BR112015023589B1 - Método para a produção de um conjugado de imunoligante/carga útil - Google Patents

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Abstract

método para a produção de um conjugado de imunoligante/carga útil, conjugado, carga útil de baixo peso molecular e uso de uma carga útil. a presente invenção refere-se a um método para a produção de um conjugado de imunoligante/carga útil, cujo método engloba conjugar uma carga útil a um imunoligante por meio de uma transpeptidase de sequência específica, ou um domínio catalítico da mesma (figura 6b).

Description

Campo da Invenção A presente invenção refere-se métodos para a produção de um conjugado de imunoligante/carga útil. Introdução
[001] Atualmente, os métodos predominantes para a marcação e/ou para conjugar moléculas a proteínas, especialmente, quando se trata de cargas úteis de pequena molécula ou marcações, envolve a conjugação química com específicas moléculas ligantes que covalentemente ligam a carga útil aos amino ácidos livres lisina e/ou cisteína das proteínas.
[002] Entretanto, muitas proteínas tais como, por exemplo, anticorpos que são de particular interesse para as estratégias imunodirecionamento, são as proteínas relativamente grandes, que podem conter diversos resíduos de lisina e cisteína. Pelo fato da conjugação química mediada a ligante ser um processo estequiométrico, a ligação química mediada a ligante das cargas úteis leva a misturas heterogêneas de proteínas conjugadas que podem diferir em sua eficácia terapêutica e/ou utilidade de diagnóstico. Obviamente, as misturas de conjugados de proteína-carga útil também representam um significante desafio no processo de aprovação regulatório para os conjugados terapêuticos, como uma variação de lote a lote e/ou variações no ingrediente farmacêutico ativo (API) são negativamente vistas pelas autoridades regulatórias em virtude de potencial preocupação de segurança.
[003] Adicionalmente, se uma relação definida de carga útil para proteína é desejada, é com frequência necessário purificar o conjugado com a desejada conjugação estequiométrica. Isso não só é tedioso, mas pode significantemente acrescentar custos aos bens no processo de fabricação, na medida em que com frequência apenas uma fração da proteína conjugada mediada a ligante representa a desejada conjugação de relação de carga útil. Isso é particularmente verdade para os conjugados de anticorpo/fármaco terapeuticamente relevantes (ADCs), onde dependendo da toxina empregada, 3 a 4 moléculas de toxina parecem ser vantajosas, mas anticorpos sem toxina acoplados a até 8 toxinas por anticorpo acoplado são encontrados em reações químicas de conjugação típica mediada a ligante (Panowski et al. (2014)).
[004] Apesar da limitação descrita acima, todos os conjugados de anticorpo/fármaco atualmente em testes clínicos, ou aprovados pelas autoridades de saúde para a terapia de doença, foram gerados por conjugação química mediada a ligante de fármacos de pequena molécula tóxica a anticorpos (Lambert (2012) ou Mulard (2013)).
[005] É amplamente conhecido na indústria e pelos técnicos científicos, que a conjugação estequiométrica e específica de campo de cargas úteis moleculares, que inclui toxina ou moléculas de marcação a imunoligantes têm uma significante vantagem em comparação à conjugação química mediada a ligante. Isso é evidenciado por tentativas para objetivar a conjugação química para amino ácidos específicos em uma estrutura de proteína (Panowski et al. (2014)).
[006] Por um lado, isso é uma tentativa de mudar determinadas posições na estrutura de proteína para deletar campos de conjugação indesejados e/ou para proporcionar campos de conjugação desejados (isto é, resíduos de lisina e/ou cisteína) aos quais a ligação a ligante pode ser objetivada (McDonagh et al. (2006) ou Junutula et al. (2008)).
[007] Por outro lado, o controle da conjugação química a proteínas é tentado pela incorporação de amino ácidos não naturais em determinadas posições, tal como selenocisteína, p-azidofenilalanina, ou acetilfenilalanina (Hofer et al. (2009), Axup et al. (2012), ou Lemke (2011)).
[008] Entretanto, todas as referidas abordagens mudam a sequência primária de amino ácido da proteína a ser conjugada, e pode resultar em propriedades funcionais indesejadas. Adicionalmente, a incorporação de amino ácidos não naturais, como descrito acima, é com frequência de pouca eficiência, e não permite a quantitativa incorporação de campos de marcação específicos a proteínas.
Sumário da Invenção
[009] Portanto, há uma urgente necessidade na indústria de se superar os itens conhecidos de métodos de conjugação estocástica em particular para a geração de imunoconjugados terapeuticamente relevantes, que incluem, mas não limitados a conjugados de fármaco de anticorpo (ADCs).
[010] É assim um objetivo da presente invenção proporcionar um método eficiente de conjugar imunoligantes e cargas úteis, por exemplo, fármacos, toxinas, citocinas, marcadores, ou semelhante, preferivelmente anticorpos monoclonais de comprimento total em toxinas de baixo peso molecular, para a geração de conjugados de fármaco de anticorpo conjugado especificamente de campo (ADCs).
[011] É outro objetivo da presente invenção se criar conjugados de imunoligante/carga útil, que tenham melhor eficácia e/ou que podem ser produzidos com mais elevada capacidade de reprodução.
[012] É outro objetivo da presente invenção se permitir que a conjugação de cargas úteis em imunoligantes em modo específico de campo e/ou específico de sequência.
[013] É outro objetivo da presente invenção se criar conjugados de imunoligante/carga útil que preservem as características de seus componentes, por exemplo, afinidade alvo, especificidade alvo, sensibilidade alvo, solubilidade, função farmacológica e semelhante.
[014] Os referidos objetivos são alcançados pelo assunto das reivindicações independentes, enquanto as reivindicações dependentes assim como o relatório descritivo descrevem modalidades preferidas adicionais.
Definições
[015] Como usado aqui, o termo “imunoligante” quer dizer que define uma entidade, um agente ou uma molécula que tem afinidade a um determinado alvo, por exemplo, um receptor, uma proteína de superfície celular, uma citocina ou semelhante. O referido imunoligante pode opcionalmente bloquear ou amortecer respostas mediadas a agonista, ou inibir a interação de receptor-agonista. Ainda mais importante, entretanto, o imunoligante pode servir como um serviço de transporte para enviar uma carga útil a um campo específico, que é definido pelo alvo reconhecido pelo referido imunoligante. Assim, um imunoligante objetivando, por exemplo, mas não limitado a um receptor, envia a sua carga útil a um campo que é caracterizado por abundância do referido receptor. Os imunoligantes incluem, mas não são limitados a, anticorpos, fragmentos de anticorpos, proteínas de ligação com base em anticorpos, anticorpos miméticos, receptores, receptores de armadilha solúvel, proteínas de andaime com afinidade para um determinado alvo e ligantes de receptores.
[016] “Anticorpos”, também chamados de “imunoglobulinas” (Ig), são em geral compreendidos de quatro cadeias de polipeptídeo, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L), e são portanto proteínas multiméricas, ou um homólogo de Ig equivalente dos mesmos (por exemplo, um nanocorpo de camelídeo, que compreende apenas a cadeia pesada, anticorpos de domínio único (dAbs) que podem ser ou ser derivados a partir de uma cadeia pesada ou leve); que inclui mutantes funcionais de comprimento total, variantes, ou derivados dos mesmos (que inclui, mas não limitados a, anticorpos de murino, quimiericos, humanizados e anticorpos completamente humanos, que retêm as características de ligação a epítopo essenciais de uma molécula de Ig, e que inclui imunoglobulinas duplas específicas, biespecíficas, multiespecíficas, e domínio variável duplo; moléculas de imunoglobulina podem ser de qualquer classe (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, e IgY), ou subclasse (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, e IgA2) e alotipo.
[017] Uma “proteína de ligação com base em anticorpo”, como usada aqui, pode representar qualquer proteína que contém pelo menos um domínio de imunoglobulina anticorpo-derivado VH, VL, ou CH no contexto de outros componentes derivados de não-imunoglobulina, ou de não-anticorpo. As referidas proteínas com base em anticorpo incluem, mas não são limitados a (i) proteínas de fusão Fc de proteínas de ligação, que incluem receptores ou componentes receptores com toda ou partes dos domínios CH de imunoglobulina, (ii) proteínas de ligação, nas quais os domínios VH e ou VL são acoplados a andaimes moleculares alternativos, ou (iii) moléculas, na qual imunoglobulina VH, e/ou VL, e/ou os domínios CH são combinados e/ou montados de modo não normalmente encontrado em anticorpos ou fragmentos de anticorpos de ocorrência natural.
[018] Um “conjugado de fármaco de anticorpo” (ADC), como usado aqui, se refere ou a um anticorpo, ou um fragmento de anticorpo, e/ou proteína de ligação com base em anticorpo, acoplada a um ingrediente farmacêutico ativo de baixo peso molecular (API), que inclui, mas não limitados a uma toxina (que inclui, por exemplo, mas não limitados a, inibidores de tubulina, ligantes de actina, inibidores de RNA polimerase, fármacos de intercalação de DNA e de modificar/danificar), um inibidor de quinase, ou qualquer API que interfere com um trajeto particular celular que é essencial para a sobrevivência da célula e/ou essencial para um trajeto celular fisiológico particular.
[019] Um “derivado ou fragmento de anticorpo”, como usado aqui, se refere a uma molécula que compreende pelo menos uma cadeia de polipeptídeo derivada a partir de um anticorpo que não é de comprimento total, que inclui, mas não é limitado a (i) um fragmento Fab, que é um fragmento monovalente que consiste dos domínios de leve variável (VL), pesada variável (VH), constante leve (CL) e constante pesado 1 (CH1); (ii) um fragmento F(ab')2, que é um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados por uma ponde de dissulfeto em uma região de dobra; (iii) uma porção de cadeia pesada de um fragmento Fab (Fd), que consiste dos domínios VH e CH1; (iv) um fragmento variável (Fv), que consiste dos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (v) um fragmento de anticorpo de domínio (dAb), que compreende um único domínio variável; (vi) uma região de determinar complementaridade isolada (CDR); (vii) um único fragmento de cadeia Fv (scFv); (viii) um diacorpo, que é um anticorpo bivalente, biespecífico no qual os domínios VH e VL são expressos em uma única cadeia de polipeptídeo, mas usando um ligante que é muito curto para permitir o pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia, desse modo forçando os domínios a parear com os domínios de complementaridade de outra cadeia e criar dois campos de ligação a antígeno; e (ix) um anticorpo linear, que compreende um par de segmentos Fv em tandem (VH-CH1-VH-CH1) que, junto com os polipeptídeos de cadeia leve complementares, forma um par de regiões de ligação a antígeno; e (x) outras porções de imunoglobulina de comprimento não total de cadeias leve e/ou pesada, ou mutantes, variantes, ou derivados dos mesmos, isoladamente ou em qualquer combinação.
[020] O termo “formato de anticorpo modificado”, como usado aqui, engloba conjugados de fármaco de anticorpo, scFv modificado por óxido de polialquileno, monocorpos, diacorpos, anticorpos de camelídeo, anticorpos de Domínio, anticorpos biou triespecíficos, IgA, ou duas estruturas IgG unidas por uma cadeia J e um componente secretório, anticorpos de tubarão, estrutura de primata de novo mundo + CDR de primata de não novo mundo, anticorpos IgG4 com região de dobra removida, IgG com dois campos de ligação adicionais trabalhados por engenharia nos domínios CH3, anticorpos com região Fc alterada para aumentar a afinidade para os receptores gama Fc, construtores dimerizados que compreendem CH3+VL+VH, e semelhante.
[021] O termo “anticorpo mimético”, como usado aqui, se refere a proteínas que não pertencem à família das imunoglobulinas, e mesmo não proteínas tais como aptâmeros, ou polímeros sintéticos. Alguns tipos têm uma estrutura de folha beta similar a anticorpo. Vantagens potenciais dos “anticorpos miméticos” ou “andaimes alternativos” sobre os anticorpos são a melhor solubilidade, maior penetração no tecido, maior estabilidade em relação ao calor e enzimas, e comparativamente baixos custos de produção.
[022] Alguns anticorpos miméticos podem ser proporcionados em grandes bibliotecas, que oferecem candidatos de ligação específicos contra cada alvo concebível. Assim como com os anticorpos, anticorpos miméticos específicos de alvo podem ser desenvolvidos por uso de tecnologias de Leitura de Alta Produtividade (HTS) assim como com tecnologias de exibição estabelecidas, tais como phage display, exibição bacteriana, exibição de levedura ou de mamífero. Os anticorpos miméticos atualmente desenvolvidos englobam, por exemplo, proteínas de repetição de anquirina (denominadas DARPins), lectinas do tipo C, proteínas de domínio A de S. aureus, transferrinas, lipocalinas, domínios de fibronectina do tipo III 10th, inibidores de protease de domínio Kunitz, ligantes de derivado de ubiquitina (denominadas afilinas), ligantes derivados gama cristalinos, nós ou notinas de cisteína, ligantes com base em andaime de tioredoxina A, aptâmeros de ácido nucleico, anticorpos artificias produzidos por impressão molecular de polímeros, bibliotecas de peptídeo a partir de genomas bacterianos, domínios SH-3, estradocorpos, “domínios A” de receptores de membrana estabilizados por ligações dissulfeto e Ca2+, compostos com base em CTLA4, Fyn SH3, e aptâmeros (ácido oligonucleico ou moléculas de peptídeo que se ligam a moléculas alvo específicas)
[023] Em caso do imunoligante não ser uma proteína ou um peptídeo, por exemplo, se for um aptâmero, o mesmo deve preferivelmente ser proporcionado com um peptídeo marcação de modo a proporcionar um adequado substrato para a conjugação enzimática descrita adicionalmente aqui.
[024] “Conjugação”, como usado aqui, se refere à associação covalente de uma molécula a outra molécula por formação de uma ligação covalente.
[025] Uma “imunotoxina”, como usado aqui, se refere a um imunoligante conjugado a uma proteína ou polipeptídeo que representa a toxina, que inclui, mas não é limitado a toxinas bacterianas, por exemplo, toxina da difteria A, endotoxina de Pseudomonas, toxina botulínica, ou por exemplo, venenos proteináceos a partir de invertebrados (por exemplo, mas não limitados a veneno de aranhas, escorpiões, moluscos, água-viva), ou vertebrados (por exemplo, mas não limitados a cobras), ou fragmentos funcionais dos mesmos.
[026] O termo “carga útil de baixo peso molecular” como usado aqui, representa uma carga útil com um peso molecular que não excede 2500 Dalton.
[027] O termo “carga útil”, como usado aqui, representa qualquer molécula de ocorrência natural ou sinteticamente gerada, que inclui moléculas de baixo peso molecular ou entidades químicas que podem ser quimicamente sintetizadas, e moléculas maiores ou entidades biológicas que precisam ser produzidas por fermentação das células hóspedes e que conferem uma nova funcionalidade a uma imunoligante específica para a ligação a alvos ou antígenos.
[028] O termo “toxina de baixo peso molecular”, como usado aqui, quer dizer um composto citotóxico de baixo peso molecular que não excede um peso molecular de 2'500 Dalton que é citotóxico para as células de mamífero.
[029] Uma “transpeptidase”, como usado aqui, é uma enzima ou um domínio catalítico de uma enzima ou uma proteína que é capaz de catalisar a ruptura de ligações de peptídeo e subsequentemente ou diretamente, ou por meio de diversas reações intermediárias, a formação de novas ligações de peptídeo, de modo que a energia da primeira ligação de peptídeo é preservada durante a reação e transferida a uma nova ligação de peptídeo. Preferivelmente, as referidas transpeptidases preferivelmente conectam o C-término de um peptídeo ou proteína com o N-término de outro peptídeo ou proteína. Em virtude da formação de uma nova ligação de peptídeo, as referidas enzimas ou domínios funcionais são também referidos como “proteína ligases”, “peptídeo ligases”, ou de apelido “proteína ou peptídeo de ligação”. As referidas proteínas ligases compreendem, mas não são limitadas a enzimas sortases, inteinas e inteinas divididas.
[030] Como usado aqui, o termo “transpepeptidase específica de sequência” pretende definir uma transpeptidase que precisa pelo menos um substrato de peptídeo ou proteína com uma determinada sequência de peptídeo como a sequência de reconhecimento (N-terminal e/ou C-terminal) para conectar o referido substrato de peptídeo ou de proteína a outro peptídeo ou proteína, ou um composto de baixo peso molecular que contém um componente de peptídeo ou de proteína.
[031] Como usado aqui, o termo “transpeptidase específica de campo” pretende definir uma transpeptidase que tem um campo específico em pelo menos um substrato de peptídeo ou de proteína que o mesmo usa para conjugar a outro peptídeo ou proteína, ou um composto de baixo peso molecular que contém um componente de peptídeo ou de proteína.
Antecedentes e Descrição Geral da Invenção
[032] A presente invenção descreve métodos que utilizam transpeptidases específicas de campo, por exemplo, enzimas sortases e inteinas divididas, para cargas uteis conjugadas especificamente e seletivamente de campo, preferivelmente toxinas de baixo peso molecular a imunoligantes, preferivelmente anticorpos, para a geração de cargas úteis de imunoligante, preferivelmente conjugados de fármaco de anticorpo (ADCs). As cargas úteis preferidas são as toxinas de baixo peso molecular modificadas com sequência de amino ácido sintético de amino ácido longo e curto, preferivelmente menos do que 13 (treze) amino ácidos, que os torna como substratos para as enzimas sortases ou a conjugação covalente mediada a intenina dividida ou em N- ou C-término dos imunoligantes (Figuras 1 & 3). A referida conjugação é alcançada em um modo específico de campo e com definida estequiometria, que é uma característica que distingue a conjugação química convencional das cargas úteis a imunoligantes, onde a conjugação é um processo estequiométrico, como descritas adicionalmente acima.
[033] A presente invenção adicionalmente descreve transpeptidase específica de campo, por exemplo, conjugação mediada a sortase ou inteina dividida de imunoligantes multiméricos, preferivelmente anticorpos especificamente com duas diferentes moléculas de toxina ou outras marcações usando diferentes modificações das subunidades da proteína multimérica, por exemplo, anticorpo de cadeias pesada e leve, e diferentes cargas úteis modificadas com diferentes, trechos de amino ácido curto específicas para diferentes transpeptidases, de modo a conjugar pelo menos duas diferentes cargas úteis funcionais ao imunoligante multimérico (A Figura 6).
[034] A presente invenção adicionalmente descreve métodos para adicionar purificação de afinidade e/ou marcações de detecção ao N- ou C-términos dos imunoligantes, que sofrem transpeptidação mediada a enzima. De modo que a remoção da purificação de afinidade e/ou marcação de detecção possa ser utilizada para selecionar os imunoligantes com completa (100%) conjugação de uma carga útil à proteína de ligação modificada, por meio de resinas de afinidade que retêm os imunoligantes que não foram completamente conjugados e, portanto, ainda retêm a afinidade adicional de purificação e/ou marcação de detecção (A Figura 4).
[035] A presente invenção adicionalmente descreve imunoligantes nos quais um domínio de transpeptidase catalítica é diretamente fundido ao N- ou C- término da proteína a ser conjugada, de modo que a atividade de transpeptidação é uma parte integral do imunoligante a ser conjugado, e nenhuma enzima sortase solúvel adicional precisa ser proporcionada no curso da reação de conjugação mediada a transpeptidase (A Figura 5).
[036] Todas as referidas modalidades mencionadas acima permitem uma conjugação específica de campo e estequiometricamente controlada de qualquer carga útil, que inclui toxinas de pequenas moléculas (entidades químicas), proteínas tóxicas, ou marcações fluorescentes, preferivelmente toxinas de baixo peso molecular a imunoligantes, que incluem preferivelmente anticorpos, que é superior à conjugação química padrão de cargas úteis a proteínas por métodos químicos de ligantes químicos, que não podem ser controlados para a relação de conjugação e campo. Portanto, para a geração de conjugados de fármaco de anticorpo (ADCs) a conjugação de cargas úteis tóxicas por transpeptidases, preferivelmente enzimas sortases e inteinas divididas a anticorpos levará a produtos mais homogêneos com as esperadas propriedades terapêuticas aprimoradas para a terapia do câncer (A Figura 12).
[037] A conjugação enzimática de cargas úteis a imunoligantes por enzimas sortases e inteina dividida permite a conjugação específica de campo e a conjugação estequiométrica de carga útil a proteínas e imunoligantes, reduzindo os custos de produção e proporcionando conjugados homogêneos de imunoligante-carga útil, em especial na medida em que a seletividade das transpeptidases permite a conjugação de cargas úteis a imunoligantes em sobrenadante de cultura de célula bruta, e não requer componentes purificados como na conjugação química mediada a ligante tradicional. Portanto, o uso de transpeptidases específicas de sequência para a conjugação de cargas úteis a imunoligantes pode reduzir de modo significante o custo de bens em imunoligante- carga útil, e particularmente fabricação de ADC.
[038] O primeiro tipo de transpeptidase descrita aqui, as enzimas sortases, foram identificadas na variedade de bactéria gram-positiva, tais como tais como Staphilococcus, Streptococcus e Pneumococcus espécie, e catalisa o acoplamento de fatores de virulência aos proteoglicanos de parede celular, de modo a mudar a assinatura da superfície da bactéria para evadir uma eficiente resposta imune pelo hóspede infectado (Mazmanian et al. (1999)). Enzima A sortase da bactéria gram-positiva Staphilococcus aureus foi caracterizada primeiro (Ton-That et al. (1999)) e foi subsequentemente caracterizada adicionalmente como uma ferramenta para muitas modificações de proteína (Tsukiji (2009)). A atração de enzimas sortases é que as duas moléculas a serem conjugadas apenas precisam ser modificadas ou expressas por um laudo com uma marcação de peptídeo de 5 amino ácidos de comprimento curto (marcação de sortase, LPXTG em caso de sortase A de Staphilococcus aureus, X sendo qualquer um dos 20 amino ácidos de ocorrência natural), e um trecho, preferivelmente de 3 a 5 amino ácido de comprimento de glicina (Antos et al. (2009a)) (A Figura 1), que pode facilmente ser adicionado a cada uma das moléculas para alcançar ou a conjugação de proteínas N- terminal ou C-terminal. Isso permite utilizar o sistema por um lado para o acoplamento ou a conjugação de duas proteínas, mas também para a conjugação de moléculas menores a proteínas.
[039] O segundo tipo de transpeptidase que resulta em clivagem e formação de ligação de peptídeo, é representada pelas assim denominadas inteinas, que foram originalmente descobertas como proteína introns, que podem remover (retirar) a si mesmas de proteínas precursoras por clivagem de ligações de peptídeo e formação de novas ligações de peptídeo (Xu et al. (1993)) (A Figura 2a). Inteinas podem também ocorrer separadas em domínios de N-inteina e C-inteina (as assim chamadas inteinas divididas) e fixadas a proteínas independentes que podem subsequentemente catalisar a trans-splicing dos domínios de exteina (A Figura 2b). Inteinas divididas foram utilizadas para o acoplamento covalente das frações de N-exteina e C-exteina, e também a purificação e/ou a circularização de proteínas (Eleuche (2010)). Entretanto, de modo a utilizar as inteinas divididas também para a conjugação de cargas úteis de pequenas moléculas, é necessário se utilizar inteinas divididas que funcionam se ou o domínio de N- inteina ou de C-inteina puder ser reduzido para poucos amino ácidos, que podem facilmente ser adicionados a moléculas de qualquer tamanho por síntese química, similar preferivelmente o trecho de 3 glicinas necessária para a transpeptidação mediada a sortase. Com o desenvolvimento da inteina dividida Ssp GyrB S11 artificial, na qual o domínio C-inteina apenas compreende seis amino ácidos (Sun et al. (2004)), essa condição foi alcançada e a referida inteina dividida foi utilizada para a marcação C-terminal de proteínas com biotina (Volkmann et al. (2009)) (A Figura 3a). Da mesma forma, o desenvolvimento de uma N-inteina curta de 11 amino ácidos de comprimento a partir de inteina dividida Ssp DnaX permite a conjugação N-terminal de proteínas com qualquer molécula, se o referido trecho de 11 amino ácidos de comprimento é adicionado por síntese química a uma carga útil de escolha (A Figura 3b).
[040] Portanto, um aspecto da presente invenção é de acrescentar ou um trecho curto de amino ácido glicina preferivelmente de 3 a 5 glicinas de comprimento, ou um trecho de amino ácido curto GVFVHNSXXXXX de 12 amino ácidos de comprimento (X é qualquer amino ácido de ocorrência natural ou artificial), que contém um domínio C-int de 6 amino ácidos de Ssp GyrB ou um domínio N-int de 11 amino ácidos de Ssp DnaX a uma molécula de carga útil, que é suficiente para permitir que a respectiva transpeptidase conjugue a carga útil modificada em proteínas e imunoligantes, preferivelmente anticorpos que, respectivamente, contêm o motivo de reconhecimento de enzima sortase, por exemplo, LPXTG em caso de utilização de Sortase A de Staphilococcus aureus, ou um domínio 150aa N-int em caso de utilização de Inteina dividida Ssp GyrB, ou um domínio 139 aa C-int em caso de utilização de Inteina dividida Ssp DnaX (vide Figs 1 & 3).
[041] A adição de trechos curtos de amino ácidos, tais cmo, por exemplo, resíduos de 3 ou 5 glicinas à toxinas de baixo peso molecular como necessário para a conjugação mediada a sortase, ou 12 amino ácidos como necessário para a conjugação mediada a inteina dividida, foram observadas acrescentar à solubilidade a água de determinadas moléculas hidrófobas de toxina (dados não mostrados), de modo que o aduto de amino ácido-toxina pode ser dissolvido no tampão fisiológico, o que garante uma ótima conjugação de sortase ou inteina dividida. Isso evita a tensão da integridade estrutural de moléculas de proteína grande, particularmente anticorpos que podem facilmente ser desnaturados por exposição a solventes orgânicos e pH não fisiológico com frequência associado com a química tradicional de ligante e conjugação. Adicionalmente, a conjugação de moléculas hidrófobas de toxina em grandes proteínas, anticorpos particulares podem induzir determinados níveis de agregação de proteína. Também isso pode ser aprimorado pelo uso de transpeptidases, particularmente enzimas sortases, pelo fato de que amino ácidos hidrófilos adicionais permanecem no conjugado enzimaticamente gerado, reduzindo a propensão de agregação de proteína grande, ou conjugados de fármaco de anticorpo.
[042] As enzimas sortases foram amplamente descritas na técnica anterior para as ligações de proteína-proteína ou de proteína-peptídeo (Mao et al. (2004), Parthasarathy et al. (2007) ou WO2011/133704A2), mesmo incluindo circularização de proteínas (Antos et al. (2009b)). As aplicações de proteína sortase ou ligação de peptídeo também inclui proteína ou ligação de peptídeo usando fragmentos de anticorpos, tais como fragmentos Fab- e scFv- com marcações de proteína- ou peptídeo (Mohlmann et al. (2011), Madej et al. (2012), ou US 2010/0055761A1 e WO 2012/142659A1). Mesmo dois documentos da técnica anterior foram publicados, nos quais anticorpos de comprimento total estão ligados a sortase em proteínas (Levary et al. (2011), por exemplo, EGFP, albumina, gelonina foram conjugados à cadeia leve de um anticorpo), ou na qual anticorpos de comprimento total foram ligados a sortase a peptídeos curtos (Swee et al. (2013)). Entretanto, nenhum documento da técnica anterior pode ser identificado demonstrando a conjugação mediada a sortase de toxinas de baixo peso molecular, tais como, por exemplo, auristatinas ou maitansinas e semelhante, a anticorpos de comprimento total ou fragmentos de anticorpos. Em particular nenhum documento da técnica anterior pode ser identificado, no qual a geração de conjugados de fármaco de anticorpo (ADCs) com toxinas de baixo peso molecular foi descrita resultando em conjugados de fármaco de anticorpo (ADCs) com toxinas de baixo peso molecular homogeneamente conjugado a cadeias ou de IgH ou de IgL (relação de fármaco para anticorpo 2), ou para cadeias de IgH e IgL (relação de fármaco para anticorpo 4), como descrito aqui.
[043] Embora a técnica anterior também descreva a modificação de substratos de não proteína com resíduos de glicina de modo que os mesmos podem ser usados para modificação de sortase de proteínas ou peptídeos simples, de subunidade única (Tsukiji (2009), ou pedido de patente internacional publicado sob o No. WO 2007/108013 A3, respectivamente), a conjugação homogena mais desafiante de substratos de não proteína, preferivelmente toxinas de baixo peso molecular, proteínas multiméricas, preferivelmente anticorpos, não foram descritas antes, apesar do fato de que a proteína mediada a enzima sortase ou ligação de peptídeo estiveram na técnica anterior por muitos anos.
[044] Ademais, a conjugação de proteínas multiméricas, particularmente anticorpos monoclonais de comprimento total com duas diferentes cargas úteis, preferivelmente duas diferentes toxinas de baixo peso molecular como descrito aqui, não foram descritas anes na técnica anterior, apesar do fato de que a proteína mediada a enzima sortase ou ligação de peptídeo estiveram na técnica anterior por muitos anos (Panowski et al. (2014)).
[045] É conhecido a partir da técnica anterior que as enzimas sortases podem aceitar substratos que contêm um mínimo de 3 amino ácidos de glicina (Parthasarathy et al. (2007), portanto a presente invenção pode incluir cargas úteis que contêm pelo menos três (3) resíduos de amino ácido de glicina adicionados à molécula de carga útil de interesse, embora mesmo um ou dois resíduos de glicina podem ser suficientes, e devem ser compreendidos pelo método descrito aqui. Em caso de cargas úteis moleculares de baixo peso a adição de poucos resíduos de amino ácido de glicina pode ser alcançada por química de peptídeo sintético convencional, como descrito aqui. Em caso de proteínas resíduos de glicina pode ser adicionado ou por adicionar códons para um número de resíduos de glicina, preferivelmente pelo menos três resíduos de glicina, na estrutura para a estrutura de leitura aberta da proteína, ou por química de peptídeo sintético convencional de modo que a proteína recombinante contém pelo menos três resíduos N-terminal de amino ácido de glicina.
[046] É sabido a partir da literatura que diferentes Enzimas sortases, por exemplo, Sortase B a partir de Staphilococcus aureus, ou Sortases a partir de outras bactérias gram-positivas reconhecem diferentes motivos pentapentídeo, que diferem a partir do motivo de reconhecimento de sortase A LPXTG (X = qualquer amino ácido) a partir de Staphilococcus aureus (Spirig et al. (2011)). Portanto, a presente invenção deve também incluir o conceito de adicionar outros motivos de reconhecimento de sortase a proteínas e imunoligantes, que inclui preferivelmente anticorpos, que diferem a partir do motivo de reconhecimento LPXTG de sortase A Staphilococcus aureus, de modo a preparar os mesmos para a conjugação de sortase com diferentes cognatos de enzima sortase de diferentes espécies de bactérias gram-positivas. Portanto, proteínas e imunoligantes, preferivelmente anticorpos, podem também ser expressos com um diferente motivo de reconhecimento de sortase, por exemplo, um motivo de pentapeptídeo NPQTN específico para sortase B a partir de Staphilococcus aureus que pode então ser conjugado a cargas úteis modificadas a glicina.
[047] Em um outro aspecto da presente invenção, imunoligantes multiméricos, preferivelmente mas não limitados a anticorpos, que são compostos de imunoglobulina de cadeias pesada e leve, permitem a utilização das referidas diferentes sequências de reconhecimento de sortase adicionadas aos diferentes polipeptídeos das referidas proteínas multiméricas (em caso de anticorpos adicionar diferente sequências de reconhecimento de sortase ao anticorpo de cadeias pesada e leve), de modo a permitir a conjugação de diferentes cargas úteis nos referidos diferentes polipeptídeos por realizar as conjugações sequenciais com cargas úteis marcadas com Glin (n > 2) na presença da respectiva enzima sortase (A Figura 6b). Para isso, um anticorpo precisa ser expresso com diferentes modificações C-terminal nas cadeias pesada e leve que compreendem diferentes motivos de reconhecimento de sortase para diferentes enzimas sortases. O referido anticorpo pode então em sequência ser conjugado a duas diferentes cargas úteis que contêm a modificação de glicina como descrito adicionalmente acima.
[048] Esse formato pode ter a vantagem de que os conjugados de fármaco de anticorpo (ADCs) especificamente podem ser carregadas com duas diferentes toxinas, preferivelmente que interferem com um diferente trajeto celular será mais potente em extermínio de células de câncer, pelo fato de que é mais difícil para a célula de câncer objetivada se evadir ao ataque de duas toxinas compreendidas nas conjugados de fármaco de anticorpo (ADCs).
[049] Está claro para aqueles versados na técnica, que o motivo de reconhecimento de pentapeptídeo sortase, tal como o motivo LPXTG de sortase A de Staphilococcus aureus, pode ser adicionado seletivamente a polipeptídeos individuais de imunoligantes multiméricos, de modo a proporcionar campos de conjugação desejados. Por exemplo, no caso de anticorpos, isso permite a geração de anticorpos modificados, ou apenas contendo motivos de reconhecimento de sortase adicionados ás cadeias pesadas (que resulta em duas cargas úteis por conjugação de anticorpo), ou apenas contendo motivos de reconhecimento de sortase adicionados às cadeia leves (que resulta em duas cargas úteis por conjugação de anticorpo), ou que contém motivos de reconhecimento de sortase adicionados as cadeias pesadas e as cadeia leves (que resulta em quatro cargas úteis por conjugação de anticorpo). As referidas variações projetadas permitem a específica conjugação de cargas úteis a anticorpos por enzimas sortases ou às cadeias pesadas isoladamente (gerando conjugados de fármaco de anticorpo (ADCs) com uma relação de fármaco para anticorpo de 2, isto é, DAR2), ou às cadeias leves isoladamente (gerando conjugados de fármaco de anticorpo (ADCs) com uma relação de fármaco para anticorpo de 2, isto é, DAR2), ou simultaneamente para as cadeias pesadas e cadeias leves (gerando conjugados de fármaco de anticorpo (ADCs) com uma relação de fármaco para anticorpo de 4, isto é, DAR4). Desse modo, os campos de conjugação e as estequiometrias para os anticorpos pode ser variada de modo controlado, ou gerando duas conjugações de carga útil por anticorpo de cadeia pesada ou cadeia leve, ou gerando quatro conjugações de carga útil por anticorpo pela adição de uma carga útil para as cadeias pesadas e para as cadeias leves.
[050] 'Similar ás variações acima descritas em campos de conjugação e estequiometrias usando diferentes motivos de reconhecimento de sortase e enzimas sortases em proteínas multiméricas ou imunoligantes, é um aspecto adicional da presente invenção se conjugar diferentes cargas úteis a diferentes cadeias de polipeptídeo de proteínas multiméricas combinando conjugação mediada a sortase e conjugação mediada a inteina dividida. O referido conceito permite a simultânea conjugação de diferentes cargas úteis a diferentes cadeias de polipeptídeo de proteínas multiméricas e imunoconjugados em uma etapa, pelo fato de que diferentes transpeptidases e substratos estão sendo empregados (A Figura 6a).
[051] Deve ser subentendido que a conjugação acima mencionada de duas diferentes cargas úteis a proteína multimérica, preferivelmente um anticorpo, que é composto de cada dois dissulfitos ligados de cadeias pesada e leve, pode ou ser realizada por combinar conjugação de enzima mediada a sortase com conjugação mediada a inteina dividida, como ilustrado, na Figura 6a, mas que é também possível se conjugar duas diferentes cargas úteis a proteína multimérica, preferivelmente um anticorpo, por utilizar duas diferentes enzimas sortases, reconhecendo diferentes motivos de peptídeo sortase, por exemplo, sortase A e sortase B a partir de Staphilococcus aureus, como mencionado adicionalmente acima (A Figura 6b). Entretanto, isso pode também incluir enzimas sortases de outras classes de sortase (por exemplo, sortases C, D, E, F), ou enzimas sortases a partir de outra espécie bacteriana, que diferem em suas especificidades de modito de sortase.
[052] A conjugação mediada a sortase de cargas úteis a proteínas e imunoligantes pode ser alcançada ou por proporcionar proteínas marcadas com motivo de reconhecimento de sortase e pelo menos cargas úteis marcadas com tri-glicina e adicionar enzima sortase enzimaticamente ativa ou um fragmento funcional da mesma como uma enzima solúvel. Em outro aspecto da presente invenção o domínio de enzima sortase enzimaticamente ativo pode também ser proporcionado como um domínio fundido a ou o N- ou C-término da proteína. Na referida variação, é vantajoso, mas não obrigatório, se adicionar o domínio enzimático sortase ou N-terminal a um motivo de reconhecimento de sortase N-terminal, ou C-terminal a um motivo de reconhecimento de sortase C-terminal. Ambas as possibilidades garantem que após a reação com uma carga útil marcada com glicina, que o domínio enzimático sortase é removido a partir da proteína no curso da reação (A Figura 5).
[053] A referida variação de aplicar conjugação mediada a sortase de cargas úteis a proteínas é similar em conceito a conjugação mediada a inteina dividida de cargas úteis, onde os domínios N-inteina de inteinas divididas enzimaticamente ativas são fixados à proteína a ser conjugada, de modo a definir o campo de conjugação em uma proteína.
[054] Similar ao grande número de diferentes transpeptidases sortases com diferente especificidade de substrato que foi identificada na literatura (Spirig et al. (2011)), há também um grande e crescente número de inteinas divididas conhecidas a partir de diferentes espécies e proteínas com diferentes sequencias de N-inteina e C- inteina necessárias para a transpeptização que pode ser recuperada a partir dos assim chamados bancos de dados InBase (Perler (2002). Portanto, embora os exemplos de conjugação mediada a inteina dividida de imunoligantes com cargas úteis descreva a inteina dividida Ssp GyrB S11 preferida (Volkmann et al. (2009)), pelo fato de que o domínio C-inteina pode ser reduzida a um trecho de amino ácido curto linear 6-mer, a conjugação mediada a inteina dividida de cargas úteis a proteínas e imunoligantes pode também ser alcançada com outras inteinas divididas a partir do banco de dados InBase, desde que os domínios N-inteina ou C-inteina sejam suficientemente curtos (preferivelmente mais curtos do que 13 amino ácidos) para facilmente permitir a síntese de peptídeo e a adição a qualquer molécula de carga útil de escolha. Entretanto, está claro para aqueles versados na técnica que no caso de cargas úteis de proteína, os domínios C-inteina de qualquer tamanho podem ser fundidos a carga útil de proteína por fusão genética ao ORF da carga útil de proteína de interesse, e não há vantagem mecânica de usar inteinas divididas com domínios C-inteina ou N-inteina pequenos (< 13 amino ácidos).
[055] Entretanto, se as cargas úteis sintéticas de pequena molécula tiverem que ser conjugadas a proteínas e imunoligantes, então um pequeno domínio N-int ou C-int de menos do que 13 amino ácidos como descrito aqui é vantajoso, como no caso do preferido C-int da inteina dividida Ssp GyrB S11, de N-int de Ssp DnaX, pelo fatod e que um peptídeo curto pode ser sinteticamente adicionado a qualquer carga útil de molécula de baixo peso sintética por química sintética padrão.
[056] Conjugação mediada a sortase e conjugação mediada a inteina dividida de cargas úteis pode ser realizada em ou a N- ou os C-términos de proteínas e imunoligantes. Isso é apenas dependente em como o trecho de glicina/motivo de sortase e os domínios de N-intein/C-inteina são posicionados na proteína e carga útil (A Figura 1).
[057] No caso de anticorpos, que são os imunoligante preferidos, é preferido se conjugar as cargas úteis aos C-términos dos anticorpos, pelo fato de que isso posiciona as cargas úteis mais distalmente aos campos de ligação de antígeno ao anticorpo. Entretanto, a referida preferência não deve ser interpretada por meio de limitação, e pode ser vantajoso se conjugar as cargas úteis ao N-término de outras moléculas imunoligantes, tais como, por exemplo, anticorpos miméticos, nos quais os domínios de ligação funcionais não são localizados no N-término da molécula.
[058] Outro aspecto da presente invenção é de aprimorar a eficiência da conjugação de cargas úteis de sortase e inteina dividida a proteínas e imunoligantes por adicionar purificação de afinidade ou marcações de detecção, tais como, por exemplo, mas não limitado a marcações de pequenos peptídeos (por exemplo, marcações de histidina, marcação de strep, marcação MYC ou marcação HA) ou marcações de purificação de afinidade de proteína maior (por exemplo, marcação de proteína de ligação a maltose (MBP), marcação de Glutationa-S-transerase (GST), ou marcação de ligação a quitina) distal ao motivo de reconhecimento de sortase ou ao domínio fundido de inteina dividida à proteína ou imunoligante de interesse. Com o referido aspecto da presente invenção a marcação de purificação de afinidade será removida a partir do imunoligante a ser conjugado como parte da reação de transpeptidação. Isso pode ser explorado para enriquecer completamente os imunoligantes conjugados a carga útil, como proteínas não reagidas e imunoligantes, que ainda contêm a marcação de purificação de afinidade, podem ser removidos por ligação a uma resina de afinidade adequada, enquanto completamente proteínas completamente conjugadas de carga útil e imunoligantes não mais conterão a marcação de purificação de afinidade, e podem assim ser especificamente separados a partir dos substratos de imunoligante não reagido. Esse aspecto da presente invenção é particularmente potente no contexto de proteínas multiméricas e imunoligantes, tais como os preferidos anticorpos, nos quais diversas cargas úteis precisam ser conjugadas. O uso de marcações de purificação de afinidade localizadas distais à sortase ou campo de conjugação de transpeptidase inteina garante que se pode remover as proteínas e os imunoligantes nos quais a marcação de purificação de afinidade está ainda presente em virtude da incompleta conjugação de carga útil (A Figura 5).
[059] Em comparação a conjugação química, isso proporciona uma significante vantagem no processo de obter conjugados homogêneos de imunoligante/carga útil, e preferivelmente conjugados de fármaco de anticorpo (ADCs) nas quais as toxinas de baixo peso molecular são conjugadas especificamente a campo aos C-términos de anticorpos de cadeias leve e/ou pesada.
[060] Em geral, o método descrito proporciona um novo e eficiente método de conjugar cargas úteis estequiometricamente e específicas de campo, preferivelmente toxinas de baixo peso molecular a imunoligantes, preferivelmente anticorpos, pelos quais conjugados definidos de imunoligante/carga útil, preferivelmente conjugados de fármaco de anticorpo (ADCs) são gerados, que são úteis para a terapia de doenças, preferivelmente de câncer. O método pode também ser utilizado para a geração de conjugados de imunoligante/carga útil úteis para o diagnóstico de doenças, preferivelmente doenças oncológicas. O novo método permite a geração de conjugados covalentes de imunoligante/carga útil por utilização de ruptura de ligação de peptídeo e formar enzimas (transpeptidases), que incluem enzimas sortases e inteinas divididas, ou fragmentos cataliticamente ativos das mesmas. As referidas enzimas podem catalisar a conjugação covalente e a conjugação específica de campo de cargas úteis que contêm trechos de amino ácido curto (preferivelmente mais curto do que 13 amino ácidos) ou ao N- ou C-términos de imunoligantes que são adequadamente modificados permitindo que sortase e inteinas divididas se rompam e para formar ligações de peptídeo no curso da reação. Imunoligantes são preferivelmente anticorpos, para a conjugação específica de campo de toxinas de baixo peso molecular, de modo a gerar conjugados de fármaco de anticorpo (ADCs) com definida carga útil de anticorpo, ou as relações de fármaco para anticorpo.
Modalidades da presente invenção
[061] De acordo com a presente invenção, um método para a produção de um conjugado de imunoligante/carga útil é descrito, cujo método engloba conjugar uma carga útil a um imunoligante por meio de uma transpeptidase específica de sequência, ou um domínio catalítico da mesma.
[062] De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção, a carga útil e/ou o imunoligante ou consiste, inteiramente, de uma proteína ou peptídeo ou compreende pelo menos um domínio de proteína ou peptídeo, ou compreende pelo menos uma cadeia de peptídeo e, adicionalmente, a proteína ou peptídeo ou domínio compreende, preferivelmente, uma sequência de amino ácido que pode ser detectada por uma transpeptidase específica de sequência, ou um domínio catalítico da mesma.
[063] Isso quer dizer, por exemplo, que, em caso da carga útil e/ou do imunoligante ser uma proteína, quer dizer que a referida proteína compreende, em seu N- ou C-término, uma sequência de amino ácido que pode ser detectada por uma transpeptidase específica de sequência. Se a referida sequência de amino ácido está faltando de uma proteína Naive, a mesma pode ser fundida ao N- ou C-término da referida proteína por métodos recombinantes conhecidos na técnica.
[064] Em caso da carga útil e/ou do imunoligante não ser uma proteína, a referida sequência de amino ácido que pode ser detectada por uma transpeptidase específica de sequência, deve ser conjugado ao primeiro por métodos de reticulação química convencional conhecidos na técnica.
[065] Funcionalidades adicionais podem ser incorporadas entre a sequência de reconhecimento para a específica transpeptidase e a carga útil. Isso pode ser realizado por estruturas químicas ou sendo categorizado por ser clivável (por exemplo, que contém hidrazona, ou química de dissulfeto, ou específica sequência de peptídeos for proteases intracelulares) ou sendo não clivável (por exemplo, que contém química de tioéter) em seguida de internalização em células.
[066] As estruturas químicas que contêm química de hidrazona podem ser seletivamente clivadas dentro do compartimento intracelular de lisossomos (pH mais baixo comparado a circulação sanguínea sistêmica).
[067] Ligantes de peptídeo têm o potencial de serem seletivamente clivados por proteases de lisossomo (por exemplo, catepsina-B) e demonstraram aumento na estabilidade no soro e aprimorados efeitos anti-tumor comparados aos ligantes de hidrazona. Os pares valina-citrulina (Val-Cit) são os ligantes de peptídeo mais comumente usados e são de modo ideal adequados para trabalhar com a família de fármacos da auristatina tal como monometil auristatina E (MMAE).
[068] Faz tempo que os ligantes não cliváveis têm sido esquecidos na medida em que os pesquisadores foram convencidos de que a clivagem do ligante o modo mais razoável de liberar o fármaco. Entretanto, conjugados podem, com a ligação ao receptor de membrana, ficar rapidamente internalizados e uma vez internalizados, o imunoligante pode ser degradado ao ponto onde a carga útil, por exemplo, o fármaco é exposto. Como um exemplo proeminente, ligantes de tioéter, usam o ligante SMCC (N- succinimidil-4-(N-maleimidometil)- ciclohexano-1-carboxilato) (A Figura )
[069] Todas as referidas abordagens têm em comum que não há verdadeira especificidade de campo da reação de acoplamento. Pelo fato da conjugação química mediada a ligante ser um processo estequiométrico, a ligação química mediada a ligante de cargas úteis leva a misturas heterogêneas de proteínas conjugadas que podem diferir em sua eficácia terapêutica e/ou potencial de diagnóstico. Obviamente, as misturas de conjugados de proteína-carga útil também representam um significante desafio no processo de aprovação regulatório para os conjugados terapêuticos, na medida em que a variação de lote a lote e/ou variações no ingrediente farmacêutico ativo (API) são vistas de modo negativo pelas autoridades regulatórias em virtude de preocupações potenciais em relação à segurança.
[070] Ligantes não cliváveis têm sido esquecidos na medida em que os pesquisadores foram convencidos de que a clivagem do ligante foi o meio mais razoável de liberar o fármaco. Entretanto, conjugados podem, com a ligação a um receptor de membrana, ser rapidamente internalizado e uma vez internalizado, o imunoligante pode ser degradado ao ponto onde a carga útil, por exemplo, o fármaco é exposto. Um proeminente exemplo, ligantes de tioéter, usam o ligante SMCC (N-succinimidil-4-(N- maleimidometil)- ciclohexano-1-carboxilato) (Vide A Figura 14a, estrutura 2).
[071] Todas as referidas abordagens têm em comum que não há verdadeira especificidade de campo da reação de acoplamento. Pelo fato da conjugação química mediada a ligante ser um processo estequiométrico, a ligação química mediada a ligante de cargas úteis leva a misturas heterogêneas de proteínas conjugadas que podem diferir em sua eficácia terapêutica e/ou potencial de diagnóstico. Obviamente, as misturas de conjugados de proteína-carga útil também representam um significante desafio no processo de aprovação regulatório para os conjugados terapêuticos, na medida em que a variação de lote a lote e/ou variações no ingrediente farmacêutico ativo (API) são vistas de modo negativo pelas autoridades regulatórias em virtude de preocupações potenciais em relação à segurança.
[072] De acordo com outra modalidade preferida da presente invenção, o imunoligante compreendido no conjugado de imunoligante/carga útil é pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste de um anticorpo, formato de anticorpo modificado, derivado ou fragmento de anticorpo, e/ou um anticorpo mimético.
[073] Preferivelmente, na referida modalidade, uma pequena carga útil molecular é tornada um substrato para a transpeptidase específica de sequência por acoplamento de um peptídeo de menos do que 13 amino ácidos a uma pequena carga útil molecular, de modo que o mesmo pode ser conjugado pela transpeptidase aos C-términos de um anticorpo monoclonal que contém modificações C-terminal reconhecidas pelas referidas transpeptidases. As referidas modificações C-terminal podem ser contidas em uma ou em ambas as cadeias pesadas, ou em ambas as cadeias leves, ou de cadeias pesada e leve de um anticorpo de comprimento total, desse modo permitindo a geração de um conjugado de fármaco de anticorpo (ADC) específico e campo ou com uma relação de fármaco para anticorpo de 2 ou 4 (DAR2 ou DAR4).
[074] De acordo com outra modalidade preferida da presente invenção, o imunoligante se liga a pelo menos uma entidade selecionada a partir do grupo que consiste de um receptor, um antígeno,, um fator de crescimento, uma citocina, e/ou um hormônio.
[075] Como usado aqui, o termo “receptor” quer dizer uma molécula de superfície celular, preferivelmente uma molécula de superfície celular que (i) se liga a uma molécula específica, ou a grupos de moléculas de sinalização específicas, (isto é, um receptor, tal como, por exemplo, o receptor VEGF), e/ou (ii) não tem ligante conhecido (isto é, um receptor órfão, tal como, por exemplo, HER2/neu). Os receptores naturais são expressos na superfície de uma população de células, ou os mesmos meramente representam o domínio extracelular da referida molécula (seja se a referida forma exista naturalmente ou não), ou uma molécula solúvel que realiza função de ligação natural no plasma, ou dentro da célula ou órgão. Preferivelmente, o referido receptor é um membro de uma cascata de sinalização que é envolvido em um processo patogênico particular (por exemplo, um receptor que pertence a uma cascata de sinalização de um fator de crescimento), ou é expresso na superfície da célula ou partícula que é envolvida no processo patológico, por exemplo, a célula de câncer.
[076] Como usado aqui, o termo “antígeno” quer dizer uma substância que tem a capacidade de induzir uma específica resposta imune, e podem incluir proteínas de superfície ou complexos de proteína (por exemplo, canais de íon). Muitas vezes, os antígenos são associados ás entidades patogênicas, por exemplo, uma célula de câncer.
[077] Como usado aqui, o termo “citocina” se refere a moléculas de proteína de sinalização de célula pequena que são secretadas por numerosas células e são uma categoria de moléculas de sinalização usadas extensivamente em comunicação intracelular. As citocinas podem ser classificas como proteínas, peptídeos, ou glicoproteínas; o termo “citocina” engloba uma grande e diversa família de reguladores produzidos através do corpo por células de diversas origens embriológicas.
[078] Como usado aqui, o termo “fator de crescimento” se refere a substâncias de ocorrência natural capazes de estimular o crescimento celular, proliferação e diferenciação celular. Em geral um fator de crescimento é uma proteína ou um hormônio esteróide. Fatores de crescimento são importantes para regular uma variedade de processos celulares.
[079] Como usado aqui, o termo “hormônio” se refere a um produto químico liberado pela célula, uma glândula, ou um órgão em uma parte do corpo que envia mensagens que afetam as células em outras partes do organismo. O termo engloba hormônios peptídeos, lipídeos e hormônios derivados de fosfolipídeos que incluem hormônios esteróides, e monoaminas.
[080] Em caso do imunoligante se ligar a um receptor ou a um antígeno, o conjugado de imunoligante-carga útil pode, por exemplo, ser direcionado a um campo específico, por exemplo, a uma entidade patogênica, por exemplo, uma célula de câncer, onde a carga útil, por exemplo, a toxina ou um agente quimioterapêutico, é enviada. Assim, a toxicidade sistêmica da toxina ou do agente quimioterapêutico é reduzida, enquanto a concentração local da última no campo de ação é aumentada, assim proporcionando uma melhor eficácia ao mesmo tempo em que os efeitos colaterais são reduzidos. Adicionalmente, a respectivo cascata de sinalização pode ser inibida pela ligação do imunoligante. Em caso da carga útil ser um marcador a última pode assim ser usada para marcar um campo específico, por exemplo, uma célula de câncer caracterizada por um determinado antígeno de superfície detectado pelo imunoligante, para diagnóstico.
[081] Em caso do imunoligante se ligar a um fator de crescimento, a citocina, e/ou um hormônio, o conjugado de imunoligante/carga útil pode, por exemplo, ser direcionado ao campo, o fator de crescimento citocina ou hormônio usual se liga ao, de modo a enviar a carga útil em modo específico de campo. Adicionalmente, a respectiva cascata de sinalização pode ser inibida pela ligação do imunoligante.
[082] Como usado aqui, o termo “para ligar” quer dizer uma interação bem subentendida ou outra associação não aleatória entre imunoligantes, por exemplo, anticorpos, ou fragmentos de anticorpos, e os seus alvos. Preferivelmente, a referida reação de ligação é caracterizada por alta especificidade e/ou sensibilidade ao alvo. Preferivelmente, a reação de ligação é caracterizada pela constante de dissociação (Kd) < 10-3 M, preferivelmente < 10-4 M, < 10-5 M, < 10-6 M, < 10-7 M, < 10-8 M, < 10-9 M, e mais preferida < 10-10.
[083] De acordo com a modalidade preferida da presente invenção, é proporcionado que pelo menos um domínio catalítico da transpeptidase específica de sequência seja fundido ao N-término ou ao C-término de ou do imunoligante ou da carga útil.
[084] A referida fusão pode ocorrer por engenharia recombinante, ou por acoplamento químico. Na referida modalidade, a atividade enzimática que leva à conjugação específica de campo do imunoligante para a carga útil não precisa ser adicionada à reação como uma enzima recombinante separada, mas é em vez disso uma parte do substrato de proteína a ser conjugado.
[085] Preferivelmente, a transpeptidase específica de sequência é pelo menos uma selecionada a partir do grupo que consiste de uma sortase, ou um ou mais fragmentos ou derivados da mesma, uma inteina dividida, ou um ou mais fragmentos ou derivados da mesma.
[086] Em uma modalidade preferida, onde a transpeptidase é uma sortase, a carga útil, por exemplo, a toxina, é preferivelmente tornada um substrato para conjugação de sortase pela adição de um pequeno número de resíduos de amino ácido de glicina, preferivelmente 3 ou 5 resíduos de glicina.
[087] Em outra modalidade preferida, onde a transpeptidase é uma inteina dividida, por exemplo, a Inteina dividida Ssp GyrB, a carga útil, por exemplo, a toxina é tornada um susbtrato para conjugação de inteina dividida pela adição de menos do que resíduos de 13 amino ácidos de sequência GVFVHN-SXn, X sendo qualquer amino ácido e n sendo um número inteiro entre > 0 e < 5.
[088] O uso de transpeptidases, preferivelmente enzimas sortases e inteinas divididas para a geração de conjugados de fármaco de anticorpo, nos quais as toxinas de baixo peso molecular são conjugadas a anticorpos de comprimento total, ainda não foram descritos na técnica anterior (Panowski et al. (2014)).
[089] Enzimas sortases foram identificadas em uma variedade de bactérias gram-positivas, tais como as espécies Staphilococcus, Streptococcus e Pneumococcus, e catalisa, in vivo, o acoplamento de fatores de virulência a proteoglicanos de parede celular, de modo a mudar a superfície signature da bactéria para evadir uma eficiente resposta imune pelo hóspede infectado (Mazmanian et al. (1999)).
[090] A enzima A sortase da bactéria gram-positiva Staphilococcus aureus foi caracterizada primeiro (Ton-That et al. (1999)) e foi subsequentemente caracterizada adicionalmente como uma ferramenta para muitas modificações proteicas (Tsukiji (2009)).
[091] Uma característica benéfica das enzimas sortases é que as duas moléculas a serem conjugadas apenas precisam de marcações de peptídeo curto (“marcações de sortase”), que no caso da sortase A de Staphilococcus aureus é, por exemplo, LPXTG no C-término de uma molécula (por exemplo, a carga útil), e um trecho curto de glicina de 3 a 5 amino ácidos no N-término da outra molécula (por exemplo, o imunoligante, vide a Figura 1). As referidas marcações de peptídeo podem ou ser fundidas nas moléculas, ou conjugadas ás mesmas por meio de uma química de reticulação convencional. Isso permite se utilizar o sistema por um lado para a ligação de duas proteínas, mas também para a conjugação de compostos moleculares de pequeno peso, preferivelmente toxinas de baixo peso molecular a proteínas. Em caso de sortase B de Staphilococcus aureus, o respectivo motivo de sortase é NPQTN.
[092] Inteinas, que originalmente foram descobertas como introns de proteína que podem remover (juntar) a si mesmas das proteínas precursoras por clivagem de ligações de peptídeo e a formação de novas ligações de peptídeo (Xu et al. (1993)) (A Figura 2a).
[093] Inteinas divididas de ocorrência natural e artificiais envolve que a região de codificação de inteina tenha sido dividida em N-inteina e domínios C-inteina, que podem ser fixados a diferentes proteínas ou peptídeos de tal modo que, subsequentemente ao trans-splicing dos domínios exteina (A Figura 2b) leva a uma conjugação das duas proteínas
[094] Inteinas divididas têm assim sido utilizadas paara o acoplamento covalente das frações N-exteina e C-exteina, e também para a purificação e/ou a circularização de proteínas (Eleuche (2010)). Uma modalidade descrita aqui é de utilizar inteinas divididas para a conjugação de compostos moleculares de pequeno peso, preferivelmente toxinas de baixo peso molecular e outras marcações de pequenas moléculas, nas quais uma sequência de peptídeo curta de C-exteina de menos do que 13 amino ácidos é acoplada às moléculas de qualquer tamanho, similar ao trecho curto de amino ácido de glicina necessário para a transpeptidação mediada a sortase.
[095] Em caso de adição de enzimas sortases de um trecho curto de glicina (> 2 resíduos de glicina) a uma molécula de escolha é suficiente para permitir que a molécula seja conjugada a imunoligantes que contêm um motivo de pentapeptídeo de reconhecimento de sortase, tais como, por exemplo, LPXTG em caso de sortase A de S. aureus. Em caso de inteinas divididas, um trecho curto de no mínimo 12 amino ácido GVFVHNSAGSGK que contém a C-inteina curta de 6 amino ácidos (GVFVHN) a partir de Ssp GyrB e a C-exteina curta (aqui: SAGSGK) são suficientes para modificar qualquer molécula de carga útil, preferivelmente a toxina de baixo peso molecular, para conjugação mediada a inteina dividida a imunoligantes que contém o domínio N-inteina da Inteina dividida Ssp GyrBa (Volkmann et al. (2009)). Outras inteinas divididas, nas quais os domínios de inteina funcional podem ser reduzidos a trechos de peptídeo curto de <13 amino ácidos de comprimento pode ser utilizado também.
[096] Mesmo se, na literatura, enzimas divididas não sejam sempre referidas como enzimas, as mesmas se qualificam como tal, pelo fato de que a reação que elas catalisam resulta na ruptura da ligação de peptídeo e a formação de uma nova ligação de peptídeo e isso pode ser visto como transpeptidases, pelo fato de que a energia de uma ligação de peptídeo existente é transferida para uma nova ligação de peptídeo.
[097] Diferente da conjugação química, a conjugação mediada a transpeptidase ocorre sob condições de tampão aquoso fisiológico e temperaturas fisiológicas, desse modo afetando minimamente a proteína ou a integridade do anticorpo na reação de conjugação. Esta característica garante otima funcionalidade ao conjugado resultante.
[098] De acordo com outra modalidade preferida da presente invenção, é proporcionado uma carga útil compreendida no conjugado de imunoligante/carga útil é pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste de um marcador, uma marcação de processamento, e/ou um fármaco.
[099] O termo “marcador” (também denominado “marcação de detecção”), como usado aqui, pode se referir a qualquer molécula ou fração que compreende uma ou mais substâncias químicas apropriadas ou enzimas, que diretamente ou indiretamente geram um composto detectável ou sinal na reação química, física ou enzimática.
[0100] O termo “marcação de processamento” como usado aqui, pode englobar marcações de afinidade, marcações de solubilização, marcações de cromatografia e marcações de epítopo. Marcações de afinidade (também usado como marcações de purificação) são anexadas às proteínas de modo que as mesmas permitem a purificação da molécula marcada a partir de sua fonte biológica bruta usando uma técnica de afinidade. As referidas incluem proteína de ligação a quitina (CBP), proteína de ligação a maltose (MBP), e glutationa-S-transferase (GST). A marcação poli(His), preferivelmente a marcação 6xHis, é a uma marcação de processamento amplamente usada; a mesma se liga a matrizes de metal. As marcações de solubilização são usadas, em especial para as proteínas recombinantes expressas em espécies deficientes de chaperone tal como E. coli, para ajudar na duplicação adequada em proteínas e impedir que as mesmas se precipitem. As referidas incluem tioredoxina (TRX) e poli(NANP). Algumas marcações de afinidade têm um duplo papel como um agente de solubilização, tal como MBP, e GST.
[0101] Marcações de cromatografia são usadas para alterar as propriedades cromatográficas da proteína para prorprocionar diferente resolução através da técnica de separação particular. Com frequência, as referidas consistem de amino ácidos polianiônicos, tal como marcação FLAG.
[0102] Marcações de epítopo são sequências de peptídeos curtas que são escolhidas por sua alta afinidade a anticorpos que podem ser produzidos de modo confiável em muitas diferentes espécies. Marcações de epítopo são em geral derivadas a partir de genes virais, que explicam a sua alta imunoreatividade. Marcações de epítopo incluem, por exemplo, a marcação V5, marcação MYC, e a marcação HA. As referidas marcações são particularmente uteis para experimentos de western blotting, imunofluorescência e imunoprecipitação, embora as mesmas também encontram uso em purificação de proteína.
[0103] As marcações de processamento encontram muitos outros usos, tal como modificação específica enzimática (tal como marcações de biotina ligase) e marcação de modificação química (FlAsH). Com frequência as marcações são combinadas para produzir modificações multifuncionais da proteína.
[0104] Preferivelmente, o referido marcador é pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste de uma radiomarcação, preferivelmente um peptídeo ou proteína marcada por radioatividade, uma marcação fluorescente, preferivelmente um peptídeo ou proteína fluorescente, e/ou uma marcação de enzima, preferivelmente uma peroxidase.
[0105] A referida enumeração de cargas úteis de marcador potencial não é de modo algum restritiva. De acordo com outra modalidade preferida, o referido fármaco é pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste de uma citocina, um agente radioativo, um fármaco anti-inflamatório, uma toxina, e/ou um agente quimioterapêutico.
[0106] A referida enumeração de cargas úteis de fármaco potencial não é de modo alguma restritiva. Como usado aqui, o termo “citocina” se refere a moléculas de proteína de sinalização de célula pequena que são secretadas por numerosas células e são uma categoria de moléculas de sinalização usadas extensivamente em comunicação intracelular. Citocinas podem ser classificadas como proteínas, peptídeos, ou glicoproteínas; o termo “citocina” engloba uma grande e diversa família de reguladores produzidos através do corpo por células de diversas origens embriológicas. No presente contexto, citocinas são, por exemplo, designadas para prejudicar, ou mesmo exterminar, entidade patogênica, por exemplo, uma célula de câncer.
[0107] Como usado aqui, o termo “agente radioativo” se refere a uma entidade que tem pelo menos um átomo com um núcleo instável, e que é assim propenso a sofrer queda radioativa, que resulta na emissão de raios gama e/ou partículas subatômicas tais como partículas alfa ou beta, que têm um efeito de extermínio de célula. No presente contexto, agentes radioativos são designados para prejudicar, ou mesmo exterminar, entidade patogênica, por exemplo, uma célula de câncer.
[0108] Como usado aqui, o termo “fármaco anti-inflamatório” se refere a compostos que reduzem a inflamação. Os mesmos podem ser, por exemplo, esteróides, tais como os glicocorticoides específicos (com frequência referidos como corticosteróides), que reduzem a inflamação ou o inchaço por se ligarem a receptores de glicocorticóides. O termo adicionalmente engloba fármaco anti-inflamatórios não esteroides (NSAIDs), que contrabalançam a enzima ciclooxigenase (COX). Por si só, a enzima COX sintetiza as prostaglandinas, que criam a inflamação. No todo, os NSAIDs evitam que as prostaglandinas sejam sintetizadas, reduzindo ou eliminando a dor. O termo adicionalmente engloba Derivados Anti-inflamatórios Seletivos Imunes (ImSAIDs), que são uma classe de peptídeos que alteram a ativação e a migração de células inflamatórias, que são células imunes responsáveis pela amplificação da resposta inflamatória.
[0109] Como usado aqui, o termo “toxina” se refere a uma molécula que é tóxica a uma célula viva ou organismo. Toxinas podem ser peptídeos, ou proteínas ou preferivelmente compostos moleculares de pequeno peso, que são pretendidos para prejudicar, ou mesmo exterminar, a entidade patogênica, por exemplo, a célula de câncer. Toxinas, como pretendido aqui, englobam, em particular, toxinas celulares. Preferivelmente, a referida toxina é uma toxina molecular pequena, isto é, tendo um peso molecular de < 2500 Da.
[0110] Como usado aqui, o termo “agente quimioterapêutico” se refere a moléculas que têm a propriedade funcional de inibir o desenvolvimento ou a progressão de um neoplasma, particularmente uma lesão maligna (cancerosa), tal como um carcinoma, sarcoma, linfoma, ou leucemia. A inibição de metástase ou de angiogênese é frequentemente uma propriedade de agente anti-cancer ou agente quimioterapêutico. Um agente quimioterapêutico pode ser um agente citotóxico ou um agente quimioterapêutico. Preferivelmente, o referido agente quimioterapêutico é um agente citoestático de baixo peso molecular, que inibe ou suprime o desenvolvimento e/ou a multiplicação de células de câncer.
[0111] Conjugar citocinas, agente radioativos, toxinas ou agentes quimioterapêuticos a um imunoligante pode ajudar a reduzir os efeitos colaterais e os riscos relacionados á sua administração, pelo fato de que o imunoligante direciona o conjugado a um campo específico, por exemplo, a uma entidade patogênica, por exemplo, uma célula de câncer onde a carga útil efetua a sua função tóxica. Assim, a toxicidade sistêmica da carga útil é reduzida, enquanto a concentração local da última no campo de ação é aumentada, assim proporcionando uma melhor eficácia ao mesmo tempo em que os efeitos colaterais são reduzidos.
[0112] Pode ser proporcionado que o conjugado seja internalizado pela entidade patogênica, de tal modo que após a internalização, a carga útil seja liberada e apenas então desenvolva a sua função desejada citotóxica, isto é, sem afetar as células ou tecidos circundantes.
[0113] A Tabela a seguir é uma lista não restritiva de alvos/antígenos potenciais (1a. coluna) e exemplos para os imunoligantes existentes objetivando o primeiro (2a. coluna). A 3a. coluna mostra uma lista não restritiva de toxinas potenciais, citocinas ou agentes quimioterapêuticos. Observar que os exemplos a partir da 1a. e da 3a. coluna podem ser combinados um com o outro ad libitum, enquanto centenas de alvos adicionais e cargas úteis existem. As combinações respectivas de alvo/carga útil não explicitamente mencionadas na tabela são englobadas pelo âmbito da presente invenção.
[0114] De acordo ainda com outra modalidade da presente invenção, o imunoligante compreende pelo menos duas subunidades cada uma sendo conjugada a uma carga útil.
[0115] Preferivelmente, pelo menos duas diferentes cargas úteis podem ser conjugadas a pelo menos duas subunidades. Essa opção proporciona uma versátil caixa de ferramentas com a qual uma grande variedade de diferentes construtores de imunoligante-carga útil pode ser criada. Por exemplo, um imunoligante biespecífico de domínio duplo pode ser conjugado com duas diferentes cargas úteis, por exemplo, um marcador e uma toxina.
[0116] Preferivelmente as pelo menos duas diferentes cargas úteis são cargas úteis tóxicas que interferem com um ou mais trajetos celulares.
[0117] A referida modalidade pode ser realizada, por exemplo, por conjugar as duas diferentes cargas úteis a cada uma das 2 cadeia leves de um anticorpo de comprimento total, e às 2 cadeias pesadas de um anticorpo de comprimento total, respectivamente, por utilizar duas diferentes enzimas sortases, reconhecendo diferentes motivos de reconhecimento de sortase, mais um anticorpo que contém diferentes modificações C-terminal nas cadeias pesada e leve que compreendem os respectivos motivos de reconhecimento para as referidas diferentes enzimas sortases.
[0118] De tal modo, um conjugado de fármaco de anticorpo pode ser criado que é composto de cada duas cadeias leves de Ig e cadeias pesadas de Ig de comprimento total, que contêm diferentes cargas úteis covalentemente fixadas às referidas cadeias pesada e leve.
[0119] Referida modalidade resulta, preferivelmente, na conjugação sincrônica das pelo menos duas subunidades para a geração de cargas úteis de imunoligante com igual conjugação de carga útil a cada uma das referidas subunidades.
[0120] De acordo com outra modalidade preferida, o referido imunoligante com pelo menos duas subunidades está sendo conjugado com pelo menos 80% de eficiência por campo de conjugação.
[0121] De acordo com ainda outra modalidade preferida, o referido imunoligante com pelo menos duas subunidades contém uma sequência de espaçamento de peptídeo de pelo menos dois amino ácidos, preferivelmente 2-5 amino ácidos, anexada aos C-términos de pelo menos uma das duas subunidades
[0122] A referida abordagem resulta, de modo vantajoso, na conjugação sincrônica das pelo menos duas subunidades para a geração de cargas úteis de imunoligante com igual conjugação de carga útil a cada uma das referidas subunidades. De acordo com outra modalidade da presente invenção, o método permite uma relação estequiometricamente definida entre imunoligante e carga útil. De acordo com a referida modalidade, uma relação estrita quantitativa entre imunoligante e carga útil pode ser proporcionada, assim aprimorando a capacidade de reprodução e o desempenho geral do respectivo conjugado de imunoligante/carga útil particularmente para aplicações clínica e/ou terapêutica. Isso é contabilizado pela sequência- e/ou especificidade de campo da transpeptidase usada.
[0123] De acordo com uma modalidade particularmente preferida a referida relação estequiometricamente definida entre imunoligante e carga útil é alcançada por remoção de substrato imunoligante com modificação C-terminal parcialmente reagido. A referida remoção pode, por exemplo, ser realizada por meio de purificação de afinidade. A referida abordagem resulta, preferivelmente, em uma relação homogênea de fármaco para imunoligante.
[0124] Preferivelmente, a referida remoção é realizada por purificação de afinidade usando uma marcação de afinidade posicionada C-terminal para o motivo de reconhecimento de transpeptidase ou domínio. Os métodos padrão conhecidos daqueles versados na técnica podem ser usados para esse fim, por exemplo, marcação HIS, marcação CBP, marcação CYD (peptídeo NorpD dissociable e ainda covalente), marcação Strep II, marcação FLAG, marcação HPC (cadeia pesada de proteína C), e as marcações de proteína de fusão GST e MBP.
[0125] De acordo com outra modalidade da presente invenção, o método permite uma conjugação específica de campo de uma carga útil ao imunoligante. De acordo com a referida modalidade, é garantido que o processo de conjugação não interfere com a atividade do imunoligante, ou a carga útil, em si, assim aprimorando a capacidade de reprodução e o desempenho geral do respectivo conjugado de imunoligante/carga útil particularmente para aplicações clínicas e/ou terapêuticas. Isso é contabilizado pela sequência- e/ou especificidade de campo da transpeptidase usada. Além da química de ligação convencional, que não é específica de campo na maioria dos casos, ou tem especificidade de campo limitada (por exemplo, quando a carga útil é conjugada a um amino grupo livre, tal como em Arg, Lys, Asn ou Gln), o campo de ligação pode assim ser exatamente determinado, de modo que as funcionalidades caracterizantes do imunoligante (por exemplo, especificidade de alvo) ou a carga útil (por exemplo, toxicidade) não são afetadas.
[0126] A presente invenção adicionalmente proporciona um conjugado de imunoligante/carga útil obtido com um método de acordo com as modalidades acima mencionadas.
[0127] Preferivelmente, o referido conjugado de imunoligante/carga útil é selecionado a partir do grupo que consiste de um anticorpo/fármaco conjugado, e/ou um anticorpo/marcador conjugado.
[0128] A presente invenção adicionalmente proporciona o uso de um conjugado de imunoligante/carga útil de acordo com as modalidades acima mencionadas para diagnóstico in vitro ou in vivo de uma determinada condição patológica, previsão ou prognóstico in vitro ou in vivo com relação à uma determinada condição patológica, o tratamento de um ser humano ou de um animal que sofre a partir de ou está em risco de desenvolver uma determinada condição patológica, e/ou para fins de pesquisa e/ou desenvolvimento.
[0129] Preferivelmente, a referida condição patológica é pelo menos uma selecionada a partir do grupo que consiste de, doença neoplástica, doença autoimune, doença neurodegenerativa, e/ou, doença infecciosa.
[0130] Em todos os casos, o conjugado de imunoligante/carga útil de acordo com a presente invenção pode ter efeitos benéficos, por exemplo, por direcionar o último a um campo específico, por exemplo, uma célula de câncer, um campo de neuropatologia, ou um campo de uma reação autoimune.
[0131] A carga útil, por exemplo, uma toxina, um agente quimioterapêutico, uma citocina ou um fármaco é enviada ao referido campo, por exemplo, para esgotar a célula de câncer, para agir de modo anti-proliferativo na célula de câncer, para dissolver a placa, para inibir autoanticorpos, e semelhante.
[0132] Em todos os referidos casos, o conjugado de imunoligante/carga útil de acordo com a presente invenção pode ter efeitos benéficos, por exemplo, por direcionar o último a um campo específico, por exemplo, a célula de câncer, onde a carga útil, por exemplo, a toxina ou um agente quimioterapêutico, é enviada, por exemplo, para esgotar a célula de câncer, para agir anti-proliferativamente na célula de câncer.
[0133] Assim, a toxicidade sistêmica da toxina ou do agente quimioterapêutico é reduzida, enquanto o local do último no campo de ação é aumentada, assim proporcionando uma melhor eficácia ao mesmo tempo em que os efeitos colaterais são reduzidos. Adicionalmente, a respectiva cascata de sinalização pode ser inibida pela ligação do imunoligante. Em caso da carga útil ser um marcador o último pode assim ser usado para marcar um campo específico, por exemplo, uma célula de câncer caracterizada por um determinado antígeno de superfície detectado pelo imunoligante, para diagnóstico.
[0134] A especificidade de campo do processo de conjugar garante uma alta capacidade de reprodução e desempenho geral do respectivo conjugado de imunoligante/carga útil particularmente para aplicações clínicas e/ou terapêuticas.
[0135] O termo “doença neoplástica”, como usado aqui, se refere a um estado anormal ou condição de células ou tecido caracterizado por desenvolvimento celular de rápida proliferação ou neoplasma. Em um significado mais específico, o termo se refere a processos cancerosos, por exemplo, tumores e/ou leucemias.
[0136] O termo “doenças neuropatológicas” engloba, entre outras, doenças neurodegenerativas, doenças neuroinflamatórias ou distúrbios convulsivos.
[0137] Doença neurodegenerativas são caracterizadas por perda progressiva de estrutura ou função dos neurônios, que inclui morte dos neurônios. Muitas doenças neurodegenerativas que incluem Parkinson, Alzheimer, Huntington, esclerose amiotrófica lateral e esclerose múltipla ocorre como um resultado dos processos neurodegenerativos. Há muitos paralelos entre diferentes desordens neurodegenerativas que incluem conjuntos atípicos de proteína assim como morte celular induzida. A neurodegeração pode adicionalmente ser encontrada em muitos níveis diferentes de circuito neuronal que varia a partir de molecular a sistêmico.
[0138] Os termos “Doenças neurodegenerativas” e “doenças neuroinflamatórias” têm um âmbito parcialmente sobreposto. As respostas inflamatórias são uma marca da doença neurodegenerativa e participa, ou contribui, através de diferentes mecanismos na morte da célula neuronal. O catabolismo do trptofano ao longo do trajeto de Kynurenine (KP) representa um dos referidos mecanismos.
[0139] Distúrbios convulsivos são desordens cerebrais que são caracterizadas por sinalização anormal entre as células cerebrais. Distúrbios convulsivos podem afetar parte do cérebro (Convulsões parciais) ou em todo o cérebro (convulsões generalizadas). O distúrbio convulsivo mais prominente é a epilepsia.
[0140] O termo “Doença autoimune”, como usado aqui, engloba doenças autoimunes específicas de órgão, na qual an resposta autoimune é direcionada contra um único tecido, tal como doença de Crohn e colite ulcerativa, diabetes melitus do tipo 1, miastenia gravis, vitiligo, doença de Graves, doença de Hashimoto, doença de Addison e gastrite autoimune e hepatite autoimune. O termo também engloba doenças autoimunes não específicas de órgão, nas quais uma resposta autoimune é direcionada contra um componente presente em diversos ou muitos órgãos através do corpo.
[0141] As referidas doenças autoimunes incluem, por exemplo, artrite reumatoide, doença, lupus eritematosso sistêmico, esclerose sistêmica progressiva e variantes, polimiosite e dermatomiosite.
[0142] Doenças autoimunes adicionais incluem anemia perniciosa que inclui algumas gastrites autoimunes, cirrose biliar primaria, trombocitopenia autoimune, síndrome de Sjogren, esclerose múltipla e psoríase. Aqueles versados na técnica entenderão que os métodos da presente invenção podem ser aplicados ás referidas e a outras doenças autoimunes, como desejado.
[0143] O termo “doença infecciosa” como usado aqui, inclui, mas não é limitado a qualquer doença que é causada por um organismo infecccioso. Organismos infecciosos podem compreende vírus, (por exemplo, vírus de RNA de fita única, vírus de DNA de fita única, vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus da hepatite A, B, e C vírus, vírus da herpes simplex (HSV), citomegalovirus (CMV) vírus de Epstein-Barr (EBV), vírus do papiloma humano (HPV)), parasitas (por exemplo, patógenos de protozoan e metazoan tais como a espécie Plasmodia, a espécie Leishmania, a espécie Schistosoma, a espécie Trypanosoma), bactéria (por exemplo, Mycobacteria, em particular, M. tuberculosis, Salmonela, Streptococci, E. coli, Staphilococci), fungos (por exemplo, a especei Candida, a espécie Aspergilus), Pneumocystis carinii, e prions.
[0144] A presente invenção adicionalmente proporciona uma carga útil de baixo peso molecular modificado com a modificação Glin, em que, n > 1, preferivelmente n = 3 ou n = 5.
[0145] Como usado aqui, o termo “modificação Glin” quer dizer que um oligo- ou polipeptídeo que consiste de resíduos de n Glicin foram adicionados à referida carga útil. Como usado aqui, o termo “composto de carga útil de baixo peso molecular” deve englobar cargas úteis que têm um peso molecular de 2500 Da ou menos.
[0146] A referida carga útil é, preferivelmente, pelo menos uma selecionado a partir do grupo que consiste de , um marcador, , uma marcação de processamento, e/ou , um fármaco.
[0147] O referido marcador é pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste de, uma radiomarcação, preferivelmente um peptídeo ou proteína marcada por radioatividade, uma marcação fluorescente, preferivelmente um peptídeo ou proteína fluorescente, e/ou, uma marcação de enzima, preferivelmente uma peroxidase.
[0148] O referido fármaco é pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste de, uma citocina, um agente radioativo, uma toxina, e/ou, um agente quimioterapêutico.
[0149] Como já discutido acima, a referida toxina é preferivelmente uma toxina de baixo peso molecular, isto é, tendo a peso molecular de < 2500 Da.
[0150] Preferivelmente, a referida toxina é pelo menos uma selecionada a partir do grupo constindo de , Maitansinae, Monometil auristatina, e/ou, Alfa- amanitina a, ou derivados dos primeiros. Exemplos para as referidas toxinas Glin- modificadas são mostrados nas estruturas 1 a 9 da Figura 14A - 14C
[0151] A presente invenção adicionalmente proporciona o uso de uma carga útil modificada a glicina de baixo peso molecular para conjugação dos mesmos a um imunoligante.
[0152] Preferivelmente, e como mencionado acima, a conjugação é uma conjugação mediada a transpeptidase, preferivelmente com uma sortase e/ou uma inteina dividida. Da mesma forma preferivelmente, o imunoligante é um anticorpo.
[0153] Preferivelmente, o referido imunoligante é um anticorpo. De tal modo que, um conjugado de fármaco de anticorpo (ADC) pode ser proporcionado.
[0154] Preferivelmente, a reação de conjugação de imunoligante - carga útil é realizada em sobrenadante de cultura de célula bruta. Isso quer dizer que, preferivelmente, a reação de conjugação pode ocorrer com componentes não purificados ou apenas parcialmente purificados.
Experimentos e Figuras
[0155] Embora a presente invenção tenha sido ilustrada e descrita em detalhes nos desenhos e descrição anterior, a referida ilustração e descrição devem ser consideradas ilustrativas ou exemplificativas e não restritivas; a presente invenção não é limitada às modalidades descritas. Outras variações para as modalidades descritas podem ser subentendidas e efetuadas por aqueles versados na técnica na prática da invenção reivindicada, a partir de um estudo dos desenhos, da descrição, e das reivindicações em anexo. Nas reivindicações, o termo “que compreende” não exclui outros elementos ou etapas, e o artigo indefinido “a”, “o” ou “um”, “uma” não exclui uma pluralidade. O mero fato de que determinadas medidas são recitadas em reivindicações dependentes mutuamente diferentes não indica que a combinação das referidas medidas não pode ser usada com vantagem. Quaisquer sinais de referência nas reivindicações não devem ser construídos como limitando o âmbito.
[0156] Todas as sequências de amino ácidos descritas aqui são mostradas a partir de N-término para C-término; todas as sequências de ácido nucleico descritas aqui são mostradas 5'->3'.
[0157] Exemplo 1: Clonagem de vetores de expressão e expressão de um anticorpo monoclonal CD19 com marcação de sortase LPETG C-terminal e marcações 6x-His adicional e marcações de purificação de afinidade strepil.
[0158] De modo a realizar a conjugação C-terminal de uma carga útil a um anticorpo, primeiro um anticorpo recombinante precisa ser expresso que contém modificações C-terminal, que inclui um motivo de reconhecimento, por exemplo, para sortase A de Staphilococcus aureus.
[0159] Para isso, primeiro ORFs para as cadeias pesada e leve de um anticorpo específico CD19 anti-humano pode ser gene sintetizado, por exemplo, em organizações de pesquisa por contrato (CROs) que oferecem os referidos serviços de síntese de gene, tais como, por exemplo, Genscript (www.genscript.com, Piscataway, NJ, USA). Como um exemplo, as sequências de cadeia pesada e de cadeia leve de um anticorpo hBU12 anti-humano CD19 humanizado podem ser observados na patente US 8,242,252 B2 sob Seq 53 (variante HF) e Seq 58 (variante LG). As regiões VH e VL do referido anticorpo CD19 anti-humano são como a seguir:
[0160] SEQ ID NO 1 (região de codificação VH de anticorpo hBU12 anti-humano CD19 humanizado):
[0161] ATGGGATGGAGCTGGATCTTTCTTTTCCTCCTGTCAGGAA CTGCAGGTGTCCATTGTCAGGTTCAGCTGCAAGAGTCTGGCCCTGGGTTGGTTAAG CCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTACTGTGTCTGGGGGTTCAATCAGCACTTCT GGTATGGGTGTAGGCTGGATTAGGCAGCACCCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGATTG GACACATTTGGTGGGATGATGACAAGAGATATAACCCAGCCCTGAAGAGCAGAGTG ACAATCTCTGTGGATACCTCCAAGAACCAGTTTAGCCTCAAGCTGTCCAGTGTGACA GCTGCAGATACTGCTGTCTACTACTGTGCTAGAATGGAACTTTGGTCCTACTATTTTG ACTACTGGGGCCAAGGCACCCTTGTCACAGTCTCCTCA
[0162] Isso se traduz na sequência de amino ácido a seguir (SEQ ID NO 2):
[0163] MGWSWIFLFLSGTAGVHCQVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCT VSGGSISTSGMGVGWIRQHPGKGLEWIGHIWWDDDKRYNPALKSRVTISVDTSKNQFS LKLSSVTAADTAVYYCARMELWSYYFDYWGQGTLVTVSS
[0164] SEQ ID NO 3 (região de codificação VL de anticorpo hBU12 anti-humano CD19 humanizado)
[0165] ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGA TTCCTGCTTCCAGCAGTGAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAACCCTGTCTCTCT CTCCAGGGGAAAGGGCTACCCTGAGCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATG CACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGCAGGCTCCCAGACTCCTGATTTATGACACATC CAAACTGGCTTCTGGTATTCCAGCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTT TACACTCACAATCAGCAGCCTGGAGCCAGAGGATGTTGCTGTCTATTACTGTTTTCA GGGGAGTGTATACCCATTCACTTTTGGCCAAGGGACAAAGTTGGAAATCAAA
[0166] 'Isso se traduz na sequência de amino ácido a seguir (SEQ ID NO 4):
[0167] M KLPVRLVLMFWIPASSSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSA SSSVSYMHWYQQKPGQAPRLIYDTSKLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDVAVY YCFQGSVYPFTFGQGTKLEIK
[0168] As referidas sequências podem ser fundidas às regiões de cadeia pesada constante de IgG1 humano e regiões de cadeia leve constante que contêm marcações C-terminal adicionais, de modo a realizar o método descrito aqui.
[0169] De modo a realizar a presente invenção, a região de cadeia pesada IgG1 constante humana pode ser sintetizada com 3'-códons adicionais, que codificam uma marcacaod e reconhecimento de sortase A de um LPETG de Staphilococcus aureus, seguido por uma marcação 6xHis (HHHHHH), uma marcação MYC (EQKLISEEDL) e uma marcação strep II (WSHPQFEK) que resulta na sequência, que é como a seguir:
[0170] SEQ ID NO 5 (região de codificação constante de cadeia pesada de região de IgG1 humano com extensão 3' em estrutura que codifica uma marcação de sortase LPETG, uma marcação 6xHis e uma marcação strep II):
[0171] AGCACCAAGGGCCCATCTGTCTTCCCCCTGGCACCCTCC TCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCTGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTT CCCTGAACCTGTGACAGTGTCCTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCAC ACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGAC CGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGC CCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACA CATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTC CCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGT GGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGAC GGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCA CGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAG GAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCAT CTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCC GGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTAT CCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACA AGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTC ACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCA TGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAC TGCCCGAGACCGGCCACCACCACCACCACCACGGCGAGCAGAAGCTGATCAGCGA GGAGGACCTGGGCTGGAGCCACCCCCAGTTCGAGAAGTAG
[0172] Isso se traduz na sequência de amino ácido a seguir (SEQ ID NO 6, amino ácidos das marcações são sublinhados):
[0173] STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLISLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS CDKTHTCPPCPAPELGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKLPETGHH HHHHGEQKLISEEDLGWSHPQFEK^
[0174] Adicionalmente, a região de cadeia leve kappa IgG1 constante humana pode ser sintetizada com 3’-códons adicionais, que codificam uma marcação de reconhecimento de sortase A LPETG de Staphilococcus aureus, seguido pelaa marcação 6xHis e uma marcação strep II (WSHPQFEK) que resulta na sequência, que é como a seguir:
[0175] SEQ ID NO 7 (região de codificação constante de cadeia leve kappa IgG1 humana com estrutura de extensão 3' que codifica uma marcação de sortase LPETG, uma marcação 6xHis, uma marcação Myc, e uma marcação strep II):
[0176] ACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTG ATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATC CCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCC CAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCA CCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTC ACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTCT GCCCGAGACCGGCCACCACCACCACCACCACGGCGAGCAGAAGCTGATCAGCGAG GAGGACCTGGGCTGGAGCCACCCCCAGTTCGAGAAGTAG
[0177] Isso se traduz na sequência de amino ácido a seguir (SEQ ID NO 8, amino ácidos das marcações são sublinhados):
[0178] 'TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLNNFYPREAKVQWKV DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSF NRGECLPETGHHHHHHGEQKLISEEDLGWSHPQFEK*
[0179] As regiões de codificação completas para marcação de sortase LPETG, marcadas 6xHis e strepII de cadeias pesada e leve de anticorpo hBU12 anti- humano CD19 humanizado são então como a seguir:
[0180] SEQ ID NO 9 (região de codificação de cadeia pesada VH-CH de IgG1 humano completo para hBU12 com Marcação de sortase LPETG C-terminal, marcação 6xHis, Marcação Myc, e uma marcação strep II):
[0181] ATGGGATGGAGCTGGATCTTTCTTTTCCTCCTGTCAGGAA CTGCAGGTGTCCATTGTCAGGTTCAGCTGCAAGAGTCTGGCCCTGGGTTGGTTAAG CCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTACTGTGTCTGGGGGTTCAATCAGCACTTCT GGTATGGGTGTAGGCTGGATTAGGCAGCACCCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGATTG GACACATTTGGTGGGATGATGACAAGAGATATAACCCAGCCCTGAAGAGCAGAGTG ACAATCTCTGTGGATACCTCCAAGAACCAGTTTAGCCTCAAGCTGTCCAGTGTGACA GCTGCAGATACTGCTGTCTACTACTGTGCTAGAATGGAACTTTGGTCCTACTATTTTG ACTACTGGGGCCAAGGCACCCTTGTCACAGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCA TCTGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCTGCCCT GGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCTGAACCTGTGACAGTGTCCTGGAACTCAG GCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTC TACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTA CATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGC CCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGG GGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCC CGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGG TCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCG CGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGC ACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTC CCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACA GGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGA CCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAAT GGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCT CCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAAC GTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGC CTCTCCCTGTCTCCGGGTAAACTGCCCGAGACCGGCCACCACCACCACCACCACGG CGAGCAGAAGCTGATCAGCGAGGAGGACCTGGGCTGGAGCCACCCCCAGTTCGAG AAGTAG
[0182] Isso se traduz na sequência de amino ácido a seguir (SEQ ID NO 10, os amino ácidos das marcações são sublinhados):
[0183] MGWSWIFLFLSGTAGVHCQVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCT VSGGSISTSGMGVGWIRQHPGKGLEWIGHIWWDDDKRYNPALKSRVTISVDTSKNQFS LKLSSVTAADTAVYYCARMELWSYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTS GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLISLSSVVTVPSSSLGT QTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSPGKLPETGHHHHHHGEQKLISEEDLGWSHPQFEK^
[0184] SEQ ID NO 11 (região de codificação de cadeia kappa VL-CL de IgG1 humano completa para hBU12 com Marcação de sortase LPETG C-terminal, marcação 6xHis, Marcação Myc, e uma marcação strep II):
[0185] ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGA TTCCTGCTTCCAGCAGTGAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAACCCTGTCTCTCT CTCCAGGGGAAAGGGCTACCCTGAGCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATG CACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGCAGGCTCCCAGACTCCTGATTTATGACACATC CAAACTGGCTTCTGGTATTCCAGCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTT TACACTCACAATCAGCAGCCTGGAGCCAGAGGATGTTGCTGTCTATTACTGTTTTCA GGGGAGTGTATACCCATTCACTTTTGGCCAAGGGACAAAGTTGGAAATCAAAAGAAC TGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGG AACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACA GTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGC AGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGC AGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCT CGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTCTGCCCGAGACCGGCCACCA CCACCACCACCACGGCGAGCAGAAGCTGATCAGCGAGGAGGACCTGGGCTGGAGC CACCCCCAGTTCGAGAAGTAG
[0186] Isso se traduz na sequência de amino ácido a seguir (SEQ ID NO 12, os amino ácidos das marcações são sublinhados):
[0187] M KLPVRLVLMFWIPASSSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSA SSSVSYMHWYQQKPGQAPRLIYDTSKLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDVAVY YCFQGSVYPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLNNFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPV TKSFNRGECLPETGHHHHHHGEQKLISEEDLGWSHPQFEK^
[0188] As regiões de codificação para as cadeias pesada e leve do anticorpo específico CD19 anti-humano como descrito em SEQ ID NOs 9 e 11, respectivamente, podem então ser sintetizadas com campos de enzimas de restrição de flanco (por exemplo, HindIII e NotI) de modo que as mesmas podem ser clonadas em um vetor de expressão de mamífero padrão, tal como pCDNA3.1-hygro (+) (Invitrogen), por métodos de biologia mlelcular padrão conhecidos na técnica.
[0189] A sequência de DNA completa de do vetor de expressão de cadeia pCDNA3.1-hygro (+)-IgH para o anticorpo hBU12 anti-humano CD19 marcado será como a seguir:
[0190] SEQ ID NO 13 (região de codificação de cadeia pesada VH-CH IgG1 humano para hBU12 com Marcação de sortase LPETG C-terminal, marcação 6xHis e uma marcação strep II sublinhados, e campos de clonagem HindIII e NotI sombreados):
[0191] GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTCGACTC TCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTG TGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGC TTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGC GATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAAT CAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTAC GGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAA TGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGG ACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTAC GCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACA TGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTAC CATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCAC GGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAA ATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCG GTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAA CCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCT GGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTCCATGGGATGGAGCTGGATCTTTCTTTTCCTCCT GTCAGGAACTGCAGGTGTCCATTGTCAGGTTCAGCTGCAAGAGTCTGGCCCTGGGT TGGTTAAGCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTACTGTGTCTGGGGGTTCAATCA GCACTTCTGGTATGGGTGTAGGCTGGATTAGGCAGCACCCAGGGAAGGGTCTGGA GTGGATTGGACACATTTGGTGGGATGATGACAAGAGATATAACCCAGCCCTGAAGA GCAGAGTGACAATCTCTGTGGATACCTCCAAGAACCAGTTTAGCCTCAAGCTGTCCA GTGTGACAGCTGCAGATACTGCTGTCTACTACTGTGCTAGAATGGAACTTTGGTCCT ACTATTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCCTTGTCACAGTCTCCTCAGCTAGCACCA AGGGCCCATCTGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACA GCTGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCTGAACCTGTGACAGTGTCCTG GAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCT CAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACC CAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAA AGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGA ACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCA TGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGA CCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGA CAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCAC CGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACA AAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGA GAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGT CAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGG AGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTC CGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGC AGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACA CAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAACTGCCCGAGACCGGCCACCACCACCA CCACCACGGCGAGCAGAAGCTGATCAGCGAGGAGGACCTGGGCTGGAGCCACCCC CAGTTCGAGAAGTAGGCGGCCGCTCGAGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGAT CAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGC CTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAA TTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAG GACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGG GCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCAC GCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGA CCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTC TCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGCATCCCTTTAGGG TTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGT TCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTC CACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCG GTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGGGGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATG AGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGG TGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCA ATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATG CAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATC CCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTT TTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGA GGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCC ATTTTCGGATCTGATCAGCACGTGATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTGTC GAGAAGTTTCTGATCGAAAAGTTCGACAGCGTCTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGA GGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCTGC GGGTAAATAGCTGCGCCGATGGTTTCTACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACTTTG CATCGGCCGCGCTCCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGAATTCAGCGAGAGC CTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTGCACAGGGTGTCACGTTGCAAGACCTGCCTGA AACCGAACTGCCCGCTGTTCTGCAGCCGGTCGCGGAGGCCATGGATGCGATCGCT GCGGCCGATCTTAGCCAGACGAGCGGGTTCGGCCCATTCGGACCGCAAGGAATCG GTCAATACACTACATGGCGTGATTTCATATGCGCGATTGCTGATCCCCATGTGTATC ACTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTGCGTCCGTCGCGCAGGCTCTCGAT GAGCTGATGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCCGGCACCTCGTGCACGCGG ATTTCGGCTCCAACAATGTCCTGACGGACAATGGCCGCATAACAGCGGTCATTGACT GGAGCGAGGCGATGTTCGGGGATTCCCAATACGAGGTCGCCAACATCTTCTTCTGG AGGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCGCTACTTCGAGCGGAGGCATC CGGAGCTTGCAGGATCGCCGCGGCTCCGGGCGTATATGCTCCGCATTGGTCTTGAC CAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGG TCGATGCGACGCAATCGTCCGATCCGGAGCCGGGACTGTCGGGCGTACACAAATC GCCCGCAGAAGCGCGGCCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATA GTGGAAACCGACGCCCCAGCACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATAGCACGTGCTACG AGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCG GGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCC CACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAA ATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATC AATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCAT GGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACG AGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACAT TAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTG CATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTC CGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTAT CAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGA AAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTT GCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCT CAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCT GGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTC CGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCT CAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTC AGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGA CACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTA TGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAA GGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTG GTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCA AGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTA CGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGA TTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAAT CTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCA CCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGT AGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCG CGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAG GGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTG TTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGC CATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTC CGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGG TTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCAC TCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTT TTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACC GAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTT TAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTAC CGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCAT CTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAA AAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATA TTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTT AGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACG TC
[0192] A sequência de DNA completa de vetor de expressão de cadeia pCDNA3.1-hygro (+)-IgL para o anticorpo hBU12 anti-humano CD19 marcado será como a seguir:
[0193] SEQ ID NO 14 (região de codificação de cadeia leve kappa VLCL de IgG1 humano para hBU12 com Marcação de sortase LPETG C-terminal, marcação 6xHis, Marcação Myc, e uma marcação strep II sublinhados, e campos de clonagem HindIII e NotI sombreados):
[0194] GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTCGACTC TCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTG TGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGC TTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGC GATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAAT CAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTAC GGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAA TGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGG ACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTAC GCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACA TGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTAC CATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCAC GGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAA ATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCG GTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAA CCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCT GGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTCCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGAT GTTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGTGAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAACCCT GTCTCTCTCTCCAGGGGAAAGGGCTACCCTGAGCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAA GTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGCAGGCTCCCAGACTCCTGATTTAT GACACATCCAAACTGGCTTCTGGTATTCCAGCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGG AACAGATTTTACACTCACAATCAGCAGCCTGGAGCCAGAGGATGTTGCTGTCTATTA CTGTTTTCAGGGGAGTGTATACCCATTCACTTTTGGCCAAGGGACAAAGTTGGAAAT CAAAAGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTT GAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGC CAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTG TCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCT GAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGG GCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTCTGCCCGAGAC CGGCCACCACCACCACCACCACGGCGAGCAGAAGCTGATCAGCGAGGAGGACCTG GGCTGGAGCCACCCCCAGTTCGAGAAGTAGGCGGCCGCTCGAGTCTAGAGGGCCC GTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTT TGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTC CTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGG GGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCA TGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGC TCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGG TGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTC GCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAAT CGGGGCATCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAA CTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGC CCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAA CACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGGGGATTTCGGC CTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGA ATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGGCAGGCAGAAGTAT GCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCC CAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGC CCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCC CATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAG CTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTC CCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAGCACGTGATGAAAAAGCCTGAA CTCACCGCGACGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATCGAAAAGTTCGACAGCGTCTCCGA CCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGGAG GGCGTGGATATGTCCTGCGGGTAAATAGCTGCGCCGATGGTTTCTACAAAGATCGT TATGTTTATCGGCACTTTGCATCGGCCGCGCTCCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATT GGGGAATTCAGCGAGAGCCTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTGCACAGGGTGTCAC GTTGCAAGACCTGCCTGAAACCGAACTGCCCGCTGTTCTGCAGCCGGTCGCGGAG GCCATGGATGCGATCGCTGCGGCCGATCTTAGCCAGACGAGCGGGTTCGGCCCAT TCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATACACTACATGGCGTGATTTCATATGCGCGATTG CTGATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTGCGTCC GTCGCGCAGGCTCTCGATGAGCTGATGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCC GGCACCTCGTGCACGCGGATTTCGGCTCCAACAATGTCCTGACGGACAATGGCCGC ATAACAGCGGTCATTGACTGGAGCGAGGCGATGTTCGGGGATTCCCAATACGAGGT CGCCAACATCTTCTTCTGGAGGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCGCT ACTTCGAGCGGAGGCATCCGGAGCTTGCAGGATCGCCGCGGCTCCGGGCGTATAT GCTCCGCATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCGATGA TGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATCGTCCGATCCGGAGCCGGGACT GTCGGGCGTACACAAATCGCCCGCAGAAGCGCGGCCGTCTGGACCGATGGCTGTG TAGAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGACGCCCCAGCACTCGTCCGAGGGCAAAG GAATAGCACGTGCTACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGG CTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCA TGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATA AAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTG GTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTA GAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCAC AATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAAT GAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAA ACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTT GCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTC GGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAA TCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAA CCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGC ATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGA TACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCC GCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATG CTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTG TGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTT GAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAG GATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTA ACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTA CCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGC GGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAA GATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAA GGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAA AATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAA TGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTG CCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCC AGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAAT AAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCT CCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATA GTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTG GTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCA TGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGT TGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCAT GCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGA ATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCG CGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAA AACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCAC CCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAG GAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTC ATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGG ATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCC CGAAAAGTGCCACCTGACGTC
[0195] Os referidos construtores permitem a transfecção em células de mamífero, tais como, por exemplo, - mas não limitados a células -CHO, que são tipicamente usadas para a expressão recombinante de anticorpo, a expressão de anticorpo hBU12 humanizado específico CD19 anti-humano com adições C-terminal de uma marcação de sortase A, a marcação 6xHis, uma marcação Myc, e uma marcação strep II em ambas as cadeias IgH e IgL.
[0196] 'Exemplo 2: Clonagem de vetores de expressão para anticorpo monoclonal com domínio N-inteina C-terminal de Ssp GyrB 11 inteina dividida com 6xHis C-terninal adicionale marcações streplI de purificação de afinidade
[0197] Similar ao desenho dos cartuchos e vetores de expressão de cadeias pesada e leve de IgG1 marcada com sprtase A de Staphilococcus aureus, as regiões de codificação para a fusão C-terminal do domínio N-inteina de Ssp GyrB 11 inteina dividida a ou a a cadeia IgH e IgL podem ser desenhadas como a seguir, de modo a sintetizar o gene por uma CRO qualificada (por exemplo, Genscript (www.genscript.com, Piscataway, NJ, USA), com os mesmos elementos para o anticorpo CD19 anti-humano como descrito adicionalmente acima.
[0198] As 150 sequências de amino ácido do domínio N-inteina de Ssp GyrB 11 inteina dividida podem ser encontradas na publicação por Appleby et al. (2009), e é como a seguir:
[0199] SEQ ID NO 15 (N-inteina domínio de Ssp GyrB 11 inteina dividida):
[0200] CFSGDTLVALTDGRSVSFEQLVEEEKQGKQNFCYTIRHDGSI GVEKIINARKTKTNAKVIKVTLDNGESIICTPDHKFMLRDGSYKCAMDLTLDDSLMPLHRK ISTTEDSGHMEAVLNYNHRIVNIEAVSETIDVYDIEVPHTHNFALAS
[0201] A tradução reversa daquela sequência de amino ácido com uso de códon de mamífero resultará na sequência de codificação para o domínio N-inteina de Ssp GyrB 11 inteina dividida como a seguir:
[0202] SEQ ID NO 16 (sequência codificando para o domínio N-inteina de Ssp GyrB 11 inteina dividida):
[0203] TGCTTCAGCGGCGACACCCTGGTGGCCCTGACCGACGG CAGAAGCGTGAGCTTCGAGCAGCTGGTGGAGGAGGAGAAGCAGGGCAAGCAGAAC TTCTGCTACACCATCAGACACGACGGCAGCATCGGCGTGGAGAAGATCATCAACGC CAGAAAGACCAAGACCAACGCCAAGGTGATCAAGGTGACCCTGGACAACGGCGAG AGCATCATCTGCACCCCCGACCACAAGTTCATGCTGAGAGACGGCAGCTACAAGTG CGCCATGGACCTGACCCTGGACGACAGCCTGATGCCCCTGCACAGAAAGATCAGCA CCACCGAGGACAGCGGCCACATGGAGGCCGTGCTGAACTACAACCACAGAATCGT GAACATCGAGGCCGTGAGCGAGACCATCGACGTGTACGACATCGAGGTGCCCCAC ACCCACAACTTCGCCCTGGCCAGC
[0204] Com essa informação de sequência a mão, a região de codificação de cadeia pesada de IgG1 completa para o anticorpo CD19 anti-humano hBU12 com extensão C-terminal, que compreende o domínio N-inteina de Ssp GyrB 11 inteina dividida, seguido por uma marcação 6x His e uma marcação strep II pode ser desenhada como descrito em SEQ ID NO 17 abaixo:
[0205] ATGAATTTTGGACTGAGGCTGATTTTCCTGGTGCTGACCC TGAAAGGCGTCCAGTGTCAGGTTCAGCTGCAAGAGTCTGGCCCTGGGTTGGTTAAG CCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTACTGTGTCTGGGGGTTCAATCAGCACTTCT GGTATGGGTGTAGGCTGGATTAGGCAGCACCCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGATTG GACACATTTGGTGGGATGATGACAAGAGATATAACCCAGCCCTGAAGAGCAGAGTG ACAATCTCTGTGGATACCTCCAAGAACCAGTTTAGCCTCAAGCTGTCCAGTGTGACA GCTGCAGATACTGCTGTCTACTACTGTGCTAGAATGGAACTTTGGTCCTACTATTTTG ACTACTGGGGCCAAGGCACCCTTGTCACAGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCA TCTGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCTGCCCT GGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCTGAACCTGTGACAGTGTCCTGGAACTCAG GCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTC TACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTA CATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGC CCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGG GGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCC CGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGG TCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCG CGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGC ACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTC CCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACA GGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGA CCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAAT GGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCT CCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAAC GTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGC CTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGCTTCAGCGGCGACACCCTGGTGGCCCTGACCGA CGGCAGAAGCGTGAGCTTCGAGCAGCTGGTGGAGGAGGAGAAGCAGGGCAAGCA GAACTTCTGCTACACCATCAGACACGACGGCAGCATCGGCGTGGAGAAGATCATCA ACGCCAGAAAGACCAAGACCAACGCCAAGGTGATCAAGGTGACCCTGGACAACGG CGAGAGCATCATCTGCACCCCCGACCACAAGTTCATGCTGAGAGACGGCAGCTACA AGTGCGCCATGGACCTGACCCTGGACGACAGCCTGATGCCCCTGCACAGAAAGATC AGCACCACCGAGGACAGCGGCCACATGGAGGCCGTGCTGAACTACAACCACAGAA TCGTGAACATCGAGGCCGTGAGCGAGACCATCGACGTGTACGACATCGAGGTGCC CCACACCCACAACTTCGCCCTGGCCAGCCACCATCACCATCACCATGGCTGGAGCC ACCCCCAGTTCGAGAAGTAG
[0206] Isso se traduz para a sequência de amino ácido SEQ ID NO 18 (amino ácidos do domínio N-inteina são sublinhados, a marcação 6x His e a marcação strep II são sombreadas):
[0207] MNFGLRLIFLVLTLKGVQCQVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCT VSGGSISTSGMGVGWIRQHPGKGLEWIGHIWWDDDKRYNPALKSRVTISVDTSKNQFS LKLSSVTAADTAVYYCARMELWSYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTS GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLISLSSVVTVPSSSLGT QTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSPGKCFSGDTLVALTDGRSVSFEQLVEEEKQGKQNFCYTIRHDGSIGV EKIINARKTKTNAKVIKVTLDNGESIICTPDHKFMLRDGSYKCAMDLTLDDSLMPLHRKIST TEDSGHMEAVLNYNHRIVNIEAVSETIDVYDIEVPHTHNFALASHHHHHHGWSHPQFEK^
[0208] Da mesma forma, uma região de codificação de cadeia leve kappa de IgG1 completa para anticorpo CD19 anti-humano hBU12 com extensão C- terminal, que compreende o domínio N-inteina de Ssp GyrB 11 inteina dividida, seguido por uma marcação 6x His e uma marcação strep II pode ser desenhada como descrito em SEQ ID NO 19 abaixo:
[0209] ATGAATTTTGGACTGAGGCTGATTTTCCTGGTGCTGACCC TGAAAGGCGTCCAGTGTGACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGT CTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTTTGAT GGTGATAGTTATATGAACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAAGTCCTC ATCTATGCTGCATCCAATCTAGAATCTGGGATCCCAGCCAGGTTTAGTGGCAGTGGG TCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAAC CTATTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGATCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGC TGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATG AGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCA GAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAG GAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCC TGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACC CATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGCTTCAG CGGCGACACCCTGGTGGCCCTGACCGACGGCAGAAGCGTGAGCTTCGAGCAGCTG GTGGAGGAGGAGAAGCAGGGCAAGCAGAACTTCTGCTACACCATCAGACACGACG GCAGCATCGGCGTGGAGAAGATCATCAACGCCAGAAAGACCAAGACCAACGCCAAG GTGATCAAGGTGACCCTGGACAACGGCGAGAGCATCATCTGCACCCCCGACCACAA GTTCATGCTGAGAGACGGCAGCTACAAGTGCGCCATGGACCTGACCCTGGACGACA GCCTGATGCCCCTGCACAGAAAGATCAGCACCACCGAGGACAGCGGCCACATGGA GGCCGTGCTGAACTACAACCACAGAATCGTGAACATCGAGGCCGTGAGCGAGACCA TCGACGTGTACGACATCGAGGTGCCCCACACCCACAACTTCGCCCTGGCCAGCCAC CATCACCATCACCATGGCTGGAGCCACCCCCAGTTCGAGAAGTAG
[0210] Isso se traduz para a sequência de amino ácido SEQ ID NO 20 (amino ácidos do domínio N-inteina são sublinhados, a marcação 6xHis e a marcação strep II são sombreadas):
[0211] MNFGLRLIFLVLTLKGVQCDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCK ASQSVDFDGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVE EEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVT HQGLSSPVTKSFNRGECFSGDTLVALTDGRSVSFEQLVEEEKQGKQNFCYTIRHDGSIG VEKIINARKTKTNAKVIKVTLDNGESIICTPDHKFMLRDGSYKCAMDLTLDDSLMPLHRKIS TTEDSGHMEAVLNYNHRIVNIEAVSETIDVYDIEVPHTHNFALASHHHHHHGWSHPQFE K
[0212] As regiões de codificação para a N-inteina modificado de cadeias pesada e leve do anticorpo específico CD19 anti-humano como descrito em SEQ ID NOs 17 e 19, respectivamente, podem então ser sintetizadas com campos de enzimas de restrição de flanco (por exemplo, HindIII e NotI) de modo que as mesmas podem ser clonadas em um vetor de expressão de mamífero padrão, tal como pCDNA3.1-hygro (+) (Invitrogen), por métodos de biologia molecular padrão conhecidos na técnica.
[0213] A sequência de DNA completa do vetor de expressão de cadeia pCDNA3.1-hygro (+)-IgH para a N-inteina de anticorpo hBU12 anti-humano CD19 marcado é então como a seguir:
[0214] SEQ ID NO 21 (região de codificação de cadeia pesada VH-CH de IgG1 humano para hBU12 com domínio N-inteina C-terminal de inteina dividida Ssp GyrB S11, seguido por marcação 6xHis a marcação strep II (sublinhados), e campos de clonagem HindIII e NotI (sombreadas)):
[0215] GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTCGACTC TCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTG TGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGC TTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGC GATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAAT CAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTAC GGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAA TGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGG ACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTAC GCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACA TGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTAC CATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCAC GGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAA ATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCG GTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAA CCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCT GGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTCCATGAATTTTGGACTGAGGCTGATTTTCCTGGT GCTGACCCTGAAAGGCGTCCAGTGTCAGGTTCAGCTGCAAGAGTCTGGCCCTGGGT TGGTTAAGCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTACTGTGTCTGGGGGTTCAATCA GCACTTCTGGTATGGGTGTAGGCTGGATTAGGCAGCACCCAGGGAAGGGTCTGGA GTGGATTGGACACATTTGGTGGGATGATGACAAGAGATATAACCCAGCCCTGAAGA GCAGAGTGACAATCTCTGTGGATACCTCCAAGAACCAGTTTAGCCTCAAGCTGTCCA GTGTGACAGCTGCAGATACTGCTGTCTACTACTGTGCTAGAATGGAACTTTGGTCCT ACTATTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCCTTGTCACAGTCTCCTCAGCTAGCACCA AGGGCCCATCTGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACA GCTGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCTGAACCTGTGACAGTGTCCTG GAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCT CAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACC CAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAA AGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGA ACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCA TGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGA CCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGA CAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCAC CGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACA AAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGA GAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGT CAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGG AGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTC CGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGC AGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACA CAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGCTTCAGCGGCGACACCCTGGTGGC CCTGACCGACGGCAGAAGCGTGAGCTTCGAGCAGCTGGTGGAGGAGGAGAAGCAG GGCAAGCAGAACTTCTGCTACACCATCAGACACGACGGCAGCATCGGCGTGGAGAA GATCATCAACGCCAGAAAGACCAAGACCAACGCCAAGGTGATCAAGGTGACCCTGG ACAACGGCGAGAGCATCATCTGCACCCCCGACCACAAGTTCATGCTGAGAGACGGC AGCTACAAGTGCGCCATGGACCTGACCCTGGACGACAGCCTGATGCCCCTGCACAG AAAGATCAGCACCACCGAGGACAGCGGCCACATGGAGGCCGTGCTGAACTACAAC CACAGAATCGTGAACATCGAGGCCGTGAGCGAGACCATCGACGTGTACGACATCGA GGTGCCCCACACCCACAACTTCGCCCTGGCCAGCCACCATCACCATCACCATGGCT GGAGCCACCCCCAGTTCGAGAAGTAGGCGGCCGCTCGAGTCTAGAGGGCCCGTTT AAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCC CCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAAT AAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTG GGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTG GGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAG GGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTT ACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTT CTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGG CATCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGA TTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTT GACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACT CAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGGGGATTTCGGCCTAT TGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGT GTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGGCAGGCAGAAGTATGCAA AGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGC AGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCT AACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATG GCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTAT TCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCG GGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAGCACGTGATGAAAAAGCCTGAACTC ACCGCGACGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATCGAAAAGTTCGACAGCGTCTCCGACCT GATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGGAGGGC GTGGATATGTCCTGCGGGTAAATAGCTGCGCCGATGGTTTCTACAAAGATCGTTATG TTTATCGGCACTTTGCATCGGCCGCGCTCCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATTGGG GAATTCAGCGAGAGCCTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTGCACAGGGTGTCACGTT GCAAGACCTGCCTGAAACCGAACTGCCCGCTGTTCTGCAGCCGGTCGCGGAGGCC ATGGATGCGATCGCTGCGGCCGATCTTAGCCAGACGAGCGGGTTCGGCCCATTCG GACCGCAAGGAATCGGTCAATACACTACATGGCGTGATTTCATATGCGCGATTGCTG ATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTGCGTCCGTC GCGCAGGCTCTCGATGAGCTGATGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCCGGC ACCTCGTGCACGCGGATTTCGGCTCCAACAATGTCCTGACGGACAATGGCCGCATA ACAGCGGTCATTGACTGGAGCGAGGCGATGTTCGGGGATTCCCAATACGAGGTCGC CAACATCTTCTTCTGGAGGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCGCTACT TCGAGCGGAGGCATCCGGAGCTTGCAGGATCGCCGCGGCTCCGGGCGTATATGCT CCGCATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCGATGATGC AGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATCGTCCGATCCGGAGCCGGGACTGTC GGGCGTACACAAATCGCCCGCAGAAGCGCGGCCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAG AAGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGACGCCCCAGCACTCGTCCGAGGGCAAAGGA ATAGCACGTGCTACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTT CGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATG CTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAA GCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGT TTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGA GCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAAT TCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAG TGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACC TGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCG TATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGC TGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCA GGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACC GTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCAT CACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATA CCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGC TTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCT CACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTG CACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGA GTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGA TTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAAC TACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACC TTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGG TGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGA TCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGG GATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAAT GAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATG CTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCC TGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAG TGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAA CCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCC ATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTT TGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTA TGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGT TGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGG CCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGC CATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATA GTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGC CACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAAC TCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCA ACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAA GGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATA CTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATA CATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGA AAAGTGCCACCTGACGTC
[0216] A sequência de DNA completa do vetor de expressão de cadeia pCDNA3.1-hygro (+)-IgL para anticorpo CD19 anti-humano hBU12 marcado com domínio N-inteina Ssp GyrB S11 será como a seguir:
[0217] SEQ ID NO 22 (região de codificação de cadeia leve kappa VLCL de IgG1 humano para hBU12 com C-terminal domínio N-inteina Ssp GyrB S11, marcação 6xHis e uma marcação strep II sublinhados, e campos de clonagem HindIII e NotI sombreados):
[0218] GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTCGACTC TCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTG TGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGC TTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGC GATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAAT CAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTAC GGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAA TGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGG ACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTAC GCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACA TGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTAC CATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCAC GGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAA ATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCG GTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAA CCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCT GGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTCCATGAATTTTGGACTGAGGCTGATTTTCCTGGT GCTGACCCTGAAAGGCGTCCAGTGTGACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTT GGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTG ATTTTGATGGTGATAGTTATATGAACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCA AAGTCCTCATCTATGCTGCATCCAATCTAGAATCTGGGATCCCAGCCAGGTTTAGTG GCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGAT GCTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGATCCGTGGACGTTCGGTGGAGG CACCAAGCTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCC ATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTT CTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTA ACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAG CAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCG AAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAG TGCTTCAGCGGCGACACCCTGGTGGCCCTGACCGACGGCAGAAGCGTGAGCTTCG AGCAGCTGGTGGAGGAGGAGAAGCAGGGCAAGCAGAACTTCTGCTACACCATCAG ACACGACGGCAGCATCGGCGTGGAGAAGATCATCAACGCCAGAAAGACCAAGACCA ACGCCAAGGTGATCAAGGTGACCCTGGACAACGGCGAGAGCATCATCTGCACCCCC GACCACAAGTTCATGCTGAGAGACGGCAGCTACAAGTGCGCCATGGACCTGACCCT GGACGACAGCCTGATGCCCCTGCACAGAAAGATCAGCACCACCGAGGACAGCGGC CACATGGAGGCCGTGCTGAACTACAACCACAGAATCGTGAACATCGAGGCCGTGAG CGAGACCATCGACGTGTACGACATCGAGGTGCCCCACACCCACAACTTCGCCCTGG CCAGCCACCATCACCATCACCATGGCTGGAGCCACCCCCAGTTCGAGAAGTAGGCG GCCGCTCGAGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTT CTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAG GTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGA GTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGA TTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGG CGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGC ATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGC GCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGC TTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGCATCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTA CGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATC GCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGG ACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTAT AAGGGATTTTGGGGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATT TAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGC TCCCCAGGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGT GTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAAT TAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCC CAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCC GAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGG CCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCA GCACGTGATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATCG AAAAGTTCGACAGCGTCTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAATCTCGT GCTTTCAGCTTCGATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCTGCGGGTAAATAGCTGCGC CGATGGTTTCTACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACTTTGCATCGGCCGCGCTCCC GATTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGAATTCAGCGAGAGCCTGACCTATTGCATCTC CCGCCGTGCACAGGGTGTCACGTTGCAAGACCTGCCTGAAACCGAACTGCCCGCT GTTCTGCAGCCGGTCGCGGAGGCCATGGATGCGATCGCTGCGGCCGATCTTAGCC AGACGAGCGGGTTCGGCCCATTCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATACACTACATGG CGTGATTTCATATGCGCGATTGCTGATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGTGATG GACGACACCGTCAGTGCGTCCGTCGCGCAGGCTCTCGATGAGCTGATGCTTTGGG CCGAGGACTGCCCCGAAGTCCGGCACCTCGTGCACGCGGATTTCGGCTCCAACAAT GTCCTGACGGACAATGGCCGCATAACAGCGGTCATTGACTGGAGCGAGGCGATGTT CGGGGATTCCCAATACGAGGTCGCCAACATCTTCTTCTGGAGGCCGTGGTTGGCTT GTATGGAGCAGCAGACGCGCTACTTCGAGCGGAGGCATCCGGAGCTTGCAGGATC GCCGCGGCTCCGGGCGTATATGCTCCGCATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCT TGGTTGACGGCAATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATC GTCCGATCCGGAGCCGGGACTGTCGGGCGTACACAAATCGCCCGCAGAAGCGCGG CCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGACGCCCC AGCACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATAGCACGTGCTACGAGATTTCGATTCCACCGC CGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGA TCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTG CAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTT TTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTG TATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGT GTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTG TAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACT GCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAAC GCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGA CTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCG GTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAA GGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAG GCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAA ACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGC TCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGA AGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTT CGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCT TATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGG CAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAG TTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGC GCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAA CAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGA AAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGG AACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCT AGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACT TGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTA TTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAG GGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGC TCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTC CTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAA GTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGG TGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGC GAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGA TCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGC ATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTC AACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGT CAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAA AACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGA TGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTC TGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACAC GGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGT TATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGG TTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTC
[0219] Os referidos vetores de expressão com base em pcDNA3.1- hygro(+) descritos em SEQ ID NOs 21 e 22 permitem a transfecção em células de mamífero, tais como, por exemplo, mas não limitados a células CHO, que são tipicamente usadas para a expressão recombinante de anticorpo, a expressão do anticorpo hBU12 humanizado específico CD19 anti-humano com domínio N-inteina C-terminal fundido, seguido por a marcação 6xHis e uma marcação strep II em ambas as cadeias IgH e IgL.
[0220] Exemplo 3: Clonagem e expressão de Enzima sortase A recombinante a partir de Staphilococcus aureus.
[0221] O ORF de Sortase A a partir de Staphilococcus aureus é publicado no Genbank e pode ser encontrado sob a entrada: AF162687.1. A sequência aa- naquele registro é mostrada como SEQ ID NO 23 (sequência de amino ácido de sortase A a partir de Staphilococcus aureus):
[0222] MKKWTNRLMTIAGVVLILVAAILFAKPHIDNILHDKDKDEKIEQ YDKNVKEQASKDKKQQAKPQIPKDKSKVAGYIEIPDADIKEPVYPGPATPEQLNRGVSFA EENESLDDQNISIAGHTFIDRPNYQFTNLKAAKKGSMVYFKVGNETRKYKMTSIRDVKPT DVGVLDEQKGKDKQLTLITCDDYNEKTGVWEKRKIFVATEVK
[0223] A sequência de nucleotídeo correspondente nessa entrada de Genbank é proporcionada como SEQ ID NO 24:
[0224] ATGAAAAAATGGACAAATCGATTAATGACAATCGCTGGTG TGGTACTTATCCTAGTGGCAGCATATTTGTTTGCTAAACCACATATCGATAATTATCTT CACGATAAAGATAAAGATGAAAAGATTGAACAATATGATAAAAATGTAAAAGAACAGG CGAGTAAAGATAAAAAGCAGCAAGCTAAACCTCAAATTCCGAAAGATAAATCGAAAG TGGCAGGCTATATTGAAATTCCAGATGCTGATATTAAAGAACCAGTATATCCAGGAC CAGCAACACCTGAACAATTAAATAGAGGTGTAAGCTTTGCAGAAGAAAATGAATCAC TAGATGATCAAAATATTTCAATTGCAGGACACACTTTCATTGACCGTCCGAACTATCA ATTTACAAATCTTAAAGCAGCCAAAAAAGGTAGTATGGTGTACTTTAAAGTTGGTAAT GAAACACGTAAGTATAAAATGACAAGTATAAGAGATGTTAAGCCTACAGATGTAGGA GTTCTAGATGAACAAAAAGGTAAAGATAAACAATTAACATTAATTACTTGTGATGATTA CAATGAAAAGACAGGCGTTTGGGAAAAACGTAAAATCTTTGTAGCTACAGAAGTCAA ATAA
[0225] A informação técnica com relação à expressão de um fragmento enzimaticamente ativa de sortase A recombinante em E.coli, que compreende os amino ácidos 60-205 com marcação 6xHis são descritas em referência no pedido de patente internacional publicado sob o No. WO 2007/108013 A2. A região de codificação para a versão marcada 6xHis de sortase A de Staphilococcus aureus (aa60-205) é proporcionado abaixo como SEQ ID NO 25:
[0226] ATGCAAGCTAAACCTCAAATTCCGAAAGATAAATCGAAAG TGGCAGGCTATATTGAAATTCCAGATGCTGATATTAAAGAACCAGTATATCCAGGAC CAGCAACACCTGAACAATTAAATAGAGGTGTAAGCTTTGCAGAAGAAAATGAATCAC TAGATGATCAAAATATTTCAATTGCAGGACACACTTTCATTGACCGTCCGAACTATCA ATTTACAAATCTTAAAGCAGCCAAAAAAGGTAGTATGGTGTACTTTAAAGTTGGTAAT GAAACACGTAAGTATAAAATGACAAGTATAAGAGATGTTAAGCCTACAGATGTAGGA GTTCTAGATGAACAAAAAGGTAAAGATAAACAATTAACATTAATTACTTGTGATGATTA CAATGAAAAGACAGGCGTTTGGGAAAAACGTAAAATCTTTGTAGCTACAGAAGTCAA ACACCATCACCATCACCATTAA
[0227] Isso se traduz para a sequência de amino ácido SEQ ID NO 26:
[0228] MQAKPQIPKDKSKVAGYIEIPDADIKEPVYPGPATPEQLN RG VSFAEENESLDDQNISIAGHTFIDRPNYQFTNLKAAKKGSMVYFKVGNETRKYKMTSIRD VKPTDVGVLDEQKGKDKQLTLITCDDYNEKTGVWEKRKIFVATEVKHHHHHH*
[0229] A região de codificação para o fragmento de sortasde A marcado de 6xHis de Staphilococcus aureus, como proporcionado em SEQ ID NO 25, pode ser clonado em um vetor de expressão bacteriano padrão, tal como, por exemplo, pET29 (Novagen), de modo a transformar a cepa de E. coli BL21(DE3) (Novagen) e para gerar um clone de E. coli que pode ser usado para a produção bacteriana de sortase A recombinante de acordo com métodos padrão conhecidos na técnica. Em suma, E. coli BL21(DE3) transformada com plasmídeos de expressão pET29 para sortase A pode ser cultivada a 37 °C em meio LB com 50 μg/mL de canamicina até que uma OD600 = 0,5 - 0,8 seja alcançada. IPTG pode então ser adicionado à concentração final de 0,4 mM e a expressão da proteína pode ser induzida por três horas a 30 °C. As células podem então ser coletadas por centrifugação e ressuspensas em tampão de lise (50 mM de Tris pH 8.0, 300 mM de NaCl suplementado com 1 mM de MgCl2, 2 unidades/mL de DNAseI (NEB), 260 nM de aprotinina, 1.2 μM de leupeptina, e 1 mM de PMSF). Células podem então ser lisadas por sonicação e o sobrenadante clarificado pode então ser purificado em Ni-NTA agarose seguindo as instruções~eos do fabricante.
[0230] As frações que são de >90% de puriza, como julgado por SDS- PAGE, podem então ser consolidadas e dialisadas contra salina Tris-tamponada (25 mM de Tris pH 7.5, 150 mM de NaCl), e a concentração da enzima pode ser calculada a partir da A280 medida usando o coeficiente de extinção publicado de 17,420 M-1 cm-1.o protoclo acima mencionado foi seguido e ca. 20 mg de > 90% de fragmento puro recombinante enzimaticamente ativo (de ca. 17 kD) sortase A de Staphilococcus aureus foi produzido e a análise da proteína recombinante por SDS-PAGE e Western blotting é descrita na Figura 7.
[0231] Exemplo 4: expressão e purificação de anticorpos recombinantes marcados com sortase marcados com N-inteina em células CHO
[0232] expressão de célula CHO: a expressão de anticorpos IgG1 recombinantes a partir da construtores de expressão descritos sob os Exemplos 2 e 3 pode ser alcançada por transfecção transitória usando, por exemplo, os sistemas de expressão CHO comercialmente oferecidos, tais como o sistema CHO freeStyle CHO da Invitrogen seguindo as instruções do manual de CHO freeStyle.
[0233] Em suma, cerca de 1 dia antes da transfecção, células CHO devem ser semeadas em 5-6 x106 células/mL em meio CHO freeStyle em frascos de agitação de modo a expandir as mesmas a 120 rpm em um agitador orbital a 37°C em um incubador umidificado a 7,5% de atmosfera de CO2. Os dias a seguir as células podem ser transfectadas, quando as mesmas alcançam uma densidade de 1.2-1,5x106/mL. As células então precisam ser diluídas a 1x106 células/mL. 30 mL da referida suspensão celular então precisa ser adicionada a um frasco de agitação de 125 mL e 40 μg de DNA de plasmídeo de expressão de IgH e IgL 1:1 misturado é adicionado a 600 μL de meio OptiPro SF (Invitrogen). Ao mesmo tempo, 40 μL reagente de transfecção Max de freeStyle precisa ser adicionado a 600 μL de meio OptiPro SF, e ambas as amostras precisam ser gentilmente misturadas, e incubadas por 10 min a temperatura ambiente para permitir que o reagente de transfecção de DNA complexe para formar. Então a mistura de reagente de transfecção de DNA pode ser adicionada lentamente aos 125 mL de cultura de célula CHO a partir de acima e as células transfectadas são então desenvolvidas por até 6 dias a 120 rpm em um agitador orbital a 37°C no incubador umidificado a 7.5% de atmosfera de CO2.
[0234] Posteriormente, sobrenadante de cultura celular pode ser coletado e analisado para titulação de expressão de anticorpo por métodos adequados conhecidos na técnica (ELISA, Luminex, etc.).
[0235] b.) Purificação de proteína A: a purificação de Proteína A de anticorpos recombinantes a partir de sobrenadante de célula CHO pode ser realizada com colunas de sefarose de proteína A comercialmente oferecidas (Thermo Fisher, Pierce) de acordo com instruções a partir do fabricante.
[0236] Em suma, sobrenadante de cultura celular liberada é rodado sobre uma coluna de proteína A de tamanho adequado e capacidade equilibrada com PBS. O meio residual é lavado com PBS e eventualmente o IgG ligado pode ser eluído com tampão de baixo tampão, tall como 0,1 M de ácido cítrico-NaOH, pH 3.0. O IgG eluído deve ser neutralizado imediatamente com 1/10th volume de 1M de Tris/Cl, pH7.4. As frações combinadas que contém IgG podem então ser dializadas contra PBS durante a noite a 4°C.
[0237] Os protocolos proporcionados no Exemplo 4 proporcionam àqueles versados na técnica de frações combinadas com a instrução para produzir suficientes quantidades de anticorpo recombinantes purificados a partir dos construtores descritos nos Exemplos 1 e 2.
[0238] Exemplo 5: Geração de anticorpos monoclonais conjugados de carga útil tóxica MMAE C-terminal específica de campo por transpeptidação mediada a sortase e inteina dividida
[0239] Toxina monometil Auristatina A acoplada a um trecho de glicina de 5 amino ácidos e um peptídeo de 6 amino ácidos SSp GyrB S11 C-int inteina dividida de acordo com as fórmulas proporcionadas abaixo, pode ser ordenado customizado a partir de química qualificada CROs.
[0240]
[0248] Me = grupo metila (-CH3)
[0249] GVFVHNSAGSGK = trecho Gli-Val-Fe-Val-His-Asn-Ser-Ala- Gli-Ser-Gli-Lys
[0250] Conjugação de carga útil de MMAE tóxica de anticorpos IgG recombinantes marcados com motivo LPETG sortase A
[0251] A conjugação de 5 amino ácidos de glicina e carga útil tóxica modificada com MMAE a anticorpo IgG1 marcado com LPETG sortase A (que pode ser produzido pelos Exemplos 1 e 4 a seguir) pode ser alcançada por misturar relações apropriadas de anticorpo IgG1 marcado com LPETG com a toxina MMAE glicina- modificada descrita na Fórmula 1 (por exemplo, a uma relação de 1:1 e 50 μM de concentração) e com sortase A recombinante (produção descrita no Exemplo 3) (por exemplo, a 5 μM de concentração), e usando tampão de incubação fisiológico, tal como, por exemplo; 5 mM de Tris/Cl, 15 mM de NaCl, 6 mM de CaCl2, pH 8.0, e incubando a 37°C a 40°C por um mínimo de 2 horas.
[0252] Eficiência da conjugação pode ser monitorada por analisar a ausência da marcação 6xHis e/ou da marcação streplI após parar a reação, por exemplo, por análise de western-blot ou ELISA com os anticorpos de marcação anti-Hise/ou marcação anti-strepII.
[0253] O produto completamente conjugado pode ser enriquecido por colunas de Nickel-NTA, ou ligação de coluna de estreptactina, que se ligam à marcação 6xHis ou à marcação strepII, respectivamente, que podem apenas estar presentes no substrato incompletamente reagido IgG1. O conjugado final de IgG-carga útil pode eventualmente ser purificado usando purificação de proteína A como descrito acima.
[0254] b.) conjugação de carga útil MMAE tóxica de anticorpos IgG recombinantes marcados com SSp GyrB S11 N-inteina
[0255] A conjugação de carga útil tóxica de MMAE modificada com amino ácido C-inteina Ssp GyrB S11 a anticorpo IgG1 marcado com N-inteina (que pode ser produzido pelos seguintes Exemplos 2 e 4) pode ser alcançada ao se misturar relações adequadas de anticorpo IgG1 marcado com N-inteina com a toxina MMAE modificada com amino ácido C-inteina descrita na Fórmula 2 (por exemplo, a uma relação de 1:10 ou 1:25 a 5 μM de concentração do anticorpo IgG) usando tampão de incubação fisiológico, tal como, por exemplo; 20 mM de Tris/Cl, 250 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, pH 8.5, e incubar a temperatura ambiente ou a 37°C por um mínimo de 4 horas.
[0256] A eficiência da conjugação pode ser monitorada por analisar a ausência da marcação 6xHis e/ou da marcação streplI após parar a reação, por exemplo, por análise de western-blot ou ELISA com anticorpos de marcação anti-Hise/ou marcação anti-strepII.
[0257] O produto completamente conjugado pode ser enriquecido por Colunas de Nickel-NTA, ou ligação de coluna de estreptactina, que se ligam à marcação 6xHis ou à marcação strepII, respectivamente, que podem apenas estar presentes em substrato IgG1 incompletamente reagido. O conjugado final de IgG-carga útil pode eventualmente ser purificado usando purificação de proteína A como descrito acima.
[0258] Em suma, os Exemplos 1-5 descritos acima permitem que aqueles versados na técnica pratique a presente invenção de enzimaticamente conjugar a carga útil tóxica específica de campo ao C-término ou usando transpeptidação mediada a sortase A ou mediada a inteina dividida.
[0259] Exemplo 6: Produção de Trastuzumab com ligante (glicina- serina) C-terminal GS, motivo LPETG Sortase e marcaçõe adicionais de 6x-His e Strep II de purificação de afinidade ou em cadeia pesada ou em cadeia leve
[0260] Construtores de expressão de anticorpo que codificam anticorpo monoclonal Trastuzumab (Tras) de cadeias pesada e leve, ou não marcados (SEQ ID NOs: 31 - 34) ou marcados em C-terminal com ligante ligante GS (glicina-serina), marcação de sortase LPETG, marcação 6xHis, e Marcação Strep II (SEQ ID NOs: 35 - 38) foram gerados essencialmente como descrito no Exemplo 1. Usando os referidos construtores de expressão, Tras-HC-GS-LHS e Tras-LC-GS-LHS (HC = cadeia pesada, LC = cadeia leve, GS = glicina-serina, LHS = Marcação LPETG + marcação 6xHis + marcação strepII) foram produzidos em células CHO por co-transfecção dos construtores de expressão correspondentes. Tras-HC-GS-LHS é uma variante de Trastuzumab com uma cadeia leve não modificada (SEQ ID NOs: 35 - 36), e a cadeia pesada marcada C- terminal com ligante GS (glicina-serina), motivo LPETG Sortase, marcação 6xHis, e marcação strepII (SEQ ID NOs: 33 - 34). Tras-LC-GS-LHS é uma variante de Trastuzumab com uma cadeia pesada não modificada (SEQ ID NOs: 31 - 32), e a cadeia leve marcada C-terminal com ligante GS, motivo LPETG Sortase, marcação 6xHis, e marcação strepII (SEQ ID NOs: 37 - 38). A transfecção de célula CHO e purificação de afinidade de anticorpos por proteína A-cromatografia de sefarose foi realizada essencialmente como descrito no Exemplo 4.
[0261] Exemplo 7: Conjugação mediada a sortase A de cadeia psada ou de cadeia leve de Trastuzumab com toxina DM1 modificada a Gli5
[0262] Reações de conjugação que contém toxina DM1 modificada a Gli5 (adquirido de Concortis, San Diego, CA, U.S., estrutura vide a Figura 14 a.) e um fragmento recombinante de 17kD de sortase A de Staphilococcus aureus (vide Exemplo 3) foram realizadas com 10,5 mg de cada anticorpo monoclonal (mAb) (vide Exemplo 6) em 1x tampão de Sortase (25 mM de Tris-HCl, pH8.2; 150 mM de NaCl; 7.5 mM de CaCl2), como mostrado na Tabela II, abaixo. A reacaod e conjugação Tras-HC-GS-LHS foi incubada a 25°C por 2h; a reacaod e conjugação Tras-LC-GS-LHS foi incubada a 25°C for 18h. Cada mistura de reação foi então passada sobre colunas de Strep-Tactin® Sefarose (IBA Life-Sciences, Gottingen, Germany). Para isso, 1 mL de Strep-Tactin Agarose foi embalada sob gravidade em uma coluna fritada e equilibrada com 2 volumes de coluna de tampão de equilíbrio (100 mM de Tris-HCl, pH 8.0; 150 mM de NaCl; 1 mM de EDTA). Cada mistura de conjugação foi passada duas vezes na mesma coluna usando o fluxo de gravidade (para aumentar o tempo de estadia da resina). A resina foi lavada com um volume de coluna adicional de tampão de equilíbrio para maximizar o rendimento do conjugado e o pool então aplicado imediatamente a uma coluna de proteína A. Para isso, uma coluna HiTrap de 1 mL de Proteína A foi equilibrada com 10 volumes de coluna de tampão (25 mM de fosfato de sódio pH 7.5). Cada reação de conjugação foi então aplicada a uma coluna equilibrada e a coluna lavada com 5 volumes adicionais de coluna de tampão. O conjugado ligado foi eluído com 5 volumes de coluna de tampão de elução (0,1M de ácido succinico, pH 2.8) com frações de 1 volume de coluna coletadas (em tubos que contêm 25% v/v de 1M de Tris Base para neutralisar o ácido) e analisadas para o teor de proteína. Proteína que contém frações foram agrupadas e formuladas por G25 cromatografia de coluna. Para isso, colunas NAP 25 de um tamanho adequado para cada escala de fabricação foram usadas para formular os conjugados para armazenamento a longo prazo. As colunas foram equilibradas, carregadas e eluídas com 10 mM de Succinato de sódio pH 5.0, 100 mg/mL Trehalose, 0,1% % w/v de Polisorbato 20 (Tampão de formulação para Kadcila® (T-DM1), comercializado pela Roche/Genentech) de acordo com as instrções do fabricante.
[0263] Os rendimentos do conjugado Tras-HC-GS-LHS e Tras-LC-GS- LHS DM1 foram, respectivamente, 8,0 mg (76.2%) e 5,9 mg (56.2%). As principais perdas do processo ocorreram durante a purificação de Proteína A e G25, mais provavelmente como um resultado do corte de pico para garantir a máxima concentração do produto para cada etapa subsequente ou armazenamento.
Breve Descrição dos Desenhos
[0264]
[0265] Tabela 2: Condições de conjugação para Tras-HC-GS-LHS e Tras-LC-GS-LHS:
[0266] A carga de fármaco foi avaliada por Cromatografia de Interação Hidrófoba (HIC), e foi realizada em uma coluna TOSOH Butil-NPR 4.6mm x 3.5 cm, 2,5 μm rodada a 0,8 mL/min com um gradiente linear de 12 minutos entre A - 1,5M (NH4)2SO4, 25 mM NaPi, pH = 6.95 ± 0,05 e B - 75% 25 mM NaPi, pH = 6.95 ± 0,05, 25% IPA. Os perfis de HIC revelaram que para ambos, Tras-HC-GS-LHS e Tras-LC-GS-LHS, não houve não conjugado mAb deixado detectável, e a fração principal de cada mAb foi carregada com 2 fármacos (vide Figura 8).
[0267] Exemplo 8: Teste de toxicidade In vitro com conjugados de Trastuzumab-DM1 mediados a sortase A
[0268] A citotoxicidade de DM1-sortaseA-conjugado Tras-HC-GS-LHS e DM1-sortaseA-conjugado Tras-LC-GS-LHS foi investigada e comparada a Kadcila® (Roche/Genentech) usando células SKBR3, uma linhagem de célula de câncer de mama de ser humano superexpressando o cognato de antígeno de trastuzumab (Tras) HER- 2/neu, e células T47D-5R, uma linhagem de células de câncer de mama que expressam naturalmente baixos níveis de HER-2/neu, trabalhadas por engenharia para serem desprovidas de HER-2/neu de superfície celular (Graus-Porta et al. (1995)). As células foram laminadas em placas de 96 cavidades em 100 μL de DMEM completo (10’000 células por cavidade). Após um dia de incubação, 50μL de meio foi cuidadosamente removido a partir de cada cavidade e substituído por 50μL de 3.5-vezes de diluição em série de cada ADC em DMEM completo, que resulta em Concentrações de ADC que varia a partir de 20 μg/mL a 0,25 ng/mL. Cada diluição foi realizada em duplicatas ou triplicatas. Após 3 dias adicionais de incubação at37°C no incubador umidificado a 5% de atmosfera de CO2, as placas foram removidas a partir da incubadora e equilibradas a temperatura ambiente. Após aproximadamente 30 minutos, 100 μL de solução CelTiter-Glo® Luminescente (Promega, Cat.No G7570) foi adicionado a cada cavidade e, após agitar as placas a 450 rpm por 5 min seguido por uma incubação de 10 min sem agitação, a luminescência foi medida em um Tecan Infinity F200 com um te po de integração de 1 segundo por cavidade. Todos os três conjugados de fármaco de anticorpo (ADCs) foram altamente citotóxicos para a linhagem de células de câncer de mama SKBR3 que superexpressam HER-2/neu, mas não para a linhagem de células de câncer de mama T47D-5R negativa para HER-2/neu (vide a Figura 9). Os valores de EC50 para a linhagem de células de cêncer de mama SKBR3 positivas para Her-2/neu foram: Kadcila®, 32,4 ng/mL; DM1-conjugado Tras-HC-GS-LHS, 45,6 ng/mL; Tras-LC-GS-LHS, 51,4 ng/mL, e assim estão dentro da faixa similar de potência no experimento in vitro de extermínio de célula de tumor. De modo oposto, nenhuma toxicidade específica celular foi detectável com a linhagem de células de câncer de mama T47D-5R negativa para Her-2/neu, demonstrando a equivalência funcional de sortase A, enzimaticamente conjugado ADC versus o tradicional, quimicamente conjugado ADC, quando a comparação acarreta o mesmo anticorpo objetivado e a mesma toxina (DM1) (A Figura 9).
[0269] Entretanto, parece que reduz a relação de fármaco-para anticorpo de ca. 1.80 (deduzido a partir da integração dos picos de DAR1 e DAR2 na Figura 8) para o Tras-HC-GS-LHS e Tras-LC-GS-LHS sortase A-conjugado conjugados de fármaco de anticorpo (ADCs), comparados a DAR de ca. 3-4, reportado por Kadcila® não traduzem em uma citotoxicidade celular proporcionalmente diferente nos testes de extermínio de célula de tumor in vitro (A Figura 9). Esse achado inesperado pode ser o resultado de uma conjugação de anticorpo-toxina específica de campo mediada por sortase A mais definida em comparação Kadcila® quimicamente conjugada e menos definida estocasticamente.
[0270] Exemplo 9: Otimização da sincronização de conjugação de carga útil de cadeia pesada e cadeia leve por anticorpo mediado a sortase A por variação do comprimento do peptídeo-espaçador inserido entre a extremidade C-terminal do anticorpo de cadeia pesada e cadeia leve e o motivo de reconhecimento de sortase A
[0271] A influência do comprimento do peptídeo-espaçador posicionado entre o C-término de anticorpo de cadeia pesada ou de cadeia leve e o motivo de reconhecimento LPETG sortase foi investigada. Para isso, os anticorpos construtores de expressão de cadeia pesada e de cadeia leve que codificam mAb Ac10 quimérica específica de CD30 de cadeias pesada e leve (sequência HC derivada a partir de US 2008213289 A1, Seq1, sequência LC derivada a partir de US 2008213289 A1, Seq9), C- terminalmente modificado com sequências que compreendem ou que não compreendem o espaçador de 2 amino ácidos GS (glicina-serina), e que compreendem um motivo de reconhecimento LPETG sortase A, e a marcação de purificação strep-II (SEQ ID NOs: 39 - 46), foram clonados essencialmente de acordo com as instruções descritas no Exemplo 1. Usando os referidos construtores de expressão, mAbs Ac10-HC-GS-LHS/LC-GS-LHS e Ac10-HC-LS/LC-LS foram produzidos em células CHO por co-transfecção dos plasmídeos correspondentes. Ac10-HC-GS-LHS/LC-GS-LHS é uma variante Ac10 com cadeias pesada e leve modificadas nos C-términos de cada HC e LC com um espaçador de peptídeo GS, um motivo LPETG sortase A, uma marcação 6xHis, e uma marcação strep-II (SEQ ID NOs:39 - 42; Tabela 3). Ac10-HC-LS/LC-LS é uma variante Ac10 com cadeias pesada e leve modificadas nos C-términos com motivo LPETG Sortase e marcação strep-II sem o ligante de 2-peptídeo GS (SEQ ID NOs: 43 - 46; Tabela 3). A transfecção de célula CHO e purificação de afinidade de anticorpos por proteína A- cromatografia de sefarose foi realizada essencialmente como descrito no Exemplo 4.
[0272] Para se investigar a eficiência de conjugação, diluições em série de Sortase A foram usadas para conjugar FITC modificado por penta-glicina (Gli5- FITC, vide Fórmula 3 abaixo).
[0273] Fórmula 3: FITC modificado com penta-glicina (Gli5-FITC)
[0274] G = resíduo de glicina
[0275] Para isso, Gli5-FITC foi sortase A conjugado a duas variantes de Ac10 em 1x tampão de Sortase (25 mM de Tris-HCl, pH8.2; 150 mM de NaCl; 7,5 mM de CaCl2), como mostrado na Tabela 4. Após 4h a 42°C, os produtos de reação foram analisados por desnaturação, redução de gel de eletroforese de SDS-PAGE, e a FITC foi visualizada por dispor os géis em uma caixa de UV (A Figura 10). Conjugação para a cadeia pesada foi observada ser altamente eficiente independente da presença ou ausência do ligante GS entre o C-término da cadeia pesada e o motivo de reconhecimento de sortase LPETG. Inesperadamente, a conjugação mediada a sortase A na cadeia leve foi significantemente menos eficiente em comparação a conjugação de cadeia pesada mediada a sortase A. Adicionalmente, foi surpreendentemente observado que a eficiência do acoplamento foi dramaticamente afetada pela presença ou ausência do espaçador 2 peptídeo GS (glicina-serina) posicionado entre o C-término do anticorpo de cadeia leve o motivo de reconhecimento LPETG sortase A. Enquanto que a presença do ligante GS, a conjugação par a cadeia leve ocorreu com cerca de 5-10x menos eficiência do que para a cadeia pesada, que foi cerca de 50-100x menos eficiente na ausência de um ligante. Portanto, foi concluído que ao se aumentar o comprimento do espaçador de peptídeo entre a cadeia leve e o motivo de reconhecimento de sortase LPETG se deve adicionalmente aprimorar a eficiência da conjugação.
[0276] Portanto, a influência de aumentar o comprimento do espaçador de peptídeo entre a cadeia leve e motivo de reconhecimento de sortase LPETG na eficácia da conjugação foi investigada sm seguida. Os construtores de expressão que codificam mAb Ac10 de cadeia leve, C-terminalmente marcados com Motivo de reconhecimento de sortase LPETG e marcação de purificação strep-II, com um ligante de 2 a 5 amino ácidos (SEQ ID NOs: 47 - 54), foram gerados essencialmente como descrito no Exemplo 1. Usando os referidos construtores de expressão, mAbs Ac10-HC-LS/LC- GS-LS, Ac10-HC-LS/LC-GGS-LS, Ac10-HC-LS/LC-GGGS-LS e Ac10-HC-LS/LC- GGGGS-LS foram produzidos em células CHO por co-transfecção dos construtores de expressão correspondentes. Em cada um dos referidos anticorpos, a cadeia pesada é C- terminalmente modificada com um motivo de reconhecimento de sortase LPETG e uma marcação de purificação strep-II (SEQ ID NOs: 43 - 44; Tabela 3). A cadeia leve é C- terminalmente modificada com uma marcação de sortase LPETG e marcação de strep-II que contém ou um espaçador de peptídeo GS, GGS, GGGS, ou um GGGGS (SEQ ID NOs: 47 - 54; Tabela 3) na frente do motivo LPETG. A transfecção de célula CHO e a purificação de afinidade de anticorpos por proteína A-cromatografia de sefarose foi realizada essencialmente como descrito no Exemplo 4.
[0277] Para se investigar a eficiência da conjugação, diluições em série de Sortase A foram usadas para conjugar FITC modificado por penta-glicina (Gli5- FITC, vide Fórmula 3, acima) a quatro diferentes variantes de Ac10 mAb em 1x Tampão de Sortase (25 mM de Tris-HCl, pH 8,2; 150 mM de NaCl; 7,5 mM de CaCl2), como mostrado na Tabela 5. Após 4h a 42°C, os produtos de reação foram analisados por desnaturação, reduzindo o gel de eleltroforese SDS-PAGE, e FITC foi visualizada ao se dispor os géis em uma caixa de UV (Figura 11). Como esperado, a conjugação para a cadeia pesada foi igualmente eficiente em todas as quatro variantes de anticorpo. De modo diferente, a conjugação na cadeia leve foi aprimorada de modo significativo por aumentar o comprimento do espaçador de peptídeo. De modo significativo, com o espaçador de peptídeo mais longo analisado (GGGGS), a eficiência da conjugação da cadeia leve foi igualmente eficiente em comparação à conjugação da cadeia pesada, desse modo permitindo conjugação sincrônica das cadeias pesada e leve de um anticorpo C- terminalmente modificado em ambas as cadeias pesada e leve. É concluído que esse formato de anticorpo facilitará a produção mediada a Sortase A de conjugados de fármaco de anticorpo (ADCs) homogêneas carregadas com 4 fármacos por anticorpo (DAR4). Tabela 3: Variantes Ac10 produzidas de anticorpo monoclonal C-terminalmente modificado Tabela 4: Condições de conjugação para mAbs Ac10-HC-GS-LHS/LC-GS-LHS e Ac10-HC-LS/LC-LS Tabela 5: Condições de conjugação para mAbs Ac10-HC-LS/LC-GS-LS, Ac10-HC-LS/LC-GGS-LS, Ac10-HC-LS/LC-GGGS-LS e Ac10-HC-LS/LC-GGGGS-LS.
[0278] Exemplo 10: Geração de ADC homogêneo por marcação de purificação de afinidade strepII
[0279] Conjugação mediada a Sortase A com Gli5-marcado vc-PAB- MMAE (vide Fórmula 1, Exemplo 5) foi realizada com anticorpo Ac10 modificado anti-CD30 nos C-términos ou da cadeia pesada, ou da cadeia leve com sequências que compreendem um motivo de LPETG sortase e a marcação strepII de purificação de afinidade como proporcionado na Tabela 6 abaixo: Tabela 6: anticorpo Ac10 C-terminalmente modificado ou com modificação ou HC ou LC
[0280] Os vetores de expressão que codificam as sequências Ac10 de cadeia pesada ou de cadeia leve da Tabela 4 foram construídas essencialmente como descrito no Exemplo 1. A transfecção de célula CHO e a purificação de afinidade de anticorpos por proteína A-cromatografia de sefarose foi realizada essencialmente como descrito no Exemplo 4.
[0281] A conjugação mediada a sortase A de anticorpos anti- CD30marcados com motivo de sortase de cadeia pesada ou de cadeia leve com vc-PAB- MMAE marcado com Gli5 (vide Fórmula 1, Exemplo 5) foi realizada essencialmente de acordo com o protocolo proporcionado no Exemplo 7.
[0282] Como descrito adicionalmente acima na descrição detalhada da presente invenção, o anticorpo não reagido irá reter a marcação de strep-II de purificação de afinidade C-terminal, que pode ser explorada para enriquecer o ADC completamente reagido com DAR2. A análise da conjugação sortase A de cadeia pesada com a toxina vc- PAB-MMAE por meio de cromatografia de interação de hidrofobicidade (HIC) (A Figura 12, painel A), mostra que a maioria das cadeia pesadas modificadas por motivo sortase foi conjugada, mas um determinado percentual de substrato não reagido (DAR0 = relação de fármaco para anticorpo = zero), ou de substrato parcialmente reagido (DAR1 = relação de fármaco para anticorpo = 1) foi ainda detectável por HIC (A Figura 12, Painel A).
[0283] Portanto, a conjugado vc-PAB-MMAE purificado por proteína A foi passado 4 vezes sobre a coluna de afinidade StrepTactin® (IBA Sciences, Gottingen, Germany), essencialmente como descrito no Exemplo 7, de modo a remover anticorpo modificado a sortase A não reagido ou parcialmente reagido.
[0284] A Figura 12, Painel B mostra que com diversas passagens do vc-PAB-MMAE heterogêneo conjugado de fármaco de anticorpo, completamente reagido DAR2 conjugados de fármaco de anticorpo (ADCs) (DAR2 = relação de fármaco para anticorpo = 2) pode ser altamente enriquecido. Esse experimento demonstra a possibilidade de utilizar marcações de purificação de afinidade adicionais adicionadas C- terminalmente ao motivo de reconhecimento LPETG sortase A para gerar ADC homogêneo com uma relação definida de fármacos para anticorpo (aqui DAR2).
[0285] Exemplo 11: Síntese de maitansinae modificada com 5xglicina e toxinas alfa-amanitina
[0286] De modo a permitir a conjugação de duas diferentes cargas úteis, preferivelmente cargas úteis tóxicas a um único anticorpo, modificado com diferentes motivos sortase na cadeia pesada e na cadeia leve de C-términos, é necessário se modificar duas diferentes toxinas com resíduos de glicina, preferivelmente toxinas com diferentes modos de ação, de modo que a célula de câncer objetivada com a dupla carga útil conjugada ADC, seja atacada por meio de duas vias diferentes, potencialmente sinergísticas. A síntese de duas diferentes cargas úteis tóxicas glicina-modificadas (aqui maitansinae e alfa-amanitina) satisfazendo essa necessidade tem sido realizada e é descrito aqui.
[0287] 11.1 Síntese de alfa-amanitina glicina-modificada:
[0288] 30 mg alfa-amanitina (Estrutura 1) (Sigma-Aldrich, order # A2263) foi dissolvido em 1 mL de DMSO anídrico. A essa solução 19 mg de NH-Boc- amino-hexilbrometo foram adicionadas, seguido por terc-butóxido de potássio (1M solução em THF, 35 μL). A mistura de reação foi agitada a temperatura ambiente por 6 h e mais terc-butóxido de potássio (1M solução em THF, 20 μL) foi adicionado. A reação foi mantida a temperatura ambiente por 16 h. Ácido acético (10 μL) foi adicionado e a mistura bruta foi purificada por RP-HPLC diretamente (coluna Sunfire C18 5μ 3 cm x 10 cm, 50 mL/min, 550% de acetonitrila/água 15 min gradiente). A fração desejada foi coletada e liofilizada para se obter a estrutura 2 como um pó branco (15 mg), que foi tratado com solução de TFA/DCM (1/1, v/v, 1 mL) por 30 minutos a temperatura ambiente. Os voláteis foram removidos sob reduzida pressão para se obter a estrutura 3 como uma goma relativamente amarela, que foi usada na próxima etapa sem purificação adicional.
[0289] Fmoc-Gli5-OH (8 mg) foi dissolvido em DMF anídrico (0,5 mL). HATU (Sigma-Aldrich, order # 445460) (6 mg) foi adicionado, seguido por DIEA (10 mL) (Sigma-Aldrich, order #496219). A mistura foi agitada gentilmente a temperatura ambiente por 30s e então transferida a uma solução de composto 3 em DMF (0,5 mL). Após 30 mins, a análise de LC/MS mostrou que todo o composto 3 foi consumido. Piperidina (30 μL) foi adicionado e o progresso da reação foi monitorado por LC/MS. Ácido acético foi adicionado para neutralizar a reação após 1 h e a mistura foi purificada por RP-HPLC (coluna Sunfire C18 5μ 3 cm x 25 cm coluna, 50 mL/min, 2-40% de acetonitrila/água 30 min gradiente). As frações foram agrupadas e liofilizada para se obter a estrutura 5 como um pó branco (12 mg). Os dados analíticos para o composto 5 são proporcionados na Figura 13, painel A).
[0290] Esquema 1: Síntese de alfa-amanitina glicina-modificado
[0291] 11.2. Síntese de maitansinae glicina-modificado:
[0292] Maitansinaol (0,6 g, 1.1 mmol) (Clearsynth Labs, Mumbai, India) foi dissolvido em THF anídrico (6 mL) e DMF anídrico (3 mL) após o que 1,2 mL DIEA (Sigma-Aldrich, order #496219) foi adicionado. A solução foi disposta sob atmosfera de argônio. Triflato de zinco (1,2 g) e NMeAla NCA (0,7 g) foram adicionados em uma porção. A mistura foi sonicada até que o sólido foi dissolvido. A mistura de reação foi agitada a temperatura ambiente por 2 dias e então diluída com acetato de etila (100 mL). A mesma foi lavada com NaHCO3 saturado (solução aquosa, 2 x 50 mL) e salmoura (50 mL). A camada orgânica foi seca (sobre MgSO4) e concentrada para se obter a maitansinaol 3- (S)-alfa-N-metilaminopropionato bruto (8) que foi usado diretamente na próxima etapa sem purificação adicional.
[0293] Fmoc-Gli5-OH (26 mg) foi dissolvido em DMF anídrico (1 mL). HATU (Sigma-Aldrich, order # 445460) (19 mg) foi adicionado, seguido por DIEA (18 μL). A mistura foi agitada gentilmente a temperatura ambiente por 30s e então transferida a uma solução de composto 8 em THF (1 mL). Após 30 mins, a análise de LC/MS mostrou que todo o composto 8 foi consumido. Piperidina (40 μL) foi adicionado e o progresso da reação foi monitorado por LC/MS. Éter (40 mL) foi adicionado à reação após 2 h e o precipitado sólido foi coletado e lavado com éter. O composto bruto foi purificado por RP- HPLC (coluna Sunfire C18 5μ 3 cm x 10 cm, 50 mL/min, 10-60% de acetonitrila/água 20 min gradiente). As frações foram agrupadas e liofilizadas para se obter o composto 10 como um pó branco (33 mg). Os dados analíticos para o composto 10 são proporcionados na Figura 13, painel B.
[0294] Esquema 2: Síntese de maitansinae glicina-modificado
[0295] É importante ser observado que em princípio, qualquer toxina pode ser funcionaliada para conjugação mediada a sortase enzimática, se ou 5 glicinas (como mostrados aqui), ou qualquer número de resíduos de glicina maior ou igual do que uma glicina, são fixados às toxinas (vide a Figura 14).
[0296] Exemplo 12: Inibição de tumor In vivo de conjugado de sortase A-Trastuzumab-DM1 em modelos de xenoenxerto de carcinoma ovariano SKOV3.
[0297] Celulals de tumor 5 x 106 SKOV3 em 200 μL de PBS/Matrigel (relação de 1:1) foram implantadas subcutaneamente nos flancos esquerdos de camundongos femeas de 5-6 semanas de udade NMRI. Os volumes primários de tumor foram monitorados por calibragem. Após um volume médio de tumor de 100-200mm3 ser alcançado, os animais que tinham o tumor foram aleatorizados em 3 grupos de acordo com os tamanhos dos tumores (10 animais por grupo). No dia da aleatorização (dia 0) e no dia 21, os animais dos grupos 1, 2 e 3 foram injetados por via intravenosa com, respectivamente, 5 mL/kg de PBS, 15 mg/kg de Kadcila®, ou 15 mg/kg de conjugado sortase A- Trastuzumab-DM1. Os volumes do tumor foram medidos duas vezes por semana por calibragem (A Figura 15). O estudo foi terminado após 39 dias e os animais foram euthaniziados de acordo com as diretrizes aceitas de experimentação com animais.
[0298] No curso do estudo, os tumores nos animais de controle falsamente injetados com PBS desenvolveram unioformenten a um volume de de aproximadamente 600 mm3. De modo diferente, os tumores nos animais tratados com Kadcila® retraíram e foram essencialmente indetectáveis no dia 39. A atividade anti-tumor do conjugado de Sortase A- Trastuzumab-DM1 não diferiu de modo significativo a partir daquele comercialmente oferecido Kadcila®, apesar do fato de que o conjugado sortase- T-DM1 exibiu uma relação mais baixa de fármaco para anticorpo de aproximadamente 2, em comparação ao reportado DAR de 3,5 de Kadcila®. Em combinação com os dados a partir do Exemplo 8, os resultados demonstram que o conjugado sortase conjugados de fármaco de anticorpo (ADCs), usando o anticorpo idêntico e a fração de toxina, teve atividade de extermínio de tumor comparável em comparação ao quimicamente comercialmente oferecido conjugado Kadcila® in vitro e in vivo, apesar da relação mais baixa de fármaco para anticorpo.
[0299] Exemplo 13: Conjugação mediada a sosrtase A em sobrenadante bruto de célula CHO.
[0300] A variante de Trastuzumab Tras-HC-LS/LC-GGGGS-LS, que consiste de cadeias pesadas C-terminalmente marcadas com motivo LPETG Sortase e marcação de purificação Strep II (SEQ ID NOs: 055-056), e cadeias leves C-terminalmente marcadas com um espaçador de 5 amino ácidos Gli4-Ser (GGGGS), motivo LPETG Sortase e Marcação Strep II (SEQ ID NOs: 057-058), foi produzida em células CHO essencialmente como descrito no Exemplo 4. O sobrenadante de célula bruta livre de soro resultante conteve aproximadamente 157mg/L Tras-HC-LS/LC-GGGGS-LS e foi diretamente usado para conjugação essencialmente como descrito no Exemplo 9, por adicionar Tampão de Sortase, Gli5-FITC, e diluições em série de Sortase A diretamente ao sobrenadante. Em paralelo, Tras-HC-LS/LC-GGGGS-LS purificado por cromatografia de afinidade de proteína A foi também conjugado sob condições idênticas. Após 4 horas a 42°C, as reações foram analisadas por desnaturação, redução de gel de eletroforese SDS-PAGE. Após a visualização de FITC ao dispor o gel em uma caixa de UV, a proteína foi corada usando azul Coomassie Briliant (A Figura 16). Os dados mostram o achado inesperado de que a conjugação de anticorpos mediada a sortase A em sobrenadante de cultura de célula bruta foi tão eficiente como aquela do anticorpo purificado. Adicionalmente, a reação de conjugação foi altamente específica e nenhum dos contaminantes de proteína presentes no sobrenadante bruto de célula CHO foram não especificamente conjugado. Junto, os referidos ados sugerem que a robustez da reação de Sortase pode ajudar a facilitar a fabricação de ADC por permitir a realização da conjugação de fármaco diretamente após a produção em células CHO antes de purificação e processamento à jusante.
Legendas das Figuras
[0301] A Figura 1: Essa Figura ilustra o princípio de conjugação de carga útil específica de campo mediada a sortase A a um imunoligante (ou proteína de ligação), que pode ser realizada no N-término de uma proteína (a), ou no C-término da proteína (b). de modo a alcançar a conjugação N-terminal, a carga útil precisa conter o motivo de reconhecimento penta-peptídeo sortase (aqui LPXTG, o motivo de reconhecimento de sortase A a partir de Staphilococcus aureus (X que representa qualquer um dos 20 amino ácidos naturais), enquanto que o N-término do imunoligante/proteína de ligação a ser marcado precisa ser expresso com uma extensão N-terminal de minimamente 3 resíduos de glicina, aqui indicado como Gn, (com n > 2), que tem um grupo amino N-terminal livre (aqui indicado pelo símbolo menor H2N). Tipicamente 3-5 glicinas são usadas de modo a modificar um substrato para conjugação mediada a sortase. A adição da enzima recombinante sortase A enzima a partir de Staphilococcus aureus, como indicado aqui, então catalisa a ruptura da ligação de peptídeo entre o T e o resíduo C-terminal G no motivo penta-peptídeo LPXTG e forma a nova ligação de peptídeo entre a glicina N-terminal do trecho Gn (n > 2) e o resíduo T. o resíduo G C-terminal do motivo LPXTG (aqui ressaltado em negrito) é removido na reação de transpeptidação. (b) de modo oposto, de modo a alcançar a conjugação C-terminal de uma carga útil a uma proteína, que é o método preferido para a conjugação de cargas úteis, particularmente toxinas, a anticorpos (vide A Figura 6), o motivo de reconhecimento penta-peptídeo LPXTG sortase precisa ser adicionado à extremidade C-terminal do imunoligante/proteína de ligação (por exemplo, por tecnologia de expressão de proteína recombinante, como descrito nos Exemplos), e a carga útil precisa ser modificada com um trecho curto de glicina (Gn, com n > 2, tipicamente 3-5 glicinas). Como descrito sob (a), a adição de sortase A a partir de Staphilococcus aureus então irá catalisar a transpeptidação do trecho Gn-ao motivo LPXTG, com o que o resíduo G terminal do motivo LPXTG (em negrito) será removido.
[0302] A Figura 2: Essa Figura ilustra o princípio de transpeptidação mediada a inteina (a) e inteina dividida (b). (a) Inteinas podem ocorre como as assim chamadas “proteína-introns” em proteínas precursoras, onde as mesmas separam as partes N-terminal e C-terminal de uma proteína madura, que são em geral denominadas N-exteina e C-exteina. A inteina “proteína-intron” pode catalisar a ruptura da ligação de peptídeo entre a inteina e C-exteina e a formação de uma nova ligação de peptídeo entre N-exteina e C-exteina por transferir o amino ácido N-terminal da C-exteina ao amino ácido C-terminal da N-exteina na reação de transpeptidação. O resultado da reação é a remoção da inteina “proteína-intron” a partir da proteína precursora e a geração de uma proteína madura com uma recém criada ligação de peptídeo entre a N-exteina e domínios C-inteina. (b) A atividade de inteina foi também descrito ser separável em domínios distintos, que pode ser fixado a diferentes proteínas, para as quais essa variação foi denominada inteina dividida. Os domínios N-int e C-int da inteina dividida formam um complexo estrutural não covalente, que pode realizar a mesma reação de transpeptidação como uma inteina contigua, nos domínios N-exteina e C-exteina fixados que são então em proximidade espacial e parte do complexo. O resultado da reação de transpeptidação de N-int e C-int inteina dividida é então uma “proteína trans-splicing”, ou essencialmente uma proteína de ligação entre os domínios N-exteina e C-exteina, por formação de uma nova ligação de peptídeo.
[0303] A Figura 3: Essa Figura ilustra como inteinas divididas particulares que são caracterizadas por ou um domínio C-int extremamente curto ou um domínio N-int extremamente curto pode ser usado para conjugar qualquer carga útil a um imunoligante (ou proteína de ligação), que inclui entidades de baixo peso molecular, pelo fato de que os trechos de amino ácido curto podem ser sintetizados quimicamente e podem facilmente ser fixados a entidades de baixo peso molecular por acoplamento químico convencional. (a) Essa parte da ilustração mostra o uso da inteina dividida Ssp GyrB S11 (descrito em Appleby et al. (2009)) para a conjugação C-terminal de uma carga útil a um imunoligante/proteína de ligação. Aqui o domínio C-int é apenas de 6 amino ácidos de comprimento e compreende a sequência de amino ácido GVFVHN, como indicado. Entretanto, como há a necessidade de ter alguns peptídeos que sejam o equivalente de um domínio C-exteina, amino ácidos adicionais precisam ser adicionados, dos quais o primeiro precisa ser um resíduo de amino ácido de serina ou de cisteína, enquanto o restante dos amino ácidos pode ser escolhido. Isso é indicado pelo símbolo SXn, que quer dizer que um trecho de amino ácido curto leva ao lado N-terminal por serina e seguido por n amino ácidos (n > 2, preferivelmente 5), que pode ser qualquer um dos 20 amino ácidos de ocorrência natural (portanto indicado como X). Assim, como descrito no Exemplo, um trecho curto de 12 amino ácidos que compreende um trecho de mini domínio C-int de 6 amino ácidos e um trecho C-ext de 6 amino ácidos são suficientes para permitir que o complexo N-int/C-int catalise a transpeptidação a partir da ligação de peptídeo asparagine- serina em GVFVHN-SXn (X qualquer amino ácido, n > 2, preferivelmente 5) para a ligação de peptídeo entre a transição de N-exteina e N-int. isso irá resultar no conjugado C- terminalmente imunoligante/proteína de ligação com a carga útil fixada por meio de um trecho curto de amino ácido C-exteina. (b) Essa parte da ilustração mostra o uso de Inteina dividida Ssp DnaX (descrito em Song et al. (2012)), que pode ser separada em um domonio N-int muito curto de 11 amino ácidos e um domínio C-int 139 aa C-int para a conjugação N-terminal de uma carga útil a um imunoligante/proteína de ligação. Como indicado aqui, isso apenas requer a síntese e o acoplamento de um domínio N-int curto de 11 amino ácidos a qualquer carga útil (ou a adição por tecnologia de proteína recombinante), que então permite a específica conjugação da carga útil ao N-término de qualquer imunoligante ou proteína, que tenha um domínio C-int Ssp DnaX de 139 amino ácidos de comprimento fundido ao N-término. O resultado dessa reação é então uma N- terminalmente conjugado de imunoligante/proteína de ligação. Portanto, tal como no caso de transpeptidação de sortase, onde a conjugação C-terminal ou N-terminal apenas depende do arranjo de motivos de peptídeo LPXTG e Gn com relação a uma proteína e carga útil, as inteinas divididas podem também mediar a conjugação N- e C-terminal específica de campo de proteínas com cargas úteis modificadas por peptídeo curto, e por explorar os domínios de peptídeo curto mini C-int, ou mini N-int, tais como os de Ssp GyrB e Ssp DnaX inteinas divididas, respectivamente.
[0304] A Figura 4: (a) Essa Figura ilustra a utilidade de adicionar purificação de afinidade adicional e/ou marcações de detecção além da marcação de sortase em uma conjugação de cargas úteis a imunoligantes. (a) Essa parte da Figura mostra como um amino ácido adicional adicionado que representa a marcação de purificação 6xHis (HHHHHH), uma marcação MYC de detecção (EQKLISEEDL) e uma marcação strep II de purificação de afinidade (WSHPQFEK), como descrito nos Exemplos são removidas no curso da conjugação C-terminal de carga útil via transpeptidase de Staphilococcus aureus sortase A. Isso permite se selecionar o produto conjugado, se as resinas de afinidade Ni-NTA (para a marcação 6xHis) ou resinas de afinidade estreptactina (par a marcação strep II) são empregadas para esperar substrato não conjugado a partir do produto conjugado. A referida combinação de marcações é apenas proporcionada como Exemplo.
[0305] Figura 4(b) Essa Figura ilustra que o uso de marcações de purificação de afinidade é particularmente útil para selecionar/purificar o produto completamente conjugado no caso de proteínas multiméricas, tais como anticorpos como ilustrado aqui. Como também proporcionado nos Exemplos, os anticorpos podem ser modificados com campos de conjugação específicos nas cadeias pesada e leve, e se a modificação é objetivada aos C-términos das cadeias de IgH e IgL, então até quatro cargas úteis podem ser conjugadas ao anticorpo. A adição de (a) marcação de purificação de afinidade(s) adicional, por exemplo, como descrito na Figura 4(a) permite se ligar no produto completamente conjugado, que pode apenas ter um, dois, ou três (como ilustrado aqui) cargas úteis conjugadas ao anticorpo, ainda ligam a respectiva resina de purificação de afinidade, e pode assim facilmente ser separada a partir do produto de carga útil completamente conjugado. Esse paradigma é evidentemente também aplicável aos imunoligante modificados por inteina, e não apenas aos imunoligantes modificados por motivo sortase, como ilustrado aqui.
[0306] A Figura 5: Essa Figura ilustra a variação da conjugação mediada a sortase que pode também ser aplicada, na qual a enzima sortase não é adicionada como uma proteína recombinante separada ao imunoligante marcado com sortase e a carga útil modificada com um trecho de glicina, mas onde o domínio enzimático sortase é expresso como uma proteína de fusão C-terminal à marcação LPXTG de sortase. O domínio de enzima sortase será inativo desde que o mesmo não seja incubado com a carga útil modificada com trecho de glicina (ou substrato). Tão logo o substrato modificado com trecho de glicina (ou aqui carga útil) é adicionado ao referido construtor, o domínio sortase fundido irá catalisar a transpeptidação do substrato de glicina-carga útil a marcação LPXTG de sortase, por clivar a proteína entre a treonina-4 e glicina-5 posição da marcação LPXTG, e desse modo remover o domínio de enzima sortase com marcações de purificação de afinidade adicionais, que podem ser adicionadas opcionalmente, como ilustrado aqui. O referido procedimento tem a vantagem de que, similar à adição de domínios de inteina dividida cataliticamente ativa, o domínio de enzima sortase pode ser expresso por tecnologia de proteína recombinante como um componente integral do imunoligante a ser conjugado.
[0307] A Figura 6: (a) Essa Figura ilustra o uso de diferentes transpeptidases (aqui sortase e inteina dividida), de modo a simultaneamente conjugar diferentes cargas úteis a diferentes subunidades de uma proteína multimérica, tall como, por exemplo, como ilustrado aqui, as cadeias pesadas e as cadeias leves de um anticorpo. Nesse exemplo selecionado, os C-términos das cadeias pesadas são modificados com o domínio N-int de Ssp GyrB (como proporcionado no Exemplo 2), enquanto as cadeia leves são modificadas o motivo LPXTG penta-peptídeo de sortase A (como proporcionado no Exemplo 1, as marcações adicionais são omitidas por uma questão de simplicidade). Incubação com a carga útil modificada com trecho de glicina A e com um domínio C-int- modificado e carga útil B e enzima sortase irá permitir a simultânea e seletiva conjugação de carga útil B às cadeias pesadas e de carga útil A às cadeias leves. Se as cargas úteis A e B são toxinas objetivando diferentes trajetos celulares, essa estratégia pode gerar fármacos anti-câncer mais potentes, do que o convencional conjugados de fármaco de anticorpo (ADCs), apenas que contém uma única fração de toxina. (b) Essa Figura ilustra o uso de diferentes enzimas sortases (aqui sortase A e sortase B a partir de Staphilococcus aureus), de modo a simultaneamente conjugar diferentes cargas úteis a diferentes subunidades de uma proteína multimérica, tal como, por exemplo, como ilustrado aqui, as cadeias pesadas e as cadeias leves de um anticorpo. No referido exemplo selecionado, os C-términos das cadeias pesadas são modificados com o motivo pentapeptídeo de reconhecimento para sortase B, NPQTN, enquanto as cadeias leves são modificadas com o móvito penta-peptídeo motivo LPXTG de sortase A. A conjugação eequencial de cargas úteis A e B modificadas com trechos de glicina com sortase A e sortase B irá permitir a simultânea e seletiva conjugação de carga útil B às cadeias pesadas e carga útil A às cadeias leves (permanecendo a sequência de peptídeos a partir de LPXTG e NPQTN são omitidas na estrutura do conjugado por uma questão de simplicidade). Se as cargas úteis A e B são toxinas objetivando diferentes trajetos celulares, essa estratégia pode gerar fármacos anti-câncer mais potentes, do que os convencionais conjugados de fármaco de anticorpo (ADCs), que contêm apenas uma única fração de toxina.
[0308] A Figura 7: As anállises de SDS-PAGE (a.) e Western-blot (b.) de fragmento de sortase A recombinante enzimaticamente ativa de Staphilococcus aureus. (a.) A linhagem 1 em SDS-PAGE contém BSA (ca. 66.4 kD), A linhagem M1 contém proteína de peso molecular padrão de Genscript (Cat.-Nr.: MO0505), A linhagem 2 contém fragmento recombinante de sortase A purificado por marcação HIS de Staphilococcus aureus. As proteínas no SDS-PAGE são coradas com azul Commassie. (b.) O Westernblot foi desenvolvido com um anticorpo anti-His (Genscript Cat.-Nr.: AO0186). A linhagem 3 contém fragmento recombinante de sortase A purificado por marcação HIS de Staphilococcus aureus. A linhagem M2 contém peso molecular padrão de Genscript (Cat.- Nr.: MM0908).
[0309] A Figura 8: Análise de Cromatografia de Interação Hidrófoba (HIC) de conjugado de DM1-toxina Tras-HC-GS-LHS (A) e Tras-LC-GS-LHS (B). DAR1 indica a relação de fármaco para anticorpo de 1; DAR2 indica a relação de fármaco para anticorpo de 2.
[0310] A Figura 9: A resposta de dose de efeitos citotóxicos de conjugados de fármaco de anticorpo (ADCs) indicado em SKBR3 que super expressa HER2 (A) e células T47D-5R negativas para HER2 (B). As células foram incubadas com diluições em série de conjugados de fármaco de anticorpo (ADCs) por 3 dias, após o que a viabilidade da célula foi detectada por CelTiter-Glo® solução Luminescente (Promega). LC: DM1-sortaseA-conjugado Tras-LC-GS-LHS; HC: DM1-sortaseA-conjugado Tras-HC- GS-LHS.
[0311] A Figura 10: Conjugação mediada a sortase A de Gli5-FITC a variantes mAb Ac10 com ou sem espaçador de peptídeo GS. Diluições em série de Sortase A foram usadas para conjugar Gli5-FITC a mAb Ac10-HC-GS-LHS/LC-GS-LHS (A) e mAb Ac10-HC-LS/LC-LS (B) sob condições idênticas. Os produtos de reação foram seperados por tamanho on desnaturação, redução dos géis de SDS-PAGE. FITC foi visualizada por dispor os géis em uma caixa de UV. As concentrações de sortase A usadas foram: linhagens 1, 9: 50 μM; linhagens 2, 10: 25 μM; linhagens 3, 11: 12,5 μM; linhagens 4, 12: 6.25 μM; linhagens 5, 13: 3.13 μM; linhagens 6, 14: 1,56 μM; linhagens 7, 15: 0,78 μM; linhagens 8, 16: 0.39 μM.
[0312] A Figura 11: Influência do comprimento do peptídeo espaçador na eficiência da conjugação de cadeia leve. Diluições em série de Sortase A foram usadas para conjugar Gli5-FITC a mAbs Ac10-HC-LS/LC-GS-LS (A, esquerda), Ac10-HC-LS/LC- GGS-LS (A, direita), Ac10-HC-LS/LC-GGGS-LS (B, esquerda) e Ac10-HC-LS/LC- GGGGS-LS (B, direita) sob condições idênticas. Os produtos de reação foram seperados por tamanho em desnaturação, redução dos géis de SDS-PAGE. FITC foi visualizada por dispor os géis em uma caixa de UV. As concentrações de Sortase A usadas foram: linhagens 1, 8, 15, 22: 25 μM; linhagens 2, 9, 16, 23: 12,5 μM; linhagens 3, 10, 17, 24: 6.25 μM; linhagens 4, 11, 18, 25: 3.13 μM; linhagens 5, 12, 19, 26: 1,56 μM; linhagens 6, 13, 20, 27: 0,78 μM; linhagens 7, 14, 21, 28: 0.39 μM
[0313] A Figura 12: Análise de sortase A vc-PAB-MMAE toxina cadeia pesada-conjugado ADC de mAb Ac10 por cromatografia interação de hidrofobicidade (HIC), que é capaz de diferenciar substrato não reagido (DAR0 = 0 relação de fármaco para anticorpo), substrato na qual uma das duas cadeias pesadas foi conjugada (DAR1 = 1 relação de fármaco para anticorpo), e substrato no qual ambas as cadeias pesadas modificadas foram conjugadas (DAR2 = relação de 2 fármacos para anticorpo), como indicado. O painel A mostra o perfil HIC após uma conjugação de HC modificado Ac10 mAb mediada a sortase A padrão, na qual ainda as espécies DAR0 e DAR1 são detectáveis, próximas ao produto desejado DAR2. O painel B mostra o perfil HIC após 4 passagens da preparação de ADC analisadas no painel A sobre a coluna de purificação de afinidade StrepTactin®.
[0314] A Figura 13: Análise de toxina alfa-amanitina Gli5-modificada sintetizada (a.) e toxina maitansina Gli5-modificada (b.). Em cada um dos painéis a.) e b.) a estrutura sintetizada é proporcionada em cima, com as cinco glicinas ressaltadas por uma caixa. A análise de cada composto por espectrometria de massa e HPLC de fase reversa é proporcionado abaixo. a.) A massa esperada da toxina alfa-amanitina Gli5- modificada é 1302,07 D, a massa observada é 1325.38 D, correspondendo a Ms + Na+. O perfil de RP-HPLC indica a pureza de > 95%. b.) a massa esperada da toxina maitansinae Gli5-modificada é 991.41 D, a massa observada é 957.69 D, correspondendo a Ms + Na+. RP-HPLC o perfil indica uma pureza de > 95%.
[0315] A Figura 14: estruturas de toxinas modificadas 5xGlicina (Gli5) que foram ou sintetizadas por Concortis, San Diego, CA, U.S. (estruturas 1-6, e 9), ou que podem ser sintetizadas (estruturas 7 & 8), demonstram que qualquer toxina pode ser funcionalizada para conjugação mediada a sortase enzimática, se ou 5 glicinas são fixadas às toxinas (como mostrado aqui), ou qualquer número de resíduos de glicina maior ou igual do que uma glicina. Toxinas modificadas por Glicina podem ou ser sintetizadas contendo estruturas ligante/espaçador adicional validadas como proporcionado nas estruturas 1-3 na Figura 14 a.), potencialmente adicionar determinada funcionalidade adicional (por exemplo, capacidade de clivagem em determinados compartimentos subcelulares) ou sem ligantes adicionais, como ilustrado nas estruturas 4-6 na Figura 14 b.). Se diversos grupos reativos são oferecidos em uma determinada toxina, tal como, por exemplo, no caso de toxina alfa-amanitina, resíduos de glicina podem ser adicionados aos referidos diferentes grupos como exemplificado nas estruturas 7-9 na Figura 14c.).
[0316] A Figura 15: os volumes de tumor como determinado no Exemplo 12. Os resultados demonstram que conjugados conjugados de fármaco de anticorpo (ADCs) sortase, usando idêntico anticorpo e fração de toxina, têm comparável atividade de extermínio de tumor em comparação aos conjugados Kadcila® comercialmente oferecidos quimicamente.
[0317] A Figura 16: Os géis corados com azul de Coomassie como descrito no Exemplo 13. Os dados mostram o inesperado achado de que a Conjugação mediada a sortase A de anticorpos em sobrenadante de cultura de célula bruta foram tão eficientes quanto os do anticorpo purificado. Referências
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Claims (11)

1. Método para a produção de um conjugado de imunoligante/carga útil, o método caracterizado pelo fato que compreende a) proporcionar um imunoligante selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo, e b) conjugar enzimaticamente pelo menos uma carga útil ao imunoligante por uma sortase específica de sequência ou um domínio catalítico da mesma, em que a carga útil é uma toxina com um peso molecular não superior a 2.500 Dalton, em que o imunoligante compreende um motivo de reconhecimento de sortase e a toxina é modificada com uma modificação Glyn, em que n é 3 a 5, e em que o imunoligante compreende um espaçador de peptídeo GlyGlyGlyGlySer (= GGGGS) posicionado entre o terminal C do imunoligante e o motivo de reconhecimento de sortase, produzindo assim o conjugado imunoligante/carga útil.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato que o imunoligante se liga a pelo menos uma entidade selecionada a partir do grupo que consiste em um receptor, um antígeno, um fator de crescimento, uma citocina e um hormônio.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato que pelo menos um domínio catalítico da sortase é fundido ao terminal C do imunoligante ou da carga útil.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato que compreende a conjugação do referido imunoligante a pelo menos duas cargas úteis diferentes, pelo menos uma das quais é a toxina, e em que o referido imunoligante tem pelo menos duas subunidades, cada uma sendo conjugada a uma carga útil.
5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato que a proporção de imunoligante e carga útil é definida estequiometricamente.
6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato que o método compreende uma etapa de purificação por afinidade para separar conjugados incompletos de conjugados completos usando uma etiqueta de purificação de afinidade que é anexada ao imunoligante por meio de um motivo de reconhecimento de sortase.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato que o imunoligante contém pelo menos dois marcadores de purificação de afinidade.
8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato que a conjugação da carga útil com o imunoligante é específica do local.
9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato que a conjugação compreende uma transpeptidação do motivo de reconhecimento da sortase.
10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato que o motivo de reconhecimento da sortase é LPXTG (SEQ ID NO: 27) ou NPQTN (SEQ ID NO: 28).
11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato que a conjugação é realizada em sobrenadante bruto de cultura de células.
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