標的エピトープの同定のための、標的抗原探索、表現型スクリーニングおよびそれらの使用
MX371455B (es) * 2013-08-02 2020-01-28 Pfizer Anticuerpos anti-cxcr4 y conjugados de anticuerpo y farmaco.
WO2015019284A2 (en) * 2013-08-05 2015-02-12 Cambridge Enterprise Limited Inhibition of cxcr4 signaling in cancer immunotherapy
WO2015038887A1 (en) * 2013-09-12 2015-03-19 Dana-Farber Cancer Institute Inc. Methods for evaluating and treating waldenstrom's macroglobulinemia
CN110058023B (zh) * 2013-09-23 2022-10-14 X博迪公司 用于生成对抗细胞表面抗原的结合剂的方法和组合物
ES2742079T3 (es) 2013-11-06 2020-02-13 Bristol Myers Squibb Co Tratamiento de macroglobulinemia de Waldenström asociada a C1013G/CXCR4 con un anticuerpo anti-CXCR4
WO2015085075A1 (en) 2013-12-06 2015-06-11 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods to distinguish waldenström's macroglobulinemia from igm monoclonal gammopathy of undetermined significance
US20160340414A1 (en) 2014-01-15 2016-11-24 Medimmune, Llc Rsv-specific antibodies and functional parts thereof
JP2017527615A (ja) * 2014-09-02 2017-09-21 シーダーズ−サイナイ メディカル センター 線維化疾患及び癌を治療するための組成物及び方法
WO2016081455A1 (en) * 2014-11-17 2016-05-26 Pelican Therapeutics, Inc. Human tnfrsf25 antibody
ES2747386T3 (es) 2015-01-14 2020-03-10 Bristol Myers Squibb Co Dímeros de benzodiacepina unidos por heteroarileno, conjugados de los mismos y métodos de preparación y uso
RU2719033C2 (ru) 2015-04-23 2020-04-16 Нантомикс, Ллс Способ получения фармацевтического агента для иммунотерапии рака
EP3394096A1 (en) 2015-12-21 2018-10-31 Bristol-Myers Squibb Company Variant antibodies for site-specific conjugation
EP3448390A1 (en) 2016-04-29 2019-03-06 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Hck as a therapeutic target in myd88 mutated diseases
EP3454909A1 (en) 2016-05-10 2019-03-20 Bristol-Myers Squibb Company Antibody-drug conjugates of tubulysin analogs with enhanced stability
US10005843B2 (en) 2016-06-09 2018-06-26 Pelican Therapeutics, Inc. Anti-TNFRSF25 antibodies
WO2017220989A1 (en) 2016-06-20 2017-12-28 Kymab Limited Anti-pd-l1 and il-2 cytokines
KR102493853B1 (ko) 2016-08-19 2023-01-30 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 세코-시클로프로파피롤로인돌 화합물, 그의 항체-약물 접합체, 및 제조 및 사용 방법
WO2018075842A1 (en) 2016-10-20 2018-04-26 Bristol-Myers Squibb Company Condensed benzodiazepine derivatives and conjugates made therefrom
CA3052070A1 (en) * 2017-01-31 2018-08-09 Msm Protein Technologies Inc. Anti-cxcr4 antibodies
US10472361B2 (en) 2017-08-16 2019-11-12 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a benzotriazole moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10508115B2 (en) 2017-08-16 2019-12-17 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having heteroatom-linked aromatic moieties, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10487084B2 (en) 2017-08-16 2019-11-26 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a heterobiaryl moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10494370B2 (en) 2017-08-16 2019-12-03 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a pyridine or pyrazine moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10457681B2 (en) 2017-08-16 2019-10-29 Bristol_Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a tricyclic moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
KR20200132915A (ko) * 2018-03-13 2020-11-25 푼다시온 파라 라 인베스티가시온 바이오메디카 델 호스피탈 우니베르시타리오 라 파즈 암 면역요법을 위한, 활성화되고 확장된 자연 킬러 세포와 조합된 항-cxcr4 항체
US11485741B2 (en) 2018-04-24 2022-11-01 Bristol-Myers Squibb Company Macrocyclic toll-like receptor 7 (TLR7) agonists
EA202092747A1 (ru) 2018-05-29 2021-03-16 Бристол-Маерс Сквибб Компани Модифицированные саморазрушающиеся фрагменты для применения в пролекарствах и конъюгатах и способы применения и изготовления
US11554120B2 (en) 2018-08-03 2023-01-17 Bristol-Myers Squibb Company 1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidine compounds as toll-like receptor 7 (TLR7) agonists and methods and uses therefor
PL3886914T3 (pl) 2018-11-30 2023-05-08 Bristol-Myers Squibb Company Przeciwciało zawierające c-końcowe rozszerzenie łańcucha lekkiego zawierające glutaminę, jego koniugaty oraz metody i zastosowania
KR20210102334A (ko) 2018-12-12 2021-08-19 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 트랜스글루타미나제 접합을 위해 변형된 항체, 그의 접합체, 및 방법 및 용도
WO2021055306A1 (en) 2019-09-16 2021-03-25 Bristol-Myers Squibb Company Dual capture method for analysis of antibody-drug conjugates
EP4051298A1 (en) 2019-11-01 2022-09-07 Magenta Therapeutics, Inc. Dosing regimens for the mobilization of hematopoietic stem and progentor cells
AU2021205893A1 (en) 2020-01-08 2022-06-23 Synthis Therapeutics, Inc. ALK5 inhibitor conjugates and uses thereof
MX2022013493A (es) 2020-04-27 2023-02-22 Magenta Therapeutics Inc Metodos y composiciones para transducir celulas madre y progenitoras hematopoyeticas in vivo.
CN112661845B (zh) * 2020-12-25 2022-06-21 暨南大学 与cxcr4结合的亲和力成熟结合蛋白及其应用
CN112521500B (zh) * 2020-12-25 2022-06-24 暨南大学 与cxcr4结合的亲和力成熟结合蛋白及应用
WO2022197776A1 (en) 2021-03-16 2022-09-22 Magenta Therapeutics, Inc. Dosing regimens for hematopoietic stem cell mobilization for stem cell transplants in multiple myeloma patients

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006089141A2 (en) * 2005-02-18 2006-08-24 Dana-Farber Cancer Institute Antibodies against cxcr4 and methods of use thereof

Family Cites Families (152)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4475196A (en) 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4486194A (en) 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
DE3572982D1 (en) 1984-03-06 1989-10-19 Takeda Chemical Industries Ltd Chemically modified lymphokine and production thereof
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US5374548A (en) 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
MX9203291A (es) 1985-06-26 1992-08-01 Liposome Co Inc Metodo para acoplamiento de liposomas.
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4954617A (en) 1986-07-07 1990-09-04 Trustees Of Dartmouth College Monoclonal antibodies to FC receptors for immunoglobulin G on human mononuclear phagocytes
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4881175A (en) 1986-09-02 1989-11-14 Genex Corporation Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US5013653A (en) 1987-03-20 1991-05-07 Creative Biomolecules, Inc. Product and process for introduction of a hinge region into a fusion protein to facilitate cleavage
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
EP0623679B1 (en) 1987-05-21 2003-06-25 Micromet AG Targeted multifunctional proteins
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5476996A (en) 1988-06-14 1995-12-19 Lidak Pharmaceuticals Human immune system in non-human animal
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
JP2919890B2 (ja) 1988-11-11 1999-07-19 メディカル リサーチ カウンスル 単一ドメインリガンド、そのリガンドからなる受容体、その製造方法、ならびにそのリガンドおよび受容体の使用
JP2989002B2 (ja) 1988-12-22 1999-12-13 キリン―アムジエン・インコーポレーテツド 化学修飾顆粒球コロニー刺激因子
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
US6291158B1 (en) 1989-05-16 2001-09-18 Scripps Research Institute Method for tapping the immunological repertoire
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
DE69133566T2 (de) 1990-01-12 2007-12-06 Amgen Fremont Inc. Bildung von xenogenen Antikörpern
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US6261774B1 (en) 1990-06-11 2001-07-17 Gilead Sciences, Inc. Truncation selex method
US5712375A (en) 1990-06-11 1998-01-27 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue selex
US5864026A (en) 1990-06-11 1999-01-26 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue selex
US5763566A (en) 1990-06-11 1998-06-09 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue SELEX
US5789157A (en) 1990-06-11 1998-08-04 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue selex
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
DK0814159T3 (da) 1990-08-29 2005-10-24 Genpharm Int Transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
GB9021679D0 (en) * 1990-10-05 1990-11-21 Gorman Scott David Antibody preparation
GB9108652D0 (en) 1991-04-23 1991-06-12 Antisoma Ltd Immunoreactive compounds
JP3949712B2 (ja) 1991-12-02 2007-07-25 メディカル リサーチ カウンシル 抗体セグメントレパートリー由来でファージに表示される抗自己抗体の産生
ATE463573T1 (de) 1991-12-02 2010-04-15 Medimmune Ltd Herstellung von autoantikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken
JPH07503132A (ja) 1991-12-17 1995-04-06 ジェンファーム　インターナショナル，インコーポレイティド 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
CA2118508A1 (en) 1992-04-24 1993-11-11 Elizabeth S. Ward Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US6765087B1 (en) 1992-08-21 2004-07-20 Vrije Universiteit Brussel Immunoglobulins devoid of light chains
CA2144043C (en) 1992-09-16 2005-01-18 Dennis R. Burton Human neutralizing monoclonal antibodies to respiratory syncytial virus
GB9223377D0 (en) 1992-11-04 1992-12-23 Medarex Inc Humanized antibodies to fc receptors for immunoglobulin on human mononuclear phagocytes
JP3919830B2 (ja) 1992-11-28 2007-05-30 財団法人化学及血清療法研究所 抗ネコヘルペスウイルス−１組換え抗体および該抗体をコードする遺伝子断片
EP0754225A4 (en) 1993-04-26 2001-01-31 Genpharm Int HETEROLOGIC ANTIBODY-PRODUCING TRANSGENIC NON-HUMAN ANIMALS
DK0698097T3 (da) 1993-04-29 2001-10-08 Unilever Nv Produktion af antistoffer eller (funktionaliserede) fragmenter deraf afledt af Camelidae-immunoglobuliner med tung kæde
CA2163345A1 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Susan Adrienne Morgan Antibodies
JP3367581B2 (ja) 1993-10-14 2003-01-14 小野薬品工業株式会社 新規なポリペプチド、その製造方法、そのポリペプチドをコードするｄｎａ、そのｄｎａからなるベクター、そのベクターで形質転換された宿主細胞
AU1866895A (en) 1994-01-04 1995-08-01 Scripps Research Institute, The Human monoclonal antibodies to herpes simplex virus and methods therefor
SE9400088D0 (sv) 1994-01-14 1994-01-14 Kabi Pharmacia Ab Bacterial receptor structures
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6013443A (en) 1995-05-03 2000-01-11 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue SELEX
WO1996034875A1 (en) 1995-05-03 1996-11-07 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue selex
US6090382A (en) 1996-02-09 2000-07-18 Basf Aktiengesellschaft Human antibodies that bind human TNFα
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
EP0983303B1 (en) 1997-05-21 2006-03-08 Biovation Limited Method for the production of non-immunogenic proteins
US5840598A (en) 1997-08-14 1998-11-24 Micron Technology, Inc. LOC semiconductor assembled with room temperature adhesive
DE19742706B4 (de) 1997-09-26 2013-07-25 Pieris Proteolab Ag Lipocalinmuteine
GB9722131D0 (en) 1997-10-20 1997-12-17 Medical Res Council Method
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
EP2261229A3 (en) 1998-04-20 2011-03-23 GlycArt Biotechnology AG Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
GB9814383D0 (en) 1998-07-02 1998-09-02 Cambridge Antibody Tech Improvements relating to antibodies
WO2000005266A1 (en) 1998-07-21 2000-02-03 Connex Gesellschaft Zur Optimierung Von Forschung Und Entwicklung Mbh Anti hepatitis c virus antibody and uses thereof
NZ539776A (en) 1999-01-15 2006-12-22 Genentech Inc Polypeptide variants with altered effector function
US6914128B1 (en) 1999-03-25 2005-07-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing
EP2270148A3 (en) 1999-04-09 2011-06-08 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
US6387620B1 (en) 1999-07-28 2002-05-14 Gilead Sciences, Inc. Transcription-free selex
CA2380813A1 (en) 1999-07-29 2001-02-08 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies to her2/neu
US7605238B2 (en) 1999-08-24 2009-10-20 Medarex, Inc. Human CTLA-4 antibodies and their uses
KR100942863B1 (ko) 1999-08-24 2010-02-17 메다렉스, 인코포레이티드 인간 씨티엘에이-4 항체 및 그의 용도
US6794132B2 (en) 1999-10-02 2004-09-21 Biosite, Inc. Human antibodies
ES2288886T3 (es) 1999-12-30 2008-02-01 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Proteoliposomas que contienen una proteina integral de membrana que tiene uno o mas dominios transmembrana.
US7417130B2 (en) 2000-09-08 2008-08-26 University Of Zurich Collection of repeat proteins comprising repeat modules
US7138496B2 (en) * 2002-02-08 2006-11-21 Genetastix Corporation Human monoclonal antibodies against human CXCR4
US6818216B2 (en) 2000-11-28 2004-11-16 Medimmune, Inc. Anti-RSV antibodies
ES2295228T3 (es) 2000-11-30 2008-04-16 Medarex, Inc. Roedores transcromosomicos transgenicos para la preparacion de anticuerpos humanos.
US20040001822A1 (en) 2000-12-29 2004-01-01 Avigdor Levanon Y1-isolated molecules comprising epitopes containing sulfated moieties, antibodies to such epitopes, and uses thereof
AU2002256371B2 (en) 2001-04-26 2008-01-10 Amgen Mountain View Inc. Combinatorial libraries of monomer domains
US20050048512A1 (en) 2001-04-26 2005-03-03 Avidia Research Institute Combinatorial libraries of monomer domains
US20050053973A1 (en) 2001-04-26 2005-03-10 Avidia Research Institute Novel proteins with targeted binding
US20030157561A1 (en) 2001-11-19 2003-08-21 Kolkman Joost A. Combinatorial libraries of monomer domains
US20040175756A1 (en) 2001-04-26 2004-09-09 Avidia Research Institute Methods for using combinatorial libraries of monomer domains
US20050089932A1 (en) 2001-04-26 2005-04-28 Avidia Research Institute Novel proteins with targeted binding
KR100583331B1 (ko) 2001-05-11 2006-05-26 기린 비루 가부시키가이샤 인간 항체 λ 경쇄 유전자를 포함하는 인간 인공 염색체 및 자손 전달 가능한 상기 인간 인공 염색체를 포함하는 비인간 동물
WO2002092780A2 (en) 2001-05-17 2002-11-21 Diversa Corporation Novel antigen binding molecules for therapeutic, diagnostic, prophylactic, enzymatic, industrial, and agricultural applications, and methods for generating and screening thereof
AU2002319402B2 (en) 2001-06-28 2008-09-11 Domantis Limited Dual-specific ligand and its use
HUP0600342A3 (en) 2001-10-25 2011-03-28 Genentech Inc Glycoprotein compositions
US7442512B2 (en) * 2001-11-30 2008-10-28 Chemocentryx, Inc. Compositions and methods for detecting and treating diseases and conditions related to chemokine receptors
AU2003217912A1 (en) 2002-03-01 2003-09-16 Xencor Antibody optimization
PL373256A1 (en) 2002-04-09 2005-08-22 Kyowa Hakko Kogyo Co, Ltd. Cells with modified genome
CA2489280A1 (en) 2002-06-14 2003-12-24 Centocor, Inc. Modified "s" antibodies
JP2006512895A (ja) 2002-06-28 2006-04-20 ドマンティス リミテッド リガンド
DE10161767T1 (de) 2002-07-03 2018-06-07 Honjo Tasuku Immunopotenzierende Zusammensetzungen, die einen Anti-PD-L1 Antikörper enthalten
KR100944575B1 (ko) 2002-10-17 2010-02-25 젠맵 에이/에스 Ｃｄ20에 대한 인간 모노클로날 항체
EP2267032A3 (en) 2002-11-08 2011-11-09 Ablynx N.V. Method of administering therapeutic polypeptides, and polypeptides therefor
AU2003299581A1 (en) 2002-12-02 2004-06-23 Abgenix, Inc. Antibodies against drugs of abuse
US20050002939A1 (en) * 2002-12-23 2005-01-06 Albert Zlotnik Tumor killing/tumor regression using CXCR4 antagonists
AU2003290330A1 (en) 2002-12-27 2004-07-22 Domantis Limited Dual specific single domain antibodies specific for a ligand and for the receptor of the ligand
US9259459B2 (en) 2003-01-31 2016-02-16 Celldex Therapeutics Inc. Antibody vaccine conjugates and uses therefor
US20090005257A1 (en) 2003-05-14 2009-01-01 Jespers Laurent S Process for Recovering Polypeptides that Unfold Reversibly from a Polypeptide Repertoire
CA2526398C (en) 2003-05-21 2014-07-15 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies against bacillus anthracis protective antigen
PL1639011T3 (pl) 2003-06-30 2009-05-29 Domantis Ltd Pegilowane przeciwciała jednodomenowe (dAb)
HN2004000285A (es) 2003-08-04 2006-04-27 Pfizer Prod Inc ANTICUERPOS DIRIGIDOS A c-MET
US7674618B2 (en) 2003-09-04 2010-03-09 Medarex, Inc. Expression vector
WO2005040229A2 (en) 2003-10-24 2005-05-06 Avidia, Inc. Ldl receptor class a and egf domain monomers and multimers
US20050249723A1 (en) 2003-12-22 2005-11-10 Xencor, Inc. Fc polypeptides with novel Fc ligand binding sites
US20060008844A1 (en) 2004-06-17 2006-01-12 Avidia Research Institute c-Met kinase binding proteins
CA2587424A1 (en) 2004-11-16 2006-05-26 Avidia Research Institute Protein scaffolds and uses thereof
AR051805A1 (es) * 2004-12-21 2007-02-07 Centocor Inc Anticuerpos anti-il-12, epitopos, composiciones, metodos y usos
JP2008528010A (ja) 2005-01-31 2008-07-31 アブリンクス ナームローゼ フェンノートシャップ 重鎖抗体の可変ドメイン配列を作出する方法
KR101291640B1 (ko) 2005-02-18 2013-08-05 메다렉스, 엘.엘.시. 푸코실 잔기가 결핍된 전립선 특이적 막 항원(ｐｓｍａ)에대한 단클론성 항체
WO2006096488A2 (en) 2005-03-08 2006-09-14 Pharmacia & Upjohn Company Llc Composition comprising human igg2 antibody and chelating agent
AU2006294644A1 (en) 2005-09-27 2007-04-05 Amunix, Inc. Proteinaceous pharmaceuticals and uses thereof
US10155816B2 (en) 2005-11-28 2018-12-18 Genmab A/S Recombinant monovalent antibodies and methods for production thereof
SI2066351T1 (sl) * 2006-10-02 2016-02-29 E.R. Squibb & Sons, L.L.C. Humana protitelesa, ki vežejo cxcr4 in njihova uporaba
SI2776032T1 (sl) * 2011-11-09 2018-12-31 Bristol-Myers Squibb Company Zdravljenje hematoloških malignih obolenj z anti-CXCR4 protitelesom
ES2742079T3 (es) * 2013-11-06 2020-02-13 Bristol Myers Squibb Co Tratamiento de macroglobulinemia de Waldenström asociada a C1013G/CXCR4 con un anticuerpo anti-CXCR4

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006089141A2 (en) * 2005-02-18 2006-08-24 Dana-Farber Cancer Institute Antibodies against cxcr4 and methods of use thereof

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107427574A (zh) * 2015-01-09 2017-12-01 阿达尔塔私人有限公司 Cxcr4结合分子
CN114478773A (zh) * 2015-01-09 2022-05-13 阿达尔塔有限公司 Cxcr4结合分子
CN108026173A (zh) * 2015-06-12 2018-05-11 百时美施贵宝公司 通过联合阻断pd-1和cxcr4信号传导途径治疗癌症
CN117003876A (zh) * 2023-08-31 2023-11-07 恺佧生物科技(上海)有限公司 一种Anti-CXCR4膜蛋白抗体及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
ES2625798T3 (es) 2017-07-20
BRPI0718197A2 (pt) 2014-09-30
EP2066351A2 (en) 2009-06-10
AR113225A2 (es) 2020-02-19
AR063086A1 (es) 2008-12-23
PL2066351T3 (pl) 2016-02-29
KR20150065959A (ko) 2015-06-15
KR20090064589A (ko) 2009-06-19
HK1131904A1 (zh) 2010-02-12
DK2066351T3 (en) 2015-12-14
HUE027165T2 (en) 2016-08-29
JP2016105719A (ja) 2016-06-16
EP2486941A1 (en) 2012-08-15
US11312777B2 (en) 2022-04-26
CA2665239A1 (en) 2008-05-22
NO20091283L (no) 2009-04-24
ME02269B (me) 2016-04-28
HUE033630T2 (en) 2017-12-28
SG10201608268RA (en) 2016-11-29
CN101528259B (zh) 2014-04-09
US8450464B2 (en) 2013-05-28
TWI522366B (zh) 2016-02-21
WO2008060367A2 (en) 2008-05-22
WO2008060367A9 (en) 2008-07-10
KR101722261B1 (ko) 2017-04-03
SI2486941T1 (sl) 2017-08-31
IL197831A (en) 2017-01-31
DK2486941T3 (en) 2017-06-26
US20190031763A1 (en) 2019-01-31
TW200831535A (en) 2008-08-01
JP2013227339A (ja) 2013-11-07
CN103897058B (zh) 2018-06-15
EA200900424A1 (ru) 2009-08-28
AU2007320024A1 (en) 2008-05-22
IL197831A0 (en) 2011-08-01
US20130251729A1 (en) 2013-09-26
SI2066351T1 (sl) 2016-02-29
CY1117036T1 (el) 2017-04-05
JP5417175B2 (ja) 2014-02-12
WO2008060367A3 (en) 2008-11-06
TWI592425B (zh) 2017-07-21
PT2066351E (pt) 2015-11-30
PT2486941T (pt) 2017-05-30
LT2486941T (lt) 2017-06-12
US20100104508A1 (en) 2010-04-29
EP2066351B1 (en) 2015-09-09
ES2553553T3 (es) 2015-12-10
NZ575924A (en) 2012-05-25
JP6097650B2 (ja) 2017-03-15
RS55740B1 (sr) 2017-07-31
TW201604208A (zh) 2016-02-01
ZA200902256B (en) 2019-02-27
RS54424B1 (en) 2016-04-28
MX2009003306A (es) 2009-04-23
NO345287B1 (no) 2020-11-30
KR20170123712A (ko) 2017-11-08
US10106615B2 (en) 2018-10-23
AU2007320024B2 (en) 2012-11-08
CN101528259A (zh) 2009-09-09
EP2486941B1 (en) 2017-03-15
PL2486941T3 (pl) 2017-08-31
JP2010505830A (ja) 2010-02-25
SG178712A1 (en) 2012-03-29
EA018836B1 (ru) 2013-11-29
CL2007002835A1 (es) 2008-05-30
CY1118949T1 (el) 2018-01-10
JP6496673B2 (ja) 2019-04-03
JP2019054798A (ja) 2019-04-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101528259B (zh) 结合cxcr4的人类抗体及其用途
CN101626782B (zh) 结合cd22的人抗体及其用途
CN101356195B (zh) 抗岩藻糖基-gm1的人单克隆抗体及使用抗岩藻糖基-gm1抗体的方法
CN101124249B (zh) 抗前列腺特异性膜抗原（psma）的人单克隆抗体
JP5401639B2 (ja) タンパク質チロシンキナーゼ７（ｐｔｋ７）に対するヒトモノクローナル抗体およびそれらの使用
CN101578296A (zh) 结合btla的人类单克隆抗体及使用方法
CN102341412A (zh) 特异于cadm1 的全人抗体

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20180213

Address after: new jersey

Applicant after: E.R. expensive precious & Sheng Si limited liability company is executed

Address before: new jersey

Applicant before: MEDAREX,INC

TA01 Transfer of patent application right
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant