BRPI0718197A2 - Anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, composição, imunoconjugado, molécula de ácido nucleico isolada, vetor de expressão, célula hospedeira, e, métodos para preparar um anticorpo anti-cxcr4, para modular a atividade do cxcr4 em uma célula, e para estimular a mobilização de células tronco cd34+ da medula óssea para o sangue periférico em um indivíduo. - Google Patents

Anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, composição, imunoconjugado, molécula de ácido nucleico isolada, vetor de expressão, célula hospedeira, e, métodos para preparar um anticorpo anti-cxcr4, para modular a atividade do cxcr4 em uma célula, e para estimular a mobilização de células tronco cd34+ da medula óssea para o sangue periférico em um indivíduo. Download PDF

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Peter Brams
Dawn M Tanamachi
Josephine M Cardarelli
Alan Korman
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Description

I “ANTICORPO MONOCLONAL ISOLADO, OU UMA PORÇÃO DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO DO MESMO, COMPOSIÇÃO, IMUNOCONJUGADO, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO ISOLADA, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA, E, MÉTODOS PARA 5 PREPARAR UM ANTICORPO ANTI-CXCR4, PARA MODULAR A ATIVIDADE DO CXCR4 EM UMA CÉLULA, E PARA ESTIMULAR A MOBILIZAÇÃO DE CÉLULAS TRONCO CD34+ DA MEDULA ÓSSEA PARA O SANGUE PERIFÉRICO EM UM INDIVÍDUO”
Antecedentes
As quimoquinas são uma família de cerca de 50 pequenas
proteínas que modulam o tráfego e a angiogênese de células e também desempenham um papel significativo no microambiente do tumor (Vicari, A. P. e Caux, C. (2002) Cytokine Growth Factor Rev. 13:143-154). Dependendo da sua estrutura, as quimoquinas são classificadas como quimoquinas C-C 15 (contendo um motivo cisteína-cisteína) ou quimoquinas C-X-C (contendo um motivo cisteína-X-cisteína). Deste modo, os receptores que ligam estas quimoquinas são classificados como membros da família CCR ou da família CXCR, respectivamente. Um membro da família CXCR é o CXCR4, um receptor acoplado à proteína G com sete domínios transmembrana que é 20 predominantemente expresso em linfócitos e que ativa a quimiotaxia. O CXCR4 se liga à quimoquina CXCL12 (SDF-1).
O CXCR4 desempenha um papel na embriogênese, homeostase e inflamação. Estudos com camundongos modificados para serem deficientes em CXCR4 ou SDF-I implicam a via CXCR4/SDF-1 na 25 vascularização de órgãos, bem como nos sistemas imunológico e hematopoiético (Tachibana, K. et al. (1998) Nature 393:591-594). Além disso, o CXCR4 demonstrou que funciona como um co-receptor para isolados de HIV-I linfotrópicos de células T (Feng, Y. et al. (1996) Science 272:872- 877). O CXCR4 também demonstrou ser expresso numa variedade de tipos de células de câncer. Adicionalmente, a via do CXCR4/SDF-1 demonstrou estar envolvida no estímulo do processo metastático em muitos neoplasmas diferentes (Murphy, P. M. (2001) N. Engl J. Med,. 345:833-835). Por exemplo, o CXCR4 e o SDF-I demonstraram que mediam a metástase órgão5 específica criando um gradiente quimiotático entre o local do tumor primário e o local metastático (Muller, A. et al. (2001) Nature 410:50-56; Murakami, T. et al. (2002) Cancer Res. 62:7328-7334; Hanahan, D. et al. (2003) Cancer Res. 63:3005-3008).
Sumário
A presente revelação proporciona anticorpos monoclonais
isolados, em particular anticorpos monoclonais humanos que se ligam ao CXCR4 humano e que exibem várias propriedades desejáveis. Estas propriedades incluem a capacidade de se ligar ao CXCR4 humano nativo expresso na superfície de uma célula, a capacidade de inibir a ligação do 15 SDF-I ao CXCR4 humano, a capacidade de inibir o fluxo de cálcio induzido por SDF-I em células que expressam CXCR4, a capacidade de inibir a migração induzida por SDF-I de células que expressam CXCR4, a capacidade de inibir a formação de vaso capilar por células endoteliais de veia umbilical humana (HuVECs), a capacidade de induzir a apoptose em células 20 que expressam CXCR4, a capacidade de inibir a proliferação de células tumorais in vitro, a capacidade de inibir a proliferação de células tumorais in vivo, a capacidade de inibir metástases de células tumorais CXCR4+ e/ou a capacidade de aumentar o tempo de sobrevida de um indivíduo portador de um tumor CXCR4+.
Em um aspecto, a presente revelação pertence a um anticorpo
monoclonal isolado, ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, onde o anticorpo se liga ao CXCR4 humano, nativo expresso na superfície de uma célula. Em uma modalidade, o anticorpo também inibe a ligação do SDF-I ao CXCR4 humano, de preferência com um valor EC5Q para inibição de 50 nM ou menos, ou 30 nM ou menos, ou 15 nM ou menos, ou 10 nM ou menos, ou 5 nM ou menos, ou 3 nM ou menos, (por exemplo, um EC50 para inibição de 28,60 nM ou menos, ou 12,51 nM ou menos, ou 2,256 nM ou menos). Em outra modalidade, o anticorpo se liga ao CXCR4 humano nativo expresso na 5 superfície de uma célula mas não inibe a ligação de SDF-I ao CXCR4 humano. Em ainda outras modalidades, o anticorpo também inibe o fluxo de cálcio induzido por SDF-I em células que expressam CXCR4 humano, de preferência com um valor EC50 para inibição de 3 nM ou menos, ou 2 nM ou menos, ou 1 nM ou menos, ou 0,9 nM ou menos, ou 0,8 nM ou menos, ou 0,7 10 nM ou menos, ou 0,6 nM ou menos, ou 0,5 nM ou menos, ou 0,4 nM ou menos, (por exemplo, 0,9046 nM ou menos, 0,5684 ou menos, ou 0,3219 nM ou menos). Em ainda outras modalidades, o anticorpo também inibe a migração induzida por SDF-I de células que expressam CXCR4, de preferência com um valor EC5O para inibição de 50 nM ou menos, ou 30 nM 15 ou menos, ou 20 nM ou menos, ou 15 nM ou menos (por exemplo, 18,99 nM ou menos, ou 12,44 ou menos). Em ainda outras modalidades, o anticorpo também inibe a formação de vaso capilar por HuVECs, induz a apoptose de células que expressam CXCR4, inibe a proliferação de células tumorais in vitro, inibe a proliferação de células tumorais ou induz a apoptose de células 20 tumorais in vivo, inibe metástases de células tumorais CXCR4+ e/ou aumenta o tempo de sobrevida de um indivíduo portador de um tumor CXCR4+.
De preferência, o anticorpo se liga ao CXCR4 humano com
•j
alta afinidade, como por exemplo, com uma Kd de 1 x 10' M ou menos ou
O
com uma Kd de 5 x 10' M ou menos. De preferência, os anticorpos desta 25 revelação são anticorpos de comprimento total (isto é, compreendendo regiões variáveis e constantes). Além disso, os anticorpos desta revelação, de preferência, são produzidos contra o CXCR-4 humano de comprimento total expresso na sua conformação nativa numa célula hospedeira ou numa membrana artificial. Em um aspecto preferido, esta revelação pertence a um anticorpo monoclonal humano isolado, ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, onde o anticorpo:
(a) liga-se ao CXCR4 humano nativo expresso na superfície
de uma célula;
(b) inibe a ligação do SDF-I ao CXCR4 humano;
(c) inibe o fluxo de cálcio induzido por SDF-I em células que expressam CXCR4 humano;
(d) inibe a migração induzida por SDF-I de células que expressam CXCR4 humano; e
(e) inibe a formação de vaso capilar por células endoteliais de veia umbilical humana.
Ainda mais preferencialmente, o anticorpo também induz a apoptose de células que expressam CXCR4 humano e/ou inibem o crescimento de células tumorais CXCR4+ e/ou induz a apoptose de células tumorais in vivo.
Em um outro aspecto, esta revelação pertence a um anticorpo monoclonal humano isolado, ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, onde o anticorpo entra em competição cruzada para ligação ao CXCR4 com um anticorpo de referência, onde o anticorpo de referência compreende:
(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29; ou
(b) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 30; ou
(c) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 31; ou (d) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQID NO: 32.
Em certas modalidades, esta revelação proporciona um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada que é o produto ou é derivado de um gene Vh 3-48 humano, onde o anticorpo especificamente se liga ao CXCR4 humano. Em outras modalidades, esta revelação proporciona um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia leve que é o produto ou é derivado de um gene Vk L15 humano, onde o anticorpo especificamente se liga ao CXCR4 humano. Em ainda outras modalidades, esta revelação proporciona um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada que é o produto ou é derivado de um gene Vh 3-48 humano e uma região variável de cadeia leve que é o produto ou é derivado de um gene Vk Ll5 humano, onde o anticorpo especificamente se liga ao CXCR4 humano.
Em um outro aspecto, esta revelação proporciona um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo:
uma região variável de cadeia pesada que compreende as seqüências CDRl, CDR2, e CDR3; e uma região variável de cadeia leve que compreende as seqüências CDRl, CDR2 e CDR3, onde:
(a) a seqüência CDR3 da região variável de cadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das seqüências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 9-12, e modificações conservadoras desta; (b) a seqüência CDR3 da região variável de cadeia leve compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das seqüências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 21-24, e modificações conservadoras desta; e (c) o anticorpo se liga ao CXCR4 humano, nativo expresso na
superfície de uma célula.
Em modalidades preferidas, este anticorpo também tem uma ou mais das seguintes características: inibe a ligação de SDF-I ao CXCR4, inibe o fluxo de cálcio induzido por SDF-I em células que expressam 10 CXCR4, inibe a migração induzida por SDF-I de células que expressam o CXCR-4; inibe a formação de vaso capilar por HuVECs; induz a apoptose em células que expressam o CXCR4 (in vitro e/ou in vivo), inibe o crescimento de células tumorais CXCR4+ in vitro e/ou in vivo, e/ou inibe metástases de células tumorais CXCR4+.
De preferência, a seqüência CDR2 da região variável de cadeia
pesada compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das seqüências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 5-8, e modificações conservadoras desta; e a seqüência CDR2 da região variável de cadeia leve compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que 20 consiste das seqüências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 17-20, e modificações conservadoras desta. De preferência, a seqüência CDRl da região variável de cadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das seqüências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 1-4, e modificações conservadoras desta; e a seqüência CDRl da região 25 variável de cadeia leve compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das seqüências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 13-16, e modificações conservadoras desta.
Uma combinação preferida compreende:
(a) região variável de cadeia pesada CDRl compreendendo a SEQ ID NO: I;
(b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo a SEQ ID NO: 5;
(c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo a SEQ ID NO: 9;
(d) uma região variável de cadeia leve CDRl compreendendo a SEQ ID NO: 13;
(e) uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo a SEQ ID NO: 17; e
(f) uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo a
SEQ ID NO: 21.
Outra combinação preferida compreende:
(a) uma região variável de cadeia pesada CDRl compreendendo a SEQ ID NO: 2;
(b) uma região variável de cadeia pesada CDR2
compreendendo a SEQ ID NO: 6;
(c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo a SEQ ID NO: 10;
(d) uma região variável de cadeia leve CDRl compreendendo
a SEQ ID NO: 14;
(e) uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo a SEQ ID NO: 18; e
(f) uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo a SEQ ID NO: 22.
Outra combinação preferida compreende:
(a) uma região variável de cadeia pesada CDRl compreendendo a SEQ ID NO: 3;
(b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo a SEQ ID NO: 7; (c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo a SEQ ID NO: 11;
(d) uma região variável de cadeia leve CDRl compreendendo a SEQ ID NO: 15;
(e) uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo
a SEQID NO: 19; e
(f) uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo a SEQ ID NO: 23.
Outra combinação preferida compreende:
(a) uma região variável de cadeia pesada CDRl
compreendendo a SEQ ID NO: 4;
(b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo a SEQ ID NO: 8;
(c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo a SEQID NO: 12;
(d) uma região variável de cadeia leve CDRl compreendendo a SEQ ID NO: 16;
(e) uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo a SEQ ID NO: 20; e
(f) uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo a
SEQ ID NO: 24.
Outros anticorpos preferidos desta revelação ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendem: (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do 25 grupo que consiste das SEQ ID NOs: 25-28 e 41-44; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 29-32 e 45-48; onde o anticorpo especificamente se liga ao CXCR4.
Uma combinação preferida compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25 ou 41; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 ou 45.
Outra combinação preferida compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26 ou 42; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 30 ou 46.
Outra combinação preferida compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27 ou 43; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 31 ou 47.
Outra combinação preferida compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28 ou 44; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 32 ou 48.
Em outro aspecto desta revelação, são proporcionados anticorpos, ou porções de ligação ao seu antígeno, que competem pela ligação ao CXCR4 com qualquer um dos anticorpos acima mencionados.
Os anticorpos desta revelação podem ser, por exemplo, anticorpos de comprimento total, por exemplo de um isotipo IgGl ou IgG4. Alternativamente, os anticorpos podem ser fragmentos de anticorpos, tais como fragmentos Fab, Fab5 ou Fab’2 ou anticorpos de cadeia única.
Esta revelação também proporciona um imunoconjugado compreendendo um anticorpo desta revelação, ou sua porção de ligação ao 25 antígeno, ligado a um agente terapêutico, como por exemplo, uma citotoxina ou um isótopo radioativo. Esta revelação também proporciona uma molécula biespecífica compreendendo um anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno, desta revelação, ligado a uma segunda unidade funcional tendo uma especificidade de ligação diferente do referido anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno.
São também proporcionadas composições compreendendo um anticorpo, ou sua porção de ligação ao antígeno, ou imunoconjugado ou molécula biespecífica desta revelação e um veículo farmaceuticamente 5 aceitável.
Moléculas de ácido nucleico que codificam os anticorpos ou suas porções de ligação ao antígeno desta revelação são também abrangidas por esta revelação, assim como vetores de expressão compreendendo estes ácidos nucleicos e células hospedeiras compreendendo estes vetores de 10 expressão. São também proporcionados métodos para preparar anticorpos anti-CXCR4 utilizando as células hospedeiras compreendendo estes vetores de expressão e podem incluir os passos de (i) expressar o anticorpo na célula hospedeira e (ii) isolar o anticorpo da célula hospedeira.
Outro aspecto desta revelação pertence a métodos para modular a atividade do CXCR4 numa célula, onde as células são postas em contacto com um anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, desta revelação. As células podem ser postas em contacto in vitro cultivando as células com um anticorpo ou as células podem ser postas em contacto in vivo administrando o anticorpo a um indivíduo. Numa modalidade preferida, as células são células de tumor que expressam CXCR4 e o método resulta na inibição do crescimento das células de tumor e/ou na inibição de metástases das células de tumor. Em outra modalidade, as células são células T que expressam CXCR4 e o método resulta na inibição da entrada do HIV nas células. Em ainda outra modalidade, as células são linfócitos numa doença inflamatória e os métodos resultam na inibição da inflamação. Em ainda outra modalidade, as células estão envolvidas na vascularização e o método resulta na modulação da angiogênese.
Em um outro aspecto, esta revelação pertence a um método para estimular a mobilização de células tronco CD34+ da medula óssea para o sangue periférico num indivíduo, o método compreendendo administrar ao indivíduo um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, desta revelação, de tal modo que seja estimulada a mobilização das células tronco CD34+ da medula óssea para o sangue periférico. O método pode também 5 compreender colher as células tronco CD34+ do sangue periférico, para, por exemplo, utilização em transplante de células tronco autólogas.
Outras características e vantagens da presente revelação ficarão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada e exemplos que não devem ser interpretados como limitativos. Os teores de todas as referências, entradas no Genbank, patentes e pedidos de patentes publicados citados por todo este pedido são expressamente aqui incorporados por citação.
Breve Descrição dos Desenhos
A Figura IA ilustra a seqüência de nucleotídeos (SEQ ID NO:
33) e a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO: 25) da região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano F7. As regiões CDRl (SEQ
ID NO: 1), CDR2 (SEQ ID NO: 5) e CDR3 (SEQ ID NO: 9) estão delineadas e as derivações das linhas germinais V, D e J estão indicadas.
A Figura IB ilustra a seqüência de nucleotídeos (SEQ ID NO:
37) e a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO: 29) da região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal humano F7. As regiões CDRl (SEQ ID
NO: 13), CDR2 (SEQ ID NO: 17) e CDR3 (SEQ ID NO: 21) estão delineadas e as derivações das linhas germinais VeJ estão indicadas.
A Figura 2A ilustra a seqüência de nucleotídeos (SEQ ID NO:
34) e a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO: 26) da região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano F9. As regiões CDRl (SEQ
ID NO: 2), CDR2 (SEQ ID NO: 6) e CDR3 (SEQ ID NO: 10) estão delineadas e as derivações das linhas germinais V, D e J estão indicadas.
A Figura 2B ilustra a seqüência de nucleotídeos (SEQ ID NO:
38) e a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO: 30) da região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal humano F9. As regiões CDRl (SEQ ID NO: 14), CDR2 (SEQ ID NO: 18) e CDR3 (SEQ ID NO: 22) estão delineadas e as derivações das linhas germinais VeJ estão indicadas.
A Figura 3A ilustra a seqüência de nucleotídeos (SEQ ID NO:
35) e a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO: 27) da região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano Dl. As regiões CDRl (SEQ ID NO: 3), CDR2 (SEQ ID NO: 7) e CDR3 (SEQ ID NO: 11) estão delineadas e as derivações das linhas germinais V, D e J estão indicadas.
A Figura 3B ilustra a seqüência de nucleotídeos (SEQ ID NO:
39) e a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO: 31) da região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal humano Dl. As regiões CDRl (SEQ ID NO: 15), CDR2 (SEQ ID NO: 19) e CDR3 (SEQ ID NO: 23) estão delineadas e as derivações das linhas germinais VeJ estão indicadas.
A Figura 4A ilustra a seqüência de nucleotídeos (SEQ ID NO:
36) e a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO: 28) da região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano E2. As regiões CDRl (SEQ ID NO: 4), CDR2 (SEQ ID NO: 8) e CDR3 (SEQ ID NO: 12) estão delineadas e as derivações das linhas germinais V, D e J estão indicadas.
A Figura 4B ilustra a seqüência de nucleotídeos (SEQ ID NO:
40) e a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO: 32) da região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal humano E2. As regiões CDRl (SEQ ID NO: 16), CDR2 (SEQ ID NO: 20) e CDR3 (SEQ ID NO: 24) estão delineadas e as derivações das linhas germinais VeJ estão indicadas.
A Figura 5A ilustra o alinhamento da seqüência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de F7 (SEQ ID NO: 25) e F7GL (SEQ ID NO: 41) com a seqüência de aminoácidos VH 3-48 da linha germinal humana (SEQ ID NO: 49) (linha germinal JH6b revelada como a SEQ ID NO: 52).
A Figura 5B ilustra o alinhamento da seqüência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de F7 (SEQ ID NO: 29) e F7GL (SEQ ID NO: 45) com a seqüência de aminoácidos Vk Ll5 da linha germinal humana (SEQ ID N0:50) (linha germinal JKl revelada como a SEQ ID NO: 53).
A Figura 6A ilustra o alinhamento da seqüência de
aminoácidos da região variável de cadeia pesada de F9 (SEQ ID NO: 26) e F9GL (SEQ ID NO: 42) com a seqüência de aminoácidos Vh 3-48 da linha germinal humana (SEQ ID NO: 49) (linha germinal JH6b revelada como a SEQ ID NO: 52).
A Figura 6B ilustra o alinhamento da seqüência de
aminoácidos da região variável de cadeia leve de F9 (SEQ ID NO: 30) e F9GL (SEQ ID NO: 46) com a seqüência de aminoácidos Vk Ll5 da linha germinal humana (SEQ ID N0:50) (linha germinal JKl revelada como a SEQ ID NO: 53).
A Figura 7A ilustra o alinhamento da seqüência de
aminoácidos da região variável de cadeia pesada de Dl (SEQ ID NO: 27) e DlGL (SEQ ID NO: 43) com a seqüência de aminoácidos Vh 3-48 da linha germinal humana (SEQ ID NO: 49) (linha germinal JH6b revelada como a SEQ ID NO: 52).
A Figura 7B ilustra o alinhamento da seqüência de
aminoácidos da região variável de cadeia leve de Dl (SEQ ID NO: 31) e DlGL (SEQ ID NO: 47) com a seqüência de aminoácidos Vk L15 da linha germinal humana (SEQ ID N0:50) (linha germinal JKl revelada como a SEQ ID NO: 53).
A Figura 8A ilustra o alinhamento da seqüência de
aminoácidos da região variável de cadeia pesada de E2 (SEQ ID NO: 28) e E2GL (SEQ ID NO: 44) com a seqüência de aminoácidos e Vh 3-48 da linha germinal humana (SEQ ID NO: 49) (linha germinal JH6b revelada como a SEQ ID NO: 52). A Figura 8B ilustra o alinhamento da seqüência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de E2 (SEQ ID NO: 32) e E2GL (SEQ ID NO: 48) com a seqüência de aminoácidos Vk Ll 5 da linha germinal humana (SEQ ID N0:50) (linha germinal JKl revelada como a SEQ ID NO: 53).
A Figura 9 é um gráfico que ilustra a ligação dos anticorpos F7, F9, Dl e E2 humanos anti-CXCR4 para células CEM que expressam CXCR4 humano, nativo na superfície da célula.
A Figura 10 é um gráfico que ilustra a competição do anticorpo para se ligar a células CEM entre o anticorpo F9 anti-CXCR4 marcado com FITC e um painel de anticorpos humanos anti-CXCR4 não marcados.
A Figura 11 é um gráfico que ilustra a inibição da ligação de
1
SDF-I marcado com I a células CEM por anticorpos F7, F9 e Dl humanos anti-CXCR4.
A Figura 12 é um gráfico que ilustra a inibição do fluxo de cálcio induzido por SDF-I em células CEM por anticorpos F7, F9 e Dl humanos anti-CXCR4.
A Figura 13 é um gráfico que ilustra a inibição da migração induzida por SDF-I de células CEM por anticorpos F7 e F9 humanos antiCXCR4.
A Figura 14 é um gráfico que ilustra a inibição da proliferação de células de tumor Ramos in vitro por anticorpos F7, F9 e E2 humanos antiCXCR4.
As Figuras 15A-C são gráficos que ilustram a inibição da
proliferação de células de tumor Ramos in vivo num modelo de tumor subcutâneo por anticorpos F7 e F9 humanos anti-CXCR4. A Figura 15A ilustra a curva de crescimento médio do volume do tumor; a Figura 15B ilustra a curva mediana de crescimento do volume do tumor; a Figura 15C ilustra a mudança mediana da % de peso corporal.
A Figura 16 é um gráfico que ilustra a % de sobrevivência de camundongos tratados com o anticorpo humano F9 anti-CXCR4 num modelo de célula de tumor sistêmico Ramos.
Descrição Detalhada desta Revelação
A presente revelação se refere a anticorpos monoclonais, particularmente anticorpos monoclonais humanos, que se ligam especificamente ao CXCR4 humano, nativo expresso na superfície de uma célula. Em certas modalidades, os anticorpos desta revelação são derivados de 10 seqüências de linha germinal de cadeia pesada e leve em particular e/ou compreendem características estruturais particulares, tais como regiões CDR compreendendo seqüências de aminoácidos em particular. Esta descrição proporciona anticorpos isolados, métodos para fazer estes anticorpos, imunoconjugados e moléculas biespecíficas compreendendo estes anticorpos 15 e composições farmacêuticas contendo os anticorpos, imunoconjugados ou moléculas biespecíficas desta revelação. Esta revelação também se relaciona a métodos para usar os anticorpos, tais como detectar o CXCR4, bem como para modular a atividade do CXCR4 em doenças ou transtornos associados à expressão de CXCR4 ou envolvendo a via CXCR4/SDF-1, tais como 20 cânceres, metástases de tumor, infecção por HIV, inflamação e angiogênese. Deste modo, esta revelação também proporciona métodos para utilizar os anticorpos anti-CXCR4 desta revelação para tratar câncer, por exemplo para tratar um câncer tal como o câncer da mama, do ovário, da próstata, pulmonar de células não pequenas, pancreático, da tiróide, melanoma, nasofaringeano, 25 da célula renal, linfoma, neuroblastoma, glioblastoma, rabdomiossarcoma, colo-retal, do rim, osteossarcoma, leucemia linfoblástica aguda ou leucemia mielóide aguda. Além disso esta revelação proporciona métodos para utilizar os anticorpos anti-CXCR4 desta revelação para inibir as metástases tumorais.
A fim de que a presente revelação possa ser entendida mais prontamente, certos termos são primeiro definidos. Definições adicionais são apresentadas por toda a descrição detalhada.
O termo "CXCR4" inclui variantes, isoformas, homólogos, ortólogos e parólogos. Por exemplo, os anticorpos específicos para CXCR4 podem, em certos casos, ter reação cruzada com o CXCR4 de outras espécies que não seja a humana. Em outras modalidades, os anticorpos específicos para o CXCR4 humano podem ser completamente específicos para o CXCR4 humano e podem não exibir espécies ou outros tipos de reação cruzada. O termo “CXCR4 humano” se refere ao CXCR4 de seqüência humana, tal como IO a seqüência de aminoácidos completa de CXCR4 humano tendo o número de acesso ao Genbank P61073 (SEQ ID NO.:51). O CXCR4 é também conhecido na técnica, por exemplo, como LESTR, Fusin ou CD 184. A seqüência humana do CXCR4 pode diferir do CXCR4 humano da SEQ ID NO.:51 tendo, por exemplo, mutações conservadas ou mutação em regiões não conservados e o CXCR4 tem substancialmente a mesma função biológica que o CXCR4 humano da SEQ ID NO.:51. Por exemplo, uma função biológica do CXCR4 humano é ter um epítopo no domínio extracelular de CXCR4 que é especificamente ligado por um anticorpo da presente revelação ou a função biológica do CXCR4 humano é de ligação a quimoquina ou envolvimento no processo metastático.
Uma seqüência de CXCR4 humano em particular, de um modo geral, será pelo menos 90% idêntica em seqüência de aminoácidos ao CXCR4 humano da SEQ ID NO.:51e contém resíduos de aminoácidos que identificam a seqüência de aminoácidos como sendo humana quando 25 comparada às seqüências de aminoácidos do CXCR4 de outras espécies (por exemplo, murina). Em certos casos, um CXCR4 humano pode ser pelo menos 95%, ou mesmo pelo menos 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico em seqüência de aminoácidos ao CXCR4 da SEQ ID NO.:51. Em certas modalidades, uma seqüência de CXR4 humano não apresentará mais de 10 aminoácidos diferentes do CXCR4 da SEQ ID NO.:51. Em certas modalidades modalidades, o CXCR4 humano pode apresentar não mais de 5, ou mesmo não mais de 4, 3, 2 ou 1 aminoácido diferente do CXCR4 da SEQ ID NO.:51. A percentagem da identidade pode ser determinada conforme aqui descrito.
O termo “SDF-1” se refere ao fator 1 derivado de células do estroma que é um ligando para CXCR4. O termo “SDF-1” abrange diferentes isoformas de SDF-1, tais como SDF-ID e SDF-1 □. A seqüência de aminoácidos do SDF-ID humano tem o número de acesso ao Genbank NP_954637. A seqüência de aminoácidos do SDF-1 β humano tem o número de acesso ao Genbank NP 000600. O SDF-1 humano é também descrito na Patente US N0 5,756,084. O SDF-1 é também conhecido como CXCL12. A seqüência de aminoácidos do SDF-1 humano pode diferir do SDF-1 de NP_954637 ou NP_000600, conforme aqui descrito para CXCR4.
O termo "resposta imune" se refere à ação, por exemplo, de linfócitos, células que apresentam antígeno, células fagocíticas, granulócitos e macromoléculas solúveis produzidas pelas células acima mencionadas ou o fígado (incluindo anticorpos, citocinas e complemento) que resulta em lesão, destruição ou eliminação seletiva do corpo humano de patógenos invasores, células ou tecidos infectados com patógenos, células cancerosas ou, nos casos de autoimunidade ou inflamação patológica, células ou tecidos humanos normais.
Uma “via de transdução de sinal” se refere à relação bioquímica entre uma variedade de moléculas de transdução de sinal que desempenham um papel na transmissão de um sinal de uma porção de uma célula para outra porção de uma célula. Conforme aqui utilizada, a expressão "receptor da superfície celular" inclui, por exemplo, moléculas e complexos de moléculas capazes de receber um sinal e a transmissão deste sinal através da membrana plasmática de uma célula. Um exemplo de um “receptor da superfície celular” da presente divulgação é o receptor CXCR4. O termo “anticorpo”, conforme aqui referido, inclui anticorpos inteiros e qualquer fragmento de ligação ao antígeno (isto é, “porção de ligação ao antígeno”) ou suas cadeias simples. Um "anticorpo" se refere a uma glicoproteína compreendendo pelo menos duas cadeia pesadas (H) e duas 5 cadeias leves (L) interligadas por ligações dissulfureto ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo. Cada cadeia pesada é compreendida por uma região variável de cadeia pesada (aqui abreviada como Vh) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada é compreendida por três domínios, Ch 1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é 10 compreendida por uma região variável de cadeia leve (aqui abreviada como VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve é compreendida por um domínio, Cl- As regiões Vh e Vl podem ainda ser subdivididas em regiões de hipervariabilidade, chamadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que 15 são mais conservadas, chamadas de regiões estruturais (FR). Cada Vh e Vl é composta por três CDRs e quatro FRs, dispostas do amino-terminal até o carbóxi-terminal na seguinte ordem: FRl, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias pesadas e leves contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos 20 podem mediar a ligação da imunoglobulina a tecidos hospedeiros ou fatores, incluindo várias células do sistema imunológico (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema de complemento clássico.
O termo "porção de ligação ao antígeno" de um anticorpo (ou simplesmente "porção do anticorpo"), conforme aqui utilizado, se refere a um 25 ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a capacidade de se ligar especificamente a um antígeno (por exemplo, CXCR4). Foi demonstrado que a função de ligação ao antígeno de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo de comprimento total. Exemplos de fragmentos de ligação abrangidos no termo "porção de ligação ao antígeno" de um anticorpo inclui (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste dos domínios VL, VH, Cl e ChI ; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados a uma ponte dissulfüreto na região de dobradiça; (iii) um fragmento Fab’, que é 5 essencialmente um Fab com parte da região de dobradiça (ver, FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul ed., 3.sup.rd ed. 1993); (iv) um fragmento Fd que consiste dos domínios Vh e ChI; (v) um fragmento Fv que consiste dos domínios Vl e Vh de um único braço de um anticorpo, (vi) um fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste de um 10 domínio VH; (vii) uma região determinante de complementaridade isolada (CDR); e (viii) um nanocorpo, uma região variável de cadeia pesada contendo um único domínio variável e dois domínios constantes. Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, Vl e VH, sejam codificados por genes separados, os mesmos podem ser unidos, utilizando métodos recombinantes, 15 por um ligante sintético que permite que os mesmos sejam feitos como uma cadeia de proteína simples onde as regiões Vl e Vh se emparelham para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia simples (scFv); ver, por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; e Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 85:5879-5883). Estes anticorpos de 20 cadeia simples também se destinam a ser abrangidos pelo termo "porção de ligação ao antígeno" de um anticorpo. Estes fragmentos de anticorpos são obtidos utilizando técnicas convencionais conhecidas dos especialistas na técnica e os fragmentos são rastreados quanto à utilidade, da mesma maneira que os anticorpos intactos.
Um "anticorpo isolado", conforme aqui utilizado, pretende se
referir a um anticorpo que é substancialmente livre de outros anticorpos com especificidades antigénicas (por exemplo, um anticorpo isolado que especificamente se liga ao CXCR4 é substancialmente livre de anticorpos que especificamente se ligam a antígenos que não seja o CXCR4). Um anticorpo isolado que especificamente se liga ao CXCR4 pode, no entanto, ter reatividade cruzada com outros antígenos, tais como moléculas de CXCR4 de outras espécies. Além disso, um anticorpo isolado pode ser substancialmente livre de outros materiais celulares e/ou químicos.
5 Os termos "anticorpo monoclonal" ou "composição de
anticorpo monoclonal", conforme aqui utilizados, se referem a uma preparação de moléculas de anticorpo de composição molecular simples. Uma composição de anticorpo monoclonal apresenta uma especificidade e afinidade de ligação simples para um epítopo em particular.
O termo "anticorpo humano", conforme aqui utilizado,
pretende incluir anticorpos que têm regiões variáveis em que tanto a região estrutural como a CDR são derivadas de seqüências de imunoglobulina de linha germinal humana. Além disso, se o anticorpo contiver uma região constante, a região constante também é derivada de seqüências de 15 imunoglobulina da linha germinal humana. Os anticorpos humanos desta revelação podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por seqüências de imunoglobulina da linha germinal humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou sítio-específica in vitro ou por mutação somática in vivo). No entanto, o termo "anticorpo humano" 20 conforme aqui utilizado, não pretende incluir anticorpos onde as seqüências CDR derivadas da linha germinal de outras espécies de mamíferos, tais como um camundongo, tenham sido enxertadas nas seqüências estruturais humanas.
O termo "anticorpo monoclonal humano" se refere a anticorpos que apresentam uma única especificidade de ligação, que têm 25 regiões variáveis em que tanto a região estrutural como a CDR são derivadas de seqüências de imunoglobulina de linha germinal humana. Em uma modalidade, os anticorpos monoclonais humanas são produzidos por um hibridoma que inclui uma célula B obtida de um animal não humano transgênico, por exemplo, um camundongo transgênico, tendo um genoma que compreende um transgene de cadeia pesada humana e um transgene de cadeia leve fundidos em uma célula imortalizada.
O termo "anticorpo humano recombinante", conforme aqui utilizado, inclui todos os anticorpos humanas que são preparados, expressos, 5 criados ou isolados por meios recombinantes, tais como (a) anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico ou transcromossômico para genes de imunoglobulina humana ou um hibridoma preparados destes (descrito mais adiante), (b) anticorpos isolados de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo humano, por 10 exemplo, de um transfectoma, (c) anticorpos isolados de uma biblioteca de anticorpos humanos combinatórios, recombinantes e (d) anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por qualquer outro meio que envolva a união (splicing) das seqüências do gene da imunoglobulina humana a outras seqüências de ADN. Estes anticorpos humanos recombinantes têm 15 regiões variáveis onde a estrutura e as regiões CDR são derivadas das seqüências da imunoglobulina da linha germinal humana. Em certas modalidades, no entanto, estes anticorpos humanos recombinantes podem ser submetidos a mutagênese in vitro (ou, quando é utilizado um animal transgênico para as seqüências de Ig humana, mutagênese somática in vivo) e, 20 deste modo, as seqüências de aminoácidos das regiões Vh e Vl dos anticorpos recombinantes são seqüências que, embora derivadas e relacionadas às seqüências Vh e Vl da linha germinal humana, podem não existir naturalmente no repertório in vivo da linha germinal de anticorpos humanos.
Conforme aqui utilizado, "isotipo" se refere à classe de anticorpo (por exemplo, IgM ou IgGl) que é codificado pelos genes da região constante de cadeia pesada.
As expressões "um anticorpo que reconhece um antígeno" e "um anticorpo específico para um antígeno" são aqui usadas de forma intercambiável com o termo "um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno”.
O termo “derivados de anticorpo humano” se refere a qualquer forma modificada do anticorpo humano, por exemplo, um conjugado do anticorpo e outro agente ou anticorpo.
O termo “anticorpo humanizado” pretende se referir a
anticorpos onde as seqüências CDR derivadas da linha germinal de outra espécie mamífera, tal como camundongo, foram enxertadas nas seqüências estruturais humanas. Modificações adicionais da região estrutural podem ser feitas nas seqüências estruturais humanas.
O termo “anticorpo quimérico” pretende se referir a anticorpos
onde as seqüências da região variável são derivadas de uma espécie e as seqüências da região constante são derivadas de outra espécie, por exemplo, como um anticorpo onde as seqüências da região variável são derivadas de um anticorpo de camundongo e as seqüências da região constante são derivadas de um anticorpo humano.
Conforme aqui utilizado, um anticorpo que “especificamente se liga ao CXCR4 humano” pretende se referir a um anticorpo que se liga ao CXCR4 humano (e possivelmente CXCR4 de uma ou mais espécies não humanas) mas não se liga substancialmente a proteínas não-CXCR4. Em 20 certas modalidades, um anticorpo da presente revelação especificamente se liga ao CXCR4 humano da SEO ID NO.: 51 ou uma variante desta. De preferência, o anticorpo se liga ao CXCR4 humano com uma K0 de 1 x 10'
o
M ou menos, mais preferencialmente 5 x 10' M menos, mais
o f o
preferencialmente 3x10’ M menos, mais preferencialmente 1x10’ M ou menos, ainda mais preferencialmente 5 x IO'9 M menos.
O termo “não se liga substancialmente” a uma proteína ou célula, conforme aqui utilizado, significa que não se liga com uma alta afinidade à proteína ou células, isto é, liga-se à proteína ou células com uma Kd de 1 x IO'6 M ou mais, mais preferencialmente 1 x IO'5 M ou mais, mais preferencialmente 1 x IO-4 M ou mais, mais preferencialmente 1 x IO'3 M ou mais, ainda mais preferencialmente 1 x IO'2 M ou mais.
O termo "Kassoc" ou “Ka”, conforme aqui utilizado, pretende se referir à taxa de associação de uma interação específica anticorpo-antígeno, ao passo que o termo "Kdis" ou ctKd", conforme aqui utilizado, pretende se referir à taxa de dissociação de uma interação específica anticorpo-antígeno.
O termo “KD”, conforme aqui utilizado, pretende se referir à constante de dissociação, que é obtida da proporção de Kd para Ka (isto é, KdZKa) e é expressa como uma concentração molar (M). Os valores Kd para anticorpos podem ser determinados utilizando métodos estabelecidos na técnica. Um método preferido para determinar a Kd de um anticorpo é por meio da utilização de ressonância de plasmons de superfície, tipicamente usando um sistema biossensor, tal como um sistema Biacore®.
Conforme aqui utilizado, o termo “alta afinidade” por um anticorpo IgG se refere a um anticorpo que tem uma K0 de 1 x 10' M ou
Q
menos, mais preferencialmente 5 x 10" M ou menos, ainda mais
■ o # · · Q
preferencialmente 1x10" M ou menos, ainda mais preferencialmente 5 x 10" M ou menos e ainda mais preferencialmente 1 x IO'9 M ou menos, por um antígeno alvo. No entanto, a ligação de “alta afinidade” pode variar para outros isotipos de anticorpos. Por exemplo, ligação de “alta afinidade” por um isotipo IgM se refere a um anticorpo com uma K0 de IO"6 M ou menos, mais
7 8
preferencialmente 10' M ou menos, ainda mais preferencialmente 10' M ou menos.
Conforme aqui utilizado, o termo "indivíduo" inclui qualquer animal humano ou não humano. O termo "animal não humano" inclui todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, tais como primatas não humanos, ovelhas, cães, gatos, cavalos, vacas, galinhas, anfíbios, peixes, répteis, etc.
Vários aspectos desta revelação são descritos em mais detalhes nas subseções a seguir.
Anticorpos Anti-CXCR4
Os anticorpos desta revelação são caracterizados por atributos ou propriedades funcionais particulares dos anticorpos. Por exemplo, os 5 anticorpos se ligam ao CXCR4 humano nativo expresso na superfície de uma célula. De preferência, um anticorpo desta revelação se liga ao CXCR4 com alta afinidade, por exemplo com uma Kd de 1 x IO'7 M ou menos. Os anticorpos anti-CXCR4 desta revelação, de preferência, exibem uma ou mais das seguintes características:
(a) ligam-se ao CXCR4 humano nativo expresso na superfície
de uma célula;
(b) inibem a ligação de SDF-1 ao CXCR4;
(c) inibem o fluxo de cálcio induzido por SDF-1 em células que expressam CXCR4;
(d) inibem a migração induzida por SDF-1 de células que
expressam CXCR4;
(e) inibem a formação de vaso capilar por células endoteliais da veia umbilical humana;
n
(f) ligam-se ao CXCR4 humano com uma Kd de 1x10' M ou
menos;
(g) induzem a apoptose em células que expressam CXCR4;
(h) inibem a proliferação de células tumorais in vitro;
(i) inibem a proliferação de células tumorais e/ou indução de apoptose de células tumorais in vivo;
(j) inibem as metástases de células tumorais CXCR4+; e/ou
(k) aumentam o tempo de sobrevida de um indivíduo portador de tumor CXCR4+.
Em certas modalidades, um anticorpo desta revelação se liga ao CXCR4 humano, nativo na superfície de uma célula mas não inibe a ligação do SDF-1 ao CXCR4 e não inibe o fluxo de cálcio induzido por SDF
1 em células que expressam CXCR4 e não inibe a migração induzida por SDF-1 de células que expressam CXCR4. Em outras modalidades, um anticorpo desta revelação se liga ao CXCR4 humano, nativo na superfície de uma célula e inibe a ligação do SDF-1 ao CXCR4 e inibe o fluxo de cálcio induzido por SDF-1 em células que expressam CXCR4 mas não inibe a migração induzida por SDF-1 de células que expressam CXCR4. Em ainda outras modalidades, um anticorpo desta revelação se liga ao CXCR4 humano nativo em uma superfície de uma célula e inibe a ligação de SDF-1 a CXCR4 e inibe o fluxo de cálcio induzido por SDF-1 em células que expressam CXCR4 e inibe a migração induzida por SDF-1 de células que expressam CXCR4. Em ainda outras modalidades, um anticorpo desta revelação se liga ao CXCR4 humano, nativo na superfície de uma célula, inibe a ligação de SDF-1 a CXCR4, inibe o fluxo de cálcio induzido por SFD-I em células que expressam CXCR4, inibe a migração de células SDF-1 que expressam CXCR4 e inibe a formação de vaso capilar por HuVECs.
De preferência, um anticorpo desta revelação se liga ao CXCR4 humano com uma Kd de 5 x IO'8 M ou menos, liga-se ao CXCR4
Q
humano com uma Kd de 2 x 10' M ou menos, liga-se ao CXCR4 humano com uma Kd de 5 x IO'9 M ou menos, liga-se ao CXCR4 humano com uma Kd de 4 x IO'9 M ou menos, liga-se ao CXCR4 humano com uma Kd de 3 x IO'9 M ou menos, ou liga-se ao CXCR4 humano com uma Kd de 2 x IO'9 M ou menos.
De preferência, um anticorpo desta revelação inibe a ligação 25 do SDF-1 ao CXCR4 humano com um valor EC50 para inibição de 50 nM ou menos, mais preferencialmente 30 nM ou menos, ou 15 nM ou menos, ou 10 nM ou menos, ou 5 nM ou menos, ou 3 nM ou menos (por exemplo, um valor EC5O para inibição de 28,60 nM ou menos, ou 12,51 nM ou menos, ou 2,256 nM ou menos). De preferência, um anticorpo desta revelação inibe o fluxo de cálcio induzido por SDF-1 em células que expressam CXCR4 humano com um valor EC50 para inibição de 3 nM ou menos, mais preferencialmente 2 nM ou menos, ou 1 nM ou menos, ou 0,9 nM ou menos, ou 0,8 nM ou menos, ou 5 0,7 nM ou menos, ou 0,6 nM ou menos, ou 0,5 nM ou menos, ou 0,4 nM ou menos (por exemplo, 0,9046 nM ou menos, 0,5684 ou menos, ou 0,3219 nM ou menos).
De preferência, um anticorpo desta revelação inibe a migração induzida por SDF-1 de células que expressam CXCR4 humano com um valor EC50 para inibição de 50 nM ou menos, mais preferencialmente 30 nM ou menos, ou 20 nM ou menos, ou 15 nM ou menos (por exemplo, 18,99 nM ou menos, ou 12,44 ou menos).
Ensaios padrão para avaliar a capacidade de ligação dos anticorpos aos CXCR4 humanos, nativos expressos na superfície de uma 15 célula são conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, análise de citometria de fluxo utilizando uma linhagem celular que naturalmente expressa o CXCR4 nativo ou que foi transfectada para expressar o CXCR4 nativo. Ensaios adequados estão descritos em detalhes nos Exemplos. Uma linhagem celular preferida que expressa o CXCR4 nativo é a linhagem celular 20 T CEM. São também descritos em detalhes nos Exemplos, ensaios adequados para avaliar a inibição da ligação de SDF-1, a inibição do fluxo de cálcio induzido por SDF-1, a inibição da migração celular induzida por SDF-1, a inibição de formação de vaso capilar por HuVECs, indução de apoptose em células que expressam o CXCR4 in vitro e/ou in vivo, inibição do crescimento 25 de células tumorais CXCR4+ in vitro e/ou in vivo, e/ou inibição de metástases de células tumorais CXCR4+. A afinidade de ligação dos anticorpos também pode ser determinada por métodos convencionais, tais como por análise de Scatchard.
Anticorpos Monoclonais F7, F9, Dl e E2 Os anticorpos preferidos desta revelação são os anticorpos monoclonais humanos F7, F9, Dle E2, isolados e estruturalmente caracterizados conforme descrito nos Exemplos 1 e 2. As seqüências de aminoácidos Vh de F7, F9, Dl e E2 estão apresentadas nas SEQ ID NOs: 25, 5 26, 27 e 28, respectivamente. As seqüências de aminoácidos Vl de F7, F9, Dl e E2 estão apresentadas nas SEQ ID NOs: 29, 30, 31 e 32, respectivamente. Adicionalmente, foram criadas formas alternativas de F7, F9, Dl e E2, em que certos resíduos estruturais foram substituídos por um resíduo de linha germinal, e são aqui referidas como F7GL, F9GL, DlGL e E2GL. As 10 seqüências de aminoácidos Vh de F7GL, F9GL, DlGL e E2GL estão apresentadas nas SEQ ID NOs: 41, 42, 43 e 44, respectivamente. As seqüências de aminoácidos Vl de F7GL, F9GL, DlGL e E2GL estão apresentadas nas SEQ ID NOs: 45, 46, 47 e 48, respectivamente.
Dado que cada um destes anticorpos pode se ligar ao CXCR4, 15 as seqüências Vh e Vl podem ser “misturadas e combinadas” para criar outras moléculas de ligação anti-CXCR4 desta revelação. A ligação CXCR4 destes anticorpos “misturados e combinados” pode ser testada utilizando os ensaios de ligação descritos acima e nos Exemplos (por exemplo, citometria de fluxo com células CEM). De preferência, quando as cadeias Vh e Vl são misturadas 20 e combinadas, uma seqüência Vh de um emparelhamento VhAAl em particular é substituída por uma seqüência Vh estruturalmente similar. Do mesmo modo, de preferência, uma seqüência Vl de um emparelhamento VhAZl em particular é substituída por uma seqüência VL. estruturalmente similar.
Em concordância, em um aspecto esta revelação proporciona um anticorpo monoclonal, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo:
(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 25-28 e 41-44; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 29-32 e 45-48;
onde o anticorpo especificamente se liga ao CXCR4, de preferência CXCR4 humano.
As combinações preferidas de cadeia pesada e leve incluem:
(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25 ou 41 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 ou 45; ou
(b) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26 ou 42 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 30 ou 46; ou
(c) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27 ou 43 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 31 ou 47; ou
(d) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28 ou 44 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 32 ou 48.
Em um outro aspecto esta revelação proporciona anticorpos que compreendem a cadeia pesada e a cadeia leve das CDRls, CDR2s e CDR3s de F7, F9, Dl ou E2, ou combinações das mesmas. As seqüências de aminoácidos das CDRls de Vh de F7, F9, Dl e E2 são apresentadas nas SEQ ID NOs: 1-4, respectivamente. As seqüências de aminoácidos das CDR2s de Vh de F7, F9, Dl e E2 são apresentadas nas SEQ ID NOs: 5-8, respectivamente. As seqüências de aminoácidos das CDR3s de Vh de F7, F9, Dl e Ε2 são apresentadas nas SEQ ID NOs: 9-12, respectivamente. As seqüências de aminoácidos das CDRls de Vk de F7, F9, Dl e E2 são apresentadas nas SEQ ID NOs: 13-16, respectivamente. As seqüências de aminoácidos das CDR2s de Vk de F7, F9, Dl e E2 são apresentadas nas SEQ 5 ID NOs: 17-20, respectivamente. As seqüências de aminoácidos das CDR3s de Vk de F7, F9, Dl e E2 são apresentadas nas SEQ ID NOs: 21-24, respectivamente. As regiões CDR são delineadas utilizando o sistema de Kabat (Kabat, E. A., et al. (1991) Seqüências of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, US Department of Health e Human Services, NIH IO Publication N0 91 -3242).
Dado que cada um destes anticorpos pode se ligar ao CXCR4 e que a especificidade de ligação ao antígeno é proporcionada principalmente pelas regiões CDRl, CDR2 e CDR3, as seqüências de Vh de CDRl, CDR2, e CDR3 e as seqüências de Vk de CDRl, CDR2, e CDR3 podem ser 15 “misturadas e combinadas” (isto é, CDRs de anticorpos diferentes podem ser misturadas e combinadas, embora cada tenha de conter uma Vh de CDRl, CDR2, e CDR3 e uma Vk de CDRl, CDR2, e CDR3) para criar outras moléculas de ligação anti-CXCR4 desta revelação. A ligação de CXCR4 destes anticorpos “misturados e combinados” pode ser testada utilizando os 20 ensaio de ligação descritos acima e nos Exemplos (por exemplo, ELISAs, análise Biacore®). De preferência, quando as seqüências Vh de CDR são misturadas e combinadas, a seqüência CDRl, CDR2, e/ou CDR3 de uma seqüência de Vh específica é substituída por uma sequência(s) CDR estruturalmente similar(es). Do mesmo modo, quando as seqüências de Vk de 25 CDR são misturadas e combinadas, a seqüência CDRl, CDR2 e/ou CDR3 de uma seqüência Vk em particular é de preferência substituída por uma sequência(s) CDR estruturalmente similar(es). Ficará prontamente evidente para o especialista na técnica que as novas seqüências de Vh e Vl podem ser criadas substituindo uma ou mais seqüências da região Vh e/ou Vl de CDR por seqüências estruturalmente similares das seqüências de CDR aqui reveladas para os anticorpos monoclonais F7, F9, Dl e E2.
Em concordância, em um outro aspecto, esta revelação proporciona um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo:
(a) uma região variável de cadeia pesada CDRl compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 1-4;
(b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que
consiste das SEQ ID NOs: 5-8;
(c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 9-12;
(d) uma região variável de cadeia leve CDRl compreendendo
uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 13-16;
(e) uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das SEQ ID
NOs: 17-20; e
(f) uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 21-24;
onde o anticorpo especificamente se liga ao CXCR4, de preferência CXCR4 humano.
Em uma modalidade preferida, o anticorpo compreende:
(a) uma região variável de cadeia pesada CDRl compreendendo a SEQID NO: 1;
(b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo a SEQ ID NO: 5;
(c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo a SEQ ID NO: 9;
(d) uma região variável de cadeia leve CDRl compreendendo a SEQ ID NO: 13;
(e) uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo a SEQ ID NO: 17; e
(f) uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo a SEQ ID NO: 21.
Em uma outra modalidade, o anticorpo compreende:
(a) uma região variável de cadeia pesada CDRl compreendendo a SEQ ID NO: 2;
(b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo a SEQ ID NO: 6;
(c) uma região variável de cadeia pesada CDR3
compreendendo a SEQ ID NO: 10;
(d) uma região variável de cadeia leve CDRl compreendendo a SEQ ID NO: 14;
(e) uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo a SEQ ID NO: 18; e
(f) uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo a SEQ ID NO: 22.
Em uma outra modalidade, o anticorpo compreende:
(a) uma região variável de cadeia pesada CDRl compreendendo a SEQ ID NO: 3;
(b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo a SEQ ID NO: 7;
(c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo a SEQ ID NO: 11; (d) uma região variável de cadeia leve CDRl compreendendo
a SEQID NO: 15;
(e) uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo a SEQ ID NO: 19; e
(f) uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo a
SEQID NO: 23.
Em uma outra modalidade, o anticorpo compreende:
(a) uma região variável de cadeia pesada CDRl compreendendo a SEQ ID NO: 4;
(b) uma região variável de cadeia pesada CDR2
compreendendo a SEQ ID NO: 8;
(c) uma região variável de cadeia pesada CD R3 compreendendo a SEQID NO: 12;
(d) uma região variável de cadeia leve CDRl compreendendo a SEQID NO: 16;
(e) uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo a SEQID NO: 20; e
(f) uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo a SEQID NO: 24.
É sabido na técnica que o domínio CDR3, independentemente
do(s) domínio(s) CDRl e/ou CDR2, por si só pode determinar a especificidade da ligação de um anticorpo para um antígeno cognato e que, previsivelmente, podem ser gerados anticorpos múltiplos tendo a mesma especificidade de ligação com base em uma seqüência de CDR3 comum. Ver, 25 por exemplo, Klimka et al., British J. of Cancer 83(2V.252-260 (2000) (que descreve a produção de anticorpo anti-CD30 humanizado utilizando apenas o domínio variável de cadeia pesada CDR3 de anticorpo Ki-4 anti-CD30 murino); Beiboer et al., J. Mol. Biol 296:833-849 (2000) (que descreve anticorpos de glicoproteína-2 (EGP-2) epitelial recombinante utilizando apenas a seqüência CDR3 de cadeia pesada do anticorpo MOC-31anti-EGP-2 murino); Rader et al., Proc. Natl. Acad.. Sei. EUA. 95:8910-8915 (1998) (que descreve um painel de anticorpos anti-integrina ανβ3 humanizados utilizando um domínio CDR3 variável de cadeia pesada e cadeia leve de um anticorpo 5 LM609 anti-integrina murino ανβ3, onde cada anticorpo membro compreende uma seqüência distinta fora do domínio CDR3 e capaz de ligar o mesmo epítopo que o anticorpo murino precursor com afinidades tão altas ou mais altas que o anticorpo murino precursor); Barbas et al., J. Am. Chem. Soc. 116:2161-2162 (1994) (que revelam que o domínio CDR3 proporciona a 10 contribuição mais significativa à ligação do antígeno); Barbas et al., Proc. Natl. Aead. Sei. EUA. 92:2529-2533 (1995) (que descrevem o enxerto de seqüências CDR3 de cadeia pesada de três Fabs (SI-1, SI-40, e SI-32) contra ADN placentário humano na cadeia pesada de um Fab toxóide anti-tetânico, deste modo substituindo a cadeia pesada de CDR3 existente e demonstrando 15 que o domínio CDR3 por si só confere especificidade de ligação); Ditzel et al., J. Immunol. 157:739-749 (1996) (que descrevem estudos de enxerto onde a transferência de apenas o CDR3 de cadeia pesada de um Fab LNA3 poliespecífico precursor para uma cadeia pesada de um anticorpo Fab p313 de ligação ao toxóide de tétano IgG monoespecífico foi suficiente para reter a 20 especificidade de ligação do Fab precursor); Berezov et al., BIAjournal 8: Scientific Review 8 (2001) (que descrevem peptídeos miméticos com base no CDR3 de um anticorpo monoclonal anti-HER2; Igarashi et al., J. Biochem (Tóquio) 117:452-7 (1995) (que descrevem um polipeptídio sintético de 12 aminoácidos correspondente ao domínio CDR3 de um anticorpo anti25 fosfatidilserina); Bourgeois et al, J. Virol 72:807-10 (1998) (que mostram que um único peptídeo derivado do domínio CDR3 de cadeia pesada de um anticorpo anti-vírus sincicial respiratório (RSV) foi capaz de neutralizar o vírus in vitro); Levi et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 90:4374-8 (1993) (que descrevem um peptídeo com base no domínio CDR3 de cadeia pesada de um anticorpo murino anti-HIV); Polymenis e Stoller, J. Immunol. 152:5218-5329 (1994) (que descrevem permitir a ligação de um scFv enxertando a região CDR3 de cadeia pesada de um anticorpo de ligação ao Z-ADN) e Xu e Davis, Immunity J_3:37-45 (2000) (que descrevem que a diversidade no CDR3 de 5 cadeia pesada é suficiente para permitir que moléculas IgM de resto idênticas sejam distinguidas entre uma variedade de haptenos e antígenos protéicos). Ver também, as Patentes US Nos. 6,951,646; 6,914,128; 6,090,382; 6,818,216; 6,156,313; 6,827,925; 5,833,943; 5,762,905 e 5,760,185, que descrevem anticorpos patenteados definidos por um único domínio CDR. 10 Cada uma destas referências é aqui integralmente incorporada por citação.
Em concordância, a presente revelação proporciona anticorpos monoclonais que compreendem um ou mais domínios CDR3 de cadeia pesada e/ou leve de um anticorpo derivado de um animal humano ou não humano, onde o anticorpo monoclonal é capaz de especificamente se ligar ao CXCR4. 15 Em certos aspectos, a presente revelação proporciona anticorpos monoclonais que compreendem um ou mais domínios CDR3 de cadeia pesada e/ou leve de um anticorpo não humano, tal como o anticorpo de um camundongo ou rato, onde o anticorpo monoclonal é capaz de especificamente se ligar ao CXCR4. Em algumas modalidades, estes anticorpos da invenção compreendendo um 20 ou mais domínios CDR3 de cadeia pesada e/ou leve de um anticorpo não humano (a) são capazes de competir por ligação; (b) reter as características funcionais; (c) ligar-se ao mesmo epítopo; e/ou (d) ter uma afinidade de ligação similar à do anticorpo não humano parental correspondente.
Em outros aspectos, a presente divulgação proporciona 25 anticorpos monoclonais que compreendem um ou mais domínios CDR3 de cadeia pesada e/ou leve de um anticorpo humano, tal como, por exemplo, um anticorpo humano obtido de um animal não humano, onde o anticorpo humano é capaz de se ligar especificamente ao CXCR4. Em outros aspectos, a presente divulgação proporciona anticorpos monoclonais que compreendem um ou mais domínios CDR3 de cadeia pesada e/ou leve de um primeiro anticorpo humano, tal como, por exemplo um anticorpo humano obtido de um animal não humano, onde o primeiro anticorpo humano é capaz de especificamente se ligar ao CXCR4 e onde o domínio CDR3 do primeiro 5 anticorpo humano substitui um domínio CDR3 num anticorpo humano que não tem especificidade de ligação para CXCR4 para gerar um segundo anticorpo humano que é capaz de se ligar especificamente ao CXCR4. Em algumas modalidades, estes anticorpos da invenção que compreendem um ou mais domínios CDR3 de cadeia pesada e/ou leve do primeiro anticorpo 10 humano (a) são capazes de competir por ligação; (b) reter as características funcionais; (c) ligar-se ao mesmo epítopo; e/ou (d) ter uma afinidade de ligação similar do anticorpo não humano parental correspondente.
Anticorpos com Seqüências de Linha Germinal Específica
Em certas modalidades, um anticorpo desta revelação compreende uma região variável de cadeia pesada de um gene de imunoglobulina de cadeia pesada de linha germinal específica e/ou uma região variável de cadeia leve de um gene de imunoglobulina de cadeia leve de linha germinal específica.
Por exemplo, em uma modalidade preferida, esta divulgação 20 proporciona um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada que é o produto ou é derivado de um gene Vh 3-48 humano, onde o anticorpo se liga especificamente ao CXCR4. Em outra modalidade preferida, esta divulgação proporciona um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de 25 ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia leve que é o produto ou é derivado de um gene Vk Ll 5 humano, onde o anticorpo se liga especificamente ao CXCR4. Em ainda outra modalidade preferida, esta divulgação proporciona um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada que é o produto ou é derivado de um gene Vh 3-48 humano e compreende uma região variável de cadeia leve que é o produto ou é derivado de um gene Vk Ll5 humano, onde o anticorpo se liga especificamente ao CXCR4, de preferência CXCR4 humano. Estes anticorpos 5 também podem possuir uma ou mais das características funcionais acima descritas em detalhe, tais como ligação ao CXCR4 nativo expresso na superfície de uma célula, inibição da ligação de SDF-I ao CXCR4, inibição do fluxo de cálcio induzido por SDF-I em células que expressam CXCR4, inibição da migração induzida por SDF-I de células que expressam CXCR4, 10 inibição da formação de vaso capilar por HuVECs, indução de apoptose em células que expressam o CXCR4 in vitro e/ou in vivo, inibição do crescimento de células tumorais CXCR4+ in vitro e/ou in vivo, e/ou inibição de metástases de células tumorais CXCR4+.
Exemplos de anticorpos que têm Vh e Vk de Vh 3-48 e Vk L15, respectivamente, são os anticorpos F7, F9, Dle E2.
Conforme aqui utilizado, um anticorpo humano compreende regiões variáveis de cadeia pesada ou leve que é “o produto de” ou “derivado de” uma seqüência de linha germinal específica se as regiões variáveis do anticorpo forem obtidas de um sistema que utiliza genes de imunoglobulina 20 de linha germinal humana. Estes sistemas incluem imunizar um camundongo transgênico portador de imunoglobulina humana com o antígeno de interesse ou rastrear uma biblioteca de genes de imunoglobulina humana apresentados sobre a superfície de fagos com o antígeno de interesse. Um anticorpo humano que é “o produto de” ou “derivado de” uma seqüência de 25 imunoglobulina de linha germinal humana pode ser identificado como tal por comparação da seqüência de aminoácidos do anticorpo humano com as seqüências de aminoácidos das imunoglobulinas de linha germinal humana e selecionando a seqüência de imunoglobulina de linha germinal humana que seja mais próxima em seqüência (isto é, maior % de identidade) à seqüência do anticorpo humano. Um anticorpo humano que é “o produto de” ou “derivado de” uma seqüência de imunoglobulina de linha germinal humana específica pode conter diferenças de aminoácidos em comparação com a seqüência da linha germinal, por exemplo, devido a mutações somáticas de 5 ocorrência natural ou introdução intencional de mutação sítio-dirigida. No entanto, um anticorpo humano selecionado, tipicamente, é pelo menos 90% idêntico em seqüência de aminoácidos a uma seqüência de aminoácidos codificada por um gene de imunoglobulina de linha germinal humana e contém resíduos de aminoácidos que identificam o anticorpo humano como 10 sendo humano quando comparado a seqüências de aminoácido de imunoglobulina de linha germinal de outras espécies (por exemplo seqüências de linha germinal murina). Em certos casos, um anticorpo humano pode ser pelo menos 95% ou mesmo pelo menos 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico em seqüência de aminoácidos à seqüência de aminoácidos codificada pelo gene 15 de imunoglobulina de linha germinal humana. Tipicamente, um anticorpo humano derivado de uma seqüência de linha germinal humana específica não apresentará mais de 10 aminoácidos diferentes da seqüência de aminoácidos codificada pelo gene de imunoglobulina de linha germinal humana. Em certos casos, o anticorpo humano pode apresentar não mais de 5 ou mesmo não mais 20 de 4, 3, 2 ou 1 aminoácidos diferentes da seqüência de aminoácidos codificada pelo gene de imunoglobulina de linha germinal.
Anticorpos Homólogos
Em ainda outra modalidade, um anticorpo desta revelação compreende regiões variáveis de cadeia pesada e leve compreendendo 25 seqüências de aminoácidos que são homólogas às seqüências de aminoácidos dos anticorpos preferidos aqui descritos, e onde os anticorpos retêm as propriedades funcionais desejadas para os anticorpos anti-CXCR4 desta revelação.
Por exemplo, esta revelação proporciona um anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, onde:
(a) a região variável de cadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 80% homóloga a uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 25-28 e 41-44;
(b) a região variável de cadeia leve compreende uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 80% homóloga a uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 29-32 e 45- 48;
(c) o anticorpo se liga ao CXCR4 humano nativo expresso na superfície de uma célula.
Adicionalmente ou alternativamente, o anticorpo pode possuir uma ou mais das seguintes propriedades funcionais: (i) liga-se ao CXCR4 humano com uma Kd de IxlO"7 M ou menos; (ii) inibe a ligação do SDF-I ao CXCR4; (iii) inibe o fluxo de cálcio induzido por SDF-I em células que expressam CXCR4; (iv) inibe a migração induzida por SDF-I de células que expressam CXCR4; (v) inibe a formação de vaso capilar por HuVECs; (vi) induz a apoptose em células que expressam CXCR4 in vitro e/ou in vivo; (vii) inibe o crescimento de células tumorais CXCR4+ in vitro e/ou in vivo; e/ou (viii) inibe metástases de células tumorais de CXCR4+.
Em várias modalidades, o anticorpo pode ser, por exemplo, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico.
Em outras modalidades, a seqüência de aminoácidos Vh e/ou Vl pode ser 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% homóloga às seqüências apresentadas acima. Um anticorpo que tem regiões VHe Vl com alta homologia (isto é, 80% ou superior) às regiões Vh e Vl das seqüências apresentadas acima, podem ser obtidos por mutagênese, (por exemplo, mutagênese sítio-dirigida ou mediada por PCR) de moléculas de ácido nucleico que codificam as SEQ ID NOs: 25-32 ou 41-48, seguido por teste dos anticorpos alterados codificados para a função retida (isto é, as funções apresentadas acima) utilizando os ensaios funcionais aqui descritos.
5 Conforme aqui utilizado, a percentagem da homologia entre as
seqüências de aminoácidos é equivalente à percentagem de identidade entre as duas seqüências. A percentagem de identidade entre as duas seqüências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas seqüências (isto é, % homologia = N0 de posições idênticas/N° total de posições x 100), 10 levando em conta o número de espaços (gaps) e o comprimento de cada espaço que necessita ser introduzido para o alinhamento ótimo das duas seqüências. A comparação de seqüências e a determinação da percentagem de identidade entre duas seqüências pode ser obtida utilizando um algoritmo matemático, conforme descrito nos exemplos não limitativos adiante.
A percentagem de identidade entre duas seqüências de
aminoácidos pode ser determinada utilizando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)), que foi incorporado no programa ALIGN (versão 2.0) usando uma tabela de resíduo de peso PAM120, uma penalidade para comprimento de espaços (gap lenght penalty) 20 de 12 e uma penalidade para espaços (gap penalty) de 4. Além disso, a percentagem de identidade entre duas seqüências de aminoácidos pode ser determinada utilizando o algoritmo de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)) que foi incorporado no programa GAP no pacote de software GCG (disponível em http://www.gcg.com), utilizando uma matriz 25 Blossum 62 ou uma matriz PAM250 e um gap weight de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e um length weight de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.
Adicionalmente ou alternativamente, as seqüências de proteínas da presente invenção também podem ser utilizadas como uma "seqüência de consulta" {query sequence) para realizar uma busca em bases de dados públicas a fim de, por exemplo, identificar seqüências relacionadas. Estas buscas podem ser realizadas utilizando o programa XBLAST (versão 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Buscas da proteína BLAST podem ser realizadas com o programa XBLAST, escore = 50, 5 comprimento da palavra = 3 para obter seqüências de aminoácidos homólogas às moléculas de anticorpos da invenção. Para obter alinhamentos espaçados com finalidade de comparação, pode-se utilizar Gapped BLAST conforme descrito em Altschul et al, (1997) Nucleic Aeids Res. 25(17):3389-3402. Quando se utiliza os programas BLAST e Gapped BLAST, são úteis os 10 parâmetros por defeito dos programas respectivos (por exemplo, XBLAST e NBLAST). Ver www.ncbi.nlm.nih.gov.
Anticorpos com Modificações Conservadoras
Em certas modalidades, um anticorpo desta divulgação compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo as 15 seqüências CDRl, CDR2 e CDR3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo as seqüências CDR1, CDR2 e CDR3, onde uma ou mais destas seqüências CDR compreendem seqüências de aminoácido especificadas com base nos anticorpos preferidos aqui descritos (por exemplo, F7, F9, Dl ou E2), ou modificações conservadoras das mesmas e onde os 20 anticorpos retêm as propriedades funcionais desejadas dos anticorpos antiCXCR4 desta revelação. É entendido na técnica que podem ser feitas certas modificações conservadoras de seqüência que não removem a ligação ao antígeno. Ver, por exemplo, Brummell et al (1993) Bioehem 32:1180-8 (que descrevem a análise mutacional no domínio da cadeia pesada de CDR3 de 25 anticorpos específicos para Salmonellaf); de Wildt et al. (1997) Prot. Eng. 10:835-41 (que descrevem estudos de mutação em anticorpos anti-UAl); Komissarov et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:26864-26870 (que demonstram que mutações no meio de HCDR3 levam a uma afinidade abolida ou diminuída); Hall et al. (1992) J. Immunol. 149:1605-12 (que descrevem que uma única mudança de aminoácido na região CDR3 aboliu a atividade de ligação); Kelley e O5Connell (1993) Biochem. 32:6862-35 (que descrevem a contribuição dos resíduos de Tyr em ligação ao antígeno); Adib-Conquy et al. (1998) Int. Immunol. 10:341-6 (que descrevem o efeito da hidrofobicidade na 5 ligação) e Beers et al. (2000) Clin. Can. Res. 6:2835-43 (que descrevem aminoácidos HCDR3 mutantes). Em concordância, a invenção proporciona um anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo as seqüências CDRl, CDR2 e CDR3 e uma região variável 10 de cadeia leve compreendendo as seqüências CDRl, CDR2 e CDR3, onde:
(a) a seqüência CDR3 da região variável de cadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das seqüências de aminoácido das SEQ ID NOs: 9-12, e modificações conservadoras das mesmas;
(b) a seqüência CDR3 da região variável de cadeia leve
compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das seqüências de aminoácido das SEQ ID NOs: 21-44, e modificações conservadoras das mesmas; e
(c) to anticorpo se liga ao CXCR4 humano nativo expresso na superfície de uma célula.
Adicionalmente ou alternativamente, o anticorpo pode possuir uma ou mais das seguintes propriedades: (i) liga-se ao CXCR4 humano com uma Kd de IxlO'7 M ou menos; (ii) inibe a ligação de SDF-I ao CXCR4; (iii) inibe o fluxo de cálcio induzido por SDF-I em células que expressam 25 CXCR4; (iv) inibe a migração induzida por SDF-I de células que expressam CXCR4; (v) inibe a formação de vaso capilar por HuVECs; (vi) induz a apoptose em células que expressam CXCR4 in vitro e/ou in vivo; (vii) inibe o crescimento de células tumorais CXCR4+ in vitro e/ou in vivo; e/ou (viii) inibe a metástase de células tumorais CXCR4+. Numa modalidade preferida, a seqüência CDR2 da região variável de cadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das seqüências SEQ ID NOs: 5-8, e modificações conservadoras das mesmas; e a seqüência CDR2 da região 5 variável de cadeia leve compreende uma seqüência de selecionada do grupo que consiste das seqüências SEQ ID NOs: 17-20, e modificações conservadoras das mesmas. Em uma outra modalidade preferida, a seqüência CDRl da região variável de cadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das seqüências SEQ ID NOs: 10 1-4, e modificações conservadoras das mesmas; e a seqüência CDRl da região variável de cadeia leve compreende uma seqüência de selecionada do grupo que consiste das seqüências SEQ ID NOs: 13-16, e modificações conservadoras das mesmas.
Em várias modalidades, o anticorpo pode ser, por exemplo, anticorpos humanos, anticorpos humanizados ou anticorpos quiméricos.
Conforme aqui utilizado, o termo “modificações conservadoras da seqüência” pretende se referir a modificações do aminoácido que não afetam ou alteram de forma significativa as características do anticorpo que contém a seqüência de aminoácidos. Estas 20 modificações conservadoras incluem substituições adições e deleções de aminoácidos. Modificações podem ser introduzidas num anticorpo desta revelação por meio de métodos convencionais conhecidos na técnica, tais como mutagênese sítio-dirigida e mutagênese mediada por PCR. Substituições conservadoras de aminoácidos são aquelas nas quais o resíduo 25 de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido que tem uma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos de aminoácidos com cadeia laterais similares foram definidas na técnica. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano), cadeias laterais não polares (exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadeias laterais beta-ramificadas (exemplo, treonina, valina, 5 isoleucina) e cadeia laterais aromáticas (exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Deste modo, um ou mais resíduos de aminoácidos nas regiões CDR de um anticorpo desta revelação podem ser substituídos por outros resíduos de aminoácido da mesma família de cadeia lateral e o anticorpo alterado pode ser testado quanto à função retida (isto é, as funções 10 apresentada cima) utilizando os ensaios funcionais aqui descritos.
Anticorpos que se Ligam ao Mesmo Epítopo que os Anticorpos Anti-CXCR4 Em uma outra modalidade, esta revelação proporciona anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo em CXCR4 humano que qualquer um dos anticorpos monoclonais anti-CXCR4 desta revelação (isto é, anticorpos que têm a capacidade de competição cruzada para ligação ao CXCR4 com qualquer um dos anticorpos monoclonais desta revelação). Em modalidades preferidas, o anticorpo de referência para estudo de competição cruzada pode ser o anticorpo monoclonal F7 (que tem seqüências Vh e Vl conforme apresentado nas SEQ ID NOs: 25 e 29, respectivamente), ou o anticorpo monoclonal F9 (que tem seqüências VH e Vl conforme apresentado nas as SEQ ID NOs: 26 e 30, respectivamente) ou o anticorpo monoclonal Dl (que tem seqüências Vh e Vl conforme apresentado nas SEQ ID NOs: 27 e 31, respectivamente) ou o anticorpo monoclonal E2 (que tem seqüências Vh e Vl conforme apresentado nas SEQ ID NOs: 28 e 32, respectivamente).
Estes anticorpos de competição cruzada podem ser
identificados com base na sua capacidade de competição cruzada com F7, F9, Dl ou E2 em ensaios de ligação convencionais de CXCR4. Por exemplo, citometria de fluxo com células CEM pode ser utilizada para demonstrar a competição cruzada com os anticorpos da presente revelação, onde o anticorpo de referência é marcado com FITC e é avaliada a capacidade de um anticorpo de teste de inibir a ligação do anticorpo de referência marcado com FITC a células CEM. A capacidade de um anticorpo de teste de inibir a ligação, por exemplo de F7, F9, Dl ou E2 ao CXCR4 humano demonstra que 5 o anticorpo de teste pode competir com F7, F9, Dl ou E2 quanto à ligação ao CXCR4 humano e, deste modo, se liga ao mesmo epítopo em CXCR4 humano que F7, F9, Dl ou E2. Em uma modalidade preferida, o anticorpo que se liga ao mesmo epítopo em CXCR4 que F7, F9, Dl ou E2 é um anticorpo monoclonal humano. Estes anticorpos monoclonais humanos 10 podem ser preparados e isolados conforme descrito nos Exemplos.
Anticorpos Engenheirados e Modificados
Um anticorpo da invenção também pode ser preparado utilizando um anticorpo que tem uma ou mais das seqüências Vh e/ou Vl aqui descritas como material de partida para produzir um anticorpo modificado, 15 cujo anticorpo modificado pode ter propriedades alteradas em relação ao anticorpo de partida. Um anticorpo pode ser produzido pela modificação de um ou mais resíduos em uma ou ambas as regiões variáveis (isto é, Vh e/ou VL), por exemplo em uma ou mais regiões CDR e/ou em uma ou mais regiões estruturais. Adicionalmente ou alternativamente, um anticorpo pode ser 20 produzido pela modificação dos resíduos na(s) região(ões) constante(s), por exemplo para alterar a(s) função(ões) efetora(s) do anticorpo.
Em certas modalidades, pode-se utilizar enxerto de CDR para modificar regiões variáveis dos anticorpos. Os anticorpos interagem com antígenos alvo predominantemente por meio de resíduos de aminoácidos que 25 estão localizados nas seis regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada e leve (CDRs). Por este motivo, as seqüências de aminoácido no interior das CDRs são mais diversas entre anticorpos individuais do que seqüências fora das CDRs. Devido ao fato das seqüências de CDR serem responsáveis pela maior parte das interações anticorpo-antígeno, é possível expressar anticorpos recombinantes que simulam as propriedades de anticorpos específicos de ocorrência natural construindo vetores de expressão que incluem seqüências de CDR do anticorpo específico de ocorrência natural enxertado nas seqüências de estrutura de um anticorpo diferente com 5 propriedades diferentes (ver, por exemplo, Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525: Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci EUA 86:10029-10033; Patente US N0 5,225,539 de Winter e Patentes US Nos. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 e 6,180,370 de Queen et al.)
Em concordância, outra modalidade desta revelação pertence a
um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo as seqüências CDRl, CDR2 e CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das SEQ ID 15 NOs: 1-4, SEQ ID NOs: 5-8 e SEQ ID NOs: 9-12, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve compreendendo as seqüências CDRl, CDR2 e CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 13-16, SEQ ID NOs: 17-20 e SEQ ID NOs: 21-24, respectivamente. Deste modo, estes anticorpos contêm as seqüências 20 CDR de Vh e Vl dos anticorpos monoclonais F7, F9, Dl ou E2 porém podem conter seqüências estruturais diferentes destes anticorpos.
Estas seqüências estruturais podem ser obtidas de bases de dados públicas de ADN ou referências publicadas que incluem seqüências de gene de anticorpo de linha germinal. Por exemplo, as seqüências de ADN de 25 linha germinal para genes da região variável de cadeia pesada e leve podem ser encontradas na base de dados de seqüências de linha germinal humana "VBase" (disponível na Internet em www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase). bem como em Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, NIH Publication N0 91-3242; Tomlinson, I. M., et al (1992) "The Repertoire of Human Germline Vh Sequences Reveals about Fifty Groups of Vh Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol Biol. 227:776-798; e Cox, J. P. L. et al. (1994) "A Directory of Human Germline Vh Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836; os conteúdos integrais de cada uma das quais são aqui expressamente incorporados por citação. Como outro exemplo, as seqüências de ADN de linha germinal para genes da região variável de cadeia pesada e leve podem ser encontradas na base de dados do GenBank. Por exemplo, as seguintes seqüências de linha IO germinal de cadeia pesada encontradas no camundongo HCo7 HuMAb estão disponíveis nos seguinte números de acesso do GenBank: 1-69 (NG 0010109, NT_024637 e BC070333), 3-33 (NG_0010109 e NT_024637) e 3-7 (NG_0010109 e NT_024637). Como outro exemplo, as seguintes seqüências de linha germinal de cadeia pesada encontradas no camundongo HCo 12 HuMAb estão disponíveis nos seguinte números de acesso do GenBank: 1-69 (NG_0010109, NT_024637 e BC070333), 5-51 (NG 0010109 e NT__024637), 4-34 (NG_0010109 e NT_024637), 3-30.3 (CAJ556644) e 3-23 (AJ406678). Ainda outra fonte de seqüências de linha germinal de cadeia pesada e leve humanas é a base de dados de genes de imunoglobulina humana disponível de IMGT (http://imgt.cines.fr).
As seqüências de proteínas de anticorpos são comparadas a uma base de dados compilada de seqüências de proteínas utilizando um dos métodos de busca de similaridade de seqüência chamado Gapped BLAST (Altschul et al. (1997) Nucleic Aeids Research 25:3389-3402), que é bem 25 conhecido dos especialistas na técnica. BLAST é um algoritmo heurístico onde é provável que um alinhamento estatisticamente significativo entre a seqüência de anticorpos e a seqüência da base de dados contenha pares de segmentos de alto escore (do inglês High-scoring segment pairs, HSP) de palavras alinhadas. Os pares de segmentos cujos escores não podem ser melhorados por extensão ou corte é chamado de hit. Em resumo, as seqüências de nucleotídeos de origem VBASE (httyJ/vbase. mrccpe. cam. ac. ukZvbasel/list2.php) são traduzidas e a região entre e incluindo a região de estrutura FRl até FR3 é retida. As seqüências da base de dados têm 5 um comprimento médio de 98 resíduos. São removidas as seqüências em duplicata que são correspondências exatas do comprimento total da proteína. Um BLAST busca proteínas utilizando o programa blastp com default, parâmetros padrão exceto o filtro de baixa complexidade que é desligado e a matriz de substituição de BLOSUM62, filtros dos 5 maiores hits dando 10 correspondências de seqüência. As seqüências de nucleotídeos são traduzidas em todas as seis fases e a fase sem códon de parada no segmento correspondente da seqüência da base de dados é considerado o hit potencial. Isto é, por sua vez, confirmado utilizando o programa BLAST tblastx, que traduz a seqüência de anticorpo em todas as seis fases e compara estas 15 traduções às seqüências de nucleotídeos da VBASE dinamicamente traduzidas em todas seis fases. Outras bases de dados de seqüências de linha germinal humana, tais como as disponíveis de IMGT (http://imgt.cines.fr), podem ser pesquisadas de forma similar às da VBASE descritas acima.
As identidades são correspondências de aminoácidos exatas 20 entre a seqüência de anticorpos e a base de dados de proteínas ao longo de um comprimento total da seqüência. Os positivos (identidades + correspondências de substituição) não são idênticos mas substituições de aminoácidos guiadas pela matriz de substituição BLOSUM62. Se a seqüência de anticorpos corresponde a duas das seqüências da base de dados com a mesma identidade, 25 o hit com mais positivos seria decidido como sendo o hit da seqüência correspondente.
As seqüências estruturais preferidas para utilização nos anticorpos desta revelação são aquelas que são estruturalmente similares às seqüências estruturais utilizadas por anticorpos selecionados desta revelação, por exemplo, similares às seqüências estruturais Vh 3-48 (SEQ ID NO: 49) e/ou à seqüência estrutural Vk Ll5 (SEQ ID NO: 50) utilizadas por anticorpos monoclonais preferidos desta revelação. As seqüências de CDRl, CDR2 de Vh e CDR3, e as seqüências de CDRl, CDR2 e CDR3 de Vk, podem ser 5 enxertadas em regiões estruturais que têm a seqüência idêntica àquela encontrada no gene da imunoglobulina de linha germinal do qual a seqüência de estrutura deriva ou as seqüências de CDR podem ser enxertadas nas regiões estruturais que contêm uma ou mais mutações em comparação com as seqüências da linha germinal. Por exemplo, constatou-se que em certos casos, 10 é benéfico causar a mutação de resíduos nas regiões estruturais para manter ou aumentar a capacidade de ligação do antígeno (ver, por exemplo, as Patentes US Nos. 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370 de Queen et al).
Outro tipo de modificação da região variável é causar uma mutação dos resíduos de aminoácidos no interior das regiões Vh e/ou Vk de CDR1, CDR2 e/ou CDR3 para, deste modo, melhorar uma ou mais propriedades de ligação (por exemplo, a afinidade) do anticorpo de interesse. Pode-se realizar a mutagênese sítio-dirigida ou a mutagênese mediada por PCR para introduzir a(s) mutação(ões) e o efeito sobre a ligação ao anticorpo ou outras propriedades funcionais de interesse pode ser avaliado em ensaios in vitro ou in vivo conforme aqui descrito e proporcionado nos Exemplos. De preferência, são introduzidas modificações conservadoras (conforme discutido acima). As mutações podem ser substituições, adições ou deleções de aminoácidos, mas, de preferência, são substituições. Além disso, tipicamente, não são alterados mais de um, dois, três, quatro ou cinco resíduos no interior de uma região CDR.
Em concordância, em uma outra modalidade, a presente divulgação proporciona anticorpos monoclonais isolados anti-CXCR4 ou porções de ligação ao seu antígeno, compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo (a) uma região CDRl de Vh compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 1-4, ou uma seqüência de aminoácidos que tem uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos em comparação com as SEQ ID NOs: 1-4; (b) uma região CDR2 de Vh compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 5-8, ou uma seqüência de aminoácidos que tem uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos em comparação com as SEQ ID NOs: 5-8; (c) uma região CDR3 de Vh compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 9-12, ou uma seqüência de aminoácidos que tem uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos em comparação com as SEQ ID NOs: 9-12; (d) uma região CDRl de Vk compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 13-16, ou uma seqüência de aminoácidos que tem uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos em comparação com as SEQ ID NOs: 13-16; (e) uma região CDR2 de Vk compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 17-20, ou uma seqüência de aminoácidos que tem uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos em comparação com as SEQ ID NOs: 17-20; e (f) uma região CDR3 de Vk compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 21-24, ou uma seqüência de aminoácidos que tem uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos em comparação com as SEQID NOs: 21-24.
Os anticorpos engenehirados desta revelação incluem aqueles onde foram feitas modificações aos resíduos estruturais em Vh e/ou Vk, por exemplo para melhorar as propriedades do anticorpo. Tipicamente, estas modificações da estrutura são feitas para diminuir a imunogenicidade do anticorpo. Por exemplo, uma abordagem é “reverter” um ou mais resíduos da estrutura à seqüência da linha germinal correspondente. Mais especificamente, um anticorpo que foi submetido a mutação somática pode conter resíduos de estrutura que diferem da seqüência da linha germinal da 5 qual o anticorpo é derivado. Estes resíduos podem ser identificados por comparação das seqüências de estrutura do anticorpo com as seqüências da linha germinal da qual o anticorpo é derivado.
Por exemplo, para a região de Vh de F7, as seguintes posições de aminoácidos da região estrutural (utilizando o sistema de numeração de 10 Kabat) diferem da linha germinal: 1, 6 e 25. Uma, duas ou todas as três destas posições podem ter a mutação revertida para seqüências de linha germinal fazendo uma, duas ou todas as três das seguintes substituições: QlE, Q6E e A25S. Uma forma modificada preferida da região de Vh de F7 é Vh de F7GL (cuja seqüência de aminoácidos está apresentada na Figura 5A e na SEQ ID 15 NO: 41), que tem as seguintes substituições estruturais: QlE e Q6E.
Além disso, para a região de Vk de F7, as seguintes posições de aminoácidos da região estrutural (utilizando o sistema de numeração de Kabat) diferem da linha germinal: 1, 3 e 84. Uma, duas ou todas as três destas posições podem ter a mutação revertida para seqüências de linha germinal 20 fazendo uma, duas ou todas as três das seguintes substituições: AID, R3Q e V84A. Uma forma modificada preferida da região de Vjc de F7 é Vk de F7GL (cuja seqüência de aminoácidos está apresentada na Figura 5B e na SEQ ID NO: 45), que tem as seguintes substituições estruturais: AID e R3Q.
Além disso, para a região de Vh de F9, as seguintes posições 25 de aminoácidos da região estrutural (utilizando o sistema de numeração de Kabat) diferem da linha germinal: 1, 6 e 25. Uma, duas ou todas as três destas posições podem ter a mutação revertida para seqüências de linha germinal fazendo uma, duas ou todas as três das seguintes substituições: QlE, Q6E e A25S. Uma forma modificada preferida da região de Vh de F9 é a Vh de F9GL (cuja seqüência de aminoácidos está apresentada na Figura 6A e na SEQ ID NO: 42), que tem as seguintes substituições estruturais: QlEe Q6E.
Além disso, para a região Vk de F9, as seguintes posições de aminoácidos da região estrutural (utilizando o sistema de numeração de 5 Kabat) diferem da linha germinal: 1, 3, 4 e 60. Uma, duas, três ou todas as quatro destas posições podem ter a mutação revertida para seqüências de linha germinal fazendo uma, duas, três ou todas as quatro das seguintes substituições: ElD, V3Q, L4M e P60S. Uma forma modificada preferida da região de Vk de F9 é a Vk de F9GL (cuja seqüência de aminoácidos está 10 apresentada na Figura 6B e na SEQ ID NO: 46), que tem as seguintes substituições estruturais: ElD, V3Q e L4M.
Além disso, para a região Vh de Dl, as seguintes posições de aminoácidos da região estrutural (utilizando o sistema de numeração de Kabat) diferem da linha germinal: 6, 25 e 76. Uma, duas ou todas as três 15 destas posições podem ter a mutação revertida para seqüências de linha germinal fazendo uma, duas ou todas as três das seguintes substituições: Q6E, A25S e R76K. Uma forma modificada preferida da região de Vh de Dl é a Vh de DlGL (cuja seqüência de aminoácidos está apresentada na Figura 7A e na SEQ ID NO: 43), que tem a seguinte substituição estruturais: Q6E.
Além disso, para a região Vk de Dl, as seguintes posições de
aminoácidos da região estrutural (utilizando o sistema de numeração de Kabat) diferem da linha germinal: 1, 3, 4, 45 e 46. Uma, duas, três, quatro ou todas as cinco destas posições podem ter a mutação revertida para seqüências de linha germinal fazendo uma, duas, três, quatro ou todas as cinco das 25 seguintes substituições: VlD, W3Q, V4M, E45K e L46S. Uma forma modificada preferida da região de Vk de Dl é a Vk de DlGL (cuja seqüência de aminoácidos está apresentada na Figura 7B e na SEQ ID NO: 47), que tem as seguintes substituições estruturais: VlD, W3Q e V4M.
Além disso, para a região Vh de E2, as seguintes posições de aminoácidos da região estrutural (utilizando o sistema de numeração de Kabat) diferem da linha germinal: 6 e 25. Uma ou ambas destas posições podem ter a mutação revertida para seqüências de linha germinal fazendo uma ou ambas das seguintes substituições: Q6E e A25S. Uma forma modificada 5 preferida da região de Vh de E2 é a Vh de E2GL (cuja seqüência de aminoácidos está apresentada na Figura 8A e na SEQ ID NO: 44), que tem a seguinte substituição estruturais: Q6E.
Além disso, para a região Vjc de E2, as seguintes posições de aminoácidos da região estrutural (utilizando o sistema de numeração de 10 Kabat) diferem da linha germinal: 1, 3 e 4. Uma, duas ou todas as três destas posições podem ter a mutação revertida para seqüências de linha germinal fazendo uma, duas ou todas as três das seguintes substituições: ElD, V3Q e L4M. Uma forma modificada preferida da região de Vk de E2 é a Vk de E2GL (cuja seqüência de aminoácidos está apresentada na Figura 8B e na SEQ ID 15 NO: 48), que tem as seguintes substituições estruturais: ElD, V3Q e L4M.
Outro tipo de modificação estrutural envolve a mutação de um ou mais resíduos na região de estrutura ou mesmo uma ou mais regiões CDR, para remover epítopos de células T a fim de, deste modo, reduzir a imunogenicidade potencial do anticorpo. Esta abordagem é também referida 20 como “desimunização” e é descrita em mais detalhes na Publicação de Patente US N0 20030153043 por Carr et al.
Adicionalmente ou alternativamente às modificações feitas no interior da estrutura ou regiões CDR, os anticorpos da invenção podem ser produzidos para incluir modificações na região Fe, tipicamente para alterar 25 uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo, tal como a meia-vida sérica, a fixação do complemento, ligação ao receptor de Fc e/ou a citotoxicidade celular antígeno-dependente. Além disso, um anticorpo da invenção pode ser quimicamente modificado (por exemplo, uma ou mais unidades químicas podem ser ligadas ao anticorpo) ou pode ser modificado para alterar a sua glicosilação, uma vez mais para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo. Cada uma destas modalidades é descrita em mais detalhe adiante. A numeração dos resíduos na região Fc é a do índice EU de Kabat.
5 Em uma modalidade, a região conectora de CHl é modificada
de tal modo que o número de cisteínas na região conectora é alterada, por exemplo, aumentada ou diminuída. Esta abordagem é melhor descrita na Patente US N0 5.677.425 por Bodmer et al. O número de resíduos de cisteína na região conectora de CHl é alterada para, por exemplo, facilitar a 10 montagem das cadeias leve e pesada ou para aumentar ou diminuir a estabilidade do anticorpo.
Em outra modalidade, a região conectora de Fc de um anticorpo é submetida a mutação para diminuir a meia-vida biológica do anticorpo. Mais especificamente, uma ou mais mutações de aminoácidos são 15 introduzidas na região de interface do domínio CH2-CH3 do fragmento Fc conector de tal modo que o anticorpo tem a ligação à proteína A de Staphylococcus (SpA) prejudicada em relação à ligação a SpA do domínio do Fc conector nativo. Esta abordagem é descrita em mais detalhes na Patente US N0 6.165.745 por Ward et al.
Em uma outra modalidade, o anticorpo é modificado para
aumentar a sua meia-vida biológica. São possíveis várias abordagens. Por exemplo, uma ou mais das seguintes mutações podem ser introduzidas: T252L, T254S, T256F, conforme descrito na Patente US N0 6.277.375 de Ward. Alternativamente, para aumentar a meia-vida biológica, o anticorpo 25 pode ser alterado no interior da região CHl ou CL para conter um epítopo de ligação do receptor selvagem tomado de dois loops de um domínio CH2 de uma região Fc de uma IgG, conforme descrito nas Patentes US Nos. 5.869.046 e 6.121.022 por Prestae/ al.
Em ainda outras modalidades, a região Fc é alterada pela substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido por um resíduo de aminoácido diferente para alterar a(s) fimção(ões) efetora(s) do anticorpo. Por exemplo, um ou mais aminoácidos selecionados dos resíduos de aminoácido 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 e 322 podem ser substituídos por um 5 resíduo de aminoácido diferente, de tal modo que o anticorpo tem uma afinidade alterada por um ligando efetor mas retém a capacidade de ligação ao antígeno do anticorpo precursor. O ligando efetor para o qual a afinidade é alterada pode ser, por exemplo, um receptor de Fc ou o componente Cl do complemento. Esta abordagem é descrita em mais detalhe nas Patentes US 10 Nos. 5,624,821 e 5,648,260, ambas de Winter et al.
Em outro exemplo, um ou mais aminoácidos selecionados dos resíduos de aminoácidos 329, 331 e 322 podem ser substituídos por um resíduo de aminoácido diferente de tal modo que o anticorpo tem a ligação Clq alterada e/ou a citotoxicidade pendente de complemento (CDC) reduzida 15 ou abolida. Esta abordagem é descrita em mais detalhe na Patente US N0 6,194,551 por Idusogie et al.
Em um outro exemplo, um ou mais resíduos de aminoácidos nas posições de aminoácidos 231 e 239 são alterados para, deste modo, alterar a capacidade do anticorpo em fixar o complemento. Esta abordagem é melhor descrita na Publicação PCT WO 94/29351 por Bodmer et al.
Em ainda outro exemplo, a região Fc é modificada para aumentar a capacidade do anticorpo em mediar a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e/ou para aumentar a afinidade do anticorpo por um receptor Fcy modificando um ou mais aminoácidos nas seguintes 25 posições: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 ou 439. Esta abordagem é melhor descrita na Publicação PCT WO 00/42072 por Presta. Além disso, os sítios de ligação na IgGl humana para FcyRl, FcyRII, FcyRIII e FcRn foram mapeados e as variantes com ligações melhoradas foram descritas (ver Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604). Mutações 5 específicas nas posições 256, 290, 298, 333, 334 e 339 demonstram que melhoram a ligação a FcyRIII. Além disso, as seguintes combinações de mutantes demonstraram que melhoram a ligação a Fe DRIII: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A e S298A/E333A/K334A.
Em ainda outra modalidade, a glicosilação de um anticorpo é modificada. Por exemplo, pode-se fazer um anticorpo aglicosilado (isto é, o anticorpo não tem glicosilação). A glicosilação pode ser alterada, por exemplo, para aumentar a afinidade do anticorpo pelo antígeno. Estas modificações de hidrato de carbono podem ser acompanhadas, por exemplo, pela alteração de um ou mais sítios de glicosilação na seqüência de anticorpos. Por exemplo, podem ser feitas uma ou mais substituições de aminoácidos, as quais resultam na eliminação de um ou mais sítios de glicolisação da estrutura da região variável para, deste modo, eliminar a glicolisação naquele sítio. Esta aglicosilação pode aumentar a afinidade do anticorpo para o antígeno. Esta abordagem é descrita em mais detalhe nas Patentes US Nos. 5.714.350 e 6,350,861 por Co et al.
Adicionalmente ou alternativamente, pode-se fazer um anticorpo que tem um tipo alterado de glicosilação, tal como um anticorpo hipofiicosilado que tem quantidades reduzidas de resíduos fucosil ou um anticorpo que tem estruturas GlcNac de seccionamento aumentadas. 25 Demonstrou-se que estes padrões de glicosilação alterados alteram a capacidade ADCC dos anticorpos. Estas modificações de hidrato de carbono podem ser conseguidas, por exemplo, expressando o anticorpo em uma célula hospedeira com maquinaria de glicosilação alterada. Células em maquinaria de glicosilação alterada foram descritas na técnica e podem ser utilizadas como células hospedeiras nas quais expressar anticorpos recombinantes desta revelação para, deste modo, produzir anticorpos com glicosilação alterada. Por exemplo, as linhas celulares Ms704, Ms705 e Ms709 não têm o gene fucosiltransferase, FUT8 (alfa (1,6) fucosiltransferase), de tal modo que 5 anticorpos expressos nas linhas celulares Ms704, Ms705 e Ms709 não têm fucose nos seus hidratos de carbono. As linhas celulares Ms704, Ms705 e Ms709 FUT8'7' foram criadas pela ruptura dirigida do gene FUT8 em células CHO/DG44 utilizando dois vetores de substituição (ver a Publicação de Patente US N0 20040110704 por Yamane et al. e Yamane-Ohnuki et al.
(2004) Biotechnol Bioens 87:614-22). Como outro exemplo, o documento EP 1,176,195 por Hanai et al. descreve uma linhagem celular com um gene FUT8 de funcionalidade rompida, que codifica uma fucosiltransferase, de tal modo que os anticorpos expressos nesta linhagem celular exibem uma hipofucosilação, reduzindo ou eliminando a enzima relacionada à ligação alfa 15 1,6. Hanai et al. também descrevem linhagens celulares que têm uma baixa atividade enzimática para adicionar fucose à N-acetilglucosamina que se liga à região Fc do anticorpo ou não tem a atividade enzimática, por exemplo a linhagem celular de mieloma de rato YB2/0 (ATCC CRL 1662). A Publicação PCT WO 03/035835 por Presta descreve uma linhagem celular 20 variante de células CHO, Lec 13, com capacidade reduzida para ligar fucose a hidratos de carbono ligados a Asn(297), também resultando em hipofucosilação dos anticorpos expressos naquela célula hospedeira (ver também Shields, RL. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740). Anticorpos com um perfil de glicosilação modificado também podem ser 25 produzidos em ovos de galinha, conforme descrito no Pedido de Patente US N0 PCT/US06/05853. Alternativamente, anticorpos com um perfil de glicosilação modificado podem ser produzidos em células de plantas, tais como Lemna. Métodos para produção de anticorpos num sistema de plantas são divulgados no pedido de Patente US correspondente a Alston & Bird LLP com o número de expediente do solicitador 040989/314911, apresentado em
11 de Agosto de 2006. A Publicação PCT WO 99/54342 por Umana et al. descreve linhagens celulares modificadas para expressar glucosiltransferases modificadoras de glicoproteína (por exemplo, beta(l,4)-N5 acetilglucosaminiltransferase III (GnTIII)) de tal modo que os anticorpos expressos nas linhagens celulares modificadas exibem estruturas GlcNac de divisão aumentadas, o que resulta em atividade ADCC aumentada dos anticorpos (ver também Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-180). Alternativamente, os resíduos de fucose do anticorpo podem ser clivados 10 utilizando uma enzima de fucosidase. Por exemplo, a fucosidase alfa-Lfucosidase remove resíduos de fucosil dos anticorpos (Tarentino, A.L. et al. (1975)Biochem. 14:5516-23).
Outra modificação dos anticorpos que é aqui contemplada por esta revelação é a peguilação. Um anticorpo pode ser peguilado, por exemplo, 15 para aumentar a meia-vida biológica (por exemplo, sérica) do anticorpo. Para peguilar um anticorpo o anticorpo ou seu fragmento, tipicamente é feito reagir com polietileno glicol (PEG), tal como um éster ou aldeído reativo ou derivado de PEG, em condições onde um ou mais grupos PEG fica ligado ao anticorpo ou fragmento do anticorpo. De preferência, a peguilação é realizada 20 por meio de uma reação de acilação ou uma reação de alquilação com uma molécula PEG reativa (ou um polímero solúvel em água reativo análogo). Conforme aqui utilizado, o termo “polietileno glicol” pretende abranger qualquer das formas de PEG que foram utilizadas para derivatizar outras proteínas, tais como mono (Cl-ClO) alcoxi ou arilóxi-polietileno glicol ou 25 polietileno glicol-maleimida. Em certas modalidades, o anticorpo a ser peguilado é um anticorpo aglicosilado. Métodos para peguilar proteínas são conhecidos na técnica e podem ser aplicados aos anticorpos desta revelação.Ver, por exemplo, o documento EP 0 154 316 por Nishimura et al. e o documento EP 0 401 384 por Ishikawa et al. Fragmentos de Anticorpos e Mimetismo de Anticorpos
A presente invenção não está limitada a anticorpos tradicionais e pode ser praticada através da utilização de fragmentos de anticorpos e mimetismo de anticorpo. Conforme detalhado adiante, uma ampla variedade 5 de tecnologias de fragmentos de anticorpos e mimetismo de anticorpos foram agora desenvolvidas e são amplamente conhecidas na técnica. Embora inúmeras destas tecnologias, tais como anticorpos de domínio, Nanocorpos, e UniBodies façam uso de fragmentos ou outras modificações a estruturas tradicionais de anticorpos, há também tecnologias alternativas, como por 10 exemplo, Affibodies, DARPins, Anticalinas, Avimers e Versabodies que empregam estruturas de ligação que, ao mesmo tempo que simulam a ligação tradicional de anticorpos, são geradas e funcionam por meio de mecanismos distintos.
Anticorpos de Domínio (dAbs) são as menores unidades de 15 ligação funcional de anticorpos, correspondentes às regiões variáveis das cadeias pesada (VH) ou leve (VL) dos anticorpos humanos. Os anticorpos de domínio têm um peso molecular de aproximadamente 13 kDa. A Domantis Limited desenvolveu uma série de bibliotecas grandes e altamente funcionais de dAbs VH e VL totalmente humanos (mais de dez bilhões de seqüências 20 diferentes em cada biblioteca) e utiliza estas bibliotecas para selecionar dAbs que são específicos para alvos terapêuticos. Em contraste com muitos anticorpos convencionais os Anticorpos de domínio são bem expressos em sistemas de células bacterianas, de levedura e de mamíferos. Detalhes adicionais dos anticorpos de domínio e seus métodos de produção podem ser 25 obtidos por referência às Patentes US 6,291,158; 6,582,915; 6,593,081; 6,172,197; 6,696,245; US Série N0 2004/0110941; Pedido de Patente Européia N0 1433846 e Patentes Européias 0368684 & 0616640; W005/035572, W004/101790, W004/081026, W004/058821, W004/003019 e W003/002609, cada uma das quais são aqui integralmente incorporadas por citação.
Nanocorpos são proteínas terapêuticas derivadas de anticorpo que contêm as propriedades estruturais e funcionais únicas de anticorpos de cadeia pesada de ocorrência natural. Estes anticorpos de cadeia pesada 5 contêm um único domínio variável (VHH) e dois domínios constantes (CH2 e CH3). Significativamente, o domínio VHH clonado e isolado é um polipeptídeo perfeitamente estável que abriga a capacidade total de ligação ao antígeno do anticorpo de cadeia pesada original. Os Nanocorpos têm uma alta homologia com os domínios VH dos anticorpos humanos e podem ainda ser 10 humanizados sem qualquer perda de atividade. Significativamente, os Nanocorpos têm um baixo potencial imunogênico que foi confirmado em estudos de primatas com compostos conduzidos por Nanocorpos.
Os Nanocorpos combinam as vantagens dos anticorpos convencionais com características importantes de drogas de molécula pequena. Como os anticorpos convencionais, os Nanocorpos apresentam alta especificidade ao alvo, alta afinidade para o seu alvo e baixa toxicidade inerente. No entanto, como as drogas de molécula pequena os mesmos podem inibir enzimas e ter pronto acesso a fissuras de receptores. Além disso, os Nanocorpos são extremamente estáveis, podem ser administrados por meios que não seja por injeção (ver, por exemplo, o documento WO 04/041867, que é aqui integralmente incorporado por citação) e são fáceis de fabricar. Outras vantagens dos Nanocorpos incluem o reconhecimento de epítopos incomuns ou escondidos como resultado do seu pequeno tamanho, ligando-se a cavidades ou sítios ativos de alvos de proteína com alta afinidade e seletividade devido ao seu formato tridimensional, flexibilidade de formato de droga, adaptação da meia-vida e facilidade e velocidade de descoberta da droga.
Os Nanocorpos são codificados por genes únicos e são produzidos de forma eficiente em quase todos os hospedeiros procarióticos e eucarióticos, por exemplo, E. coli (ver, por exemplo, a Patente US 6,765,087, que é aqui integralmente incorporada por citação), bolores (por exemplo, Aspergillus ou Trichoderma) e levedura (por exemplo Saccharomyees, Kluyveromyces, Hansenula ou Piehia) (Ver, por exemplo, a Patente US 5 6,838,254, que é aqui integralmente incorporada por citação). O processo de produção é escalonável e foram produzidas quantidades de muitos quilogramas de Nanocorpos. Pelo fato dos Nanocorpos exibirem uma estabilidade superior em comparação com anticorpos convencionais, os mesmos podem ser formulados como uma solução com longo prazo de 10 validade e pronta para ser usada.
O método de Nanoclone (ver, por exemplo, o documento WO 06/079372, que é aqui integralmente incorporado por citação) é um método privado para gerar Nanocorpos contra um alvo desejado, com base em seleção de alta produtividade automático de células B e poderia ser utilizado no contexto da presente invenção.
UniBodies são uma outra tecnologia de fragmento de anticorpo, no entanto esta é baseada na remoção da região conectora dos anticorpos IgG4. A deleção da região conectora resulta numa molécula que é essencialmente metade do tamanho dos anticorpos IgG4 tradicionais e tem 20 uma região de ligação univalente em vez da região de ligação bivalente dos anticorpos IgG4. É também sabido que os anticorpos IgG4 são inertes e, deste modo, não interagem com o sistema imunológico, o que pode ser vantajoso para o tratamento de doenças onde a resposta imune não é desejada e esta vantagem é passada aos UniBodies. Por exemplo, UniBodies podem 25 funcionar para inibir ou silenciar, mas não matar, as células às quais estão ligados. Além disso, a ligação de UniBody a células de câncer não estimula a proliferação das mesmas. Além disso, pelo fato dos UniBodies serem metade do tamanho dos anticorpos IgG4 tradicionais, os mesmos podem apresentar uma melhor distribuição sobre tumores grandes sólidos com eficácia potencialmente vantajosa. Os UniBodies são eliminados do corpo a uma taxa similar à dos anticorpos IgG4 inteiros e são capazes de ligar com uma afinidade similar aos seus antígenos como os anticorpos inteiros. Detalhes adicionais de UniBodies podem ser obtidos por referência à Publicação PCT 5 N0 W02007/059782, que é aqui integralmente incorporada por citação.
As moléculas Affibody representam uma nova classe de proteínas baseadas num domínio de proteínas de 58 resíduos de aminoácidos, derivadas de um dos domínios de ligação a IgG da proteína A de staphyloccoccus. Este domínio de grupo de três hélices foi utilizado como um 10 esqueleto {scaffold) para a construção de bibliotecas combinatórias de fagemidos das quais as variantes de Affibody que se dirigem às moléculas desejadas podem ser selecionadas utilizando a tecnologia de apresentação sobre fago (Nord K, Gunneriusson E, Ringdahl J, Stahl S, Uhlen M, Nygren PA, Binding proteins selected from combinatorial libraries of an a-helical 15 bacterial receptor domain, Nat Biotechnol 1997;15:772-7. Ronmark J, Gronlund H, Uhlen M, Nygren PA, Human immunoglobulin A (IgA)-specific ligands from combinatorial engineering of protein A, Eur J Biochem 2002;269:2647-55). A estrutura simples e robusta das moléculas de Affibody em combinação com o seu baixo peso molecular (6 kDa), torna as mesmas 20 adequadas para uma ampla variedade de aplicações, por exemplo, como reagentes de detecção (Ronmark J, Hansson M, Nguyen T, et al., Construction and characterization of affibody-Fc chimeras produced in Eseheriehia eoli, J Jmmunol Methods 2002;261:199-211) e para inibir interações de receptor (Sandstorm K, Xu Z, Forsberg G, Nygren PA, 25 Inhibition of the CD28-CD80 co-stimulation signal by a CD28-binding Affibody ligand developed by combinatorial protein engineering, Protein Eng 2003;16:691-7). Detalhes adicionais sobre Affibodies e seus métodos de produção podem ser obtidos por referência à Patente US N0 5831012, que é aqui integralmente incorporada por citação. Affibodies marcados também podem ser úteis em aplicações de imagiologia para determinar a abundância das Isoformas.
As DARPins (Proteínas Projetadas de Repetição de Anquirina) são um exemplo de uma tecnologia de anticorpo mimético DRP (Proteína Projetada de Repetição) que foi desenvolvida para explorar as capacidades de ligação de polipeptídeos não-anticorpos. As proteínas de repetição como a anquirina ou proteínas ricas em leucina são moléculas de ligação ubíqua que ocorrem, ao contrário dos anticorpos, intra e extracelularmente. Suas características de arquitetura modular única apresenta unidades estruturais repetidas (repetições) que se empilham para formar domínios de repetição alongados apresentando superfícies de ligação ao alvo variável e modular. Com base nesta modularidade, pode-se gerar bibliotecas combinatórias de polipeptídeos com especifícidades de ligação altamente diversificadas. Esta estratégia inclui a concepção de consenso de repetições auto-compatíveis que apresentam resíduos de superfície variável e sua montagem aleatória em domínios de repetição.
DARPins podem ser produzidas em sistemas de expressão bacteriano em rendimentos muito elevados e pertencem às proteínas mais estáveis conhecidas. Foram selecionadas DARPins altamente específicas, de 20 alta afinidade a uma ampla faixa de proteínas alvo, incluindo receptores humanos, citoquinas, quinases, proteases humanas, vírus e proteínas de membrana. Pode-se obter DARPins que têm afinidade em nível de nanomolar de um dígito a picomolar.
As DARPins foram utilizadas numa ampla faixa de aplicações, 25 incluindo ELISA, ELISA sanduíche, análise citométrica de fluxo (FACS), imuno-histoquímica (IHC), aplicações de chip, purificação de afinidade ou Western blotting. As DARPins também demonstraram ser altamente ativas no compartimento intracelular por exemplo como proteínas marcadoras intracelulares fundidas à proteína fluorescente verde (GFP). As DARPins foram também utilizadas para inibir a entrada viral com IC50 ao nível de pM. As DARPins não são apenas ideais para bloquear interações proteínaproteína, mas também para inibir enzimas. Proteases, quinases e transportadores foram inibidos com sucesso, na maioria dos casos um modo 5 de inibição alostérico. Enriquecimentos específicos e muito rápidos no tumor e proporções de tumor para sangue muito favoráveis tomam as DARPins muito adequadas para diagnósticos in vivo ou abordagens terapêuticas.
Informações adicionais referentes a DARPins e outras tecnologias DRP podem ser encontradas na Publicação do Pedido de Patente US N0 2004/0132028 e Publicação do Pedido de Patente Internacional N0 WO 02/20565, ambas as quais são aqui integralmente incorporadas por citação.
Anticalinas são uma tecnologia mimética de anticorpo adicional, no entanto, neste caso, a especificidade de ligação é derivada de lipocalinas, uma família de proteínas de baixo peso molecular que são natural 15 e abundantemente expressas em tecidos humanos e fluidos corporais. As lipocalinas evolveram para realizar uma variedade de funções in vivo associadas com o transporte fisiológico e a armazenagem de compostos quimicamente sensíveis ou insolúveis. As lipocalinas têm uma estrutura intrínseca robusta compreendendo um barril-B altamente conservado que 20 suporta quatro loops num terminal da proteína. Estes loops formam a entrada para uma bolsa de ligação e diferenças conformacionais nesta parte da molécula são responsáveis pela variação na especificidade de ligação entre lipocalinas individuais.
Embora a estrutura dos loops hipervariáveis como um todo 25 suportados por uma estrutura de folha-B seja reminiscente de imunoglobulinas, as lipocalinas diferem consideravelmente dos anticorpos em termos de tamanho, sendo compostas de uma cadeia de polipeptídeo simples de 160-180 aminoácidos que é marginalmente maior do que um domínio de imunoglobulina simples. As lipocalinas são clonadas e seus loops são submetidos a modificação a fim de criar Anticalinas. Foram geradas bibliotecas de Anticalinas estruturalmente diversas e a apresentação de Anticalina permite a seleção e rastreio da função de ligação, seguida pela expressão e produção de 5 proteína solúvel para análise adicional em sistemas procarióticos ou eucarióticos. Estudos demonstraram com êxito que pode-se desenvolver Anticalinas que são específicas para virtualmente qualquer proteína alvo humana e podem ser isoladas e pode-se obter afinidades de ligação ao nível nanomolar ou superior.
As Anticalinas também podem ser formatadas como proteínas
de direcionamento duplo, chamadas Duocalinas. Uma Duocalina liga dois alvos terapêuticos separados numa proteína monomérica facilmente produzida utilizando processos de fabricação padrão ao mesmo tempo que retém a especificidade e a afinidade independentemente da orientação estrutural dos seus dois domínios de ligação.
A modulação de alvos múltiplos através de uma única molécula é particularmente vantajoso em doenças conhecidas por envolver mais de um único fator causador. Além disso, formatos de ligação bi ou multivalentes tais como Duocalinas têm potencial significativo em atingir 20 moléculas da superfície celular em doença, mediando efeitos agonistas sobre vias de transdução de sinal ou induzindo efeitos de intemalização aumentados por meio de ligação e agrupamento de receptores de superfície de célula. Além disso, a estabilidade altamente intrínseca das Duocalinas é comprável às Anticalinas monoméricas, oferecendo formulação flexível e potencial de 25 administração para as Duocalinas.
Informações adicionais sobre Anticalinas podem ser encontradas na Patente US N0 7,250,297 e na Publicação do Pedido de Patente Internacional N0 WO 99/16873 ambas as quais são aqui integralmente incorporadas por citação. Outra tecnologia de mimética de anticorpo útil no contexto da presente invenção são os Avimers. Avimers são evolvidos de uma grande família de domínios de receptores extracelulares humanos por uma troca de éxons (exon shujfling) e apresentação sobre fago, gerando proteínas de 5 domínios múltiplos com propriedades de ligação e inibidoras. Foi demonstrado que a ligação de domínios de ligação independentes múltiplos cria avidez e resulta em afinidade e especificidade melhoradas comparadas com proteínas convencionais de ligação de um epítopo. Outras vantagens potenciais incluem a produção simples e eficaz de moléculas específicas de IO alvo múltiplo em Escherichia coli, termoestabilidade melhorada e resistência a proteases. Avimers com afinidades sub-nanomolares foram obtidos contra uma variedade de alvos.
Informações adicionais com relação a Avimers podem ser encontradas nas Publicações dos Pedidos de Patente US Nos. 2006/0286603, 2006/0234299, 2006/0223114, 2006/0177831, 2006/0008844, 2005/0221384, 2005/0164301, 2005/0089932, 2005/0053973, 2005/0048512, 2004/0175756, todos os quais são aqui integralmente incorporados por citação.
Versabodies são uma outra tecnologia de mimética de anticorpo que pode ser utilizada no contexto da presente invenção. Os 20 Versabodies são proteínas pequenas de 3-5 kDa com >15% de cisteínas, que formam um esqueleto de dissulfeto de alta densidade, substituindo o núcleo hidrófobo que as proteínas típicas têm. A substituição de um grande número de aminoácidos hidrófobos, compreendendo o núcleo hidrófobo, por um pequeno número de dissulfetos resulta em uma proteína que é menor, mais 25 hidrófila (menos agregação e ligação não específica), mas resistente a proteases e calor e tem uma densidade menor de epítopos de células T, porque os resíduos que mais contribuem para a apresentação de MHC são hidrófobos. Todas quatro destas propriedades são conhecidas por afetar a imunogenicidade, e espera-se que, juntas, as mesmas causem uma grande diminuição em imunogenicidade.
A inspiração para Versabodies vem dos biofarmacêuticos injetáveis naturais produzidos por sanguessugas, cobras, aranhas, escorpiões, lesmas e anêmonas que são conhecidos por exibir uma imunogenicidade 5 inesperadamente baixa. Partindo de famílias de proteínas naturais selecionadas, projetando e selecionando o tamanho, a hidrofobicidade, o processamento de antígeno proteolítico e a densidade de epítopo são minimizados a níveis muito abaixo da média para proteínas injetáveis naturais.
Dadas as estruturas de Versabodies, estes miméticos de
anticorpo oferecem uma forma versátil que inclui multi-valência, multiespecificidade, uma diversidade de mecanismos de meia-vida, módulos de direcionamento a tecido e a ausência da região Fc do anticorpo. Além disso, os Versabodies são fabricados em E. coli em altos rendimentos, e por causa 15 da sua hidrofilicidade e pequeno tamanho, os Versabodies são altamente solúveis e podem ser formulados em altas concentrações. Os Versabodies são excepcionalmente termoestáveis (eles podem ser fervidos) e oferecem vida útil prolongada.
Informações adicionais sobre Versabodies podem ser encontradas na Publicação de Pedido de Patente US N0 2007/0191272 que é aqui integralmente incorporada por citação.
A descrição detalhada de fragmentos de anticorpos e tecnologias de mimética de anticorpos acima apresentada não pretende ser uma lista completa de todas as tecnologias que poderiam ser utilizadas no 25 contexto da presente memória descritiva. Por exemplo, e também não a título de limitação, uma variedade de tecnologias adicionais poderia ser utilizadas no contexto da presente invenção, incluindo tecnologias à base de polipeptídeo alternativo, tais como fusões de regiões determinantes de complementaridade conforme indicado em Qui et al., Nature Biotechnology, 25(8) 921-929 (2007), que é aqui integralmente incorporado por citação, bem como tecnologias à base de ácido nucleico, tais como tecnologias de aptâmeros de ARN descritas nas Patentes US Nos. 5,789,157, 5,864,026, 5,712,375, 5,763,566, 6,013,443, 6,376,474, 6,613,526, 6,114,120, 6,261,774, 5 e 6,387,620, todas as quais são aqui incorporadas por citação.
Propriedades Físicas dos Anticorpos
Os anticorpos da presente invenção podem ser ainda caracterizados pelas várias propriedades físicas dos anticorpos anti-CXCR4. Vários ensaios podem ser utilizados para detectar e/ou diferenciar classes diferentes de anticorpos com base nestas propriedades físicas.
Em algumas modalidades, os anticorpos da presente invenção podem conter um ou mais sítios de glicosilação tanto na região variável leve como na pesada. A presença de um ou mais sítios de glicosilação na região variável pode resultar em imunogenicidade aumentada do anticorpo ou uma 15 alteração do pK do anticorpo devido a ligação ao antígeno alterado (Marshall et al (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala FA e Morrison SL (2004) J Immunol 172:5489-94: Wallick et al (1988) JExp Med 168:1099-109; Spiro RG (2002) Glycobiology J_2:43R-56R; Parekh et al (1985) Nature 316:452-7; Mimura et al. (2000) Mol Immunol 37:697-706). Sabe-se que a glicosilação 20 ocorre em motivos contendo uma seqüência N-X-S/T. A glicosilação da região variável pode ser testada utilizando um ensaio Glycoblot, que cliva o anticorpo para produzir um Fab e, depois, testa quanto à glicosilação utiliza um ensaio que mede a formação de oxidação por periodato e base de Schiff. Alternativamente, a glicosilação da região variável pode ser testada usando 25 cromatografía leve Dionex (Dionex-LC) que cliva sacarídeos de um Fab em monossacarídeos e analisa o teor do sacarídeo individual. Em alguns casos, é preferido um anticorpo anti-CXCR4 que não contém glicosilação da região variável. Isto pode ser conseguido selecionando anticorpos que não contêm o motivo de glicosilação na região variável ou pela mutação dos resíduos no motivo de glicosilação utilizando métodos padrão conhecidas na técnica.
Em uma modalidade preferida, os anticorpos da presente revelação não contêm sítios de isomerização de asparagina. Uma desamidação ou efeito do ácido isoaspártico pode ocorrer nas seqüências N-G ou D-G, 5 respectivamente. A desamidação ou efeito do ácido isoaspártico resulta na criação de ácido isoaspártico que diminui a estabilidade de um anticorpo criando uma estrutura torcida fora de um terminal carboxi de cadeia lateral em vez da cadeia principal. A criação de ácido isoaspártico pode ser medida utilizando um ensaio iso-quant, que utiliza uma HPLC de fase reversa para IO testar quando ao ácido isoaspártico.
Cada anticorpo terá um ponto isoelétrico (pi) único, mas em geral, os anticorpos se enquadram na faixa de pH entre 6 e 9,5. O pi para um anticorpo IgGl, tipicamente se enquadra na gama de pH de 7-9,5 e o pi para um anticorpo IgG4 tipicamente se enquadra na gama de pH de 6-8. Os 15 anticorpos podem ter um pi que está fora desta faixa. Embora os efeitos sejam geralmente conhecidos, há especulações de que os anticorpos com um pi fora da faixa normal têm algum desdobramento e instabilidade em condições in vivo. O ponto isoelétrico pode ser testado utilizando um ensaio de focagem isoelétrica capilar que cria um gradiente de pH e pode utilizar focagem a laser 20 para uma precisão aumentada (Janini et al (2002) Electrophoresis 23:1605- 11; Ma et al. (2001) Chromatographia 53:S75-89; Hunt et al (1998) J Chromatogr A 800:355-67). Em alguns casos, é preferido ter um anticorpo anti-CXCR4 que contenha um valor de pi que se enquadra na faixa normal. Isto pode ser conseguido pela seleção de anticorpos com um pi na faixa 25 normal ou por mutação de resíduos de superfície carregados utilizando métodos padrão conhecidos na técnica.
Cada anticorpo terá uma temperatura de fusão que é indicativa da estabilidade térmica (Krishnamurthy R e Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71). Uma estabilidade térmica mais alta indica uma maior estabilidade do anticorpo in vivo como um todo. O ponto de fusão de um anticorpo pode ser medido utilizando técnicas tais como calorimetria diferencial de varredura (Chen et al (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando et al (1999) Immunol Lett 68:47-52). TMi indica a temperatura do 5 desdobramento inicial do anticorpo. TM2 indica a temperatura de completo desdobramento do anticorpo. De um modo geral, é preferido que a TMi de um anticorpo da presente invenção seja superior a 60 0C, preferencialmente superior a 65°C, ainda mais preferencialmente superior a 70 0C. Alternativamente, a estabilidade térmica de uma anticorpo pode ser medida 10 utilizando dicroísmo (Murray et al. (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9).
Em uma modalidade preferida, são selecionados anticorpos que não se degradam rapidamente. A fragmentação de um anticorpo antiCXCR4 pode ser medida utilizando eletroforese capilar (CE) e MALDI-MS, como é entendido na técnica (Alexander AJ e Hughes DE (1995) Anal Chem 67:3626-32).
Em uma outra modalidade preferida são selecionados anticorpos que têm efeitos mínimos de agregação. A agregação pode levar ao desencadeamento de uma resposta imune indesejada e/ou alterada ou propriedades farmacocinéticas desfavoráveis. De um modo geral, os 20 anticorpos são aceitáveis com agregação de 25% ou menos, preferencialmente 20% ou menos, ainda mais preferencialmente 15% ou menos, ainda mais preferencialmente 10% ou menos e ainda mais preferencialmente 5% ou menos. A agregação pode ser medida por vários métodos conhecidas na técnica, incluindo cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) em 25 coluna de exclusão por tamanho (SEC) e difusão da luz para identificar monômeros, dímeros, trímeros ou multímeros.
Métodos para Produzir Anticorpos
Conforme discutido acima, o anticorpos anti-CXCR4 que têm seqüências Vh e Vk aqui revelados podem ser utilizados para criar novos anticorpos anti-CXCR4 por meio da modificação das seqüências Vh e/ou Vk ou da(s) região(ões) constantes ligados às mesmas. Deste modo, em um outro aspecto desta revelação, as características estruturais de um anticorpo antiCXCR4 desta revelação, por exemplo, F7, F9, Dl ou E2, são utilizadas para 5 criar anticorpos anti-CXCR4 estruturalmente relacionados que retêm pelo menos uma propriedade de funcionalidade dos anticorpos desta divulgação, tal como a ligação ao CXCR4 humano. Por exemplo, uma ou mais regiões CDR de F7, F9, Dl ou E2, ou suas mutações, podem ser combinadas de forma recombinante com regiões estruturais conhecidas e/ou outras CDRs 10 para criar anticorpos anti-CXCR4 adicionais, produzidos de forma recombinante desta revelação, conforme discutido acima. Outros tipos de modificações incluem aquelas descritas na seção anterior. O material de partida para o método de produção é uma ou mais das seqüências Vh e/ou Vk aqui proporcionadas ou uma ou mais das suas regiões CDR. Para criar o 15 anticorpo produzido, não é necessário de fato preparar (isto é, expressar como uma proteína) um anticorpo tendo uma ou mais seqüências Vh e/ou Vk aqui proporcionadas ou uma ou mais das suas regiões CDR. Mais precisamente, a informação contida na(s) sequência(s) é utilizada como o material de partida para criar uma seqüência de “segunda geração” derivada da(s) sequência(s) 20 original(ais) e depois a(s) sequência(s) de “segunda geração” é(são) preparada(s) e expressa(s) como uma proteína.
Em concordância, em uma outra modalidade, esta revelação proporciona um método para preparar um anticorpo anti-CXCR4 compreendendo:
(a) proporcionar: (i) uma seqüência de anticorpo de região
variável de cadeia pesada compreendendo uma seqüência CDRl selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 1-4, uma seqüência CDR2 selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 5-8, e/ou uma seqüência CDR3 selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 9-12; e/ou (ii) uma seqüência de anticorpo de região variável de cadeia leve compreendendo uma seqüência CDRl selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 13-16, uma seqüência CDR2 selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 17-20, e/ou uma seqüência CDR3 selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 21-24;
(b) alterar pelo menos um resíduo de aminoácido na seqüência de anticorpo de região variável de cadeia pesada e/ou seqüência de anticorpo de região variável de cadeia leve para criar pelo menos uma seqüência de anticorpo alterado; e
(c) expressar a uma seqüência de anticorpo alterado como uma
proteína.
Pode-se utilizar técnicas convencionais de biologia molecular para preparar e expressar a seqüência de anticorpo alterado.
De preferência, o anticorpo codificado pela(s) sequência(s) alterada(s) é um que retém uma, alguma ou todas as propriedades funcionais dos anticorpos anti-CXCR4 aqui descritos, cujas propriedades funcionais incluem, mas não se limitam a:,
(i) ligar ao CXCR4 humano nativo expresso na superfície de
uma célula;
(ii) inibir a ligação de SDF-I ao CXCR4;
(iii) inibir o fluxo de cálcio induzido por SDF-I em células que expressam CXCR4;
(iv) inibir a migração induzida por SDF-I de células que expressam CXCR4;
(v) inibir a formação de vaso capilar por HuVECs;
(vi) ligar ao CXCR4 humano com uma K0 de IxlO'7 M ou
menos;
(vii) induzir apoptose em células que expressam CXCR4;
(viii) inibir a proliferação de células tumorais in vitro; (ix) inibir a proliferação de células tumorais e/ou induzir apoptose de células tumorais in vivo;
(x) inibir metástase de células tumorais CXCR4+; e/ou
(xi) aumentar o tempo de sobrevida de um indivíduos portador de um tumor CXCR4+.
As propriedades funcionais dos anticorpos alterados podem ser expressas utilizando ensaios convencionais disponíveis na técnica e/ou aqui descritos, tais como aqueles apresentados nos Exemplos (por exemplo, citometria de fluxo, ensaios de ligação).
Em certas modalidades dos métodos de modificação de
anticorpos desta revelação, as mutações podem ser introduzidas aleatoriamente ou seletivamente ao longo de toda ou parte de uma seqüência de codificação de anticorpo anti-CXCR4 e os anticorpos anti-CXCR4 modificados resultantes podem ser rastreados quanto à atividade de ligação 15 e/ou outras propriedades funcionais conforme aqui descrito. Métodos mutacionais foram descritos na técnica. Por exemplo a Publicação PCT WO 02/092780 por Short descreve métodos para criar e rastrear mutações de anticorpos utilizando mutagênese de saturação, montagem de ligação sintética ou uma combinações destes. Alternativamente, a Publicação PCT WO 20 03/074679 por Lazar et al. descreve métodos para utilização de métodos de rastreio computacionais para otimizar as propriedades fisioquímicas dos anticorpos.
Moléculas de Ácido Nucleico que Codificam Anticorpos desta Revelação
Um outro aspecto desta revelação pertence a moléculas de 25 ácido nucleico que codificam os anticorpos deste revelação. Os ácidos nucleicos podem estar presentes em células inteiras, em um lisato de célula ou em uma forma parcialmente purificada ou substancialmente pura. Um ácido nucleico é "isolado" ou "tomado substancialmente puro" quando purificado distante de outros componentes celulares ou outros contaminantes, por exemplos, outros ácidos nucleicos celulares ou proteínas, por meio de técnicas convencionais, incluindo tratamento alcalino/SDS, bandeamento por CsCl, cromatografia em coluna, eletroforese em gel de agarose e outros conhecidos na técnica. Ver, F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular 5 Biology, Greene Publishing e Wiley Interscience, Nova Iorque. Um ácido nucleico esta revelação pode ser, por exemplo, ADN ou ARN e pode conter ou não seqüências intrônicas. Em uma modalidade preferida o ácido nucleico é uma molécula de cADN.
Os ácidos nucleicos desta revelação podem ser obtidos 10 utilizando técnicas de biologia molecular convencionais. Para os anticorpos expressos por hibridomas (por exemplo hibridomas preparados a partir de camundongos transgênicos portadores de genes de imunoglobulina humana conforme descrito adiante), cADNs que codificam as cadeias leve e pesada do anticorpo feitas pelo hibridoma podem ser obtidos por técnicas convencionais 15 de amplificação por PCR ou clonagem de cADN. Para os anticorpos obtidos de uma biblioteca de gene de imunoglobulina (por exemplo, utilizando técnicas de apresentação em fagos ) um ácido nucleico que codifica estes anticorpos podem ser recuperado da biblioteca de genes.
As moléculas de ácido nucleico preferidas desta revelação são 20 aquelas que codificam as seqüências Vh eVL dos anticorpos monoclonais F7, F9, Dl e E2. As seqüências de ADN que codificam as seqüências Vh de F7, F9, Dl e E2 estão apresentadas nas SEQ ID NOs: 33-36, respectivamente. As seqüências de ADN que codificam as seqüências Vl de F7, F9, Dl e E2 estão apresentadas nas SEQ ID NOs: 37-40, respectivamente.
Uma vez obtidos os fragmentos de ADN que codificam os
segmentos Vh e VL, estes fragmentos de ADN podem ser adicionalmente manipulados por meio de técnicas convencionais de ADN recombinante, por exemplo, para converter os genes da região variável em genes de cadeia de anticorpos de comprimento total, em genes de fragmento Fab em um gene scFv. Nestas manipulações um fragmento de ADN que codifica Vl ou Vh é operativamente ligado a outro fragmento de ADN que codifica outra proteína, tal como uma região constante do anticorpo ou um ligante flexível. O termo "operativamente ligado", conforme utilizado neste contexto, pretende 5 significar que os dois fragmentos de ADN são unidos de tal modo que as seqüências de aminoácidos codificadas pelo dois fragmentos de ADN permanecem in-frame.
O ADN isolado que codifica a região Vh pode ser convertido em um gene de cadeia pesada de comprimento total ligando operativamente o ADN que codifica a Vh a outra molécula de ADN que codifica regiões constantes de cadeia pesada (CHI, CH2 e CH3). As seqüências de genes humanos de região constante de cadeia pesada são conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Kabat, E. A., et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, NIH Publication N0 91-3242, 1991) e os fragmentos de ADN que abrangem estas regiões podem ser obtidos por meio de amplificação por PCR convencional. A região constante de cadeia pesada pode ser uma região constante de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ou IgD, mas, mais tipicamente, é uma região constante de uma IgGl ou IgG4. Para um gene de cadeia pesada de fragmento Fab, o ADN que codifica a Vh pode ser operativamente ligado a outra molécula de ADN que codifica apenas a região constante CHl de cadeia pesada.
O ADN isolado que codifica a região Vl pode ser convertido em um gene de cadeia leve de comprimento total (bem como um gene de 25 cadeia leve Fab) ligando operativamente o ADN que codifica a Vl a outra molécula de ADN que codifica a região constante de cadeia leve, Cl- As seqüências de genes humanos da região constante de cadeia leve são conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Kabat, E. A., et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, NIH Publication N0 91-3242, 1991) e os fragmentos de ADN que abrangem estas regiões podem ser obtidos por meio de amplificação por PCR convencional. Em modalidades preferidas, a região constante de cadeia leve pode ser uma região constante kappa ou lambda.
Para criar um gene scFv, os fragmentos de ADN que
codificam Vh e Vl são ligados operativamente a outro fragmento que codifica um ligante flexível, por exemplo, codificando a seqüência de aminoácidos (Gly4 -Ser)3, de tal modo que as seqüências Vh e Vl possam ser expressas como uma proteína de cadeia simples contígua, com as regiões Vh e Vl 10 unidas pelo ligante flexível (ver, por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554).
Produção dos Anticorpos Monoclonais desta Revelação
Os anticorpos monoclonais (mAbs) da presente revelação 15 podem ser produzidos por uma variedade de técnicas, incluindo metodologia de anticorpo monoclonal convencional, por exemplo, pela técnica de hibridação de células somáticas padrão de Kohler e Milstein (1975) Nature 256: 495. Embora os procedimentos de hibridação de células somática seja preferido, em princípio, outras técnicas para produzir anticorpo monoclonal 20 podem ser utilizadas, por exemplo, transformação viral ou oncogênica de linfócitos B.
O sistema animal preferido para preparar hibridomas é o sistema murino. A produção de hibridoma em um camundongo é um procedimento bem estabelecido. Os protocolos e técnicas de imunização para 25 o isolamento de esplenócitos imunizados para fusão são conhecidos na técnica. Os parceiros de fusão (por exemplo, células de mieloma murino) e os procedimentos de fusão também são conhecidos.
Os anticorpos quiméricos ou humanizados da presente revelação podem ser preparados com base na seqüência de um anticorpo monoclonal não humano preparado conforme descrito acima. O ADN que codifica as imunoglobulinas de cadeia pesada e leve pode ser obtido do hibridoma não humano de interesse e modificado para conter seqüências de imunoglobulina não murina (por exemplo, humana) utilizando técnicas de 5 biologia molecular padrão. Por exemplo, para criar um anticorpo quimérico, as regiões variáveis murinas podem ser ligadas às regiões constantes humanas utilizando métodos conhecidos na técnica (ver, por exemplo, a Patente US N0 4,816,567 de Cabilly et al.). Para criar um anticorpo humanizado, regiões CDR murinas podem ser inseridas numa estrutura humana utilizando métodos 10 conhecidos na técnica (ver, por exemplo a Patente US N0 5,225,539 de Winter e as Patentes US Nos. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 e 6,180,370 e Queen et al.).
Em uma modalidade preferida, os anticorpos desta revelação são anticorpos monoclonais humanos. Estes anticorpos monoclonais humanos 15 dirigidos contra CXCR4 podem ser gerados utilizando camundongos transgênicos ou transcromossômicos portadores de partes do sistema imunológico humano em vez do sistema do camundongo. Estes camundongos transgênicos ou transcromossômicos incluem camundongos aqui referidos como o camundongo HuMAb® e o camundongo KM®, respectivamente e são 20 coletivamente aqui referidos como “camundongos Ig humanos”.
O camundongo HuMAb® (Medarex®, Inc.) contém mini-loci de gene de imunoglobulina humana que codifica seqüências de imunoglobulina não rearranjadas humanas de cadeia pesada (μ e γ) e leve, juntamente com mutações dirigidas que inativam os Ioci de cadeia μ e κ 25 endógenos (ver, por exemplo, Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856- 859). Em concordância, os camundongos exibem expressão reduzida de IgM ou κ de camundongo e em resposta à imunização, os transgenes de cadeia pesada e leve humanos introduzidos sofrem troca de classe e mutação somática para gerar anticorpos monoclonais IgG κ humanos de alta afinidade (Lonberg, N. et al (1994), supra; revisto em Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. e Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 1_3: 65-93, e Harding, F. e Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sei. 764:536-546). A preparação e utilização com camundongo 5 HuMAb®, e as modificações genômicas portadas por estes camundongos é melhor descrita em Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Aeids Research 20:6287- 6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830;
Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; e Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology J_4: 845-851, cujos conteúdos são aqui todos especificamente e integralmente incorporados por citação. Ver também as Patentes US Nos. 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.877.397;
5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; e 5.770.429; todas de Lonberg e Kay; Patente US N0 5.545.807 de Surani et al.; Publicações PCT Nos. WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 e WO 99/45962, todas de Lonberg e Kay; e Publicação PCT N0 WO 01/14424 de Korman et al.
Em uma outra modalidade, os anticorpos humanos da invenção
podem ser produzidos utilizando um camundongo que porta seqüências de imunoglobulina humana em transgenes e transcromossomas, tal como um camundongo que porta um transgene humano de cadeia pesada e um transcromossoma humano de cadeia leve. Este camundongo é aqui referido
como um “camundongo KM®,” e é descrito em detalhe na Publicação PCT WO 02/43478 de Ishida et al.
Além disso, sistemas alternativos de animais transgênicos que expressam genes de imunoglobulina humana estão disponíveis na técnica e podem ser utilizados para produzir os anticorpos anti-CXCR4 desta revelação. Por exemplo, pode ser utilizado um sistema transgênico alternativo referido como Xenomouse (Abgenix, Inc.); estes camundongos estão descritos, por exemplo nas Patentes US Nos. 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6,150,584 e 6,162,963 de Kucherlapati et al.
Além disso, alternativos sistemas de animais
transcromossômicos que expressam genes de imunoglobulina humana estão disponíveis na técnica e podem ser utilizados para produzir os anticorpos antiCXCR4 desta revelação. Por exemplo, podem ser utilizados camundongos portadores de um transcromossoma humano de cadeia pesada e um 10 transcromossoma humano de cadeia leve, referido como “camundongo TC”; estes camundongos estão descritos em Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97:722-727. Além disso vacas portadoras de transcromossomas humanos de cadeia pesada foram descritas na técnica (por exemplo, Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894 e pedido 15 PCT N0 WO 2002/092812) e podem ser utilizadas para produzir anticorpos anti-CXCR4 desta revelação.
Os anticorpos monoclonais humanos desta revelação também podem ser preparados utilizando métodos de apresentação em fagos para rastrear bibliotecas de genes de imunoglobulinas humanas. Estes métodos de 20 apresentação em fagos para isolar anticorpos humanos são estabelecidos na técnica. Ver, por exemplo: Patentes US Nos. 5,223,409; 5,403,484; e 5,571,698 de Ladner et al.; Patentes US Nos. 5,427,908 e 5,580,717 de Dower et al.; Patentes US Nos. 5,969,108 e 6,172,197 de McCafferty et al.; e Patentes US Nos. 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 e 25 6,593,081 de Griffiths et al.
Os anticorpos monoclonais humanos desta revelação também podem ser preparados utilizando camundongos SCID nos quais células imunes humanas foram reconstituídas de tal modo que uma resposta de anticorpo humano possa ser gerada mediante imunização. Estes camundongos estão descritos, por exemplo, nas Patentes US Nos. 5,476,996 e 5,698,767 to Wilson et al.
Em uma modalidade particularmente preferida, são preparados anticorpos humanos anti-CXCR4 utilizando uma combinação de camundongo 5 Ig humano e técnicas de apresentação em fagos, conforme descrito na Patente US N0 6,794,132 por Buechler et al. Mais especificamente, o método primeiro envolve produzir um resposta de anticorpo anti-CXCR4 num camundongo Ig (tal como um camundongo HuMab ou camundongo KM conforme descrito acima) imunizando o camundongo com um antígeno 10 CXCR4, seguido por isolamento de ácidos nucleicos que codificam cadeias de anticorpos humanos de células linfáticas dos camundongo e introduzindo estes ácidos nucleicos num vetor de apresentação (por exemplo, um fago) para proporcionar uma biblioteca de embalagens de apresentação. Deste modo, cada membro da biblioteca compreende um ácido nucleico que 15 codifica uma cadeia de anticorpo humano e cada cadeia de anticorpo humano é apresentada desta embalagens de apresentação. A biblioteca é, então rastreada com um antígeno CXCR4 para isolar membros da biblioteca que especificamente se liga ao CXCR4. Inserções de ácido nucleico dos membros selecionados da biblioteca são, então, isoladas e sequenciadas por meio de 20 métodos convencionais para determinar as seqüências variáveis leve e pesada dos ligantes selecionados de CXCR4. As regiões variáveis podem ser convertidas em cadeias de anticorpo de comprimento total por técnicas de ADN recombinante convencionais, tais como a clonagem das regiões variáveis num vetor de expressão que tem as regiões constantes de cadeia leve 25 e pesadas humanas, de tal modo que a região VH fique operativamente ligada à região CH e a região VL fique operativamente ligada à região CL. Para uma melhor descrição da preparação de anticorpos CXCR4 humanos utilizando este sistema combinado de camundongo transgênico/apresentação em fago, ver o Exemplo 1. Imunização de Camundongos Ig Humanos
Quando camundongos Ig humanos são utilizados para produzir os anticorpos humanos desta revelação, estes camundongos podem ser imunizados com uma preparação purificada ou enriquecida de antígeno CXCR4 e/ou CXCR4 recombinante ou células que expressam CXCR4 ou uma proteína de fusão CXCR4 conforme descrito por Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368(6474): 856859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851; e Publicação PCT WO 98/24884 e WO 01/14424. De preferência os camundongos terão 6-16 semanas de idade depois da primeira perfusão. Por exemplo, uma preparação purificada ou recombinante (5-50 μg) de antígeno CXCR4 pode ser utilizada para imunizar o camundongo Ig humano por via intraperitoneal. Mais preferencialmente, o imunógeno utilizado para produzir os anticorpos desta revelação compreende CXCR4 humano na sua conformação nativa no interior de uma membrana, exemplos não limitativos dos quais incluem células transfectadas para expressar CXCR4 nas sua superfície celular, células que nativamente expressam o CXCR4 na sua superfície celular (por exemplo, células CEM) e membranas artificiais (por exemplo, lipossomas) nas quais o CXCR4 foi incorporado, tais como proteolipossomas magnéticos (MPLs) que incorporam CXCR4 (melhor descrito no Exemplo 1).
Procedimentos detalhados para gerar anticorpos monoclonais totalmente humanos para CXCR4 estão descritos no Exemplo 1 adiante. Experiência cumulativa com vários antígenos demonstrou que os camundongos transgênicos respondem quando inicialmente imunizados por 25 via intraperitoneal (IP) com antígeno em adjuvante completo de Freund, seguido por imunizações IP em semanas alternadas (até um total de 6) com antígeno em adjuvante completo de Freund. No entanto, constatou-se que adjuvantes que não sejam de Freund também são eficazes. Além disso, constatou-se que células inteiras na ausência de adjuvante são altamente imunogênicas. A resposta imune pode ser monitorizada ao longo do transcurso do protocolo de imunização com amostras de plasma sento obtidas por sangramento retro-orbital. O plasma pode ser rastreado por ELISA (conforme descrito adiante) e os camundongos com titulações suficientes de 5 imunoglobulina humana anti-CXCR4 podem ser utilizados para fusões. Os camundongos podem ser reforçados por via intravenosa com o antígeno 3 dias antes do sacrifício e remoção do baço. Espera-se que seja necessário realizar 2-3 fusões para cada imunização. Entre 6 e 24 camundongos são tipicamente imunizados para cada antígeno. Habitualmente, são utilizadas tanto as estirpes 10 HCo7 como HCo 12. Além disso, tanto o transgene HCo7 como HCo 12 podem ser gerados juntos em um único camundongo com dois transgenes diferentes de cadeia pesada humana (HCo7/HCol2). Alternativamente ou adicionalmente, pode ser utilizada a estirpe do camundongo KM®, conforme descrito no Exemplo 1.
Geração de Hibridomas que Produzem os Anticorpos Monoclonais Humanos desta revelação
Para gerar hibridomas que produzem os anticorpos monoclonais humanos desta revelação, esplenócitos e/ou gânglios linfáticos de camundongos imunizados podem ser isolados e fundidos a uma linha 20 celular imortalizada apropriada, tal como uma linha celular de mieloma de camundongo. Os hibridomas resultantes podem ser rastreados quando à produção de anticorpos antígeno-específicos. Por exemplo, suspensões de célula única de linfócitos esplênicos de camundongos imunizados podem ser fundidas a um sexto do número células de mieloma (ATCC, CRL 1580) de 25 camundongo não secretoras de P3X63-Ag8.653 com 50% de PEG. Alternativamente, a suspensão de célula única de linfócitos esplênicos de camundongos imunizados pode ser fundida utilizando um campo elétrico com base no método de eletrofusão, utilizando um eletroporador de fusão de células de câmara grande CytoPulse (CytoPulse Sciences, Inc., Glen Bumie, Maryland). As células são plaqueadas a aproximadamente 2 x IO5 em placa de microtitulação de fundo plano, seguido por uma incubação de duas semanas em meio seletivo contendo 20% de Soro fetal bovino, 18% de meio condicionado "653", 5% origem (IGEN), L-glutamina 4 mM, piruvato de 5 sódio I mM, HEPES 5 mM, 2-mercaptoetanol 0,055 mM, 50 unidades/mL de penicilina, 50 mg/mL de estreptomicina, 50 mg/mL de gentamicina e IX HAT (Sigma; o HAT é adicionado 24 horas depois da fusão). Depois de aproximadamente duas semanas, as células podem ser cultivadas em meio no qual o HAT é substituído por HT. Poços individuais podem, então, ser 10 rastreados por ELISA quanto a anticorpos monoclonais IgM e IgG. Uma vez que ocorre extenso crescimento de hibridoma, o meio pode ser observado geralmente depois de 10-14 dias. Os anticorpos que segregam hibridomas podem ser replaqueados, rastreados uma vez mais, e, se ainda apresentarem resultados positivos para IgG humana, os anticorpos monoclonais podem ser 15 subclonados pelo menos duas vezes por diluição limitante. Os subclones estáveis podem, então, ser cultivados in vitro para gerar pequenas quantidades de anticorpos em meio de cultura de tecido para caracterização.
Para purificar os anticorpos monoclonais humanos, hibridomas selecionados podem ser desenvolvidos em frascos spinner de dois litros para a 20 purificação dos anticorpos monoclonais. Os sobrenadantes podem ser filtrados antes da cromatografia de afinidade com proteína A-sepharose (Pharmacia, Piscataway, N.J.). A IgG eluída pode ser verificada por eletroforese em gel e cromatografia líquida de alto desempenho para assegurar pureza. A solução tampão pode ser trocada por PBS, e a 25 concentração pode ser determinada por OD280 utilizando coeficiente de extinção de 1,43. Os anticorpos monoclonais podem ser divididos em alíquotas e armazenados a -80° C.
Geração de Transfectomas que Produzem os Anticorpos Monoclonais desta Revelação Os anticorpos desta revelação também podem ser produzidos num transfectoma de célula hospedeira utilizando, por exemplo, uma combinação de técnicas de ADN recombinante e métodos de transfecção de gene como é conhecido na técnica (por exemplo, Morrison, S. (1985) Science 5 229:1202).
Por exemplo, para expressar os anticorpos ou seus fragmentos de anticorpos, pode-se obter ADNs que codificam cadeias leves e pesadas de comprimento parcial ou total por meio de técnicas convencionais de biologia molecular (por exemplo, amplificação por PCR ou clonagem de cADN 10 utilizando um hibridoma que expressa o anticorpo de interesse) e os ADNs podem ser inseridos nos vetores de expressão de tal modo que os genes são operativamente ligados a seqüências de controle transcricionais e translacionais. Neste contexto, o termo "operativamente ligado" pretende significar que um gene de anticorpo é ligado a um vetor de tal modo que as 15 seqüências de controle transcricionais e translacionais no vetor servem a sua função pretendida de regular a transcrição e a translação do gene do anticorpo. O vetor de expressão e as seqüências de controle da expressão são selecionadas para serem compatíveis com a célula hospedeira de expressão utilizada. O gene de cadeia leve do anticorpo e o gene de cadeia pesada do 20 anticorpo podem ser inseridos em vetores separados ou, mais tipicamente, ambos os genes podem ser inseridos no mesmo vetor de expressão. Os genes do anticorpo são inseridos no vetor de expressão por meio de métodos padrão (por exemplo, ligação de sítios de restrição complementares no fragmento do gene do anticorpo e ligação de vetor ou extremidade romba se não estiverem 25 presentes sítios de restrição). As regiões variáveis de cadeia leve e pesada dos anticorpos aqui descritos podem ser utilizadas para criar genes de anticorpos de comprimento total de qualquer isotipo de anticorpo pela inserção dos mesmos em vetores de expressão que já codificam a região constante de cadeia pesa e a região constante de cadeia leve do isotipo desejado de tal modo que o segmento Vh seja operativamente ligado ao(s) segmento(s) Ch no vetor e o segmento Vk seja operativamente ligado ao segmento Cl no vetor. Adicionalmente ou alternativamente, o vetor de expressão recombinante pode codificar um peptídeo sinal que facilita a secreção da cadeia do anticorpo de 5 uma célula hospedeira. O gene da cadeia do anticorpo pode ser clonado no vetor de tal modo que o peptídeo sinal seja ligado in-frame ao terminal amino do gene da cadeia de anticorpo. O peptídeo sinal pode ser um peptídeo sinal de imunoglobulina ou um peptídeo sinal heterólogo (isto é, um peptídeo sinal de uma proteína não-imunoglobulina).
Além dos genes da cadeia do anticorpo, os vetores de
expressão recombinantes desta revelação têm seqüências reguladoras que controlam a expressão dos genes da cadeia do anticorpo numa célula hospedeira. O termo "seqüência reguladora" pretende incluir promotores, intensificadores e outros elementos de controle (por exemplo, sinais de 15 poliadenilação) que controlam a transcrição ou translação dos genes da cadeia do anticorpo. Estas seqüências reguladoras são descritas, por exemplo em Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)). Será entendido pelos especialistas na técnica que a concepção do vetor de expressão, incluindo a seleção de 20 seqüências reguladoras, pode depender de fatores tais como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão de proteína desejado, etc. As seqüências reguladoras preferidas para expressão de célula hospedeira de mamífero incluem elementos virais que dirigem altos nível de expressão de proteína em células de mamíferos, tais como promotores e/ou 25 intensificadores derivados de citomagalovírus (CMV), Simian Vírus 40 (SV40), adenovírus, (por exemplo, o principal promotor tardio de adenovírus (AdMLP) e polioma. Alternativamente, podem ser utilizadas seqüências reguladoras não virais tais como o promotor de ubiquitina ou promotor de βglobina. Além disso, os elementos reguladores compostos de seqüências de fontes diferentes, tais como o sistema promotor SRa, que contém seqüências do promotor precoce SV40 e da repetição terminal longa da leucemia de células T humana tipo 1 (Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472).
Além dos genes de cadeia de anticorpo e seqüências 5 reguladoras, os vetores de expressão recombinantes da invenção podem ter seqüências adicionais, tais como seqüências que regulam a replicação do vetor nas células hospedeiras (por exemplo, origens de replicação) e genes marcadores selecionáveis. O gene marcador selecionável facilita a seleção de células hospedeiras nas quais o vetor foi introduzido (ver, por exemplo, as 10 Patentes US N0 4.399.216, 4.634.665 e 5,179.017, todas por Axel et al.). Por exemplo, tipicamente, o gene marcador selecionável confere resistência a drogas, tais como G418, higromicina ou metotrexato, em uma célula hospedeira na qual o vetor foi introduzido. Os genes marcadores selecionáveis preferidos incluem o gene di-hidrofolato redutase (DHFR) (para utilização em 15 células hospedeiras dhfr- com seleção/amplificação de metotrexato) e o neo gene (para seleção de G418). Para a expressão das cadeias leves e pesadas, o(s) vetor(es) de expressão que codificam as cadeias leves e pesadas é(são) transferido(s) para uma célula hospedeira por meio de técnicas padrão. As várias formas do termo "transfecção" destinam-se a abranger uma ampla 20 variedade de técnicas habitualmente utilizadas para a introdução de ADN exógeno em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica, por exemplo, eletroporação, precipitação de cálcio-fosfato, transfecção DEAE-dextrano e outras. Embora seja teoricamente possível expressar os anticorpos da invenção tanto em células procarióticas como eucarióticas, a expressão de 25 anticorpos em células eucarióticas, e mais tipicamente em células hospedeiras de mamíferos, é a mais preferida porque estas células eucarióticas e, em particular as células de mamíferos, são mais prováveis do que as células procarióticas de montar e segregar um anticorpo apropriadamente dobrado e imunologicamente ativo. A expressão procariótica de genes de anticorpos foi relatada como sendo ineficaz para a produção de altos rendimentos de anticorpos ativos (Boss, Μ. A. e Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13).
As células de hospedeiras de mamíferos preferidas para expressar os anticorpos recombinantes desta revelação incluem Ovário de Hamster Chinês (células CHO) (incluindo as células CHO dhfr", descritas em Urlaub e Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 77:4216-4220, utilizadas como um marcador selecionável de DHFR, como descrito, por exemplo, em R. J. Kaufman e P. A. Sharp (1982) J. Mol. Biol. 159:601-621), células NSO de mieloma, células COS e células SP2. Em particular, para utilização com células NSO de mieloma, outro sistema de expressão preferido é o sistema de expressão de gene GS revelado nos documento WO 87/04462 (de Wilson), WO 89/01036 (de Bebbington) e EP 338,841 (de Bebbington). Quando vetores de expressão recombinantes que codificam os genes do anticorpos são introduzidos em células hospedeiras de mamífero, os anticorpos são produzidos cultivando as células hospedeiras por um período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou, mais preferencialmente, a secreção do anticorpo no meio de cultura no qual as células hospedeiras são desenvolvidas. Os anticorpos podem ser recuperados do meio de cultura utilizando métodos convencionais de purificação de proteína.
Caracterização de Ligação do Anticorpo ao Antígeno
Os anticorpos desta revelação podem ser testados quanto à ligação ao CXCR4, por exemplo, por meio de métodos de citometria de fluxo 25 convencionais. Uma vez que os anticorpos desta revelação, de preferência, reconhecem o CXCR4 na sua conformação nativa no interior de uma membrana, o teste para a ligação do CXCR4 é realizado, de preferência com um ensaio (por exemplo, citometria de fluxo), que utiliza um reagente que expressa CXCR4 de conformação nativa. Exemplos não limitativos de reagentes que expressam CXCR4 de conformação nativa que podem ser utilizados nos ensaios de ligação incluem células que expressam CXCR4 naturalmente (por exemplo, células CEM), células que foram transfectadas para expressar o CXCR4 (por exemplo, células R1610 transfectadas com 5 vetor de expressão CXCR4) e lipossomas nos quais foi incorporado o CXCR4 (por exemplo, proteolipossomas magnéticos que incorporam CXCR4), cada uma das quais está descrita em mais detalhe nos Exemplos. Em resumo, para o ensaio de citometria de fluxo, as células que expressam CXCR4 são incubadas com o anticorpo de teste, lavadas, incubadas com um reagente IO secundário marcado capaz de se ligar ao anticorpo de teste, lavadas mais uma vez e submetidas a análise para detectar a ligação do reagente secundário às células (por exemplo, utilizando uma máquina FACS). De preferência, os camundongos que desenvolvem as titulações mais altas, conforme avaliado por citometria de fluxo serão usados para fusões ou para seleção adicional de 15 anticorpos (por exemplo, rastreio por apresentação de fago de bibliotecas de anticorpos feitas de células B de camundongo).
Um ensaio de citometria de fluxo conforme descrito acima também pode ser utilizado para rastrear hibridomas que apresentam reatividade positiva com o imunógeno CXCR4. Hibridomas que expressam 20 anticorpos que se ligam com alta avidez ao CXCR4 são subclonados e adicionalmente caracterizados. Um clone de cada hibridoma, que retém a reatividade das células precursoras (por citometria de fluxo) pode ser escolhido para fazer um banco de células de 5-10 frascos armazenado a 140°C, e para purificação de anticorpo.
Para purificar anticorpos anti-CXCR4, hibridomas
selecionados podem ser desenvolvidos em frascos spinner de dois litros para a purificação dos anticorpos monoclonais. Os sobrenadantes podem ser filtrados antes da cromatografia de afinidade com proteína A-sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ). A IgG eluída pode ser verificada por eletroforese em gel e cromatografia líquida de alto desempenho para assegurar pureza. A solução tampão pode ser trocada por PBS e a concentração pode ser determinada por OD280 utilizando coeficiente de extinção de 1,43. Os anticorpos monoclonais pode ser divididos em alíquotas 5 e armazenados a -80 0C.
Para determinar se os anticorpos monoclonais anti-CXCR4 se ligam a epítopos únicos, cada anticorpos pode ser biotinilado utilizando reagentes comercialmente disponíveis (Pierce, Rockford, IL). Pode-se realizar estudos de competição utilizando anticorpos monoclonais não marcados e 10 anticorpos monoclonais biotinilados podem ser realizados utilizando um ensaio ELISA de célula inteira no qual as placas ELISA são revestidas com células que expressam o CXCR4, e é examinada a capacidade do anticorpo não marcado de competir com o anticorpo biotinilado pela ligação à células que expressam CXCR4. A ligação de mAb biotinilados pode ser detectada 15 com uma sonda estrepavidina-fosfatase alcalina.
Para determinar o isotipo de anticorpos purificados, pode-se realizar ELISAs de isotipo utilizando reagentes específicos para anticorpos de um isotipo em particular. Por exemplo, para determinar o isotipo de um anticorpo monoclonal humano, poços de placas de microtitulação podem ser 20 revestidas com 1 μg/mL de imunoglobulina anti-humana de um dia para o outro a 4°C. Depois de bloqueio com 1% BSA, as placas são feitas reagir como 1 μg /mL ou menos de anticorpos monoclonais de teste ou controles de isotipo purificado, à temperatura ambiente por uma a duas horas. Os poços podem, então, ser feitos reagir com IgGl humana ou sondas fosfatase alcalina 25 conjugadas com IgM específica humana. As placas são desenvolvidas e analisadas conforme descrito acima.
IgGs humanas anti-CXCR4 podem ser também testadas quanto à reatividade ao antígeno CXCR4 por Western blotting. Em resumo, o CXCR4 pode ser preparado e submetido a eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio. Depois da eletroforese, os antígenos separados são transferidos para membranas de nitrocelulose, bloqueados com 10% de soro fetal bovino e sondados com os anticorpos monoclonais a serem testados. A ligação a IgG humana pode ser detectada 5 utilizando fosfatase alcalina de IgG anti-humana e desenvolvida com comprimidos de substrato BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St. Louis, Mo.).
A especificidade de ligação de um anticorpo desta revelação também pode ser determinada pela monitoração da ligação do anticorpo a células que expressam CXCR4, por exemplo, por citometria de fluxo. 10 Tipicamente, uma linhagem celular, tal como a linhagem celular CHO, pode ser transfectada com um vetor de expressão que codifica uma forma transmembrana de CXCR4. A proteína transfectada pode compreender uma etiqueta (tag), tal como uma etiqueta-myc, preferencialmente no terminal N para detecção utilizando uma anticorpo para a etiqueta. A ligação de um 15 anticorpo desta revelação ao CXCR4 pode ser determinada incubando a células transfectadas com o anticorpo e detectando o anticorpo ligado. A ligação de um anticorpo à etiqueta na proteína transfectada pode ser utilizada como um controle positivo.
Imunoconiugados
Em um outro aspecto, a presente invenção apresenta um
anticorpo anti-CXCR4, ou um seu fragmento, conjugado a uma unidade terapêutica, tal como uma citotoxina, uma droga (por exemplo, um imunossupressor) ou uma radiotoxina. Estes conjugados são aqui referidos como “imunoconjugados”. Imunoconjugados que incluem uma ou mais 25 citotoxinas são referidos como as “imunotoxinas.” Uma citotoxina ou agente citotóxico inclui qualquer agente que é prejudicial (por exemplo, mata) às células. Exemplos incluem taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposide, tenoposide, vincristina, vinblastina, colcicina, doxorubicina, daunorubicina, di-hidroxi antracenediona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotestosterona, glucocorticóides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol e puromicina e seus análogos ou homólogos. Agentes terapêuticos também incluem, por exemplo, antimetabólitos (por exemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6- 5 tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina), agentes alquilantes (por exemplo, mecloretamina, tiotepa, clorambucil, melfalan, carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU), ciclotosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C e cis-diclorodiamina platina (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (por exemplo, daunorubicina (anteriormente 10 daunomicina) e doxorubicina), antibióticos (por exemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina e antramicina (AMC)) e agentes anti-mitóticos (por exemplo, vincristina e vinblastina).
Outros exemplos preferidos de citotoxinas terapêuticas que podem ser conjugadas a um anticorpo da invenção incluem duocarmicinas, caliqueamicinas, maitansinas e auristatinas e seus derivados. Um exemplo de um conjugado de anticorpo de caliqueamicina está disponível comercialmente (Mylotarg®; American Home Products).
As citotoxinas podem ser conjugadas a anticorpos desta revelação utilizando tecnologia de ligante conhecida na técnica. Exemplos de 20 tipos de ligantes que foram utilizadas para conjugar uma citotoxina a um anticorpo incluem, mas não se limitam a hidrazonas, tioéteres, ésteres, dissulfetos e ligantes contendo peptídeo. Pode-se escolher um ligante que é, por exemplo, susceptível a clivagem por pH baixo no compartimento lisosomal ou susceptível a clivagem por proteases, tais como proteases 25 preferencialmente expressas em tecido tumoral tais como catepsinas (por exemplo, catepsinas B, C, D).
Para discussão adicional de tipos de citotoxinas, ligantes e métodos para conjugação de agentes terapêuticos a anticorpos, ver também Saito, G. et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail, P.A. et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen, Τ.Μ. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan, I. e Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P. D. e Springer, C.J. (2001) Adv. DrugDeliv. Rev. 53:247-264.
Os anticorpos da presente invenção também podem ser
conjugados a um isótopo radioativo para gerar produtos radiofarmacêuticos citotóxicos, também referidos como radioimunoconjugados. Exemplos de isótopos radioativos que podem ser conjugados a anticorpos para utilização
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em diagnósticos ou terapêutica incluem, mas não se limitam a iodo , 10 índio111, ítrio90 e lutécio177. Métodos para preparar radioimunoconjugados estão estabelecidos na técnica. Exemplos de radioimunoconjugados estão disponíveis comercialmente, incluindo, Zevalin® (IDEC Pharmaceuticals) e Bexxar® (Corixa Pharmaceuticals), e métodos similares podem ser utilizados para preparar radioimunoconjugados utilizando os anticorpos desta revelação. 15 Os conjugados de anticorpos da invenção podem ser utilizados
para modificar uma dada resposta biológica e a unidade de droga não deve ser interpretada como limitada a agentes terapêuticos químicos clássicos. Por exemplo, a unidade de droga pode ser uma proteína ou peptídeo que possui uma atividade biológica desejada. Estas proteínas podem incluir, por 20 exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa ou seu fragmento ativo, tal como abrina, ricina A, pseudomonas exotoxina ou toxina diftérica; uma proteína tal como o fator de necrose tumoral ou interferon-γ; ou, modificadores da resposta biológica tais como, por exemplo, linfocinas, interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), fator estimulante de colônia 25 de granulócitos e macrófagos ("GM-CSF"), fator estimulante de colônia de granulócitos ("G-CSF") ou outros fatores de crescimento.
As técnicas para conjugar estas unidades terapêuticas a anticorpos são conhecidas, ver, por exemplo, Amon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", em Monoclonal Antibodies And Caneer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243- 56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", em Controlled Drug Delivery (2a Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Mareei Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic 5 Agents In Caneer Therapy: A Review", em Monoclonal Antibodies '84: Biologieal And Clinicai Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective OfThe Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", em Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 10 (Academic Press 1985), e Thorpe et al., Immunol. Rev., 62:119-58 (1982). Moléculas Biespecíficas
Em um outro aspecto, a presente invenção apresenta moléculas biespecífieas compreendendo um anticorpo anti-CXCR4, ou um seu fragmento, desta revelação. Um anticorpo desta revelação, ou porção de 15 ligação ao antígeno do mesmo, pode ser derivatizado ou ligado a outra molécula funcional, por exemplo, outro peptídeo ou proteína (por exemplo, outro anticorpo ou ligando para um receptor) para gerar uma molécula biespecífica que se liga a pelo menos dois sítios de ligação ou moléculas alvo diferentes. O anticorpo desta revelação pode, na realidade, ser derivatizado ou 20 ligado a mais de uma outra molécula funcional para gerar moléculas multiespecíficas que se ligam a mais de dois sítios de ligação e/ou moléculas alvo diferentes; estas moléculas multiespecíficas também pretendem ser abrangidas pelo termo “molécula biespecífica”, conforme aqui utilizado. Para criar uma molécula biespecífica desta revelação, um anticorpo desta revelação 25 pode ser ligado funcionalmente (por exemplo, por acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou outras) a uma ou mais outras moléculas de ligação, tal como outro anticorpo, fragmento de anticorpo, peptídeo ou ligação mimética, de tal modo que resulte uma molécula biespecífica. Em concordância, a presente invenção inclui moléculas biespecíficas compreendendo pelo menos uma primeira especificidade de ligação por CXCR4 e uma segunda especificidade de ligação para um segundo epítodo alvo. Em uma modalidade em particular desta revelação, o 5 segundo epítopo alvo é um receptor Fe, por exemplo, FcyRI (CD64) humano ou um receptor Fcy (CD89) humano. Portanto, esta revelação inclui moléculas biespecíficas capazes de se ligarem tanto a FcyR como FcyR que expressam células efetoras (por exemplo monócitos, macrófagos ou células polimorfonucleares (PMNs)) e dirigir-se a células que expressam CXCR4. 10 Estas moléculas biespecíficas se dirigem a células que expressam CXCR4 para célula efetora e desencadeiam atividades de célula efetora mediada pelo receptor Fe, tais como a fagocitose de uma célula que expressa CXCR4, citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), libertação de citoquina ou geração de ânion superóxido.
Em uma modalidade desta revelação na qual a molécula
biespecífica é multiespecífica, a molécula pode ainda incluir uma terceira especificidade de ligação, além da especificidade de ligação anti-Fc e uma especificidade de ligação anti-CXCR4. Em uma modalidade, a terceira especificidade de ligação é uma porção do fator de anti-intensificação (EF), 20 por exemplo, uma molécula que se liga a uma proteína de superfície envolvida em atividade citotóxica e, deste modo, aumenta a resposta imune contra a célula alvo. A "porção do fator de anti-intensificação" pode ser um anticorpo, fragmento de anticorpo funcional ou um ligando que se liga a uma dada molécula, por exemplo, um antígeno ou um receptor e, deste modo, 25 resulta numa intensificação do efeito das determinantes de ligação para o receptor Fc ou antígeno da célula alvo. A “porção do fator de antiintensificação” pode ligar um receptor Fc ou antígeno da célula alvo. Alternativamente, a porção do fator de anti-intensificação pode se ligar a uma entidade que é diferente da entidade à qual se ligam a primeira e a segunda especificidades. Por exemplo, a porção do fator de anti-intensificação pode se ligar a uma célula T citotóxica (por exemplo, por meio de CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-I ou outra célula imune que resulta numa resposta imune aumentada contra a célula alvo).
5 Em uma modalidade, as moléculas biespecíficas desta
revelação compreendem como uma especificidade de ligação pelo menos um anticorpo ou um seu fragmento de anticorpo, incluindo, por exemplo, um Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, dAb, ou um Fv de cadeia única. O anticorpo também pode ser um dímero de cadeia leve ou cadeia pesada ou qualquer fragmento 10 mínimo deste, tal como um Fv ou uma cadeia única construída como descrito na Patente US N0 4.946.778 de Ladner et al., cujo teor é expressamente incorporado por citação.
Em uma outra modalidade, a especificidade de ligação para um receptor Fcy proporcionada por um anticorpo monoclonal, cuja ligação 15 não é bloqueada por imunoglobulina G humana (IgG). Conforme aqui utilizado, o termo "receptor IgG" se refere a qualquer um dos oito genes de cadeia y localizados no cromossoma I. Estes genes codificam um total de doze isoformas transmembrana ou receptor solúvel que são agrupadas em três classes de receptor Fcy: FcyRI (CD64), FcyRII(CD32) e FcyRIII (CD16). 20 Numa modalidade preferida, o receptor Fcyé um FcyRI humano de alta afinidade. O FcyRI humano é uma molécula de 72 kDa que apresenta alta
n Ql
afinidade por IgG monomérica (10 - 10 M').
A produção e caracterização de certos anticorpos monoclonais anti-Fcysao descritas na Publicação PCT WO 88/00052 e na Patente US N0 25 4,954,617 de Fanger et al., cujos ensinamentos são aqui integralmente incorporados por citação. Estes anticorpos se ligam a um epítopo de FcyRI, FcyRII ou FcyRIII num sítio que é distinto do sítio de ligação de Fcy do receptor e, deste modo, a sua ligação não é substancialmente bloqueada por níveis fisiológicos de IgG. Os anticorpos anti-FcyRI específicos úteis nesta invenção são mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 e mAb 197. O hibridoma que produz o mAb 32 está disponível da American type Culture Collection, N0 de Acesso ATCC HB9469. Em outras modalidades, o anticorpo para o receptor anti-Fcy é uma forma humanizada do anticorpo monoclonal 22 5 (H22). A produção e caracterização do anticorpo H22 é descrita em Graziano, R.F. et al. (1995) J. Immunol 155 (10): 4996-5002 e Publicação PCT WO 94/10332 de Tempest et al. A linha celular que produz o anticorpo H22 foi depositada na American type Culture Collection sob a designação HA022CL1 e tem o N0 de Acesso CRL 11177.
Em ainda outras modalidades, a especificidade de ligação para
um receptor Fc é proporcionada por um anticorpo que se liga a um receptor IgA humano, por exemplo, um receptor Fc-alfa (FcaRI (CD89)), cuja ligação, de preferência, não é bloqueada por imunoglobulina humana A (IgA). O termo "receptor IgA" pretende incluir o gene produto de um α-gene (FcaRI) localizado no cromossoma 19. Este gene é conhecido por codificar várias isoformas transmembranas unidas alternativamente de 55 a 110 kDa. O FcaRI (CD89) é constitutivamente expresso sobre monócitos/macrófagos, granulócitos eosinofílicos e neutrofílicos, mas não em populações de células não efetoras. O FcaRI tem afinidade média (»5 x IO7 M'1) tanto por IgAl como IgA2 que é aumentada mediante exposição a citoquinas como, por exemplo, G-CSF ou GM-CSF (Morton, H.C. et al. (1996) Criticai Reviews in Immunology 16:423-440). Foram descritos quatro anticorpos monoclonais Fc aRI-específicos, identificados como A3, A59, A62 e A77, que ligam FcaRI fora do domínio de ligação do ligando IgA, (Monteiro, R.C. et al. (1992) J. Immunol. 148:1764).
Os FcaRI e FcyRI são receptores de desencadeamento preferidos para utilização nas moléculas biespecíficas desta revelação porque os mesmos são (1) expressos primariamente sobre células efetoras imunes, por exemplo, monócitos, PMNs, macrófagos e células dendríticas; (2) expressos em altos níveis (por exemplo 5.000-100.000 por célula); (3) mediadores de atividades citotóxicas (por exemplo, ADCC, fagocitose); e (4) mediam a apresentação de antígeno aumentada de antígenos, incluindo autoantígenos, dirigidos aos mesmos.
5 Embora os anticorpos monoclonais humanos seja preferidos,
outros anticorpos que podem ser utilizados nas moléculas biespecíficas desta revelação são anticorpos murinos, quiméricos e anticorpos monoclonais humanizados.
As moléculas biespecíficas da presente invenção podem ser preparadas conjugando as especificidades de ligação constituintes, por exemplo, as especificidades de ligação anti-FcR e anti-CXCR4, utilizando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, cada especificidade de ligação da molécula biespecífica pode ser gerada separadamente e, depois, conjugada uma a uma outra. Quando as especificidades de ligação são proteínas ou peptídeos, pode-se utilizar uma variedade de agentes de acoplamento ou ligação-cruzada para conjugação covalente. Exemplos de agentes de ligação cruzada incluem a proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetiltioacetato (SATA), ácido 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzóico) (DTNB), ofenilenedimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP) e sulfosuccinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclo-haxano-1-carboxilato (sulfo-SMCC) (ver, por exemplo Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 82:8648). Outros métodos incluem aqueles descritos em Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. N0 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229:81-83, e Glennie et al. (1987) J. Immunol 139: 2367-2375). Os agentes de conjugação preferidos são SATA e sulfo-SMCC, ambos disponíveis da Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).
Quando as especificidades de ligação são anticorpos, os mesmos podem ser conjugados por meio de uma ligação sulfidril das regiões conectoras do terminal C das duas cadeias pesadas. Numa modalidade particularmente preferida, a região conectora é modificada para conter um número ímpar de resíduos de sulfidril, de preferência um, antes da conjugação.
Alternativamente, ambas as especificidades de ligação podem ser codificadas no mesmo vetor e expressas e montadas na mesma célula hospedeira. Este método é particularmente útil onde a molécula biespecífica é uma proteína de fusão mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 ou ligando x Fab. Uma molécula biespecífica desta revelação pode ser uma molécula de cadeia única compreendendo um anticorpo de cadeia única e um determinante de ligação, ou uma molécula biespecífica de cadeia única compreendendo dois determinantes de ligação. As moléculas biespecíficas podem compreender pelo menos duas moléculas de cadeia única. Métodos para preparar moléculas bioespecíficas são descritos, por exemplo nas Patentes US Nos. 5,260,203; 5,455,030; 4,881,175; 5,132,405; 5,091,513; 5,476,786; 5,013,653; 5,258,498; e 5,482,858, todas as quais são aqui integralmente incorporadas por citação.
A ligação das moléculas biespecíficas aos seu alvos específicos pode ser confirmada, por exemplo, por ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA), análise FACS, bioensaio 20 (por exemplo, inibição do crescimento) ou ensaio Western Blot. Cada um destes ensaios, em geral, detecta a presença de complexos de proteínaanticorpo de particular interesse utilizando um reagente marcado (por exemplo, um anticorpo) específico para o complexo de interesse. Por exemplo, os complexos FcR-anticorpo podem ser detectados utilizando, por 25 exemplo, um anticorpo ligado a enzima ou fragmento de anticorpo que reconhece e especificamente se liga aos complexos anticorpo-FcR. Alternativamente, os complexos podem ser detectados utilizando qualquer um de uma variedade de outros imunoensaios. Por exemplo, o anticorpo pode ser marcado radioactivamente e utilizado num radioimunoensaio (RIA) (ver, por exemplo, Weintraub, B., Principies of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, Março de 1986, que é aqui incorporado por citação). O isótopo radioativo pode ser detectado por meios tais como a utilização de um contador Dou um contador 5 de cintilação ou por auto-radiografia.
Composições Farmacêuticas
Em um outro aspecto, a presente revelação proporciona uma composição, por exemplo, uma composição farmacêutica, contendo um ou uma combinação de anticorpos monoclonais ou suas porções de ligação ao 10 antígeno, da presente revelação, formulada juntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável. Estas composições podem incluir um ou uma combinação de anticorpos (por exemplo, um ou mais anticorpos diferentes) ou imunoconjugados ou moléculas biespecíficas desta revelação. Por exemplo, uma composição farmacêutica desta revelação pode compreender 15 uma combinação de anticorpos (ou imunoconjugados ou biespecíficos) que se ligam a epítopos diferentes no antígeno alvo ou que têm atividades complementares.
As composições farmacêuticas desta revelação também podem ser administradas em terapia de combinação, isto é, combinadas a outras 20 agentes. Por exemplo a terapia de combinação pode incluir um anticorpo antiCXCR4 da presente revelação combinado com pelo menos um outro agente antiinflamatório ou imunossupressor. Exemplos de agentes terapêuticos que podem ser utilizados em terapia de combinação são descritos em mais detalhe adiante na seção sobre usos dos anticorpos desta revelação.
Conforme aqui utilizado, "veículo farmaceuticamente
aceitável" inclui quaisquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifungicos, agentes isotônicos e de atraso de absorção e outros semelhantes que são físiologicamente compatíveis. De preferência, o veículo é adequado para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parenteral, espinhal ou epidérmica (por exemplo, por injeção ou perfusão). Dependendo da via de administração, o composto ativo, isto é, o anticorpo, imunoconjugado ou molécula biespecífica, pode ser revestido em um material para proteger o composto 5 contra a ação de ácidos e outras condições naturais que podem inativar o composto.
Os compostos farmacêuticos desta revelação podem incluir um ou mais sais farmaceuticamente aceitáveis. Um "sal farmaceuticamente aceitável" se refere a um sal que retém a atividade biológica desejada do IO composto precursor e não confere quaisquer efeitos toxicológicos indesejáveis (ver, por exemplo, Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sei. 66:1-19). Exemplos destes sais incluem sais de adição de ácido e sais de adição de base. Os sais de adição de ácido são aqueles derivados de ácidos inorgânicos não tóxicos, tais como, o ácido clorídrico, nítrico, fosfórico, sulfurico, bromídrico, 15 iodrídrico, fosforoso e outros, bem como ácidos orgânicos não tóxicos, tais como ácidos alifáticos mono e dicarboxílicos, ácidos alcanóicos fenilsubstituídos, ácidos hidroxi alcanóicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfônicos alifáticos e aromáticos e outros. Os sais de adição de base incluem aqueles derivados de metais alcalino terrosos, tais como sódio, potássio, magnésio, 20 cálcio e outros, bem como de aminas orgânicas não tóxicas, tais como N5N'dibenziletilenodiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilenodiamina, procaína e outras.
Uma composição farmacêutica desta revelação também pode incluir um antioxidante farmaceuticamente aceitável. Exemplos de 25 antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) antioxidantes solúveis em água, tais como ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, bissulfato de sódio, metabissulfato de sódio, sulfito de sódio e outros; (2) antioxidantes solúveis em óleo, tais como ascorbil palmitado, hidroxianisole butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, propil gaiato, alfa-tocoferol e outros; e (3) agentes quelantes metálicos, tais como ácido cítrico, ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico e outros.
Exemplos de veículos aquosos e não aquosos adequados que 5 podem ser utilizados nas composições farmacêuticas desta revelação incluem água, etanol, polióis (tais como glicol, propileno glicol, polietileno glicol e outros) e suas misturas adequadas, óleos vegetais, tais como azeite de oliva e ésteres orgânicos injetáveis, tais como oleato de etila. Pode-se manter uma fluidez apropriada, por exemplo, pela utilização de materiais de revestimento, 10 tais como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de dispersões e pela utilização de tensoativos.
Estas composições também podem conter coadjuvantes tais como conservantes, agentes umectantes, agentes emulsionantes e agentes dispersantes. A prevenção da presença de microrganismos pode ser 15 assegurada tanto por procedimentos de esterilização, supra, como pela inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo parabeno, clorobutanol, ácido fenol sórbico e outros. Pode também ser desejável incluir nas composições agentes isotônicos, tais como açúcares, cloreto de sódio e outros. Além disso, a absorção prolongada da forma 20 farmacêutica injetável pode ser ocasionada pela inclusão de agentes que retardam a absorção, tais como monoestearato de alumínio e gelatina.
Os veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções ou dispersões aquosas e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. A utilização destes meios e agentes para 25 substâncias farmaceuticamente ativas é conhecida na técnica. Exceto na medida em que quaisquer meios convencionais ou agentes sejam incompatíveis com o composto ativo, é contemplada a utilização destes nas composições farmacêuticas desta revelação. Compostos ativos suplementares também pode ser incorporados nas composições. Tipicamente, as composições terapêuticas têm de ser estéreis e estáveis em condições de fabricação e armazenamento. As composições podem ser formuladas como uma solução, microemulsão, liposoma ou outra estrutura ordenada adequada a uma alta concentração de droga. O veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo glicerol, propileno glicol e polietileno glicol líquido e outros) e suas misturas adequadas. Pode-se manter uma fluidez apropriada, por exemplo, pela utilização de um revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de dispersões e pela utilização de tensoativos. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos nas composições, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio. A absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser ocasionada pela inclusão de agentes que retardam a absorção, tais como sais monoestearato e gelatina. Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas
incorporando o composto ativo na quantidade necessária em um solvente apropriado com um ou uma combinação dos ingredientes enumerados acima, conforme necessário, seguido pela esterilização por microfiltração. De um modo geral, as dispersões são reparadas incorporando o composto ativo em 20 um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e outros ingredientes necessários destes enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são secagem a vácuo e secagem por congelamento (liofilização) que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado 25 adicional a partir de uma sua solução anteriormente esterilizada por filtração.
A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material veículo para produzir uma forma de dosagem única irá variar dependendo do indivíduo sendo tratado e o modo de administração em particular. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material veículo para produzir uma forma de dosagem única, de um modo geral, será aquela quantidade da composição que produz um efeito terapêutico. Em geral, de cem por cento, esta quantidade irá variar de cerca de 0,01 por cento a cerca de noventa e nove por cento do ingrediente ativo, 5 preferencialmente de cerca de 0,1 por cento a cerca de 70 por cento, mais preferencialmente e de cerca de 1 por cento a cerca de 30 por cento do ingrediente ativo em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável.
Os regimes de dosagem são ajustados para proporcionar a resposta ótima desejada (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, pode-se administrar um bolo único, pode-se administrar várias doses divididas ao longo do tempo ou a dose pode ser reduzida ou aumentada proporcionalmente conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica. E especialmente vantajoso formular composições parenterais em forma de dosagem unitária para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. Conforme aqui utilizado, forma de dosagem unitária se refere a unidades fisicamente individuais adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo farmacêutico necessário. As especificações para as formas de dosagem unitárias desta revelação são ditadas e diretamente dependentes (a) das características únicas do composto ativo e o efeito terapêutico em particular a ser obtido e (b) das limitações inerentes na técnica de formulação de compostos tal como um composto ativo para o tratamento de sensibilidade em indivíduos.
Para a administração do anticorpo, as dosagens variam de cerca de 0,0001 a 100 mg/kg e mais frequentemente 0,01 to 5 mg/kg, do peso corporal do hospedeiro. Por exemplo, as dosagens podem ser de 0,3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal ou 10 mg/kg de peso corporal ou na faixa de 1-10 mg/kg. Um regime de tratamento exemplificativo implica a administração uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez a cada quatro semanas, uma vez por mês, uma vez a cada 3 meses ou uma 5 vez a cada três a 6 meses. Regimes de dosagem em particular para um anticorpo anti-CXCR4 desta revelação incluem 1 mg/kg de peso corporal ou 3 mg/kg de peso corporal por administração intravenosa, com o anticorpo sendo dado utilizando um dos seguintes esquemas de dosagem: (i) a cada quatro semanas por seis dosagens, depois a cada três meses; (ii) a cada três semanas; 10 (iii) 3 mg/kg de peso corporal uma vez seguido por 1 mg/kg de peso corporal a cada três semanas.
Em alguns métodos, dois ou mais anticorpos monoclonais com especificidades de ligação diferentes são administrados simultaneamente, em cujo caso a dosagem de cada anticorpo administrado se enquadra nas faixas 15 indicadas. O anticorpo é, em geral, administrado em ocasiões múltiplas. Os intervalos entre dosagens unitárias podem ser, por exemplo, semanais, mensais, a cada três meses ou anuais. Os intervalos também podem ser irregulares conforme indicado pela medição dos níveis de anticorpo no sangue do paciente contra o antígeno alvo. Em alguns métodos, a dosagem é ajustada 20 para obter uma concentração de anticorpos no plasma de cerca de 1-1000 Dg ImL e, em alguns métodos, cerca de 25-300 μg /mL.
Alternativamente, o anticorpo pode ser administrado como uma formulação de libertação sustentada, em cujo caso é necessária uma administração menos freqüente. A dosagem e frequência variam dependendo 25 da meia-vida do anticorpo no doente. Em geral, os anticorpos humanos apresentam a meia-vida mais longa, seguido por anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos e anticorpos não humanos. A dosagem e a frequência da administração pode variar dependendo se o tratamento é profilático ou terapêutico. Nas aplicações profiláticas, uma dosagem relativamente baixa é administrada em intervalos relativamente infrequentes por um período de tempo prolongado. Alguns pacientes continuam a receber tratamento para o resto de suas vidas. Nas aplicações terapêuticas, uma dosagem relativamente alta em intervalos relativamente curtos é, algumas vezes, necessária até que o 5 progresso da doença seja reduzido ou terminado e, de preferência, até que o paciente apresente uma melhora parcial ou completa dos sintomas da doença. Depois disto, o paciente pode ser administrado com um regime profüático.
Os níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas da presente invenção podem variar de modo a obter uma quantidade do ingrediente ativo que seja eficaz para atingir a resposta terapêutica desejada para um paciente em particular, composição e modo de administração, sem ser tóxico para o paciente. O nível de dosagem selecionado irá depender de uma variedade de fatores farmacocinéticos incluindo a atividade das composições em particular utilizadas da presente revelação ou seu éster, sal ou amida, a via de administração, a hora da administração, a taxa de excreção do composto em particular sendo utilizado, a duração do tratamento, outras drogas, compostos e/ou materiais utilizados na combinação com as composições em particular utilizadas, a idade, sexo, peso, estado, saúde em geral e histórico médico anterior do paciente sendo tratado e fatores semelhantes conhecidos na medicina.
Uma "dosagem terapeuticamente eficaz" de um anticorpo antiCXCR4 desta revelação, de preferência resulta em uma diminuição na gravidade dos sintomas da doença, num aumento na frequência e duração de períodos livres de sintomas da doença ou numa prevenção de deficiência ou 25 incapacidade devido à aflição da doença. Por exemplo, para o tratamento de tumores CXCR4+, a uma "dosagem terapeuticamente eficaz", de preferência, inibe o crescimento celular ou crescimento do tumor em pelo menos cerca de 20%, mais preferencialmente em pelo menos cerca de 40%, ainda mais preferencialmente em pelo menos cerca de 60% e ainda mais preferencialmente em pelo menos cerca de 80% em relação a indivíduos não tratados. A capacidade de um composto de inibir o crescimento do tumor pode ser avaliada em um sistema de modelo animal previsível da eficácia em tumores humanos. Alternativamente, esta propriedade de uma composição 5 pode ser avaliada examinando a capacidade do composto de inibir o crescimento celular, esta inibição pode ser medida in vitro por ensaios conhecidos dos especialistas. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto terapêutico pode diminuir o tamanho do tumor ou, caso contrário, melhorar os sintomas em um indivíduo. Alguém com conhecimento corrente 10 da técnica seria capaz de determinar estas quantidades com base em fatores tais como o tamanho do indivíduo, a gravidade dos sintomas do indivíduo e a composição em particular ou via de administração selecionadas.
Uma composição da presente revelação pode ser administrada por meio de uma ou mais vias de administração utilizando uma ou mais de uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Conforme será entendido pelo técnico especialista, a via e/ou modo de administração irá variar dependendo dos resultados desejados. As vias de administração preferidas para os anticorpos da invenção incluem as vias intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutânea, espinal ou outras vias parenterais de administração, por exemplo, por injeção ou perfusão. A expressão "administração parenterais" conforme aqui utilizada, significa modos de administração além da administração entérica e tópica, em geral por injeção e inclui, sem limitação, injeção e perfusão intravenosa, intramuscular, intrarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaraquinóide, intraespinal, epidural e intraestemal.
Alternativamente, um anticorpo desta revelação pode ser administrado por uma via não parenteral, tal como uma via de administração tópica, epidérmica ou mucosa, por exemplo por via intranasal, oral, vaginal, retal, sublingual ou tópica.
Os compostos ativos podem ser preparados com veículos que protegerão os compostos contra a libertação rápida, tal como uma formulação de libertação controlada, incluindo implantes, adesivos transdérmicos e 5 sistemas de administração microencapsulados. Polímeros biodegradáveis, biocompatíveis podem ser utilizados, tais como o etileno vinil acetato, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido polilático. Muitos métodos para a preparação destas formulações são patenteados e são, em geral, conhecidos dos especialistas na técnica. Ver, por exemplo, 10 Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems (J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, 1978).
As composições terapêuticas podem ser administradas com dispositivos médicos conhecidos na técnica. Por exemplo, em uma modalidade preferida, uma composição terapêutica desta revelação pode ser 15 administrada com um dispositivo de injeção hipodérmica sem agulha, tal como os dispositivos revelados nas Patentes US N0 5.399.163; 5.383.851; 5.312.335; 5.064.413; 4.941.880; 4.790.824; ou 4.596.556. Exemplos de implantes e módulos conhecidos úteis na presente revelação incluem: Patente US N0 4,487,603, que revela uma bomba de micro-perfusão implantável para 20 administrar um medicamento a uma taxa controlada; Patente US N0 4.486.194, que revela um dispositivo terapêutico para administrar medicamentos através da pele; Patente US N0 4.447.233, que revela uma bomba de perfusão de medicamentos para administrar um medicamento a uma taxa de perfusão precisa; Patente US N0 4.447.224, que revela um 25 aparelho de perfusão implantável de fluxo variável para a administração de droga de forma contínua; Patente US N0 4.439.196, que revela um sistema de administração de droga osmótico com compartimentos de câmaras múltiplas; e Patente US N0 4.475.196, que revela um sistema de administração de droga osmótico. Estas patentes são aqui incorporadas por citação. Muitos outros implantes, sistemas e módulos de administração deste tipo são conhecidos dos especialistas na técnica.
Em certas modalidades, os anticorpos monoclonais humanos desta revelação podem ser formulados para assegurar uma distribuição apropriada in vivo. Por exemplo, a barreira sangue cérebro (BBB) exclui muitos compostos altamente hidrófilos. Para assegurar que os compostos terapêuticos da invenção cruzam a BBB (se desejado) os mesmos podem ser formulados, por exemplo, em liposomas. Para métodos de fabricar liposomas, ver, por exemplo as Patentes US Nos. 4.522.811; 5.374.548; e 5.399.331. Os liposomas podem compreender uma ou mais unidades que são transportadas, de forma seletiva, para dentro de células ou órgãos específicos, deste modo aumenta a administração de droga dirigida (ver, por exemplo, V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Unidades de direcionamento exemplificativas incluem folato e biotina (ver, por exemplo, a Patente US 5,416,016 de Low et al.); manosidos (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); anticorpos (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); receptor da proteína tensoativa A (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134); pl20 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); ver também K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; JJ. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273.
Utilizações e Métodos
Os anticorpos, particularmente os anticorpos humanos, composições de anticorpos e métodos da presente revelação têm inúmeras 25 utilidades para diagnóstico e terapêuticas in vitro e in vivo envolvendo o diagnóstico e o tratamento de doenças mediadas por CXCR4. Por exemplo, estas moléculas podem ser administradas a células em cultura, in vitro ou ex vivo ou a indivíduos humanos, por exemplo, in vivo, para tratar, prevenir e diagnosticar uma variedade de doenças. Conforme aqui utilizado, o termo "indivíduo" pretende incluir seres humanos e animais não humanos. Animais não humanos incluem todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, tais como primatas não humanos, ovelhas, cães, gatos, vacas, cavalos, galinhas, anfíbios e répteis. Os indivíduos preferidos incluem 5 pacientes humanos com doenças mediadas ou moduladas pela atividade do CXCR4 ou que envolvem a via CXCR4/SDF-1. Quando anticorpos para CXCR4 são administrados juntamente com outro agente, os dois podem ser administrados em qualquer ordem ou simultaneamente.
Dada a ligação específica dos anticorpos desta revelação por CXCR4, os anticorpos desta revelação podem ser utilizados para detectar, especificamente a expressão de CXCR4 na superfície de células e, além disso, podem ser utilizados para purificar o CXCR4 por meio de purificação por imunoafinidade.
As vias adequadas de administração das composições de 15 anticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais humanos, anticorpos humanizados, moléculas multiespecíficas e biespecíficas e imunoconjugados) desta revelação in vivo e in vitro são conhecidas na técnica e podem ser selecionadas pelos especialistas. Por exemplo, as composições de anticorpo podem ser administradas por injeção (por exemplo, intravenosa ou 20 subcutânea). As dosagens adequadas das moléculas utilizadas dependerá da idade e do peso do indivíduo e a concentração e/ou formulação da composição de anticorpos.
Conforme descrito anteriormente, os anticorpos humanos antiCXCR4 desta revelação podem ser co-administrados com um ou mais outros 25 agentes terapêuticos, por exemplo, um agente citotóxico, um agente radiotóxico ou um agente imunossupressor. O anticorpo pode ser ligado ao agente (como um imunocomplexo) ou pode ser administrado separado do agente. Neste último caso (administração separada), o anticorpo pode ser administrado antes, depois ou concomitantemente com o agente ou pode ser co-administrado com outras terapias conhecidas, por exemplo, uma terapia anti-câncer, por exemplo, radiação. Estes agentes terapêuticos incluem, entre outros, agentes anti-neoplásicos tais como doxorubicina (adriamicina), sulfato de bleomicina e cisplatina, carmustina, clorambucil e ciclofosfamida hidroxiurea que, por si sós, são eficazes só em níveis que são tóxicos ou subtóxicos a um paciente. A cisplatina é administrada por via intravenosa como uma dose de 100 mg/kg uma vez cada quatro semanas e a adriamicina é administrada por via intravenosa como uma dose de 60-75 mg/mL uma vez cada 21 dias. Co-administração dos anticorpos humanos anti-CXCR4, ou fragmentos de ligação ao seu antígeno, da presente revelação com agentes quimioterapêuticos proporciona dois agentes anti-câncer que funcionam por meio de mecanismos diferentes que produzem um efeito citotóxico em células tumorais humanas. Esta co-administração pode resolver problemas devidos ao desenvolvimento de resistência a drogas ou uma mudança na antigenicidade das células tumorais que as tomariam não reativas com o anticorpo.
As células efetoras alvo-específicas, por exemplo células efetoras ligadas a composições (por exemplo, anticorpos humanos, moléculas multiespecíficas e biespecíficas) desta revelação também podem ser utilizadas como agentes terapêuticos. As células efetoras para direcionamento podem 20 ser leucócitos humanos, tais como macrófagos, neutrófilos ou monócitos. Outras células incluem eosinófilos, células exterminadoras naturais (<natural killer cells) e outras células portadoras do receptor de IgG ou IgA. Se desejado, as células efetoras podem ser obtidas do indivíduo a ser tratado. As células efetoras alvo-específicas podem ser administradas como uma 25 suspensão de células em uma solução fisiologicamente aceitável. O número
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de células administrado pode ser na ordem de 10-10 mas variará dependendo da finalidade terapêutica. Em geral, a quantidade será suficiente para obter a localização na célula alvo, por exemplo, uma célula de tumor que expressa CXCR4, e para matar as células, por exemplo, por fagocitose. As vias de administração também podem variar. As terapias com células efetoras alvo-específicas podem ser realizadas em conjunto com outras técnicas para a remoção das células atingidas. Por exemplo, a terapia anti-tumor que utiliza as composições (por exemplo anticorpos humanos, moléculas multiespecíficas e biespecíficas) desta revelação e/ou células efetoras armadas com estas composições pode ser utilizadas em conjunto com quimioterapia. Adicionalmente, a imunoterapia de combinação pode ser utilizada para dirigir duas populações efetoras citotóxicas distintas para a rejeição da célula tumoral. Por exemplo, anticorpos anti-CXCR4 ligados ao anti-Fc-gama RI ou anti-CD3 podem ser utilizados em conjunto com agentes de ligação específicos para o receptor IgG ou IgA.
As moléculas biespecíficas e multiespecíficas desta revelação também podem ser utilizadas para modular os níveis de FcyR ou FcyR em células efetoras, como por exemplo, pela cobertura e eliminação dos receptores na superfície da célula. Misturas de receptores anti-Fc também podem ser utilizadas para esta finalidade.
As composições (por exemplo, anticorpos humanos, humanizados ou quiméricos, moléculas multiespecíficas e biespecíficas e imunoconjugados) desta revelação que têm sítios de ligação complementares, tais como porções de IgGl, IgG2, IgG3 ou IgM, que ligam o complemento, também podem ser utilizadas na presença de complemento. Em uma modalidade, o tratamento ex vivo de uma população de células compreendendo células alvo com um agente de ligação desta revelação e células efetoras apropriadas pode ser suplementado por meio da adição de complemento ou complemento contendo soro. A fagocitose das células alvo revestidas com um agente de ligação desta revelação pode ser melhorada pela ligação das proteínas do complemento. Em uma outra modalidade as células alvo revestidas com as composições (por exemplo anticorpos humanos, moléculas multiespecíficas e biespecíficas) desta revelação também podem ser lisadas pelo complemento. Em ainda outra modalidade, as composições da invenção não ativam o complemento.
As composições (por exemplo, anticorpos humanos, 5 humanizados ou quiméricos e moléculas biespecíficas e imunoconjugados) desta revelação podem ser administradas juntamente com o complemento. Em concordância, no âmbito desta revelação estão composições que compreendem anticorpos humanos, moléculas multiespecíficas ou biespecíficas e soro ou complemento. Estas composições são vantajosas uma 10 vez que o complemento é localizado em estreita proximidade aos anticorpos humanos, moléculas multiespecíficas ou biespecíficas. Alternativamente, os anticorpos humanos, moléculas multiespecíficas ou biespecíficas desta revelação e o complemento ou soro podem ser administrados separadamente.
Os anticorpos desta revelação também podem ser utilizados 15 em combinação com um ou mais anticorpos terapêuticos adicionais ou outros agentes de ligação, tais como proteínas de fusão Ig. Exemplos não limitativos de outros anticorpos ou agentes de ligação com os quais um anticorpo antiCXCR4 desta revelação pode ser administrado em associação incluem anticorpos ou agentes de ligação a CTLA-4, PSMA, CD30, IP-10, IFN-γ, 20 CD70, PD-1, PD-LI, TNF, TNF-R, VEGF, VEGF-R, CCR5, IL-1, IL-18, IL18R, CD 19, Campath-I, EGFR, CD33, CD20, Her-2, CD25, gpIIb/IIIa, IgE, CDl la, integrina γ4, IFNy e IFNARl.
Do mesmo modo, no âmbito da presente invenção estão kits compreendendo as composições de anticorpos da invenção (por exemplo, 25 anticorpos humano, moléculas biespecíficas ou multiespecíficas ou imunoconjugados) e instruções para utilização. O kit pode ainda conter um ou mais reagentes adicionais, tais como um reagente imunossupressor, um agente citotóxico ou um agente radiotóxico ou um ou mais anticorpos humanos adicionais desta revelação (por exemplo um anticorpo humano tendo uma atividade complementar que liga a um epítopo no CXCR4 diferente do primeiro anticorpo humano).
Em concordância, os pacientes tratados com as composições de anticorpo desta revelação podem ser adicionalmente administrados (antes, 5 simultaneamente ou a seguir a administração de um anticorpo humano desta revelação) com outro agente terapêutico, tal como um agente citotóxico ou radiotóxico, que intensifica ou aumenta o efeito terapêutico dos anticorpo humanos.
Em outras modalidades, o indivíduo pode ser adicionalmente 10 tratado com um agente que modula, por exemplo intensifica ou inibe, a expressão ou atividade de Fcy ou receptores Fcy, por exemplo, tratando o indivíduo com uma citoquina. As citoquinas preferidas para administração durante o tratamento com a molécula multiespecífica inclui o fator estimulante de colônia de granulócitos (G-CSF), fator estimulante de colônia 15 de granulócitos e macrófagos (GM-CSF), interferon-γ (IFN-γ) e fator de necrose tumoral (TNF).
As composições (por exemplo, anticorpos humanos, moléculas multiespecíficas e biespecíficas) desta revelação também podem ser utilizadas para atingir células que expressam CXCR4, por exemplo, para marcar estas 20 células. Para esta utilização o agente de ligação pode ser ligado a uma molécula que pode ser detectada. Assim sendo, esta revelação proporciona métodos para localizar, ex vivo ou in vitro, células que expressam CXCR4. O marcador detectável pode ser, por exemplo, um radioisótopo, um composto fluorescente, uma enzima ou um co-fator enzimático.
Em uma modalidade em particular, esta revelação proporciona
métodos para detectar a presença de antígeno de CXCR4 em uma amostra, ou medir a quantidade de antígeno de CXCR4, compreendendo pôr a amostra, e uma amostra de controle, em contacto com um anticorpo monoclonal humano ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, que especificamente se liga a CXCR4, em condições que permitam a formação de um complexo entre o anticorpo ou sua porção e o CXCR4. É, então, detectada a formação de um complexo, onde uma formação de complexo diferente entre a amostra comparada com a amostra de controle é indicativo da presença do antígeno de CXCR4 na amostra.
Em ainda outra modalidade, os imunoconjugados desta revelação podem ser utilizados para dirigir compostos (por exemplo, agentes terapêuticos, marcadores, citotoxinas, radiotoxinas, imunossupressores, etc.) para células que têm receptores de superfície de célula de CXCR4 ligando 10 estes compostos ao anticorpo. Deste modo, a invenção também proporciona métodos para localizar, ex vivo ou in vivo, células que expressam CXCR4 (por exemplo, um marcador detectável, tal como um radioisótopo, um composto fluorescente, uma enzima ou um co-fator enzimático). Alternativamente, os imunoconjugados podem ser utilizados para matar células que têm receptores 15 de superfície celular de CXCR4 dirigindo as citotoxinas ou radiotoxinas para o CXCR4.
O CXCR4 é conhecido por ser expresso em uma variedade de tipos de células de tumor e também é conhecido por estar envolvido nas metástases de tumores. Além disso, como um co-receptor para a entrada do 20 HIV em células T, o CXCR4 é conhecido por estar envolvido na infecção por HIV. Adicionalmente, a via CXCR4/SDF-1 demonstrou estar envolvida em estados inflamatórios. Além disso, a via CXCR4/SDF-1 demonstrou estar envolvida em angiogênese ou neovascularização. Em concordância, os anticorpos anti-CXCR4 (e imunoconjugados e moléculas biespecíficas) desta 25 revelação podem ser utilizados para modular a atividade do CXCR4 em cada uma destas situações clínicas, como a seguir:
A. Câncer
O CXCR4 demonstrou ser expresso por uma variedade de tipos de câncer e em certas situações uma correlação inversa foi estabelecida entre a expressão de CXCR4 e o prognóstico ou sobrevida do paciente. Exemplos não limitativos de tipos de câncer associados com a expressão do CXCR4 incluem: mama (Muller, A. et al. (2001) Nature 410:50-56); de ovário (Scotton, C. et al. (2001) Br. J. Cancer 85:891-897; da próstata (Taichman, R.S. et al. (2002) Cancer Res. 62:1832-1837; pulmonar de células não pequenas (Spano J.P. et al. (2004) Ann. Oncol. 15:613-617); pancreático (Koshiba, T. et al. (2000) Clin. Cancer Res. 6:3530-3535); datiróide (Hwang, J.H. et al. (2003) J. Clin. Endocrinol. Metab. 88:408-416); carcinoma nasofaringeano (Wang, N. et al. (2005) J. Transi. Med. 3:26-33); melanoma (Scala, S. et al. (2005) Clin. Cancer Res. H: 1835-1841); carcinoma da célula renal (Staller, P. et al. (2003) Nature 425:307-311); linfoma (Bertolini, F. et al. (2002) Cancer Res. 62:3530-3535); neuroblastoma (Geminder, H. et al. (2001) J. Immunol. 167:4747-4757); glioblastoma (Rempel, S.A. et al. (2000) Clin. Caneer Res. 6:102-111); rabdomiossarcoma (Libura, J. et al. (2002) Blood 100:2597-2606); colo-retal (Zeelenberg, I.S. et al. (2003) Cancer Res. 63:3833-3839); do rim (Schrader, A.J. et al. (2002) Br. J. Cancer 86:1250- 1256); osteossarcoma (Laverdiere, C. et al. (2005) Clin. Cancer Res. 11:2561-2567); leucemia linfoblástica aguda (Crazzolara, R. et al. (2001) Br. J. Haematol. 115:545-553); e leucemia mielóide aguda (Rombouts, E.J.C. et al. (2004) Blood 104:550-557).
Tendo em vista o acima mencionado, os anticorpos antiCXCR4 desta revelação podem ser utilizados no tratamento de cânceres, incluindo mas não limitado a um câncer selecionado do grupo que consiste de câncer da mama, do ovário, da próstata, pulmonar de células não pequenas, 25 pancreático, da tiróide, carcinoma nasofaringeano, melanoma, carcinoma da célula renal, linfoma, neuroblastoma, glioblastoma, rabdomiossarcoma, coloretal, do rim, osteossarcoma, leucemia linfoblástica aguda ou leucemia mielóide aguda. O anticorpo pode ser utilizado só ou em associação com outros tratamentos de câncer, tais como cirurgia e/ou radiação e/ou com outros agentes anti-neoplásicos, tais como os agentes anti-neoplásicos discutidos e apresentados acima, incluindo drogas quimioterapêuticas e outros anticorpos de antígeno anti-tumoral, tais como aqueles que ligam CD20, Her2, PSMA, Campath-I, EGFR e outros.
5 B. Infecções Virais, incluindo Infecção por HIV
O CXCR4 demonstrou ser um co-receptor para a entrada do HIV em células T, e adicionalmente, certos anticorpos murinos anti-CXCR4 demonstraram serem capazes de inibir a entrada de isolados de HIV em células T (ver Hou, T. et al. (1998j J. Immunol. 160:180-188; Camec, X. et al. (2005) J. Virol. 79:1930-1938). Deste modo, o CXCR4 pode ser utilizado por vírus como um receptor para entrada nas células e os anticorpos contra CXCR4 podem ser utilizados para inibir a entrada destes vírus que utilizam o CXCR4 como receptor. Em concordância, os anticorpos anti-CXCR4 humanos desta revelação podem ser utilizados para inibir a entrada de um vírus numa célula, onde o vírus usa o CXCR4 como receptor para entrada na célula, de tal modo que é inibida a infecção viral. Em uma modalidade preferida, os anticorpos são utilizados para inibir a entrada do HIV em células T, por exemplo, no tratamento ou prevenção de HIV/AIDS. O anticorpo pode ser utilizado só ou em associação com outros agentes anti-virais, tais como drogas anti-retrovirais como o AZT ou inibidores de protease.
C. Estados Inflamatórios
A via CXCR4/SDF-1 demonstrou desempenhar um papel numa variedade de estados inflamatórios, incluindo mas não limitado à doença inflamatória do fígado (Terada, R. et al. (2003) Lab. Invest. 83:665- 25 672); inflamação autoimune da articulação (Matthys, P. et al. (2001) J. Immunol. 167:4686-4692); doença alérgica de vias aéreas (Gonzalo, J. A. et al. (2000) J. Immunol. 165:499-508); e doença periodontal (Hosokawa, Y. et al. (2005) Clin. Exp. Immunol. 141:467-474).
Em concordância, os anticorpos anti-CXCR4 humanos desta revelação que inibem a ligação do SDF-I ao CXCR4 podem ser utilizados para inibir a inflamação em doenças inflamatórias, incluindo doenças selecionadas do grupo que consiste de doença inflamatória de fígado, inflamação autoimune da articulação, doença alérgica de vias aéreas, doença 5 periodontal, artrite reumatóide, doença inflamatória do intestino, lúpus eritematoso sistêmico, diabetes Tipo I, doenças inflamatórias da pele (por exemplo, psoríase, líquen plano), doença autoimune da tiróiode, síndrome de Sjogren, inflamação pulmonar (por exemplo, doença pulmonar obstrutiva crônica, sarcoidose pulmonar, alveolite linfocítica) e doença inflamatória do 10 rim (por exemplo, nefropatia por IgA, glomerulonefrite). O anticorpo pode ser utilizado só ou em associação com outros agentes antiinflamatórios, tais como drogas antiinflamatórias não esteróides (NSAIDs), corticosteróides (por exemplo, prednisona, hidrocortisona), metotrexato, inibidores da COX-2, antagonistas do TNF (por exemplo, etanercept, infliximab, adalimumab) e 15 imunossupressores (tais como 6-mercaptopurina, azatioprina e ciclosporina A).
D. Angiogênese
Foi demonstrado que o SDF-I induz a neovascularização através do recrutamento de hemangiócitos que expressam CXCR4 (Jin, D. K. 20 et al. (2006) Nat. Med. 12:557-567). Além disso, o bloqueio da via SDF1/CXCR4 pode atenuar o crescimento tumoral in vivo inibindo a angiogênese de uma maneira independente do VEGF (Guleng, B. et al. (2005) Caneer Res. 65:5864-58-71). Além disso, conforme demonstrado no Exemplo 2, os anticorpos desta revelação são capazes de inibir a formação de vaso capilar in 25 vitro. Em concordância, os anticorpos anti-CXCR4 desta revelação que inibem a ligação do SDF-I ao CXCR4 podem ser utilizados para inibir a angiogênese interferindo com a via SDF-1/CXCR4. A inibição da angiogênese pode ser utilizada, por exemplo, para inibir o crescimento de tumor ou metástase de tumor (independentemente se o tumor é CXCR4+). O anticorpo pode ser utilizado só ou em associação com outros agentes antiangiogênicos, tais como anticorpos anti-VEGF.
E. Transplante de Células Tronco Autólogas
Células tronco do sangue periférico são a fonte preferida de 5 células tronco para uso no transplante de células tronco autólogas, por exemplo, no tratamento de certas malignidades hematológicas. A colheita de células tronco do sangue periférico exige a mobilização de células tronco CD34+ da medula óssea para o sangue periférico. Várias citoquinas, quimoquinas e moléculas de aderência foram implicadas na regulação deste 10 processo (revisto em Gazitt, Y. (2001) J. Hematother. Stem Cell Res. 10:229- 236), incluindo a interação de CXCR4 e SDF-1. Além disso, um antagonista CXCR4 de molécula pequena demonstrou que estimula a rápida mobilização de células tronco CD34+ da medula óssea para o sangue periférico (ver, por exemplo, Devine, S.M. et al. (2004) J. Clin. Oncol. 22:1095-1102; 15 Broxmeyer, H.E. et al. (2005) J. Exp. Med. 201:1307-1318; Flomenberg, N. et al. (2005) Blood 106:1867-1874). Em concordância, os anticorpos antiCXCR4 desta revelação que inibem a atividade do CXCR4 (isto é, anticorpos antagonistas) podem ser utilizados para estimular a mobilização de células tronco CD34+ da medula óssea para o sangue periférico para permitir a 20 utilização destas células tronco (por exemplo, transplante autólogo), por exemplo, no tratamento de doenças hematológicas, tais como mieloma múltiplo e linfoma não Hodgkin. O anticorpo pode ser utilizado só ou em associação com outros agentes utilizados para estimular a mobilização de células tronco, tais como G-CSF e/ou GM-CSF. Deste modo, em uma outra 25 modalidade, a invenção proporciona um método para estimular a mobilização de células tronco CD34+ da medula óssea para o sangue periférico num indivíduo, o método compreendendo administrar ao indivíduo um anticorpo anti-CXCR4 da invenção de tal modo que a mobilização das células tronco CD34+ da medula óssea para o sangue periférico seja estimulada. O método pode compreender ainda colher células tronco CD34+ do sangue periférico, por exemplo, para utilização em transplante de células tronco autólogas.
A presente invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos que não devem ser interpretados como mais limitadores. Os teores de todas as figuras e todas as referências, patentes e pedidos de publicações de patentes citados por toda esta memória descritiva são expressamente aqui incorporados por citação.
EXEMPLOS
Exemplo 1: Geração de Anticorpos Monoclonais Humanos Contra CXCR4
Anticorpos monoclonais humanos anti-CXCR4 foram gerados utilizando uma abordagem de combinação na qual, primeiro, camundongos que expressam genes de anticorpos humanos foram imunizados para produzir, nos camundongos, um repertório de imunoglobulinas humanas específicas 15 para o CXCR4 humano e, depois, em segundo lugar, foi preparada uma biblioteca de anticorpos humanos a partir de células do baço dos camundongos e apresentadas sobre fago, de tal modo que os fagos foram então rastreados quanto à expressão de anticorpos com especificidade para CXCR4. Esta abordagem de combinação é descrita, de modo genérico, no 20 Pedido US N0 20030091995 por Buechler et al.
Antígeno
Células R1610 (uma linhagem celular de pulmão de Hamster Chinês, originalmente descrita em Thirion, J. P. et al. (1976) Geneties 83:137- 147) foram transfectadas com um vetor de expressão que codifica a proteína 25 CXCR4 humana de comprimento total de tal modo que a proteína foi expressa na superfície das células. Uma forma otimizada com códon do cADN de CXCR4 foi utilizada no vetor de expressão, que foi preparado conforme descrito em Mirzabekov, T. et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:28745-28750. Para aumentar a imunogeniciade das células, as células foram revestidas com trinitrofenol (TNP), por incubação com uma solução aquosa de ácido trinitrobenzenossulfônico (TNBS), disponível comercialmente como uma
O
solução a 5% (Sigma, Cat. N0 P2297). Mais especificamente, 1 x 10 células foram lavadas uma vez em PBS estéril, incubadas com 50 μι da solução 5 comercial de TNBS a 5% durante uma hora, no escuro, à temperatura ambiente e, depois, lavadas três vezes com PBS. As células R1610 resultantes revestidas com TNP, que expressam CXCR4 foram utilizadas como antígeno para imunização. O imunógeno final era uma mistura de 100 μι de células lavadas, revestidas com TNP (1 x IO7 células) mais 100 μΙ. de adjuvante Ribi. 10 Os camundongos receberam seis doses do imunógeno ao longo do tempo. Estripe de Camundongo KM® Transgênico Transcromossômico
Foram preparados anticorpos monoclonais totalmente humanos para CXCR4 inicialmente imunizando a estirpe KM de camundongos transgênicos transcromossômicos que expressa genes de
anticorpos humanos. Na estirpe deste camundongo, o gene endógeno de cadeia leve kappa do camundongo foi dividido homozigoticamente, conforme descrito em Chen et al. (1993) EMBO J. 12:811-820 e o gene endógeno de cadeia pesada do camundongo foi dividido homozigoticamente conforme descrito no Exemplo 1 da Publicação PCT WO 01/09187. Além disso, esta 20 estirpe de camundongo tem um transgene de cadeia leve kappa humano, KCo5, conforme descrito em Fishwild et al. (1996) Nature Bioteehnology 14:845-851) e também contém o transcromossoma SC20, que tem o lócus da cadeia pesada Ig humana, conforme descrito na Publicação PCT WO 02/43478. Os camundongos KM são também descritos em detalhe no Pedido 25 US N0 20020199213.
Imunização de KM
Para produzir anticorpos monoclonais totalmente humanos para CXCR4, camundongos da estirpe KM® foram imunizados com células Rl 610 transfectadas para expressar CXCR4 e revestidas com TNP (conforme descrito acima para o antígeno). Os esquemas genéricos de imunização para a produção de anticorpos humanos em estirpes de camundongos que portam genes de anticorpos humanos são descritos em Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 5 14: 845-851 e na Publicação PCT WO 98/24884. Os camundongos tinham 6-
16 semanas de idade depois da primeira perfusão de antígeno.
Os camundongos KM foram imunizados com antígeno em adjuvante Ribi por via intraperitoneal (IP), subcutânea (Sc) ou pela almofada plantar (FP), seguido por 3-21 dias de reimunização IP, Sc ou FP (num total 10 de 6 imunizações) com o antígeno em adjuvante Ribi. A resposta imune foi monitorizada por sangramentos retro-orbitais. O plasma foi rastreado por FACS manchamento das células Rl 610 que expressam CXCR4 (versus células R1610 precursoras não transfectadas). Os camundongos com titulações suficientes de imunoglobulina humana anti-CXCR4 foram 15 utilizados para colheitas dos baços.
Preparação de Biblioteca de Apresentação de Fago e Rastreio de Anticorpos Anti-CXCR4
Baços colhidos dos camundongos imunizados descritos acima foram utilizados para fazer uma biblioteca de apresentação de fago que 20 expressam cadeias pesadas e leves de anticorpos humanos. Mais especificamente, o ARN total foi isolado dos baços, o cADN foi preparado do ARN e o cADN da região variável do anticorpo humano foi especificamente ampliado por PCR, essencialmente conforme descrito no Pedido de Patente US 20030091995 por Buechler et al. A biblioteca de regiões variáveis de 25 anticorpo humano foi clonada em vetores de expressão de fago, uma vez mais, essencialmente conforme descrito no Pedido de Patente US 20030091995 por Buechler et al. A biblioteca de apresentação de fago foi rastreada quanto a membros da biblioteca que têm afinidade por CXCR4 por seleção com CXCR4 humano incorporado em proteolipossomas magnéticos (CXCR4-MPL). MPLs que expressam CXCR4, ou outros sete receptores transmembrana (7TM) (por exemplo CCR5), de tal modo que a conformação nativa do receptor 7TM é mantida, foram anteriormente descritos (ver, por exemplo, Mirzabekov, T. et al. (2000) Nat. Biotechnol. J_8:649-654; Babcock, 5 GJ. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:38433-38440; Publicação PCT WO 01/49265; Pedido de Patente US 20010034432). Em resumo, o CXCR4 humano recombinante que continha um epítopo marcado foi solubilizado a partir de uma linhagem celular que expressa CXCR4 transfectada utilizando o detergente CHAPSO e a proteína foi capturada em pérolas magnéticas por 10 meio do epítopo marcado. Uma membrana lipídica foi reconstituída durante a remoção do detergente, de tal modo que a conformação da membrana nativa do CXCR4 foi mantida, para criar os CXCR4-MPLs. Três ciclos de seleção da biblioteca de apresentação de fago nos CXCR4-MPLs levou a um enriquecimento de 30 vezes dos ligantes de CXCR4 em comparação com o 15 background. Os fragmentos da região variável de interesse foram clonados num vetor de expressão Fab e o Fab foi novamente testado quanto à ligação de antígeno contra células que expressam CXCR4 transfectado. Anticorpos inteiros foram, então, gerados a partir dos Fabs utilizando técnicas de biologia molecular convencionais.
Os clones F7, F9, Dl e E2 do Fab foram selecionados para
análises adicionais.
Exemplo 2: Caracterização Estrutural dos Anticorpos Monoclonais Humanos Γ7, F9, Dl e E2 Anti-CXCR4
As seqüências de cADN que codificam as regiões variáveis de cadeia pesada e leve dos clones F7, F9, Dle E2 do Fab, obtidas do rastreio da biblioteca de apresentação de fago conforme descrito no Exemplo 1, foram sequenciadas utilizando técnicas de sequenciamento de ADN convencionais.
As seqüências de nucleotídeos e aminoácidos da região variável de cadeia pesada de F7 estão ilustradas na Figura IA e nas SEQ ID NO: 33 e 25, respectivamente.
As seqüências de nucleotídeos e aminoácidos da região variável de cadeia leve de F7 estão ilustradas na Figura IBe nas SEQ ID NO:
37 e 29, respectivamente.
A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeia
pesada de F7 com as seqüências conhecidas de cadeia pesada de imunoglobulina da linha germinal humana demonstrou que a cadeia pesada de F7 utiliza um segmento Vh da linha germinal humana Vh 3-48, um segmento D da linha germinal humana 4-23, e um segmento JH da linha germinal 10 humana JH 6B. Análises adicionais da seqüência Vh de F7 utilizando o sistema de Kabat de determinação de região CDR levaram à delineação das regiões CDR1, CDR2 e CD3 de cadeia pesada conforme ilustrado na Figura IAe nas SEQ ID NOs: 1, 5 e 9, respectivamente.
A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeia leve 15 de F7 com as seqüências conhecidas de cadeia leve de imunoglobulina da linha germinal humana demonstrou que a cadeia leve de F7 utiliza um segmento Vl da linha germinal humana Ll5 de Vk e um segmento JK da linha germinal humana JK 1. Análises adicionais da seqüência Vl de F7 utilizando o sistema de Kabat de determinação de região CDR levaram à 20 delineação das regiões CDRl, CDR2 e CD3 de cadeia leve conforme ilustrado na Figura IB e nas SEQ ID NOs: 13, 17 e 21, respectivamente.
As seqüências de nucleotídeos e aminoácidos da região variável de cadeia pesada de F9 estão ilustradas na Figura 2A e nas SEQ ID NO: 34 e 26, respectivamente.
As seqüências de nucleotídeos e aminoácidos da região
variável de cadeia leve de F9 estão ilustradas na Figura 2B e nas SEQ ID NO:
38 e 30, respectivamente.
A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeia pesada de F9 com as seqüências conhecidas de cadeia pesada de imunoglobulina da linha germinal humana demonstrou que a cadeia pesada de F9 utiliza um segmento Vh da linha germinal humana Vh 3-48, um segmento D da linha germinal humana 4-23, e um segmento JH da linha germinal humana JH 6B. Análises adicionais da seqüência Vh de F9 utilizando o 5 sistema de Kabat de determinação de região CDR levaram à delineação das regiões CDRl, CDR2 e CD3 de cadeia pesada conforme ilustrado na Figura 2A e nas SEQ ID NOs: 2, 6 e 10, respectivamente.
A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeia leve de F9 com as seqüências conhecidas de cadeia leve de imunoglobulina da 10 linha germinal humana demonstrou que a cadeia leve de F9 utiliza um segmento Vl da linha germinal humana Vk Ll5 e um segmento JK da linha germinal humana JK 1. Análises adicionais da seqüência Vl de F9 utilizando o sistema de Kabat de determinação de região CDR levaram à delineação das regiões CDRl, CDR2 e CD3 de cadeia leve conforme ilustrado na Figura 2B 15 e nas SEQ ID NOs: 14, 18 e 22, respectivamente.
As seqüências de nucleotídeos e aminoácidos da região variável de cadeia pesada de Dl estão ilustradas na Figura 3 A e nas SEQ ID NO: 35 e 27, respectivamente.
As seqüências de nucleotídeos e aminoácidos da região variável de cadeia leve de Dl estão ilustradas na Figura 3B e nas SEQ ID NO:
39 e 31, respectivamente.
A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeia pesada de Dl com as seqüências conhecidas de cadeia pesada de imunoglobulina da linha germinal humana demonstrou que a cadeia pesada de 25 Dl utiliza um segmento Vh da linha germinal humana Vh 3-48, um segmento D da linha germinal humana 4-23, e um segmento JH da linha germinal humana JH 6B. Análises adicionais da seqüência Vh de Dl utilizando o sistema de Kabat de determinação de região CDR levaram à delineação das regiões CDRl, CDR2 e CD3 de cadeia pesada conforme ilustrado na Figura 3A e nas SEQ ID NOs: 3, 7 e 11, respectivamente.
A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeia leve de Dl com as seqüências conhecidas de cadeia leve de imunoglobulina da linha germinal humana demonstrou que a cadeia pesada de Dl utiliza um 5 segmento Vl da linha germinal humana Vk Ll5 e um segmento JK da linha germinal humana JK 1. Análises adicionais da seqüência Vl de Dl utilizando o sistema de Kabat de determinação de região CDR levaram à delineação das regiões CDRl, CDR2 e CD3 de cadeia leve conforme ilustrado na Figura 3B e nas SEQ ID NOs: 15, 19 e 23, respectivamente.
As seqüências de nucleotídeos e aminoácidos da região
variável de cadeia pesada de E2 estão ilustradas na Figura 4A e nas SEQ ID NO: 36 e 28, respectivamente.
As seqüências de nucleotídeos e aminoácidos da região variável de cadeia leve de E2 estão ilustradas na Figura 4B e nas SEQ ID NO: 40 e 32, respectivamente.
A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeia pesada de E2 com as seqüências conhecidas de cadeia pesada de imunoglobulina da linha germinal humana demonstrou que a cadeia pesada de E2 utiliza um segmento Vh da linha germinal humana Vh 3-48, um segmento 20 D da linha germinal humana 4-23, e um segmento JH da linha germinal humana JH 6B. Análises adicionais da seqüência Vh de E2 utilizando o sistema de Kabat de determinação de região CDR levaram à delineação das regiões CDRl, CDR2 e CD3 de cadeia pesada conforme ilustrado na Figura 4A e nas SEQ ID NOs: 4, 8 e 12, respectivamente.
A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeia leve
de E2 com as seqüências conhecidas de cadeia leve de imunoglobulina da linha germinal humana demonstrou que a cadeia leve de E2 utiliza um segmento Vl da linha germinal humana Vk Ll5 e um segmento JK da linha germinal humana JK 1. Análises adicionais da seqüência Vl de E2 utilizando o sistema de Kabat de determinação de região CDR levaram à delineação das regiões CDRl, CDR2 e CD3 de cadeia leve conforme ilustrado na Figura 4B e nas SEQ ID NOs: 16, 20 e 24, respectivamente.
Análise das seqüências estruturais das regiões Yh e Vl de F7, F9, Dl e E2, quando comparada com as seqüências de linha germinal das quais derivam, identificou vários resíduos de aminoácidos estruturais que diferiam da linha germinal. Certos resíduos estruturais nas regiões Nterminais dos segmentos Vh e Vl foram escolhidos para “mutação revertida” para restaurar o resíduo estrutural na seqüência de linha germinal, porque estes resíduos da linha não-germinal na porção N-terminal foram codificadas pelos iniciadores usados para criar as bibliotecas de apresentação de fago descritas no Exemplo I. Em particular, as seguintes formas modificadas dos segmentos Vh e Vl de F7, F9, Dl e E2 (aqui referidas como formas “GL”, para linha germinal, do inglês Germline) foram criadas utilizando técnicas de biologia molecular convencionais para substituir o resíduo de aminoácido de linha germinal na posição estrutural indicada:
Vh de F7GL: QlE, Q6E Vk de F7GL: AID, R3Q Vh de F9GL: QlE, Q6E Vk de F9GL: ElD, V3Q, L4M
Vh de D1GL: Q6E Vk de D1GL: VlD, W3Q, V4M Vh de E2GL: Q6E Vk de E2GL: ElD, V3Q, L4M A Figura 5A ilustra o alinhamento das seqüências de
aminoácidos variáveis de cadeia pesada de F7 (SEQ ID NO: 25) e F7GL (SEQ ID NO: 41) com a seqüência de aminoácidos codificada de Vh 3-48 de linha germinal (SEQ ID NO: 49) As regiões CDRl, CDR2 e CDR3 estão indicadas. A Figura 5B ilustra o alinhamento das seqüências de aminoácidos variáveis de cadeia leve de F7 (SEQ ID NO: 29) e F7GL (SEQ ID NO: 45) com a seqüência de aminoácidos codificada de Vk Ll5 de linha germinal (SEQ ID NO: 50). As regiões CDRl, CDR2 e CDR3 estão indicadas.
A Figura 6A ilustra o alinhamento das seqüências de aminoácido variáveis de cadeia pesada de F9 (SEQ ID NO: 26) e F9GL (SEQ ID NO: 42) com a seqüência de aminoácidos codificada de Vr 3-48 de linha germinal (SEQ ID NO: 49). As regiões CDRl, CDR2 eCDR3 estão indicadas.
A Figura 6B ilustra o alinhamento das seqüências de
aminoácido variáveis de cadeia leve de F9 (SEQ ID NO: 30) e F9GL (SEQ ID NO: 46) com a seqüência de aminoácidos codificada de Vk Ll5 de linha germinal (SEQ ID NO: 50). As regiões CDRl, CDR2 e CDR3 estão indicadas.
A Figura 7A ilustra o alinhamento das seqüências de
aminoácido variáveis de cadeia pesada de Dl (SEQ ID NO: 27) e DlGL (SEQ ID NO: 43) com a seqüência de aminoácidos codificada de Vh 3-48 de linha germinal (SEQ ID NO: 49). As regiões CDRl, CDR2 e CDR3 estão indicadas.
A Figura 7B ilustra o alinhamento das seqüências de
aminoácido variáveis de cadeia leve de Dl (SEQ ID NO: 31) e DlGL (SEQ ID NO: 47) com a seqüência de aminoácidos codificada de Vk Ll5 de linha germinal (SEQ ID NO: 50). As regiões CDRl, CDR2 e CDR3 estão indicadas.
A Figura 8A ilustra o alinhamento das seqüências de
aminoácido variáveis de cadeia pesada de E2 (SEQ ID NO: 28) e E2GL (SEQ ID NO: 44) com a seqüência de aminoácidos codificada de Vh 3-48 de linha germinal (SEQ ID NO: 49). As regiões CDRl, CDR2 e CDR3 estão indicadas. A Figura 8B ilustra o alinhamento das seqüências de aminoácido variáveis de cadeia leve de E2 (SEQ ID NO: 32) e E2GL (SEQ ID NO: 48) com a seqüência de aminoácidos codificada de Vk Ll5 de linha germinal (SEQ ID NO: 50). As regiões CDRl, CDR2 e CDR3 estão 5 indicadas.
Os fragmentos Fab de F7, F9, Dl e E2 são convertidos em anticorpos de comprimento total utilizando técnicas de ADN recombinante convencionais. Por exemplo, o ADN que codifica as regiões Vh e Vk de um dos fragmentos Fab pode ser clonado num vetor de expressão que tem as 10 regiões constantes de cadeia pesada e leve, de tal modo que as regiões variáveis sejam operativamente ligadas às regiões constantes. Alternativamente, pode-se utilizar vetores separados para expressão da cadeia pesada de comprimento total e da cadeia leve de comprimento total. Exemplos não limitativos de vetores de expressão adequados para utilização 15 na criação de anticorpos de comprimento total incluem os vetores pIE descritos no Pedido de Patente US N0 20050153394 por Black.
Exemplo 3; Características de Ligação dos Anticorpos Monoclonais Humanos Anti-CXCR4
Neste exemplo, as características de ligação dos anticorpos anti-CXCR4 foram examinadas por citometria de fluxo.
A linhagem celular T humana CEM, que expressa o CXCR4 humano, nativo na superfície da sua célula, foi utilizada para examinar a capacidade dos anticorpos F7, F9, Dl e E2 de se ligaram à superfície celular do CXCR4 nativo. F7, F9, Dl e E2 de comprimento total foram titulados 25 numa série de diluições seriais 1:3, resultando numa faixa de concentração de 300 nM a 5 pM. Os anticorpos foram então misturados com células CEM e deixou-se que se ligassem antes de serem detectados com um anticorpos secundários de IgG anti-humana conjugado com FITC. As células foram, então, analisadas por citometria fluorescente. As intensidades médias de fluorescência resultantes estão apresentadas no gráfico da Figura 9, que demonstra que todos os quatro anticorpos anti-CXCR4 ligam-se a células CEM. Os valores EC50 para ligação de F7, F9, Dl e E2 foram de 21 nM, 14 nM, 80 nM e 290 nM, respectivamente.
5 Para determinar a capacidade de um painel de anticorpos anti
CXCR4 de competir pela ligação ao CXCR4, foram realizados estudos de competição. Foram utilizados os quatro anticorpos anti-CXCR4 humanos F9, F7, E2 e Dl, juntamente com quatro anticorpos anti-CXCR4 murinos comercialmente disponíveis (12G5, 708, 716 e 717; R&D Systems, Nos. de 10 catálogo: MAB170, MAB171, MAB172 e MAB173, respectivamente). Os anticorpos anti-CXCR4 foram titulados numa série de diluições seriais 1:3 resultando numa faixa de concentração de 300 nM e 5 pM na presença de uma concentração constante de anticorpo F9 anti-CXCR4 marcado com FITC. A mistura de anticorpos foi, então, adicionada a células CEM e deixou-se que se 15 ligassem. A capacidade de cada anticorpo de competir com F9 para ligação a células CEM foi avaliada por citometria fluorescente e a detecção de FITC. As intensidades médias de fluorescência resultantes estão apresentadas no gráfico da Figura 10, que demonstra que todos os sete anticorpos examinados (F7, E2, Dl, 12G5, 708, 716 e 717) foram capazes de competir com o F9 para 20 ligação a células CEM, embora o anticorpo E2 apenas demonstrou inibição parcial em altas concentrações em comparação com os outros anticorpos.
Em um outro conjunto de experimentos, a capacidade do mAB F7 de se ligar a uma variedade de linhas celulares diferentes foi examinada por citometria de fluxo realizando uma titulação de FACs. Quantidades 25 crescentes mAb (desde menos de 0,001 μg/mL até mais de 100 μg/mL) foram incubadas com 100,00 células e a ligação foi avaliada por citometria. Foi também determinado o valor Bmax, que indica aproximadamente quantas moléculas de CXCR4 estão presentes em cada célula. Com base nas curvas de ligação, foi determinado um valor EC50 para ligação ao anticorpo, cujos resultados estão resumidos adiante na Tabela 1:
Tabela 1: Resultados de Titulação FACS para Ligação do mAb F7 a Linhas Celulares Diferentes
Tipo de célula EC50 fag/mL) Bmax Ramos 0,48 106,000 Raji 0,34 52,536 Namalwa 1,57 116,000 L540 3,69 31,868 DMS79 3,99 24,587 MDA-MB-231 9,24 14,186 Bmax = ligação máxima (unidades GMFI)
Os resultados mostram que o mAb F7 é capaz de se ligar
eficazmente a cada uma das seis linhas celulares testadas, com os valores EC50S mais baixos observados com a linhas celulares Ramos e Raji. Estes dados também mostram que a expressão do receptor CXCR4 é mais alta para células Ramos e Namalwa e mais baixa para células MDA-MB-231 e células DMS79.
Em um outro experimento de ligação, foi examinada a capacidade do mAb F7 de se ligar a diferentes subconjuntos de células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs). As PBMCs humanas foram isoladas por métodos convencionais e diferentes subconjuntos celulares 15 foram isolados por FACS. Em particular, foram isolados os seguintes subconjuntos celulares: (i) CD3+, (ii) CD20+; (iii) CDllb+ e (iv) CD14+. Experimentos de citometria de fluxo conduzidos com o mAb F7 (a 33 μg/mL) demonstraram que o mAb F7 foi capaz de se ligar eficazmente a cada um dos quatro subconjuntos, em comparação com um anticorpo de controle 20 correspondente ao isotipo.
Exemplo 4: Inibição da Ligação do SDF-I ao CXCR4 por Anticorpos Anti-CXCR4
Para determinar a capacidade dos anticorpos anti-CXCR4 humanos de inibir a ligação do SDF-I ao CXCR4, foi realizado um estudo de
I
competição utilizando SDF-I marcado com I e células CEM, que naturalmente expressam o CXCR4. Uma comparação dos anticorpos antiCXCR4 em bloquear a ligação do SDF-I a células CEM foi realizada por um ensaio convencional de ligação ao ligando rádio-marcado. Os anticorpos antiCXCR4 foram diluídos serialmente 1:3 para dar uma faixa de concentrações 5 de 300 nM a 137 pM. Os anticorpos foram adicionados a 750.000 células CEM em 100 μι na presença de 125I-SDF-I 100 pM com uma atividade específica de 2000 Ci/mmole (Amersham, N0 de catálogo IM314-25UCI). Um anticorpo irrelevante do mesmo isotipo foi utilizado como controle negativo. O total de ligando radio-marcado ligado possível foi determinado permitindo
125
que o lijI-SDF-I se ligasse a células CEM na ausência de anticorpos durante 2 horas a 4°C. A ligação não específica do ligando rádio-marcado foi
* 1 -nc
determinada permitindo que o I-SDF-I se ligasse na presença de 1 μΜ de SDF-I não marcado (Peprotech, N0 de catálogo 300-28A). A quantidade de
125
I-SDF-I associado a célula foi determinada por meio de métodos 15 convencionais. Os resultados estão apresentados na Figura 11, que demonstram que o anticorpo F7 proporciona o bloqueio mais eficaz de ligação do SDF-I ao CXCR4 expresso em células CEM. Os anticorpos F9 e Dl também bloquearam a ligação do SDF-1, embora mais moderadamente do que o F7. O anticorpo E2, embora se ligue ao CXCR4 em células CEM 20 (conforme demonstrado no Exemplo 3), não bloqueou eficazmente a ligação do SDF-I ao CXCR4 em células CEM. Os valores EC50S para o bloqueio de SDF-I por F7, F9 e Dl foram de 2,3 nM, 12,5 nM e 28,6 nM, respectivamente.
Exemplo 5: Inibição do Fluxo de Cálcio Induzido por SDF-I por Anticorpos Anti-CXCR4
Para determinar a capacidade dos anticorpos anti-CXCR4 humanos de inibir o fluxo de cálcio em células CEM induzido por SDF-1, células CEM foram primeiro marcadas com o corante fluorescente Calcium 3 (Molecular Devices). Os anticorpos anti-CXCR4 foram titulados numa diluição serial 1:3 resultando numa faixa de concentração de 100 nM a 1 pM e deixou-se que se ligassem a 200.000 células CEM a 200 μι e foram incubados por 10 minutos à temperatura ambiente antes de serem carregados numa máquina Flexstation (Molecular Devices). Como controle negativo, foi utilizado um anticorpo irrelevante do mesmo isotipo. As células foram, então, estimuladas com uma concentração final de 50 nM de SDF-Ia humano recombinante (Peprotech), adicionado com 500 nM num volume de 22 μι para um volume final de 222 μι. O fluxo de cálcio resultante foi medido por 200 segundos por poço. Como controle positivo, células na ausência de anticorpo foram estimuladas com SDF-Ia (feitas em solução salina tamponada de Hank (HBS) com 0,1 % BSA ou HBS) para atingir um sinal máximo possível de fluxo de cálcio. Para determinar uma linha de base, células foram estimuladas com HBS com 0,1 % BSA. A libertação de cálcio estimulada por SDF-Ia foi medida pelo desenvolvimento de fluorescência cálcio-dependente ao longo do tempo. A área sob a curva do traço de fluorescência resultante foi relatada como uma indicação de fluxo de cálcio. A inibição resultante de fluxo de cálcio pelos anticorpos anti-CXCR4 está representada na Figura 12. Os dados foram esquematizados e os valores EC50S foram calculados utilizando o software GraphPad Prism e o ajuste de curva não linear, fórmula dose-resposta sigmoidal. Os anticorpos F7, F9 e Dl inibiram o fluxo de cálcio induzido por SDF-I a. O anticorpo E2, embora não se ligasse ao CXCR4 (conforme demonstrado no Exemplo 3), não inibiu o fluxo de cálcio induzido por SDF-Ia de forma significativa. Os valores EC50S para a inibição do fluxo de cálcio induzido por SDF-I por F7, F9 e Dl foram de 0,90 nM, 0,32 nM e 0,57 nM, respectivamente.
Exemplo 6: Inibição da Migração Induzida por SDF-I de Células CEM por Anticorpos Anti-CXCR4
Para determinar a capacidade dos anticorpos anti-CXCR4 humanos de inibir a migração de células CEM induzida por SDF-1, células CEM foram primeiro marcadas com o reagente BATDA (Perkin Elmer). Os anticorpos anti-CXCR4 foram titulados numa diluição serial 1:3 resultando numa faixa de concentração de 100 nM a 1 pM e deixou-se que se ligassem a células CEM marcadas a uma densidade de 10 milhões de células por mL.
5 Como controle negativo, foi utilizado um anticorpo irrelevante do mesmo isotipo. SDF-Ia humano recombinante (Peprotech) foi adicionado a 5 nM a 30 μι por poço à câmara inferior de uma placa de migração Neuroprobe de 96 poços com filtros de 5,7 mm de diâmetro por poço. Cada poço contém poros de 5 μΜ. As células CEM marcadas com ou sem o anticorpo foram 10 carregadas nos filtros a uma concentração de 0,5 milhões de células por poço num volume de 50 μι. As placas de migração foram incubadas a 37°C durante 2,5 horas. A células migradas foram capturadas na câmara inferior da placa, lisadas e detectadas com solução de detecção (Perkin Elmer). O sinal quimioluminescente foi registrado num instrumento Fusion. A inibição 15 resultante da migração induzida por SDF-Ia pelos anticorpos anti-CXCR4 está apresentada na Figura 13. Os resultados demonstraram que os anticorpos F7 e F9 inibiram a migração eficazmente, ao passo que os anticorpos Dl e E2 não inibiram a migração de forma significativa. Os valores EC5oS para inibição de migração de células CEM induzida por SDF-I por F7 e F9 foram 20 de 12,44 nM e 18,99 nM, respectivamente.
Exemplo 7: Inibição de Formação de Vasos Capilar por HuVEC por Anticorpos Anti-CXCR4
Neste exemplo, foi examinada a capacidade dos anticorpos anti-CXCR4 humanos de inibir a formação de vaso capilar por células 25 endoteliais de veia umbilical humana (HuVEC). Matrigel foi diluído 1:1 com RPMI e plaqueado em poços de uma placa de 96 poços e deixou-se que polimerizasse durante 30 minutos a 37°C. As HuVEC (da Cambrex, cat. N0 CC-2519) a 80% de confluência foram tripsinizadas e ressuspensas a Ix IO6 células por mL em RPMI com 0,5% FBS. Os anticorpos foram, então, misturados com HuVEC a uma concentração final de 3 μ^ΓηΙ, e deixados a incubar à temperatura ambiente durante for 30 minutos. Como controle negativo, foi utilizado um anticorpo irrelevante do mesmo isotipo. Como controle positivo de inibição de formação de vaso, foi usado um anticorpo 5 anti-avp3 humano (CD51/CD61) de camundongo (R&D Systems, cat. N0 MAB3050). As HuVEC com ou sem anticorpos foram plaqueadas nos poços revestidos com matrigel e incubadas a 37°C durante 18 horas.
As HuVEC incubadas só com o meio ou com o anticorpo de controle correspondente ao isotipo formaram vasos capilares resultando no 10 aparecimento de células conectadas ao largo da placa com 3-5 pontos de conexão ou pontos de ramificação por célula. As HuVEC incubadas com os anticorpos anti-CXCR4 humanos ou o anticorpo anti-avP3 não formaram vasos capilares. As células pareciam isoladas com poucos ou sem pontos de ramificação. Os anticorpos anti-CXCR4 que foram mais eficazes em bloquear 15 a ligação de SDF-1, o fluxo de cálcio induzido por SDF-I e a migração induzida por SDF-1, isto é, F7 e F9, também foram mais eficazes na inibição da formação de vaso capilar. O anticorpo E2 anti-CXCR4, que se liga ao CXCR4 mas não bloqueia a ligação de SDF-I ou reduz os efeitos induzidos por SDF-1, não inibiu a formação de vaso capilar.
Exemplo 8: Inibição da Proliferação de Células Tumorais In Vitro por Anticorpos Anti-CXCR4
Neste exemplo, foi examinada a capacidade dos anticorpos anti-CXCR4 humanos de inibir a proliferação de células tumorais Ramos (uma linhagem celular de linfoma de Burkitt humano) in vitro. No ensaio 1 x 25 IO4 células/poço foram incubadas com doses crescentes (IO'3 a 300 nM) do anticorpo F7 IgG4, do anticorpo F9 IgGl, do anticorpo E2 IgGl, do anticorpo F9 Fab’ ou controle de isotipo. As células foram incubadas com anticorpos durante 72 horas, com 3H-timidina sendo adicionada nas 24 horas finais da incubação para permitir a monitoração da proliferação das células. Depois da incubação, a incorporação de 3H-timidina pelas células foi medida por técnicas convencionais. Os resultados estão apresentados no gráfico da Figura
14. Os resultados demonstram que os anticorpos F7 IgG4, F9 IgGl e E2 IgGl, cada um deles, foi capaz de inibir a proliferação das células Ramos, 5 conforme indicado por incorporação diminuída de 3H-timidina quando incubadas com estes anticorpos, ao passo que o fragmento F9 Fab’ não inibiu a proliferação das células. Estes resultados indicam que os anticorpos antiCXCR4 têm um efeito anti-proliferativo direto sobre as células tumorais in vitro e, deste modo, não necessitam de ligação cruzada secundária para obter 10 um efeito anti-proliferativo.
Exemplo 9: Inibição da Proliferação de Células de Tumor Sólido In Vivo por Anticorpos Anti-CXCR4
Neste exemplo, foi examinada a capacidade dos anticorpos anti-CXCR4 humanos de inibir a proliferação in vivo de um tumor sólido estabelecido utilizando um modelo de célula de tumor subcutâneo Ramos. Neste ensaio, 10 x IO6 células Ramos/camundongo foram implantadas na região do flanco de cada camundongo e deixadas a desenvolver até um
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tamanho médio de 40 mm , calculado pelo comprimento x largura x altura/2 dos tumores. Os camundongos, então, receberam com uma injeção 20 intraperitoneal (i.p.) de uma primeira dose de anticorpo (designado como o dia 0 do tratamento) e receberam uma segunda dose i.p. do anticorpo no dia 7. Os camundongos tratados com um fragmento de anticorpo Fab’ também receberam doses i.p. de anticorpo no dia 3 e no dia 10. Grupos de camundongos (n=8) foram tratados com (i) veículo; (ii) controle de isotipo 25 (15 mg/kg); (iii) F7 IgG4 (15 mg/kg); (iv) F9 IgGl (15 mg/kg); (v) F9 Fab’ (10 mg/kg); ou (vi) controle positivo anti-CD20 (15 mg/kg). O volume do tumor e o peso corporal do camundongo foram medidos a intervalos regulares (aproximadamente 2-3 vezes/semana) entre o dia Oeo dia 30 pós-dosagem. Os resultados do experimento estão apresentados nas Figuras 15A, 15B e 15C, que mostram o volume médio do tumor (Figura 15A), volume mediano do tumor (Figura 15B) e % da alteração do peso corporal mediano (Figura 15C). Os resultados demonstraram que, como o controle positivo, os anticorpos F7 IgG4 e F9 IgGl inibiram, de forma significativa, o 5 crescimentos das células tumorais conforme medido por volume de tumor aumentado, ao passo que o fragmento F9 Fab’ não inibiu o crescimentos das células tumorais em comparação com o controle de isotipo. Todos os tratamentos foram bem tolerados conforme indicado por uma insignificante mudança do peso corporal. As diferenças em pesos corporais entre 10 tratamentos foi provavelmente devido aos pesos do tumores. Os resultados indicam que os anticorpos anti-CXCR4 humanos são capazes de inibir o crescimento de um tumor sólido estabelecido in vivo.
Exemplo 10; Tempo de Sobrevida Aumentado num Modelo Camundongo de Célula de Tumor Sistêmico por Tratamento com um Anticorpo anti-CXCR4
Neste exemplo, foi examinada a capacidade dos anticorpos anti-CXCR4 humanos de aumentar o tempo de sobrevida de camundongos utilizando um modelo de células de tumor sistêmico Ramos. Neste ensaio, 1 x IO6 células Ramos/camundongo foram injetadas por via intravenosa (i.v.) em 20 cada camundongo no dia 0. Os camundongos, então, receberam uma injeção intraperitoneal (i.p.) de uma primeira dose de anticorpo no dia 1 (isto é, um dia depois da administração i.v. das células tumorais) e receberam mais quatro doses i.p. do anticorpo nos dias 5, 8, 15 e 22 (os camundongos tratados com o controle positivo do anticorpo foram tratados apenas no dia 1). Grupos 25 de camundongos (n=8) foram tratados com (i) veículo; (ii) controle de isotipo (15 mg/kg); (iii) F9 IgGl (15 mg/kg); ou (iv) controle positivo anti-CD19 (15 mg/kg). A percentagem da sobrevida foi medida a intervalos regulares entre o dia 0 e o dia 50 pós-dosagem (a paralisia da perna traseira foi utilizada como
o ponto final do experimento). Os resultados do experimento estão apresentados na Figura 16, que mostra a percentagem de sobrevida ao longo do tempo. O n° de dias mediano de sobrevida para os camundongos tratados com o veículo ou com o controle de isotipo foi de 23 e 25,5 dias respectivamente, ao passo que o n° de dias mediano de sobrevida dos 5 camundongos tratados com uma dose do controle positivo anti-CD19 foi de 39 dias. Significativamente, 100% dos camundongos no grupo tratado com cinco doses do anticorpo F9 IgGl sobreviveram até o fim do experimento. Estes resultados indicam que o anticorpo anti-CXCR4 humano é capaz de aumentar os tempos de sobrevida de camundongos num modelo de células de 10 tumor sistêmico.
Exemplo 11: Indução de Apoptose por Anticorpo Monoclonal F7 Anti-CXCR4
Neste exemplo, foi examinada a capacidade do mAb F7 antiCXCR4 de induzir apoptose em células diferentes. No ensaio de apoptose, o mAb F7 a 10 μg/mL foi incubado com células Ramos (500.000 células), células Namalwa (500.000 células) ou células R1610 transfectadas para expressar CXCR4 (100.000 células). Células R1610 não transfectadas foram utilizadas como controle negativo. O mAb F7 anti-CXCR4 ou controle de isotipo foi incubado com as células a 37°C e amostras de 250 \\L foram removidas às 24, 48 e 72 horas. A fim de avaliar a apoptose, as células de vários pontos no tempo foram incubadas com Anexina V-FITC-FLl e Iodeto de Propídio - FL3, seguido por citometria de fluxo. A percentagem combinada de células colhidas nos quadrantes duplos positivos FL1, FL3 e FL1-FL3 foi considerada apoptótica. Para remover o background, as percentagens das células apoptóticas induzidas por isotipo de anticorpo foram subtraídas da percentagem das células apoptóticas induzidas pelo mAb F7.
Os resultados estão resumidos na Tabela 2: Tabela 2: Indução de Apoptose por mAb F7 Anti-CXCR4
Células TemDo ffloras) % Anoptose R1610 72 <1 R1610-CXCR4 24 39 R1610-CXCR4 48 58 R1610-CXCR4 72 46 Ramos 24 22 Ramos 48 31 Ramos 72 22 Namalwa 24 17 Namalwa 48 24 Namalwa 72 44 Os valores totais de % de apoptose são corrigidos para linha de base induzido por anticorpos de controle de isotipo.
Os resultados demonstram que o mAb F 7 é capaz de induzir 5 apoptose nas células Ramos, Namalwa e R1610-CXCR4 ao passo que o F7 não teve efeito sobre a indução da apoptose de células R1610 precursoras indicando que a resposta foi CXCR4-específica.
Exemplo 12: Estudos Adicionais que Demonstram a Inibição da Proliferação de Células de Tumor Sólido In Vivo por Anticorpos AntiCXCR4
Neste exemplo, foi examinada a capacidade dos anticorpos anti-CXCR4 humanos de inibir a proliferação ou induzir a apoptose de tumores sólidos in vivo utilizando modelos de células de tumores adicionais ao modelo Ramos descrito acima no Exemplo 9. Foram examinadas uma 15 variedade de linhas de células tumorais. Os experimentos representativos e os resultados são como a seguir.
Em um experimento, 7,5 x IO6 de células MDA-MB231 de câncer da mama humano/camundongo foram implantadas na região do flanco de cada camundongo e deixadas a desenvolver até um tamanho médio de 100 20 mm3, calculado pelo comprimento x largura x altura/2 dos tumores que foi o dia 7 pós-implante. Os camundongos foram randomizados em grupos de tratamentos diferentes e receberam uma injeção intraperitoneal (i.p.) de uma primeira dose de anticorpos no dia 7 pós-implante, receberam uma segundo pose i.p. de anticorpo no dia 14 pós-implante e, depois, receberam uma terceira dose no dia 46 pós-implante. Grupos de camundongos (n=9) foram tratados com (i) veículo (PBS); (ii) controle de isotipo IgGl (15 mg/kg); (iii) controle de isotipo IgG4 (15 mg/kg); (iv) F7 IgGl (15 mg/kg); ou (v) F7 IgG4 5 (15 mg/kg). Os volumes dos tumores foram medidos a intervalos regulares e o volume médio e a mediana do tumor foram determinados para cada grupo de tratamento em cada intervalo. Os resultados deste experimento estão resumidos adiante na Tabela 3, que apresenta o volume médio do tumor (em mm3) e a % da inibição do crescimento do tumor (TGI) no dia 52, e a 10 mediana do volume do tumor (em mm3) e a % da TGI no dia 59 pós-implante: Tabela 3: Inibição do Crescimento do Tumor de Células MDA-MB231 In Vivo por mAb F7
Tratamento Dia 52 Dia 59 Média TGI (%) Mediana TGI (%) Veículo 154 187 Controle de Isotipo IgGl 172 216 Controle de Isotipo IgG4 188 226 F7 IgGl Anti-CXCR4 86 50 130 40 F7 IgG4 Anti-CXCR4 79 58 108 52 Adicionalmente, um dos camundongos no grupo de tratamento F7 IgG4 estava livre do tumor no dia 59. Os resultados demonstram que o mAb F7 é capaz de inibir o crescimento de células de câncer de mama MDAMB231 in vivo.
Num segundo experimento, 5 x IO6 células DMS79 de carcinoma pulmonar de célula pequena humano/camundongo foram implantadas na região do flanco de cada camundongo e deixadas a
Λ
desenvolver até um tamanho médio de 160 mm , calculado pelo comprimento x largura x altura/2 dos tumores que foi o dia 7 pós-implante. Os camundongos foram randomizados em grupos de tratamentos diferentes e receberam injeções intraperitoneais (i.p.) de anticorpo no esquema de dosagem de Q3Dx5 (cada três dias por cinco vezes). Grupos de camundongos 25 (n=10) foram tratados com (i) veículo (PBS); (ii) controle de isotipo IgG4 (10 mg/kg); ou (iii) F7 IgG4 (10 mg/kg). Os volumes dos tumores foram medidos a intervalos regulares e o volume médio e a mediana do tumor foram determinados para cada grupo de tratamento em cada intervalo. Os resultados deste experimento estão resumidos adiante na Tabela 4, que apresenta o 5 volume médio e a mediana do tumor (em mm3) e a % da inibição do crescimento do tumor (TGI) no dia 34 pós-implante:
Tabela 4: Inibição do Crescimento do Tumor de Células DMS79 In Vivo por
mAb F7
Tratamento Dia 34 Média TGI (oZ0) Mediana TGI (%) Veículo 900 882 Controle de Isotipo IgG4 992 903 F7 IgG4 Anti-CXCR4 620 38 599 34 Os resultados demonstram que o mAb F7 é capaz de inibir o crescimento de células de carcinoma pulmonar de célula pequena humano DMS79 in vivo.
Modelos de tumor de xenoenxerto subcutâneo adicionais foram testados quanto à capacidade dos anticorpos anti-CXCR4 de inibir o crescimento e tumor, em experimentos similares àqueles descritos acima e no 15 Exemplo 9. Num experimento utilizando células SU-DHL-6 B de linfoma, os resultados demonstraram que o tratamento com o mAb F7 IgG4 a 15 mg/kg resultou em aproximadamente 60% de inibição do crescimento do tumor. De modo similar, num experimento utilizando células Namalwa de linfoma de Burkitt, os resultados demonstraram que o tratamento com o mAb F7 IgG4 a 20 3 mg/kg resultou em aproximadamente 70% de inibição do crescimento do tumor. Em contraste, não foi observada inibição do crescimento do tumor pelo mAb F7 em experimentos utilizando células de carcinoma pulmonar NIH-H226 ou células de adenocarcinoma pancreático humano HPAC. No entanto, o manchamento destas células pelo mAb F7 em experimentos de 25 citometria de fluxo apresentaram expressão mínima in vitro. Embora as células de tumor in vivo pudessem ser manchadas pelo mAb por imunohistoquímica, não é claro em que estádio do seu desenvolvimento de tumor que o CXCR4 começou a ser expresso. Isto sugere que a expressão do CXCR4 por estas duas linhas de células foi insuficiente para permitir a inibição do crescimento do tumor ou a indução de apoptose in vivo por tratamento anti-CXCR4.
Exemplo 13; Inibição de Metástases Pulmonares In Vivo por Anticorpos Anti-CXCR4
Neste exemplo, foi examinada a capacidade do mAb F 7 antiCXCR4 humano de inibir metástases pulmonares utilizando um modelo de tumor sistêmico de camundongo C57. Mais especificamente, 0,4 x IO6 de células B16-CXCR4 (células B16 transfectadas para expressar CXCR4 humano) foram injetadas por via intravenosa em cada um de 30 camundongos da estirpe C57. Os camundongos foram randomizados em três grupos de dez camundongos cada, que foram, então, tratados com (i) veículo (PBS); (ii) controle de isotipo IgG4 (5 mg/kg); ou (iii) F7 IgG4 (5 mg/kg). O anticorpo ou veículo foi injetado por via intraperitoneal 30 minutos depois das células B16-CXCR4 terem sido injetadas por via intravenosa. Os pulmões foram colhidos no dia 14 e o número de nódulos pulmonares metastáticos foi quantificado. Os resultados estão resumidos adiante na Tabela 5, que apresenta o número médio e a mediana das metástases em cada grupo:
Tabela 5: Inibição de Metástases Pulmonares In Vivo por mAb F7
Tratamento Número de Metástases % de Inibição de Pulmonares Metástases Pulmonares (Média) Média Mediana Veículo 364 397 Controle de Isotipo 309 294 15% IgG4 F7 IgG4Anti-CXCR4 157 186 56% Os resultados mostram que o tratamento com o mAb F7 levou a uma redução no número médio de nódulos pulmonares metastáticos de 56%, ao passo que a redução foi de apenas 15% com o anticorpo de controle de isotipo, demonstrando que o mAb F7 é capaz de inibir metástases pulmonares num modelo de tumor sistêmico.

Claims (49)

1. Anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, onde o anticorpo é humano, caracterizado pelo fato do anticorpo se ligar ao CXCR4 humano nativo expresso na superfície de uma célula.
2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do anticorpo inibir a ligação do SDF-I ao CXCR4 humano.
3. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do anticorpo não inibir a ligação do SDF-I ao CXCR4 humano.
4. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de inibir o fluxo de cálcio induzido por SDF-I em células que expressam CXCR4 humano.
5. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de inibir a migração induzida por SDF-I de células que expressam CXCR4 humano.
6. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de inibir a formação de vaso capilar por células endoteliais da veia umbilical humana.
7. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de induzir a apoptose em células que expressam CXCR4 humano.
8. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de inibir o crescimento ou induzir a apoptose de células tumorais CXCR4+ in vivo.
9. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do referido anticorpo se ligar ao CXCR4 humano com uma Kd de1x 1O'7 M ou menos.
10. Anticorpo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato do referido anticorpo se ligar ao CXCR4 humano com uma Kd de5 x 1O"8 M ou menos.
11. Anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, o anticorpo sendo humano, caracterizado pelo fato do anticorpo: (f) ligar-se ao CXCR4 humano, nativo expresso na superfície de uma célula; (g) inibir a ligação do SDF-I ao CXCR4 humano; (h) inibir o fluxo de cálcio induzido por SDF-I em células que expressam o CXCR4 humano; (i) inibir a migração induzida por SDF-I de células que expressam o CXCR4 humano; e (j) inibir a formação de vaso capilar por células endoteliais de veia umbilical humana.
12. Anticorpo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de induzir a apoptose em células que expressam o CXCR4.
13. Anticorpo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de inibir o crescimento ou induzir a apoptose de células tumorais CXCR4+ in vivo.
14. Anticorpo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de inibir a ligação do SDF-I ao CXCR4 humano com um valor de EC50 de 50 nM ou menos.
15. Anticorpo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de inibir o fluxo de cálcio induzido por SDF-I em células que expressam o CXCR4 humano com um valor de EC50 de 3 nM ou menos.
16. Anticorpo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de inibir a migração induzida por SDF-I de células que expressam o CXCR4 humano com um valor EC5O de 50 nM ou menos.
17. Anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, o anticorpo sendo humano, caracterizado pelo fato do anticorpo fazer competição cruzada pela ligação ao CXCR4 com um anticorpo de referência, em que o anticorpo de referência compreende: (e) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29; ou (f) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 30; ou (g) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 31; ou (h) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 32.
18. Anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de compreender uma região variável de cadeia pesada que é o produto ou é derivado de um gene Vh 3-48 humano, em que o anticorpo se liga especificamente ao CXCR4 humano.
19. Anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de compreender uma região variável de cadeia leve que é o produto ou é derivado de um gene Vk Ll 5 humano, em que anticorpo se liga especificamente ao CXCR4 humano.
20. Anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de compreender uma região variável de cadeia pesada que é o produto ou é derivado de um gene Vh 3-48 humano e uma região variável de cadeia leve que é o produto ou é derivado de um gene Vk Ll5 humano, em que anticorpo se liga especificamente ao CXCR4 humano.
21. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender: (a) região variável de cadeia pesada CDRl compreendendo a SEQ ID NO: 1; (b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo a SEQ ID NO: 5; (c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo a SEQ ID NO: 9; (d) uma região variável de cadeia leve CDRl compreendendo a SEQ ID NO: 13; (e) uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo a SEQ ID NO: 17; e (f) uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo a SEQ ID NO: 21.
22. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender: (a) uma região variável de cadeia pesada CDRl compreendendo a SEQ ID NO: 2; (b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo a SEQ ID NO: 6; (c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo a SEQ ID NO: 10; (d) uma região variável de cadeia leve CDRl compreendendo a SEQ ID NO: 14; (e) uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo a SEQ ID NO: 18; e (f) uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo a SEQ ID NO: 22.
23. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender: (a) uma região variável de cadeia pesada CDRl 5 compreendendo a SEQ ID NO: 3; (b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo a SEQ ID NO: 7; (c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo a SEQID NO: 11; (d) uma região variável de cadeia leve CDRl compreendendo a SEQ ID NO: 15; (e) uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo a SEQ ID NO: 19; e (f) uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo a SEQ ID NO: 23.
24. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender: (a) uma região variável de cadeia pesada CDRl compreendendo a SEQ ID NO: 4; (b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo a SEQ ID NO: 8; (c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo a SEQ ID NO: 12; (d) uma região variável de cadeia leve CDRl compreendendo a SEQ ID NO: 16; (e) uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo a SEQ ID NO: 20; e (f) uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo a SEQ ID NO: 24.
25. Anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de compreendendo (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 25-28 e 41-44; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 29-32 e 45-48; em que anticorpo se liga especificamente ao CXCR4 humano.
26. Anticorpo de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de compreender: (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma seqüência de aminoácidos das SEQ ID NO: 25 ou 41; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácidos das SEQ ID NO: 29 ou 45.
27. Anticorpo de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de compreender: (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma seqüência de aminoácidos das SEQ ID NO: 26 ou 42; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácidos das SEQ ID NO: 30 ou 46.
28. Anticorpo de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de compreender: (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma seqüência de aminoácidos das SEQ ID NO: 27 ou 43; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácidos das SEQ ID NO: 31 ou 47.
29. Anticorpo de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de compreender: (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma seqüência de aminoácidos das SEQ ID NO: 28 ou 44; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácidos das SEQ ID NO: 32 ou 48.
30. Composição, caracterizada pelo fato de compreender o anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, como definido na reivindicação 1, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
31. Imunoconj ugado, caracterizado pelo fato de compreender o anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, como definido na reivindicação 1, ligado a um agente terapêutico.
32. Composição, caracterizada pelo fato de compreender o imunoconjugado como definido na reivindicação 31 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
33. Imunoconjugado de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato do agente terapêutico ser uma citotoxina.
34. Composição, caracterizada pelo fato de compreender o imunoconjugado como definido na reivindicação 33 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
35. Imunoconjugado de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato do agente terapêutico ser um isótopo radioativo.
36. Composição, caracterizada pelo fato de compreender o imunoconjugado como definido na reivindicação 35 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
37. Molécula de ácido nucleico isolada, caracterizada pelo fato de codificar o anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, como definido na reivindicação 1.
38. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de compreender a molécula de ácido nucleico como definido na reivindicação37.
39. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de compreender o vetor de expressão como definida na reivindicação 38.
40. Método para preparar um anticorpo anti-CXCR4, caracterizado pelo fato de expressar o anticorpo na células hospedeira como definido na reivindicação 39 e isolar o anticorpo da células hospedeira.
41. Método para modular a atividade do CXCR4 em uma célula, caracterizado pelo fato de pôr a célula em contato com o anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, como definido na reivindicação 1, de tal modo que a atividade do CXCR4 na célula seja modulada.
42. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato da atividade do CXCR4 ser modulada in vitro cultivando a célula com o anticorpos ou porção de ligação ao antígeno do mesmo.
43. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo da atividade do CXCR4 ser modulada in vivo num indivíduo por meio da administração do anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, ao indivíduo.
44. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato da célula ser uma célula tumoral que expressa o CXCR4 e o método resultar na inibição de crescimento de célula tumoral ou inibição de metástases da célula tumoral.
45. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato da célula ser uma célula T que expressa o CXCR4 e o método resultar na inibição da entrada do HIV na célula.
46. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato da célula ser um linfócito numa doença inflamatória e o método resultar na inibição da inflamação.
47. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato da célula estar envolvida na vascularização e o método resultar na modulação da angiogênese.
48. Método para estimular a mobilização de células tronco CD34+ da medula óssea para o sangue periférico em um indivíduo, caracterizado pelo fato do método compreender a administração do anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, ao indivíduo, como definido na reivindicação 1, de tal modo que a mobilização das células tronco CD34+ da medula óssea para o sangue periférico seja estimulada.
49. Método de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de compreender ainda colher células tronco CD34+ do sangue periférico.
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