JP2020508697A - 抗cxcr4抗体 - Google Patents
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Abstract
本発明は、CXCR4に対する単一特異的抗体又はその結合断片、その発生機序がCXCR4の活性化に関する疾患の治療におけるこのような抗CXCR4抗体又は結合断片の使用の他に、このような抗CXCR4抗体又は結合断片を含む医薬組成物に関する。
Description
本発明は、単一特異的抗CXCR4抗体及び結合断片、発生機序がCXCR4の活性化に関する疾患の治療におけるこのような抗CXCR4抗体及び結合断片の使用、並びに、このような抗CXCR4抗体及び結合断片を含む医薬組成物及びキットに関する。
7回膜貫通ドメイン受容体としても公知であるGタンパク質共役型受容体(GPCR)は、一般に、様々な生物学的及び病理学的プロセスにおいて重要な役割を果たす、タンパク質のスーパーファミリーを形成する。ケモカイン受容体はGPCRのサブファミリーであり、近くの応答性細胞において定方向走化性を誘導するそのリガンド(すなわち、ケモカイン)の能力にちなんで命名されている。これらのケモカイン受容体のうち、CXCR4(当技術分野において、例えば、LESTR、Fusin又はCD184としても公知)は、白血球の定方向遊走及び活性化を媒介することにより免疫及び炎症応答において重要な役割を果たす。CXCR4はまた、様々ながん細胞株及び組織において発現されるか又は過剰発現されることが、示されている。CXCR4の重要なリガンドは、間質細胞由来因子1(SDF−1、CXCL12としても公知)である。CXCR4とSDF−1との相互作用は、腫瘍成長、浸潤、血管新生及び転移などの腫瘍発生の複数の段階において重要な役割を果たしていると思われる。ユビキチンはCXCR4の別の公知のリガンドである。
CXCR4活性化に関する疾患を治療するとの観点で、いくつものCXCR4アンタゴニストが同定及び/又は開発されている。例えば、ビシクラムCXCR4アンタゴニストであるプレリキサホル又はAMD3100は、多発性骨髄腫及び非ホジキンリンパ腫を有する患者における回収及びその後の自家移植のために血流に造血幹細胞を動員させるために顆粒球コロニー刺激因子と組み合わせて使用することをFDAにより承認されている。CXCR4アンタゴニストペプチドであるLY2510924は現在、がんの第II相臨床試験にある。
公知の抗CXCR4抗体の例は12G5であり、これは一般的に、研究室の実験において試薬/陽性対照として使用されるマウス抗体である。
CXCR4を標的とする利用可能な又は開発中のいくつもの剤があるが、CXCR4を標的とする効果的な治療剤の必要性が依然として存在する。
(発明の要旨)
本発明は、CDR1L、CDR2L及びCDR3Lを有する軽鎖可変領域並びにCDR1H、CDR2H及びCDR3Hを有する重鎖可変領域を含む単一特異的抗体又はその結合断片であって、前記CDR1Lが配列番号1のアミノ酸配列を含み、前記CDR2Lが配列番号2のアミノ酸配列を含み、前記CDR3Lが配列番号3又は4のアミノ酸配列を含み、前記CDR1Hが配列番号5又は6のアミノ酸配列を含み、前記CDR2Hが配列番号7、8、9又は10のアミノ酸配列を含み、かつ前記CDR3Hが配列番号11又は12のアミノ酸配列を含む、単一特異的抗体又はその結合断片に関する。また、1つ以上の保存的改変を含有する配列番号1〜12の配列のバリアントも包含される。抗体又は結合断片は、ヒトCXCR4に特異的に結合する。
本発明は、CDR1L、CDR2L及びCDR3Lを有する軽鎖可変領域並びにCDR1H、CDR2H及びCDR3Hを有する重鎖可変領域を含む単一特異的抗体又はその結合断片であって、前記CDR1Lが配列番号1のアミノ酸配列を含み、前記CDR2Lが配列番号2のアミノ酸配列を含み、前記CDR3Lが配列番号3又は4のアミノ酸配列を含み、前記CDR1Hが配列番号5又は6のアミノ酸配列を含み、前記CDR2Hが配列番号7、8、9又は10のアミノ酸配列を含み、かつ前記CDR3Hが配列番号11又は12のアミノ酸配列を含む、単一特異的抗体又はその結合断片に関する。また、1つ以上の保存的改変を含有する配列番号1〜12の配列のバリアントも包含される。抗体又は結合断片は、ヒトCXCR4に特異的に結合する。
本発明は、配列番号13又は14のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、単一特異的抗体又はその結合断片にさらに関する。また、保存的改変を含有する後者の配列のバリアントも包含される。単一特異的抗体又は結合断片は、配列番号15、16、17、18又は19のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をさらに含む。1つ以上の保存的改変を含有する後者の配列のバリアントも包含される。抗体又は結合断片は、ヒトCXCR4に特異的に結合する。
特定の実施形態では、本発明の上記の単一特異的抗体又は結合断片は、それぞれ、ヒトの操作された抗体又は結合断片である。
より特定の実施形態では、本発明の上記の単一特異的抗体は、IgGアイソタイプである。
本発明は、本発明の単一特異的抗体及び結合断片の治療応用の他に、診断応用をさらに包含する。
ヒト又は別の哺乳動物対象においてCXCR4発現がん細胞を発見するためのインビトロ診断アッセイにおいて、対象から採取されたがん細胞を含有する生検又は液体試料は、CXCR4を検出するために本発明の単一特異的抗体又は結合断片を用いる免疫化学又は免疫組織化学アッセイにおいて分析され得る。ヒト又は他の哺乳動物対象においてCXCR4発現がん細胞及び組織を発見するためのインビボ診断アッセイは、放射性に標識された本発明の単一特異的抗体又は結合断片を使用し得る。アッセイにおいて、放射性標識された抗体又は結合断片は、対象に典型的には非経口的に投与され、その後に免疫シンチグラフィーにより抗体又は結合断片の分布が評価される。
本発明は、バーキットリンパ腫及び乳がんなどのCXCR4を発現するがんを治療する方法であって、治療有効量の本発明の単一特異的抗体又は結合断片をこのような治療を必要とするヒト又は他の哺乳動物対象に投与することを含む方法に、さらに関する。本発明は、バーキットリンパ腫及び乳がんなどのCXCR4を発現するがんの治療のための、本発明の単一特異的抗体又は結合断片の使用にさらに関する。
本発明は、CXCR4を発現する乳がん又は別のがんの転移を予防する方法であって、治療有効量の本発明の単一特異的抗体又は結合断片をこのような治療を必要とするヒト又は非ヒト哺乳動物対象に投与することを含む方法に、さらに関する。本発明は、CXCR4を発現する乳がん又は他のがんの転移の予防のための、本発明の単一特異的抗体又は結合断片の使用にさらに関する。
本発明はまた、治療有効量の本発明の単一特異的抗体又は結合断片及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物に関する。典型的に、このような医薬組成物は対象への非経口投与のためのものであり、したがって、治療有効量の本発明の単一特異的抗体又は結合断片、非経口的に許容される希釈剤、及び任意選択的に、薬学的に許容される賦形剤を含む。本発明の単一特異的抗体又は結合断片を含む診断キットも包含される。
本発明はまた、本発明の単一特異的抗体又は結合断片をコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。したがって、本発明はまた、CDR1L、CDR2L及びCDR3Lを有する軽鎖可変領域並びにCDR1H、CDR2H及びCDR3Hを有する重鎖可変領域を含む単一特異的抗体又はその結合断片をコードするポリヌクレオチド(又は単離されたポリヌクレオチド)であって、前記CDR1Lが配列番号1のアミノ酸配列を含み、前記CDR2Lが配列番号2のアミノ酸配列を含み、前記CDR3Lが配列番号3又は4のアミノ酸配列を含み、前記CDR1Hが配列番号5又は6のアミノ酸配列を含み、CDR2Hが配列番号7、8、9又は10のアミノ酸配列を含み、かつ前記CDR3Hが配列番号11又は12のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチドに、関する。1つ以上の保存的改変を含有する配列番号1〜12の配列のバリアントも、包含される。後者のポリヌクレオチドから発現される抗体又は結合断片は、ヒトCXCR4に特異的に結合する。例えば、ポリヌクレオチドは、配列番号20のCDR1Lをコードするポリヌクレオチド、配列番号21のCDR2Lをコードするポリヌクレオチド、配列番号22又は23のCDR3Lをコードするポリヌクレオチド、配列番号24又は25のCDR1Hをコードするポリヌクレオチド、配列番号26、27、28又は29のCDR2Hをコードするポリヌクレオチド、及び配列番号30又は31のCDR3Hをコードするポリヌクレオチドを含み得る。
より具体的には、単一特異的抗体又はその結合断片をコードするポリヌクレオチド(又は単離されたポリヌクレオチド)は、配列番号13又は14のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み得る。保存的改変を含有する後者の配列のバリアントも包含される。単一特異的抗体又は結合断片は、配列番号15、16、17、18又は19のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をさらに含む。1つ以上の保存的改変を含有する後者の配列のバリアントも包含される。後者のポリヌクレオチドから発現される抗体又は結合断片は、ヒトCXCR4に特異的に結合する。例えば、ポリヌクレオチドは、配列番号32又は33の軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド及び配列番号34、35、36、37又は38の重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含み得る。
本発明は、抗CXCR4抗体及びその使用の他に、抗CXCR4抗体を含む医薬組成物に関する。
本発明がより容易に理解され得るように、ある特定の用語が以下に具体的に定義される。この文献の他の箇所で明示的に定義されない限り、本明細書において使用される全ての他の科学技術用語は、関連技術の当業者により一般的に理解される意味を有する。
添付の特許請求の範囲を含めて本明細書において使用される場合、「a」、「an」及び「the」のような語の単数形は、明らかにそうでないことを文脈が指し示さない限り、対応する複数への言及を包含する。
「ヒトCXCR4」という用語は、そのアミノ酸配列が、GenBank受託番号P61073を有するヒトCXCR4の完全なアミノ酸配列と少なくとも90%、少なくとも95%若しくは少なくとも96%、97%、98%若しくは99%同一であるタンパク質を指し、又はCXCR4と実質的に同じ生物学的機能を有するが、その配列が、1つ以上のアミノ酸の置換、挿入若しくは欠失によりヒトCXCR4の完全なアミノ酸配列とは異なるタンパク質を指す。
「抗体」の一般構造は、当技術分野において周知である。IgG型の抗体について、鎖間ジスルフィド結合を介して架橋された4つのアミノ酸鎖(2つの「重」鎖及び2つの「軽」鎖)がある。重鎖及び軽鎖のそれぞれは、可変のN末端領域及び定常領域を有する。免疫グロブリン抗体の定常領域はFc部分と呼ばれ、ヒトにおいて高度に保存されている。各軽鎖/重鎖ペアの可変領域は、抗体の抗原結合部位を含む可変ドメインを形成する。
重鎖及び軽鎖可変領域のそれぞれは、フレームワーク領域(FR)と称されるより保存された領域が散在する相補性決定領域(CDR)と称される、超可変性の領域にさらに細分され得る。各可変領域は、アミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4で並んだ3つのCDR及び4つのFRから構成される。本明細書において、重鎖の3つのCDRはCDR1H、CDR2H及びCDR3Hと称され、軽鎖の3つのCDRはCDR1L、CDR2L及びCDR3Lと称される。CDRは、抗原との特異的相互作用を形成する残基のほとんどを含有する。以下において、重鎖及び軽鎖可変領域はそれぞれHCVR及びLCVRと称されることがある。
本明細書において使用される場合、抗体若しくは結合断片又はその部分の所与のアミノ酸配列の「保存的改変」という用語は、アミノ酸配列を含有する抗体、結合断片又はその部分の結合性の特徴に有意に影響することもそれを有意に変化させることもない、アミノ酸改変を指す。このような保存的改変としては、アミノ酸の置換、付加及び欠失が挙げられる。改変は、部位特異的変異生成及びPCR媒介変異生成のような当技術分野において公知の標準技術により本開示の抗体中に導入され得る。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、関連する化学的特徴の側鎖を有するアミノ酸残基と置換されるものである。関連する化学的特徴の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、ベータ分岐側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)及び芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン)を有するアミノ酸が挙げられる。したがって、本開示の抗体のCDR領域内の1つ以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基と置換されてよく、改変された抗体は、本明細書において記載される機能アッセイを使用して抗原結合特性の保持について試験され得る。
本明細書において使用される配列のナンバリングは、Kabat et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesdaに従う。本明細書において使用されるCDRの定義は、MacCallum et al. (1996) J. Mol. Biol. 626:732−745に記載されている方法に従う。
本発明による抗体は、Fc領域を含む、完全な若しくは全長の定常領域を含むインタクトなものであってよく、又は抗原結合部分を含みかつ抗原結合能力を保持するこのような抗体の部分若しくは断片(「結合断片」)であってよい。このような部分又は断片は、例えば、それぞれが定常及び可変領域を含有する一対の重鎖及び軽鎖断片から構成されるFab断片(「fragment antigen binding」;すなわち、抗原に結合する抗体の領域)、又は本明細書において開示される抗CXCR4抗体のCDR若しくは可変領域を含むFab’若しくはF(ab’)2断片を含み得る。さらには、このような部分又は断片は、軽鎖及び重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドから製造され得る単鎖Fv断片であって、後者のヌクレオチド配列がリンカー配列により分離されている単鎖Fv断片であり得る(例えば、Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer−Verlag, New York, pp 269−315, 1994)。断片又は部分が特定されているかどうかにかかわらず、本明細書において使用される「結合断片」という用語は、別に指し示さない限り、このような断片又は部分の他に、単鎖形態を含む。タンパク質が、CXCR4に特異的又は優先的に結合する能力を保持しかつ本明細書において開示されるCDR配列を含む限り、タンパク質は、それぞれ、「抗体」及び「結合断片」という用語に含まれる。全長抗体のみが抗体依存性細胞傷害性(ADCC)のようなある特定のエフェクター機能を行い得ることが理解される。
本発明の抗体は、免疫グロブリンクラス(IgA、IgD、IgG、IgM及びIgE)のいずれかから選択される重鎖定常領域を有してよい。好ましくは、本発明の抗体は、IgG型であり、より好ましくはIgG1アイソタイプである。特に逆の記載がない限り、本明細書における「IgG1」という用語はヒトIgG1を指すことが理解されるべきである。
「ヒトの操作された抗体」という用語は、ヒトゲノム配列に由来するフレームワーク、ヒンジ領域及び定常領域と同一又は実質的に同一(実質的にヒト)であるヒト起源のフレームワーク、ヒンジ領域及び定常領域を有する抗体を指す。完全ヒトフレームワーク、ヒンジ領域及び定常領域は、ヒト生殖細胞系列において発現される配列の他に、自発的な体細胞変異を含有する配列を包含する。ヒトの操作された抗体は、その中に1つ以上のアミノ酸置換、欠失若しくは付加及び/又はグリコシル化修飾を含有する完全ヒトフレームワーク、ヒンジ又は定常領域に由来するフレームワーク、ヒンジ又は定常領域を含み得る。「ヒトの操作された結合断片」は、ヒトの操作された抗体の部分又は断片を指す。多くの場合、ヒトの操作された抗体は、ヒトにおいて実質的に非免疫原性である。
様々な異なるヒトフレームワーク配列が、本発明のヒトの操作された抗体の基礎として単独又は組合せで使用されてよい。好ましくは、本発明の抗体のフレームワーク領域は、ヒト起源である又は実質的にヒトのもの(少なくとも95%、97%又は99%のヒト起源)である。ヒト起源のフレームワーク領域の配列は、Current Trends in Monoclonal Antibody Development and Manufacturing, Shire et al., ISBN 978−0−387−76643−0から得ることができる。好ましくは、本発明による抗体において、重鎖のフレームワーク領域は、生殖細胞系列コンセンサス配列サブグループIIIに対応する。好ましくはまた、本発明による抗体において、軽鎖のフレームワーク領域は、生殖細胞系列カッパーIIIコンセンサス配列に対応する。
本明細書において使用される場合、「単一特異的抗体」又は「単一特異的抗体組成物」という用語は、同一のタンパク質配列を有する抗体分子の調製物を指す(イオン性又は酸化マイクロバリアントが挙げられる)。単一特異的抗体組成物は、特定のエピトープについて単一の結合特異性及び親和性を示す。
本明細書において使用される場合、「ヒトCXCR4に特異的に結合する」抗体は、以下の本明細書の実施例4において記載される蛍光フローサイトメトリーベースのアッセイにおける測定で50nM以下のEC50でヒトCXCR4(及び場合により1つ以上の非ヒト種からのCXCR4)に結合するが、例えばCXCR7のような他のGPCRに実質的に結合しない抗体を指す。
抗体に言及する時に本明細書において使用される場合、非CXCR4タンパク質に「実質的に結合しない」という語句は、抗体が非CXCR4タンパク質に全く結合しない又は弱い結合のみを呈することを意味する。このような弱い結合のEC50値は、実施例4に記載される蛍光フローサイトメトリーベースのアッセイにおける測定で100nM以上であり得る。
本明細書において使用される場合、ADCCは抗体依存性細胞傷害性、すなわち、主にFc領域により促される抗体のエフェクター機能である、抗体媒介性の細胞死を指す。IgGアイソタイプ、特にIgG1の抗体は、良好なADCC特性を有することが公知である。
本明細書においてSDF−1又はCXCL12に言及する場合、別の記載又は例示がなければ、それは、例えば、SDF−1アルファ又はCXCL12a及びSDF−1ベータ又はCXCL12bなどの、任意の及び全てのヒトSDF−1バリアントを指すことが意図される。
結合特性に言及する場合、最大半量有効濃度50(EC50)は、所与の抗体のベースラインの結合と最大の結合との中間の応答を誘導する濃度である。それは、本明細書の実施例4に説明されるように、用量応答曲線を介して算出される。
「対象」は哺乳動物、好ましくはヒトである。
「治療すること」(又は「治療する」若しくは「治療」)という用語は、症状、障害、状態又は疾患の進行又は重症度を緩慢化させ、停止させ、低減させ又は後退させることを意味する。
「予防すること」(又は「予防する」若しくは「予防」)という用語は、症状、障害、状態又は疾患の出現、発生又は再発を妨げ、抑制し又は阻害することを意味する。
「治療有効量」という用語は、患者への単回又は複数回用量の投与により所望の治療を提供する、本発明の抗体の量又は用量を指す。
本発明の特定の抗体は、ファージディスプレイライブラリー、及び本明細書において記載される親和性成熟プロセスを起源とする。
ファージディスプレイライブラリーは、ヒトの操作された抗体の生成及び最適化のための出発点を提供する抗体断片の選択のための一般的に使用される技術である。例えば、Hoogenboom (2005) Nat. Biotechnol. 23: 1105−1116;Bradbury & Marks (2004) J. Immunol. Methods 290: 29−49;及びFredericks et al., (2004) Protein Eng. Des. SeI. 17: 95−106を参照。酵母、mRNA及びリボソームのディスプレイライブラリーなどの、生成及び親和性成熟(最適化)のために有用な他の種類のディスプレイ技術が抗体の選択及び最適化のために普及してきている(Hoogenboom、Bradbury & Marks、及びFredericksらを参照)。
ディスプレイライブラリーは、単鎖可変ドメイン抗体断片(scFv)又はFab断片を提示するものであってよく、またコーディングDNA又はRNAを含有してよい。それらは、高い遺伝的多様性又はレパートリーの大きさ(一般的に10^9〜10^13)を有する。これらのライブラリーにおける遺伝的多様性は、一般的に、ナイーブ又は免疫化個体からの免疫グロブリン重鎖及び軽鎖可変遺伝子セグメントのレパートリーをクローニングすることにより作出される。あるいは、この多様性は、化学合成されたCDR断片の使用などの、CDR配列の無作為化により、又はこれらの2つのアプローチの組合せにより達成され得る。次に、(このようなライブラリーからの選択のために)結合ステップが、表面上、(米国特許第6,761,902号に記載されるプロテオリポソームのような)リポソーム上、細胞上などに固定された、溶液中の標的(受容体)を用いて行われ得る。大規模な洗浄後、結合したクローンが回収され、さらなる選択ラウンドのために増幅される。
次に、より良好な安定性及び/又は向上した結合性などのような向上した特性を有する誘導体候補を得るための試みにおいて、最初の最良の結合抗体候補に対して親和性成熟プロセスが行われてよい。以下に限定されないが、定方向包括的変異生成(directed comprehensive mutagenesis)、CDR又は軽鎖/重鎖シャッフリング、CDR中の点挿入若しくは欠失又はこれらのアプローチの任意の組合せのようないくつもの親和性成熟戦略が当業者に利用可能である。
本発明の特定の抗体は、本明細書の実施例1及び2において開示される抗体を含む。本発明はまた、本明細書において提供される可変領域の間のCDRのそれぞれの及びあらゆる可能な交換を包含することが理解されるべきである。好ましくは、重鎖CDRは別の重鎖可変領域のCDRと交換されてよく、同様に、軽鎖CDRは別の軽鎖可変領域のCDRと交換されてよい。
抗体の合成
本発明の抗体は、当技術分野において周知の技術、例えば、組換え技術、インビトロタンパク質発現技術、又はこのような技術又は当技術分野において容易に知られる他の技術との組合せを使用して製造され得る。
本発明の抗体は、当技術分野において周知の技術、例えば、組換え技術、インビトロタンパク質発現技術、又はこのような技術又は当技術分野において容易に知られる他の技術との組合せを使用して製造され得る。
例えば、Fabディスプレイライブラリーのスクリーニングから直接的に又は親和性成熟の後に得られるFab断片は、所望の定常領域をコードする適切な発現ベクターへのクローニングのような一般的に使用される技術によりIgGに変換され得る。
IgG抗体の直接的な製造のために、HEK293又はCHO細胞のような適切な宿主細胞は、IgG抗体を製造及び分泌するために好適な発現系を一過的に又は安定的に形質導入されてよい。発現系は、最適化された比で形質導入される重鎖及び軽鎖発現構築物を含み、又は発現可能な軽鎖遺伝子の他に重鎖遺伝子を含む単一のベクター系を含む。分泌された抗体は、多くの慣用技術のいずれかを使用して精製され得る。例えば、抗体を含有する培養培地は、適合性緩衝液、例えばリン酸緩衝食塩水(pH7.4)で平衡化されたプロテインA又はG Sepharose FFカラムに簡便に適用され得る。次に、非特異的に結合した成分を除去するためにカラムは洗浄される。結合した抗体は、例えばpH勾配の適用により溶出される。抗体含有画分は、例えばSDS−PAGEにより検出され、プールされる。意図する使用に応じて、抗体はさらに精製され得る。抗体は、一般的な技術を使用して濃縮及び/又は滅菌濾過され得る。可溶性凝集物及び多量体は、サイズ排除、疎水性相互作用、イオン交換又はヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどの一般的な技術により効果的に除去され得る。精製された抗体は、典型的に、冷蔵、冷凍又は凍結乾燥されて貯蔵され得る。
Fab抗体が、細菌、真菌(酵母)又は昆虫細胞のような細胞を使用して同様に製造され得ることは当業者に知られている。
本発明の抗体の特性
Fabフォーマット及び/又はIgGフォーマットの本発明の抗体は、いくつもの望ましい生物学的特性に関して特徴付けられた。
Fabフォーマット及び/又はIgGフォーマットの本発明の抗体は、いくつもの望ましい生物学的特性に関して特徴付けられた。
CXCR4への結合は、本発明による抗体の有効性の第1の基準である。本発明による抗体は、トランスフェクトされた発現可能な遺伝子からCXCR4を発現する細胞及び/又はCXCR4を発現する腫瘍細胞株を使用する実験により明らかにされたように、50nM未満、好ましくは10nM未満のEC50でCXCR4に特異的に結合する。
IgG抗体へのFab断片の変換は、一般に、受容体結合(EC50)を向上させる。これもまた本発明の抗体で検証された。好ましくは、IgG1フォーマットの場合、本発明による抗体は、5nM未満のEC50でCXCR4に特異的に結合する。
本発明の抗体は、CXCR4受容体へのSDF−1の結合を阻害し、受容体活性化を防止する。SDF−1のその受容体への結合の帰結としては、例えば、がん細胞の浸潤の重要なパラメーターである、カルシウムフラックスの誘導及び細胞遊走が挙げられる。本発明の抗体は、CXCR4発現細胞のカルシウムフラックスの誘導及び/又は遊走を阻害する。
トラスツズマブ及びリツキシマブのような抗体について実証されたように、ADCCは、腫瘍に対する治療的抗体の重要な作用機序であり得る。本発明の抗体は、ADCCの能力があることが示された。異種移植腫瘍モデルでの研究により、本発明の抗体の抗腫瘍活性が実証された。
医薬組成物及びこれらの投与
本発明はまた、本発明の抗体を含む医薬組成物に関する。後者の組成物は、優先的には非経口的に投与されるが、経鼻、経肺又は経皮送達もまた想定される。医薬組成物は、任意の従来の非毒性の薬学的に許容される賦形剤を含有してよく、液体配合物の場合、希釈剤を含有してよい。一部の場合には、配合物のpHは、配合された剤又はその送達形態の安定性を増進させるために薬学的に許容される酸、塩基又は緩衝剤で調整されてよい。本明細書において使用される非経口という用語は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病巣内及び頭蓋内注射又は注入を含む。
本発明はまた、本発明の抗体を含む医薬組成物に関する。後者の組成物は、優先的には非経口的に投与されるが、経鼻、経肺又は経皮送達もまた想定される。医薬組成物は、任意の従来の非毒性の薬学的に許容される賦形剤を含有してよく、液体配合物の場合、希釈剤を含有してよい。一部の場合には、配合物のpHは、配合された剤又はその送達形態の安定性を増進させるために薬学的に許容される酸、塩基又は緩衝剤で調整されてよい。本明細書において使用される非経口という用語は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病巣内及び頭蓋内注射又は注入を含む。
本発明の抗体は、凍結乾燥配合物として又は溶液として貯蔵され得る。注射用調製物、例えば、無菌注射用水性又は油性懸濁液は、好適な分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤を使用して公知の技術に従って配合されてよい。無菌注射用調製物はまた、非毒性の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の無菌の注射溶液、懸濁液又はエマルションであってよい。用いられ得る許容される希釈剤には、水、リンゲル溶液、U.S.P.及び等張性塩化ナトリウム溶液が含まれる。加えて、無菌の固定油が溶媒又は懸濁媒として従来通りに用いられる。組成物は、当技術分野において典型的に用いられる「薬学的に許容される」賦形剤又は安定化剤(これらの全ては「賦形剤」と称される。)をさらに含み得る。賦形剤は、例えば、緩衝剤、安定化剤、防腐剤、張度剤、非イオン性洗剤、酸化防止剤及び他の種々雑多な添加剤を含む。(Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th edition, A. Osol, Ed. (1980)を参照)。このような添加剤は、用いられる投与量及び濃度においてレシピエントに対して非毒性でなければならない。
緩衝剤は、好ましくは、約2mM〜約50mMの範囲内の濃度で存在する。好適な緩衝剤としては、クエン酸緩衝剤(例えば、クエン酸一ナトリウム−クエン酸二ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸一ナトリウム混合物など)、コハク酸緩衝剤(例えば、コハク酸−コハク酸一ナトリウム混合物、コハク酸−水酸化ナトリウム混合物、コハク酸−コハク酸二ナトリウム混合物など)、酒石酸緩衝剤(例えば、酒石酸−酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸−酒石酸カリウム混合物、酒石酸−水酸化ナトリウム混合物など)、フマル酸緩衝剤(例えば、フマル酸−フマル酸一ナトリウム混合物など)、フマル酸緩衝剤(例えば、フマル酸−フマル酸一ナトリウム混合物、フマル酸−フマル酸二ナトリウム混合物、フマル酸一ナトリウム−フマル酸二ナトリウム混合物など)、グルコン酸緩衝剤(例えば、グルコン酸−グリコン酸ナトリウム(sodium glyconate)混合物、グルコン酸−水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸−グリウコン酸カリウム(potassium glyuconate)混合物など)、シュウ酸緩衝剤(例えば、シュウ酸−シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸−水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸−シュウ酸カリウム混合物など)、乳酸緩衝剤(例えば、乳酸−乳酸ナトリウム混合物、乳酸−水酸化ナトリウム混合物、乳酸−乳酸カリウム混合物など)及び酢酸緩衝剤(例えば、酢酸−酢酸ナトリウム混合物、酢酸−水酸化ナトリウム混合物など)のような有機及び無機の両方の酸及びこれらの塩が挙げられる。さらに、リン酸緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤及びトリスのようなトリメチルアミン塩を挙げることができる。防腐剤は、微生物増殖を遅らせるために加えられてよく、0.2%〜1%(w/v)の範囲内の量で加えられてよい。本発明で使用するための好適な防腐剤としては、フェノール、ベンジルアルコール、メタクレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ベンザルコニウム(benzalconium)ハロゲン化物(例えば、塩化物、臭化物、ヨウ化物)、塩化ヘキサメトニウム、メチル又はプロピルパラベンのようなアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール及び3−ペンタノールが挙げられる。
医薬組成物の容量オスモル濃度は、組成物の意図する使用と適合する値に張度剤で調整されてよい。例えば、注射溶液の容量オスモル濃度は、水中の約0.9w/v%の塩化ナトリウムに相当するおおよそ血液の浸透圧に調整されてよい。好適な張度剤の例としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム及びマグネシウムの塩化物塩、デキストロース、グリセロール、プロピレングリコール、マンニトール、ソルビトール、エリスリトール、アラビトール、キシリトールなど及びこれらの混合物が挙げられる。張度剤は、典型的に、約0.001〜約1%w/vの範囲内の量で使用される。これらの量は、生理学的に許容される張度の提供において有用であることが判明している。好ましくは、張度剤は、150〜450mOsm/kg、より好ましくは約220〜約350mOsm/kg、最も好ましくは約270〜約300mOsm/kgの最終浸透値を組成物に提供する量で用いられる。
組成物は、安定化剤(stablilizer)をさらに含み得る。典型的な安定化剤は、多価糖アルコール(上に列記);アルギニン、リシン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、L−ロイシン、2−フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニンなどのようなアミノ酸、イノシトールのようなシクリトールを含めて、ラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイニシトール、ガラクチトール、グリセロールなどのような有機の糖又は糖アルコール;ポリエチレングリコール;アミノ酸ポリマー;尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、アルファ−モノチオグリセロール及びチオ硫酸ナトリウムのような硫黄含有還元剤;低分子量ポリペプチド(すなわち、10残基未満);ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンのようなタンパク質;ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー;キシロース、マンノース、フルクトース、グルコースのような単糖;ラクトース、マルトース、スクロースのような二糖及びラフィノースのような三糖(trisaccacharides);デキストランのような多糖であり得る。安定化剤は、本発明の抗体の質量の0.1〜10,000倍の質量範囲内で存在してよい。
本発明の抗体の可溶化を助けるための他に、撹拌誘導性の凝集からそれを保護するために湿潤剤を加えてよい。好適な湿潤剤としては、ポリソルベート(20、80など)、ポロキサマー(184、188など)、プルロニック.RTM、ポリオール、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル(Tween.RTM.−20、Tween.RTM.−80など)のような非イオン性界面活性剤が挙げられる。非イオン性界面活性剤は、約0.05mg/ml〜約1.0mg/ml、好ましくは約0.07mg/ml〜約0.2mg/mlの範囲内で存在してよい。
医薬組成物はまた、治療されている特定の適応症のために必要に応じて追加の活性化合物を含有してよく、好ましくは、本発明の抗体の活性に有害に影響しない活性を有する化合物を含有してよい。例えば、がんが治療されている場合、1つ以上の化学療法剤をさらに提供することが望ましいことがある。このような化合物は、好適には、意図する目的のために効果的な量の組合せで存在する。
医薬組成物は、例えば、滅菌濾過膜を通した濾過により、滅菌され得る。
本発明の抗体はまた、例えば、コアセルベーション技術又は界面重合により調製されるマイクロカプセル中に捕捉されていてよく、例えば、それぞれ、コロイド薬物送達システム(例えば、リポソーム、アルブミンミクロフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)中又はマクロエマルション中のヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ−(メチルメタシレート(methylmethacylate))マイクロカプセル中に捕捉されていてよい。このような技術は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th edition, A. Osal, Ed. (1980)に開示されている。
持続放出調製物が調製されてよい。本発明の抗体の送達のために適合され得る持続放出調製物の好適な例としては、成形品、例えば、フィルム又はマイクロカプセルの形態であるマトリックスである、抗体を含有する固形疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられる。持続放出マトリックスの例としては、ポリエステル、ハイドロゲル(例えば、ポリ(2−ヒドロキシエチル−メタクリレート)又はポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号)、L−グルタミン酸とエチル−L−グルタメートとのコポリマー、非分解性エチレン−ビニルアセテート、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー及びポリ−D−(−)−3−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−ビニルアセテート及び乳酸−グリコール酸のようなポリマーは100日を超えて分子の放出を可能とするが、ある特定のハイドロゲルはより短い期間にわたりタンパク質を放出する。カプセル化された抗体が身体中に長期間残存する場合、これらは37℃の水分への曝露の結果として変性又は凝集して、生物学的活性の喪失及び免疫原性の変化の可能性を結果としてもたらすことがある。関与する機序に応じて安定化のための合理的な戦略を工夫することができる。例えば、凝集の機序がチオール−ジスルフィド相互変換による分子間S−−S結合の形成であると発見された場合、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分含有量を制御し、適切な添加剤を使用し、及び特定のポリマーマトリックス組成物を開発することにより、安定化が達成され得る。
投与方法は、対象の年齢及び症状を考慮して適切に選択することができる。本発明の抗体又は結合断片の医薬組成物中の用量は、例えば、各投与について約0.0005〜約100mg/kgであってよい。より好ましくは、用量は、各投与について約0.1〜約20mg/kgであってよい。投与は、1日に数回、連日、2日毎、半週毎又は1週毎であってよい。しかしながら、本発明は、上記した数値により限定されない。用量及び投与方法は、対象の体重、年齢、症状などに応じて異なる。当業者は、上記した要因を考慮して適切な用量及び投与方法を設定することができる。
本発明の抗体の診断的使用
本発明の抗体及び結合断片は、診断アッセイ、例えば、特定の細胞、組織又は血清におけるCXCR4の発現を検出するためのアッセイにおいて有用であり得る。診断応用のために、抗体は、典型的に、検出可能な部分により標識される。多数の標識が利用可能である。酵素標識の例としては、ルシフェラーゼ(例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ;米国特許第4,737,456号)、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRPO)のようなペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ(例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ及びグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ)、(ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼのような)複素環オキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどが挙げられる。抗体に酵素をコンジュゲートさせる技術は、O’Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme−Antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (Ed. Langone & Van Vunakis), Academic press, New York, 73: 147−166 (1981)に記載されている。
本発明の抗体及び結合断片は、診断アッセイ、例えば、特定の細胞、組織又は血清におけるCXCR4の発現を検出するためのアッセイにおいて有用であり得る。診断応用のために、抗体は、典型的に、検出可能な部分により標識される。多数の標識が利用可能である。酵素標識の例としては、ルシフェラーゼ(例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ;米国特許第4,737,456号)、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRPO)のようなペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ(例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ及びグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ)、(ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼのような)複素環オキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどが挙げられる。抗体に酵素をコンジュゲートさせる技術は、O’Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme−Antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (Ed. Langone & Van Vunakis), Academic press, New York, 73: 147−166 (1981)に記載されている。
時に、標識は抗体と間接的にコンジュゲートされる。当業者は、これを達成するための様々な技術を認識している。例えば、抗体がビオチンとコンジュゲートされてよく、かつ上記した標識のいずれかがアビジンとコンジュゲートされてよい、又はその逆であってよい。ビオチンはアビジンに選択的に結合し、したがって、標識は、この間接的な様式で抗体バリアントとコンジュゲートされ得る。あるいは、抗体との標識の間接的なコンジュゲートを達成するために、抗体は小さいハプテン(例えば、ジゴキシン)とコンジュゲートされ、かつ上記した異なる種類の標識のうちの1つは抗ハプテン抗体(例えば、抗ジゴキシン抗体)とコンジュゲートされる。このようにして、抗体との標識の間接的なコンジュゲートが達成され得る。
本発明の別の実施形態では、本発明の抗体は標識される必要がなく、その存在は、抗体に結合する標識された抗体を使用して検出され得る。
本発明の抗体又は結合断片は、競合結合アッセイ、直接及び間接サンドイッチアッセイ及び免疫沈降アッセイのような任意の公知の免疫化学アッセイ方法において用いられてよい。Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147−158 (CRC Press, Inc. 1987)。これらはまた、細胞及び組織上のCXCR4の免疫組織化学検出のために使用され得る。免疫組織化学のために、組織試料、例えば腫瘍組織試料は、新鮮若しくは凍結されていてよく、又はパラフィン中に包埋され、例えばホルマリンのような防腐剤で固定されていてよい。
抗体はまた、インビボ診断アッセイのために使用されてよい。一般に、免疫シンチオグラフィー(immunoscintiography)を使用してCXCR4過剰発現細胞が局在化され得るように、抗体又は結合断片は、(111In、99Tc、14C、131I、3H、32P又は35Sのような)放射性ヌクレオチドで標識される。
本発明の抗体又は結合断片は、キット、すなわち、診断アッセイを行うための使用説明書との予め決定された量の試薬のパッケージ化された組合せで提供され得る。抗体が酵素で標識されている場合、キットは、基質及び酵素により必要とされる補因子(例えば、検出可能な発色団又はフルオロフォアを提供する基質前駆体)を含んでよい。加えて、安定化剤、緩衝剤(例えば、遮断緩衝剤又は溶解緩衝剤)などのような他の添加剤が含まれてよい。様々な試薬の相対的な量は、アッセイの感度を実質的に最適化する試薬の溶液中の濃度を提供するために広範に異なってよい。特に、試薬は、溶解時に適切な濃度を有する試薬溶液を提供する賦形剤を含む、通常は凍結乾燥された、乾燥粉末として提供されてよい。
本発明の抗体及び結合断片のヒト治療での使用
本発明の抗体は、幹細胞及び再生医療において使用され得る。SDF−1アルファとのCXCR4の相互作用は、骨髄中の造血幹細胞の保持において重要である。抗CXCR4抗体は、末梢血幹細胞として血流中に造血幹細胞を動員することができるアンタゴニストとして働き得る。末梢血幹細胞の動員は、(外科的に回収した骨髄の移植の代替として)造血幹細胞移植において重要であり得、G−CSFのような薬物を使用して現在行われている。本発明の抗体及び結合断片はまた、後期ステージのHIV(X4ウイルス)がCXCR4受容体と相互作用してT細胞に入るのを防止するために使用され得る。
本発明の抗体は、幹細胞及び再生医療において使用され得る。SDF−1アルファとのCXCR4の相互作用は、骨髄中の造血幹細胞の保持において重要である。抗CXCR4抗体は、末梢血幹細胞として血流中に造血幹細胞を動員することができるアンタゴニストとして働き得る。末梢血幹細胞の動員は、(外科的に回収した骨髄の移植の代替として)造血幹細胞移植において重要であり得、G−CSFのような薬物を使用して現在行われている。本発明の抗体及び結合断片はまた、後期ステージのHIV(X4ウイルス)がCXCR4受容体と相互作用してT細胞に入るのを防止するために使用され得る。
本発明の抗体及び結合断片はさらに、CXCR4を発現する様々な異なるがんの治療において使用され得る。CXCR4は、ヒトのがん及び実験用マウスのがんの両方において、最も一般的に腫瘍細胞上に見出されるケモカイン受容体であり得る。受容体は、少なくとも以下の腫瘍の種類において見出されている:B−CLL、AML、B系列ALL(バーキットリンパ腫を含む)、濾胞中心骨髄腫、CML、多発性骨髄腫、膵臓がん、前立腺がん、乳がん、卵巣がん、甲状腺がん、結腸直腸がん、口腔扁平癌、子宮頸がん、神経芽腫、腎臓がん、神経膠腫、横紋筋肉腫、小肺がん及び黒色腫。Balkwill (2004) Seminars in Cancer Biology 14: 171−9。治療は、本発明の抗体又は結合断片を含む医薬組成物のがん患者への投与を伴う。組成物は、非経口、皮下、腹腔内、肺内、鼻腔内及び病巣内投与などの任意の好適な手段により投与されてよい。非経口注入としては、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下投与が挙げられる。加えて、抗体又は結合断片は、好適には、パルス注入により、特に抗体又は結合断片の用量を漸減させるパルス注入により投与される。好ましくは、投薬は、部分的には投与が短期であるのかそれとも慢性的であるのかに応じて、注射により、最も好ましくは静脈内又は皮下注射により、与えられる。
疾患の種類及び重症度に応じて、例えば、1つ以上の別々の投与による、又は連続的な注入によるかにかかわらず、約0.1mg/kg〜約20mg/kgの抗体又は結合断片が、対象への投与のための最初の投与量候補である。典型的な1日の投与量は、約1mg/kg〜100mg/kg以上の範囲内でよい。
本発明の抗体又は結合断片を含む医薬組成物は、良質な医学のための原則に合致する様式で配合され、適量に分けられ、投与される。この文脈において考慮される因子としては、がんの種類及びステージ、個々の対象の臨床状態、剤の送達部位、投与の方法、投与のスケジュール、及び医師に既知の他の因子が挙げられる。投与される抗体の「治療有効量」はこのような考慮により支配され、疾患を治療するために必要な最小量である。抗体は、その必要はないが、任意選択的に、疾患を治療するために現在使用されている1つ以上の剤、例えば1つ以上の化学療法剤と共に配合される。このような他の剤の有効量は、配合物中に存在する抗体又は結合断片の量、がんの種類及びステージ、並びに上記で論じた他の因子に依存する。これらは、一般に、(本発明の抗体なしで)現在使用されているのと同じ投与量及び投与経路で使用され、又は現在用いられている投与量の約1〜99%で使用される。
実施例1:Fabファージライブラリーの調製及びファージ抗体のスクリーニング
本発明の抗体は、元々、無作為化CDRによるヒトFab重鎖及びヒトFab軽鎖をコードするFab E.コリ(E. coli)コドン最適化合成遺伝子を持つpSF1ファージミドを含む10^11のサイズのFabライブラリーに由来する。重鎖のためにフレームワークDP47を用い、軽鎖のためにフレームワークDPK22を用いた。
本発明の抗体は、元々、無作為化CDRによるヒトFab重鎖及びヒトFab軽鎖をコードするFab E.コリ(E. coli)コドン最適化合成遺伝子を持つpSF1ファージミドを含む10^11のサイズのFabライブラリーに由来する。重鎖のためにフレームワークDP47を用い、軽鎖のためにフレームワークDPK22を用いた。
Knappik et al. (2000) J. Mol. Biol. 296:57−86;Lee et al. (2004) J. Mol. Biol. 340:1073−93;Hoet et al. (2005) 23:344−8に記載されるプロトコール及びCDR無作為化スキームを用いてファージライブラリーを生成した。
より具体的には、Fabライブラリーにおいて重鎖CDR1、CDR2及びCDR3並びに軽鎖CDR3を無作為化に供した。重鎖CDR3の無作為化のために、トリヌクレオチドベースのオリゴヌクレオチドをKnappikらに記載される通りに用いた一方、他のCDRについて標準的なヌクレオチド混合物を用いてCDRオリゴヌクレオチドを生成した。
Fabライブラリーの一般的な軽鎖CDRは以下の通りであった(MacCallum et al. (1996) J. Mol. Biol. 626:732−745):
CDR1L−−SSYLAWY−−(配列番号1)
CDR2L−−LLIYGASSRA−−(配列番号2)
CDR1L−−SSYLAWY−−(配列番号1)
CDR2L−−LLIYGASSRA−−(配列番号2)
Fabライブラリーのスクリーニングのために、Magnetic ProteoLiposome技術を使用して、その天然コンフォメーションに密接に似たコンフォメーションでリポソーム膜中にCXCR4を提示させた。Mirzabekov et al. (2000) Nat Biotechnol. 18:649−54及び米国特許第6,761,902号を参照。
Mirzabekovらに記載される方法を使用してFabライブラリーのスクリーニングを実行し、以下のFab候補を得た:
実施例2:親和性成熟
次に、上記した通りの初期候補を親和性成熟に付した。それぞれCDR2H又はCDR3L無作為化により2つの親和性成熟ライブラリーを生成した。これらのライブラリーのそれぞれを2ラウンドの高ストリンジェンシー選択に付した。選択したFabを個々に発現させ、向上した結合特性を有するクローンを保持した。最良のCXCR4結合親和性及び選択性の他に、Caフラックスのリガンド誘導を防止する最良の能力で特徴付けた最良のクローンをIgGとしてリフォーマットした。最終ステップとして、最も有望なIgGの重鎖及び軽鎖を組み換え、結果として得られたIgGを以前の通りに再び特徴付けた。
次に、上記した通りの初期候補を親和性成熟に付した。それぞれCDR2H又はCDR3L無作為化により2つの親和性成熟ライブラリーを生成した。これらのライブラリーのそれぞれを2ラウンドの高ストリンジェンシー選択に付した。選択したFabを個々に発現させ、向上した結合特性を有するクローンを保持した。最良のCXCR4結合親和性及び選択性の他に、Caフラックスのリガンド誘導を防止する最良の能力で特徴付けた最良のクローンをIgGとしてリフォーマットした。最終ステップとして、最も有望なIgGの重鎖及び軽鎖を組み換え、結果として得られたIgGを以前の通りに再び特徴付けた。
加えて、CDR3Hを点変異の導入により成熟させた。結果として得られた変異型Fab断片を特徴付けて、最良のCXCR4結合物を同定した。
以下の成熟化抗体候補をさらに追及した:
以前に記載した通り、本発明の全ての抗体は同じCDR1L(配列番号1)及びCDR2L(配列番号2)を共有する。
実施例3:IgG抗体の合成
Biotechnology Research Institute of the Canadian National Research Council(NRC−BRI)のCHO/pTT Transient Transfection SystemをNRC−BRIにより提供されたプロトコールに従って使用した。国際特許出願公開WO2009/137911A1を参照。より具体的には、トランスフェクション試薬としてポリエチレンイミン(PEI)を使用してIgGのそれぞれ軽鎖及び重鎖を発現するpTTベクターを共トランスフェクトしたCHO−3E7細胞中で目的の各IgGを製造した。
Biotechnology Research Institute of the Canadian National Research Council(NRC−BRI)のCHO/pTT Transient Transfection SystemをNRC−BRIにより提供されたプロトコールに従って使用した。国際特許出願公開WO2009/137911A1を参照。より具体的には、トランスフェクション試薬としてポリエチレンイミン(PEI)を使用してIgGのそれぞれ軽鎖及び重鎖を発現するpTTベクターを共トランスフェクトしたCHO−3E7細胞中で目的の各IgGを製造した。
IgGを含有する細胞培地を回収し、標準的な方法論を使用してProtein A Plus Agarose(Pierce)でIgGを精製した。全ての精製手順は、無菌のエンドトキシンフリーの溶液を使用して行った。
以下の実施例では、目的のFab断片又は目的のIgG抗体を、適宜、「試験Fab」、「試験抗体」又は「試験IgG」と称する。
実施例4:CXCR4発現細胞への結合
CXCR4発現細胞へのFab又はIgGの結合を蛍光フローサイトメトリーベースのアッセイにより測定した。細胞を以下のもので染色した:
(A)Fabについて、試験Fab中に存在するタグに結合する抗c−Mycマウス抗体9E10 Mabの後に、二次抗マウスIgGフィコエリトリン(PE)コンジュゲート抗体、又は
(B)IgGについて、抗ヒトFc PEコンジュゲート抗体。
CXCR4発現細胞へのFab又はIgGの結合を蛍光フローサイトメトリーベースのアッセイにより測定した。細胞を以下のもので染色した:
(A)Fabについて、試験Fab中に存在するタグに結合する抗c−Mycマウス抗体9E10 Mabの後に、二次抗マウスIgGフィコエリトリン(PE)コンジュゲート抗体、又は
(B)IgGについて、抗ヒトFc PEコンジュゲート抗体。
対照として、CXCR4を発現しない細胞又は他のGPCRを発現する細胞を使用した。
蛍光フローサイトメトリーベースのアッセイの典型的なプロトコールは以下の通りであった。10マイクロリットルの精製した試験IgG溶液又は対照として緩衝液を、ヒトCXCR4を発現するようにトランスフェクトした約30,000個のCf2−Th細胞を含有する10マイクロリットルの懸濁液に加えた。氷上での40分間のインキュベーション後、FACS緩衝液(リン酸緩衝食塩水(PBS)、pH7.4;2%のウシ胎仔血清、0.1%のアジ化ナトリウム)で細胞を洗浄して未結合の抗体を除去した。次に、10マイクロリットルのフィコエリトリン(PE)コンジュゲートマウス抗ヒトFcモノクローナル抗体溶液(1/20希釈;商品番号12−4998−82、eBioscience Inc.、San Diego、CA)を細胞に加え、氷上での30分間のインキュベーション後、細胞を2回洗浄し、ホルマリン固定した(FIX緩衝液:PBS、pH7.4;0.5%のホルムアルデヒド)。Guava−PCA96機器(EMD Millipore Chemicals、Merck KGaA、Darmstadt、Germany)を使用して蛍光フローサイトメトリーにより、固定した試料を分析した。
EC50値を決定するために、試験抗体の異なる濃度においてCXCR4発現細胞への結合を測定した。各濃度について2連又は3連の試料を分析した。SoftMaxPro5プログラム(Molecular Devices Corp.、Sunnyvale、CA)を使用して機器により提供される平均蛍光強度(MFI)値に基づいて滴定曲線を構築した。
一部の実験では、トランスフェクトされていないCf2−Th親細胞(ATCC(登録商標)CRL−1430(商標))を陰性対照として使用し、それによりCXCR4に対する抗体の特異性を確立した。一部の他の実験では、同じ抗体候補のいくつものバッチを並行して試験した。IgG1フォーマットの試験抗体で得られた用量応答曲線及びEC50の結果を図1a〜図1eに示す。全ての試験IgG1抗体は10nMより充分に低いEC50を呈した。
実施例5:CXCR−4発現ヒトリンパ腫細胞への結合
CXCR4発現ヒトリンパ腫細胞(Ramos;RA1、ATCC(登録商標)CRL−1596(商標))への試験IgGの結合を蛍光フローサイトメトリーベースのアッセイにより測定した。腫瘍細胞の染色を以下の通りに実行した:2%のヒト血清及び0.5mMのEDTAを含有するPBS中4℃での30分間のインキュベーションによりRA1細胞のヒトFcγ受容体を飽和させた。次に、細胞を試験IgG又はヒトアイソタイプIgG1カッパー対照(Coger Sarl、Paris、France)(両方の抗体の種類は10μg/mL)で4℃で1時間インキュベートした。細胞をPBSで洗浄し、ヤギF(ab’)2断片抗ヒトIgG(H+L)−PE(Beckman Coulter)で4℃で1時間さらにインキュベートした。細胞をPBSで2回洗浄し、フローサイトメトリーによる分析のためにPBS中の0.5%のホルムアルデヒドで固定した。11色のフローサイトメーター(LSRII、BD Biosciences)を使用してデータを取得し、FlowJoフローサイトメトリー分析ソフトウェア(Tree Star Inc.、Ashland、OR)を用いて分析を行った。側方散乱(SSC)及び前方散乱(FSC)を使用して生細胞を選択し、10,000の事象を各分析のために取得した。PEチャネルを使用してMFI値を記録した。
CXCR4発現ヒトリンパ腫細胞(Ramos;RA1、ATCC(登録商標)CRL−1596(商標))への試験IgGの結合を蛍光フローサイトメトリーベースのアッセイにより測定した。腫瘍細胞の染色を以下の通りに実行した:2%のヒト血清及び0.5mMのEDTAを含有するPBS中4℃での30分間のインキュベーションによりRA1細胞のヒトFcγ受容体を飽和させた。次に、細胞を試験IgG又はヒトアイソタイプIgG1カッパー対照(Coger Sarl、Paris、France)(両方の抗体の種類は10μg/mL)で4℃で1時間インキュベートした。細胞をPBSで洗浄し、ヤギF(ab’)2断片抗ヒトIgG(H+L)−PE(Beckman Coulter)で4℃で1時間さらにインキュベートした。細胞をPBSで2回洗浄し、フローサイトメトリーによる分析のためにPBS中の0.5%のホルムアルデヒドで固定した。11色のフローサイトメーター(LSRII、BD Biosciences)を使用してデータを取得し、FlowJoフローサイトメトリー分析ソフトウェア(Tree Star Inc.、Ashland、OR)を用いて分析を行った。側方散乱(SSC)及び前方散乱(FSC)を使用して生細胞を選択し、10,000の事象を各分析のために取得した。PEチャネルを使用してMFI値を記録した。
アイソタイプ対照のものより充分に高いMFI値はRA1細胞の陽性染色を指し示し、これは全ての試験IgGについて観察された。
実施例6:CXCR4への特異性
CXCR4以外の異なるGPCRを過剰発現する細胞及びCXCR4を過剰発現するようにトランスフェクトしたいくつもの株(R1610−hCXCR4、Cf2Th−hCXCR4及びCHO−hCXCR4)を比較した。培養物をFACS緩衝液中100nMの試験IgGで4℃で40分間インキュベートした。その後、細胞を2回洗浄し、抗ヒトFc抗体−PEコンジュゲート(Jackson Immunoresearch Laboratories Inc.、West Grove、PA)で染色し、FACS緩衝液中で2回洗浄した後、FIX緩衝液に移した。425VでGUAVA PCA−96により蛍光強度を測定(3連)した。
CXCR4以外の異なるGPCRを過剰発現する細胞及びCXCR4を過剰発現するようにトランスフェクトしたいくつもの株(R1610−hCXCR4、Cf2Th−hCXCR4及びCHO−hCXCR4)を比較した。培養物をFACS緩衝液中100nMの試験IgGで4℃で40分間インキュベートした。その後、細胞を2回洗浄し、抗ヒトFc抗体−PEコンジュゲート(Jackson Immunoresearch Laboratories Inc.、West Grove、PA)で染色し、FACS緩衝液中で2回洗浄した後、FIX緩衝液に移した。425VでGUAVA PCA−96により蛍光強度を測定(3連)した。
市販の抗体(陽性対照)を使用してCXCR4以外のGPCRの発現を確認した。例えば、CXCR1トランスフェクトCHO細胞上のCXCR1の発現を確認するために市販の抗CXCR1抗体を陽性対照として使用した。
得られたMFIデータの要約を以下の表に示す。
実施例7:CXCR4へのリガンド結合の阻害
N末端FLAGタグを含有する細菌発現SDF−1アルファを使用して蛍光フローサイトメトリーによりSDF−1アルファのリガンド結合の阻害をアッセイした。
N末端FLAGタグを含有する細菌発現SDF−1アルファを使用して蛍光フローサイトメトリーによりSDF−1アルファのリガンド結合の阻害をアッセイした。
CXCR4を発現するようにトランスフェクトしたCf2−Th細胞を試験IgG抗体(100nM)で氷上で30分間インキュベートした。その後、FLAGタグ化リガンドを100nMの最終濃度まで加え、細胞をさらに20分間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、適切な抗FLAGタグPEコンジュゲート抗体で染色し、FIX緩衝液で固定した。対照には抗体を加えなかった。次に、蛍光を記録した。IgG試験抗体に曝露しなかった細胞のMFI(MFINoAb)と比較した試験抗体に曝露した細胞のMFI値(MFIWithAb)の減少は、抗体とリガンドとの競合を指し示した。阻害パーセントを(MFIWithAb/MFINoAb)×100%として定義した。類似のMFIWithAb及びMFINoAbの値は、事前に結合した試験抗体が細胞表面上のCXCR4へのタグ化リガンドの結合を防止しなかったことを指し示した。試験した抗体V62.1及びV62.1R108Hは、リガンド結合を最大96%阻害することができた。
実施例8:SDF−1誘導性のカルシウムフラックスの阻害
CXCR4トランスフェクトChem−1細胞(商品番号HTS004C、EMD Millipore Chemicals)でのFLIPRカルシウムアッセイ(Calcium−5キット、Molecular Devices LLC、Sunnyvale、CA)から得られたデータに基づいてIC50値を推定した。細胞を37℃及び5%のCO2で終夜生育させた。Caフラックス測定の前に、細胞を37℃及び5%のCO2で3時間、無血清培地中で飢餓状態とさせた。色素を細胞に加えた後、細胞を異なる濃度の試験IgG1抗体の存在下、37℃及び5%のCO2で30分間インキュベートした。対照試料を同様に調製したが、抗体を加えなかった。その後、TBS中のSDF−1アルファ(R&D Systems)を30nMの最終濃度まで色素負荷細胞に加えた。細胞内カルシウム濃度(Caフラックス)のケモカイン誘導性の増加の阻害を以下の通りに算出した:
CXCR4トランスフェクトChem−1細胞(商品番号HTS004C、EMD Millipore Chemicals)でのFLIPRカルシウムアッセイ(Calcium−5キット、Molecular Devices LLC、Sunnyvale、CA)から得られたデータに基づいてIC50値を推定した。細胞を37℃及び5%のCO2で終夜生育させた。Caフラックス測定の前に、細胞を37℃及び5%のCO2で3時間、無血清培地中で飢餓状態とさせた。色素を細胞に加えた後、細胞を異なる濃度の試験IgG1抗体の存在下、37℃及び5%のCO2で30分間インキュベートした。対照試料を同様に調製したが、抗体を加えなかった。その後、TBS中のSDF−1アルファ(R&D Systems)を30nMの最終濃度まで色素負荷細胞に加えた。細胞内カルシウム濃度(Caフラックス)のケモカイン誘導性の増加の阻害を以下の通りに算出した:
用量応答曲線を作成し、IC50値を算出した。IC50は、SDF−1アルファ誘導性のカルシウムフラックスの50%の阻害が観察される試験IgGの濃度を表す。異なる試験IgGについて決定されたIC50値の要約を以下の表に示す:
全ての試験抗体は、CXCR4発現細胞においてSDF−1アルファ誘導性のカルシウムフラックスを有意に阻害した。
実施例9:走化性/細胞遊走の阻害
ヒトU937細胞を10%のFCSを含むRPMI−1640培地中で生育させた後、2回洗浄し、無血清RPMI−1640中37℃で3時間(5%のCO2)でインキュベートした。飢餓状態とさせたU937細胞を1ml当たり3*10^5個の細胞で走化性用の培地(0.3%のBSAを含むRPMI−1640)に再懸濁し、
a)室温で30分間インキュベートし(アッセイ用の前処理しない陽性対照)、
b)1μMの濃度のAMD3100で30分間室温で前処理し(走化性阻害用の陽性対照)、又は
c)100nMの濃度の試験IgGで30分間室温で前処理した。
ヒトU937細胞を10%のFCSを含むRPMI−1640培地中で生育させた後、2回洗浄し、無血清RPMI−1640中37℃で3時間(5%のCO2)でインキュベートした。飢餓状態とさせたU937細胞を1ml当たり3*10^5個の細胞で走化性用の培地(0.3%のBSAを含むRPMI−1640)に再懸濁し、
a)室温で30分間インキュベートし(アッセイ用の前処理しない陽性対照)、
b)1μMの濃度のAMD3100で30分間室温で前処理し(走化性阻害用の陽性対照)、又は
c)100nMの濃度の試験IgGで30分間室温で前処理した。
次に、各々の前処理しなかった又は前処理したU937細胞をミクロ走化性チャンバーの上ウェルに入れた(1ウェル当たり15,000個の細胞)。以下の表に概略的に示すように、下ウェルへの添加を行った。
8μMの孔径を有するポリカーボネートフィルターにより上チャンバー及び下チャンバーを分離した。
37℃(5%のCO2)での1時間のインキュベーション後、細胞懸濁液を上ウェルから除去し、PBSでウェルを1回洗浄した。次に、チャンバーを500rpmで4分間遠心分離し、下ウェルから遊走細胞を50μlのPBSを含有するV字型96ウェルプレートのウェル内に移した。Guava PCA−96サイトメーターを使用して各ウェル中の遊走細胞の数を決定した。全ての測定を3連で行った。
すぐ上の表における条件(a1)と条件(a)との遊走細胞の数の差異としてSDF−1誘導性の最大遊走を算出した。次に、この最大遊走を参照することにより試験抗体についての遊走阻害のパーセンテージを算出した。
異なる試験IgGによるSDF−1アルファ誘導性の走化性の阻害の結果を以下の表に示す。
全ての試験抗体は、SDF−1アルファ誘導性の走化性を少なくとも約70%阻害した。
実施例10:抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性(ADCC)
乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)の放出を測定するアッセイである、CytoTox 96(登録商標) Non−Radioactive Cytotoxicity Assay(Promega Corp.、Fitchburg、WI))を使用し、RA1細胞を標的細胞(T)として用いてADCCを測定した。丸底96ウェル培養プレートを以下の対照ウェル及び実験ウェルで準備した(100マイクロリットルの最終体積):
a.RA1細胞(標的細胞自発性LDH放出対照用)
b.RA1細胞(標的細胞最大LDH放出対照用)
c.体積訂正対照のために使用した培養培地(フェノールレッドを含まないRPMI 1640培地(1X))
d.培養培地(培養培地バックグラウンド対照用)
e.RA1+エフェクター細胞(E)(標的+エフェクター細胞自発性LDH放出対照用)
f.各試験IgGの段階希釈液を有する又は試験IgGを有しないエフェクター細胞及び標的細胞(105)の実験ウェル。
乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)の放出を測定するアッセイである、CytoTox 96(登録商標) Non−Radioactive Cytotoxicity Assay(Promega Corp.、Fitchburg、WI))を使用し、RA1細胞を標的細胞(T)として用いてADCCを測定した。丸底96ウェル培養プレートを以下の対照ウェル及び実験ウェルで準備した(100マイクロリットルの最終体積):
a.RA1細胞(標的細胞自発性LDH放出対照用)
b.RA1細胞(標的細胞最大LDH放出対照用)
c.体積訂正対照のために使用した培養培地(フェノールレッドを含まないRPMI 1640培地(1X))
d.培養培地(培養培地バックグラウンド対照用)
e.RA1+エフェクター細胞(E)(標的+エフェクター細胞自発性LDH放出対照用)
f.各試験IgGの段階希釈液を有する又は試験IgGを有しないエフェクター細胞及び標的細胞(105)の実験ウェル。
プレートを1600rpmで2分間遠心分離し、37℃で4時間インキュベートした。上清回収の1時間前に、20マイクロリットルの溶解溶液(10X)を条件b)及び条件c)に加えた。プレートを1600rpmで2分間遠心分離し、アッセイプレートの各ウェルから50マイクロリットルの上清を平底96ウェル酵素アッセイプレートの対応するウェルに移した。基質混合物(50マイクロリットル)を後者のプレートの各ウェルに加え、プレート(光から保護)を室温で30分間インキュベートした。最後に、50マイクロリットルの停止溶液を各ウェルに加え、490nmで吸光度(OD値)を測定した。各条件を3連で試験した。
最適なE:T比を決定するために事前実験を実行した。以下に示すデータが、105個のRA1標的細胞を用いて20:1のE:T比で得られた。この研究において使用したエフェクター細胞は以下の通りに調製した:リンパ球分離培地(ref. J15−004、Invitrogen Corp.、Carlsbad、CA)を使用する密度勾配遠心分離により、健常ドナーから得られたヒト末梢血単核細胞(PBMC)を単離した。37℃の加湿インキュベーター(5%のCO2)中、10%のFCS、ペニシリン/ストレプトマイシン及び1mL当たり100単位のヒト組換えIL−2(Roussel−Uclafより入手)を含むRPMI 1640中で1mL当たり2×106個のPBMCを2日間培養した。
異なる濃度の試験IgGにおいて得られたADCCのパーセンテージを式% ADCC=(f−e)/(b−a)×100、すなわち、% ADCC=(標的+エフェクター細胞+/−試験MabのOD − 標的+エフェクター細胞の自発性放出のOD)/(最大放出標的細胞のOD − 標的細胞の自発性放出のOD)×100で算出した。
以下の表に示すデータは、全ての試験抗体が有意な細胞媒介性の細胞傷害性を誘導したことを実証する。
実施例11:SCID/RA1異種移植モデルにおける抗腫瘍活性
試験抗体の治療効果をバーキットリンパ腫の動物モデルにおいて評価した。使用したモデルにおいて、SCIDマウスにおける全身性のがんは、後肢麻痺を引き起こし、全ての主な臓器に浸潤する。
試験抗体の治療効果をバーキットリンパ腫の動物モデルにおいて評価した。使用したモデルにおいて、SCIDマウスにおける全身性のがんは、後肢麻痺を引き起こし、全ての主な臓器に浸潤する。
腫瘍細胞注射の48時間前に、雌SCIDマウス(7〜9週齢、体重17〜22g)にγ線源(1.8Gy、60Co)で照射した。D0に、200μlのRPMI 1640中に懸濁した100万個のRA1細胞(アメリカ型バーキットリンパ腫の患者から確立されたBリンパ球型細胞株)をマウスの尾静脈に静脈注射した。D4に、Vivo manager(登録商標)ソフトウェア(Biosystemes、Dijon、France)を使用して、腫瘍を有するマウスを体重に基づいて各10匹のマウスの10群に割り当てた。平均体重は群間で統計的に異ならなかった(平均体重:19.3±1.4g)。処置をD4に開始した:4、8、12、16、20及び24日目にマウスに5mg/kg又は10mg/kgの用量の試験抗体を静脈内投与した。注射用のビヒクルは、10mMのクエン酸Na、150mMのNaCl、50mMのアルギニン(pH5.5)であった。体重を週に2回測定し、記録した。各群について死亡日の平均として平均生存期間を算出し、各群について死亡日の中央値(メジアン)としてメジアン生存期間を算出した。寿命値の増加(increased life span value;ILS)により各試験抗体の有効性を判定した。ILS%を以下の通りに表した:ILS%=[(T−C)/C]×100。Tは各試験抗体で処置した動物の生存期間の中央値(メジアン)であり、Cはビヒクルで処置した対照動物のメジアン生存期間であった。実験は腫瘍注射の81日後に終了した。
ビヒクル又はゾレア(登録商標)(アイソタイプ対照)で処置した全ての対照マウスは重篤な体重減少と共に散剤性疾患により死亡し、又はマウスは腫瘍細胞接種後4週間以内に瀕死であったので終了させた。
抗体V62.1又はV62.1−R108Hでの繰返しの処置は、対照マウスと比較して生存率の2倍の増加に繋がった(p<0.001)。加えて、陽性対照として使用したCD20抗体マブセラ(登録商標)で処置したマウスは、対照マウスより有意に長く生存した(p<0.001)。これらのデータは、試験抗体V62.1及びV62.1−R108Hがこの高度に侵襲性の異種移植モデルにおいてRA1細胞増殖を効果的に標的化及び抑制できたことを指し示した。詳細な結果を以下の表に示す。
実施例12:ヒト乳がん異種移植モデルにおける抗転移活性
この実験の目的は、MDA−MB−231/Luc細胞(商品番号AKR−231、Cell Biolabs,Inc、San Diego、CA)をBALB/cヌードマウスの静脈内に移植した乳癌転移モデルにおいて4つの試験抗体の有効性を評価することであった。MDA−MB−231/Luc細胞株は、MDA−MB−231ヒト乳がん細胞株に由来するルシフェラーゼ発現亜株である。MDA−MB−231/Luc細胞は、肺において実験的転移を生じさせる。MDA−MB−231がん細胞の経内皮遊走の他に血管透過性はSDF1/CXCR4シグナル伝達に依存することが公知であった(Lee et al. (2004) Mol. Cancer Res. 2: 327)。
この実験の目的は、MDA−MB−231/Luc細胞(商品番号AKR−231、Cell Biolabs,Inc、San Diego、CA)をBALB/cヌードマウスの静脈内に移植した乳癌転移モデルにおいて4つの試験抗体の有効性を評価することであった。MDA−MB−231/Luc細胞株は、MDA−MB−231ヒト乳がん細胞株に由来するルシフェラーゼ発現亜株である。MDA−MB−231/Luc細胞は、肺において実験的転移を生じさせる。MDA−MB−231がん細胞の経内皮遊走の他に血管透過性はSDF1/CXCR4シグナル伝達に依存することが公知であった(Lee et al. (2004) Mol. Cancer Res. 2: 327)。
試験は、12匹の雌BALB/cヌードマウスをそれぞれ含有する7つの実験群からなるものであった。−1日目に、体重に基づいて動物を無作為化した。各群の平均体重は、分散分析により群間で統計的に異ならなかった。0日目に、100μlの0.9%のNaCl中の2×106個のMDA−MB−231/Luc細胞を全ての参加する動物の静脈内に移植した。インビボ生物発光イメージングを使用して2、9、15、24、28、31、35及び38日目に転移性増殖を評価した。1日毎に動物の体重を測定した(月、水、金曜日)。群2〜5の動物の静脈内に−1、3、7、11、15及び19日目に10mg/kgの試験抗体を投与し(Q4Dx6)、群1にビヒクル(10mMのクエン酸Na、150mMのNaCl、50mMのアルギニン、pH5.5)を与えた。最新の体重測定に基づいて抗体の用量を算出した。
試験終了時(38日目)の胸部領域の総ルシフェラーゼ活性を図2に示す。全ての試験抗体は、胸部領域において腫瘍細胞増殖を有意に阻害した。
本明細書における値の範囲の記載は単に、本明細書において別に指し示さない限り、範囲内に入る各別々の値に個々に言及する簡略化された方法として働くことを意図し、各別々の値は、これが本明細書において個々に記載されているかのように、本明細書に組み込まれる。別に指し示さない限り、本明細書において提供される全ての厳密な値は、対応するおおよその値の代表である(例えば、特定の因子又は測定値に関して提供される全ての厳密な例示的な値は、適切な場合、「約」により修飾された、対応するおおよその測定値も提供すると考えることができる。)。
本明細書において提供される任意の及び全ての例又は例示的な表現(例えば、「のような」)の使用は単に、本発明をよりよく説明することを意図するものであり、別に指し示さない限り、発明の範囲を限定しない。
本明細書における特許文献の引用及び組込みは簡便性のために行うものに過ぎず、このような特許文献の妥当性、特許性及び/又は権利行使可能性に関するいかなる見解も反映しない。構成要素への言及のような用語を使用する本発明の任意の態様又は実施形態の本明細書における記載は、別の記載がない限り又は明らかに文脈に矛盾しない限り、その特定の構成要素「からなる」、「から本質的になる」又は「実質的に含む」本発明の類似の態様又は実施形態のサポートを提供することを意図する(例えば、特定の構成要素を含むと本明細書において記載される組成物は、別の記載がない限り又は明らかに文脈に矛盾しない限り、その構成要素からなる組成物も記載するものと理解されるべきである。)。
本発明は、適用法により許容される最大の程度まで、本明細書において提示される態様又は特許請求の範囲に記載される主題の全ての改変及び均等物を含む。
本明細書において引用される全ての刊行物及び特許出願は、各個々の刊行物又は特許出願が参照することにより組み込まれることを具体的かつ個々に指し示されたかのように、参照することによりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
理解を明確にする目的から説明及び例により、以上の発明の一部の詳細を記載してきたが、添付の特許請求の範囲の本質又は範囲から離れることなくある特定の変更及び改変が為され得ることが本発明の教示に照らして当業者に容易に明らかとなる。
Claims (14)
- (i)配列番号13若しくは14のアミノ酸配列又は1つ以上の保存的改変により前記アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び
(ii)配列番号15、16、17、18若しくは19のアミノ酸配列又は1つ以上の保存的改変により前記アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、単一特異的抗体又は結合断片。 - (i)配列番号1の配列又は1つ以上の保存的改変により前記アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するCDR1L;配列番号2の配列又は1つ以上の保存的改変により前記アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するCDR2L;及び配列番号3若しくは4の配列又は1つ以上の保存的改変により前記アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するCDR3Lを含む可変軽鎖;及び
(ii)配列番号5若しくは6の配列又は1つ以上の保存的改変により前記アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するCDR1H;配列番号7、8、9若しくは10の配列又は1つ以上の保存的改変により前記アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するCDR2H;及び配列番号11若しくは12の配列又は1つ以上の保存的改変により前記アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するCDR3Hを含む可変重鎖を有する、単一特異的抗体又は結合断片。 - 操作されたヒト抗体又は結合断片である、請求項1又は2に記載の単一特異的抗体又は結合断片。
- lgG1アイソタイプである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の単一特異的抗体又は結合断片。
- CXCR4を発現するがんの治療において使用するための、請求項1〜4のいずれか一項に記載の単一特異的抗体又は結合断片。
- バーキットリンパ腫の治療において使用するための、請求項1〜4のいずれか一項に記載の単一特異的抗体又は結合断片。
- 乳がんの治療において使用するための、請求項1〜4のいずれか一項に記載の単一特異的抗体又は結合断片。
- 治療される対象がヒト対象である、請求項5〜7のいずれか一項に記載の使用。
- 哺乳動物対象においてCXCR4発現がん細胞を検出する方法であって、
(i)がん細胞を含有する生検若しくは液体試料を、前記対象から採取すること、及び前記がん細胞におけるCXCR4の発現を検出する免疫化学若しくは免疫組織化学アッセイにおいて、請求項1〜4のいずれかに記載の単一特異的抗体若しくは結合断片を使用すること、又は
(ii)放射性標識された請求項1〜4のいずれかに記載の単一特異的抗体若しくは結合断片を、前記対象に非経口的に投与すること、及び免疫シンチグラフィーにより前記対象中の抗体若しくは結合断片を検出すること
を含む、方法。 - 哺乳動物対象がヒト対象である、請求項9に記載の方法。
- 治療有効量の請求項1〜4のいずれかに記載の単一特異的抗体又は結合断片、及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
- 治療有効量の請求項1〜4のいずれかに記載の単一特異的抗体又は結合断片、非経口的に許容される希釈剤、及び任意選択的に、薬学的に許容される賦形剤を含む、対象への非経口投与のための医薬組成物。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の単一特異的抗体又は結合断片を含む、診断キット。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の単一特異的抗体又は結合断片をコードする、ポリヌクレオチド。
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