NO345287B1 - Humane antistoffer som binder CXCR4 og anvendelser derav - Google Patents

Humane antistoffer som binder CXCR4 og anvendelser derav Download PDF

Info

Publication number
NO345287B1
NO345287B1 NO20091283A NO20091283A NO345287B1 NO 345287 B1 NO345287 B1 NO 345287B1 NO 20091283 A NO20091283 A NO 20091283A NO 20091283 A NO20091283 A NO 20091283A NO 345287 B1 NO345287 B1 NO 345287B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
seq
cxcr4
antibody
chain variable
variable region
Prior art date
Application number
NO20091283A
Other languages
English (en)
Other versions
NO20091283L (no
Inventor
Josephine M Cardarelli
Alan J Korman
Peter Brams
Michelle Kuhne
Dawn M Tanamachi
Original Assignee
Squibb & Sons Llc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=39402166&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=NO345287(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Squibb & Sons Llc filed Critical Squibb & Sons Llc
Publication of NO20091283L publication Critical patent/NO20091283L/no
Publication of NO345287B1 publication Critical patent/NO345287B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)

Description

Kjemokiner er en familie på cirka 50 små proteiner som modulerer celle trafikkering og angiogenese og spiller også en signifikant rolle i tumor mikromiljø (Vicari, A.P. og Caux, C. (2002) Cytokine Growth Factor Rev.13:143-154). Avhengig av deres struktur er kjemokiner klassifisert som C-C kjemokiner (som inneholder et cystein-cystein motiv) eller C-X-C kjemokiner (som inneholder et cystein-X-cystein motiv). Reseptorer som binder slike kjemokiner klassifiseres således som medlemmer av CCR familien eller CXCR familien, respektivt. En medlem av CXCR familien er CXCR4, en syv transmembran G-protein koblet reseptor som først og fremst uttrykkes på lymfocytter og som aktiverer kjemotaksi. CXCR4 binder kjemokinet CXCL12 (SDF-1).
CXCR4 spiller en rolle i embryogenese, homeostase og inflammasjon. Studier med mus modifisert til å være defisiente i CXCR4 eller SDF-1 impliserer CXCR4/SDF-1 reaksjonsveien i organ vaskularisering, så vel som i immun og hematopoietiske systemer (Tachibana, K. et al. (1998) Nature 393:591-594). Videre har CXCR4 vist seg å fungere som en koreseptor for T lymfotrofiske HIV-1 isolater (Feng, Y. et al. (1996) Science 272:872-877). CXCR4 har også vist seg å være uttrykt på et bredt spekter av kreftcelletyper. I tillegg har CXCR4/SDF-1 reaksjonsveien vist seg å være involvert i stimulering av metastase prosessen i mange forskjellige neoplasmer (Murphy, P.M. (2001) N. Engl. J. Med.345:833-835). For eksempel har CXCR4 og SDF-1 vist seg å mediere organ-spesifikk metastase ved å danne en kjemotaktisk gradient mellom det primære tumor setet og det metastatiske setet (Muller, A. et al. (2001) Nature 410:50-56; Murakami, T. et al. (2002) Cancer Res.62:7328-7334; Hanahan, D. et al. (2003) Cancer Res. 63:3005-3008).
Monoklonale antistoffer er blitt generert mot humant CXCR4. For eksempel beskriver WO 2006/089141 produksjonen av anti-CXCR4 antistoffer for å forhindre X4-tropisk HIV-infeksjon og graft-mot-vert-reaksjon, og antyder videre bruk av slikt antistoffer i behandling av kreft for å forhindre metastaser og angiogenese. WO 2004/059285 beskriver CXC4-antagonister, inkludert monoklonale antistoffer som binder seg til CXCR4 eller til CXCR4-liganden (SDF-1), og som kan brukes til å redusere spredning eller forårsake død av CXCR4-uttrykkende tumorceller.
Sammenlignet med disse kjente anti-CXCR4 antistoffer tilveiebringer foreliggende søknad anti-CXCR4 antistoffer som viser overlegen terapeutisk potensial som bestemt ved prekliniske studier, inklusive studier som demonstrerer effektiv blokkering av SDF-1 til celleoverflateuttrykt CXCR4 (eksempel 4); høy effektiv inhibering av SDF-1indusert kalsiumfluks (eksempel 5); effektiv hemming av SDF-1-indusert CEM-cellemigrasjon (eksempel 6); effektiv hemming av kapillarrørdannelse (eksempel 7); betydelig hemming av tumorcelleproliferasjon in vitro (eksempel 8) og in vivo (eksempler 9 og 12); økt overlevelsestid for mus i en systemisk tumorcellemodell (eksempel 10), induksjon av apoptose av CXCR4-uttrykkende celler (eksempel 11) og hemming av kreftmetastase in vivo (eksempel 12). Foreliggende søknad viser dermed at de beskrevne anti-CXCR4 antistoffene er spesielt effektiv til å hemme vekst av en rekke tumorceller, forhindre tumor metastase in vivo, og økt overlevelse av tumorbærende mus.
Foreliggende beskrivelse tilveiebringer isolerte monoklonale antistoffer, særlig humane monoklonale antistoffer, som binder til human CXCR4 og som fremviser et antall ønskede egenskaper. Disse egenskapene inkluderer evnen til å binde til naturlig human CXCR4 uttrykt på en celle overflate, evnen til å inhibere SDF-1 binding til human CXCR4, evnen til å inhibere SDF-1-indusert kalsium fluks i celler som uttrykker CXCR4, evnen til å inhibere SDF-1-indusert migrering av celler som uttrykker CXCR4, evnen til å inhibere kapillær rør dannelse med humane umbilikal vene endotel celler (HuVECer), evnen til å indusere apoptose i celler som uttrykker CXCR4, evnen til å inhibere tumor celle proliferasjon in vitro, evnen til å inhibere tumor celle proliferasjon in vivo, evnen til å inhibere metastaser til CXCR4<+ >tumor celler og/eller evnen til å øke overlevelsestid til et CXCR4<+ >tumor-bærende subjekt.
I et aspekt angår foreliggende beskrivelse et isolert humant monoklonalt antistoff, eller en antigen-bindende del derav, hvori antistoffet binder til naturlig human CXCR4 uttrykt på en celle overflate. I en utførelsesform inhiberer antistoffet også binding av SDF-1 til human CXCR4, foretrukket med en EC50 for inhibering på 50 nM eller mindre, eller 30 nM eller mindre, eller 15 nM eller mindre, eller 10 nM eller mindre, eller 5 nM eller mindre, eller 3 nM eller mindre (for eksempel en EC50 for inhibering på 28.60 nM eller mindre, eller 12.51 nM eller mindre, eller 2.256 nM eller mindre). I en annen utførelsesform binder antistoffet til naturlig human CXCR4 uttrykt på en celle overflate, men inhiberer ikke binding av SDF-1 til human CXCR4. I ytterligere andre utførelsesformer inhiberer antistoffet også SDF-1-indusert kalsium fluks i celler som uttrykker human CXCR4, foretrukket med en EC50 for inhibering på 3 nM eller mindre, eller 2 nM eller mindre, eller 1 nM eller mindre, eller 0.9 nM eller mindre, eller 0.8 nM eller mindre, eller 0.7 nM eller mindre, eller 0.6 nM eller mindre, eller 0.5 nM eller mindre, eller 0.4 nM eller mindre (for eksempel 0.9046 nM eller mindre, 0.5684 eller mindre, eller 0.3219 nM eller mindre). I ytterligere andre utførelsesformer inhiberer antistoffet også SDF-1-indusert migrering av celler som uttrykker human CXCR4, foretrukket med en EC50 for inhibering på 50 nM eller mindre, eller 30 nM eller mindre, eller 20 nM eller mindre, eller 15 nM eller mindre (for eksempel 18.99 nM eller mindre, eller 12.44 eller mindre). I ytterligere andre utførelsesformer inhiberer antistoffet også kapillær rør dannelse av HuVECer, induserer apoptose til celler som uttrykker CXCR4, inhiberer tumor celle proliferasjon in vitro, inhiberer tumor celle proliferasjon eller induserer tumor celle apoptose in vivo, inhiberer metastaser til CXCR4<+ >tumor celler og/eller øker overlevelsestid til et CXCR4<+ >tumor-bærende subjekt.
Foretrukket binder antistoffet til human CXCR4 med høy affinitet, slik som med en KD på 1 x 10<-7 >M eller mindre eller med en KD på 5 x 10<-8 >M eller mindre. Foretrukket er antistoffene i foreliggende beskrivelse full-lengde antistoffer (det vil si som innbefatter variable og konstante regioner). Videre er antistoffene i foreliggende beskrivelse foretrukket hevet ovenfor full-lengde human CXCR-4 uttrykt i deres naturlige konformasjon på en vertscelle eller i en kunstig membran.
I et foretrukket aspekt angår foreliggende beskrivelse et isolert humant monoklonalt antistoff, eller en antigen-bindende del derav, hvori antistoffet:
(a) binder til naturlig human CXCR4 uttrykt på en celle overflate;
(b) inhiberer binding av SDF-1 til human CXCR4;
(c) inhiberer SDF-1-indusert kalsium fluks i celler som uttrykker human CXCR4;
(d) inhiberer SDF-1-indusert migrering av celler som uttrykker human CXCR4; og (e) inhiberer kapillær rør dannelse av human umbilikal vene endotel celler.
Enda mer foretrukket induserer antistoffet også apoptose til celler som uttrykker human CXCR4 og/eller inhiberer vekst av CXCR4<+ >tumor celler og/eller induserer tumor celle apoptose in vivo.
I et annet aspekt angår foreliggende beskrivelse et isolert humane monoklonalt antistoff, eller antigen bindende del derav, hvori antistoffet kryss-konkurrerer for binding til CXCR4 med et referanse antistoff, hvori referanse antistoffet innbefatter:
(a) en tungkjede variabel region som innbefatter aminosyresekvensen ”SEQ ID NO”: 25 og en lettkjede variabel region som innbefatter aminosyresekvensen ”SEQ ID NO”: 29; eller
(b) en tungkjede variabel region som innbefatter aminosyresekvensen ”SEQ ID NO”: 26 og en lettkjede variabel region som innbefatter aminosyresekvensen ”SEQ ID NO”: 30; eller
(c) en tungkjede variabel region som innbefatter aminosyresekvensen ”SEQ ID NO”: 27 og en lettkjede variabel region som innbefatter aminosyresekvensen ”SEQ ID NO”: 31; eller
(d) en tungkjede variabel region som innbefatter aminosyresekvensen ”SEQ ID NO”: 28 og en lettkjede variabel region som innbefatter aminosyresekvensen ”SEQ ID NO”: 32.
I visse utførelsesformer tilveiebringer foreliggende beskrivelse et isolert monoklonalt antistoff, eller en antigen-bindende del derav, som innbefatter en tungkjede variabel region som er produktet av eller avledet fra et humant VH 3-48 gen, hvori antistoffet spesifikt binder human CXCR4. I andre utførelsesformer tilveiebringer foreliggende beskrivelse et isolert monoklonalt antistoff, eller antigen-bindende del derav, som innbefatter en lettkjede variabel region som er produktet av eller avledet fra et humant VK L15 gen, hvori antistoffet spesifikt binder human CXCR4. I ytterligere andre utførelsesformer tilveiebringer foreliggende beskrivelse et isolert monoklonalt antistoff, eller en antigen-bindende del derav, som innbefatter en tungkjede variable region som er produktet av eller avledet fra et humant VH 3-48 gen og en lettkjede variabel region som er produktet av eller avledet fra et humant VK L15 gen, hvori antistoffet spesifikt binder human CXCR4.
I et annet aspekt tilveiebringer foreliggende beskrivelse et isolert monoklonalt antistoff, eller antigen bindende del derav, som innbefatter:
en tungkjede variabel region som innbefatter CDR1, CDR2 og CDR3 sekvenser; og en lettkjede variabel region som innbefatter CDR1, CDR2 og CDR3 sekvenser, hvori: (a) tungkjede variabel region CDR3 sekvensen innbefatter en aminosyresekvensen valgt fra gruppen som består av aminosyresekvensene ”SEQ ID NO”: 9-12, og konservative modifikasjoner derav;
(b) lettkjede variabel region CDR3 sekvensen som innbefatter en aminosyresekvensen valgt fra gruppen som består av aminosyre sekvensen ”SEQ ID NO”: 21-24, og konservative modifikasjoner derav; og
(c) antistoffet binder til naturlig human CXCR4 uttrykt på en celle overflate.
I foretrukne utførelsesformer har dette antistoffet også en eller flere av følgende karakteristikker: inhiberer binding av SDF-1 til CXCR4, inhiberer SDF-1-indusert kalsium fluks i celler som uttrykker CXCR4, inhiberer SDF-1-indusert migrering av celler som uttrykker CXCR-4; inhiberer kapillær rør dannelse av HuVECer; induserer apoptose i celler som uttrykker CXCR4 (in vitro og/eller in vivo), inhiberer vekst av CXCR4<+ >tumor celler in vitro og/eller in vivo, og/eller inhiberer metataser av CXCR4<+ >tumor celler.
Foretrukket innbefatter tungkjede variabel region CDR2 sekvensen en aminosyresekvensen valgt fra gruppen som består av aminosyresekvensene ”SEQ ID NO”: 5-8, og konservative modifikasjoner derav; og lettkjede variabel region CDR2 sekvensen innbefatter en aminosyresekvensen valgt fra gruppen som består av aminosyresekvensene ”SEQ ID NO”: 17-20, og konservative modifikasjoner derav. Foretrukket innbefatter tungkjede variabel region CDR1 sekvensen en aminosyresekvensen valgt fra gruppen som består av aminosyresekvensene ”SEQ ID NO”: 1-4, og konservative modifikasjoner derav; og lettkjede variabel region CDR1 sekvensen innbefatter en aminosyresekvensen valgt fra gruppen som består av aminosyresekvenser ”SEQ ID NO”: 13-16, og konservative modifikasjoner derav.
En foretrukket kombinasjon innbefatter:
(a) tungkjede variabel region CDR1 som innbefatter ”SEQ ID NO”: 1;
(b) en tungkjede variabel region CDR2 som innbefatter ”SEQ ID NO”: 5;
(c) en tungkjede variabel region CDR3 som innbefatter ”SEQ ID NO”: 9;
(d) en lettkjede variabel region CDR1 som innbefatter ”SEQ ID NO”: 13;
(e) en lettkjede variabel region CDR2 som innbefatter ”SEQ ID NO”: 17; og
(f) en lettkjede variabel region CDR3 som innbefatter ”SEQ ID NO”: 21.
En annen foretrukket kombinasjon innbefatter:
(a) en tungkjede variabel region CDR1 som innbefatter ”SEQ ID NO”: 2;
(b) en tungkjede variabel region CDR2 som innbefatter ”SEQ ID NO”: 6;
(c) en tungkjede variabel region CDR3 som innbefatter ”SEQ ID NO”: 10;
(d) en lettkjede variabel region CDR1 som innbefatter ”SEQ ID NO”: 14;
(e) en lettkjede variabel region CDR2 som innbefatter ”SEQ ID NO”: 18; og
(f) en lettkjede variabel region CDR3 som innbefatter ”SEQ ID NO”: 22.
En annen foretrukket kombinasjon innbefatter:
(a) en tungkjede variabel region CDR1 som innbefatter ”SEQ ID NO”: 3;
(b) en tungkjede variabel region CDR2 som innbefatter ”SEQ ID NO”: 7;
(c) en tungkjede variabel region CDR3 som innbefatter ”SEQ ID NO”: 11;
(d) en lettkjede variabel region CDR1 som innbefatter ”SEQ ID NO”: 15;
(e) en lettkjede variabel region CDR2 som innbefatter ”SEQ ID NO”: 19; og
(f) en lettkjede variabel region CDR3 som innbefatter ”SEQ ID NO”: 23.
En annen foretrukket kombinasjon innbefatter:
(a) en tungkjede variabel region CDR1 som innbefatter ”SEQ ID NO”: 4;
(b) en tungkjede variabel region CDR2 som innbefatter ”SEQ ID NO”: 8;
(c) en tungkjede variabel region CDR3 som innbefatter ”SEQ ID NO”: 12;
(d) en lettkjede variabel region CDR1 som innbefatter ”SEQ ID NO”: 16;
(e) en lettkjede variabel region CDR2 som innbefatter ”SEQ ID NO”: 20; og
(f) en lettkjede variabel region CDR3 som innbefatter ”SEQ ID NO”: 24.
Andre foretrukne antistoffer i følge foreliggende beskrivelse eller antigen bindende deler derav, innbefatter: (a) en tungkjede variabel region som innbefatter en aminosyresekvensen valgt fra gruppen som består av ”SEQ ID NO”: 25-28 og 41-44; og (b) en lettkjede variabel region som innbefatter en aminosyresekvensen valgt fra gruppen som består av ”SEQ ID NO”: 29-32 og 45-48; hvori antistoffet spesifikt binder CXCR4.
En foretrukket kombinasjon innbefatter: (a) en tungkjede variabel region som innbefatter aminosyresekvensen ”SEQ ID NO”: 25 eller 41; og (b) en lettkjede variabel region som innbefatter aminosyresekvensen ”SEQ ID NO”: 29 eller 45.
En annen foretrukket kombinasjon innbefatter: (a) en tungkjede variabel region som innbefatter aminosyresekvensen ”SEQ ID NO”: 26 eller 42; og (b) en lettkjede variabel region som innbefatter aminosyresekvensen ”SEQ ID NO”: 30 eller 46.
En annen foretrukket kombinasjon innbefatter: (a) en tungkjede variabel region som innbefatter aminosyresekvensen ”SEQ ID NO”: 27 eller 43; og (b) en lettkjede variabel region som innbefatter aminosyresekvensen ”SEQ ID NO”: 31 eller 47.
En annen foretrukket kombinasjon innbefatter: (a) en tungkjede variabel region som innbefatter aminosyresekvensen ”SEQ ID NO”: 28 eller 44; og (b) en lettkjede variabel region som innbefatter aminosyresekvensen ”SEQ ID NO”: 32 eller 48.
I et annet aspekt av foreliggende beskrivelse er antistoffer eller antigen-bindende deler derav tilveiebrakt som konkurrerer om binding til CXCR4 med et hvilket som helst av de ovenfor nevnte antistoffene.
Antistoffene i følge oppfinnelsen kan for eksempel være full-lengde antistoffer, for eksempel en IgG1 eller IgG4 isotyp. Alternativt kan antistoffene være antistoff fragmenter, slik som Fab, Fab’ eller Fab’2 fragmenter, eller enkeltkjede antistoffer.
Foreliggende beskrivelse tilveiebringer også et immunokonjugat som innbefatter et antistoff i følge foreliggende beskrivelse, eller antigen-bindende del derav, bundet til et terapeutisk middel, slik som et cytotoksin eller en radioaktiv isotop. Foreliggende beskrivelse tilveiebringer også et bispesifikt molekyl som innbefatter et antistoff eller antigen-bindende del derav, i følge foreliggende beskrivelse, bundet til en andre funksjonell bestanddel som har en forskjellig bindingsspesifisitet i forhold til nevnte antistoff, eller antigen bindende del derav.
Sammensetninger som innbefatter et antistoff eller antigen-bindende del derav eller immunokonjugat eller bispesifikt molekyl i følge foreliggende beskrivelse og en farmasøytisk akseptabel bærer er også tilveiebrakt.
Nukleinsyre molekyler som koder antistoffene eller antigen-bindende deler derav, i følge foreliggende beskrivelse er også omfattet av foreliggende beskrivelse, så vel som ekspresjonsvektorer som innbefatter nevnte nukleinsyrer og vertsceller som innbefatter slike ekspresjonsvektorer. Fremgangsmåter for fremstilling av anti-CXCR4 antistoffer ved anvendelse av vertscellene som innbefatter slike ekspresjonsvektorer er også tilveiebrakt og kan inkludere trinnene med å (i) uttrykke antistoffet i vertscellen og (ii) isolere antistoffet fra vertscellen.
Et annet aspekt i følge foreliggende oppfinnelsen angår fremgangsmåter for å modulere CXCR4 aktivitet i en celle, hvori cellene bringes i kontakt med et antistoff, eller antigen-bindende del derav, i følge foreliggende beskrivelse. Cellene kan bringes i kontakt in vitro ved dyrkning av cellene med antistoffet eller cellene kan bringes i kontakt in vivo ved administrering av antistoffet til et subjekt. I en foretrukket utførelsesform er cellene tumor celler som uttrykker CXCR4 og fremgangsmåten resulterer i inhibering av veksten av tumor celler og/eller inhibering av tumor celle metastase. I en annen utførelsesform er cellene T celler som uttrykker CXCR4 og fremgangsmåte resulterer i inhibering av inngang av HIV inn i cellene. I en ytterligere annen utførelsesform er cellene lymfocytter i en inflammatorisk forstyrrelse og fremgangsmåtene resulterer i inhibering av inflammasjon. I en ytterligere annen utførelsesform er cellene involvert i vaskularisering og fremgangsmåten resulterer i modulering av angiogenese.
I en annet aspekt angår foreliggende beskrivelse en fremgangsmåte for stimulering av mobilisering av CD34<+ >stamceller fra benmarg til perifert blod hos et subjekt, hvor fremgangsmåten innbefatter administrering til subjektet et antistoff, eller antigenbindende del derav, i følge foreliggende beskrivelse slik at mobilisering av CD34<+ >stamceller fra benmarg til perifert blod blir stimulert. Fremgangsmåten kan ytterligere innbefatte oppsamling av CD34<+ >stamceller fra det perifere blodet, slik som for anvendelse i autolog stamcelle transplantasjon.
Figur 1A viser nukleotidsekvensen (”SEQ ID NO”: 33) og aminosyresekvensen (”SEQ ID NO”: 25) til tungkjede variabel regionen til det F7 humane monoklonale antistoffet. CDR1 (”SEQ ID NO”: 1), CDR2 (”SEQ ID NO”: 5) og CDR3 (”SEQ ID NO”: 9) regionene er avtegnet og V, D og J germlinje derivasjoner er indikert.
Figur 1B viser nukleotidsekvensen (”SEQ ID NO”: 37) og aminosyresekvensen (”SEQ ID NO”: 29) til lettkjede variabel regionen til det F7 humane monoklonale antistoffet. CDR1 (”SEQ ID NO”: 13), CDR2 (”SEQ ID NO”: 17) og CDR3 (”SEQ ID NO”: 21) regionene er avtegnet og V og J germlinje derivasjoner er indikert.
Figur 2A viser nukleotidsekvensen (”SEQ ID NO”: 34) og aminosyresekvensen (”SEQ ID NO”: 26) til tungkjede variabel regionen til det F9 humane monoklonale antistoffet. CDR1 (”SEQ ID NO”: 2), CDR2 (”SEQ ID NO”: 6) og CDR3 (”SEQ ID NO”: 10) regionene er avtegnet og V, D og J germlinje derivasjoner er indikert.
Figur 2B viser nukleotidsekvensen (”SEQ ID NO”: 38) og aminosyresekvensen (”SEQ ID NO”: 30) til lettkjede variabel regionen til det F9 humane monoklonale antistoffet. CDR1 (”SEQ ID NO”: 14), CDR2 (”SEQ ID NO”: 18) og CDR3 (”SEQ ID NO”: 22) regionene er avtegnet og V og J germlinje derivasjoner er indikert.
Figur 3A viser nukleotidsekvensen (”SEQ ID NO”: 35) og aminosyresekvensen (”SEQ ID NO”: 27) til tungkjede variabel regionen til det D1 humane monoklonale antistoffet. CDR1 (”SEQ ID NO”: 3), CDR2 (”SEQ ID NO”: 7) og CDR3 (”SEQ ID NO”: 11) regionene er avtegnet og V, D og J germlinje derivasjoner er indikert.
Figur 3B viser nukleotidsekvensen (”SEQ ID NO”: 39) og aminosyresekvensen (”SEQ ID NO”: 31) til lettkjede variabel regionen til det D1 humane monoklonale antistoffet.
CDR1 (”SEQ ID NO”: 15), CDR2 (”SEQ ID NO”: 19) og CDR3 (”SEQ ID NO”: 23) regionene er avtegnet og V og J germlinje derivasjoner er indikert.
Figur 4A viser nukleotidsekvensen (”SEQ ID NO”: 36) og aminosyresekvensen (”SEQ ID NO”: 28) til tungkjede variabel regionen til det E2 humane monoklonale antistoffet. CDR1 (”SEQ ID NO”: 4), CDR2 (”SEQ ID NO”: 8) og CDR3 (”SEQ ID NO”: 12) regionene er avtegnet og V, D og J germlinje derivasjoner er indikert.
Figur 4B viser nukleotidsekvensen (”SEQ ID NO”: 40) og aminosyresekvensen (”SEQ ID NO”: 32) til lettkjede variabel regionen til det E2 humane monoklonale antistoffet. CDR1 (”SEQ ID NO”: 16), CDR2 (”SEQ ID NO”: 20) og CDR3 (”SEQ ID NO”: 24) regionene er avtegnet og V og J germlinje derivasjoner er indikert.
Figur 5A viser oppstilling av aminosyresekvensen til tungkjede variabel regionene til F7 (”SEQ ID NO”: 25) og F7GL (”SEQ ID NO”: 41) med den humane germlinje VH 3-48 aminosyresekvensen (”SEQ ID NO”: 49)(JH6b germlinje beskrevet som ”SEQ ID NO”: 52).
Figur 5B viser oppstilling av aminosyresekvensen til lettkjede variabel regionen til F7 (”SEQ ID NO”: 29) og F7GL (”SEQ ID NO”: 45) med den humane germlinje Vk L15 aminosyresekvensen (”SEQ ID NO”:50) (JK1 germlinje beskrevet som ”SEQ ID NO”: 53).
Figur 6A viser oppstilling av aminosyresekvensen til tungkjede variabel regionene til F9 (”SEQ ID NO”: 26) og F9GL (”SEQ ID NO”: 42) med den humane germlinje VH 3-48 aminosyresekvensen (”SEQ ID NO”: 49) (JH6b germlinje beskrevet som ”SEQ ID NO”: 52).
Figur 6B viser oppstilling av aminosyresekvensen til lettkjede variabel regionen til F9 (”SEQ ID NO”: 30) og F9GL (”SEQ ID NO”: 46) med den humane germlinje Vk L15 aminosyresekvensen (”SEQ ID NO”:50) (JK1 germlinje beskrevet som ”SEQ ID NO”: 53).
Figur 7A viser oppstilling av aminosyresekvensen til tungkjede variabel regionene til D1 (”SEQ ID NO”: 27) og D1GL (”SEQ ID NO”: 43) med den humane germlinje VH 3-48 aminosyresekvensen (”SEQ ID NO”: 49) (JH6b germlinje beskrevet som ”SEQ ID NO”: 52).
Figur 7B viser oppstilling av aminosyresekvensen til lettkjede variabel regionen til D1 (”SEQ ID NO”: 31) og D1GL (”SEQ ID NO”: 47) med den humane germlinje Vk L15 aminosyresekvensen (”SEQ ID NO”:50) (JK1 germlinje beskrevet som ”SEQ ID NO”: 53).
Figur 8A viser oppstilling av aminosyresekvensen til tungkjede variabel regionene til E2 (”SEQ ID NO”: 28) og E2GL (”SEQ ID NO”: 44) med den humane germlinje VH 3-48 aminosyresekvensen (”SEQ ID NO”: 49) (JH6b germlinje beskrevet som ”SEQ ID NO”: 52).
Figur 8B viser oppstilling av aminosyresekvensen til lettkjede variabel regionen til E2 (”SEQ ID NO”: 32) og E2GL (”SEQ ID NO”: 48) med den humane germlinje Vk L15 aminosyresekvensen (”SEQ ID NO”:50) (JK1 germlinje beskrevet som ”SEQ ID NO”: 53).
Figur 9 er en graf som viser binding av anti-CXCR4 humane antistoffer F7, F9, D1 og E2 til CEM celler som uttrykker naturlig human CXCR4 på celle overflaten.
Figur 10 er en graf som viser antistoff konkurrering for binding til CEM celler mellom FITC-merket anti-CXCR4 antistoff F9 og et panel av umerkede anti-CXCR4 humane antistoffer.
Figur 11 er en graf som viser inhibering av binding av <125>I-merket SDF-1 til CEM celler med anti-CXCR4 humane antistoffer F7, F9 og D1.
Figur 12 er en graf som viser inhibering av SDF-1-indusert kalsium fluks i CEM celler med anti-CXCR4 humane antistoffer F7, F9 og D1.
Figur 13 er en graf som viser inhibering av SDF-1-indusert migrering av CEM celler med anti-CXCR4 humane antistoffer F7 og F9.
Figur 14 er en graf som viser inhibering av Ramos tumor celle proliferasjon in vitro med anti-CXCR4 humane antistoffer F7, F9 og E2.
Figur 15A-C er grafer som viser inhibering av Ramos tumor celle proliferasjon in vivo i en subkutant tumor modell med anti-CXCR4 humane antistoffer F7 og F9. Figur 15A viser midlere tumor volum vekstkurve; Figur 15B viser median tumor volum vekstkurve; Figur 15C viser median % kroppsvekt forandring.
Figur 16 er en graf som viser % overlevelse av mus behandlet med det anti-CXCR4 humane antistoff F9 i en Ramos systemisk tumor celle modell.
Foreliggende beskrivelse angår isolerte monoklonale antistoffer, særlig humane monoklonale antistoffer, som binder spesifikt til naturlig human CXCR4 uttrykt på en celle overflate. I visse utførelsesformer er antistoffene i foreliggende beskrivelse avledet fra særlige tung og lettkjede germlinje sekvenser og/eller innbefatter særlige strukturtrekk slik som CDR regioner som innbefatter spesielle aminosyresekvenser. Foreliggende beskrivelse tilveiebringer isolerte antistoffer, fremgangsmåter for fremstilling av slike antistoffer, immunokonjugater og bispesifikke molekyler som innbefatter slike antistoffer og farmasøytiske sammensetninger som inneholder antistoffene, immunokonjugatene eller bispesifikke molekyler i følge foreliggende beskrivelse. Foreliggende beskrivelse angår også fremgangsmåter for anvendelse av antistoffene, slik som for å detektere CXCR4, så vel som for å modulere CXCR4 aktivitet i sykdommer eller forstyrrelser assosiert med ekspresjon av CXCR4 eller som involverer CXCR4/SDF-1 reaksjonsveien, slik som kreft, tumor metastaser, HIV infeksjon, inflammasjon og angiogenese. Følgelig tilveiebringer foreliggende beskrivelse også fremgangsmåter for anvendelse av anti-CXCR4 antistoffene i følge foreliggende beskrivelse for behandling av kreft, for eksempel for behandling av kreft slik som bryst, eggstokk, prostata, ikke-småcelle lunge, pankreatisk, tyroid, melanom, nasofaryngeal, renal celle, lymfom, neuroblastom, glioblastom, rabdomyosarkom, kolorektal, nyre, osteosarkom, akutt lymfoblastisk leukemi eller akutt myeloid leukemi. I tillegg tilveiebringer foreliggende beskrivelse fremgangsmåter for anvendelse av anti-CXCR4 antistoffene i følge foreliggende beskrivelse for inhibering av tumor metastaser.
For at foreliggende beskrivelse lettere skal forstås blir visse begreper først definert. Ytterligere definisjoner er fremsatt i foreliggende detaljerte beskrivelse.
Begrepet ”CXCR4” inkluderer varianter, isoformer, homologer, ortologer og paraloger. For eksempel kan antistoffer spesifikke for CXCR4 i visse tilfeller kryss-reagere med CXCR4 for arter forskjellige fra mennesker. I andre utførelsesformer kan antistoffer spesifikke for human CXCR4 være fullstendig spesifikk for human CXCR4 og kan ikke fremvise arts eller andre typer kryss-reaktivitet. Begrepet “human CXCR4” refererer til human sekvens CXCR4, slik som den fullstendige aminosyresekvensen til human CXCR4 som har Genbank aksesjonsnummer P61073 (SEQ ID NO:51). CXCR4 er også kjent i litteraturen som for eksempel LESTR, fusjon eller CD184. Human CXCR4 sekvensen kan være forskjellig fra human CXCR4 til SEQ ID NO:51 ved for eksempel å ha konserverte mutasjoner eller mutasjoner i ikke-konserverte regioner og CXCR4 har i det vesentlige samme biologiske funksjon som den humane CXCR4 til SEQ ID NO:51. For eksempel er en biologisk funksjon til human CXCR4 å ha en epitop i det ekstracellulære domenet til CXCR4 som er spesifikt bundet til et antistoff i følge foreliggende beskrivelse eller den biologiske funksjonen til det humane CXCR4 er kjemokin binding eller involvering i metastase prosessen.
En særlig human CXCR4 sekvens vil generelt være minst 90% identisk i aminosyresekvens med human CXCR4 til SEQ ID NO: 51 og inneholder aminosyre residuer som identifiserer aminosyresekvensen som værende human sammenlignet med CXCR4 aminosyresekvenser til andre arter (for eksempel fra muse familien). I visse tilfeller kan human CXCR4 være minst 95%, eller til og med minst 96%, 97%, 98% eller 99% identisk i aminosyresekvens med CXCR4 til SEQ ID NO: 51. I visse utførelsesformer vil en human CXCR4 sekvens fremvise ikke mer enn 10 aminosyre forskjeller fra CXCR4 til SEQ ID NO: 51. I visse utførelsesformer kan den humane CXCR4 fremvise ikke mer enn 5, eller til og med ikke mer enn 4, 3, 2 eller 1 aminosyre forskjell fra CXCR4 til SEQ ID NO: 51. Prosent identitet kan bestemmes slik det er beskrevet heri.
Begrepet “SDF-1” refererer til stromal celle-avledet faktor 1, som er en ligand for CXCR4. Begrepet “SDF-1” omfatter forskjellige isoformer av SDF-1, slik som SDF-1α og SDF-1β. Aminosyresekvensen til human SDF-1α har Genbank aksesjonsnummer NP_954637. Aminosyresekvensen til human SDF-1β har Genbank aksesjonsnummer NP_000600. Human SDF-1 er også beskrevet i US patentnr.5,756,084. SDF-1 er også kjent som CXCL12. Aminosyresekvensen til human SDF-1 kan være forskjellig fra SDF-1 til NP_954637 eller NP_000600, slik det er beskrevet heri for CXCR4.
Uttrykket “immunrespons” refererer til virkningen til for eksempel lymfocytter, antigen presenterende celler, fagocytiske celler, granulocytter og løselige makromolekyler produsert av cellene ovenfor eller leveren (som inkluderer antistoffer, cytokiner og komplement) som resulterer i selektiv skade på, destruksjon av eller eliminering fra den humane kroppen for invaderende patogener, celler eller vev infisert med patogener, kreftceller eller, i tilfelle autoimmunitet eller patologisk inflammasjon, normale humane celler eller vev.
En “signal transduksjonsreaksjonsvei” refererer til den biokjemiske relasjonen mellom et antall signal transduksjonsmolekyler som spiller en rolle i transmisjon av et signal fra en del av en celle til en annen del av en celle. Slik det anvendes heri inkluderer uttrykket ”celle overflate reseptor” for eksempel molekyler og komplekser av molekyler i stand til å motta et signal og transmisjonen av et slik signal over plasma membranen til en celle. Et eksempel på en ”celle overflate reseptor” i følge foreliggende beskrivelse er CXCR4 reseptoren.
Begrepet “antistoff” slik det refereres til heri inkluderer hele antistoffer og et hvilket som helst antigen bindingsfragment (for eksempel “antigen-bindende del”) eller enkle kjeder derav. Et ”antistoff” refererer til et glykoprotein som innbefatter minst to tunge (H) kjeder og to lette (L) kjeder mellom-bundet med disulfid bindinger, eller en antigen bindende del derav. Hver tunge kjede består av en tungkjede variabel region (forkortet heri som VH) og en tungkjede konstant region. Tungkjede konstant regionen består av tre domener, CH1, CH2 og CH3. Hver lette kjede består av en lettkjede variabel region (forkortet her som VL) og en lettkjede konstant region. Den lettkjede konstant regionen består av et domene, CL. VH og VL regioner kan ytterligere underoppdeles i regioner med hypervariasjon, navngitt komplementært bestemmende regioner (CDR), hvor det er spredd regioner som er mer konservert, navngitt rammeverk regioner (FR). Hver VH og VL består av tre CDRer og fire FRer, arrangert fra amino-terminus til karboksy-terminus i følgende rekkefølge: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. De variable regionene til tung og lettkjedene inneholder et bindingsdomene som reagerer innbyrdes med et antigen. Konstant regionene til antistoffene kan mediere bindingen av immunoglobulinet til vertsvev eller faktorer, som inkluderer forskjellige celler til immunsystemet (for eksempel effektorceller) og den første komponenten (Clq) til det klassiske komplement systemet.
Begrepet ”antigen-bindende del” til et antistoff (eller kort ”antistoff del”), slik det anvendes heri, refererer til et eller flere fragmenter til et antistoff som bibeholder evnen til spesifikt å binde til et antigen (for eksempel CXCR4). Det har blitt vist at antigenbindingsfunksjonen til et antistoff kan utføres av fragmenter til et full-lengde antistoff. Eksempler på bindingsfragmenter omfattet av begrepet ”antigen-bindende del” til et antistoff inkluderer (i) et Fab fragment, et monovalent fragment som består av VL, VH, CL og CH1 domenene; (ii) et F(ab')2 fragment, et bivalent fragment som innbefatter to Fab fragmenter bundet med en disulfid bro ved hengsel regionen; (iii) et Fab’ fragment, som i det vesentlige er et Fab fragment med del av hengsel regionen (se ”FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY” (Paul red., 3.sup.rd utg. 1993); (iv) et Fd fragment som består av VH og CH1 domenene; (v) et Fv fragment som består av VL og VH domenene til en enkel arm til et antistoff, (vi) et dAb fragment (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), som består av et VH domene; (vii) en isolert komplementært bestemmende region (CDR); og (viii) et nanostoff, en tungkjede variabel region som inneholder et enkelt variabel domene og to konstante domener. Videre, selv om de to domenene til Fv fragmentet, VL og VH, er kodet for av separate gener kan de bindes sammen, ved anvendelse av rekombinante fremgangsmåter, med en syntetisk bindingsgruppe som muliggjør at de blir fremstilt som en enkelt protein kjede hvori VL og VH regionene pares for å danne monovalente molekyler (kjent som enkelt kjede Fv (scFv); se for eksempel, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; og Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Slike enkelt kjede antistoffer er også tiltenkt å være omfattet av begrepet ”antigen-bindende del” av et antistoff. Disse antistoff fragmentene oppnås ved anvendelse av vanlige teknikker kjente for fagmannen og fragmentene screenes for anvendelse på samme måte som tilfellet er med intakte antistoffer.
Et ”isolert antistoff”, slik det anvendes heri, er tiltenkt å referere til et antistoff som er i det vesentlige uten andre antistoffer som har forskjellige antigene spesifisiteter (for eksempel et isolert antistoff som spesifikt binder CXCR4 er i det vesentlige fri for antistoffer som spesifikt binder antigener forskjellige fra CXCR4). Et isolert antistoff som spesifikt binder CXCR4 kan imidlertid ha kryss-reaktivitet til andre antigener, slik som CXCR4 molekyler fra andre arter. Videre kan et isolert antistoff være i det vesentlige fri for annet cellulært materiale og/eller kjemikalier.
Begrepene ”monoklonale antistoff” eller ”monoklonal antistoff sammensetning” slik det anvendes heri refererer til et preparat av antistoff molekyler av enkel molekylær sammensetning. En monoklonal antistoff sammensetning fremviser en enkel bindingsspesifisitet og affinitet for en bestemt epitop.
Begrepet ”humant antistoff”, slik det anvendes heri, er tiltenkt å inkludere antistoffer som har forskjellige regioner hvori både rammeverk og CDR regionene er avledet fra humane germlinje immunoglobulin sekvenser. Videre, hvis antistoffet inneholder en konstant region, er den konstante regionen også avledet fra humane germlinje immunoglobulin sekvenser. De humane antistoffene i følge foreliggende beskrivelse kan inkludere aminosyre residuer ikke kodet av humane germlinje immunoglobulin sekvenser (for eksempel mutasjoner introdusert ved randomisert eller sete-spesifikk mutagenese in vitro eller ved somatisk mutasjon in vivo). Imidlertid er begrepet ”humant antistoff”, slik det anvendes heri, ikke tiltenkt å inkludere antistoffer hvori CDR sekvenser avledet fra germlinjen til andre pattedyr arter, slik som mus, har blitt podet på humane rammeverk sekvenser.
Begrepet ”humant monoklonalt antistoff” refererer til antistoffer som fremviser en enkel bindingsspesifisitet, som har variable regioner hvori både rammerverk og CDR regionene er avledet fra humane germlinje immunoglobulin sekvenser. I en utførelsesform blir de humane monoklonale antistoffene produsert av en hybridom som inkluderer en B celle oppnådd fra et transgent ikkehumant dyr, for eksempel en transgen mus, som har et genom som innbefatter et humant tungkjede transgen og et lettkjede transgen sammensmeltet til en immortalisert celle.
Begrepet ”rekombinant humant antistoff”, slik det anvendes heri, inkluderer alle humane antistoffer som fremstilles, uttrykkes, dannes eller isoleres ved rekombinante metoder, slike som (a) antistoffer isolert fra et dyr (for eksempel en mus) som er transgen eller transkromosomal for humane immunoglobulin gener eller en hybridom fremstilt derfra (beskrevet videre nedenfor), (b) antistoffer isolert fra en vertscelle transformert til å uttrykke det humane antistoffet, for eksempel fra en transfektom, (c) antistoffer isolert fra et rekombinant, kombinatorisk humant antistoff bibliotek og (d) antistoffer fremstilt, uttrykt, dannet eller isolert ved en hvilken som helst annen metode som involverer spleising av humane immunoglobulin gen sekvenser til andre DNA sekvenser. Slike rekombinante humane antistoffer har variable regioner hvori rammeverk og CDR regionene er avledet fra humane germlinje immunoglobulin sekvenser. I visse utførelsesformer kan imidlertid slike rekombinante humane antistoffer gjøres til gjenstand for in vitro mutagenese (eller når et dyr transgent for humane Ig sekvenser anvendes, in vivo somatisk mutagenese) og således er aminosyresekvensene til VH og VL regionene til de rekombinante antistoffene sekvenser som, mens de er avledet fra og relatert til humane germlinje VH og VL sekvenser, ikke kan naturlig eksistere innenfor det humane antistoff germlinje repertoaret in vivo.
Slik det anvendes heri refererer ”isotyp” til antistoff klassen (for eksempel IgM eller IgGl) som er kodet av tungkjede konstant region genene.
Uttrykkene “et antistoff som gjenkjenner et antigen” og “et antistoff spesifikt for et antigen” anvendes innbyrdes utbyttbart heri med begrepet “et antistoff som binder spesifikt til et antigen”.
Begrepet “humane antistoff derivater” refererer til en hvilken som helst modifisert form av det humane antistoffet, for eksempel et konjugat av antistoffet og annet middel eller antistoff.
Begrepet “humanisert antistoff” er tiltenkt å referere til antistoffer hvori CDR sekvenser avledet fra germlinjen til en annen pattedyr art, slik som en mus, har blitt podet på de humane rammeverk sekvensene. Ytterligere rammeverk region modifikasjoner kan gjøres innenfor de humane rammeverk sekvensene.
Begrepet “kimerisk antistoff” er tiltenkt å referere til antistoffer hvori variabel region sekvensene er avledet fra en art og konstant region sekvensene er avledet fra en annen art, slik som et antistoff hvori variabel region sekvensene er avledet fra et muse antistoff og konstant region sekvensene er avledet fra et humant antistoff.
Slik det anvendes heri er et antistoff som “spesifikt binder til human CXCR4” tiltenkt å referere til et antistoff som binder til human CXCR4 (og eventuelt CXCR4 fra en eller flere ikke-humane arter), men som ikke vesentlig binder til ikke-CXCR4 proteiner. I visse utførelsesformer binder et antistoff i følge foreliggende beskrivelse spesifikt til human CXCR4 med ”SEQ ID NO: 51 eller en variant derav. Foretrukket binder antistoffet til human CXCR4 med en KD på 1 x 10<-7 >M eller mindre, mer foretrukket 5 x 10<-8 >M eller mindre, mer foretrukket 3 x 10<-8 >M eller mindre, mer foretrukket 1 x 10<-8 >M eller mindre, enda mer foretrukket 5 x 10<-9 >M eller mindre.
Uttrykket “binder ikke vesentlig” til et protein eller celler, slik det anvendes heri, betyr binder ikke eller binder ikke med høy affinitet til proteinet eller cellene, det vil si binder til proteinet eller cellene med en KD på 1 x 10<-6 >M eller mer, mer foretrukket 1 x 10<-5 >M eller mer, mer foretrukket 1 x 10<-4 >M eller mer, mer foretrukket 1 x 10<-3 >M eller mer, ennå mer foretrukket 1 x 10<-2 >M eller mer.
Uttrykket ”Kassos<” >eller “Ka<”>, slik det anvendes heri, er tiltenkt å referere til assosiasjonsgraden til en bestemt antistoff-antigen interaksjon, mens begrepet ”Kdis” eller “Kd”, slik det anvendes heri, er tiltenkt å referere til dissosiasjonsgraden til en bestemt antistoff-antigen interaksjon. Begrepet “KD”, slik det anvendes heri, er tiltenkt å referere til dissosiasjonskonstanten, som oppnås fra forholdet mellom Kd og Ka (det vil si Kd/Ka) og uttrykkes som en molar konsentrasjon (M). KD verdier for antistoffer kan bestemmes ved anvendelse av fremgangsmåter godt kjente i litteraturen. En foretrukket fremgangsmåte for å bestemme KD til et antistoff er ved anvendelse av overflate plasmon resonans, foretrukket ved anvendelse av et biosensor system slik som et Biacore® system.
Slik det anvendes heri refererer begrepet “høy affinitet” for et IgG antistoff til et antistoff som har en KD på 1 x 10<-7 >M eller mindre, mer foretrukket 5 x 10<-8 >M eller mindre, enda mer foretrukket 1 x 10<-8 >M eller mindre, enda mer foretrukket 5 x 10<-9 >M eller mindre og enda mer foretrukket 1 x 10<-9 >M eller mindre for et mål antigen.
Imidlertid kan “høy affinitet” binding variere for andre antistoff isotyper. For eksempel refererer “høy affinitet” binding for en IgM isotyp til et antistoff som har en KD på 10<-6 >M eller mindre, mer foretrukket 10<-7 >M eller mindre, enda mer foretrukket 10<-8 >M eller mindre.
Slik det anvendes heri inkluderer uttrykket ”subjekt” et hvilket som helst humant eller ikke humant dyr. Begrepet ”ikke humant dyr” inkluderer vertebrater, for eksempel pattedyr og ikke pattedyr, slike som ikke humane primater, sauer, hunder, katter, hester, kuer, kyllinger, amfibier, reptiler, etc.
Forskjellige aspekter ved foreliggende beskrivelse er beskrevet ytterligere i detalj i følgende underavsnitt.
Antistoffene i foreliggende beskrivelse er kjennetegnet ved særlige funksjonelle trekk eller egneskaper for antistoffene. For eksempel binder antistoffene til naturlig human CXCR4 uttrykt på en celle overflate. Foretrukket binder et antistoff i følge foreliggende beskrivelse til CXCR4 med høy affinitet, for eksempel med en KD på 1 x 10<-7 >M eller mindre. Anti-CXCR4 antistoffene i følge foreliggende beskrivelse fremviser foretrukket en eller flere av følgende karakteristikker:
(a) binder til naturlig human CXCR4 uttrykt på en celle overflate;
(b) inhiberer binding av SDF-1 til CXCR4;
(c) inhiberer SDF-1-indusert kalsium fluks i celler som uttrykker CXCR4;
(d) inhiberer SDF-1-indusert migrering av celler som uttrykker CXCR4;
(e) inhiberer kapillær rør dannelse av human umbilikal vene endotel celler;
(f) binder til human CXCR4 med en KD på 1 x 10<-7 >M eller mindre;
(g) induserer apoptose i celler som uttrykker CXCR4;
(h) inhiberer tumor celle proliferasjon in vitro;
(i) inhiberer tumor celle proliferasjon og/eller induserer tumor celle apoptose in vivo; (j) inhiberer metastaser til CXCR4<+ >tumor celler; og/eller
(k) øker overlevelsestid til et CXCR4<+ >tumor-bærende subjekt.
I visse utførelsesformer binder et antistoff i følge foreliggende beskrivelse til naturlig human CXCR4 på en celle overflate, men inhiberer ikke binding av SDF-1 til CXCR4 og inhiberer ikke SDF-1-indusert kalsium fluks i celler som uttrykker CXCR4 og inhiberer ikke SDF-1-indusert migrering av celler som uttrykker CXCR4. I andre utførelsesformer binder et antistoff i følge foreliggende beskrivelse til naturlig human CXCR4 på en celle overflate og inhiberer binding av SDF-1 til CXCR4 og inhiberer SDF-1-indusert kalsium fluks i celler som uttrykker CXCR4, men inhiberer ikke SDF-1-indusert migrering av celler som uttrykker CXCR4. I ytterligere andre utførelsesformer binder et antistoff i følge foreliggende beskrivelse til naturlig human CXCR4 på en celle overflate og inhiberer binding av SDF-1 til CXCR4 og inhiberer SDF-1-indusert kalsium fluks i celler som uttrykker CXCR4 og inhiberer SDF-1-indusert migrering av celler som uttrykker CXCR4. I ytterligere andre utførelsesformer binder et antistoff i følge foreliggende beskrivelse til naturlig human CXCR4 på en celle overflate, inhiberer binding av SDF-1 til CXCR4, inhiberer SDF-1-indusert kalsium fluks i celler som uttrykker CXCR4, inhiberer SDF-1-indusert migrering av celler som uttrykker CXCR4 og inhiberer kapillær rør dannelse av HuVECer.
Foretrukket binder et antistoff i følge foreliggende beskrivelse til human CXCR4 med en KD på 5 x 10<-8 >M eller mindre, binder til human CXCR4 med en KD på 2 x 10<-8 >M eller mindre, binder til human CXCR4 med en KD på 5 x 10<-9 >M eller mindre, binder til human CXCR4 med en KD på 4 x 10<-9 >M eller mindre, binder til human CXCR4 med en KD på 3 x 10<-9 >M eller mindre, eller binder til human CXCR4 med en KD på 2 x 10<-9 >M eller mindre.
Foretrukket inhiberer et antistoff binding av SDF-1 til human CXCR4 med en EC50 for inhibering på 50 nM eller mindre, mer foretrukket 30 nM eller mindre, eller 15 nM eller mindre, eller 10 nM eller mindre, eller 5 nM eller mindre, eller 3 nM eller mindre (for eksempel en EC50 for inhibering på 28.60 nM eller mindre, eller 12.51 nM eller mindre, eller 2.256 nM eller mindre).
Foretrukket inhiberer et antistoff i følge foreliggende beskrivelse SDF-1-indusert kalsium fluks i celler som uttrykker human CXCR4 med en EC50 for inhibering på 3 nM eller mindre, mer foretrukket 2 nM eller mindre, eller 1 nM eller mindre, eller 0.9 nM eller mindre, eller 0.8 nM eller mindre, eller 0.7 nM eller mindre, eller 0.6 nM eller mindre, eller 0.5 nM eller mindre, eller 0.4 nM eller mindre (for eksempel 0.9046 nM eller mindre, 0.5684 eller mindre, eller 0.3219 nM eller mindre).
Foretrukket inhiberer et antistoff i følge foreliggende beskrivelse SDF-1-indusert migrering av celler som uttrykker human CXCR4 med en EC50 for inhibering på 50 nM eller mindre, mer foretrukket 30 nM eller mindre, eller 20 nM eller mindre, eller 15 nM eller mindre (for eksempel 18.99 nM eller mindre, eller 12.44 eller mindre).
Standard undersøkelser for å evaluere bindingsevnen til antistoffene ovenfor naturlig human CXCR4 uttrykt på en celle overflate er kjent i litteraturen, som for eksempel inkluderer strømnings cytometri analyse ved anvendelse av en cellelinje som naturlig uttrykker naturlig CXCR4 eller som har blitt transfektert til å uttrykke naturlig CXCR4. Passende undersøkelser er beskrevet i detalj i eksemplene. En foretrukket cellelinje som uttrykker naturlig CXCR4 er CEM T cellelinjen. Egnede undersøkelser for å evaluere inhibering av binding av SDF-1, inhibering av SDF-1 indusert kalsium fluks, inhibering av SDF-1 indusert celle migrering, inhibering av kapillær rør dannelse av HuVECer, induksjon av apoptose i celler som uttrykker CXCR4 in vitro og/eller in vivo, inhibering av vekst av CXCR4<+ >tumor celler in vitro og/eller in vivo, og/eller inhibering av metastaser til CXCR4<+ >tumor celler er også beskrevet i detalj i eksemplene.
Bindingsaffiniteten til antistoffene kan også bestemmes ved standard fremgangsmåter, slik som med Scatchard analyse.
Foretrukne antistoffer i følge foreliggende beskrivelse er de humane monoklonale antistoffene F7, F9, D1 og E2, isolert og strukturelt karakterisert som beskrevet i Eksempel 1 og 2. VH aminosyresekvensene til F7, F9, D1 og E2 er vist i ”SEQ ID NO”: 25, 26, 27 og 28, respektivt. VL aminosyresekvensene til F7, F9, D1 og E2 er vist i ”SEQ ID NO”: 29, 30, 31 og 32, respektivt. I tillegg ble alternative former av F7, F9, D1 og E2, hvori visse rammeverk residuer ble substituert med et germlinje residue, dannet og blir referert til heri som F7GL, F9GL, D1GL og E2GL. VH aminosyresekvensene til F7GL, F9GL, D1GL og E2GL er vist i ”SEQ ID NO”: 41, 42, 43 og 44, respektivt. VL aminosyresekvensene til F7GL, F9GL, D1GL og E2GL er vist i ”SEQ ID NO”: 45, 46, 47 og 48, respektivt.
Gitt at hvert av disse antistoffene kan binde til CXCR4 kan VH og VL sekvensene “blandes og matches” for å danne andre anti-CXCR4 bindingsmolekyler i følge foreliggende beskrivelse. CXCR4 binding av slike “blandede og matchede” antistoffer kan testes ved anvendelse av bindingsundersøkelsene beskrevet ovenfor og i eksemplene (for eksempel strømnings cytometri med CEM celler). Foretrukket, når VH og VL kjeder blandes og matches, blir en VH sekvens fra en bestemt VH/VL paring erstattet med en strukturelt tilsvarende VH sekvens. På samme måte blir foretrukket en VL sekvens fra en bestemt VH/VL paring erstattet med en strukturelt tilsvarende VL sekvens.
Følgelig, i et aspekt, tilveiebringer foreliggende beskrivelse et isolert monoklonalt antistoff, eller antigen bindende del derav som innbefatter:
(a) en tungkjede variabel region som innbefatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen som består av ”SEQ ID NO”: 25-28 og 41-44; og
(b) en lettkjede variabel region som innbefatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen som består av ”SEQ ID NO”: 29-32 og 45-48;
hvori antistoffet spesifikt binder CXCR4, foretrukket human CXCR4.
Foretrukne tung og lettkjede kombinasjoner inkluderer:
(a) en tungkjede variabel region som innbefatter aminosyresekvensen ”SEQ ID NO”: 25 eller 41 og en lettkjede variabel region som innbefatter aminosyresekvensen ”SEQ ID NO”: 29 eller 45; eller
(b) en tungkjede variabel region som innbefatter aminosyresekvensen ”SEQ ID NO”: 26 eller 42 og en lettkjede variabel region som innbefatter aminosyresekvensen ”SEQ ID NO”: 30 eller 46; eller
(c) en tungkjede variabel region som innbefatter aminosyresekvensen ”SEQ ID NO”: 27 eller 43 og en lettkjede variabel region som innbefatter aminosyresekvensen ”SEQ ID NO”: 31 eller 47; eller
(d) en tungkjede variabel region som innbefatter aminosyresekvensen ”SEQ ID NO”: 28 eller 44 og en lettkjede variabel region som innbefatter aminosyresekvensen ”SEQ ID NO”: 32 eller 48.
I et annet aspekt tilveiebringer foreliggende beskrivelse antistoffer som innbefatter tungkjede og lettkjede CDR1er, CDR2er og CDR3er til F7, F9, D1 eller E2, eller kombinasjoner derav. Aminosyresekvensene til VH CDR1er til F7, F9, D1 og E2 er vist i ”SEQ ID NO”: 1-4, respektivt. Aminosyresekvensene til VH CDR2er til F7, F9, D1 og E2 er vist i ”SEQ ID NO”: 5-8, respektivt. Aminosyresekvensene til VH CDR3er til F7, F9, D1 og E2 er vist i ”SEQ ID NO”: 9-12, respektivt. Aminosyresekvensene til Vk CDR1er til F7, F9, D1 og E2 er vist i ”SEQ ID NO”: 13-16, respektivt.
Aminosyresekvensene til Vk CDR2er til F7, F9, D1 og E2 er vist i ”SEQ ID NO”: 17-20, respektivt. Aminosyresekvensene til Vk CDR3er til F7, F9, D1 og E2 er vist i ”SEQ ID NO”: 21-24, respektivt. CDR regionene er avtegnet ved anvendelse av Kabat systemet (Kabat, E. A., et al. (1991) ”Sequences of Proteins of Immunological Interest”, femte utg., U.S. Department of Health and Human Services, NIH publikasjonnr. 91-3242).
Gitt at hver av disse antistoffene kan binde til CXCR4 og at antigenbindingsspesifisiteten er tilveiebrakt primært av CDR1, CDR2 og CDR3 regionene kan VH CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene og Vk CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene “blandes og matches” (det vil si CDRene fra forskjellige antistoffer kan blandes og matches, selv om hvert antistoff må inneholde en VH CDR1, CDR2 og CDR3 og en Vk CDR1, CDR2 og CDR3) for å danne andre anti-CXCR4 bindingsmolekyler i følge foreliggende beskrivelse. CXCR4 binding til slike “blandede og matchede” antistoffer kan testes ved anvendelse av bindingsundersøkelsene beskrevet ovenfor og i eksemplene (for eksempel ELISAer, Biacore<® >analyse). Foretrukket, når VH CDR sekvenser blandes og matches blir CDR1, CDR2 og/eller CDR3 sekvensen fra en bestemt VH sekvens erstattet med en strukturelt tilsvarende CDR sekvens. På samme måte, når Vk CDR sekvenser blandes og matches blir CDR1, CDR2 og/eller CDR3 sekvensen fra en bestemt Vk sekvens foretrukket erstattet med en strukturelt tilsvarende CDR sekvens. Det vil være nærliggende for fagmannen at nye VH og VL sekvenser kan dannes ved å substituere en eller flere VH og/eller VL CDR region sekvenser med strukturelt tilsvarende sekvenser fra CDR sekvensene beskrevet heri for monoklonale antistoffer F7, F9, D1 og E2.
Følgelig, i et annet aspekt, tilveiebringer foreliggende beskrivelse et isolert monoklonalt antistoff eller antigen bindende del derav som innbefatter:
(a) en tungkjede variabel region CDR1 som innbefatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen som består av ”SEQ ID NO”: 1-4;
(b) en tungkjede variabel region CDR2 som innbefatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen som består av ”SEQ ID NO”: 5-8;
(c) en tungkjede variabel region CDR3 som innbefatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen som består av ”SEQ ID NO”: 9-12;
(d) en lettkjede variabel region CDR1 som innbefatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen som består av ”SEQ ID NO”: 13-16;
(e) en lettkjede variabel region CDR2 som innbefatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen som består av ”SEQ ID NO”: 17-20; og
(f) en lettkjede variabel region CDR3 som innbefatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen som består av ”SEQ ID NO”: 21-24;
hvori antistoffet spesifikt binder CXCR4, foretrukket human CXCR4.
I en foretrukket utførelsesform innbefatter antistoffet:
(a) en tungkjede variabel region CDR1 som innbefatter ”SEQ ID NO”: 1;
(b) en tungkjede variabel region CDR2 som innbefatter ”SEQ ID NO”: 5;
(c) en tungkjede variabel region CDR3 som innbefatter ”SEQ ID NO”: 9;
(d) en lettkjede variabel region CDR1 som innbefatter ”SEQ ID NO”: 13;
(e) en lettkjede variabel region CDR2 som innbefatter ”SEQ ID NO”: 17; og
(f) en lettkjede variabel region CDR3 som innbefatter ”SEQ ID NO”: 21.
I en annen foretrukket utførelsesform innbefatter antistoffet:
(a) en tungkjede variabel region CDR1 som innbefatter ”SEQ ID NO”: 2;
(b) en tungkjede variabel region CDR2 som innbefatter ”SEQ ID NO”: 6;
(c) en tungkjede variabel region CDR3 som innbefatter ”SEQ ID NO”: 10;
(d) en lettkjede variabel region CDR1 som innbefatter ”SEQ ID NO”: 14;
(e) en lettkjede variabel region CDR2 som innbefatter ”SEQ ID NO”: 18; og
(f) en lettkjede variabel region CDR3 som innbefatter ”SEQ ID NO”: 22.
I en annen foretrukket utførelsesform innbefatter antistoffet:
(a) en tungkjede variabel region CDR1 som innbefatter ”SEQ ID NO”: 3;
(b) en tungkjede variabel region CDR2 som innbefatter ”SEQ ID NO”: 7;
(c) en tungkjede variabel region CDR3 som innbefatter ”SEQ ID NO”: 11;
(d) en lettkjede variabel region CDR1 som innbefatter ”SEQ ID NO”: 15;
(e) en lettkjede variabel region CDR2 som innbefatter ”SEQ ID NO”: 19; og
(f) en lettkjede variabel region CDR3 som innbefatter ”SEQ ID NO”: 23.
I en annen foretrukket utførelsesform innbefatter antistoffet:
(a) en tungkjede variabel region CDR1 som innbefatter ”SEQ ID NO”: 4;
(b) en tungkjede variabel region CDR2 som innbefatter ”SEQ ID NO”: 8;
(c) en tungkjede variabel region CDR3 som innbefatter ”SEQ ID NO”: 12;
(d) en lettkjede variabel region CDR1 som innbefatter ”SEQ ID NO”: 16;
(e) en lettkjede variabel region CDR2 som innbefatter ”SEQ ID NO”: 20; og
(f) en lettkjede variabel region CDR3 som innbefatter ”SEQ ID NO”: 24.
Det er godt kjent i litteraturen at CDR3 domenet, uavhengig fra CDR1 og/eller CDR2 domenene, alene kan bestemme bindingsspesifisiteten til et antistoff for et kognat antigen og at multiple antistoffer kan predikerbart genereres som har samme bindingsspesifisitet basert på en felles CDR3 sekvens. Se for eksempel, Klimka et al., British J. of Cancer 83(2):252-260 (2000) (som beskriver produksjon av et humanisert anti-CD30 antistoff ved anvendelse kun av tungkjede variabel domenet CDR3 til murin anti-CD30 antistoff Ki-4); Beiboer et al., J. Mol. Biol.296:833-849 (2000) (som beskriver rekombinante epitel glykoprotein-2 (EGP-2) antistoffer ved anvendelse kun av tungkjede CDR3 sekvensen til det parenterale murin MOC-31 anti-EGP-2 antistoffet); Rader et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.95:8910-8915 (1998) (som beskriver et panel av humaniserte anti-integrin αvβ3 antistoffer ved anvendelse av et tung og lettkjede variabel CDR3 domene til et murin anti-integrin αvβ3 antistoff LM609 hvori hver antistoff medlem innbefatter en bestemt sekvens utenfor CDR3 domenet og i stand til å binde samme epitop som mor murine antistoffet med affiniteter så høye som eller høyere enn mor murin antistoffet); Barbas et al., J. Am. Chem. Soc.116:2161-2162 (1994) (som beskriver at CDR3 domenet tilveiebringer det mest signifikante bidraget til antigen binding); Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.92:2529-2533 (1995) (som beskriver poding av tungkjede CDR3 sekvenser til tre Faber (SI-1, SI-40, og SI-32) ovenfor human placental DNA på tungkjeden til en anti-tetanus toksoid Fab hvorved den eksisterende tungkjede CDR3 erstattes og som demonstrerer at CDR3 domenet gir bindingsspesifisitet); Ditzel et al., J. Immunol. 157:739-749 (1996) (som beskriver podingsstudier hvori overføring av kun tungkjede CDR3 til en mor polyspesifikk Fab LNA3 til en tungkjede til et monospesifikt IgG tetanus toksoid-bindende Fab p313 antistoff var tilstrekkelig til å bibeholde bindingsspesifisitet til mor Fab); Berezov et al., BIAjournal 8:Scientific Review 8 (2001) (som beskriver peptid mimetiske midler basert på CDR3 til et anti-HER2 monoklonalt antistoff; Igarashi et al., J. Biochem (Tokyo) 117:452-7 (1995) (som beskriver et 12 aminosyre syntetisk polypeptid som korresponderer til CDR3 domenet til et anti-fosfatidylserin antistoff); Bourgeois et al., J. Virol 72:807-10 (1998) (som viser at et enkelt peptid avledet fra tungkjede CDR3 domenet til et anti-respiratorisk syncytial virus (RSV) antistoff var i stand til å nøytralisere viruset in vitro); Levi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.90:4374-8 (1993) (som beskriver et peptid basert på tungkjede CDR3 domenet til et murin anti-HIV antistoff); Polymenis og Stoller, J. Immunol.152:5218-5329 (1994) (som beskriver muliggjøring av binding av et scFv ved poding av tungkjede CDR3 regionen til et Z-DNA-bindende antistoff) og Xu og Davis, Immunity 13:37-45 (2000) (som beskriver at diversitet ved tungkjede CDR3 er tilstrekkelig til å muliggjøre ellers identiske IgM molekyler til å skille mellom et antall hapten og protein antigener). Se også US patentnr.
6,951,646; 6,914,128; 6,090,382; 6,818,216; 6,156,313; 6,827,925; 5,833,943;
5,762,905 og 5,760,185, som beskriver patenterte antistoffer definert ved et enkelt CDR domene.
Følgelig tilveiebringer foreliggende beskrivelse monoklonale antistoffer som innbefatter et eller flere tung og/eller lettkjede CDR3 domener fra et antistoff avledet fra et humant eller ikke-humant dyr, hvori det monoklonale antistoffet er i stand til spesifikt å binde til CXCR4. Innenfor visse aspekter tilveiebringer foreliggende beskrivelse monoklonale antistoffer som innbefatter et eller flere tung og/eller lettkjede CDR3 domener fra et ikke-humant antistoff, slik som et muse eller rotte antistoff, hvori det monoklonale antistoffet er i stand til spesifikt å binde til CXCR4. Innenfor noen utførelsesformer er slike antistoffer i følge oppfinnelsen som innbefatter et eller flere tung og/eller lettkjede CDR3 domener fra et ikke-humant antistoff (a) i stand til å konkurrere for binding med; (b) bibeholde funksjonelle karakteristikker; (c) binde til den samme epitopen; og/eller (d) ha en tilsvarende bindingsaffinitet som det korresponderende parenterale ikkehumane antistoffet.
Innenfor andre aspekter tilveiebringer foreliggende beskrivelse monoklonale antistoffer som innbefatter et eller flere tung og/eller lettkjede CDR3 domener fra et humant antistoff, slik som for eksempel et humant antistoff oppnådd fra et ikke-humant dyr, hvori det humane antistoffet er i stand til spesifikt å binde til CXCR4. Innenfor andre aspekter tilveiebringer foreliggende beskrivelse monoklonale antistoffer som innbefatter et eller flere tung og/eller lettkjede CDR3 domener fra et første humant antistoff, slik som for eksempel et humant antistoff oppnådd fra et ikke-humant dyr, hvori det første humane antistoffet er i stand til spesifikt å binde til CXCR4 og hvori CDR3 domenet fra det første humane antistoffet erstatter et CDR3 domene i et humant antistoff som mangler bindingsspesifisitet for CXCR4 for å generere et andre humant antistoff som er i stand til spesifikt å binde til CXCR4. Innenfor noen utførelsesformer er slike antistoffer i følge oppfinnelsen som innbefatter et eller flere tung og/eller lettkjede CDR3 domener fra det første humane antistoffet (a) i stand til å konkurrere for binding med; (b) bibeholde de funksjonelle karakteristikkene; (c) binde til den samme epitopen; og/eller (d) ha en tilsvarende bindingsaffinitet som det korresponderende parenterale første humane antistoffet.
I visse utførelsesformer innbefatter et antistoff i følge foreliggende beskrivelse en tungkjede variabel region fra et spesielt germlinje tungkjede immunoglobulin gen og/eller en lettkjede variabel region fra et spesielt germlinje lettkjede immunoglobulin gen.
For eksempel, i en foretrukket utførelsesform, tilveiebringer foreliggende beskrivelse et isolert monoklonalt antistoff eller en antigen-bindende del derav, som innbefatter en tungkjede variabel region som er produktet av eller avledet fra et humant VH 3-48 gen, hvori antistoffet spesifikt binder CXCR4. I en annen foretrukket utførelsesform tilveiebringer foreliggende beskrivelse et isolert monoklonalt antistoff eller en antigenbindende del derav, som innbefatter en lettkjede variabel region som er produktet av eller avledet fra et humant VK L15 gen, hvori antistoffet spesifikt binder CXCR4. I en ytterligere annen foretrukket utførelsesform tilveiebringer foreliggende beskrivelse et isolert monoklonalt antistoff, eller antigen-bindende del derav, hvori antistoffet innbefatter en tungkjede variabel region som er produktet av eller avledet fra et humant VH 3-48 gen og innbefatter en lettkjede variabel region som er produktet av eller avledet fra et humant VK L15 gen , hvori antistoffet spesifikt binder til CXCR4, foretrukket humant CXCR4. Slike antistoffer kan også fremvise en eller flere av de funksjonelle karakteristikkene beskrevet i detalj ovenfor, slik som binding til naturlig CXCR4 uttrykt på en celle overflate, inhibering av SDF-1 binding til CXCR4, inhibering av SDF-1-indusert kalsium fluks i celler som uttrykker CXCR4, inhibering av SDF-1-indusert migrering av celler som uttrykker CXCR4, inhibering av kapillær rør dannelse av HuVECer, induksjon av apoptose i celler som uttrykker CXCR4 in vitro og/eller in vivo, inhibering av vekst av CXCR4<+ >tumor celler in vitro og/eller in vivo, og/eller inhibering av metastaser av CXCR4<+ >tumor celler.
Eksempler på antistoffer som har VH og VK omfattende VH 3-48 og VK L15, respektivt, er F7, F9, D1 og E2 antistoffene.
Slik det anvendes heri innbefatter et humant antistoff tung eller lettkjede variable regioner som er “produktet av” eller “avledet fra” en spesiell germlinje sekvens hvis de variable regionene til antistoffet oppnås fra et system som anvender humane germlinje immunoglobulin gener. Slike systemer inkluderer immunisering av en transgen mus som bærer humane immunoglobulin gener med antigenet av interesse eller screening avet humant immunoglobulin gen bibliotek fremvist på fag med antigenet av interesse. Et humant antistoff som er “produktet av” eller “avledet fra” en human germlinje immunoglobulin sekvens kan identifiseres som sådan ved sammenligning av aminosyresekvensen til det humane antistoffet med aminosyresekvensen til humane germlinje immunoglobuliner og velge den humane germlinje immunoglobulin sekvensen som er nærmes i sekvens (det vil si størst % identitet) med sekvensen til det humane antistoffet. Et humant antistoff som er “produktet av” eller “avledet fra” en spesiell human germlinje immunoglobulin sekvens kan inneholde aminosyre forskjeller sammenlignet med germlinje sekvensen, for eksempel på grunn av naturlig forekomne somatiske mutasjoner eller intensjonsmessig introduksjon av sete-rettet mutsjon.
Imidlertid er et valgt humant antistoff typisk minst 90% identisk i aminosyresekvens med en aminosyresekvens kodet av et humant germlinje immunoglobulin gen og inneholder aminosyre residuer som identifiserer det humane antistoffet som værende humant sammenlignet med germlinje immunoglobulin aminosyresekvensene til andre arter (for eksempel muse germlinje sekvenser). I visse tilfeller kan et humant antistoff være minst 95%, eller til og med minst 96%, 97%, 98% eller 99% identisk i aminosyresekvens med aminosyresekvensen kodet av germlinje immunoglobulin genet. Typisk vil et humant antistoff avledet fra en bestemt human germlinje sekvens fremvise ikke mer enn 10 aminosyre forskjeller fra aminosyresekvensen kodet av det humane germlinje immunoglobulin genet. I visse tilfeller kan det humane antistoffet fremvise ikke mer enn 5, eller til og med ikke mer enn 4, 3, 2 eller 1 aminosyre forskjeller fra aminosyresekvensen kodet av germlinje immunoglobulin genet.
I en ytterligere annen utførelsesform innbefatter et antistoff i følge foreliggende forbindelse tung og lettkjede variabel regioner som innbefatter aminosyresekvenser som er homologe med aminosyresekvensene til de foretrukne antistoffene beskrevet heri, og hvori antistoffene bibeholder de ønskede funksjonelle egenskapene til anti-CXCR4 antistoffene i følge foreliggende beskrivelse.
For eksempel tilveiebringer foreliggende beskrivelse et isolert monoklonalt antistoff, eller antigen bindende del derav, som innbefatter en tungkjede variabel region og en lettkjede variabel region, hvori:
(a) tungkjede variabel regionen innbefatter en aminosyresekvens som er minst 80% homolog med en aminosyresekvens valgt fra gruppen som består av ”SEQ ID NO”: 25-28 og 41-44;
(b) lettkjede variabel regionen innbefatter en aminosyresekvens som er minst 80% homolog med aminosyresekvensen valgt fra gruppen som består av ”SEQ ID NO”: 29-32 og 45-48;
(c) antistoffet binder til naturlig human CXCR4 uttrykt på en celle overflate.
I tillegg eller alternativt kan antistoffet fremvise en eller flere av følgende funksjonelle egneskaper: (i) binder til human CXCR4 med en KD på 1x10<-7 >M eller mindre; (ii) inhiberer SDF-1 binding til CXCR4; (iii) inhiberer SDF-1-indusert kalsium fluks i celler som uttrykker CXCR4; (iv) inhiberer SDF-1-indusert migrering av celler som uttrykker CXCR4; (v) inhiberer kapillær rør dannelse av HuVECer; (vi) induserer apoptose i celler som uttrykker CXCR4 in vitro og/eller in vivo; (vii) inhiberer vekst av CXCR4<+ >tumor celler in vitro og/eller in vivo; og/eller (viii) inhiberer metastaser av CXCR4<+ >tumor celler.
I forskjellige utførelsesformer kan antistoffet for eksempel være et humant antistoff, et humanisert antistoff eller et kimerisk antistoff.
I andre utførelsesformer kan VH og/eller VL aminosyresekvensene være 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% eller 99% homologe med sekvensene fremsatt ovenfor. Et antistoff som har VH og VL regioner som har høy (det vil si 80% eller større) homologi med VH og VL regionene til sekvensene fremsatt ovenfor kan oppnås ved mutagenese (for eksempel sete-rettet eller PCR-mediert mutagenese) av nukleinsyremolekyler som koder ”SEQ ID NO”: 25-32 eller 41-48, fulgt av testing av det kodede forandrede antistoffet for bibeholdt funksjon (det vil si funksjonene fremsatt ovenfor) ved anvendelse av de funksjonelle undersøkelsene beskrevet heri.
Slik det anvendes heri er prosent homologi mellom to aminosyresekvenser ekvivalente med prosent identitet mellom de to sekvensene. Prosent identitet mellom de to sekvensene er en funksjon av antallet identiske posisjoner som deles av sekvensene (det vil si % homologi = # av identiske posisjoner/total # av posisjoner x 100), som tar hensyn til antallet mellomrom og lengden av hvert mellomrom, som trenger å bli introdusert for optimal oppstilling av de to sekvensene. Sammenligningen av sekvensene og bestemmelse av prosent identitet mellom to sekvenser kan utføres ved anvendelse av en matematisk algoritme, slik det er beskrevet i de ikke-begrensende eksemplene nedenfor.
Prosent identitet mellom to aminosyresekvenser kan bestemmes ved anvendelse av algoritmen til E. Meyers og W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)) som har blitt inkorporert i ALIGN programmet (versjon 2.0), ved anvendelse av en PAM120 vekt residue tabell, en mellomrom lengde straff på 12 og mellomrom straff på 4. I tillegg kan prosent identitet mellom to aminosyresekvenser bestemmes ved anvendelse av Needleman og Wunsch (J. Mol. Biol.48:444-453 (1970)) algoritmen som har blitt inkorporert i GAP programmet i GCG software pakken (tilgjengelig ved http://www.gcg.com), ved anvendelse av enten en Blossum 62 matriks eller en PAM250 matriks, og en mellomrom vekt på 16, 14, 12, 10, 8, 6 eller 4 og en lengde vekt på 1, 2, 3, 4, 5 eller 6.
I tillegg eller alternativt, kan protein sekvenser i følge foreliggende beskrivelse ytterligere anvendes som en ”spørresekvensen” for å utføre et søk i offentlige databaser for for eksempel å identifisere relaterte sekvenser. Slike søk kan utføres ved anvendelse av XBLAST programmet (versjon 2.0) til Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol.215:403-10. BLAST protein søk kan utføres med XBLAST programmet, score = 50, ordlengde = 3 for å oppnå aminosyresekvenser homologe med antistoff molekylene i følge foreliggende beskrivelse. For å oppnå mellomroms oppstillinger for sammenligningsformål kan Gapped BLAST anvendes slik det er beskrevet i Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402. Ved anvendelse av BLAST og Gapped BLAST programmer er standard parametere for de respektive programmene (for eksempel XBLAST og NBLAST) anvendelige. Se www.ncbi.nlm.nih.gov.
I visse utførelsesformer innbefatter et antistoff i følge foreliggende oppfinnelse en tungkjede variabel region som innbefatter CDR1, CDR2 og CDR3 sekvenser og en lettkjede variabel region som innbefatter CDR1, CDR2 og CDR3 sekvenser, hvori en eller flere av disse CDR sekvensene innbefatter spesifikke aminosyresekvenser basert på de foretrukne antistoffene beskrevet heri (for eksempel F7, F9, D1 eller E2), eller konservative modifikasjoner derav, og hvori antistoffene bibeholder de ønskede funksjonelle egenskapene til anti-CXCR4 antistoffene i følge foreliggende beskrivelse. Slik det er kjent fra litteraturen kan visse konservative sekvens modifikasjoner gjøres som ikke fjerner antigen binding. Se for eksempel Brummell et al. (1993) Biochem 32:1180-8 (som beskriver mutasjonsanalyse i CDR3 tungkjede domenet til antistoffer spesifikke for Salmonella); de Wildt et al. (1997) Prot. Eng. 10:835-41 (som beskriver mutasjonsstudier i anti-UA1 antistoffer); Komissarov et al. (1997) J. Biol. Chem.
272:26864-26870 (som viser at mutasjoner i midten av HCDR3 fører enten til avskaffet eller redusert affinitet); Hall et al. (1992) J. Immunol.149:1605-12 (som beskriver at en enkel aminosyre forandring i CDR3 regionen avskaffer bindingsaktivitet); Kelley og O’Connell (1993) Biochem.32:6862-35 (som beskriver bidraget til Tyr residuer i antigen binding); Adib-Conquy et al. (1998) Int. Immunol.10:341-6 (som beskriver effekten av hydrofobisitet i binding) og Beers et al. (2000) Clin. Can. Res.6:2835-43 (som beskriver HCDR3 aminosyre mutanter). Følgelig tilveiebringer foreliggende beskrivelse et isolert monoklonalt antistoff, eller antigen bindende del derav, som innbefatter en tungkjede variabel region som innbefatter CDR1, CDR2 og CDR3 sekvenser og en lettkjede variabel region som innbefatter CDR1, CDR2 og CDR3 sekvenser, hvori:
(a) tungkjede variabel region CDR3 sekvensen innbefatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen som består av aminosyresekvensen ”SEQ ID NO”: 9-12, og konservative modifikasjoner derav;
(b) lettkjede variabel region CDR3 sekvensen som innbefatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen som består av aminosyresekvens ”SEQ ID NO”: 21-44, og konservative modifikasjoner derav; og
(c) antistoffet binder til naturlig human CXCR4 uttrykt på en celle overflate.
I tillegg eller alternativt kan antistoffet fremvise en eller flere av følgende funksjonelle egenskaper: (i) binder til human CXCR4 med en KD på 1 x 10<-7 >M eller mindre; (ii) inhiberer SDF-1 binding til CXCR4; (iii) inhiberer SDF-1-indusert kalsium fluks i celler som uttrykker CXCR4; (iv) inhiberer SDF-1-indusert migrering av celler som uttrykker CXCR4; (v) inhiberer kapillær rør dannelse av HuVECer; (vi) induserer apoptose i celler som uttrykker CXCR4 in vitro og/eller in vivo; (vii) inhiberer vekst av CXCR4<+ >tumor celler in vitro og/eller in vivo; og/eller (viii) inhiberer metastaser til CXCR4<+ >tumor celler.
I en foretrukket utførelsesform innbefatter tungkjede variabel region CDR2 sekvensen en aminosyresekvens valgt fra gruppen som består av aminosyresekvensen ”SEQ ID NO”: 5-8, og konservative modifikasjoner derav; og lettkjede variabel region CDR2 sekvensen innbefatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen som består av aminosyresekvensen ”SEQ ID NO”: 17-20, og konservative modifikasjoner derav. I en annen foretrukket utførelsesform innbefatter tungkjede variabel region CDR1 sekvensen en aminosyresekvens valgt fra gruppen som består av aminosyresekvensen ”SEQ ID NO”: 1-4, og konservative modifikasjoner derav; og lettkjede variabel region CDR1 sekvensen innbefatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen som består av aminosyresekvensen ”SEQ ID NO”: 13-16, og konservative modifikasjoner derav.
I forskjellige utførelsesformer kan antistoffet for eksempel være humane antistoffer, humaniserte antistoffer eller kimeriske antistoffer.
Slik det anvendes heri er begrepet “konservative sekvens modifikasjoner” tiltenkt å referere til aminosyre modifikasjoner som ikke signifikant påvirker eller forandrer bindingskarakteristikkene til antistoffet som inneholder aminosyresekvensen. Slike konservative modifikasjoner inkluderer aminosyre substitusjoner, addisjoner og delesjoner. Modifikasjoner kan introduseres inn i et antistoff i følge foreliggende beskrivelse ved standard teknikker kjente i litteraturen, slik som sete-rettet mutagenese og PCR-mediert mutagenese. Konservative aminosyre substitusjoner er noen hvori aminosyre residuet erstattes med et aminosyre residue som har en tilsvarende sidekjede. Familier av aminosyre residuer som har tilsvarende sidekjeder har blitt definert i litteraturen. Disse familiene inkluderer aminosyrer med basiske sidekjeder (for eksempel lysin, arginin, histidin), sure sidekjeder (for eksempel aspartamsyre, glutamsyre), ikke-ladede polare sidekjeder (for eksempel glysin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tyrosin, cystein, tryptofan), ikke-polare sidekjeder (for eksempel alanin, valin, leucin, isoleucin, prolin, fenylalanin, metionin), beta-forgrenede sidekjeder (for eksempel treonin, valin, isoleucin) og aromatiske sidekjeder (for eksempel tyrosin, fenylalanin, tryptofan, histidin). Således kan et eller flere aminosyre residuer innenfor CDR regionene til et antistoff i følge foreliggende beskrivelse erstattes med andre aminosyre residuer fra samme sidekjede familie og det forandrede antistoffet kan testes for bibeholdt funksjon (det vil si funksjonene fremsatt ovenfor) ved anvendelse av funksjonelle undersøkelser beskrevet heri.
I en annen utførelsesform tilveiebringer foreliggende beskrivelse antistoffer som binder til den samme epitopen på menneske CXCR4 som et hvilket som helst av de anti-CXCR4 monoklonale antistoffene i følge foreliggende beskrivelse (det vil si antistoffer som har evnen til å kryss-konkurrere for binding til CXCR4 med et hvilket som helst av de monoklonale antistoffene i følge foreliggende beskrivelse). I foretrukne utførelsesformer kan referanse antistoffet for kryss-konkurreringsstudier være det monoklonale antistoffet F7 (som har VH og VL sekvenser som vist i ”SEQ ID NO”: 25 og 29, respektivt), eller det monoklonale antistoffet F9 (som har VH og VL sekvenser som vist i ”SEQ ID NO”: 26 og 30, respektivt) eller det monoklonale antistoffet D1 (som har VH og VL sekvenser som vist i ”SEQ ID NO”: 27 og 31, respektivt) eller det monoklonale antistoffet E2 (som har VH og VL sekvenser som vist i ”SEQ ID NO”: 28 og 32, respektivt).
Slike kryss-konkurrerende antistoffer kan identifiseres basert på deres evne til å krysskonkurrere med F7, F9, D1 eller E2 i standard CXCR4 bindingsundersøkelser. For eksempel kan strømnings cytometri med CEM celler anvendes for å demonstrere krysskonkurrering med antistoffene i foreliggende beskrivelse, hvori referanse antistoffet er merket med FITC og evnen til et test antistoff til å inhibere bindingen til det FITC-merkede referanse antistoffet til CEM celler blir evaluert. Evnen til et test antistoff til å inhibere bindingen til for eksempel F7, F9, D1 eller E2 til human CXCR4 demonstrerer at test antistoffet kan konkurrere med F7, F9, D1 eller E2 for binding til human CXCR4 og således binde til den samme epitopen på human CXCR4 som F7, F9, D1 eller E2. I en foretrukket utførelsesform er antistoffet som binder til den samme epitopen på CXCR4 som F7, F9, D1 eller E2 et humant monoklonalt antistoff. Slike humane monoklonale antistoffer kan fremstilles og isoleres som beskrevet i eksemplene.
Et antistoff i følge foreliggende oppfinnelse kan ytterligere fremstilles ved anvendelse av et antistoff som har en eller flere av VH og/eller VL sekvensene beskrevet heri som utgangsmateriale for å modifisere et modifisert antistoff, hvilket modifiserte antistoff kan ha forandrede egenskaper i forhold til utgangs antistoffet. Et antistoff kan modifiseres ved å modifisere et eller flere residuer i en eller begge variable regioner (det vil si VH og/eller VL), for eksempel innenfor en eller flere CDR regioner og/eller innenfor en eller flere rammeverk regioner. I tillegg eller alternativt kan et antistoff modifiseres ved å modifisere residuer innenfor konstant regionene, for eksempel for å forandre effektor funksjonene til antistoffet.
I visse utførelsesformer kan CDR poding anvendes for å modifisere variable regioner til antistoffer. Antistoffer reagerer innbyrdes med mål antigener først og fremst gjennom aminosyre residuer som er lokalisert i de seks tung og lettkjede komplementært bestemmende regionene (CDRene). Av denne grunn er aminosyresekvensene innenfor CDRene mer forskjelligartede mellom individuelle antistoffer i forhold til sekvenser utenfor CDRene. På grunn av at CDR sekvenser er ansvarlig for de fleste antistoffantigen interaksjonene, er det mulig å uttrykke rekombinante antistoffer som etterligner egenskapene til spesifikke naturlige forekomne antistoffer ved å konstruere ekspresjonsvektorer som inkluderer CDR sekvenser fra det spesifikke naturlige forekomne antistoffet podet på rammeverk sekvenser fra et forskjellig antistoff med forskjellige egenskaper (se for eksempel Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. See. U.S.A.86:10029-10033; US patentnr. 5,225,539 til Winter, og US patentnr.
5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 og 6,180,370 til Queen et al.).
Følgelig angår en annen utførelsesform av foreliggende beskrivelse et isolert monoklonalt antistoff, eller antigen bindende del derav, som innbefatter en tungkjede variabel region som innbefatter CDR1, CDR2 og CDR3 sekvenser som innbefatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen som består av ”SEQ ID NO”: 1-4, ”SEQ ID NO”: 5-8, og ”SEQ ID NO”: 9-12, respektivt, og en lettkjede variabel region som innbefatter CDR1, CDR2 og CDR3 sekvenser som innbefatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen som består av ”SEQ ID NO”: 13-16, ”SEQ ID NO”: 17-20, og ”SEQ ID NO”: 21-24, respektivt. Således kan slike antistoffer som inneholder VH og VL CDR sekvensene til monoklonale antistoffer F7, F9, D1 eller E2 også inneholde forskjellige rammeverk sekvenser fra disse antistoffene.
Slike rammeverk sekvenser kan oppnås fra offentlige DNA databaser eller publiserte referanser som inkluderer germlinje antistoff gen sekvenser. For eksempel kan germlinje DNA sekvenser fra humane tung og lettkjede variabel region gener finnes i ”VBase” human germlinje sekvens databasen (tilgjengelig på internett ved www.mrccpe.cam.ac.uk/vbase), så vel som i Kabat, E. A., et al. (1991) ”Sequences of Proteins of Immunological Interest”, femte utg., U.S. Department of Health and Human Services, NIH publikasjonnr.91-3242; Tomlinson, I. M., et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol.227:776-798; og Cox, J. P. L. et al. (1994) "A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol.24:827-836; hvor innholdene av hver av disse er innbefattet fullt med referanse heri. Som et annet eksempel kan germlinje DNA sekvensene for humane tung og lettkjede variabel region gener finnes i Genbank databasen. For eksempel er følgende tungkjede germlinje sekvenser funnet i HCo7 HuMAb mus tilgjengelig i ledsagende Genbank aksesjonsnumre: 1-69 (NG_0010109, NT_024637 og BC070333), 3-33 (NG_0010109 og NT_024637) og 3-7 (NG_0010109 og NT_024637). Som et annet eksempel er følgende tungkjede germlinje sekvenser funnet i HCo12 HuMAb mus tilgjengelig i ledsagende Genbank aksesjonsnumre: 1-69 (NG_0010109, NT_024637 og BC070333), 5-51 (NG_0010109 og NT_024637), 4-34 (NG_0010109 og NT_024637), 3-30.3 (CAJ556644) og 3-23 (AJ406678). Som en ytterligere kilde for human tung og lettkjede germlinje sekvenser er databasen av humane immunoglobulin gener tilgjengelig fra IMGT (http://imgt.cines.fr).
Antistoff protein sekvenser sammenlignes mot en kompilert protein sekvens database ved anvendelse av en av sekvenslikhets søke fremgangsmåtene kalt ”the Gapped BLAST” (Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Research 25:3389-3402), som er godt kjent for fagmannen. BLAST er en heuristisk algoritme ved at en statistisk signifikant oppstilling mellom antistoff sekvensen og database sekvensen trolig inneholder høyscore segment par (HSP) av oppstilte ord. Segment par hvis score ikke kan forbedres ved ekstensjon eller trimming kallen en treff. Kort fortalt blir nukleotidsekvensene av VBASE opprinnelse (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase1/list2.php) translatert og regionen mellom og som inkluderer FR1 til og med FR3 rammeverk regionen bibeholdes. Database sekvensene har en gjennomsnittlig lengde på 98 residuer. Duplikat sekvenser som sammenfaller eksakt over hele lengden til proteinene fjernes. Et BLAST søk etter proteiner ved anvendelse av programmet blastp med standard parametere unntatt når det gjelder lav kompleksitet filtre, som skrus av, og substitusjonsmatriksen til BLOSUM62, filtrerer for topp 5 treff som gir sekvens sammenfall. Nukleotid sekvensene translateres i alle seks rammer og rammen uten stopp kodoner i det sammenfallende segmentet til database sekvensen ansees potensielt treff. Dette bekreftes i sin tur ved anvendelse av BLAST programmet tblastx, som translaterer antistoff sekvensen i alle seks rammer og sammenligner disse translasjonene med VBASE nukleotid sekvensene dynamisk translatert i alle seks rammer. Andre humane germlinje sekvens databaser, slik som den som er tilgjengelig fra IMGT (http://imgt.cines.fr), kan søke tilsvarende med VBASE som beskrevet ovenfor.
Identitetene er eksakte aminosyre likheter mellom antistoff sekvensen og protein databasen over hele sekvenslengden. Positivene (identiteter substitusjonslikhet) er ikke identisk, men aminosyre substitusjoner guidet av BLOSUM62 substitusjonsmatriksen. Hvis antistoff sekvensen tilsvarer to av database sekvensene med samme identitet vil treffet med samme positiver bestemmes til å være det tilsvarende sekvenstreffet.
Foretrukne rammeverk sekvenser for anvendelse i antistoffene i foreliggende beskrivelse er de som er strukturelt tilsvarende rammeverk sekvensene anvendt av valgte antistoffer i følge foreliggende beskrivelse, det vil si tilsvarende VH 3-48 rammeverk sekvensene (”SEQ ID NO”: 49) og/eller VK L15 rammeverk sekvensen (”SEQ ID NO”: 50) anvendt av foretrukne monoklonale antistoffer i følge foreliggende beskrivelse. VH CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene og VK CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene kan podes på rammeverk regioner som har den identiske sekvensen med den som finnes i germlinje immunoglobulin genet fra hvilket rammeverk sekvensen er avledet, eller CDR sekvensene kan podes på rammeverk regionene som inneholder en eller flere mutasjoner sammenlignet med germlinje sekvensene. For eksempel har det blitt funnet at i visse tilfeller er det fordelaktig å mutere residuer innenfor rammeverk regionene for å opprettholde eller øke antigen bindingsevnen til antistoffet (se for eksempel US patentnr.5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 og 6,180,370 til Queen et al.).
En annen type av variabel region modifikasjon er å mutere aminosyre residuer innenfor VH og/eller VK CDR1, CDR2 og/eller CDR3 regionene for derved å forbedre en eller flere bindingsegenskaper (for eksempel affinitet) til antistoffet av interesse. Sete-rettet mutagenese eller PCR-mediert mutagenese kan utføres for å introdusere mutasjoner og effekten på antistoff binding, eller andre funksjonelle egenskaper av interesse, kan evalueres i in vitro eller in vivo undersøkelser slik det er beskrevet heri og tilveiebrakt i eksemplene. Foretrukne konservative modifikasjoner (slik det er diskutert ovenfor) blir introdusert. Mutasjonene kan være aminosyre substitusjoner, addisjoner eller delesjoner, men er foretrukket substitusjoner. Videre blir typisk ikke mer enn en, to, tre, fire eller fem residuer innenfor en CDR region forandret.
Følgelig, i en annen utførelsesform, tilveiebringer foreliggende beskrivelse isolerte anti-CXCR4 monoklonale antistoffer, eller antigen bindende deler derav, som innbefatter en tungkjede variabel region som innbefatter: (a) en VH CDR1 region som innbefatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen som består av ”SEQ ID NO”: 1-4, eller en aminosyresekvens som har en, to, tre, fire eller fem aminosyre substitusjoner, delesjoner eller addisjoner sammenlignet med ”SEQ ID NO”: 1-4; (b) en VH CDR2 region som innbefatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen som består av ”SEQ ID NO”: 5-8, eller en aminosyresekvens som har en, to, tre, fire eller fem aminosyre substitusjoner, delesjoner eller addisjoner sammenlignet med ”SEQ ID NO”: 5-8; (c) en VH CDR3 region som innbefatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen som består av ”SEQ ID NO”: 9-12, eller en aminosyresekvens som har en, to, tre, fire eller fem aminosyre substitusjoner, delesjoner eller addisjoner sammenlignet med ”SEQ ID NO”: 9-12; (d) en VK CDR1 region som innbefatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen som består av ”SEQ ID NO”: 13-16, eller en aminosyresekvens som har en, to, tre, fire eller fem aminosyre substitusjoner, delesjoner eller addisjoner sammenlignet med ”SEQ ID NO”: 13-16; (e) en VK CDR2 region som innbefatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen som består av ”SEQ ID NO”: 17-20, eller en aminosyresekvens som har en, to, tre, fire eller fem aminosyre substitusjoner, delesjoner eller addisjoner sammenlignet med ”SEQ ID NO”: 17-20; og (f) en VK CDR3 region som innbefatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen som består av ”SEQ ID NO”: 21-24, eller en aminosyresekvens som har en, to, tre, fire eller fem aminosyre substitusjoner, delesjoner eller addisjoner sammenlignet med ”SEQ ID NO”: 21-24.
Modifiserte antistoffer i følge foreliggende beskrivelse inkluderer de hvori modifikasjoner har blitt gjort på rammeverk residuer innenfor VH og/eller VK, for eksempel for å forbedre egenskapene til antistoffet. Typisk blir slike rammeverk modifikasjoner gjort for å redusere immunogenisiteten til antistoffet. For eksempel er en tilnærming å “tilbakemutere” et eller flere rammeverk residuer til den korresponderende germlinje sekvensen. Mer spesifikt kan et antistoff som har gjennomgått somatisk mutasjon inneholde rammeverk residuer som er forskjellige fra germlinje sekvensen fra hvilken antistoffet er avledet. Slike residuer kan identifiseres ved å sammenligne antistoff rammeverk sekvensene med germlinje sekvensene fra hvilke antistoffet er avledet.
For eksempel, for F7 VH regionen, er følgende rammeverk region aminosyre posisjoner (ved anvendelse av Kabat nummereringssystemet) forskjellige fra germlinje: 1, 6 og 25. En, to eller alle tre av disse posisjonene kan tilbakemuteres til germlinje sekvenser ved å gjøre en, to eller alle tre av følgende substitusjoner: Q1E, Q6E og A25S. En foretrukket modifisert form av F7 VH regionen er F7GL VH (aminosyresekvensen som er vist i Figur 5A og i ”SEQ ID NO”: 41), som har følgende rammeverk substitusjoner: Q1E og Q6E.
Videre, for F7 Vk regionen, er følgende rammeverk region aminosyre posisjoner (ved anvendelse av Kabat nummereringssystemet) forskjellige fra germlinje: 1, 3 og 84. En, to eller alle tre av disse posisjonene kan tilbakemuteres til germlinje sekvenser ved å gjøre en, to eller alle tre av følgende substitusjoner: A1D, R3Q og V84A. En foretrukket modifisert form av F7 Vk regionen er F7GL Vk (aminosyresekvensen som er vist i Figur 5B og i ”SEQ ID NO”: 45), som har følgende rammeverk substitusjoner: A1D og R3Q.
Videre, for F9 VH regionen, er følgende rammeverk region aminosyre posisjoner (ved anvendelse av Kabat nummereringssystemet) forskjellige fra germlinje: 1, 6 og 25. En, to eller alle tre av disse posisjonene kan tilbakemuteres til germlinje sekvenser ved å gjøre en, to eller alle tre av følgende substitusjoner: Q1E, Q6E og A25S. En foretrukket modifisert form av F9 VH regionen er F9GL VH (aminosyresekvensen som er vist i Figur 6A og i ”SEQ ID NO”: 42), som har følgende rammeverk substitusjoner: Q1E og Q6E.
Videre, for F9 Vk regionen, er følgende rammeverk region aminosyre posisjoner (ved anvendelse av Kabat nummereringssystemet) forskjellige fra germlinje: 1, 3, 4 og 60. En, to, tre eller alle fire av disse posisjonene kan tilbakemuteres til germlinje sekvensene ved å gjøre en, to, tre eller alle fire av følgende substitusjoner: E1D, V3Q, L4M og P60S. En foretrukket modifisert form av F9 Vk regionen er F9GL Vk (aminosyresekvensen som er vist i Figur 6B og i ”SEQ ID NO”: 46), som har følgende rammeverk substitusjoner: E1D, V3Q og L4M.
Videre, for D1 VH regionen, er følgende rammeverk region aminosyre posisjoner (ved anvendelse av Kabat nummereringssystemet) forskjellige fra germlinje: 6, 25 og 76. En, to eller alle tre av disse posisjonene kan tilbakemuteres til germlinje sekvenser ved å gjøre en, to eller alle tre av følgende substitusjoner: Q6E, A25S og R76K. En foretrukket modifisert form av D1 VH regionen er D1GL VH (aminosyresekvensen som er vist i Figur 7A og i ”SEQ ID NO”: 43), som har følgende rammeverk substitusjon: Q6E.
Videre, for D1 Vk regionen, er følgende rammeverk region aminosyre posisjoner (ved anvendelse av Kabat nummereringssystemet) forskjellige fra germlinje: 1, 3, 4, 45 og 46. En, to, tre, fire eller alle fem av disse posisjonene kan tilbakemuteres til germlinje sekvenser ved å gjøre en, to, tre, fire eller alle fem av følgende substitusjoner: V1D, W3Q, V4M, E45K og L46S. En foretrukket modifisert form av D1 Vk regionen er D1GL Vk (aminosyresekvensen som er vist i Figur 7B og i ”SEQ ID NO”: 47), som har følgende rammeverk substitusjoner: V1D, W3Q og V4M.
Videre, for E2 VH regionen, er følgende rammeverk region aminosyre posisjoner (ved anvendelse av Kabat nummereringssystemet) forskjellige fra germlinje: 6 og 25. En eller begge av disse posisjonene kan tilbakemuteres til germlinje sekvenser ved å gjøre en eller begge av følgende substitusjoner: Q6E og A25S. En foretrukket modifisert form av E2 VH regionen er E2GL VH (aminosyresekvensen som er vist i Figur 8A og i ”SEQ ID NO”: 44), som har følgende rammeverk substitusjon: Q6E.
Videre, for E2 Vk regionen, er følgende rammeverk region aminosyre posisjoner (ved anvendelse av Kabat nummereringssystemet) forskjellige fra germlinje: 1, 3 og 4. En, to eller alle tre av disse posisjonene kan tilbakemuteres til germlinje sekvenser ved å gjøre en, to eller alle tre av følgende substitusjoner: E1D, V3Q og L4M. En foretrukket modifisert form av E2 Vk regionen er E2GL Vk (aminosyresekvensen som er vist i Figur 8B og i ”SEQ ID NO”: 48), som har følgende rammeverk substitusjoner: E1D, V3Q og L4M.
En annen type rammeverk modifikasjon involverer mutering av et eller flere residuer innenfor rammeverk regionen, eller til og med innenfor en eller flere CDR regioner, for å fjerne T celle epitoper for derved å redusere den potensielle immunogenisiteten til antistoffet. Denne tilnærmingen er også referert til som “deimmunisering” og er beskrevet ytterligere i detalj i US patent publikasjonsnr.20030153043 av Carr et al.
I tillegg til eller alternativt til modifikasjoner gjort inne i rammeverk eller CDR regionene kan antistoffer i følge foreliggende oppfinnelse modifiseres til å inkludere modifikasjoner innenfor Fc regionen, typisk for å forandre en eller flere funksjonelle egneskaper til antistoffet, slik som serum halveringstid, komplement fiksering, Fc reseptor binding og/eller antigen-avhengig cellulær cytotoksisitet. Videre kan et antistoff i følge foreliggende beskrivelse bli kjemisk modifisert (for eksempel en eller flere kjemiske bestanddeler kan bindes til antistoffet) eller modifisert for å forandre dets glykosylering, igjen for å forandre en eller flere funksjonelle egenskaper til antistoffet. Hver av disse utførelsesformene er beskrevet ytterligere i detalj nedenfor.
Nummereringen av residuene i Fc regionen er den til EU indeksen til Kabat.
I en utførelsesform blir hengsel regionen til CH1 modifisert slik at antallet cystein residuer i hengsel regionen forandres, for eksempel økes eller reduseres. Denne tilnærmingen er beskrevet ytterligere i US patentnr.5,677,425 av Bodmer et al.
Nummereringen av cystein residuer i hengsel regionen til CH1 forandres for eksempel for å lette etablering av lette og tunge kjeder eller for å øke eller redusere stabiliteten til antistoffet.
I en annen utførelsesform blir Fc hengsel regionen til et antistoff mutert til å redusere den biologiske halveringstiden til antistoffet. Mer spesifikt blir en eller flere aminosyre mutasjoner introdusert i CH2-CH3 domene grenseflate regionen til Fc-hengsel fragmentet slik at antistoffet har redusert Staphylococcyl protein A (SpA) binding relativ til naturlig Fc-hengsel domene SpA binding. Denne tilnærmingen er beskrevet ytterligere i detalj i US patentnr.6,165,745 av Ward et al.
I en annen utførelsesform blir antistoffet modifisert til å øke dets biologiske halveringstid. Forskjellige tilnærminger er mulige. For eksempel kan en eller flere av følgende mutasjoner introduseres: T252L, T254S, T256F, slik det er beskrevet i US patentnr. 6,277,375 til Ward. Alternativt kan, for å øke den biologiske halveringstiden, antistoffet forandres innenfor CH1 eller CL regionen til å inneholde en bergingsreseptor bindingsepitop tatt fra to looper til et CH2 domene til en Fc region til en IgG, slik det er beskrevet i US patentnr. 5,869,046 og 6,121,022 av Presta et al.
I ytterligere andre utførelsesformer blir Fc regionen forandret ved å erstatte minst et aminosyre residue med et forskjellig aminosyre residue for å forandre effektor funksjonene til antistoffet. For eksempel kan en eller flere aminosyrer valgt fra aminosyre residuene 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 og 322 erstattes med et forskjellig aminosyre residue slik at antistoffet har en forandret affinitet for en effektor ligand, men bibeholder antigen-bindingsevnen til mor antistoffet. Effektor liganden hvor affiniteten forandres kan for eksempel være en Fc reseptor eller C1 komponenten til komplementet. Denne tilnærmingen er beskrevet ytterligere i detalj i US patentnr. 5,624,821 og 5,648,260, begge av Winter et al.
I et annet eksempel kan en eller flere aminosyrer valgt fra aminosyre residuene 329, 331 og 322 erstattes med et forskjellig aminosyre residue slik at antistoffet har forandret C1q binding og/eller redusert eller avskaffet komplement avhengig cytotoksisitet (CDC). Denne tilnærmingen er beskrevet ytterligere i detalj i US patentnr.6,194,551 av Idusogie et al.
I et annet eksempel blir en eller flere aminosyre residuer innenfor aminosyre posisjonene 231 og 239 forandret for derved å forandre evnen til antistoffet til å fiksere komplement. Denne tilnærmingen er beskrevet ytterligere i PCT publikasjon WO 94/29351 av Bodmer et al.
I et ytterligere annet eksempel blir Fc regionen modifisert til å øke evnen til antistoffet til å mediere antistoff avhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC) og/eller for å øke affiniteten til antistoffet for en Fcγ reseptor ved å modifisere en eller flere aminosyrer ved følgende posisjoner: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 eller 439. Denne tilnærmingen er beskrevet ytterligere i PCT publikasjon WO 00/42072 av Presta. Videre har bindingssetene på human IgG1 for FcγR1, FcγRII, FcγRIII og FcRn blitt kartlagt og varianter med forbedret binding har blitt beskrevet (se Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem.276:6591-6604). Spesifikt ble mutasjoner ved posisjoner 256, 290, 298, 333, 334 og 339 vist å forbedre binding til FcγRIII. I tillegg ble følgende kombinasjonsmutasjoner vist å forbedre FcγRIII binding: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A og S298A/E333A/K334A.
I en ytterligere annen utførelsesform ble glykosylering av et antistoff modifisert. For eksempel kan et aglykosylert antistoff fremstilles (det vil si antistoffet mangler glykosylering). Glykosylering kan forandres for eksempel ved å øke affiniteten til antistoffet for antigen. Slike karbohydrat modifikasjoner kan for eksempel utføres ved å forandre et eller flere glykosyleringsseter inne i antistoff sekvensen. For eksempel kan en eller flere aminosyre substitusjoner gjøres som resulterer i eliminering av et eller flere variabel region rammeverk glykosyleringsseter for derved å eliminere glykosylering ved det setet. Slik aglykosylering kan øke affiniteten til antistoffet for antigenet. En slik tilnærming er beskrevet ytterligere i detalj i US patentnr.5,714,350 og 6,350,861 av Co et al.
I tillegg eller alternativt kan et antistoff fremstilles som har en forandret glykosyleringstype, slik som et hypofukosylert antistoff som har reduserte mengder av fukosyl residuer eller et antistoff som har økt todelte GlcNac strukturer. Slike forandrede glykosyleringsmønstre har blitt demonstrert å øke ADCC evnen til antistoffer. Slike karbohydrat modifikasjoner kan utføres for eksempel ved å uttrykke antistoffet i en vertscelle med forandret glykosyleringsmaskineri. Celler med forandret glykosyleringsmaskineri har blitt beskrevet i litteraturen og kan anvedes som vertsceller for å uttrykke rekombinante antistoffer i følge foreliggende beskrivelse for derved å produsere et antistoff med forandret glykosylering. For eksempel, cellelinjene Ms704, Ms705 og Ms709 mangler fukosyltransferase genet, FUT8 (alfa (1,6) fukosyltransferase), slik at antistoffer uttrykt i Ms704, Ms705 og Ms709 cellelinjene mangler fukose på deres karbohydrater. Ms704, Ms705 og Ms709 FUT8<-/- >cellelinjene ble dannet ved målrettet oppbryting av FUT8 genet i CHO/DG44 celler ved anvendelse av to erstatningsvektorer (se US patent publikasjon nr.20040110704 av Yamane et al. og Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22). Som et annet eksempel beskriver EP 1,176,195 av Hanai et al. en cellelinje med et funksjonelt ødelagt FUT8 gen, som koder en fukosyl transferase, slik at antistoffer uttrykt i en slik cellelinje fremviser hypofukosylering ved å redusere eller eliminere det alfa 1,6 bundet-relaterte enzymet. Hanai et al. beskriver også cellelinjer som har en lav enzym aktivitet for tilsetning av fukose til N-acetylglukosaminet som binder til Fc regionen til antistoffet eller ikke har enzym aktiviteten, for eksempel rotte myelom cellelinje YB2/0 (ATCC CRL 1662). PCT publikasjon WO 03/035835 av Presta beskriver en variant CHO cellelinje, Lec13 celler, som reduserer evnen til å binde fukose til Asn(297)-bundede karbohydrater, som også resulterer i hypofukosylering av antistoffene uttrykt i den vertscellen (se også Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem.277:26733-26740).
Antistoffer med en modifisert glykosyleringsprofil kan også fremstilles i kyllingegg, slik det er beskrevet i US patentsøknad nr. PCT/US06/05853. Alternativt kan antistoffer med en modifisert glykosyleringsprofil fremstilles i planteceller, slik som Lemna.
Fremgangsmåter for fremstilling av antistoffer i et plantesystem er beskrevet i US patentsøknad som korresponderer til Alston & Bird LLP fullmektig referansenr.
040989/314911, inngitt 11. august 2006. PCT publikasjon WO 99/54342 av Umana et al. beskriver cellelinjer modifisert til å uttrykke glykoprotein-modifiserende glykosyl transferaser (for eksempel beta(1,4)-N-acetylglukosaminyltransferase III (GnTIII)) slik at antistoffene uttrykt i de modifiserte cellelinjene fremviser økt todelte GlcNac strukturer som resulterer i økt ADCC aktivitet til antistoffene (se også Umana et al. (1999) Nat. Biotech.17:176-180). Alternativt kan fukose residuene til antistoffet spaltes av ved anvendelse av et fukosidase enzym. For eksempel fjerner fukosidase alfa-L-fukosidase fukosyl residuer fra antistoffer (Tarentino, A.L. et al. (1975) Biochem.
14:5516-23).
En annen modifikasjon av antistoffene heri som er omfattet av foreliggende beskrivelse er pegylering. Et antistoff kan bli pegylert for eksempel for å øke den biologiske (for eksempel serum) halveringstiden til antistoffet. For å pegylere et antistoff blir antistoffet, eller fragment derav, typisk omsatt med polyetylenglykol (PEG), slik som en reaktiv ester eller aldehyd derivat av PEG, under betingelser hvori en eller flere PEG grupper blir bundet til antistoffet eller antistoff fragmentet. Foretrukket blir pegylering utført via en acyleringsreaksjon eller en alkyleringsreaksjon med et reaktivt PEG molekyl (eller en analog reaktiv vannløselig polymer). Slik det anvendes heri er begrepet “polyetylenglykol” tiltenkt å omfatte en hvilken som helst av formene av PEG som har blitt anvendt for å derivatisere andre proteiner, slik som mono (C1-C10) alkoksy- eller aryloksy-polyetylenglykol eller polyetylenglykol-maleimid. I visse utførelsesformer er antistoffet som pegyleres et aglykosylert antistoff. Fremgangsmåter for pegylering av proteiner er kjent i litteraturen og kan anvendes på antistoffene i følge foreliggende beskrivelse. Se for eksempel EP 0154 316 av Nishimura et al. og EP 0 401 384 av Ishikawa et al.
Foreliggende oppfinnelse er ikke begrenset til tradisjonelle antistoffer og kan utøves ved anvendelse av antistoff fragmenter og antistoff mimetiske midler. Slik det er detaljert nedenfor har et bredt spekter av antistoff fragment og antistoff mimetiske teknologier nå blitt utviklet og er godt kjent i litteraturen. Mens et antall av disse teknologiene, slik som domene antistoffer, Nanostoffer og Unistiffer gjør anvendelse av fragmenter av, eller andre modifikasjoner av, tradisjonelle antistoff strukturer, er det også alternative teknologier, slik som Affistoffer, DARPins, Anticaliner, Avimerer og Versastoffer som anvender bindingstrukturer som, mens de etterligner tradisjonell antistoff binding, genereres fra og fungerer via bestemte mekanismer.
Domene antistoffer (dAbs) er den minste funksjonelle bindingsenheten til antistoffer, som korresponderer til de variable regionene til enten tung (VH) eller lett (VL) kjedene til humane antistoffer. Domene antistoffer har en molekylvekt på cirka 13 kDa.
Domantis har utviklet en serie av store og svært funksjonelle biblioteker med full human VH og VL dAbs (mer enn ti milliarder forskjellige sekvenser i hvert bibliotek), og anvender disse bibliotekene for å velge dAbs som er spesifikke for terapeutiske mål. Til forskjell fra mange vanlige antistoffer er domene antistoffer godt uttrykt i bakterielle, gjær og pattedyr cellesystemer. Ytterligere detaljer når det gjelder domene antistoffer og fremgangsmåter for fremstilling derav kan oppnås med referanse til US patent 6,291,158; 6,582,915; 6,593,081; 6,172,197; 6,696,245; US serie nr.
2004/0110941; Europeisk patentsøknad nr.1433846 og Europeisk patent 0368684 & 0616640; WO05/035572, WO04/101790, WO04/081026, WO04/058821, WO04/003019 og WO03/002609.
Nanostoffer er antistoff-avledede terapeutiske proteiner som inneholder de unike strukturelle og funksjonelle egenskapene til naturlig forekomne tungkjede antistoffer. Disse tungkjede antistoffene inneholder et enkelt variabelt domene (VHH) og to konstante domener (CH2 og CH3). Viktig her er at det klonede og isolerte VHH domenet er et perfekt stabilt polypeptid som er havn for full-lengde antigenbindingskapasiteten til det opprinnelige tungkjede antistoffet. Nanostoffer har en høy homologi med VH domenene til humane antistoffer og kan ytterligere humaniseres uten tap av aktivitet. Viktig her er at Nanostoffer har et lavt immunogent potensiale, som har blitt bekreftet i primat studier med Nanostoff ledeforbindelser.
Nanostoffer kombinerer fordelene med vanlige antistoffer med viktige trekk til små molekyl legemidler. På samme måte som vanlige antistoffer viser Nanostoffer høy mål spesifisitet, høy affinitet til deres mål og lav iboende toksisitet. Imidlertid, som små molekyl legemidler, kan de inhibere enzymer og lett nå reseptor kløfter. Videre er Nanostoffer ekstremt stabile, kan administreres ved metoder forskjellig fra injeksjon (se for eksempel WO 04/041867) og er enkle å fremstille. Andre fordeler med Nanostoffer inkluderer gjenkjenning av uvanlige eller gjemte epitoper som resultat av deres lille størrelse, binding til hulrom eller aktive seter til protein mål med høy affinitet og selektivitet på grunn av deres unike tredimensjonale, legemiddelformat fleksibilitet, målretting av halveringstid og enkle og raske legemiddel oppdagelse.
Nanostoffer kodes av enkelt gener og blir effektivt fremstilt i tilnærmet alle prokaryote og eukaryote verter for eksempel E. coli (se for eksempel US 6,765,087), mull (for eksempel Aspergillus eller Trichoderma) og gjær (for eksempel Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula eller Pichia) (se for eksempel US 6,838,254).
Fremstillingsprosessen er skalerbar og multi-kilogram mengder av Nanostoffer har blitt fremstilt. På grunn av at Nanostoffer fremviser en overlegen stabilitet sammenlignet med vanlige antistoffer kan de formuleres som en langtidsholdbar, ferdig-tilanvendelse-løsning.
Nanoklone fremgangsmåten (se for eksempel WO 06/079372), er en proprietær fremgangsmåte for å generere Nanostoffer ovenfor et ønsket mål, basert på automatisert høy-gjennomstrømnings seleksjon av B-celler og kan anvendes i sammenheng med foreliggende oppfinnelse.
Unistoffer er en annen antistoff fragment teknologi, imidlertid er denne basert på fjerning av hengsel regionen til IgG4 antistoffer. Delesjon av hengsel regionen resulterer i et molekyl som er tilnærmet halve størrelsen av tradisjonelle IgG4 antistoffer og har en univalent bindingsregion snarere enn den bivalente bindingsregionen til IgG4 antistoffer. Det er godt kjent at IgG4 antistoffer er inerte og således ikke kan reagere innbyrdes med immunsystemet, som kan være fordelaktig for behandling av sykdommer hvor en immunrespons ikke er ønskelig, og denne fordelen bringes videre til Unistoffer. For eksempel kan Unistoffer fungere med å inhibere eller gjøre stille, men ikke avlive, celler til hvilke de er bundet. I tillegg stimulerer Unistoff binding til kreftceller ikke at de prolifererer. Videre, på grunn av at Unistoffer er cirka halve størrelsen av tradisjonelle IgG4 antistoffer, kan de vise bedre fordeling over større faste tumorer med potensiell fordelaktig effekt. Unistoffer klareres fra kroppen ved en tilsvarende hastighet som hele IgG4 antistoffer og er i stand til å binde med tilsvarende affinitet for deres antigener som hele antistoffer. Ytterligere detaljer når det gjelder Unistoffer kan oppnås med referanse til patent WO2007/059782.
Affistoff molekyler representerer en ny klasse av affinitetsproteiner basert på et 58-aminosyre residue protein domene, avledet fra IgG-bindingsdomenene til staphylococcal protein A. Dette tre heliks bunt domenet har blitt anvendt som er skjellett for konstruksjon av kombinatoriske fagemid biblioteker, fra hvilke Affistoff varianter som målrettes mot de ønskede molekylene kan velges ved anvendelse av fag display teknologi (Nord K, Gunneriusson E, Ringdahl J, Stahl S, Uhlen M, Nygren PA, ”Binding proteins selected from combinatorial libraries of an α-helical bacterial receptor domain”, Nat Biotechnol 1997;15:772-7. Ronmark J, Gronlund H, Uhlen M, Nygren PA, ”Human immunoglobulin A (IgA)-specific ligands from combinatorial engineering of protein A”, Eur J Biochem 2002;269:2647-55). Den enkle robuste strukturen til Affistoff molekyler i kombinasjon med deres lave molekylvekt (6 kDa), gjør dem egnet for et bredt spekter av applikasjoner, for eksempel som deteksjonsreagenser (Ronmark J, Hansson M, Nguyen T, et al, “Construction and characterization of affibody-Fc chimeras produced in Escherichia coli”, J Immunol Methods 2002;261:199-211) og for å inhibere reseptor interaksjoner (Sandstorm K, Xu Z, Forsberg G, Nygren PA, “Inhibition of the CD28-CD80 co-stimulation signal by a CD28-binding Affibody ligand developed by combinatorial protein engineering”, Protein Eng 2003;16:691-7). Ytterligere detaljer når det gjelder Affistoffer og fremgangsmåter for fremstilling derav kan oppnås med referanse til US patentnr.5831012, som er innbefattet heri med referanse i sin helhet.
Merkede Affistoffer kan også anvendes i avbildingsapplikasjoner for å bestemme forekomst av isoformer.
DARPins (designet ankyrin repeterende proteiner) er et eksempel på en antistoff mimetisk DRP (designet repeterende protein) teknologi som har blitt utviklet for å utforske bindingsevner til ikke-antistoff polypeptider. Repeterende proteiner slik som ankyrin eller leucin-rike repeterende proteiner er allestedsnærværende bindingsmolekyler som forekommer, til forskjell fra antistoffer, intra- og ekstracellulært. Deres unike modulære arkitektur med repeterende strukturelle enheter (repeteringer), som stables sammen for å danne forlengede repeterende domener fremviser variable og modulære målbindingsoverflater. Basert på deres modulerbarhet kan kombinasjonsbiblioteker av polypeptider med svært diversifiserte bindingsspesifisiteter genereres. Denne strategien inkluderer konsensus design av selvkompatible repeteringer som fremviser variabel overflate residuer og deres randomiserte oppstilling i repeterende domener.
DARPins kan fremstilles i bakterielle ekspresjonssystemer i svært høye utbytter og de tilhører de mest stabile proteinene som er kjent. Høy spesifisitet, høy affinitet DARPins til et bredt spekter av mål proteiner, som inkluderer human reseptorer, cytokiner, kinaser, humane proteaser, viruser og membran proteiner, har blitt valgt. DARPins som har affiniteter i ensiffer nanomolar til pikomolar området kan oppnås.
DARPins har blitt anvendt innenfor et bredt spekter av applikasjoner, som inkluderer ELISA, sandwich ELISA, strømnings cytometrisk analyse (FACS), immunohistokjemi (IHC), chip applikasjoner, affinitetsrensing eller Western blotting. DARPins har også vist seg å være svært aktiv i den intracellulære delen for eksempel som intracellulære markørproteiner sammensmeltet til grønn fluorescens protein (GFP). DARPins ble ytterligere anvendt for å inhibere viral inntreden med IC50 i pM området. DARPins er ikke bare ideelle for å blokkere protein-protein interaksjoner, men inhiberer også enzymer. Proteaser, kinaser og transportere har blitt vellykket inhibert, oftest en allosterisk inhiberingsmodus. Svært raske og spesifikke anrikninger av tumorene og svært fordelaktige tumor til blod forhold gjør DARPins godt egnet for in vivo diagnostiske eller terapeutiske tilnærminger.
Ytterligere informasjon med hensyn til DARPins og andre DRP teknologier kan finnes i US patentsøknad publikasjonnr.2004/0132028 og Internasjonal patentsøknad publikasjonnr. WO 02/20565.
Anticaliner er en ytterligere antistoff mimetisk teknologi, imidlertid i dette tilfellet er bindingsspesifisiteten avledet fra lipocaliner, en familie av lav molekylvekt proteiner som er naturlig og omfattende uttrykt i humane vev og kroppsfluider. Lipocaliner har utviklet seg til å utføre et antall funksjoner in vivo assosiert med den fysiologiske transporten og lagringen av kjemisk sensitive eller uløselige forbindelser. Lipocaliner har en robust iboende struktur som innbefatter en svært konservert ß-sylinder som støtter fire looper ved en terminus til proteinet. Disse loopene danner inngangen til en bindingslomme og konformasjonsmessige forskjeller i denne delen av molekylet sørger for variasjonen i bindingsspesifisitet mellom individuelle lipocaliner.
Mens den totale strukturen til hypervariable looper støttet av et konservert ß-ark rammeverk minner om immunoglobuliner er lipocaliner betydelig forskjellige fra antistoffer når det gjelder størrelse, hvor de består av en enkel polypeptid kjede med 160-180 aminosyrer som er marginalt større enn et enkelt immunoglobulin domene.
Lipocaliner klones og deres looper gjøres til gjenstand for modifikasjon for å danne Anticaliner. Biblioteker over strukturelt forskjellige Anticaliner har blitt generert og Anticalin display muliggjør seleksjon og screening av bindingsfunksjon, fulgt av ekspresjon og produksjon av løselig protein for ytterligere analyse i prokaryote eller eukaryote systemer. Studier har vellykket demonstrert at Anticaliner kan utvikles som er spesifikke for i virkeligheten et hvilket som helst humant mål protein som kan isoleres og bindingsaffiniteter i det nanomolare eller høyere området kan oppnås.
Anticaliner kan også formateres som dual målrettende proteiner, såkalte Duocaliner. Et Duocalin binder to separate terapeutiske mål i et enkeltprodusert monomerisk protein ved anvendelse av standard fremstillingsprosesser mens mål spesifisiteten og affiniteten bibeholdes uansett den strukturelle orienteringen til deres to bindingsdomener.
Modulering av multiple mål gjennom et enkelt molekyl er særlig fordelaktig i sykdommer kjent for å involvere mer enn en enkel årsaksfaktor. Videre har bi- eller multivalente bindingsformater slik som Duocaliner signifikant potensiale i å målrette celle overflate molekyler i sykdom, som medierer agonistiske effekter på signal transduksjons reaksjonsveier eller induserer økte internaliseringseffekter via binding og kløstring av celle overflate reseptorer. Videre er den høye iboende stabiliteten til Duocaliner sammenlignbar med monomeriske Anticaliner, som gir fleksibel formulering og leveringspotensiale for Duocaliner.
Ytterligere informasjon med hensyn til Anticaliner kan finnes i US patent nr.7,250,297 og Internasjonal patentsøknad publikasjonnr. WO 99/16873, hvor begge disse er innbefattet heri med referanse i sin helhet.
En annen antistoff mimetisk teknologi anvendelig i sammenheng med foreliggende oppfinnelse er Avimerer. Avimerer utvikles fra en stor familie av humane ekstracellulære reseptor domener ved in vitro exon shuffling og fag display, som genererer multidomene proteiner med bindings- og inhiberingsegenskaper. Binding av multiple uavhengige bindingsdomener har vist seg å danne aviditet og resulterer i økt affinitet og spesifisitet sammenlignet med vanlige enkel-epitop bindingsproteiner. Andre potensielle fordeler inkluderer enkel og effektiv produksjon av multimålspesifikke molekyler i Escherichia coli, forbedret termostabilitet og resistens ovenfor proteaser. Avimerer med under-nanomolare affiniteter har blitt oppnådd ovenfor et antall mål.
Ytterligere informasjon med hensyn til Avimerer kan finnes i US patentsøknad publikasjonnr. 2006/0286603, 2006/0234299, 2006/0223114, 2006/0177831, 2006/0008844, 2005/0221384, 2005/0164301, 2005/0089932, 2005/0053973, 2005/0048512, 2004/0175756
Versastoffer er en annen antistoff mimetisk teknologi som kan anvendes i sammenheng med foreliggende oppfinnelse. Versastoffer er små proteiner på 3-5 kDa med >15% cysteiner, som danner et høy disulfid tetthet skjellett, som erstatter den hydrofobe kjernen som typisk proteiner har. Erstatningen av et stort antall hydrofobe aminosyrer, som innbefatter den hydrofobe kjernen, med et lite antall disulfider resulterer i et protein som er mindre, mer hydrofilt (mindre aggregering og ikke-spesifikk binding), mer resistent ovenfor proteaser og varme, og har en lavere tetthet av T-celle epitoper, på grunn av at residuene som bidrar mest til MHC presentasjon er hydrofobe. Alle fire av disse egenskapene er godt kjent for å påvirke immunogenisitet, og sammen forventes de å forårsake en stor reduksjon i immunogenisitet.
Inspirasjonen for Versastoffer kommer fra de naturlig injiserbare biofarmasøytiske midlene produsert av igler, slanger, edderkopper, skorpioner, snegler og anemoner, som er kjent for å fremvise uventet lav immunogenisitet. Med utgangspunkt i valgte naturlige protein familier, ved design og ved screening blir størrelse, hydrofobisitet, proteolytisk antigen prosessering og epitop tetthet minimalisert til nivåer langt under gjennomsnittet for naturlige injiserbare proteiner.
Gitt strukturen til Versastoffer gir disse antistoff mimetiske midlene et allsidig format som inkluderer multi-valens, multi-spesifisitet, omfattende halveringstid mekanismer, vevs målrettende moduler og fravær av antistoff Fc regionen. Videre blir Versastoffene fremstilt i E. coli ved høye utbytter og på grunn av deres hydrofobisitet og lille størrelse er Versastoffer svært løselige og kan formuleres til høye konsentrasjoner. Versastoffer er eksepsjonelt varmestabile (de kan kokes) og gir utvidet lagringstid.
Ytterligere informasjon med hensyn til Versastoffer kan finnes i US patentsøknad publikasjonnr. 2007/0191272.
Den detaljerte beskrivelsen av antistoff fragment og antistoff mimetiske teknologier tilveiebrakt ovenfor er ikke tiltenkt å være en uttømmende liste over alle teknologier som kan anvendes i sammenheng med foreliggende beskrivelse. For eksempel kan et antall ytterligere teknologier som inkluderer alternative polypeptid-baserte teknologier, slike som fusjoner av komplimentært bestemmende regioner som angitt i Qui et al., Nature Biotechnology, 25(8) 921-929 (2007), så vel som nukleinsyre-baserte teknologier, slik som RNA aptamer teknologier beskrevet i US patent nr.5,789,157, 5,864,026, 5,712,375, 5,763,566, 6,013,443, 6,376,474, 6,613,526, 6,114,120, 6,261,774 og 6,387,620.
Antistoffene i følge foreliggende beskrivelse kan ytterligere karakterisers ved de forskjellige fysiske egenskapene til anti-CXCR4 antistoffene. Forskjellige undersøkelser kan anvendes for å detektere og/eller differensiere forskjellige klasser av antistoffer basert på deres fysiske egenskaper.
I noen utførelsesformer kan antistoffer i følge foreliggende beskrivelse inneholde et eller flere glykosyleringsseter i enten lett eller tungkjede variabel regionen.
Tilstedeværelsen av et eller flere glykosyleringsseter i den variable regionen kan resultere i økt immunogenisitet til antistoffet eller en forandring av pK til antistoffet på grunn av forandret antigen binding (Marshall et al (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala FA og Morrison SL (2004) J Immunol 172:5489-94; Wallick et al (1988) J Exp Med 168:1099-109; Spiro RG (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al (1985) Nature 316:452-7; Mimura et al. (2000) Mol Immunol 37:697-706).
Glykosylering er kjent for å forekomme ved motiver som inneholder en N-X-S/T sekvensen. Variabel region glykosylering kan testes ved anvendelse av en Glycoblot undersøkelse, som spalter antistoffet for å produsere en Fab, og deretter tester for glykosylering ved anvendelse av en undersøkelse som måler perjodat oksidasjon og Schiff base dannelse. Alternativt kan variabel region glykosylering testes ved anvendelse av Dionex lett kromatografi (Dionex-LC), som spalter sakkarider fra et Fab til monosakkarider og analyserer det individuelle sakkarid innholdet. I noen tilfeller er det foretrukket å ha et anti-CXCR4 antistoff som ikke inneholder variabel region glykosylering. Dette kan oppnås enten ved å velge antistoffer som ikke inneholder glykosyleringsmotivet i den variable regionen eller ved å mutere residuer inne i glykosyleringsmotivet ved anvendelse av standard teknikker godt kjente i litteraturen.
I en foretrukket utførelsesform inneholder antistoffene i følge foreliggende beskrivelse ikke asparaginase isomerisme seter. En deamiderings eller isoaspartamsyre effekt kan forekomme på N-G eller D-G sekvensene, respektivt. Deamidering eller isoaspartamsyre effekten resulterer i dannelse av isoaspartamsyre som reduserer stabiliteten til et antistoff ved å danne en floket struktur vekk fra en sidekjede karboksy terminus snarere enn hovedkjeden. Dannelse av isoaspartamsyre kan måles ved anvendelse av en iso-quant undersøkelse, som anvender en omvendt-fase HPLC for å teste for isoaspartamsyre.
Hvert antistoff vil ha et unikt isoelektrisk punkt (pI), men generelt vil antistoffer falle innenfor pH området fra 6 til 9.5. pI for et IgG1 antistoff faller typisk innenfor pH området 7-9.5 og pI for et IgG4 antistoff faller typisk innenfor pH området 6-8.
Antistoffer kan ha en pI som er utenfor dette området. Selv om effektene generelt er ukjente spekuleres det at antistoffer med en pI utenfor det normale området kan ha noe utfolding og instabilitet under in vivo betingelser. Det isoelektriske punktet kan testes ved anvendelse av en kapillær isoelektrisk fokuserende undersøkelse, som danner en pH gradient og kan anvende laser fokusering for økt nøyaktighet (Janini et al (2002) Electrophoresis 23:1605-11; Ma et al. (2001) Chromatographia 53:S75-89; Hunt et al (1998) J Chromatogr A 800:355-67). I noen tilfeller er det foretrukket å ha et antiCXCR4 antistoff som inneholder en pI verdi som faller i det normale området. Dette kan oppnås enten ved å velge antistoffer med en pI i det normale området eller ved mutasjon av ladede overflate residuer ved anvendelse av standard teknikker kjente i litteraturen.
Hver antistoff vil ha en smeltetemperatur som er indikativ for termisk stabilitet (Krishnamurthy R og Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71). En høyere termisk stabilitet indikerer større total antistoff stabilitet in vivo. Smeltepunktet til et antistoff kan måles ved anvendelse av teknikker slik som differensiell scanning kalorimetri (Chen et al (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando et al (1999) Immunol Lett 68:47-52). TM1 indikerer temperaturen til den initielle utfoldingen av antistoffet. TM2 indikerer temperaturen for fullstendig utfolding av antistoffet. Generelt er det foretrukket at TM1 til et antistoff i følge foreliggende beskrivelse er større enn 60ºC, foretrukket større enn 65ºC, enda mer foretrukket større enn 70ºC. Alternativt kan den termiske stabiliteten til et antistoff måles ved anvendelse av sirkulær dikroisme (Murray et al. (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9).
I en foretrukket utførelsesform er antistoffene valgt slik at de ikke raskt brytes ned. Fragmentering av et anti-CXCR4 antistoff kan måles ved anvendelse av kapillær elektroforese (CE) og MALDI-MS, slik det er kjent i litteraturen (Alexander AJ og Hughes DE (1995) Anal Chem 67:3626-32).
I en annen foretrukket utførelsesform er antistoffene valgt som har minimale aggregeringseffekter. Aggregering kan føre til trigging av uønsket immunrespons og/eller forandrede eller ikke fordelaktige farmakokinetiske egenskaper. Generelt er antistoffene akseptable med aggregering på 25% eller mindre, foretrukket 20% eller mindre, enda mer foretrukket 15% eller mindre, enda mer foretrukket 10% eller mindre og enda mer foretrukket 5% eller mindre. Aggregering kan måles ved flere teknikker godt kjent i litteraturen, som inkluderer størrelses-eksklusjonskolonne (SEC) høyytelses væske kromatografi (HPLC) og lysspredning for å identifisere monomerer, dimerer, trimerer eller multimerer.
Slik det er diskutert ovenfor kan anti-CXCR4 antistoffene som har VH og VK sekvenser beskrevet heri anvendes for å danne nye anti-CXCR4 antistoffer ved å modifisere VH og/eller VK sekvensene, eller de konstante regionene bundet dertil. Således, i et annet aspekt av foreliggende beskrivelse, blir strukturtrekkene til et anti-CXCR4 antistoff i følge foreliggende beskrivelse, for eksempel F7, F9, D1 eller E2, anvendt for å danne strukturelt relaterte anti-CXCR4 antistoffer som bibeholder minst en funksjonell egenskap til antistoffene i følge foreliggende beskrivelse, slik som binding til human CXCR4. For eksempel kan en eller flere CDR regioner til F7, F9, D1 eller E2, eller mutasjoner derav, kombineres rekombinant med kjente rammeverk regioner og/eller andre CDRer for å danne ytterligere, rekombinant-modifiserte, anti-CXCR4 antistoffer i følge foreliggende beskrivelse, slik det er diskutert ovenfor. Andre typer av modifikasjoner inkluderer de som er beskrevet i tidligere avsnitt. Utgangsmaterialet for modifiseringsfremgangsmåten er en eller flere av VH og/eller VK sekvensene tilveiebrakt heri, eller en eller flere CDR regioner derav. For å danne det modifiserte antistoffet er det ikke nødvendig å i virkeligheten fremstille (det vil si uttrykke som et protein) et antistoff som har en eller flere av VH og/eller VK sekvensene tilveiebrakt heri, eller en eller flere CDR regioner derav. Snarere blir informasjonen innbefattet i sekvensene anvendt som utgangsmaterialet for å danne en ”andre generasjon” sekvenser avledet fra de opprinnelige sekvensene og deretter blir de ”andre generasjon” sekvensene fremstilt og uttrykt som et protein.
Følgelig, i en annen utførelsesform, tilveiebringer foreliggende beskrivelse en fremgangsmåte for fremstilling av et anti-CXCR4 antistoff som innbefatter:
(a) tilveiebringe: (i) en tungkjede variabel region antistoff sekvens som innbefatter en CDR1 sekvens valgt fra gruppen som består av ”SEQ ID NO”: 1-4, en CDR2 sekvens valgt fra gruppen som består av ”SEQ ID NO”: 5-8, og/eller en CDR3 sekvens valgt fra gruppen som består av ”SEQ ID NO”: 9-12; og/eller (ii) en lettkjede variabel region antistoff sekvens som innbefatter en CDR1 sekvens valgt fra gruppen som består av ”SEQ ID NO”: 13-16, en CDR2 sekvens valgt fra gruppen som består av ”SEQ ID NO”: 17-20, og/eller en CDR3 sekvens valgt fra gruppen som består av ”SEQ ID NO”: 21-24;
(b) forandre minst et aminosyre residue innenfor tungkjede variabel region antistoff sekvensen og/eller lettkjede variabel region antistoff sekvensen for å danne minst en forandret antistoff sekvens; og
(c) uttrykke den forandrede antistoff sekvensen som et protein.
Standard molekylær biologi teknikker kan anvendes for å fremstille og uttrykke den forandrede antistoff sekvensen.
Foretrukket er antistoffet kodet av de forandrede antistoff sekvensene et som bibeholder en, noen eller alle de funksjonelle egenskapene til anti-CXCR4 antistoffene beskrevet heri, hvilke funksjonelle egenskaper inkluderer, men er ikke begrenset til:
(i) binding til naturlig human CXCR4 uttrykt på en celle overflate;
(ii) inhibere binding av SDF-1 til CXCR4;
(iii) inhibere SDF-1-indusert kalsium fluks i celler som uttrykker CXCR4;
(iv) inhibere SDF-1-indusert migrering av celler som uttrykker CXCR4;
(v) inhibere kapillær rør dannelse av HuVECer;
(vi) binding til human CXCR4 med en KD på 1 x 10<-7 >M eller mindre;
(vii) indusere apoptose i celler som uttrykker CXCR4;
(viii) inhibere tumor celle proliferasjon in vitro;
(ix) inhibere tumor celle proliferasjon og/eller indusere tumor celle apoptose in vivo; (x) inhibere metastaser av CXCR4<+ >tumor celler; og/eller
(xi) øke overlevelsestid til et CXCR4<+ >tumor-bærende subjekt.
De funksjonelle egenskapene til de forandrede antistoffene kan bestemmes ved anvendelse av standard undersøkelser tilgjengelige i litteraturen og/eller beskrevet heri, slik som de som er fremsatt i eksemplene (for eksempel strømnings cytometri, bindingsundersøkelser, funksjonelle undersøkelser).
I visse utførelsesformer av fremgangsmåtene for å modifisere antistoffer i følge foreliggende beskrivelse kan mutasjoner introduseres randomisert eller selektivt langs alle eller del av en anti-CXCR4 antistoff kodende sekvens og de resulterende modifiserte anti-CXCR4 antistoffene kan screenes for bindingsaktivitet og/eller andre funksjonelle egenskaper slik det er beskrevet heri. Mutasjonsfremgangsmåter har blitt beskrevet i litteraturen. For eksempel beskriver PCT publikasjon WO 02/092780 av Short fremgangsmåter for å danne og screene antistoff mutasjoner ved anvendelse av metnings mutagenese, syntetisk ligateringsoppstilling eller en kombinasjon derav. Alternativt beskriver PCT publikasjon WO 03/074679 av Lazar et al. fremgangsmåter for anvendelse av datamaskin screening fremgangsmåter for å optimalisere fysiokjemiske egenskaper til antistoffer.
Et annet aspekt av foreliggende beskrivelse angår nukleinsyre molekyler som koder antistoffene i følge foreliggende beskrivelse. Nukleinsyrene kan være tilstede i hele celler, i et celle lysat eller i en delvis renset eller i det vesentlige ren form. En nukleinsyre blir ”isolert” eller ”gjort i det vesentlige ren” når den renses bort fra andre cellulære komponenter eller andre kontaminanter, for eksempel andre cellulære nukleinsyrer eller proteiner, ved standard teknikker, som inkluderer alkali/SDS behandling, CsCl bunting, kolonne kromatografi, agarose gel elektroforese og andre godt kjente i litteraturen. Se F. Ausubel, et al., red. (1987) ”Current Protocols in Molecular Biology”, Greene Publishing og Wiley Interscience, New York. En nukleinsyre i følge foreliggende beskrivelse kan for eksempel være DNA eller RNA og kan eller kan ikke inneholde introniske sekvenser. I en foretrukket utførelsesform er nukleinsyren et cDNA molekyl.
Nukleinsyrer i følge foreliggende beskrivelse kan oppnås ved anvendelse av standard molekylær biologi teknikker. For antistoffer uttrykt av hybridomer (for eksempel hybridomer fremstilt fra transgene mus som bærer humane immunoglobulin gener som beskrevet ytterligere nedenfor) kan cDNAer som koder lett og tungkjedene til antistoffet fremstilt ved hybridomet oppnås ved standard PCR amplifisering eller cDNA klone teknikker. For antistoffer oppnådd fra et immunoglobulin gen bibliotek (for eksempel ved anvendelse av fag display teknikker) kan en nukleinsyre som koder slike antistoffer utvinnes fra gen biblioteket.
Foretrukne nukleinsyre molekyler i følge foreliggende beskrivelse er de som koder VH og VL sekvensene til de F7, F9, D1 og E2 monoklonale antistoffene. DNA sekvenser som koder VH sekvensene til F7, F9, D1 og E2 er vist i ”SEQ ID NO”: 33-36, respektivt. DNA sekvenser som koder VL sekvensene til F7, F9, D1 og E2 er vist i ”SEQ ID NO”: 37-40, respektivt.
I det DNA fragmenter som koder VH og VL segmenter oppnås kan disse DNA fragmentene ytterligere manipuleres ved standard rekombinant DNA teknikker, for eksempel for omdanning av variabel region gener til full-lengde antistoff kjede gener, til Fab fragment gener eller til et scFv gen. I disse manipuleringene blir et VL- eller VH-kodende DNA fragment operativt bundet til et annet DNA fragment som koder et annet protein, slik som en antistoff konstant region eller en fleksibel bindingsgruppe. Begrepet ”operativt bundet”, slik det anvendes i denne sammenheng, er tiltenkt å bety at de to DNA fragmentene blir bundet slik at aminosyresekvensene kodet av de to DNA fragmentene holdes i-ramme.
Det isolerte DNA som koder VH regionen kan omdannes til et full-lengde tungkjede gen ved operativt å binde det VH-kodende DNA til et annet DNA molekyl som koder tungkjede konstant regioner (CH1, CH2 og CH3). Sekvensene til human tungkjede konstant region gener er kjente i litteraturen (se for eksempel Kabat, E. A., el al. (1991) ”Sequences of Proteins of Immunological Interest”, femte utg., U.S. Department of Health and Human Services, NIH publikasjonnr. 91-3242) og DNA fragmenter som omfatter disse regionene kan oppnås ved standard PCR amplifisering. Tungkjede konstant regionen kan være en IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM eller IgD konstant region, men er mest foretrukket en IgG1 eller IgG4 konstant region. For et Fab fragment tungkjede gen kan VH-kodende DNA operativt bindes til et annet DNA molekyl som koder kun tungkjede CH1 konstant regionen.
Det isolerte DNA som koder VL regionen kan omdannes til et full-lengde lettkjede gen (så vel som et Fab lettkjede gen) ved operativt å binde det VL-kodende DNA til et annet DNA molekyl som koder lettkjede konstant regionen, CL. Sekvensene til human lettkjede konstant region gener er kjente i litteraturen (se for eksempel Kabat, E. A., et al. (1991) ”Sequences of Proteins of Immunological Interest”, femte utg., U.S.
Department of Health and Human Services, NIH publikasjonnr.91-3242) og DNA fragmenter som omfatter disse regionene kan oppnås ved standard PCR amplifisering. I foretrukne utførelsesformer kan lettkjede konstant regionen være en kappa eller lambda konstant region.
For å danne et scFv gen blir de VH- og VL-kodende DNA fragmentene operativt bundet til et annet fragment som koder en fleksibel bindingsgruppe, for eksempel som koder aminosyresekvensen (Gly4 -Ser)3, slik at VH og VL sekvensene kan uttrykkes som et tilstøtende enkeltkjede protein, med VL og VH regionene bundet av den fleksible bindingsgruppen (se for eksempel Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554).
Monoklonale antistoffer (mAbs) i følge foreliggende beskrivelse kan fremstilles ved et antall teknikker, som inkluderer vanlig monoklonale antistoff metodologi, for eksempel den standard somatiske celle hybridiseringsteknikken til Kohler og Milstein (1975) Nature 256: 495. Selv om somatisk celle hybridiseringsfremgangsmåter er foretrukket kan i prinsippet andre teknikker for fremstilling av monoklonale antistoffer anvendes, for eksempel viral eller onkogen omdanning av B lymfocytter.
Det foretrukne dyresystemet for fremstilling av hybridomer er musesystemet. Hybridom produksjon i mus er en svært godt etablert fremgangsmåte. Immuniseringsprotokoller og teknikker for isolering av immuniserte splenocytter for fusjon er kjente i litteraturen. Fusjonspartnere (for eksempel muse myelom celler) og fusjonsfremgangsmåter er også kjente.
Kimeriske eller humaniserte antistoffer i følge foreliggende beskrivelse kan fremstilles basert på sekvensen til et ikke-humant monoklonalt antistoff fremstilt som beskrevet ovenfor. DNA som koder tung og lettkjede immunoglobulinene kan oppnås fra det ikkehumane hybridomet av interesse og modifiseres til å inneholde ikke-murine (for eksempel humane) immunoglobulin sekvenser ved anvendelse av standard molekylær biologi teknikker. For eksempel, for å danne et kimerisk antistoff, kan murine variable regioner bindes til humane konstante regioner ved anvendelse av fremgangsmåter kjente i litteraturen (se for eksempel US patentnr.4,816,567 til Cabilly et al.). For å danne et humanisert antistoff kan murin CDR regioner innsettes i et humant rammeverk ved anvendelse av fremgangsmåter kjente i litteraturen (se for eksempel US patentnr.
5,225,539 til Winter, og US patentnr. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 og 6,180,370 til Queen et al.).
I en foretrukket utførelsesform er antistoffene i følge foreliggende beskrivelse humane monoklonale antistoffer. Slike humane monoklonale antistoffer rettet mot CXCR4 kan genereres ved anvendelse av transgene eller transkromosome mus som bærer deler av det humane immunsystemet snarerre enn musesystemet. Disse transgene og transkromosome musene inkluderer mus referert til heri som HuMAb Mus<® >og KM Mus<®>, respektivt, og blir samlet referert til heri som “human Ig mus”.
HuMAb Mus<® >(Medarex<®>, Inc.) inneholder humant immunoglobulin gen miniloci som koder ikke omleirede humane tung (μ og γ) og κ lettkjede immunoglobulin sekvenser, sammen med målrettede mutasjoner som inaktiverer den endogene μ og κ kjede loci (se for eksempel Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859). Følgelig fremviser mus redusert ekspresjon av muse IgM eller κ, og som respons på immunisering gjennomgår de introduserte humane tung og lettkjede transgenene klasse switching og somatisk mutasjon for å generere høy affinitet humane IgGκ monoklonale antistoffer (Lonberg, N. et al. (1994), supra; reviewed in Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. og Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, og Harding, F. og Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci.
764:536-546). Fremstilling og anvendelse av HuMAb Mus<®>, og de genomiske modifikasjonene utført på slike mus, er ytterligere beskrevet i Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J.12: 821-830;
Tuaillon et al. (1994) J. Immunol.152:2912-2920; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; og Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845851. Se videre US patentnr.5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; og 5,770,429; alle til Lonberg og Kay; US patentnr. 5,545,807 til Surani et al.; PCT publikasjonnr. WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 og WO 99/45962, alle til Lonberg og Kay; og PCT publikasjonnr. WO 01/14424 til Korman et al.
I en annen utførelsesform kan de humane antistoffene i følge foreliggende beskrivelse dannes ved anvendelse av en mus som bærer humane immunoglobulin sekvenser eller transgener og transkromosomer, slik som en mus som bærer et humant tungkjede transgen og et humant lettkjede transkromosom. Denne musen blir referert til heri som en “KM mus<®>”, og er beskrevet i detalj i PCT publikasjon WO 02/43478 til Ishida et al.
Enda ytterligere er alternative transgene dyresystemer som uttrykker humane immunoglobulin gener tilgjengelige i litteraturen og kan anvendes for å oppnå anti-CXCR4 antistoffer i følge foreliggende beskrivelse. For eksempel kan et alternativt transgent system referert til som Xenomouse (Abgenix, Inc.) anvendes; hvor slike mus er beskrevet for eksempel i US patentnr.5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6,150,584 og 6,162,963 til Kucherlapati et al.
Videre er alternative transkromosome dyresystemer som uttrykker humane immunoglobulin gener tilgjengelige i litteraturen og kan anvendes for å oppnå anti-CXCR4 antistoffer i følge foreliggende beskrivelse. For eksempel kan mus som både bærer et humant tungkjede transkromosom og et humant lettkjede trankromosom, referert til som “TC mus” anvendes; hvor slike mus er beskrevet i Tomizuka et al.
(2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727. Videre har kuer som bærer human tung og lettkjede transkromosomer blitt beskrevet i litteraturen (for eksempel Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894 og PCT søknadnr. WO 2002/092812) og kan anvendes for å oppnå anti-CXCR4 antistoffer i følge foreliggende oppfinnelse.
Humane monoklonale antistoffer i følge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles ved anvendelse av fag display fremgangsmåter for å screene biblioteker av humane immunoglobulin gener. Slike fag display fremgangsmåter for isolering av humane antistoffer er etablerte i litteraturen. Se for eksempel: US patentnr.5,223,409;
5,403,484; og 5,571,698 til Ladner et al.; US patentnr.5,427,908 og 5,580,717 til Dower et al.; US patentnr. 5,969,108 og 6,172,197 til McCafferty et al.; og US patentnr. 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 og 6,593,081 til Griffiths et al.
Humane monoklonale antistoffer i følge foreliggende beskrivelse kan også fremstilles ved anvendelse av SCID mus inn i hvilke humane immunceller har blitt rekonstitusjonert slik at en human antistoff respons kan genereres etter immunisering. Slike mus er for eksempel beskrevet i US patentnr. 5,476,996 og 5,698,767 til Wilson et al.
I en særlig foretrukket utførelsesform blir humane anti-CXCR4 antistoffer fremstilt ved anvendelse av en kombinasjon av human Ig mus og fag display teknikker, slik det er beskrevet i US patentnr. 6,794,132 av Buechler et al. Mer spesifikt involverer fremgangsmåten først oppnåelse av en anti-CXCR4 antistoff respons i en human Ig mus (slik som en HuMab mus eller KM mus som beskrevet ovenfor) ved å immunisere musen med et CXCR4 antigen, fulgt av isolering av nukleinsyrer som koder de humane antistoff kjedene fra lymfatiske celler til musen og introdusere disse nukleinsyrene inn i en display vektor (for eksempel fag) for å tilveiebringe et bibliotek av display pakker. Således blir hvert biblioteksmedlem som innbefatter en nukleinsyre som koder en human antistoff kjede og hver antistoff kjede fremvist fra display pakken. Biblioteket blir deretter screenet med et CXCR4 antigen for å isolere biblioteksmedlemmer som spesifikt binder CXCR4. Nukleinsyre innsettinger av de valgte biblioteksmedlemmene blir deretter isolert og sekvensert ved standard fremgangsmåter for å bestemme lett og tungkjede variabel sekvensene til de valgte CXCR4 bindemidlene. De variable regionene kan omdannes til full-lengde antistoff kjeder ved standard rekombinant DNA teknikker, slik som kloning av de variable regionene inn i en ekspresjonsvektor som bærer de humane tung og lettkjede konstant regionene slik at VH regionen blir operativt bundet til CH regionen og VL regionen blir operativt bundet til CL regionen. For en ytterligere beskrivelse av fremstillingen av humane anti-CXCR4 antistoffer ved anvendelse av dette kombinerte transgen muse/fag display systemet, se Eksempel 1.
Når human Ig mus anvendes for å heve humane antistoffer i følge foreliggende beskrivelse kan slike mus immuniseres med et renset eller anriket preparat av CXCR4 antigen og/eller rekombinant CXCR4, eller celler som uttrykker CXCR4, eller et CXCR4 fusjonsprotein, slik det er beskrevet av Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851; og PCT publikasjon WO 98/24884 og WO 01/14424. Foretrukket vil musen være 6-16 uker gammel etter den første infusjonen. For eksempel kan et renset eller rekombinant preparat (5-50 µg) av CXCR4 antigen anvendes for å immunisere den humane Ig musen intraperitonealt. Mest foretrukket innbefatter immunogenet anvendt for å oppnå antistoffene i følge foreliggende oppfinnelse human CXCR4 i sin naturlige konformasjon innenfor en membran, hvor ikke-begrensende eksempler på denne inkluderer celler transfektert til å uttrykke CXCR4 på deres celle overflate, celler som naturlig uttrykker CXCR4 (for eksempel CEM celler) og kunstige membraner (for eksempel liposomer) inn i hvilke CXCR4 har blitt inkorporert, slik som magnetiske proteoliposomer (MPLer) som inkorporerer CXCR4 (beskrevet ytterligere i Eksempel 1).
Detaljerte fremgangsmåter for å generere full humane monoklonale antistoffer til CXCR4 er beskrevet i Eksempel 1 nedenfor. Kumulativt eksperiment med forskjellige antigener har vist at den transgene musen responderer når den initielt immuniseres intraperitonealt (IP) med antigen i fullstendig Freunds adjuvans, fulgt av IP immuniseringer hver annen uke (opptil totalt 6) med antigen i ikke-fullstendig Freunds adjuvans. Imidlertid er adjuvanser forskjellig fra Freunds også funnet effektivt. I tillegg er hel celler under fravær av adjuvans funnet å være svært immunogene.
Immunresponsen kan overvåkes i løpet av immuniseringsprotokollen med plasma prøver som oppnås ved retroorbitale blødninger. Plasma kan screenes med ELISA (som beskrevet nedenfor) og mus med tilstrekkelig titrer volumer av anti-CXCR4 humant immunoglobulin kan anvendes for fusjoner. Mus kan forsterkes intravenøst med antigen 3 dager før avlivning og fjerning av milten. Det forventes at 2-3 fusjoner for hver immunisering kan være nødvendig å utføre. Mellom 6 og 24 mus blir typisk immunisert for hvert antigen. Vanligvis blir både HCo7 og HCo12 stammer anvendt. I tillegg kan både HCo7 og HCo12 transgen avles opp sammen med en enkel mus som har to forskjellige humane tungkjede transgener (HCo7/HCo12). Alternativt, eller i tillegg, kan KM Muse<® >stammen anvendes, slik det er beskrevet i Eksempel 1.
For å generere hybridomer som produserer humane monoklonale antistoffer i følge foreliggende beskrivelse kan splenocytter og/eller lymfeknuteceller fra immuniserte mus isoleres og sammensmeltes til en passende immortalisert cellelinje, slik som en muse myelom cellelinje. De resulterende hybridomene kan screenes for produksjon av antigen-spesifikke antistoffer. For eksempel kan enkel cellesuspensjoner av spleniske lymfocytter fra immuniserte mus sammensmeltes til en sjettedel av antallet P3X63-Ag8.653 ikke-utskillende muse myelom celler (ATCC, CRL 1580) med 50% PEG. Alternativt kan enkelt cellesuspensjonen av spleniske lymfocytter fra immuniserte mus sammensmeltes ved anvendelse av en elektrisk felt basert elektrofusjonsmetode, ved anvendelse av CytoPulse storkammer cellefusjon elektroporator (CytoPulse Sciences, Inc., Glen Burnie Maryland). Celler tilsettes ved cirka 2 x 10<5 >i flatbunnet mikrotiter plate, fulgt av en to uker inkubering i selektivt medium som inneholder 20% foster klone serum, 18% ”653” kondisjonert media, 5% origen (IGEN), 4 mM L-glutamin, 1 mM natrium pyruvat, 5mM HEPES, 0.055 mM 2-merkaptoetanol, 50 enheter/ml penicillin, 50 mg/ml streptomycin, 50 mg/ml gentamycin og 1X HAT (Sigma; HAT tilsettes 24 timer etter fusjonen). Etter cirka to uker kan cellene dyrkes i medium hvori HAT er erstattet med HT. Individuelle brønner kan deretter screenes med ELISA for humane monoklonale IgM og IgG antistoffer. Etter at omfattende hybridom vekst finner sted kan mediet observeres vanligvis etter 10-14 dager. De antistoff utskillende hybridomene kan tilsettes plater en gang til, screenes igjen og hvis de fremdeles er positive for human IgG kan de monoklonale antistoffene underklones minst to ganger med begrensende fortynning. De stabile underklonene kan deretter dyrkes in vitro for å generere små mengder antistoff i vevsdyrkningsmedium for karakterisering.
For å rense humane monoklonale antistoffer kan valgte hybridomer dyrkes i to-liter spinner-kolber for monoklonal antistoff rensing. Supernatanter kan filtreres og konsentreres før affinitetskromatografi med protein A-sefarose (Pharmacia, Piscataway, NJ). Eluert IgG kan sjekkes ved gel elektroforese og høyytelses væske kromatografi for å forsikre om renhet. Buffer løsningen kan byttes med PBS og konsentrasjonen kan bestemmes ved OD280 ved anvendelse av 1.43 ekstinksjons koeffisient. De monoklonale antistoffene kan alikvoteres og lagres ved -80 ̊C.
Antistoffer i følge foreliggende oppfinnelse kan produseres i en vertscelle transfektom for eksempel ved anvendelse av en kombinasjon av rekombinante DNA teknikker og gen transfeksjonsfremgangsmåter slik det er kjent i litteraturen (for eksempel Morrison, S. (1985) Science 229:1202).
For eksempel, for å uttrykke antistoffene, eller antistoff fragmenter derav, kan DNAer som koder delvise eller full-lengde lett og tungkjeder oppnås ved standard molekylær biologi teknikker (for eksempel PCR amplifikasjon eller cDNA kloning ved anvendelse av en hybridom som uttrykker antistoffet av interesse) og DNAene kan innsettes i ekspresjonsvektorer slik at genene blir operativt bundet til transkripsjons- og translasjonskontroll sekvenser. I denne sammenhengen er begrepet ”operativt bundet” tiltenkt å bety at et antistoff gen er ligatert inn i en vektor slik at transkripsjons- og translokasjonskontroll sekvensene inne i vektoren tjener deres tiltenkte funksjon med å regulere transkripsjon og translatasjon av antistoff genet. Ekspresjonsvektoren og ekspresjonskontroll sekvensene velges slik at de er kompatible med ekspresjonsvertscellen som anvendes. Antistoff lettkjede genet og antistoff tungkjede genet kan innsettes i separat vektor eller, mer typisk, kan begge genene innsettes i samme ekspresjonsvektor. Antistoff genene innsettes i ekspresjonsvektoren ved standard fremgangsmåter (for eksempel ligasjon av komplementære restriksjonsseter på antistoff gen fragmentet og vektoren, eller butt ende ligatering hvis ingen restriksjonsseter er tilstede). Lett og tungkjede variabel regionene til antistoffene beskrevet heri kan anvendes for å danne full-lengde antistoff gener av en hvilken som helst antistoff isotyp ved innsetting av dem i ekspresjonsvektorer som allerede koder tungkjede konstant og lettkjede konstant regioner til den ønskede isotypen slik at VH segmentet er operativt bundet til CH segmentene innenfor vektoren og VK segmentet er operativt bundet til CL segmentet inne i vektoren. I tillegg eller alternativt kan den rekombinante ekspresjonsvektoren kode et enkelt peptid som letter sekresjon av antistoff kjeden fra en vertscelle. Antistoff kjede genene kan klones inn i vektoren slik at signal peptidet bindes i-ramme til aminoterminusen til antistoff kjede genet. Signal peptidet kan være et immunoglobulin signal peptid eller et heterologt signal peptid (det vil si et signal peptid fra et ikke-immunoglobulin protein).
I tillegg til antistoff kjede genene bærer de rekombinante ekspresjonsvektorene i følge foreliggende beskrivelse reguleringssekvenser som kontrollerer ekspresjonen av antistoff kjede genene i en vertscelle. Uttrykket ”reguleringssekvens” er tiltenkt å inkludere promotorer, forsterkere og andre ekspresjonskontroll elementer (for eksempel polyadenyleringssignaler) som kontrollerer transkripsjonen eller translasjonen av antistoff kjede genene. Slike reguleringssekvenser er beskrevet for eksempel i Goeddel (”Gene Expression Technology”. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)). Fagmannen vil forstå at designet av ekspresjonsvektoren, som inkluderer valg av reguleringssekvenser, kan avhenge av slike faktorer som valg av vertscelle som skal omdannes, nivået av ekspresjon av proteinet som er ønsket, etc. Foretrukne reguleringssekvenser for pattedyr vertscelle ekspresjon inkluderer virale elementer som retter høye nivåer av protein ekspresjon i pattedyr celler, slike som promotorer og/eller forsterkere avledet fra cytomegalovirus (CMV), Simian Virus 40 (SV40), adenovirus (for eksempel adenovirus viktig sen promotoren (AdMLP)) og polyom. Alternativt kan ikke-virale reguleringssekvenser anvendes, slik som ubiquitin promotoren eller β-globin promotoren. Ennå ytterligere reguleringselementer bestående av sekvenser fra forskjellige kilder, slik som SRα promotor systemet, som inneholder sekvenser fra SV40 tidlig promotoren og den lange terminale repetisjonen av human T celle leukemi virus type 1 (Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol.8:466-472).
I tillegg til antistoff kjede genene og reguleringssekvensene kan de rekombinante ekspresjonsvektorene i følge foreliggende beskrivelse bære ytterligere sekvenser, slik som sekvenser som regulerer replikasjon av vektoren i vertsceller (for eksempel opprinnelser for replikasjon) og selekterbare markør gener. Det selekterbare markør genet letter seleksjon av vertsceller inn i hvilke vektoren har blitt introdusert (se for eksempel US patentnr.4,399,216, 4,634,665 og 5,179,017, alle av Axel et al.). For eksempel gir typisk det selekterbare markør genet resistens ovenfor legemidler, slik som G418, hygromycin eller metotreksat, til en vertscelle inn i hvilken vektoren har blitt introdusert. Foretrukne selekterbare markør gener inkluderer dihydrofolat reduktase (DHFR) genet (for anvendelse i dhfr-vertsceller med metotreksat seleksjon/amplifisering) og neo genet (for G418 seleksjon).
For ekspresjons av lette og tunge kjeder blir ekspresjonsvektorene som koder de tunge og lette kjedene transfektert inn i en vertscelle ved standard teknikker. De forskjellige formene av begrepet ”transfeksjon” er tiltenkt å omfatte et bredt spekter av teknikker som vanligvis anvendes for introduksjon av eksogent DNA inn i en prokaryot eller eukaryot vertscelle, for eksempel elektroporasjon, kalsium-fosfat presipitasjon, DEAE-dekstran transfeksjon og lignende. Selv om det er teoretisk mulig å uttrykke antistoffene i følge foreliggende beskrivelse i deres prokaryote eller eukaryote vertsceller er ekspresjon av antistoffene i eukaryote celler og mest foretrukket pattedyr vertsceller, den mest foretrukne på grunn av at slike eukaryote celler og særlig pattedyr celler, mer trolig enn prokaryote celler vil bli satt sammen og skille ut et passende foldet og immunologisk aktivt antistoff. Prokaryot ekspresjon av antistoff gener har blitt rapportert å være ineffektiv for produksjon av høye utbytter av aktivt antistoff (Boss, M. A. og Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13).
Foretrukne pattedyr vertsceller for å uttrykke de rekombinante antistoffene i følge foreliggende beskrivelse inkluderer Kinesisk hamster eggstokk (CHO celler) (som inkluderer dhfr- CHO celler, beskrevet i Urlaub og Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, anvendt med en DHFR selekterbar markør, for eksempel slik det er beskrevet i R. J. Kaufman og P. A. Sharp (1982) J. Mol. Biol.159:601-621), NSO myelom celler, COS celler og SP2 celler. Særlig, for anvendelse med NSO myelom celler, er et annet foretrukket ekspresjonssystem GS gen ekspresjonssystemet beskrevet i WO 87/04462 (til Wilson), WO 89/01036 (til Bebbington) og EP 338,841 (til Bebbington). Når rekombinante ekspresjonsvektorer som koder antistoff gener introduseres inn i pattedyr vertsceller blir antistoffer produsert ved dyrkning av vertscellene i en tidsperiode tilstrekkelig til å muliggjøre ekspresjon av antistoffet i vertscellene eller, mer foretrukket, sekresjon av antistoffet inn i dyrkningsmediet hvori vertscellene dyrkes. Antistoffer kan utvinnes fra dyrkningsmediet ved anvendelse av standard protein rensingsfremgangsmåter.
Antistoffer i følge foreliggende beskrivelse kan testes for binding til CXCR4 ved for eksempel standard strømnings cytometri fremgangsmåter. Siden antistoffene i følge foreliggende beskrivelse foretrukket gjenkjenner CXCR4 i sin naturlige konformasjon inne i en membran blir testing for binding til CXCR4 foretrukket gjort med en undersøkelse (for eksempel strømnings cytometri) som anvender et reagens som uttrykker naturlig konformasjon CXCR4. Ikke-begrensende eksempler på reagenser som uttrykker naturlig konformasjon CXCR4 som kan anvendes i bindingsundersøkelsene inkluderer celler som naturlig uttrykker CXCR4 (for eksempel CEM celler), celler som har blitt transfektert til å uttrykke CXCR4 (for eksempel R1610 celler transfektert med en CXCR4 ekspresjonsvektor) og liposomer inn i hvilke CXCR4 har blitt inkorporert (for eksempel magnetiske proteoliposomer som inkorporerer CXCR4), hvor hver av disse er beskrevet ytterligere i detalj i eksemplene. Kort fortalt, for strømnings cytometri undersøkelsen, blir celler som uttrykker CXCR4 inkubert med test antistoffet, vasket, inkubert med et merket sekundært reagens i stand til å binde til test antistoffet, vasket igjen og gjort til gjenstand for analyse for å detektere binding av det sekundære reagenset til cellene (for eksempel ved anvendelse av en FACS maskin). Foretrukket vil mus som utvikler de høyeste titrer volumene ved evaluering med strømnings cytometri anvendes for fusjoner eller for ytterligere seleksjon av antistoffer (for eksempel fag display screening av antistoff biblioteker fremstilt fra B celler til musene).
En strømnings cytometri undersøkelse som beskrevet ovenfor kan også anvendes for å screene for hybridomer som viser positiv reaktivitet med CXCR4 immunogen.
Hybridomer som uttrykker antistoffer som binder med høy aviditet til CXCR4 blir underklonet og ytterligere karakterisert. En klone fra hver hybridom, som bibeholder reaktiviteten til mor cellene (ved strømnings cytometri) kan velges for å frembringe en 5-10 medisinflaske cellebank lagret ved -140°C, og for antistoff rensing.
For å rense anti-CXCR4 antistoffer kan valgte hybridomer dyrkes i to-liter spinnerkolber for monoklonal antistoff rensing. Supernatanter kan filtreres og konsentreres før affinitetskromatografi med protein A-sefarose (Pharmacia, Piscataway, NJ). Eluert IgG kan sjekkes med gel elektroforese og høyytelses væske kromatografi for å forsikre om renhet. Buffer løsningen kan utbyttes med PBS, og konsentrasjonen kan bestemmes med OD280 ved anvendelse av 1.43 ekstinksjons koeffisient. De monoklonale antistoffene kan alikvoteres og lagres ved -80 ̊C.
For å bestemme om de valgte anti-CXCR4 monoklonale antistoffene binder til unike epitoper kan hvert antistoff bli biotinylert ved anvendelse av kommersielt tilgjengelige reagenser (Pierce, Rockford, IL). Konkurreringsstudier ved anvendelse av ikke-merkede monoklonale antistoffer og biotinylerte monoklonale antistoffer kan utføres ved anvendelse av en hel celle ELISA undersøkelse hvori ELISA platene belegges med celler som uttrykker CXCR4, og evnen til det ikke-merkede antistoffet til å konkurrere med det biotinylerte antistoffet for binding til de CXCR4-uttrykkende cellene blir undersøkt. Biotinylert mAb binding kan detekteres med en strep-avidin-alkalisk fosfatase probe.
For å bestemme isotypen til rensede antistoffer kan isotyp ELISAer utføres ved anvendelse av reagenser spesifikke for antistoffene til en bestemt isotyp. For eksempel, for å bestemme isotypen til et humant monoklonalt antistoff kan brønner til mikrotiter plater belegges med 1 μg/ml anti-human immunoglobulin over natten ved 4°C. Etter blokkering med 1% BSA blir platene omsatt med 1 μg/ml eller mindre av test monoklonale antistoffer eller rensede isotyp kontroller, ved omgivelsestemperatur i en til to timer. Brønnene kan deretter reagere med enten humane IgG1 eller humane IgM-spesifikke alkalisk fosfatase-konjugerte prober. Plater utvikles og analyseres som beskrevet ovenfor.
Anti-CXCR4 humane IgGer kan ytterligere testes for reaktivitet med CXCR4 antigen ved Western blotting. Kort fortalt kan CXCR4 fremstilles og gjøres til gjenstand for natrium dodecyl sulfat polyakrylamid gel elektroforese. Etter elektroforese blir de separerte antigenene overført til nitrocellulose membraner, blokkert med 10% foster kalve serum og probet med de monoklonale antistoffene som skal testes. Human IgG binding kan detekteres ved anvendelse av anti-human IgG alkalisk fosfatase og utvikles med BCIP/NBT substrat tabletter (Sigma Chem. Co., St. Louis, Mo).
Bindingsspesifisiteten til et antistoff i følge foreliggende beskrivelse kan også bestemmes ved å overvåke binding av antistoffet til celler som uttrykker CXCR4, for eksempel ved strømnings cytometri. Typisk kan en cellelinje, slik som en CHO cellelinje, transfekteres med en ekspresjonsvektor som koder en transmembran form av CXCR4. Det transfekterte proteinet kan innbefatte en tag, slik som en myc-tag, foretrukket ved N-terminusen, for deteksjon ved anvendelse av et antistoff ovenfor tagen. Binding av et antistoff i følge foreliggende beskrivelse til CXCR4 kan bestemmes ved å inkubere de transfekterte cellene med antistoffet, og detektere bundet antistoff. Binding av et antistoff til tagen på det transfekterte proteinet kan anvendes som en positiv kontroll.
I et annet aspekt angår foreliggende beskrivelse et anti-CXCR4 antistoff, eller et fragment derav, konjugert til en terapeutisk bestanddel, slik som et cytotoksin, et legemiddel (for eksempel en immunosuppressant) eller et radiotoksin. Slike konjugater blir referert til heri som “immunokonjugater”. Immunokonjugater som inkluderer et eller flere cytotoksiner blir referert til som “immunotoksiner”. Et cytotoksin eller cytotoksisk middel inkluderer et hvilket som helst middel som er skadelig for (for eksempel avliver) celler. Eksempler inkluderer taxol, cytochalasin B, gramicidin D, etidium bromid, emetin, mitomycin, etoposid, tenoposid, vincristin, vinblastin, colchicin, doxorubicin, daunorubicin, dihydroksy antracin dion, mitoxantron, mithramycin, actinomycin D, 1-dehydrotestosteron, glukokortikoider, procain, tetracain, lidocain, propranolol og puromycin og analoger eller homologer derav. Terapeutiske midler inkluderer også for eksempel antimetabolitter (for eksempel metotrexat, 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, cytarabin, 5-fluorouracil decarbazin), alkyleringsmidler (for eksempel mekloretamin, tioepa klorambucil, melfalan, carmustin (BSNU) og lomustin (CCNU), cyklotosfamid, busulfan, dibromomannitol, streptozotocin, mitomycin C og cis-diklordiamin platina (II) (DDP) cisplatin), antracykliner (for eksempel daunorubicin (tidligere daunomycin) og doxorubicin), antibiotiske midler (for eksempel dactinomycin (tidligere actinomycin), bleomycin, mitramycin og antramycin (AMC)), og anti-mitotiske midler (for eksempel vincristin og vinblastin).
Andre foretrukne eksempler på terapeutiske cytotoksiner som kan konjugeres til et antistoff i følge foreliggende beskrivelse inkluderer duocarmyciner, calicheamiciner, maytansiner og auristatiner og derivater derav. Et eksempel på et calicheamicin antistoff konjugat er kommersielt tilgjengelig (Mylotarg®; American Home Products).
Cytotoksiner kan konjugeres til antistoffer i følge foreliggende beskrivelse ved anvendelse av bindingsgruppe teknologi tilgjengelig i litteraturen. Eksempler på bindingstyper som har blitt anvendt for å konjugere et cytotoksin til et antistoff inkluderer, men er ikke begrenset til, hydrazoner, tioetere, estere, disulfider og peptidinneholdende bindingsgrupper. En bindingsgruppe kan velges som for eksempel er mottakelig for spalting ved lav pH innenfor den lysosomale delen eller mottakelig for spalting ved proteaser, slik som proteaser foretrukket uttrykt i tumor vev slik som catepsiner (for eksempel catepsin B, C, D).
For ytterligere diskusjon når det gjelder typer av cytotoksiner, bindingsgrupper og fremgangsmåter for konjugering av terapeutiske midler til antistoffer, se også Saito, G. et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev.55:199-215; Trail, P.A. et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan, I. og Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. og Springer, C.J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev.53:247-264.
Antistoffer i følge foreliggende beskrivelse kan også konjugeres til en radioaktiv isotop for å generere cytotoksiske radiofarmasøytiske midler, også referert til som radioimmunokonjugater. Eksempler på radioaktive isotoper som kan konjugeres antistoffer for anvendelse diagnostisk eller terapeutisk inkluderer, men er ikke begrenset til, jod<131>, indium<111>, yttrium<90 >og lutetium<177>. Fremgangsmåter for fremstilling av radioimmunkonjugater er etablert i litteraturen. Eksempler på radioimmunokonjugater er kommersielt tilgjengelige, som inkluderer Zevalin® (IDEC Pharmaceuticals) og Bexxar® (Corixa Pharmaceuticals) og tilsvarende fremgangsmåter kan anvendes for fremstilling av radioimmunokonjugater ved anvendelse av antistoffene i følge foreliggende beskrivelse.
Antistoff konjugatene i følge foreliggende beskrivelse kan anvendes for å modifisere en gitt biologisk respons og legemiddel bestanddelen skal ikke konstrueres som noen begrensning til klassiske kjemiske terapeutiske midler. For eksempel kan legemiddel bestanddelen være et protein eller polypeptid som fremviser en ønsket biologisk aktivitet. Slike proteiner kan for eksempel inkludere et enzymatisk aktivt toksin eller aktivt fragment derav, slik som abrin, ricin A, pseudomonas exotoksin eller difteri toksin; et protein slik som tumor nekrose faktor eller interferon-γ; eller biologisk respons modifiserere slik som for eksempel lymfokiner, interleukin-1 ("IL-1"), interleukin-2 ("IL-2"), interleukin-6 ("IL-6"), granulocytt makrofag koloni stimulerende faktor ("GM-CSF"), granulocytt koloni stimulerende faktor ("G-CSF") eller andre vekstfaktorer.
Teknikker for å konjugere slike terapeutiske bestanddeler til antistoffer er godt kjente, se for eksempel Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", i ”Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy”, Reisfeld et al.
(red.), s.243-56 (Alan R. Liss, Inc.1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", i ”Controlled Drug Delivery” (2. utg.), Robinson et al. (red.), s.623-53 (Marcel Dekker, Inc.1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", i ”Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications”, Pinchera et al. (red.), s.475-506 (1985); "Analysis, Results, and Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", i ”Monoclonal Antibodies For Cancer Detection and Therapy”, Baldwin et al. (red.), s.
303-16 (Academic Press 1985), og Thorpe et al., Immunol. Rev., 62:119-58 (1982).
I et annet aspekt angår foreliggende beskrivelse bispesifikke molekyler som innbefatter et anti-CXCR4 antistoff, eller et fragment derav, i følge foreliggende beskrivelse. Et antistoff i følge foreliggende beskrivelse, eller antigen-bindende deler derav, kan derivatiseres eller bindes til et annet funksjonelt molekyl, for eksepel et annet peptid eller protein (for eksempel et annet antistoff eller ligand for en reseptor) for å generere et bispesifikt molekyl som binder til minst to forskjellige bindingsseter eller mål molekyler. Antistoffet i følge foreliggende beskrivelse kan i virkeligheten derivatiseres eller bindes til mer enn et annet funksjonelt molekyl for å generere multispesifikke molekyler som binder til mer enn to forskjellige bindingsseter og/eller mål molekyler; slike multispesifikke molekyler er også tiltenkt å være omfattet av begrepet “bispesifikt molekyl” slik det anvendes heri. For å danne et bispesifikt molekyl i følge foreliggende beskrivelse kan et antistoff i følge foreliggende beskrivelse funksjonelt bindes (for eksempel ved kjemisk kobling, genetisk fusjon, ikke-kovalent assosiasjons eller på annen måte) til et eller flere andre bindingsmolekyler, slik som et annet antistoff, antistoff fragment, peptid eller binding mimetisk middel, slik at et bispesifikt molekyl blir resultatet.
Følgelig inkluderer foreliggende beskrivelse bispesifikke molekyler som innbefatter minst en første bindingsspesifisitet for CXCR4 og en andre bindingsspesifisitet for en andre mål epitop. I en særlig utførelsesform av foreliggende beskrivelse er den andre mål epitopen en Fc reseptor, for eksempel human FcγRI (CD64) eller en human Fcα reseptor (CD89). Derfor inkluderer foreliggende beskrivelse bispesifikke molekyler i stand til å binde både til FcγR eller FcαR uttrykkende effektor celler (for eksempel monocytter, makrofager eller polymorfonukleære celler (PMNer)), og til mål celler som uttrykker CXCR4. Disse bispesifikke molekylene målretter CXCR4 uttrykkende celler til effektor celle og trigger Fc reseptor-mediert effektor celle aktiviteter, slik som fagocytose av CXCR4 uttrykkende celler, antistoff avhengig celle-mediert cytotoksisitet (ADCC), cytokin frigivelse eller generering av superoksid anion.
I en utførelsesform i foreliggende beskrivelse hvori det bispesifikke molekylet er multispesifikt kan molekylet ytterligere inkludere en tredje bindingsspesifisitet, i tillegg til en anti-Fc bindingsspesifisitet og en anti-CXCR4 bindingsspesifisitet. I en utførelsesform er den tredje bindingsspesifisiteten en anti-forsterkningsfaktor (EF) del, for eksempel et molekyl som binder til et overflate protein involvert i cytotoksisk aktivitet og derved øker immunresponsen ovenfor mål cellen. ”Anti-forsterkningsfaktor del” kan være et antistoff, funksjonelt antistoff fragment eller en ligand som binder til et gitt molekyl, for eksempel et antigen eller en reseptor, og derved resulterer i en forsterkning av effekten av bindingsdeterminantene for Fc reseptoren eller mål celle antigenet. ”Anti-forsterkningsfaktor delen” kan binde en Fc reseptor eller et mål celle antigen. Alternativt kan anti-forsterkningsfaktor delen binde til en bestanddel som er forskjellig fra bestanddelen til hvilken de første og andre bindingsspesifisitetene binder. For eksempel kan en anti-forsterkningsfaktor del binde en cytotoksisk T-celle (for eksempel via CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 eller annen immuncelle som resulterer i en økt immunrespons ovenfor mål cellen).
I en utførelsesform innbefatter de bispesifikke molekylene i følge foreliggende beskrivelse som en bindingsspesifisitet minst et antistoff, eller et antistoff fragment derav, som inkluderer for eksempel et Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, dAb eller et enkelt kjede Fv. Antistoffet kan også være en lettkjede eller tungkjede dimer, eller et hvilket som helst minimalt fragment derav slik som en Fv eller et enkelt kjede konstrukt slik det er beskrevet i US patentnr. 4,946,778 til Ladner et al., hvor innholdet i denne er innbefattet uttrykkelig med referanse.
I en utførelsesform er bindingsspesifisiteten for en Fcγ reseptor tilveiebrakt ved et monoklonalt antistoff, hvor bindingen av dette ikke er blokkert av humant immunoglobulin G (IgG). Slik det anvendes heri refererer begrepet ”IgG reseptor” til et hvilket som helst av de åtte γ-kjede genene lokalisert på kromosom 1. Disse genene koder totalt tolv transmembran eller løselige reseptor isoformer som er gruppert i tre Fcγ reseptor klasser: FcγRI (CD64), FcγRII(CD32) og FcγRIII (CD16). I en foretrukket utførelsesform er Fcγ reseptoren en human høy affinitet FcγRI. Det humane FcγRI er et 72 kDa molekyl, som viser høy affinitet for monomer IgG (10<8 >- 10<9 >M<-1>).
Fremstilling og karakterisering av visse foretrukne anti-Fcγ��monoklonale antistoffer er beskrevet i PCT publikasjon WO 88/00052 og i US patentnr.4,954,617 til Fanger et al., hvor læren i denne er innbefattet fullt ut med referanse heri. Disse antistoffene binder til en epitop til FcγRI, FcγRII eller FcγRIII ved et sete som er forskjellig fra Fcγ bindingssetet til reseptoren og således er deres binding ikke blokkert vesentlig ved fysiologiske nivåer av IgG. Spesifikke anti-FcγRI antistoffer anvendelige i foreliggende beskrivelse er mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 og mAb 197. Hybridom produserende mAb 32 er tilgjengelig fra the American Type Culture Collection, ATCC aksesjonsnr. HB9469. I andre utførelsesformer er anti-Fcγ reseptor antistoffet en humanisert form av monoklonalt antistoff 22 (H22). Produksjon og karakterisering av H22 antistoffet er beskrevet i Graziano, R.F. et al. (1995) J. Immunol 155 (10): 4996-5002 og PCT publikasjon WO 94/10332 til Tempest et al. Den H22 antistoff produserende cellelinjen ble deponert ved the American Type Culture Collection under betegnelsen HA022CL1 og har aksesjonsnr. CRL 11177.
I ytterligere andre foretrukne utførelsesformer er bindingsspesifisiteten for en Fc reseptor tilveiebrakt ved et antistoff som binder til en human IgA reseptor, for eksempel en Fc-alfa reseptor (FcαRI (CD89)), hvor bindingen av denne foretrukket ikke blokkeres av human immunoglobulin A (IgA). Begrepet ”IgA reseptor” er tiltenkt å inkludere gen produktet av et α-gen (FcαRI) lokalisert på kromosom 19. Dette genet er kjent for å kode flere alternativt spleisede transmembran isoformer med 55 til 110 kDa. FcαRI (CD89) er konstitutivt uttrykt på monocytter/makrofager, eosinofile og neutrofile granulocytter, men ikke på ikke-effektor celle populasjoner. FcαRI har middels affinitet (≈ 5 × 10<7 >M<-1>) for både IgA1 og IgA2, som øker etter eksponering for cytokiner slik som G-CSF eller GM-CSF (Morton, H.C. et al. (1996) Critical Reviews in Immunology 16:423-440). Fire FcαRI-spesifikke monoklonale antistoffer, identifisert som A3, A59, A62 og A77, som binder FcαRI utenfor IgA ligand bindingsdomenet, har blitt beskrevet (Monteiro, R.C. et al. (1992) J. Immunol. 148:1764).
FcαRI og FcγRI er foretrukne trigger reseptorer for anvendelse i de bispesifikke molekylene i følge foreliggende beskrivelse på grunn av at de er (1) uttrykt primært på immune effektor celler, for eksempel monocytter, PMNer, makrofager og dendritt celler; (2) uttrykt ved høye nivåer (for eksempel 5,000-100,000 per celle); (3) mediatorer av cytotoksiske aktiviteter (for eksempel ADCC, fagocytose); og (4) medierer økt antigen presentasjon av antigener, som inkluderer selv-antigener, målrettet til dem.
Mens humane monoklonale antistoffer er foretrukket er andre antistoffer som kan anvendes i de bispesifikke molekylene i følge foreliggende oppfinnelse murine, kimeriske og humaniserte monoklonale antistoffer.
De bispesifikke molekylene i følge foreliggende beskrivelse kan fremstilles ved å konjugere de konstituente bindingsspesifisitetene, for eksempel de anti-FcR og anti-CXCR4 bindingsspesifisitetene, ved anvendelse av fremgangsmåter kjente i litteraturen. For eksempel kan hver bindingsspesifisitet til det bispesifikke molekylet genereres separat og deretter konjugeres til hverandre. Når bindingsspesifisitetene er proteiner eller peptider kan et antall koblings eller kryss-bindingsmidler anvendes for kovalent konjugering. Eksempler på kryss-bindingsmidler inkluderer protein A, karbodiimid, N-suksinimidyl-S-acetyl-tioacetat (SATA), 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzosyre) (DTNB), ofenylendimaleimid (oPDM), N-suksinimidyl-3-(2-pyridylditio)propionat (SPDP) og sulfosuksinimidyl 4-(N-maleimidometyl) cykloheksan-1-karboksylat (sulfo-SMCC) (se for eksempel Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med.160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648). Andre fremgangsmåter inkluderer de som er beskrevet i Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No.78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229:81-83, og Glennie et al. (1987) J. Immunol.139: 2367-2375). Foretrukne konjugerende midler er SATA og sulfo-SMCC, begge tilgjengelig fra Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).
Når bindingsspesifisitetene er antistoffer kan de være konjugert via sulfhydryl binding av C-terminus hengsel regionene til de to tunge kjedene. I en særlig foretrukket utførelsesform blir hengsel regionen modifisert til å inneholde et odde antall sulfhydryl residuer, foretrukket en, før konjugering.
Alternativt kan begge bindingsspesifisitetene bli kodet i samme vektor og uttrykkes og oppstilles i samme vertscellen. Denne fremgangsmåten er særlig anvendelig der det bispesifikke molekylet er et mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 eller ligand x Fab fusjonsprotein. Et bispesifikt molekyl i følge foreliggende beskrivelse kan være et enkelt kjede molekyl som innbefatter et enkelt kjede antistoff og en bindingsdeterminant, eller et enkelt kjede bispesifikt molekyl som innbefatter to bindingsdeterminanter. Bispesifikke molekyler kan innbefatte minst to enkelt kjede molekyler. Fremgangsmåter for fremstilling av bispesifikke molekyler er beskrevet for eksempel i US patentnr.5,260,203; 5,455,030; 4,881,175; 5,132,405; 5,091,513;
5,476,786; 5,013,653; 5,258,498; og 5,482,858, hvor alle disse er innbefattet uttrykkelig heri med referanse.
Binding av bispesifikke molekyler til deres spesifikke mål kan for eksempel bekreftes med enzym-bundet immunosorbent undersøkelse (ELISA), radioimmunoundersøkelse (RIA), FACS analyse, bioundersøkelse (for eksempel vekst inhibering) eller Western Blot undersøkelse. Hver av disse undersøkelsene detekterer generelt tilstedeværelsen av protein-antistoff komplekser av særlig interesse ves anvendelse av et merket middel (for eksempel et antistoff) spesifikt for komplekset av interesse. For eksempel kan FcR-antistoff kompleksene detekteres for eksempel ved anvendelse av et enzym-bundet antistoff eller antistoff fragment som gjenkjenner eller spesifikt binder til antistoff-FcR kompleksene. Alternativt kan kompleksene detekteres ved anvendelse av et hvilket som helst av et antall andre immunoundersøkelser. For eksempel kan antistoffet bli radioaktivt merket og anvendt i en radioimmunoundersøkelse (RIA) (se for eksempel Weintraub, B., ”Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques”, The Endocrine Society, mars 1986, som er innbefattet med referanse heri). Deb radioaktive isotopen kan detekteres ved slike metoder som anvendelse av en γ teller eller en scintillasjonsteller eller ved autoradiografi.
I et annet aspekt tilveiebringer foreliggende beskrivelse en sammensetning, for eksempel en farmasøytisk sammensetning, som inneholder et eller en kombinasjon av monoklonale antistoffer, eller antigen-bindende deler derav, i følge foreliggende beskrivelse, formulert sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer. Slike sammensetninger kan inkludere en eller en kombinasjon av (for eksempel to eller flere forskjellige) antistoffer, eller immunokonjugater eller bispesifikke molekyler i følge foreliggende beskrivelse. For eksempel kan en farmasøytisk sammensetning i følge foreliggende beskrivelse innbefatte en kombinasjon av antistoffer (eller immunokonjugater eller bispesifikke forbindelser) som binder til forskjellige epitoper på mål antigenet eller som har komplementære aktiviteter.
Farmasøytiske sammensetninger i følge foreliggende beskrivelse kan også administreres i kombinasjonsbehandling, for eksempel kombinert med andre midler. For eksempel kan kombinasjonsbehandlingen inkludere et anti-CXCR4 antistoff i følge foreliggende beskrivelse kombinert med minst et annet antiinflammatorisk eller immunoundertrykkende middel. Eksempler på terapeutiske midler som kan anvendes i kombinasjonsbehandling er beskrevet i større detalj nedenfor i delen som omfatter anvendelser av antistoffene i følge foreliggende beskrivelse.
Slik det anvendes heri inkluderer ”farmasøytisk akseptabel bærer” et hvilket som helst og alle løsemidler, dispersjonsmedier, belegg, antibakterielle og antifungale midler, isotonisitets- og absorpsjonsforsinkende midler som er fysiologisk kompatible.
Foretrukket er bæreren egnet for intravenøs, intramuskulær, subkutant, parenteral, spinal eller epidermal administrasjon (for eksempel ved injeksjon eller infusjon).
Avhengig av administrasjonsruten kan den aktive forbindelsen, det vil si antistoffet, immunokonjugatet eller bispesifikke molekylet, være belagt med et materiale for å beskytte forbindelsen fra virkningen av syrer og andre naturlige betingelser som kan inaktivere forbindelsen.
De farmasøytiske forbindelsene i følge foreliggende beskrivelse kan inkludere et eller flere farmasøytisk akseptable salter. Et ”farmasøytisk akseptabelt salt” refererer til et salt som bibeholder den ønskede biologiske aktiviteten til mor forbindelsen og som ikke gir noen uønskede toksikologiske effekter (se for eksempel Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19). Eksempler på slike salter inkluderer syreaddisjonssalter og baseaddisjonssalter. Syreaddisjonssalter inkluderer de som er avledet fra ikke-toksiske uorganiske syrer, slik som saltsyre, salpetersyre, fosforsyre, svovelsyre, hydrobromsyre, hydrojodsyre, fosforsyre, så vel som fra ikke-toksiske organiske syrer slik som alifatiske mono- og dikarboksylsyrer, fenyl-substituerte alkansyrer, hydroksy alkansyrer, aromatiske syrer, alifatiske og aromatiske sulfonsyrer. Baseaddisjonssalter inkluderer de som er avledet fra jordalkalimetaller, slik som natrium, kalium, magnesium, kalsium, så vel som fra ikke-toksiske organiske aminer, slik som N,N'-dibenzyletylendiamin, N-metylglukamin, klorprokain, kolin, dietanolamin, etylendiamin, prokain.
En farmasøytisk sammensetning i følge foreliggende beskrivelse kan også inkludere en farmasøytisk akseptabel antioksidant. Eksempler på farmasøytisk akseptable antioksidanter inkluderer: (1) vannløselige antioksidanter, slik som askorbinsyre, cystein hydroklorid, natrium bisulfat, natrium metabisulfitt, natrium sulfitt; (2) oljeløselige antioksidanter, slik som askorbyl palmitat, butylert hydroksyanisol (BHA), butylert hydroksytoluen (BHT), lecitin, propyl gallat, alfa-tokoferol; og (3) metall sjelatinerende midler, slik som sitronsyre, etylendiamin tetraeddiksyre (EDTA), sorbitol, vinsyre, fosforsyre.
Eksempler på egnede vandige og ikke-vandige bærere som kan anvendes i de farmasøytiske sammensetningene i følge foreliggende beskrivelse inkluderer vann, etanol, polyoler (slik som glyserol, propylen glykol, polyetylen glykol) og egnede blandinger derav, vegetabilske oljer, slike som olivenolje og injiserbare organiske estere, slik som etyl oleat. Passende fluiditet kan opprettholdes for eksempel ved anvendelse av belegningsmaterialer, slike som lecitin, ved opprettholdelse av den påkrevde partikkelstørrelsen i tilfelle dispersjoner og ved anvendelsen av surfaktanter.
Disse sammensetningene kan også inneholde adjuvanser slike som konserveringsmidler, fuktemidler, emulgeringsmidler og dispergeringsmidler. Hindring av tilstedeværelse av mikroorganismer kan forsikres både ved steriliseringsprosedyrer, på forhånd og ved inklusjon av forskjellige antibakterielle og antifungale midler, for eksempel paraben, klorbutanol, fenol sorbinsyre. Det kan også være ønskelig å inkludere isotonisitetsfremmende midler slike som sukker, natrium klorid, inn i sammensetningene. I tillegg kan forlenget absorpsjon av den injiserbare farmasøytiske formen oppnås ved inklusjon av midler som forsinker absorpsjon slik som aluminium monostearat og gelatin.
Farmasøytisk akseptable bærere inkluderer sterile vandige løsninger eller dispersjoner og sterile pulvere for den ekstemporære fremstillingen av sterile injiserbare løsninger eller dispersjoner. Anvendelsen av slike medier og midler for farmasøytisk aktive substanser er kjent i litteraturen. Unntatt tilfelle der eventuelt vanlig media eller middel er inkompatibelt med den aktive forbindelsen er anvendelsen derav i de farmasøytiske sammensetningene i følge foreliggende beskrivelse omfattet. Supplementære aktive forbindelser kan også inkorporeres i sammensetningene.
Terapeutiske sammensetninger må typisk være sterile og stabile under betingelsene for fremstilling og lagring. Sammensetningen kan formuleres som en løsning, mikroemulsjon, liposom eller annen ordnet struktur egnet for høy legemiddel konsentrasjon. Bæreren kan være et løsemiddel eller dispersjonsmedium som for eksempel inneholder vann, etanol, polyol (for eksempel glyserol, propylen glykol og flytende polyetylen glykol) og passende blandinger derav. Passende fluiditet kan for eksempel opprettholdes ved anvendelse av et belegg slik som lecitin, ved opprettholdelse av den påkrevde partikkelstørrelsen i tilfelle dispersjon og ved anvendelse av surfaktanter. I mange tilfeller vil det være foretrukket å inkludere isotonisitetsfremmende midler, for eksempel sukker, polyalkoholer slike som mannitol, sorbitol eller natrium klorid i sammensetningen. Forlenget absorpsjon av de injiserbare sammensetningene kan oppnås ved inkludering i sammensetningen av et middel som forsinker absorpsjon, for eksempel monostearat salter og gelatin.
Sterile injiserbare løsninger kan fremstilles ved inkorporering av den aktive forbindelsen i den påkrevde mengden i et passende løsemiddel med en eller en kombinasjon av ingredienser angitt ovenfor, slik det er påkrevet, fulgt av sterilisering ved mikrofiltrering. Generelt blir dispersjoner fremstilt ved inkorporering av den aktive forbindelsen i en steril vehikkel som inneholder et basisk dispersjonsmedium og de påkrevde andre ingrediensene fra de som er angitt ovenfor. I tilfelle sterile pulvere for fremstilling av sterile injiserbare løsninger er de foretrukne fremgangsmåtene for fremstilling vakuumtørking og frysetørking (lyofilisasjon) som gir et pulver av den aktive ingrediensen pluss en hvilken som helst ytterligere ønsket ingrediens fra en på forhånd steril-filtrert løsning derav.
Mengden av den aktive ingrediensen som kan kombineres med et bærer materiale for å gi en enkel doseringsform vil variere avhengig av subjektet som behandles og den bestemte administrasjonsmåten. Mengden av aktiv ingrediens som kan kombineres med et bærer materiale for å gi en enkel doseringsform vil generelt være den mengden av sammensetningen som gir en terapeutisk effekt. Generelt, av hundre prosent, vil denne mengden variere fra cirka 0.01 prosent til cirka nittini prosent av aktiv ingrediens, foretrukket fra cirka 0.1 prosent til cirka 70 prosent, mest foretrukket fra cirka 1 prosent til cirka 30 prosent av aktiv ingrediens i kombinasjon med en farmasøytisk akseptabel bærer.
Doseringsregimene justeres for å tilveiebringe den optimale ønskede responsen (for eksempel en terapeutisk respons). For eksempel kan en enkel bolus administreres, flere oppdelte doser kan administreres over tid eller dosen kan proporsjonalt reduseres eller økes slik det indikeres ut fra nødvendigheten av den terapeutiske situasjonen. Det er særlig fordelaktig å formulere parenterale sammensetninger i doseringsenhetsform for enkel administrasjon og enhetlig dosering. Doseringsenhetsform slik det anvendes heri refererer til fysisk atskilte enheter egnet for enhetsdoseringer for subjektene som behandles; hvor hver enhet inneholder en forhåndsbestemt mengde av aktiv forbindelse beregnet til å gi den ønskede terapeutiske effekten i assosiasjon med den påkrevde farmasøytiske bæreren. Spesifikasjonen for doseringsenhetsformene i følge foreliggende beskrivelse er diktert ved og direkte avhengig av (a) de unike karakteristikkene til den aktive forbindelsen og den bestemte terapeutiske effekten som skal oppnås, og (b) begrensningene iboende i teknikkens stand når det gjelder sammenblanding av en slik aktiv forbindelse for sensitivitetsbehandling hos individer.
For administrasjon av antistoffet varierer doseringen fra cirka 0.0001 til 100 mg/kg og mer vanlig 0.01 til 5 mg/kg av vertens kroppsvekt. For eksempel kan doseringer være 0.3 mg/kg kroppsvekt, 1 mg/kg kroppsvekt, 3 mg/kg kroppsvekt, 5 mg/kg kroppsvekt eller 10 mg/kg kroppsvekt eller innenfor området 1-10 mg/kg. Et eksempel behandlingsregime omfatter administrasjon en gang per uke, en gang per to uker, en gang per tre uker, en gang per fire uker, en gang per måned, en gang per tredje måned eller en gang per tredje til sjette måned. Foretrukne doseringsregimer for et anti-CXCR4 antistoff i følge foreliggende beskrivelse inkluderer 1 mg/kg kroppsvekt eller 3 mg/kg kroppsvekt via intravenøs administrasjon, hvor antistoffet anvendes ved anvendelse av en eller flere av følgende protokoller: (i) hver fjerde uke for seks doseringer, den hver tredje måned; (ii) hver tredje uke; (iii) 3 mg/kg kroppsvekt en gang fulgt av 1 mg/kg kroppsvekt hver tredje uke.
I noen fremgangsmåter blir to eller flere monoklonale antistoffer med forskjellige bindingsspesifisiteter administrert simultant, i hvilket tilfelle doseringen av hvert antistoff administrert faller innenfor områdene som er indikert. Antistoff blir vanligvis administrert flere ganger. Intervaller mellom enkeldoseringer kan for eksempel være ukentlig, månedlig, hver tredje måned eller årlig. Intervaller kan også være irregulære slik det er indikert ved å måle blodnivåer av antistoff til mål antigenet hos pasienten. I noen fremgangsmåter blir doseringen justert for å oppnå en plasma antistoff konsentrasjon på cirka 1-1000 μg/ml og i noen fremgangsmåter cirka 25-300 μg/ml.
Alternativt kan antistoff administreres som en vedvarende frigivelseformulering, i hvilket tilfelle mindre hyppig administrasjon er påkrevet. Dosering og frekvens varierer avhengig av halveringstiden til antistoffet i pasienten. Generelt viser humane antistoffer den lengste halveringstiden, fulgt av humaniserte antistoffer, kimeriske antistoffer og ikkehumane antistoffer. Doseringen og frekvensen for administrasjon kan variere avhengig av om behandlingen er profylaktisk eller terapeutisk. Ved profylaktiske anvendelser blir en relativt lav dose administrert ved relativt ikke-hyppige intervaller over en lang tidsperiode. Noen pasienter fortsetter å motta behandling i løpet av resten av deres liv. I noen terapeutiske anvendelser er en relativt høy dosering ved relativt korte intervaller til tider påkrevet til progresjon av sykdommen er redusert eller terminert, og foretrukket til pasienten viser delvis eller fullstendig lindring av symptomer på sykdom. Deretter kan pasienten administreres et profylaktisk regime.
Virkelige doseringsnivåer av de aktive ingrediensene i de farmasøytiske sammensetningene i følge foreliggende beskrivelse kan varieres for å oppnå en mengde av den aktive ingrediensen som er effektiv til å oppnå den ønskede terapeutiske responsen for en bestemt pasient, sammensetning og administrasjonsmåte, uten å være toksisk for pasienten. Det valgte doseringsnivået vil avhenge av et antall farmakokinetiske faktorer som inkluderer aktiviteten til de bestemte sammensetningene i følge foreliggende beskrivelse som anvendes eller esteren, saltet eller amidet derav, administrasjonsruten, administrasjonstiden, utskillelseshastigheten av den bestemte forbindelsen som anvendes, varigheten på behandlingen, andre legemidler, forbindelser og/eller materialer anvendt i kombinasjon med de bestemte sammensetningene som anvendes, alderen, kjønnet, vekten, tilstanden, den generelle helsen og tidligere medisinsk historie til pasienten som behandles, og lignende faktorer godt kjent i medisinsk litteratur.
En ”terapeutisk effektiv dose” av et anti-CXCR4 antistoff i følge foreliggende beskrivelse resulterer foretrukket i en reduksjon i alvorligheten av sykdomssymptomene, en økning i frekvens og varighet på sykdomssymptomfrie perioder, eller en hindring av svekkelse eller uførhet på grunn av sykdommen. For eksempel, for behandling av CXCR4<+ >tumorer inhiberer en ”terapeutisk effektiv dosering” foretrukket cellevekst eller tumorvekst med minst cirka 20%, mer foretrukket med minst cirka 40%, enda mer foretrukket med minst cirka 60%, og ytterligere mer foretrukket med minst cirka 80% relativt til ubehandlede subjekter. Evnen til en forbindelse til å inhibere tumorvekst kan evalueres i et dyremodellsystem predikativt for effektivitet på humane tumorer. Alternativt kan denne egenskapen til en sammensetning evalueres ved å undersøke evnen til forbindelsen til å inhibere cellevekst, hvor slik inhibering kan måles in vitro ved undersøkelser kjente for fagmannen. En terapeutisk effektiv mengde av en terapeutisk forbindelse kan redusere tumor størrelse eller på annen måte lindre symptomer hos et subjekt. Fagmannen vil være i stand til å bestemme slike mengder basert på slike faktorer som subjektets størrelse, alvorligheten av subjektets symptomer og den bestemte sammensetningen eller administrasjonsruten som velges.
En sammensetning i følge foreliggende beskrivelse kan administrere via en eller flere administrasjonsruter ved anvendelse av en eller flere av et antall fremgangsmåter kjente i litteraturen. Slik det vil være kjent for fagmannen vil rute og/eller fremgangsmåte for administrasjon variere avhengig av de ønskede resultatene. Foretrukne administrasjonsruter for antistoffer i følge foreliggende beskrivelse inkluderer intravenøs, intramuskulær, intradermal, intraperitoneal, subkutant, spinal eller andre parenterale administrasjonsruter, for eksempel ved injeksjon eller infusjon. Uttrykket ”parenteral administrasjon” slik det anvendes heri betyr administrasjonsmåter forskjellige fra enteral og topisk administrasjon, vanligvis ved injeksjon, og inkluderer, uten begrensning, intravenøs, intramuskulær, intraarterial, intratekal, intrakapsulær, intraorbital, intrakardial, intradermal, intraperitoneal, transtrakeal, subkutant, subkutikulær, intraartikulær, subkapsulær, subaraknoid, intraspinal, epidural og intrasternal injeksjon og infusjon.
Alternativt kan et antistoff i følge foreliggende beskrivelse administreres via en ikkeparenteral rute, slik som en topisk, epidermal eller mukosal administrasjonsrute, for eksempel intranasal, oral, vaginal, rektal, sublingual eller topisk.
De aktive forbindelsene kan fremstilles med bærere som vil beskytte forbindelsen ovenfor rask frigivelse, slik som en kontrollert frigivelseformulering, som inkluderer implantater, transdermale plastere og mikroinnkapslede leveringssystemer.
Bionedbrytbare, biokompatible polymerer kan anvendes, slik som etylenvinylacetat, polyanhydrider, polyglykolsyre, kollagen, polyortoestere og polymelkesyre. Mange fremgangsmåter for fremstilling av slike formuleringer er patenterte eller generelt kjente for fagmannen. Se for eksempel ”Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems”, J.R. Robinson, red., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
Terapeutiske sammensetninger kan administreres med medisinske innretninger kjente i litteraturen. For eksempel, i en foretrukket utførelsesform, kan en terapeutisk sammensetning i følge foreliggende beskrivelse administreres med en nålløs hypodermisk injeksjonsinnretning, hvor slike innretninger er beskrevet i US patentnr.
5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; eller 4,596,556. Eksempler på godt kjente implantater og moduler anvendelige i følge foreliggende beskrivelse inkluderer: US patentnr.4,487,603, som beskriver en implanterbar mikroinfusjonspumpe for å slippe ut medisinering ved en kontrollert hastighet;
US patentnr.4,486,194, som beskriver en terapeutisk innretning for administrering av medikamenter gjennom huden; US patentnr.4,447,233, som beskriver en medisineringsinfusjonspumpe for levering av medisinering ved en presis infusjonshastighet; US patentnr. 4,447,224, som beskriver en variabel strømning implanterbar infusjonsapparatur for kontinuerlig legemiddel levering;
US patentnr.4,439,196, som beskriver et osmotisk legemiddel leveringssystem som har multi-kammer avdelinger; og US patentnr. 4,475,196, som beskriver et osmotisk legemiddel leveringssystem. Disse patentene er innbefattet heri med referanse. Mange andre tilsvarende implantater, leveringssystemer og moduler er kjente for fagmannen.
I visse utførelsesformer kan de humane monoklonale antistoffene i følge foreliggende beskrivelse formuleres for å forsikre om passende fordeling in vivo. For eksempel kan blod-hjerne barriæren (BBB) ekskludere svært hydrofile forbindelser. For å forsikre om at de terapeutiske forbindelsene i følge foreliggende beskrivelse krysser BBB (hvis ønskelig) kan de for eksempel formuleres i liposomer. For fremgangsmåter for fremstilling av liposomer, se for eksempel US patenter 4,522,811; 5,374,548; og 5,399,331. Liposomene kan innbefatte en eller flere bestanddeler som blir selektivt transportert inn i spesifikke celler eller organer, som således øker målrettet legemiddel levering (se for eksempel V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Eksempler på målrettende bestanddeler inkluderer folat eller biotin (se for eksempel US patent 5,416,016 til Low et al.); mannosider (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); antistoffer (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett.357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); surfaktant protein A reseptor (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol.1233:134); p120 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem.269:9090); se også K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett.
346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273.
Antistoffene, særlig de humane antistoffene, antistoff sammensetninger og fremgangsmåter i følge foreliggende beskrivelse har et antall in vitro og in vivo diagnostiske og terapeutiske anvendelser som involverer diagnose og behandling av CXCR4 medierte forstyrrelser. For eksempel kan disse molekylene administreres til celler i kultur, in vitro eller ex vivo, eller til humane subjekter, for eksempel in vivo, for behandling, hindring og diagnostisering av et antall forstyrrelser. Slik det anvendes heri er begrepet ”subjekt” tiltenkt å inkludere humane og ikke-humane dyr. Ikke-humane dyr inkluderer alle vertebrater, for eksempel pattedyr og ikke-pattedyr, slik som ikkehumane primater, sauer, hunder, katter, kuer, hester, kyllinger, amfibier og reptiler. Foretrukne subjekter inkluderer humane pasienter som har forstyrrelser mediert av eller modulert ved CXCR4 aktivitet eller som involverer CXCR4/SDF-1 reaksjonsveien. Når antistoffer ovenfor CXCR4 administreres sammen med et annet middel kan de to administreres i en hvilken som helst rekkefølge eller samtidig.
Gitt den spesifikke bindingen av antistoffene i følge foreliggende beskrivelse for CXCR4 kan antistoffene i følge foreliggende beskrivelse anvendes for spesifikt å detektere CXCR4 ekspresjon på overflaten til celler og kan videre anvendes for å rense CXCR4 via immunoaffinitet rensing.
Egnede administrasjonsruter for antistoff sammensetningene (for eksempel humane monoklonale antistoffer, multispesifikke og bispesifikke molekyler og immunokonjugater) i følge foreliggende oppfinnelse in vivo og in vitro er godt kjente i litteraturen og kan velges av fagmannen. For eksempel kan antistoff sammensetningene administreres ved injeksjon (for eksempel intravenøs eller subkutant). Egnede doseringer av molekylene som anvendes vil avhenge av alderen og vekten til subjektet og konsentrasjonen og/eller formuleringen av antistoff sammensetningen.
Slik det er beskrevet tidligere kan humane anti-CXCR4 antistoffer i følge foreliggende beskrivelse ko-administreres med et eller flere andre terapeutiske midler (for eksempel et cytotoksisk middel, et radiotoksisk middel eller et immunosuppressivt middel.
Antistoffet kan bindes til middelet (som et immunokompleks) eller kan administreres separat fra middelet. I sistnevnte tilfelle (separat administrasjon) kan antistoffet administreres før, etter eller samtidig med middelet eller kan ko-administreres med andre kjente behandlinger, for eksempel en anti-kreft behandling, for eksempel bestråling. Slike terapeutiske midler inkluderer, blant andre, anti-neoplastiske midler slik som doxorubicin (adriamycin), cisplatin bleomycin sulfat, carmustin, klorambucil og cyklofosfamid hydroksyurea som, i seg selv, kun er effektive ved nivåer som er toksiske eller undertoksiske for en pasient. Cisplatin blir intravenøst administrert som en 100 mg/kg dose en gang hver fjerde uke og adriamycin blir intravenøst administrert som en 60-75 mg/ml dose hver 21 dag. Ko-administrasjon av de humane anti-CXCR4 antistoffene, eller antigen bindingsfragmentene derav, i følge foreliggende beskrivelse med kjemoterapeutiske midler tilveiebringer to anti-kreft midler som opererer via forskjellige mekanismer som gir en cytotoksisk effekt for humane tumor celler. Slik koadministrasjon kan løse problemer på grunn av utvikling av resistens ovenfor legemidler eller en forandring i antigenisiteten til tumor cellene som vil gjøre dem ureaktive med antistoffet.
Mål-spesifikke effektor celler, for eksempel effektor celler bundet til sammensetninger (for eksempel humane antistoffer, multispesifikke og bispesifikke molekyler) i følge foreliggende beskrivelse kan også anvendes som terapeutiske midler. Effektor celler for målretting kan være humane leukocytter slik som makrofager, neutrofiler eller monocytter. Andre celler inkluderer eosinofiler, naturlige avlivningsceller og andre IgG- eller IgA-reseptor bærende celler. Hvis ønskelig kan effektor celler oppnås fra subjektet som behandles. De mål-spesifikke effektor cellene kan administreres som en suspensjon av celler i en fysiologisk akseptabel løsning. Antallet celler som administreres kan være i størrelsesorden 10<8>-10<9>, men vil variere avhengig av det terapeutiske formålet. Generelt vil mengden være tilstrekkelig til å oppnå lokalisering av mål cellen, for eksempel en tumor celle som uttrykker CXCR4, og å resultere i celle avlivning for eksempel ved fagocytose. Administrasjonsruter kan også variere.
Behandling med mål-spesifikke effektor celler kan utføres i forbindelse med andre teknikker for fjerning av mål celler. For eksempel kan anti-tumor behandling ved anvendelse av sammensetningene (for eksempel humane antistoffer, multispesifikke og bispesifikke molekyler) i følge foreliggende beskrivelse og/eller effektor celler utstyrt med disse sammensetningene anvendes i forbindelse med kjemoterapi. I tillegg kan kombinasjonsimmunoterapi anvendes for å rette to forskjellige cytotoksiske effektor populasjoner mot tumor celle rejeksjon. For eksempel kan anti-CXCR4 antistoffer bundet til anti-Fc-gamma RI eller anti-CD3 anvendes sammen med IgG- eller IgA-reseptor spesifikke bindingsmidler.
Bispesifikke og multispesifikke molekyler i følge foreliggende beskrivelse kan også anvendes for å modulere FcγR eller FcγR nivåer på effektor celler, slik som ved å dekke og eliminere reseptorene på celle overflaten. Blandinger av anti-Fc reseptorer kan også anvendes for dette formålet.
Sammensetningene (for eksempel humane, humaniserte eller kimeriske antistoffer, multispesifikke og bispesifikke molekyler og immunokonjugater) i følge foreliggende beskrivelse kan ha komplement bindingsseter, slik som deler fra IgG1, -2 eller -3 eller IgM som binder komplement, kan også anvendes i foreliggende komplement. I en utførelsesform kan ex vivo behandling av en populasjon av celler som innbefatter mål celler med et bindingsmiddel i følge foreliggende beskrivelse og passende effektor celler supplementeres med tilsetning av komplement eller serum inneholdende komplement. Fagocytose av mål celler belagte med et bindingsmiddel i følge foreliggende beskrivelse kan forbedres ved binding av komplement proteiner. I en annen utførelsesform kan mål celler belagte med sammensetningene (for eksempel humane antistoffer, multispesifikke og bispesifikke molekyler) i følge foreliggende beskrivelse også lyseres med komplement. I en ytterligere annen utførelsesform aktiverer sammensetningene i følge foreliggende beskrivelse ikke komplement.
Sammensetningene (for eksempel humane, humaniserte eller kimeriske antistoffer, multispesifikke og bispesifikke molekyler og immunokonjugater) i følge foreliggende beskrivelse kan også administreres sammen med komplement. Følgelig, innenfor omfanget av foreliggende beskrivelse, er sammensetningene som innbefatter humane antistoffer, multispesifikke eller bispesifikke molekyler og serum eller komplement. Disse sammensetningene er fordelaktige ved at komplementet blir lokalisert i nærheten av de humane antistoffene, multispesifikke eller bispesifikke molekyler. Alternativt kan de humane antistoffene, multispesifikke eller bispesifikke molekylene i følge foreliggende beskrivelse og komplementet eller serum administreres separat.
Antistoffene i følge foreliggende beskrivelse kan også anvendes i kombinasjon med et eller flere ytterligere terapeutiske antistoffer eller andre bindingsmidler, slik som Ig fusjonsproteiner. Ikke-begrensende eksempler på andre antistoffer eller bindingsmidler med hvilke et anti-CXCR4 antistoff i følge foreliggende beskrivelse kan administreres i kombinasjon inkluderer antistoffer eller bindingsmidler ovenfor CTLA-4, PSMA, CD30, IP-10, IFN- γ, CD70, PD-1, PD-L1, TNF, TNF-R, VEGF, VEGF-R, CCR5, IL-1, IL-18, IL-18R, CD19, Campath-1, EGFR, CD33, CD20, Her-2, CD25, gpIIb/IIIa, IgE, CD11a, α4 integrin, IFNα og IFNAR1.
Også innenfor omfanget av foreliggende beskrivelse er kit som innbefatter antistoff sammensetningene i følge foreliggende beskrivelse (for eksempel humane antistoffer, bispesifikke eller multispesifikke molekyler, eller immunokonjugater) og instruksjoner for anvendelse. Kittet kan ytterligere inneholde et eller flere ytterligere reagenser, slik som et immunosuppressivt reagens, et cytotoksisk middel eller et radiotoksisk middel, eller et eller flere ytterligere humane antistoffer i følge foreliggende beskrivelse (for eksempel et humant antistoff som har en komplementær aktivitet som binder til en epitop i CXCR4 antigenet forskjellig fra det første humane antistoffet).
Følgelig kan pasienter behandlet med antistoff sammensetningene i følge foreliggende beskrivelse bli ytterligere administrert (før, simultant med eller etterfølgende administrasjon av et humant antistoff i følge foreliggende beskrivelse) med et annet terapeutisk middel, slik som et cytotoksisk eller radiotoksisk middel, som øker eller supplerer den terapeutiske effekten til de humane antistoffene.
I andre utførelsesformer kan subjektet i tillegg behandles med et middel som modulerer, for eksempel øker eller inhiberer, ekspresjonen eller aktiviteten til Fcγ eller Fcγ reseptorer for eksempel ved behandling av subjektet med et cytokin. Foretrukne cytokiner for administrering i løpet av behandling med det multispesifikke molekylet inkluderer granulocytt koloni-stimulerende faktor (G-CSF), granulocytt-makrofag koloni-stimulerende faktor (GM-CSF), interferon-γ (IFN-γ) og tumor nekrose faktor (TNF).
Sammensetningene (for eksempel humane antistoffer, multispesifikke og bispesifikke molekyler) i følge foreliggende beskrivelse kan også anvendes for målretting mot celler som uttrykker CXCR4, for eksempel for å merke slike celler. For slik anvendelse kan bindingsmiddelet bindes til et molekyl som kan detekteres. Således tilveiebringer foreliggende beskrivelse fremgangsmåter for å lokalisere ex vivo eller in vitro celler som uttrykker CXCR4. Det detekterbare merket kan for eksempel være en radioisotop, en fluorescens forbindelse, et enzym eller en enzym ko-faktor.
I en særlig utførelsesform tilveiebringer foreliggende beskrivelse fremgangsmåter for å detektere tilstedeværelse av CXCR4 antigen i en prøve, eller å måle mengden av CXCR4 antigen, som innbefatter å bringe prøven, og en kontrollprøve, i kontakt med et humant monoklonalt antistoff, eller en antigen bindende del derav, som spesifikt binder til CXCR4, under betingelser som muliggjør dannelse av et kompleks mellom antistoffet eller del derav og CXCR4. Dannelsen av et kompleks blir deretter detektert, hvori en forskjellig kompleksdannelse mellom prøven og kontrollprøven er indikativ for tilstedeværelse av CXCR4 antigen i prøven.
I en ytterligere annen utførelsesform kan immunokonjugater i følge foreliggende beskrivelse anvendes for å målrette forbindelser (for eksempel terapeutiske midler, merker, cytotoksiner, radiotoksiner, immunosuppressanter, etc.) til celler som har CXCR4 celle overflate reseptorer ved å binde slike forbindelser til antistoffet. Således tilveiebringer foreliggende beskrivelse også fremgangsmåter for å lokalisere ex vivo eller in vivo celler som uttrykker CXCR4 (for eksempel med et detekterbart merke, slik som en radioisotop, en fluorescens forbindelse, et enzym eller en enzym ko-faktor). Alternativt kan immunokonjugatene anvendes for avlivning av celler som har CXCR4 celle overflate reseptorer ved å målrette cytotoksiner eller radiotoksiner mot CXCR4.
CXCR4 er kjent for å være uttrykt på et bredt spekter av tumor celle typer og er også kjent for å være involvert i tumor metastaser. Videre, som en koreseptor for HIV inngang inn i T celler, er CXCR4 kjent for å være involvert i HIV infeksjon. I tillegg har CXCR4/SDF-1 reaksjonsveien vist seg å være involvert i inflammatoriske tilstander. Enda ytterligere har CXCR4/SDF-1 reaksjonsveien vist seg å være involvert i angiogenese eller neovaskularisering. Følgelig kan anti-CXCR4 antistoffene (og immunokonjugatene og bispesifikke molekyler) i følge foreliggende beskrivelse anvendes for å modulere CXCR4 aktivitet i hver av disse kliniske situasjonene, som følger:
CXCR4 har vist seg å være uttrykt av et antall krefttyper og i visse situasjoner har en invers korrelasjon blitt etabler mellom CXCR4 ekspresjon og pasient prognose eller overlevelse. Ikke-begrensende eksempler på krefttyper assosiert med CXCR4 ekspresjon inkluderer: bryst (Muller, A. et al. (2001) Nature 410:50-56); eggstokk (Scotton, C. et al. (2001) Br. J. Cancer 85:891-897); prostata (Taichman, R.S. et al. (2002) Cancer Res.62:1832-1837); ikke-små celle lunge (Spano J.P. et al. (2004) Ann. Oncol. 15:613-617); pankreatisk (Koshiba, T. et al. (2000) Clin. Cancer Res.6:3530-3535); tyroid (Hwang, J.H. et al. (2003) J. Clin. Endocrinol. Metab.88:408-416); nasofaryngeal karsinom (Wang, N. et al. (2005) J. Transl. Med.3:26-33); melanom (Scala, S. et al. (2005) Clin. Cancer Res.11:1835-1841); renal celle karsinom (Staller, P. et al. (2003) Nature 425:307-311); lymfom (Bertolini, F. et al. (2002) Cancer Res.
62:3530-3535); neuroblastom (Geminder, H. et al. (2001) J. Immunol.167:4747-4757); glioblastom (Rempel, S.A. et al. (2000) Clin. Cancer Res.6:102-111); rabdomyosarkom (Libura, J. et al. (2002) Blood 100:2597-2606); kolorektal (Zeelenberg, I.S. et al. (2003) Cancer Res. 63:3833-3839); nyre (Schrader, A.J. et al. (2002) Br. J. Cancer 86:1250-1256); osteosarkom (Laverdiere, C. et al. (2005) Clin. Cancer Res.11:2561-2567); akutt lymfoblastisk leukemi (Crazzolara, R. et al. (2001) Br. J. Haematol.115:545-553); og akutt myeloid leukemi (Rombouts, E.J.C. et al. (2004) Blood 104:550-557).
I lys av det foregående kan anti-CXCR4 antistoffene i følge foreliggende beskrivelse anvendes ved behandling av kreft, som inkluderer, men er ikke begrenset til, kreft valgt fra gruppen som består av bryst, eggstokk, prostata, ikke-små celle lunge, pankreatisk, tyroid, nasofaryngeal karsinom, melanom, renal celle karsinom, lymfom, neuroblastom, glioblastom, rabdomyosarkom, kolorektal, nyre, osteosarkom, akutt lymfoblastisk leukemi og akutt myeloid leukemi. Antistoffet kan anvendes alene eller i kombinasjon med andre kreft behandlinger, slike som kirurgi og/eller bestråling, og/eller med andre anti-neoplastiske midler, slike som de anti-neoplastiske midlene diskutert og fremsatt ovenfor, som inkluderer kjemoterapeutiske legemidler og andre anti-tumor antigen antistoffer, slike som de som binder CD20, Her2, PSMA, Campath-1, EGFR og lignende.
CXCR4 har vist seg å være en koreseptor for HIV inngang i T celler og i tillegg har visse murin anti-CXCR4 antistoffer blitt demonstrert å være i stand til å inhibere inngang av HIV isolater inn i T celler (se Hou, T. et al. (1998) J. Immunol.160:180-188; Carnec, X. et al. (2005) J. Virol.79:1930-1938). Således kan CXCR4 anvendes som en reseptor av viruser for inngang inn i cellen og antistoffer ovenfor CXCR4 kan anvendes for å inhibere celle inngang i slike viruser som anvender CXCR4 som en reseptor. Følgelig kan de humane anti-CXCR4 antistoffene i følge foreliggende beskrivelse anvendes for å inhibere inngang av et virus inn i en celle, hvori viruset anvender CXCR4 som en reseptor for celle inngangen, slik at viral infeksjon blir inhibert. I en foretrukket utførelsesform blir antistoffene anvendt for å inhibere inngang av HIV inn i T celler, for eksempel ved behandling eller hindring av HIV/AIDS.
Antistoffet kan anvendes alene eller i kombinasjon med andre anti-virale midler, slike som anti-retrovirale legemidler slik som AZT eller protease inhibitorer.
CXCR4/SDF-1 reaksjonsveien har vist seg å spille en rolle i et antall inflammatoriske tilstander, som inkluderer, men er ikke begrenset til, inflammatorisk leversykdom (Terada, R. et al. (2003) Lab. Invest.83:665-672); autoimmun ledd inflammasjon (Matthys, P. et al. (2001) J. Immunol.167:4686-4692); allergisk luftveissykdom (Gonzalo, J.A. et al. (2000) J. Immunol. 165:499-508); og periodontal sykdom (Hosokawa, Y. et al. (2005) Clin. Exp. Immunol.141:467-474).
Følgelig kan de humane anti-CXCR4 antistoffene i følge foreliggende beskrivelse som inhiberer binding av SDF-1 til CXCR4 anvendes for å inhibere inflammasjon ved inflammatoriske forstyrrelser, som inkluderer forstyrrelser valgt fra gruppen som består av inflammatorisk leversykdom, autoimmun ledd inflammasjon, allergisk luftveissykdom, periodontal sykdom, reumatoid artritt, inflammatorisk tarmsykdom, systemisk lupus erytematose, Type I diabetes, inflammatoriske hudforstyrrelser (for eksempel psoriasis, lichen planus), autoimmun tyroid sykdom, Sjøgrens syndrom, lunge inflammasjon (for eksempel kronisk obstruktiv lungesykdom, pulmonær sarkoidose, lymfocytisk alveolititt) og inflammatorisk nyresykdom (for eksempel IgA nefropati, glomerulonefritt). Antistoffet kan anvendes alene eller i kombinasjon med andre antiinflammatoriske midler, slik som ikke-steroidale anti-inflammatoriske legemidler (NSAIDer), kortikosteroider (for eksempel prednison, hydrokortison), metotreksat, COX-2 inhibitorer, TNF antagonister (for eksempel etanercept, infliximab, adalimumab) og immunosuppressanter (slik som 6-merkaptopurin, azatioprin og cyklosporin A).
Det har blitt demonstrert at SDF-1 induserer neovaskularisering gjennom rekruttering av CXCR4-uttrykkende hemangiocytter (Jin, D.K. et al. (2006) Nat. Med.12:557-567). Videre kan blokkering av SDF-1/CXCR4 reaksjonsveien attenuere in vivo tumorvekst ved å inhibere angiogenese på en VEGF-uavhengig måte (Guleng, B. et al. (2005) Cancer Res. 65:5864-58-71). Enda ytterligere, slik det er demonstrert i Eksempel 2, er antistoffer i følge foreliggende beskrivelse i stand til å inhibere kapillær rør dannelse in vitro. Følgelig kan anti-CXCR4 antistoffene i følge foreliggende beskrivelse som inhiberer binding av SDF-1 til CXCR4 anvendes for å inhibere angiogenese ved å interferere med SDF-1/CXCR4 reaksjonsveien. Inhibering av angiogenese kan for eksempel anvendes for å inhibere tumorvekst eller tumor metastase (uansett om tumoren er CXCR4<+>). Antistoffet kan anvendes alene eller i kombinasjon med andre anti-angiogene midler, slik som anti-VEGF antistoffer.
Perifere blod stamceller er den foretrukne kilden for stamceller for anvendelse i autolog stamcelle transplantasjon, for eksempel ved behandling av visse hematologiske malignanser. Oppsamling av stamceller fra det perifere blodet krever mobilisering av CD34<+ >stamceller fra benmargen til det perifere blodet. Forskjellige cytokiner, kjemokiner og adhesjonsmolekyler har blitt implisert i reguleringen av denne prosessen (gjennomgått i Gazitt, Y. (2001) J. Hematother. Stem Cell Res.10:229-236), som inkluderer interaksjon mellom CXCR4 og SDF-1. Videre har en små molekyl CXCR4 antagonist blitt demonstrert å stimulere rask mobilisering av CD34<+ >stamceller fra benmargen til periferien (se for eksempel Devine, S.M. et al. (2004) J. Clin. Oncol. 22:1095-1102; Broxmeyer, H.E. et al. (2005) J. Exp. Med.201:1307-1318; Flomenberg, N. et al. (2005) Blood 106:1867-1874). Følgelig kan anti-CXCR4 antistoffer i følge foreliggende beskrivelse som inhiberer CXCR4 aktivitet (det vil si antagonist antistoffer) anvendes for å stimulere mobilisering av CD34<+ >stamceller fra benmargen til det perifere blodet for å muliggjøre anvendelse av slike stamceller ved transplantasjon (for eksempel autolog transplantasjon), for eksempel ved behandling av hematologiske forstyrrelser, slik som multippel myelom og ikke-Hodgkins lymfom. Antistoffet kan anvendes alene eller i kombinasjon med andre midler anvendt for å stimulere mobilisering av stamceller, slik som G-CSF og/eller GM-CSF. Således, i en annen utførelsesform, tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å stimulere mobilisering av CD34<+ >stamceller fra benmarg til perifert blod hos et subjekt, hvor fremgangsmåten innbefatter administrering til subjektet et anti-CXCR4 antistoff i følge oppfinnelsen slik at mobilisering av CD34<+ >stamceller fra benmarg til perifert blod blir stimulert. Fremgangsmåten kan ytterligere innbefatte oppsamling av CD34+ stamceller fra perifert blod, slik som for anvendelse i autolog stamcelle transplantasjon.
Foreliggende beskrivelse blir ytterligere illustrert ved følgende eksempler.
EKSEMPLER
Eksempel 1: Generering av humane monoklonale antistoffer ovenfor CXCR4 Anti-CXCR4 humane monoklonale antistoffer ble generert ved anvendelse av en kombinasjonstilnærming hvori først mus som uttrykker humane antistoff gener ble immunisert til å heve hos musen et repertoir av humane immunoglobuliner spesifikke for human CXCR4 og deretter ble et humant antistoff bibliotek fremstilt fra miltceller til musen og fremvist på fag slik at faget deretter kan screenes for ekspresjon av antistoffer med spesifisitet for CXCR4. Denne kombinasjonstilnærmingen er generelt beskrevet i US søknad nr. 20030091995 av Buechler et al.
R1610 celler (en Kinesisk hamster lunge cellelinje, opprinnelig beskrevet i Thirion, J.P. et al. (1976) Genetics 83:137-147) ble transfektert med en ekspresjonsvektor som koder full-lengde human CXCR4 proteinet slik at proteinet ble uttrykt på overflaten til cellene. En kodon-optimalisert form av CXCR4 cDNA ble anvendt i ekspresjonsvektoren, som ble fremstilt som beskrevet i Mirzabekov, T. et al. (1999) J. Biol. Chem.274:28745-28750. For å øke immunogenisiteten til cellene ble cellene belagt med trinitrofenol (TNP), ved inkubering med en vandig løsning av trinitrobenzensulfonsyre (TNBS), tilgjengelig kommersielt som en 5% løsning (Sigma, kat. #P2297). Mer spesifikt ble 1 x 10<8 >celler vasket en gang med steril PBS, inkubert med 50 µl av den kommersielle 5% TNBS løsningen i en time i mørket ved romtemperatur og deretter vasket tre ganger med PBS. De resulterende TNP-belagte, CXCR-4-uttrykkende R1610 cellene ble anvendt som antigen for immunisering. Det endelige immunogenet var en blanding av 100 µl TNP-belagte, vaskede celler (1 x 10<7 >celler) pluss 100 µl Ribi adjuvans. Musene mottok seks doser av immunogenet over tid.
Fulle humane monoklonale antistoffer for CXCR4 ble fremstilt ved initiell immunisering av KM stammen til transgene transkromosome mus, som uttrykker humane antistoff gener. I denne musestammen har det endogene muse kappa lettkjede genet blitt homogent brutt ned som beskrevet i Chen et al. (1993) EMBO J.12:811-820 og det endogene muse tungkjede genet har blitt homogent brutt ned som beskrevet i Eksempel 1 i PCT publikasjon WO 01/09187. I tillegg bærer denne musestammen et humant kappa lettkjede transgen, KCo5 (som beskrevet i Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851) og som også inneholder SC20 transkromosomet, som bærer den humane Ig tungkjede locus, som beskrevet i PCT publikasjon WO 02/43478. KM mus er også beskrevet i detalj i US søknad nr.20020199213.
For å heve full humane monoklonale antistoffer ovenfor CXCR4 ble mus fra KM Mus<® >stammen immunisert med R1610 celler transfektert til å uttrykke CXCR4 og belagt med TNP (som beskrevet ovenfor for antigenet). Generelle immuniseringsskjemaer for å heve humane antistoffer i musestammer som bærer humane antistoff gener er beskrevet i Lonberg, N. et al (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 og PCT publikasjon WO 98/24884. Musen var 6-16 uker gammel etter den første infusjonen av antigen.
KM mus ble immunisert med antigen i Ribi adjuvans enten intraperitonealt (IP), subkutant (Sc) eller via fotpote (FP), fulgt av 3-21 dager IP, Sc eller FP reimmunisering (i totalt 6 immuniseringer) med antigenet i Ribi adjuvans. Immunresponsen ble overvåket ved retroorbitale blødninger. Plasma ble screenet ved FACS farging av CXCR4-uttrykkende R1610 celler (versus ikke-transfekterte parentale R1610 celler). Mus med tilstrekkelig titrervolum av anti-CXCR4 human immunoglobulin ble anvendt for høsting av milt.
Fremstilling av fag display bibliotek og screening for anti-CXC4 antistoffer
Milt høstet fra immunisert mus beskrevet ovenfor ble anvendt for fremstilling av et fag display bibliotek som uttrykker human antistoff tunge og lette kjeder. Mer spesifikt ble total RNA isolert fra milt, cDNA ble fremstilt fra RNA og human antistoff variabel region cDNA ble spesifikt amplifisert med PCR, essensielt som beskrevet i US patentsøknad 20030091995 av Buechler et al. Biblioteket av human antistoff variabel regioner ble klonet inn i fag ekspresjonsvektorer, igjen essensielt som beskrevet i US patentsøknad 20030091995 av Buechler et al. Fag display biblioteket ble screenet for biblioteksmedlemmer som har affinitet for CXCR4 ved panne behandling med human CXCR4 inkorporert i magnetiske proteoliposomer (CXCR4-MPL). MPLer som uttrykker CXCR4, eller andre syv transmembran (7TM) reseptorer (for eksempel CCR5), slik at den naturlige konformasjonen til 7TM reseptoren opprettholdes, har blitt beskrevet tidligere (se for eksempel Mirzabekov, T. et al. (2000) Nat. Biotechnol.
18:649-654; Babcock, G.J. et al. (2001) J. Biol. Chem.276:38433-38440; PCT publikasjon WO 01/49265; US patentsøknad 20010034432). Kort fortalt ble rekombinant human CXCR4 som inneholder en epitop tag solubilisert fra en transfektert CXCR4-uttrykkende cellelinje ved anvendelse av detergenten CHAPSO og proteinet ble fanget opp på magnetiske perler via epitop tagen. En lipid membran ble rekonstitusjonert i løpet av fjerningen av detergenten, slik at den naturlige membran konformasjonen til CXCR4 ble opprettholdt, for å danne CXCR4-MPLene. Tre runder med behandling i panne for fag display biblioteket på CXCR4-MPLer førte til en 30-ganger anrikning av CXCR4-bindemidler sammenlignet med bakgrunn. Variabel region fragmenter av interesse ble klonet en gang til inn i en Fab ekspresjonsvektor og Fab retestet for antigen binding mot transfekterte CXCR4-uttrykkende celler. Hele antistoffer ble deretter generert fra Fabene ved anvendelse av standard molekylær biologi teknikker.
Fab kloner F7, F9, D1 og E2 ble valgt for ytterligere analyse.
Eksempel 2: Strukturell karakterisering av human anti-CXCR4 monoklonale antistoffer F7, F9, D1 og E2
cDNA sekvensene som koder tung og lettkjede variabel regionene til F7, F9, D1 og E2 Fab klonene, oppnådd fra fag display bibliotek screening som beskrevet i Eksempel 1, ble sekvensert ved anvendelse av standard DNA sekvenseringsteknikker.
Nukleotid og aminosyresekvensene til tungkjede variabel regionen til F7 er vist i Figur 1A og i ”SEQ ID NO”: 33 og 25, respektivt.
Nukleotid og aminosyresekvensene til lettkjede variabel regionen til F7 er vist i Figur 1B og i ”SEQ ID NO”: 37 og 29, respektivt.
Sammenligning av F7 tungkjede immunoglobulin sekvensen med de kjente humane germlinje immunoglobulin tungkjede sekvensene viser at F7 tungkjeden anvender et VH segment fra human germlinje VH 3-48, et D segment fra human germlinje 4-23 og et JH segment fra human germlinje JH 6B. Ytterligere analyse av F7 VH sekvensen ved anvendelse av Kabat systemet for CDR region bestemmelse fører til avtegning av tungkjede CDR1, CDR2 og CD3 regionene slik det er vist i Figur 1A og i ”SEQ ID NO”: 1, 5 og 9, respektivt.
Sammenligning av F7 lettkjede immunoglobulin sekvensen med de kjente humane germlinje immunoglobulin lettkjede sekvensene viser at F7 lettkjeden anvender et VL segment fra human germlinje VK L15 og et JK segment fra human germlinje JK 1. Ytterligere analyse av F7 VL sekvensen ved anvendelse av Kabat systemet for CDR region bestemmelse fører til avtegning av lettkjede CDR1, CDR2 og CD3 regionene slik det er vist i Figur 1B og i ”SEQ ID NO”: 13, 17 og 21, respektivt.
Nukleotid og aminosyresekvensene til tungkjede variabel regione til F9 er vist i Figur 2A og i ”SEQ ID NO”: 34 og 26, respektivt.
Nukleotid og aminosyresekvensene til lettkjede variabel regionen til F9 er vist i Figur 2B og i ”SEQ ID NO”: 38 og 30, respektivt.
Sammenligning av F9 tungkjede immunoglobulin sekvensen med de kjente humane germlinje immunoglobulin tungkjede sekvensene viser at F9 tungkjeden anvender et VH segment fra human germlinje VH 3-48, et D segment fra human germlinje 4-23 og et JH segment fra human germlinje JH 6B. Ytterligere analyse av F9 VH sekvensen ved anvendelse av Kabat systemet for CDR region bestemmelse fører til avtegning av tungkjede CDR1, CDR2 og CD3 regionene slik det er vist i Figur 2A og i ”SEQ ID NO”: 2, 6 og 10, respektivt.
Sammenligning av F9 lettkjede immunoglobulin sekvensen med de kjente humane germlinje immunoglobulin lettkjede sekvensene viser at F9 lettkjeden anvender et VL segment fra human germlinje VK L15 og et JK segment fra human germlinje JK 1. Ytterligere analyse av F9 VL sekvensen ved anvendelse av Kabat systemet for CDR region bestemmelse fører til avtegning av lettkjede CDR1, CDR2 og CD3 regionene slik det er vist i Figur 2B og i ”SEQ ID NO”: 14, 18 og 22, respektivt.
Nukleotid og aminosyresekvensene til tungkjede variabel regionen til D1 er vist i Figur 3A og i ”SEQ ID NO”: 35 og 27, respektivt.
Nukleotid og aminosyresekvensene til lettkjede variabel regionen til D1 er vist i Figur 3B og i ”SEQ ID NO”: 39 og 31, respektivt.
Sammenligning av D1 tungkjede immunoglobulin sekvensen med de kjente humane germlinje immunoglobulin tungkjede sekvensene viser at D1 tungkjeden anvender et VH segment fra human germlinje VH 3-48, et D segment fra human germlinje 4-23 og et JH segment fra human germlinje JH 6B. Ytterligere analyse av D1 VH sekvensen ved anvendelse av Kabat systemet for CDR region bestemmelse fører til avtegning av tungkjede CDR1, CDR2 og CD3 regionene slik det er vist i Figur 3A og i ”SEQ ID NO”: 3, 7 og 11, respektivt.
Sammenligning av D1 lettkjede immunoglobulin sekvensen med de kjente humane germlinje immunoglobulin lettkjede sekvensene viser at D1 lettkjeden anvender et VL segment fra human germlinje VK L15 og et JK segment fra human germlinje JK 1. Ytterligere analyse av D1 VL sekvensen ved anvendelse av Kabat systemet for CDR region bestemmelse fører til avtegning av lettkjede CDR1, CDR2 og CD3 regionene slik det vist i Figur 3B og i ”SEQ ID NO”: 15, 19 og 23, respektivt.
Nukleotid og aminosyresekvensene til tungkjede variabel regionen til E2 er vist i Figur 4A og i ”SEQ ID NO”: 36 og 28, respektivt.
Nukleotid og aminosyresekvensene til lettkjede variabel regionen til E2 er vist i Figur 4B og i ”SEQ ID NO”: 40 og 32, respektivt.
Sammenligning av E2 tungkjede immunoglobulin sekvensen med de kjente humane germlinje immunoglobulin tungkjede sekvensene viser at E2 tungkjeden anvender et VH segment fra human germlinje VH 3-48, et D segment fra human germlinje 4-23 og et JH segment fra human germlinje JH 6B. Ytterligere analyse av E2 VH sekvensen ved anvendelse av Kabat systemet for CDR region bestemmelse fører til avtegning av tungkjede CDR1, CDR2 og CD3 regionene slik det er vist i Figur 4A og i ”SEQ ID NO”: 4, 8 og 12, respektivt.
Sammenligning av E2 lettkjede immunoglobulin sekvensen med de kjente humane germlinje immunoglobulin lettkjede sekvensene viser at E2 lettkjeden anvender et VL segment fra human germlinje VK L15 og et JK segment fra human germlinje JK 1. Ytterligere analyse av E2 VL sekvensen ved anvendelse av Kabat systemet for CDR region bestemmelse fører til avtegning av lettkjede CDR1, CDR2 og CD3 regionene slik det er vist i Figur 4B og i ”SEQ ID NO”: 16, 20 og 24, respektivt.
Analyse av rammeverk sekvensene til VH og VL regionene til F7, F9, D1 og E2, sammenlignet med germlinje sekvensene fra hvilke de er avledet, identifiserer forskjellige rammeverk aminosyre residuer som er forskjellige fra germlinje. Visse rammeverk residuer i de N-terminale regionene til VH og VL segmentene ble valgt for “tilbakemutasjon” for å gjenopprette rammeverk residuet til germlinje sekvensen, på grunn av at disse ikke-germlinje residuene i den N-terminale delen ble kodet med primere anvendt for å danne fag display bibliotekene beskrevet i Eksempel 1. Spesielt ble følgende modifiserte former av VH og VL segmentene til F7, F9, D1 og E2 (referert til som “GL” former, for germlinje) dannet ved anvendelse av standard molekylær biologi teknikker for å erstatte germlinje aminosyre residuene ved den indikerte rammeverk posisjonen:
F7GL VH: Q1E, Q6E
F7GL Vk: A1D, R3Q
F9GL VH: Q1E, Q6E
F9GL Vk: E1D, V3Q, L4M
D1GL VH: Q6E
D1GL Vk: V1D, W3Q, V4M
E2GL VH: Q6E
E2GL Vk: E1D, V3Q, L4M
Figur 5A viser oppstilling av F7 (”SEQ ID NO”: 25) og F7GL (”SEQ ID NO”: 41) tungkjede variabel aminosyresekvenser med den germlinje VH 3-48 kodede aminosyresekvensen (”SEQ ID NO”: 49). CDR1, CDR2 og CDR3 regionene er avtegnet.
Figur 5B viser oppstilling av F7 (”SEQ ID NO”: 29) og F7GL (”SEQ ID NO”: 45) lettkjede variabel aminosyresekvenser med den germlinje VK L15 kodede aminosyresekvensen (”SEQ ID NO”: 50). CDR1, CDR2 og CDR3 regionene er avtegnet.
Figur 6A viser oppstilling av F9 (”SEQ ID NO”: 26) og F9GL (”SEQ ID NO”: 42) tungkjede variabel aminosyresekvenser med den germlinje VH 3-48 kodede aminosyresekvensen (”SEQ ID NO”: 49). CDR1, CDR2 og CDR3 regionene er avtegnet.
Figur 6B viser oppstilling av F9 (”SEQ ID NO”: 30) og F9GL (”SEQ ID NO”: 46) lettkjede variabel aminosyresekvenser med den germlinje VK L15 kodede aminosyresekvensen (”SEQ ID NO”: 50). CDR1, CDR2 og CDR3 regionene er avtegnet.
Figur 7A viser oppstilling av D1 (”SEQ ID NO”: 27) og D1GL (”SEQ ID NO”: 43) tungkjede variabel aminosyresekvenser med den germlinje VH 3-48 kodede aminosyresekvensen (”SEQ ID NO”: 49). CDR1, CDR2 og CDR3 regionene er avtegnet.
Figur 7B viser oppstilling av D1 (”SEQ ID NO”: 31) og D1GL (”SEQ ID NO”: 47) lettkjede variabel aminosyresekvenser med den germlinje VK L15 kodede aminosyresekvensen (”SEQ ID NO”: 50). CDR1, CDR2 og CDR3 regionene er avtegnet.
Figur 8A viser oppstilling av E2 (”SEQ ID NO”: 28) og E2GL (”SEQ ID NO”: 44) tungkjede variabel aminosyresekvenser med den germlinje VH 3-48 kodede aminosyresekvensen (”SEQ ID NO”: 49). CDR1, CDR2 og CDR3 regionene er avtegnet.
Figur 8B viser oppstilling av E2 (”SEQ ID NO”: 32) og E2GL (”SEQ ID NO”: 48) lettkjede variabel aminosyresekvenser med den germlinje VK L15 kodede aminosyresekvensen (”SEQ ID NO”: 50). CDR1, CDR2 og CDR3 regionene er avtegnet.
F7, F9, D1 og E2 Fab fragmentene omdannes til full-lengde antistoffer ved anvendelse av standard rekombinant DNA teknikker. For eksempel kan DNA som koder VH og VK regionene til et av Fab fragmentene klones inn i en ekspresjonsvektor som bærer tung og lettkjede konstant regionene slik at de variable regionene blir operativt bundet til de konstante regionene. Alternativt kan separate vektorer anvendes for ekspresjon av fulllengde tungkjeden og full-lengde lettkjeden. Ikke-begrensende eksempler på ekspresjonsvektorer egnet for anvendelse for å danne full-lengde antistoffer inkluderer pIE vektorene beskrevet i US patentsøknad nr.20050153394 av Black.
Eksempel 3: Bindingskarakteristikker til anti-CXCR4 humane monoklonale antistoffer
I dette eksempelet ble bindingskarakteristikkene til anti-CXCR4 antistoffene undersøkt med strømnings cytometri.
Den humane T cellelinjen CEM, som uttrykker naturlig human CXCR4 på dens celle overflate, ble anvendt for å undersøke evnen til F7, F9, D1 og E2 antistoffene til å binde til naturlig celle overflate CXCR4. Full-lengde F7, F9, D1 og E2 ble titrert i en 1:3 serie fortynningsserie, som resulterte i et konsentrasjonsområde fra 300 nM til 5 pM.
Antistoffene ble deretter blandet med CEM celler og ble bundet før de ble detektert med et FITC-konjugert anti-human IgG sekundært antistoff. Cellene ble deretter analysert med fluorescens cytometri. De resulterende midlere fluorescens intensitetene er vist i grafen på Figur 9, som viser at alle fire anti-CXCR4 antistoffene binder til CEM celler. EC50 for binding av F7, F9, D1 og E2 var 21 nM, 14 nM, 80 nM og 290 nM, respektivt.
For å bestemme evnen til et panel av anti-CXCR4 antistoffer til å konkurrere for binding til CXCR4, ble konkurreringsstudier utført. De fire humane anti-CXCR4 antistoffene F9, F7, E2 og D1 ble anvendt, sammen med fire kommersielt tilgjengelige murine monoklonale anti-CXCR4 antistoffer (12G5, 708, 716 og 717; R&D Systems katalog #: MAB170, MAB171, MAB172 og MAB173, respektivt). Anti-CXCR4 antistoffene ble titrert i en 1:3 serie fortynningsserie som resulterer i et konsentrasjonsområde fra 300 nM til 5 pM under nærvær av en konstant konsentrasjon av FITC-merket anti-CXCR4 antistoff F9. Blandingen av antistoffer ble deretter tilsatt til CEM celler og ble bundet. Evnen til hvert antistoff til å konkurrere med F9 for binding til CEM celler ble bestemt ved fluorescent cytometri og deteksjon av FITC. De resulterende midlere fluorescens intensitetene er vist i grafen i Figur 10, som demonstrerer at alle syv antistoffene som ble undersøke (F7, E2, D1, 12G5, 708, 716 og 717) var i stand til å konkurrere med F9 for binding til CEM celler, selv om E2 antistoffet kun demonstrerte delvis inhibering ved høye konsentrasjoner sammenlignet med de andre antistoffene.
I et annet sett av eksperimenter ble evnen til F7 mAb til å binde til et antall forskjellige cellelinjer undersøkt med strømnings cytometri ved å utføre en FACS titrering. Økende mengder av mAb (fra mindre enn 0.001 µg/ml til mer enn 100 µg/ml) ble inkubert med 10000 celler og binding bestemt ved strømnings cytometri. Bmax verdien ble også bestemt, som indikerer tilnærmet hvor mange CXCR4 molekyler som er tilstede på hver celle. Basert på bindingskurvene ble en EC50 for antistoff binding bestemt, hvor resultatene er summert nedenfor i Tabell 1:
Tabell 1: FACS titrerin sresultater for mAb F7 bindin til forsk ellige cellelinjer
Bmax = maks med binding (GMFI enheter)
Resultatet viser at F7 mAb er i stand til å binde effektivt til hver av de seks cellelinjene som ble testet, med de laveste EC50 verdiene observert med Ramos og Raji cellelinjer. Disse dataene viser også at ekspresjonen av CXCR4 reseptoren er høyest for Ramos og Namalwa celler og lavest for MDA-MB-231 celler og DMS79 celler.
I et annet bindingseksperiment ble evnen til F7 mAb til å binde til forskjellige undersett av humane perifere blod mononukleære celler (PBMCer) undersøkt. Humane PBMCer ble isolert ved standard fremgangsmåter og forskjellige cellulære undersett ble isolert med FACS. Særlig ble følgende cellulære undersett isolert: (i) CD3<+>, (ii) CD20<+>; (iii) CD11b<+ >og (iv) CD14<+>. Strømnings cytometri eksperimenter utført med F7 mAb (ved 33 µg/ml) viste at F7 mAb var i stand til å binde effektivt til hvert av de fire undersettene, sammenlignet med et isotyp-matchet kontroll antistoff.
Eksempel 4: Inhibering av SDF-1 binding til CXCR4 med anti-CXCR4 antistoffer
For å bestemme evnen til de anti-CXCR4 humane antistoffene til å inhibere bindingen av SDF-1 til CXCR4 ble en konkurrerende studie utført ved anvendelse av <125>I-merkede SDF-1 og CEM celler, som naturlig uttrykker CXCR4. En sammenligning av anti-CXCR4 antistoffer når det gjelder blokkering av SDF-1 binding til CEM celler ble utført med en standard radio-merket ligand bindingsundersøkelse. De anti-CXCR4 antistoffene ble seriefortynnet 1:3 for å gi et konsentrasjonsområde fra 300 nM til 137 pM. Antistoffene ble tilsatt til 750,000 CEM celler i 100 µl under nærvær av 100 pM <125>I-SDF-1 med en spesifikk aktivitet på 2000 Ci/mmol (Amersham, katalog #IM314-25UCI). Et irrelevant antistoff av samme isotyp ble anvendt som en negativ kontroll. Den totalt mulige bundede radio-merkede liganden ble bestemt ved å la <125>I-SDF-1 binde til CEM celler under fravær av antistoffer i 2 timer ved 4°C. Ikke-spesifikk binding av den radio-merkede liganden ble bestemt ved å muliggjøre at <125>I-SDF-1 ble bundet under nærvær av 1 µM ikke-merket SDF-1 (Peprotech, katalog # 300-28A). Mengden av celle-assosiert <125>I-SDF-1 ble bestemt ved standard fremgangsmåter.
Resultatene er vist i Figur 11, som demonstrerer at F7 antistoffet gir den mest effektive blokkeringen av SDF-1 binding til CXCR4 uttrykt på CEM celler. F9 og D1 antistoffene blokkerte også SDF-1 binding, selv om dette var mer moderat enn F7. E2 antistoffet, selv om det ikke binder til CXCR4 på CEM celler (slik det er demonstrert i Eksempel 3), blokkerte ikke effektivt SDF-1 binding til CXCR4 på CEM celler. EC50 verdiene for SDF-1 blokkering av F7, F9 og D1 var 2.3 nM, 12.5 nM og 28.6 nM, respektivt.
Eksempel 5: Inhibering av SDF-1-indusert kalsium fluks med anti-CXCR4 antistoffer
For å bestemme evnen til de anti-CXCR4 humane antistoffene til å inhibere kalsium fluks i CEM celler indusert med SDF-1 ble CEM celler først merker med et fluorescens fargestoff kalsium 3 (Molecular Devices). Anti-CXCR4 antistoffene ble titrert i en 1:3 serie fortynningsserie som resulterte i et konsentrasjonsområde fra 100 nM til 1 pM og ble bundet til 200,000 CEM celler i 200 µl og inkubert i 10 minutter ved romtemperatur før tilsetning til en Flexstation maskin (Molecular Devices). Som en negativ kontroll ble et irrelevant antistoff av samme isotyp anvendt. Celler ble deretter stimulert med en sluttkonsentrasjon på 50 nM rekombinant human SDF-1α (Peprotech), tilsatt som 500 nM i et volum på 22 µl for et sluttvolum på 222 µl. Den resulterende kalsium fluksen ble målt i 200 sekunder per brønn. Som en positiv kontroll ble cellene under fravær av antistoff stimulert med SDF-1α (fremstilt i Hanks bufrede saltvann (HBS) med 0.1% BSA eller HBS) som ga et maksimum mulig kalsium fluks signal. For å bestemme en grunnlinje ble cellene stimulert med HBS med 0.1% BSA. SDF-1α-stimulert frigivelse av kalsium ble målt ved utviklingen av kalsium-avhengig fluorescens over tid. Arealet under kurven til det resulterende fluorescens diagrammet ble rapportert som en indikasjon på kalsium fluks. Den resulterende inhiberingen av kalsium fluks med anti-CXCR4 antistoffene er angitt i Figur 12. Data ble plottet og EC50 verdiene ble beregnet ved anvendelse av GraphPad Prism software og den ikke-lineære kurvetilpasningen, sigmoidal doserespons formel. Antistoffene F7, F9 og D1 inhiberte SDF-1α-indusert kalsium fluks. Antistoff E2, selv om den ble bundet til CXCR4 (slik det er demonstrert i Eksempel 3), inhiberte den ikke signifikant SDF-1α-indusert kalsium fluks. EC50 verdiene for inhibering av SDF-1-indusert kalsium fluks med F7, F9 og D1 var 0.90 nM, 0.32 nM og 0.57 nM, respektivt.
Eksempel 6: Inhibering av SDF-1-indusert migrering av CEM celler med anti-CXCR4 antistoffer
For å bestemme evnen til de anti-CXCR4 humane antistoffene til å inhibere migrering av CEM celler indusert av SDF-1 ble CEM celler først merket med BATDA reagenset (Perkin Elmer). Anti-CXCR4 antistoffene ble titrert i en 1:3 serie fortynningsserie som resulterte i et konsentrasjonsområde fra 100 nM til 1 pM og ble bundet til merkede CEM celler ved en tetthet på 10 millioner celler per ml. Som en negativ kontroll ble et irrelevant antistoff av samme isotyp anvendt. Rekombinant human SDF-1α (Peprotech) ble tilsatt ved 5 nM ved 30 µl per brønn til det laveste kammeret til en 96 brønns Neuroprobe migreringsplate med 5.7 mm diameter filtere per brønn. Hver brønn inneholder 5 µM porer. Merkede CEM celler med og uten antistoff ble tilsatt på filtrene ved en konsentrasjon på 0.5 millioner celler per brønn i et volum på 50 µl.
Migreringsplaten ble inkubert ved 37°C i 2.5 timer. Migrerte celler ble samlet opp i det laveste kammeret til platen, lysert og detektert med Europium deteksjonsløsning (Perkin Elmer). Kjemi-luminescens signalet ble avlest på et Fusjonsinstrument. Den resulterende inhiberingen av SDF-1a-indusert migrering av anti-CXCR4 antistoffene er vist i Figur 13. Resultatene demonstrerer at antistoffene F7 og F9 inhiberte migrering effektivt, mens antistoffene D1 og E2 inhiberte ikke signifikant migrering. EC50 verdiene for inhibering av SDF-1-indusert CEM celle migrering av F7 og F9 var 12.44 nM og 18.99 nM, respektivt.
Eksempel 7: Inhibering av HuVEC kapillær rør dannelse med anti-CXCR4 antistoffer
I dette eksempelet ble evnen til de anti-CXCR4 humane antistoffene til å inhibere kapillær rør dannelse med human umbilical vene endotel celler (HuVEC) undersøkt. Matrigel ble fortynnet 1:1 med RPMI og tilsatt brønnene i en 96 brønns plate og ble polymerisert i 30 minutter ved 37°C. HuVEC (fra Cambrex, kat. # CC-2519) ved 80% konfluens ble trypsanisert og resuspendert ved 1 x 10<6 >celler per ml i RPMI med 0.5% FBS. Antistoffer ble blandet godt med HuVEC ved en sluttkonsentrasjon på 3 µg/ml og ble inkubert ved romtemperatur i 30 minutter. Et irrelevant antistoff av samme isotyp eller media alene ble anvendt som en negativ kontroll. Som en positiv kontroll for inhibering av rør dannelse ble et muse anti-human αvβ3 (CD51/CD61) antistoff (R&D Systems, kat. # MAB3050) anvendt. HuVEC med eller uten antistoffer ble tilsatt på matrigel-belagte plater og inkubert ved 37°C i 18 timer.
HuVEC inkubert med media alene eller med de isotyp-matchede kontroll antistoff dannede kapillær rørene resulterte i tilsynekomst av sammenkoblede celler over platen med 3-5 forbindelsespunkter eller forgreningspunkter per celle. HuVEC inkubert med enten de anti-CXCR4 humane antistoffene eller det anti-αvβ3 antistoffet dannet ikke kapillær rør. Cellene synes isolerte og med få eller ingen forgreningspunkter. Anti-CXCR4 antistoffene som var mest effektive når det gjaldt å blokkere SDF-1 binding, SDF-1-indusert kalsium fluks og SDF-1-indusert migrering, nemlig F7 og F9, var også de mest effektive i å inhibere kapillær rør dannelse. Anti-CXCR4 antistoffet E2, som binder til CXCR4, men som ikke blokkerer SDF-1 binding eller SDF-1-induserte effekter, inhiberte ikke kapillær rør dannelse.
Eksempel 8: Inhibering av tumor celle proliferasjon in vitro med anti-CXCR4 antistoffer
I dette eksempelet ble evnen til anti-CXCR4 humane antistoffer til å inhibere proliferasjon av Ramos tumor celler (en human Burkitts lymfom cellelinje) in vitro undersøkt. I undersøkelsen ble 1 x 10<4 >celler/brønn inkubert med økende dose (10<-3 >til 300 nM) av F7 IgG4 antistoff, F9 IgG1 antistoff, E2 IgG1 antistoff, F9 Fab’ antistoff eller isotyp kontroller. Cellene ble inkubert med antistoff i 72 timer, med <3>H-tymidin tilsatt i de siste 24 timene med inkubering for å muliggjøre overvåking av celle proliferasjon. Etterfølgende inkuberingen ble inkorporering av <3>H-tymidin med cellene målt ved standard teknikker. Resultatene er vist i grafen i Figur 14. Resultatene viser at F7 IgG4, F9 IgG1 og E2 IgG1 antistoffene var i stand til å inhibere Ramos celle proliferasjon, slik det er indikert ved redusert <3>H-tymidin inkorporering ved inkubering med disse antistoffene, mens F9 Fab’ fragmentet inhiberte ikke celle proliferasjon. Disse resultatene indikerer at de anti-CXCR4 humane antistoffene har en direkte antiproliferativ effekt på tumor cellene in vitro og krever således ikke sekundær tverrbinding for å oppnå en anti-proliferativ effekt.
Eksempel 9: Inhibering av fast tumor celle proliferasjon in vivo med anti-CXCR4 antistoffer
I dette eksempelet ble evnen til de anti-CXCR4 humane antistoffene til å inhibere proliferasjon av en etablert fast tumor in vivo undersøkt ved anvendelse av en Ramos subkutant tumor celle modell. I denne undersøkelsen ble 10 x 10<6 >Ramos celler/mus implantert i sideregionen til hver mus og ble dyrket til en midlere størrelse på 40 mm<3>, beregnet ved lengde x bredde x høyde/2 av tumorene. Musene mottok deretter en intraperitoneal (i.p.) injeksjon av en første dose av antistoff (betegnet som dag 0 av behandling) og mottok en andre i.p. dose av antistoff på dag 7. Mus behandlet med et Fab’ fragment antistoff mottok også i.p. antistoff doser på dag 3 og dag 10. Grupper av mus (n=8) ble behandlet med enten (i) vehikkel; (ii) isotyp kontroll (15 mg/kg) ; (iii) F7 IgG4 (15 mg/kg); (iv) F9 IgG1 (15 mg/kg); (v) F9 Fab’ (10 mg/kg); eller (vi) anti-CD20 positiv kontroll (15 mg/kg). Tumor volum og muse kroppsvekt ble målt ved regulær intervaller (cirka 2-3 ganger/uke) mellom dag 0 og dag 30 etter dosering. Resultatene av eksperimentet er angitt i Figurene 15A, 15B og 15C, som viser midler tumor volum (Figur 15A), median tumor volum (Figur 15B) og median % kroppsvekt forandring (Figur 15C). Resultatene viser at, på samme måte som den positive kontrollen, inhiberte F7 IgG4 og F9 IgG1 antistoffene signifikant tumor cellevekst slik det ble målt ved økt tumor volum, mens F9 Fab’ fragmentet inhiberte ikke tumor cellevekst sammenlignet med isotyp kontrollen. Alle behandlinger ble godt tolerert slik det er indikert ved ingen signifikant kroppsvekt forandring. Forskjellene i kroppsvekter mellom behandlinger var trolig ikke på grunn av vekten av tumorene. Resultatene indikerer at de anti-CXCR4 humane antistoffene er i stand til å inhibere vekst av en etablert fast tumor in vivo.
Eksempel 10: Økt overlevelsestid i en muse systemisk tumor celle modell ved behandling med et anti-CXCR4 antistoff
I dette eksempelet ble evnen til et anti-CXCR4 humane antistoff til å øke overlevelsestid til mus undersøkt ved anvendelse av en Ramos systemisk tumor celle modell. I denne undersøkelsen ble 1 x 10<6 >Ramos celler/mus injisert intravenøst (i.v.) til hver mus på dag 0. Musene mottok deretter en intraperitoneal (i.p.) injeksjon av en første dose av antistoff på dag 1 (det vil si en dag etter i.v. administrasjon av tumor celler) og mottok fire ytterligere i.p. doser av antistoff, på dag 5, 8, 15 og 22 (mus behandlet med det positive kontroll antistoffet ble behandlet kun på dag 1). Grupper av mus (n=8) ble behandlet med enten (i) vehikkel; (ii) isotyp kontroll (15 mg/kg); (iii) F9 IgG1 (15 mg/kg); eller (iv) anti-CD19 positiv kontroll (15 mg/kg). Prosent overlevelse ble målt ved regulær intervaller mellom dag 0 og dag 50 etter dosering (bakben paralyse ble anvendt som sluttpunktet for eksperimentet). Resultatene av eksperimentet er angitt i Figur 16, som viser prosent overlevelse over tid. Median # dagene med overlevelse for mus behandlet med enten vehikkel eller isotyp kontrollen var 23 og 25.5 dager, respektivt, mens median # dager med overlevelse for mus behandlet med en dose av den anti-CD19 positive kontrollen var 39 dager. Signifikant overlevde 100% av mus i gruppen behandlet med fem doser av F9 IgG1 antistoff til slutten av eksperimentet. Disse resultatene indikerer at det anti-CXCR4 humane antistoffet er i stand til å øke overlevelsestider til mus i en systemisk tumor celle modell.
Eksempel 11: Induksjon av apoptose med anti-CXCR4 monoklonalt antistoff F7
I dette eksempelet ble evnen til anti-CXCR4 mAb F7 til å indusere apoptose i forskjellige celler undersøkt. I apoptose undersøkelsen ble F7 mAb ved 10 µg/ml inkubert med enten Ramos celler (500,000 celler), Namalwa celler (500,000 celler) eller R1610 celler transfektert til å uttrykke CXCR4 (100,000 celler). Ikke-transfekterte R1610 celler ble anvendt som en negativ kontroll. Anti-CXCR4 mAb F7 eller isotyp kontroll antistoff ble inkubert med celler ved 37°C og 250 µl prøver ble fjernet ved 24, 48 og 72 timer. For å bestemme apoptose ble celler fra forskjellige tidspunkter inkubert med Annexin V-FITC-FL1 og Propidium jodid – FL3, fulgt av strømnings cytometri. Den kombinerte prosentandelen av celler samlet opp i FL1, FL3 og FL1-FL3 dobbel positive kvadranter ble ansett apoptotiske. For å fjerne bakgrunn ble prosentandel av isotyp antistoff-induserte apoptotiske celler subtrahert fra prosentandelen av F7 mAbinduserte apoptotiske celler.
Resultatene er summert nedenfor i Tabell 2:
Tabell 2: Induks on av a o tose med anti-CXCR4 mAb F7
Total % apoptose verdier er korrigert for grunnlinje forandringer indusert med isotyp kontroll antistoffer.
Resultatene demonstrerer at F7 mAb er i stand til å indusere apoptose i Ramos, Namalwa og R1610-CXCR4 cellene mens F7 hadde ingen effekt på induksjon av apoptose av parentale R1610 celler som indukerer at responsen var CXCR4-spesifikk.
Eksempel 12: Ytterligere studier som viser inhibering av fast tumor celle proliferasjon in vivo med anti-CXCR4 antistoffer
I dette eksempelet ble evnen til anti-CXCR4 humane antistoffer til å inhibere proliferasjon eller indusere apoptose av establerte faste tumorer in vivo undersøkt ved anvendelse av ytterligere tumor celle modeller tilsvarende Ramos modellen beskrevet ovenfor i Eksempel 9. Et antall tumor cellelinjer ble undersøkt. Representative eksperimenter og resultater er som følger.
I et eksperiment ble 7.5 x 10<6 >MDA-MB231 human brystkreft celler/mus implantert i sideregionen til hver mus og ble dyrket til en midlere størrelse på 100 mm<3>, beregnet med lengde x bredde x høyde/2 av tumorer, som var dag 7 etter-implantering. Musene ble randomisert i forskjellige behandlingsgrupper og mottok en intraperitoneal (i.p.) injeksjon av en første dose av antistoff på dag 7 etter-implantering, mottok en andre i.p. dose av antistoff på dag 14 etter-implantering og mottok deretter en tredje dose på dag 46 etter-implantering. Gruppene av mus (n=9) ble behandlet med enten (i) vehikkel (PBS); (ii) IgG1 isotyp kontroll (15 mg/kg) ; (iii) IgG4 isotyp kontroll (15 mg/kg); (iv) F7 IgG1 (15 mg/kg); eller (v) F7 IgG4 (15 mg/kg). Tumor volumer ble målt ved regulære intervaller og det midlere og median tumor volumet bestemt for hver behandlingsgruppe ved hvert intervall. Resultatene av dette eksperimentet er summert nedenfor i Tabell 3, som viser midlere tumor volum (i mm<3>) og % tumorvekst inhibering (TGI) ved dag 52, og median tumor volum (i mm<3>) og % TGI ved dag 59 etter-implantering:
Tabell 3: Tumorvekst inhiberin av MDA-MB231 celler in vivo med mAb F7
I tillegg var en av musene i F7 IgG4 behandlingsgruppen tumorfri ved dag 59.
Resultatene demonstrerer at F7 mAb er i stand til å inhibere vekst av MDA-MB231 brystkreft celler in vivo.
I et andre eksperiment ble 5 x 10<6 >DMS79 humane småcelle lunge karsinom celler/mus implantert i sideregionen til hver mus og ble dyrket til en midlere størrelse på 160 mm<3>, beregnet ved lengde x bredde x høyde/2 av tumorene, som var dag 7 etter-implantering. Musene ble randomisert i forskjellige behandlingsgrupper og mottok intraperitoneale (i.p.) injeksjoner av antistoff på en doseringsprotokoll med Q3Dx5 (hver tredje dag fem ganger). Grupper av mus (n=10) ble behandlet med enten (i) vehikkel (PBS); (ii) IgG4 isotyp kontroll (10 mg/kg); eller (iii) F7 IgG4 (10 mg/kg). Tumor volumer ble målt ved regulære intervaller og det midlere og median tumor volumet bestemt for hver behandlingsgruppe ved hvert intervall. Resultatene av dette eksperimentet er summert nedenfor i Tabell 4, som viser midlere og median tumor volum (i mm<3>) og % tumorvekst inhibering (TGI) ved dag 34 etter-implantering:
Tabell 4: Tumorvekst inhiberin av DMS79 celler in vivo med mAb F7
Resultatene viser at F7 mAb er i stand til å inhibere vekst av DMS79 human småcelle lunge karsinom celler in vivo.
Ytterligere subkutante xenograft tumor modeller ble testet for evnen til anti-CXCR4 antistoffene til å inhibere tumorvekst, i eksperimenter tilsvarende de som er beskrevet ovenfor og i Eksempel 9. I et eksperiment ved anvendelse av SU-DHL-6 B celle lymfom celler viser resultatene at behandling med F7 IgG4 mAb ved 15 mg/kg resulterte i tilnærmet 60% tumorvekst inhibering. Tilsvarende, i et eksperiment ved anvendelse av Namalwa Burkitts lymfom celler, viste resultatene at behandling med F7 IgG4 mAb ved 3 mg/kg resulterte i tilnærmet 70% tumorvekst inhibering. Til forskjell fra dette ble ingen tumorvekst inhibering med F7 mAb observert i eksperimenter ved anvendelse av NIH-H226 lunge karsinom celler eller HPAC humane pankreatiske adenokarsinom celler. Imidlertid viste farging av disse cellene ved F7 mAb i strømnings cytometri eksperimenter minimal in vitro ekspresjon. Selv om tumorcellene in vivo var mulige å farge med mAb ved immunohistokjemi, er det uklart ved hvilket stadie av deres tumorvekst CXCR4 begynte å bli uttrykt. Dette viser at ekspresjon av CXCR4 med disse to cellelinjene var utilstrekkelig til å gi tumorvekst inhibering eller induksjon av apoptose in vivo ved anti-CXCR4 behandling.
Eksempel 13: Inhibering av lunge metastaser in vivo med anti-CXCR4 antistoffer
I dette eksempelet ble evnen til F7 anti-CXCR4 mAb til å inhibere lunge metastaser undersøkt ved anvendelse av en C57 muse systemisk tumor modell. Mer spesifikt ble 0.4 x 10<6 >B16-CXCR4 celler (B16 celler transfektert til å uttrykke human CXCR4) injisert intravenøst i hver av 30 mus i C57 stammen. Musene ble randomisert i tre grupper av ti mus hver, som deretter ble behandlet med enten (i) vehikkel (PBS); (ii) IgG4 isotyp kontroll (5 mg/kg); eller (iii) F7 IgG4 (5 mg/kg). Antistoffet eller vehikkelet ble injisert intraperitonealt 30 minutter etter at B16-CXCR4 cellene ble injisert intravenøst. Lunger ble høstet på dag 14 og antallet lunge metastase noduler ble kvantifisert. Resultatene er summert nedenfor i Tabell 5, som viser midlere og median antall lunge metastaser i hver gruppe:
Tabell 5: Inhiberin av lun e metastaser in vivo med mAb F7
Resultatene viser at behandling med F7 mAb fører til en reduksjon i det midlere antalle lunge metastase noduler på 56%, hvorved reduksjon kun var 15% med isotyp kontroll antistoffet, som viser at F7 mAb er i stand til å inhibere lunge metastaser i en systemisk tumor modell.

Claims (33)

PATENTKRAV
1. Monoklonalt antistoff eller en antigenbindende del derav, som binder spesifikt til human CXCR4 uttrykt på en celleoverflate og omfatter en tungkjede variabel region omfattende aminosyrer som har en sekvens som er minst 90% identisk med sekvensen som angitt i SEQ ID NO:49 kodet for av et humant VH 3-48 germlinje immunoglobulingen og en lettkjede variabel region omfattende aminosyrer som har en sekvens som er minst 90% identisk med sekvensen som angitt i SEQ ID NO:50 kodet for av et humant VK L15 germlinje immunoglobulingen, hvor nevnte monoklonale antistoff eller antigenbindende del derav omfatter:
(a) en tungkjede variabel region CDR1 omfattende aminosyrer som har sekvensen angitt i SEQ ID NO:1 eller én konservativ aminosyresubstitusjon derav; en tungkjede variabel region CDR2 omfattende aminosyrer som har sekvensen angitt i SEQ ID NO:5 eller én konservativ aminosyresubstitusjon derav; en tungkjede variabel region CDR3 omfattende aminosyrer som har sekvensen angitt i SEQ ID NO:9; en lettkjede variabel region CDR1 omfattende aminosyrer som har sekvensen angitt i SEQ ID NO:13 eller én konservativ aminosyresubstitusjon derav; en lettkjede variabel region CDR2 omfattende aminosyrer som har sekvensen angitt i SEQ ID NO:17 eller én konservativ aminosyresubstitusjon derav; og en lettkjede variabel region CDR3 omfattende aminosyrer som har sekvensen angitt i SEQ ID NO:21 eller én konservativ aminosyresubstitusjon derav;
(b) en tungkjede variabel region CDR1 omfattende aminosyrer som har sekvensen angitt i SEQ ID NO:2 eller én konservativ aminosyresubstitusjon derav; en tungkjede variabel region CDR2 omfattende aminosyrer som har sekvensen angitt i SEQ ID NO:6 eller én konservativ aminosyresubstitusjon derav; en tungkjede variabel region CDR3 omfattende aminosyrer som har sekvensen angitt i SEQ ID NO:10; en lettkjede variabel region CDR1 omfattende aminosyrer som har sekvensen angitt i SEQ ID NO:14 eller én konservativ aminosyresubstitusjon derav; en lettkjede variabel region CDR2 omfattende aminosyrer som har sekvensen angitt i SEQ ID NO:18 eller én konservativ aminosyresubstitusjon derav; og en lettkjede variabel region CDR3 omfattende aminosyrer som har sekvensen angitt i SEQ ID NO:22 eller én konservativ aminosyresubstitusjon derav;
(c) en tungkjede variabel region CDR1 omfattende aminosyrer som har sekvensen angitt i SEQ ID NO:3 eller én konservativ aminosyresubstitusjon derav; en tungkjede variabel region CDR2 omfattende aminosyrer som har sekvensen angitt i SEQ ID NO:7 eller én konservativ aminosyresubstitusjon derav; en tungkjede variabel region CDR3 omfattende aminosyrer som har sekvensen angitt i SEQ ID NO:11; en lettkjede variabel region CDR1 omfattende aminosyrer som har sekvensen angitt i SEQ ID NO:15 eller én konservativ aminosyresubstitusjon derav; en lettkjede variabel region CDR2 omfattende aminosyrer som har sekvensen angitt i SEQ ID NO:19 eller én konservativ aminosyresubstitusjon derav; og en lettkjede variabel region CDR3 omfattende aminosyrer som har sekvensen angitt i SEQ ID NO:23 eller én konservativ aminosyresubstitusjon derav; eller
(d) en tungkjede variabel region CDR1 omfattende aminosyrer som har sekvensen angitt i SEQ ID NO:4 eller én konservativ aminosyresubstitusjon derav; en tungkjede variabel region CDR2 som omfatter aminosyrer som har sekvensen angitt i SEQ ID NO:8 eller én konservativ aminosyresubstitusjon derav; en tungkjede variabel region CDR3 omfattende aminosyrer som har sekvensen angitt i SEQ ID NO:12; en lettkjede variabel region CDR1 omfattende aminosyrer som har sekvensen angitt i SEQ ID NO:16 eller én konservativ aminosyresubstitusjon derav; en lettkjede variabel region CDR2 omfattende aminosyrer som har sekvensen angitt i SEQ ID NO:20 eller én konservativ aminosyresubstitusjon derav; og en lettkjede variabel region CDR3 omfattende aminosyrer som har sekvensen angitt i SEQ ID NO:24 eller én konservativ aminosyresubstitusjon derav, hvor nevnte monoklonale antistoff eller antigenbindende del derav induserer apoptose i celler som uttrykker human CXCR4 og hemmer vekst og/eller induserer apoptose av CXCR4+ tumorceller in vivo.
2. Monoklonalt antistoff eller en antigenbindende del derav ifølge krav 1, som omfatter:
en tungkjede variabel region CDR1 omfattende aminosyrer som har sekvensen angitt i SEQ ID NO:1;
en tungkjede variabel region CDR2 omfattende aminosyrer som har sekvensen angitt i SEQ ID NO:5;
en tungkjede variabel region CDR3 omfattende aminosyrer som har sekvensen angitt i SEQ ID NO:9;
en lettkjede variabel region CDR1 omfattende aminosyrer som har sekvensen angitt i SEQ ID NO:13;
en lettkjede variabel region CDR2 omfattende aminosyrer som har sekvensen angitt i SEQ ID NO:17; og
en lettkjede variabel region CDR3 omfattende aminosyrer som har sekvensen angitt i SEQ ID NO:21.
3. Monoklonalt antistoff eller antigenbindende del derav ifølge krav 1, som omfatter:
(a) en tungkjede variabel region tungkjede omfattende aminosyrer som har en sekvens som er minst 80% homolog med sekvensen angitt i SEQ ID NO:25 eller 41, og en lettkjede variabel region som omfatter aminosyrer som har en sekvens som er minst 80% homolog med sekvensen angitt i SEQ ID NO:29 eller 45;
(b) en tungkjede variabel region omfattende aminosyrer som har sekvensen angitt i SEQ ID NO:26 eller 42 eller en sekvens som er minst 80% homolog med denne, og en lettkjede variabel region som omfatter aminosyrer som har sekvensen angitt i SEQ ID nr:30 eller 46 eller en sekvens som er minst 80% homolog med denne; (c) en tungkjede variabel region omfattende aminosyrer som har sekvensen angitt i SEQ ID NO:27 eller 43 eller en sekvens som er minst 80% homolog med denne, og en lettkjede variabel region som omfatter aminosyrer som har sekvensen angitt i SEQ ID nr:31 eller 47 eller en sekvens som er minst 80% homolog med denne; eller
(d) en tungkjede variabel region omfattende aminosyrer som har sekvensen angitt i SEQ ID NO:28 eller 44 eller en sekvens som er minst 80% homolog med denne, og en lettkjede variabel region som omfatter aminosyrer som har sekvensen angitt i SEQ ID nr:32 eller 48 eller en sekvens som er minst 80% homolog med denne.
4. Monoklonalt antistoff eller antigenbindende del derav ifølge krav 1, som omfatter:
en tungkjede variabel region omfattende aminosyrer som har sekvensen angitt i SEQ ID NO:25 og en lettkjede variabel region som omfatter aminosyrer som har sekvensen angitt i SEQ ID NO:29.
5. Monoklonalt antistoff eller antigenbindende del derav ifølge krav 1, som omfatter:
en tungkjede variabel region omfattende aminosyrer som har sekvensen angitt i SEQ ID NO:41 og en lettkjede variabel region som omfatter aminosyrer som har sekvensen angitt i SEQ ID NO:45.
6. Monoklonalt antistoff eller antigenbindende del derav ifølge krav 1, omfattende:
(a) en tungkjede variabel region bestående av aminosyrer som har sekvensen angitt i SEQ ID NO:26 og en lettkjede variabel region bestående av aminosyrer som har sekvensen angitt i SEQ ID NO:30;
(b) en tungkjede variabel region bestående av aminosyrer som har sekvensen angitt i SEQ ID NO:27 og en lettkjede variabel region bestående av aminosyrer som har sekvensen angitt i SEQ ID NO:31; eller
(c) en tungkjede variabel region bestående av aminosyrer som har sekvensen angitt i SEQ ID NO:28 og en lettkjede variabel region bestående av aminosyrer som har sekvensen angitt i SEQ ID NO:32.
7. Monoklonalt antistoff eller antigenbindende del derav ifølge et hvilket som helst av kravene 1-6, som
(a) hemmer binding av SDF-1 til human CXCR4;
(b) hemmer SDF-1-indusert kalsiumfluks i celler som uttrykker human CXCR4; (c) hemmer SDF-1-indusert migrasjon av celler som uttrykker human CXCR4; og/eller
(d) hemmer kapillærrørdannelse ved humane navlestrengsendotelceller;
(e) hemmer metastaser av CXCR4<+ >tumorceller;
(f) øker overlevelsestiden til et CXCR4<+ >tumorbærende individ;
(g) er av en IgG1 eller IgG4 isotype eller en antigenbindende del derav; og/eller (h) er et kimært, humanisert eller humant antistoff eller en antigenbindende del derav.
8. Monoklonalt antistoff eller antigenbindende del derav ifølge et hvilket som helst av kravene 1-7, som
(a) binder til human CXCR4 uttrykt på en celleoverflate med en KD av 1 x 10<-8 >M eller mindre;
(b) binder til human CXCR4 uttrykt på en celleoverflate med en KD på 5 x 10<-9 >M eller mindre;
(c) hemmer binding av SDF-1 til human CXCR4 med en EC50 på 50 nM eller mindre;
(d) hemmer SDF-1-indusert kalsiumfluks i celler som uttrykker human CXCR4 med en EC50 på 3 nM eller mindre; og eller
(e) hemmer SDF-1-indusert migrasjon av celler som uttrykker human CXCR4 med en EC50 på 50 nM eller mindre.
9. Monoklonalt antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1-8, hvor nevnte monoklonale antistoff er et full-lengde antistoff.
10. Monoklonalt antistoff eller antigenbindende del derav ifølge et hvilket som helst av kravene 1-8, hvor den antigenbindende del er et Fab-fragment, et F(ab')2 fragment, et Fab'-fragment, et Fd-fragment, et Fv-fragment eller en scFv.
11. Monoklonalt antistoff eller antigenbindende del derav ifølge krav 10, hvor den antigenbindende del er et F(ab')2 fragment.
12. Immunokonjugat omfattende det monoklonale antistoffet eller den antigenbindende del derav ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 11, bundet til et terapeutisk middel slik som et cytotoksin eller en radioaktiv isotop.
13. Bispesifikt molekyl som omfatter det monoklonale antistoffet eller den antigenbindende del derav ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 11, bundet til en andre funksjonell del som har en annen bindingsspesifisitet enn det monoklonale antistoff eller den antigenbindende del derav.
14. Sammensetning omfattende:
(a) det monoklonalt antistoff eller den antigenbindende del derav ifølge et hvilket som helst av kravene 1-11;
(b) immunokonjugatet ifølge krav 12; eller
(c) det bispesifikke molekyl ifølge krav 13; og
en farmasøytisk akseptabel bærer.
15. Isolert nukleinsyre som koder for det monoklonale antistoff eller den antigenbindende del derav ifølge et hvilket som helst av kravene 1-11.
16. Ekspresjonsvektor som omfatter nukleinsyren ifølge krav 15.
17. Vertscelle som omfatter ekspresjonsvektoren ifølge krav 16.
18. Fremgangsmåte for fremstilling av et anti-CXCR4-antistoff eller en antigenbindende del derav, som omfatter å uttrykke antistoffet eller den antigenbindende del derav i vertscellen ifølge krav 17 og isolering av antistoffet eller antigenbindende del derav fra vertscellen.
19. In-vitro fremgangsmåte for å inhibere CXCR4-aktivitet i en celle som omfatter å bringe cellen i kontakt med det monoklonale antistoffet eller den antigenbindende del derav ifølge et hvilket som helst av kravene 1-11 slik at CXCR4-aktivitet i cellen inhiberes.
20. Fremgangsmåte ifølge krav 19, hvor:
(a) cellen er en tumorcelle som uttrykker CXCR4 og fremgangsmåten resulterer i inhibering av vekst av tumorcellen; eller
(b) cellen er en T-celle som uttrykker CXCR4 og fremgangsmåten resulterer i inhibering av innføring av HIV i cellen.
21. Monoklonalt antistoff eller antigenbindende del derav ifølge et hvilket som helst av kravene 1-8 for anvendelse i en terapeutisk fremgangsmåte for:
(a) inhibering av CXCR4 aktivitet i en celle til et individ;
(b) inhibering av vekst eller metastase av en tumorcelle i et individ, eventuelt hvor tumorcellen er valgt fra en celle av en B-celle leukemi, et lymfom, en akutt lymfoblastisk leukemi, en akutt myeloid leukemi, et småcellet lungekarsinom, en ikke-småcellet lungekreft, en brystkreft, en ovariecancer, en prostatakreft, en kreft i bukspyttkjertelen, en skjoldbruskkjertelkreft, et nasofaryngealt karsinom, et melanom, et nyrecellekarsinom, en neuroblastom, en glioblastom, en rhabdomyosarkom , en kolorektal kreft, en nyrekreft, en osteosarkom og en metastatisk lungekreft;
(c) hemming av innføring av HIV i en T-celle i et individ, hvor nevnte HIV bruker CXCR4 som en koreseptor for innføring i T-cellen;
(d) hemming av inflammasjon i et individ som rammes av en inflammatorisk lidelse;
(e) hemming av angiogenese i et individ eller
(f) stimulering av mobilisering av CD34<+ >stamceller fra beinmarg til perifert blod i et individ, eventuelt hvor fremgangsmåten videre omfatter innsamling av
CD34<+ >stamceller fra perifert blod.
22. Monoklonalt antistoff eller antigenbindende del derav ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6, for anvendelse i en fremgangsmåte for å inhibere CXCR4-aktivitet i en celle til et individ, hvor:
(a) cellen er en tumorcelle som uttrykker CXCR4, og fremgangsmåten resulterer i inhibering av vekst av tumorcellen eller inhibering av metastase av tumorcellen i individet;
(b) cellen er en T-celle som uttrykker CXCR4, og fremgangsmåten resulterer i inhibering av innføring av HIV i individets celle;
(c) cellen er en lymfocytt i en inflammatorisk lidelse og fremgangsmåten resulterer i inhibering av inflammasjon i individet; eller
(d) cellen er involvert i vaskularisering og fremgangsmåten resulterer i modulering av angiogenese i individet.
23. Monoklonalt antistoff eller antigenbindende del derav, for anvendelse ifølge krav 22, hvor tumorcellen er valgt fra en celle av en brystkreft, en eggstokkreft, en prostatakreft, en ikke-småcellet lungekreft, en bukspyttkjertelkreft, skjoldbruskkjertelkreft, nasofaryngealt karsinom, melanom, nyrecellekarsinom, lymfom, neuroblastom, glioblastom, rhabdomyosarkom, kolorektal kreft, nyrekreft, osteosarkom, akutt lymfoblastisk leukemi, akutt myeloid leukemi , et småcellet lungekarsinom og en metastatisk lungekreft.
24. Monoklonalt antistoff eller antigenbindende del derav ifølge et hvilket som helst av kravene 1-11, for anvendelse i en fremgangsmåte for stamcelle transplantasjon omfattende stimulering av mobilisering av CD34<+ >stamceller fra beinmarg til perifert blod; eventuelt hvor fremgangsmåten videre omfatter innsamling av CD34<+ >stamceller fra perifert blod.
25. Monoklonalt antistoff eller antigenbindende del derav ifølge et hvilket som helst av kravene 1-11 for anvendelse, i kombinasjon med et annet terapeutisk middel, i en fremgangsmåte for behandling av kreft hos et individ.
26. Monoklonalt antistoff eller antigenbindende del derav for anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1-11, hvor det andre terapeutiske middel er et antistoff som binder til CTLA-4, PD-1 eller PD-L1.
27. Monoklonalt antistoff eller antigenbindende del derav for anvendelse ifølge krav 25, hvor kreften er en bukspyttkjertelkreft eller et småcellet lungekarsinom.
28. Monoklonal antistoff eller antigenbindende del derav for anvendelse ifølge krav 25, hvor det andre terapeutiske middel er et antistoff som binder til PD-1.
29. Monoklonalt antistoff eller antigenbindende del derav ifølge krav 3 for anvendelse i kombinasjon med et annet terapeutisk middel i en fremgangsmåte for behandling av kreft i et individ.
30. Monoklonalt antistoff eller antigenbindende del derav for anvendelse ifølge krav 29, hvor det monoklonale antistoffet eller den antigenbindende del derav omfatter en tungkjede variabel region omfattende aminosyrer som har sekvensen angitt i SEQ ID NO:25 og en lettkjede variabel region omfattende aminosyrer som har sekvensen angitt i SEQ ID NO:29.
31. Monoklonalt antistoff eller antigenbindende del derav for anvendelse ifølge krav 29 eller 30, hvor det andre terapeutiske middel er et antistoff som binder til CTLA-4, PD-1 eller PD-L1.
32. Monoklonalt antistoff eller antigenbindende del derav for anvendelse ifølge krav 29 eller 30, hvor kreften er en bukspyttkjertelkreft eller et småcellet lungekarsinom.
33. Monoklonalt antistoff eller antigenbindende del derav for anvendelse ifølge krav 29 eller 30, hvor det andre terapeutiske middel er et antistoff som binder til PD-1.
NO20091283A 2006-10-02 2009-03-30 Humane antistoffer som binder CXCR4 og anvendelser derav NO345287B1 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US82785106P 2006-10-02 2006-10-02
PCT/US2007/021152 WO2008060367A2 (en) 2006-10-02 2007-10-01 Human antibodies that bind cxcr4 and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO20091283L NO20091283L (no) 2009-04-24
NO345287B1 true NO345287B1 (no) 2020-11-30

Family

ID=39402166

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20091283A NO345287B1 (no) 2006-10-02 2009-03-30 Humane antistoffer som binder CXCR4 og anvendelser derav

Country Status (30)

Country Link
US (3) US8450464B2 (no)
EP (2) EP2066351B1 (no)
JP (4) JP5417175B2 (no)
KR (3) KR20150065959A (no)
CN (2) CN103897058B (no)
AR (2) AR063086A1 (no)
AU (1) AU2007320024B2 (no)
BR (1) BRPI0718197A2 (no)
CA (1) CA2665239A1 (no)
CL (1) CL2007002835A1 (no)
CY (2) CY1117036T1 (no)
DK (2) DK2486941T3 (no)
EA (1) EA018836B1 (no)
ES (2) ES2553553T3 (no)
HK (1) HK1131904A1 (no)
HU (2) HUE027165T2 (no)
IL (1) IL197831A (no)
LT (1) LT2486941T (no)
ME (1) ME02269B (no)
MX (1) MX2009003306A (no)
NO (1) NO345287B1 (no)
NZ (1) NZ575924A (no)
PL (2) PL2066351T3 (no)
PT (2) PT2066351E (no)
RS (2) RS55740B1 (no)
SG (2) SG10201608268RA (no)
SI (2) SI2486941T1 (no)
TW (2) TWI522366B (no)
WO (1) WO2008060367A2 (no)
ZA (1) ZA200902256B (no)

Families Citing this family (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2009000656A (es) 2006-07-18 2009-03-25 Noxxon Pharma Ag Acidos nucleicos que se fijan a sdf-i.
KR20150065959A (ko) * 2006-10-02 2015-06-15 메다렉스, 엘.엘.시. Ｃｘｃｒ4에 결합하는 인간 항체 및 이의 용도
FR2915102B1 (fr) * 2007-04-23 2014-05-16 Pf Medicament Utilisation d'un anticorps anti-cxcr4 pour le traitement du cancer
AU2008285939B2 (en) * 2007-08-06 2014-09-18 TME Pharma AG SDF-1 binding nucleic acids and the use thereof
US7892546B2 (en) 2008-05-14 2011-02-22 Eli Lilly And Company Anti-CXCR4 antibodies
WO2009140124A1 (en) * 2008-05-14 2009-11-19 Eli Lilly And Company Anti-cxcr4 antibodies
CN102459575A (zh) 2009-06-05 2012-05-16 细胞动力国际有限公司 重编程t细胞和造血细胞的方法
WO2011042398A1 (en) * 2009-10-09 2011-04-14 Ablynx Nv Immunoglobulin single variable domain directed against human cxcr4 and other cell associated proteins and methods to generate them
EP3689911A1 (en) * 2009-11-11 2020-08-05 Ganymed Pharmaceuticals GmbH Antibodies specific for claudin 6 (cldn6)
WO2011083140A1 (en) * 2010-01-08 2011-07-14 Ablynx Nv Immunoglobulin single variable domain directed against human cxcr4
GB201002238D0 (en) * 2010-02-10 2010-03-31 Affitech As Antibodies
EP2371863A1 (en) * 2010-03-30 2011-10-05 Pierre Fabre Médicament Humanized anti CXCR4 antibodies for the treatment of cancer
WO2011161266A1 (en) * 2010-06-25 2011-12-29 Ablynx Nv Improved immunoglobulin single variable domains and constructs thereof directed against cxcr4
US20140120555A1 (en) * 2011-06-20 2014-05-01 Pierre Fabre Medicament Anti-cxcr4 antibody with effector functions and its use for the treatment of cancer
WO2012178137A1 (en) 2011-06-24 2012-12-27 Gillies Stephen D Light chain immunoglobulin fusion proteins and methods of use thereof
WO2013006443A2 (en) 2011-07-01 2013-01-10 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Discovery of a somatic mutation in myd88 gene in lymphoplasmacytic lymphoma
WO2013013025A2 (en) * 2011-07-20 2013-01-24 Medimmune Limited Anti-cxcr4 antibodies and methods of use
AR087364A1 (es) 2011-07-29 2014-03-19 Pf Medicament Anticuerpo anti-cxcr4 y su uso para la deteccion y dianostico de canceres
AR087363A1 (es) * 2011-07-29 2014-03-19 Pf Medicament Uso del anticuerpo i-3859 para la deteccion y diagnostico de los canceres
BR112014011144A2 (pt) * 2011-11-09 2017-05-16 Bristol Myers Squibb Co tratamento de malignidades hematológicas com um anticorpo anti-cxcr4
ES2775207T3 (es) * 2013-02-26 2020-07-24 Roche Glycart Ag Moléculas de unión a antígeno activadoras de linfocitos T biespecíficas específicas para CD3 y CEA
RU2678421C2 (ru) 2013-06-28 2019-01-28 Экс-Боди, Инк. Обнаружение антигена-мишени, фенотипический скрининг и его применение для идентификации специфичных эпитопов-мишеней клеток-мишеней
BR112016002008B1 (pt) * 2013-08-02 2021-06-22 Pfizer Inc. Anticorpos anti-cxcr4, seu uso, conjugado anticorpo-fármaco e composição farmacêutica
EP3030322A2 (en) * 2013-08-05 2016-06-15 Cambridge Enterprise Limited Inhibition of cxcr4 signaling in cancer immunotherapy
CA3206628A1 (en) * 2013-09-12 2015-03-19 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for evaluating and treating waldenstrom's macroglobulinemia
AU2014321251B2 (en) * 2013-09-23 2020-04-16 X-Body, Inc. Methods and compositions for generation of binding agents against cell surface antigens
EP3599248A1 (en) 2013-11-06 2020-01-29 Bristol-Myers Squibb Company Treatment of c1013g/cxcr4-associated waldenström's macroglobulinemia with an anti-cxcr4 antibody
EP3077001B1 (en) 2013-12-06 2020-04-15 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods to distinguish waldenström's macroglobulinemia from igm monoclonal gammopathy of undetermined significance
JP6836398B2 (ja) 2014-01-15 2021-03-03 メディミューン，エルエルシー Ｒｓｖ特異的抗体およびその機能的部分
EP3188800A4 (en) * 2014-09-02 2018-05-09 Cedars-Sinai Medical Center Compositions and methods for treating fibrosing disorders and cancer
WO2016081455A1 (en) 2014-11-17 2016-05-26 Pelican Therapeutics, Inc. Human tnfrsf25 antibody
CA2973317A1 (en) * 2015-01-09 2016-07-14 Adalta Pty Ltd Cxcr4 binding molecules
CA2973355A1 (en) 2015-01-14 2016-07-21 Bristol-Myers Squibb Company Heteroarylene-bridged benzodiazepine dimers, conjugates thereof, and methods of making and using
BR112017022845A2 (pt) 2015-04-23 2018-07-17 Nantomics, Llc neoepítopos de câncer
CA2989144A1 (en) 2015-06-12 2016-12-15 Bristol-Myers Squibb Company Treatment of cancer by combined blockade of the pd-1 and cxcr4 signaling pathways
KR20180089433A (ko) 2015-12-21 2018-08-08 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 부위-특이적 접합을 위한 변이체 항체
CN109152781A (zh) 2016-04-29 2019-01-04 达纳-法伯癌症研究所有限公司 作为myd88突变疾病中的治疗靶标的hck
WO2017196598A1 (en) 2016-05-10 2017-11-16 Bristol-Myers Squibb Company Antibody-drug conjugates of tubulysin analogs with enhanced stability
WO2017214547A1 (en) 2016-06-09 2017-12-14 Pelican Therapeutics, Inc. Anti-tnfrsf25 antibodies
CA3026474A1 (en) 2016-06-20 2017-12-28 Kymab Limited Anti-pd-l1 and il-2 cytokines
CN109641911B (zh) 2016-08-19 2023-02-21 百时美施贵宝公司 seco-环丙吡咯并吲哚化合物和其抗体-药物缀合物以及制备和使用方法
US10398783B2 (en) 2016-10-20 2019-09-03 Bristol-Myers Squibb Company Antiproliferative compounds and conjugates made therefrom
JP2020508697A (ja) * 2017-01-31 2020-03-26 エム・エス・エム・プロテイン・テクノロジーズ・インコーポレイテッド 抗ｃｘｃｒ４抗体
US10457681B2 (en) 2017-08-16 2019-10-29 Bristol_Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a tricyclic moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10508115B2 (en) 2017-08-16 2019-12-17 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having heteroatom-linked aromatic moieties, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10472361B2 (en) 2017-08-16 2019-11-12 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a benzotriazole moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10494370B2 (en) 2017-08-16 2019-12-03 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a pyridine or pyrazine moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10487084B2 (en) 2017-08-16 2019-11-26 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a heterobiaryl moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US20230181635A1 (en) * 2018-03-13 2023-06-15 Fundación Para La Investigación Biomédica Del Hospital Universitario La Paz Anti-cxcr4 antibody combined with activated and expanded natural killer cells for cancer immunotherapy
WO2019209811A1 (en) 2018-04-24 2019-10-31 Bristol-Myers Squibb Company Macrocyclic toll-like receptor 7 (tlr7) agonists
IL312163A (en) 2018-05-29 2024-06-01 Bristol Myers Squibb Co Modified atom groups that sacrifice themselves for use in prodrugs and conjugates and methods of use and preparation
EP3820888A4 (en) 2018-07-13 2022-04-27 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. CO-RECEPTOR SYSTEMS FOR THE TREATMENT OF INFECTIOUS DISEASES
US11554120B2 (en) 2018-08-03 2023-01-17 Bristol-Myers Squibb Company 1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidine compounds as toll-like receptor 7 (TLR7) agonists and methods and uses therefor
CN113453725A (zh) 2018-11-30 2021-09-28 百时美施贵宝公司 包含含有谷氨酰胺的轻链c末端延伸的抗体、其缀合物以及方法和用途
JP2022512481A (ja) 2018-12-12 2022-02-04 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー トランスグルタミナーゼによるコンジュゲーションのための改変抗体、ならびにそのコンジュゲート、方法および用途
WO2021055306A1 (en) 2019-09-16 2021-03-25 Bristol-Myers Squibb Company Dual capture method for analysis of antibody-drug conjugates
US20220401481A1 (en) 2019-11-01 2022-12-22 Magenta Therapeutics, Inc. Dosing regimens for the mobilization of hematopoietic stem and progenitor cells
US20230090552A1 (en) 2020-01-08 2023-03-23 Synthis Therapeutics, Inc. Alk5 inhibitor conjugates and uses thereof
AU2021263754A1 (en) 2020-04-27 2022-12-01 Ensoma, Inc. Methods and compositions for transducing hematopoietic stem and progenitor cells in vivo
CN112521500B (zh) * 2020-12-25 2022-06-24 暨南大学 与cxcr4结合的亲和力成熟结合蛋白及应用
CN112661845B (zh) * 2020-12-25 2022-06-21 暨南大学 与cxcr4结合的亲和力成熟结合蛋白及其应用
WO2022197776A1 (en) 2021-03-16 2022-09-22 Magenta Therapeutics, Inc. Dosing regimens for hematopoietic stem cell mobilization for stem cell transplants in multiple myeloma patients
CN117003876B (zh) * 2023-08-31 2024-06-18 恺佧生物科技(上海)有限公司 一种Anti-CXCR4膜蛋白抗体及其制备方法和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030206909A1 (en) * 2002-02-08 2003-11-06 Shaobing Hua Human monoclonal antibodies against membrane proteins
WO2004059285A2 (en) * 2002-12-23 2004-07-15 Protein Design Labs, Inc. Tumor killing/tumor regression using cxcr4 antagonists
WO2006089141A2 (en) * 2005-02-18 2006-08-24 Dana-Farber Cancer Institute Antibodies against cxcr4 and methods of use thereof

Family Cites Families (150)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4475196A (en) 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4486194A (en) 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US5374548A (en) 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
MX9203291A (es) 1985-06-26 1992-08-01 Liposome Co Inc Metodo para acoplamiento de liposomas.
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4954617A (en) 1986-07-07 1990-09-04 Trustees Of Dartmouth College Monoclonal antibodies to FC receptors for immunoglobulin G on human mononuclear phagocytes
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4881175A (en) 1986-09-02 1989-11-14 Genex Corporation Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
US5013653A (en) 1987-03-20 1991-05-07 Creative Biomolecules, Inc. Product and process for introduction of a hinge region into a fusion protein to facilitate cleavage
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
EP0623679B1 (en) 1987-05-21 2003-06-25 Micromet AG Targeted multifunctional proteins
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5476996A (en) 1988-06-14 1995-12-19 Lidak Pharmaceuticals Human immune system in non-human animal
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
DE68913658T3 (de) 1988-11-11 2005-07-21 Stratagene, La Jolla Klonierung von Immunglobulin Sequenzen aus den variablen Domänen
JP2989002B2 (ja) 1988-12-22 1999-12-13 キリン―アムジエン・インコーポレーテツド 化学修飾顆粒球コロニー刺激因子
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
US6291158B1 (en) 1989-05-16 2001-09-18 Scripps Research Institute Method for tapping the immunological repertoire
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
SG48759A1 (en) 1990-01-12 2002-07-23 Abgenix Inc Generation of xenogenic antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5712375A (en) 1990-06-11 1998-01-27 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue selex
US5763566A (en) 1990-06-11 1998-06-09 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue SELEX
US5789157A (en) 1990-06-11 1998-08-04 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue selex
US6261774B1 (en) 1990-06-11 2001-07-17 Gilead Sciences, Inc. Truncation selex method
US5864026A (en) 1990-06-11 1999-01-26 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue selex
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
WO1994025585A1 (en) 1993-04-26 1994-11-10 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
KR100272077B1 (ko) 1990-08-29 2000-11-15 젠팜인터내셔날,인코포레이티드 이종 항체를 생산할 수 있는 전이유전자를 가진 인간이외의 동물
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
GB9021679D0 (en) * 1990-10-05 1990-11-21 Gorman Scott David Antibody preparation
GB9108652D0 (en) 1991-04-23 1991-06-12 Antisoma Ltd Immunoreactive compounds
DE69233408T2 (de) 1991-12-02 2005-09-22 Cambridge Antibody Technology Ltd., Melbourn Herstellung von Antikörpern auf Phagenoberflächen ausgehend von Antikörpersegmentbibliotheken.
US5885793A (en) 1991-12-02 1999-03-23 Medical Research Council Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
AU3328493A (en) 1991-12-17 1993-07-19 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
AU4116793A (en) 1992-04-24 1993-11-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US6765087B1 (en) 1992-08-21 2004-07-20 Vrije Universiteit Brussel Immunoglobulins devoid of light chains
ES2191016T3 (es) 1992-09-16 2003-09-01 Scripps Research Inst Anticuerpos monoclonales neutralizantes humanos para el virus respiratorio sincitial.
GB9223377D0 (en) 1992-11-04 1992-12-23 Medarex Inc Humanized antibodies to fc receptors for immunoglobulin on human mononuclear phagocytes
JP3919830B2 (ja) 1992-11-28 2007-05-30 財団法人化学及血清療法研究所 抗ネコヘルペスウイルス−１組換え抗体および該抗体をコードする遺伝子断片
WO1994025591A1 (en) 1993-04-29 1994-11-10 Unilever N.V. PRODUCTION OF ANTIBODIES OR (FUNCTIONALIZED) FRAGMENTS THEREOF DERIVED FROM HEAVY CHAIN IMMUNOGLOBULINS OF $i(CAMELIDAE)
WO1994029351A2 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Celltech Limited Antibodies
JP3367581B2 (ja) 1993-10-14 2003-01-14 小野薬品工業株式会社 新規なポリペプチド、その製造方法、そのポリペプチドをコードするｄｎａ、そのｄｎａからなるベクター、そのベクターで形質転換された宿主細胞
AU1866895A (en) 1994-01-04 1995-08-01 Scripps Research Institute, The Human monoclonal antibodies to herpes simplex virus and methods therefor
SE9400088D0 (sv) 1994-01-14 1994-01-14 Kabi Pharmacia Ab Bacterial receptor structures
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6013443A (en) 1995-05-03 2000-01-11 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue SELEX
US6114120A (en) 1995-05-03 2000-09-05 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue selex
US6090382A (en) 1996-02-09 2000-07-18 Basf Aktiengesellschaft Human antibodies that bind human TNFα
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
DE69833755T2 (de) 1997-05-21 2006-12-28 Biovation Ltd. Verfahren zur herstellung von nicht-immunogenen proteinen
US5840598A (en) 1997-08-14 1998-11-24 Micron Technology, Inc. LOC semiconductor assembled with room temperature adhesive
DE19742706B4 (de) 1997-09-26 2013-07-25 Pieris Proteolab Ag Lipocalinmuteine
GB9722131D0 (en) 1997-10-20 1997-12-17 Medical Res Council Method
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
ES2434961T5 (es) 1998-04-20 2018-01-18 Roche Glycart Ag Ingeniería de glicosilación de anticuerpos para mejorar la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo
GB9814383D0 (en) 1998-07-02 1998-09-02 Cambridge Antibody Tech Improvements relating to antibodies
EP1097172A1 (en) 1998-07-21 2001-05-09 Genmab A/S Anti hepatitis c virus antibody and uses thereof
KR100887482B1 (ko) 1999-01-15 2009-03-10 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
US6914128B1 (en) 1999-03-25 2005-07-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing
EP3031917A1 (en) 1999-04-09 2016-06-15 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
US6387620B1 (en) 1999-07-28 2002-05-14 Gilead Sciences, Inc. Transcription-free selex
JP2003516718A (ja) 1999-07-29 2003-05-20 メダレックス インク ＨＥＲ２／ｎｅｕに対するヒトモノクローナル抗体
US7605238B2 (en) 1999-08-24 2009-10-20 Medarex, Inc. Human CTLA-4 antibodies and their uses
EP1212422B1 (en) 1999-08-24 2007-02-21 Medarex, Inc. Human ctla-4 antibodies and their uses
US6794132B2 (en) 1999-10-02 2004-09-21 Biosite, Inc. Human antibodies
DE60035369T2 (de) 1999-12-30 2008-02-28 Dana-Farber Cancer Institute, Inc., Boston Proteoliposomen, die ein integral membranprotein mit einer oder memhreren transmembrandomänen enthalten
AU2002218166A1 (en) 2000-09-08 2002-03-22 Universitat Zurich Collections of repeat proteins comprising repeat modules
US6818216B2 (en) 2000-11-28 2004-11-16 Medimmune, Inc. Anti-RSV antibodies
KR100857943B1 (ko) 2000-11-30 2008-09-09 메다렉스, 인코포레이티드 인간 항체의 제조를 위한 형질전환 트랜스염색체 설치류
US20040001822A1 (en) 2000-12-29 2004-01-01 Avigdor Levanon Y1-isolated molecules comprising epitopes containing sulfated moieties, antibodies to such epitopes, and uses thereof
US20050048512A1 (en) 2001-04-26 2005-03-03 Avidia Research Institute Combinatorial libraries of monomer domains
US20050053973A1 (en) 2001-04-26 2005-03-10 Avidia Research Institute Novel proteins with targeted binding
WO2002088171A2 (en) 2001-04-26 2002-11-07 Avidia Research Institute Combinatorial libraries of monomer domains
US20050089932A1 (en) 2001-04-26 2005-04-28 Avidia Research Institute Novel proteins with targeted binding
US20030157561A1 (en) 2001-11-19 2003-08-21 Kolkman Joost A. Combinatorial libraries of monomer domains
US20040175756A1 (en) 2001-04-26 2004-09-09 Avidia Research Institute Methods for using combinatorial libraries of monomer domains
DE60227067D1 (de) 2001-05-11 2008-07-24 Kirin Pharma Kk Künstliches menschliches chromosom mit dem gen für die lambda-leichte kette menschlicher antikörper
EP1421203A4 (en) 2001-05-17 2005-06-01 Diversa Corp NEW ANTIGEN-BINDING MOLECULES FOR THERAPEUTIC, DIAGNOSTIC, PROPHYLACTIC, ENZYMATIC, INDUSTRIAL AND AGRICULTURAL APPLICATIONS AND METHOD FOR THE PRODUCTION AND SCREENING THEREOF
EP1399484B1 (en) 2001-06-28 2010-08-11 Domantis Limited Dual-specific ligand and its use
WO2004081026A2 (en) 2003-06-30 2004-09-23 Domantis Limited Polypeptides
CA2463879C (en) 2001-10-25 2012-12-04 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
US7442512B2 (en) * 2001-11-30 2008-10-28 Chemocentryx, Inc. Compositions and methods for detecting and treating diseases and conditions related to chemokine receptors
AU2003217912A1 (en) 2002-03-01 2003-09-16 Xencor Antibody optimization
EP1498485A4 (en) 2002-04-09 2006-09-06 Kyowa Hakko Kogyo Kk CELLS WITH MODIFIED GENOM
WO2003105898A1 (en) 2002-06-14 2003-12-24 Centocor, Inc. Modified "s" antibodies
CN1678634A (zh) 2002-06-28 2005-10-05 多曼蒂斯有限公司 免疫球蛋白单个变体抗原结合区及其特异性构建体
ATE481985T1 (de) * 2002-07-03 2010-10-15 Ono Pharmaceutical Co Immunpotenzierende zusammensetzungen
EP3284753B1 (en) * 2002-10-17 2019-06-05 Genmab A/S Human monoclonal antibodies against cd20 for use in the treatment of multiple sclerosis
AU2003286002B2 (en) 2002-11-08 2011-06-16 Ablynx N.V. Single domain antibodies directed against tumour necrosis factor-alpha and uses therefor
WO2004050032A2 (en) 2002-12-02 2004-06-17 Abgenix, Inc. Antibodies against drugs of abuse
JP2006523090A (ja) 2002-12-27 2006-10-12 ドマンティス リミテッド リガンドに、そしてリガンド受容体に特異的な二重特異性単一ドメイン抗体
US9259459B2 (en) 2003-01-31 2016-02-16 Celldex Therapeutics Inc. Antibody vaccine conjugates and uses therefor
EP1627062A1 (en) 2003-05-14 2006-02-22 Domantis Limited A process for recovering polypeptides that unfold reversibly from a polypeptide repertoire
EP1633785B1 (en) * 2003-05-21 2012-11-28 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies against bacillusanthracis protective antigen
HN2004000285A (es) 2003-08-04 2006-04-27 Pfizer Prod Inc ANTICUERPOS DIRIGIDOS A c-MET
EP1660654B1 (en) 2003-09-04 2011-11-09 Medarex, Inc. Expression vector
AU2004284090A1 (en) 2003-10-24 2005-05-06 Avidia, Inc. LDL receptor class A and EGF domain monomers and multimers
EP1697520A2 (en) 2003-12-22 2006-09-06 Xencor, Inc. Fc polypeptides with novel fc ligand binding sites
US20060008844A1 (en) 2004-06-17 2006-01-12 Avidia Research Institute c-Met kinase binding proteins
AU2005307789A1 (en) 2004-11-16 2006-05-26 Avidia Research Institute Protein scaffolds and uses thereof
NZ583153A (en) * 2004-12-21 2011-06-30 Centocor Ortho Biotech Inc Anti-IL-12 antibodies, epitopes, compositions, methods and uses
JP2008528010A (ja) 2005-01-31 2008-07-31 アブリンクス ナームローゼ フェンノートシャップ 重鎖抗体の可変ドメイン配列を作出する方法
EP1851251A2 (en) 2005-02-18 2007-11-07 Medarex, Inc. Monoclonal antibodies against prostate specific membrane antigen (psma) lacking in fucosyl residues
BRPI0608815B1 (pt) 2005-03-08 2021-10-13 Pfizer Products Inc Composições de anticorpo anti-ctla-4
JP2009509535A (ja) 2005-09-27 2009-03-12 アムニクス， インコーポレイテッド タンパク様薬剤およびその使用
AU2006317242A1 (en) 2005-11-28 2007-05-31 Genmab A/S Recombinant monovalent antibodies and methods for production thereof
KR20150065959A (ko) * 2006-10-02 2015-06-15 메다렉스, 엘.엘.시. Ｃｘｃｒ4에 결합하는 인간 항체 및 이의 용도
BR112014011144A2 (pt) * 2011-11-09 2017-05-16 Bristol Myers Squibb Co tratamento de malignidades hematológicas com um anticorpo anti-cxcr4
EP3599248A1 (en) * 2013-11-06 2020-01-29 Bristol-Myers Squibb Company Treatment of c1013g/cxcr4-associated waldenström's macroglobulinemia with an anti-cxcr4 antibody

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030206909A1 (en) * 2002-02-08 2003-11-06 Shaobing Hua Human monoclonal antibodies against membrane proteins
WO2004059285A2 (en) * 2002-12-23 2004-07-15 Protein Design Labs, Inc. Tumor killing/tumor regression using cxcr4 antagonists
WO2006089141A2 (en) * 2005-02-18 2006-08-24 Dana-Farber Cancer Institute Antibodies against cxcr4 and methods of use thereof

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
D6: BARIBAUD F. ET AL. "Antigenically Distinct Conformations of CXCR4". Journal of Virology. 2001. Vol. 75, Nr. 19, side 8957-8967., Dated: 01.01.0001 *
ENDRES M.J. ET AL. "CD4-Independent Infection by HIV-2 is mediated by Fusin/CXCR4". Cell. 1996. Vol. 87, side 745-756., Dated: 01.01.0001 *
GULENG B. ET AL. "Blockade of the Stromal Cell–Derived Factor-1/CXCR4 Axis Attenuates In vivo Tumor Growth by Inhibiting Angiogenesis in a Vascular Endothelial Growth Factor–Independent Manner". Cancer Research. 2005. Vol. 65, Nr. 13, side 5864-5871., Dated: 01.01.0001 *
VADAY G. G. ET AL. "CXCR4 and CXCL12 (SDF-1) in Prostate Cancer: Inhibitory Effects of Human Single Chain Fv Antibodies". Clinical Cancer Research. 2004. Vol. 10, Nr. 16, side 5630-5639., Dated: 01.01.0001 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN103897058B (zh) 2018-06-15
IL197831A (en) 2017-01-31
TW200831535A (en) 2008-08-01
EA018836B1 (ru) 2013-11-29
US20130251729A1 (en) 2013-09-26
TWI522366B (zh) 2016-02-21
JP6496673B2 (ja) 2019-04-03
HUE033630T2 (en) 2017-12-28
CL2007002835A1 (es) 2008-05-30
CY1118949T1 (el) 2018-01-10
US10106615B2 (en) 2018-10-23
JP2010505830A (ja) 2010-02-25
SG10201608268RA (en) 2016-11-29
CN103897058A (zh) 2014-07-02
JP2013227339A (ja) 2013-11-07
JP2019054798A (ja) 2019-04-11
BRPI0718197A2 (pt) 2014-09-30
HK1131904A1 (en) 2010-02-12
ES2625798T3 (es) 2017-07-20
SI2066351T1 (sl) 2016-02-29
MX2009003306A (es) 2009-04-23
ME02269B (me) 2016-04-28
SG178712A1 (en) 2012-03-29
NO20091283L (no) 2009-04-24
LT2486941T (lt) 2017-06-12
IL197831A0 (en) 2011-08-01
WO2008060367A9 (en) 2008-07-10
US20100104508A1 (en) 2010-04-29
DK2486941T3 (en) 2017-06-26
CN101528259A (zh) 2009-09-09
CA2665239A1 (en) 2008-05-22
US11312777B2 (en) 2022-04-26
KR20090064589A (ko) 2009-06-19
AU2007320024B2 (en) 2012-11-08
TW201604208A (zh) 2016-02-01
JP5417175B2 (ja) 2014-02-12
CN101528259B (zh) 2014-04-09
RS55740B1 (sr) 2017-07-31
KR20170123712A (ko) 2017-11-08
DK2066351T3 (en) 2015-12-14
PT2486941T (pt) 2017-05-30
SI2486941T1 (sl) 2017-08-31
ZA200902256B (en) 2019-02-27
EP2066351A2 (en) 2009-06-10
US20190031763A1 (en) 2019-01-31
JP6097650B2 (ja) 2017-03-15
JP2016105719A (ja) 2016-06-16
KR20150065959A (ko) 2015-06-15
WO2008060367A2 (en) 2008-05-22
EP2066351B1 (en) 2015-09-09
PL2066351T3 (pl) 2016-02-29
PT2066351E (pt) 2015-11-30
WO2008060367A3 (en) 2008-11-06
EA200900424A1 (ru) 2009-08-28
ES2553553T3 (es) 2015-12-10
AU2007320024A1 (en) 2008-05-22
TWI592425B (zh) 2017-07-21
AR113225A2 (es) 2020-02-19
HUE027165T2 (en) 2016-08-29
AR063086A1 (es) 2008-12-23
US8450464B2 (en) 2013-05-28
CY1117036T1 (el) 2017-04-05
PL2486941T3 (pl) 2017-08-31
EP2486941B1 (en) 2017-03-15
KR101722261B1 (ko) 2017-04-03
NZ575924A (en) 2012-05-25
EP2486941A1 (en) 2012-08-15
RS54424B1 (en) 2016-04-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11312777B2 (en) Human monoclonal antibodies that bind CXCR4 and uses thereof
KR101570252B1 (ko) 글리피칸-3에 대한 단클론 항체
US8496931B2 (en) Monoclonal antibodies against stromal derived factor-1 (SDF-1)
WO2008109533A2 (en) Human antibodies that bind multiple irta family proteins, and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
CHAD Change of the owner's name or address (par. 44 patent law, par. patentforskriften)

Owner name: MEDAREX LLC, US

CHAD Change of the owner's name or address (par. 44 patent law, par. patentforskriften)

Owner name: E.R. SQUIBB & SONS, US