CN113453725A

CN113453725A - 包含含有谷氨酰胺的轻链c末端延伸的抗体、其缀合物以及方法和用途

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Publication number: CN113453725A
Application number: CN201980078228.3A
Authority: CN
Inventors: P·施特罗; C·饶-奈克; 邓晓笛; P·O·谢泼德; P·G·霍尔德; 山添纱有美
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2018-11-30
Filing date: 2019-11-25
Publication date: 2021-09-28
Also published as: IL283576A; JP2022513686A; ES2943474T3; SI3886914T1; IL283576B2; CA3121131A1; FI3886914T3; IL283576B1; HRP20230500T1; BR112021010060B1; WO2020112588A1; DK3886914T3; EP3886914B1; US20220016260A1; RS64205B1; CY1126075T1; AU2019386945A1; EP3886914A1; JP7389803B2; PT3886914T

Abstract

抗体在其轻链的C末端处具有含有谷氨酰胺的延伸，使其适于经由转谷氨酰胺酶介导的转酰胺基作用进行缀合。

Description

包含含有谷氨酰胺的轻链C末端延伸的抗体、其缀合物以及方法和用途

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年11月30日提交的美国临时申请序列号62/773,708的35U.S.C.§119(e)下的权益；将其公开内容通过引用并入本文。

序列表

通过引用整体并入本文的是命名为“191017_SEQT_13142WO PCT_YC.txt”的序列表，所述序列表包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:40，其包括本文公开的核酸和/或氨基酸序列。所述序列表经由EFS-Web以ASCII文本形式随同提交，并且因此构成了其纸质可读形式和计算机可读形式。所述序列表最初是在2018年10月26日使用PatentIn 3.5创建的，大小约为14K B。

背景技术

本公开文本涉及可通过酶转谷氨酰胺酶缀合的经修饰的抗体和由此类抗体制成的缀合物。

引起当前强烈兴趣的一种类型的生物制剂是其中抗体与配偶体分子共价连接的生物制剂(“缀合物”或“免疫缀合物”)。因此，缀合物包含三种组分：(1)抗体、(2)配偶体分子、和(3)共价连接前两种组分的接头。

配偶体分子可以是治疗剂，如抗癌药物、佐剂、另一种蛋白质、或放射性同位素。抗体是其抗原由靶细胞或组织表达的抗体。抗体用于通过其与抗原的结合将缀合物递送至靶标。一旦到达那里，共价连接的切割或抗体的降解导致治疗剂在目标位置处的释放。相反，当缀合物在血液系统中循环时，治疗剂由于其与抗体的共价键而保持无活性，从而降低了副作用的风险。关于在抗癌治疗中的缀合物，参见Gerber等人2013。

作为治疗剂的替代，所述配偶体分子可以是用于诊断、定位疾病部位或监测医学状况的测定剂。在此类情况下，所述测定剂可以是例如生物素、荧光标记、放射性标记或氘代聚合物。Smith等人2019披露了用于MRI成像的包含氘代聚合物的缀合物。在此类情况下，在靶位点处的接头的切割不是必需的，并且实际上可能是不希望的。对于此类用途，可以将接头设计为不可切割的类型。

在制备缀合物中的关键步骤是共价连接步骤，也称为缀合步骤。已经披露了用于实现缀合的许多方法。最近引起人们极大兴趣的方法是由酶转谷氨酰胺酶(EC 2.3.2.13)介导的缀合。

已知许多转谷氨酰胺酶变体，其由不同的生物体自然产生或由生物工程制造。食品工业中常用于组织化(texturing)蛋白质的转谷氨酰胺酶变体是通过发酵或重组表达获得的茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)转谷氨酰胺酶。在本文中，通常使用术语“转谷氨酰胺酶”，除非指明特定的类型或来源。

转谷氨酰胺酶在谷氨酰胺(胺受体，或相对地，酰基供体)的甲酰胺侧链与赖氨酸(胺供体，或相对地，酰基受体)的ε-氨基基团之间形成酰胺键。就特异性而言(Specificity-wise)，转谷氨酰胺酶关于谷氨酰胺残基具有选择性，要求所述谷氨酰胺残基位于蛋白质环的柔性部分中，并且侧接某些氨基酸，但是关于赖氨酸残基则是各式各样的，例如容易接受亚烷基氨基化合物的氨基基团作为赖氨酸ε-氨基替代物。参见Fontana等人2008。

在典型的转谷氨酰胺酶介导的缀合中，谷氨酰胺残基位于抗体上，而氨基基团位于接头-配偶体分子部分上，如下所示：

谷氨酰胺残基在多肽链上的定位对其作为胺受体的可行性具有很大影响。通常，抗体上的谷氨酰胺残基均不可用，并且需要抗体的一些修饰以使其可用。典型地，使抗体在重链的天冬酰胺297(N297)处糖基化(N-连接的糖基化)。Jeger等人2010披露了通过N297A取代消除糖基化位点或翻译后酶促去糖基化进行的抗体的去糖基化使得附近的谷氨酰胺295(Q295)可用于通过茂原链霉菌(S.mobaraensis)转谷氨酰胺酶的转酰胺基作用。他们进一步显示N297Q取代不仅消除糖基化，而且还引入也作为胺受体的第二谷氨酰胺残基(在位置297处)。因此，简单的去糖基化产生每个抗体两个转谷氨酰胺酶反应性谷氨酰胺残基(每条重链一个，在Q295处)，而具有N297Q取代的抗体产生四个此类谷氨酰胺残基(每条重链两个，在Q295和Q297位置处)。

除了由Jeger等人2010披露的N297A和N297Q取代外，存在关于修饰抗体或其他蛋白质以使其成为转谷氨酰胺酶的底物的其他公开文本。

(a)Strop等人2017和Farias等人2016披露了用含有谷氨酰胺的标签(如LLQGG、LSLSQG、GGGLLQGG、GLLQG等)工程化的抗体Fc区，其中标签中的谷氨酰胺可以充当胺受体并且位于抗体重链或轻链的多个位置(包括其羧基末端)处。

(b)Chen等人2005披露了用QSKVX标签修饰蛋白质，其中X是L或I，然后所述蛋白质可以与转谷氨酰胺酶缀合。

(c)Fischer等人2015披露了将下式的含有谷氨酰胺(Q)的标签掺入缺乏Fc结构域的抗体片段中：

(Q)-NH-(C)-X-L-(V-(Y-(M或Z)_z)_q)_r。

(d)Rao-Naik等人2018披露了将含有谷氨酰胺的重链C末端延伸附加到抗体上以使其具有转谷氨酰胺酶反应性。

在修饰抗体以使其具有转谷氨酰胺酶反应性的补充方法中，Rao-Naik等人2017披露了修饰转谷氨酰胺酶以使其能够与野生型抗体缀合。

还已经使用含有小肽的分子研究了转谷氨酰胺酶的底物特异性：Ando等人1989、Kamiya等人2011、Ohtsuka等人2000。

与使用转谷氨酰胺酶缀合抗体或其他蛋白质相关的其他公开文本是：Bregeon2016、Bregeon等人2016、Bregeon等人2017、Dennler等人2014、Innate Pharma 2013、Lin等人2006、Mero等人2009、Mindt等人2008、Sato 2002、Sato等人2001、Schibli等人2007以及Sugimura等人2007。

还已知为了经由迈克尔(Michael)加成与马来酰亚胺基团缀合的目的，将含有半胱氨酸的末端延伸附接到抗体上。Liu等人2014披露了将此类延伸附接到重链的C末端。Babcook等人2017披露了将此类延伸附接到轻链的C末端。

本说明书的结尾处列出了通过第一作者或发明人和年份对本文中引用的文献的完全引用。

发明内容

缀合位点的位置可以影响缀合物的稳定性和药代动力学。Strop等人2013。因此，希望提供可替代的缀合位点和缀合物结构，以使可用于开发生物制品的选择多样化。

本说明书公开了抗体，所述抗体在轻链上具有含有谷氨酰胺的C末端延伸以用于与转谷氨酰胺酶缀合。在一个实施方案中，提供了一种全长抗体，所述抗体在其轻链的C末端(羧基末端)上具有含有谷氨酰胺的延伸，所述含有谷氨酰胺的延伸包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、NO:2、NO:3、NO:4、NO:5、NO:6、NO:7、NO:8、NO:9、NO:10、NO:11、NO:12、NO:13、NO:14、NO:15、NO:16、NO:17、NO:18、NO:19、NO:20、NO:21、NO:22、NO:23、NO:24、NO:25、NO:26、NO:29、NO:30、NO:31、NO:32、NO:33、NO:34、NO:35、NO:36、NO:37、NO:38、NO:39、和NO:40。

在另一方面，本说明书提供了一种式(IV)的缀合物

其中

Ab是一种全长抗体，所述全长抗体在其轻链的C末端(羧基末端)上具有含有谷氨酰胺的延伸，所述含有谷氨酰胺的延伸包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、NO:2、NO:3、NO:4、NO:5、NO:6、NO:7、NO:8、NO:9、NO:10、NO:11、NO:12、NO:13、NO:14、NO:15、NO:16、NO:17、NO:18、NO:19、NO:20、NO:21、NO:22、NO:23、NO:24、NO:25、NO:26、NO:29、NO:30、NO:31、NO:32、NO:33、NO:34、NO:35、NO:36、NO:37、NO:38、NO:39、和NO:40；

L是经由与含有谷氨酰胺的延伸中的谷氨酰胺的酰胺键

而键合至Ab的接头部分；并且

D选自蛋白质、放射性同位素、测定剂、和治疗剂。

在另一方面，本说明书提供了一种制造抗体缀合物的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)在转谷氨酰胺酶的存在下，将全长抗体与胺供体化合物混合，所述全长抗体在其轻链的C末端(羧基末端)上具有含有谷氨酰胺的延伸，所述含有谷氨酰胺的延伸包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、NO:2、NO:3、NO:4、NO:5、NO:6、NO:7、NO:8、NO:9、NO:10、NO:11、NO:12、NO:13、NO:14、NO:15、NO:16、NO:17、NO:18、NO:19、NO:20、NO:21、NO:22、NO:23、NO:24、NO:25、NO:26、NO:29、NO:30、NO:31、NO:32、NO:33、NO:34、NO:35、NO:36、NO:37、NO:38、NO:39、和NO:40，所述胺供体化合物包含伯胺和选自以下的部分：蛋白质、放射性同位素、测定剂、和治疗剂；以及

(b)允许所述转谷氨酰胺酶催化在所述含有谷氨酰胺的延伸的谷氨酰胺的侧链甲酰胺与所述胺供体化合物的伯胺之间形成酰胺键，从而制造所述抗体缀合物。

(a)在转谷氨酰胺酶的存在下，将全长抗体与第一化合物混合，所述全长抗体在其轻链的C末端(羧基末端)上具有含有谷氨酰胺的延伸，所述含有谷氨酰胺的延伸包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、NO:2、NO:3、NO:4、NO:5、NO:6、NO:7、NO:8、NO:9、NO:10、NO:11、NO:12、NO:13、NO:14、NO:15、NO:16、NO:17、NO:18、NO:19、NO:20、NO:21、NO:22、NO:23、NO:24、NO:25、NO:26、NO:29、NO:30、NO:31、NO:32、NO:33、NO:34、NO:35、NO:36、NO:37、NO:38、NO:39、和NO:40，所述第一化合物是具有伯胺和第一反应官能团的胺供体化合物；

(b)允许所述转谷氨酰胺酶催化在所述含有谷氨酰胺的延伸的谷氨酰胺的侧链甲酰胺与所述第一化合物的伯胺之间形成酰胺键，以制造所述抗体与所述第一化合物的加合物；

(c)使所述加合物与第二化合物接触，所述第二化合物具有第二反应官能团和选自以下的部分：蛋白质、放射性同位素、测定剂、和治疗剂；所述第二反应官能团能够与所述第一反应官能团反应以在其间形成共价键；以及

(d)允许所述第一反应官能团与所述第二反应官能团反应并且在其间形成共价键，从而制造所述抗体缀合物。

在部分(在所述第一化合物或第二化合物中，视情况而定)是蛋白质的情况下，所得的缀合物是融合蛋白。在所述部分是放射性同位素的情况下，所得的缀合物可以用于放射疗法或放射成像。所述部分可以是测定剂，如荧光标记、氘代聚合物、或配体(像生物素)，在这种情况下，所述缀合物可以用于诊断医学状况、监测治疗或分析应用。优选地，所述部分是治疗剂(在这种情况下，所述产物也被称为抗体-药物缀合物或ADC)，所述治疗剂可以用于医学治疗，尤其是癌症治疗。

附图说明

图1示意性地示出了具有如本文公开的C末端延伸(SEQ ID NO:1)的抗体轻链。

图2比较了使用转谷氨酰胺酶(BTG)制造缀合物的一步方法和两步方法。

具体实施方式

定义

“抗体”意指完整抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链变体。完整抗体是包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的蛋白质。每条重链包含重链可变区(V_H)和包含三个结构域C_H1、C_H2和C_H3的重链恒定区。每条轻链包含轻链可变区(V_L或V_k)和包含一个单结构域的轻链恒定区CL。V_H区和V_L区可以进一步细分为高变性区域，称为互补决定区(CDR)，散布有较保守的框架区(FR)。每个V_H和V_L包含三个CDR和四个FR，按以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、和FR4。可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。恒定区可以介导抗体与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。如果抗体以5x10^-8M或更小、更优选1x10^-8M或更小、更优选6x10^-9M或更小、更优选3x10^-9M或更小、甚至更优选2x10^-9M或更小的K_D与抗原X结合，则认为所述抗体“特异性结合至”抗原X。抗体可以是嵌合的、人源化的、或优选是人的。重链恒定区可以经工程化以影响糖基化类型或程度，以延长抗体的半衰期、增强或减少与效应细胞或补体系统的相互作用、或调节一些其他特性。工程化可以通过替换、添加或缺失一个或多个氨基酸或通过用来自另一种免疫球蛋白类型的结构域替换结构域或前述的组合来完成。

抗体的“抗原结合片段”和“抗原结合部分”(或简单地，“抗体部分”或“抗体片段”)意指抗体的保留与抗原特异性结合的能力的一个或多个片段。已经显示，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来执行，所述片段诸如(i)Fab片段，为由V_L、V_H、C_L和C_H1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')₂片段，为包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fab’片段，其实质上是具有铰链区的一部分的Fab(参见例如Abbas等人,Cellular and Molecular Immunology,第6版,Saunders Elsevier 2007)；(iv)由V_H结构域和C_H1结构域组成的Fd片段；(v)由抗体的单臂的V_L结构域和V_H结构域组成的Fv片段，(vi)dAb片段(Ward等人,(1989)Nature 341:544-546)，其由V_H结构域组成；(vii)分离的互补决定区(CDR)；和(viii)纳米抗体，为含有单个可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。优选的抗原结合片段是Fab、F(ab’)₂、Fab’、Fv、和Fd片段。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编码，但是可以使用重组方法通过合成接头将它们连接，所述合成接头能够将它们制成单个蛋白质链，在所述单个蛋白质链中VL区和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv或scFv)；参见例如，Bird等人(1988)Science 242:423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。此类单链抗体也涵盖在抗体的术语“抗原结合部分”范围内。

除非另外指示(例如通过引用SEQ ID NO:列表中的线性编号)，否则对抗体重链或轻链可变区(V_H或V_L)中氨基酸位置的编号的引用是根据Kabat系统的(Kabat等人,“Sequences of proteins of immunological interest,第5版,公开号91-3242,U.S.Dept.Health&Human Services,NIH,贝塞斯达,马里兰州,1991，下文称为“Kabat”)并且对抗体重链或轻链恒定区(C_H1、C_H2、C_H3或C_L)中氨基酸位置的编号的引用是根据如Kabat中列出的EU索引。参见Lazar等人,US 2008/0248028 A1，将其公开内容通过引用并入本文，例如此类使用。此外，ImMunoGeneTics信息系统(IMGT)在其网站上提供了标题为“IMGTScientific Chart:Correspondence between C Numberings”的表，其示出了对于重链恒定区，其编号系统EU编号与Kabat编号之间的对应关系。

“分离的抗体”意指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合抗原X的分离的抗体基本上不含特异性结合除抗原X外的抗原的抗体)。然而，特异性结合抗原X的分离的抗体可以与其他抗原(诸如来自其他物种的抗原X分子)具有交叉反应性。在某些实施方案中，分离的抗体与人抗原X特异性结合并且不与其他(非人)抗原X抗原交叉反应。此外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学物。

“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”意指单一分子组成的抗体分子制剂，其对特定表位展示单一结合特异性和亲和力。

“人抗体”意指具有可变区的抗体，其中框架区和CDR区(以及恒定区，如果存在的话)均源自人种系免疫球蛋白序列。人抗体可以包括随后的修饰，所述修饰包括天然修饰或合成修饰。人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，“人抗体”不包括其中源自另一种哺乳动物物种(诸如小鼠)的种系的CDR序列已经被移植到人框架序列上的抗体。

“人单克隆抗体”意指显示出单一结合特异性的具有可变区的抗体，其中框架区和CDR区均源自人种系免疫球蛋白序列。在一个实施方案中，人单克隆抗体是由杂交瘤产生的，所述杂交瘤包括与永生化细胞融合的获自具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组的转基因非人动物(例如转基因小鼠)的B细胞。

实施方案

总体上，转谷氨酰胺酶介导的抗体缀合物的制备可以通过一步方法或两步方法进行，如图2中示意性展示的。在一步方法中，转谷氨酰胺酶使在延伸上的谷氨酰胺甲酰胺(充当胺受体)与胺供体化合物H₂N-L-D偶联，以直接形成缀合物，在所述胺供体化合物中，L是接头部分，并且配偶体分子D是蛋白质、放射性同位素、测定剂、或治疗剂。在两步方法中，转谷氨酰胺酶催化在延伸上的谷氨酰胺甲酰胺(充当胺受体)与第一化合物(H₂N-L'-R')之间形成初始转酰胺基加合物，所述第一化合物是胺供体化合物，其中L'是第一接头部分并且R'是第一反应官能团。随后，所述加合物与第二化合物(R"-L"-D)反应，在所述第二化合物中，R"是能够与R'反应的第二反应官能团，L"是第二接头部分，并且D是如上所定义的。有时，将所述一步方法称为酶促方法，而将所述两步方法称为化学酶促方法，因为它需要化学步骤和酶促步骤二者。L、L'和L”中的每一个均可以是烷基链-(CH₂)_m-，其中m是2至10(包含端值)的整数，或可以是(特别是在L和L”的情况下)更复杂的结构，如下所讨论。

胺供体(H₂N-L-D或H₂N-L’-R’)经常大量过量使用以抑制在谷氨酰胺甲酰胺与抗体赖氨酸的ε-氨基基团之间的不希望的转酰胺基作用。如果部分D昂贵或难以获得，则大量过量的使用可能是不切实际的。在这种情况下，所述两步方法可能是优选的，即使它需要另外的步骤。

作为证明，我们将缀合具有与Terrett等人,US 8,268,970 B2(2012)的抗体6A4相同的重链和轻链CDR的抗间皮素抗体。其重链和轻链序列分别提供为SEQ ID NO:27和SEQID NO:28。附接具有以下公开的序列的轻链C末端延伸，然后使用所述一步方法将如此修饰的抗体与作为胺供体的化合物(A)或化合物(B)缀合。

在化合物(A)中，所述治疗剂是Toll样受体7(TLR7)激动剂，其可以用作用于疫苗和治疗多种病症的免疫治疗剂的佐剂。TLR7激动剂的例子披露于美国申请序列号16/103210、16/103511、16/103581、16/013601、和16/103619；各自在2018年8月14日提交；将其公开内容通过引用并入本文。在化合物(B)中，所述治疗剂是微管溶素(tubulysin)类似物，一种可用于抗癌治疗的细胞毒素。化合物(B)的制备披露于2018年6月22号提交的US临时申请序列号62/688737；将其公开内容通过引用并入本文。

在一个实施方案中，本文公开的轻链C末端延伸具有一个谷氨酰胺。例子连同从其制备的缀合物的药物-抗体比率(DAR)在下表A中列出。由于每个抗体具有两条轻链，每个均带有延伸，因此理论最大DAR是2.0。图1示意性地示出了具有SEQ ID NO:1的C末端延伸的抗体轻链。

在另一个实施方案中，轻链C末端延伸具有两个谷氨酰胺。例子连同从其制备的缀合物的药物-抗体比率(DAR)在下表B中列出。由于每个抗体具有两条轻链，每个均带有具有两个谷氨酰胺的延伸，因此理论最大DAR是4.0。

可能的是，在具有两个谷氨酰胺的C末端延伸中，通过在它们之间插入两个与四个之间的氨基酸，将谷氨酰胺彼此分离得比它们在表B中更远是有益的。

由于轻链的C末端在一定程度上被掩埋，因此希望提供间隔子以使延伸中的谷氨酰胺更突出并且易于接近转谷氨酰胺酶。这种效果可以通过在延伸的N末端处使用多个甘氨酸(2至4个)来实现。参照表A，可以看出没有甘氨酸的延伸(SEQ ID NO:13)导致比具有两个或四个甘氨酸的延伸的DAR更低的DAR。

在一个实施方案中，所述抗体具有包含两个间隔子甘氨酸和一个谷氨酰胺的轻链C末端延伸。此类延伸通过SEQ ID NO:1、NO:2、NO:3、NO:4、NO:5、和NO:6例示。

在另一个实施方案中，所述抗体具有包含四个间隔子甘氨酸和一个谷氨酰胺的轻链C末端延伸。此类延伸通过SEQ ID NO:7、NO:8、NO:9、NO:10、NO:11、和NO:12例示。

在另一个实施方案中，所述抗体具有包含两个间隔子甘氨酸和两个谷氨酰胺的轻链C末端延伸。此类延伸通过SEQ ID NO:14、NO:15、NO:16、NO:17、NO:18、NO:19、NO:29、NO:30、NO:31、NO:32、NO:33、和NO:34例示。

在另一个实施方案中，所述抗体具有包含四个间隔子甘氨酸和两个谷氨酰胺的轻链C末端延伸。此类延伸通过SEQ ID NO:20、NO:21、NO:22、NO:23、NO:24、NO:25、NO:35、NO:36、NO:37、NO:38、NO:39、和NO:40例示。

有利地，所述C末端轻链延伸在谷氨酰胺的N末端侧上含有缬氨酸-亮氨酸二肽(VL)。

可以通过本公开文本的方法修饰和缀合的抗体包括识别以下抗原的那些：间皮素、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、CD19、CD22、CD30、CD70、B7H3、B7H4(也称为O8E)、蛋白酪氨酸激酶7(PTK7)、磷脂酰肌醇聚糖-3、RG1、岩藻糖基-GM1、CTLA-4、和CD44。抗体可以是动物的(例如，鼠)、嵌合的、人源化的、或优选是人的。抗体优选是单克隆的，尤其是单克隆人抗体。以下公开了针对前述一些抗原的人单克隆抗体的制备：Korman等人,US 8,609,816 B2(2013；B7H4，也称为08E；特别是抗体2A7、1G11、和2F9)；Rao-Naik等人,8,097,703B2(2012；CD19；特别是抗体5G7、13F1、46E8、21D4、21D4a、47G4、27F3、和3C10)；King等人,US 8,481,683B2(2013；CD22；特别是抗体12C5、19A3、16F7、和23C6)；Keler等人,US 7,387,776B2(2008；CD30；特别是抗体5F11、2H9、和17G1)；Terrett等人,US 8,124,738B2(2012；CD70；特别是抗体2H5、10B4、8B5、18E7、和69A7)；Korman等人,US 6,984,720 B1(2006；CTLA-4；特别是抗体10D1、4B6、和1E2)；Vistica等人,US 8,383,118 B2(2013，岩藻糖基-GM1，特别是抗体5B1、5B1a、7D4、7E4、13B8、和18D5)；Korman等人,US 8,008,449 B2(2011；PD-1；特别是抗体17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3、和5F4)；Huang等人,US 2009/0297438 A1(2009；PSMA，特别是抗体1C3、2A10、2F5、2C6)；Cardarelli等人,US 7,875,278 B2(2011；PSMA；特别是抗体4A3、7F12、8C12、8A11、16F9、2A10、2C6、2F5、和1C3)；Terrett等人,US 8,222,375 B2(2012；PTK7；特别是抗体3G8、4D5、12C6、12C6a、和7C8)；Terrett等人,US 8,680,247 B2(2014；磷脂酰肌醇聚糖-3；特别是抗体4A6、11E7、和16D10)；Harkins等人,US 7,335,748 B2(2008；RG1；特别是抗体A、B、C、和D)；Terrett等人,US 8,268,970 B2(2012；间皮素；特别是抗体3C10、6A4、和7B1)；Xu等人,US 2010/0092484 A1(2010；CD44；特别是抗体14G9.B8.B4、2D1.A3.D12、和1A9.A6.B9)；Deshpande等人,US 8,258,266 B2(2012；IP10；特别是抗体1D4、1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、7C10、8F6、10A12、10A12S、和13C4)；Kuhne等人,US 8,450,464B2(2013；CXCR4；特别是抗体F7、F9、D1、和E2)；和Korman等人,US 7,943,743 B2(2011；PD-L1；特别是抗体3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7、和13G4)；将其公开内容通过引用并入本文。

关于式(IV)的缀合物

(a)在一个实施方案中，D优选是细胞毒性药物。

(b)在另一个优选的实施方案中，D是TLR7、STING、NRLP3、或RIG-1激动剂。

(c)在优选的实施方案中，L是-(CH₂)_2-6-。

(d)在另一个优选的实施方案中，L是

其中

T是自我牺牲基团；

t是0或1；

AA^a和每个AA^b独立地选自丙氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、γ-羧基谷氨酸、瓜氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、和缬氨酸；

p是1、2、3、或4；

q是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10；并且

r是1、2、3、4、或5。

现在更详细地讨论用于缀合的一步和两步方法。

在优选的实施方案中，一步方法中的胺供体化合物由式(I)表示：

H₂N-(CH₂)_2-6D (I)

其中D是蛋白质、放射性同位素、测定剂、或治疗剂。

在另一个优选的实施方案中，用于所述一步方法的胺供体化合物具有由式(Ia)表示的结构：

其中

D是蛋白质、放射性同位素、测定剂、或治疗剂；

T是自我牺牲基团；

t是0或1；

p是1、2、3、或4；

q是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10；并且

r是1、2、3、4、或5。

在式(Ia)、(Ia’)和(III)(以下)中，-AA^a-[AA^b]_p-表示多肽，其长度由p值确定(如果p是1，则是二肽，；如果p是3，则是四肽等)。AA^a是多肽的羧基末端并且其羧基基团与D(或T，如果存在)的胺氮形成肽(酰胺)键。相反，最后的AA^b在多肽的氨基末端处并且其α-氨基基团与

形成肽键。

优选的多肽-AA^a-[AA^b]_p-是Val-Cit、Val-Lys、Lys-Val-Ala、Asp-Val-Ala、Val-Ala、Lys-Val-Cit、Ala-Val-Cit、Val-Gly、Val-Gln、和Asp-Val-Cit，以常规的N-至-C方向书写，如在H₂N-Val-Cit-CO₂H中)。更优选地，所述多肽是Val-Cit、Val-Lys、或Val-Ala。优选地，多肽-AA^a-[AA^b]_p-可以通过在靶细胞内发现的酶(例如组织蛋白酶，并且尤其是组织蛋白酶B)或在靶器官或组织周围的酶切割。

如果下标q不是0，则化合物(Ia)含有聚(乙二醇)(PEG)基团，所述聚(乙二醇)基团可以有利地改善化合物(Ia)的溶解度，从而促进与抗体的缀合-在水性介质中进行的步骤。同样，PEG基团可以用作抗体与肽-AA^a-[AA^b]_p-之间的间隔子，因此抗体的大部分不会在空间上干扰肽切割酶的作用。

如下标t等于0或1所示，任选地存在自我牺牲基团T。自我牺牲基团是这样的基团：从AA^a或AA^b(视情况而定)切割引发反应序列，从而导致所述自我牺牲基团自身破坏与D的键合(disbonding)并且释放后者以发挥其治疗功能。存在时，自我牺牲基团T优选是对氨基苄基氧基羰基(PABC)基团，其结构如下所示，星号(*)表示键合至药物D的胺氮的PABC的末端，并且波浪线

表示键合至多肽-AA^a-[AA^b]_p-的末端。PABC基团可以被取代，如2018年5月29日提交的美国临时申请序列号62/677307中所披露。

可以使用的另一个自我牺牲基团是取代的噻唑，如Feng,US7,375,078B2(2008)中所披露。

化合物(A)和(B)展示了根据式(Ia)的胺供体化合物的设计，它们的各种元素的排列如所示。化合物(A)(而不是化合物(B))包含自我牺牲基团。

在两步缀合中，可以使用基团R’和R”的许多组合。R’和R”(或反之亦然，R”和R’)的合适的组合包括：

(a)马来酰亚胺基团和巯基基团，以形成迈克尔加成加合物，如在以下中：

(b)二苯并环辛炔基团和叠氮基团，以经由“点击”化学形成环加成产物，如在以下中：

(c)N-羟基琥珀酰亚胺酯和胺，以形成酰胺，如在以下中：

和

(d)醛或酮(其中“烷基”优选是C_1-3烷基)和羟胺，以形成肟，如在以下中：

因此，R’可以选自

然而相对地，R”可以选自

式(II)中描绘了用于两步方法的合适的胺供体第一化合物

H₂N-(CH₂)_2-8-R' (II)

其中R’是如上所定义的并且优选是

相应的合适的化合物R”-L”-D示于式(III)中

其中R”是如上所定义的并且优选是

并且r、q、AA^b、p、AA^a、T、t、和D是如上关于式(Ia)所定义的。

在缀合物旨在用于癌症治疗的情况下，所述治疗剂可以是导致靶向的癌细胞死亡的细胞毒性药物。可用于缀合物的细胞毒性药物包括以下类型的化合物及其类似物和衍生物：

(a)烯二炔，如卡奇霉素(参见例如，Lee等人,J.Am.Chem.Soc.1987,109,3464和3466)和尤西拉霉素(uncialamycin)(参见例如，Davies等人,WO 2007/038868 A2(2007)；Chowdari等人,US 8,709,431 B2(2012)；和Nicolaou等人,WO 2015/023879 A1(2015))；

(b)微管溶素(参见例如，Domling等人,US 7,778,814 B2(2010)；Cheng等人,US8,394,922 B2(2013)；和Cong等人,US 8,980,824 B2(2015))；

(c)DNA烷基化剂如CC-1065的类似物和杜卡霉素(duocarmycin)(参见例如，Yang等人,US 2018/0051031 A1(2018)；Boger,US 6,5458,530 B1(2003)；Sufi等人,US 8,461,117 B2(2013)；和Zhang等人,US 8,852,599 B2(2014))；

(d)埃博霉素(参见例如，Vite等人,US 2007/0275904 A1(2007)和US RE42930 E(2011))；

(e)奥瑞他汀(auristatins)(参见例如Senter等人,US 6,844,869 B2(2005)和Doronina等人,US 7,498,298 B2(2009))；

(f)苯并二氮杂卓二聚体(参见例如，Zhang等人,US 9,527,871 B2(2016)；Zhang等人,US 9,688,694 B2(2017)；McDonald等人,US 9,526,801 B2(2016)；Howard等人,US2013/0059800 A1(2013)；US 2013/0028919 A1(2013)；和WO 2013/041606 A1(2013))；以及

(g)美登木素生物碱，如DM1和DM4(参见例如，Chari等人,US 5,208,020(1993)和Amphlett等人,US 7,374,762 B2(2008))。

在一个实施方案中，所述细胞毒性药物是DNA烷基化剂、微管溶素、奥瑞他汀、苯并二氮杂卓二聚体、烯二炔、或美登木素生物碱。通过说明而不是限制的方式，具体的例子是

免疫系统具有这样的受体，其天然配体是病原体相关分子模式(PAMP)。PAMP与其同源受体的结合激活免疫系统，以防御相关病原体的感染。此外，这些受体还可以被合成激动剂激活，所述合成激动剂对疫苗和在治疗除实际病原体感染以外的多种病症中的免疫治疗剂的作用具有佐剂效应。特别地，免疫肿瘤学药剂(如伊匹单抗、纳武单抗和派姆单抗)可以从这种佐剂效应中受益。可以被合成激动剂激活的受体包括TLR3、TLR7、TLR9(分别为Toll样受体-3、-7和-9)、STING(干扰素基因的刺激物；也称为MPYS、TMEM173、MITA或ERIS)、NLRP3(NOD样受体蛋白3)、和RIG-I(视黄酸诱导型基因I)。因此，在可替代的实施方案中，所述治疗剂是TLR3、TLR7、TLR9、STING、NLRP3、或RIG-I激动剂。特别地，所述治疗剂可以是如披露于以下文献的TLR7激动剂：Poudel等人,US 2019/0055243 A1(2019)；Young等人,US2019/0055244 A1(2019)；Poudel等人,US 2019/0055245 A1(2019)；He等人,US 2019/0055246 A1(2019)；He等人,US 2019/0055247 A1(2019)；和Purandare等人,PCT申请PCT/US2019/028697，2019年4月23日提交。

上述治疗剂可以用于通过一步或两步方法制造的缀合物中。

实施例

通过参考以下实施例可以进一步理解本发明的实践，所述实施例是作为说明而非限制来提供的。

实施例1-经修饰的抗体的制备

ExpiCHO细胞用于表达抗体。在塑料烧瓶中在37℃，8％CO₂气氛下在ExpiCHO培养基中，使ExpiCHO细胞生长。将用于重链和轻链的表达载体在OptiMEM中混合，添加在OptiMEM中的PEI溶液，并且将所得的PEI/DNA复合物在室温下孵育30min，然后添加到细胞中。转染后24h，将Feed B和VPA添加到细胞中并且将细胞在搅动的情况下在37℃下保持。7天后，将培养上清液通过离心和过滤收集。将上清液用MabSelect SuRe LX树脂纯化。简言之，将细胞上清液与树脂在4℃下孵育过夜，用10CV的PBS洗涤，然后用4CV的0.1M柠檬酸盐(pH 3.5)洗脱，立即用1/10体积的1M tris(pH 8)中和。

实施例2-经修饰的抗体的缀合

通过以下所列方案使用转谷氨酰胺酶进行如本文所述修饰的抗体与胺供体的缀合。我们使用分散酶激活具有V65I和Y75F点突变的BTG酶。在使用前将其透析至来自配制品(缓冲液20mM乙酸盐、10％甘油(pH 4))的50mM乙酸钠(pH 5.5)中。

在对于每个抗体存在0.2摩尔过量转谷氨酰胺酶的情况下，在50mM Tris-HCl(pH8.0)或20mM组氨酸、50mM咪唑、10％蔗糖(pH约7.8)中，使抗体以约2mg/mL与每个位点过量10倍摩尔的胺供体反应。允许在连续的温和混合的情况下在37℃下反应过夜。

将抗体药物缀合物进行0.2μm过滤并且使用mAb Select SuRe^TM柱(GEHealthcare)纯化。将缀合物装载到用50mM Tris-HCl(pH 8.0)预平衡的柱上，并且用10CV(柱体积)的平衡缓冲液洗涤，然后用10CV的50mM Tris-HCl、17％乙腈(pH 8.0)洗涤，以去除未反应的胺供体。将所述柱用50mM Tris-HCl(pH 8.0)重新平衡，然后用0.1M柠檬酸盐(pH 3.5)在1mL级分中洗脱，并且用1M Tris(pH 8.0)以1/10的洗脱体积中和。将所希望的级分在配制品缓冲液20mM组氨酸、10％蔗糖(pH 6.0)中透析，并且通过LC-MS(ESI-QTOF)、RP-HPLC和SDS-PAGE分析纯度和药物与抗体比率(DAR)。

实施例3-缀合的经修饰的抗体的分析

在对于每个抗体存在0.2摩尔过量重组细菌转谷氨酰胺酶的情况下，在50mM咪唑、10％蔗糖(pH 8)中，使抗体以5mg/mL与每个位点10倍摩尔的胺供体反应。在连续的温和混合的情况下在37℃下过夜孵育后，将反应混合物通过LC-MS(ESI-QTOF)分析以用于DAR评价。

前述具体实施方式包括主要或专门涉及本发明的特定部分或方面的段落。应当理解，这是为了清楚和方便，特定特征可能在不只是公开它的段落中是相关的，并且本文所公开的内容包括在不同段落中找到的信息的所有适当组合。类似地，尽管本文中的各种附图和描述涉及本发明的具体实施方案，但是应当理解，在特定附图或实施方案的背景下公开了具体特征的情况下，也可以在另一个附图或实施方案的背景下、与另一个特征组合、或总体上在本发明中在适当的程度上使用此类特征。

此外，尽管已经根据某些优选实施方案具体描述了本发明，但是本发明不限于此类优选实施方案。而是，本发明的范围由所附权利要求限定。

参考文献

下面提供了在本说明书较早以缩写方式通过第一作者(或发明人)和日期引用的以下参考文献的完整引用。将这些参考文献的每一个出于所有目的通过引用并入本文。

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Sugimura et al.,J.Biotechnol.2007,131,121,“Novel site-specificimmobilization of a functional protein using a preferred substrate sequencefor transglutaminase 2.”。

序列表

<110> 百时美施贵宝公司

<120> 包含含有谷氨酰胺的轻链C末端延伸的抗体、其缀合物以及方法和用途

<130> 13142-WO-PCT

<150> US 62/773708

<151> 2018-11-30

<160> 40

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C末端延伸

<400> 1

Gly Gly Val Leu Gln Arg Ala Ser

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C末端延伸

<400> 2

Gly Gly Val Leu Gln Gly Ala Ser

1 5

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C末端延伸

<400> 3

Gly Gly Val Leu Gln Arg Pro Ser

1 5

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C末端延伸

<400> 4

Gly Gly Val Leu Gln Gly Pro Ser

1 5

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C末端延伸

<400> 5

Gly Gly Val Leu Gln Ser Pro Ser

1 5

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C末端延伸

<400> 6

Gly Gly Val Leu Gln Tyr Ala Ser

1 5

<210> 7

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C末端延伸

<400> 7

Gly Gly Gly Gly Val Leu Gln Arg Ala Ser

1 5 10

<210> 8

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C末端延伸

<400> 8

Gly Gly Gly Gly Val Leu Gln Gly Ala Ser

1 5 10

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C末端延伸

<400> 9

Gly Gly Gly Gly Val Leu Gln Arg Pro Ser

1 5 10

<210> 10

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C末端延伸

<400> 10

Gly Gly Gly Gly Val Leu Gln Gly Pro Ser

1 5 10

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C末端延伸

<400> 11

Gly Gly Gly Gly Val Leu Gln Ser Pro Ser

1 5 10

<210> 12

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C末端延伸

<400> 12

Gly Gly Gly Gly Val Leu Gln Tyr Ala Ser

1 5 10

<210> 13

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C末端延伸

<400> 13

Val Leu Gln Tyr Ala Ser

1 5

<210> 14

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C末端延伸

<400> 14

Gly Gly Val Leu Gln Arg Gln Ser

1 5

<210> 15

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C末端延伸

<400> 15

Gly Gly Val Leu Gln Gly Gln Ser

1 5

<210> 16

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C末端延伸

<400> 16

Gly Gly Val Leu Gln Arg Gln Arg Pro Ser

1 5 10

<210> 17

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C末端延伸

<400> 17

Gly Gly Val Leu Gln Gly Gln Gly Pro Ser

1 5 10

<210> 18

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C末端延伸

<400> 18

Gly Gly Val Leu Gln Ser Gln Ser Pro Ser

1 5 10

<210> 19

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C末端延伸

<400> 19

Gly Gly Val Leu Gln Tyr Gln Ser

1 5

<210> 20

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C末端延伸

<400> 20

Gly Gly Gly Gly Val Leu Gln Arg Gln Ser

1 5 10

<210> 21

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C末端延伸

<400> 21

Gly Gly Gly Gly Val Leu Gln Gly Gln Ser

1 5 10

<210> 22

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C末端延伸

<400> 22

Gly Gly Gly Gly Val Leu Gln Arg Gln Arg Pro Ser

1 5 10

<210> 23

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C末端延伸

<400> 23

Gly Gly Gly Gly Val Leu Gln Gly Gln Gly Pro Ser

1 5 10

<210> 24

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C末端延伸

<400> 24

Gly Gly Gly Gly Val Leu Gln Ser Gln Ser Pro Ser

1 5 10

<210> 25

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C末端延伸

<400> 25

Gly Gly Gly Gly Val Leu Gln Tyr Gln Ser

1 5 10

<210> 26

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C末端延伸

<400> 26

Val Leu Gln Tyr Gln Ser

1 5

<210> 27

<211> 451

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 抗间皮素抗体重链

<400> 27

Gln Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ile Thr Phe Arg Ile Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Leu Trp Tyr Asp Gly Ser His Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Gly Asp Tyr Tyr Asp Ser Gly Ser Pro Leu Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Arg Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Pro Gly

450

<210> 28

<211> 214

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 抗间皮素抗体κ链

<400> 28

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 29

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C末端延伸

<400> 29

Gly Gly Val Leu Gln Val Leu Gln Ser

1 5

<210> 30

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C末端延伸

<400> 30

Gly Gly Val Leu Gln Gly Val Leu Gln Ser

1 5 10

<210> 31

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C末端延伸

<400> 31

Gly Gly Val Leu Gln Gly Gly Val Leu Gln Ser

1 5 10

<210> 32

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C末端延伸

<400> 32

Gly Gly Val Leu Gln Val Leu Gln Gly Pro Ser

1 5 10

<210> 33

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C末端延伸

<400> 33

Gly Gly Val Leu Gln Gly Gly Gln Gly Pro Ser

1 5 10

<210> 34

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C末端延伸

<400> 34

Gly Gly Val Leu Gln Gly Gly Gly Gln Gly Pro Ser

1 5 10

<210> 35

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C末端延伸

<400> 35

Gly Gly Gly Gly Val Leu Gln Val Leu Gln Ser

1 5 10

<210> 36

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C末端延伸

<400> 36

Gly Gly Gly Gly Val Leu Gln Gly Val Leu Gln Ser

1 5 10

<210> 37

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C末端延伸

<400> 37

Gly Gly Gly Gly Val Leu Gln Gly Gly Val Leu Gln Ser

1 5 10

<210> 38

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C末端延伸

<400> 38

Gly Gly Gly Gly Val Leu Gln Val Leu Gln Gly Pro Ser

1 5 10

<210> 39

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C末端延伸

<400> 39

Gly Gly Gly Gly Val Leu Gln Gly Gly Gln Gly Pro Ser

1 5 10

<210> 40

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C末端延伸

<400> 40

Gly Gly Gly Gly Val Leu Gln Gly Gly Gly Gln Gly Pro Ser

1 5 10

Claims

1.一种全长抗体，所述全长抗体在其轻链的C末端上具有含有谷氨酰胺的延伸，所述含有谷氨酰胺的延伸包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、NO:2、NO:3、NO:4、NO:5、NO:6、NO:7、NO:8、NO:9、NO:10、NO:11、NO:12、NO:13、NO:14、NO:15、NO:16、NO:17、NO:18、NO:19、NO:20、NO:21、NO:22、NO:23、NO:24、NO:25、NO:26、NO:29、NO:30、NO:31、NO:32、NO:33、NO:34、NO:35、NO:36、NO:37、NO:38、NO:39、和NO:40。

2.根据权利要求1所述的全长抗体，其中所述延伸具有选自以下的氨基酸序列：SEQ IDNO:1、NO:2、NO:3、NO:4、NO:5、和NO:6。

3.根据权利要求1所述的全长抗体，其中所述延伸具有选自以下的氨基酸序列：SEQ IDNO:7、NO:8、NO:9、NO:10、NO:11、和NO:12。

4.根据权利要求1所述的全长抗体，其中所述延伸具有选自以下的氨基酸序列：SEQ IDNO:14、NO:15、NO:16、NO:17、NO:18和NO:19。

5.根据权利要求1所述的全长抗体，其中所述延伸具有选自以下的氨基酸序列：SEQ IDNO:20、NO:21、NO:22、NO:23、NO:24、和NO:25。

6.根据权利要求1所述的全长抗体，其中所述含有谷氨酰胺的延伸在谷氨酰胺的N末端侧上具有缬氨酸-亮氨酸(VL)。

7.一种式(IV)的缀合物

其中

L是经由与含有谷氨酰胺的延伸中的谷氨酰胺的酰胺键

而键合至Ab的接头部分；并且

D选自蛋白质、放射性同位素、测定剂、和治疗剂。

8.根据权利要求7所述的缀合物，其中D是细胞毒性药物。

9.根据权利要求7所述的缀合物，其中D是TLR3、TLR7、TLR9、STING、NLRP3、或RIG-I激动剂t。

10.根据权利要求7所述的缀合物，其中L是-(CH₂)_2-6-。

11.根据权利要求7所述的缀合物，其中L是

其中

T是自我牺牲基团；

t是0或1；

p是1、2、3、或4；

q是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10；并且

r是1、2、3、4、或5。

12.一种制造抗体缀合物的方法，所述方法包括以下步骤：

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述胺供体化合物具有结构

H₂N-L-D

其中L是接头部分并且D是蛋白质、放射性同位素、测定剂、或治疗剂。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述胺供体化合物具有结构

H₂N-(CH₂)_2-6D (I)。

15.根据权利要求12所述的方法，其中所述胺供体化合物具有由式(Ia)表示的结构

其中

D是蛋白质、放射性同位素、测定剂、或治疗剂；

T是自我牺牲基团；

t是0或1；

p是1、2、3、或4；

q是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10；并且

r是1、2、3、4、或5。

16.根据权利要求12所述的方法，其中所述部分是治疗剂。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述治疗剂是细胞毒性药物。

18.根据权利要求16所述的缀合物，其中治疗剂是TLR3、TLR7、TLR9、STING、NLRP3、或RIG-I激动剂。

19.一种制造抗体缀合物的方法，所述方法包括以下步骤：

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述第一化合物具有结构

H₂N-L’-R’

其中L’是第一接头部分并且R’是第一反应官能团，并且所述第二化合物具有结构

R”-L”-D

其中R”是能够与R’反应的第二反应官能团，L”是第二接头部分，并且D是蛋白质、放射性同位素、测定剂、或治疗剂。

21.根据权利要求20所述的方法，其中R’选自

并且相对地，R”选自

22.根据权利要求20所述的方法，其中所述第一化合物具有由式(II)表示的结构

H₂N-(CH₂)_2-8-R' (II)

并且所述第二化合物具有由式(III)表示的结构

其中

R’是第一反应官能团；

R”是能够与R’反应的第二反应官能团；

D是蛋白质、放射性同位素、测定剂、或治疗剂；

T是自我牺牲基团；

t是0或1；

p是1、2、3、或4；

q是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10；并且

r是1、2、3、4、或5。

23.根据权利要求22所述的方法，其中R’选自

并且相对地，R”选自