BR112021010060B1 - Anticorpo que compreende uma extensão c-terminal de cadeia leve que contém glutamina, conjugados do mesmo, e método de preparação de conjugados - Google Patents

Anticorpo que compreende uma extensão c-terminal de cadeia leve que contém glutamina, conjugados do mesmo, e método de preparação de conjugados Download PDF

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Abstract

anticorpo que compreende uma extensão c-terminal de cadeia leve que contém glutamina, conjugados do mesmo e métodos e usos. a presente invenção refere-se a um anticorpo tem uma extensão que contém glutamina no c-término de uma cadeia leve do mesmo, tornando-o adequado para conjugação por meio de transamidação mediada por transglutaminase.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] O presente pedido reivindica o benefício sob a Lei 35 U.S.C. §119 (e) do Pedido Provisório Norte-Americano N° de Série 62/773.708, depositado em 30 de novembro de 2018; cuja descrição é incorporada ao presente documento a título de referência.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[002] Incorporada ao presente documento a título de referência na íntegra está uma Listagem de Sequências denominada "191017_ SEQT_13142WOPCT_YC.txt" que compreende SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 40, a qual inclui as sequências de ácidos nucleicos e/ou ami- noácidos descritas no presente documento. A Listagem de Sequências foi enviada com este documento em formato de texto ASCII via EFS- Web e, portanto, constitui sua forma legível em papel e em computador. A Listagem de Sequências foi criada pela primeira vez usando PatentIn 3.5 em 26 de outubro de 2018 e tem aproximadamente 14 KB de tamanho.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[003] A presente invenção refere-se a anticorpos modificados conjugáveis pela enzima transglutaminase e conjugados feitos a partir de tais anticorpos.
[004] Um tipo de produto biológico que tem atraído intenso inte resse atualmente é aquele no qual um anticorpo está covalentemente ligado a uma molécula parceira ("conjugado" ou "imunoconjugado"). Assim, um conjugado compreende três componentes: (1) o anticorpo, (2) a molécula parceira e (3) um ligante que une covalentemente os primeiros dois componentes.
[005] A molécula parceira pode ser um agente terapêutico, tal como um fármaco anticâncer, um adjuvante, outra proteína ou um ra- dioisótopo. O anticorpo é aquele cujo antígeno é expresso por uma célula ou tecido-alvo. O anticorpo, por meio de sua ligação ao antíge- no, serve para distribuir o conjugado ao alvo. Uma vez lá, a clivagem da ligação covalente ou degradação do anticorpo resulta na liberação do agente terapêutico no local-alvo. Por outro lado, enquanto o conjugado está circulando no sistema sanguíneo, o agente terapêutico é mantido inativo em virtude de sua ligação covalente ao anticorpo, reduzindo o risco de efeitos colaterais. Para uma revisão sobre conjugados no tratamento anticâncer, consulte Gerber et al. 2013.
[006] Alternativamente a um agente terapêutico, a molécula par ceira pode ser um agente de ensaio para diagnosticar, localizar um local de doença ou monitorar uma condição médica. Em tal caso, o agente de ensaio pode ser, por exemplo, biotina, um marcador fluorescente, um marcador radioativo ou um polímero deuterado. Smith et al. 2019 descrevem um conjugado que compreende um polímero deu- terado para imagiologia MRI. Em tal caso, a clivagem do ligante no local-alvo não é necessária e pode, na verdade, ser indesejável. Para tal uso, o ligante pode ser concebido para ser do tipo não clivável.
[007] Uma etapa-chave na preparação de um conjugado é a eta pa de união covalente, também denominada como etapa de conjugação. Muitos métodos foram descritos para efetuar a conjugação. Um que atraiu um interesse recente substancial é a conjugação mediada pela enzima transglutaminase (EC 2.3.2.13).
[008] Muitas variantes da transglutaminase são conhecidas, se jam produzidas naturalmente por diferentes organismos ou por bioen- genharia. Uma comumente usada na indústria alimentícia para texturi- zar proteínas é a transglutaminase de Streptomyces mobaraensis, obtida por meio de fermentação ou expressão recombinante. No presen te documento, o termo "transglutaminase" é usado genericamente, a menos que um tipo ou fonte específica seja indicada.
[009] A transglutaminase forma uma ligação de amida entre a cadeia lateral de carboxamida de uma glutamina (o aceitador de amina ou, reciprocamente, o doador de acila) e o grupo ε-amino de uma lisina (o doador de amina ou, reciprocamente, o aceitador de acila). Em termos de especificidade, a transglutaminase é seletiva em relação ao resíduo de glutamina, requerendo que ela esteja localizada em uma parte flexível de uma alça de proteína e flanqueada por determinados aminoácidos, mas é promíscua em relação ao resíduo de lisina, por exemplo, aceitando prontamente o grupo amino de um composto de alquilenamino como um substituto ε-amino da lisina. Consulte Fontana et al. 2008
[0010] Em uma conjugação típica mediada por transglutaminase, o resíduo de glutamina está localizado no anticorpo, enquanto que o grupo amino está localizado na porção da molécula ligante-parceira, conforme mostrado abaixo:
[0011] A localização de um resíduo de glutamina em uma cadeia polipeptídica tem um grande efeito sobre sua disponibilidade como um aceitador de amina. Normalmente, nenhum dos resíduos de glutamina em um anticorpo está disponível e alguma modificação do anticorpo é necessária para torná-los disponíveis. Tipicamente, um anticorpo é glicosilado na asparagina 297 (N297) da cadeia pesada (glicosilação N-ligada). Jeger et al. 2010 descobriram que a desglicosilação do anti- corpo, seja por eliminação do sítio de glicosilação através de uma substituição N297A ou desglicosilação enzimática pós-traducional, torna a glutamina 295 vizinha (Q295) disponível para transamidação pela transglutaminase de S. mobaraensis. Eles mostraram ainda que uma substituição N297Q não apenas elimina a glicosilação, mas também introduz um segundo resíduo de glutamina (na posição 297) que também é um aceitador de amina. Assim, a desglicosilação simples gera dois resíduos de glutamina reativos à transglutaminase por anticorpo (um por cadeia pesada, em Q295), enquanto que um anticorpo com uma substituição N297Q gera quatro destes resíduos de glutamina (dois por cadeia pesada, nas posições Q295 e Q297).
[0012] Além das substituições N297A e N297Q descritas por Jeger et al. 2010, houve outras descrições sobre a modificação de um anticorpo ou outra proteína para torná-la um substrato para a transglutaminase. (a) Strop et al. 2017 e Farias et al. 2016 descrevem regiões Fc de anticorpo manipuladas com etiquetas que contêm glutamina, tais como LLQGG, LSLSQG, GGGLLQGG, GLLQG, etc., onde a glutamina na etiqueta pode atuar como um aceitador de amina e ser posicionada em vários lugares de uma cadeia pesada ou leve de anticorpo, incluindo os terminais carbóxi do mesmo. (b) Chen et al. 2005 descrevem a modificação de uma proteína com a etiqueta QSKVX, onde X é L ou I, proteína tal que pode, então, ser conjugada com transglutaminase. (c) Fischer et al. 2015 descrevem a incorporação em um fragmento de anticorpo sem um domínio Fc de uma etiqueta que contém glutamina (Q) da fórmula: (Q)-NH-(C)-X-L-(V-(Y-(M or Z)z)q)r (d) Rao-Naik et al. 2018 descrevem extensões C-terminais da cadeia pesada que contêm glutamina a um anticorpo para torná-lo reativo à transglutaminase.
[0013] Em uma abordagem complementar à modificação de um anticorpo para torná-lo reativo à transglutaminase, Rao-Naik et al. 2017 descrevem a modificação da transglutaminase para torná-la capaz de ser conjugada a um anticorpo de tipo selvagem.
[0014] Também houve estudos sobre a especificidade por substra to da transglutaminase usando pequenas moléculas que contêm pep- tídeos: Ando et al. 1989, Kamiya et al. 2011, Ohtsuka et al. 2000.
[0015] Outras descrições relacionadas à conjugação de anticorpos ou outras proteínas usando transglutaminase são: Bregeon 2016, Bre- geon et al. 2016, Bregeon et al. 2017, Dennler et al. 2014, Innate Pharma 2013, Lin et al. 2006, Mero et al. 2009, Mindt et al. 2008, Sato 2002, Sato et al. 2001, Schibli et al. 2007 e Sugimura et al. 2007.
[0016] Também se sabe como anexar extensões terminais que contêm cisteína a um anticorpo com a finalidade de efetuar a conjugação por meio da adição de Michael a um grupo maleimida. Liu et al. 2014 descrevem anexar tais extensões ao C-término de uma cadeia pesada. Babcook et al. 2017 descrevem anexar tais extensões ao C- término de uma cadeia leve.
[0017] As citações completas para os documentos citados no pre sente documento pelo primeiro autor ou inventor e ano estão listadas ao final do presente relatório descritivo.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0018] A localização do sítio de conjugação pode afetar a estabili dade e a farmacocinética de um conjugado. Strop et al. 2013. Assim, é desejável fornecer sítios de conjugação alternativos e estruturas conjugadas para diversificar as opções disponíveis para o desenvolvimento de produtos biológicos.
[0019] O presente relatório descritivo descreve anticorpos que têm extensões que contêm glutamina C-terminal em uma cadeia leve para conjugação com transglutaminase. Em uma modalidade, é fornecido um anticorpo de comprimento total que tem no C-término (terminal carbóxi) de uma cadeia leve do mesmo uma extensão que contém glu- tamina que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, NO: 2, NO: 3, NO: 4, NO: 5, NO: 6, NO: 7, NO: 8, NO: 9, NO: 10, NO: 11, NO: 12, NO: 13, NO: 14, NO: 15, NO: 16, NO: 17, NO: 18, NO: 19, NO: 20, NO: 21, NO: 22, NO: 23, NO: 24, NO: 25, NO: 26, NO: 29, NO: 30, NO: 31, NO: 32, NO: 33, NO: 34, NO: 35, NO: 36, NO: 37, NO: 38, NO: 39 e NO: 40.
[0020] Em outro aspecto, o presente relatório descritivo fornece um conjugado da fórmula (IV): em que: Ab é um anticorpo de comprimento total que tem no C- término (terminal carbóxi) de uma cadeia leve do mesmo uma extensão que contém glutamina que compreende uma sequência de amino- ácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, NO: 2, NO: 3, NO: 4, NO: 5, NO: 6, NO: 7, NO: 8, NO: 9, NO: 10, NO: 11, NO: 12, NO: 13, NO: 14, NO: 15, NO : 16, NO: 17, NO: 18, NO: 19, NO: 20, NO: 21, NO: 22, NO: 23, NO: 24, NO: 25, NO: 26, NO: 29, NO: 30, NO: 31, NO: 32, NO: 33, NO: 34, NO: 35, NO: 36, NO: 37, NO: 38, NO: 39 e NO: 40; L é uma porção ligante ligada a Ab através da ligação de 9 H amida a uma glutamina em uma extensão que contém gluta- mina; e D é selecionado a partir do grupo que consiste em uma proteína, um radioisótopo, um agente de ensaio e um agente terapêutico.
[0021] Em outro aspecto, o presente relatório descritivo fornece um método para preparar um conjugado de anticorpo que compreende as etapas de: (a) misturar um anticorpo de comprimento total que tem no C-término (terminal carbóxi) de uma cadeia leve do mesmo uma extensão que contém glutamina que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, NO: 2, NO : 3, NO: 4, NO: 5, NO: 6, NO: 7, NO: 8, NO: 9, NO: 10, NO: 11, NO: 12, NO: 13, NO: 14, NO: 15, NO: 16, NO: 17, NO: 18, NO: 19, NO: 20, NO: 21, NO: 22, NO: 23, NO: 24, NO: 25, NO: 26, NO: 29, NO : 30, NO: 31, NO: 32, NO: 33, NO: 34, NO: 35, NO: 36, NO: 37, NO: 38, NO: 39, e NO: 40 com um composto doador de amina que compreende um amina primária e uma porção selecionada a partir do grupo que consiste em uma proteína, um radioisótopo, um agente de ensaio e um agente terapêutico, na presença de uma transglutaminase; e (b) permitir que a transglutaminase catalise a formação de uma ligação de amida entre a carboxamida da cadeia lateral de uma glutamina da extensão que contém glutamina e a amina primária do composto doador de amina, deste modo, formando o conjugado de anticorpo.
[0022] Em outro aspecto, o presente relatório descritivo fornece um método para preparar um conjugado de anticorpo que compreende as etapas de: (c) misturar um anticorpo de comprimento total que tem no C-término (terminal carbóxi) de uma cadeia leve do mesmo uma extensão que contém glutamina que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, NO: 2, NO : 3, NO: 4, NO: 5, NO: 6, NO: 7, NO: 8, NO: 9, NO: 10, NO: 11, NO: 12, NO: 13, NO: 14, NO: 15, NO: 16, NO: 17, NO: 18, NO: 19, NO: 20, NO: 21, NO: 22, NO: 23, NO: 24, NO: 25, NO: 26, NO: 29, NO : 30, NO: 31, NO: 32, NO: 33, NO: 34, NO: 35, NO: 36, NO: 37, NO: 38, NO: 39, e NO: 40 com um primeiro composto, primeiro composto o qual é um composto doador de amina que tem uma amina primária e um primeiro grupo funcional reativo, na presença de uma transglutaminase; (d) permitir que a transglutaminase catalise a formação de uma ligação de amida entre a carboxamida da cadeia lateral de uma glutamina da extensão que contém glutamina e a amina primária do primeiro composto para produzir um aduto do anticorpo e do primeiro composto; (e) contatar o aduto com um segundo composto que tem um segundo grupo funcional reativo e uma porção selecionada a partir do grupo que consiste em uma proteína, um radioisótopo, um agente de ensaio e um agente terapêutico; o segundo grupo funcional reativo sendo capaz de reagir com o primeiro grupo funcional reativo para formar uma ligação covalente entre eles; e (f) permitir que o primeiro e segundo grupos funcionais reativos reajam e formem uma ligação covalente entre os mesmos, deste modo, formando o anticorpo conjugado.
[0023] Quando a porção (no primeiro composto ou no segundo composto, conforme o caso) é uma proteína, o conjugado resultante é uma proteína de fusão. Onde a porção é um radioisótopo, o conjugado resultante pode ser usado para radioterapia ou radioimagiologia. A porção pode ser um agente de ensaio, tal como um marcador fluorescente, um polímero deuterado ou um ligante tal como biotina, caso no qual o conjugado pode ser usado para diagnosticar uma condição médica, monitoramento de tratamento ou aplicações analíticas. De preferência, a porção é um agente terapêutico (caso no qual o produto também é denominado como um conjugado de anticorpo-fármaco ou ADC), o qual pode ser usado em tratamentos médicos, especialmente no tratamento de câncer.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0024] A Figura 1 mostra esquematicamente uma cadeia leve de anticorpo que tem uma extensão C-terminal (SEQ ID NO: 1) conforme descrito no presente documento.
[0025] A Figura 2 compara os métodos de uma e duas etapas para produzir conjugados usando transglutaminase (BTG).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO DEFINIÇÕES
[0026] "Anticorpo" significa anticorpos completos e qualquer frag mento de ligação a antígeno (ou seja, "porção ligante a antígeno") ou variantes com uma única cadeia dos mesmos. Um anticorpo completo é uma proteína que compreende pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadas através de ligações de dissul- feto. Cada cadeia pesada compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região constante de cadeia pesada que compreende três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve compreende uma região variável de cadeia leve (VL ou Vk) e uma região constante de cadeia leve que compreende um único domínio, CL. As regiões VH e VL podem ser subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade (Complementarity Determining Regions, CDRs), intercaladas com regiões estruturais (Framework Regions, FRs) mais conservadas. Cada VH e VL compreende três CDRs e quatro FRs arranjadas, a partir do terminal amino para carbóxi, na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. As regiões variáveis contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes podem mediar a ligação do anticorpo aos tecidos ou fatores do hospedeiro, incluindo várias células do sistema imune (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (C1q) do sistema de complemento clássico. Diz-se que um anticorpo se "liga especificamente" a um antígeno X se o anticorpo se liga ao antígeno X com uma KD de 5 x 10-8 M ou menos, mais prefe-rivelmente 1 x 10-8 M ou menos, mais preferivelmente 6 x 10-9 M ou menos, mais preferivelmente 3 x 10-9 M ou menos, ainda mais preferivelmente 2 x 10-9 M ou menos. O anticorpo pode ser quimérico, humanizado ou, de preferência, humano. A região constante da cadeia pesada pode ser manipulada para afetar o tipo ou extensão da glicosila- ção, para estender a meia-vida do anticorpo, para aumentar ou reduzir as interações com células efetoras ou o sistema de complemento ou para modular alguma outra propriedade. A manipulação pode ser realizada por meio de substituição, adição ou eliminação de um ou mais aminoácidos ou substituição de um domínio por um domínio de outro tipo de imunoglobulina, ou uma combinação dos precedentes.
[0027] "Fragmento de ligação a antígeno" e "porção ligante a antí- geno" de um anticorpo (ou simplesmente "porção de anticorpo" ou "fragmento de anticorpo") significam um ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a capacidade de se ligar especificamente a um antígeno. Foi demonstrado que a função de ligação a antígeno de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo de comprimento completo, tais como (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste nos domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados através de uma ponte de dissulfeto na região de dobradiça; (iii) um fragmento Fab', o qual é essencialmente um Fab com parte da região de dobradiça (consulte, por exemplo, Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, 6a Ed., Saunders Elsevier 2007); (iv) um fragmento Fd que consiste nos domínios VH e CH1; (v) um fragmento Fv que consiste nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (vi) um fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), o qual consiste em um domínio VH; (vii) uma região determinante de complementaridade (CDR) isolada; e (viii) um nanocorpo, uma região variável de cadeia pesada que contém um único domínio variável e dois domínios constantes. Os fragmentos de ligação a antí- geno preferidos são fragmentos Fab, F(ab')2, Fab', Fv e Fd. Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por genes separados, eles podem ser unidos, usando métodos recombinantes, através de um ligante sintético que permite que sejam produzidos como uma única cadeia de proteína na qual as regiões VL e VH emparelham para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv com uma única cadeia ou scFv); consulte, por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; e Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Estes anticorpos com uma única cadeia também estão incluídos no termo "porção ligante a antígeno" de um anticorpo.
[0028] A menos que indicado de outra forma - por exemplo, atra vés de referência à numeração linear em uma SEQ ID NO: listagem - referência à numeração das posições de aminoácidos em uma região variável de cadeia pesada ou leve de anticorpo (VH ou VL) estão de acordo com o sistema de Kabat (Kabat et al., "Sequences of Protein of Immunological Interest, 5a ed., Pub. N° 91-3242, US Dept. Health & Human Services, NIH, Bethesda, Md., 1991, daqui em diante "Kabat") e referências à numeração das posições de aminoácidos em uma região constante da cadeia pesada ou leve do anticorpo (CH1, CH2, CH3 ou CL) estão de acordo com o índice EU, conforme apresentado em Kabat. Consulte Lazar et al., documento US 2008/0248028 A1, cuja descrição é incorporada ao presente documento a título de referência, para exemplos de tal uso. Além disso, o Sistema de Informação ImMunoGeneTics (IMGT) fornece em seu site uma tabela intitulada " IMGT Scientific Chart: Correspondence between C Numberings" que mostra a correspondência entre seu sistema de numeração, a numeração EU e a numeração de Kabat para a região constante de cadeia pesada.
[0029] Um "anticorpo isolado" significa um anticorpo que é subs tancialmente isento de outros anticorpos com diferentes especificidades antigênicas (por exemplo, um anticorpo isolado que se liga especificamente ao antígeno X é substancialmente isento de anticorpos que se ligam especificamente a outros antígenos que não o antígeno X). Um anticorpo isolado que se liga especificamente ao antígeno X pode, no entanto, ter reatividade cruzada com outros antígenos, tais como moléculas de antígeno X de outras espécies. Em determinadas modalidades, um anticorpo isolado se liga especificamente ao antígeno X humano e não exibe reação cruzada com outros antígenos do antíge- no X (não humano). Além disso, um anticorpo isolado pode ser substancialmente isento de outro material celular e/ou produtos químicos.
[0030] "Anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpo mo noclonal" significa uma preparação de moléculas de anticorpo de composição molecular única que exibe uma especificidade e afinidade de ligação exclusiva por um epítopo particular.
[0031] "Anticorpo humano" significa um anticorpo que tem regiões variáveis nas quais tanto as regiões estruturais como as CDRs (e a região constante, se presente) são derivadas de sequências de imu- noglobulina da linhagem germinativa humana. Os anticorpos humanos podem incluir modificações posteriores, incluindo modificações naturais ou sintéticas. Os anticorpos humanos podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas por meio de mutagênese aleatória ou sítio-específica in vitro ou mutação somática in vivo). No entanto, "anticorpo humano" não inclui anticorpos nos quais as sequências de CDR derivadas da linhagem germinativa de outras espécies de mamíferos, tal como um camundongo, foram enxertadas em sequências estruturais humanas.
[0032] "Anticorpo monoclonal humano" significa um anticorpo que exibe uma única especificidade de ligação, que tem regiões variáveis nas quais as regiões estruturais e CDRs são derivadas de sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana. Em uma modalidade, os anticorpos monoclonais humanos são produzidos por um hi- bridoma que inclui uma célula B obtida de um animal transgênico não humano, por exemplo, um camundongo transgênico, que tem um ge- noma que compreende um transgene de cadeia pesada humana e um transgene de cadeia leve fundido a uma célula imortalizada.
MODALIDADES
[0033] Em geral, a preparação mediada por transglutaminase de um conjugado de anticorpo pode ser por um processo em uma etapa ou um processo em duas etapas, conforme ilustrado esquematicamente na Figura 2. No processo em uma etapa, a transglutaminase acopla uma carboxamida da glutamina na extensão, atuando como o aceitador de amina, e um composto doador de amina H2N-L-D, onde L é uma porção ligante e a molécula parceira D é uma proteína, um radioi- sótopo, um agente de ensaio ou um agente terapêutico, para formar o conjugado diretamente. No processo em duas etapas, a transglutaminase catalisa a formação de um aduto de transamidação inicial entre uma carboxamida da glutamina na extensão, atuando como o receptor de amina, e o primeiro composto (H2N-L'-R'), o qual é um composto doador de amina, onde L' é uma primeira porção ligante e R' é um primeiro grupo funcional reativo. Subsequentemente, o aduto reage com um segundo composto (R"-L"-D), onde R" é um segundo grupo funcional reativo capaz de reagir com R', L" é uma segunda porção ligante e D é conforme definido acima. Algumas vezes, o processo em uma etapa é denominado como o processo enzimático e o processo em duas etapas como o processo quimioenzimático, uma vez que envolve uma etapa química e uma enzimática. Cada um de L, L' e L" pode ser uma cadeia de alquila -(CH2)m- onde m é um número inteiro a partir de 2 a 10, inclusive, ou pode ser, especialmente no caso de L e L", uma estrutura mais complexa, conforme discutido abaixo.
[0034] O doador de amina, seja H2N-L-D ou H2N-L'-R', é frequen temente usado em grande excesso para suprimir a transamidação in- desejada entre a carboxamida da glutamina e um grupo ε-amino de uma lisina do anticorpo. Se a porção D for cara ou difícil de obter, o uso de um grande excesso pode ser impraticável. Em tais casos, o processo em duas etapas pode ser preferível, embora requeira uma etapa adicional.
[0035] Como uma demonstração, nós conjugamos um anticorpo anti-mesotelina que tem as mesmas CDRs de cadeia pesada e leve que o anticorpo 6A4 de Terrett et al., documento US 8.268.970 B2 (2012). Suas sequências de cadeia pesada e leve são fornecidas como SEQ ID NO: 27 e SEQ ID NO: 28, respectivamente. Extensões C- terminais de cadeia leve com as sequências descritas abaixo foram anexadas e os anticorpos assim modificados foram, então, conjugados ao composto (A) ou composto (B) como o doador de amina, usando o processo em uma etapa.
[0036] No Composto (A), o agente terapêutico é um agonista do Receptor 7 Toll-like (TLR7), o qual pode ser usado como um adjuvante para vacinas e agentes para imunoterapia no tratamento de uma vari-edade de condições. Exemplos de agonistas de TLR7 são descritos nos Pedidos Norte-Americanos Nos de Série 16/103210, 16/103511, 16/103581, 16/013601 e 16/103619; cada um depositado em 14 de agosto de 2018; cujas descrições são incorporadas ao presente documento a título de referência. No Composto (B), o agente terapêutico é um análogo de tubulisina, uma citotoxina que pode ser usada no tratamento anticâncer. A preparação do Composto (B) é descrita no Pedido Provisório Norte-Americano No de Série 62/688737, depositado em 22 de junho de 2018; cuja descrição é incorporada ao presente documento a título de referência.
[0037] Em uma modalidade, as extensões C-terminais da cadeia leve descritas no presente documento têm uma glutamina. Exemplos estão listados na Tabela A abaixo, juntamente com a proporção de fármaco-anticorpo (Drug-Antibody Ratio, DAR) de conjugados preparados a partir da mesma. Uma vez que há duas cadeias leves por anticorpo, cada uma com uma extensão, a DAR máxima teórica é 2,0. A Figura 1 mostra esquematicamente uma cadeia leve de anticorpo que tem a extensão C-terminal de SEQ ID NO: 1.
[0038] Em outra modalidade, a extensão C-terminal da cadeia leve tem duas glutaminas. Exemplos estão listados na Tabela B abaixo, juntamente com a proporção de fármaco-anticorpo (DAR) de conjugados preparados a partir da mesma. Uma vez que há duas cadeias leves por anticorpo, cada uma trazendo uma extensão com duas gluta- minas, a DAR máxima teórica é 4,0.
[0039] Pod e ser que, em extensões C-terminais com duas gluta- minas, seja benéfico separar as glutaminas uma da outra mais do que na Tabela B através da interposição de dois a quatro aminoácidos entre elas.
[0040] Uma vez que o C-término de uma cadeia leve está um pou co enterrado, é desejável fornecer espaçadores para tornar a glutami- na na extensão mais saliente e acessível à transglutaminase. Tal efeito pode ser alcançado usando várias glicinas (duas a quatro) no N- terminal da extensão. Com referência à Tabela A, pode-se ver que a extensão sem glicinas (SEQ ID NO: 13) leva a uma DAR mais baixa do que aquelas com duas ou quatro glicinas.
[0041] Em uma modalidade, o anticorpo tem uma extensão C-ter- minal de cadeia leve que compreende duas glicinas espaçadoras e uma glutamina. Estas extensões são exemplificadas por SEQ ID NO: 1, NO: 2, NO: 3, NO: 4, NO: 5 e NO: 6.
[0042] Em outra modalidade, o anticorpo tem uma extensão C-ter- minal de cadeia leve que compreende quatro glicinas espaçadoras e uma glutamina. Estas extensões são exemplificadas por SEQ ID NO: 7, NO: 8, NO: 9, NO: 10, NO: 11 e NO: 12.
[0043] Em outra modalidade, o anticorpo tem uma extensão C-ter- minal de cadeia leve que compreende duas glicinas espaçadoras e duas glutaminas. Tais extensões são exemplificadas por SEQ ID NO: 14, NO: 15, NO: 16, NO: 17, NO: 18, NO: 19, NO: 29, NO: 30, NO: 31, NO: 32, NO: 33 e NO: 34.
[0044] Em outra modalidade, o anticorpo tem uma extensão C-ter- minal de cadeia leve que compreende quatro glicinas espaçadoras e duas glutaminas. Tais extensões são exemplificadas por SEQ ID NO: 20, NO: 21, NO: 22, NO: 23, NO: 24, NO: 25, NO: 35, NO: 36, NO: 37, NO: 38, NO: 39 e NÃO: 40.
[0045] Vantajosamente, as extensões C-terminais de cadeia leve contêm um dipeptídeo valina-leucina (VL) no lado N-terminal de uma glutamina.
[0046] Os anticorpos que podem ser modificados e conjugados por meio dos métodos da presente invenção incluem aqueles que reco-nhecem os seguintes antígenos: mesotelina, antígeno na membrana específico para próstata (PSMA), CD19, CD22, CD30, CD70, B7H3, B7H4 (também conhecido como O8E), proteína tirosina quinase 7 (PTK7), glipicana-3, RG1, fucosil-GM1, CTLA 4 e CD44. O anticorpo pode ser animal (por exemplo, de murino), quimérico, humanizado ou, de preferência, humano. O anticorpo é, de preferência, monoclonal, especialmente um anticorpo monoclonal humano. A preparação de anticorpos monoclonais humanos contra alguns dos antígenos supraci-tados é descrita em Korman et al., documento US 8.609.816 B2 (2013; B7H4, também conhecido como 08E; em particular os anticorpos 2A7, 1G11 e 2F9); Rao-Naik et al., documento US 8.097.703 B2 (2012; CD19; em particular os anticorpos 5G7, 13F1, 46E8, 21D4, 21D4a, 47G4, 27F3 e 3C10); King et al., documento US 8.481.683 B2 (2013; CD22; em particular os anticorpos 12C5, 19A3, 16F7 e 23C6); Keler et al., documento US 7.387.776 B2 (2008; CD30; em particular os anticorpos 5F11, 2H9 e 17G1); Terrett et al., documento US 8.124.738 B2 (2012; CD70; em particular os anticorpos 2H5, 10B4, 8B5, 18E7 e 69A7); Korman et al., documento US 6.984.720 B1 (2006; CTLA-4; em particular anticorpos 10D1, 4B6 e 1E2); Vistica et al., documento US 8.383.118 B2 (2013, fucosil-GM1, em particular os anticorpos 5B1, 5B1a, 7D4, 7E4, 13B8 e 18D5); Korman et al., documento US 8.008.449 B2 (2011; PD-1; em particular os anticorpos 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 e 5F4); Huang et al., documento US 2009/0297438 A1 (2009; PSMA; em particular os anticorpos 1C3, 2A10, 2F5, 2C6); Cardarelli et al., documento US 7.875.278 B2 (2011; PSMA; em particular os anticorpos 4A3, 7F12, 8C12, 8A11, 16F9, 2A10, 2C6, 2F5 e 1C3); Terrett et al., documento US 8.222.375 B2 (2012; PTK7; em particular os anticorpos 3G8, 4D5, 12C6, 12C6a e 7C8); Terrett et al., documento US 8.680.247 B2 (2014; glipicana-3; em particular os anticorpos 4A6, 11E7 e 16D10); Harkins et al., documento US 7.335.748 B2 (2008; RG1; em particular os anticorpos A, B, C e D); Terrett et al., documento US 8.268.970 B2 (2012; mesotelina; em particular os anticorpos 3C10, 6A4 e 7B1); Xu et al., documento US 2010/0092484 A1 (2010; CD44; em particular os anticorpos 14G9.B8.B4, 2D1.A3.D12 e 1A9.A6.B9); Deshpande et al., documento US 8.258.266 B2 (2012; IP10; em particular os anticorpos 1D4, 1E1, 2G1, 3C4, 6A5, 6A8, 7C10, 8F6, 10A12, 10A12S e 13C4); Kuhne et al., documento US 8.450.464 B2 (2013; CXCR4; em particular os anticorpos F7, F9, D1 e E2); e Korman et al., documento US 7.943.743 B2 (2011; PD-L1; em particular os anticorpos 3G10, 12A4, 10A5, 5F8, 10H10, 1B12, 7H1, 11E6, 12B7 e 13G4); cujas descrições são incorporadas ao presente documento a título de referência.
[0047] Em relação aos conjugados de fórmula (IV): (a) Em uma modalidade, D é, de preferência, um fármaco citotóxico. (b) Em outra modalidade preferida, D é um agonista de TLR7, STING, NRLP3 ou RIG-1. (c) Em uma modalidade preferida, L é -(CH2)2—6-. (d) Em outra modalidade preferida, L é: em que: T é um grupo de autoimolação; t é 0 ou 1; cada AAa e AAb são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em alanina, β-alanina, ácido Y-aminobu- tírico, arginina, asparagina, ácido aspártico, ácido Y-carboxiglutâmico, citrulina, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, isoleu- cina, leucina, lisina, metionina, norleucina, norvalina, ornitina, fenilala- nina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina; p é 1, 2, 3 ou 4; q é 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10; e r é 1, 2, 3, 4 ou 5.
[0048] Os processos em uma e duas etapas para conjugação são agora discutidos em mais detalhes.
[0049] Em uma modalidade preferida, o composto doador de ami na em um processo em uma etapa é representado pela fórmula (I): onde D é uma proteína, um radioisótopo, um agente de ensaio ou um agente terapêutico.
[0050] Em outra modalidade preferida, o composto doador de ami na para o processo em uma etapa tem uma estrutura representada pela fórmula (Ia): em que: D é uma proteína, um radioisótopo, um agente de ensaio ou um agente terapêutico; T é um grupo de autoimolação; t é 0 ou 1; cada AAa e AAb são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em alanina, β-alanina, ácido Y-aminobu- tírico, arginina, asparagina, ácido aspártico, ácido Y—carboxiglutâmico, citrulina, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, isoleu- cina, leucina, lisina, metionina, norleucina, norvalina, ornitina, fenilala- nina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina; p é 1, 2, 3 ou 4; q é 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10; e r é 1, 2, 3, 4 ou 5.
[0051] Nas fórmulas (Ia), (Ia') e (III) (abaixo), -AAa-[AAb]p- representa um polipeptídeo cujo comprimento é determinado pelo valor de p (dipeptídeo se p for 1, tetrapeptídeo se p for 3, etc.). AAa está no terminal carbóxi do polipeptídeo e seu grupo carboxila forma uma ligação peptídica (amida) com um nitrogênio da amina de D (ou T, se presente). Por outro lado, o último AAb está no terminal amino do polipeptídeo e seu grupo α-amino forma uma ligação peptídica com
[0052] Os polipeptídeos -AAa-[AAb]p- preferidos são Val-Cit, Val- Lys, Lys-Val-Ala, Asp-Val-Ala, Val-Ala, Lys-Val-Cit, Ala-Val-Cit, Val-Gly, Val-Gln, and Asp-Val-Cit, escritos na direção convencional de N para C, conforme em H2N-Val-Cit-CO2H. Mais preferivelmente, o po- lipeptídeo é Val-Cit, Val-Lys ou Val-Ala. De preferência, um polipeptí- deo -AAa-[AAb]p- é clivável por uma enzima encontrada dentro da célula-alvo, por exemplo, uma catepsina, e especialmente catepsina B, ou uma enzima nos arredores do órgão ou tecido-alvo.
[0053] Se o subscrito q for diferente de 0, o composto (Ia) contém um grupo poli-etileno glicol (PEG), o qual pode melhorar vantajosamente a solubilidade do composto (Ia), facilitando a conjugação ao an- ticorpo - uma etapa que é realizada em meio aquoso. Além disso, um grupo PEG pode servir como um espaçador entre o anticorpo e o pep- tídeo -AAa-[AAb]p-, de modo que a maior parte do anticorpo não interfira estericamente com a ação de uma enzima de clivagem peptídica.
[0054] Conforme indicado pelo subscrito t igual a 0 ou 1, um grupo de autoimolação T está opcionalmente presente. Um grupo de autoi- molação é aquele no qual a clivagem de AAa ou AAb, conforme o caso, inicia uma sequência de reação resultando no grupo de autoimolação se dissociando de D e liberando este último para exercer sua função terapêutica. Quando presente, o grupo de autoimolação T é, de prefe-rência, um grupo p-aminobenzil oxicarbonila (PABC), cuja estrutura é mostrada abaixo, com um asterisco (*) denotando o final do grupo PABC ligado a um nitrogênio da amina do fármaco D e um a linha denotando a extremidade ligada ao polipeptídeo -AAa-[AAb]p-. O grupo PABC pode ser substituído, conforme descrito no Pedido Provisório Norte-Americano N° de Série 62/677307, depositado em 29 de maio de 2018.
[0055] Outro grupo de autoimolação que pode ser usado é um ti- azol substituído, conforme descrito em Feng, documento US 7.375.078 B2 (2008).
[0056] Os compostos (A) e (B) ilustram a concepção de compostos doadores de amina de acordo com a fórmula (Ia), com a disposição dos seus vários elementos conforme mostrado. O composto (A), mas não o composto (B), compreende um grupo de autoimolação.
[0057] Em uma conjugação em duas etapas, muitas combinações de grupos R' e R" podem ser usadas. Combinações adequadas de R' e R" (ou, vice-versa, R" e R') incluem: (a) um grupo maleimida e um grupo sulfidrila, para formar um aduto de adição de Michael, conforme em: (b) um grupo dibenzociclo-octino e um grupo azida, para formar um produto de cicloadição via química "Click", conforme em: (c) um éster de N-hidroxissuccinimida e uma amina, para formar uma amida, conforme em: (d) um aldeído ou cetona (onde "alquila" é, de preferência, C1-3 alquila) e uma hidroxilamina, para formar uma oxima, conforme em:
[0058] Assim, R' pode ser selecionado a partir de: enquanto que, reciprocamente, R" pode ser selecionado a partir de:
[0059] Um primeiro composto doador de amina adequado para o processo em duas etapas é representado na fórmula (II): onde R' é conforme definido acima e, de preferência, é:
[0060] Um composto adequado que corresponde a R"-L"-D é mos trado na fórmula (III): onde R" é conforme definido acima e, de preferência, é: e r, q, AAb, p, AAa, T, t e D são como definidos acima em relação à fórmula (Ia).
[0061] No caso onde o conjugado se destina ao uso no tratamento de câncer, o agente terapêutico pode ser um fármaco citotóxico que causa a morte da célula cancerosa-alvo. Fármacos citotóxicos que po-dem ser usados em conjugados incluem os seguintes tipos de com-postos e seus análogos e derivados: (a) enodiinas, tais como caliqueamicina (consulte, por exemplo, Lee et al., J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 3464 e 3466) e un- cialamicina (consulte, por exemplo, Davies et al., documento WO 2007/038868 A2 (2007); Chowdari et al., documento US 8.709.431 B2 (2012); e Nicolaou et al., documento WO 2015/023879 A1 (2015)); (b) tubulisinas (consulte, por exemplo, Domling et al., do-cumento US 7.778.814 B2 (2010); Cheng et al., documento US 8.394.922 B2 (2013); e Cong et al., documento US 8.980.824 B2 (2015)); (c) alquilantes de DNA, tais como análogos de CC-1065 e duocarmicina (consulte, por exemplo, Yang et al., documento US 2018/0051031 A1 (2018); Boger, documento US 6.5458.530 B1 (2003); Sufi et al., documento US 8.461.117 B2 (2013); e Zhang et al., documento US 8.852.599 B2 (2014)); (d) epotilonas (consulte, por exemplo, Vite et al., documento US 2007/0275904 A1 (2007) e documento US RE42930 E (2011)); (e) auristatinas (consulte, por exemplo, Senter et al., docu-mento US 6.844.869 B2 (2005) e Doronina et al., documento US 7.498.298 B2 (2009)); (f) dímeros de benzodiazepina (consulte, por exemplo, Zhang et al., documento US 9.527.871 B2 (2016); Zhang et al., docu-mento US 9.688.694 B2 (2017); McDonald et al., documento US 9.526.801 B2 (2016); Howard et al., documento US 2013/0059800 A1 (2013); documento US 2013/0028919 A1 (2013); e documento WO 2013/041606 A1 (2013)); e (g) maitansinoides, tais como DM1 e DM4 (consulte, por exemplo, Chari et al., documento US 5.208.020 (1993) e Amphlett et al., documento US 7.374.762 B2 (2008)).
[0062] Em uma modalidade, o fármaco citotóxico é um alquilante de DNA, uma tubulisina, uma auristatina, um dímero de benzodiazepi- na, uma enodina ou um maitansinoide. Exemplos específicos são, a título de ilustração e não de limitação:
[0063] O sistema imune possui receptores cujos ligantes naturais são padrões moleculares associados a patógenos (Pathogen- Associated Molecular Patterns, PAMPs). A ligação de um PAMP ao seu receptor cognato ativa o sistema imune para defesa um contra uma infecção pelo patógeno associado. Além disso, estes receptores também podem ser ativados por agonistas sintéticos que têm um efeito adjuvante na ação de vacinas e agentes para imunoterapia no tratamento de uma variedade de condições diferentes da infecção pelo patógeno real. Os agentes imuno-oncológicos, tais como ipilimumabe, nivolumabe e pembrolizumabe, em particular, podem se beneficiar deste efeito adjuvante. Receptores que podem ser ativados por ago- nistas sintéticos incluem TLR3, TLR7, TLR9 (receptor Toll-like-3, -7 e - 9, respectivamente), STING (Estimulador de Genes INterferon; também conhecido como MPYS, TMEM173, MITA ou ERIS), NLRP3 (proteína 3 receptora similar a NOD) e RIG-I (gene I indutível por ácido re- tinoico). Assim, em uma modalidade alternativa, o agente terapêutico é um agonista de TLR3, TLR7, TLR9, STING, NLRP3 ou RIG-I. Em particular, o agente terapêutico pode ser um agonista de TLR7, conforme descrito em Poudel et al., documento US 2019/0055243 A1 (2019); Young et al., documento US 2019/0055244 A1 (2019); Poudel et al., documento US 2019/0055245 A1 (2019); He et al., documento US 2019/0055246 A1 (2019); He et al., documento US 2019/0055247 A1 (2019); e Purandare et al., Pedido PCT PCT/US2019/028697, depositado em 23 de abril de 2019.
[0064] Os agentes terapêuticos supracitados podem ser usados em conjugados feitos por meio do processo em uma ou duas etapas
. EXEMPLOS
[0065] A prática da presente invenção pode ser melhor entendida por meio de referência aos exemplos a seguir, os quais são fornecidos a título de ilustração e não de limitação.
Exemplo 1 - Preparação de Anticorpos Modificados
[0066] Células ExpiCHO foram usadas para expressar os anticor pos. As células ExpiCHO foram cultivadas em meio ExpiCHO a 37 °C, atmosfera de 8 % de CO2 em frascos de plástico. Os vetores de ex-pressão para a cadeia pesada e a cadeia leve foram misturados em OptiMEM, solução PEI adicionada ao OptiMEM e o complexo PEI/DNA resultante foi incubado em temperatura ambiente durante 30 min antes de adicionar às células. 24 horas após a transfecção, Feed B e VPA foram adicionados às células e as células foram mantidas a 37 °C com agitação. Após 7 dias, o sobrenadante da cultura foi coletado por meio de centrifugação e filtração. O sobrenadante foi purificado com resina MabSelect SuRe LX. Resumidamente, o sobrenadante celular foi incu-bado com resina durante a noite a 4 °C, lavado com 10 CV de PBS, seguido por eluição com 4 CV de citrato a 0,1 M, pH de 3,5, imediata-mente neutralizado com 1/10 volumes de tris a 1 M, pH de 8.
Exemplo 2 - Conjugação de Anticorpos Modificados
[0067] A conjugação de um anticorpo modificado conforme des crito no presente documento com um doador de amina usando trans-glutaminase foi realizada por meio do protocolo listado abaixo. Usamos dispase para ativar a BTGase com mutações pontuais V65I e Y75F. Ela foi dialisada em acetato de sódio a 50 mM, pH de 5,5, a partir da formulação (tampão de acetato a 20 mM, glicerol a 10 %, pH de 4) antes de uso.
[0068] O anticorpo, a ~ 2 mg/mL, em Tris-HCl a 50 mM, pH de 8,0, ou Histidina a 20 mM, Imidazol a 50 mM, sacarose a 10 %, pH ~ 7,8 foi reagido com excesso de 10 vezes molar por sítio doador de amina na presença de um excesso de 0,2 molar de transglutaminase por anticorpo. A reação foi deixada prosseguir durante a noite a 37 °C com agitação suave contínua.
[0069] O conjugado de anticorpo-fármaco foi filtrado em um filtro de 0,2 μm e purificado usando uma coluna mAb Select SuRe™ (GE Healthcare). O conjugado foi carregado na coluna pré-equilibrada com Tris-HCl a 50 mM, pH de 8,0, e lavado com 10 CV (Column Volumes, volumes de coluna) de tampão de equilíbrio, seguido por 10 CV de Tris-HCl a 50 mM, acetonitrila a 17 %, pH de 8,0, para remover o doador de amina não reagido. A coluna foi reequilibrada com Tris-HCl a 50 mM, pH de 8,0, antes da eluição com citrato a 0,1 M, pH de 3,5, em frações de 1 mL e neutralizada com 1/10 do volume de eluição com Tris a 1 M, pH de 8,0. As frações desejadas são dialisadas em tampão para formulação de Histidina a 20 mM, sacarose a 10 %, pH de 6,0, e analisadas por LC-MS (ESI-QTOF), RP-HPLC e SDS-PAGE quanto à pureza e proporção de fármaco para anticorpo (DAR).
Exemplo 3 - Análise de Anticorpos Modificados Conjugados
[0070] O anticorpo a 5 mg/mL em imidazol a 50 mM, sacarose a 10 %, pH de 8, foi reagido com 10 vezes um excesso molar por sítio do doador de amina na presença de um excesso de 0,2 molar de transglutaminase bacteriana recombinante por anticorpo. Após incubação durante a noite a 37 °C com mistura suave contínua, a mistura de reação foi analisada por LC-MS (ESI-QTOF) para avaliação da DAR.
[0071] A descrição detalhada precedente da invenção inclui pas sagens que estão principal ou exclusivamente relacionadas a partes ou aspectos particulares da invenção. Deve ser entendido que isto é para clareza e conveniência, que uma característica particular pode ser relevante em mais do que apenas a passagem na qual ela é descrita, e que a descrição no presente documento inclui todas as combinações apropriadas de informações encontradas nas diferentes passagens. Da mesma forma, embora as várias figuras e descrições no presente documento se refiram a modalidades específicas da invenção, deve ser entendido que, quando uma característica específica é descrita no contexto de uma figura ou modalidade particular, tal carac- terística também pode ser usada, na medida apropriada, no contexto de outra figura ou modalidade, em combinação com outra característica, ou na invenção em geral.
[0072] Além disso, embora a presente invenção tenha sido particu larmente descrita em termos de determinadas modalidades preferidas, a invenção não está limitada a tais modalidades preferidas. Em vez disso, o escopo da invenção é definido pelas reivindicações em anexo
REFERÊNCIAS
[0073] Citações completas para as referências a seguir citadas de forma abreviada pelo primeiro autor (ou inventor) e data precedente no presente relatório descritivo são fornecidas abaixo. Cada uma destas referências é incorporada ao presente documento a título de referência para todas as finalidades.

Claims (16)

1. Anticorpo de comprimento total, caracterizado pelo fato de que tem no C-término de uma cadeia leve do mesmo uma extensão que contém glutamina que compreende uma sequência de aminoáci- dos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, NO: 2, NO: 3, NO: 4, NO: 5, NO: 6, NO: 7, NO: 8, NO: 9, NO: 10, NO: 11, NO: 12, NO: 13, NO: 14, NO: 15, NO: 16, NO : 17, NO: 18, NO: 19, NO: 20, NO: 21, NO: 22, NO: 23, NO: 24, NO: 25, NO: 26, NO: 29, NO: 30, NO: 31, NO: 32, NO: 33, NO: 34, NO: 35, NO: 36, NO: 37, NO: 38, NO: 39 e NO: 40.
2. Anticorpo de comprimento total, de acordo com a reivin-dicação 1, caracterizado pelo fato de que a extensão tem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, NO: 2, NO: 3, NO: 4, NO: 5 e NO: 6.
3. Anticorpo de comprimento total, de acordo com a reivin-dicação 1, caracterizado pelo fato de que a extensão tem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 7, NO: 8, NO: 9, NO: 10, NO: 11 e NO: 12.
4. Anticorpo de comprimento total, de acordo com a reivin-dicação 1, caracterizado pelo fato de que a extensão tem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 14, NO: 15, NO: 16, NO: 17, NO: 18 e NO: 19.
5. Anticorpo de comprimento total, de acordo com a reivin-dicação 1, caracterizado pelo fato de que a extensão tem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 20, NO: 21, NO: 22, NO: 23, NO: 24 e NO: 25
6. Anticorpo de comprimento completo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a extensão que contém glutamina tem uma valina-leucina (VL) no lado N-terminal de uma glutamina.
7. Conjugado da fórmula (IV): caracterizado pelo fato de que: Ab é um anticorpo de comprimento total que tem no C-tér- mino (terminal carbóxi) de uma cadeia leve do mesmo uma extensão que contém glutamina que compreende uma sequência de aminoáci- dos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, NO: 2, NO: 3, NO: 4, NO: 5, NO: 6, NO: 7, NO: 8, NO: 9, NO: 10, NO: 11, NO: 12, NO: 13, NO: 14, NO: 15, NO : 16, NO: 17, NO: 18, NO: 19, NO: 20, NO: 21, NO: 22, NO: 23, NO: 24, NO: 25, NO: 26, NO: 29, NO: 30, NO: 31, NO: 32, NO: 33, NO: 34, NO: 35, NO: 36, NO: 37, NO: 38, NO: 39 e NO: 40; L é uma porção ligante ligada a Ab através da ligação de amida: a uma glutamina em uma extensão que contém glutamina; e D é selecionado a partir do grupo que consiste em uma pro-teína, um radioisótopo, um agente de ensaio e um agente terapêutico.
8. Conjugado, de acordo com a reivindicação 7, caracteri-zado pelo fato de que D é um fármaco citotóxico; ou um agonista de TLR3, TLR7, TLR9, STING, NLRP3 ou RIG-I; e/ou em que L é - (CH2)2-6- ou em que: T é um grupo de autoimolação; t é 0 ou 1; cada AAa e AAb é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, β-alanina, ácido Y-aminobutírico, arginina, asparagina, ácido aspártico, ácido Y-carboxiglutâmico, citruli- na, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, norleucina, norvalina, ornitina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina; p é 1, 2, 3 ou 4; q é 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10; e r é 1, 2, 3, 4 ou 5.
9. Método de preparação de um conjugado de anticorpo, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) misturar um anticorpo de comprimento total que tem no C-término (terminal carbóxi) de uma cadeia leve do mesmo uma ex-tensão que contém glutamina que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, NO: 2, NO : 3, NO: 4, NO: 5, NO: 6, NO: 7, NO: 8, NO: 9, NO: 10, NO: 11, NO: 12, NO: 13, NO: 14, NO: 15, NO: 16, NO: 17, NO: 18, NO: 19, NO: 20, NO: 21, NO: 22, NO: 23, NO: 24, NO: 25, NO: 26, NO: 29, NO : 30, NO: 31, NO: 32, NO: 33, NO: 34, NO: 35, NO: 36, NO: 37, NO: 38, NO: 39, e NO: 40 com um composto doador de amina que compreende um amina primária e uma porção selecionada a partir do grupo que consiste em uma proteína, um radioisótopo, um agente de ensaio e um agente terapêutico, na presença de uma transglutaminase; e (b) permitir que a transglutaminase catalise a formação de uma ligação de amida entre a carboxamida da cadeia lateral de uma glutamina da extensão que contém glutamina e a amina primária do composto doador de amina, deste modo, formando o conjugado de anticorpo.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o composto doador de amina tem: (i) a estrutura H2N-L-D, preferencialmente H2N-(CH2)2-6D, em que L é uma porção ligante e D é uma proteína, um ra- dioisótopo, um agente de ensaio ou um agente terapêutico; ou (ii) uma estrutura representada pela fórmula (Ia): em que: D é uma proteína, um radioisótopo, um agente de ensaio ou um agente terapêutico; T é um grupo de autoimolação; t é 0 ou 1; cada AAa e AAb é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, β-alanina, ácido Y—aminobutírico, arginina, asparagina, ácido aspártico, ácido Y—carboxiglutâmico, citruli- na, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, norleucina, norvalina, ornitina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina; p é 1, 2, 3 ou 4; q é 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10; e r é 1, 2, 3, 4 ou 5.
11. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a porção é um agente terapêutico, opcionalmente em que o agente terapêutico é um fármaco citotóxico, ou um agonista TLR3, TLR7, TLR9, STING, NLRP3 ou RIG—I.
12. Método de preparação de um conjugado de anticorpo, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) misturar um anticorpo de comprimento total que tem no C—término (terminal carbóxi) de uma cadeia leve do mesmo uma ex— tensão que contém glutamina que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, NO: 2, NO : 3, NO: 4, NO: 5, NO: 6, NO: 7, NO: 8, NO: 9, NO: 10, NO: 11, NO: 12, NO: 13, NO: 14, NO: 15, NO: 16, NO: 17, NO: 18, NO: 19, NO: 20, NO: 21, NO: 22, NO: 23, NO: 24, NO: 25, NO: 26, NO: 29, NO : 30, NO: 31, NO: 32, NO: 33, NO: 34, NO: 35, NO: 36, NO: 37, NO: 38, NO: 39 e NO: 40 com um primeiro composto, primeiro com posto o qual é um composto doador de amina que tem uma amina primária e um primeiro grupo funcional reativo, na presença de uma transglutaminase; (b) permitir que a transglutaminase catalise a formação de uma ligação de amida entre a carboxamida da cadeia lateral de uma glutamina da extensão que contém glutamina e a amina primária do primeiro composto para produzir um aduto do anticorpo e do primeiro composto; (c) contatar o aduto com um segundo composto que tem um segundo grupo funcional reativo e uma porção selecionada a partir do grupo que consiste em uma proteína, um radioisótopo, um agente de ensaio e um agente terapêutico; o segundo grupo funcional reativo sendo capaz de reagir com o primeiro grupo funcional reativo para formar uma ligação covalente entre eles; e (d) permitir que o primeiro e segundo grupos funcionais rea-tivos reajam e formem uma ligação covalente entre os mesmos, deste modo, formando o anticorpo conjugado.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o primeiro composto tem a estrutura: H2N-L'-R' em que L' é uma primeira porção ligante e R' é um primeiro grupo fun-cional reativo e o segundo composto tem a estrutura: R"-L"-D em que R" é um segundo grupo funcional reativo capaz de reagir com R', L" é uma segunda porção ligante e D é uma proteína, um radioisó- topo, um agente de ensaio ou um agente terapêutico.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracteriza- do pelo fato de que R' é selecionado a partir de: e, reciprocamente, R" é selecionado a partir de:
15. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o primeiro composto tem uma estrutura representada pela fórmula (II): e o segundo composto tem uma estrutura representada pela fórmula (III): em que: R' é um primeiro grupo funcional reativo; R" é um segundo grupo funcional reativo capaz de reagir com R'; D é uma proteína, um radioisótopo, um agente de ensaio ou um agente terapêutico; T é um grupo de autoimolação; t é 0 ou 1; cada AAa e AAb é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, β-alanina, ácido Y—aminobutírico, arginina, asparagina, ácido aspártico, ácido Y—carboxiglutâmico, citruli- na, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, norleucina, norvalina, ornitina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina; p é 1, 2, 3 ou 4; q é 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10; e r é 1, 2, 3, 4 ou 5.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracteriza— do pelo fato de que R' é selecionado a partir de: e, reciprocamente, R" é selecionado a partir de:
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